WO2022220539A1 - 세포 내 물질 전달 플랫폼 - Google Patents

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WO2022220539A1
WO2022220539A1 PCT/KR2022/005272 KR2022005272W WO2022220539A1 WO 2022220539 A1 WO2022220539 A1 WO 2022220539A1 KR 2022005272 W KR2022005272 W KR 2022005272W WO 2022220539 A1 WO2022220539 A1 WO 2022220539A1
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WO
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channel
vortex
fluid
mass transfer
transfer platform
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/005272
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English (en)
French (fr)
Inventor
정아람
허정수
Original Assignee
㈜엠엑스티바이오텍
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/04—Flat or tray type, drawers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to a platform for delivering a substance into a cell, and more particularly, to a platform for delivering a substance into a cell by forming a vortex.
  • Intracellular mass transfer is one of the most basic experiments in cell engineering, and materials are usually delivered using carriers or by making nanopores in the cell/nuclear membrane.
  • Viral or Lipofectamine-based carrier techniques can deliver high-efficiency mass delivery when optimized, but there are problems such as safety, slow delivery speed, labor/cost-intensive carrier preparation process, and low reproducibility.
  • US Patent No. 2014-0287509 discloses a technology for inducing cell transformation by directly flowing the cells into a channel having a bottleneck structure by applying pressure to the cells.
  • the rate at which the cells are transformed is not constant, and thus the mass transfer efficiency is lowered.
  • the mass transfer efficiency is fundamentally low, and there is a problem in that it is difficult to transfer the nucleic acid into the nucleus. Therefore, it is urgent to develop an innovative next-generation intracellular mass transfer platform that can deliver various substances uniformly and efficiently into cells while maintaining the high processing function of the microfluidic device.
  • an embodiment of the present invention a first channel through which a fluid including a cell and a transmitter flows with a flow; a second channel and a third channel connected at an angle to the first channel through which the fluid including cells and a delivery material flows with a flow; and an intracellular mass transfer platform in which the fluid forms at least one of a collision and vortex region in at least one of the first channel, the second channel, and the third channel.
  • the cross section of at least one of the first channel to the third channel may be formed in a rectangle having a minor axis and a major axis, the minor axis may be provided as a vertical surface, and the major axis may be provided as a horizontal surface. .
  • the mass transfer platform comprises: a first supply unit for supplying a first supply fluid containing at least one of a cell and a delivery material; A second supply unit for supplying a second supply fluid; wherein the first supply fluid is supplied to the first channel through a first supply unit channel, and the second supply fluid is supplied to the second supply unit through a second supply unit channel
  • One channel may be supplied, and at least one channel of the second supply unit may be formed, and the second supply channel may supply the second fluid from both sides of the channel of the first supply unit.
  • the Reynolds number of the first supply channel and the Reynolds number of the second supply channel may be 2:1 to 1:3.
  • the fluid in the first channel includes the first supply fluid and the second supply fluid, and the first supply fluid flows in the center of the long axis in the first channel. flowing, the second supply fluid flows from both sides of the first supply fluid, flows and flows at both ends of the long axis in the first channel, and the first supply fluid and the second supply fluid flow through the second channel And it may be mixed in at least one of the third channel.
  • the vortex region may be one in which the linear flow of the fluid is temporarily stopped.
  • the delivery material may be at least one of nucleic acids, proteins, fluorescent dyes, quantum dots, carbon nanotubes, antigens, ribonucleoproteins, gene scissors, polymers, and nanoparticles.
  • the second channel and the third channel may be formed symmetrically or asymmetrically with respect to the first channel.
  • the angle formed by the second channel and the third channel with the first channel may be at least one of an acute angle, a right angle, and an obtuse angle.
  • a cross section of at least one of the first channel, the second channel, and the third channel has a rectangular shape having a major axis and a minor axis, the major axis is provided in a horizontal plane, and the minor axis is a vertical plane provided, and the long axis may be 10 ⁇ m to 10 mm, and the short axis may be 5 ⁇ m to 60 ⁇ m.
  • the fluid containing the cell and the delivery material has a Reynolds number of 1 to 1000 according to Equation 1 in the first channel, and at least one of the second channel and the third channel is expressed in Equation 1 below. According to the Reynolds number may be 1 to 1000.
  • Equation 1 ⁇ is the viscosity coefficient of the fluid, ⁇ is the density, V is the average velocity of the fluid, and D is the hydraulic diameter of the pipe.
  • the Reynolds number of the second channel or the third channel may be 40% to 110% of the Reynolds number of the first channel.
  • At least one of the first channel to the third channel may have a hydraulic diameter according to Equation 2 of 5 ⁇ m to 130 ⁇ m.
  • Equation 2 Ac is the cross-sectional area of the pipe through which the fluid flows, and P is the length of the two-dimensional curve in contact with the fluid when looking at the cross-section.
  • At least one of the cells and the delivery material of the first channel may have a particle Reynolds number defined by Equation 3 of 4 to 100.
  • the hydraulic diameter of the second channel or the third channel may be 40% to 110% of the hydraulic diameter of the first channel.
  • At least one of a first vortex and a second vortex is formed in the vortex region, and the first vortex is formed in a portion where the first channel, the second channel, and the third channel are connected to each other, , the second vortex may be formed in at least one of the second channel and the third channel.
  • the second vortex is formed in at least one of the second channel and the third channel, and the second vortex is formed in the center of the first channel in the longitudinal direction of the second channel or the third channel. As a result, it may be formed in a portion spaced from 20 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • At least one of the first vortex and the second vortex may be formed by a change in pressure of the fluid.
  • the first vortex or the second vortex may be formed stronger as the Reynolds number of the fluid increases.
  • the time for which the flow of the cells is stopped by the second vortex may be 0.1 ⁇ s to 100 ⁇ s.
  • At least any one of the collision, the first vortex, and the second vortex forms a temporary perforation in at least one of the cell membrane and the nuclear membrane of the cell, and the transmitter is introduced into the cell through the perforation it could be
  • a perforation is formed in at least one of the cell membrane and the nuclear membrane of the cell by at least one of the collision, the first vortex, and the second vortex, and the perforation is the same or a different site of the cell membrane or nuclear membrane After the first perforation is maintained or restored, the next perforation is formed, and the perforation formed first may be enlarged or maintained in size by the next perforation.
  • the second channel and the third channel are respectively connected at the ends of the first channel to branch the fluid flowing in the first channel, and a protruding groove is formed between the second channel and the third channel. and the protrusion groove may be formed to protrude in a fluid flowing direction at a position corresponding to the first channel.
  • the protruding groove may be formed in at least one of a rectangular, triangular, and cylindrical vertical cross section.
  • the introduction portion of the protrusion groove may be 1 ⁇ m to 20 ⁇ m, and the depth of the protrusion groove may be 3 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • At least one of a first vortex and a second vortex is formed in the vortex region, and the first vortex is an introduction part of the protruding groove, the inside of the protruding groove, in which the fluid passing through the first channel is and the reversal of the local pressure after colliding with at least one of the partition walls around the protruding groove, and the second vortex may be formed by reversing the local pressure in each of the second and third channels.
  • the delivery material may include a variety of delivery materials such as nucleic acids, proteins, nanoparticles, etc., any one of which is not specified, two or more such as nucleic acids and proteins are combined to provide a platform for delivery into cells. .
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing that cells and delivery materials flow in a platform and delivery materials are delivered into cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing that cells, transporters, fluids, etc. are transferred to the first channel from the first supply unit or the second supply unit according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 schematically shows the first supply unit channel or the first supply fluid or the fluid flowing through the first channel.
  • FIG. 4 is a diagram simulating a process of forming a first vortex according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a state in which a first vortex is formed in a Y-type channel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a view showing a state in which a second vortex is formed in the Y-type channel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the efficiency of delivery of a delivery material into a cell in a Y-type channel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a view showing a state in which cells are deformed according to the formation of a first vortex in an arrow ( ⁇ )-shaped channel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a view showing a state in which cells are deformed according to the formation of a second vortex in an arrow-shaped channel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing the efficiency of delivery of a delivery material into a cell in an arrow-shaped channel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram showing the efficiency and viability of delivery of a delivery material into a cell using the platform of an embodiment of the present invention.
  • an embodiment of the present invention a first channel through which a fluid including a cell and a transmitter flows with a flow; a second channel and a third channel connected at an angle to the first channel through which the fluid including cells and a delivery material flows with a flow; and an intracellular mass transfer platform in which the fluid forms at least one of a collision and vortex region in at least one of the first channel, the second channel, and the third channel.
  • a range of “5 to 10” includes the values of 5, 6, 7, 8, 9, and 10, as well as any subranges such as 6 to 10, 7 to 10, 6 to 9, 7 to 9, etc. It will be understood to include any value between integers that are appropriate for the scope of the recited range, such as 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 to 8.5 and 6.5 to 9, and the like.
  • a range of “10% to 30%” includes values such as 10%, 11%, 12%, 13%, and all integers up to and including 30%, as well as 10% to 15%, 12% to 18. It will be understood to include any subrange, such as %, 20% to 30%, etc., and also any value between reasonable integers within the scope of the recited range, such as 10.5%, 15.5%, 25.5%, and the like.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a state in which a vortex is formed and a fluid flows in intracellular mass transfer platforms according to an embodiment of the present invention.
  • 1 shows an embodiment of the present invention, but is not limited thereto.
  • the platform of FIG. 1 is a T-shaped platform, the same process may be performed in a Y-shaped or arrow-shaped ( ⁇ ) platform.
  • an embodiment of the present invention a first channel through which a fluid including a cell and a transmitter flows with a flow; a second channel and a third channel connected at an angle to the first channel through which the fluid including cells and a delivery material flows with a flow; and an intracellular mass transfer platform in which the fluid forms at least one of a collision and vortex region in at least one of the first channel, the second channel, and the third channel.
  • the first channel may be a channel through which a fluid including a cell and a delivery material is introduced with a flow.
  • the fluid When the fluid has a flow in the first channel, the fluid simply diffuses and an external force is applied to flow with a constant velocity.
  • the flow of the fluid in the first channel may be controlled by an external force, and thus the cells and the delivery material flowing together with the fluid in the first channel may also flow at a constant speed.
  • the fluid may represent all of the fluids flowing through the first to third channels.
  • the first supply fluid and the second supply fluid flow separately, but in the second channel or the third channel, the first supply fluid and the second supply fluid are mixed and flow.
  • a cross section of at least one of the first to third channels may be formed in a rectangle having a minor axis and a major axis.
  • the long axis may be provided parallel to the floor with respect to the floor surface, that is, it may be provided in a horizontal surface.
  • the short axis may be provided almost vertically with respect to the bottom surface, that is, it may be provided in a vertical surface.
  • the mass transfer platform may include a first supply unit for supplying a first supply fluid containing at least one of a cell and a delivery material; A second supply unit for supplying a second supply fluid; wherein the first supply fluid is supplied to the first channel through a first supply unit channel, and the second supply fluid is supplied to the second supply unit through a second supply unit channel One channel may be supplied, and at least one channel of the second supply unit may be formed, and the second supply channel may supply the second fluid from both sides of the channel of the first supply unit.
  • the first supply unit may supply the first supply fluid to the first channel.
  • the first supply fluid may be a hydrophilic fluid containing another material.
  • the other material may be at least one of a cell, a delivery material, and a medium.
  • the first supply unit may apply an external force to the first supply fluid to flow through the first supply unit channel toward the first channel. Accordingly, the first supply fluid may flow with a constant velocity in the first supply unit channel or the first channel.
  • the second supply unit may supply the second supply fluid to the first channel.
  • the second supply fluid may be a hydrophilic fluid, for example, water.
  • the second supply fluid may include a delivery material.
  • the second supply unit may apply an external force to the second supply fluid to flow toward the first channel through the second supply unit channel. Accordingly, the second supply fluid may flow at a constant speed in the second supply unit channel or the first channel.
  • the first supply fluid or the second supply fluid may flow with a predetermined Reynolds number.
  • the Reynolds number of the first supply channel and the Reynolds number of the second supply channel may be 2:1 to 1:3.
  • the Reynolds number of the first supply channel and the Reynolds number of the second supply channel may be 1:1.
  • the Reynolds number of each of the channels of the second supply unit may be the same.
  • a plurality of channels may be connected to the first channel from one second supply unit.
  • each channel of the second supply unit may be connected to the first channel from a plurality of second supply units.
  • the Reynolds number of the second supply may be more than twice the Reynolds number of the first supply.
  • the Reynolds number of the first supply unit and the second supply unit may be 1:1 to 1:3.
  • the Reynolds number of the second feeder may be equal to or slightly higher than the Reynolds number of the first feeder.
  • the Reynolds number of the first supply unit and the second supply unit may be 1:1 to 1:1.5.
  • the second supply channels may be formed on both sides with the first supply channel interposed therebetween. Accordingly, the second supply fluid may be supplied to both sides with the first supply fluid interposed therebetween to be supplied to the first channel.
  • the first supply fluid flows and flows in the center of the long axis in the first channel, and the second supply fluid flows on both sides of the first supply fluid, that is, the amount of the long axis in the first channel. It can flow by flowing at the tip.
  • the second supply fluid flows up to the first 1/3 point
  • the first supply fluid flows up to the second 1/2 point
  • the last 1/3 point may flow and flow.
  • Both the first supply fluid and the second supply fluid may include a hydrophilic fluid, but may not be mixed in the first channel.
  • the first supply fluid and the second supply fluid may flow with a constant velocity and a constant Reynolds number, so that the fluids and substances included in each of the fluids may not be mixed or diffused.
  • the immiscibility of the first supply fluid and the second supply fluid may be affected by the size and shape of the first channel.
  • the first supply fluid may be guided to flow in the center of the first channel by the second supply fluid.
  • the first supply fluid may pass through the first channel and collide with a protrusion groove or a protrusion groove formed to face the center of the first channel, so that the cells included in the first supply fluid are moved to the protrusion groove or the protrusion groove. It may collide near the protrusion groove.
  • the second channel and the third channel may be channels connected to an end of the first channel.
  • the second channel and the third channel may be connected to the first channel at a predetermined angle to receive the fluid of the first channel.
  • An angle between the second channel and the third channel with the first channel may be at least one of an acute angle, a right angle, and an obtuse angle.
  • the second channel and the third channel may be formed in an arrow ( ⁇ ) shape, a T shape, or a Y shape based on the first channel.
  • the second channel and the third channel may be formed in an arrow ( ⁇ ) shape or a T shape with respect to the first channel.
  • the second channel and the third channel may be formed symmetrically or asymmetrically with respect to the first channel.
  • the second channel and the third channel may be formed symmetrically with respect to the first channel.
  • the second channel and the third channel may be formed symmetrically with respect to the longitudinal direction of the first channel.
  • a cross section of at least one of the first channel, the second channel, and the third channel has a rectangular shape having a major axis and a minor axis, the major axis is provided in a horizontal plane, the minor axis is provided in a vertical plane, and the major axis is 10 ⁇ m to 10 mm, and the short axis may be 5 ⁇ m to 60 ⁇ m.
  • the length of the short axis or the long axis may be in a range in which the first supply fluid and the second supply fluid may flow without mixing in the first channel.
  • the length of the short axis or the long axis may be in a range in which a vortex can be well formed in the second channel and the third channel.
  • the first to third channels may have a long axis and a short axis in a length ratio of 2:1, and may have, for example, a rectangular shape of 80x40 ⁇ m or 40x30 ⁇ m.
  • the vortex region may be a portion in which the linear flow of the first fluid is temporarily stopped.
  • the delivery material can be applied without limitation as long as it is a material that can be delivered into cells.
  • the delivery material may be, for example, at least one of nucleic acids, proteins, fluorescent dyes, quantum dots (quantum dots), carbon nanotubes, antigens, ribonucleoproteins, gene scissors, polymers, and nanoparticles.
  • the fluid including the cell and the delivery material may have a Reynolds number of 1 to 1000 according to Equation 1 below in the first to third channels. If the Reynolds number is less than 1, the vortex may not be formed because a sufficient amount and velocity to generate a vortex in the channel may not be formed. If the Reynolds number is greater than 1000, an unstable fluid flow may be generated.
  • Equation 1 ⁇ is the viscosity coefficient of the fluid, ⁇ is the density, V is the average velocity of the fluid, and D is the hydraulic diameter of the pipe.
  • the Reynolds number of the second channel or the third channel may be 40% to 110% of the Reynolds number of the first channel.
  • the Reynolds number of the second channel or the third channel may be smaller than the Reynolds number of the first channel.
  • the Reynolds number of the second channel or the third channel may be 50% to 80% of the Reynolds number of the first channel.
  • the hydraulic diameter according to Equation 2 in at least one of the first to third channels may be 1 ⁇ m to 100 mm. Also preferably, the hydraulic diameter according to Equation 2 may be 5 ⁇ m to 130 ⁇ m.
  • the hydraulic diameter can define the size of each channel. Therefore, when each channel is not a cylinder, the size of each channel can be determined by the hydraulic diameter.
  • the hydraulic diameter in Equation 2 may be the hydraulic diameter in Equation 1 above.
  • Equation 2 A c is the cross-sectional area of the pipe through which the fluid flows, and P is the length of the two-dimensional curve surrounding the fluid when viewed from the cross-section.
  • the hydrodynamic diameter of the channel is less than 5 ⁇ m, the amount of fluid flowing in the channel may not be sufficient to form a vortex.
  • a force eg, reversal of pressure
  • a vortex in the flow of the fluid may not be formed.
  • the hydraulic diameter of the second channel or the third channel may be 40% to 110% of the hydraulic diameter of the first channel.
  • the hydraulic diameter of the second channel or the third channel may be smaller than the hydraulic diameter of the first channel.
  • the hydraulic diameter of the second channel or the third channel may be 50% to 80% of the hydraulic diameter of the first channel.
  • the fluid of the first channel may be defined by the particle Reynolds number (Re p ) of Equation 3 .
  • Re p is the particle Reynolds number
  • Re is the Reynolds number
  • a is the diameter of the cell or particle
  • D is the hydraulic diameter
  • the first supply fluid delivered to the first channel may flow in the center of the first channel. Accordingly, in this case, the cells can flow to the center of the first channel even without the second supply channel.
  • the second supply fluid guides the first supply fluid, so that the first supply fluid can flow and flow in the center of the first channel.
  • the Reynolds number of particles in the first channel may be 0.5 to 100. Also, the Reynolds number of particles in the first channel may be 1 to 100. Also preferably, the Reynolds number of particles in the first channel may be 4 to 100. Also preferably, the Reynolds number of particles in the first channel may be 25 to 40.
  • At least one of the first to third channels and a portion where the first channel and the second and third channels meet may include a vortex region.
  • the linear flow of the fluid flowing through the first to third channels may be temporarily stopped in the vortex region.
  • the vortex region may be a portion in which a vortex is formed in the channel.
  • a protrusion groove may be formed in a portion where the first channel is connected to the second channel and the third channel.
  • the protrusion groove may be formed to protrude in a fluid flowing direction at a position corresponding to the first channel.
  • the protrusion groove may branch the fluid flowing in the first channel by connecting the second channel and the third channel at an end of the first channel, respectively.
  • the protruding groove may be formed in at least one of a rectangular, triangular, and cylindrical vertical cross section.
  • the protruding groove may be in the form of a tube with a closed end, and may not be limited to the above example as a form capable of generating a vortex.
  • the introduction portion of the protrusion groove may be 1 ⁇ m to 20 ⁇ m, and the depth of the protrusion groove may be 3 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the cells from the first channel may collide with the introduction part of the protruding groove or may collide by flowing into the protruding groove. Even when the cells are introduced into the protrusion groove and collide, they may escape out of the protrusion groove after the collision and experience a vortex.
  • the cells may collide with the partition wall around the protruding groove.
  • At least one of a first vortex and a second vortex may be formed in the vortex region.
  • the first vortex may be formed in a portion where the first channel and the second channel are connected and a portion where the first channel and the third channel are connected to each other.
  • the second vortex may be formed in at least one of the second channel and the third channel.
  • the vortex may refer to a flow in which a flow direction is changed as the fluid encounters a sudden change in pressure, an obstacle, or the like, and the flow is interrupted. That is, the vortex may be formed as the fluid flowing through the channel collides with an obstacle (eg, a protruding groove or a partition wall) or a straight flow is stagnated due to a reversal of pressure. Therefore, when a vortex is formed in the fluid, cells and/or a transmitter included in the fluid may receive an external force while experiencing the vortex, and deformation may occur in the cell during this process.
  • an obstacle eg, a protruding groove or a partition wall
  • the first vortex may be formed in a stagnation point region.
  • the stagnation point region may be included in a portion where the first channel is connected to the second channel and the third channel.
  • the stagnation point region may be a portion in which the fluid flowing out of the first channel is stagnant to form the first vortex. That is, the stagnation point region may be a portion in which the fluid flowing out of the first channel collides with at least one of the protruding groove and the partition wall to form a first vortex.
  • the stagnation point region may be a portion where cells and/or a delivery material included in the fluid collide with at least one of the protruding groove and the partition wall and undergo a first vortex.
  • the cell may experience only one of the collision and the first vortex, and even in this case, deformation may occur in the cell.
  • the “collision" of the cells may mean that the cells collide with at least one of the introduction part of the protruding groove, the inside of the protruding groove, and the partition wall.
  • the partition wall may be a partition wall around the protruding groove.
  • the second vortex may be formed in at least one of the second channel and the third channel.
  • the portion where the second vortex is formed may be a portion completely outside the end of the first channel.
  • the region where the second vortex is formed may be a region completely out of a region extending to the same width as the width of the first channel in the longitudinal direction of the first channel.
  • the portion where the second vortex is formed is to be formed in a portion spaced apart by 20 ⁇ m to 200 ⁇ m in the longitudinal direction of the second channel or the third channel with respect to the center of the first channel (or the center of the protruding groove).
  • the first fluid flowing in the first channel may interfere with the formation of the vortex, so that the vortex may not be well formed.
  • the fluid may not have sufficient velocity or Reynolds number to form a vortex.
  • the fluid may be formed by a pressure change in the second channel or the third channel, and the flow of the fluid may be stopped at a portion where the second vortex is formed. Accordingly, the flow of the cells and the transporter included in the fluid may be stagnant.
  • Stagnation (or stopping) of the flow of the fluid, cell, and carrier means that the linear flow is stagnant, and may not mean that there is no motion.
  • the flow of the fluid, cell, and carrier may move in a vortex shape in the flow of the vortex. That is, the fluid, cells and transporter may be stagnant by the vortex.
  • the time for which cells are stopped (stagnant) by the second vortex may be 0.1 ⁇ s to 100 ⁇ s.
  • the first vortex or the second vortex may be strongly formed as the Reynolds number of the fluid increases. Accordingly, when the Reynolds number of the first channel is greater than that of the second channel and/or the third channel, the first vortex may be formed stronger than the second vortex. In this case, the cell may be more deformed by the first vortex.
  • the fluid flowing through the first to third channels and the cells and the delivery material included in the fluid may experience at least one of the collision, the first vortex, and the second vortex. Accordingly, even when the cell undergoes only one of the collision, the first vortex, and the second vortex, the cell is deformed and the transmitter can be delivered into the cell.
  • a temporary perforation is formed in at least one of the cell membrane and the nuclear membrane, and the delivery material can be introduced into the cell through the perforation.
  • the perforation may be formed in at least one of a cell membrane and a nuclear membrane of the cell. Also, if the cell undergoes several collisions or vortices, the perforation may form more than once. At this time, the perforation may be formed in the same site or a different site of the cell membrane or nuclear membrane, and after the first perforation is maintained or recovered, the next perforation may be formed. The perforations formed first can be further expanded by subsequent perforations.
  • the cell may undergo both the collision, the first vortex and the second vortex, in which case the transmitter may be better delivered into the cell.
  • the delivery material When the delivery material is delivered into the cell by the collision or vortex, when only the cell membrane is deformed, the delivery material can be delivered into the cell. However, when deformation occurs in the cell membrane and the nuclear membrane, the delivery material may be delivered to at least one of the cell and the nucleus.
  • the delivery material may include any material having a size smaller than that of a cell.
  • the delivery material may be, for example, at least one of nucleic acids, proteins, and nanoparticles.
  • the delivery material may consist of nucleic acids, proteins, and nanoparticles, respectively, and may include various combinations of one or more, such as a combination between nucleic acids, proteins, and nanoparticles, depending on the use.
  • At least one of a first vortex and a second vortex is formed in the vortex region, and the first vortex may be generated after the fluid passing through the first channel collides with the protruding groove or the partition wall, and the second The vortex may be formed by a local increase in pressure in each of the second and third channels.
  • the cell may receive two stages of force in the stagnation point region.
  • the cell In the first step, the cell may be deformed by colliding with the introduction part of the protruding groove or inside the protruding groove, or by colliding with the partition wall and receiving a force.
  • the cell leaves the protruding groove or the partition wall, and the flow of the fluid leaving the protruding groove or the partition wall and the flow of the first channel mix to form a first vortex, so that the cell can be deformed. have.
  • the cell may undergo only one of the first and second stages.
  • the cell undergoes a first vortex after impact, it can deform to a greater extent in the region of the stagnation point.
  • the force of the first vortex to deform the cell may be greater than the force caused by the second vortex.
  • the second vortex may be generated by an increase in pressure in a local portion of the second channel and/or the third channel.
  • the fluid flows from a high pressure side to a low pressure side, but there may be a portion where the pressure is reversed in a local portion of the second channel (or third channel), wherein The second vortex may be formed.
  • the first vortex and the second vortex may be sequentially formed based on a single cell or delivery material. However, the first vortex and the second vortex may be formed at the same time or at different times based on the platform according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing that a fluid containing cells and a transmitter undergoes a first vortex and a second vortex in the T-channel, which is an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1A shows that a fluid including cells and a delivery material flows at a constant speed in the first channel.
  • circles represent cells and triangles represent transmitters, and they float and flow in a fluid.
  • 1B shows a state in which the cell undergoes a first vortex by leaving the protruding groove or septum after colliding with the protruding groove or septum.
  • the cells may be deformed and perforated while colliding with the protruding groove or partition wall, and thus the delivery material may be delivered.
  • the cell angle is deformed to cause perforation, and the delivery material can be delivered into the cell.
  • the cell may be perforated in at least any one of the cell membrane and the nuclear membrane while undergoing at least one of the collision and the first vortex, and the delivery material may be delivered into the cell (or in the nucleus) through the perforation.
  • FIG. 1C shows a state in which cells and transmitters flowing into the second or third channel undergo a second vortex in the middle of the channel.
  • the cells that have undergone the second vortex may have already collided with the protruding groove or the partition wall or have suffered at least one of the first vortex.
  • cells that undergo the second vortex may be cells that have not undergone neither collision nor the first vortex.
  • the transporter can be delivered again into the cell where the transporter is already present.
  • a transmitter may be delivered into a cell that lacks the transmitter.
  • Figure 1d shows a state in which the cell exits the channel after receiving the transmitter. These cells can be obtained and used in various fields.
  • FIG. 2 schematically shows a system in which cells, a delivery material, a fluid, etc. are delivered to a first channel from the first supply unit and the second supply unit.
  • A denotes a first supply part, and at least one of a cell, a delivery material and a medium flows into the first supply fluid and is supplied to the first channel.
  • B1 to B3 denote a second supply unit, and a delivery material or the like flows into the second supply fluid and is supplied to the first channel.
  • a plurality of second supply channels may be connected to the first channel (Fig. 2 upper), and each second supply unit channel in the plurality of second supply units may be connected to the first channel (Fig. 2 lower). .
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of the channel shown in FIG. 2, and schematically shows a first supply unit channel or a first supply fluid or a fluid flowing through the first channel.
  • a fluid including cells or a delivery material flows throughout the channel.
  • the second supply fluid supplied from the second supply channel further exists, and the first supply fluid and the second supply fluid flow without mixing.
  • the first supply fluid delivered from the first supply channel flows to the center of the first channel, and the cells included therein flow to the center among the first supply fluid.
  • Both the first supply fluid and the second supply fluid may include fluids having the same properties, but the fluids are not mixed or exchanged with each other due to the velocity or the shape of the channels of these fluids.
  • FIG. 4 is a result of visualizing and simulating a process in which the fluid flowing out from the first channel collides with the protruding groove or partition wall to form a first vortex through micro-fluorescent particles. Through the movement path of cells and microfluorescent particles, it can be confirmed that they move under the influence of the vortex after they collide with the partition wall.
  • 5 to 7 show the process and efficiency of material delivery into cells by forming a vortex in the Y-type channel, which is an embodiment of the present invention.
  • the platform used a first channel with a cross-sectional diameter of 80x40 ⁇ m, and the Reynolds number was 300 in the first channel of the fluid.
  • FIG. 5 shows a state in which cells contained in the fluid flowing out of the first channel collide with the protruding groove, and the shape of the cells is deformed and undergoes the first vortex. It can be seen that the cells collided with the protruding groove are deformed in shape depending on the shape of the protruding groove or are deformed by the first vortex.
  • FIG. 6 shows a state in which the fluid undergoes the second vortex while flowing through the second channel (or the third channel).
  • the flow of cells is stopped at a point in the middle of the channel. This stagnation is caused by the formation of a second vortex in the channel, and in this process, the cells are deformed and substances are transferred into the cells.
  • FITC-Dextran t-phase of fluorescence
  • Figure 7a is a control, and measures the cells not treated with the platform. Therefore, it is located on the left side of the graph because it contains almost no fluorescent material.
  • Figure 7b shows the overlapping control (right) and the experimental group (left) together. In the experimental group, a lot of fluorescent material was delivered to the cells, so it was skewed to the right.
  • FIGS. 8 to 10 show the process and efficiency of transferring a substance into a cell by forming a vortex in an arrow-shaped channel according to an embodiment of the present invention.
  • the platform used a first channel with a cross-sectional diameter of 80x40 ⁇ m, and the Reynolds number was 300 in the first channel of the fluid.
  • FIG. 8 and 10 it can be seen that the shape of the cell is changed as the cell undergoes the first vortex or the second vortex, similar to the Y-type channel.
  • FIG. 9 it can be seen that the flow of cells is stagnated at an intermediate point of the channel due to the second vortex in the interval of 20 ⁇ s to 24 ⁇ s.
  • FIG. 10 is a result of delivering a fluorescent material to each cell under the same conditions as in FIG. 7 and quantitatively measuring the t-phase of fluorescence (FITC-Dextran) using flow cytometry.
  • FITC-Dextran t-phase of fluorescence
  • 11 is a view confirming the efficiency and viability of delivery of a delivery material into a cell using the platform of an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11A it can be seen that fluorescence was not expressed in the control group, but fluorescence was expressed in the experimental group (cell stretching).
  • 11B is a graph showing the delivery efficiency according to the mRNA concentration. As the concentration of mRNA increased, the delivery efficiency increased, and even at a very low concentration of 2 ⁇ g/ml of mRNA, the efficiency was about 90%.
  • FIG. 11C the result in FIG. 11B is again schematically represented as a ratio to the absolute fluorescence intensity.
  • the average fluorescence intensity in the case of mRNA concentration of 2 ⁇ g/ml was about 10 times higher than that in the case of no mRNA.

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Abstract

본 발명은 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 흐름을 가지고 유동하는 제1채널; 상기 제1채널과 각도를 가지고 연결되어 세포 및 전달물질을 포함하는 상기 유체가 흐름을 가지고 유동하는 제2채널 및 제3채널; 및 상기 제1채널, 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 상기 유체가 충돌 및 와류 영역 중 적어도 어느 하나를 형성하는, 세포 내 물질 전달 플랫폼에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 채널 내에 와류를 형성하여 세포 내에 물질을 효과적으로 전달할 수 있다.

Description

세포 내 물질 전달 플랫폼
본 발명은 세포 내 물질을 전달하는 플랫폼에 관한 것으로, 보다 상세하게는 와류의 형성에 의하여 세포 내에 물질 전달할 수 있는 플랫폼에 관한 것이다.
세포 내 물질 전달은 세포공학의 가장 기본이 되는 실험 중 하나로 보통 캐리어를 이용하거나 세포막/핵막에 나노구멍(nanopore)을 만들어 물질을 전달한다. 바이러스 또는 Lipofectamine 중심의 캐리어 기법들은 최적화 시 고효율 물질 전달이 가능하나 안전성, 느린 전달 속도, 노동/비용 집약적인 캐리어 준비 과정, 낮은 재현성 등의 문제점들이 존재한다.
이에 반하여 세포막에 에너지를 가하여 나노구멍을 만드는 방법들, 예를 들어 전기천공(Electroporation) 또는 마이크로니들(microneedle)과 같은 기술들은 상대적으로 여러 물질을 다양한 세포로 전달이 가능한 장점이 있다. 그러나 방법의 침습성으로 인한 낮은 세포 생존율, 전달 물질의 변성 그리고 낮은 처리량은 큰 한계로 지적되고 있다. 이러한 문제점들을 해결하고자 대량의 세포처리가 가능한 미세유체기기(microfluidic device)들의 사용이 두드러진다. 대표적으로 미세관에 병목 구간(narrow constriction or bottleneck)을 만들고 세포들이 병목 구간을 지날 때 세포의 물리적 변형을 통해 세포막에 나노구멍을 만드는 플랫폼이 존재한다. 그러나, 이 접근법은 실험 진행 시 병목 구간 자체가 막히고, 일정하지 못한 물질 전달 효율 등의 큰 단점들을 가진다.
예를 들어 미국 특허 제2014-0287509호(이하 종래기술)는 병목 구조를 갖는 채널로 세포를 직접 흘림으로써 세포에 압력을 인가하여 세포변형을 유도하는 기술을 개시하고 있다. 하지만, 이 경우 세포들이 불균일한 속도로 진행하기 때문에 세포가 변형되는 속도가 일정하지 못하고, 따라서 물질 전달 효율이 떨어진다. 또한 세포가 확산(diffusion)에 의한 방식으로만 전달되기 때문에 물질 전달 효율이 근본적으로 낮고 핵 내로의 핵산이 전달되기 어려운 문제가 있다. 따라서 상기 미세유체 기기의 높은 처리 기능을 살리면서 세포 내에 다양한 물질을 균일하게 고효율로 전달할 수 있는 혁신적인 차세대 세포 내 물질 전달 플랫폼 개발이 시급하다.
본 발명의 목적은 미세관 내에서 와류를 발생시켜 세포 내에 물질을 전달할 수 있는 플랫폼을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일측면에 따르면, 본 발명의 일 실시예는, 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 흐름을 가지고 유동하는 제1채널; 상기 제1채널과 각도를 가지고 연결되어 세포 및 전달물질을 포함하는 상기 유체가 흐름을 가지고 유동하는 제2채널 및 제3채널; 및 상기 제1채널, 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 상기 유체가 충돌 및 와류 영역 중 적어도 어느 하나를 형성하는 것인, 세포 내 물질 전달 플랫폼을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 제1채널 내지 제3채널 중 적어도 어느 하나의 단면은 단축 및 장축을 갖는 직사각형으로 형성되고, 상기 단축이 세로면으로 구비되고, 상기 장축이 가로면으로 구비되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 물질 전달 플랫폼은 세포 및 전달물질 중 적어도 어느 하나를 포함하는 제1공급 유체를 공급하는 제1공급부; 제2공급 유체를 공급하는 제2공급부;를 더 포함하고, 상기 제1공급 유체는 제1공급부 채널을 통해 상기 제1채널로 공급되고, 상기 제2공급 유체는 제2공급부 채널을 통해 상기 제1채널로 공급되고, 상기 제2공급부 채널은 하나 이상 형성되고, 상기 제2공급부 채널은 상기 제1공급부 채널의 양 옆에서 상기 제2유체를 공급하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1공급부 채널의 레이놀즈 수 및 상기 제2공급부 채널의 레이놀즈 수는 2:1 내지 1:3인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1채널에서, 상기 제1채널에서 상기 유체는 상기 제1공급 유체 및 제2공급 유체를 포함하고, 상기 제1공급 유체는 제1채널에서 장축의 중앙에서 유동하여 흐르고, 상기 제2공급 유체는 상기 제1공급 유체의 양 옆에서 유동하여 흐르고, 상기 제1채널에서 장축의 양 끝단에서 유동하여 흐르고, 상기 제1공급 유체 및 제2공급 유체는 상기 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 혼합되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 와류 영역은 상기 유체의 직선형 흐름이 일시적으로 정체되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 전달물질은 핵산, 단백질, 형광 다이, 양자점, 탄소나노튜브, 항원, 리보핵단백질, 유전자가위, 고분자 및 나노입자 중 적어도 어느 하나인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2채널 및 제3채널은 상기 제1채널을 기준으로 대칭 또는 비대칭을 이루어 형성되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2채널 및 제3채널이 상기 제1채널과 이루는 각도는 예각, 직각 및 둔각 중 적어도 어느 하나인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1채널, 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나의 단면은 장축과 단축을 가진 직사각형 형태를 가지고, 상기 장축은 가로면으로 구비되고, 상기 단축은 세로면으로 구비되고, 상기 장축은 10μm 내지 10mm이고, 상기 단축은 5μm 내지 60μm인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 세포 및 전달물질을 포함하는 유체는 상기 제1채널에서 하기 식 1에 따른 레이놀즈 수가 1 내지 1000이고, 상기 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나는 하기 식 1에 따른 레이놀즈 수가 1 내지 1000인 것일 수 있다.
[식 1]
Figure PCTKR2022005272-appb-img-000001
(상기 식 1에서 μ는 유체의 점성계수, ρ는 밀도, V는 유체의 평균속도, D는 관의 수력학적 직경이다.)
일 실시예에 있어서, 상기 제2채널 또는 제3채널의 레이놀즈 수는 상기 제1채널의 레이놀즈 수에 대하여 40% 내지 110%로 구비되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1채널 내지 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 하기 식 2에 따른 수력학적 직경은 5 μm 내지 130μm인 것일 수 있다.
[식 2]
Figure PCTKR2022005272-appb-img-000002
(상기 식 2에서 Ac는 유체가 흐르는 관의 단면적, P는 단면을 바라봤을 때 유체와 둘러 닿아있는 2차원 곡선의 길이이다.)
일 실시예에 있어서, 상기 제1채널의 세포 및 전달물질 중 적어도 어느 하나는 식 3에 의하여 정의되는 파티클 레이놀즈 수가 4 내지 100인 것일 수 있다.
[식 3]
Figure PCTKR2022005272-appb-img-000003
(상기 식 3에서 Rep는 파티클 레이놀즈 수이고, Re는 레이놀즈 수이고, a는 세포나 입자의 직경(diameter)이고, D는 수력학적 직경이다.)
일 실시예에 있어서, 상기 제2채널 또는 제3채널의 수력학적 직경은 상기 제1채널의 수력학적 직경에 대하여 40% 내지 110%로 구비되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 와류 영역에서 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나가 형성되고, 상기 제1와류는 상기 제1채널과 제2채널 및 제3채널이 서로 연결되는 부분에서 형성되고, 상기 제2와류는 상기 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 형성되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2와류는 상기 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 형성되고, 상기 제2와류는 상기 제1채널의 중심부에서 상기 제2채널 또는 제3채널의 길이 방향으로 20μm 내지 200μm 이격된 부분에서 형성되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나는 상기 유체의 압력 변화에 의하여 형성되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1와류 또는 제2와류는 상기 유체의 레이놀즈 수가 클수록 강하게 형성되는 것이 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2와류에 의하여 상기 세포의 흐름이 정체되는 시간은 0.1 μs 내지 100 μs인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 충돌, 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나는 상기 세포의 세포막 및 핵막 중 적어도 하나에 일시적인 천공을 형성하고, 상기 천공을 통해 상기 전달물질이 상기 세포 내로 유입되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 충돌, 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나에 의하여 상기 세포의 세포막 및 핵막 중 적어도 하나에 천공이 형성되고, 상기 천공은 상기 세포막 또는 핵막의 동일 부위 또는 다른 부위에 형성되고, 첫 번째로 형성되는 천공이 유지되거나 회복된 후 다음 천공이 형성되고, 첫 번째로 형성되는 천공은 그 다음 천공에 의하여 더 크게 확장되거나 크기가 유지되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1채널의 말단에서 상기 제2채널 및 제3채널이 각각 연결되어 상기 제1채널 중에 흐르는 유체를 분기시키고, 상기 제2채널 및 제3채널 사이에서 돌출홈이 형성되고, 상기 돌출홈은 상기 제1채널에 대응하는 위치에서 유체가 흐르는 방향으로 돌출되어 형성되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 돌출홈은 세로 단면이 사각형, 삼각형 및 원통형 중 적어도 어느 하나로 형성되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 돌출홈의 도입부는 1μm 내지 20μm이고, 상기 돌출홈의 깊이는 3μm 내지 100μm인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 와류 영역에서 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나가 형성되고, 상기 제1와류는 상기 제1채널을 통과한 상기 유체가 상기 돌출홈의 도입부, 돌출홈의 내부 및 돌출홈 주변의 격벽 중 적어도 어느 하나에 충돌한 후 국소적인 압력의 역전에 의해 형성되고, 상기 제2와류는 상기 제2채널 및 제3채널 각각에서 국소적인 압력의 역전에 의해 형성되는 것일 수 있다.
이상 살펴본 바와 같은 본 발명에 따르면, 다중 와류를 발생시켜 세포 내로 전달물질을 전달하는 플랫폼을 제공할 수 있다. 또한, 상기 전달 물질은 핵산, 단백질, 나노입자 등 다양한 전달 물질을 포함할 수 있으며, 이들 중 어느 하나만이 특정된 것이 아닌 핵산 및 단백질 등 두개 이상이 조합되어 세포 내로 전달되는 플랫폼을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 및 전달물질이 플랫폼 내에서 유동하고 세포 내로 전달물질이 전달되는 것을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제1공급부 또는 제2공급부에서 세포, 전달물질, 유체 등이 제1채널로 전달되는 것을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 제1공급부 채널 또는 제1채널에서 제1공급 유체 또는 유체가 유동하여 흐르는 형태를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따라 제1와류가 형성되는 과정을 시뮬레이션한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 Y형 채널에서 제1와류가 형성되는 모습을 나타낸 도면이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따라 Y형 채널에서 제2와류가 형성되는 모습을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 Y형 채널에서 전달물질이 세포 내로 전달되는 효율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 화살표(→)형 채널에서 제1와류 형성에 따른 세포가 변형되는 모습을 나타낸 도면이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따라 화살표형 채널에서 제2와류 형성에 따라 세포가 변형되는 모습을 나타낸 도면이다.
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따라 화살표형 채널에서 전달물질이 세포 내로 전달되는 효율을 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예의 플랫폼을 이용하여 세포 내에 전달물질이 전달되는 효율 및 생존율을 나타내는 도면이다.
본 발명의 일측면에 따르면, 본 발명의 일 실시예는, 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 흐름을 가지고 유동하는 제1채널; 상기 제1채널과 각도를 가지고 연결되어 세포 및 전달물질을 포함하는 상기 유체가 흐름을 가지고 유동하는 제2채널 및 제3채널; 및 상기 제1채널, 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 상기 유체가 충돌 및 와류 영역 중 적어도 어느 하나를 형성하는, 세포 내 물질 전달 플랫폼을 포함할 수 있다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 이하의 설명에서 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다
또한, 본 발명에서 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들 뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼들에서 와류가 형성되고 유체가 흐르는 모습을 모식적으로 나타낸 도면이다. 도 1은 본 발명의 일 실시예를 도시한 것이고, 이에 한정되지 않는다. 도 1의 플랫폼은 T형 플랫폼이지만, Y형 또는 화살표형(→) 플랫폼에서도 이와 동일한 과정을 거칠 수 있다.
본 발명의 일측면에 따르면, 본 발명의 일 실시예는, 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 흐름을 가지고 유동하는 제1채널; 상기 제1채널과 각도를 가지고 연결되어 세포 및 전달물질을 포함하는 상기 유체가 흐름을 가지고 유동하는 제2채널 및 제3채널; 및 상기 제1채널, 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 상기 유체가 충돌 및 와류 영역 중 적어도 어느 하나를 형성하는, 세포 내 물질 전달 플랫폼을 포함할 수 있다.
상기 제1채널은 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 흐름을 가지고 유입되는 채널일 수 있다. 상기 제1채널에서 유체가 흐름을 가진다는 것은, 상기 유체가 단순히 확산되는 것과 함께 외력이 가하여져 일정 속도를 가지고 유동하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 상기 제1채널에서의 유체의 흐름은 외력에 의하여 제어될 수 있으며, 따라서 상기 제1채널에서 유체와 함께 흐르는 상기 세포 및 전달물질도 일정 속도를 가지고 유동하는 것일 수 있다.
상기 유체는 상기 제1채널 내지 제3채널을 흐르는 유체를 모두 나타낼 수 있다. 상기 유체는 상기 제1채널에서는 제1공급 유체와 제2공급 유체가 구분되어 흐르지만, 상기 제2채널 또는 제3채널에서는 상기 제1공급 유체와 제2공급 유체가 혼합되어 흐르는 것일 수 있다.
상기 제1채널 내지 제3채널 중 적어도 어느 하나의 단면은 단축 및 장축을 갖는 직사각형으로 형성될 수 있다. 상기 장축은 바닥면을 기준으로 바닥과 평행하게 구비되는 즉, 가로면으로 구비될 수 있다. 상기 단축은 바닥면을 기준으로 거의 수직으로 구비되는 즉, 세로면으로 구비될 수 있다. 그러나 이는 일 실시예일 뿐 상기 제1채널 내지 제3채널의 형태는 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 물질 전달 플랫폼은 세포 및 전달물질 중 적어도 어느 하나를 포함하는 제1공급 유체를 공급하는 제1공급부; 제2공급 유체를 공급하는 제2공급부;를 더 포함하고, 상기 제1공급 유체는 제1공급부 채널을 통해 상기 제1채널로 공급되고, 상기 제2공급 유체는 제2공급부 채널을 통해 상기 제1채널로 공급되고, 상기 제2공급부 채널은 하나 이상 형성되고, 상기 제2공급부 채널은 상기 제1공급부 채널의 양 옆에서 상기 제2유체를 공급하는 것일 수 있다.
상기 제1공급부는 상기 제1공급 유체를 상기 제1채널에 공급할 수 있다. 상기 제1공급 유체는 다른 물질을 포함하는 친수성 유체일 수 있다. 상기 다른 물질은 세포, 전달물질 및 배지 중 적어도 어느 하나일 수 있다.
상기 제1공급부는 상기 제1공급 유체에 외력을 가하여 상기 제1공급부 채널을 통해 상기 제1채널을 향해 유동시킬 수 있다. 따라서 상기 제1공급 유체는 상기 제1공급부 채널 또는 제1채널에서 일정 속도를 가지고 유동할 수 있다.
상기 제2공급부는 상기 제2공급 유체를 상기 제1채널에 공급할 수 있다. 상기 제2공급 유체는 친수성 유체일 수 있고, 예를 들어 물일 수 있다. 상기 제2공급 유체는 전달물질을 포함할 수 있다.
상기 제2공급부는 상기 제2공급 유체에 외력을 가하여 상기 제2공급부 채널을 통해 상기 제1채널을 향해 유동시킬 수 있다. 따라서 상기 제2공급 유체는 상기 제2공급부 채널 또는 제1채널에서 일정 속도를 가지고 유동할 수 있다.
상기 제1공급부 채널 또는 제2공급부 채널에서 상기 제1공급 유체 또는 제2공급 유체는 일정 레이놀즈 수를 가지고 유동할 수 있다. 상기 제1공급부 채널의 레이놀즈 수와 상기 제2공급부 채널의 레이놀즈 수는 2:1 내지 1:3인 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 제1공급부 채널의 레이놀즈 수와 상기 제2공급부 채널의 레이놀즈 수는 1:1일 수 있다. 상기 제2공급부 채널이 2개 이상 있는 경우, 각각의 상기 제2공급부 채널의 레이놀즈 수는 동일할 수 있다.
상기 제2공급부 채널은 한 개의 제2공급부에서 복수개의 채널이 상기 제1채널로 연결될 수 있다. 또는 상기 제2공급부 채널은 복수개의 제2공급부에서 각각 채널이 상기 제1채널로 연결될 수 있다.
예를 들어 상기 제2공급부가 한 개 있고 여기에서 연결되는 2개의 제2공급부 채널이 있는 경우, 상기 제2공급부의 레이놀즈 수는 상기 제1공급부의 레이놀즈 수의 2배 이상이 될 수 있다. 이 경우 상기 제1공급부와 제2공급부의 레이놀즈 수는 1:1 내지 1:3일 수 있다.
또한 예를 들어 상기 제2공급부가 두 개 있고 여기에서 각각 연결되는 1개씩의 제2공급부 채널이 있는 경우, 상기 제2공급부의 레이놀즈 수는 상기 제1공급부의 레이놀즈 수와 동일하거나 약간 높을 수 있다. 이 경우 상기 제1공급부와 제2공급부의 레이놀즈 수는 1:1 내지 1:1.5일 수 있다.
상기 제2공급부 채널은 2개 이상 있을 수 있고, 상기 제2공급부 채널은 상기 제1공급부 채널을 사이에 두고 양 옆에 형성될 수 있다. 따라서 상기 제2공급 유체는 상기 제1공급 유체를 사이에 두고 양 옆으로 공급되어 상기 제1채널로 공급될 수 있다.
구체적으로 상기 제1채널에서, 상기 제1공급 유체는 제1채널에서 장축의 중앙에서 유동하여 흐르고, 상기 제2공급 유체는 상기 제1공급 유체의 양 옆, 즉 상기 제1채널에서 장축의 양 끝단에서 유동하여 흐를 수 있다. 예를 들어 상기 제1채널의 장축을 3등분 하였을 때 첫번째 1/3 지점까지는 상기 제2공급 유체가 유동하고, 두번째 1/2 지점까지는 상기 제1공급 유체가 유동하며, 마지막 1/3 지점까지는 다시 상기 제2공급 유체가 유동하여 흐를 수 있다.
상기 제1공급 유체 및 상기 제2공급 유체는 모두 친수성 유체를 포함할 수 있지만 상기 제1채널에서 혼합되지 않는 것일 수 있다. 상기 제1공급 유체 및 제2공급 유체는 일정한 속도 및 일정한 레이놀즈 수를 가지고 유동할 수 있고, 이에 의하여 상기 유체들 및 상기 유체들 각각이 포함하고 있는 물질들이 혼합되거나 확산되지 않을 수 있다. 또한 상기 제1공급 유체 및 제2공급 유체가 혼합되지 않는 것은 상기 제1채널의 크기 및 형상에 의해 영향을 받을 수 있다.
즉 상기 제1공급 유체는 상기 제2공급 유체에 의하여 제1채널의 중앙에서 흐르도록 가이드될 수 있다. 상기 제1공급 유체는 상기 제1채널을 통과하여 상기 제1채널의 중앙을 대면하여 형성된 돌출홈 또는 돌출홈 부근에 충돌할 수 있고, 따라서 상기 제1공급 유체에 포함된 세포가 상기 돌출홈 또는 돌출홈 부근에 충돌할 수 있다.
상기 제2채널 및 제3채널은 상기 제1채널의 말단과 연결되는 채널일 수 있다.
상기 제2채널 및 제3채널은 상기 제1채널과 일정 각도를 가지고 연결되어 상기 제1채널의 유체를 전달받을 수 있다. 상기 제2채널 및 제3채널이 상기 제1채널과 이루는 각도는 예각, 직각 및 둔각 중 적어도 어느 하나일 수 있다. 따라서 상기 제1채널을 기준으로 상기 제2채널 및 제3채널이 화살표(→)형, T형 또는 Y형을 이루어 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기 제2채널 및 제3채널은 상기 제1채널을 기준으로 화살표(→)형 또는 T형으로 형성될 수 있다.
상기 제2채널 및 제3채널은 상기 제1채널을 기준으로 대칭 또는 비대칭을 이루어 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기 제2채널 및 제3채널은 상기 제1채널을 기준으로 대칭으로 형성될 수 있다. 다시 말하면, 상기 제1채널의 길이 방향을 기준으로 상기 제2채널 및 제3채널이 대칭으로 형성되어 있을 수 있다.
상기 제1채널, 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나의 단면은 장축과 단축을 가진 직사각형 형태를 가지고, 상기 장축은 가로면으로 구비되고, 상기 단축은 세로면으로 구비되고, 상기 장축은 10μm 내지 10mm이고, 상기 단축은 5μm 내지 60μm인 것일 수 있다. 상기 단축 또는 장축의 길이는 상기 제1채널에서 상기 제1공급 유체 및 제2공급 유체가 혼합되지 않고 유동할 수 있는 범위일 수 있다. 또한 상기 단축 또는 장축의 길이는 상기 제2채널 및 제3채널에서 와류가 잘 형성될 수 있는 범위일 수 있다.
상기 제1채널 내지 제3채널은 장축 및 단축이 2:1의 길이 비율로 구비될 수 있고, 예를 들어 80x40μm 또는 40x30μm의 직사각형 형태로 구비될 수 있다.
상기 와류 영역은 상기 제1유체의 직선형 흐름이 일시적으로 정체되는 부분일 수 있다.
상기 전달물질은 세포 내에 전달할 수 있는 물질이면 제한 없이 적용할 수 있다. 상기 전달물질은 예를 들어, 핵산, 단백질, 형광 다이, 양자점(퀀텀닷), 탄소나노튜브, 항원, 리보핵단백질, 유전자 가위, 고분자 및 나노입자 중 적어도 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 세포 및 전달물질을 포함하는 유체는, 상기 제1채널 내지 제3채널에서 하기 식 1에 따른 레이놀즈 수가 1 내지 1000인 것일 수 있다. 상기 레이놀즈 수가 1보다 작으면 채널 내에 와류가 생길 정도로 충분한 양과 속도가 형성되지 않아 와류가 형성되지 않을 수 있고, 상기 레이놀즈 수가 1000보다 크면 불안정한 유체의 흐름이 생성될 수 있다.
[식 1]
Figure PCTKR2022005272-appb-img-000004
식 1에서 μ는 유체의 점성계수, ρ는 밀도, V는 유체의 평균속도, D는 관의 수력학적 직경이다.
상기 제2채널 또는 제3채널의 레이놀즈 수는 상기 제1채널의 레이놀즈 수에 대하여 40% 내지 110%로 구비될 수 있다.
또한 상기 제2채널 또는 제3채널의 레이놀즈 수는 상기 제1채널의 레이놀즈 수보다 작게 구비될 수 있다. 예를 들어 상기 재2채널 또는 제3채널의 레이놀즈 수는 상기 제1채널의 레이놀즈 수의 50% 내지 80%로 구비될 수 있다.
또한 상기 제1채널 내지 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 하기 식 2에 따른 수력학적 직경은 1μm 내지 100mm인 것일 수 있다. 또한 바람직하게는 상기 식 2에 따른 수력학적 직경은 5μm 내지 130μm일 수 있다. 상기 수력학적 직경은 각 채널의 크기를 정의할 수 있다. 따라서 각 채널이 원통이 아닌 경우 상기 수력학적 직경에 의하여 각 채널의 크기를 정할 수 있다. 식 2의 수력학적 직경은 상기 식 1에서의 수력학적 직경일 수 있다.
[식 2]
Figure PCTKR2022005272-appb-img-000005
식 2에서 Ac는 유체가 흐르는 관의 단면적, P는 단면을 바라봤을 때 유체와 둘러 닿아 있는 2차원 곡선의 길이이다.
상기 채널의 수력학적 직경이 5μm 보다 작은 경우 채널 내에 흐르는 유체의 양이 와류를 형성하기 충분하지 않을 수 있다. 또한 상기 채널의 수력학적 직경이 130μm 보다 큰 경우 유체의 흐름이 와류를 형성할 수 있는 힘(예를 들어 압력의 역전)이 형성되지 않을 수 있다.
상기 제2채널 또는 제3채널의 수력학적 직경은 상기 제1채널의 수력학적 직경에 대하여 40% 내지 110%로 구비될 수 있다.
또한 상기 제2채널 또는 제3채널의 수력학적 직경은 상기 제1채널의 수력학적 직경보다 작게 구비될 수 있다. 예를 들어 상기 재2채널 또는 제3채널의 수력학적 직경은 상기 제1채널의 수력학적 직경의 50% 내지 80%로 구비될 수 있다.
또한 상기 제1채널의 유체는 식 3의 파티클 레이놀즈 수(Rep)에 의하여 정의될 수 있다.
[식 3]
Figure PCTKR2022005272-appb-img-000006
(상기 식 3에서 Rep는 파티클 레이놀즈 수이고, Re는 레이놀즈 수이고, a는 세포나 입자의 직경(diameter)이고, D는 수력학적 직경이다.)
예를 들어 상기 파티클 레이놀즈 수가 1 내외이면, 상기 제1채널에 전달된 제1공급 유체는 상기 제1채널의 중앙에서 유동하여 흐를 수 있다. 따라서 이 경우에는 상기 제2공급부 채널이 없어도 상기 세포가 상기 제1채널의 중앙으로 흐르 수 있다.
또한 예를 들어 상기 파티클 레이놀즈 수가 4 내지 100사이이면, 상기 제2공급 유체가 상기 제1공급 유체를 가이드함으로써 상기 제1공급 유체가 제1채널의 중앙에서 유동하여 흐를 수 있다.
따라서 상기 제1채널에서 파티클 레이놀즈 수는 0.5 내지 100일 수 있다. 또한 상기 제1채널에서 파티클 레이놀즈 수는 1 내지 100일 수 있다. 또한 바람직하게는 상기 제1채널에서 파티클 레이놀즈 수는 4 내지 100일 수 있다. 또한 바람직하게는 상기 제1채널에서 파티클 레이놀즈 수는 25 내지 40일 수 있다.
상기 제1채널 내지 제3채널 및 상기 제1채널과 제2, 3채널이 만나는 부분 중 적어도 어느 하나는 와류 영역을 포함할 수 있다. 상기 제1채널 내지 제3채널을 흐르는 유체는 상기 와류 영역에서 직선형 흐름이 일시적으로 정체될 수 있다. 상기 와류 영역은 채널 내에서 와류가 형성되는 부분일 수 있다.
상기 제1채널이 상기 제2채널 및 제3채널과 연결되는 부분에는 돌출홈이 형성될 수 있다. 상기 돌출홈은 상기 제1채널에 대응하는 위치에서 유체가 흐르는 방향으로 돌출되어 형성될 수 있다.
상기 돌출홈은 상기 제1채널의 말단에서 상기 제2채널 및 제3채널이 각각 연결되어 상기 제1채널 중에 흐르는 유체를 분기시킬 수 있다.
상기 돌출홈은 세로 단면이 사각형, 삼각형 및 원통형 중 적어도 어느 하나로 형성될 수 있다. 상기 돌출홈은 말단이 막힌 관의 형태일 수 있고, 와류를 일으킬 수 있는 형태로서 상기 예에 제한되지 않을 수 있다.
또한 상기 돌출홈의 도입부는 1μm 내지 20μm이고, 상기 돌출홈의 깊이는 3μm 내지 100μm인 것일 수 있다.
상기 제1채널에서 나온 세포가 상기 돌출홈의 도입부에 충돌하거나 상기 돌출홈의 내부로 유입되어 충돌할 수 있다. 상기 세포가 상기 돌출홈의 내부로 유입되어 충돌하는 경우에도, 충돌 후에 상기 돌출홈 밖으로 이탈하여 와류를 겪을 수 있다.
또는 상기 세포는 상기 돌출홈 주변의 격벽에 충돌할 수 있다.
상기 와류 영역에서 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나가 형성될 수 있다. 구체적으로 상기 제1와류는 상기 제1채널과 제2채널이 연결되는 부분 및 상기 제1채널과 상기 제3채널이 서로 연결되는 부분에서 형성될 수 있다. 또한 구체적으로 상기 제2와류는 상기 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 형성될 수 있다.
상기 와류는 유체가 급작스런 압력의 변화, 장애물 등을 만나 흐름이 방해됨으로써 진행 방향이 바뀌는 흐름을 의미할 수 있다. 즉, 상기 와류는 채널을 흐르는 유체가 장애물(예를 들어 돌출홈, 격벽)에 부딪치거나 압력의 역전 등에 의하여 직선 흐름이 정체되면서 형성될 수 있다. 따라서 상기 유체에 와류가 형성되면 상기 유체에 포함된 세포 및/또는 전달물질은 상기 와류를 겪으면서 외력을 받을 수 있고, 이 과정에서 상기 세포에 변형이 일어날 수 있다.
더 자세하게 상기 제1와류는 정체점 영역에서 형성될 수 있다. 상기 정체점 영역은 상기 제1채널이 상기 제2채널 및 제3채널과 연결되는 부분에 포함될 수 있다. 상기 정체점 영역은 상기 제1채널에서 흘러나온 유체가 정체되어 상기 제1와류를 형성하는 부분일 수 있다. 즉, 상기 정체점 영역은 상기 제1채널에서 흘러나온 유체가 상기 돌출홈 및 격벽 중 적어도 어느 하나에 충돌하고 제1와류를 형성하는 부분일 수 있다. 따라서 상기 정체점 영역은 상기 유체에 포함된 세포 및/또는 전달물질이 상기 돌출홈 및 격벽 중 적어도 어느 하나에 충돌하고 제1와류를 겪는 부분일 수 있다. 다만 세포는 충돌 및 제1와류 중 어느 하나만 겪을 수도 있고, 이경우에도 상기 세포에 변형이 일어날 수 있다.
상기 세포가 "충돌"하는 것은 상기 세포가 돌출홈의 도입부, 돌출홈의 내부 및 격벽 중 적어도 어느 하나에 충돌하는 것을 모두 포함하는 의미일 수 있다. 여기에서 상기 격벽은 상기 돌출홈 주변의 격벽일 수 있다.
또한 상기 제2와류는 상기 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 형성될 수 있다. 상기 제2와류가 형성되는 부위는 상기 제1채널의 말단을 완전히 벗어난 부위일 수 있다. 다시 말하면 상기 제2와류가 형성되는 부위는 상기 제1채널의 길이 방향으로 상기 제1채널의 폭과 동일한 폭으로 연장되는 영역을 완전히 벗어난 부위일 수 있다. 구체적으로 상기 제2와류가 형성되는 부위는 상기 제1채널의 중심부(또는 상기 돌출홈의 중심부)를 기준으로 상기 제2채널 또는 제3채널의 길이 방향으로 20μm 내지 200μm 이격된 부분에서 형성되는 것일 수 있다.
상기 제2채널(또는 제3채널)의 길이 방향으로 20μm 보다 앞선 지점에서는, 상기 제1채널에서 흐르는 제1유체가 와류의 형성을 방해하여 와류가 잘 형성되지 않을 수 있다. 또한 상기 제2채널(또는 제3채널)의 길이 방향으로 200μm 보다 뒤의 지점에서는, 유체가 와류를 형성하기에 충분한 속도 도는 레이놀즈 수를 가지지 못할 수 있다.
상기 제2와류는 상기 유체가 상기 제2채널 또는 제3채널에서 압력변화로 형성될 수 있고, 상기 유체는 상기 제2와류가 형성되는 부분에서 흐름이 정체될 수 있다. 따라서 상기 유체에 포함된 상기 세포 및 전달물질의 흐름이 정체될 수 있다.
상기 유체, 세포 및 전달물질의 흐름이 정체된다(또는 멈춘다)는 것은 직선 흐름이 정체된다는 의미이고, 움직임이 없는 상태를 의미하는 것은 아닐 수 있다. 상기 유체, 세포 및 전달물질의 흐름이 정체되는 경우에는 이들이 상기 와류의 흐름을 타고 소용돌이 모양으로 움직일 수 있다. 즉, 상기 유체, 세포 및 전달물질은 와류에 의해 정체될 수 있다.
상기 제2와류에 의하여 세포가 멈추는(정체되는) 시간은 0.1 μs 내지 100 μs일 수 있다.
상기 제1와류 또는 제2와류는 상기 유체의 레이놀즈 수가 클수록 강하게 형성될 수 있다. 따라서 상기 제1채널의 레이놀즈 수가 상기 제2채널 및/또는 제3채널보다 큰 경우, 상기 제1와류가 상기 제2와류보다 강하게 형성될 수 있다. 이 경우에, 상기 세포는 상기 제1와류에 의해 더 많이 변형될 수 있다.
상기 제1채널 내지 제3채널을 흐르는 유체 및 상기 유체에 포함된 세포 및 전달물질은 상기 충돌, 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나를 겪을 수 있다. 따라서 상기 세포가 상기 충돌, 제1와류 및 제2와류 중 하나 만을 겪는 경우에도 상기 세포가 변형되어 상기 전달물질이 상기 세포 내로 전달될 수 있다.
상기 충돌 또는 와류에 의하여 세포가 변형되면 세포막 및 핵막 중 적어도 어느 하나에 일시적인 천공을 형성하고, 상기 천공을 통해 상기 전달물질이 상기 세포 내로 유입될 수 있다.
상기 천공은 상기 세포의 세포막 및 핵막 중 적어도 어느 하나에 형성될 수 있다. 또한 세포가 충돌 또는 와류를 여러 번 겪는 경우, 상기 천공이 2회 이상 형성될 수 있다. 이 때 상기 천공은 상기 세포막 또는 핵막의 동일 부위 또는 다른 부위에 형성될 수 있고, 첫번째로 형성되는 천공이 유지되거나 회복된 후 그 다음 천공이 형성될 수 있다. 첫번째로 형성된 천공은 그 다음 천공에 의하여 더 크게 확장 수 있다.
상기 세포는 상기 충돌, 제1와류 및 제2와류를 모두 겪을 수 있고 이때 상기 전달물질이 세포 내로 더 잘 전달될 수 있다.
상기 충돌 또는 와류에 의하여 상기 세포내로 전달물질이 전달되는 경우, 상기 세포막에만 변형이 일어나면 세포 내로 전달물질이 전달될 수 있다. 그러나 상기 세포막 및 핵막에 변형이 일어나면 상기 전달물질은 상기 세포 내 및 핵 내 중 적어도 어느 하나로 전달될 수 있다.
상기 전달물질은 세포보다 작은 크기의 모든 물질을 포함할 수 있다. 상기 전달물질은 예를 들어 핵산, 단백질 및 나노입자 중 적어도 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 전달물질은 핵산, 단백질 및 나노입자 각각으로 이루어질 수 있으며, 용도에 따라서는 핵산, 단백질 및 나노입자 사이의 조합 등 하나 이상을 다양하게 조합한 것을 포함할 수 있다.
상기 와류 영역에서 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나가 형성되고, 상기 제1와류는 상기 제1채널을 통과한 상기 유체가 상기 돌출홈 또는 격벽에 충돌한 후 발생할 수 있고, 상기 제2와류는 상기 제2채널 및 제3채널 각각에서 국소적인 압력의 상승에 의해 형성될 수 있다.
구체적으로 상기 세포는 상기 정체점 영역에서 2단계의 힘을 받을 수 있다. 1단계로, 상기 세포는 상기 돌출홈의 도입부 또는 돌출홈 내부에서 충돌하거나, 상기 격벽에 충돌하여 힘을 받음으로써 상기 세포에 변형이 일어날 수 있다. 2단계로, 상기 세포는 상기 돌출홈 또는 상기 격벽을 이탈하고, 상기 돌출홈 또는 상기 격벽을 이탈하는 유체의 흐름과 상기 제1채널의 흐름이 섞여 제1와류를 형성함으로써 세포에 변형이 일어날 수 있다. 그러나 상기 세포는 상기 1단계 및 2단계 중 어느 하나만을 겪을 수도 있다.
상기 세포는 충돌 후 제1와류를 겪기 때문에 상기 정체점 영역에서 더 크게 변형될 수 있다. 또한 상기 제1와류가 상기 세포를 변형시키는 힘은 상기 제2와류에 의한 힘보다 더 클 수 있다.
반면 상기 제2와류는 상기 제2채널 및/또는 제3채널의 국소 부분에서 압력이 상승함으로써 발생할 수 있다. 이는 상기 제2채널 및/또는 제3채널에서 상기 유체는 압력이 높은 쪽에서 낮은 쪽으로 흐르지만, 상기 제2채널(또는 제3채널)의 국소 부분에서 압력이 역전되는 부분이 있을 수 있고, 여기에서 상기 제2와류가 형성되는 것일 수 있다.
상기 제1와류 및 제2와류는 하나의 세포 또는 전달물질을 기준으로 순차적으로 형성될 수 있다. 그러나 상기 제1와류 및 제2와류는 본 발명의 일 실시예에 의한 플랫폼을 기준으로 동시 또는 이시(異時)에 형성될 수 있다.
이하 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명의 권리 범위가 하기 실시예들에 의하여 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예인 T형 채널에서 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 제1와류 및 제2와류를 겪는 것을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 1a는 제1채널에서 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 일정 속도를 가지고 흐르는 것을 나타낸 것이다. 도 1a에서 동그라미는 세포, 세모는 전달물질을 나타내며, 이들은 유체에 부유하여 유동한다.
도 1b는 상기 세포가 돌출홈 또는 격벽에 충돌한 후, 돌출홈 또는 격벽을이탈하여 제1와류를 겪는 모습을 나타낸 것이다. 상기 세포는 본 도면에 도시되지는 않았지만 상기 돌출홈 또는 격벽에 충돌하는 동안에 세포가 변형되어 천공이 발생할 수 있고, 따라서 전달물질이 전달될 수 있다. 또한 상기 세포가 제1와류를 겪는 동안에도 세포각 변형되어 천공이 발생하고, 전달물질이 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 세포는 충돌 및 제1와류 중 적어도 어느 하나를 겪으면서 세포막 및 핵막 중 적어도 어느 하나에 천공이 발생할 수 있고, 상기 천공을 통해 전달물질이 세포 내(또는 핵 내)로 전달되는 것일 수 있다.
도 1c는 제2채널 또는 제3채널로 유입된 세포 및 전달물질이 채널의 중간 부분에서 제2와류를 겪는 모습을 나타낸 것이다. 여기에서 제2와류를 겪는 세포들은 이미 돌출홈 또는 격벽에 충돌하거나 제1와류 중 적어도 어느 하나를 겪은 것일 수 있다. 또한 제2와류를 겪는 세포들은 충돌이나 제1와류 모두 겪지 않은 세포일수도 있다. 여기에서 이미 전달물질이 있는 세포 내에 다시 전달물질이 전달될 수 있다. 또한 전달물질이 없는 세포 내에 전달물질이 전달될 수도 있다.
도 1d는 상기 세포가 전달물질을 전달받은 후 채널을 빠져나가는 모습을 나타낸다. 이 세포들을 수득하여 여러 분야에 이용할 수 있다.
도 2는 제1공급부 및 제2공급부에서 세포, 전달물질 및 유체 등이 제1채널로 전달되는 시스템을 모식적으로 나타낸 것이다. A는 제1공급부를 나타내고 세포, 전달물질 및 배지 중 적어도 어느 하나가 제1공급 유체에 유동하여 제1채널로 공급된다. B1 내지 B3은 제2공급부를 나타내고, 전달물질 등이 제2공급 유체에 유동하여 제1채널로 공급된다.
제2공급부 하나에서 복수개의 제2공급부 채널이 제1채널로 연결될 수도 있고(도 2위), 복수개의 제2공급부에서 각각의 제2공급부 채널이 제1채널로 연결될 수도 있다(도 2아래).
도 3은 도 2위 도면의 채널 단면을 나타내고, 제1공급부 채널 또는 제1채널에서 제1공급 유체 또는 유체가 유동하여 흐르는 형태를 모식적으로 나타낸 것이다. 상기 제1공급부 채널에서는 세포 또는 전달물질 등을 포함하는 유체가 채널 전체에서 흐른다. 그러나 제1채널에서는 제2공급부 채널에서 공급된 제2공급 유체가 더 존재하고, 제1공급 유체와 제2공급 유체는 섞이지 않고 흐른다. 도면에서 보이는 바와 같이 제1공급부 채널에서 전달된 제1공급 유체는 제1채널의 중앙으로 흐르고, 여기에 포함된 세포는 제1공급 유체 중에서도 중앙으로 흐른다.
제1공급 유체와 제2공급 유체는 모두 동일한 성질의 유체를 포함할 수 있으나, 이들 유체들이 가지는 속도 또는 채널의 형상에 의하여 유체들이 혼합되거나 물질 교환이 이루어지지 않는다.
도 4는 제1채널에서 흘러나온 유체가 돌출홈 또는 격벽에 충돌하여 제1와류를 형성하는 과정을 미세형광입자를 통해 시각화하고 이를 시뮬레이션한 결과이다. 세포와 미세형광입자들의 이동 경로를 통해 격벽에 층돌한 후 와류에 영향을 받으며 이동하는 것을 확인할 수 있다.
도 5 내지 7는 본 발명의 일 실시예인 Y형 채널에서 와류를 형성하여 세포 내로 물질이 전달되는 과정 및 효율을 나타낸 것이다. 여기에서 플랫폼은 단면 직경이 80x40μm인 제1채널을 사용하였고, 유체의 제1채널에서 레이놀즈 수는 300이었다.
도 5은 제1채널에서 흘러나온 유체에 포함된 세포가 돌출홈에 충돌하여 세포의 모양이 변형되고, 제1와류를 겪는 모습을 나타낸다. 돌출홈에 충돌한 세포는 돌출홈의 모양에 따라 형태가 변형되거나, 제1와류에 의하여 형태가 변형되는 것을 확인할 수 있다.
또한 도 6은 유체가 제2채널(또는 제3채널)을 흐르면서 제2와류를 겪는 모습을 나타낸다. 24 μs 내지 32 μs의 구간에서 세포의 흐름이 채널의 중간 정도의 지점에서 정체되는 것을 확인할 수 있다. 이런 정체는 채널에서 제2와류가 형성되어 발생하고, 이 과정에서 세포가 변형되어 세포 내로 물질이 전달된다.
도 7은 각 세포에 형광물질을 전달하고 형광(FITC-Dextran)의 t기를 유세포분석기(flow cytometry)를 사용해 정량적으로 측정한 결과이다. 총 5000개의 세포를 측정하였고 x축이 형광세기, y축이 세포의 개수를 나타낸다. 이를 이용하여 본 플랫폼에서 전달물질이 세포 내로 전달되는 효율을 확인할 수 있다.
도 7a는 대조군으로, 플랫폼 처리가 되지 않은 세포들을 측정한 것이다. 따라서 형광물질이 거의 들어있지 않아 그래프의 왼쪽에 위치한다. 반면 도 7b는 대조군(오른쪽)과 실험군(왼쪽)을 오버랩하여 함께 표현한 것이다. 실험군은 세포에 형광물질이 많이 전달되어 오른쪽에 치우친 모습을 나타낸다.
도 8 내지 10은 본 발명의 일 실시예인 화살표형 채널에서 와류를 형성하여 세포 내로 물질이 전달되는 과정 및 효율을 나타낸 것이다. 여기에서 플랫폼은 단면 직경이 80x40μm인 제1채널을 사용하였고, 유체의 제1채널에서 레이놀즈 수는 300이었다.
도 8 및 10에서 Y형 채널과 마찬가지로 세포가 제1와류 또는 제2와류를 겪으면서 세포의 형태가 변형되는 것을 확인할 수 있다. 도 9에서는 20 μs 내지 24 μs의 구간에서 세포의 흐름이 제2와류에 의하여 채널의 중간 정도의 지점에서 정체되는 것을 확인할 수 있다.
도 10은 도 7와 동일한 조건에서 각 세포에 형광물질을 전달하고 형광(FITC-Dextran)의 t기를 유세포분석기(flow cytometry)를 사용해 정량적으로 측정한 결과이다. 도 10b에서 플랫폼을 통과한 세포들은 형광이 발현되어 그래프가 오른쪽으로 치우쳐 있는 것을 확인할 수 있다.
도 11는 본 발명의 일 실시예의 플랫폼을 이용하여 세포 내에 전달물질이 전달되는 효율 및 생존율을 확인한 도면이다.
K562 세포에 대하여 녹색 형광 단백질(GFP, Green Fluorescent Protein)을 발현하는 mRNA를 전달하였다. 도 11A에서 대조군(control)에서는 형광이 발현되지 않았지만, 실험군(cell stretching)에서는 형광이 발현되는 것을 확인할 수 있다.
도 11B에서는 mRNA 농도에 따른 전달 효율을 나타내는 그래프이다. mRNA의 농도가 높아질수록 전달 효율이 올라가고, mRNA의 농도가 2μg/ml의 매우 저농도에서도 효율은 약 90% 정도였다.
또한 도 11C에서는 도 11B에서의 결과를 절대적인 형광 세기에 대한 비율로 다시 도식화한 것이다. mRNA의 농도가 2μg/ml인 경우의 평균 형광 강도가 mRNA가 없는 경우보다 약 10배 정도 세게 나타났다
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (26)

  1. 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 흐름을 가지고 유동하는 제1채널;
    상기 제1채널과 각도를 가지고 연결되어 세포 및 전달물질을 포함하는 상기 유체가 흐름을 가지고 유동하는 제2채널 및 제3채널; 및
    상기 제1채널, 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 상기 유체가 충돌 및 와류 영역 중 적어도 어느 하나를 형성하는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  2. 제1항에 있어서,
    제1채널 내지 제3채널 중 적어도 어느 하나의 단면은 단축 및 장축을 갖는 직사각형으로 형성되고,
    상기 단축이 세로면으로 구비되고, 상기 장축이 가로면으로 구비되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 물질 전달 플랫폼은 세포 및 전달물질 중 적어도 어느 하나를 포함하는 제1공급 유체를 공급하는 제1공급부;
    제2공급 유체를 공급하는 제2공급부;를 더 포함하고,
    상기 제1공급 유체는 제1공급부 채널을 통해 상기 제1채널로 공급되고, 상기 제2공급 유체는 제2공급부 채널을 통해 상기 제1채널로 공급되고,
    상기 제2공급부 채널은 하나 이상 형성되고,
    상기 제2공급부 채널은 상기 제1공급부 채널의 양 옆에서 상기 제2유체를 공급하는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제1공급부 채널의 레이놀즈 수 및 상기 제2공급부 채널의 레이놀즈 수는 2:1 내지 1:3인,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 제1채널에서 상기 유체는 상기 제1공급 유체 및 제2공급 유체를 포함하고,
    상기 제1공급 유체는 제1채널에서 장축의 중앙에서 유동하여 흐르고,
    상기 제2공급 유체는 상기 제1채널에서 장축의 양 끝단에서 상기 제1공급 유체를 사이에 두고 유동하여 흐르고,
    상기 제1공급 유체 및 제2공급 유체는 상기 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 혼합되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 와류 영역은 상기 유체의 직선형 흐름이 일시적으로 정체되는 것인,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 전달물질은 핵산, 단백질, 형광 다이, 양자점, 탄소나노튜브, 항원, 리보핵단백질, 유전자가위, 고분자 및 나노입자 중 적어도 어느 하나인,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제2채널 및 제3채널은 상기 제1채널을 기준으로 대칭 또는 비대칭을 이루어 형성되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제2채널 및 제3채널이 상기 제1채널과 이루는 각도는 예각, 직각 및 둔각 중 적어도 어느 하나인,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제1채널, 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나의 단면은 장축과 단축을 가진 직사각형 형태를 가지고,
    상기 장축은 가로면으로 구비되고, 상기 단축은 세로면으로 구비되고,
    상기 장축은 10μm 내지 10mm이고,
    상기 단축은 5μm 내지 60μm인,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 세포 및 전달물질을 포함하는 유체는
    상기 제1채널에서 하기 식 1에 따른 레이놀즈 수가 1 내지 1000이고,
    상기 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나는 하기 식 1에 따른 레이놀즈 수가 1 내지 1000인 것인,
    [식 1]
    Figure PCTKR2022005272-appb-img-000007
    (상기 식 1에서 μ는 유체의 점성계수, ρ는 밀도, V는 유체의 평균속도, D는 관의 수력학적 직경이다.)
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제2채널 또는 제3채널의 레이놀즈 수는 상기 제1채널의 레이놀즈 수에 대하여 40% 내지 110%로 구비되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 제1채널 내지 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 하기 식 2에 따른 수력학적 직경은 5 μm 내지 130μm인 것인,
    [식 2]
    Figure PCTKR2022005272-appb-img-000008
    (상기 식 2에서 Ac는 유체가 흐르는 관의 단면적, P는 단면을 바라봤을 때 유체와 둘러 닿아있는 2차원 곡선의 길이이다.)
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 제1채널의 세포 및 전달물질 중 적어도 어느 하나는 식 3에 의하여 정의되는 파티클 레이놀즈 수가 0.5 내지 100인,
    [식 3]
    Figure PCTKR2022005272-appb-img-000009
    (상기 식 3에서 Rep는 파티클 레이놀즈 수이고, Re는 레이놀즈 수이고, a는 세포나 입자의 직경(diameter)이고, D는 수력학적 직경이다.)
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 제2채널 또는 제3채널의 수력학적 직경은 상기 제1채널의 수력학적 직경에 대하여 40% 내지 110%로 구비되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 와류 영역에서 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나가 형성되고,
    상기 제1와류는 상기 제1채널과 제2채널 및 제3채널이 서로 연결되는 부분에서 형성되고,
    상기 제2와류는 상기 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 형성되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 제2와류는 상기 제2채널 및 제3채널 중 적어도 어느 하나에서 형성되고,
    상기 제2와류는 상기 제1채널의 중심부에서 상기 제2채널 또는 제3채널의 길이 방향으로 20μm 내지 200μm 이격된 부분에서 형성되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나는 상기 유체의 압력 변화에 의하여 형성되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 제1와류 또는 제2와류는 상기 유체의 레이놀즈 수가 클수록 강하게 형성되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 제2와류에 의하여 상기 세포의 흐름이 정체되는 시간은 0.1 μs 내지 100 μs인,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  21. 제16항에 있어서,
    상기 충돌, 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나는 상기 세포의 세포막 및 핵막 중 적어도 하나에 일시적인 천공을 형성하고, 상기 천공을 통해 상기 전달물질이 상기 세포 내로 유입되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  22. 제16항에 있어서,
    상기 충돌, 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나에 의하여 상기 세포의 세포막 및 핵막 중 적어도 하나에 천공이 형성되고, 상기 천공은 상기 세포막 또는 핵막의 동일 부위 또는 다른 부위에 형성되고,
    첫 번째로 형성되는 천공이 유지되거나 회복된 후 다음 천공이 형성되고,
    첫 번째로 형성되는 천공은 그 다음 천공에 의하여 더 크게 확장되거나 크기가 유지되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 제1채널의 말단에서 상기 제2채널 및 제3채널이 각각 연결되어 상기 제1채널 중에 흐르는 유체를 분기시키고,
    상기 제2채널 및 제3채널 사이에서 돌출홈이 형성되고,
    상기 돌출홈은 상기 제1채널에 대응하는 위치에서 유체가 흐르는 방향으로 돌출되어 형성되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 돌출홈은 세로 단면이 사각형, 삼각형 및 원통형 중 적어도 어느 하나로 형성되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 돌출홈의 도입부는 1μm 내지 20μm이고,
    상기 돌출홈의 깊이는 3μm 내지 100μm인,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 와류 영역에서 제1와류 및 제2와류 중 적어도 어느 하나가 형성되고,
    상기 제1와류는 상기 제1채널을 통과한 상기 유체가 상기 돌출홈의 도입부, 돌출홈의 내부 및 돌출홈 주변의 격벽 중 적어도 어느 하나에 충돌한 후 국소적인 압력의 역전에 의해 형성되고,
    상기 제2와류는 상기 제2채널 및 제3채널 각각에서 국소적인 압력의 역전에 의해 형성되는,
    세포 내 물질 전달 플랫폼.
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