WO2022245089A1 - 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 코로나바이러스감염증-19(covid-19) 치료용 조성물 - Google Patents

타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 코로나바이러스감염증-19(covid-19) 치료용 조성물 Download PDF

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WO
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pharmaceutically acceptable
acceptable salt
treatment
tdca
taurodeoxycholic acid
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PCT/KR2022/007007
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English (en)
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성승용
한선애
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(주)샤페론
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Definitions

  • the present invention relates to a composition for treatment of coronavirus infection-19 (COVID-19) containing taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and more particularly, to taurine. It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating lower respiratory tract infections, including coronavirus infection-19 (COVID-19), containing deoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • COVID-19 coronavirus infection-19
  • deoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a pandemic that seriously threatens human health worldwide, with more than 200 million confirmed cases and more than 4 million deaths since its existence was first confirmed in 2019.
  • COVID-19 is a severe acute respiratory syndrome disease spread by a novel coronavirus (SARS-CoV-2).
  • SARS-CoV-2 belongs to the family of coronaviruses (Coronaviridae) and includes SARS-CoV (severe acute respiratory syndrome coronavirus), Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV, Middle East respiratory syndrome coronavirus).
  • SARS-CoV-2 belongs to the family of coronaviruses (Coronaviridae) and includes SARS-CoV (severe acute respiratory syndrome coronavirus), Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV, Middle East respiratory syndrome coronavirus).
  • MERS-CoV Middle East respiratory syndrome coronavirus
  • SARS-CoV-2 is an RNA virus with a gene size of 27 to 32 kb that can infect humans and various animals.
  • SARS-CoV-2 has an incubation period of about 2 weeks, and mainly shows respiratory symptoms such as cough with fever, difficulty breathing, shortness of breath, and phlegm. Gastrointestinal symptoms such as abdominal pain and diarrhea may also occur.
  • SARS-CoV-2 also causes lower respiratory tract infections.
  • Lower respiratory tract infections are diseases caused by pathogens invading the lower respiratory tract centering on the vocal cords, such as bronchitis, pneumonia, and pneumonitis.
  • Pneumonia is a representative lower respiratory tract infection. If you get pneumonia, the lungs become inflamed and the normal function of the lungs is disrupted, resulting in pulmonary symptoms and systemic symptoms throughout the body. Pulmonary symptoms include coughing due to irritation of the respiratory system, sputum due to discharge of inflammatory substances, and dyspnea due to impaired breathing function. Gastrointestinal symptoms such as nausea, vomiting, and diarrhea may also appear.
  • systemic diseases may occur throughout the body, such as headache, fatigue, muscle pain, and joint pain.
  • SARS-CoV-2 characteristically causes cytokine release syndrome or cytokine storm.
  • a cytokine storm is a systemic inflammatory syndrome that can be induced by cancer, autoimmune diseases, infectious diseases, etc., and is characterized by excessive secretion of cytokines and overactivation of immune cells.
  • This cytokine storm induces a systemic immune response, resulting in high fever, lymph gland disorders, liver and spleen enlargement, hemocytopenia, hyperferritinosis, and central nervous system abnormalities. If not treated, it can progress to multiple organ disorders.
  • the hypersensitivity reaction of the systemic immune system causes secondary dysfunction of various organs, leading to death of the patient (Fajgenbaum et, al. N Engl J Med.
  • the drug officially approved by the US FDA for the treatment of inpatients with COVID-19 is the antiviral drug Remdesivir, and the drug to prevent systemic inflammation caused by infection and tissue damage caused by it is still limited Currently, steroids such as dexamethasone are used for conservative management to reduce the risk of death.
  • steroids such as dexamethasone are used for conservative management to reduce the risk of death.
  • anti-inflammatory drugs the IL-6 receptor blocker Tocilizumab and the JAK inhibitor Baricitinib are used. ) is used with emergency approval, but various side effects have been reported.
  • tocilizumab As a result of analyzing a total of five large-scale clinical trials, the evaluation of therapeutic efficacy was often different for each clinical trial, but only two clinical trials, 'REMAP-CAP' and 'RECOVERY trials', showed significant therapeutic effects. It was confirmed that the effect was low without the combination of steroids, and emergency approval was conditional on the condition that it be used in combination with steroids when using it.
  • baricitinib as a result of analyzing two large-scale clinical trials, the 'ACTT-2 trial' confirmed the treatment effect, but the 'COV-BARRIER trial' confirmed the treatment effect only in the severely ill patient group.
  • P2X7 receptors are distributed systemically, including immune cells, lung epithelial cells, and central nervous system cells, and when infection with pathogens including SARS-CoV-2 occurs (1), interaction between virus spike protein and ACE2, a virus entry receptor, occurs ( 2) Angiotensin 2 rises (3) ComC regulators are activated.
  • the P2X7 receptor is an ion channel receptor composed of a complex belonging to the P2Xn purinergic receptor family, and stimulating P2X7 promotes the extracellular release of potassium ions and the rapid movement of calcium ions and sodium ions into cells.
  • a disease state such as infection, cells die and the concentration of extracellular ATP rises significantly, activating the P2X7 receptor.
  • Activated P2X7 activates the NLRP3 inflammasome, which is amplified by potassium ion release and intracellular ion imbalance.
  • the activated pro-IL-1 ⁇ /18 of the NLRP3 inflammasome complex is activated and released into tissues, intensifying the inflammatory response of the surrounding tissues along with the dead cells.
  • P2X7 antagonists have not been developed.
  • Bile acids are important physiological molecules in the secretion of bile for absorption of lipids, harmful metabolites and nutrients in the intestine, and are produced in perivenous hepatocytes of the human liver.
  • the primary bile acids produced by the human body are chenodeoxycholic acid and cholic acid. Chenodeoxycholic acid is conjugated with taurine or glycine to produce a total of eight conjugated bile acids: taurochenodeoxycholate and glycochenodeoxycholate.
  • deoxycholic acid, lithocholic acid, and ursodeoxycholic acid are formed as secondary bile acids due to the influence of intestinal microorganisms on primary bile acids.
  • Cholic acid is converted to deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid to lithocholic acid or ursodeoxycholic acid.
  • taurine is conjugated to deoxycholic acid to form taurodeoxycholic acid.
  • These bile acids are known to play an important role as signaling molecules in the absorption of dietary lipids, homeostasis of cholesterol and regulation of systemic endocrine function, and to regulate the activity of the immune system and metabolic system by regulating various signal transduction pathways.
  • ursodeoxycholic acid which exists only in very small amounts as a secondary bile acid, has been proven to have a pharmacological effect of improving liver function and is being applied as a treatment for liver diseases.
  • anti-inflammatory action of bile acid has been reported in some cases, reports on the detailed mechanism of action and especially on the control of inflammatory complex activity are extremely limited.
  • taurodeoxycholic acid binds to GPCR19 to increase the expression of GPCR19 and decrease the expression of P2X7, as well as to inhibit the activation of P2X7 by increasing the formation of a GPCR19-P2X7 complex.
  • GPCR19 exists as a complex bound to the cell membrane of the P2X7 receptor and keratinocytes, microglia, and macrophages, etc.
  • the interaction mechanism of GPCR19 and P2X7 which has not been known so far, is identified, and by controlling their interaction to suppress the NLRP3 inflammatory complex, a fundamental treatment that can treat pneumonia caused by COVID-19 wanted to provide
  • an object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating lower respiratory tract infections containing taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating lower respiratory tract infections, comprising administering taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • Another object of the present invention is to provide a use of taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating lower respiratory tract infections.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lower respiratory tract infections, containing taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. .
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of lower respiratory tract infections, containing taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating lower respiratory tract infections, comprising administering taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • the present invention provides the use of taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating lower respiratory tract infections.
  • the present inventors confirmed that salts of taurodeoxycholic acid inhibit excessive inflammatory responses by inhibiting the activation of the NLRP3 inflammatory complex by regulating the interaction of GPCR19 and P2X7 in inflammatory bone marrow-derived macrophages. did In addition, the salt of taurodeoxycholic acid alleviates the inflammatory response in septic animal models, improves clinical symptoms caused by coronavirus infection-19 (COVID-19) and pneumonia caused by it, and prolongs the recovery period. Since it was confirmed that shortening, the taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be used as an active ingredient of a composition for preventing or treating lower respiratory tract infections, including COVID-19.
  • FIGs 1a to 1c show that sodium taurodeoxycholate (hereinafter referred to as "TDCA”) controls the initiation step of inflammatory complex activity.
  • TDCA sodium taurodeoxycholate
  • FIG. 2a and 2b are diagrams showing that TDCA not only regulates the expression of its own receptors, GPCR19 and P2X7R, but also regulates the physical binding between the two receptors.
  • LPS and ATP or BzATP were treated to induce inflammatory activity signals, and TDCA-induced changes in GPCR19, P2X7R and their mutual coupling (Fig. 2a), and TDCA inhibited IL-1 ⁇ production after treatment with BzATP, an agonist of P2X7R. It is a diagram showing (FIG. 2b).
  • Figure 3a is a diagram schematically illustrating a method of constructing a sepsis model and administering TDCA in dogs.
  • FIG. 3b to 3g show the survival rate (FIG. 3b), blood pressure (FIG. 3c), blood urea nitrogen (BUN, FIG. 3d), creatinine (FIG. 3e), IL- It is a diagram showing changes in 1 ⁇ (FIG. 3f) and IL-8 (FIG. 3g).
  • Figure 4 is a diagram comparing the treatment efficiency of NuSepin 0.2mg / kg, an injection formulation containing TDCA as an active ingredient, with placebo in patients with COVID-19 pneumonia.
  • the treatment effect ratio of NuSepin 0.2 mg/kg compared to placebo was analyzed with a Cox hazard proportional model, reflecting various variables that affect the clinical evaluation of NEWS2.
  • a statistically significant treatment effect of NuSepin 0.2 mg/kg compared to placebo was shown in the antiviral treatment group and in moderate or severely ill patients at the hospital visit.
  • Figure 5 is a diagram showing the effect of shortening the treatment day compared to placebo of NuSepin 0.2 mg / kg intravenous injection in patients with COVID-19 pneumonia.
  • the treatment efficiency judged by the NEWS2-based clinical evaluation index between the NuSepin 0.2 mg/kg administration group and the placebo group in patients with moderate or higher symptoms with NEWS2 of 5 or higher on the clinical start date was compared and analyzed with a Kaplan-Meier survival curve, and also with a Cox risk proportional model.
  • the recovery rate (RR) was calculated.
  • the graph on the left of Figure 5 is a graph showing the percentage of patients who recovered during the treatment period for the intention-to-treatment (ITT) analysis group, and the graph on the right of Figure 5 is composed of only patients who did not violate the clinical protocol during the clinical trial period. It is a graph showing the percentage of patients who recovered during the treatment period for the per-protocol (PP) analysis group.
  • ITT intention-to-treatment
  • PP per-protocol
  • Figure 6 is a diagram showing the reduction of ventilator dependence by intravenous injection of NuSepin 0.2 mg/kg or placebo in COVID-19 pneumonia patients.
  • the cumulative fraction of patients not requiring adjuvant oxygen therapy between the NuSepin 0.2 mg/kg group and the placebo group in moderate and severe patients with NEWS2 >5 or higher at admission was analyzed using Kaplan-Meier survival curve and Cox risk proportional model.
  • Figure 7 is a diagram showing the improvement of clinical condition according to the type of assisted oxygen ventilator by NuSepin 0.2 mg / kg in patients with COVID-19 pneumonia.
  • type of respiratory type It is a diagram comparing the reduction rate compared to the start date (baseline) of the ordinal scale, which is a clinical indicator according to
  • CRP and cytokines are inflammatory indicators in the blood, by NuSepin 0.2 mg/kg in patients with COVID-19 pneumonia.
  • CRP, IL-8, TNF- ⁇ , IL-6 in the blood at the start of the trial (day 1) in the NuSepin 0.2 mg/kg administration group and the placebo group and CRP on the 4th day of the trial or on the end of the trial (EoS ) is a diagram comparing the concentration of cytokines in the blood.
  • the proportion of patients with CRP or cytokine concentrations in the normal range at the time of observation was compared with the placebo group and the NuSepin 0.2 mg/kg group.
  • FIG. 9 is a diagram showing the mechanism by which TDCA suppresses excessive inflammatory response.
  • prevention refers to all actions that inhibit or delay the occurrence, spread, and recurrence of lower respiratory tract infectious diseases by administration of the composition of the present invention
  • treatment refers to the treatment of the disease by administration of the composition of the present invention. It means any action that improves or beneficially changes the condition.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lower respiratory tract infections, containing taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of lower respiratory tract infections, containing taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating lower respiratory tract infections, comprising administering taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • the present invention provides the use of taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating lower respiratory tract infections.
  • the taurodeoxycholic acid isolated from animal carcasses such as cattle, pigs, sheep, dogs, goats, or rabbits, commercially available products, or synthesized products can be used without limitation.
  • the taurodeoxycholic acid is a type of bile acid, in the form of taurine-conjugated deoxycholic acid, and has a chemical structure represented by the following [Formula 1], more specifically, the following [Formula 2] ] has the chemical structure described by:
  • the taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof can inhibit the production of inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-8 or IL-6.
  • the taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof is a GPCR19 agonist, as shown in the schematic diagram of FIG. 9, increases cAMP to inhibit NF- ⁇ B activation, and inhibits P2X7 function to reduce the NLRP3 inflammatory complex. By inhibiting activation, the production of the inflammatory cytokine can be inhibited.
  • the lower respiratory tract infectious disease is fever, cough, sputum, body aches, sore throat, diarrhea, conjunctivitis, headache, skin rash, dyspnea, acute bronchitis, pneumonia, pneumonitis, renal failure, kidney function caused by coronavirus infection It may be a disease having one or more symptoms selected from the group consisting of disorders, septic shock, sepsis, and cytokine release syndrome, but is not limited thereto.
  • the coronavirus may be any one or more selected from the group consisting of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV) and Novel Coronavirus (SARS-CoV-2) , Specifically, it may be a novel coronavirus (SARS-CoV-2), but is not limited thereto.
  • MERS-CoV Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus
  • SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus
  • SARS-CoV-2 Novel coronavirus
  • the present invention includes not only taurodeoxycholic acid, but also its pharmaceutically acceptable salts, possible solvates, hydrates, racemates, or stereoisomers that can be prepared therefrom.
  • the taurodeoxycholic acid of the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful as the salt.
  • Acid addition salts are formed with inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid, and aliphatic mono- and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanes. Obtained from non-toxic organic acids such as dioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids.
  • These pharmaceutically non-toxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulphate, sulphite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, ioda Id, fluoride, acetate, propionate, decanoate, caprylate, acrylate, formate, isobutyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, suberate , sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitro benzoate, hydroxybenzoate, Toxybenzoates, phthalates, terephthalates, benzenesulfonates, toluenesulfonates
  • the acid addition salt according to the present invention is prepared by a conventional method, for example, by dissolving taurodeoxycholic acid in an excess aqueous acid solution, and dissolving the salt in a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. It can be prepared by precipitation using In addition, it may be prepared by evaporating the solvent or excess acid from the mixture and drying it, or by suction filtering the precipitated salt.
  • a pharmaceutically acceptable metal salt may be prepared using a base.
  • An alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained, for example, by dissolving the compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is suitable for pharmaceutically to prepare a sodium, potassium or calcium salt, and more specifically, it is suitable to prepare a sodium salt.
  • the corresponding silver salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • composition When formulating the composition, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, patients, powders, granules, capsules, troches, etc., and these solid preparations contain at least one or more taurodeoxycholic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention. It is prepared by mixing excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate and talc are also used.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, internal solutions, emulsions, or syrups. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included. can
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, freeze-dried formulations, suppositories, and the like.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • injectable esters such as ethyl oleate
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerol, gelatin, and the like may be used.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is based on the type, severity, and activity of the drug in the patient. , sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the compound according to the present invention may vary depending on the patient's age, sex, and weight, and is generally 0.01 mg to 100 mg per 1 kg of body weight, more specifically 0.1 mg to 15 mg per day or every other day. Alternatively, it may be divided into 1 to 3 doses per day. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, severity, sex, weight, age, etc., the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • Example 1 Production of bone marrow-derived macrophages and analysis of inflammatory cytokines through stimulation of inflammatory regulatory complexes
  • Bone marrow-derived macrophages were prepared in the following manner.
  • bone marrow extracted from C57BL/6N mice was supplemented with 10% FBS, 100 U/ml penicillin streptomycin, 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol, and 10 ng/ml recombinant mouse granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF).
  • the cells were differentiated for 7 days in supplemented RPMI medium. As a result of measuring the ratio of differentiated macrophages on day 7 using flow cytometry, it was measured to be 94-96%.
  • the bone marrow-derived macrophages of Example ⁇ 1-1> were cultured in culture dishes at various densities and then collected (4 x 10 4 , 5 x 10 5 , 1 x 10 6 cells/well, each 96-well, 24 cells/well). -well, and 12-well petri dishes).
  • Salmonella enterica serotype enteritidis in bone marrow-derived macrophages Salmonella enterica serotype enteritidis ) 300 ⁇ M BzATP, or 300 ⁇ M BzATP and 400 ng/ml of sodium taurodeoxycholate (hereinafter referred to as “TDCA”) were treated with 10 ng/ml LPS derived from the mixture for 1 hour. After the time was over, the cells were collected and stored at -80°C, followed by qRT-PCR analysis.
  • bone marrow-derived macrophages were treated with 10 ng/ml LPS for 3 hours to activate the inflammatory initiation signal, and then various concentrations (0. 25. 100, 400 ng/ml) of TDCA was added and incubated for 1 hour. After the time was over, the supernatant was collected and stored at -80 ° C, followed by ELISA analysis.
  • the bone marrow-derived macrophages of Example ⁇ 1-1> were cultured in culture dishes at various densities and collected (4 x 10 4 , 5 x 10 5 , 1 x 10 6 cells/well, each 96-well, 24 cells/well). -well, and 12-well petri dishes). The next day, in order to evaluate TGR5 and P2X7 as inflammatory activity signal-related factors and IL-1 ⁇ , an inflammatory cytokine derived from the signal, bone marrow-derived macrophages were treated with 10 ng/ml LPS and 300 ⁇ M BzATP for 3 hours, and then treated with designated each other. TDCA at different concentrations (0, 25, 100, 400 ng/ml) was treated for 1 hour. After the time was over, the supernatant was collected and stored at -80 ° C, followed by ELISA analysis.
  • Sepsis was induced by intravenous administration of 0.5 mg/kg/ml of LPS according to the protocol shown in FIG. ml (PBS was administered in the placebo group) was administered intravenously 1 hour later, and TDCA 1 mg/kg/2 ml was administered intravenously 12 hours and 24 hours later.
  • LPS administration blood pressure was monitored every hour, blood was collected at 0, 1, 3, 6, 12, 18, 24, 36, and 48 h, and the animals were sacrificed at 48 h to complete the experiment.
  • the survival rate was confirmed by checking the number of dead beagle dogs for 48 hours in the two treatment groups inducing sepsis in Example ⁇ 2-1>.
  • Blood pressure was measured hourly for 48 hours in the two treatment groups in which sepsis was induced in Example ⁇ 2-1>.
  • BUN blood urea nitrogen
  • COS creatinine
  • Blood was collected hourly for 48 hours from the two sepsis-induced treatment groups of Example ⁇ 2-1>, serum was separated, and the inflammatory cytokine IL-1 ⁇ in the serum was measured.
  • Diastolic blood pressure (DBP): ⁇ 50 mmHg or > 90 mmHg 7
  • Those who have taken drugs that induce or inhibit drug metabolizing enzymes such as barbiturates within 1 month before screening 10
  • OTC
  • a subject requests suspension of administration of a clinical trial drug during a clinical trial or withdraws consent to participate in a trial 2 If a subject is administered a drug that is expected to affect the evaluation of the safety or pharmacokinetics of the test drug during a clinical trial 3 In case of serious adverse reaction/adverse drug reaction 4 When it is impossible to perform blood collection for the pharmacokinetic/safety test of the subject 5 New significant protocol violations discovered during clinical trials 6 If there is a request for suspension from the sponsor or the Ministry of Food and Drug Safety 7 Other cases where the clinical trial director/person in charge determines that the trial should be stopped
  • PK drug safety/tolerability
  • NuSepin an injectable clinical preparation containing TDCA, was used as a therapeutic agent.
  • Adverse reactions were described by dose group and treatment group based on severity and causal relationship with the investigational drug, and the frequency and percentage of the number of subjects with adverse reactions were compared and evaluated. Vital signs, electrocardiograms, clinical laboratory tests, physical examinations, abnormal reaction monitoring such as subjective/objective symptoms, continuous ECG, SpO2 monitoring, etc. are comprehensively reviewed, and only items judged to be clinically significant are subjected to statistical analysis as necessary. did
  • pharmacokinetic variables were obtained by a non-compartmental analysis method using appropriate and validated pharmacokinetic software (e.g., Phoenix WinNonlin® (Version 8.0 or later, Pharsight, CA, USA)), dose group and treatment group Descriptive statistics (average, standard deviation, etc.) were obtained for each.
  • pharmacokinetic software e.g., Phoenix WinNonlin® (Version 8.0 or later, Pharsight, CA, USA)
  • dose group and treatment group Descriptive statistics average, standard deviation, etc.
  • ALT Alanine Transaminase
  • AST Aspartate Transaminase
  • a randomized, double-blind, standard treatment-based placebo control group was assigned to the clinical trial to evaluate the efficacy of the treatment for the recruited clinical trial patients.
  • NuSepin a therapeutic agent containing TDCA as an active ingredient, was used as a therapeutic agent.
  • a screening test was performed.
  • a screening number is assigned to each patient and includes demographic information, patient history, past and current medication history, current medical history, vital signs (blood pressure, heart rate, body temperature, respiratory rate, level of consciousness), physical examination, electrocardiogram, and laboratory tests.
  • COVID-19 PCR test, arterial blood gas analysis, and chest x-ray or CT scan for evaluation of pulmonary infiltration were performed.
  • a serum pregnancy test was performed for women of childbearing age.
  • Vital signs blood pressure, heart rate, temperature, respiratory rate, level of consciousness
  • SpO 2 and physical examination are regularly monitored for 2 to 14 days from baseline, the patient's clinical status is assessed, and laboratory tests (serum chemistry analysis) are performed.
  • blood tests, urine tests, liver/renal function tests, inflammatory parameters), 12-lead ECG, adverse drug reactions, and changes in patient-administered drugs were collected and recorded. According to the judgment of the researcher and clinician, it was decided whether to discharge the participants early, and the early discharge subjects collected research data through follow-up management and final termination test process.
  • Vital signs monitoring blood pressure, heart rate, body temperature, respiration rate, level of consciousness
  • SpO 2 measurement 6-step clinical condition evaluation
  • physical examination 12-lead ECG
  • urine pregnancy test Women of childbearing age
  • laboratory analysis serum chemistry, urinalysis, liver/kidney function test, inflammatory marker test
  • adverse drug reactions and drug changes during the treatment period were collected.
  • the NEWS2 clinical index is based on the measurement data of body temperature, blood pressure, heart rate, body temperature, respiratory rate, level of consciousness, and oxygen saturation, whether or not a ventilator is needed, and is scored according to the criteria in [Table 7], and the severity of the patient's symptoms is evaluated by synthesizing them. and is a clinical evaluation index used to evaluate/determine the treatment stage.
  • a clinical evaluation index NEWS2 was evaluated and recorded on days 1 to 15 and on the end date. If the NEWS2 index was 5 or higher, the patient was classified as a moderate or higher risk group, and subgroup analysis and stratification analysis were performed as a high-risk patient.
  • the time required to maintain complete remission for 24 hours with a NEWS2 index of 0 was recorded and analyzed as a NEWS2-based treatment day.
  • OS is a clinical index that is divided into 6 stages according to the criteria in [Table 8] according to the depth of oxygen respiration therapy and is scored. The lower the score, the better the patient's condition is. As a clinical evaluation index for patients with COVID-19 pneumonia, OS was evaluated and recorded on days 1 to 15 and on the end date.
  • CRP as an acute inflammatory factor
  • blood concentrations of IL-6, IL-8, and TNF- ⁇ as inflammatory cytokines were measured/recorded from 1 to 15 days and ending days in patients with COVID-19 pneumonia.
  • mBMDM was isolated/extracted in the same manner as described in Example ⁇ 1-2>, and TDCA was treated with cells inflammatoryally stimulated by LPS, etc., and the effect of TDCA on inhibiting inflammatory signals was confirmed in vitro .
  • mBMDM cells were treated with a control group, 100 ng/ml LPS for 30 minutes, an experimental group treated with 100 ng/ml LPS and After preparing an experimental group treated with 400ng/ml TDCA for 30 minutes at the same time, the cAMP concentration of cells in each experimental group was measured by a chemiluminescent assay.
  • mBMDM was treated with 10 ng/ml LPS and 300 ⁇ M BzATP for 1 hour, and the experimental group treated with 10 ng/ml LPS, 300 ⁇ M BzATP, and 400 ng/ml Transcriptional expression of ASC, NLRP3, Caspase1, and IL-1 ⁇ , which are inflammation-related factors, was measured in the experimental group treated with TDCA for 1 hour at the same time through qRT-PCR experiments, and the reduction rate of how much TDCA expression was reduced compared to the inflammatory situation was analyzed.
  • mBMDM was treated with 10 ng/ml LPS for 3 hours and then treated with 0, 25, 100, and 400 ng/ml of TDCA for 1 hour, respectively.
  • TNF- ⁇ was measured by ELISA and analyzed for comparison.
  • cAMP increased by TDCA inhibits NF- ⁇ B to reduce the expression of inflammatory factors such as ASC, NLRP3, and Caspase1, and as a result, the expression of the inflammatory cytokine TNF- ⁇ It was confirmed that there is an inflammatory signal suppression effect that suppresses.
  • mBMDM was isolated/extracted in the same manner as described in Example ⁇ 1-3>, and expression and interaction changes of GPCR19-P2X7 by TDCA and inhibitory effect of the inflammatory cytokine IL-1 ⁇ were confirmed in the inflammatory cells. did
  • mBMDM in steady state, mBMDM injected with 10 ng/ml LPS and 300 ⁇ M BzATP stimulation simultaneously, and 10 ng/ml LPS + 300 ⁇ M BzATP stimulation state
  • mBMDM treated with 400 ng/ml TDCA the expression and pattern of GPCR19 (green fluorescence signal) and P2X7 (red fluorescence signal) were confirmed through immunofluorescence staining and confocal microscopy.
  • mBMDM activated with LPS+ATP or LPS+BzATP were treated with 0, 25, 100, or 400 ng/ml of TDCA and then IL-1 ⁇ concentration was measured by ELISA.
  • TDCA inhibits the excessive inflammatory response of immune cells and inhibits the production of TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ through the same mechanism as shown in the schematic diagram of FIG. 9 . This suggests that TDCA can prevent and treat the cytokine storm caused by SARS-CoV-2 infection.
  • TDCA TDCA was administered at 2 mg/kg, 1 mg/kg, and 1 mg every 12 hours. /kg was administered three times each, and the treatment effect of reducing mortality and organ failure indicators and reducing cytokine storm was confirmed in the TDCA-treated animal experimental group.
  • TDCA exhibits excellent human safety and tolerability.
  • the NEWS2 clinical index-based treatment days (days required for NEWS2 to maintain 0 for 24 hours) compared to the placebo group of NuSepin-administered patients were analyzed according to age, gender, underlying disease, severity, concomitant medication, etc.
  • the treatment effect was confirmed by calculating the recovery rate ratio with the Cox risk proportional model by reflecting the underlying factors. Specifically, it was confirmed that there was a significant difference in treatment effect by NuSepin when the use of antiviral drugs and patients in the moderate or higher risk group with a NEWS2 score of 5 or higher were variables.
  • NuSepin-treated patients have a treatment cost of 3.7 [95% C.I.
  • the comparison of the Kaplan-Meier survival curve shown in Figure 5 shows the NEWS2-based treatment in the moderate to severe patient group with 5 or more NEWS2.
  • the NuSepin administration group has a treatment effect that shortens the treatment day more than the placebo control group.
  • the median value of NEWS2-based treatment days in the placebo group was 12.5 [95% C.I. 8.0 to 25.0] days
  • NuSepin-treated group had 9.0 [95% C.I. 7.0 ⁇ 12.0] days, which arithmetically shortened the treatment days by 3.5 days, and the treatment cost was 1.9 [95% C.I.
  • the reduction rate of the OS score on the 9th day of the clinical trial was compared with that of the clinical trial start date.
  • the NuSepin administration group showed a higher reduction rate than the placebo, It was confirmed that there was an improvement effect. Specifically, in all patients, the placebo group reduced the OS score by an average of 30.9%, whereas the NuSepin group decreased by 43.9%. And in patients with moderate to severe symptoms of NEWS2 5 or higher, the placebo group decreased by 24.3%, whereas the NuSepin group decreased by 41.7%. It was confirmed that
  • plasma IL-8 levels reached normalization levels (less than 10 mg/ml) in 33% of the placebo group, whereas 55% of the treatment group normalized.
  • IL-8 levels at the end of the trial in the placebo group did not decrease significantly compared to the start date, whereas in the NuSepin group, IL-8 levels decreased from 22.1 ( ⁇ 4.0) at the start of the trial to 12.8 ( ⁇ 2.2) at the end of the trial.
  • Statistical significance calculated by the Wilcoxon Rank sum test was p ⁇ 0.05, confirming that it was a significant decrease by the treatment drug.
  • 33% of the placebo group reached normalization levels (less than 3.3 pg/ml), whereas 60% of the treatment group normalized.
  • Taurodeoxycholic acid (TDCA) or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention treats clinical symptoms caused by SARS-CoV-2 infection, relieves inflammation and Since it exhibits an early cure effect through inflammatory cytokine inhibition, it can be used as an active ingredient in a composition for preventing or treating lower respiratory tract infections, including COVID-19.

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Abstract

본 발명은 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid, TDCA) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 타우로데옥시콜린산의 약학적으로 허용가능한 염을 이용하여 신종코로나바이러스(SARS-CoV-2) 감염에 의해 유발되는 임상적 증상을 치료하고, 염증 완화와 염증성 사이토카인 억제 효능을 통한 조기 완치 효과를 확인하였으므로, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 코로나바이러스감염증-19를 포함한 하기도 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다.

Description

타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물
본 발명은 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 포함한 하기도 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
코로나바이러스감염증-19(COVID-19)는 2019년 처음 그 존재가 확인된 이후 지금까지 2억명 이상의 확진자가 발생하고 4백만명 이상이 사망한 전세계적으로 심각하게 인류의 보건을 위협하는 유행병이다. COVID-19는 신종코로나바이러스(SARS-CoV-2)에 의해 전파되는 중증급성호흡기증후군 질환이다. SARS-CoV-2는 코로나바이러스군(Coronaviridae)에 속하며 사스 코로나바이러스(SARS-CoV, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스), 메르스 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV, 중동호흡기증후군 코로나바이러스)와 유사한 바이러스로 알려져 있다. 아직까지 명확한 감염원인 숙주와 감염경로는 확인되지 않았으나, 박쥐와의 접촉을 통해 감염되었을 가능성이 높고 사람 간 밀접접촉에 의한 전파가 가능하다고 보고되었다.
SARS-CoV-2는 사람과 다양한 동물에 감염될 수 있는 바이러스로서 유전자 크기 27 ~ 32 kb의 RNA 바이러스이다. SARS-CoV-2는 잠복기가 약 2주일 가량이며 발열을 동반한 기침, 호흡곤란, 숨가쁨, 가래 등 호흡기 증상을 주로 보이고, 그 이외에도 두통, 오한, 콧물, 근육통 뿐만 아니라 식욕부진, 메스꺼움, 구토, 복통, 설사 등 소화기 증상도 나타날 수 있다.
또한, SARS-CoV-2는 하기도 감염을 유발한다. 하기도 감염은 기관지염, 폐렴, 폐농증 등의 성대를 중심으로 아래쪽에 위치한 호흡기에 병원체가 침입하여 나타나는 질환으로 폐렴이 대표적인 하기도 감염증이다. 폐렴에 걸리면 폐에 염증이 생겨서 폐의 정상적인 기능에 장애가 생겨 발생하는 폐 증상과 신체 전반에 걸친 전신적인 증상이 나타난다. 폐 증상으로는 호흡기계 자극에 의한 기침, 염증 물질의 배출에 의한 가래, 숨쉬는 기능의 장애에 의한 호흡곤란 등이 나타나며 구역, 구토, 설사와 같은 소화기 증상도 나타날 수 있다. 또한 두통, 피로감, 근육통, 관절통 등의 신체 전반에 걸친 전신 질환이 발생할 수 있다.
SARS-CoV-2는 특징적으로 사이토카인 방출 증후군(Cytokine Release syndrome) 또는 사이토카인 폭풍(Cytokine storm)을 유발하기도 한다. 사이토카인 폭풍은 암, 자가면역질환, 감염성질환 등에 의해 유발될 수 있는 전신 염증 증후군으로 사이토카인의 과다 분비와 면역세포의 과활성화를 특징으로 한다. 이러한 사이토카인 폭풍은 전신적인 면역반응을 유발하여 고열, 림프샘 장애, 간과 비장비대, 혈구감소증, 과페리틴증, 중추신경계 이상등을 초래하며, 치료하지 않을 경우 다발성 기관 장애로 진행될 수 있다. 또한, 전신적인 면역체계의 과민 반응으로 여러 장기의 2차 기능부전을 유발하여 환자를 사망에 이르게 한다(Fajgenbaum et, al. N Engl J Med. 2020 Dec 3;383(23):2255-2273). 현재 COVID-19가 유발하는 사이토카인 폭풍으로 인한 장기부전이 주요 사망 원인으로 밝혀졌으며, 병리학적으로 사이토카인 폭풍을 일으키는 주요 원인은 NLRP3 염증복합체(inflammasome)의 과도 활성화이다. 현재 사이토카인 폭풍을 방지하기 위해서 환자에게 일반적으로 코르티코스테로이드 계열의 스테로이드를 병용 투여하고 있지만 전신적인 면역체계의 과도한 억제 부작용과 대사 부작용으로 인하여 한계가 있는 실정이다.
현재까지 COVID-19 입원환자의 치료를 목적으로 미국 FDA에서 정식으로 승인한 약물은 항바이러스제인 렘데시비르 (Remdesivir)가 대표적이며, 감염으로 인한 전신 염증과 이로 인한 조직손상을 방지하기 위한 약물은 아직까지 제한적이다. 현재는 보전적 관리 요법을 위한 약제로서 덱사메타손과 같은 스테로이드제가 사망위험을 낮추기 위해서 사용되고 있으며, 항염즘 용도의 약물로서는 IL-6 수용체 차단제인 토실리주맙 (Tocilizumab)과 JAK 억제제인 바리시티닙 (Baricitinib)이 긴급승인을 받아 사용되고 있지만, 다양한 부작용이 보고되고 있다. 미국 NIH의 공식 COVID-19 가이드라인인 'COVID-19 Treatment Guidelines Panel'에 의하면 FDA 및 NIH의 전문가 의원들은 부신피질 스테로이드제인 덱사메타손을 비롯한 스테로이드 제제와 토실리주맙, 바리시티닙의 부작용과 위험성에 대해서 언급하여 임상의의 세심한 주의가 필요하다는 한계와 경고를 내리고 있다. 예를들어, 스테로이드 제제에 대해서는 전신대사 부작용 때문에 10일 이상 장기 투여를 금지하고 있으며, 진균 기회 감염 또는 바이러스의 재활성화와 같은 2차 감염의 위험성을 크게 높인다고 경고하고 있다. 토실리주맙의 경우에는 총 5건의 대규모 임상시험을 분석한 결과 치료효능에 대한 평가가 임상시험마다 다른 경우가 많았는데 'REMAP-CAP'과 'RECOVERY trials'의 2건의 임상시험에서만 유의미한 치료효과를 확인하였고, 스테로이드 병용 없이는 효과가 낮은 한계점을 확인하여 사용시 필수적으로 스테로이드와 병용할 것을 조건으로 조건부 긴급승인을 받았으며, 간효소 수치 상승, 호중구 저하증, 혈전증, 2차 감염 상승의 부작용 우려를 경고받았다. 바리시티닙의 경우에는 2건의 대규모 임상실험을 분석한 결과 'ACTT-2 trial'에서는 치료효과를 확인했으나 ‘COV-BARRIER trial’에서는 위중증 환자군에서만 치료효과를 확인하는 등 약효 해석에 대한 한계가 있었기에 스테로이드와 병용할 것을 조건으로 조건부 긴급승인을 받았으며, 심각한 감염과 혈전관련 부작용 위험성이 관찰되어 사용에 경고받고 있다. 따라서 앞으로도 COVID-19에 의한 전신 염증을 유효하게 감소시키면서 부작용이 적은 치료제의 개발은 계속 필요하다. 또한 엔데믹으로 COVID-19의 양상이 바뀌더라도 전신 염증으로 인해 입원하는 환자는 계속해서 발생할 것으로 예상되고, 변이로 인한 재유행의 가능성이 있기에 안전성, 유효성이 담보된 항염증제는 필요할 것이다.
SARS-CoV-2 감염 후 P2X7 수용체의 활성화에 의한 NLRP3 염증복합체의 과도 활성화가 COVID-19 환자 폐렴의 주요 원인이다. P2X7 수용체는 면역세포, 폐 상피세포 및 중추신경계 세포등 전신적으로 분포되어 있으며, SARS-CoV-2를 포함한 병원체의 감염이 일어나면 (1) 바이러스 스파이크 단백질과 바이러스 진입 수용체인 ACE2의 상호작용이 일어나고 (2) 안지오텐신 2의 상승으로 인해 (3) ComC 조절자가 활성화 된다. 상기 일련의 반응에 더하여 바이러스의 증식으로 유도된 세포의 괴사와 이로 인하여 방출된 ATP가 P2X7 수용체를 활성화 시켜 NLRP3 염증복합체의 과도한 활성화를 유발하게 되고 이로 인한 전신염증반응이 환자를 사망에 이르게 하거나 폐섬유화와 같은 심한 후유증을 일으킨다.
P2X7 수용체는 P2Xn 퓨린 수용체군에 속하는 복합체로 구성된 이온 통로 수용체이며, P2X7을 자극하면 칼륨이온의 세포밖 방출과, 칼슘이온 및 나트륨이온의 세포안으로의 빠른 이동이 촉진된다. 감염과 같은 질병 상태에서 세포가 괴사되고 이로인해 세포 외 ATP의 농도가 크게 상승하여 P2X7 수용체가 활성화한다. 활성화된 P2X7은 NLRP3 염증복합체를 활성화하며 이는 칼륨이온의 배출과 세포내 이온 불균형에 의하여 증폭된다. NLRP3 염증복합체가 활성화되된 pro-IL-1β/18이 활성화되어 조직으로 유리되며 사멸된 세포와 더불어 주변조직의 염증 반응을 심화시킨다.
그러나 P2X7에 의한 NLRP3 염증복합체의 활성화 기전에 대한 상세한 이해에도 불구하고 P2X7 길항제가 개발되지 못하고 있다. 한 개체에 있어서 다양한 P2X7의 아형과 사람 간에 다양한 P2X7의 다형성은 P2X7 길항제 개발에 주요한 장벽으로 작용한다.
담즙산(bile acid)은 지질, 유해 대사산물 및 장내 영양소 흡수를 위한 담즙 분비에 있어 중요한 생리적 분자로, 인간의 간의 정맥주위 간세포(perivenous hepatocytes)에서 생산된다. 인체에서 형성되는 1 차 담즙산은 케노데옥시콜린산(chenodeoxycholic acid)과 콜린산(cholic acid)이다. 케노데옥시콜린산은 타우로케노데옥시콜레이트(taurochenodeoxycholate)와 글리코케노데옥시콜레이트(glycochenodeoxycholate)와 같은 총 8 가지 접합된 담즙산을 생성하기 위해 타우린(taurine) 또는 글리신(glycine)과 접합된다. 또한, 1 차 담즙산에 대한 장내 미생물의 영향으로 2 차 담즙산으로 데옥시콜린산(deoxycholic acid), 리토콜린산(lithocholic acid), 우르소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid) 등이 형성된다. 콜린산은 데옥시콜린산으로 전환되고 케노데옥시콜린산은 리토콜린산 또는 우르소데옥시콜린산으로 전환된다. 또한, 데옥시콜린산에 타우린이 접합되어 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid)이 형성된다. 이러한 담즙산은 식이 지질의 흡수와 콜레스테롤의 항상성 (homeostasis) 및 전신 내분비 기능 조절에서 신호 분자로서 중요한 역할을 하고, 다양한 신호 전달 경로를 조절하여 면역계 및 대사계의 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 예컨대, 2차 담즙산으로 매우 소량만이 존재하는 우르소데옥시콜린산은 간 기능 개선이라는 약리적 효과가 입증되어 간 질환 치료제로 응용되고 있다. 일부에서 bile acid의 항염증 작용이 보고 되고 있으나 상세한 작용기전과 특히 염증 복합체 활성 제어에 대한 보고는 극히 제한되어 있다.
이에, 본 발명자들은 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스에 의한 하기도 감염 질환에서 우수한 치료 효과를 보이며 안전하고 부작용이 적은 새로운 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 타우로데옥시콜린산의 염을 이용하여 염증을 유발한 골수 유래 대식세포에서 타우로데옥시콜린산이 GPCR19와 결합하여 GPCR19의 발현을 증가시키고 P2X7의 발현을 감소시킬 뿐만 아니라, GPCR19-P2X7의 복합체 형성을 증가시켜 P2X7의 활성화를 억제하는 것을 확인하였다. GPCR19은 P2X7 수용체와 케라틴 세포, 소교세포 그리고 대식세포 등에서 세포막에 상호간에 결합된 복합체로 존재하며, 염증이 유도된 세포에서 GPCR19의 발현은 현격히 줄고 P2X7 수용체의 발현은 현격히 높아져서 염증 반응이 증폭된다. 이러한 염증 조직에서 타우로데옥시콜린산이 GPCR19와 결합하여 P2X7의 활성화를 억제함으로써 NLRP3 염증복합체의 활성화가 억제되어 주요한 염증 반응들이 차단되는 것을 확인하였다. 아울러, 타우로데옥시콜린산의 염을 이용하여 패혈증 동물모델에서 염증이 완화되는 것을 확인하고, COVID-19 환자에서 임상적 증상이 완화되고, 치료기간이 단축되는 것을 확인하였다. 이를 통해 타우로데옥시콜린산 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 COVID-19를 포함한 하기도 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
현재까지 COVID-19 치료를 위한 효과가 우수한 특이적인 항바이러스제는 개발되지 못하고 있다. 또한 바이러스의 세포내 침투력을 중화시키는 항체 치료제는 경증 환자에서만 제한적인 유효성을 보이고 있다. 그러나 SARS-CoV-2 감염후 P2X7 수용체의 활성화에 의한 NLRP3 염증복합체의 과도 활성화가 중등증 및 중증 COVID-19 환자 폐렴의 주요 원인으로 주목 받고 있으나, 다양한 P2X7의 다형성으로 인해 P2X7 길항제 개발에 어려움이 있다.
상기 문제를 해결하기 위해 본 발명에서는 지금까지 알려져 있지 않은 GPCR19 및 P2X7의 상호작용 기전을 규명하고, 이들의 상호작용을 조절하여 NLRP3 염증 복합체를 억제함으로써 COVID-19에 의한 폐렴을 치료할 수 있는 근본적인 치료법을 제공하고자 하였다.
이에, 본 발명의 목적은 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 하기도 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 하기도 감염 질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기도 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 하기도 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 하기도 감염 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 하기도 감염 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 하기도 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명자들은 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid)의 염이 염증을 유발한 골수 유래 대식세포에서 GPCR19 및 P2X7의 상호작용을 조절하여 NLRP3 염증 복합체의 활성화를 억제함으로써 과도한 염증 반응을 저해하는 것을 확인하였다. 또한, 타우로데옥시콜린산의 염이 패혈증 동물모델에서 염증 반응을 완화하고, 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 및 이로 인한 폐렴 환자들에게 유발되는 임상적 증상을 개선하며, 회복기간을 단축하는 것을 확인하였으므로, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 COVID-19를 포함한 하기도 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 타우로데옥시콜산나트륨(sodium taurodeoxycholate, 이하 "TDCA"라 함)가 염증복합체 활성의 개시단계를 제어함을 보여주고 있다. 체외 (in vitro) 마우스 골수 유래 대식세포 (mouse bone marrow-derived macrophages, mBMDM) 모델에서 지질 다당체인 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 처리하여 염증개시 신호 유도 후 TDCA에 의한 cAMP 변화 (도 1a), ASC, NLRP3, Caspase1, IL-1β 전사의 억제 (도 1b), TNF-α 생성의 억제 (도 1c)를 나타낸 도이다.
도 2a 및 도 2b는 TDCA가 자신의 수용체인 GPCR19와 P2X7R의 발현을 조절 할 뿐만 아니라 두 수용체간의 물리적 결합을 조절하고 있음을 보여주는 도이다. in vitro mBMDM 모델에서 LPS와 ATP 또는 BzATP를 처리하여 염증활성 신호 유도 후 TDCA에 의한 GPCR19, P2X7R 및 이들의 상호결합 변화 (도 2a), P2X7R의 작용제인 BzATP 처리후 TDCA가 IL-1β생성을 억제함을 (도 2b) 나타낸 도이다.
도 3a는 개에서 패혈증 모델 제작 및 TDCA 투여 방법을 모식화한 도이다.
도 3b 내지 도 3g는 개의 패혈증 모델에서 TDCA 투여에 따른 생존율 (도 3b), 혈압 (도 3c), 혈액요소질소 (Blood urea nitrogen; BUN, 도 3d), 크레아티닌(creatinine, 도 3e), IL-1β (도 3f), IL-8 (도 3g) 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 COVID-19 폐렴 환자에서 TDCA를 유효성분으로 한 주사제제인 NuSepin 0.2mg/kg의 치료 효율을 위약과 비교한 도이다. NEWS2 임상 평가에 영향을 미치는 여러 변수를 반영하여 위약대비 NuSepin 0.2 mg/kg의 치료효과 비율을 Cox 위험 비례 모델로 분석하였다. 이때 항바이러스 치료제 투여군과 내원시 중등 또는 중증환자에서 위약 대비 NuSepin 0.2 mg/kg의 통계적으로 의미있는 치료효과를 나타내었다.
도 5는 COVID-19 폐렴 환자에서 NuSepin 0.2 mg/kg 정맥 주사제의 위약대비 치료일 단축 효과를 나타낸 도이다. 임상 시작일에 NEWS2가 5이상인 중등증 이상의 환자들에서 NuSepin 0.2 mg/kg 투약군과 위약군간에 NEWS2 기반의 임상 평가 지수로 판단한 치료 효율을 Kaplan-Meier survival curve로 비교분석하였고, 또한 Cox 위험 비례 모델로 회복비율 (recovery rate, RR)을 계산하였다. 도 5의 왼쪽 그래프는 intention-to-treatment (ITT) 분석군을 대상으로 치료기간 동안 회복된 환자의 비율을 나타낸 그래프이며, 도 5의 오른쪽 그래프는 임상 시험기간에 임상 프로토콜 위배가 없는 환자만으로 구성된 per-protocol (PP) 분석군에 대한 치료기간 동안 회복된 환자의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 COVID-19 폐렴 환자에서 NuSepin 0.2 mg/kg 또는 위약의 정맥 주사에 의한 산소호흡기 의존도 감소를 나타낸 도이다. 입원시 NEWS2 >5 이상인 중등 및 증증 환자에서 NuSepin 0.2 mg/kg 투약군과 위약군 간의 보조적 산소 치료 요법이 필요하지 않은 환자의 누적 분율을 Kaplan-Meier survival curve과 Cox 위험 비례 모델로 분석한 도이다.
도 7은 COVID-19 폐렴 환자에서 NuSepin 0.2 mg/kg에 의한 보조 산소 호흡기의 종류에 따라서 임상 상태의 호전도 향상 효과를 나타낸 도이다. 전체 시험 환자군과 임상 시험 시작일 기준 NEWS2 임상점수가 5이상인 중등증 이상의 환자에서 임상 9일차에 NuSepin 0.2 mg/kg을 투약한 환자와 위약을 투약한 환자 간의 산소 호흡기 의존도의 호전도를 비교하기 위해 호흡기 종류에 따른 임상 지표인 ordinal scale의 시작일 (baseline) 대비 감소율을 비교한 도이다.
도 8은 COVID-19 폐렴 환자에서 NuSepin 0.2 mg/kg에 의한 혈액내 염증지표인 CRP와 사이토카인의 감소효과를 나타낸 도이다. COVID-19 폐렴 임상 시험에서 NuSepin 0.2 mg/kg 투약군 및 위약군의 임상 시작일 당시 (day 1)의 혈중 CRP, IL-8, TNF-α, IL-6와 임상 4일차의 CRP 또는 임상 종료일 (EoS)의 혈중 사이토카인의 농도를 비교한 도이다. 또한 관찰 시점에서 CRP 또는 사이토카인 농도가 정상 범위인 환자의 분율을 위약군과 NuSepin 0.2 mg/kg군과 비교하였다.
도 9는 TDCA가 과도한 염증반응을 억제하는 기전을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서 용어 "예방"이란 본 발명의 조성물 투여로 하기도 감염 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 용어 "치료"란 본 발명의 조성물 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명은 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 하기도 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 하기도 감염 질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 하기도 감염 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 하기도 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명에서, 상기 타우로데옥시콜린산은 동물의 사체, 예컨대 소, 돼지, 양, 개, 염소 또는 토끼와 같은 동물로부터 분리한 것, 시판되는 것, 합성한 것 모두 무방하게 사용할 수 있다.
상기 타우로데옥시콜린산은 담즙산의 일종으로, 타우린이 접합된 데옥시콜린산(taurine-conjugated deoxycholic acid) 형태이며, 하기 [화학식 1]로 기재되는 화학 구조를 갖고, 보다 구체적으로 하기 [화학식 2]로 기재되는 화학 구조를 갖는다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022007007-appb-img-000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2022007007-appb-img-000002
본 발명에서, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 염증성 사이토카인, 예컨대 TNF-α, IL-1β, IL-8 또는 IL-6의 생성을 억제할 수 있다.
또한, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 GPCR19 작용제로 도 9의 모식도와 같이 cAMP를 증가시켜 NF-κB의 활성화를 억제하고, P2X7의 기능을 억제하여 NLRP3 염증 복합체의 활성화를 억제하여 상기 염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있다.
본 발명에서, 상기 하기도 감염 질환은 코로나바이러스 감염으로 유발되는 발열, 기침, 가래, 몸살, 인후통, 설사, 결막염, 두통, 피부발진, 호흡곤란, 급성기관지염, 폐렴, 폐화농증, 신부전, 신장 기능 장애, 패혈성 쇼크, 패혈증 및 사이토카인 방출 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 증상을 갖는 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 코로나바이러스는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV) 및 신종코로나바이러스(SARS-CoV-2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 신종코로나바이러스(SARS-CoV-2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 타우로데옥시콜린산뿐만 아니라, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체, 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.
본 발명의 타우로데옥시콜린산은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 타우로데옥시콜린산을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하고, 보다 구체적으로 나트륨염을 제조하는 것이 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.01 mg 내지 100 mg, 보다 구체적으로 0.1 mg 내지 15 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 골수 유래 대식세포의 제작 및 염증조절복합체 자극을 통한 염증성 사이토카인 분석
<1-1> 골수 유래 대식세포의 제작
골수 유래 대식세포는 하기와 같은 방법으로 제작하였다.
구체적으로, C57BL/6N 마우스에서 추출한 골수를 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 스트렙토마이신, 55 μM 2-머캅토에탄올, 그리고 10 ng/ml 재조합 쥐 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF)를 첨가한 RPMI 배지에서 7일간 분화하였다. 7일차에 유세포분석기를 이용하여 분화된 대식세포의 비율을 측정한 결과 94~96%로 측정되었다.
<1-2> 염증개시(inflammation priming) 신호로부터 유래한 염증성 사이토카인 IL-1β, TNF-α의 생성 억제능 분석
상기 실시예 <1-1>의 골수 유래 대식세포를 배양접시에 다양한 밀도로 배양한 후 수집하였다(4 x 104, 5 x 105, 1 x 106 cells/well, 각각 96-well, 24-well, 그리고 12-well 배양접시). 다음날, 염증개시 신호 관련 인자로 NLRP3 염증복합체 구성요소인 ASC, NLRP3, Caspase1, 염증개시 신호로부터 유래한 염증성 사이토카인 IL-1β의 평가를 위해서 골수 유래 대식세포에 살모넬라균(Salmonella enterica serotype enteritidis)에서 유래한 10 ng/ml LPS와 함께 300 μM BzATP, 또는 300μM BzATP 및 400 ng/ml의 타우로데옥시콜산나트륨(sodium taurodeoxycholate, 이하, 'TDCA'로 명명함)를 1시간 처리하였다. 시간이 종료된 뒤 세포를 수집하여 -80℃에 보관한 뒤 qRT-PCR 분석을 실시하였다.
또한, 염증성 사이토카인 TNF-α의 평가를 위해서 골수 유래 대식세포에 10 ng/ml LPS를 3시간 동안 처리하여 염증개시 신호를 활성화한 뒤, 다양한 농도(0. 25. 100, 400 ng/ml)의 TDCA를 추가하여 1시간 동안 배양하였다. 시간이 종료된 뒤 상층액을 수집하여 -80℃에 보관한 뒤 ELISA 분석을 실시하였다.
<1-3> 염증활성(inflammation activation) 신호로부터 유래한 염증성 사이토카인 IL-1β의 생성 억제능 분석
상기 실시예 <1-1>의 골수 유래 대식세포를 배양접시에서 다양한 밀도로 배양한 후 수집하였다(4 x 104, 5 x 105, 1 x 106 cells/well, 각각 96-well, 24-well, 그리고 12-well 배양접시). 다음날, 염증활성 신호 관련 인자로 TGR5 및 P2X7, 상기 신호로부터 유래한 염증성 사이토카인 IL-1β의 평가를 위하여 골수 유래 대식세포에 10 ng/ml LPS 및 300 μM BzATP를 3시간 동안 처리한 뒤 지정된 서로 다른 농도(0, 25, 100, 400 ng/ml)의 TDCA를 1시간 처리하였다. 시간이 종료된 뒤 상층액을 수집하여 -80℃에 보관한 뒤 ELISA 분석을 실시하였다.
<실시예 2> 패혈증 동물모델에서 염증성 사이토카인 분석
<2-1> 패혈증 동물모델 제작
각 실험군당 체중 30-35 kg의 Mongrel dog로 구성된 2개의 처리군에 도 3a에 도시된 프로토콜에 따라 LPS 0.5 mg/kg/ml를 정맥 투여하여 패혈증을 유발하고, 이후 TDCA 2 mg/kg/2 ml (위약군은 PBS를 투약)를 1시간 후에 정맥 주사하였고, TDCA 1 mg/kg/2 ml를 12시간 및 24시간 후에 정맥 투여하였다. LPS 투여 후 혈압을 1시간마다 모니터링하고, 0, 1, 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48h 시점에서 채혈을 하고 48시간에 동물들을 희생하여 실험을 완료하였다.
<2-2> 생존율 분석
상기 실시예 <2-1>의 패혈증을 유발한 2개의 처리군에서 48시간 동안 사망한 비글견 수를 확인하여 생존율을 확인하였다.
<2-3> 혈압 및 신장기능 분석
상기 실시예 <2-1>의 패혈증을 유발한 2개의 처리군에서 48시간 동안 시간별로 혈압을 측정하였다.
또한, 신장기능 검사로 혈액요소질소(Blood urea nitrogen; BUN) 및 크레아티닌(ceratinine) 검사를 실시하였다. 구체적으로, 상기 실시예 <2-1>의 패혈증을 유발한 2개의 처리군에서 48시간 동안 시간별로 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후, 혈청 내 BUN과 크레아틴 농도를 측정하였다.
<2-4> 염증성 사이토카인 IL-1β 및 IL-8 분석
상기 실시예 <2-1>의 패혈증을 유발한 2개의 처리군에서 48시간 동안 시간별로 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후, 혈청 내 염증성 사이토카인 IL-1β를 측정하였다.
<실시예 3> TDCA의 인체 안전성 확인-임상 1상시험
<3-1> 임상시험 대상자의 선정
국내 건강한 성인 남성 지원자 40명을 임상시험 대상자로 하였다. 임상시험은 서울대학교 병원(서울, 한국) 주체 하에 실시하였으며 [표 1]의 선정기준을 모두 만족하는 사람을 대상으로 하였다.
순서 임상 선정 기준
1 스크리닝 방문 시 연령이 만 19 세 이상 45 세 이하인 건강한 남성
2 스크리닝 방문 시 BMI 측정 결과가 18.0 kg/m2 이상 - 27.0 이하 kg/m2 에 있는 자
3 병력 조사, 신체검진, 활력징후, 심전도 (ECG) 검사 및 적절한 임상실험실 검사 결과 임상적으로 건강한 것으로 확인된 자 (단, 정상 범위를 벗어날지라도 연구자 판단에 따라 참여할 수 있음.)
4 본 임상시험에 참여할 것을 자발적으로 결정하고 임상시험 준수사항을 반드시 이행할 것을 서면 동의한 자
단, 하기 [표 2]에 나타낸 항목에 해당되는 피험자들은 제외하였다.
순서 임상 제외 기준
1 Taurodeoxycholate 성분을 포함하는 약물이나 일반 약물 (아스피린, 항생제 등)에 대한 과민반응 또는 임상적으로 유의한 과민반응의 과거력이 있는 자
2 첫 투약일 전 2 주 이내에 급성 감염성 질환으로 의심되는 임상증상을 보였거나, 스크리닝 시 측정된 체온(고막)이 38.0℃ 이상의 수치를 보인 자
3 간, 신장, 소화기계, 호흡기계, 근골격계, 내분비계, 신경정신계,혈액·종양계, 심혈관계 등에 해당하는 임상적으로 유의한 질환이 있거나 과거력이 있는 자
4 임상시험용의약품의 흡수에 영향을 줄 수 있는 위장관계 질환 (예: 크론씨병, 궤양 등)이나 수술 (단, 단순 맹장수술이나 탈장수술은 제외)의 과거력이 있는 자
5 약물남용의 과거력이 있거나 소변 약물 스크리닝 검사에서 오남용 우려 약물에 대하여 양성반응을 보인 자
6 스크리닝 방문 시 3 분 이상 휴식 후 좌위에서 측정한 다음과 같은 혈압을 가진 자
A. 수축기 혈압(SBP): < 90 mmHg 혹은 > 150 mmHg
B. 이완기 혈압(DBP): < 50 mmHg 혹은 > 90 mmHg
7 첫 투약일 전 6 개월 이내에 다른 임상시험 또는 생동성시험에 참여하여 약물을 투여 받은 자 (기간은 이전 시험 마지막 투약일 기준으로 판단한다.)
8 첫 투약일 전 2 개월 이내에 전혈 헌혈 또는 1 개월 이내에 성분 헌혈을 하였거나, 1 개월 이내에 수혈을 받은 자
9 스크리닝 전 1 개월 이내에 바르비탈류 약물 등의 약물대사효소 유도 및 억제 약물을 복용 한 자
10 첫 투약 3 일 이내에 그레이프프루트(자몽)/카페인 함유 음식물을 섭취한 자 및 입원 3 일 전부터 퇴원일까지 그레이프프루트(자몽) 함유 음식물의 섭취를 금할 수 없는 자
11 첫 투약일 전 2 주 이내에 전문의약품 또는 한약을 복용하였거나, 1 주 이내에 일반의약품 (OTC)을 복용한 자 (단, 시험자의 판단에 따라 다른 조건이 합당한 경우에 임상시험에 참여할 수 있다.)
12 카페인 과다 섭취자, 알코올 과다 섭취자 또는 과다 흡연자 (카페인 >5 units/일, 알코올 > 21 units/주 (1 unit = 순수 알코올로써 10 mL),담배 > 10 개비/일)
13 특이한 식습관 (예: 지속적인 채식 위주의 식습관 등)을 가졌거나 본 임상시험에서 제공하는 식사를 섭취할 수 없는 자
14 기타 시험자가 임상시험대상자로 부적합하다고 판정한 자
또한 임상시험 진행 도중, [표 3]의 기준에 해당하는 피험자는 중도탈락 하였다.
순서 중도 탈락 기준
1 시험대상자가 임상시험 중 임상시험용의약품의 투여 중단을 요구하거나, 시험참여 동의를 철회하는 경우
2 시험대상자가 임상시험 중 시험약의 안전성이나 약동학을 평가하는데 영향을 줄 것으로 예상되는 약물을 투여한 경우
3 중대한 이상반응/약물이상반응이 발생한 경우
4 시험대상자의 약동학/안전성 검사를 위한 채혈의 수행이 불가능한 경우
5 임상시험 중 중대한 계획서 위반 사항이 새롭게 발견된 경우
6 의뢰자 혹은 식품의약품안전처의 중단 요청이 있는 경우
7 기타 임상시험책임자/담당자가 시험을 중지하여야 한다고 판단한 경우
<3-2> 임상 1상 시험 진행 및 관리
임상시험 대상자에서 약물 안전성/내약성(tolerability) 및 약물 동력학(pharmacokinetic, PK) 평가하기 위해 무작위배정, 이중 맹검, 표준치료기반 위약대조군 시험군을 배정하였다. 또한 치료제로서는 TDCA가 함유된 주사형 임상제제인 NuSepin을 사용하였다.
[시험 방법]
건강한 남성 자원자에 한하여 임상시험용의약품 첫 번째 투약일 (1d)로부터 4주 이내 (-28d ~ -4d)에 스크리닝 검사를 시행하여, 본 임상시험에 적합하다고 판단되는 시험대상자를 선정하였다. 선정된 시험대상자는 임상시험용의약품 투약 4 일 전 오후에 서울대학교병원 임상시험센터에 입원하여, NuSepin 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6 mg/kg 용량 투여 또는 위약군 중 하나에 무작위 배정한 후 TDCA 베이스라인 확인을 위한 약동학 채혈을 3일 간 (-3d ~ -1d) 시행하였다. 그리고 임상시험용의약품 투약일 (1d) 오전에 약동학 분석용 채혈, 안전성 평가 등 정해진 검사를 시행 후 공복상태에서 시험약 또는 위약을 정맥투여 하였다. 시험대상자들은 정해진 일정에 따라 임상시험을 수행하고 투약 1일 뒤 (2d)에 퇴원하였으며, 모든 임상시험일정을 마친 대상자는 4d ~ 6d 사이에 종료방문 (post-study visit) 검사를 수행하였다.
[평가 방법]
● 안전성 및 내약성 평가
- 자·타각 증상 등 이상반응 모니터링
- 신체검사
- 활력징후
- 심전도 (12-Lead ECG) 검사
- 임상실험실 검사
- 국소 독성 평가
- 연속 ECG, SpO2 모니터링
● 약동학적 평가
임상시험용의약품 정맥투여 후 최대 24 시간까지 HY209 의 약동학적 평가를 위한 채혈이 이루어졌다;
- 채혈 시각: 투약 전 -3d 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, -2d 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, -1d 0 시간, 1 시간,2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 1d 투약 직전 (0h), 투약 시작 후 15 분,30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간 (2d)
- 평가 변수: AUCinf, AUClast, Cmax, Tmax, t1/2
- 비임상 자료를 통해 산출된 추정치를 통해 산출된 약물의 반감기는 약 1 시간 정도로 추정하였다.
[자료 분석]
● 안전성 및 내약성 분석
이상반응은 중증도 및 임상시험용의약품과의 인과관계에 근거하여 용량군 및 치료군 별로 기술하고, 이상반응 발생 시험대상자 수의 빈도, 백분율을 비교하여 평가하였다. 활력징후, 심전도 검사, 임상실험실검사, 신체검사, 자·타각 증상 등 이상반응 모니터링, 연속 ECG, SpO2 모니터링 등을 종합적으로 검토하여 임상적으로 유의하다고 판단된 항목에 한하여 필요에 따라서 통계분석을 진행하였다.
● 약동학 평가
본 임상시험을 완료한 대상자들을 대상으로 적절하고 검증된 약동학 소프트웨어(예: Phoenix WinNonlin® (Version 8.0 이상, Pharsight, CA, USA)를 사용하여 비구획 분석 방법으로 약동학 변수를 구하고, 용량군 및 치료군 별로 기술통계량 (평균, 표준편차 등)을 구하였다.
<실시예 4> TDCA의 코로나바이러스감염증-19 (COVID-19) 환자 대상 치료제로서 약효 확인-임상 2상시험
<4-1> 임상 2상 시험 대상자의 선정
임상시험 대상자로는 유럽 루마니아에서 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 감염자 중 [표 4]의 기준을 모두 만족하는 사람을 대상으로 하였다.
순서 환자 선정 기준
1 18세 이상, 80세 미만의 남성 또는 여성
2 무작위 배정 전, 144시간 이내 SARS-CoV-2 감염이 실험실 PCR검사에 의해 처음으로 확진이 된 경우
3 방사선 투과 이미지(chest x-ray, CT scan) 그리고 다음 중 3가지의 임상적 증상이 발생한 경우(새로 발생한 기침, 열, 피로, 객담(하루종일), 빈호흡, 호흡곤란, 늑막성 흉통) 그리고 CRP>10mg/L 이상인 경우
4 환자의 혈중 백혈구 수>4.0 x 109/L, 림프구 수>0.7 x 109/L 인 경우
5 스크리닝 단계에서 실내 SpO2≤94% 또는 Pa02/FI02 ratio<300mmHg 인 경우
6 임상시험에 참여하는 것이 적합하다고 판단하고, 자유의사에 의해 임상시험에 참여하겠다는 서면동의서를 작성한 사람
7 가임기 여성의 경우, 의학적으로 허용되는 효과적인 피임법을 임상시험 마지막 투약 90일 이후까지 지속할 것에 동의한 사람
단, 하기 [표 5]에 나타낸 항목에 해당되는 피험자들은 제외하였다.
순서 환자 제외 기준
1 ALT(Alanine Transaminase) 또는 AST(Aspartate Transaminase)>5xULN 인 경우
2 eGFR<30 ml/min, 혈액 투석 또는 혈액 여과를 받아야 하는 신기능 감소를 보이는 경우
3 임부 또는 수유부
4 다발성 장기부전의 징후가 보이는 경우
5 임상시험 참여 72시간 전, 스테로이드 투약을 받은 경우
6 COVID-19와 관련된 임상시험에 참여한 경우
7 임상시험에 참여하는 것이 환자에게 최선의 선택이 아니거나, 임상 프로토콜을 안전하게 수행할 수 없는 상황이라고 의사가 판단한 경우
또한 임상시험 진행 도중, [표 6]의 기준에 해당하는 피험자는 중도탈락 하였다.
순서 환자의 중도 탈락 기준
1 Lab abnormalities를 포함하여 임상시험자 판단에 따른 심각한 부작용이 발생한 경우
2 환자가 임상시험을 제대로 준수하지 않는 경우
3 프로토콜에서 심각한 일탈이 발견된 경우
4 금지된 약물의 치료가 필요한 경우(Steroid)
5 중간에 임신을 한 경우
6 어떠한 이유에서라도 연구책임자가 환자의 임상시험 진행 중단을 결정한 경우
<4-2> 임상시험 진행 및 관리
모집된 임상시험 환자를 대상으로 치료제의 효능을 평가하기 위해 무작위배정, 이중 맹검, 표준치료기반 위약대조군 시험군을 배정하여 임상시험을 진행하였다. 또한 치료제로서는 TDCA를 유효성분으로 함유하는 치료제인 NuSepin을 사용하였다.
[진행단계]
환자 스크리닝 (Day -5 ~ 0)
임상시험 참가를 원하는 환자는 환자 정보 시트 및 사전 동의양식에 서명을 한 뒤, 선별 검사를 수행하였다. 선별번호는 각 환자에게 부여되며, 인구 통계학적 정보, 환자 병력, 과거 및 현재 약물 복용력, 현재 병력, 활력 징후(혈압, 심박수, 체온, 호흡수, 의식 수준), 신체 검사, 심전도, 실험실 검사, COVID-19 PCR test, 동맥혈 가스 분석 및 폐 침윤 평가를 위한 흉부 x-ray 또는 CT 촬영을 수행하였다. 가임기 여성의 경우, 혈청 임신검사를 수행하였다.
환자 기준 설정 (Day 1)
활력 징후(혈압, 심박수, 체온, 호흡수, 의식 수준)의 모니터링 후 경피적 산소포화도 (SpO2), 신체 검사, 임상시험 포함/제외 기준의 평가를 수행하였다. 환자의 임상적 상태는 6단계 척도로 평가하였다.
환자는 NuSepin 0.1, 0.2 mg/kg 또는 항바이러스제를 이용한 표준치료를 병행하는 위약군 중 하나에 무작위 배정하였다. 이후 약물 투여는 1일 차부터 14일 또는 퇴원일까지 1일 2회 정맥 투약하였다. 투약기간 동안, 약물 이상 반응(AE) 및 환자가 투약받는 약물의 모든 내용을 수집하고 기록하여 관리하였다.
임상평가 진행 (Day 2 ~ Day 14)
시험 기준 일로부터 2 ~ 14일 동안 활력징후(혈압, 심박수, 체온, 호흡 수, 의식 수준), SpO2, 신체검사를 정기적으로 모니터링 하며, 환자의 임상적 상태를 평가하고 실험실 검사(혈청 화학 분석, 혈액 검사, 소변 검사, 간/신장 기능 검사, 염증 파라미터), 12-lead ECG, 약물 이상반응 및 환자 투여 약물의 변화를 수집하고 기록하였다. 연구자 및 임상의사의 판단에 따라 참여자의 조기퇴원 여부를 결정하고, 조기퇴원 대상자는 후속관리와 최종 종료 시험과정을 거쳐 연구 데이터를 수집하였다.
후속관리
투약실험 14일 이후 임상시험용 의약품 투약 종료 후 활력 징후 모니터링(혈압, 심박수, 체온, 호흡 수 , 의식수준), SpO2 측정, 6단계 임상상태 평가, 신체검사, 12-lead ECG, 소변 임신 테스트(가임기 여성), 실험실 분석(혈청 화학, 소변검사, 간/신장 기능 검사, 염증 지표 검사), 그리고 약물 이상반응과 투약기간 중 약물 변화에 대한 수집을 종료하였다.
임상시험 종료
최종적으로 28일차에 임상 추적 방문(Clinical follow-up visit), 신체검사, SpO2 측정, 실험실 분석(혈청 화학, 혈액 검사, 소변 검사, 간/신장 기능 검사, 염증 지표 검사)를 수행하여 약물이상반응, 병용 약물의 변화 및 생존 상태에 대한 정보를 수집하였다.
[임상 평가 지표]
1. NEWS2 (National Early Warning Score 2)
NEWS2 임상 지수는 산소호흡기 필요 유무, 체온, 혈압, 심박수, 체온, 호흡 수, 의식수준, 산소포화도 측정데이터를 바탕으로 [표 7]의 기준에 의거해 점수화하고 이를 종합하여 환자의 병증 정도를 평가하고 치료 단계를 평가/결정하는데 사용되는 임상 평가지수이다. 임상 평가 지표로서 NEWS2를 1 ~ 15일 및 종료일에 평가하여 기록하였다. NEWS2 지수가 5 이상이면 중등증 이상의 위험군 환자로 분류되어 고위험군의 환자로서 하위집단 분석 (subgroup analysis) 및 층화분석 (Stratification Analysis)을 진행하였다. 그리고 NEWS2 지수가 0점인 완전관해 상태를 24시간 유지하는 데까지 소요된 시간을 NEWS2 기반 치료일로써 기록하고 분석하였다.
physiological parameter NEWS2 Score
3 2 1 0 1 2 3
respiration rate (per minute) ≤8 9-11 12-20 21-24 ≥25
SpO2 Scale 1(%) ≤91 92-93 94-95 ≥96
SpO2 Scale 2(%) ≤83 84-85 86-87 88-92
≥93 on air		 93-94 on oxygen 95-96 on oxygen ≥97 on oxygen
Air or oxygen? oxygen Air
Systolic blood pressure(mmHg) ≤90 91-100 101-110 111-219 ≥220
Pulse(per minute) ≤40 41-50 51-90 91-110 111-130 ≥131
Consciousness Alert CVPU
Temperature(℃) ≤35.0 35.1-36.0 36.1-38.0 38.1-39.0 ≥39.1
2. OS (Ordinal scale)
OS는 산소호흡 치료요법의 심화도에 따라 [표 8]의 기준에 의거해 6단계로 나뉘어 점수화하는 임상지표이며 점수가 낮아질수록 환자의 상태가 호전되어 감을 의미한다. COVID-19 폐렴환자의 임상 평가 지표로서 OS를 1 ~ 15일 및 종료일에 평가하여 기록하였다.
Score Criteria
1 Complete Clinical Remission
2 Hospitalization, not requiring supplemental oxygen
3 Hospitalization, requiring supplemental oxygen (such as Low Flow Nasal Canula or facial mask)
4 ICU/Hospitalization, requiring Non-invasive ventilation/High Flow Nasal Canula therapy
5 ICU, requiring Extracorporeal Membrane Oxygenation and/or invasive mechanical ventilation
6 Death
3. 산소호흡 치료 종료일
COVID-19 폐렴환자의 호흡기 기능회복의 지표로서 최종적으로 산소호흡 치료를 종료하는 일을 1 ~ 15일 및 종료일에 걸쳐서 관찰/기록하였다.
4. CRP, IL-6, IL-8, TNF-α
COVID-19 폐렴환자에서 급성염증 인자로서 CRP를, 염증성 사이토카인으로서 IL-6, IL-8, TNF-α의 혈중 농도를 1 ~ 15일 및 종료일에 걸쳐서 측정/기록하였다.
<실험예 1> in vitro mBMDM 모델에서 TDCA의 염증 관련 인자 억제능 확인
염증성 신호로 인한 사이토카인 방출증후군을 TDCA가 억제할 수 있는지를 확인하기 위해 in vitro mBMDM 모델을 이용하여 실험을 진행하였다.
<1-1> 염증개시 신호에서 TDCA의 염증성 사이토카인 IL-1β 및 TNF-α 억제능 확인
상기 실시예 <1-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 mBMDM을 분리/추출하고 LPS 등으로 염증자극을 일으킨 세포에 TDCA를 처리하여 in vitro 상에서 TDCA에 의한 염증신호 억제효능을 확인하였다.
구체적으로 NF-κB pathway를 통한 염증인자 관련 유전자 전사를 억제하는 세포 내 cAMP의 농도 조절 효과를 확인하기 위해 mBMDM 세포에서 대조군, 100 ng/ml LPS을 30분 처리한 실험군, 100 ng/ml LPS와 400ng/ml TDCA를 동시에 30분 처리한 실험군을 준비한 후에 각 실험군 세포의 cAMP 농도를 화학발광 (chemiluminescent) 분석법으로 측정하였다.
그 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이 LPS에 의한 염증신호에 의해 감소된 cAMP가 TDCA에 의해 회복되는 것을 확인하였다.
이어서 염증 상황에서 TDCA에 의한 염증 관련 인자의 전사 억제 효능을 확인하기 위해 mBMDM에 10 ng/ml LPS와 300 μM BzATP를 1시간 처리한 실험군과 10 ng/ml LPS, 300 μM BzATP, 400 ng/ml TDCA를 동시에 1시간 처리한 실험군에서 염증관련 인자인 ASC, NLRP3, Caspase1, IL-1β의 전사 발현을 qRT-PCR 실험을 통해 측정하여 염증 상황 대비 TDCA가 얼마나 발현을 감소시키는지 감소율을 분석하였다.
그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이 LPS+BzATP에 의한 염증 상황에서 TDCA 처리에 의해서 세포내 ASC, NLRP3, Caspase1, IL-1β의 전사 발현이 모두 감소함을 확인하였다.
또한 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현에 미치는 TDCA의 영향을 확인하기 위해 mBMDM에 10 ng/ml LPS를 3시간 동안 처리한 뒤 각기 0, 25, 100, 400 ng/ml의 TDCA를 1시간 처리한 실험군에서 TNF-α를 ELISA를 통해 측정하여 비교 분석 하였다.
그 결과, 도 1c에 나타난 바와 같이, LPS에 의해 생성된 TNF-α가 TDCA의 처리에 의해 감소되는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 도 9에 나타낸 모식도와 같이 TDCA에 의해 증가된 cAMP가 NF-κB를 억제하여 ASC, NLRP3, Caspase1와 같은 염증인자의 발현을 감소시키며, 결과적으로 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현을 억제하는 염증신호 억제 효과가 있음을 확인하였다.
<1-2> 염증활성 신호에서 TDCA의 염증성 사이토카인 IL-1β 억제능 확인
상기 실시예 <1-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 mBMDM을 분리/추출하고 염증자극을 일으킨 세포에서 TDCA에 의한 GPCR19-P2X7의 발현 및 상호작용 변화와 염증성 사이토카인 IL-1β 억제효능을 확인하였다.
구체적으로 TDCA에 의한 GPCR19, P2X7의 발현 및 상호작용 변화를 관찰하기 위해 정상상태의 mBMDM, 10 ng/ml LPS와 300 μM BzATP 자극을 동시에 주입한 mBMDM, 10 ng/ml LPS + 300 μM BzATP 자극 상태에서 400 ng/ml TDCA를 처리한 mBMDM에 면역형광염색과 공초점현미경 통해 GPCR19(녹색형광신호)와 P2X7(적색형광신호)의 발현과 패턴을 확인하였다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이 염증신호가 활성화 되면 GPCR19의 발현이 감소하며 동시에 P2X7의 발현은 증가하며, 이때 TDCA를 처리하면 GPCR19의 감소와 P2X7의 증가가 억제되는 것을 확인하였다. 더불어서 염증신호 활성시에는 GPCR19-P2X7의 co-localization 형광신호(황색형광신호)가 감소하고 TDCA의 처리에 의해 다시 증가하는 것을 확인하였다.
또한, TDCA의 염증성 사이토카인 IL-1β 억제효능을 확인하기 위해서 LPS+ATP 또는 LPS+BzATP로 염증을 활성화 시킨 mBMDM에 TDCA를 0, 25, 100, 400 ng/ml을 처리한 후 IL-1β 농도를 ELISA를 통해 측정하였다.
그 결과, 도 2b에서 나타난 바와 같이 염증이 활성화 되어 생성된 IL-1β의 농도가 처리한 TDCA의 양에 비례하여 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 도 9에 나타낸 모식도와 같이 염증이 활성화된 이후 TDCA에 의해 GPCR19, P2X7R의 발현이 조절되며 두 단백질 간의 상호결합이 증가하고, 이로 인한 신호전달로 인하여 NLRP3 염증 복합체의 활성화가 억제되어 염증성 사이토카인 IL-1β의 생성이 저해되는 것을 알 수 있다.
상기 <실험예 1>의 결과를 통해 도 9에 나타낸 모식도와 같은 기전으로 TDCA가 면역세포의 과도한 염증반응을 억제하여 TNF-α 및 IL-1β의 생성을 저해하는 것을 알 수 있다. 이는 TDCA가 SARS-CoV-2 감염으로 인한 사이토카인 폭풍을 예방, 치료할 수 있음을 시사한다.
<실험예 2> in vivo 전신 염증유발 동물모델에서 TDCA의 치료효과 확인
COVID-19 폐렴환자는 전신 염증으로 인한 사이토카인 폭풍으로 인해 장기 부전 혹은 사망위험이 높아지기에 in vivo에서 전신 염증반응시 TDCA로 이를 억제할 수 있음을 확인하는 실험을 진행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 개에서 LPS를 정맥 투여하여 전신 염증을 유발시킨 대형 동물모델에서 TDCA를 12시간 간격으로 2 mg/kg, 1 mg/kg, 1 mg/kg를 각각 3회 투약하였을 때, TDCA 투약 동물 실험군에서 사망률 및 장기부전지표가 감소하며 사이토카인 폭풍이 감소하는 치료 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 3b에서 나타난 바와 같이 전신염증 유발 동물실험에서 위약 실험군은 실험 종료 시점인 48시간에 절반이 사망한 반면 TDCA를 투약한 동물은 48까지 전원 생존하여 생존율 향상의 치료 효과를 보여주었다. 도 3c에서 나타나듯이 심혈관계 부전의 지표인 혈압의 관찰에서 위약동물군에서는 저혈압 쇼크가 일어나지만 TDCA를 투약한 동물군은 혈압이 저혈압쇼크가 억제되는 양상을 보여주었다. 더불어 도 3d와 3e에서 나타나듯이 신장 부전의 지표인 BUN과 creatine의 혈중 수치가 위약군에서는 상승하는데 반해 TDCA 투약군에서는 상승이 억제되는 치료 효과를 보여주었다. 또한 도 3f와 3g에서 나타나듯이 사이토카인 폭풍의 원인에 속하는 IL-1β와 IL-8이 LPS로 인한 전신염증에 의해 유발되며, 이때 TDCA를 투약한 동물은 위약군보다 사이토카인이 억제되는 치료양상을 보여주었다.
상기의 결과는 전신염증이 유발된 생체 내에서 TDCA에 의한 사망률, 장기부전 위험성, 사이토카인 폭풍 감소 치료효과를 제시하였으며, 결과적으로 COVID-19 폐렴환자의 위험 병인인 전신염증에 의한 사망, 장기부전, 조직손상 등을 TDCA로 방지/치료 할 수 있음을 시사한다.
<실험예 3> TDCA의 인체 안전성 확인
TDCA의 약물 안전성/내약성(tolerability) 및 약물 동력학(pharmacokinetic, PK)을 확인하기 위하여 상기 <실시예 3>에 기재한 방법과 동일한 방법으로 임상 시험을 진행하였다.
그 결과, 임상시험 대상자 중 3명에서 부작용이 나타났고, 1명에서 경증의 IMD (immunomodulatory drugs) 관련 부작용이 나타났으며, 상기 부작용 모두 심하지 않고 치료 없이 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 농도 의존적으로 PK 특성을 나타내는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 TDCA가 우수한 인체 안전성 및 내약성을 나타내는 것을 알 수 있다.
<실험예 4> TDCA의 COVID-19 폐렴 환자 임상 치료효능 확인
실제 COVID-19 폐렴 환자에게서 TDCA에 의한 치료효능이 있는지를 확인하기 위해 TDCA를 유효성분으로 함유한 주사형 임상 의약품인 NuSepin의 임상시험을 진행하고 임상평가 모니터링과 치료시점을 확인하여 효능을 평가하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 4>에서 기재한 방법과 동일한 방법으로 임상환자를 모집하고 실험을 진행하여 위약 대조군 20명과 NuSepin 0.2 mg/kg 정맥 투여군 22명의 임상 약효평가 자료를 수집하였다. 임상 환자들의 기본적인 인구통계학적 지표는 [표 9]과 같았으며 병의 중증도 분포는 [표 10]과 같았다.
　 NuSepin
(n=22)		 Placebo
(n=20)
Gender
Female 10 (45%) 10 (50%)
Male 12 (55%) 10 (50%)
Age, years
Median (IQR) 59 (54-68) 63 (56-69)
18-60 years 13 (59%) 9 (45%)
>60 years 9 (41%) 11 (55%)
Race
Caucasian 22 (100%) 20 (100%)
Comorbidities
Obesity 6 (27%) 4 (20%)
Type 2 diabetes 7 (32%) 3 (15%)
Hypertension 12 (55%) 14 (70%)
Cardiac disorders 3 (14%) 3 (15%)
Lab.
C-reactive protein, mg/L 77.1 (50.8) 84.1 (62.7)
TNFα, pg/ml 10.3 (7.2) 11.4 (3.2)
IL-1β, pg/ml 4.6 (5.4) 3.5 (2.7)
IL-6, pg/ml 19.0 (18.4) 51.0 (138.2)
IL-8, pg/ml 22.1 (18.7) 22.0 (14.1)
*N (%) or mean (SD)
　 NuSepin
(n=22)		 Placebo
(n=20)
Disease severity
Mild(NEWS2 < 5) 4 (18%) 7 (35%)
Moderate (NEWS2 = 5 or 6) 3 (14%) 4 (20%)
Severe (NEWS2 ≥ 7) 15 (68%) 9 (45%)
Fever (temperature >37.3℃) 8 (36%) 3 (15%)
Respiratory rate >24 breaths/min 0 (0%) 0 (0%)
Pulse ≥125 beats/min 0 (0%) 0 (0%)
Respiratory support
All patients requiring supplemental oxygen, N 21 19
LFNC or facial mask 15 (71%) 17 (89%)
Noninvasive ventilation orhigh-flow nasal cannula 6 (29%) 2 (11%)
Moderate (NEWS2 5 and 6), N 3 4
LFNC or facial mask 3 (100%) 3 (75%)
Noninvasive ventilation orhigh-flow nasal cannula 0 (0%) 1 (25%)
Severe (NEWS2 ≥ 7), N 15 9
LFNC or facial mask 9 (60%) 8 (89%)
Noninvasive ventilation orhigh-flow nasal cannula 6 (40%) 1 (11%)
*N (%)
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, NuSepin 투약환자의 위약군 대비 NEWS2 임상지표 기반 치료일 (NEWS2가 0점을 24시간 유지하는데 까지 소요된 일자)을 연령, 성별, 기저질환, 중등도, 병용 약물 등의 기저 요인을 반영하여 Cox 위험비례 모델로 치료비 (Recovery rate ratio)를 계산하여 치료효과를 확인하였다. 구체적으로 항바이러스제 사용과 NEWS2 5점 이상의 중등증 이상의 위험군 환자가 변인일 경우 NuSepin에 의한 유의미한 치료효과 차이가 있음을 확인하였다. 자세하게 설명하자면, 항바이러스제 변인 요소 반영 시 NuSepin 투약환자는 위약군 대비 치료비가 3.7 [95% C.I. 1.4~10.2]이며 p=0.01로 유의한 치료증가 효과를 보였으며, NEWS2≥5의 증등증 변인 요소를 반영하여 분석하면 NuSepin 투약군의 위약군 대비 치료비가 2.7 [95% C.I. 1.2~6.4]이며 p=0.02로 유의한 치료증가 효과를 보였다. 항바이러스제 병용과 위중증 (NEWS2≥5) 변수를 동시에 반영하여 분석하면 NuSepin 투약환자는 위약군 대비 치료비가 3.4 [95% C.I. 1.5~7.4]이며 p=0.003으로 유의한 치료증가 효과가 있음을 확인하였다.도 5에 나타낸 카플란-메이어 생존 곡선 (Kaplan-Meier survival curve) 비교 그림은 NEWS2 5이상의 중등증 이상의 환자군에서 NEWS2 기반 치료일의 누적 패턴을 비교한 결과로서 NuSepin 투약군이 위약 대조군보다 치료일이 더 단축되는 치료효과가 있음을 보여주고 있다. 구체적으로는 중등증 이상의 ITT (intend to treated) 환자 대상으로 비교 시, 위약군은 NEWS2 기반 치료일의 중앙값이 12.5 [95% C.I. 8.0~25.0] 일인 반면 NuSepin 투약군은 9.0 [95% C.I. 7.0~12.0] 일로 치료일을 산술적으로 3.5일 단축시켰으며, 치료비는 1.9 [95% C.I. 0.9~4.3]로 향상됨을 확인하였다. 그리고 PP (Per protocol) 환자 대상으로 비교 시, 위약군은 NEWS2 기반 치료일이 12.5 [95% C.I. 8.0~25.0] 일인 반면 NuSepin 투약군은 9.0 [95% C.I. 7.0~11.0] 일로 치료일을 3.5일 단축시켰으며, Log-Rank 검정으로 계산된 통계 유의성은 p=0.016으로 통계적으로 유의미한 차이임을 확인하였다. 또한 이때 콕스-위험비례 모델에 의해 계산된 치료비는 2.7 [95% C.I. 1.2~6.4]이며 p=0.02로 유의한 치료증가 효과를 확인하였다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 산소호흡 치료 종료일까지 걸리는 시간을 평가지표로서 중증도(NEWS2≥5)를 조정변수로 치료비를 계산한 결과 중등증 이상의 환자에서 NuSepin 투약군이 위약군 보다 산소호흡 치료를 더 일찍 종료하는 치료효과가 있음을 확인하였다. 구체적으로는 위약군은 9일 [95% C.I. 7.9~10.1]에 종료하는 반면에 투약군은 8일 [95% C.I. 7.4~8.6]에 종료하여 산소 호흡 치료일 1일 단축되며, 콕스-위험비례 모델에 의해 계산된 치료비는 2.2 [95% C.I. 1.0~4.6]이며 통계 유의성은 p=0.04로 유의미함을 확인하였다.
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 호흡기 기반 OS 임상지표 호전효과를 확인하기 위해 임상 시험 시작일 대비 임상 시험 9 일차의 OS 점수의 감소율을 비교 확인하였고, 그 결과 NuSepin 투약군이 위약보다 감소율이 높음으로써 호전효과가 있음을 확인하였다. 구체적으로 전체 환자에서 위약군은 OS 점수의 감소율이 평균 30.9% 감소된 반면, NuSepin 투약군은 43.9% 감소되었다. 그리고 NEWS2 5이상의 중등증 이상의 환자에서는 위약군은 24.3% 감소된 반면, NuSepin 투약군에서는 41.7% 감소하였으며, Wilcoxon Rank sum 검정으로 계산된 통계 유의성은 p=0.028로 위약군과 NuSepin 투약군의 약효 차이가 유의미함을 확인하였다.
또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 전체 환자에서 NuSepin 투약군이 위약군보다 CRP 및 사이토카인의 수치가 정상으로 돌아오는 환자의 비율이 높은 치료효과가 있음을 확인하였다. 구체적으로 임상 4일차에서 CRP가 위약군은 20%가 정상화 수준(10 mg/ml 미만)에 도달한 반면, 투약군은 52%가 정상화 되었다. 임상시험 마지막 날에 혈중 TNF-α 수치가 위약군은 11%가 정상화 수준 (6 pg/ml 미만)에 도달한 반면, 투약군은 35%가 정상화 되었다. 또한 종료일 시점에 위약군의 TNF-α 평균수치(±SEM)는 24.8 (±12.3)인데 반해 NuSepin 투약군은 평균 7.4 (±0.7)로 낮았으며, Wilcoxon Rank sum 검정으로 계산된 통계 유의성은 p=0.007로 위약군과 NuSepin 투약군의 약효 차이가 유의미함을 확인하였다. 임상시험 마지막 날에 혈중 IL-8 수치가 위약군은 33%가 정상화 수준(10 mg/ml 미만)에 도달한 반면, 투약군은 55%가 정상화 되었다. 또한 위약군은 임상 종료 시점의 IL-8 수치가 시작일보다 유의하게 감소되지 않은 반면 NuSepin 투약군은 임상 시작 시점에 IL-8 수치가 22.1 (±4.0)에서 종료일에 12.8 (±2.2)로 감소하였으며, Wilcoxon Rank sum 검정으로 계산된 통계 유의성은 p<0.05 으로 치료 약물에 의한 유의미한 감소임을 확인하였다. IL-6의 경우에는 임상 시험 종료시점에 위약군은 33%가 정상화 수준 (3.3 pg/ml 미만)에 도달한 반면, 투약군은 60%가 정상화 되었다.
상기의 임상 2상 실험결과를 통해 NuSepin이 COVID-19 폐렴환자의 치료일을 단축시키고 전신 염증을 억제하는 약효 유효성이 있음을 확인하였다.
아울러 표 11에 나타난 바와 같이, 임상 실험 중 NuSepin 0.1 mg/kg 및 0.2 mg/kg 투약에 의한 발생한 심각한 부작용 사례는 없었으며, 부작용 사례는 적을 뿐만 아니라 위약군과 비교해도 차이가 없었다. 발생한 부작용은 병증이 매우 경미하였으며 임상 시험 도중에 모두 회복되는 일시적인 증상으로 확인되었다. 이를 통해 본 실험의 치료제인 TDCA의 안전성과 우수한 내약성을 확인하였다.
NuSepin
0.1 mg/kg
(n=22) 		NuSepin
0.2 mg/kg
(n=22) 		Placebo (n=20)
Patients with ≥1 adverse event, No. (%) 6 (27) 6 (27) 4 (20)
Patients with severe adverse event
Any severe adverse event 0 (0) 1 (5) 0 (0)
Study drug related severe adverse event 0 (0) 0 (0) 0 (0)
Relationship
Possibly 5 (23) 3 (13) 2 (10)
Unassesible 1 (5) 3 (13) 2 (10)
Fatal event 0 (0) 0 (0) 0 (0)
Patients with adverse events of specific organs, No. (%)
- Blood system
Anemia 1 (5) 1 (5) 0 (0)
Leukocytosis 1 (5) 0 (0) 0 (0)
Neutrophilia 1 (5) 0 (0) 0 (0)
- Cardiovascular system
Tachycardia 1 (5) 0 (0) 3 (15)
Hypotension 1 (5) 1 (5) 0 (0)
- Gastrointestinal tract
Diarrhea 0 (0) 1 (5) 0 (0)
- Hepatobiliary system
ALT increased 1 (5) 2 (9) 2 (10)
AST increased 2 (9) 2 (9) 0 (0)
GGT increased 2 (9) 2 (9) 0 (0)
- Metabolism
Hypokalemia 0 (0) 1 (5) 0 (0)
- Nervous system
Headache 0 (0) 2 (9) 2 (10)
- Thorax
Dyspnea 0 (0) 1 (5)* 0 (0)
- Skin and subcutaneous tissue
Exanthema 1 (5) 0 (0) 0 (0)
* Severe adverse event, not related to NuSepin
결과적으로 상기 <실험예 4>의 결과는 도 9에 나타낸 모식도와 같은 기전으로 TDCA가 면역세포의 과도한 염증반응을 억제하여 COVID-19 폐렴 환자에게 유효한 치료효과를 나타냄을 시사한다.
본 발명에 따른 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid, TDCA) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 신종코로나바이러스(SARS-CoV-2) 감염에 의해 유발되는 임상적 증상을 치료하고, 염증 완화와 염증성 사이토카인 억제 효능을 통한 조기 완치 효과를 나타내므로, 코로나바이러스감염증-19를 포함한 하기도 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 타우로데옥시콜린산(taurodeoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 하기도 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 타우로데옥시콜린산은 하기 [화학식 2]로 기재되는 화합물인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2022007007-appb-img-000003
  3. 제 1항에 있어서, 상기 염은 나트륨염인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 TNF-α, IL-1β, IL-8, IL-6 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 cAMP를 증가시켜 NF-κB의 활성화를 억제하고, P2X7의 기능을 억제하여 NLRP3 염증 복합체의 활성화를 억제하는 GPCR19 작용제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 하기도 감염 질환은 코로나바이러스 감염으로 유발되는 발열, 기침, 가래, 몸살, 인후통, 설사, 결막염, 두통, 피부발진, 호흡곤란, 급성기관지염, 폐렴, 폐화농증, 신부전, 신장 기능 장애, 패혈성 쇼크, 패혈증 및 사이토카인 방출 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 증상을 갖는 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV) 및 신종코로나바이러스(SARS-CoV-2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 하기도 감염 질환 예방 방법.
  9. 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 하기도 감염 질환 치료 방법.
  10. 하기도 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 타우로데옥시콜린산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
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