WO2022239986A1 - Baff 세포외 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

Baff 세포외 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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진화섭
전태훈
양준
이창희
이나영
박인병
강석진
박시원
이현정
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주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩
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Definitions

  • the present invention relates to a chimeric antigen receptor (CAR) comprising a BAFF extracellular domain; a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor protein; a vector containing the polynucleotide; T cells or natural killer cells (NK cells) transformed with the vector; It relates to a cell therapy or a pharmaceutical composition for the treatment of cancer and systemic lupus erythematosus, comprising the cells as an active ingredient.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • B-cell activating factor is a cytokine belonging to the tumor necrosis factor (TNF) ligand, BLyS (B-lymphocyte stimulator), TALL-1 (TNF- and ApoL related leukocyte-expressed ligand 1), THANK (TNF homologue that activates apoptosis, nuclear factor- ⁇ B and c-Jun NH2-terminal kinase), and is called TNFSF13B (TNFsuperfamily member 13B) or zTNF4 (Mackay and Browning, 2002).
  • TNFSF13B TNFsuperfamily member 13B
  • zTNF4 Mackay and Browning, 2002.
  • BAFF is a type 2 transmembrane protein originally composed of 285 amino acids.
  • BAFF is secreted from macrophages, monocytes, and dendritic cells (Mackay and Browning, 2002).
  • Receptors that bind to BAFF include the BAFF receptor, B-cell maturation antigen (BCMA), and Transmembrane activator and CAML interactor (TACI) (Mackay and Browning, 2002).
  • BAFF receptors are expressed on most human B cells, except for plasma cells in the bone marrow, and BCMA is mainly expressed on antibody-secreting human cells (Mackay and Schneider, 2009).
  • BCMA B-cell maturation antigen
  • TACI Transmembrane activator and CAML interactor
  • BAFF receptors are expressed on most human B cells, except for plasma cells in the bone marrow, and BCMA is mainly expressed on antibody-secreting human cells (Mackay and Schneider, 2009).
  • TACI is also expressed in most peripheral B cells (Mackay and Schneider, 2009). Therefore, signal transduction by the interaction between BAFF and three receptors that bind to BAFF, the BAFF
  • BCMA is a marker for multiple myeloma (Carpenter et al., 2013), breast cancer, T cell lymphoma, and B cell chronic lymphocytic leukemia (B -CLL) and non-small cell lung cancer (Haiat et al., 2006; Dou et al., 2016; Kampa et al., 2020).
  • the BAFF receptor is a B-cell lymphoma, follicular lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), mantle cell lymphoma, B cell It is expressed in various lymphomas such as B-cell non-Hodgkin lymphoma, and also in leukemias such as acute lymphoblastic leukemia (ALL) and chronic lymphoblastic leukemia (CLL).
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • CLL chronic lymphoblastic leukemia
  • BAFF receptors are overexpressed in B cells of autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE) (Haiat et al., 2006; Parameswaran et al., 2010; Takahata et al., 2010; Yang et al., 2010). al., 2014).
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • TACI is found in multiple myeloma, breast cancer, thyroid carcinoma, and non-small cell lung cancer (Moreaux et al., 2009; Dou et al., 2016; Kampa et al., 2020).
  • cytotoxic T lymphocytes CTL
  • NK cells natural killer cells
  • a key obtained by grafting a single-chain variable fragment (scFv) of an antibody that recognizes an antigen to a domain grafted to CD3 zeta or the cytoplasmic signaling domain of another protein has been attempted as a method of delivering a chimeric antigen receptor (CAR).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the chimeric antigen receptor is grafted onto T cells or natural killer cells, the anticancer activity of T cells or natural killer cells can be achieved only by recognizing the specific antigen of the single-chain Fv fragment, regardless of signal transduction by antigen presenting cells (APCs). It can be activated, and it is not limited to the HLA type, so it can be used as a more efficient treatment method that can be used universally by many people.
  • these chimeric antigen receptor-expressing T cells or natural killer cells show efficacy in various cancers (Holzinger et al., 2016; Pettitt et al., 2018; Wang et al., 2020
  • CAR-T T cells recognizing BCMA or BAFF receptors as tumor antigens (US Patent Publication No. 2020-0283534) or water-soluble TACI immunoglobulin compositions and methods of use (US Patent Registration No. 08524232) have been disclosed.
  • the invention of using the BAFF receptor, BCMA, and TACI-expressing cancer cell-expressing extracellular domain (extracellular domain) of BAFF as an antigen-binding domain has not been described for use as an immunocancer therapeutic agent.
  • the present inventors have identified or induced the expression of BAFF receptors, BCMA, and TACI in various cancer cells, and the fact that the BAFF and BAFF receptors, BCMA, and TACI can bind to the extracellular domain of BAFF.
  • Cancer-specific chimeric antigen receptor-expressing T cells and natural killer cells expressing the BAFF receptor, BCMA, and TACI used are prepared, and the T cells or natural killer cells are specific for cells expressing the BAFF receptor, BCMA, and TACI It was confirmed through experiments that there is a cytotoxic ability. At this time, a fusion protein linking each of the extracellular domains of BAFF with the human immunoglobulin G 1 heavy chain constant region was created to amplify signal transduction strength.
  • chimeric antigen receptors have only one antigen-recognizing site by a single-chain Fv fragment, whereas the chimeric antigen receptor designed by the present inventors binds each of the extracellular domains of BAFF to human human immunoglobulin G 1 By linking with the heavy chain constant region (IgG 1 heavy chain constant region), two extracellular domains of BAFF per chimeric antigen receptor recognize antigens, thereby amplifying signal transduction strength.
  • the heavy chain constant region IgG 1 heavy chain constant region
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor protein, a vector containing the polynucleotide, and T cells or natural killer cells transformed with the vector.
  • Another object of the present invention is to provide a cell therapy or a pharmaceutical composition for treating cancer and systemic lupus erythematosus expressing BAFF receptor, BCMA or TACI, including the transformed T cells or natural killer cells.
  • the present invention is an antigen binding site, an extracellular domain; transmembrane domain; And a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an intracellular signaling domain, wherein the antigen binding domain comprises an extracellular domain of BAFF that specifically binds to a BAFF receptor, BCMA or TACI.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor protein, a vector containing the polynucleotide, and T cells or natural killer cells transformed with the vector.
  • the present invention provides a cell therapy or a pharmaceutical composition for treating cancer and systemic lupus erythematosus expressing BAFF receptor, BCMA or TACI, including the transformed T cells or natural killer cells.
  • a chimeric antigen receptor according to the present invention comprises an extracellular domain of BAFF that specifically binds to the BAFF receptor, BCMA or TACI. Therefore, in the case of cytotoxic T cells or natural killer cells transformed with a vector capable of overexpressing the chimeric antigen receptor, they have cytotoxicity specifically for carcinoma and autoimmune diseases expressing the BAFF receptor, BCMA or TACI. It can be usefully used as an immune cell therapy for the treatment of cancer and systemic lupus erythematosus.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing cDNA regions of each domain expressing a chimeric antigen receptor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2A is a schematic diagram of a lentiviral vector according to an embodiment of the present invention.
  • 2B is a schematic diagram of a retroviral vector according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a chimeric antigen receptor expressed on the surface of cytotoxic T cells or natural killer cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4a is a schematic diagram of inserting BAFF receptor cDNA into a retroviral vector to express BAFF receptor, which is a target of the chimeric antigen receptor provided in the present invention, in Chinese hamster ovary (CHO) cells.
  • Figure 4b is a schematic diagram of inserting BCMA cDNA into a retroviral vector to express BCMA, which is the target of the chimeric antigen receptor provided in the present invention, in Chinese hamster ovary (CHO) cells.
  • FIG. 4c is a schematic diagram of inserting TACI cDNA into a retroviral vector to express TACI, which is the target of the chimeric antigen receptor provided in the present invention, in Chinese hamster ovary (CHO) cells.
  • Figure 5a is a diagram showing the results of measuring the expression level of BAFF receptor in Chinese hamster ovary (CHO) cells expressing BAFF receptor, which is a target of the chimeric antigen receptor provided in the present invention, using flow cytometry.
  • Figure 5b is a diagram showing the results of measuring the expression level of BCMA using flow cytometry in CHO cells expressing BCMA, which is the target of the chimeric antigen receptor provided in the present invention.
  • Figure 5c is a diagram showing the results of measuring the expression level of TACI using flow cytometry in CHO cells expressing TACI, which is the target of the chimeric antigen receptor provided in the present invention.
  • Figure 6a is a diagram showing the result of comparing the expression ratio of GFP in cytotoxic T cells (BAFF CAR-T cells) transduced with an expression vector according to an embodiment of the present invention using a lentivirus system.
  • FIG. 6B is a diagram showing the results of comparing the expression ratio of BAFF in natural killer cells (BAFF CAR-NK cells) transduced with an expression vector according to an embodiment of the present invention using a retroviral system.
  • FIG. 7a is a diagram showing whether BAFF receptors are recognized by cytotoxic T cells (BAFF CAR-T cells) transduced with an expression vector according to an embodiment of the present invention using a lentivirus system, using flow cytometry.
  • Figure 7b is a diagram showing whether cytotoxic T cells (BAFF CAR-T cells) transduced with an expression vector according to an embodiment of the present invention using a lentivirus system recognize BCMA using flow cytometry.
  • Figure 7c is a diagram showing whether cytotoxic T cells (BAFF CAR-T cells) transduced with an expression vector according to an embodiment of the present invention using a lentivirus system recognize TACI using flow cytometry.
  • 8A is a diagram showing whether BAFF CAR-NK cells transduced with an expression vector according to an embodiment of the present invention using a retroviral system recognize BAFF receptors using flow cytometry.
  • 8B is a diagram showing whether BAFF CAR-NK cells transduced with an expression vector according to an embodiment of the present invention using a retroviral system recognize BCMA using flow cytometry.
  • 8C is a diagram showing whether TACI is recognized by natural killer cells (BAFF CAR-NK cells) transduced with an expression vector according to an embodiment of the present invention using a retroviral system, using flow cytometry.
  • BAFF CAR-NK cells natural killer cells
  • Figure 9a is a cytotoxic T cell (BAFF CAR-T cell) according to an embodiment of the present invention or a cytotoxic T cell (Mock T cell) transduced with an empty vector as an effector cell, BAFF receptor, It is a diagram showing the results of measuring cytotoxicity to CHO cells expressing BCMA and TACI, respectively.
  • FIG. 9B shows BAFF receptors, BCMA, It is a diagram showing the results of measuring cytotoxicity to CHO cells expressing TACI, respectively.
  • an antigen-binding domain transmembrane domain; And a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an intracellular signaling domain, wherein the antigen binding domain comprises an extracellular domain of BAFF that specifically binds to a BAFF receptor, BCMA or TACI. do.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the "Chimeric antigen receptor (CAR)" naturally binds to a desired antigen without the mediation of an antigen-presenting cell (APC) or antibody necessary for the activation of T cells or natural killer cells, resulting in an antigen-antibody reaction. It refers to a fusion protein to be expressed in T cells or natural killer cells in order to induce activation of T cells and attack cells expressing the corresponding antigen. That is, it can be seen as a protein that binds to an antigen when expressed in T cells or natural killer cells and induces the activation of these cells. Through this, it may be a protein that recognizes an antigen specific to a cell to cause an immune response, and the cell to cause an immune response may refer to a cell present in a specific tissue or forming a tissue that causes a lesion.
  • APC antigen-presenting cell
  • Chimeric antigen receptor proteins may include functional equivalents.
  • 'Functional equivalent' means at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably, the amino acid sequence of the chimeric antigen receptor protein as a result of addition, substitution, or deletion of amino acids. has a sequence homology of 95% or more, and refers to a protein that exhibits substantially the same physiological activity.
  • 'Substantially homogeneous physiological activity means having an activity that can specifically bind to the BAFF receptor, BCMA or TACI.
  • the present invention also includes fragments, derivatives and analogs of chimeric antigen receptors.
  • fragments, derivatives and analogs of chimeric antigen receptors include (1) a polypeptide in which one or more conservative or non-conservative amino acid residues (preferably conservative amino acid residues) are substituted (the substituted amino acid residues are encoded by the genetic code).
  • polypeptide having substituent(s) on one or more amino acid residues (2) a polypeptide having substituent(s) on one or more amino acid residues, or (3) another compound (a compound capable of extending the half-life of a polypeptide, such as polyethylene glycol) a polypeptide derived from the combined mature polypeptide, or (4) an additional amino acid sequence (e.g., a leader sequence, a secreted sequence, a sequence used to purify the polypeptide, a proteinogen sequence, or a fusion protein) and It may be a polypeptide derived from the polypeptide to which it is linked.
  • additional amino acid sequence e.g., a leader sequence, a secreted sequence, a sequence used to purify the polypeptide, a proteinogen sequence, or a fusion protein
  • B-cell activating factor is a cytokine belonging to the tumor necrosis factor (TNF) ligand, BLyS (B-lymphocyte stimulator), TALL-1 (TNF- and ApoL related leukocyte-expressed ligand 1), THANK (TNF homologue that activates apoptosis, nuclear factor- ⁇ B and c-Jun NH2-terminal kinase), is called TNFSF13B (TNFsuperfamily member 13B) or zTNF4.
  • TNFSF13B tumor necrosis factor-expressed ligand 1
  • THANK TNF homologue that activates apoptosis, nuclear factor- ⁇ B and c-Jun NH2-terminal kinase
  • TNFSF13B TNFsuperfamily member 13B
  • BAFF is a type 2 transmembrane protein originally composed of 285 amino acids. After being expressed on the cell surface as a homotrimer, the transmembrane portion is cut off and secreted out of the cell.
  • BAFF is secreted from macrophages, monocytes, and dendritic cells.
  • Receptors that bind to BAFF include the BAFF receptor, B-cell maturation antigen (BCMA), and Transmembrane activator and CAML interactor (TACI).
  • BCMA B-cell maturation antigen
  • TACI Transmembrane activator and CAML interactor
  • the extracellular domain of the BAFF may consist of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence showing 95% or more homology thereto, but is not limited thereto.
  • the human immunoglobulin G 1 heavy chain constant region may consist of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence exhibiting 95% or more homology thereto, but is not limited thereto.
  • BAFF receptor In the present invention, "BAFF receptor”, “BCMA”, and “TACI” are observed in various malignant cells and autoimmune diseases, preferably systemic lupus erythematosus (SLE). So far, carcinomas expressing "BAFF receptor”, “BCMA”, and “TACI” are acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphoblastic leukemia (CLL), and follicular lymphoma (follicular lymphoma).
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • CLL chronic lymphoblastic leukemia
  • follicular lymphoma follicular lymphoma
  • lymphoma mantle cell lymphoma
  • B-cell lymphoma diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL)
  • B-cell non-Hodgkin lymphoma lymphoma B-cell non-Hodgkin lymphoma lymphoma
  • multiple myeloma T cell lymphoma, breast cancer, thyroid cancer, and non-small cell lung cancer. , but not limited thereto.
  • the "transmembrane domain” is a site that connects the extracellular domain of BAFF and the co-stimulatory and essential signaling domains between the cell membrane, and the intracellular signaling domain is an immune cell by binding of the antigen-binding domain. refers to the site that activates the immune response of
  • the transmembrane domain is selected from the group consisting of CD28, CD3epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 and CD154 It may include one or more types, and preferably, the CD8 may be a transmembrane domain of CD8 ⁇ , which may consist of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence showing 95% or more homology thereto, but is not limited thereto not.
  • intracellular signaling domain means a site that activates the immune response of immune cells by binding to an antigen binding domain.
  • the intracellular domain may be CD28, 4-1BB, CD3 zeta, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the chimeric antigen receptor according to the present invention uses CD28, 4-1BB, and CD3 zeta as intracellular signaling domains, and has a high activity to kill cancer cells, especially cancer cells expressing BAFF receptors, BCMA, and TACI. can represent
  • the CD28 has SEQ ID NO: 4 or 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more sequence homology thereto, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 4-1BB (CD137) is SEQ ID NO: 5 or 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more.
  • sequence homology may consist of an amino acid sequence showing a function substantially equivalent to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, CD3 zeta functions as an NK cell activation domain, and SEQ ID NO: 6 or 70 % or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more sequence homology, and an amino acid sequence that exhibits a function substantially equivalent to that of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 It can be done.
  • the antigen-binding domain may include a CD8 ⁇ signal peptide, and the CD8 ⁇ signal peptide may consist of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence showing 95% or more homology thereto, but is not limited thereto.
  • a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor protein is provided.
  • the polynucleotide encoding the antigen receptor of the present invention changes the amino acid sequence of the antigen receptor expressed from the coding region due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred in organisms intended to express the antigen receptor.
  • Various modifications may be made to the coding region within a range not specified, and various modifications or modifications may be made to a part other than the coding region within a range that does not affect gene expression, and such modified genes are also within the scope of the present invention. It will be well understood by those skilled in the art.
  • nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and these are also included in the scope of the present invention.
  • a vector containing the polynucleotide and a cell transformed with the vector are provided.
  • Vectors used in the present invention may use various vectors known in the art, and depending on the type of host cell to produce the antigen receptor, a promoter, terminator, enhancer, etc. Expression control sequences, sequences for membrane targeting or secretion, etc. may be appropriately selected and combined in various ways depending on the purpose.
  • Vectors of the present invention include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors and viral vectors. Suitable vectors include expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, stop codons, polyadenylation signals and enhancers, as well as signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion, and may be prepared in various ways depending on the purpose.
  • a lenti-virus vector or a retro-virus vector can be used, and in the following embodiment of the present invention, the pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vector (lenti-virus vector) and pLNCX2 (retro-viral vector) was used, but is not limited thereto.
  • cells can be transformed by introducing a chimeric antigen receptor that specifically binds to BAFF receptor, BCMA or TACI into cells through the vector.
  • the cells may be T cells, tumor-infiltrating lymphocytes, B cells, natural killer cells, or NKT cells, and preferably may be cytotoxic T cells or natural killer cells.
  • the cells may be obtained or prepared from bone marrow, peripheral blood, peripheral blood mononuclear cells or umbilical cord blood, and the cells may be human cells, but are not limited thereto.
  • Cells transformed by introducing the chimeric antigen receptor of the present invention as described above recognize BAFF receptor, BCMA or TACI as an antigen and bind strongly thereto.
  • chimeric antigen receptor T cell (hereinafter, simply abbreviated as 'CAR-T cell')" or “chimeric antigen receptor expressing NK cell (chimeric antigen receptor NK cell, hereinafter) Shortly abbreviated as 'CAR-NK cell')
  • 'CAR-NK cell' is a chimeric antigen receptor that specifically responds to cancer cells rather than the original T cell receptor or NK cell receptor by a method such as transduction of normal T cells or natural killer cells. refers to T cells or NK cells expressing T cells or NK cells having this receptor exhibit cytotoxicity by inducing apoptosis of target cells.
  • CAR-T cells or CAR-NK cells may be cells into which the chimeric antigen receptor of the present invention is introduced into cytotoxic T cells or NK cells.
  • the cells have the advantage of anticancer-specific targeted therapy, which is an existing advantage of CAR-T therapeutics.
  • the CAR-T cells or CAR-NK cells of the present invention recognize cancer cells expressing BAFF receptors, BCMA, and TACI to effectively can destroy
  • the present invention provides a cell therapeutic agent containing the cells or a pharmaceutical composition for treating cancer containing the same as an active ingredient.
  • cell therapy refers to cells and tissues prepared from a subject through isolation, culture, and special manipulation, and is a pharmaceutical product used for the purpose of treatment, and is a living autologous, allogeneic, or xenogeneic living agent to restore the function of a cell or tissue. It refers to drugs used for the purpose of treatment through a series of actions, such as proliferation and selection of cells in vitro or altering the biological characteristics of cells in other ways.
  • treatment refers to all activities that improve or beneficially change symptoms caused by cancer and autoimmune diseases by administration of the composition.
  • composition may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the "pharmaceutically acceptable carrier” may refer to a carrier or diluent that does not inhibit the biological activity and properties of the compound to be injected without irritating living organisms.
  • the type of the carrier that can be used in the present invention is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art and pharmaceutically acceptable can be used.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • composition containing a pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral formulations. When formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and these solid preparations contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, and lactose in the compound. , can be prepared by mixing gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solutions for internal use, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • Witepsol, Macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used as a base for the suppository.
  • composition can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is dependent on the type and severity of the subject, age, sex, infected virus type, and drug activity, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including concomitantly used drugs and other factors well known in the medical arts.
  • the administration means introducing the composition of the present invention to a patient by any suitable method, and the administration route of the composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration may be administered, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may be administered daily or intermittently, and the number of administrations per day may be administered once or divided into 2 to 3 times.
  • the number of administrations when the two active ingredients are each a single agent may be the same or may be different.
  • the composition of the present invention can be used alone or in combination with other drug treatments for the treatment of cancer expressing BAFF receptors, BCMA, and TACI. It is important to administer the amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the subject refers to humans, monkeys, cows, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, rats, rabbits, or animals that have or may develop cancer expressing BAFF receptors, BCMA, or TACI. All animals, including guinea pigs.
  • the type of subject is included without limitation as long as the disease can be effectively treated by administering the pharmaceutical composition of the present invention to the subject.
  • the autoimmune disease is preferably systemic lupus erythematosus (SLE), but is not limited thereto.
  • Types of the cancer include acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphoblastic leukemia (CLL), follicular lymphoma, mantle cell lymphoma, B B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), B-cell non-Hodgkin lymphoma, multiple myeloma, T-cell lymphoma It may be selected from the group consisting of (T cell lymphoma), breast cancer, thyroid cancer, and non-small cell lung cancer, but is not limited thereto.
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • CLL chronic lymphoblastic leukemia
  • follicular lymphoma mantle cell lymphoma
  • B B-cell lymphoma diffuse large B-cell lymphoma
  • B-cell non-Hodgkin lymphoma multiple myeloma
  • an antigen recognition site in which a pair of BAFF extracellular domains are linked to human immunoglobulin G 1 heavy chain constant region (IgG 1 heavy chain constant region) and transmembrane transmembrane of CD8 ⁇
  • the protein coding sequences of the intracellular domains of each of the domains CD28, 4-1BB, and CD3 zeta were identified in a gene database.
  • FIG. 1 A schematic diagram showing the cDNA region of each domain expressing the chimeric antigen receptor is shown in FIG. 1 .
  • lentivirus-derived expression of the corresponding gene It was cloned into a vector, pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP (System Biosciences) or a retrovirus-derived expression vector, pLNCX2 (Addgene).
  • a primer that creates a restriction enzyme XbaI cleavage site sequence is synthesized at the 5' end, a restriction enzyme cleavage site is created by polymerase chain reaction, and a restriction enzyme cleavage site is also made at the 3' end.
  • a restriction enzyme cleavage site was prepared by synthesizing a primer that creates the cleavage site sequence of the enzyme NotI and polymerase chain reaction. After that, the 5' end of the gene having a restriction enzyme cleavage site due to polymerase chain reaction was treated with XbaI, and the 3' end was treated with NotI. In addition, the multicloning site of the expression vector was treated with XbaI and NotI so that the gene could be inserted. After mixing the restriction enzyme-treated gene and the expression vector, they were ligated by treatment with a ligase.
  • a primer that creates a restriction enzyme Bgl II cleavage site sequence is synthesized at the 5' end, a restriction enzyme cleavage site is made by polymerase chain reaction, and a restriction enzyme NotI cleavage site sequence is also added at the 3' end.
  • a primer was synthesized to make a restriction enzyme cleavage site by polymerase chain reaction. After that, the 5' end of the gene having a restriction enzyme cleavage site due to polymerase chain reaction was treated with BglII, and the 3' end was treated with NotI. In addition, the multicloning site of the expression vector was treated with BglII and NotI so that the gene could be inserted. After mixing the restriction enzyme-treated gene and the expression vector, they were ligated by treatment with a ligase.
  • a recombinant vector BAFF receptor, BCMA, TACI.CAR- that recognizes BAFF receptor, BCMA, and TACI and expresses a protein obtained by fusing a human immunoglobulin G 1 heavy chain constant region and a signaling protein domain (see FIG. 3).
  • T.pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP and the BAFF receptor, BCMA, TACI.CAR-NK.pLNCX2 were completed (see Figures 2a and 2b).
  • each of the BAFF receptor, BCMA, and TACI genes had a restriction enzyme Bgl II cleavage site sequence at the 5' end and a restriction enzyme Hind III cleavage site at the 3' end. It was cloned into the pLNCX2 vector using the sequence (see FIGS. 4a, 4b and 4c).
  • a retroviral system using 293GPG cells was used to introduce the pLNCX2 vector into Chinese hamster ovary (CHO) cells (ATCC) into which BAFF receptor, BCMA, and TACI genes had been inserted.
  • CHO Chinese hamster ovary
  • ATCC Chinese hamster ovary
  • 6 3 ⁇ 10 293GPG cells were dissolved in 10 ml of DMEM culture medium containing 10% calf serum, inoculated into a 100 ⁇ cell culture dish, and cultured for 24 hours.
  • Each of the previously prepared recombinant vectors (BAFF-R.pLNCX2 vector, BCMA.pLNCX2 vector, TACI.pLNCX2 vector) (20 ⁇ g) was crystallized using calcium phosphate and HEPES-buffered solution, and then added to the previously cultured 293GPG cell culture medium. has been added Thereafter, the culture medium was replaced at 24 hour intervals over 72 hours, and the culture supernatant of 293GPG cells containing the retrovirus was collected and stored.
  • the collected retrovirus-containing supernatant was centrifuged at 21,000 rpm for 2 hours using an ultra-high-speed centrifuge, and then reconstituted in DMEM (welgene) containing 10% calf serum to be concentrated 100 times compared to before concentration.
  • DMEM fetal calf serum
  • To transduce the concentrated retrovirus into CHO cells the CHO cells were inoculated in a 24-well cell culture dish at a density of 5 ⁇ 10 5 /ml. Then, a mixture obtained by adding 8 ⁇ g/ml of polybrene to the concentrated retrovirus was added to the culture medium of CHO cells, and cultured for 24 hours.
  • BAFF receptor After proliferation, the expression levels of BAFF receptor, BCMA, and TACI in CHO cells were measured by flow cytometry, respectively, and the recombinant vectors (BAFF-R.pLNCX2 vector, BCMA.pLNCX2 vector, TACI.pLNCX2 vector) were introduced into each CHO cell.
  • Anti-human BAFF receptor antibody Biolegend
  • anti-human BCMA receptor antibody Biolegend
  • anti-human TACI receptor antibody Biolegend
  • CHO cell lines that strongly express BAFF receptor, BCMA, and TACI were used as target cells, and mock CHO cell lines that do not express BAFF receptor, BCMA, and TACI were used as target cells. was used as a negative control.
  • cytotoxic T cells were first isolated from human peripheral blood mononuclear cells. After purchasing human peripheral blood mononuclear cells (Medi Lab Korea), magnetic-activated cell sorting was used to isolate cytotoxic T cells. Peripheral blood mononuclear cells are combined with an antibody (CD8 + T cell biotin-conjugated antibody cocktail, Miltenyi Biotec) capable of binding to other immune cells except for cytotoxic T cells, and then the antibodies are combined with magnetic microbeads (anti- biotin microbead) (Miltenyi Biotec).
  • an antibody CD8 + T cell biotin-conjugated antibody cocktail, Miltenyi Biotec
  • magnetic microbeads anti- biotin microbead
  • the microbeads, antibodies attached thereto, and cells were passed through a magnetic separation column (Miltenyi Biotec) to obtain cytotoxic T cells unlabeled with the antibodies.
  • flow cytometry was performed using CD8 and CD3 ⁇ , which are cell surface factors of cytotoxic T cells, and as a result, the purity was over 95%.
  • cytotoxic T cells Contains 1 ⁇ 10 6 /ml of human CD3 and CD28 antibody-coated magnetic beads (Thermo Fisher Scientific) and 10% calf serum supplemented with 100 U/ ⁇ l recombinant human IL-2 for activation of isolated cytotoxic T cells.
  • the cells were reconstituted in RPMI (Welgene) at a density of 1.5 ⁇ 10 6 cells/ml, inoculated into a 24-well cell culture dish, and cultured for 24 hours.
  • Example 5 Construction of chimeric antigen receptor-expressing cytotoxic T cells
  • Example 2 In order to introduce the recombinant vector prepared in Example 2 into cytotoxic T cells, a lentiviral system using 293FT cells (Thermo Fisher Scientific) was used.
  • 293FT cells were inoculated into 2.5 ⁇ 10 6 cells in a 100 ⁇ cell culture dish, and cultured in DMEM medium containing 10% calf serum. After 24 hours of incubation, when the cells have grown to cover 60-70% of the dish, 20 ⁇ g of BAFF.CAR-T.pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vector DNA was mixed with 10 ⁇ g of psPAX2 (Addgene) and 3 ⁇ g of pMD2. .G (Addgene) vector was crystallized using Calcium phosphate and Hepes-buffered solution and then introduced into 293FT cells.
  • culture supernatants containing lentivirus were collected at intervals of 24 hours after 48 hours of 293FT cells into which the expression vector was introduced.
  • the collected supernatant was centrifuged for 2 hours at 21,000 rpm using an ultra-high speed centrifuge to concentrate the virus.
  • the concentrated virus was mixed with 4 ⁇ g/ml of polybrene and added to the culture medium of activated cytotoxic T cells, followed by centrifugation at 1,800 g for 75 minutes using a centrifuge for transduction.
  • the centrifuged cytotoxic T cells were further cultured for 4 hours and then replaced with RPMI culture medium containing 10% calf serum. After 48 hours, some of the transduced cytotoxic T cells were used to measure transduction efficiency.
  • the transduction efficiency was measured by flow cytometry for the amount of GFP expression inside the cell, and the transduced cytotoxic T cell (BAFF CAR-T cell) was transduced with a virus constructed with an empty vector. Cytotoxic T cell (Mock T cell) transduced ) The results compared with the transduction rate of ) are shown in Figure 6a.
  • the collected retrovirus-containing supernatant was centrifuged at 21,000 rpm for 2 hours using an ultra-high-speed centrifuge, and then reconstituted in Myelocult H5100 culture medium (STEMCELL) containing 10% calf serum to be concentrated 100 times compared to before concentration.
  • NK92MI cells American type culture collection, ATCC
  • NK92MI cells were inoculated in a 24-well cell culture dish at a density of 5 ⁇ 10 5 /ml. Then, a mixed solution in which 8ug/ml of polybrene was added to the concentrated retrovirus was added to the culture medium of NK92MI cells, and cultured for 24 hours.
  • NK92MI cells treated with retrovirus were cultured using Myelocult H5100 culture medium supplemented with neomycin antibiotic (600 ⁇ g/ml) 24 hours after the culture medium change for selection of cells into which the gene was introduced. After 14 days of neomycin selection, NK92MI cells were transferred to a fresh culture medium and grown for one week.
  • Example 7 chimeric antigen receptor and BAFF receptor, BCMA or TACI Affinity measurement of expressing human cell lines
  • the BAFF CAR-T cell and BAFF CAR-NK cell prepared in Examples 5 and 6 were To measure the binding to BAFF receptors, BCMA and TACI, soluble recombinant human BAFF receptor IgG (Acrobiosystems), soluble recombinant BCMA IgG (R&D systems), and soluble recombinant TACI IgG (R&D systems) were respectively tested in BAFF CAR-T cells and BAFF CAR-NK cells were treated and confirmed through flow cytometry.
  • soluble recombinant human BAFF receptor IgG, soluble recombinant BCMA IgG, and soluble recombinant TACI IgG do not bind to Mock T cells, but bind to BAFF CAR-T cells (see FIGS. 7a to 7c), and also to Mock NK cells. It did not bind, but bound to BAFF CAR-NK cells (see FIGS. 8a to 8c).
  • BAFF CAR-T cells and BAFF CAR-NK cells expressing chimeric antigen receptors prepared based on the above results were used as effector cells, and CHO cell lines expressing BAFF receptors, BCMA or TACI were used as target cells (target cells). ), BAFF receptor, BCMA, and TACI-specific cytotoxicity of BAFF CAR-T cells and BAFF CAR-NK cells were verified.
  • Example 8 CAR-T cells BAFF receptor, BCMA , TACI Verification of expression cell-specific cytotoxicity
  • BAFF receptor which is the target cell selected in Example 3, to determine whether the prepared chimeric antigen receptor-expressing cytotoxic T cell specifically recognizes cells expressing BAFF receptor, BCMA, or TACI and exhibits toxicity.
  • Expression CHO cells, BCMA-expressing CHO cells, and TACI-expressing CHO cells were co-cultured with BAFF.CAR-T cells or cytotoxic T cells (Mock T cells) into which an empty vector was introduced for 6 hours.
  • a non-radioactive cytotoxicity assay that measures the degree of cytotoxicity of cytotoxic T cells to target cells by the amount of lactate dehydrogenase present in the supernatant after co-culture used
  • cytotoxic T cells (1x10 5 cell) and target cells (1x10 4 cell) into wells of a 96-well cell culture dish, set the effector: target ratio to 10:1, and inoculate so that the volume per well is 100 ⁇ l. Centrifuge for 4 minutes under the condition of 250g using a centrifuge to close the gap between cells. Then, after culturing for 6 hours, 50 ⁇ l of the supernatant from each well was removed and transferred to a transparent 96-well dish for measuring absorbance, and then the enzyme reaction was progressed and stopped by treating the assay solution and 1M hydrochloric acid solution.
  • the degree of cytotoxicity of the cytotoxic T cells in each well was quantified by measuring and converting the absorbance in the 490 nm wavelength band using a fluorescence/emission/absorption meter (multi-detection plate reader).
  • the prepared chimeric antigen receptor-expressing cytotoxic T cells were 27.99% in the BAFF receptor-expressing CHO cell line, 20% in the BCMA-expressing CHO cell line, and TACI-expressing CHO cell line. showed high toxicity of more than 25.42% to Mock CHO cell line, whereas it showed toxicity of 4.15% to Mock CHO cell line.
  • cytotoxic T cells (Mock T cells) introduced with the empty vector as a control group, they showed low toxicity of 3.02% to the BAFF receptor-expressing CHO cell line, 5.58% to the BCMA-expressing CHO cell line, and 4.85% to the TACI-expressing CHO cell line. , showed toxicity of 7.24% against Mock CHO cell line.
  • the chimeric antigen recognition receptor-expressing cytotoxic T cells containing the extracellular domain of BAFF showed cytotoxicity specific to the BAFF receptor, BCMA or TACI protein, and thus cancer-related cancers using the CAR-T cells It was confirmed that cell therapy is possible.
  • BAFF receptor-expressing CHO cells which are the target cells selected in Example 3, to determine whether the prepared chimeric antigen receptor-expressing NK cells specifically recognize BAFF receptor-, BCMA-, and TACI-expressing cells and exhibit toxicity.
  • BCMA-expressing CHO cells and TACI-expressing CHO cells were co-cultured with BAFF.CAR-NK cells or Mock NK cells into which an empty vector was introduced.
  • a non-radioactive cytotoxicity assay was used to measure the degree of cytotoxicity of NK cells to target cells with the amount of lactate dehydrogenase present in the supernatant. .
  • the degree of cytotoxicity of NK cells in each well was quantified by measuring and converting the absorbance in the 490 nm wavelength band using a fluorescence/luminescence/absorption meter (multi-detection plate reader).
  • the prepared chimeric antigen receptor-expressing cytotoxic T cells were 67.88% in the BAFF receptor-expressing CHO cell line, 57.06% in the BCMA-expressing CHO cell line, and 57.06% in the TACI-expressing CHO cell line. While it showed high toxicity of 60.84% or more, it showed toxicity of 31.68% against Mock CHO cell line.
  • mock NK cells introduced with the empty vector as a control group, they showed low toxicity of 22.72% to BAFF receptor-expressing CHO cell lines, 22.49% to BCMA-expressing CHO cell lines, and 27.00% to TACI-expressing CHO cell lines. , showed 26.18% toxicity against Mock CHO cell line.
  • chimeric antigen recognition receptor-expressing NK cells containing the extracellular domain of BAFF showed specific cytotoxicity to the BAFF receptor, BCMA or TACI protein, and thus related cancer cell treatment using the CAR-NK cells was able to confirm that it is possible.

Abstract

본 발명은 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는, BAFF의 세포외 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체; 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드; 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 벡터로 형질전환된 세포; 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제 또는 암 및 전신 홍반성 루프스의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 BAFF의 세포외 도메인을 포함한다. 따라서, 상기 키메릭 항원 수용체를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포의 경우 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암종 및 자가면역질환에 특이적으로 세포독성을 갖게되므로 암 및 전신 홍반성 루프스 치료를 위한 면역세포 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

BAFF 세포외 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도
본 발명은 BAFF 세포외 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR); 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드; 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 벡터로 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포(Natural killer cell, NK cell); 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제 또는 암 및 전신 홍반선 루프스의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
B-cell activating factor (BAFF)는 tumor necrosis factor (TNF) 리간드에 속하는 사이토카인이며, BLyS (B-lymphocyte stimulator), TALL-1 (TNF- and ApoL related leukocyte-expressed ligand 1), THANK (TNF homologue that activates apoptosis, nuclear factor-κB and c-Jun NH2-terminal kinase), TNFSF13B (TNFsuperfamily member 13B) 또는 zTNF4로 불리운다(Mackay and Browning, 2002). BAFF는 원래 285개의 아미노산으로 구성된 type 2 막관통 단백질(transmembrane protein)로 동형3합체(homotrimer)로 세포 표면에 발현된 후, 막관통 부분이 잘려져 나가 세포외로 분비된다. BAFF는 대식세포(macrophage), 단핵구세포(monocyte), 수지상세포(dendritic cell)에서 분비된다(Mackay and Browning, 2002). BAFF와 결합하는 수용체는 BAFF 수용체(BAFF receptor), B-cell maturation antigen (BCMA), Transmembrane activator and CAML interactor (TACI) 등이 있다(Mackay and Browning, 2002). BAFF 수용체는 골수내 형질세포(plasma cell)를 제외한 대부분의 사람 B 세포에서 발현되며, BCMA는 주로 항체를 분비하는 사람 세포에서 발현된다(Mackay and Schneider, 2009). 또한 TACI는 대부분의 말초 B 세포에서 발현된다(Mackay and Schneider, 2009). 따라서, BAFF와 BAFF와 결합하는 3가지 수용체인 BAFF 수용체, BCMA, TACI의 상호 작용에 의한 신호 전달은 B 세포 활성에 매우 중요하다고 여겨진다(Mackay and Schneider, 2009).
BAFF와 결합하는 3가지 수용체인 BAFF 수용체, BCMA, TACI는 또한, 다양한 암종(malignant cells)에서 과발현이 관찰된다. 특히 BCMA는 다발성 골수종(multiple myeloma)의 표지 인자이며(Carpenter et al., 2013), 유방암(breast cancer), T 세포 림프종(T cell lymphoma), 만성 B 림프구성백혈병(B cell Chronic lymphocytic leukemia, B-CLL), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer) 등에서 발견된다(Haiat et al., 2006; Dou et al., 2016; Kampa et al., 2020). 또한, BAFF 수용체는 B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 광범위큰 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B 세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma) 등 다양한 림프종에서 발현하며, 또한, 급성림프아구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성림프아구성백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL) 등과 같은 백혈병에서도 발현한다. 이 밖에도 BAFF 수용체는 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE) 같은 자가면역질환의 B 세포에도 과발현 된다(Haiat et al., 2006; Parameswaran et al., 2010; Takahata et al., 2010; Yang et al., 2014). 한편, TACI는 다발성 골수종(multiple myeloma), 유방암(breast cancer), 갑상선암(thyroid carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer) 등에서 발견된다(Moreaux et al., 2009; Dou et al., 2016; Kampa et al., 2020).
효과적인 암 치료를 위해서 직접적으로 암 세포를 표적하는 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocytes, CTL)와 자연살생세포(natural killer cell, NK cell)가 중요하다는 사실이 보고되어왔다. 지금까지 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포를 이용한 항암 치료에 대한 연구는 환자 유래 특정 암 항원을 환자의 세포독성 T 세포에 전달하여 활성을 유발하거나, 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity)을 유발하고자 하였다(Galluzzi et al., 2018; Lu et al., 2020). 하지만, 최근에는 세포독성 T 세포와 자연살생세포를 이용한 새로운 항암 치료 방법이 도입되었다. 즉, 항원을 인식하는 항체의 단일사슬 Fv 단편(single-chain variable fragment, scFv) 부분을 CD3 제타(zeta) 또는 다른 단백질의 세포질내 신호전달 도메인(cytoplasmic signaling domain)에 접목시킨 도메인에 접목시킨 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 전달하는 방법으로 시도되었다. 키메릭 항원 수용체를 T 세포 또는 자연살생세포에 접목시키면 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에 의한 신호 전달과 관계없이 단일사슬 Fv 단편의 특정 항원 인지만으로 T 세포 또는 자연살생세포의 항암 작용을 활성화시킬 수 있으며, 또한 HLA type에 제한적이지 않아 많은 사람들이 보편적으로 사용할 수 있는 보다 효율적인 치료 방법으로 이용할 수 있다. 실제로, 이러한 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포나 자연살생세포는 여러 암에서 효능을 보이고 있다(Holzinger et al., 2016; Pettitt et al., 2018; Wang et al., 2020).
현재, BCMA 또는 BAFF 수용체를 종양항원으로 인식하는 CAR-T T세포(미국공개특허 제2020-0283534호)나 수용성 TACI 이뮤노글로불린 조성물과 사용 방법(미국등록특허 제08524232호)가 공개되어 있으나, BAFF 수용체, BCMA, TACI가 발현되는 암세포에 대한 결합 특이성을 갖는 BAFF의 세포외 도메인(extracellular domain)을 항원 결합 도메인에 포함하여 면역 항암 치료제로서 이용하는 발명에 대해서는 기재된 바 없다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 다양한 암세포에서의 BAFF 수용체, BCMA, TACI 발현이 확인 또는 유도된다는 점과, 상기 BAFF와 BAFF 수용체, BCMA, TACI의 결합이 가능하다는 점을 이용하여 BAFF의 세포외 도메인을 사용한 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 암 특이적 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포와 자연살생세포를 제작하고, 상기 T 세포 또는 자연살생세포가 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 세포에 특이적으로 세포독성 능력이 있음을 실험을 통해 확인하였다. 이때, BAFF의 세포외 도메인 각각을 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)과 연결하는 융합 단백질을 만들어 신호 전달 강도를 증폭하였다. 즉, 기존의 키메릭 항원 수용체는 단일사슬 Fv 단편에 의해 항원을 인식하는 부위가 하나인 반면에, 본 발명자들이 고안한 키메릭 항원 수용체는 BAFF의 세포외 도메인 각각을 인간 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)과 연결시켜, 키메릭 항원 수용체 하나당 2개의 BAFF의 세포외 도메인이 항원을 인식하게 하여, 신호 전달 강도를 증폭하고자 하였다.
따라서 본 발명의 목적은 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는, BAFF의 세포외 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드, 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 포함하는, 세포 치료제 또는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암 및 전신 홍반성 루프스의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 항원 결합 부위인 세포외 도메인; 막관통 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)로서, 상기 항원 결합 도메인은 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 BAFF의 세포외 도메인을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드, 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 T 세포 또는 자연살생세포를 포함하는, 세포 치료제 또는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암 및 전신 홍반성 루프스의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 BAFF의 세포외 도메인을 포함한다. 따라서, 상기 키메릭 항원 수용체를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포의 경우 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암종 및 자가면역 질환에 특이적으로 세포독성을 갖게 되므로 암 및 전신 홍반성 루프스 치료를 위한 면역세포 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 렌티바이럴 벡터의 모식도이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 레트로바이럴 벡터의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포독성 T 세포 또는 자연살생세포 표면에 발현하는 키메릭 항원 수용체의 모식도이다.
도 4a는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 표적인 BAFF 수용체를 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 발현하기 위해 BAFF 수용체 cDNA를 레트로바이럴 벡터에 삽입한 모식도이다.
도 4b는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 표적인 BCMA를 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 발현하기 위해 BCMA cDNA를 레트로바이럴 벡터에 삽입한 모식도이다.
도 4c는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 표적인 TACI를 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 발현하기 위해 TACI cDNA를 레트로바이럴 벡터에 삽입한 모식도이다.
도 5a는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 표적인 BAFF 수용체를 발현하는 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에서 BAFF 수용체의 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5b는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 표적인 BCMA를 발현하는 CHO cell에서 BCMA의 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5c는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 표적인 TACI를 발현하는 CHO cell에서 TACI의 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 세포독성 T 세포(BAFF CAR-T cell)에서의 GFP의 발현 비율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 레트로바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 자연살생세포(BAFF CAR-NK cell)에서의 BAFF의 발현 비율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 세포독성 T 세포(BAFF CAR-T cell)가 BAFF 수용체를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 세포독성 T 세포(BAFF CAR-T cell)가 BCMA를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 세포독성 T 세포(BAFF CAR-T cell)가 TACI를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 레트로바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 자연살생세포(BAFF CAR-NK cell)가 BAFF 수용체를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 레트로바이러스 시스템을 이용하여 형질도입 시킨 자연살생세포(BAFF CAR-NK cell)가 BCMA를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 레트로바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 자연살생세포(BAFF CAR-NK cell)가 TACI를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포독성 T 세포(BAFF CAR-T cell) 또는 공벡터를 형질도입시킨 세포독성 T 세포(Mock T cell)를 작동세포(effector cell)로 하여 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 각각 발현하는 CHO 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 자연살생세포(BAFF CAR-NK cell) 또는 공벡터를 형질도입시킨 자연살생세포(Mock NK cell)를 작동세포(effector cell)로 하여 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 각각 발현하는 CHO 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 하나의 양태로서, 항원 결합 도메인; 막관통 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)로서, 상기 항원 결합 도메인은 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 BAFF의 세포외 도메인을 포함하는, 키메릭 항원 수용체를 제공한다.
본 발명에서 "키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)"는 자연적으로 T 세포 또는 자연살생세포가 활성화하는데 필요한 항원 제시 세포(APC)나 항체의 매개 없이 원하는 항원에 결합하여 항원-항체 반응을 통해 T 세포의 활성화를 유도하고 해당 항원을 발현하는 세포를 공격할 수 있도록 하기 위해 T 세포 또는 자연살생세포에 발현시키기 위한 융합 단백질을 의미한다. 즉, T 세포 또는 자연살생세포에 발현 시 항원에 결합하여 이들 세포들의 활성화를 유도하는 단백질이라고 볼 수 있다. 이를 통해 면역 반응을 일으키고자 하는 세포에 특이적인 항원을 인식하는 단백질일 수 있으며, 상기 면역 반응을 일으키고자 하는 세포는 특정 조직에 존재하거나 병변을 일으킨 조직을 이루는 세포를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체 단백질은 기능적 동등물을 포함할 수 있다. '기능적 동등물’이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 키메릭 항원 수용체 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. '실질적으로 동질의 생리활성’이란 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 가진 것을 의미한다.
본 발명은 또한 키메릭 항원 수용체의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 '단편', '유도체' 및 '유사체'는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (1) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (2) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (3) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (4) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.
B-cell activating factor (BAFF)는 tumor necrosis factor (TNF) 리간드에 속하는 사이토카인이며, BLyS (B-lymphocyte stimulator), TALL-1 (TNF- and ApoL related leukocyte-expressed ligand 1), THANK (TNF homologue that activates apoptosis, nuclear factor-κB and c-Jun NH2-terminal kinase), TNFSF13B (TNFsuperfamily member 13B) 또는 zTNF4로 불리운다. BAFF는 원래 285개의 아미노산으로 구성된 type 2 막관통 단백질(transmembrane protein)로 동형3합체(homotrimer)로 세포 표면에 발현된 후, 막관통 부분이 잘려져 나가 세포외로 분비된다. BAFF는 대식세포(macrophage), 단핵구세포(monocyte), 수지상세포(dendritic cell)에서 분비된다. BAFF와 결합하는 수용체는 BAFF 수용체(BAFF receptor), B-cell maturation antigen (BCMA), Transmembrane activator and CAML interactor (TACI) 등이 있다.
상기 BAFF의 세포외 도메인은 서열번호 1 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)은 서열번호 2 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "BAFF 수용체", "BCMA", "TACI"는 다양한 암종(malignant cells)과 자가면역질환, 바람직하게는 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE)에서 관찰된다. 지금까지 "BAFF 수용체", "BCMA", "TACI"를 발현하는 암종은 급성림프아구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성림프아구성백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 광범위큰 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), B 세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), T 세포 림프종(T cell lymphoma), 유방암(breast cancer), 갑상선암(thyroid carcinoma) 및 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "막관통 도메인(Transmembrane domain)"은 BAFF의 세포외 도메인과 보조자극, 필수 신호전달 도메인을 세포막 사이로 연결하는 부위이며, 세포내 신호 전달 도메인은 항원 결합 도메인의 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다.
일 실시예에서, 상기 막관통 도메인은 CD28, CD3엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 CD8은 CD8α의 막관통 도메인일 수 있고, 이는 서열번호 3 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "세포내 신호전달 도메인"은 항원 결합 도메인에 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다. 일 실시예에서, 상기 세포내 도메인은 CD28, 4-1BB, CD3 제타(zeta) 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 세포내 신호전달 도메인으로 CD28, 4-1BB, CD3 제타(zeta)를 이용함으로써 높은 활성으로 암 세포, 특히 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 암세포에 대한 사멸 효과를 나타낼 수 있다.
상기 CD28은 서열번호 4 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 4-1BB(CD137)은 서열번호 5 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, CD3 제타(zeta)는 NK 세포 활성화 도메인으로 기능하며, 서열번호 6 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
상기 항원 결합 도메인은 CD8α 신호 펩타이드를 포함할 수 있으며, 상기 CD8α 신호 펩타이드는 서열번호 7 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 다른 하나의 양태로서, 상기 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 항원 수용체를 암호화하는 폴리 뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 항원 수용체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항원 수용체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리 뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명에 따른 또 다른 하나의 양태로서 상기 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 항원 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
본 발명에서는 바람직한 일 실시예로서, 렌티-바이러스용 벡터 또는 레트로-바이러스용 벡터를 사용할 수 있으며, 본 발명의 하기 실시예에서는 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터(렌티-바이러스용 벡터)와 pLNCX2(레트로-바이러스용 벡터)를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 일시예에서, BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 상기 벡터를 통해 세포에 도입하여 세포를 형질전환시킬 수 있다. 상기 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구, B 세포, 자연살생세포, 또는 NKT 세포일 수 있으며, 바람직하게는, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)또는 자연살생세포 일 수 있다. 상기 세포는 골수, 말초혈액, 말초혈액단핵세포 또는 제대혈로부터 얻거나 제조될 수 있으며, 세포는 인간 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같이 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입되어 형질전환된 세포는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 항원으로 인식하고 이와 강하게 결합하는 특징을 가진다.
본 발명에서, "키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(chimeric antigen receptor T cell, 이하 간략하게 'CAR-T 세포'라 약칭함)" 또는 "키메릭 항원 수용체 발현 NK 세포(chimeric antigen receptor NK cell, 이하 간략하게 'CAR-NK 세포'라 약칭함)"란 정상의 T 세포 또는 자연살생세포를 형질도입 등의 방법으로 본래의 T 세포 수용체 또는 NK cell 수용체가 아닌 암세포에 특이적으로 반응하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포 또는 NK cell을 의미한다. 이 수용체를 갖는 T 세포 또는 NK 세포는 표적세포(target cell)의 세포자살을 유도하여 세포독성을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 특히 CAR-T 세포나 CAR-NK 세포는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell) 또는 NK cell에 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입된 세포일 수 있다. 상기 세포는 CAR-T 치료제의 기존 장점인 항암 특이적 표적 치료의 장점을 가지며, 특히, 본 발명의 CAR-T 세포나 CAR-NK 세포는 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 암세포를 인지하여 효과적으로 파괴할 수 있다.
따라서 본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 세포를 포함하는 세포 치료제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 암 및 자가면역질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
상세하게는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 개체란, BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한 없이 포함된다.
본 발명에 있어 치료 대상이 되는 질환은 암 및 자가면역질환이 있다. 상기 자가면역질환은 바람직하게는 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE)이며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 암의 종류로는 급성림프아구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성림프아구성백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 광범위큰 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), B 세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), T 세포 림프종(T cell lymphoma), 유방암(breast cancer), 갑상선암(thyroid carcinoma) 및 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 유전자 합성 방법에 의한 키메릭 항원 수용체 유전자의 클로닝
본 발명의 키메릭 항원 수용체를 제조하기 위해서 BAFF의 세포외 도메인 중 도메인 한 쌍을 각각 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)에 연결시킨 항원 인식 부위와 CD8α의 막관통 도메인, CD28, 4-1BB, CD3 제타(zeta) 각각의 세포내 도메인 부분의 단백질 암호화 서열을 유전자 데이터베이스(database)에서 확인하였다.
그 후 상기 도메인들을 이루는 염기서열의 종결 코돈 부분을 제외한 나머지 서열들을 하나로 이어 유전자 합성을 진행하였다. 유전자 합성의 정확도는 단백질 발현 플라스미드를 제작한 후 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 상기 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역을 나타낸 모식도를 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 키메릭 항원 수용체 단백질 발현 플라스미드 제조
BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 인식하고, 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역과 신호전달 단백질 도메인을 융합시킨 재조합 단백질을 세포독성 T 세포와 자연살생세포에 발현시키기 위해, 해당 유전자를 렌티바이러스 유래 발현벡터인 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(System Biosciences) 또는 레트로바이러스 유래 발현벡터인 pLNCX2(Addgene)에 클로닝하였다.
먼저, pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터에 클로닝하기 위해서 5′말단에 제한효소 XbaI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들고, 3′말단에도 제한효소 NotI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들었다. 그 후 중합효소연쇄반응으로 인해 제한효소 절단 부위를 가진 유전자를 5′말단은 XbaI을 처리하였으며, 3′말단은 NotI을 처리하였다. 그리고 발현 벡터의 다중클로닝 자리를 XbaI과 NotI을 처리하여 유전자가 삽입될 수 있게 만들었다. 제한효소가 처리된 유전자와 발현 벡터를 섞어 준 다음, 결합 효소(ligase)를 처리하여 연결하였다.
다음, pLNCX2 벡터에 클로닝하기 위해서 5′말단에 제한효소 Bgl II의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들고, 3′말단에도 제한효소 NotI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단 부위를 만들었다. 그 후 중합효소연쇄반응으로 인해 제한효소 절단 부위를 가진 유전자를 5′말단은 BglII를 처리하였으며, 3′말단은 NotI을 처리하였다. 그리고 발현 벡터의 다중클로닝 자리를 BglII과 NotI을 처리하여 유전자가 삽입될 수 있게 만들었다. 제한효소가 처리된 유전자와 발현 벡터를 섞어 준 다음, 결합 효소(ligase)를 처리하여 연결하였다.
그 결과, BAFF 수용체, BCMA, TACI를 인식하고, 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역과 신호전달 단백질 도메인을 융합시킨 단백질(도 3 참조)을 발현하는 재조합 벡터 BAFF 수용체, BCMA, TACI.CAR-T.pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 및 BAFF 수용체, BCMA, TACI.CAR-NK.pLNCX2를 완성하였다(도 2a 및 2b 참조).
실시예 3. BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 세포주 제작
BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 세포 표면에 발현하는 세포주를 제작하기 위해서, BAFF 수용체, BCMA, TACI 유전자 각각을 5′말단에 제한효소 Bgl II 절단 부위 서열과 3′말단에 제한효소 Hind III의 절단 부위 서열을 이용하여 pLNCX2 벡터에 클로닝 하였다(도 4a, 4b 및 4c 참조).
그 후, BAFF 수용체, BCMA, TACI 유전자가 삽입된 pLNCX2 벡터를 Chinese hamster ovary (CHO) 세포(ATCC)에 도입하기 위하여 293GPG 세포를 사용한 레트로바이러스 시스템을 이용하였다. 먼저, 293GPG 세포 3Х106개를 10ml의 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배양액 10ml에 풀어 100π 세포 배양 접시에 접종 후 24시간 동안 배양하였다. 앞서 제작한 재조합 벡터(BAFF-R.pLNCX2 벡터, BCMA.pLNCX2 벡터, TACI.pLNCX2 벡터) (20 μg) 각각을 calcium phosphate 및 HEPES-buffered solution을 이용하여 결정화시킨 후 앞서 배양한 293GPG 세포의 배양액에 첨가해주었다. 이후 24시간 간격으로 72시간에 걸쳐 배양액을 교체하며 레트로바이러스를 함유한 293GPG 세포의 배양 상층액을 채취 및 보관하였다. 상기 채취한 레트로바이러스 함유 상층액은 초고속 원심분리기를 이용하여 21,000 rpm으로 2시간 동안 원심분리 후 농축 이전 대비 100배로 농축될 수 있도록 10% 송아지 혈청 함유 DMEM (welgene)에 재구성하였다. 농축한 레트로바이러스를 CHO 세포에 형질도입하기 위해 CHO 세포를 24 well 세포 배양 접시에 5Х105/ml의 밀도로 접종하였다. 그 다음 농축된 레트로바이러스에 polybrene을 8 μg/ml만큼 첨가한 혼합액을 배양 중인 CHO 세포의 배양액에 추가한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새 배양액으로 교체하였으며 유전자가 도입된 세포의 선별을 위해 배양액 교체 후 24시간 후부터는 neomycin 항생제(600 μg/ml)가 첨가된 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배양액을 이용하여 레트로바이러스를 처리해준 CHO 세포를 배양하였다. 14일 간의 neomycin 선별과정을 마친 CHO 세포는 다시 신선한 배양액에 옮겨 1주일간 증식시켰다.
증식 후 유세포 분석을 이용해 CHO 세포의 BAFF 수용체, BCMA, TACI 발현량을 각각 측정하였으며 재조합 벡터(BAFF-R.pLNCX2 벡터, BCMA.pLNCX2 벡터, TACI.pLNCX2 벡터)를 도입한 각각의 CHO 세포와 공벡터인 pLNCX2를 도입한 CHO 세포(Mock CHO cell)의 BAFF 수용체, BCMA, TACI 발현량을 항 인간 BAFF 수용체 항체(Biolegend), 항 인간 BCMA 수용체 항체(Biolegend), 항 인간 TACI 수용체 항체(Biolegend)를 이용한 유세포분석기를 이용하여 비교한 각각의 결과를 도 5a 내지 5c에 나타내었다.
상기 결과를 근거로 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 강하게 발현하는 CHO 세포주 각각을 표적세포(target cell)로 이용하였으며, BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하지 않는 Mock CHO cell 세포주를 표적세포(target cell)의 음성 대조군으로 사용하였다.
실시예 4. 세포독성 T 세포 분리 및 활성화
본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 제작하기 위해 먼저 세포 독성 T 세포를 사람의 말초 혈액 단핵세포에서 분리하였다. 사람의 말초 혈액 단핵세포(메디랩 코리아)를 구입한 후, 세포독성 T 세포를 분리하기 위해서 자력이용 세포 분리법(magnetic-activated cell sorting)을 이용하였다. 말초 혈액 단핵세포들을 세포독성 T 세포를 제외한 다른 면역세포들과 결합 가능한 항체(CD8+ T cell biotin-conjugated antibody cocktail, Miltenyi Biotec)와 결합시킨 다음, 상기 항체들을 다시 자성을 가진 마이크로비드(anti-biotin microbead)(Miltenyi Biotec)와 결합시켰다. 상기 마이크로비드와 그에 붙은 항체, 세포들을 자기장 분리 칼럼(magnetic seperation column) (Miltenyi Biotec)에 통과시켜 그 중 항체로 표지되지 않은 세포독성 T 세포를 얻었다. 분리한 세포독성 T 세포의 순도를 확인하기 위하여 세포독성 T 세포의 세포표면 인자인 CD8과 CD3ε을 이용한 유세포 분석을 실시하였고 그 결과 95% 이상의 순도를 보였다.
분리한 세포독성 T 세포의 활성화를 위해 1Х106개/ml의 사람 CD3와 CD28 항체가 코팅된 자석비드(Thermo Fisher Scientific), 그리고 100 U/μl recombinant human IL-2가 첨가된 10% 송아지 혈청 함유 RPMI (Welgene)에 1.5Х106 개/ml의 밀도로 세포를 재구성하여 24 웰(well) 세포 배양 접시에 접종 후 24시간 동안 배양하였다.
실시예 5. 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포 제작
상기 실시예 2를 통해 제작한 재조합 벡터를 세포독성 T 세포에 도입하기 위하여 293FT 세포(Thermo Fisher Scientific)를 사용한 렌티바이러스 시스템을 이용하였다.
먼저, 293FT 세포를 100π 세포 배양 접시에 2.5Х106 세포가 되도록 접종한 후, 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포가 접시의 60~70% 정도를 덮을 정도로 자라면, 20μg의 BAFF.CAR-T.pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터 DNA를 10μg의 psPAX2(Addgene)와 3μg의 pMD2.G(Addgene) 벡터를 Calcium phosphate 및 Hepes-buffered solution을 이용하여 결정화시킨 후 293FT 세포에 도입하였다. 그 후, 상기 발현 벡터가 도입된 293FT 세포를 48시간 후 24시간 간격으로 렌티바이러스를 포함하는 배양 상층액을 모았다. 모은 상층액을 초고속 원심분리기를 21,000 rpm으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 농축시켰다. 농축된 바이러스를 polybrene 4 μg/ml과 혼합하여 활성화시킨 세포독성 T 세포의 배양액에 추가한 후 원심분리기를 이용해 1,800g로 75분 동안 원심분리하여 형질도입을 진행하였다. 원심 분리를 마친 세포독성 T 세포는 4시간 동안 추가 배양 후 10% 송아지 혈청 함유 RPMI 배양액으로 교체하였으며 48시간 후에는 형질도입한 세포독성 T 세포의 일부를 형질도입 효율 측정에 사용하였다. 형질도입 효율은 세포 내부의 GFP 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정했으며 형질도입된 세포독성 T 세포(BAFF CAR-T cell)를 공벡터로 제작한 바이러스를 형질도입한 세포독성 T 세포(Mock T cell)의 형질도입 비율과 비교한 결과를 도 6a에 나타내었다.
실시예 6. 키메릭 항원 수용체 발현 자연살해세포 제작
상기 실시예 2를 통해 제작한 재조합 벡터를 NK 세포에 도입하기 위하여 293GPG 세포를 사용한 레트로바이러스 시스템을 이용하였다.
먼저, 293GPG 세포 3Х106개를 10ml의 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배양액 10ml에 풀어 100π 세포 배양 접시에 접종 후 24시간 동안 배양하였다. 앞서 제작한 재조합 벡터(BAFF.CAR-NK.pLNCX2 벡터) 20μg을 calcium phosphate 및 HEPES-buffered solution을 이용하여 결정화시킨 후 앞서 배양한 293GPG 세포의 배양액에 첨가해주었다. 이후 24시간 간격으로 72시간에 걸쳐 배양액을 교체하며 레트로바이러스를 함유한 293GPG 세포의 배양 상층액을 채취 및 보관하였다. 상기 채취한 레트로바이러스 함유 상층액은 초고속 원심분리기를 이용하여 21,000 rpm으로 2시간 동안 원심분리 후 농축 이전 대비 100배로 농축될 수 있도록 10% 송아지 혈청 함유 Myelocult H5100 배양액(STEMCELL)에 재구성하였다. 농축한 레트로바이러스를 NK92MI 세포(American type culture collection, ATCC)에 형질도입하기 위해 NK92MI 세포를 24 well 세포 배양 접시에 5Х105/ml의 밀도로 접종하였다. 그 다음 농축된 레트로바이러스에 polybrene을 8ug/ml만큼 첨가한 혼합액을 배양 중인 NK92MI세포의 배양액에 추가한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새 배양액으로 교체하였으며 유전자가 도입된 세포의 선별을 위해 배양액 교체 후 24시간 후부터는 neomycin 항생제(600μg/ml)가 첨가된 Myelocult H5100 배양액을 이용하여 레트로바이러스를 처리해준 NK92MI세포를 배양하였다. 14일 간의 neomycin 선별과정을 마친 NK92MI 세포는 다시 신선한 배양액에 옮겨 1주일간 증식시켰다.
증식 후 유세포 분석을 이용해 NK92MI세포의 BAFF 발현량을 측정하였으며 BAFF.CAR-NK.pLNCX2를 도입한 NK92MI 세포(BAFF CAR-NK cell)와 공벡터인 pLNCX2를 도입한 NK92MI 세포(Mock NK cell)의 BAFF 발현량을 항 인간 BAFF 항체(Biolegend)를 이용한 유세포분석기를 이용하여 비교한 결과를 도 5b에 나타내었다.
실시예 7. 키메릭 항원 수용체와 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 사람 세포주의 친화도 측정
상기 제작한 키메릭 항원 수용체가 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 사람 세포주와 친화도가 있는지 확인하기 위하여, 실시예 5 및 실시예 6에서 제작한 BAFF CAR-T cell과 BAFF CAR-NK cell이 BAFF 수용체, BCMA, TACI와 결합하는가를 측정하기 위해, 수용성 재조합 human BAFF 수용체 IgG (Acrobiosystems), 수용성 재조합 BCMA IgG (R&D systems), 수용성 재조합 TACI IgG (R&D systems) 각각을 BAFF CAR-T cell과 BAFF CAR-NK cell에 처리하여 유세포 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과, 수용성 재조합 human BAFF 수용체 IgG, 수용성 재조합 BCMA IgG, 수용성 재조합 TACI IgG 모두는 Mock T cell과 결합하지 않지만, BAFF CAR-T cell과 결합하며(도 7a 내지 7c 참조), 또한 Mock NK cell과 결합하지 않지만, BAFF CAR-NK cell과는 결합하였다(도 8a 내지 8c 참조).
상기 결과를 근거로 제작한 키메릭 항원 수용체를 발현하는 BAFF CAR-T cell과 BAFF CAR-NK cell을 작동세포(effector cell)로 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 CHO 세포주를 표적세포(target cell)로, BAFF CAR-T cell과 BAFF CAR-NK cell의 BAFF 수용체, BCMA, TACI 특이적 세포독성을 검증하였다.
실시예 8. CAR-T 세포의 BAFF 수용체, BCMA , TACI 발현 세포 특이적 세포독성 검증
상기 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포가 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 세포를 특이적으로 인지하여 독성을 나타내는지 확인하기 위해 실시예 3에서 선정한 표적세포(target cell)인 BAFF 수용체 발현 CHO 세포, BCMA 발현 CHO 세포, TACI 발현 CHO 세포를 BAFF.CAR-T cell 혹은 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포(Mock T cell)와 6시간 동안 공배양하였다. 공배양 후 상층액에 존재하는 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)의 양으로 세포독성 T 세포의 표적세포(target cell)에 대한 세포독성 정도를 측정하는 비방사성 세포독성 분석법(non-radioactive cytotoxicity assay)을 이용하였다.
먼저, 96 well 세포 배양 접시의 well에 세포독성 T 세포(1x105 cell)와 표적 세포(1x104 cell)를 각각 넣어 effector: target ratio를 10:1로 맞추고, well당 부피는 100μl가 되도록 접종 후 원심분리기를 이용해 250g 조건에서, 4분 동안 원심분리하여 세포 간 간격을 가깝게 만든다. 그 후 6시간 동안 배양 진행 후 각 well의 상층액을 50μl씩 걷어내어 흡광도 측정용 투명 96 well 접시에 옮긴 후 분석용액 및 1M 염산용액을 처리하여 효소 반응을 진행 및 정지시킨다. 효소 반응을 정지시키고 난 후에는 형광/발광/흡광 측정기(multi-detection plate reader)를 이용하여 490nm 파장대의 흡광도를 측정 및 수치 변환하여 각 well의 세포독성 T 세포의 세포독성 정도를 정량화하였다.
그 결과 도 9a에서 나타낸 바와 같이, 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포(BAFF.CAR-T cell)는 BAFF 수용체 발현 CHO 세포주에 27.99%, BCMA 발현 CHO 세포주에 20%, TACI 발현 CHO 세포주에 25.42% 이상의 높은 독성을 보인 반면, Mock CHO 세포주에 대해서는 4.15%의 독성을 나타내었다. 반면, 대조군인 공벡터를 도입한 세포독성 T 세포(Mock T cell)의 경우 BAFF 수용체 발현 CHO 세포주에 3.02%, BCMA 발현 CHO 세포주에 5.58%, TACI 발현 CHO 세포주에 4.85%의 낮은 독성을 보인 반면, Mock CHO 세포주에 대해서는 7.24%의 독성을 나타내었다.
상기 결과를 통해 BAFF의 세포외 도메인을 포함하고 있는 키메릭 항원 인지 수용체 발현 세포독성 T 세포가 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI 단백질에 특이적인 세포독성을 보임으로써, 상기 CAR-T 세포를 이용하여 관련된 암 세포 치료가 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 9. CAR- NK 세포의 BAFF 수용체, BCMA , TACI 발현 세포 특이적 세포독성 검증
상기 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 NK 세포가 BAFF 수용체, BCMA, TACI 발현 세포를 특이적으로 인지하여 독성을 나타내는지 확인하기 위해, 실시예 3에서 선정한 표적세포(target cell)인 BAFF 수용체 발현 CHO 세포, BCMA 발현 CHO 세포, TACI 발현 CHO 세포를 BAFF.CAR-NK cell 혹은 공벡터를 도입한 자연살생세포(Mock NK cell)와 공배양하였다.
공배양 후 상층액에 존재하는 젖산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)의 양으로 NK 세포의 표적세포(target cell)에 대한 세포독성 정도를 측정하는 비방사성 세포독성 분석법(non-radioactive cytotoxicity assay)을 이용하였다.
먼저, 96 well 세포 배양 접시의 well에 자연살해세포(1x105 cell)와 표적 세포(1x104 cell)를 각각 넣어 effector: target ratio를 10:1로 맞추고, well당 부피는 100μl가 되도록 접종 후 원심분리기를 이용해 250g의 조건에서, 4분 동안 원심분리하여 세포 간 간격을 가깝게 만든다. 6시간 배양 진행 후 각 well의 상층액을 50μl씩 걷어내어 흡광도 측정용 투명 96 well 접시에 옮긴 후 분석용액 및 1M 염산용액을 처리하여 효소 반응을 진행 및 정지시킨다. 효소 반응을 정지시키고 난 후에는 형광/발광/흡광 측정기(multi-detection plate reader)를 이용하여 490nm 파장대의 흡광도를 측정 및 수치 변환하여 각 well의 NK 세포의 세포독성 정도를 정량화하였다.
그 결과 도 9b에서 나타낸 바와 같이, 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 세포독성 T 세포(BAFF CAR-NK cell)는 BAFF 수용체 발현 CHO 세포주에 67.88%, BCMA 발현 CHO 세포주에 57.06%, TACI 발현 CHO 세포주에 60.84% 이상의 높은 독성을 보인 반면, Mock CHO 세포주에 대해서는 31.68%의 독성을 나타내었다. 반면, 대조군인 공벡터를 도입한 자연살생세포(Mock NK cell)의 경우 BAFF 수용체 발현 CHO 세포주에 22.72%, BCMA 발현 CHO 세포주에 22.49%, TACI 발현 CHO 세포주에 27.00% 이하의 낮은 독성을 보인 반면, Mock CHO 세포주에 대해서는 26.18%의 독성을 나타내었다.
상기 결과를 통해 BAFF의 세포외 도메인을 포함하고 있는 키메릭 항원 인지 수용체 발현 NK 세포가 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI 단백질에 특이적인 세포독성을 보임으로써, 상기 CAR-NK 세포를 이용하여 관련된 암 세포 치료가 가능함을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 항원 결합 도메인;
    막관통 도메인; 및
    세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)로서, 상기 항원 결합 도메인은 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 BAFF의 세포외 도메인을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인은 BAFF의 세포외 도메인 한 쌍이 이합체(dimer)의 형태로 각각 인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)에 연결된 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 BAFF의 세포외 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  4. 제2항에 있어서,
    인간 이뮤노글로불린 G1 중쇄 불변 영역(IgG1 heavy chain constant region)은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 CD8α이며, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB 및 CD3-zeta로 이루어진 것 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 CD28은 서열번호 4; 4-1BB은 서열번호 5; 및 CD3-zeta은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인은 CD8α 신호 펩타이드를 포함하며, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 항원 수용체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드.
  10. 제9항의 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  11. 제10항의 벡터로 형질전환된 세포.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세포는 세포독성 T 세포 또는 NK 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  13. 제12항의 세포를 유효성분으로 포함하는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암 또는 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE)의 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암은 급성림프아구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성림프아구성백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 광범위큰 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), B 세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), T 세포 림프종(T cell lymphoma), 유방암(breast cancer), 갑상선암(thyroid carcinoma) 및 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제11항의 세포를 포함하는 세포 치료제.
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