WO2022231068A1 - 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법 - Google Patents

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porous
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upper chamber
thin film
culture
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김동성
이성진
김형우
윤재승
김도희
엄성수
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포항공과대학교 산학협력단
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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a microwell platform that can be utilized for the differentiation and culture of three-dimensional cell aggregates, and can reduce the loss of cell aggregates and is continuously uniform due to the flow of a porous microwell and a cell culture medium vertically penetrating it.
  • a three-dimensional cell aggregate culture apparatus providing a microenvironment around one cell aggregate, and a three-dimensional cell aggregate culture method using the same.
  • the cells in the actual body are three-dimensional, and these cells interact with the microenvironment of the cells in three dimensions.
  • the similarity to cells in the body in terms of morphology is greatly lacking, and in the case of three-dimensional culture
  • a phenomenon more similar to the actual in vivo phenomenon can be confirmed.
  • the method commonly used when replacing the above-described cell culture medium is to perform pipetting on the top of the cell culture surface, which is the upper surface of the microwell, collect the used cell culture solution containing metabolites, and inject fresh cell culture solution,
  • loss of cell aggregates may occur in the process of replacing the cell culture medium, and such loss causes a gap between the initial design of the experiment and the results of the experiment.
  • pipetting is performed at intervals of 24 or 48 hours. Fresh cell culture solution immediately after pipetting provides a sufficient environment, whereas the environment around cell aggregates immediately before the next pipetting provides nutrients There is a limit where this is not sufficient.
  • the present invention minimizes the loss of cells and three-dimensional cell aggregates caused by pipetting on the cell culture surface, which is the upper surface of the microwell, for repeated cell culture replacement, which is widely used in the past, and at the same time, continuously uniform cell aggregates.
  • the present invention provides an upper chamber including an opening, a porous thin film, and a porous microwell having a cell culture space for accommodating a culture solution; and a lower chamber having a space in which the upper chamber is disposed, the lower chamber including a fluid outlet at a lower end, wherein the fluid flowing into the upper chamber passes through the porous microwell in the upper chamber and passes through the lower chamber
  • a three-dimensional cell aggregate culture apparatus is provided, which flows through an outlet of the chamber.
  • the present invention comprises the steps of inoculating cells on the porous thin film of the upper chamber using the three-dimensional cell aggregate culture apparatus of the present invention; And it provides a three-dimensional cell aggregate culture method comprising the step of introducing the cell culture solution through the opening to the upper portion of the upper chamber.
  • the present invention it is possible to significantly reduce the possibility of loss of cells and cell aggregates during the process of culturing cells, as well as provide a continuously uniform microenvironment around the cell aggregates.
  • the height of the culture medium can be constant and maintained during the culturing process.
  • Figure 1 shows an exemplary cell culture apparatus of the present invention
  • Figure 1 (a) shows the overall shape of the cell culture apparatus
  • Figure 1 (b) is an enlarged view of a combination of one upper chamber and lower chamber
  • Figure 1 (c) shows a schematic view of an exemplary cell culture apparatus of the present invention, showing a cross-sectional view in the case of including a culture solution reservoir connected to the outlet.
  • Figure 2 shows the flow-related simulation results of the flow of the culture medium permeated through the porous membrane in the exemplary cell culture apparatus of the present invention.
  • FIG. 3 shows a micrograph of a porous microwell in which the porous thin film has a concave portion in an exemplary cell culture apparatus of the present invention.
  • 3(a) is an image enlarged at a magnification of 4 times
  • FIG. 3(b) is a magnification of 220 times.
  • 3 (c) shows a photograph of a porous microwell configured in another form in which the porous thin film has a concave portion in an exemplary cell culture apparatus of the present invention
  • FIG. 3 (c) a) is a DSLR camera
  • FIG. 3 (c) b) and (c) c) are microscopic images magnified by 4 times and 20 times, respectively.
  • the membrane of Transwell insert (Corning, USA) with an 8 ⁇ m pore size, which is a common commercial porous membrane, is attached together for reference (far left, TW).
  • 4(b), (c) and (d) show the porosity (FIG. 4(b)), the hydraulic conductivity of each nanofiber network structure according to the commercial membrane and the electrospinning time (FIG. 4( c)), and the induced pressure.
  • FIG. 5 shows experimental results comparing the degree of loss of cell aggregates when using the exemplary cell culture apparatus of the present invention and the degree of loss of cell aggregates when culturing cells through the conventional cell culture medium replacement method by pipetting.
  • Figure 6 is a numerical simulation of the nutrient concentration around the cell aggregate when using the exemplary cell culture apparatus of the present invention and the nutrient concentration around the cell aggregate when the cells are cultured through the cell culture medium replacement method by conventional pipetting. shows the results of comparison.
  • FIG. 7 shows that the fluid existing in the exemplary cell culture apparatus of the present invention is smoothly replaced with the newly injected fluid, and in this process, the level of the culture medium in the lower chamber is maintained constant.
  • FIG. 8 shows a method for preparing a porous microwell used in an exemplary cell culture apparatus of the present invention.
  • FIG. 9 shows a lower chamber (a) used in an exemplary cell culture apparatus of the present invention and an upper chamber (b) inserted into the lower chamber.
  • a three-dimensional cell aggregate culture apparatus and a culture method using the same, which can solve the problem that the loss of cells and cell aggregates may occur due to the flow of the culture medium.
  • a method for culturing cell aggregates capable of realizing a uniform cell microenvironment, such as nutrients, is provided by the flow around the cell aggregates induced by continuously penetrating the porous microwell.
  • a culture apparatus capable of culturing a three-dimensional cell aggregate and a method for culturing a three-dimensional cell aggregate using the same are provided.
  • the three-dimensional cell aggregate culture apparatus of the present invention includes an upper chamber including an opening, a porous thin film and a porous microwell having a cell culture space for accommodating a culture medium, and a space in which the upper chamber is disposed, and a lower chamber including a fluid outlet in the upper chamber, and the fluid introduced into the upper chamber passes through the porous microwell in the upper chamber and is discharged through the outlet of the lower chamber and flows.
  • the present invention using the three-dimensional cell aggregate culture apparatus of the present invention described above, the steps of inoculating the cells on the porous thin film of the upper chamber; And it provides a three-dimensional cell aggregate culture method comprising the step of introducing the cell culture solution through the opening to the upper portion of the upper chamber.
  • the porous microwell includes a porous thin film at the bottom of which a plurality of polymer nanofibers are randomly entangled, and the porous thin film may be composed of a nanofiber network. Accordingly, in the region between the nanofibers It may include a plurality of pores formed.
  • the porous thin film is made of a nanofiber network, and is a porous thin film having a porosity of 20% to 60%, for example, a porous thin film having a porosity of 30% to 50%.
  • the porosity is less than 20%, the permeability coefficient is lowered, and accordingly, the water pressure applied to the porous thin film increases, thereby causing a problem in that the viability of the cell aggregates being cultured on the porous thin film is reduced.
  • the porous thin film may have an average pore size of 10 nm to 10 ⁇ m. That is, since the porous thin film includes the average pore size in the above range, it can act as a selective permeation membrane that selectively permeates other substances such as nutrients and growth factors in the cell culture medium without permeating single cells. Due to this, it induces aggregation of single cells on the porous thin film to enable the formation of three-dimensional aggregates, and after aggregate formation, it can serve as a material transfer barrier and passage.
  • the porous thin film through which the fluid is permeated may have high permeability characteristics within the particle size range of the porosity and average pore size of the present invention described above.
  • the porous thin film of the present invention has a water permeability of 1 to 20 ⁇ m s -1 (Hydraulic conductivity). When the permeability coefficient is less than 1 ⁇ m s -1 , a high water pressure is caused in the porous membrane, and a water pressure of 1000 Pa or more can be applied to the porous membrane and the cell aggregates being cultured on the thin film, and in this case, the viability of cells is reduced. adverse effects are expected.
  • the porous thin film of the present invention is a nanofiber network for cell culture, and its manufacturing method is not particularly limited, but may be made of, for example, polymer nanofibers formed by electrospinning.
  • the polymer nanofiber may be made of, for example, a polymer resin including at least one of a thermoplastic resin, a thermosetting resin, an elastic polymer, and a biopolymer, for example, polycaprolactone, polyurethane ), polyvinylidene fluoride (Polyvinylidene fluoride, PVDF), polystyrene, collagen (Collagen), gelatin (Gelatin), and may be prepared including at least one or more of chitosan (Chitosan), but is not limited thereto. .
  • a polymer resin including at least one of a thermoplastic resin, a thermosetting resin, an elastic polymer, and a biopolymer, for example, polycaprolactone, polyurethane ), polyvinylidene fluoride (Polyvinylidene fluoride, PVDF), polystyrene, collagen (Collagen), gelatin (Gelatin), and may be prepared including at least one or more of chitosan (Chitos
  • the method for producing the nanofiber network is obtained by, for example, electrospinning a solution in which polycaprolactone is dissolved in a solvent of a chloroform/methanol (3/1 vol/vol) mixture to a concentration of 4 to 10 wt %.
  • the electrospinning is preferably performed at a discharge rate of a polymer solution of 0.1 to 2.0 ml hr -1 under a voltage of 10 to 30 kV, and when the voltage is less than the above range, there is a problem in uniform nanofiber production, If the range is exceeded, there may be a problem in the manufacture of stable nanofibers such as non-uniform stacking of nanofibers.
  • the porous microwell may be a porous thin film in which all or a part of the depression formed concave in the downward direction is preferably a porous microwell, that is, when the opening of the upper chamber is disposed to face upward, the surface forming the bottom is porous formed as a thin film.
  • the porous thin film constituting the lower surface of the upper chamber of the present invention may be formed to have a protrusion and/or a concave portion.
  • a concave portion may be formed using a porous thin film as shown in FIG. 10, or a concave portion may be formed by additionally adding a sidewall or protrusion capable of forming a compartment corresponding to the concave portion on the porous thin film as shown in FIG.
  • the material of the side wall or the protrusion is not particularly limited to that which may or may not be porous.
  • the lower surface of the recess is a porous thin film, and the side wall or protrusion may or may not be porous.
  • FIG. 3(a) and 3(b) are examples showing the shape when the sidewall of the concave portion is not a porous material by laminating an additional layer in which a through hole is formed
  • FIG. 3(c) is the porous thin film itself This is a case in which the concave portion is formed in the , and the concave portion and the non-concave portion are made of a porous material as a whole.
  • the porous microwell may be manufactured by, for example, combining a porous thin film produced by electrospinning with an arrangement of through-holes as shown in FIG. 8, but is not limited thereto.
  • the formation of the concave and protrusion parts of the porous material may be performed using a compression process using a mold as shown in FIG. 10 .
  • the upper surface of the porous thin film of the porous microwell is a region acting as a cell culture layer.
  • the porous thin film has protrusions and concavities, cells are more easily seated in the formed concavities, and the porous microwells By inducing aggregation of single cells in the well, three-dimensional cell aggregates can be stably formed and then cultured.
  • a more preferred porous thin film of the present invention has protrusions and concave parts, and all surfaces are made of a porous thin film.
  • the lower chamber of the three-dimensional cell aggregate culture apparatus of the present invention has a space in which the upper chamber is disposed, and the upper chamber is disposed therein through a fluid outlet through which the fluid can be discharged at the bottom.
  • the culture solution may flow.
  • a device capable of generating a flow may be additionally connected to the upper and/or lower chamber, for example, a device for injecting a cell culture solution into the upper chamber at a constant flow rate may be added, and the lower chamber may be It may be connected to a device for controlling the flow of fluid, such that the fluid introduced into the upper chamber passes through the porous thin film of the upper chamber and is discharged at a constant flow rate while flowing into the lower chamber, which may be, for example, a culture medium reservoir .
  • the device for inducing the flow of fluid is not limited, for example, the device for inducing the flow of fluid is a syringe pump, a peristaltic pump, or an agitator. can be used
  • the three-dimensional cell aggregate culture apparatus of the present invention is disposed on the same plane as the lower chamber, and in fluid communication with the outlet of the lower chamber, may further include a culture medium reservoir, the height of the culture medium in the culture medium reservoir It may be set to correspond to the level of the culture medium in the lower chamber.
  • the water level of the culture medium in the lower chamber may be a height of 1 to 20 mm in the upper direction based on the porous thin film at the bottom of the upper chamber, for example, 1 to 19 mm, preferably 1 to 18 mm, for example For example, it may be 1 to 8 mm. If the water level of the culture medium is less than the above preferred range, it may be impossible to supply nutrients to the cell aggregates in culture, and if it exceeds the above preferred range, overflow and overuse of the culture may result.
  • the interval between the porous thin film at the bottom of the upper chamber and the bottom of the lower chamber may be 0.1 to 8 mm, for example, 0.2 to 7 mm, preferably 1 to 5 mm.
  • the interval is less than the above preferred range, the flow of the cell culture medium is restricted, and discharge through the outlet may be impossible. In addition, when it exceeds the above preferred range, it may lead to overuse of the culture medium.
  • the fluid that is, the cell culture solution may flow while maintaining a constant speed.
  • the inflow and discharge of the fluid may be controlled at a constant speed.
  • the fluid may flow at a rate of 0.0001 to 1 ml hr -1 , for example, 0.001 to 1 ml hr -1 , preferably at a rate of 0.01 to 1 ml hr -1 .
  • the flow rate of the fluid is less than 0.0001 ml hr -1 , there may be a problem in that the required amount of cell culture solution for the cell aggregates is not supplied . Stress can act and adversely affect cell aggregates.
  • a shear stress that does not adversely affect cells for example, a shear stress of 0.001 to 10 dyne cm -2 may have a positive effect on cell differentiation and proliferation.
  • the cell culture medium is preferably applied to the water pressure of less than 1000 Pa to the porous thin film, more preferably as the pressure is less, for example, may be 1 Pa to 100 Pa.
  • the pressure is less, for example, may be 1 Pa to 100 Pa.
  • it exceeds 1000 Pa there is a problem that the cell viability is reduced.
  • a cell culture medium may be used, and the cell culture medium may include FBS, glucose and growth factors, but is not limited as long as it is a cell culture medium used in the art, and a cell culture medium suitable for the cells to be cultured is selected.
  • a culture medium can be used.
  • cell lines such as myoblasts, fetal fibroblasts, umbilical vein endothelial cells, Liver cancer cells (HepG2 cells), epidermal cells, or a mixture of at least one or more thereof may be used.
  • cell lines such as myoblasts, fetal fibroblasts, umbilical vein endothelial cells, Liver cancer cells (HepG2 cells), epidermal cells, or a mixture of at least one or more thereof may be used.
  • HepG2 cells Liver cancer cells
  • epidermal cells or a mixture of at least one or more thereof
  • cell lines such as myoblasts, fetal fibroblasts, umbilical vein endothelial cells, Liver cancer cells (HepG2 cells), epidermal cells, or a mixture of at least one or more thereof may be used.
  • HepG2 cells Liver cancer cells
  • epidermal cells or a mixture of at least one or more thereof may be used.
  • stem cells for example, induced pluripotent stem cells (Induced pluripotent stem cells), mesenchymal-derived stem cells (Mesenchymal stem cells) or cells such as a mixture of at least one or more thereof may be cultured, but is limited thereto No, it is possible to culture spheroids or organoids, which are three-dimensional cell aggregates.
  • induced pluripotent stem cells Induced pluripotent stem cells
  • mesenchymal-derived stem cells mesenchymal stem cells
  • organoids which are three-dimensional cell aggregates.
  • the three-dimensional cell aggregate culture method of the present invention using the three-dimensional cell aggregate culture apparatus of the present invention, the steps of inoculating the cells on the porous thin film of the upper chamber; and introducing the cell culture solution to the upper part of the upper chamber through the opening.
  • the cells may be inoculated on the porous membrane and cultured, and the inoculation may be performed by inoculating cells to be cultured on the porous membrane prior to introducing a fluid into the upper chamber.
  • the cells may be applied to the three-dimensional cell aggregate culture apparatus of the present invention, and the method of inoculating the cells may be performed by a method used in the art, for example, inoculation using a micropipette. .
  • Cells seeded with this method form three-dimensional cell aggregates within hours to days. After the formation of cell aggregates, the flow of the cell culture solution by the developed device can be applied.
  • PCL Polycaprolactone
  • Mn 80,000 g mol -1
  • chloroform and methanol purchased from Sigma-Aldrich (USA).
  • a PCL solution for electrospinning was prepared by dissolving PCL in a mixture of chloroform/methanol (3/1 vol/vol) at a concentration of 7.5 wt%. Put the prepared PCL solution into a 5 ml precision syringe (Gastight syringe; Hamilton) and use a commercial electrospinning machine (ES-robot, NanoNC) through a 23-gauge metal needle placed at a distance of 10 cm over an annular electrode with a diameter of 5 cm. It was discharged at a flow rate of 1ml h -1 .
  • ES-robot, NanoNC commercial electrospinning machine
  • Electrospinning was performed by applying a high voltage of 15 kV between the metal needle and the annular electrode using the commercial electrospinning machine. As-electrospun PCL nanofibers were deposited between annular electrodes to create gas- and mass-permeable nanofiber membranes. Electrospinning was performed at a relative humidity of 50 to 60% and a temperature of 20 to 25 °C. The photomicrograph according to the spinning time when manufacturing the nanofiber network is shown in Fig. 4, and it was confirmed that the nanofiber diameter is about 800-1000 nm, and as the spinning time increases, the average pore size and porosity (Porositiy) decrease. Conversely, the average thickness increased.
  • FIG. 4(a) Structural change (Fig. 4(a)), porosity change (Fig. 4(b)) of the nanofiber network according to the spinning time during the manufacture of the nanofiber network, and the hydraulic conductivity of the porous thin film (Fig. 4(c)) , and the induced pressure (Fig. 4(d)) is shown in Fig. 4, respectively.
  • the calculation method of the porosity was to convert the enlarged microscope image into a binary image, and then use Image J software (NIH, USA) to calculate the area fraction of the pores generated by the nanofiber network compared to the area of the nanofiber network. calculated and shown.
  • FIG. 8 A series of processes were performed to prepare an upper chamber including a porous microwell having a cell culture space for accommodating the porous thin film obtained in 1. and the culture solution, and is shown in FIG. 8 .
  • the porous thin film area at the bottom of the upper chamber was coated with an adhesive on a 500 ⁇ m-thick polymethyl methacrylate plate (PMMA, Acryl Choika, South Korea) and then a laser cutter (ML-7050A, Machineshop, South Korea) was used.
  • An array of through-holes was drilled in the PMMA plate coated with adhesive, and the bottom surface was finally formed as shown in FIG. 3 by combining the through-hole and the porous thin film using the applied adhesive. It was completed by forming a recess made of a porous thin film.
  • FIG. 10 A series of processes for manufacturing the porous thin film region at the bottom of the upper chamber of another type is shown in FIG. 10 . More specifically, the flat porous thin film obtained in step 1. was subjected to a compression process using a protruding mold and a concave mold to complete the lower chamber of the upper chamber having a porous thin film with protrusions and concavities formed on all surfaces of the porous thin film. .
  • the concave mold was manufactured by drilling on a 10 mm thick polymethyl methacrylate plate (PMMA, Acryl Choika, South Korea) using machining equipment (EGX-350, Roland, USA), and polydimethylsiloxane (Polydimethylsiloxane; PDMS), a mixture of PDMS and curing agent (Sylgard 184, Dow Corning, USA) in a weight ratio of 10:1 was poured into a depression mold and cured at 55° C. for 12 hours to complete.
  • PMMA polymethyl methacrylate plate
  • EGX-350 machining equipment
  • PDMS Polydimethylsiloxane
  • a mixture of PDMS and curing agent Sylgard 184, Dow Corning, USA
  • the remaining side part of the upper chamber having an opening shape was manufactured using an injection molding machine (SE50D, Sumitomo, Japan).
  • SE50D injection molding machine
  • the side portion thus obtained and the lower end of the upper chamber obtained above were combined using an adhesive to complete the upper chamber including the porous microwell.
  • a lower chamber composed of polydimethylsiloxane (PDMS) and its cover
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • a mixture of PDMS and curing agent Sylgard 184, Dow Corning, USA
  • the mold of the lower chamber and cover was manufactured using a 20 mm thick PMMA plate using machining equipment (EGX-350, Roland, USA).
  • the lower chamber was manufactured in a size of 30 mm ⁇ 30 mm ⁇ 30 mm, and at this time, a 2 mm deep groove was designed on the upper surface (FIG. 9(a)) of the porous microwell manufactured in 2.
  • the distance interval to the porous thin film was set to 8 mm (FIG. 9(b)).
  • a biopsy punch (Miltex, USA) was used at the bottom of the lower chamber and in the center of the cover to form an outlet by drilling a hole in a size of 1 mm.
  • a tube (Biokonvision, South Korea) was connected through the perforation of the opening cover, and a syringe pump (KDS200, KD Scientific, USA) was injected with the cell culture medium at a flow rate of 0.062 ml h -1 through the tube.
  • a hole in the bottom of the lower chamber was also connected to the tube so that the cell culture solution could be transferred to the culture solution reservoir.
  • the height of the storage is set to correspond to the level of the culture medium in the lower chamber, and the culture medium is continuously introduced from the syringe pump during the cultivation process. It was designed to maintain a constant level of the chamber culture medium.
  • a three-dimensional cell aggregate culture apparatus including a culture medium reservoir capable of storing the discharged culture medium was prepared as shown in FIG. 1 .
  • the height of the culture medium reservoir was set so that the water level of the lower chamber was 12 mm from the bottom of the lower chamber.
  • the thus-obtained dimensional cell aggregate culture apparatus is interchangeably referred to as the 'cell culture apparatus of the present invention' and the 'cell culture apparatus of Example 1'.
  • HepG2 hepatocytes
  • DMEM Dulbeco's Modified Eagle's Media, FBS 10%
  • HepG2 spheroids were formed in the environment.
  • the cell culture medium was continuously injected into the upper chamber at a constant flow rate of 0.062 ml hr -1 using a syringe pump.
  • the HepG2 spheroids were cultured for 8 days by discharging to the culture medium reservoir through the lower chamber formed with the fluid outlet in the lower direction.
  • Cell culture medium replacement using pipetting was performed without using an impermeable microwell composed of the bottom surface of an impermeable PMMA plate rather than a porous thin film and a device that applies the flow of the cell culture medium such as a syringe pump and culture medium reservoir.
  • HepG2 spheroids were cultured in the same manner as in Example 1, except that.
  • the flow velocity in the 3D cell aggregate culture apparatus of Example 1 through COMSOL Multiphysics software (Version 5.0, USA) (Surface velocity: 0 ms -1 ⁇ 8.11 e -6 ms -1 ), flow direction (black cone shape), and streamline (white line) were analyzed and calculated.
  • Example 1 the degree of loss of liver cell spheroids was compared at 2-day intervals, and the results are shown in FIG. 5 .
  • Example 5 there was no loss of liver cell spheroids in Example 1, but in Comparative Example 1, spheroids were continuously lost, and on the 8th day, about 15% of HepG2 cell spheroids were lost. could be seen to occur.
  • Example 1 In Example 1 and Comparative Example 1, COMSOL Multiphysics software (Version 5.0, USA) was used to measure and analyze the concentration of nutrients (glucose) around the HepG2 spheroids over time. The numerical values used in this process are shown in Table 1 below.
  • K is the permeability coefficient of the porous thin film
  • L is the thickness of the porous thin film
  • ⁇ t is the time to reach from h i to h f
  • the permeability of the porous thin film was calculated using the following formula.
  • k is the current permeability of the porous thin film
  • ⁇ is the viscosity of the cell culture medium
  • ⁇ is the density of the cell culture medium
  • g is the gravitational acceleration
  • the water pressure applied to the porous membrane was calculated using the following equation (Kozeny-Carman equation) based on the cell culture medium that permeates the porous membrane at a flow rate of 0.062 ml hr -1 , the measured permeability coefficient and the calculated permeability.
  • v is the current flow rate of the fluid passing through the porous membrane
  • k is the current permeability of the porous membrane
  • ⁇ is the viscosity of the cell culture medium
  • L is the thickness of the porous membrane
  • p is the water pressure applied to the porous membrane.
  • the hydraulic pressure applied to the porous thin film is lower as the network of nanofibers constituting the porous thin film is sparse, that is, the shorter the electrospinning time, that is, the higher the porosity and permeability coefficient.

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Abstract

본 발명은 기존에 널리 사용되는 세포 배양액 교체법에 의해 발생되는 세포 응집체의 유실을 최소화할 수 있는 새로운 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법을 제공하는 것으로, 보다 상세하게는 개구부, 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버, 및 상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하며, 하단에 유체 배출구가 포함된 하부 챔버를 포함하며, 상기 상부 챔버의 상부로 유입된 유체는 상기 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부 챔버의 배출구를 통해 배출되어 유동되는, 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법을 제공한다.

Description

3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법
본 발명은 3차원 세포 응집체의 분화 및 배양에 활용할 수 있는 마이크로웰 플랫폼에 관한 것이며, 세포 응집체의 유실을 감소시킬 수 있고 다공성 마이크로웰 및 이를 수직 투과하는 세포 배양액의 유동에 기초함으로 인해 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변 미세환경을 제공하는 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 활용한 3차원 세포 응집체 배양 방법에 관한 것이다.
실제 몸 속의 세포는 3차원의 형상이며, 이러한 세포는 세포의 미세환경과도 3차원적으로 상호작용 한다. 한편, 세포 배양 시 종래의 기술과 같이 체외에서 세포를 3차원 구조가 아닌 2차원의 단일 층(Monolayer)으로 배양할 경우 체내의 세포와 형태적인 측면에서 유사성이 크게 결여 되며, 3차원 배양하는 경우 약물 스크리닝(Drug screening) 및 세포 치료제(Cell therapy)로 활용 시 실제 생체 내 현상과 보다 유사한 현상을 확인할 수 있다.
이와 같이, 상기와 같은 2차원 단일 층 세포배양의 한계를 극복하기 위해, 3차원 세포 응집체(3D cell aggregation) 배양 및 분화가 가능한 마이크로웰 플랫폼에 대한 요구가 전 세계적으로 증가하고 있으며, 다만 이와 같은 마이크로 웰 플랫폼 상에서 3차원 세포 응집체를 약물 스크리닝 및 세포 치료제로 활용 하기 위해서는 성숙화 과정이 필수적이며, 이러한 기간은 일반적으로 수 주 또는 수 개월이 소요되므로, 이 기간 동안 반복적인 세포 배양액 교체가 요구된다.
상술한 세포 배양액 교체 시 일반적으로 사용되는 방법은 마이크로 웰의 상면인 세포 배양면의 상부에서 파이펫팅을 수행하여, 대사물이 포함되어 있는 사용된 세포 배양액은 수거하고 신선한 세포 배양액을 주입 하는 것인데, 이와 같은 방법의 경우 세포 배양액 교체 과정에서 세포 응집체의 유실이 발생할 수 있으며, 이와 같은 유실은 실험의 최초 설계와 실험 결과 간의 격차를 유발하게 된다. 또한, 일반적으로 세포 응집체 배양 과정에서 파이펫팅은 24시간 또는 48시간의 간격으로 수행되는데, 파이펫팅 수행 직후의 신선한 세포 배양액은 충분한 환경을 제공하지만 이에 비하여 다음 파이펫팅 직전의 세포 응집체 주변 환경은 영양분이 충분 하지 못한 한계점이 존재한다.
한편, 등록특허 제10-1403536호와 같이 유동을 이용하여 노폐물을 배출하고 영양분을 공급하는 세포 배양 시스템에 대한 연구가 수행되고 있기는 하나, 이는 마이크로웰 플렛폼이 아니기 때문에 다수의 3차원 세포 응집체를 생산하기에는 적합하지 못하는 단일의 3차원 세포 응집체 밖에 생산하지 못하는 한계점이 있다.
따라서, 세포 배양액 교체 과정에서 세포 및 세포 응집체의 유실을 감소시킬 수 있는 배양 방법과 이와 동시에 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변 미세환경을 제공할 수 있는 기술이 제공되는 경우 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 기존에 널리 사용되고 있는 반복적인 세포 배양액 교체를 위해 마이크로 웰의 상면인 세포 배양면에 대한 파이펫팅에 의해 발생되는 세포 및 3차원 세포 응집체 유실 등을 최소화하며 이와 동시에 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변환경을 제공 할 수 있는 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 있어서, 본 발명은 개구부, 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버; 및 상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하며, 하단에 유체의 배출구가 포함된 하부 챔버를 포함하며, 상기 상부 챔버의 상부로 유입된 유체는 상기 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부 챔버의 배출구를 통해 유동되는, 3차원 세포 응집체 배양 장치를 제공한다.
본 발명의 다른 견지에 있어서, 본 발명은 상기 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치를 이용하여, 상부 챔버의 다공성 박막 상에 세포를 접종하는 단계; 및 세포 배양액을 상부 챔버의 상부로 개구부를 통해 투입하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 응집체 배양 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 세포를 배양하는 과정 중 세포 및 세포 응집체의 유실 가능성을 현저히 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변미세환경을 제공 할 수 있다. 또한 배양액 저장소의 높이는 하부 챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정하여 배양 과정에서 배양액의 높이를 일정하고 유지할 수 있다.
또한, 투수계수(Hydraulic conductivity)가 매우 우수한 다공성 마이크로웰을 사용하여 다공성 마이크로웰 및 그 내부에서 배양중인 3차원 세포 응집체에 인가되는 수압을 최소화 하여 유동의 흐름 외의 불필요한 자극을 최소화 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치를 나타낸 것으로, 도 1(a)는 세포 배양 장치의 전체적인 형태를 나타내며, 도 1(b)는 하나의 상부 챔버 및 하부 챔버의 조합을 확대하여 나타낸 것이고, 도 1(c)는 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치의 개략도를 나타낸 것으로, 배출구와 연결된 배양액 저장소를 포함하는 경우의 단면도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 예시적인 세포 배양장치에서 다공성 박막을 통해 투과되는 배양액의 흐름을 유동 관련 시뮬레이션 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치에 있어서 다공성 박막이 오목부를 구비하는 형태로 구성된 다공성 마이크로웰의 현미경 사진을 나타낸다. 도 3(a)는 4배, 도 3(b)는 220배의 배율로 확대한 이미지이다. 도 3(c)는 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치에 있어서 다공성 박막이 오목부를 구비하는 또 다른 형태로 구성된 다공성 마이크로웰의 사진을 나타내는 것으로, 도 3 (c) a)는 DSLR 카메라, 도 3(c) b) 와 (c) c)는 각각 4배와 20배의 배율로 확대한 현미경 이미지이다.도 4는 전기 방사 시간에 따른 다공성 박막의 나노섬유 네트워크의 구조 및특성 변화를 나타낸다. 보편적인 상용 다공성 멤브레인인 8 μm 공극 사이즈의 Transwell insert (Corning, USA) 제품의 멤브레인을 참조를 위해 함께 첨부 하였다(가장 좌측, TW).도 4(a)는 상용 멤브레인, 전기방사 시간 변화에 따른 각 나노섬유 네트워크 구조를 20배의 배율로 확대한 현미경 이미지이다. 도 4(b), (c) 및 (d)는 상용 멤브레인과 전기방사 시간에 따른 각 나노섬유 네트워크 구조의 공극률(Porosity)(도 4(b)), 투수계수(Hydraulic conductivity)(도 4(c)), 및 수압(Induced pressure)을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치를 사용할 경우의 세포 응집체 유실 정도와 종래 파이펫팅에 의한 세포 배양액 교체 방법을 통해 세포를 배양할 경우의 세포 응집체 유실 정도를 비교한 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치를 사용할 경우의 세포 응집체 주변 영양분 농도(Glucose concentration)와 종래 파이펫팅에 의한 세포 배양액 교체 방법을 통해 세포를 배양할 경우의 세포 응집체 주변 영양분 농도를 수치 시뮬레이션을 통해 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치에 존재하던 유체가 새롭게 주입되는 유체로 원활하게 교체되며, 이러한 과정에서 하부 챔버 내 배양액의 수위가 일정하게 유지 되는 것을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치에 사용되는 다공성 마이크로웰을 제조 하는 방법을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 예시적인 세포 배양 장치에 사용되는 하부챔버(a)와 하부챔버 내부에 삽입된 상부챔버(b)를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면 세포를 배양하는 과정에서 마이크로웰 상부에서 파이펫팅을 통해 사용된 세포 배양액을 제거하고 새로운 세포 배양액을 주입하는 기존 세포 배양액 교체법을 사용하여 세포를 배양 및 분화하는 경우, 파이펫팅에 의한 배양액 유동에 의해 세포 및 세포 응집체의 유실이 발생할 수 있는 문제를 해결할 수 있는 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 배양 방법이 제공된다. 또한 지속적으로 다공성 마이크로웰을 투과하여 유도되는 세포 응집체 주변의 유동에 의해 영양분과 같은 균일한 세포 미세 환경의 구현이 가능한 세포 응집체 배양 방법이 제공된다.
따라서, 본 발명에 의하면 배양 과정에서 상기와 같은 세포의 유실을 최소화할 수 있으며 이와 동시에 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변 미세 환경을 유도하여, 2차원 배양에 비하여 생체 내 현상과 더욱 유사한 현상을 나타내는 3차원의 세포 응집체를 배양할 수 있는 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치는 개구부, 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버 및 상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하며, 하단에 유체 배출구가 포함된 하부 챔버를 포함하며, 상기 상부 챔버의 상부로 유입된 유체는 상기 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부 챔버의 배출구를 통해 배출되어 유동되는 것이다.
또한, 본 발명은 상술한 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치를 이용하여, 상부 챔버의 다공성 박막 상에 세포를 접종하는 단계; 및 세포 배양액을 상부 챔버의 상부로 개구부를 통해 투입하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 응집체 배양 방법 을 제공한다.
상기 다공성 마이크로웰은 복수개의 고분자 나노섬유가 무작위로 얽혀짐으로써 이루어진 다공성 박막을 하단에 포함하며, 상기 다공성 박막은 나노섬유 네트워크로 이루어진 것 일 수 있는 것으로, 이에 따라, 상기 나노섬유들의 사이 영역에 형성된 다수의 공극을 포함할 수 있는 것이다.
바람직하게 상기 다공성 박막은 나노섬유 네트워크로 이루어진 것으로, 공극률이 20 % 내지 60 %의 다공성 박막인 것이며, 예를 들어 공극률이 30 % 내지 50 % 의 다공성 박막일 수 있다. 상기 공극률이 20% 미만인 경우에는 투수 계수가 낮아지고, 이에 따라 다공성 박막에 가해지는 수압이 증가함으로써, 다공성 박막상에 배양 중인 세포 응집체의 생존률이 저하되는 문제를 발생시킬 수 있다.
이때, 상기 다공성 박막은 10 nm 내지 10 μm의 평균 공극의 입경 크기를 가질 수 있다. 즉, 상기 다공성 박막은 상기와 같은 범위의 평균 공극의 크기를 포함하므로, 단일 세포들은 투과시키지 않으면서 세포 배양액 내 영양분, 성장인자 등의 타 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있다. 이로 인해 다공성 박막 상에서 단일 세포의 응집을 유도하여 3차원 응집체 형성을 가능하게 하며, 응집체 형성 후에는 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 수행할 수 있다.
이때, 상기 유체가 투과되는 다공성 박막은 상술한 본 발명의 공극률 및 평균 공극의 입경 크기 범위 내에서 높은 투수계수의 특성을 보유 할 수 있다. 본 발명의 상기 다공성 박막은 1 내지 20 μm s-1의 투수계수(Hydraulic conductivity)를 갖는 것이다. 상기 투수 계수가 1 μm s-1 미만인 경우에는 다공성 박막에 높은 수압이 야기되며, 1000Pa 이상의 수압이 다공성 박막 및 박막 상에 배양 중인 세포 응집체에 인가될 수 있으며, 이와 같은 경우 세포의 생존률을 저하시키는 등의 악영향이 예상된다.
본 발명의 다공성 박막은 세포 배양용 나노섬유 네트워크인 것으로, 이의 제조 방법은 특히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 전기 방사에 의해 형성되는 고분자 나노섬유로 이루어진 것일 수 있다.
이때, 상기 고분자 나노섬유는 예를 들어 열가소성 수지, 열경화성 수지, 탄성 중합체 및 생체 고분자 중 적어도 하나 이상을 포함하는 고분자 수지로 이루어진 것일 수 있으며, 예를 들어 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리우레탄(Polyurethane), 폴리비닐리덴 플로라이드 (Polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리스티렌(Polystyrene), 콜라겐(Collagen), 젤라틴(Gelatin), 및 키토산(Chitosan) 중 적어도 하나 이상을 포함하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 나노섬유 네트워크의 제조 방법은 예를 들어 폴리카프로락톤을 4 내지 10 wt % 농도가 되도록 클로로포름/메탄올(3/1 vol/vol) 혼합물의 용매에 용해한 용액을 전기방사하는 단계에 의해 획득되는 것일 수 있다.
한편, 상기 전기 방사는 10 내지 30 kV 전압 하에서 0.1 내지 2.0 ml hr-1의 고분자 용액의 토출 속도로 수행되는 것이 바람직하며, 전압이 상기 범위 미만인 경우에는 균일한 나노섬유 제조에 문제가 있고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 나노섬유의 적층이 불균일해 지는 등 안정적인 나노섬유 제조에 문제가 있을 수 있다.
상기 다공성 마이크로웰은 하부 방향으로 오목하게 형성된 함몰부의 전체 또는 일부분이 다공성 박막일 수 있으며, 바람직하게는 다공성 마이크로웰, 즉 상부 챔버의 개구부가 위를 향하도록 배치하는 경우 바닥을 형성하는 면이 다공성 박막으로 형성된다.
한편, 상기 본 발명의 상부 챔버의 하면을 이루는 다공성 박막은 돌출부 및/또는 오목부를 구비하도록 형성될 수 있다. 예를 들어, 도 10과 같이 다공성 박막을 이용하여 오목부를 형성하거나, 또는 도 8과 같이 다공성 박막 상에 오목부에 상응하는 구획을 형성할 수 있는 측벽 또는 돌출부를 추가로 부가하여 오목부를 형성할 수 있으며, 이때 측벽 또는 돌출부의 재질은 다공성이거나 또는 다공성이 아닐 수 있는 것으로 특히 제한되지 않는다. 바람직하게는 오목부의 하면은 다공성 박막인 것이며, 측벽 또는 돌출부는 다공성이거나 또는 다공성이 아닐 수도 있다. 예를 들어 도 3(a) 및 도 3(b)는 관통 구멍이 형성된 추가의 층을 적층함으로써 오목부의 측벽이 다공성 재질이 아닌 경우의 형태를 나타낸 예시이며, 도 3(c)는 다공성 박막 자체에 오목부가 형성된 것으로 오목부 및 오목부가 아닌 부분이 전체적으로 모두 다공성인 재질인 경우이다.
상기 다공성 마이크로웰은 예를 들어 도 8에 나타낸 바와 같이 전기 방사로 제작된 다공성 박막을 쓰루홀 (Thru-hole)의 배열과 결합하여 제조 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 도 3(c)와 같이 다공성 재질의 오목부 및 돌출부 형성은 예를 들어 도 10과 같이 몰드를 활용한 압축 공정을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 다공성 마이크로웰의 다공성 박막의 상면은 세포 배양층으로 작용하는 영역으로, 상술한 바와 같이 다공성 박막이 돌출부 및 오목부를 구비하는 경우에는 형성된 오목부에 세포가 더욱 용이하게 안착하게 되며, 상기 다공성 마이크로웰 내에서 단일 세포의 응집을 유도하여 3차원 세포 응집체가 안정적으로 형성된 후 배양 될 수 있게 된다. 보다 바람직한 본 발명의 다공성 박막은 돌출부 및 오목부를 구비하며, 모든 면이 다공성 박막으로 이루어진 것이다.
한편, 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치의 상기 하부 챔버는 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하며, 하단에 유체가 배출될 수 있는 유체 배출구를 통해 상기 상부 챔버가 내부에 배치된 상태로 배양액을 담고 있는 하부 챔버의 유체가 하부 챔버 외부로 배출되면서 배양액이 유동할 수 있다.
이를 위해, 상기 상부 및/또는 하부 챔버에는 유동을 일으킬 수 있는 장치가 추가로 연결될 수 있으며, 예를 들어 상기 상부 챔버에 세포 배양액을 일정한 유속으로 주입하는 장치가 추가될 수 있으며, 상기 하부 챔버는 상기 상부 챔버에 유입된 유체가 상기 상부 챔버의 다공성 박막을 투과해 상기 하부 챔버로 흐르면서 일정한 유속으로 배출되도록 하는, 유체의 흐름을 제어하는 장치와 연결될 수 있으며, 이는 예를 들어 배양액 저장소일 수 있다. 이때, 상기 유체의 유동을 일으킬 수 있는 것이라면, 유체 흐름을 유도하는 장치는 제한되지 않으며, 예를 들어, 상기 유체 흐름 유도 장치는 시린지 펌프(Syringe pump), 튜브연동펌프(Peristaltic pump) 또는 교반기 등을 사용할 수 있다.
예를 들어 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양장치는 상기 하부 챔버와 동일한 평면 상에 배치되며, 하부 챔버의 배출구와 유체 연통된, 배양액 저장소를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 배양액 저장소 내 배양액의 높이는 하부 챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정되는 것일 수 있다.
이때, 상기 하부 챔버 내 배양액의 수위는 상부 챔버 하단의 다공성 박막을 기준으로 상부 방향으로 1 내지 20 mm 의 높이인 것일 수 있으며, 예를 들어 1 내지 19 mm, 바람직하게는 1 내지 18 mm, 예를 들어 1 내지 8mm일 수 있다. 배양액의 수위가 상기 바람직한 범위 미만인 경우 배양중인 세포 응집체에 원활한 영양분 공급이 불가 해 질 수 있으며, 상기 바람직한 범위를 초과 할 경우 배양액의 범람 및 과용을 초래 할 수 있다.
또한, 상기 상부 챔버 하단의 다공성 박막과 하부 챔버 바닥의 간격은 0.1 내지 8 mm인 것일 수 있으며, 예를 들어 0.2 내지 7 mm, 바람직하게는 1 내지 5 mm일 수 있다. 간격이 상기 바람직한 범위 미만인 경우 세포 배양액의 유동이 제한되어 배출구를 통한 배출이 불가능 할 수 있다. 또한, 상기 바람직한 범위를 초과할 경우 배양액의 과용을 초래 할 수 있다.
이때, 상기 유체, 즉 세포 배양액은 일정한 속도를 유지하면서 유동할 수 있다. 이를 위해 상기 유체의 유입과 배출을 일정한 속도로 조절할 수 있다. 이때, 예를 들어, 상기 유체는 0.0001 내지 1 ml hr-1, 예를들어, 0.001 내지 1 ml hr-1의 속도로, 바람직하게는 0.01 내지 1 ml hr-1의 속도로 유동할 수 있다. 상기 유체의 유동 속도가 0.0001 ml hr-1 미만인 경우에는 세포 응집체가 필요한 양의 세포 배양액이 공급되지 않는 문제가 생길 수 있으며, 1 ml hr-1를 초과하는 경우에는 세포 응집체에 유동에 의한 과도한 전단응력이 작용해 세포 응집체에 악영향이 미칠 수 있다. 세포에 악영향을 미치지 않는 전단응력 예를 들어 0.001 내지 10 dyne cm-2의 전단응력은 세포에 분화 및 증식에 긍정적인 영향을 끼칠 수 있다.
한편, 상기 세포 배양액은 1000 Pa 미만의 수압을 상기 다공성 박막에 인가하는 것이 바람직하며, 압력이 적을수록 보다 바람직하고, 예를 들어 1 Pa 내지 100 Pa일 수 있다. 한편, 1000 Pa 초과인 경우 세포 생존률이 저하되는 문제가 있다.
상기 유체는 세포 배양액을 사용할 수 있으며, 상기 세포 배양액에는 FBS, 글루코스 및 성장인자 등이 포함될 수 있으나, 당업계에서 사용되는 세포 배양액이라면 제한되지 않으며, 배양하고자 하는 세포에 적합한 세포 배양액을 선정하여 세포 배양액을 사용할 수 있다.
본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 상기 장치를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법에서는 세포주 예를 들면 근아세포(Myoblasts), 태아 섬유아세포(Embryo fibroblasts), 제정맥 내피세포(Umbilical vein endothelial cells), 간암 세포(HepG2 세포), 표피 세포(Epidermal cells) 또는 이 중 적어도 일종 이상의 혼합 등을 사용 할 수 있다. 또한, 세포주뿐만 아니라 간, 췌장, 소장 등의 1차 세포 또한 사용 될 수 있다. 마지막으로, 줄기세포 예를 들면, 유도만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell), 중간엽유래 줄기세포(Mesenchymal stem cell) 또는 이 중 적어도 일종 이상의 혼합 등의 세포를 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 3차원 세포 응집체인 스페로이드 또는 오가노이드를 배양 할 수 있다.
한편, 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 방법은 상기 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치를 이용하여, 상부 챔버의 다공성 박막 상에 세포를 접종하는 단계; 및 세포 배양액을 상부 챔버의 상부로 개구부를 통해 투입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 세포는 상기 다공성 박막 상에 상에 접종되어 배양될 수 있으며, 상기 접종은, 상기 상부 챔버에 유체를 유입하는 단계에 선행하여 배양할 세포를 상기 다공성 박막 상에 접종하여 수행될 수 있다.
이에 의해 세포는 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치에 적용될 수 있으며, 상기 세포를 접종하는 방법은 당업계에서 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 마이크로파이펫을 이용하여 접종할 수 있다.
상기 방법으로 접종된 세포는 수 시간에서 수 일 내에 3차원 세포 응집체를 형성 한다. 세포 응집체 형성 후에 개발된 장치에 의한 세포 배양액의 유동은 인가 될 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 다공성 박막의 제조
폴리카프로락톤(Polycaprolactone; PCL; Mn = 80,000 g mol-1), 클로로포름 및 메탄올은 Sigma-Aldrich (미국)에서 구입하였다. 전기 방사를 위한 PCL 용액은 7.5 wt% 농도의 클로로포름/메탄올(3/1 vol/vol)의 혼합물에 PCL을 용해하여 준비하였다. 준비된 PCL 용액을 5 ml 정밀 주사기(Gastight syringe; Hamilton)에 넣고 상업용 전기 방사 기계(ES-robot, NanoNC)를 사용하여 직경 5 cm의 고리 모양 전극 위에 10cm 거리를 두고 배치된 23 게이지 금속 바늘을 통하여 1ml h-1 의 유속으로 토출하였다. 금속 바늘과 고리 모양의 전극 사이에 상기 상업용 전기방사 기계를 활용하여 15kV의 고전압을 가하여 전기 방사를 수행하였다. 전기 방사된 PCL 나노섬유(As-electrospun PCL nanofiber)는 고리 모양 전극 사이에 증착 되어 기체 및 질량 투과성 나노섬유 멤브레인을 생성하였다. 전기 방사는 상대 습도 50 ~ 60 %, 온도 20 ~ 25 ℃에서 실시하였다. 나노섬유 네트워크 제조 시 방사 시간에 따른 현미경 사진을 도4에 나타내었으며, 나노섬유 직경은 약 800-1000 nm인 것을 확인 하였으며, 방사시간이 증가함에 따라 평균 공극의 크기 및 공극률(Porositiy)은 감소하며 반대로 평균 두께는 증가하였다.
상기 나노섬유 네트워크 제조 시 방사 시간에 따른 나노섬유 네트워크의 구조 변화(도 4(a)), 공극률 변화(도 4(b)), 다공성 박막의 투수 계수(Hydraulic conductivity)(도 4(c)), 및 수압(Induced pressure)(도 4(d))을 각각 도 4에 나타내었다.
이때, 공극률의 계산 방법은 확대 된 현미경 이미지를 이진 이미지로 (Binary image) 변환 한 다음 Image J 소프트웨어 (NIH, USA)를 사용하여 나노섬유 네트워크 면적 대비 나노섬유 네트워크에 의해 생성된 공극의 면적 분율을 계산하여 나타낸 것이다.
2. 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버 제조
상기 1.에서 획득된 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버를 제조하기 위해서 일련의 공정을 수행했으며 이를 도 8에 나타내었다. 상세하게, 상부 챔버 하단의 다공성 박막 영역은 500μm 두께의 폴리 메틸메타크릴레이트 플레이트 (PMMA, Acryl Choika, South Korea)에 접착제를 도포 한 후 레이저 절단기 (ML-7050A, Machineshop, South Korea)를 사용하여 접착제가 도포된 PMMA 플레이트에 쓰루홀의 배열을 천공하였으며 도포된 접착제를 활용하여 쓰루홀과 다공성 박막을 결합함으로써 최종적으로 도 3과 같이 바닥 면이 다공성 박막으로 이루어진 오목부를 형성하여 완성하였다.
또 다른 형태의 상부 챔버 하단의 다공성 박막 영역을 제작하기 위한 일련의 공정을 도 10에 나타내었다. 보다 상세하게는, 상기 1.에서 획득된 평평한 다공성 박막을 돌출 몰드 및 오목 몰드를 활용한 압축 공정을 통해 모든 면이 다공성 박막으로 이루어진 돌출부 및 오목부가 형성된 다공성 박막을 구비하는 상부 챔버 하단을 완성하였다. 이때 오목 몰드는 10mm 두께의 폴리 메틸메타크릴레이트 플레이트 (PMMA, Acryl Choika, South Korea)에 기계가공장비(EGX-350, Roland, USA)를 활용하여 드릴링을 통해 제작 하였으며, 폴리디메틸실록산 (Polydimethylsiloxane; PDMS)로 구성된 돌출 몰드를 제작하기 위해 10:1의 중량비로 PDMS와 경화제의 혼합물(Sylgard 184, Dow Corning, USA)을 함몰 몰드에 붓고 55℃에서 12 시간 동안 경화하여 완성했다.
상부 챔버 중 개구부 형태를 갖는 나머지 측면 부분은 사출성형기(SE50D, Sumitomo, Japan)를 활용해 제작하였다. 이렇게 획득된 상기 측면 부분과 상기에서 획득된 상부 챔버 하단을 접착제를 활용하여 결합하여 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버를 완성하였다.
3. 3차원 세포 응집체 배양 장치 제조
폴리디메틸실록산 (Polydimethylsiloxane; PDMS)로 구성된 하부 챔버와 이의덮개를 제작하기 위해 10:1의 중량비로 PDMS와 경화제의 혼합물(Sylgard 184, Dow Corning, USA)을 몰드에 붓고 55℃에서 12 시간 동안 경화했다. 하부 챔버와 덮개의 몰드는 20 mm 두께의 PMMA 플레이트를 기계가공 장비 (EGX-350, Roland, USA)를 활용하여 제작하였다. 하부 챔버는 30 mm Х 30 mm Х 30 mm 의 크기로 제작 되었으며, 이때 윗면에 2 mm 깊이의 홈을 설계하여 (도 9(a)) 하부 챔버 바닥 면으로부터 상기 2.에서 제작된 다공성 마이크로웰의 다공성 박막까지의 거리 간격은 8 mm 로 설정하였다(도 9(b)). 하부 챔버 바닥 면과 덮개의 정 중앙에 Biopsy punch (Miltex, USA)를 활용하여 1 mm 크기로 천공하여 배출구를 형성하였다.
개구부 덮개의 천공을 통해 튜브(Biokonvision, South Korea)가 연결되었으며 syringe pump (KDS200, KD Scientific, USA)는 상기 튜브를 통해 0.062 ml h-1의 유속(flow rate)으로 세포배양액을 주입하였다. 하부 챔버 바닥 면의 천공 또한 튜브와 연결되어 세포 배양액이 배양액 저장소로 이송될 수 있도록 하였다. 또한, 상기 배양액 저장소 하부에 Z-스테이지(stage)를(Sciencetown, South Korea) 구비해 저장소의 높이는 하부 챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정하여, 배양 과정에서 시린지 펌프로부터 지속적으로 배양액이 유입됨에도 하부 챔버 배양액의 수위를 일정하게 유지할 수 있도록 설계되었다.
4. 응집체 배양 장치를 이용한 세포 배양
실시예 1
상기 1에서 제조된 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버 및 하부 챔버에 더하여 배출된 배양액을 저장할 수 있는 배양액 저장소를 포함하는 3차원 세포 응집체 배양 장치를 도 1과 같이 마련하였다. 이때 배양액 저장소의 높이는 하부 챔버 바닥면으로부터 하부 챔버의 수위가 12 mm에 상응 하도록 설정하였다. 이렇게 획득된 차원 세포 응집체 배양 장치를 '본 발명의 세포 배양장치' 및 '실시예 1의 세포 배양장치'와 상호호환적으로 지칭한다.
상기 3차원 세포 응집체 배양 장치에서, 다공성 마이크로웰에 간 세포(HepG2) 및 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media, FBS 10%) 배양액과 함께 주입한 후 이를 37℃에서 48 시간 동안 유동을 인가하지 않고 정적인 환경에서 3차원 HepG2 응집체 즉 HepG2 스페로이드를 형성하였다. 그 후 시린지 펌프를 이용하여 일정한 유속인 0.062 ml hr-1으로 상부 챔버에 세포 배양액을 지속적으로 주입 하였다. 그 후 상기 주입된 유량만큼 유체를 배출하기 위해 하부 방향으로 유체 배출구가 형성된 하부 챔버를 통해 배양액 저장소로 배출 되도록 하여 8일 동안 HepG2 스페로이드를 배양 하였다.
비교예 1
다공성 박막이 아닌 불투과성 PMMA 플레이트의 바닥면으로 구성된 불투과성 마이크로웰을 사용한 것과 시린지 펌프, 배양액 저장소 등의 세포 배양액의 유동을 인가하는 장치를 사용하지 않고 파이펫팅을 이용한 세포 배양액 교체를 수행한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 HepG2 스페로이드를 배양 하였다.
실험예
(1) 시간의 흐름에 따른 3차원 세포 응집체 배양 장치 내의 유체 교환 확인
실시예 1의 3차원 세포 응집체 배양 장치에서, 상부 챔버로 새롭게 유체가 0.062ml hr-1의 유속으로 주입될 때 3차원 세포 응집체 배양장치 내의 유동 변화 (유체 교환 확인)를 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
도 7에 보이는 바와 같이, 세포 배양 응집체 내부에 기존에 존재하던 푸른 용액이 새롭게 주입되는 투명한 색의 용액으로 점진적으로 교환되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이 과정에서 하부 챔버의 수위는 일정하게 유지 되는 것을 확인 할 수 있었다.
(2) 실시예 1에서 세포 배양액의 흐름 해석
본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치에서 세포 배양액의 흐름을 측정하기 위한 전산유체해석 방법을 적용하기 위해 COMSOL Multiphysics 소프트웨어 (Version 5.0, USA)을 통해서 실시예 1의 3차원 세포 응집체 배양 장치에서 내의 유속(Surface velocity: 0 m s-1 ~ 8.11 e-6 m s-1), 유동방향(검정색 콘 모양), 유선(흰색 선)에 해당하는 내용을 해석 및 계산하였다.
그 결과, 도 2에 보이는 바와 같이, 본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치에서, 세포 배양액은 상부 챔버에서 하부 챔버로 원활하게 흐르는 것을 확인할 수 있었다.
(3) 세포 배양 시 세포가 유실되는 정도의 비교
실시예 1 및 비교예 1에서 2일 간격으로 간 세포 스페로이드의 유실 정도를 비교하였으며, 그 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5에 보이는 바와 같이, 실시예 1에서는 간 세포 스페로이드의 유실이 전혀 없었으나, 비교예 1에서는 지속적으로 스페로이드가 유실되고, 8일 째에는 약 15 % 가량의 HepG2 세포 스페로이드의 유실이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
(4) 시간의 흐름에 따른 3차원 세포 응집체 주변 영양분 농도 비교
실시예 1 및 비교예 1에서 시간에 흐름에 따른 HepG2 스페로이드 주변의 영양분(Glucose) 농도를 측정하여 비교 분석하기 위하여 COMSOL Multiphysics 소프트웨어 (Version 5.0, USA)을 활용 하였다. 이 과정에서 활용된 수치는 하기 표 1에 나타내었다.
분자(Molecules) MW [kDA] 확산 계수 [μm2s-1] 배양액 내 초기 농도[mol m-3] 소비율[mol m-3s-1]
글루코스 0.18 580 11.1 5.2E-3
도 6에 보이는 바와 같이, 실시예 1의 본 발명의 세포 배양장치에서는 36시간 이후 균일한 영양분 농도가 HepG2 세포 응집체 주변에 유도되는 것이 수치 예측되었으나, 비교예 1에서는 파이펫팅 간격 전후로 영양분 농도의 변화가 심하며 세포 응집체 주변에 불균일한 영양분 농도가 유도되는 것이 수치 예측 되었다.
(5) 실시예 1의 3차원 세포 응집체 배양 장치에서 다공성 박막의 투수 계수 및 수압 측정
상부 챔버로 새롭게 유체가 0.062 ml hr-1의 유속으로 주입될 때 3차원 세포 응집체 배양장치 내의 다공성 박막에 인가되는 수압(Applied pressure on membrane)을 확인하기 위한 실험을 진행 하였다. 이를 확인하기 위해서, 사전에 투수 계수의 측정은 발명된 장치 외부에서 하기와 같이 Falling-head method를 활용하여 진행하였다.
구체적으로, 초기 수두(Initial pressure head, hi) 를 갖는 물이 다공성 박막을 투과하여 최종 수두(Final pressure head, hf)에 도달하기 까지의 시간을 확인하여 Darcy 's law를 기반하는 공식을 통해 투수 계수를 측정하였다.
Figure PCTKR2021010026-appb-img-000001
여기서 K는 다공성 박막의 투수 계수, L은 다공성 박막의 두께, △t는 hi 에서 hf 까지 도달하는 시간이며 본 실험에서는 각 각 100mm 와 10mm의 hi 및 hf 를 활용하였다. 계산된 투수 계수를 기초로 다공성 박막의 투과도(Permeability)를 다음과 같은 수식을 활용하여 계산 하였다.
Figure PCTKR2021010026-appb-img-000002
여기서 k는 현재 다공성 박막의 투과도, μ는 세포 배양액의 점도, ρ는 세포 배양액의 밀도, g는 중력 가속도이다.
0.062 ml hr-1의 유속으로 다공성 박막을 투과하는 세포 배양액, 측정된 투수계수 와 계산된 투과도를 기반하여 다음과 같은 수식(Kozeny-Carman equation)을 활용하여 다공성 박막에 인가되는 수압을 계산 하였다.
Figure PCTKR2021010026-appb-img-000003
여기서 v는 현재 다공성 박막을 투과하는 유체의 유속 k는 현재 다공성 박막의 투과성, μ는 세포 배양액의 점도, L는 다공성 박막의 두께 이며 p는 다공성 박막에 인가되는 수압이다.
도 4에 보이는 바와 같이, 다공성 박막에 인가되는 수압 즉, 수력반발력은 다공성 박막을 구성하는 나노섬유의 네트워크가 성길수록 즉, 전기 방사 수행 시간이 짧을수록, 즉 공극률 및 투수 계수가 높을수록 낮은 것을 확인 하였다. 이를 본 발명의 다공성 박막이 아닌 상용 다공성 멤브레인과 비교 분석 하였을 때, 본 발명의 다공성 박막에 훨씬 낮은 수력 반발력이 인가 되는 것을 확인 할 수 있었으며 나노섬유 네트워크로 구성된 다공성 박막이 본 발명의 장치에 더 적합함을 확인 할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (10)

  1. 개구부, 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버; 및
    상기 상부 챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하며, 하단에 유체 배출구가 포함된 하부 챔버를 포함하며,
    상기 상부 챔버의 상부로 유입된 유체는 상기 상부 챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부 챔버의 배출구를 통해 배출되어 유동되는, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다공성 박막은 오목부가 형성된 다공성 박막이거나, 또는 다공성 박막 상에 구획을 형성할 수 있는 측벽 또는 돌출부를 추가로 포함하여 오목부가 형성된 것인, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 다공성 박막은 나노섬유 네트워크로 이루어진 것으로, 공극률이 20% 내지 60%의 다공성 박막인, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배양액의 유동은 0.0001 내지 1mL hr-1 의 유속으로 유입되고 배출되는, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양액은 1000 Pa 미만의 수압을 상기 다공성 박막에 인가하는, 3차원 세포 응집체 배양 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 하부 챔버와 동일한 평면 상에 배치되며, 하부 챔버의배출구와 유체 연통된, 배양액 저장소를 추가로 포함하며, 상기 배양액 저장소 내 배양액의 수위는 하부 챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정되는, 3차원 세포 응집체 배양장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 하부 챔버 내 배양액의 수위는 상부 챔버 하단의 다공성 박막을 기준으로 1 내지 20 mm인, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 상부 챔버 하단의 다공성 박막과 하부 챔버 바닥의 간격은 0.1 내지 8mm인, 3차원 세포 응집체 배양 장치.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 3차원 세포 응집체 배양 장치를 이용하여,
    상부 챔버의 다공성 박막 상에 세포를 접종하는 단계; 및
    세포 배양액을 상부 챔버의 상부로 개구부를 통해 투입하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 응집체 배양 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포는 유도만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell) 및 중간엽유래 줄기세포(Mesenchymal stem cell)를 포함하는 줄기세포; 근아세포(Myoblasts), 태아 섬유아세포(Embryo fibroblasts), 제정맥 내피세포(Umbilical vein endothelial cells), 간암 세포(HepG2 세포), 및 표피 세포(Epidermal cells)를 포함하는 세포주; 및 간, 췌장 또는 소장으로부터 획득된 1차 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나 이상인, 3차원 세포 응집체 배양 방법.
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