WO2022200260A1 - Verwendung von l-enantiomeren peptidliganden von nativ gefalteter humaner superoxiddismutase 1 (sod1) für die therapie von amyotropher lateralsklerose (als) - Google Patents

Verwendung von l-enantiomeren peptidliganden von nativ gefalteter humaner superoxiddismutase 1 (sod1) für die therapie von amyotropher lateralsklerose (als) Download PDF

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WO2022200260A1
WO2022200260A1 PCT/EP2022/057329 EP2022057329W WO2022200260A1 WO 2022200260 A1 WO2022200260 A1 WO 2022200260A1 EP 2022057329 W EP2022057329 W EP 2022057329W WO 2022200260 A1 WO2022200260 A1 WO 2022200260A1
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peptide
seq
sodi
peptide according
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PCT/EP2022/057329
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Dieter Willbold
Jeannine Mohrlüder
Karoline Bianka Santur
Tim Altendorf
Marc Sevenich
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a peptide comprising the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 and homologues, fragments and parts thereof, and such a peptide for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disease of the motor nervous system characterized by progressive, irreversible motor neuron loss in middle age. With an incidence of 2 per 100,000, ALS is a rare disease.
  • the clinical picture of ALS is characterized by peripheral and central paresis caused by damage or degeneration of the first and second motor neurons. In the course of the disease, after initial asymmetrical paralysis of the extremities, speech and swallowing muscles, generalization of the paresis usually occurs relatively quickly. The survival time of the patients is usually 3 to 5 years after the onset of the first symptoms. Recent findings suggest that non-neuronal cells also play a role in ALS symptoms, for example by activating inflammatory processes and/or influencing signal transduction processes.
  • SODI ubiquitously expressed SODI gene
  • the goal of causal treatment should be to stabilize the native structure of SOD1 and thus minimize the formation of toxic SODI oligomers.
  • NINDS National Institute of Neurological Disorders and Stroke
  • the existing forms of therapy are purely palliative and primarily serve to treat symptoms and maintain existing abilities.
  • Riluzole is an already approved drug that affects glutamate metabolism and extends the survival time of those affected by a few months.
  • the symptoms of the disease can be improved by the therapeutic drug edaravone. It is therefore of the utmost urgency to unveil the pathomechanism underlying the clinical picture in order to develop a drug that enables causal ALS therapy and can stop or at least significantly slow down the progression of the disease.
  • a causal and significantly life-prolonging therapy for ALS is not yet available and is urgently needed.
  • the object of the present invention was therefore the development of new chemical units which can inhibit SODI aggregation by stabilizing the native conformation and which can be used therapeutically in the treatment of ALS.
  • the chemical unit to be used in therapy or its variants should bind as affinely and specifically as possible to the native, endogenous SODI protein and thus stabilize it. The balance of misfolded and natively folded SODI conformation is thus shifted in favor of the latter. Ideally, already existing SODI oligomers and fibrils can be converted into natively folded SOD1 and thus eliminated.
  • a peptide according to claim 1 in particular by a peptide comprising the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1, and homologues, fragments and parts thereof.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 was found using an optimized phage display selection.
  • the method for phage display can of course also be used to find specific oligomer binders or even to find ligands for other species that occur in protein misfolding diseases.
  • phage display z. B a recombinant library of randomized peptide sequences presented on the gp3 protein of the M13 phage and encoded in its genome, selected against the target molecule (e.g. SOD1).
  • the gp3 molecule also known as gene product 3, is a protein that is located in the phage coat and is required for contact with the host cell.
  • the peptide sequence is advantageously presented at the N-terminus of the gp3 protein of M13 phage and is encoded in its genome.
  • the DNA sequence of the p3 gene of a selected phage is linked to the DNA sequence containing the genetic information about the corresponding peptide sequence on the gp3 molecule, allowing it to be sequenced. After sequencing, the gene sequence can be transcribed into an amino acid sequence and synthesized.
  • the entirety of the phages which present different peptides as a fusion protein with gp3 on their surface is referred to below as a phage library.
  • the corresponding peptides represent the biomolecules to be selected in the experiment.
  • So-called panning rounds can be carried out, e.g. B. three rounds.
  • the phage library is brought into contact with a fixed target molecule, also known as a bait, and binding phages are isolated from the billions of background other, non-binding phages.
  • the amount of phages that preferentially bind to oligomeric or fibrillar species of SOD1 is reduced by not offering these species as bait.
  • Phage that show an increased affinity for SODI oligomers and fibrils can be removed in this way from the phage pool, so that z.
  • the procedure can, of course, be carried out in an analogous manner be adjusted to identify SODI oligomer-binding ligands and peptides.
  • different substrate surfaces are preferably used in all panning rounds.
  • a combination of the substrate used plastic plate, in this case polystyrene with a 3D NFIS matrix which has NFIS ester as a functional group
  • the blocking or quenching agents used is defined as the substrate surface.
  • the selection pressure is successively increased.
  • the concentration of the target molecule e.g. native SOD1
  • the number of washing steps after the phage incubation is continuously increased from the 2nd round of selection in order to remove phages that do not have an affinity for SODI.
  • a different substrate surface is chosen by using different agents to block the surface (e.g., BSA, milk powder, no blocking) after the target molecule has been immobilized on the substrate.
  • BSA surface-specific antigen
  • the change between different substrate surfaces increases the specificity for the target molecule or the bait compared to the surface.
  • control selections can be carried out, which are identical to the basic selection with regard to the implementation - with the important difference that no bait is used here.
  • a data analysis of the sequences resulting from the control selections enables the identification of peptides that accumulate during the selection even without decoy and are therefore irrelevant for all subsequent steps.
  • the method is characterized by the following steps: a) Providing an immobilized bait on a substrate surface. b) contacting the baited immobilized molecule with a solution containing a library of biomolecules to be selected. c) Bringing the immobilized bait occupied with the biomolecules into contact with a washing solution. d) Separation and multiplication of the biomolecules still bound to the bait after the immobilized bait occupied with the biomolecules has been brought into contact with washing solution. e) repeating said steps using a different substrate in each repetition. f) Identification of the sequence of the biomolecules remaining on the decoys after repetition.
  • a different substrate is z. B. by changing the type of substrate and / or its blocking or non-blocking by means of possibly different reagents.
  • a molecule from the group consisting of proteins, peptides, RNA, DNA, mRNA and chemical compounds is often used as a decoy.
  • natively folded SOD1 is used as the bait.
  • z. B used a component from the group consisting of microtiter plates, magnetic particles, agarose or sepharose beads.
  • the bait according to point a) is therefore a compound to which the biomolecule to be selected is to be bound. It is fixed to a first surface (the substrate) according to methods known in the art. Proteins, peptides, RNA or DNA molecules, in particular native SOD1, can be mentioned as baits by way of example but not limitation. Microtiter plates, magnetic particles, agarose or sepharose beads can be used as possible substrates, for example. The surface with the immobilized bait can then be quenched, thereby inactivating the functional groups of the substrate. In addition, the hydrophobic free areas remaining on the substrate can be blocked with suitable agents. In the second step b), the immobilized bait is brought into contact with a randomized library of molecules, specifically biomolecules.
  • the randomized library is a mixture of very many, for example 10 12 , but also 10 4 or only 100 different biomolecules in a mixture.
  • a library can consist, for example, of peptides, proteins, DNA, RNA or mRNA, which are bound to specific vehicles and which can bind to baits. Examples of suitable vehicles are phages, polysomes or bacterial surfaces.
  • the library can consist of artificial components or components isolated from nature, or a mixture of both. For the purposes of the invention, artificially means, for example, compounds produced from oligonucleotide synthesis.
  • the immobilized bait covered with biomolecules can be brought into contact with a washing substance in step c).
  • a washing step is carried out in step c), in which a buffer solution is brought into contact with or rinsed with the immobilized baits.
  • the solution with the library of biomolecules is preferably repeatedly exchanged for a possibly similar or identical solution.
  • those library molecules are removed which dissociate less quickly from the immobilized decoys than other library molecules.
  • the speed of the detachment reaction of the binding library molecules is mainly determined by the different dissociation constants (in particular the k 0ff values) of the individual molecules.
  • the liquid containing the wash buffer is preferably aqueous and may contain a pH buffer.
  • Optional components of the solution for the washing step can be salts, detergents or reducing agents.
  • the bound biomolecules are separated from the bait.
  • the separation or elution can take place, for example, by changing the pH, heating or other changes, in particular increasing the salt concentration.
  • the separated or eluted biomolecules are then multiplied using known methods. For this purpose, for example, phage particles obtained and eluted according to steps a) to c), which carry the biomolecules on their surface, can be introduced into cells and multiplied.
  • step e the concentration of the selected biomolecules in the solution that is fed to the bait after step a) is increased.
  • 3 to 6 rounds of selection containing steps a) to e) are carried out.
  • 1 to 10 or 1 to 20 repetitions can also be carried out.
  • An increase in the washing steps in step c), which is preferably carried out, with an increasing number of cycles leads to improved selection.
  • a particularly relevant phage display provides natively folded, L-enantiomeric SOD1 in step a), a recombinant phage library carrying peptides on its surface in step b) and a buffer solution in step c) in addition to native SOD1 as bait.
  • An elution as a separation step takes place z.
  • S1VL-21 e.g. sequence variation
  • the present invention may also relate to other peptides that can be identified using the method disclosed above.
  • the peptide according to SEQ ID NO: 1 can be used as a possible drug against ALS by specific binding to the natively folded SOD1.
  • the object according to the invention is also achieved by a peptide containing homologues, fragments and parts of the amino acid sequence according to SEQ ID NO:
  • SODI peptide or SODI protein is understood here as meaning preferably the SODI peptide or SODI protein, where SOD1 stands for superoxide dismutase or superoxide dismutase 1, preferably the human one.
  • homologous sequences or “homologs” means that an amino acid sequence has an identity with one of the abovementioned amino acid sequences of the monomers of at least 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 80% and 90% are preferred.
  • identity the terms “homologous” or “homology” are used interchangeably in the present description.
  • the identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is based on comparison using the BESTFIT program calculated on the algorithm of Smith, T.F. and Waterman, M.S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) setting the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; the following parameters for nucleic acids: gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3.
  • the identity between sc Where two nucleic acid sequences or polypeptide sequences are defined by the identity of the nucleic acid sequence/polypeptide sequence over the entire sequence length in each case, as determined by comparison using the program GAP based on the algorithm of Needleman, S.B. and Wunsch, CD. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) by setting the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; and the following parameters for nucleic acids gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3.
  • Two amino acid sequences are identical for the purposes of the present invention if they have the same amino acid sequence.
  • homologues are to be understood as meaning sequences which differ from the specified sequences by up to two or three amino acids.
  • sequences which contain the above-mentioned sequences can also be used as peptides.
  • the peptide according to the invention is preferably characterized in that an acid amide group (CONH 2 - Group) or a COH group, COCI group, COBr group, CONH-alkyl residue or a CONH-alkyl-amine residue or the peptide is present in cyclized form.
  • an acid amide group CONH 2 - Group
  • COH group COCI group
  • COBr group CONH-alkyl residue
  • CONH-alkyl-amine residue or the peptide is present in cyclized form.
  • This also particularly advantageously solves the problem of providing a peptide without a negative charge at the C-terminus.
  • This has the advantageous effect that it can bind to the target molecule with higher affinity than a peptide which has a carboxyl group at the free C-terminus.
  • peptides with a free, unmodified carboxyl group have a negative charge at this end.
  • the peptides according to the invention are in the physiological state, in particular at pH 6-8, in particular 6.5-7.5, in particular at pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3 , pH 6.4, pH 6.5 pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9 or pH 8.0 modified in such a way that the C-terminus does not carry a negative charge, but instead is neutral or has one or more positive charges.
  • the peptide is characterized in that an acid amide group is present at the free C-terminus instead of the carboxyl group.
  • an acid amide group (-CONH 2 group) is arranged at the C-terminus.
  • the peptide is particularly advantageously amidated at the free C-terminus and not modified at the free N-terminus.
  • the following additional groups are present instead of the carboxyl group: COH, COCl, COBr, CONH-alkyl radical, CONH-alkyl-amine radical (positive net charge), etc., without being limited to this, if the technical teaching of the main claim is followed.
  • the affinity of the binding of the peptides modified according to the invention without a negative net charge at the C-terminus is therefore by 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, especially 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
  • the Ku value as a measure of the binding affinity of a modified peptide to the natively folded SOD1 is 1%, 2, 3, 4, 5, 6 compared to a linear binding peptide with a negative charge at the free C-terminus , 7, 8, 9, especially 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
  • the peptide according to the invention is further preferably characterized in that it contains 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more copies of the sequence with SEQ ID NO:1.
  • variants are also conceivable in which the peptide contains 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more peptides with SEQ ID NO:1.
  • Dimers of the sequences with SEQ ID NO: 1 are particularly preferred.
  • the peptide according to the invention is further preferably characterized in that the peptide consists essentially of L-amino acids.
  • the term "essentially composed of L-enantiomeric amino acids" means that the peptide used according to the invention contains at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, preferably 75%, 80%, particularly preferably 85%, 90%, 95%, in particular 96%, 97%, 98%, 99%, 100% is composed of L-enantiomeric amino acids.
  • the peptide according to the invention is also preferably characterized in that it consists of the amino acid sequence according to SEQ ID NO:1.
  • the peptide according to the invention is also preferably characterized in that the peptide is linked to another substance.
  • the linkage is a chemical bond such as that described in Römpp Chemie Lexikon, 9th edition, volume 1, page 650 et seq.
  • the substances are drugs or active ingredients, defined according to the Drugs Act ⁇ 2 or ⁇ 4 (19), as of September 2012.
  • active ingredients are therapeutically active substances that are used as medicinally active substances.
  • Anti-inflammatory drugs are preferred.
  • the substances are compounds that enhance the effect of the peptides.
  • Another alternative involves compounds that improve the solubility of the peptides and/or the passage of the blood-brain barrier.
  • the peptides according to the invention have any combination of at least two or more features of the variants, embodiments and/or alternatives described above.
  • the peptide according to the invention is also preferably characterized in that several peptides of SEQ ID NO: 1 are linked to one another covalently or non-covalently.
  • a covalent connection or linkage of the peptide units is present within the meaning of the invention if the peptides are linearly linked head to head, tail to tail or head to tail, with or without linkers or linker groups inserted in between.
  • the peptide according to the invention is also preferably characterized in that several peptides of SEQ ID NO: 1 are linked to one another without a linker, ie directly linked, or are linked to one another with a linker group.
  • a non-covalent linkage within the meaning of the invention is present if the peptides are linked to one another, for example via biotin and streptavidin, in particular streptavidin tetramer.
  • the peptide according to the invention is also preferably characterized in that several peptides of SEQ ID NO: 1 are linked to one another in a linear or branched manner.
  • the peptides can be linked to one another in a linear manner, in particular as described above.
  • the peptides are linked to one another in a branched manner to form the peptide according to the invention.
  • a branched peptide can be a dendrimer in which the peptide monomers are linked to one another covalently or non-covalently.
  • the peptides can also be linked to a platform molecule (such as PEG or sugar) to form a branched peptide.
  • a platform molecule such as PEG or sugar
  • the affinity of the binding of the peptides is defined via the dissociation constant (Ku value).
  • the dissociation constant (BRA value) of a peptide according to the invention is advantageously reduced in an advantageous embodiment of the invention. Associated with this are improved properties of the peptides according to the invention, such as higher binding affinity and higher effectiveness of the degradation and/or prevention of the formation of toxic SODI oligomers or aggregates.
  • peptides are used which bind to native SOD1 with a dissociation constant (ku value) of at most 500 pM, preferably 250, 100, 50 pM, particularly preferably 25, 10, 1 pM, particularly preferably with a dissociation constant ( Ku value) of at most 500 nM, 250, 100, 50, particularly preferably 25, 10, 1 nM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9,
  • a dissociation constant es are used which bind to native SOD1 with a dissociation constant (kra value) of at most 500 pM, preferably 250, 100, 50 pM, particularly preferably 25, 10, 1 pM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9,
  • the peptides according to the invention are also preferably characterized in that they bind to the native SOD1 with a K D of less than 20 pM.
  • the peptides can be produced, for example, via chemical synthesis or peptide synthesis.
  • Peptide according to any one of the preceding claims for preventing the formation of SODI peptide oligomers and/or SODI peptide aggregates.
  • Another variant is a peptide according to the invention for inhibiting or preventing the formation of SODI peptide oligomers and/or SODI peptide aggregates.
  • Another variant is a peptide according to the invention for the detoxification of SODI peptide oligomers and/or SODI peptide aggregates.
  • the peptides according to the invention detoxify the SODI peptide oligomers and/or SODI peptide aggregates or polymers formed therefrom, as well as fibrils, preferably by binding to natively folded SOD1 rather than to them and by shifting the equilibrium to the reduction of the SODI oligomers and thus lead to them converted into non-toxic compounds. Accordingly, the subject of the present invention is also a method for detoxifying the SODI oligomers, aggregates or fibrils formed therefrom.
  • SODI peptide oligomers and/or SODI peptide aggregates can take place in vitro or in vivo.
  • the present invention also relates to a peptide according to any one of the preceding claims for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • the S1VL-21 peptide was examined in more detail.
  • S1VL-21 exhibits micromolar binding affinity to hSODI.
  • MST measurement of CF633-hSODI (250 nM) and the peptide S1VL-21 with increasing concentration (13 nM - 210 pM) in 50 mM sodium acetate buffer pH 6 including 150 mM NaCl and 0.05% Tween-20 were performed at 25 °C with an LED and MST output of 40% on the Monolith NT.115 (Nanotemper technologies, Kunststoff, Germany).
  • a ThT assay was performed to analyze the influence of S1VL-21 on amyloid-like hSODI aggregation.
  • 5 pM native hSODI corresponds to 10 pM monomeric hSODI
  • 5 mM EDTA corresponds to 10 pM monomeric hSODI
  • 150 mM NaCl and 5 pM ThT for 15 min at 37° C incubated before the measurement of the fluorescence intensity development was started in a microtiter plate with one stainless steel ball (3.2 mm) per well.
  • Figure 3 Atomic force microscopy images of the resulting hSODI species after aggregation indicate less formation of large hSODI aggregates when incubated with S1VL-21.
  • the flea images were performed with a Nanowizard3 system (JPK Instruments AG, Berlin, Germany) with 10 pL of the samples from the ThT assay as described in Figure 2 after 65 h of aggregation. Samples were incubated on a freshly cleaved mica for 10 min at RT and then washed 4x with 100 pL ddl-hO before they were carefully dried with l ⁇ . The measurements were made with a resolution of 512 pixels at a line rate of 0.5 to 2 Hz in intermittent contact mode with a silicon cantilever with a nominal spring constant of 26 N/m and a nominal tip radius of 7 nm. The data was processed with Using the manufacturer's data processing software (JPK Data Processing Software 5.0.69). A.
  • Figure 4 Additional atomic force microscopy images of the samples from Figure 3 for an overview of the distribution of hSODI aggregates and to assess the influence of S1VL-21 on hSODI aggregation.
  • the height images were performed with a Nanowizard3 system (JPK Instruments AG, Berlin, Germany) with 10 pL of the samples from the ThT assay as described in Figure 2 after 65 h of aggregation.
  • the samples were incubated on a freshly split mica for 10 min at RT and then washed 4 ⁇ with 100 ⁇ L ddH2O before they were carefully dried with l ⁇ .
  • the measurements were made with a resolution of 256 pixels at a line rate of 2 Hz in intermittent contact mode with a silicon cantilever with a nominal spring constant of 26 N/m and a nominal tip radius of 7 nm.
  • the data was processed for comparison of the samples using the manufacturer's data processing software (JPK Data Processing Software 5.0.69) with the same parameters.
  • JPK Data Processing Software 5.0.69 JPK Data Processing Software 5.0.69
  • a cell viability assay was performed with Neuro2a cells (2500 cells/well) cultured in a microtiter plate in DMEM containing 10% FBS and 1% streptomycin and penicillin. After 6 h, the cells were treated with the pellet of the hSODI samples, which were incubated with and without increasing concentrations of S1VL-21 for 65 h under hSODI-aggregating conditions as described in FIG. For this, the samples were centrifuged at 10,000 x g for 1 h at 4 °C and the pellet was dissolved in medium and diluted 1:1. After 3 days, the cell viability was measured in a 5-fold determination using the cell proliferation kit I according to the manufacturer's instructions (Roche, Basel, Switzerland).
  • Proliferation was normalized to the mean of medium treated cells. 10% DMSO diluted in medium served as a control for the toxicity. A simple analysis of variance (one-way ANOVA) with Fisher's post-hoc test was used for the statistical evaluation (** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001).
  • the treatment of the cells with the hSODI samples in which hSODI was incubated with an increasing concentration of S1VL-21 under hSODI-aggregating conditions led to a concentration-dependent increase in cell viability compared to the non-peptide-treated hSODI sample.

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Abstract

Beschrieben wird ein Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon, sowie ein solches Peptid zur Verwendung in der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS).

Description

VERWENDUNG VON L-ENANTIOMEREN PEPTIDLIGANDEN VON NATIV GEFALTETER HUMANER SUPEROXIDDISMUTASE 1 (SOD1) FÜR DIE THERAPIE VON AMYOTROPHER LATERALSKLEROSE (ALS)
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon, sowie ein solches Peptid zur Verwendung in der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS).
Amyotrophe Lateralsklerose, kurz ALS, ist eine neurodegenerative Erkrankung des motorischen Nervensystems, die durch progressiven, irreversiblen Motoneuronenverlust im mittleren Lebensalter gekennzeichnet ist. Mit einer Inzidenz von 2 pro 100.000 gehört ALS zu den seltenen Erkrankungen. Das klinische Bild der ALS ist gekennzeichnet durch periphere und zentrale Paresen, die durch Schädigungen bzw. Degeneration der ersten und zweiten Motoneuronen bedingt sind. Im Krankheitsverlauf kommt es meist nach anfänglichen asymmetrischen Lähmungen der Extremitäten, Sprech- und Schluckmuskulatur relativ schnell zu einer Generalisierung der Parese. Die Überlebenszeit der Patienten beträgt in der Regel 3 bis 5 Jahre nach dem Auftreten der ersten Symptome. Neuere Erkenntnisse lassen vermuten, dass auch nicht-neuronale Zellen bei der ALS-Symptomatik eine Rolle spielen, indem sie z.B. inflammatorische Prozesse aktivieren und/oder Signaltransduktionsprozesse beeinflussen. Das ubiquitär exprimierte SODl-Gen (Superoxiddismutase 1) wurde bereits im Jahr 1993 mit der familiären Form von ALS in Zusammenhang gebracht und stand daher sehr früh im Fokus wissenschaftlicher Studien. Fleute werden 20% der familiären ALS-Fälle auf Mutationen im SOD1 Gen zurückgeführt, so dass SOD1 als einer der wichtigsten ätiologischen ALS-Faktoren betrachtet wird.
Verschiedene in vitro und in vivo Studien zeigten, dass nicht der Verlust der enzymatischen Funktion, sondern ein bisher nicht genau identifizierter toxischer Funktionsgewinn von SOD1 in die ALS-Pathogenese involviert ist. Mutationen innerhalb des SODl-Gens, aber auch Oxidation und Entzug der Metallionen führen zu einer drastischen Destabilisierung des SODl-Floloenzyms. Apo-SODl ohne Disulfidbrücke weist eine TM von 43 °C auf, die damit nahe an der menschlichen Körpertemperatur liegt. Es resultiert eine verstärkte Dissoziation der nativ gefalteten SODl-Flomodimere zu monomerem SOD1, welches sich zunächst zu kleinen löslichen Oligomeren und im weiteren Verlauf auch zu höheren, polymorphen Aggregaten zusammenschließt. Aktuelle Studien, bei denen fehlgefaltetes SOD1 in post-mortem Gewebe von SODl-assoziierter fALS, aber auch in nicht-SODl-assoziierter fALS, sowie in sALS-Patienten gefunden wurde, lassen vermuten, dass SODl-Fehlfaltung ein allen ALS-Pathologien gemeinsamer Prozess sein könnte. In der Vergangenheit wurde bereits mehrfach gezeigt, dass sich fehlgefaltetes SOD1 in Zellkulturen aber auch bei in vivo Studien prionartig verhält.
Aufgrund dieser Überlegungen sollte es das Ziel einer ursächlichen Behandlung sein, die native Struktur von SOD1 zu stabilisieren und somit die Bildung toxischer SODl-Oligomere zu minimieren.
Laut dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) gibt es bis heute keine kausale Therapie von ALS. Die vorhandenen Therapieformen sind rein palliativ und dienen primär der Symptombehandlung und Erhaltung noch vorhandener Fähigkeiten. Riluzol ist ein bereits zugelassenes Medikament, welches den Glutamatstoffwechsel beeinflusst und die Überlebenszeit der Betroffenen um wenige Monate verlängert. Die Krankheitssymptomatik kann durch das Therapeutikum Edaravone verbessert werden. Somit ist es von größter Dringlichkeit, den Pathomechanismus zu enthüllen, der dem Krankheitsbild zugrunde liegt, um einen Wirkstoff zu entwickeln, der eine kausale ALS-Therapie ermöglicht und den Krankheitsverlauf stoppen oder zumindest entscheidend verlangsamen kann. Zusammenfassend ist eine ursächliche und deutlich lebensverlängernde Therapie für ALS bisher nicht vorhanden und wird dringend benötigt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Entwicklung von neuen chemischen Einheiten, welche die SODl-Aggregation durch Stabilisierung der nativen Konformation inhibieren können und welche therapeutisch bei der Behandlung von ALS eingesetzt werden können.
Die in der Therapie einzusetzende chemische Einheit bzw. seine Varianten sollen möglichst affin und spezifisch an das native, endogene, SODl-Protein binden und es damit stabilisieren. Das Gleichgewicht aus fehlgefalteter und nativ gefalteter SODl-Konformation wird somit zugunsten der letzteren verschoben. So können im Idealfall bereits schon bestehende SODl-Oligomere und Fibrillen in nativ gefaltetes SOD1 umgewandelt und damit eliminiert werden.
Diese Aufgabe wurde durch ein Peptid gemäß Anspruch 1, insbesondere durch ein Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, sowie Homologe, Fragmente und Teile davon, gelöst.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Im Folgenden soll der Begriff „umfassen" auch „bestehen aus" beinhalten.
Das Peptid der SEQ ID NO: 1 wurde mit Hilfe einer optimierten Phagendisplay- Selektion gefunden.
Es sei angemerkt, dass das Verfahren zum Phagendisplay neben der hier angegebenen Selektion mit nativer SOD1 selbstverständlich auch zum Auffinden von spezifischen Oligomerbindern oder sogar zum Auffinden von Liganden gegenüber anderen bei Proteinfehlfaltungserkrankung auftretenden Spezies genutzt werden kann.
Hier war es von großer Bedeutung, das Zielmolekül hSODl in seiner nativen Konformation in die Phagendisplay Selektion einzusetzen. Hierzu zählte das Vorhandensein von einem Kupfer- und einem Zinkatom pro hSODl-Monomer, dessen Dimerisierungsstatus, sowie die Ausbildung einer intramolekularen Disulfidbrücke. Obwohl es bereits einige Veröffentlichungen zur Herstellung des Holoenzyms gab, musste die Rekonstitution von hSODl in unserem Institut weiter optimiert werden, um ausreichende Mengen in angemessener Qualität für die folgenden Versuche zu erhalten. Dies gelang uns - die optimierte Methodik führte zu signifikant erhöhten Ausbeuten des reinen Holoenzyms verknüpft mit einer stark erhöhten spezifischen Aktivität (Santur et al. 2018).
Im Phagendisplay wird z. B. eine rekombinante Bibliothek von randomisierten Peptidsequenzen, präsentiert am gp3 Protein des M13-Phagen und codiert in dessen Genom, gegen das Zielmoleküls (z. B. SOD1) selektiert. Das gp3-Molekül auch gene product 3 genannt, ist ein Protein, welches in der Hülle des Phagen sitzt und für den Kontakt mit der Wirtszelle benötigt wird.
Die Peptidsequenz wird vorteilhaft am N-Terminus des gp3-Proteins des M13- Phagen präsentiert und liegt codiert in dessen Genom vor.
Die DNA-Sequenz des p3-Gens eines selektierten Phagen ist verknüpft mit der DNA-Sequenz, die die genetische Information über die korrespondierende Peptidsequenz am gp3-Molekül enthält, wodurch diese sequenziert werden kann. Nach der Sequenzierung kann die Gensequenz in eine Aminosäuresequenz umgeschrieben und diese synthetisiert werden. Die Gesamtheit der Phagen, welche unterschiedliche Peptide als Fusionsprotein mit gp3 auf ihrer Oberfläche präsentieren wird im Folgenden als Phagenbibliothek bezeichnet. Die entsprechenden Peptide stellen die im Versuch zu selektierenden Biomoleküle dar.
Es können sogenannte panning-Runden (Selektionsrunden) durchgeführt werden, z. B. drei Runden. Dabei wird die Phagenbibliothek mit einem fixierten Zielmolekül, auch Köder genannt, in Kontakt gebracht und bindende Phagen aus dem milliardenfachen Hintergrund anderer, nicht-bindender Phagen isoliert.
Beispielhaft wird die Menge an Phagen reduziert, die bevorzugt an Oligomere oder fibrilläre Spezies von SOD1 binden, indem eben diese Spezies nicht als Köder angeboten werden. Phagen, die eine erhöhte Affinität zu SODl-Oligomeren und -Fibrillen zeigen, können auf diese Weise aus dem Phagenpool entfernt werden, so dass sich z. B. Phagen anreichern, welche spezifisch an die nativ gefaltete SOD1 binden. Das Verfahren kann selbstverständlich in analoger Weise angepasst werden, um SODl-Oligomer bindende Liganden und Peptide zu ermitteln.
Um eine Anreicherung von Plastik- oder BSA-affinen Phagen zu verringern, werden erfindungsgemäß zudem in vorzugsweise allen panning-Runden verschiedene Substratoberflächen verwendet. Als Substratoberfläche ist in diesem Fall eine Kombination aus dem verwendeten Substrat (Plastikplatte, in diesem Fall Polystyrol mit einer 3D-NFIS Matrix, welche NFIS-Ester als funktionelle Gruppe aufweist) und den verwendeten Blockierungs- bzw. Quenchingagenzien definiert. In den aufeinanderfolgenden Selektionsrunden wird sukzessive der Selektionsdruck erhöht. Dazu wird, während die Konzentration des Zielmoleküls (z. B. natives SOD1) stabil bleibt, ab der 2. Selektionsrunde kontinuierlich die Waschschrittanzahl nach der Phageninkubation erhöht, um nicht SODl-affine Phagen zu entfernen.
Des Weiteren wird in jeder Selektionsrunde des Phagendisplay eine andere Substratoberfläche gewählt, indem nach der Immobilisierung des Zielmoleküls auf dem Substrat andere Agenzien zum Blockieren der Oberfläche genutzt werden (z.B. BSA, Milchpulver, keine Blockierung). Beispielhaft kann zwischen einer zusätzlich zur Ethanolamin-behandelten BSA-blockierten Oberfläche in Runde 1, einer Milchpulver-blockierten-Oberfläche in Runde 2 und einer mit lediglich Ethanolamin-behandelten-Oberfläche in Runde 3 gewechselt werden.
Der Wechsel zwischen verschiedenen Substratoberflächen steigert die Spezifität für das Zielmolekül bzw. den Köder, gegenüber der Oberfläche. Außerdem erfolgt eine Verringerung der Liganden, die unspezifisch an Plastikoberflächen oder das Blockingagens binden.
Parallel zur eigentlichen Phagendisplayselektion können beispielhaft Kontrollselektionen durchgeführt werden, welche in Bezug auf die Durchführung mit der Flauptselektion identisch sind - mit dem wichtigen Unterschied, dass hier kein Köder eingesetzt wird. Eine Datenanalyse der Sequenzen, welche aus den Kontrollselektionen resultieren, ermöglicht die Identifizierung von Peptiden, welche sich auch ohne Köder während der Selektion anreichern und somit für alle folgenden Schritte irrelevant sind.
Das Verfahren ist gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Bereitstellen eines immobilisierten Köders auf einer Substratoberfläche. b) In Kontakt bringen des als Köder fungierenden immobilisierten Moleküls mit einer Lösung, die eine Bibliothek von zu selektierenden Biomolekülen enthält. c) In Kontakt bringen der mit den Biomolekülen besetzten immobilisierten Köder mit einer Waschlösung. d) Trennung und Vermehrung der nach dem in Kontakt bringen der mit den Biomolekülen besetzten immobilisierten Köder mit Waschlösung weiterhin an den Köder gebundenen Biomoleküle. e) Wiederholung der genannten Schritte, wobei bei jeder Wiederholung ein unterschiedliches Substrat verwendet wird. f) Identifizierung der Sequenz der nach der Wiederholung auf den Ködern verbleibenden Biomoleküle.
Ein unterschiedliches Substrat wird z. B. durch den Wechsel der Substratart und/oder dessen Blockierung oder Nichtblockierung mittels ggf. unterschiedlicher Reagenzien genutzt.
Als Köder wird häufig ein Molekül aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden, RNA, DNA, m-RNA und chemischen Verbindungen eingesetzt. Als Köder wird im vorliegenden Fall insbesondere nativ gefaltete SOD1 verwendet.
Als Oberfläche bzw. Substrat, an das der Köder immobilisiert wird, wird z. B. eine Komponente aus der Gruppe bestehend aus Mikrotiterplatten, Magnetpartikel, Agarose- oder Sepharosekügelchen eingesetzt.
Bei dem Köder nach Punkt a) handelt es sich also um eine Verbindung, an die das zu selektierende Biomolekül gebunden werden soll. Er wird nach dem Stand der Technik bekannten Methoden an eine erste Oberfläche (das Substrat) fixiert. Beispielhaft aber nicht beschränkend können als Köder Proteine, Peptide, RNA oder DNA-Moleküle genannt werden, insbesondere native SOD1. Als mögliche Substrate können beispielhaft Mikrotiterplatten, Magnetpartikel, Agarose- oder Sepharosekügelchen verwendet werden. Die Oberfläche mit dem immobilisierten Köder kann anschließend gequencht werden, wobei die funktionellen Gruppen des Substrates inaktiviert werden. Außerdem kann eine Blockierung der auf dem Substrat verbleibenden hydrophoben freien Flächen mit geeigneten Agenzien erfolgen. Im zweiten Schritt b) wird der immobilisierte Köder mit einer randomisierten Bibliothek von Molekülen - speziell Biomolekülen - in Kontakt gebracht. Diese Biomoleküle konkurrieren um die Bindung an den Köder. Bei der randomisierten Bibliothek handelt es sich um eine Mischung von sehr vielen, beispielsweise 1012, aber auch 104 oder nur 100 verschiedenen Biomolekülen in einer Mischung. Eine solche Bibliothek kann beispielsweise jeweils aus Peptiden, Proteinen, DNA, RNA oder m-RNA bestehen, welche an bestimmten Vehikeln gebunden vorliegen, und die an Köder anbinden können. Als Vehikel kommen beispielsweise Phagen, Polysomen oder Bakterienoberflächen in Betracht. Die Bibliothek kann aus artifiziellen oder aus der Natur isolierten Bestandteilen oder aus einer Mischung von beidem bestehen. Unter artifiziell im Sinne der Erfindung sind beispielsweise aus der Oligonukleotidsynthese hergestellte Verbindungen zu verstehen.
Es kann der mit Biomolekülen besetzte immobilisierte Köder in Schritt c) mit einer Waschsubstanz in Kontakt gebracht werden. Hierzu wird in Schritt c) ein Waschschritt durchgeführt, bei dem eine Pufferlösung mit den immobilisierten Ködern in Kontakt gebracht bzw. gespült wird. Dies bedeutet, dass die Lösung mit der Bibliothek von Biomolekülen vorzugsweise wiederholt durch eine ggf. ähnliche oder identische Lösung ausgetauscht wird. Somit werden diejenigen Bibliotheksmoleküle entfernt, welche weniger schnell von den immobilisierten Ködern abdissoziieren als andere Bibliotheksmoleküle. Die Schnelligkeit der Ablösungsreaktion der bindenden Bibliotheksmoleküle wird dabei hauptsächlich durch die unterschiedlichen Dissoziationskonstanten (insbesondere die k0ff-Werte) der einzelnen Moleküle bestimmt. Solche mit einem kleinen k0ff-Wert bleiben statistisch gesehen am längsten am immobilisierten Köder gebunden und haben damit eine geringere statistische Wahrscheinlichkeit, durch den Waschpuffer weggewaschen zu werden. Die den Waschpuffer enthaltene Flüssigkeit ist vorzugsweise wässrig und kann einen pH-Puffer enthalten. Fakultative Komponenten der Lösung für den Waschschritt können Salze, Detergentien oder Reduktionsmittel sein.
Vor der nachfolgenden Vermehrung der noch am Köder verbliebenen Bibliotheksmoleküle nach dem Spezifitätswaschschritt nach Schritt d) werden die gebundenen Biomoleküle vom Köder getrennt. Die Trennung bzw. Elution kann beispielsweise durch Änderung des pH-Wertes, Erhitzen oder andere Änderungen, insbesondere Erhöhung der Salzkonzentration erfolgen. Anschließend werden die getrennten bzw. eluierten Biomoleküle nach bekannten Methoden vermehrt. Hierzu können beispielsweise nach den Schritten a) bis c) gewonnene und eluierte Phagenpartikel, welche die Biomoleküle auf ihrer Oberfläche tragen, in Zellen eingebracht und vermehrt werden.
Bei Schritt e) ist die Konzentration der selektierten Biomoleküle in der Lösung, die dem Köder nach Schritt a) zugeführt wird, erhöht. Vorzugsweise werden 3 bis 6 Selektionsrunden, die die Schritte a) bis e) enthalten, durchgeführt. Es können aber auch 1 bis 10 oder 1 bis 20 Wiederholungen durchgeführt werden. Eine dabei vorzugsweise vorgenommene Erhöhung der Waschschritte in Schritt c) bei zunehmender Zyklenzahl führt zu einer verbesserten Selektion.
Ein besonders relevantes Phagendisplay sieht nativ gefaltetes, L-enantiomeres SOD1 in Schritt a) vor, eine rekombinante Phagenbibliothek, welche Peptide auf ihrer Oberfläche trägt in Schritt b) sowie eine Pufferlösung in Schritt c) neben nativem SOD1 als Köder. Eine Eluierung als Trennschritt erfolgt z. B. über pH- Wert-Erniedrigung als Trennschritt und Phagen-Amplifikation in Bakterienzellen als Vermehrung.
Auf diese Weise wurde ein L-enantiomeres Peptid, das spezifisch an natives SOD1 bindet, selektiert.
SEQ ID NO 1:
S1VL-21 (freier N-terminus, amidierter C-terminus):
YKHSWETQEKQNYVTD
Durch die Sequenzprozessierung von S1VL-21 (z.B. Sequenzvariation) besteht die Möglichkeit, weitere in der ALS-Therapie einsetzbare Substanzen zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung kann auch weitere Peptide betreffen, die mit dem vorstehend offenbarten Verfahren identifiziert werden können.
Das Peptid gemäß der SEQ ID NO: 1 kann durch die spezifische Bindung an das nativ gefaltete SOD1 als mögliches Medikament gegen ALS genutzt werden.
Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe auch durch ein Peptid enthaltend Homologe, Fragmente und Teile der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO:
1. Unter SODl-Peptid bzw. SODl-Protein wird hier bevorzugt das SODl-Peptid bzw. SODl-Protein verstanden, wobei SOD1 für Superoxiddismutase, bzw. Superoxiddismutase 1, vorzugsweise die humane, steht.
„Homologe Sequenzen" oder "Homologe" bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz eine Identität mit einer der oben genannten Amino säuresequenz der Monomere von mindestens 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% aufweist. Bevorzugt sind hierbei 80% und 90%. Anstelle des Begriffs "Identität" werden in der vorliegenden Beschreibung die Begriffe "homolog" oder "Homologie" gleichbedeutend verwendet. Die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch Vergleich mit Hilfe des Programms BESTFIT basierend auf dem Algorithmus von Smith, T. F. und Waterman, M. S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981) ) berechnet unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und folgender Parameter für Nukleinsäuren: Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen durch die Identität der Nukleinsäuresequenz/Polypeptidequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, wie sie durch Vergleich mit Hilfe des Programms GAP basierend auf dem Algorithmus von Needleman, S. B. und Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren berechnet wird: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3.
Zwei Aminosäuresequenzen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung identisch, wenn sie dieselbe Aminosäuresequenz besitzen.
Unter Homologe sind in einer Variante Sequenzen zu verstehen, die sich von den angegebenen Sequenzen um bis zu zwei oder drei Aminosäuren unterscheiden.
Ferner können als Peptide auch Sequenzen eingesetzt werden, die die oben genannten Sequenzen enthalten.
Das erfindungsgemäße Peptid ist vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass am freien C-terminus an Stelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe (CONH2- Gruppe) oder eine COH-Gruppe, COCI-Gruppe, COBr-Gruppe, CONH-alkyl-Rest oder ein CONH-alkyl-Amin-Rest vorliegt oder aber das Peptid zyklisiert vorliegt.
Dadurch wird besonders vorteilhaft zusätzlich die Aufgabe gelöst, dass ein Peptid ohne negative Ladung am C-terminus, bereitgestellt wird. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass dieses mit höherer Affinität an das Zielmolekül binden kann, als ein Peptid, welches eine Carboxylgruppe am freien C-terminus aufweist. Peptide mit freier, nichtmodifizierter Carboxylgruppe weisen im physiologischen Zustand eine negative Ladung an diesem Ende auf.
In einer Ausgestaltung der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide im physiologischen Zustand, insbesondere bei pH 6-8, insbesondere 6, 5-7, 5, insbesondere bei pH 6,0, pH 6,1, pH 6,2, pH 6,3, pH 6,4, pH 6,5 pH 6,6, pH 6,7, pH 6,8, pH 6,9, pH 7,0, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3, pH 7,4, pH 7,5, pH 7,6, pH 7,7, pH 7,8, pH 7,9 bzw. pH 8,0 derart modifiziert, dass der C-terminus keine negative Ladung trägt, sondern stattdessen neutral ist oder eine oder mehrere positive Ladungen aufweist.
In einer Ausführungsform ist das Peptid dadurch gekennzeichnet, dass am freien C-terminus an Stelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe vorliegt. Statt der Carboxylgruppe (-COOH-Gruppe) ist also eine Säureamidgruppe (-CONH2-Gruppe) am C-terminus angeordnet.
Das Peptid ist demnach besonders vorteilhaft am freien C-Terminus amidiert und am freien N-Terminus nicht modifiziert.
Dadurch wird besonders vorteilhaft die weitere Aufgabe gelöst, dass ein Peptid ohne negativen Ladungsüberschuss am C-terminus vorliegt, welches affiner an das Zielmolekül binden kann und auf einfache Weise erhältlich ist.
In einer weiteren Ausgestaltung der Offenbarung liegen folgende weitere Gruppen an Stelle der Carboxylgruppe vor: COH, COCI, COBr, CONH-alkyl-Rest, CONH-alkyl-Amin-Rest (positive Netto-Ladung) etc., wobei man hierauf nicht beschränkt, sofern der technischen Lehre des Hauptanspruchs gefolgt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist daher die Affinität der Bindung der erfindungsgemäß modifizierten Peptide ohne negative Nettoladung am C-terminus im Vergleich zu linearen Peptiden mit negativer Ladung am C-terminus aber im Übrigen gleicher Aminosäuresequenz, um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,
43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63,
64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,
85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere 100%, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116,
117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132,
133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,
149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164,
165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180,
181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196,
197, 198, 199, insbesondere 200%, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225,
226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,
242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257,
258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273,
274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289,
290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, insbesondere 300%, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318,
319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334,
335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350,
351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366,
367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382,
383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398,
399, insbesondere 400%, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427,
428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443,
444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459,
460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475,
476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491,
492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, vorteilhaft sogar 500%, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519,
520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535,
536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551,
552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567,
568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583,
584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, besonders vorteilhaft 600%, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626,
627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642,
643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658,
659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674,
675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690,
691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, besonders vorteilhaft 700%, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717,
718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733,
734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749,
750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765,
766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781,
782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797,
798, 799, ebenfalls besonders vorteilhaft 800%, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822,
823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838,
839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854,
855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870,
871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 883, 884, 885, 886,
887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, ebenfalls besonders vorteilhaft 900%, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923, 924, 925, 926,
927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942,
943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958,
959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 972, 973, 974,
975, 976, 977, 978, 979, 980, 981, 982, 983, 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990,
991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, oder sogar um 1000%, oder sogar um 10000% oder sogar um bis zu 100000% oder 1000000% erhöht, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.
Dies wird durch einen entsprechend erniedrigten Kü-Wert angezeigt. Der Kü-Wert als Maß für die Affinität der Bindung eines modifizierten Peptids an die nativ gefaltete SOD1 ist im Vergleich zu einem linearen, bindenden Peptid mit negativer Ladung am freien C-terminus, um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,
48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,
69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,
90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5%, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 bis zu 99,99 oder sogar 99,999% erniedrigt, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Kopien der Sequenz mit der SEQ ID NO: 1 enthalten.
Es sind auch Varianten denkbar, wobei das Peptid 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr Peptide mit der SEQ ID NO: 1 enthält.
Insbesondere bevorzugt sind Dimere der Sequenzen mit der SEQ ID NO: 1.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid im Wesentlichen aus L-Aminosäuren besteht.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „im Wesentlichen aus L-enantiomeren Aminosäuren", dass das erfindungsgemäß eingesetzte Peptid mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70% bevorzugt 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, 95%, insbesondere 96%, 97%, 98%, 99%, 100% aus L- enantiomeren Aminosäuren aufgebaut ist.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass es aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 besteht.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid mit einer weiteren Substanz verknüpft ist.
Bei der Verknüpfung handelt es sich im Sinne der Erfindung um eine chemische Bindung wie sie in Römpp Chemie Lexikon, 9. Auflage, Band 1, Seite 650 ff,
Georg Thieme Verlag Stuttgart definiert ist, bevorzugt um eine Hauptvalenz Bindung, insbesondere eine kovalente Bindung.
Bei den Substanzen handelt es sich in einer Variante um Arzneimittel oder Wirkstoffe, definiert gemäß Arzneimittelgesetz §2 beziehungsweise §4 (19), Stand September 2012. In einer Alternative sind Wirkstoffe therapeutisch aktive Stoffe, die als arzneilich wirksame Stoffe verwendet werden. Bevorzugt werden Entzündungshemmer eingesetzt. Bei den Substanzen handelt es sich in einer weiteren Variante um Verbindungen, die die Wirkung der Peptide verstärken.
In einer weiteren Alternative handelt es sich um Verbindungen, die die Löslichkeit der Peptide und/oder die Passage der Blut-Hirn-Schranke verbessern.
In einer Alternative haben die Peptide erfindungsgemäß jede beliebige Kombination von mindestens zwei oder mehr Merkmalen der oben beschriebenen Varianten, Ausführungen und/oder Alternativen.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1 kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.
Eine kovalente Verbindung bzw. Verknüpfung der Peptid-Einheiten liegt im Sinne der Erfindung vor, falls die Peptide Kopf an Kopf, Schwanz an Schwanz oder Kopf an Schwanz linear miteinander verknüpft werden, mit oder ohne dazwischen eingefügte Linker oder Linker-Gruppen.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1 ohne Linker, also unmittelbar miteinander verknüpft, oder mit einer Linker-Gruppe miteinander verknüpft sind.
Eine nicht kovalente Verknüpfung im Sinne der Erfindung liegt vor, falls die Peptide beispielsweise über Biotin und Streptavidin, insbesondere Streptavidin- Tetramer miteinander verknüpft sind.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1 linear oder verzweigt miteinander verknüpft sind.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung können die Peptide linear miteinander verknüpft sein, insbesondere wie oben beschrieben. In einer anderen Variante sind die Peptide verzweigt miteinander zu dem erfindungsgemäßen Peptid verknüpft. Bei einem verzweigten Peptid kann es sich erfindungsgemäß um ein Dendrimer handeln, bei dem die Peptid-Monomere kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.
Alternativ können die Peptide auch mit einem Plattform-Molekül (wie z. B. PEG oder Zucker) verknüpft sein und so ein verzweigtes Peptid bilden.
Alternativ sind auch Kombinationen dieser Optionen möglich.
In einer Ausgestaltung der Erfindung ist die Affinität der Bindung der Peptide über die Dissoziationskonstante (Kü-Wert) definiert.
Die Dissoziationskonstante (Kü-Wert) eines erfindungsgemäßen Peptids ist dabei in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung vorteilhaft erniedrigt. Damit verbunden sind verbesserte Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide, wie höhere Affinität der Bindung und höhere Effektivität des Abbaus und/oder der Verhinderung der Bildung toxischer SODl-Oligomere oder Aggregate.
In einer Variante der Erfindung werden solche Peptide eingesetzt, die an natives SOD1 mit einer Dissoziationskonstante (Kü-Wert) von höchstens 500 pM, bevorzugt 250, 100, 50 pM, besonders bevorzugt 25, 10, 1 pM, besonders bevorzugt mit einer Dissoziationskonstante (Kü-Wert) von höchstens 500 nM, 250, 100, 50, besonders bevorzugt 25, 10, 1 nM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9,
8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 pM bis sub-pM bindet, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass es mit einer KD von kleiner als 20 pM an die native SOD1 binden.
Die Peptide können beispielsweise über chemische Synthese bzw. Peptidsynthese hergestellt werden.
Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche zur Verhinderung der Bildung von SODl-Peptid-Oligomeren und/oder SODl-Peptidaggregaten. In einer weiteren Variante handelt es sich um ein erfindungsgemäßes Peptid zur Hemmung bzw. zur Verhinderung der Bildung von SODl-Peptid-Oligomeren und/oder SODl-Peptidaggregaten.
In einer weiteren Variante handelt es sich um ein erfindungsgemäßes Peptid zur Enttoxifizierung von SODl-Peptid-Oligomeren und/oder SODl-Peptidaggregaten.
Die erfindungsgemäßen Peptide enttoxifizieren die SODl-Peptid-Oligomere und/oder SODl-Peptidaggregate oder daraus gebildete Polymere, sowie Fibrillen, vorzugsweise indem sie nicht daran sondern an nativ gefaltetes SOD1 binden und durch Verschiebung des Gleichgewichts zur Reduktion der SODl-Oligomere führen und diese somit in nicht toxische Verbindungen überführen. Demgemäß ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Enttoxifizierung der SODl-Oligomere, daraus gebildeter Aggregate oder Fibrillen.
Die Hemmung bzw. zur Verhinderung der Bildung von SODl-Peptid-Oligomeren und/oder SODl-Peptid-Aggregaten, bzw. die Enttoxifizierung der SODl-Peptid- Oligomere und/oder SODl-Peptid-Aggregate kann dabei in vitro oder in vivo erfolgen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS).
Die Erfindung wird nachfolgend in nicht beschränkenden Beispielen näher erläutert.
Beispiele
Das S1VL-21-Peptid wurde näher untersucht.
Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 1 bis 5 dargestellt.
Abbildung 1: S1VL-21 weist eine mikromolare Bindungsaffinität zu hSODl auf. MST-Messung von CF633-hSODl (250 nM) und des Peptides S1VL-21 mit steigender Konzentration (13 nM - 210 pM) in 50 mM Natriumacetatpuffer pH 6 inklusive 150 mM NaCI und 0,05% Tween-20 wurden bei 25 °C mit einer LED- und MST-Leistung von 40% am Monolith NT.115 (Nanotemper technologies, München, Deutschland) durchgeführt. Zur Ableitung der Dissoziationskonstante (KD) wurden die Änderungen der normierten Fluoreszenz (Fn0rm), die hier die Änderungen in der Thermophorese repräsentieren, gegen die jeweilige Peptidkonzentration aufgetragen und unter Berücksichtigung des Thermophorese- Effekts mit Hilfe der Analysesoftware des Fierstellers (NT-analysis Software Version 1.5.41) ausgewertet. Die durchgezogene Linie repräsentiert die gefitteten Daten mit einer resultierenden Dissoziationskonstante (KD) von 5,3 ± 0,3 pM.
Abbildung 2: S1VL-21 weist einen Einfluss auf die Bildung von amyloidähnlichen hSODl-Aggregaten auf.
A. Es wurde ein ThT-Assay durchgeführt, um den Einfluss von S1VL-21 auf die amyloidähnliche hSODl-Aggregation zu analysieren. Dazu wurde 5 pM natives hSODl (entspricht 10 pM monomerer hSODl) mit und ohne steigender S1VL-21- Konzentration in 50 mM Natriumacetatpuffer pH 6 inklusive 10 mM TCEP, 5 mM EDTA, 150 mM NaCI und 5 pM ThT für 15 min bei 37 °C inkubiert bevor die Messung der Fluoreszenzintensitätsentwicklung in einer Mikrotiterplatte mit je einer Edelstahlkugel (3,2 mm) pro Vertiefung gestartet wurde. Die Fluoreszenzintensität wurde alle 15 min bei Aex = 448 nm und Aem = 482 nm gemessen, wobei vor jeder Messung die Platte für 30 s mit 400 U/min geschüttelt wurde. Die Messung erfolgte in 3- bis 5-fach Bestimmung. Die ThT- Fluoreszenzintensität wurde auf den höchsten Wert normiert und gegen die Zeit aufgetragen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichung. Die Inkubation von hSODl mit S1VL-21 unter hSODl-aggregierenden Bedingungen führte zur konzentrationsabhängigen Abnahme der ThT-Fluoreszenzemission.
B. Vergleich der in A dargestellten relativen ThT-Fluoreszenzintensitäten nach 52,5 h, wo das Fluoreszenzsignal für die Probe mit hSODl ohne Peptid maximal ist. Eine einfache Varianzanalyse (one-way ANOVA) mit Fisher-Post-hoc-Test wurde für die statistische Auswertung genutzt (** p < 0,01; *** p < 0,001). Die Inkubation von hSODl mit einem 10-fachen molaren Überschuss an S1VL-21 unter hSODl-aggregierenden Bedingungen führte zu einer signifikanten Abnahme der Fluoreszenzintensität um 90%.
Abbildung 3: Aufnahmen mittels Rasterkraftmikroskopie der resultierenden hSODl-Spezies nach Aggregation weisen auf eine geringere Bildung von großen hSODl-Aggregaten bei Inkubation mit S1VL-21.
Die Flöhenbilder wurden mit einem Nanowizard3-System (JPK Instruments AG, Berlin, Deutschland) mit 10 pL der Proben aus dem wie in Abbildung 2 beschriebenen ThT-Assay nach 65 h der Aggregation durchgeführt. Die Proben wurden auf einer frisch-gespaltenen Mica für 10 min bei RT inkubiert und anschließend 4x mit 100 pL ddl-hO gewaschen bevor diese mit l\ vorsichtig getrocknet wurden. Die Messungen erfolgten mit einer Auflösung von 512 Pixeln bei einer Zeilenrate von 0,5 bis 2 Hz im intermittierenden Kontaktmodus mit einem Silizium-Cantilever mit einer nominalen Federkonstante von 26 N/m und einem nominalen Spitzenradius von 7 nm. Die Prozessierung der Daten erfolgte mit Hilfe der Datenverarbeitungssoftware des Herstellers (JPK Data Processing Software 5.0.69). A. Aufnahmen der hSODl-Probe ohne S1VL-21 nach 65 h der Aggregation. Zu erkennen sind große, amorphe Aggregate. B. Aufnahmen der hSODl-Probe, bei der hSODl mit einem 10-fachen molaren Überschuss an S1VL- 21 während der Aggregation inkubiert wurde. Es wurden nur wenige Bereiche gefunden, die einige größere Aggregate enthielten, die jedoch nicht nur in der Menge, sondern auch in ihrer Größe im Vergleich zur hSODl-Probe ohne Peptid deutlich reduziert waren. C. Aufnahmen der Kontrollprobe mit S1VL-21 ohne hSODl. Es wurden vereinzelt Artefakte gefunden.
Abbildung 4: Weitere rasterkraftmikroskopische Aufnahmen der Proben aus Abbildung 3 für einen Überblick der Verteilung der hSODl-Aggregate und zur Beurteilung des Einflusses von S1VL-21 auf die hSODl-Aggregation.
Die Höhenbilder wurden mit einem Nanowizard3-System (JPK Instruments AG, Berlin, Deutschland) mit 10 pL der Proben aus dem wie in Abbildung 2 beschriebenen ThT-Assay nach 65 h der Aggregation durchgeführt. Die Proben wurden auf einer frisch-gespaltenen Mica für 10 min bei RT inkubiert und anschließend 4x mit 100 pL ddHzO gewaschen bevor diese mit l\ vorsichtig getrocknet wurden. Die Messungen erfolgten mit einer Auflösung von 256 Pixeln bei einer Zeilenrate von 2 Hz im intermittierenden Kontaktmodus mit einem Silizium-Cantilever mit einer nominalen Federkonstante von 26 N/m und einem nominalen Spitzenradius von 7 nm. Für einen Vergleich der Proben erfolgte die Prozessierung der Daten mit Hilfe der Datenverarbeitungssoftware des Herstellers (JPK Data Processing Software 5.0.69) mit den gleichen Parametern. A. Aufnahmen der hSODl-Probe ohne S1VL-21 nach 65 h der Aggregation. Zu erkennen sind in allen Messbereichen mehrere, große Ablagerungen, die aggregiertes hSODl enthalten. B. Aufnahmen der hSODl-Probe, bei der hSODl mit einem 10-fachen molaren Überschuss an S1VL-21 unter hSODl- aggregierenden Bedingungen inkubiert wurde. Im Vergleich zu den Aufnahmen ohne S1VL-21 in A sind hier deutlich weniger größere Ablagerungen zu sehen. C. Aufnahmen der Kontrollprobe mit S1VL-21 ohne hSODl. Es wurden vereinzelt Artefakte gefunden. Abbildung 5: Die Inkubation von hSODl mit S1VL-21 während der Aggregation führte zu für Neuro2a-Zellen signifikant geringer toxischen hSODl-Spezies im Vergleich zu nicht-peptidbehandelten hSODl-Aggregaten.
Ein Zellviabil itätsassay wurde mit Neuro2a-Zellen (2500 Zellen/Vertiefung) durchgeführt, die in einer Mikrotiterplatte in DMEM mit 10% FBS und 1% Streptomycin und Penicillin kultiviert wurden. Nach 6 h wurden die Zellen mit dem Pellet der hSODl-Proben behandelt, die mit und ohne steigender Konzentration an S1VL-21 für 65 h unter hSODl-aggregierenden Bedingungen wie in Abbildung 2 beschrieben inkubiert wurden. Dazu wurden die Proben bei 10000 x g für 1 h bei 4 °C zentrifugiert und das Pellet wurde in Medium gelöst und 1: 1 verdünnt. Nach 3 Tagen wurde die Zel Iviabi lität mit dem Zellproliferationskit I entsprechend den Anweisungen des Herstellers (Roche, Basel, Schweiz) in einer 5-fach Bestimmung gemessen. Die Proliferation wurde auf den Mittelwert der mit Medium behandelten Zellen normiert. Als Kontrolle für die Toxizität diente 10% in Medium verdünntes DMSO. Eine einfache Varianzanalyse (one-way ANOVA) mit Fisher-Post-hoc-Test wurde für die statistische Auswertung genutzt (** p < 0,01; *** p < 0,001). Die Behandlung der Zellen mit den hSODl-Proben, bei denen hSODl mit steigender Konzentration an S1VL-21 unter hSODl-aggregierenden Bedingungen inkubiert wurde, führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Zel Iviabi lität im Vergleich zur nicht- peptidbehandelten hSODl-Probe.

Claims

Ansprüche
1. Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, sowie Homologe, Fragmente und Teile davon.
2. Peptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder Homologe mit einer Identität von mindestens 80% davon umfasst.
3. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass am freien C-terminus an Stelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe (CONH2-Gruppe) oder eine COH-Gruppe, COCI-Gruppe, COBr- Gruppe, CONH-alkyl-Rest oder ein CONH-alkyl-Amin-Rest vorliegt oder aber das Peptid zyklisiert vorliegt. Alternativ kann am C-terminus ein Arginin vorliegen, welches bei neutralem pH ebenfalls eine positive Ladung trägt.
4. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Kopien der Sequenz mit der SEQ ID NO: 1 enthält.
5. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid im Wesentlichen aus L-Aminosäuren besteht. Homologe Sequenzen können aus D-enantiomeren Aminosäuren aufgebaut sein.
6. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:
1 oder der inversen Sequenz besteht.
7. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid mit einer weiteren Substanz verknüpft ist.
8. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1 kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.
9. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1 ohne Linker, also unmittelbar miteinander verknüpft, oder mit einer Linker-Gruppe miteinander verknüpft sind.
10. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1 linear oder verzweigt miteinander verknüpft sind.
11. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Dendrimer handelt, wobei Peptide der SEQ ID NO: 1 mit einem Plattform-Molekül verknüpft sind.
12. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einer KD von kleiner als 20 pM an das SODl-Peptid binden.
13. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche zur Verhinderung der Bildung von SODl-Peptid-Oligomeren und/oder SODl-Peptid-Aggregaten.
14. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche zur Enttoxifizierung von SODl-Peptid-Oligomeren und/oder SODl-Peptid-Aggregaten.
15. Peptid gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS).
PCT/EP2022/057329 2021-03-22 2022-03-21 Verwendung von l-enantiomeren peptidliganden von nativ gefalteter humaner superoxiddismutase 1 (sod1) für die therapie von amyotropher lateralsklerose (als) WO2022200260A1 (de)

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WO2017115367A1 (en) * 2015-12-28 2017-07-06 The National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd. Composition and method for treating amyotrophic lateral sclerosis

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