WO2022210802A1 - 筋萎縮症治療剤 - Google Patents

筋萎縮症治療剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2022210802A1
WO2022210802A1 PCT/JP2022/015725 JP2022015725W WO2022210802A1 WO 2022210802 A1 WO2022210802 A1 WO 2022210802A1 JP 2022015725 W JP2022015725 W JP 2022015725W WO 2022210802 A1 WO2022210802 A1 WO 2022210802A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dll4
muscle
muscular atrophy
atrophy
notch2
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/015725
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
悠介 小野
慎 藤巻
Original Assignee
国立大学法人熊本大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人熊本大学 filed Critical 国立大学法人熊本大学
Priority to JP2023511438A priority Critical patent/JPWO2022210802A1/ja
Publication of WO2022210802A1 publication Critical patent/WO2022210802A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • Non-Patent Document 4 There are five known Notch ligands in mammals: Jagged1 (Jag1), Jagged2 (Jag2), Delta-like ligand-1 (Dll1), Delta-like ligand-3 (Dll3), and Delta-like ligand-4 (Dll4). It is known to do (Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5). Among them, Dll1 and Dll4 have similar structures, but have been reported to have different functions (Non-Patent Document 6).
  • the object of the present invention is to provide a new therapeutic agent for muscular atrophy.
  • Prophylactic or therapeutic agents [6] The preventive or therapeutic agent for muscular atrophy according to [1] or [2] above, wherein the Dll4 function inhibitor is a Dll4 expression inhibitor. [7] The prophylactic or therapeutic agent for muscular atrophy according to [6] above, wherein the Dll4 expression inhibitor is siRNA or shRNA that induces RNA interference with Dll4 mRNA. [8] The preventive or therapeutic agent for muscular atrophy according to the above [1] or [2], wherein the Dll4 function inhibitor is a collagen binding inhibitor to Dll4.
  • a Outline of study administering soluble Dll4-Fc recombinant protein to wild-type mouse DB model.
  • a shows an overview of a study in which a neutralizing antibody is administered to a wild-type mouse STZ-induced severe hyperglycemia model.
  • the present invention is a prophylactic or therapeutic agent for muscular atrophy containing a Dll4 function inhibitor as an active ingredient.
  • Dll4 function inhibitor means a substance capable of suppressing muscle atrophy by inhibiting the function of Dll4 that causes muscle atrophy based on the Dll4-Notch2 signal axis.
  • Dll4 function inhibitor means a substance that inhibits the action of Dll4 that induces muscle atrophy via Notch2, but is not limited thereto.
  • Dll4 expression inhibitors Substances that inhibit Dll4 expression (hereinafter referred to as "Dll4 expression inhibitors”, “Dll4 expression inhibitors”, or simply “expression inhibitors” or “expression inhibitors” when clear from the context) , by inhibiting the expression of Dll4, the expression of Dll4, for example, the expression of Dll4 in endothelial cells and the expression of Dll4 in extracellular vesicles, is reduced, suppressing the activation of Notch2 by Dll4, and the muscle atrophy signal. Suppressing induction suppresses muscle atrophy.
  • Dll4 expression in endothelial cells more preferably Dll4 expression in vascular endothelial cells is decreased.
  • Expression inhibitors can include, for example, nucleic acid molecules that specifically inhibit expression of Dll4.
  • Nucleic acid molecules that specifically inhibit expression of Dll4 are typically non-naturally occurring nucleic acids, such as RNAi, antisense nucleic acids, or ribozymes that specifically inhibit expression of Dll4.
  • RNAi is meant any RNA capable of down-regulating the expression of a targeted Dll4 and includes siRNA, dsRNA, ssRNA and shRNA molecules.
  • the Dll4 expression inhibitor is siRNA or shRNA.
  • siRNAs or shRNAs are usually designed against a region 19-50 nucleotides downstream of the translation initiation codon.
  • the RNAi molecule is an siRNA consisting of at least about 10-40 nucleotides, preferably about 15-30 nucleotides in length.
  • siRNAs or shRNAs can include naturally occurring RNAs, synthetic RNAs, or recombinantly produced RNAs, as well as modified RNAs that differ from naturally occurring RNAs by the addition, deletion, substitution, and/or alteration of one or more nucleotides. Such modifications include modifications that render the siRNA resistant to nuclease digestion, and can include addition of non-nucleotide material, such as, for example, to the ends of the molecule or to one or more internal nucleotides of the siRNA.
  • the nucleic acid that is the expression inhibitor of the present invention has the ability to specifically hybridize to a Dll4-encoding gene or transcript.
  • Nucleic acids as expression inhibitors do not require 100% complementarity with the target sequence Dll4 sequence to specifically hybridize, but preferably have at least equal to about 90% complementarity. . More preferably, the complementarity between the nucleic acid as an expression inhibitor in the present invention and the target sequence (Dll4 target sequence) is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%. be.
  • a substance that inhibits collagen binding to Dll4 (hereinafter referred to as "Dll4 binding inhibitor to collagen”, “Dll4 binding inhibitor to collagen”, or simply “binding inhibitor” or “ binding inhibitor”) inhibits the binding of Dll4 secreted from vascular endothelial cells to collagen, inhibits the binding of Dll4 to Notch2, suppresses the activation of Notch2, and suppresses the activation of muscle atrophy signals. Suppressing induction suppresses muscle atrophy. As a result, it can be used as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for muscle atrophy.
  • Binding inhibitors include, but are not limited to, substances that bind to Dll4 and inhibit physical binding of Dll4 to collagen.
  • Dll4 function inhibitors include substances that inhibit cleavage of the intracellular domain of Notch2 (activation of Notch2) even when Dll4 binds to the extracellular domain of Notch2. can.
  • inhibitors include, but are not limited to, inhibitors of the metalloproteases and secretases associated with Notch2 cleavage.
  • a composition containing the Dll4 function inhibitor of the present invention as an active ingredient is used for the prevention or treatment of diseases associated with muscle atrophy.
  • the composition of the present invention is further used to improve muscle atrophy, thereby improving muscle mass loss or muscle weakness.
  • Muscle atrophy refers to the loss of muscle mass, resulting in a decrease in muscle mass.
  • the “muscular atrophy” targeted by the prophylactic or therapeutic agent of the present invention includes both neurogenic and myogenic muscular atrophic diseases.
  • Neurogenic muscular atrophic diseases include, for example, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), myasthenia gravis, progressive muscular atrophy, spinal muscular atrophy, spinobulbar muscular atrophy, Guillain-Barré syndrome, and muscle atrophy due to physical spinal cord injury.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • myasthenia gravis progressive muscular atrophy
  • spinal muscular atrophy spinal muscular atrophy
  • spinobulbar muscular atrophy Guillain-Barré syndrome
  • muscle atrophy due to physical spinal cord injury due to physical spinal cord injury.
  • Myogenic muscular atrophic diseases include, for example, age-related muscular atrophy (sarcopenia), disuse muscular atrophy, muscular dystrophy (e.g., Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy, distal muscular dystrophy, congenital muscular dystrophy, Emery Dreyfuss muscular dystrophy, facioscapulohumeral muscular dystrophy, myotonic muscular dystrophy type 1 or myotonic muscular dystrophy type 2, limb girdle muscular dystrophy), diabetic muscular atrophy, congenital myopathy, distal myopathy, steroid myopathy , drug-induced myopathy, rhabdomyolysis, spinal muscular atrophy, progressive spinobulbar muscular atrophy, muscle wasting diseases (e.g., age-related sarcopenia, cachexia), Charco-Marie-Tooth disease, Examples include Lambert-Eaton syndrome, muscle atrophy induced by cachexia (eg, cancer cachexia, myocardial infarction, renal failure, COPD,
  • the preventive or therapeutic agent for muscular atrophy of the present invention contains a therapeutically effective amount of a Dll4 function inhibitor.
  • a "therapeutically effective amount” refers to an amount sufficient to produce a therapeutic effect when administered to a mammal in need of treatment. A therapeutically effective amount will vary depending on the subject and the disease symptom to be treated, the subject's weight and age, the severity of the disease symptom, the mode of administration, etc., and can be readily determined by those skilled in the art.
  • Dll4 function inhibitors are small or medium molecules.
  • the Dll4 function inhibitor is an antibody or antigen-binding fragment thereof, which is used in substantially purified form.
  • the subject to whom the prophylactic or therapeutic agent of the present invention is administered is a mammal, preferably a human.
  • the subject is a human suffering from muscular atrophy.
  • the compositions of the present invention can be administered to subjects suffering from mild or moderate muscular atrophy prophylactically to prevent the progression of muscular atrophy.
  • the compositions of the invention may be administered primarily for therapeutic purposes to subjects suffering from moderate or severe muscular atrophy.
  • composition of the present invention contains a DDL4 function inhibitor in a therapeutically effective amount, and further contains a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier means a carrier approved for use by a regulatory agency or listed in a generally accepted pharmacopoeia for use in animals, particularly humans. and any and all solvents, dispersion media, coating agents, antioxidants, chelating agents, preservatives (e.g., antibacterial agents, antifungal agents), surfactants, as known to those skilled in the art.
  • compositions of the invention can be used in the compositions of the invention.
  • the composition of the present invention can be appropriately formulated into a desired dosage form according to an administration method such as oral administration or parenteral administration.
  • the dosage form is not particularly limited, but in the case of oral administration, for example, solid preparations such as powders, granules, tablets, troches, and capsules; liquid preparations such as solutions, syrups, suspensions, emulsions, etc. can be
  • parenteral administration it can be formulated into, for example, suppositories, sprays, inhalants, ointments, patches, injections (including infusions), and the like.
  • the composition of the present invention may be a freeze-dried preparation that is dissolved by adding sterilized water or the like at the time of use.
  • formulation can be suitably implemented by a well-known method according to a dosage form.
  • the dosage of the DDL4 function inhibitor, which is the active ingredient of the present invention is appropriately selected according to the type of the DDL4 function inhibitor.
  • the dosage of the DDL4 function inhibitor, which is the active ingredient of the present invention is appropriately selected depending on the symptoms, age, condition, route of administration, and the like of the subject to be administered.
  • the composition of the present invention can be administered orally or parenterally as a medicament, preferably orally.
  • solid formulations such as tablets, powders, capsules, and granules can be used, and these contain conventional excipients, binders, diluents, lubricants, and other additives. It's okay. They can also be administered as vehicles such as aqueous or oily suspensions, solutions, syrups and elixirs. In the case of parenteral administration, it can be used as an injection or the like.
  • the dosage varies depending on the patient's age, body weight and condition, type and degree of disease, administration method, etc., and cannot be categorically defined, but is usually about 0.1 to about 500 mg/kg per day for an adult.
  • the lower limit is usually about 0.01 mg per kg body weight, although not limited thereto. preferably about 0.05 mg, more preferably about 0.1 mg, while an upper limit of about 100 mg, preferably about 50 mg, more preferably about 20 mg, more preferably about 10 mg is administered in a single dose. .
  • an antigen-binding fragment of the antibody of the present invention it is usual to administer a dose higher than the above dose, for example, but not limited to, about 1.5-fold to about 50-fold, preferably about 1-fold.
  • antibodies, etc. are administered as a starting dose of at least about 1 mg to about 1000 mg.
  • the starting dose is followed by a second or multiple subsequent doses of an antibody or antigen-binding fragment thereof in an amount that is about the same as or less than that of the starting dose, wherein at least 2 weeks; at least 3 weeks; at least 4 weeks; at least 5 weeks; at least 6 weeks; separated by at least 12 weeks.
  • composition of the present invention is prepared in dosage forms prepared in unit doses to suit the intended dosage of the active ingredient.
  • dosage forms containing unit doses include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, and the like.
  • the amount of antibody to be included is generally preferably from about 5 to about 1000 mg of antibody or the like per dosage form in a unit dose.
  • Administration and treatment plans are determined by the physician who diagnosed the subject (patient), taking into consideration the symptoms, age, condition, route of administration, etc. of the subject. You can refer to the presented guidelines and decide.
  • the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention can be arbitrarily determined in consideration of the symptoms, condition and other conditions of the subject.
  • Routes of administration include, but are not limited to, intradermal, transdermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural and oral routes.
  • the pharmaceutical compositions are administered by any convenient route, such as by infusion or bolus injection, or by absorption through epithelial or mucocutaneous linings (eg, oral mucosa, rectal, and intestinal mucosa, etc.), and others. may be administered with a biologically active agent of Administration can be systemic or local.
  • compositions of the present invention can be delivered in a controlled release system. Controlled-release systems place the composition near the target, thus requiring only a small systemic dose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is an injection, it can be prepared as a ready-to-use injection or as a prefilled syringe.
  • the pharmaceutical compositions of this invention are administered subcutaneously or intravenously with standard needles and syringes.
  • a pen delivery device can also be used for subcutaneous administration. Pen delivery devices are either reusable or disposable.
  • a nucleic acid such as siRNA When a nucleic acid such as siRNA is used as a DDL4 function inhibitor in the composition of the present invention, it may be a single siRNA or a mixture of multiple siRNAs (so-called cocktail).
  • the siRNA can be directly injected into the affected area, or a vector capable of expressing the siRNA can be used.
  • siRNAs directly into the affected area they can be injected complexed with liposomes such as Lipofectamine, Lipofectin, Cellfectin and other positively charged liposomes.
  • an expression vector containing a DNA sequence encoding RNA containing an siRNA sense strand sequence and its complementary antisense strand sequence under the control of a promoter is used. It is preferably used.
  • a viral vector may be used to deliver siRNA to the affected area.
  • Viral vectors that can be used are not particularly limited, and examples thereof include adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, lentiviral vectors, retroviral vectors (such as leukemia virus vectors), and herpes virus vectors.
  • Viral vectors are preferably of the type lacking self-replication ability, for example, so as not to cause disease when used in humans.
  • self-replication-deficient adenoviral vectors lacking E1 and E3 genes can be used.
  • Viral vectors can be constructed according to known methods.
  • an adeno-associated virus vector that has delivery selectivity to skeletal muscle is particularly preferably used.
  • adeno-associated virus vectors types I to XI have been known so far, and these can be used without restriction, but vectors developed in the future can also be used without restriction as long as the object of the present invention is achieved.
  • Preferred vectors are, but are not limited to, AAV1, AAV2, AAV4, AAV6, AAV7, AAV8, or AAV9.
  • Various adeno-associated virus vectors that are suitably used are commercially available.
  • a vector carrying siRNA or shRNA is administered to a patient together with a pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline, buffer solution, and the like.
  • Pharmaceutical compositions may further contain stabilizers, preservatives, tonicity agents, and the like.
  • the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and can be either local or non-local administration, preferably local administration.
  • the vector can be administered directly by means of a syringe or the like.
  • Non-local administration can be carried out, for example, by intravenous administration.
  • a viral vector or a plasmid-liposome complex is suspended in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • mice All animal experimental procedures were approved by the Institutional Animal Care and Usage Committee (IACUC) of Kumamoto University. Animals were housed in a pathogen-free, temperature- and humidity-controlled environment. They were housed under a 12 hour light cycle with free access to food and water. Mice used in the Examples were commercially available mice, and if necessary, mice with specific gene phenotypes were bred to produce mice with desired gene phenotypes.
  • IACUC Institutional Animal Care and Usage Committee
  • STZ-Induced Diabetes Model Mice were injected intraperitoneally with a single dose of STZ (150 mg/kg body weight), which is toxic to insulin-producing pancreatic ⁇ -cells, or treated with an equal volume of vehicle (0.5 mg/kg body weight) as a control. 1M citrate buffer, pH 4.5) was injected. Mice were monitored for hyperglycemia on day 3 using Accu-chek (Roche), and only mice that achieved random blood glucose levels >300 mg/dl were used in the experiment. Mice were sacrificed 14 days after STZ injection. For survival experiments, wild-type mice were given a single intraperitoneal injection of a high dose of STZ (250 mg/kg), which induces severe diabetes.
  • STZ 150 mg/kg body weight
  • vehicle 0.5 mg/kg body weight
  • mice Tenotomy was performed on both legs of mice to induce muscle hypertrophy. In anesthetized mice, an incision was made along the midline of the calf after hair removal. After excision of the tendons belonging to SOL and GAS, the skin was closed using 3 or 4 sutures. 14 days after overload, mice were sacrificed and PLA muscles were harvested.
  • ECs were transfected with 20 nM Dll4-siRNA (SASI_Mm01_00092621, MilliporeSigma) or control-siRNA (MilliporeSigma) using Lipofectamine RNAiMAX.
  • RNA extraction and quantitative reverse transcription PCR Total RNA was extracted from muscle tissue, isolated myofibers, cultured cells, and freshly sorted cells using ISOGEN II and RNeasy Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. cDNA was prepared using the ReverTra Ace kit with genomic DNA remover (TOYOBO). Quantitative PCR (qPCR) was performed using THUNDERBIRD SYBR qPCR mix (TOYOBO) and a real-time PCR detection system (CFX96; Bio Rad).
  • TATA box binding protein Tbp
  • Notch1, Notch2, Rbpj Hes1, Dll1, Dll4, Jag1, Jag2, Ccng2, Cdkn1b, Rbl2, Bnip3, MuRF1, Atrogin1.
  • Fbxo31 Fbxo31, and MUSA1.
  • mice were fixed by perfusion through the ascending aorta with 2% PFA and 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer.
  • GAS muscles were trimmed into cubes (1 mm 3 ) and post-fixed in 0.1 M phosphate buffer containing 1% OsO 4 for 1 h on ice before embedding in epoxy resin and 1.5% acetic acid. They were block-stained with uranium, dehydrated in ethanol, infiltrated with propylene oxide, and embedded in araldite. Ultrathin sections (60-70 nm thick) were cut using an ultramicrotome and stained with 1.5% uranium acetate and lead citrate. Images were taken using a TEM (Hitachi H7700).
  • mice were fixed by perfusion through the ascending aorta with 4% PFA and 0.1% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer.
  • Serial 70 ⁇ m-thick sections were cut from GAS muscle using a vibrating microtome (Dosaka TTK-3000) and observed with correlated CSLM-EM. Specifically, sections were subjected to rapid freezing and thawing in liquid nitrogen vapor followed by anti-Dll4 antibody (1:200), anti-dystrophin antibody (1:300), anti-CD31 antibody (1:250) for 7 at 4°C.
  • HRP horseradish peroxidase
  • HSA rtTA ;TR Cre and Rosa26 LSL-N2ICD (N2ICD-mTg) mice were generated.
  • N2ICD intracellular domain of Notch2
  • Dox doxycycline
  • Tg and control mice were administered Dox (2 mg/ml in drinking water) for 3 weeks before Notch2 expression, body weight and muscle mass were measured.
  • N2ICD-mTg mice showed no difference in body weight, but a significant decrease in muscle mass compared to controls. The results are shown in FIG. This suggested that forced expression of N2ICD induces muscle atrophy.
  • Example 2 Test using muscle atrophy mouse model
  • Mlc1f Cre Mlc Cre/+ ; N2 f/f , N2 ⁇ / ⁇ .
  • Myosin light chain 1f promoter-driven Cre recombinase-expressing mice were crossed with Notch2 f/f (N2 f/f ) mice to develop muscle fiber-specific Notch2 deficiency (N2 ⁇ / ⁇ ) mice. ) mice were generated.
  • Notch2-deficient mice (N2 -/- ) had decreased Notch2 expression, whereas Notch2-deficient mice grew normally and showed no changes in body weight, muscle mass, or extensor digitorum longus (EDL) muscle fibers. showed no abnormal phenotypes in terms of myonuclei or Pax7 + satellite cell numbers per cell.
  • DB Diabetes
  • STZ streptozotocin
  • Mice were injected intraperitoneally with STZ (150 mg/kg body weight) or vehicle (Veh) and analyzed 14 days later.
  • N2 f/f and N2 ⁇ / ⁇ mice exhibited comparable hyperglycemia after STZ injection, and Notch2 gene expression was upregulated in EDL myofibers of DB and HU mice.
  • Notch2 is required for the loss of muscle mass and function due to mechanical unloading or dysmetabolic induction.
  • Example 5 Genetic analysis in muscle under HU and DB conditions Transcriptomes by RNA sequencing for N2 f/f and N2 ⁇ / ⁇ DB mice under both HU ⁇ and DB ⁇ conditions I did the analysis. As a result, the expression of many genes was significantly changed in the muscles of N2 f/f DB mice, but few of them were statistically significantly changed in N2 ⁇ / ⁇ DB mice. This indicates that Notch2 primarily regulates gene expression dynamics in muscle induced by mechanical unloading and metabolic abnormalities. Under both HU and DB conditions, only eight genes were commonly identified as differentially expressed genes (DEGs) compared to each control.
  • DEGs differentially expressed genes
  • Example 7 Examination of the induction of muscle atrophy via cell-cell contact
  • HEK293 cells were transfected with Dll1 or Dll4 expression plasmid vectors. Either was transfected and co-cultured with isolated myofibers for 48 hours to confirm expression in myofibers.
  • FIG. 12 shows the results of co-culturing EDL myofibers with HEK293 cells transfected with plasmids encoding Dll1-GFP, Dll4-GFP, or GFP (Cont.), respectively. Co-culture with Dll1-expressing HEK293 cells had no change.
  • Example 7 Investigation of ⁇ -secretase inhibitor against Dll4-induced muscle atrophy Notch, which is a transmembrane receptor, has its transmembrane domain cleaved by ⁇ -secretase, and its intracellular region translocates to the nucleus and functions as a transcription factor. . Therefore, DAPT, a ⁇ -secretase inhibitor, was used to confirm the effect of ⁇ -secretase activity on Dll4-induced muscle fiber atrophy. EDL myofibers from N2 f/f mice were cultured on plates pre-coated with recombinant Dll4 protein for 48 hours using media containing the ⁇ -secretase inhibitor DAPT (10 ⁇ M) or PBS.
  • DAPT a ⁇ -secretase inhibitor
  • ⁇ -secretase inhibitors were then tested in wild-type mice with the ⁇ -secretase inhibitor DAPT (10 mg). /kg body weight) or corn oil (Cont) were injected intraperitoneally every other day during the HU period or during the DB induction period and confirmed.
  • FIG. 14 shows the results using the mechanical unloading muscle atrophy (HU) model
  • FIG. 15 shows the results using the metabolic disorder (diabetes)-induced muscle atrophy (DB) model.
  • Treatment with DAPT was found to lead to significant suppression of muscle atrophy in both HU and DB models.
  • Example 8 Identification of the origin of Dll4
  • Dll4 ligand expression was measured in adult muscle tissue-derived CD31 + endothelial cells (endothelial cell marker CD31-positive ECs) and compared to freshly isolated myofibers. . The results are shown in the left diagram of FIG. As a result, the Dll4 gene was highly expressed about 400-fold in CD31 + EC.
  • Notch ligand Dll1, Dll4, Jag1, and Jag2 expression in CD31 + endothelial cells from GAS muscle under both HU and DB conditions using wild-type mice.
  • Dll4 was found to be upregulated in both HU and DB conditions, but the other ligands were not. Immunohistochemical analysis also confirmed upregulation of Dll4. The results are shown in FIG. In addition, immunoelectron microscopic analysis was performed. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 18A, Dll4 was found to be distributed not only on the surface of ECs but also on collagen-like fibers in the interstitial space between ECs and muscle fibers of diabetic muscle tissue. Furthermore, as shown in Figures 18B and C, Dll4 was also enriched on the surface of myofibers. These results suggest that in muscle tissue under DB conditions, ECs upregulate and secrete Dll4 into the interstitial space, and the secreted Dll4 selectively activates Notch2 receptors expressed on the surface of muscle fibers. It was shown that
  • Dll4 in EC was confirmed by immunoblot analysis. EC isolated from muscle tissue were subjected to low glucose conditions (5 mM) similar to healthy blood levels (90 mg/dl) and high glucose mimicking levels of diabetic hyperglycemia in blood (450 mg/dl). Culturing under these conditions (25 mM) and measuring Dll4 in the supernatant showed higher expression levels under high glucose conditions (25 mM) than under low glucose conditions (5 mM).
  • Example 9 Examination of Inhibition of Expression of Dll4 The function of Dll4 secreted from ECs in muscle fiber atrophy was evaluated as follows. A co-culture system of primary ECs isolated from myofibers and myofibers was prepared using Transwell, as shown in FIG. 19A. EC-derived secretions pass through the upper chamber to reach muscle fibers laid on the bottom surface. Primary ECs were transfected with control siRNA (siCont) or siRNA against Dll4 (siDll4) one day before co-culture with myofibers and co-culture was performed. Expression of Dll4 in EC transfected with siCont or siDll4 is shown in FIG. 19B.
  • siCont siRNA against Dll4
  • Example 10 Examination of Dll4 Inhibition Using the same co-culture system as in Example 9, the effect of the anti-Dll4 neutralizing antibody was confirmed. The results are shown in FIG. Treatment with anti-Dll4 neutralizing antibody ( ⁇ Dll4) (500 ng/ml) completely inhibited muscle fiber atrophy in the co-culture system.
  • ⁇ Dll4 neutralizing antibody 500 ng/ml
  • Example 11 Suppression of muscle atrophy using anti-Dll4 antibody (HU model) Using a neutralizing antibody against Dll4 protein, the effect of suppressing muscle atrophy was examined as follows. Muscle atrophy was induced in wild-type mice under HU conditions. Mice were injected intraperitoneally twice with anti-Dll4 antibody ( ⁇ Dll4) (10 mg/kg body weight) or control antibody ( ⁇ Cont) during the 7-day period of HU (days 0 and 4). Seven days after the first dose of antibody, mice were euthanized and analyzed. The results are shown in Figures 21 and 22.
  • Example 12 Suppression of muscle atrophy using anti-Dll4 antibody (DB model) Using a wild-type mouse DB-induced muscle atrophy model, the inhibitory effect of a neutralizing antibody against Dll4 protein on muscle atrophy was examined. After injection of STZ (150 mg/kg body weight; DB) or vehicle (veh; citrate buffer) into mice, ⁇ Dll4 (10 mg/kg body weight) or control antibody ( ⁇ Cont) was administered intraperitoneally three times over 2 weeks. (Days 3, 7, and 11 after STZ administration). Analysis was performed 14 days after STZ administration. The results are shown in FIGS. 23 and 24. FIG. Administration of ⁇ Dll4 showed a strong protective effect against DB-induced muscle atrophy without affecting blood glucose levels. As shown in Figure 24d, the thickness of individual myofibers was greater in ⁇ Dll4 DB.
  • Example 13 Inhibition of Muscle Atrophy Using Soluble Recombinant Anti-Dll4 Proteins Using a wild-type mouse DB-induced muscle atrophy model, soluble recombinant Dll4-Fc proteins that prevent binding of endogenous Dll4 to Notch receptors were tested. The inhibitory effect on muscle atrophy was investigated. After intraperitoneal injection of STZ (150 mg/kg body weight; DB) or vehicle (Veh; citrate buffer) to wild-type mice, soluble Dll4-Fc recombinant protein (rDll4-Fc) (0.5 mg/kg ) was administered four times (days 7, 9, 11, and 13) over a period of 14 days. Analysis was performed 14 days after administration of STZ. PBS was used as a control. The results are shown in FIG. Administration of soluble recombinant Dll4-Fc protein was confirmed to attenuate DB-induced muscle atrophy without affecting blood glucose levels.
  • STZ 150 mg/kg body weight
  • vehicle Vehicle
  • ⁇ Dll4 and ⁇ Con groups exhibited severe hyperglycemia (blood glucose ⁇ 600 mg/dl) after STZ infusion. Death or euthanasia were shown as Kaplan-Meier plots over time. While ⁇ Con-treated mice had a short lifespan (approximately 58 days), ⁇ Dll4-treated mice had a significantly higher survival rate (70% survival rate) and increased muscle strength. This result indicates that attenuation of ⁇ Dll4 activity exerts a protective effect against systemic homeostasis disruption from hyperglycemia.
  • Example 15 Effect of Dll4 Inhibition on Muscle Hypertrophy It was examined whether attenuating the Dll4-Notch2 signal axis promotes muscle hypertrophy due to mechanical overload. Using wild-type mice, muscle hypertrophy was induced by mechanical overloading (OL). PLA muscle hypertrophy was induced by synergistic ablation (tenotomy) of the SOL and GAS muscles of both legs. As a control, synergistic muscle non-absected mice were used. After tenotomy, ⁇ Dll4 (10 mg/kg body weight) or ⁇ Cont was administered intraperitoneally twice over 2 weeks (days 5 and 10 after resection) and analyzed on day 14. The results are shown in FIG.
  • Hypertrophic efficiency as measured by muscle mass and cross-sectional area of PLA muscle, was significantly higher in ⁇ Dll4-treated mice compared to ⁇ Con-treated mice.
  • the thickness of individual muscle fibers was greater in ⁇ Dll4 OL.
  • Example 16 Confirmation of intramuscular Dll4 distribution The intramuscular Dll4 distribution was confirmed by immunoelectron microscopic analysis. Using the STZ-induced DB mouse model, 60-micrometer-thick vibratome sections were made from harvested GAS muscle. Sections were processed overnight for immunohistochemical staining using a primary antibody against Dll4 (1:50) and then incubated overnight with 10 nm-nanogold goat anti-mouse IgG (1:50, CRL). Sections were then post-fixed with 1% OsO 4 aqueous solution, bulk stained with 1.5% uranyl acetate, dehydrated and flat-embedded in epoxy resin.
  • the present invention provides a preventive or therapeutic agent for muscular atrophy based on a new mechanism of action.
  • the composition of the present invention is useful for preventing, treating or improving muscle atrophy or muscle mass loss.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本発明の目的は、新たな筋萎縮症の予防または治療剤を提供することである。本発明により、Ｄｌｌ４機能阻害剤を有効成分として含有する筋萎縮症の予防または治療剤が提供される。Ｄｌｌ４機能阻害剤は、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２間の結合阻害剤、Ｄｌｌ４の発現阻害剤、または、ＬＬ４に対するコラーゲンの結合阻害剤からなる群より選択される。

Description

筋萎縮症治療剤
　本発明は、筋萎縮症治療剤に関する。本発明はより具体的には、Ｄｌｌ４の機能阻害剤を有効成分として含有する新規な筋萎縮治療剤に関する
　筋萎縮とは、筋原線維の減少による筋線維の萎縮であり、運動障害や移動障害などの病的な筋力低下を生じる。筋萎縮を伴う疾患は、その原因から、運動神経の障害に基づく筋萎縮性疾患（神経原性筋萎縮性疾患）と、筋組織自体の障害に基づく筋萎縮性疾患（筋原性筋萎縮性疾患）の２つに大別できる。
　神経原性筋萎縮性疾患として代表的なものに、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、ギラン・バレー症候群等がある。これらの疾患に対する有効な治療法や治療薬が存在しないのが現状であり、有効な治療剤が切望されている。
　また、筋原性筋萎縮性疾患としては、筋ジストロフィーや先天性ミオパチー、遠位性ミオパチー等の遺伝性筋疾患に加えて、加齢性筋萎縮症（サルコペニア）や、病気や寝たきり等の活動低下に起因する廃用性筋萎縮症などといった非遺伝性の筋疾患が存在する。特に、加齢性筋萎縮症や廃用性筋萎縮症は、社会の高齢化に伴い増加の一途をたどっている。これらのさまざまな筋萎縮症に対する有効な予防薬や治療薬は存在しないのが現状であり、有効な予防・治療薬の開発が急務となっている。
　成人の骨格筋は非常に可塑性の高い組織であり、機械的および代謝的刺激に反応してその質量を容易に減少または増加させる。骨格筋のサイズをコントロールする分子として細胞膜貫通タンパク質であるＮｏｔｃｈが着目されている。Ｎｏｔｃｈは、１－４のファミリーで構成され、骨格筋ではサテライト細胞（筋衛星細胞）を含む組織幹細胞において増殖や分化などの運命決定を制御することで知られる。
　本発明者らは、サテライト細胞を特異的に死滅させたマウスの骨格筋と正常マウスの骨格筋のＮｏｔｃｈ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現量を比較し、サテライト細胞のみならず筋線維にもＮｏｔｃｈ２が発現することを見出した。骨格筋線維特異的に活性型Ｎｏｔｃｈ２を恒常的に発現させたトランスジェニックマウス（Ｎ２ＩＣＤ－Ｔｇマウス）を作成し、その表現型解析を行い、Ｎ２ＩＣＤ－Ｔｇマウスでは、速筋において筋萎縮が認められたが、一方、筋線維の細胞核数はＮ２ＩＣＤ－Ｔｇマウスとコントロールマウスとで有意な差はなかったこと、そして、筋線維のＮｏｔｃｈ２シグナルの恒常的な活性化は筋肉量の維持に負の作用をもたらすことを報告している（非特許文献１）。
　本発明者らは、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２は、骨格筋の幹細胞であるサテライト細胞の休止期・未分化維持に必須であることを報告している（非特許文献２）。また、本発明者らは、筋線維特異的にＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２の両者を欠損した（Mlc1fCre/+:Notch1f/f:Notch2f/f）マウスを作出し、尾部懸垂や糖尿病による筋萎縮を誘導したところ、野生型マウスでは筋重量および筋線維横断面積（ＣＳＡ）が顕著に減少する一方で、Ｎｏｔｃｈ１／Ｎｏｔｃｈ２欠損マウスでは筋萎縮抵抗性が観察されたことを報告している（非特許文献３）。
　哺乳類には、Ｊａｇｇｅｄ１（Ｊａｇ１）、Ｊａｇｇｅｄ２（Ｊａｇ２）、Ｄｅｌｔａ様リガンド－１（Ｄｌｌ１）、Ｄｅｌｔａ様リガンド－３（Ｄｌｌ３）、Ｄｅｌｔａ様リガンド－４（Ｄｌｌ４）の５種類の既知のＮｏｔｃｈリガンドが存在することが知られている（非特許文献４、非特許文献５）。このうち、Ｄｌｌ１とＤｌｌ４は同じような構造を持っているが、機能が異なることが報告されている（非特許文献６）。
　Ｄｌｌ４は、分化した筋管における発現が報告されている（非特許文献７）。また最近、Ｄｌｌ４は、筋組織の微小血管内皮細胞（ＥＣ）や、網膜などの他の組織にも発現していることが報告されている（非特許文献８）、および非特許文献９）。
体力科学、６４巻（２０１５）１号、ｐ．１８ Fujimaki et al., Stem Cells 36, 278-285, 2018 体力科学、６９巻１号、（２０２０）ｐ．８８ Sjoqvist M.ら、Dev Biol 447, 58-70 (2019) Koovall R.ら、Dev Cell 41, 228-241 (2017) Preusse K.ら、PLos genetics 11, e1005328 (2015) Low S.ら、Stem Cells 36(3), 458-466 (2018) Verma M.ら、Cell Stem Cell 23(4), 530-543 e9 (2018) Miloudi K. ら、Proc Natl Acad Sci USA 116, 4538-4547 (2019) eLife 2018;7:e40045. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.40045 Glycobiology, 2020, 1-11 doi: 10.1093/glycob/cwaa113
　本発明の目的は、新たな筋萎縮症の治療剤を提供することである。
　本発明者らは、Delta-Like Protein 4（Ｄｌｌ４）が筋線維のＮｏｔｃｈ２を活性化させ、筋萎縮を誘導すること、そして、Ｄｌｌ４によるＮｏｔｃｈ２の活性化を抑制した結果、筋萎縮が抑制できることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は以下のものを含む。
［１］Ｄｌｌ４機能阻害剤（好ましくは、内皮細胞から分泌されるＤｌｌ４の機能阻害剤、より好ましくは血管の内皮細胞から分泌されるＤｌｌ４の機能阻害剤）を有効成分として含有する筋萎縮症の予防または治療剤。
［２］前記Ｄｌｌ４機能阻害剤が阻害するＤｌｌ４は、筋組織中に存在する血管の内皮細胞において発現されるＤｌｌ４である、上記［１］に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
［３］前記Ｄｌｌ４機能阻害剤は、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２間の結合阻害剤である、上記［１］または［２］に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
［４］前記結合阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ２に対するＤｌｌ４の結合を阻害する抗Ｄｌｌ４抗体である上記［３］に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
［５］前記抗Ｄｌｌ４抗体は、Ｄｌｌ４のアミノ酸配列情報（ＮＰ＿０６１９４７．１）に記載のアミノ酸配列から選ばれる５～１０個のアミノ酸を認識する抗体である上記［４］に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
［６］前記Ｄｌｌ４機能阻害剤は、Ｄｌｌ４の発現阻害剤である、上記［１］または［２］に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
［７］前記Ｄｌｌ４の発現阻害剤が、Ｄｌｌ４のｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を引き起こすｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、上記［６］に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
［８］前記Ｄｌｌ４機能阻害剤は、Ｄｌｌ４に対するコラーゲンの結合阻害剤である上記［１］または［２］に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
［９］前記筋萎縮症は、神経原性筋萎縮性疾患または筋原性筋萎縮性疾患である、上記［１］～［８］のいずれか一つに記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
［１０］前記筋萎縮症は、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、重症筋無力症、進行性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、ギラン・バレー症候群および物理的な脊髄損傷による筋萎縮からなる群より選ばれる、上記［９］に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
［１１］前記筋萎縮症は、加齢性筋萎縮症（サルコペニア）、廃用性筋萎縮症、筋ジストロフィー、糖尿病性筋萎縮症、先天性ミオパチー、遠位性ミオパチー、ステロイドミオパチー、薬剤性ミオパチー、横紋筋融解症、脊髄性筋萎縮症、進行性球脊髄性筋萎縮症、筋消耗性疾患、シャルコ・マリー・ツース病、ランバート・イートン症候群、悪液質（例えば、がん悪液質、心筋梗塞、腎不全、ＣＯＰＤ、敗血症、ＨＩＶ感染）により誘導される筋萎縮、および熱傷等にともなう筋萎縮からなる群より選ばれる、上記［９］に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
　本発明により、新たな作用機序に基づく筋萎縮症の予防または治療剤が提供される。
マウスのＥＤＬ筋から単離したサテライト細胞の培養条件を示した図である。 左図は、Ｎｏｔｃｈ２の遺伝子発現量を、中央図は体重を、右図は筋肉量を測定した結果である（ｎ＝３（Ｃｏｎｔ）、ｎ＝５（Ｎ２－ｍＴｇ））。データは平均値±ＳＥＭを表し、ポイントは個々のマウスを示す（特に断らない限り、以下の図面においても同様である）。＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．は有意差なし、を示す（特に断らない限り、以下の図面においても同様である）。 Notch2flox/flox(N2f/f)マウスおよびMlc1fCre/+;Notch2-/-(N2-/-)マウスのＥＤＬ筋から分離した個々の筋線維におけるＮｏｔｃｈ２遺伝子の発現をｑＰＣＲで解析した結果である（ｎ＝５）。 ａは、後肢免荷（ＨＵ）試験の概要を示している。ｂは、浅趾屈筋（Plantaris：ＰＬＡ）から単離した筋線維におけるＮｏｔｃｈ２発現（ｎ＝５）を解析した結果である。ｃは、N2f/fおよびN2-/-マウス（ｎ＝５）におけるヒラメ筋（Soleus：ＳＯＬ）、ＰＬＡ、腓腹筋（Gastrocnemius：ＧＡＳ）のＨＵ誘発性筋肉重量減少を確認した結果である。それぞれの左バーはN2f/fマウスの結果を、右バーはN2-/-マウス結果を示す。ｄは、ＨＵ後のＰＬＡ筋の組織断面上のラミニン免疫染色の代表的な画像である（スケールバー＝１００μｍ）。ｅは、ＰＬＡ筋の筋線維横断面積（ＣＳＡ）を示している（ｎ＝５）。 ａは、糖尿病誘発筋萎縮モデル試験の概要を示している。ｂは、ＳＴＺ注射１４日後の血糖値（ｎ＝５～８）を示している。ｃは、ＥＤＬから単離した筋線維におけるＮｏｔｃｈ２発現を確認した結果である（ｎ＝６）。ｄは、ＳＴＺ注射１４日後の前脛骨筋（Tibialis Anterior：ＴＡ）、ＰＬＡ、ＧＡＳにおける筋肉重量減少を確認した結果である（ｎ＝８）。それぞれの左バーはN2f/fマウスの結果を、右バーはN2-/-マウス結果を示す。ｅは、糖尿病誘発N2f/fおよびN2-/-マウスのＴＡ筋断面のラミニン免疫染色の代表的な画像である（スケールバー＝１００μｍ）。ｆは、ＴＡ筋線維の筋線維横断面積（ＣＳＡ）を示している（ｎ＝５）。 N2f/f;AkitaマウスまたはN2-/-;Akitaマウスの相対的筋肉重量減少を測定した結果である（ｎ＝３）。それぞれの左バーはN2f/fマウスの結果を、右バーはN2-/-マウス結果を示す。 ＤＢ条件下で、N2f/f AkitaマウスとN2-/- AkitaマウスのＴＡ筋においてテタヌス刺激により発生した筋力を測定した結果である（ｎ＝４）。代表的な強縮力記録（１００Ｈｚ）（左図）と定量化した最大筋力（右図）を示す。 ＤＢ条件下での縦ＧＡＳ筋切片の代表的な透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。右側の四角で囲まれた拡大画像は、それぞれＴ細管（上図）と筋節構造（下図）を表す。矢印は異常なミトコンドリア（スケール棒＝１μｍ）を示す。 上図は、N2f/f マウスとN2-/- マウスのＧＡＳ筋肉（倍率変化が＞２．０、ｑ＜０．０５、およびＴＰＭ＞５００の遺伝子数）において、ＨＵおよびＤＢ条件の両方に共通の有意にアップレギュレートされた遺伝子の数を示す。下図は、N2f/f マウスにおけるＨＵとＤＢ条件間の共通アップレギュレート遺伝子（３６１遺伝子）のＫＥＧＧ経路解析からの上位５経路を示している。 左図は、各タンパク質で刺激した筋線維の代表的な画像を示す（スケールバー＝５０μｍ）。右図は、筋線維直径の定量データである（１条件あたりｎ＝５マウス、個々のマウスについて＞１５筋線維を計測した）。 Ｄｌｌ４組換えタンパク質をコートしたプレートで２４時間培養後の遺伝子発現解析の結果を示す（ｎ＝５）。それぞれの左バーはＣｏｎｔの結果を、右バーはｒＤｌｌ４の結果を示す。 上図は、共培養条件の模式図である。下左図は、共培養後の代表的な画像である（スケールバー＝５０μｍ）。下右図は、筋線維直径の定量データである（１条件あたりｎ＝４マウス、個々のマウスについて＞１５筋線維を計測した）。 左図は、N2f/f マウスおよびN2-/- マウス由来のＥＤＬ筋線維を、組換えＤｌｌ４タンパク質を予めコーティングしたプレート上で培養した結果である。右図は、N2f/f マウス由来のＥＤＬ筋線維を、組換えＤｌｌ４タンパク質を予めコーティングしたプレート上でＤＡＰＴを添加して培養した結果である。上図は、筋線維の代表的な画像である（スケールバー＝５０μｍ）。下図は、筋線維直径の定量データである（１条件あたりｎ＝４マウス、個々のマウスについて＞１５筋線維を計測した）。それぞれの左側はＣｏｎｔの結果を、右側はｒＤｌｌ４の結果を示す。 左図は試験の概要を示す。右図は、ＳＯＬ、ＰＬＡ、およびＧＡＳの筋肉量を測定した結果である。それぞれの左バーはＣｏｎｔの結果を、右バーはＤＡＰＴの結果を示す。 左図は試験の概要を示す。中央図は血中グルコース濃度、右図はＳＯＬ、ＰＬＡおよびＧＡＳの筋肉量を測定した結果である。それぞれの左バーはＣｏｎｔの結果を、右バーはＤＡＰＴの結果を示す。 左図は、新鮮単離筋線維および筋肉組織由来のCD31+ 内皮細胞におけるＤｌｌ４の発現を示す（ｎ＝４）。右図は、ＨＵおよびＤＢ条件の野生型ＧＡＳ筋肉由来CD31+ 内皮細胞におけるＮｏｔｃｈリガンドの発現を示す（各条件ｎ＝４～６マウス）。 ＨＵおよびＤＢ条件下での野生型マウス由来のＴＡ筋縦断をＣＤ３１およびＤｌｌ４で免疫組織化学染色した代表的画像を示す（スケールバー＝２０μｍ）。 ＤＢマウスのＧＡＳ筋組織中のＥＣにおけるＤｌｌ４タンパク質分布を示す代表的な共焦点顕微鏡画像（Ａ）および免疫電子顕微鏡画像（Ｂ）である。共焦点顕微鏡画像（スケールバー＝２０μｍ）は、Ｄｌｌ4とＣＤ３１を可視化しており、それぞれが、Ｄｌｌ４＋ＣＤ３１＋ＥＣとＤｌｌ４－ＣＤ３１＋ＥＣに対応する（白矢印（ｐ）と矢頭（ｑ）は、それぞれＤｌｌ４陽性ＣＤ３１＋ＥＣ（図Ｂ）とＤｌｌ4陰性ＣＤ３１＋ＥＣ（図Ｃ）の免疫電子顕微鏡画像（スケールバー＝５μｍ）に対応する）。図Ｂは、免疫電子顕微鏡で可視化したＤｌｌ４タンパク質のＤＡＢ染色の画像であり（図Ｂ右図は、拡大画像である）、筋線維表面に蓄積したＤｌｌ４タンパク質（赤矢印）が示されている。拡大画像では、Ｄｌｌ４シグナルがコラーゲン様線維（緑の矢尻）中で検出された。図Ｃは、Ｄｌｌ4陰性ＥＣ（スケールバー＝５μｍ）のＤＡＢ染色画像である（陰性のコントロール）。 Ａは、本実施例で用いたトランスウェルカルチャーシステムの概念図である。Ｂは、ｓｉＣｏｎｔおよびｓｉＤｌｌ４でトランスフェクトしたＥＣにおけるＤｌｌ４発現を測定した結果である。Ｃは、筋線維の代表的な画像である（スケールバー＝５０μｍ）。Ｄは、筋線維直径の定量データである（１条件あたりｎ＝４マウス、個々のマウスについて＞２０筋線維を計測した）。 左図は、ＥＣをコントロール抗体（αＣｏｎｔ）および抗Ｄｌｌ４中和抗体と共培養した場合の筋線維の代表的な画像である（スケールバー＝５０μｍ）。右図は、筋線維直径の定量データである（１条件あたりｎ＝４マウス、個々のマウスについて＞１５筋線維を計測した）。 ａは、野生型マウスＨＵモデルに対して中和抗体を投与する試験の概要を示す。ｂは、抗体投与マウスの７日目におけるＥＤＬ筋線維あたりのサテライト細胞数を示す（ｎ＝４）。ｃは、ＳＯＬ、ＰＬＡ、ＧＡＳ筋の筋肉重量の減少を示す（ｎ＝７）。それぞれ左バーはαＣｏｎｔ、右バーはαＤｌｌ４を示す。 ｄは、ＰＬＡ筋断面のラミニン免疫組織化学染色の代表的画像を示す。ｅは、筋線維ＣＳＡの定量データを示す（ｎ＝６）。ｆは、ＧＡＳ筋肉におけるＦｏｘＯ標的遺伝子と筋萎縮原因遺伝子の発現を示している（ｎ＝６）。４つのバーにおいて、一番左のバーはαＣｏｎｔ－ＧＣを、２番目のバーはαＣｏｎｔ－ＨＵを、３番目のバーはαＤｌｌ４－ＧＣを、一番右のバーはαＤｌｌ４－ＨＵを示す。 ａは、野生型マウスＤＢモデルに対して中和抗体を投与する試験の概要を示す。ｂは、ＳＴＺ注射１４日後の血糖を示す（ｎ＝５～７）。ｃは、ＤＢが誘発するＴＡ、ＰＬＡ、ＧＡＳ筋の筋肉重量の減少を示す（ｎ＝５～６）。それぞれ左バーはαＣｏｎｔを、右バーはαＤｌｌ４を示す。 ｄは、ＴＡ筋断面のラミニン免疫組織化学染色の代表画像を示す。ｅは、筋線維ＣＳＡの定量データを示す（ｎ＝５）。ｆは、ＧＡＳ筋肉におけるＦｏｘＯ標的遺伝子と筋萎縮原因遺伝子の発現を示している（ｎ＝５）。４つのバーにおいて、一番左のバーはαＣｏｎｔ－Ｖｅｈを、２番目のバーはαＣｏｎｔ－ＤＢを、３番目のバーはαＤｌｌ４－Ｖｅｈを、一番右のバーはαＤｌｌ４－ＤＢを示す。 ａは、野生型マウスＤＢモデルに対して可溶型Ｄｌｌ４‐Ｆｃ組換タンパク質を投与する試験の概要を示す。ｂは、ＳＴＺ注射１４日後の血糖を示す（ｎ＝５）。ｃは、ＤＢが誘発するＴＡ、ＰＬＡ、ＧＡＳの筋肉重量の減少を示す（ｎ＝５）。それぞれ左バーはＰＢＳを、右バーはｒＤｌｌ４－Ｆｃを示す。 ａは、野生型マウスＳＴＺ誘発重症高血糖症モデルに対して中和抗体を投与する試験の概要を示す。ｂは、ＳＴＺ注射７日目（左）または１４日目（右）における握力を示す（ｎ＝９～１０）。ｃは、生存曲線を示す（ｎ＝１０）。生存実験のＰ値はＬｏｇ－ｒａｎｋ検定を用いて求めた。 ａは、野生型マウス機械的負荷誘発筋肥大モデルに対して中和抗体を投与する試験の概要を示す。ｂは、過負荷により誘導されたＰＬＡ筋の重量増加（ＰＬＡ筋肉重量／体重：ＯＬ処置群（ＯＬ）対未処置群（sedentary control:Ｓｅｄ））を示す（ｎ＝６）。ｃは、過負荷ＰＬＡ筋断面のラミニン免疫組織化学染色の代表画像を示す。ｄは、筋線維ＣＳＡの定量データを示す（ｎ＝６）。 ａは、N2f/f およびN2-/- マウスに対し、機械的負荷（ＯＬ）を行い、筋肥大を誘発させる試験の概要を示す。協働筋切除（tenotomy）後14日目に分析した。ｂおよびｃは、過負荷により誘導されたＰＬＡ筋の重量および重量増加（ＰＬＡ筋肉重量／体重：ＯＬ処置群（ＯＬ）対未処置群（sedentary control:Ｓｅｄ））を示す（ｎ＝６～８）。 ａは、野生型マウス機械的負荷（ＯＬ）誘発筋肥大モデルにおいてＤＡＰＴを投与した試験の概要を示す。協働筋切除（tenotomy）後に、ＤＡＰＴ（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、14日目に分析した。ｂおよびｃは、過負荷により誘導されたＰＬＡ筋の重量および重量増加（ＰＬＡ筋肉重量／体重：ＯＬ処置群（ＯＬ）対未処置群（sedentary control:Ｓｅｄ））を示す（ｎ＝６）。 糖尿病マウスから分離されたＧＡＳ筋肉におけるＤｌｌ４のイムノゴールドラベルの代表的なＴＥＭ画像である。金粒子は、ＥＣと筋線維の間の間質空間の筋線維（ａ）、コラーゲン様線維（ｂ）、または細胞外小胞（ｃ）の近くに局在していた。スケールバー＝２００ｎｍ。
　以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明するが、本発明は以下に記載の態様に限定されるものではない。なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。また、本発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書中に引用されそして本明細書の一部を構成するものである。
　本明細書において、数値範囲を示す「Ａ～Ｂ」の記載は、端点であるＡおよびＢを含む数値範囲を意味する。また、「ＡないしＢ」についても同様である。また本明細書において、「約」とは、±１０％を許容する意味で用いる。
　本明細書において、本発明のＤｌｌ４機能阻害剤を有効成分として含有する筋萎縮症の予防または治療剤を、「本発明の予防または治療剤」、「本発明の医薬組成物」、または「本発明の組成物」という場合がある。本明細書において、本発明の予防または治療剤に用いることができる有効成分を、「本発明の予防または治療剤の有効成分」、「本発明の医薬組成物の有効成分」、「本発明の組成物の有効成分」、または「本発明の有効成分」という場合があり、前後の文脈より明らかな場合は、単に「有効成分」という場合がある。本明細書において、「Ｄｌｌ４機能阻害剤」の記載は、前後の文脈よりいずれを示しているか明らかな場合を除き、Ｄｌｌ４のＮｏｔｃｈ２への結合阻害剤、Ｄｌｌ４の発現阻害剤、およびＤｌｌ４に対するコラーゲンの結合阻害剤のいずれも含む意味で用いられる。本明細書において、Ｄｌｌ４とＤｌｌ４タンパク質は、文脈より別の意味を示していると明らかな場合を除いて、物質（タンパク質）としてのＤｌｌ４を意味し、相互に置換可能な言葉として用いられる。本明細書において、Ｎｏｔｃｈ２とＮｏｔｃｈ２タンパク質は、文脈より別の意味を示していると明らかな場合を除いて、物質（タンパク質）としてのＮｏｔｃｈ２を意味し、相互に置換可能な言葉として用いられる。
　本発明は、Ｄｌｌ４機能阻害剤を有効成分として含有する筋萎縮症の予防または治療剤である。本発明において「Ｄｌｌ４機能阻害剤」とは、Ｄｌｌ４－Ｎｏｔｃｈ２シグナル軸に基づいて筋萎縮を引き起こすＤｌｌ４の機能を阻害することにより、筋萎縮を抑制できる物質を意味する。本発明者らは、筋組織中の微小血管内皮は、Ｎｏｔｃｈ２のリガンドであるＤｌｌ４をアップレギュレートして分泌し、そして、血管内皮細胞から分泌されたＤｌｌ４は、直接的な細胞間接触なしに筋線維表面に存在するＮｏｔｃｈ２に結合することにより、Ｎｏｔｃｈ２を選択的に活性化し、その結果、筋萎縮シグナルが誘導され、筋萎縮が起こることを見いだした。また本発明者らは、リガンドである内皮細胞から分泌されたＤｌｌ４は、受容体であるＮｏｔｃｈ２に結合するためには、コラーゲンと結合することが重要であることを見いだした。本発明者らはさらに、Ｄｌｌ４は内皮細胞が分泌する細胞外小胞の膜に発現しており、Ｄｌｌ４によるＮｏｔｃｈ２の活性化による筋萎縮は細胞外小胞を介して起こることを見いだした。また、内皮細胞から分泌されるＤｌｌ４には本来想定されるＤｌｌ４の分子量より小さいｃｌｅａｖｅｄ型があり、このｃｌｅａｖｅｄ型Ｄｌｌ４がＮｏｔｃｈ２への結合・活性化に重要であることも見出した。従って、本発明において「Ｄｌｌ４機能阻害剤」とは、Ｎｏｔｃｈ２を経由した筋萎縮を誘導するＤｌｌ４の作用を阻害する物質を意味し、これに限定されないが、例えば、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２間の結合を阻害する物質（好ましくは、血管から分泌されたＤｌｌ４と筋線維のＮｏｔｃｈ２との結合を阻害する物質）、Ｄｌｌ４の発現を阻害する物質（例えば、内皮細胞におけるＤｌｌ４の発現阻害剤、細胞外小胞におけるＤｌｌ発現阻害剤を含む）、Ｄｌｌ４に対するコラーゲンの結合を阻害することによりＤｌｌ４とＮｏｔｃｈ２の結合を阻害する物質のいずれも含む意味で用いられる。
　Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２間の結合を阻害する物質は（以下、「Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２との結合阻害物質」、「Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２との結合阻害剤」、あるいは文脈より明らかな場合は、単に「結合阻害物質」または「結合阻害剤」という。）は、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２との結合を阻害することにより、Ｎｏｔｃｈ２の活性化を抑止し、筋萎縮シグナルの誘導を抑制することにより、筋萎縮を抑制する。その結果、筋萎縮の予防または治療剤の有効成分として用いることができる。結合阻害物質は、たとえば、これに限定されないが、Ｄｌｌ４に結合して、Ｄｌｌ４が物理的にＮｏｔｃｈ２に結合することを阻害する物質を挙げることができる。具体的には、Ｄｌｌ４のＮｏｔｃｈ２に結合する部位（以下、「Ｄｌｌ４のＮｏｔｃｈ２への結合部位」、「Ｎｏｔｃｈ２結合部位」、「受容体結合部位」という場合がある）に結合する、低分子、中分子、抗体等を挙げることができる。好ましくは、Ｄｌｌ４のＮｏｔｃｈ２への結合部位を認識する抗体を挙げることができる。また、結合阻害物質は、たとえば、これに限定されないが、Ｎｏｔｃｈ２に結合して、Ｎｏｔｃｈ２が物理的にＤｌｌ４に結合することを阻害する物質を挙げることができる。具体的には、Ｎｏｔｃｈ２のＤｌｌ４に結合する部位（以下、「Ｎｏｔｃｈ２のＤｌｌ４への結合部位」、「Ｄｌｌ４結合部位」、「リガンド結合部位」という場合がある）に結合する、低分子、中分子、抗体等を挙げることができる。好ましくは、Ｎｏｔｃｈ２のＤｌｌ４への結合部位を認識する抗体を挙げることができる。
　血管から分泌されたＤｌｌ４は筋線維のＮｏｔｃｈ２に結合する。よって上記結合阻害物質は、好ましくは、血管から分泌されたＤｌｌ４と筋線維のＮｏｔｃｈ２との結合を阻害する物質をあげることができる。また、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２間の結合を阻害する物質は、例えば、Ｎｏｔｃｈ２の細胞外ドメインの糖鎖修飾等、Ｄｌｌ４のタンパク質修飾等を標的とした結合阻害剤も含む。
　低分子または中分子である化合物は、常法に従い、Ｄｌｌ４との結合活性、Ｎｏｔｃｈ２との結合活性、あるいは、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２との結合を阻害する活性を指標にスクリーニングすることにより探索できる。例えばこれに限定されないが、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２を試験物質の存在下または非存在下で結合させ、その後、Ｄｌｌ４－Ｎｏｔｃｈ２結合体を、抗Ｄｌｌ４抗体と抗Ｎｏｔｃｈ２抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により検出することにより、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２の結合を阻害する物質をスクリーニングできる。抗Ｄｌｌ４抗体および抗Ｎｏｔｃｈ２抗体は、常法に従い作製することもできるが、市販されているものを用いてもよい。
　または、Ｄｌｌ４分子がＮｏｔｃｈ２分子と結合した場合に蛍光を発するように化学修飾したＤｌｌ４を用い、単離した筋線維を接着培養し、筋線維に発現しているＮｏｔｃｈ２へのＤｌｌ４の結合を蛍光により検出する系を用いることができる。あるいは、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、Ｄｌｌ４分子とＮｏｔｃｈ２分子の結合を検出する系を用いることもできる。さらには、単離した筋線維の代わりに、Ｎｏｔｃｈ２が過剰に細胞表面に発現するようにした細胞を用いて同様にして行うこともできる。
　Ｄｌｌ４のＮｏｔｃｈ２への結合部位を認識する抗体、またはＮｏｔｃｈ２のＤｌｌ４への結合部位を認識する抗体は、Ｄｌｌ４タンパク質またはＮｏｔｃｈ２タンパク質を用いて常法により作製することができる。あるいは、Ｄｌｌ４のアミノ酸配列情報またはＮｏｔｃｈ２のアミノ酸配列情報を参考に、遺伝子工学的手法を用いて、常法により作成することができる。Ｄｌｌ４およびＮｏｔｈｃ２の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、公知のデータベースより入手可能である。ヒトのＤｌｌ４については、核酸配列（ＮＭ＿０１９０７４．４）およびアミノ酸配列（ＮＰ＿０６１９４７．１）として、ヒトＮｏｔｃｈ２については、核酸配列（ＮＭ＿０２４４０８．４）およびアミノ酸配列（ＮＰ＿０７７７１９．２）として登録されている。例えば、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２の結合部位に関する報告（例えば、非特許文献１０、非特許文献１１）を参考にして、結合部位を含むと考えられるアミノ酸配列に対する抗体を作成することができる。また、例えばこれに限定されないが、抗Ｎｏｔｃｈ２抗体としては、Ｎｏｔｃｈ２の細胞外ドメインのＥＧＦリピート１１－１３の領域にＤｌｌ４が結合すると示唆されているので、Ｎｏｔｃｈ２のＥＧＦリピート１１－１３の領域に結合する抗Ｎｏｔｃｈ２抗体をあげることができる。抗体としては、全長（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）であってもよく、またはその抗原結合部位を含み、機能性を改善するようにまたは必須でないエフェクター機能を除去するように修飾されたものであってもよい。例えば、ジスルフィドＦｖ、ｄＡｂフラグメント、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメント、単離されたＣＤＲ断片などの単一ドメイン、限定されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチド、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、ナノボディ（例えば、１価のナノボディ、２価のナノボディなど）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ドメインが欠損した抗体、キメラ抗体、ＣＤＲが移植された抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、三重特異性抗体、四重特異性抗体）、特異的な抗原結合能を有する抗体の少なくとも一部を含むポリペプチド、および小モジュラー免疫薬のような他の操作された分子を挙げることができる。あるいは、抗体の抗原結合断片であってもよい。抗体の抗原結合断片は、任意の天然に生じるまたは合成された、酵素的若しくは生化学的手法を用いて得られた、または遺伝子操作により得られた、抗原であるＤｌｌ４のＮｏｔｃｈ２結合部位に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。上記の内容は、抗原としてＮｏｔｃｈ２を用いる場合も同様である。
　抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質消化、または抗体の可変および（場合により）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う組換え遺伝子操作技術のような任意の適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子またはそのアミノ酸若しくは遺伝子情報から得ることができる。ＤＮＡは、配列決定され、化学的または分子生物学的技術を用いることにより、例えば、１つもしくはそれ以上の可変および／または定常ドメインを適切な位置に配置させる、あるいは、例えば、任意のコドンを導入して、システイン残基を作製するまたはアミノ酸を修飾・付加・欠損される、等の操作により、任意の抗原結合断片を作製できる。
　抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であり、少なくとも１つのＣＤＲを一般的に含み、それは１つまたはそれ以上のフレームワーク配列に隣接されるかあるいはインフレームに配置される。ＶＬドメインと繋がったＶＨドメインを有する抗原結合断片において、ＶＨおよびＶＬドメインは、任意の適切な配置で相対的に位置する。抗体の抗原結合断片は、例えば、二量体である可変領域、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含む。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含む。
　ある実施形態において、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含有する。抗体の抗原結合断片内の可変および定常ドメインの典型的配置は、これに限定されないが、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬを含む。上記の典型的な配置のいずれかを含む、可変および定常ドメインの任意の配置において、可変および定常ドメインは、互いに直接的に結合されるか若しくはリンカー領域により結合されるかのいずれかである。リンカー領域は、少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個もしくはそれ以上）のアミノ酸からなり、隣接する可変および／または定常ドメイン間を結合する。さらに、抗体の抗原結合断片は、１つの若しくはそれ以上の単量体ＶＨ若しくはＶＬドメインが非共有結合的に会合した、上記の可変および定常ドメイン配置のいずれかのホモ－二量体またはヘテロ－二量体（あるいは他の多量体）を含む。
　完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単特異性または多特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、それぞれの可変ドメインは、別々の抗原または同一抗原上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を有する。本明細書における二重特異性抗体を含む、任意の多特異性抗体は、当該技術分野において利用可能な慣例的技術を用いて作製でき、本発明の目的において抗体の抗原結合断片として使用することができる。
　Ｄｌｌ４の発現を阻害する物質（以下、「Ｄｌｌ４の発現阻害物質」、「Ｄｌｌ４の発現阻害剤」、あるいは文脈より明らかな場合は、単に「発現阻害物質」または「発現阻害剤」という。）は、Ｄｌｌ４の発現を阻害することにより、Ｄｌｌ４の発現、例えば、内皮細胞におけるＤｌｌ４の発現や細胞外小胞におけるＤｌｌ４の発現を減少させて、Ｄｌｌ４によるＮｏｔｃｈ２の活性化を抑止し、筋萎縮シグナルの誘導を抑制することにより、筋萎縮を抑制する。好ましくは内皮細胞におけるＤｌｌ４の発現、より好ましくは血管内皮細胞におけるＤｌｌ４の発現を減少させる。その結果、筋萎縮の予防または治療剤の有効成分として用いることができる。発現阻害物質は、たとえば、Ｄｌｌ４の発現を特異的に阻害する核酸分子を挙げることができる。Ｄｌｌ４の発現を特異的に阻害する核酸分子は、通常非天然の核酸であり、たとえば、Ｄｌｌ４の発現を特異的に妨害するＲＮＡｉ、アンチセンス核酸、又はリボザイムである。「ＲＮＡｉ」とは、標的対象となるＤｌｌ４の発現を下方制御する能力を有するあらゆるＲＮＡを意味し、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子が含まれる。好ましくは、Ｄｌｌ４発現阻害剤は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。
　ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、翻訳開始コドンの下流１９～５０ヌクレオチドの領域に対して通常設計される。好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、長さが少なくとも約１０～４０塩基のヌクレオチド、好ましくは約１５～３０塩基のヌクレオチドからなるｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、天然ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または組換え生成型ＲＮＡ、並びに１つ若しくは複数のヌクレオチドの付加、欠損、置換、および／または改変により、天然のＲＮＡと異なる改変型ＲＮＡを含みうる。かかる改変は、ｓｉＲＮＡがヌクレアーゼ消化に抵抗性となるような修飾を含め、例えば分子の末端部又はｓｉＲＮＡの１つ若しくは複数の内部ヌクレオチド等への非ヌクレオチド物質の付加を含みうる。
　本発明の発現阻害剤である核酸は、Ｄｌｌ４をコードする遺伝子又は転写物に特異的にハイブリダイズする能力を有する。発現阻害剤としての核酸は、特異的にハイブリダイズするのに、標的配列であるＤｌｌ４の配列と１００％の相補性を必要とはしないが、少なくとも約９０％に等しい相補性を有することが好ましい。より好ましくは、本発明における発現阻害物質としての核酸と標的配列（Ｄｌｌ４の標的配列）との間の相補性は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
　Ｄｌｌ４に対するコラーゲンの結合を阻害する物質（以下、「Ｄｌｌ４のコラーゲンへの結合阻害物質」、「Ｄｌｌ４のコラーゲンへの結合阻害剤」、あるいは文脈より明らかな場合は、単に「結合阻害物質」または「結合阻害剤」という。）は、血管内皮細胞から分泌されたＤｌｌ４のコラーゲンへの結合を阻害することにより、Ｄｌｌ４のＮｏｔｃｈ２への結合を阻害してＮｏｔｃｈ２の活性化を抑止し、筋萎縮シグナルの誘導を抑制することにより、筋萎縮を抑制する。その結果、筋萎縮の予防または治療剤の有効成分として用いることができる。結合阻害物質は、たとえば、これに限定されないが、Ｄｌｌ４に結合して、Ｄｌｌ４が物理的にコラーゲンに結合することを阻害する物質を挙げることができる。具体的には、Ｄｌｌ４のコラーゲンに結合する部位（以下、「Ｄｌｌ４のコラーゲン結合部位」、「コラーゲン結合部位」という場合がある）に結合する、低分子、中分子、抗体等を挙げることができる。好ましくは、Ｄｌｌ４のコラーゲンへの結合部位を認識する抗体を挙げることができる。また、結合阻害物質は、たとえば、これに限定されないが、コラーゲンに結合して、コラーゲンが物理的にＤｌｌ４に結合することを阻害する物質を挙げることができる。抗体を用いる場合は、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２との結合を阻害する抗体と同様に、種々の抗体を用いることができる。
　他のＤｌｌ４機能阻害剤としては、例えば、Ｄｌｌ４がＮｏｔｃｈ２の細胞外ドメインに結合してもＮｏｔｃｈ２の細胞内ドメインが切断されること（Ｎｏｔｃｈ２が活性化されること）を阻害する物質をあげることができる。これに限定されないが、このような阻害物質は、Ｎｏｔｃｈ２切断に関連するメタロプロテアーゼやセクレターゼの阻害物質を含む。
　本発明のＤｌｌ４の機能阻害剤を有効成分として含む組成物は、筋萎縮を伴う疾患の予防または治療に用いられる。本発明の組成物は、さらには、筋萎縮の改善、ひいては筋肉量低下の改善または筋力低下の改善に用いられる。例えば、加齢などによって衰える筋肉の維持、尿漏れ改善などが挙げられる。筋萎縮とは、筋肉が痩せることをいい、その結果として筋肉量が低下する。本発明の予防または治療剤が対象とする「筋萎縮症」とは、神経原性筋萎縮性疾患および筋原性筋萎縮性疾患の両者を含む。
　神経原性筋萎縮性疾患としては、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、重症筋無力症、進行性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、ギラン・バレー症候群、および物理的な脊髄損傷による筋萎縮などを挙げることができる。
　筋原性筋萎縮性疾患としては、例えば、加齢性筋萎縮症（サルコペニア）、廃用性筋萎縮症、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、遠位筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー１型、もしくは筋強直性筋ジストロフィー２型、肢帯型筋ジストロフィー）、糖尿病性筋萎縮症、先天性ミオパチー、遠位性ミオパチー、ステロイドミオパチー、薬剤性ミオパチー、横紋筋融解症、脊髄性筋萎縮症、進行性球脊髄性筋萎縮症、筋消耗性疾患（例えば、加齢関連サルコペニア、悪液質）、シャルコ・マリー・ツース病、ランバート・イートン症候群、悪液質（例えば、がん悪液質、心筋梗塞、腎不全、ＣＯＰＤ、敗血症、ＨＩＶ感染）により誘導される筋萎縮、熱傷等にともなう筋萎縮などを挙げることができる。
　本発明の筋萎縮症の予防または治療剤は、治療有効量のＤｌｌ４機能阻害剤を含む。「治療有効量」とは、治療を必要とするほ乳類に投与される場合、治療効果を生じさせるのに十分な量をいう。治療有効量は、対象および治療する疾患症状、対象の体重および年齢、疾患症状の重症度、投与方法などに依存して異なり、当該技術分野における当業者により容易に決定されることができる。ある実施形態において、Ｄｌｌ４機能阻害剤は、低分子または中分子である。ある実施形態において、Ｄｌｌ４機能阻害剤は、抗体またはその抗原結合断片であり、それらは実質的に精製されたものが用いられる。ある実施形態において、Ｄｌｌ４機能阻害剤は、核酸、好ましくはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。ある実施形態において、本発明のＤｌｌ４機能阻害剤は、筋萎縮を起こしている対象に、予防的に投与される。ある実施形態において、本発明のＤｌｌ４機能阻害剤は、筋萎縮を起こしている対象に、治療目的で投与される。
　本発明の予防または治療剤が投与される対象は、哺乳類であり、好ましくはヒトである。より特定の実施形態において、対象は、筋萎縮症を発症しているヒトである。本発明の組成物は、軽度または中度の筋萎縮症を発症している対象に対しては、治療目的に加え、筋萎縮症の進行を防ぐために予防的にも投与されうる。本発明の組成物は、中度または重度の筋萎縮症を発症している対象に対しては、主として治療目的で投与されうる。
　本発明の組成物は、ＤＤＬ４機能阻害剤を治療有効量で含み、さらに、薬学的に許容できる担体を含む。本明細書において「薬学的に許容できる担体」は、動物、特にはヒトで使用するため、規制機関によって使用が認可されている、または一般に使用が認められている薬局方に収載されている担体を意味し、当業者に知られているように、任意およびすべての、溶媒、分散媒体、コーティング剤、酸化防止剤、キレート剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、界面活性剤、緩衝剤、浸透圧調節剤、吸収遅延剤、塩、薬物安定剤、賦形剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、甘味剤、芳香剤、潤沢剤、染料など、及びそれらの組合せを含む。何れかの担体が本発明の活性成分と不適合である場合以外は、本発明の組成物において使用することができる。
　本発明の組成物は、経口投与や非経口投与などの投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。その剤形は特に限定されないが、経口投与の場合、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、トローチ剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。非経口投与の場合、例えば、座剤、噴霧剤、吸入剤、軟膏剤、貼付剤、注射剤（輸液剤を含む）等に製剤化することができる。本発明の組成物は、使用時に滅菌水等を加えて溶解する凍結乾燥製剤であってもよい。なお、製剤化は、剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。
　本発明は一つの実施形態において、対象に、Ｄｌｌ４機能阻害剤を治療有効量で投与することにより、対象を予防または治療する方法である。ＤＤＬ４機能阻害剤の治療有効量や投与方法その他については、予防剤および治療剤について上記した通りである。
　本発明の有効成分であるＤＤＬ４機能阻害剤の投与量は、ＤＤＬ４機能阻害剤の種類に応じて適宜選択される。また、本発明の有効成分であるＤＤＬ４機能阻害剤の投与量は、投与対象の症状、年齢、状態、投与経路等により適宜選択される。
　本発明の有効成分であるＤＤＬ４機能阻害剤として低分子または中分子が用いられる場合、本発明の組成物は、医薬として経口的または非経口的に投与出来るが、好ましくは経口投与である。経口投与の場合は、例えば錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤等の固形剤として使用することが出来、これらは慣用の賦形剤、結合剤、希釈剤、滑沢剤等の添加剤を含んでもよい。また、水性または油性の懸濁剤、溶液、シロップ剤、エリキシル剤等の溶剤としても投与可能である。また、非経口投与の場合は、注射剤等として使用出来る。投与量は、患者の年齢、体重および状態または疾患の種類、程度もしくは投与方法等により異なり一概に規定出来ないが、通常、成人１日当り、約０．１～約５００ｍｇ／ｋｇである。
　本発明の有効成分であるＤＤＬ４機能阻害剤として抗体が用いられる場合は、成人患者における疾患の予防または治療のために、これに限定されないが、通常、体重１ｋｇ当たり、下限として、約０．０１ｍｇ、好ましくは約０．０５ｍｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ、一方、上限としては、約１００ｍｇ、好ましくは約５０ｍｇ、より好ましくは約２０ｍｇ、さらに好ましくは約１０ｍｇの単回用量にて投与される。本発明の抗体の抗原結合断片を用いる場合は、前記用量より多くの用量を投与するのが通常であり、これに限定されないが、例えば、約１．５倍～約５０倍、好ましくは約１．５倍～約２０倍、より好ましくは約１．５倍～約１０倍の量が投与される。状態の重症度に依存して、投与の頻度および投与間隔は調節される。ある実施形態において、抗体等は、少なくとも約１ｍｇ～約１０００ｍｇの開始用量として投与される。ある実施形態において、開始用量に続き、開始用量のものとおよそ同一であるか、またはそれ未満である量における第２または多数の続く用量の抗体またはその抗原結合断片が投与され、ここで、続く用量は、少なくとも２～５日；少なくとも１週；少なくとも２週；少なくとも３週；少なくとも４週；少なくとも５週；少なくとも６週；少なくとも７週；少なくとも８週；少なくとも９週；少なくとも１０週；または少なくとも１２週により隔てられる。
　本発明の組成物は、経口または非経口のいずれにおいても、有効成分の目的用量に適合するように単位用量に調製された投薬剤形にて調製される。単位用量を含む投薬剤形は、例えば、錠剤、ピル、カプセル剤、注射（アンプル剤）、坐剤などを含む。含有される抗体の量は、一般に、単位用量において、一つの投薬形態当たり約５～約１０００ｍｇ、の抗体等が含有されることが好ましい。
　投与用量および投与スケジュールを含む投与治療計画は、投与対象の症状、年齢、状態、投与経路等を考慮し、対象（患者）を診断した医師が適宜判断して、必要に応じ、様々な機関から提示されたガイドラインを参照して、決めることができる。
　本発明の医薬組成物の投与経路は、対象の症状、状態その他の条件を考慮して任意に定めることができる。投与経路は、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路を含むが、これらに限定されない。医薬組成物は、任意の好都合な経路により、例えば、注入若しくはボーラス注射により、または上皮若しくは皮膚粘膜裏層（例えば、経口粘膜、直腸、および腸粘膜など）を通じた吸収により投与され、また、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してもよい。投与は全身または局所であり得る。
　医薬有効成分の投与においては、種々のデリバリーシステムが公知であり、これらを用いて、本発明の医薬組成物を投与できる。例えば、リポソームにおけるカプセル封入、微粒子、ナノ粒子、マイクロカプセを挙げることができる。また、ある実施形態において、医薬組成物は、制御放出システムにおいてデリバリーすることもできる。制御放出システムは、組成物が標的の近くに置かれ、従って、少量の全身性用量のみが必要とされる。
　本発明の医薬組成物を注射で投与する場合、注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、腹腔内および筋内注射用形態、または点滴注入用形態などを含む。これらの注射可能な調製物は、公知の方法を参照して調製できる。注射可能な調製物は、例えば、注射のため通常用いられる無菌の水性媒体もしくは油性媒体に、本発明の抗体等またはその塩を溶解、懸濁、または乳化することにより、調製できる。注射用水性媒体として、例えば、生理食塩水、グルコースを含有する等調溶液、および他の補助剤などを挙げることができ、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な溶解剤と併用で用いることもできる。油性媒体として、例えば、ゴマ油、大豆油などが利用され、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどのような溶解剤と併用して用いることができる。また、調製される注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
　本発明の医薬組成物が注射剤である場合、用時調製注射剤としてまたはプレフィルシリンジ剤として調製できる。本発明の医薬組成物は、標準的な針およびシリンジで皮下または静脈内に投与される。また、皮下投与のためにペンデリバリー装置を用いることもできる。ペンデリバリー装置は、再利用可能であるか、または使い捨てである。
　本発明の組成物においてＤＤＬ４機能阻害剤として核酸、例えばｓｉＲＮＡを用いる場合は、単一のｓｉＲＮＡであってもよく、また、複数のｓｉＲＮＡの混合物（いわゆる、カクテル）であってもよい。
　本発明のｓｉＲＮＡを生体内で使用するときには、ｓｉＲＮＡを直接患部に注入するか、又はｓｉＲＮＡの発現が可能なベクターを使用することができる。
　ｓｉＲＮＡを直接患部に注入する場合には、それらをリポソーム、たとえばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソームと複合体形成して注入することができる。
　ｓｉＲＮＡの発現が可能なベクターを使用する場合は、例えば、ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターが好ましく用いられる。
　ｓｉＲＮＡを得るために、ｓｈＲＮＡを用いるまたはｓｈＲＮＡを細胞内で発現させることもできる。本発明で使用可能なｓｈＲＮＡは、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列を含むものであり、細胞内ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされてｓｉＲＮＡが形成されるＲＮＡである。
　ｓｈＲＮＡは、単一のｓｈＲＮＡであってもよく、また、複数のｓｈＲＮＡの混合物（いわゆる、カクテル）であってもよい。
　ｓｉＲＮＡを患部にデリバリーするためにウイルスベクターを用いてもよい。用いることができるウイルスベクターは、特に制限はないが、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター（白血病ウイルスベクターなど）、ヘルペスウイルスベクターなどをあげることができる。ウイルスベクターは、ヒトに使用する際に疾病を引き起こさないように例えば自己複製能を欠損したタイプのものが好ましい。例えば、アデノウイルスベクターの場合には、Ｅ１遺伝子及びＥ３遺伝子を欠失した自己複製能欠損型アデノウイルスベクターを使用することができる。ウイルスベクターの構築方法は、公知の方法に従い行うことができる。
　本発明においては、骨格筋でＤＤＬ４遺伝子の発現を抑制することを目的としているので、骨格筋へのデリバリー選択性があるアデノ随伴ウイルスベクターが特に好ましく用いられる。アデノ随伴ウイルスベクターとしては、現在まで、Ｉ型からＸＩ型まで知られており、これらを制限なく用いることができるが、今後開発されるベクターも本発明の目的を達するかぎり制限なく用いることができる。好ましいベクターは、これに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９である。好適に用いられる各種アデノ随伴ウイルスベクターは市販されている。
　ウイルスベクターを用いる場合は、患部にベクターを直接注入し細胞に感染させることによって細胞内に遺伝子導入することができる。特にアデノウイルスベクターは種々の細胞種に非常に高い効率で遺伝子導入可能であることが確認されており、また遺伝子治療のために実際に臨床応用されている。このベクターはまた、ゲノム中に組み込まれることがないため、その効果は一過的であり安全性も他のウイルスベクターと比べて高いと考えられる。
　ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを直接投与する場合の投与量は、特に制限されず、タンパク質レベルでのＤＤＬ４の減少を引き起こす効果を生じる量が選択される。投与量は、治療有効量であり、また一定の時間的間隔で複数回投与することもできる。実際に用いる際は、患者の状態、年齢、性別、重篤度などに応じて専門医の判断により投与量が決定される。
　ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを搭載したベクターは、医薬上許容可能な担体、例えば、生理食塩水、緩衝液などとともに患者に投与される。医薬組成物にはさらに、安定化剤、保存剤、等張化剤などを含有させることができる。本発明の医薬組成物の投与方法については、特に制限はないが、局所投与又は非局所投与のいずれでも実施できるが、好ましくは局所投与である。局所投与の場合、注射器等の手段で直接ベクターを投与することができる。非局所投与の場合、たとえば静脈内投与で行うことができる。投与形態としては、たとえばウイルスベクター、又はプラスミドとリポソームの複合体、を医薬上許容可能な担体に懸濁させた形態で投与される。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　本発明の実施例において用いた方法を以下に説明する。
（１）抗体と試薬
　実施例で用いた各種抗体および試薬は、市販のものを購入して用いた。
（２）動物
　すべての動物実験手順は、熊本大学の実験動物委員会（Institutional Animal Care and Usage Committee：IACUC）の承認を受けて行った。動物は病原体を含まない、温度および湿度を制御した環境で飼育した。食物および水を自由に摂取できる状態で、１２時間の光サイクル下で飼育した。実施例で用いたマウスは、市販のマウスを購入して用いた他、必要に応じて、特定の遺伝子表現型を有するマウスを交配させて目的の遺伝子表現型を有するマウスを作製した。
（３）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のインビトロ阻害試験
　野生型マウスを用い、インビトロでの筋肉に対するＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害の効果を調べた。Ultra-LEAFTM抗マウスＤｌｌ４抗体（Ｄｌｌ４遮断抗体）またはUltra-LEAFTM American hamster ＩｇＧ対照抗体（対照抗体）を、各実験において４日ごとに腹腔内投与（１０ｍｇ／ｋｇ体重）した。組換えＤｌｌ４‐Ｆｃキメラ蛋白質（ｒＤｌｌ４）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、２日毎に投与（０．５ｍｇ／ｋｇ体重）した。１０％エタノールとトウモロコシ油に溶解したγ‐セクレターゼ阻害剤、ＤＡＰＴを２日毎に投与した（１０ｍｇ／ｋｇ体重）。対照マウスには、ｒＤｌｌ４またはＤＡＰＴ実験において等量のビヒクル（vehicle）を腹腔内注射した。
（４）尾部懸垂による後肢の免荷モデル
　マウスは、一端を尾部に、もう一端を特注のケージ蓋部に結びつけたひもによって、各ケージ毎に尾部からマウスを個別に懸垂した。ひもの長さは、マウスが前肢を自由に動かし、自由に飲食物を摂取できるように調整した。同腹仔で同年齢の地上（懸垂されていない）マウスを対照として用いた。７日間の懸垂後、マウスを頸部脱臼により殺し、ヒラメ筋（ＳＯＬ）、浅趾屈筋（ＰＬＡ）、および腓腹筋（ＧＡＳ）を採取した。
（５）ＳＴＺ誘発糖尿病モデル
　マウスに、インスリンを産生する膵β細胞に対して毒性を示すレベルのＳＴＺ（１５０ｍｇ／ｋｇ体重）を単回腹腔内注射するか、対照として等量の溶媒（０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４．５）を注射した。Ａｃｃｕ－ｃｈｅｋ（ロシュ社）を用いて３日目にマウスの高血糖をモニタリングし、随時血糖値が＞３００ｍｇ／ｄｌに達したマウスのみを実験に用いた。マウスはＳＴＺ注射の１４日後に屠殺した。
　生存実験のために、野生型マウスに重度の糖尿病を引き起こす高用量のＳＴＺ（２５０ｍｇ／ｋｇ）を単回腹腔内注射した。その後、これらのマウスにＤｌｌ４中和抗体または対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）のいずれかを４日ごとに投与した。糖尿病マウスの外観を毎日モニターし、体重と血糖値を毎週測定した。いずれかの群のすべてのマウスが死亡するか安楽死させられた時点で、実験は中止した。
（６）テノトミー
　筋肥大を誘発するために、マウスの両脚に対して腱切開手術を行った。麻酔下のマウスでは、被毛除去後、ふくらはぎの正中線に沿って切開を行った。ＳＯＬおよびＧＡＳに属する腱を切除した後、３本または４本の縫合糸を用いて皮膚を閉鎖した。過負荷の１４日後に、マウスを殺し、ＰＬＡ筋肉を採取した。
（７）握力とテタヌス筋力の測定
　全肢握力は、ネズミ用握力計を用いて測定した。マウスが握力を解放した時のピーク張力（Ｎ）を記録した。連続１０回の測定で決定した最大強度をデータ解析に用いた。
　テタヌス筋力は全動物筋力検査システムを用いて前脛骨筋（ＴＡ）で測定した。簡単に言うと、マウスをイソフルランで麻酔し、処置を通して３７℃の加温プレート上に置いた。右足はサーボモーターと連結したフットプレートに固定し、右膝は膝クランプで固定した。ＴＡ筋は５ｍＡで２本の針電極により皮下刺激した。テタヌス収縮は１００Ｈｚの周波数で３５０ｍｓ刺激により誘発した。各収縮に続いて２分以上の間隔を設け、連続３回の測定で求めた最大筋力をデータ解析に用いた。
（８）筋線維の単離と衛星細胞培養
　本発明者の既報（小野ら、Cell Report 10, 1135-1148 (2015)）に若干の修正を加えて、Ｉ型コラゲナーゼを用いた酵素分解により、長指伸筋（ＥＤＬ）または浅趾屈筋（ＰＬＡ）から筋線維を単離した。遺伝子発現解析のため、単離した筋線維を、液体窒素を用い直ちに凍結した。サテライト細胞はＥＤＬ筋から単離した筋線維から得た。サテライト細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２を含む雰囲気中で、ＧＭ（３０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ニワトリ胚抽出物、１０ｎｇ／ｍｌ塩基性ＦＧＦ、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ）中で培養した。培地をＤＭ（２％ウマ血清と１％ペニシリン‐ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ）に置換することにより筋原性分化を誘導した。４ＯＨ ＴＭＸ（１μＭ）を用いて、分化した筋管におけるＣｒｅリコンビナーゼの発現を誘導した。
（９）ＥＣ単離培養
　Muramatsuらの報告（Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 40, 2425-2439 (2020)）に軽微な変更を加えて、ダイナビーズを用いて野生型マウスの筋組織から一次内皮細胞（Endotherial Cells：ＥＣ）を単離した。麻酔したマウスをＰＢＳで潅流し、後肢筋肉組織を採取した。筋肉組織を、０．２％ＩＩ型コラゲナーゼを用いて消化し、続いて赤血球を溶解した。細胞を抗ＣＤ３１抗体と結合したダイナビーズとともにインキュベートし、磁気分離システムを用いて内皮および非内皮画分に分離した。第１選択後、細胞をＤＭＥＭ（２０％ ＦＢＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍｇ／ｍｌヘパリン、０．１ｍｇ／ｍｌ内皮細胞増殖サプリメント、および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加）中で７日間培養した。第２選択のために、増殖した細胞を回収し、抗ＣＤ１０２抗体と結合させたダイナビーズとともにインキュベートし、ＥＣの純度を増加させた。精製した初代ＥＣを、筋線維との共培養のためにコンフルエントになるまで培養した。Ｄｌｌ４の発現を減少させるために、ＥＣを、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸを用いて２０ ｎＭのＤｌｌ４－ｓｉＲＮＡ（SASI_Mm01_00092621、MilliporeSigma社）または対照－ｓｉＲＮＡ（MilliporeSigma社）でトランスフェクトした。
（１０）プラスミドトランスフェクション
　マウスＤｌｌ1　ｃＤＮＡおよびマウスＤｌｌ4　ｃＤＮＡをpcDNA3.1+P2A-eGFPプラスミドベクター（GenScript）にクローン化し、pcDNA3.1+Ｄｌｌ1-P2A-eGFP （Ｄｌｌ1-GFP）およびｐcDNA3.1+Ｄｌｌ4-P2A-eGFP （Ｄｌｌ4-GFP）を作製した。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｄｌｌ１－ＧＦＰプラスミド、Ｄｌｌ４－ＧＦＰプラスミド、またはpcDNA3.1+P2A-eGFP対照プラスミドのいずれかでトランスフェクトし、Lipofectamine LTXを、製造業者の指示に従ってＰｌｕｓ試薬とともに用いた。ＧＦＰシグナルは蛍光顕微鏡を用いて捕獲した。
（１１）筋線維培養と直径測定
　Sakaiらの報告（Sakaiら、PLoS One 12, e0177516 (2017)）に従い、培養皿をＮｏｔｃｈリガンドの組換え蛋白質でコーティングした。培養皿は、まず室温で１時間、１０μｇ／ｍｌの抗Ｆｃ抗体で被覆し、その後２０分間マトリゲル（Corning）で被覆した。Ｆｃ抗体コーティング皿を、各Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ４、Ｊａｇ１、およびＪａｇ２）のＦｃ融合蛋白質５ｎｇ／μｌと室温で１時間インキュベートした。ＥＤＬ筋から単離した個々の筋線維を無血清ＤＭＥＭに入れ、ＣＯ２インキュベーター中で４８時間培養した。筋線維におけるγ‐セクレターゼ活性の阻害にはＤＡＰＴ（１０μＭ）を用いた。
　筋線維とＨＥＫ２９３細胞との共培養の実験は以下のようにして行った。単離した筋線維を、ＧＦＰ、Ｄｌｌ１‐ＧＦＰ、およびＤｌｌ４‐ＧＦＰをコードする各々のプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞とともに、無血清ＤＭＥＭ中で４８時間、ＣＯ２インキュベーター中で培養した。
　筋線維と筋組織から単離した初代ＥＣとの共培養には、Transwell Permeable Supports （８μｍ孔のtranswell membrane；Corning）を用いた。個々の筋線維とＥＣをそれぞれプレートウェル（下部ウェル）とトランスウェルインサート（上部ウェル）に入れ、ＣＯ２インキュベーター中、無血清ＤＭＥＭ中で４８時間培養した。ＥＣから分泌されるＤｌｌ４蛋白質をブロックするために、抗Ｄｌｌ４中和抗体（５００ｎｇ／ｍｌ）を培養培地に加え、対照として対照抗体（５００ｎｇ／ｍｌ）を用いた。
　蛍光顕微鏡を用いて培養筋線維を捕獲し、ImageJ（NIH）を用いて少なくとも１５個の個々の筋線維から直径を定量した。
（１２）細胞の選別
　筋肉組織に属する内皮細胞を細胞選別によって新たに取得し、それらの遺伝子発現を評価した。マウスのＧＡＳ筋肉をミンチし、０．２％ＩＩ型コラゲナーゼを用いて消化し、続いて赤血球を溶解した。単核細胞をＰＥ結合ＣＤ３１抗体と４℃で３０分間インキュベートした。ＣＤ３１＋細胞は、Ｓ３ｅセルソーター（Bio Rad）を用いて選別した。破片と死細胞は前方散乱と側方散乱により除外した。ソートされた細胞は、ISOGEN II （Nippon Gene）を用いてマイクロチューブに採取した。
（１３）ＲＮＡ抽出および定量的逆転写ＰＣＲ
　筋肉組織、単離筋線維、培養細胞、および新たに選別した細胞から、製造業者の指示に従って、ISOGEN IIおよびRNeasy Kit （Qiagen）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、ReverTra Ace kit with genomic DNA remover（TOYOBO）を用いて調製した。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）はＴHUNDERBIRD SYBR qPCR mix（TOYOBO）とリアルタイムＰＣＲ検出システム（CFX96；Bio Rad）を用いて行った。プライマー配列は、以下を用いた：標準としてTATA box binding protein（Ｔｂｐ）、および、Ｐａｘ７、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｒｂｐｊ、Ｈｅｓ１、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ４、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、Ｃｃｎｇ２、Ｃｄｋｎ１ｂ、Ｒｂｌ２、Ｂｎｉｐ３、ＭｕＲＦ１、Ａｔｒｏｇｉｎ１、Ｆｂｘｏ３１、およびＭＵＳＡ１。
（１４）ＲＮＡの塩基配列決定
　全ＲＮＡは、ISOGEN IIとRNeasyキットを用いてＧＡＳ筋肉から得た。ライブラリー作製とＲＮＡ配列決定はNovogene （北京）に依頼し行った。
（１５）免疫蛍光法
　分離したＰＬＡ筋またはＴＡ筋肉を液体窒素冷却した２‐メチルブタン中で直ちに凍結し、分析まで－８０℃で保存した。凍結組織を、クリオスタットを用いて１０μｍ厚にスライスし、凍結切片を免疫組織化学的分析した。サテライト細胞および単離した筋線維の免疫細胞化学的分析を、本発明者の既報（小野ら、Cell Report 10, 1135-1148 (2015)）に従って実施した。試料を１次抗体と共に、一晩４℃でインキュベートした。次いで、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳ溶液で固定し、０．３％ TritonX-100および５％正常ヤギ血清を含むＰＢＳで、室温にて３０分間、浸透／ブロッキングを行った。Alexa Fluor共役二次抗体を用いて免疫染色標本を可視化し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。Image-J（NIH）を用いて少なくとも５００個の筋線維から筋線維ＣＳＡを定量し、少なくとも１５個の筋線維から筋線維あたりの衛星細胞数を計測した。
　血管染色のために筋組織のホールマウント染色を行った。麻酔したマウスを４％ ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液で潅流し、ＧＡＳ筋肉を注意深く採取した。切除した組織を鋭利なカミソリを用いて厚さ１ｍｍまでスライスし、１％ウシ血清アルブミン／０．１％ＰＢＳＴブロッキング溶液にて、４℃で一晩浸漬した。ブロックした組織を、一次抗体として抗ＣＤ３１抗体および抗Ｄｌｌ４抗体とともに４℃で一夜インキュベートした。組織をＰＢＳＴで３回洗浄し、適切な種特異的二次抗体およびＤＡＰＩ（核染色）にて、４℃で一晩染色した。再度ＰＢＳＴで筋肉を５回洗浄し、共焦点蛍光顕微鏡を用いて分析した。
（１６）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
　イソフルランの吸入による深麻酔下で、マウスを０．１Ｍリン酸緩衝液中の２％ ＰＦＡと２．５％グルタールアルデヒドで上行大動脈を通る潅流によって固定した。ＧＡＳ筋を立方体（１ｍｍ３）にトリミングし、氷上で、１時間、１％ＯｓＯ４含有０．１Ｍリン酸緩衝液中で後固定した後、エポキシレジン中に包埋し、１．５％酢酸ウランでブロック染色し、エタノール中で脱水し、プロピレンオキサイドで浸潤し、アラルダイト中に包埋した。超薄切片（厚さ６０～７０ｎｍ）を、超ミクロトームを用いて切断し、１．５％酢酸ウランとクエン酸鉛で染色した。画像はＴＥＭ（日立Ｈ７７００）を用いて撮影した。
（１７）相関共焦点走査レーザ顕微鏡（ＣＳＬＭ）‐電子顕微鏡（ＥＭ）
　イソフルランの吸入による深麻酔下で、マウスを０．１Ｍリン酸緩衝液中で４％ ＰＦＡと０．１％グルタールアルデヒドで上行大動脈を通る潅流によって固定した。ＧＡＳ筋肉から振動ミクロトーム（Dosaka TTK-3000）を用いて連続７０μｍ厚切片を切断し、相関ＣＳＬＭ‐ＥＭでの観察を行った。具体的には、切片を、液体窒素の蒸気中で急速凍結融解後、抗Ｄｌｌ４抗体（１：２００）、抗ジストロフィン抗体（１：３００）、抗ＣＤ３１抗体（１：２５０）と４℃で７日間インキュベートした後、ビオチン化ロバ抗ラットＩｇＧ（１：２５０）と一晩インキュベートした。次いで、Alexa 488結合抗マウスＩｇＧ（１：２００）、ローダミンレッド結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（１：２５０）、Alexa 647結合ストレプトアビジン（１：５００）と一晩インキュベートした。一次および二次抗体との長いインキュベーション期間は、厚さ７０μｍの切片のより深い部分への抗体の透過を改善するために行った。共焦点レーザ走査型光学顕微鏡を用いて高分解能画像を取得した後、Ｄｌｌ４の蛍光シグナルを、マウスペルオキシダーゼ‐抗ペルオキシダーゼ複合体（１：５００）と一夜インキュベートすることによりジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）シグナルに変換し、続いてＤＡＢ反応と１％ＯｓＯ４および１．５％酢酸ウランによる後固定を行った。切片を脱水し、エポキシ樹脂に平板面包埋した。超薄切片を、超ミクロトームを用いて切断した後、酢酸ウランとクエン酸鉛で染色した。画像はＴＥＭ（日立Ｈ７７００）を用いて撮影した。
（１８）タンパク質抽出と免疫ブロット法
　ＲＩＰＡ緩衝液（FUJIFILM-Wako）に曝露後、培養サテライト細胞またはサテライト細胞由来筋管から総タンパク質溶解物を得た。Pierce BCA Protein Assay Kit （ThermoFisher）を用いて各試料中のタンパク質濃度を定量した。ＥＣ培養中の培地への蛋白質分泌を定量するために、培養培地をAmicon Ultra（Merck）を用いて濃縮した。一次抗体をCanGetSignal solution A（TOYOBO）で希釈し、電気泳動で移動したタンパク質バンドを含む膜と４℃で一晩インキュベートした。次に膜を洗浄し、CanGetSignal solution B（TOYOBO）で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体と室温で１時間インキュベートし、化学発光法を用いて可視化した。
（１９）統計
　すべての統計解析はGraphPad Prism 8を用いて行った。２条件の統計学的比較には、Studentの両側対応のないｔ検定を用いた。２群以上の比較については、一元配置ANOVAに続いてDunnettの多重比較事後検定、または二元配置ANOVAに続いてTukeyまたはSidakの多重比較事後検定によりデータを解析した。＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）、＜０．００１（＊＊＊）のＰ値を統計学的に有意とみなした。すべてのデータは平均値±標準誤差（ＳＥＭ）を表した。ｎ．ｓ．は、結果は統計的に有意でなかったことを示している。
（実施例１）Nｏｔｃｈ２による筋萎縮の誘導
　本発明者らにより、サテライト細胞（骨格筋幹細胞）がＮｏｔｃｈ１とＮｏｔｃｈ２を発現し、それが成体マウスにおいてサテライト細胞の静止状態と未分化状態を協調的に維持することが報告されている（非特許文献２）。そこで、Ｎｏｔｃｈ２が未分化単核サテライト細胞だけでなく、最終分化多核筋線維（筋線維）でも発現していることを確認した。具体的には、図１に示す方法に従い、Pax7CreERT2/+;Rosa26LSL-DTA/+マウスのＥＤＬ筋からサテライト細胞を単離し、筋芽細胞増殖培地（ＧＭ）で培養した後、培地を筋芽細胞分化培地（ＤＭ）に切り替え、４ＯＨ ＭＴＸで処理して未分化サテライト細胞を枯渇させた。その後、ＰＣＲ解析およびウエスタンブロティングにより、Nｏｔｃｈ２の発現を確認した。
　次に、生体内での筋線維に対するＮｏｔｃｈ２の活性型の恒常的発現の影響を調べるために、HSArtTA ;TRCreとRosa26LSL-N2ICD（Ｎ２ＩＣＤ‐ｍＴｇ）マウスを作製した。このマウスでは、Ｎｏｔｃｈ２の細胞内ドメイン（Ｎ２ＩＣＤ）がドキシサイクリン（Ｄｏｘ）により筋線維特異的に誘導される。Ｔｇマウスおよびコントロールマウスに、Ｄｏｘ（飲水中２ｍｇ／ｍｌ）を３週間投与した後、Ｎｏｔｃｈ２の発現、体重および筋肉量を測定した。Ｎ２ＩＣＤ－ｍＴｇマウスでは、コントロールに比べ、体重は差がなかったが、筋肉量の有意な減少が認められた。結果を図２に示す。このことは、Ｎ２ＩＣＤの強制発現が筋萎縮を誘発することを示唆していた。
（実施例２）筋萎縮マウスモデル用いた試験
　筋線維におけるＮｏｔｃｈ２の役割を調べるために、Ｎｏｔｃｈ２の発現がMlc1fCre (Mlc Cre/+;N2 f/f,N2 -/-)によって遺伝的に除かれている、ミオシン軽鎖１ｆプロモーター駆動Ｃｒｅリコンビナーゼ発現（Mlc Cre/+）マウスと、Ｎｏｔｃｈ２f/f（N2 f/f）マウスを交配させて、筋線維特異的なＮｏｔｃｈ２欠損（N2 -/-）マウスを作製した。図３に示すように、Ｎｏｔｃｈ２欠損マウス（N2 -/-）ではＮｏｔｃｈ２発現が減少していたが、Ｎｏｔｃｈ２欠損マウスは正常に成長し、体重、筋肉重量、または体長指伸筋（ＥＤＬ）筋線維あたりの筋核またはPax7+サテライト細胞数に関して異常な表現型を示さなかった。
　機械的負荷軽減（廃用）筋萎縮および代謝異常（糖尿病）誘発筋萎縮の２つの異なる筋萎縮モデルを用い、Ｎｏｔｃｈ２不活性化の影響を試験した。Ｎｏｔｃｈ２の発現が正常なマウス（N2f/f）およびNｏｔｃｈ2欠損マウス（N2-/-）を用いた。図4に示すように、後肢免荷（Hindlimb unloading：ＨＵ）は、機械的免荷を７日間行い、解析した。N2f/fマウスでは、地上負荷対照（Ground loading control：ＧＣ）に比べて、ＨＵにより足底（ＰＬＡ）筋線維でＮｏｔｃｈ２遺伝子の発現が増加した。ＨＵは、N2f/fマウスのヒラメ筋（ＳＯＬ）、ＰＬＡ、腓腹筋（ＧＡＳ）の筋肉量を減少させるのに対し、N2-/-マウスの筋肉量はほとんど影響を受けないことを見出した。免疫組織化学的分析では、ＨＵ状態ではＰＬＡ筋の断面積（ＣＳＡ）は変化しないことが確認された。また、ｄに示すように、個々の筋線維の太さは、N2-/- ＨＵが大きかった。このことは、筋線維によって発現されるＮｏｔｃｈ２は、機械的除荷誘発性筋萎縮を引き起こすために必要であることを示している。
　糖尿病（ＤＢ）は遷延性高血糖を含む多数の代謝異常を引き起こし、筋力低下のハイリスクファクターとなっている。膵β細胞を除去することによって高血糖を誘発するストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発ＤＢマウスモデルを用いた。マウスにＳＴＺ（１５０ｍｇ／ｋｇ体重）またはビヒクル（Ｖｅｈ）を腹腔内注射し、１４日後に分析した。N2f/fとN2-/-マウスはＳＴＺ注入後に同程度の高血糖を示し、Ｎｏｔｃｈ２遺伝子の発現はＤＢマウスとＨＵマウスのＥＤＬ筋線維でアップレギュレートされた。ＴＡ、ＰＬＡ、ＧＡＳ筋の筋肉量とＴＡ筋のＣＳＡはN2f/f ＤＢマウスでは著明に減少したが、N2-/- ＤＢマウスでは減少しなかった。また、個々の筋線維の太さは、N2-/- ＤＢが大きかった（図５ｅ）。結果を図５に示す。
（実施例３）Ｉ型糖尿病マウスモデル（Akita mouseモデル）による試験
　Ｎｏｔｃｈ２欠失を導入した、Ｉ型糖尿病マウスモデル（Akita mouseモデル）を用いて、筋萎縮に対するＮｏｔｃｈ２の影響を確認した。その結果、Akita mouseモデルでも前脛骨筋（ＴＡ）、ＰＬＡ、およびＧＡＳにおいて、筋萎縮が軽減されることを確認した。結果を図６に示す。
（実施例４）N2f/f ＤＢマウスとN2-/- ＤＢマウスとの比較
　前脛骨筋（ＴＡ）における筋力を比較したところ、N2f/f ＤＢマウスでは、図７に示すように、ＴＡの力の発生は著しく減少したが、N2-/- ＤＢマウスでは減少しなかった。
それぞれのマウスについて、透過型電顕（ＴＥＭ）解析の結果、図８に示すように、N2f/f ＤＢマウスの筋には異常なトライアド（triads）とミトコンドリアの膨化が認められたが、N2-/- ＤＢマウスではこれらは認められなかった。
　以上の結果は、機械的負荷軽減または代謝異常誘発による、筋肉量および機能の喪失にＮｏｔｃｈ２が必要であることを示している。
（実施例５）ＨＵおよびＤＢ条件下での筋肉における遺伝子解析
　ＨＵ－とＤＢ－条件の両方で、N2f/f ＤＢマウスとN2-/- ＤＢマウスのそれぞれについて、ＲＮＡシークエンシングによるトランスクリプトーム解析を行った。その結果、N2f/f ＤＢマウスの筋肉では多数の遺伝子の発現が有意に変化しているが、N2-/- ＤＢマウスでは統計学的に有意に変化しているものは少なかった。このことは、Ｎｏｔｃｈ２が、機械的負荷軽減と代謝異常によって誘導される筋肉における遺伝子発現動態を主に調節していることを示している。ＨＵとＤＢの両方の条件下で、各々の対照と比較して、８つの遺伝子のみが共通に差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）として同定された。
　次いで、N2f/f マウスを用いて、ＨＵおよびＤＢ状態における一般的なＤＥＧを用いて、京都遺伝子・ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）経路解析を行った結果、図９に示すように、ＦｏｘＯシグナル伝達経路が上位ＤＥＧと関連していることを見出した。ＦｏｘＯ標的遺伝子および筋アトロゲネスを誘導するアトロゲネス遺伝子の発現を解析した結果、ＨＵおよびＤＢ条件下のN2f/f マウスの筋において、筋アトロゲネスを誘導するアトロゲネスとして知られているMuRF1、Atrogin1、Fbxo31およびMUSA1のようなユビキチン配位子と同様に、Ccng2、Cdkn1b、Rbl2およびBnip318などのＦｏｘＯ標的遺伝子の発現がアップレギュレートしていた。逆に、これらの遺伝子は、N2-/- マウスの筋では変化していなかった。
　しかしながら、筋線維特異的ＲＢＰ－Ｊ欠損マウスやＨｅｓ１欠損マウスの場合、ＨＵおよびＤＢ誘発筋萎縮に抵抗性を示さなかった。また、ＲＢＰ－Ｊをアブレーションし、筋線維にＮ２ＩＣＤを過剰発現させると、筋肉量が減少したことから、Ｎｏｔｃｈ２を強制的に活性化することで、ＲＢＰ－Ｊとは無関係に筋萎縮を引き起こす可能性が示された。これにより、標準的なＮｏｔｃｈ－ＲＢＰ－Ｊ－Ｈｅｓ／Ｈｅｙ経路により調節されるサテライト細胞とは異なり、標準的なＮｏｔｃｈ－ＲＢＰ－Ｊシグナル伝達経路はＮｏｔｃｈ２仲介筋萎縮に関与しないことが判った。これらのことから、Ｎｏｔｃｈ２が、ＲＢＰ‐Ｊ非依存的に萎縮性転写活性を支配するために、機械的および代謝的に異常な状態の両方で、筋萎縮の重要なメディエーターとして作用することが示された。
（実施例６）Ｎｏｔｃｈ２仲介筋萎縮を制御する分子の検討
　５種類の既知のＮｏｔｃｈリガンドのどのリガンドが、筋線維においてＮｏｔｃｈ２を活性化するかを検討した。成体筋肉組織における各リガンドの発現を確認したところ、Ｄｌｌ３を除く４つのリガンド（Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、Ｄｌｌ１およびＤｌｌ４）の遺伝子発現が成体筋肉組織で検出できることを確認した。
　続いて、筋線維に対するＪａｇ１、Ｊａｇ２、Ｄｌｌ１、およびＤｌｌ４の作用を評価した。これらの４つの組換えタンパク質を底面にコーティングした組織培養プレートを用い、マウスのＥＤＬ筋から新たに単離した筋線維を、無血清ＤＭＥＭ中で、それぞれのタンパク質で４８時間刺激した。結果を図１０に示す。筋線維萎縮はＤｌｌ４処理のみで誘発されたが、他のリガンドでは誘発されなかった。また、Ｄｌｌ４組換えタンパク質をコートしたプレートで２４時間培養後の遺伝子発現を解析したところ、図１１に示すように、Ｄｌｌ４刺激筋線維は、ＦｏｘＯ標的遺伝子とアトロジェンをアップレギュレートしていた。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏの萎縮モデルと一致した。
（実施例７）細胞間接触を介した筋萎縮の誘導の検討
　細胞間接触を介したＮｏｔｃｈリガンドが筋線維の萎縮を誘導できるかどうかを調べるために、ＨＥＫ２９３細胞にＤｌｌ１またはＤｌｌ４発現プラスミドベクターのいずれかをトランスフェクトし、単離した筋線維と４８時間共培養し、筋線維における発現を確認した。Ｄｌｌ１－ＧＦＰ、Ｄｌｌ４－ＧＦＰ、またはＧＦＰ（Ｃｏｎｔ．）をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のそれぞれと、ＥＤＬ筋線維を共培養した結果を図１２に示す。Ｄｌｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞との共培養では変化がなかった。また、Ｄｌｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞との共培養に比べ、Ｄｌｌ４発現ＨＥＫ２９３細胞との共培養により筋線維のサイズが顕著に減少したが、このことより、筋線維萎縮を誘発する特異的リガンドがＤｌｌ４であることがより明らかになった。
（実施例７）Ｄｌｌ４誘発筋萎縮に対するγセクレターゼ阻害剤の検討
　膜貫通型受容体であるＮｏｔｃｈは、γセクレターゼによって膜貫通ドメインが切断され、細胞内領域が核へと移行し転写因子として機能する。そこで、γセクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴを用いて、Ｄｌｌ４誘発筋線維萎縮におけるγセクレターゼ活性の影響を確認した。γ‐セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（１０μＭ）またはＰＢＳを含有する培地を用い、組換えＤｌｌ４タンパク質を予めコーティングしたプレート上で４８時間、N2f/f マウス由来のＥＤＬ筋線維を培養した。結果を図１３に示す。N2-/- 筋線維もγセクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴ）処理筋線維もＤｌｌ４刺激に対して抵抗性であった。このことにより、Ｄｌｌ４誘発筋萎縮が、Ｎｏｔｃｈ２およびγセクレターゼ活性により仲介されていることが確認された。
　次いで、機械的負荷軽減筋萎縮（ＨＵ）および代謝異常（糖尿病）誘発筋萎縮（ＤＢ）の２つの筋萎縮モデルにおけるγセクレターゼ阻害剤の効果を、野生型マウスにγ‐セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）またはトウモロコシ油（Ｃｏｎｔ）を、ＨＵ期間中あるいはＤＢ誘導期間中、隔日で腹腔内注射し、確認した。機械的負荷軽減筋萎縮（ＨＵ）モデルを用いた結果を図１４に、代謝異常（糖尿病）誘発筋萎縮（ＤＢ）モデルを用いた結果を図１５に示す。ＤＡＰＴによる処置は、ＨＵおよびＤＢのいずれのモデルにおいても、筋萎縮の有意な抑制につながることが判った。これらの結果は、Ｄｌｌ４－Ｎｏｔｃｈ２シグナル軸は、γセクレターゼ活性を介して筋萎縮を誘発することを示している。
（実施例８）Ｄｌｌ４の起源の同定
　次いで、Ｄｌｌ４リガンドの起源の同定を行った。Ｄｌｌ４リガンドが発現している部位を確認するために、成体筋肉組織由来のCD31+ 内皮細胞（内皮細胞マーカーＣＤ３１陽性ＥＣ）におけるＤｌｌ４リガンドの発現を測定し、新たに単離した筋線維と比較した。結果を図１６左図に示す。その結果、CD31+ ＥＣでは、Ｄｌｌ４遺伝子が約４００倍高発現していた。また、野生型マウスを用い、ＨＵおよびＤＢの両条件下で、ＧＡＳ筋肉由来のCD31+ 内皮細胞における、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ４、Ｊａｇ１、およびＪａｇ２）発現を測定した。結果を図１６右図に示す。ＨＵおよびＤＢのいずれの条件でも、Ｄｌｌ４はアップレギュレートされているが、他のリガンドはアップレギュレートされていないことがわかった。また、免疫組織化学的分析を行った結果、Ｄｌｌ４はアップレギュレートが確認された。結果を図１７に示す。また、免疫電子顕微鏡解析を行った。結果を図１８に示す。図１８Ａに示されるように、Ｄｌｌ４は、ＥＣの表面だけでなく、糖尿病筋組織のＥＣと筋線維の間の間質腔のコラーゲン様線維にも分布していることが明らかになった。さらに、図１８ＢおよびＣに示されるように、Ｄｌｌ４は筋線維の表面にも濃縮されていた。
　これらの結果より、ＤＢ条件下の筋肉組織において、ＥＣはＤｌｌ４をアップレギュレートして間隙に分泌し、分泌されたＤｌｌ４は、筋線維の表面に発現するＮｏｔｃｈ２受容体を選択的に活性化するであろうことが示された。
　ＥＣにおけるＤｌｌ４の発現を、イムノブロット解析により確認した。筋肉組織から単離したＥＣを、健康な血中レベル（９０ｍｇ／ｄｌ）と同様の低グルコース条件下（５ｍＭ）、および血中の糖尿病性高血糖のレベル（４５０ｍｇ／ｄｌ）を模倣した高グルコース条件下（２５ｍＭ）で培養し、上清中のＤｌｌ４を測定したところ、低グルコース条件下（５ｍＭ）よりも高グルコース条件下（２５ｍＭ）で、より高い発現レベルを示した。
（実施例９）Ｄｌｌ４の発現阻害の検討
　筋線維萎縮におけるＥＣから分泌されるＤｌｌ４の機能を以下のようにして評価した。図１９Ａに示す、トランスウエルを用いた、筋線維から単離した初代ＥＣと筋線維との共培養システムを作成した。ＥＣ由来の分泌物は、アッパーチャンバーを通過して、底面上に置かれた筋線維に到達する。初代ＥＣを、筋線維との共培養の１日前に、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔ）またはＤｌｌ４に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＤｌｌ４）でトランスフェクトし、共培養を行った。ｓｉＣｏｎｔまたはｓｉＤｌｌ４でトランスフェクトしたＥＣにおけるＤｌｌ４の発現を図１９Ｂに示す。図１９ＣおよびＤに示すように、この系では、ＥＣとの共培養で筋線維のサイズが顕著に減少したが、この筋線維萎縮はＥＣにおけるＤｌｌ４のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンによって完全に救済できることがわかった。
（実施例１０）Ｄｌｌ４の阻害の検討
　実施例９と同様の共培養系を用いて、抗Ｄｌｌ４中和抗体の効果を確認した。結果を図２０に示す。抗Ｄｌｌ４中和抗体（αＤｌｌ４）（５００ｎｇ／ｍｌ）で処理すると、共培養系における筋線維萎縮が完全に抑制された。
　以上の結果は、ＥＣ由来Ｄｌｌ４が、直接的な細胞間接触なしに、筋線維のＮｏｔｃｈ２を活性化でき、筋萎縮を誘発することを示している。
（実施例１１）抗Ｄｌｌ４抗体を用いた筋萎縮の抑制（ＨＵモデル）
　Ｄｌｌ４タンパク質に対する中和抗体を用いて、筋萎縮の抑制効果を以下のようにして検討した。野生型マウスをＨＵ条件で筋萎縮を誘導した。マウスに抗Ｄｌｌ４抗体（αＤｌｌ４）（１０ｍｇ／ｋｇ体重）または対照抗体（αＣｏｎｔ）を、ＨＵの７日間の期間中、２回腹腔内注射した（０日および４日目）。抗体を最初に投与してから７日後に、マウスを安楽死させ、解析を行った。結果を図２１および図２２に示す。αＤｌｌ４で処理すると、筋線維あたりの衛星細胞数には影響しないものの、ＨＵによって誘導されるＳＯＬ、ＰＬＡ、ＧＡＳ筋の筋肉量とＣＳＡの減少が劇的に減少することが確認された。これにより、抗Ｄｌｌ４抗体を用いて筋萎縮を抑制できることが確認された。ｄに示すように、個々の筋線維の太さは、αＤｌｌ４ ＨＵが大きかった。また、遺伝子解析に結果より、ＦｏｘＯ標的遺伝子およびＡｔｒｏｇｉｎ１を除く筋萎縮原因遺伝子（ａｔｒｏｇｅｎｅｓ）の発現量もαＤｌｌ４により抑制された。
（実施例１２）抗Ｄｌｌ４抗体を用いた筋萎縮の抑制（ＤＢモデル）
　野生型マウスＤＢ誘発筋萎縮モデルを用いて、Ｄｌｌ４タンパク質に対する中和抗体による筋萎縮の抑制効果を検討した。マウスにＳＴＺ（１５０ｍｇ／ｋｇ体重；ＤＢ）または溶媒（ｖｅｈ；クエン酸緩衝液）を注入後に、αＤｌｌ４（１０ｍｇ／ｋｇ体重）または対照抗体（αＣｏｎｔ）を、２週間にわたり、３回腹腔内投与した（ＳＴＺ投与後、３日目、７日目、および１１日目）。ＳＴＺ投与の１４日後に分析を行った。結果を図２３および図２４に示す。αＤｌｌ４に投与は、血糖値に影響を及ぼすことなく、ＤＢ誘発筋萎縮に対して強力な予防効果を示した。図２４ｄに示すように、個々の筋線維の太さは、αＤｌｌ４ ＤＢが大きかった。
（実施例１３）可溶性組換え抗Ｄｌｌ４タンパク質を用いた筋萎縮の抑制
　野生型マウスＤＢ誘発筋萎縮モデルを用いて、Ｎｏｔｃｈ受容体への内在性Ｄｌｌ４の結合を妨げる可溶性組換えＤｌｌ４－Ｆｃタンパク質による筋萎縮の抑制効果を検討した。野生型マウスにＳＴＺ（１５０ｍｇ／ｋｇ体重；ＤＢ）または溶媒（Ｖｅｈ；クエン酸緩衝液）を腹腔内に注入後、可溶型Ｄｌｌ４‐Ｆｃ組換タンパク質（ｒＤｌｌ４‐Ｆｃ）（０．５ｍｇ／ｋｇ）を１４日間かけて４回（７、９、１１、および１３日目）投与した。ＳＴＺの投与１４日後に分析を行った。対照としてＰＢＳを用いた。結果を図２５に示す。可溶性組換えＤｌｌ４－Ｆｃタンパク質の投与は、血糖値に影響を及ぼすことなくＤＢ誘発筋萎縮を減弱することを確認した。
　これらの結果より。Ｄｌｌ４蛋白質を標的とする予防・治療薬が、廃用および糖尿病状態による筋力低下のための予防・治療剤となることが確認された。ただし、内皮細胞特異的Ｄｌｌ４ノックアウトマウスを作製し、分析したところ、筋肉量がわずかに減少し、ＨＵ誘発性の筋萎縮に対する予防効果は認められなかったことから、内皮細胞におけるＤｌｌ４の適切な濃度が組織恒常性の維持に必須であることが示唆される。
（実施例１４）重症高血糖症に対する抗Ｄｌｌ４抗体の効果の確認
　マウスのＳＴＺ誘発重症高血糖症における死亡率に対する抗Ｄｌｌ４抗体（αＤｌｌ４）の効果を評価した。野生型マウスに非常に高用量のＳＴＺ（２５０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、重症高血糖症を誘発した。ＳＴＺを注入した２０匹の野生型マウスをαＤｌｌ４またはαＣｏｎｔのいずれかで処置した２群に分けた（それぞれ、１０ｍｇ／ｋｇ体重で投与）。抗体を４日ごとに腹腔内投与し、マウスが衰弱するか死亡するまで(最長５８日間)、投与を継続した。結果を図２６に示す。αＤｌｌ４群およびαＣｏｎ群はいずれも、ＳＴＺ注入後に重度の高血糖を示した（血糖値＜６００ｍｇ／ｄｌ）。死亡または安楽死は、経時的なＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットとして示した。αＣｏｎ投与マウスは寿命が短かった（約５８日）が、αＤｌｌ４を処置したマウスは、生存率が著しく高く（生存率７０％）、また筋力も高かった。この結果は、αＤｌｌ４活性の減弱は、高血糖からの全身ホメオスタシス崩壊に対する保護効果を発揮することを示している。
（実施例１５）Ｄｌｌ４阻害による筋肥大効果
　Ｄｌｌ４‐Ｎｏｔｃｈ２シグナル軸を減衰させることで、機械的過負荷による筋肥大を促進するかを検討した。野生型マウスを用い、機械的過負荷（overloading：ＯＬ）をかけることにより筋肥大を誘発させた。ＰＬＡの筋肥大は、両脚のＳＯＬとＧＡＳ筋の協働筋切除（synergistic ablation：tenotomy）によって誘発した。対照として協働筋非切除マウスを用いた。協働筋切除（tenotomy）後、2週間にわたり２回（切除後、５日目および１０日目）、αＤｌｌ４（１０ｍｇ／ｋｇ体重）またはαＣｏｎｔを腹腔内投与し、１４日目に分析した。結果を図２７に示す。ＰＬＡ筋肉の筋肉量と断面積によって測定した肥大効率は、αＣｏｎ処理マウスと比較してαＤｌｌ４処理マウスで顕著に高かった。また、ｃに示すように、個々の筋線維の太さは、αＤｌｌ４ ＯＬが大きかった。
　機械的過負荷誘導筋肥大モデルを用いて、N2-/- マウス、ＤＡＰＴ処理マウスで試験した。結果を図２８および図２９に示す。いずれの場合も、対照マウスと比較して、より容易に筋肥大を示した。
　以上の結果より、内皮Ｄｌｌ４－筋線維Ｎｏｔｃｈ２ ａｘｉｓは、筋萎縮を誘発するだけでなく、筋肥大を抑制するためにも重要であることが示された。
（実施例１６）筋肉内のＤｌｌ４の分布の確認
　免疫電子顕微鏡解析により、筋肉内のＤｌｌ４の分布を確認した。ＳＴＺ誘発ＤＢマウスモデルを用い、採取したＧＡＳ筋肉から６０マイクロメートルの厚さのビブラトーム切片を作製した。切片を、Ｄｌｌ４に対する一次抗体（１：５０）を使用して免疫組織化学染色用に一晩処理した後、１０ｎｍ－ナノゴールドヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０、ＣＲＬ）と一晩インキュベートした。その後、切片を１％ＯｓＯ４水溶液で後固定し、１．５％酢酸ウラニルで一括染色し、脱水し、エポキシ樹脂に平らに埋め込んだ。超薄切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡（Ｈ－７７００、日立）で検査した。結果を図３０に示す。Ｄｌｌ４は、ＥＣと筋線維の間の間質腔（特にコラーゲン様線維と細胞外小胞に関連する）、およびＥＣと筋線維の表面に分布していることが確認された。したがって、ＤＢ条件下の筋肉組織において、ＥＣがＤｌｌ４を抑制し、間質空間に分泌し、筋線維の表面に発現するＮｏｔｃｈ２受容体を選択的に活性化していることが示唆された。
　上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
　本発明により、新たな作用機序に基づく筋萎縮症の予防または治療剤が提供された。本発明の組成物は、筋萎縮または筋肉量低下の予防または治療または改善に有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０２１－５６４８１（出願日：２０２１年３月３０日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (11)

  1. 　Ｄｌｌ４機能阻害剤を有効成分として含有する筋萎縮症の予防または治療剤。
  2. 　前記Ｄｌｌ４機能阻害剤が阻害するＤｌｌ４は、筋組織中に存在する血管の内皮細胞において発現されるＤｌｌ４である、請求項１に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
  3. 　前記Ｄｌｌ４機能阻害剤は、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ２間の結合阻害剤である、請求項１または２に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
  4. 　前記結合阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ２に対するＤｌｌ４の結合を阻害する抗Ｄｌｌ４抗体である請求項３に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
  5. 　前記抗Ｄｌｌ４抗体は、Ｄｌｌ４のアミノ酸配列情報（ＮＰ＿０６１９４７．１）に記載のアミノ酸配列から選ばれる５～１０個のアミノ酸を認識する抗体である請求項４に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
  6. 　前記Ｄｌｌ４機能阻害剤は、Ｄｌｌ４の発現阻害剤である、請求項１または２に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
  7. 　前記Ｄｌｌ４の発現阻害剤が、Ｄｌｌ４のｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を引き起こすｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項６に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
  8. 　前記Ｄｌｌ４機能阻害剤は、Ｄｌｌ４に対するコラーゲンの結合阻害剤である請求項１または２に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
  9. 　前記筋萎縮症は、神経原性筋萎縮性疾患または筋原性筋萎縮性疾患である、請求項１～８のいずれか一つに記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
  10. 　前記筋萎縮症は、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、重症筋無力症、進行性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、ギラン・バレー症候群、および物理的な脊髄損傷による筋萎縮からなる群より選ばれる、請求項９に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
  11. 　前記筋萎縮症は、加齢性筋萎縮症（サルコペニア）、廃用性筋萎縮症、筋ジストロフィー、糖尿病性筋萎縮症、先天性ミオパチー、遠位性ミオパチー、ステロイドミオパチー、薬剤性ミオパチー、横紋筋融解症、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、進行性球脊髄性筋萎縮症、筋消耗性疾患、シャルコ・マリー・ツース病、ランバート・イートン症候群、悪液質により誘導される筋萎縮、および熱傷等にともなう筋萎縮からなる群より選ばれる、請求項９に記載の筋萎縮症の予防または治療剤。
PCT/JP2022/015725 2021-03-30 2022-03-29 筋萎縮症治療剤 WO2022210802A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023511438A JPWO2022210802A1 (ja) 2021-03-30 2022-03-29

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-056481 2021-03-30
JP2021056481 2021-03-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022210802A1 true WO2022210802A1 (ja) 2022-10-06

Family

ID=83456434

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/015725 WO2022210802A1 (ja) 2021-03-30 2022-03-29 筋萎縮症治療剤

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2022210802A1 (ja)
WO (1) WO2022210802A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013518122A (ja) * 2010-01-29 2013-05-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｄｌｌ４アンタゴニストによる自己免疫疾患の治療法
KR20140028215A (ko) * 2012-08-27 2014-03-10 한화케미칼 주식회사 신규한 이중특이성 항체 및 그의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013518122A (ja) * 2010-01-29 2013-05-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｄｌｌ４アンタゴニストによる自己免疫疾患の治療法
KR20140028215A (ko) * 2012-08-27 2014-03-10 한화케미칼 주식회사 신규한 이중특이성 항체 및 그의 용도

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUJIMAKI SHIN, MATSUMOTO TOMOHIRO, MURAMATSU MASASHI, NAGAHISA HIROSHI, HORII NAOKI, SEKO DAIKI, MASUDA SHINYA, WANG XUERUI, ASAKU: "The endothelial Dll4–muscular Notch2 axis regulates skeletal muscle mass", NATURE METABOLISM, vol. 4, no. 2, 1 February 2022 (2022-02-01), pages 180 - 189, XP055972449, DOI: 10.1038/s42255-022-00533-9 *
GERLI MATTIA FRANCESCO MARIA, MOYLE LOUISE ANNE, BENEDETTI SARA, FERRARI GIULIA, UCUNCU EKIN, RAGAZZI MARTINA, CONSTANTINOU CHRYST: "Combined Notch and PDGF Signaling Enhances Migration and Expression of Stem Cell Markers while Inducing Perivascular Cell Features in Muscle Satellite Cells", STEM CELL REPORTS, CELL PRESS, UNITED STATES, vol. 12, no. 3, 1 March 2019 (2019-03-01), United States , pages 461 - 473, XP055972445, ISSN: 2213-6711, DOI: 10.1016/j.stemcr.2019.01.007 *
LIU CHONG; LI DONGXIAO; LV CUI; GAO ZHISONG; QI YINKUANG; WU HONGRAN; TIAN YUNYUN; GUO YANSU: "Activation of the Notch Signaling Pathway and Cellular Localization of Notch Signaling Molecules in the Spinal Cord of SOD1-G93A ALS Model Mice", NEUROSCIENCE, NEW YORK, NY, US, vol. 432, 28 February 2020 (2020-02-28), US , pages 84 - 93, XP086104375, ISSN: 0306-4522, DOI: 10.1016/j.neuroscience.2020.02.034 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2022210802A1 (ja) 2022-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10894989B2 (en) Treatment of angiogenesis disorders
JP2023145784A (ja) 骨格筋ジストロフィーを治療する方法及び組成物
US20160333343A1 (en) Method of Treatment of Vascular Complications
EP2030631A1 (en) Means and methods for treating peripheral and cardiovascular diseases via modulation of arteriogenesis
WO2014122660A1 (en) Cd14 inhibitors as an effective treatment for hcv infection
KR20140103122A (ko) 신경교종을 치료하기 위한 조성물 및 방법
CN114410588A (zh) 一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用
KR20110074991A (ko) 필라델피아 염색체 양성 백혈병의 치료를 위한 피엘지에프의 억제
EP2723350B1 (en) New uses of nanog inhibitors and related methods
WO2022210802A1 (ja) 筋萎縮症治療剤
US20170020958A1 (en) Stem cells for anti-angiogenic therapy in age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, corneal vascularisation and cancer
CN115786270A (zh) 工程化的巨噬细胞及其在治疗纤维化疾病中的应用
EP3258272B1 (en) Screening method for pain-relieving substances, and pharmaceutical composition for prevention or treatment of pain
WO2017126655A1 (ja) 疼痛の予防または治療用医薬組成物およびＲｏｂｏ４を用いる疼痛抑制物質のスクリーニング方法
US20240026354A1 (en) Suppressing hippo signaling in the stem cell niche promotes skeletal muscle regeneration
CN117085132A (zh) 阻断胸膜间皮细胞cd93的活性物质及应用
WO2019101995A1 (en) Methods and pharmaceutical compositions for cardiac regeneration
US20120270922A1 (en) Antiangiogenic Agent and Method for Inhibition of Angiogenesis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22781013

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023511438

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22781013

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1