WO2022196236A1 - 抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤及び抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の製造のための化合物の使用 - Google Patents

抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤及び抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の製造のための化合物の使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2022196236A1
WO2022196236A1 PCT/JP2022/006422 JP2022006422W WO2022196236A1 WO 2022196236 A1 WO2022196236 A1 WO 2022196236A1 JP 2022006422 W JP2022006422 W JP 2022006422W WO 2022196236 A1 WO2022196236 A1 WO 2022196236A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
influenza virus
formula
compound
modified
resistant influenza
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/006422
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
正徳 池田
緑 武田
佳洲 李
Original Assignee
国立大学法人 鹿児島大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人 鹿児島大学 filed Critical 国立大学法人 鹿児島大学
Priority to JP2023506890A priority Critical patent/JPWO2022196236A1/ja
Publication of WO2022196236A1 publication Critical patent/WO2022196236A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses

Definitions

  • the present invention relates to the use of anti-drug resistant influenza virus agents and compounds for the production of anti-drug resistant influenza virus agents.
  • a neuraminidase inhibitor and a cap-dependent endonuclease inhibitor have been developed for seasonal influenza viruses.
  • Baloxavir (trade name: Xofluza), a cap-dependent endonuclease inhibitor, has stronger antiviral activity than neuraminidase inhibitors, but the emergence of baloxavir-resistant influenza viruses has become a problem.
  • Favipiravir (trade name: Avigan), a nucleic acid analog preparation, is not approved for seasonal influenza because it has teratogenicity, but is approved only for new influenza.
  • Patent Document 1 discloses that inhibitors of dihydroorotate oxidase (DHODH), which is involved in pyrimidine synthesis, exhibit antiviral activity against influenza virus.
  • DHODH dihydroorotate oxidase
  • the influenza virus for which the antiviral activity of DHODH inhibitors is being studied in Patent Document 1 is the H7N7 subtype.
  • the H7N7 subtype mainly infects birds, and spreads very little in humans. It is important to develop drugs that are effective against influenza viruses such as H1N1 subtypes that spread in humans, especially against influenza viruses that are resistant to drugs such as baloxavir.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and the use of an anti-drug resistant influenza virus agent that exhibits high antiviral activity against drug-resistant influenza viruses and a compound for producing the anti-drug resistant influenza virus agent. intended to provide
  • the anti-drug resistant influenza virus agent according to the first aspect of the present invention is A compound represented by the following formula (1), a pharmacologically acceptable salt thereof, an ester-modified, phosphoric acid- or sulfuric acid-modified hydroxyl group of the compound of formula (1), or a carboxyl group of the compound of formula (1) or an imine, amide or urea modification of the amino group of the compound of formula (1).
  • X represents a hydrogen atom or a halogen atom.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent according to the first aspect of the present invention is used against influenza viruses with mutations in the polymerase acidic subunit, You can do it.
  • the isoleucine located at the 38th position from the N-terminus in the amino acid sequence of the polymerase acidic subunit of the influenza virus is replaced with threonine. You can do it.
  • influenza virus is of the H1N1 subtype; You can do it.
  • X in the formula (1) is a fluorine atom, You can do it.
  • X represents a hydrogen atom or a halogen atom.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent according to the present invention exhibits high antiviral activity even against drug-resistant influenza viruses.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing the principle of reporter assay used in Examples.
  • FIG. FIG. 3 is a diagram showing the relationship between each protein of the influenza virus RNA replication complex and luciferase activity in the reporter assay used in Examples.
  • 2 is a diagram showing luciferase activity of existing drugs in Test Example 2.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram showing luciferase activity in a PA-introduced reporter assay of baloxavir-resistant mutants in Test Example 3.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram showing luciferase activity when wild-type PA was introduced in Test Example 4.
  • FIG. (A), (B) and (C) show results for baloxavir, favipiravir and vidfludimus, respectively.
  • FIG. 10 is a diagram showing luciferase activity when PA of a baloxavir-resistant mutant in Test Example 4 was introduced.
  • (A), (B) and (C) show results for baloxavir, favipiravir and vidfludimus, respectively.
  • FIG. 10 shows cytotoxicity in Test Example 5.
  • FIG. (A), (B) and (C) show results for baloxavir, favipiravir and vidfludimus, respectively.
  • FIG. 10 is a diagram showing the luciferase activity of each drug when wild-type PA was introduced in Test Example 6.
  • FIG. 10 shows the luciferase activity of each drug when the PA of the baloxavir-resistant mutant strain in Test Example 6 was introduced.
  • FIG. 10 shows the luciferase activity of BAY2402234 and bidofrudimus when wild-type PA was introduced in Test Example 7.
  • An anti-drug resistant influenza virus agent according to the present embodiment contains a compound represented by the following formula (1).
  • X represents a hydrogen atom or a halogen atom.
  • Halogen atoms include, for example, fluorine atom (F), chlorine atom (Cl), bromine (Br) and iodine (I).
  • X is a fluorine atom.
  • the above compound is bidofrudimus (2-[[(3-fluoro-3′-methoxy[1,1′-biphenyl]-4-yl)amino]carbonyl]-1-cyclopentene-1- carboxylic acid).
  • the compound contained as an active ingredient in the drug-resistant influenza virus agent according to the present embodiment is a pharmacologically acceptable compound represented by the above formula (1) as long as it exhibits antiviral activity against drug-resistant influenza viruses. or a modified form of the compound of formula (1).
  • modifications include ester-modified, phosphoric acid- and sulfuric acid-modified compounds of the hydroxyl group of the compound of formula (1), ester-modified and amide-modified carboxyl groups of the compound of formula (1), and Imine-modified, amide-modified and urea-modified amino groups of compounds are exemplified.
  • the pharmacologically acceptable salt of the compound represented by formula (1) above is not particularly limited as long as it is pharmacologically acceptable and exhibits antiviral activity against drug-resistant influenza viruses.
  • Salts of the compound include, for example, alkali metal salts and alkaline earth metal salts.
  • alkali metal salts include lithium salts, sodium salts and potassium salts
  • alkaline earth metal salts include magnesium salts and calcium salts.
  • the above compounds, salts thereof, and modified forms thereof, which are contained as active ingredients in the drug-resistant influenza virus agent according to the present embodiment may be collectively referred to as "compounds and the like.”
  • Antiviral activity means activity that reduces the infectivity, proliferation ability, or immune evasion ability of influenza viruses.
  • Antiviral activity in the present embodiment particularly means activity to reduce the ability of influenza virus to proliferate.
  • the growth ability of a virus includes the ability to synthesize viral particle constituent proteins, the ability to form viral particles, or the ability to replicate viral genes in a host cell, and particularly means the ability to replicate viral genes.
  • antiviral activity means, for example, the activity of inhibiting viral proteins and suppressing the formation of mature viral particles in host cells.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent according to the present embodiment inhibits RNA replication of influenza virus.
  • the viral proteins mentioned above are, in particular, proteins that are essential for the replication of viral genes.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent according to the present embodiment can be used against any of type A, B, C and D influenza viruses, preferably type A and B, particularly preferably is used against influenza A viruses.
  • the subtype of influenza virus is also not particularly limited, and for example, anti-drug resistant influenza virus agents are used against influenza viruses such as H1N1 and H3N2 subtypes.
  • the drug-resistant influenza virus agent according to the present embodiment is used against H1N1 subtype influenza virus.
  • the antidrug-resistant influenza virus agent according to this embodiment is effective against drug-resistant influenza viruses.
  • Drug-resistant influenza viruses have mutations in the polymerase acidic subunit (PA) that constitutes the RNA replication complex. This reduces the antiviral activity of cap-dependent endonuclease inhibitors such as baloxavir.
  • PA polymerase acidic subunit
  • influenza viruses use the cap structure cleaved from the host's mRNA to synthesize plus-strand viral mRNA from minus-strand RNA by the RNA replication complex.
  • the RNA replication complex is composed of PB1, PB2 and PA.
  • PA has a cap-dependent endonuclease activity that cleaves the cap structure from host mRNA.
  • a drug-resistant strain of H1N1 subtype influenza virus has a mutation (I38T , I38M or I38F). That is, drug-resistant strains of influenza virus have mutations corresponding to I38T, I38M, or I38F in the PA gene that encodes PA.
  • Anti-drug resistant influenza virus agents may be used against influenza viruses with I38T, I38M or I38F mutations in PA.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent is used against influenza viruses having the I38T mutation in PA.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent according to the present embodiment does not have mutations such as I38T, and is also effective for influenza viruses that have not acquired drug resistance.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent according to the present embodiment is produced by a known method, and contains 0.000001 to 99.9% by weight, 0.00001 to 99.8% by weight, and 0.0001 to 99% by weight of the active ingredient. 7% by weight, 0.001-99.6% by weight, 0.01-99.5% by weight, 0.1-99% by weight, 0.5-60% by weight, 1-50% by weight or 1-20% by weight % compounds, etc.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent may be a solid formulation or a liquid formulation.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent may contain any pharmacologically acceptable ingredient in addition to the compound.
  • Optional ingredients include, for example, carriers, excipients, lubricants, binders, disintegrants, solvents, solubilizers, suspending agents, tonicity agents, buffers and soothing agents. Additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents and sweeteners may be added to the anticancer activity enhancer, if necessary.
  • the dose of the anti-drug resistant influenza virus agent according to the present embodiment is appropriately determined according to the sex, age, weight, symptoms, etc. of the subject.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent is administered so that the compound or the like is in an effective amount.
  • An effective amount is an amount of a compound or the like necessary to obtain a desired result, and is an amount that suppresses the growth of influenza virus or delays, inhibits, prevents, reverses or cures the progression of symptoms due to infection with influenza virus. is the amount required for
  • the dosage of the anti-drug resistant influenza virus agent is, for example, 0.01 mg/kg to 1000 mg/kg, preferably 0.1 mg/kg to 200 mg/kg, more preferably 0.2 mg/kg to 20 mg/kg, It can be administered in one or more divided doses per day.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent is administered 1 to 4 times a day.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent may be administered at various dosing frequencies such as daily, every other day, once a week, every other week and once a month. Amounts outside the above ranges can also be used, if desired.
  • Anti-drug resistant influenza virus agents may be administered, for example, parenterally or orally.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, transdermal administration, nasal administration, pulmonary administration, enteral administration, transmucosal administration, and the like may be used.
  • Anti-drug resistant influenza virus agents may be administered via infusion.
  • anti-drug resistant influenza virus agent can be formulated in any form.
  • anti-drug resistant influenza virus agents are tablets such as sugar-coated tablets, buccal tablets, coated tablets and chewable tablets, troches, pills, powders and capsules including soft capsules, granules, suspensions, emulsions and Syrups, including dry syrups, and liquids such as elixirs may also be used.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent may be injections, inhalants, percutaneous absorption tapes, aerosols, suppositories, and the like.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent is administered to any subject as long as the subject is infected with the influenza virus.
  • vertebrate animals are preferable, and mammals are more preferable, as subjects to which the anti-drug resistant influenza virus agent is administered.
  • Mammals include, for example, humans, chimpanzees and other primates, pigs and horses, as well as birds such as ducks and chickens.
  • a particularly preferred administration subject is a human.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent according to the present embodiment is preferably administered to a subject infected with a baloxavir-resistant influenza virus having an I38T mutation, or a subject who has developed an infectious disease due to the infection.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent may be administered to a subject infected with an influenza virus that has not acquired drug resistance or to a subject who has developed an infectious disease due to the infection.
  • Infectious diseases in humans caused by influenza virus infection include fever of 37°C or higher, especially 38°C or higher, systemic symptoms such as general malaise and anorexia, respiratory symptoms such as cough, sore throat and runny nose, and lumbago. , gastrointestinal symptoms such as nausea and vomiting.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent according to the present embodiment may be prophylactically administered to a subject in whom influenza virus has been detected, during a period in which there are no clear symptoms or during the incubation period after infection.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent according to the present embodiment exhibits high antiviral activity against influenza viruses regardless of the presence or absence of drug resistance.
  • the anti-drug resistant influenza virus agent according to this embodiment has high antiviral activity and high safety.
  • use of the above-mentioned compounds, etc. for the production of anti-drug resistant influenza virus agents is provided.
  • methods of treating, ameliorating or preventing drug-resistant influenza virus infection are provided. The method includes the step of administering a compound or the like described above to a subject.
  • Viral protein expression plasmids were constructed as follows. Genes encoding RNA replication complexes (PB1, PB2, PA) and nucleoprotein (NP) were artificially synthesized based on the genetic information of the A/WSN/1933 (H1N1) strain. Each gene was introduced into pCX4bsr vector (GenBank ID: AB086384) with Pol-II promoter (CMV) (pCX4bsr/PB1, pCX4bsr/PB2, pCX4bsr/PA, pCX4bsr/NP). The nucleotide sequences of genes encoding NP, PA, PB1 and PB2 are shown in SEQ ID NOS: 1-4, respectively.
  • vRNA secretory luciferase
  • FIG. 1 A vRNA (viral RNA) having the configuration shown in FIG. 1 in which NP was replaced with secNLuc was artificially synthesized based on the genetic information of the H1N1 strain, and introduced into the pUC57 vector (GenBank ID: Y14837) (pUC57/WSN33/vsecNLucPoll 250Rz).
  • pUC57 vector GenBank ID: Y14837
  • pUC57/WSN33/vsecNLucPoll 250Rz pUC57/WSN33/vsecNLucPoll 250Rz.
  • NP 5'UTR
  • NP 3'UTR
  • this expression vector synthesizes the secNLuc minus strand gene by the host's DNA polymerase (Pol-I) in the cell into which it was first introduced.
  • a secNLuc plus-strand gene mRNA
  • RNA replication complex from the secNLuc minus-strand gene in which the 3'UTR end of the minus-strand is cleaved by hepatitis D virus (HDV) ribozyme (Rz).
  • HDV hepatitis D virus
  • Rz hepatitis D virus
  • the influenza virus replication complex specifically recognizes and binds to the 3'UTR of influenza virus.
  • SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence in which the DNA corresponding to vRNA in Fig. 1 is described in the 5' to 3' direction. Counting from the 5' end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, the 1st to 250th base sequences, the 251st to 873rd base sequences, the 874th to 918th base sequences, the 919th to 1005th base sequences and 1006
  • the base sequences from positions 1044 to 1044 correspond to the base sequences of Pol I promoter (hPol Ip), 5′UTR (NP), secNLuc, 3′UTR (NP), Rz and mPolT, respectively.
  • influenza virus polymerase is a replication complex composed of PB1, PB2 and PA.
  • NP a structural protein, binds to RNA and contributes to its stability. Therefore, which of these four types of proteins is necessary for secNLuc activity was examined as follows.
  • Human embryonic kidney cell line HEK293 cells were seeded in a 24-well plate at 4 ⁇ 10 4 cells/well. After 24 hours, 0.2 ⁇ g of each plasmid (pCX4bsr/PB1, PB2, PA, NP, pUC57/WSN33/vsecNLucPoll 250Rz) was introduced into the cells using Fugene HD reagent (manufactured by Promega). After culturing for 48 hours, the culture supernatant was collected and luciferase activity was measured using Nano-Glo Luciferase Assay System (manufactured by Promega). The secNLuc activity when all of the four types of protein expression vectors constructed above were introduced into cells and the secNLuc activity when one of the four types was removed were compared.
  • Test Example 2 Evaluation of existing drugs
  • baloxavir a cap-dependent endonuclease inhibitor
  • oseltamivir a neuraminidase inhibitor
  • HEK293 cells were seeded in 24-well plates at 4 ⁇ 10 4 cells/well. After 24 hours, 0.2 ⁇ g of each plasmid (pCX4bsr/PB1, PB2, PA, NP, pUC57/WSN33/vsecNLucPoll 250Rz) was introduced into the cells using Fugene HD reagent. After 24 hours, anti-influenza drugs were added to the medium to a concentration of 10 ⁇ M. After culturing for 24 hours, the culture supernatant was collected, and luciferase activity was measured in the same manner as in Test Example 1.
  • a baloxavir-resistant mutation is a mutation in which isoleucine located at position 38 from the N-terminus of the PA amino acid sequence is substituted with threonine.
  • QuikChange Mutagenesis manufactured by Stratagene
  • the codon (ata) corresponding to isoleucine located at the 38th position from the N-terminus of the PA amino acid sequence was replaced with the codon (aca) corresponding to threonine, resulting in pCX4bsr/PA mt. It was constructed.
  • HEK293 cells were seeded in 24-well plates at 4 ⁇ 10 4 cells/well. After 24 hours, 0.2 ⁇ g of each plasmid (pCX4bsr/PB1, PB2, PA or PA mt (PA I38T), NP, pUC57/WSN33/vsecNLucPoll 250Rz) was introduced into the cells using Fugene HD reagent. After 24 hours, baloxavir was added to the medium to a concentration of 1 ⁇ M. After culturing for 24 hours, the culture supernatant was collected, and luciferase activity was measured in the same manner as in Test Example 1.
  • Test Example 4 Evaluation of antiviral activity against wild-type and mutant influenza viruses
  • pCX4bsr/PA or PA mt-introduced HEK293 cells were used to measure the luciferase activities of baloxavir, favipiravir, and vidfludimus at given concentrations.
  • Bidofludimus is a compound that has shown inhibition of luciferase activity by screening approximately 1500 compounds using this assay.
  • FIG. 5 shows luciferase activity when wild-type PA was introduced. Both drugs inhibited luciferase activity in a dose-dependent manner.
  • baloxavir inhibited luciferase activity to a greater extent than favipiravir and vidofrudimus shown in Figures 5(B) and 5(C), respectively.
  • FIG. 6 shows luciferase activity when mutant PA is introduced. Both drugs inhibited luciferase activity in a dose-dependent manner.
  • bidofrudimus inhibited luciferase activity more than baloxavir and favipiravir shown in FIGS. 6(A) and 6(B), respectively.
  • the EC 50 of bidfludimus when wild-type PA was introduced was 1.75 ⁇ M, whereas the EC 50 of bidfludimus when mutant-PA was introduced was 2.60 ⁇ M, showing no significant difference.
  • HEK293 cells were seeded at 5 ⁇ 10 3 in 96-well plates. After 24 hours of culture, the indicated concentrations of baloxavir, favipiravir or vidfludimus were added to the medium. After culturing for 24 hours, 10 ⁇ L of Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System (manufactured by Takara Bio Inc.) was added to the medium, cultured at 37° C. for 2 hours, and absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader.
  • Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System manufactured by Takara Bio Inc.
  • Figures 7(A), (B) and (C) show the cell viability of baloxavir, favipiravir and vidofrudimus, respectively.
  • the CC50s of baloxavir, favipiravir and vidofrudimus were 344.68 ⁇ M, >400 ⁇ M and 137.68 ⁇ M, respectively.
  • FIG. 8 shows the luciferase activity of wild-type PA-introduced HEK293 cells when the concentrations of baloxavir, favipravir, and vidofrudimus are the Cmax concentrations of each. Inhibition of luciferase activity by baloxavir, favipravir and vidofrudimus was 89%, 60% and 87%, respectively.
  • the antiviral activity of bidfludimus in wild-type is similar to that of baloxavir and appears to be stronger than that of favipravir.
  • FIG. 9 shows the luciferase activity of mutant PA-introduced HEK293 cells in which the concentrations of baloxavir, favipravir, and vidofrudimus are the respective Cmax concentrations. Inhibition of luciferase activity by baloxavir, favipravir and vidofrudimus was 40%, 41% and 79%, respectively. Bidofludimus is believed to exhibit stronger antiviral activity than baloxavir and favipravir in terms of C max against mutant influenza viruses.
  • Bidofludimus is known to suppress pyrimidine production by inhibiting DHODH. Therefore, we examined whether there is a correlation between the DHODH inhibitory activity and the antiviral activity against influenza virus.
  • Bidofludimus has a DHODH inhibitory concentration IC50 of 134 nM, while BAY2402234 has a DHODH inhibitory concentration IC50 of 1.2 nM, which is about 100 times more active. If DHODH inhibitory activity correlates with antiviral activity, BAY2402234 should inhibit luciferase activity more strongly than bidofrudimus. Therefore, the antiviral activity against wild-type influenza virus was evaluated in the same manner as in Test Example 4 when cells were treated with 10 ⁇ M BAY2402234 or vidofrudimus.
  • the present invention is useful for treating influenza virus infections.

Abstract

抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、下記式（１）に示す化合物、その薬理学的に許容される塩、式（１）の化合物の水酸基のエステル修飾体、リン酸修飾体若しくは硫酸修飾体、式（１）の化合物のカルボキシ基のエステル修飾体若しくはアミド修飾体、又は式（１）の化合物のアミノ基のイミン修飾体、アミド修飾体若しくは尿素修飾体を含む。下記式（１）においてＸは水素原子又はハロゲン原子を表す。

Description

抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤及び抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の製造のための化合物の使用
　本発明は、抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤及び抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の製造のための化合物の使用に関する。
　季節性のインフルエンザウイルスに対してはノイラミニダーゼ阻害剤とキャップ依存性エンドヌクレアーゼ阻害剤が開発されている。キャップ依存性エンドヌクレアーゼ阻害剤であるバロキサビル（商品名：ゾフルーザ）はノイラミニダーゼ阻害剤よりも強い抗ウイルス活性を有するが、バロキサビルに耐性を有するインフルエンザウイルスの出現が問題となっている。
　核酸アナログ製剤であるファビピラビル（商品名：アビガン）は、催奇形性を有するため季節性インフルエンザには承認されておらず、新型インフルエンザに限定で承認されている。
　特許文献１には、ピリミジンの合成に関与するジヒドロオロト酸オキシダーゼ（ＤＨＯＤＨ）の阻害剤がインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性を示すことが開示されている。
国際公開第２０１０／１２８０５０号
　特許文献１でＤＨＯＤＨ阻害剤の抗ウイルス活性が検討されているインフルエンザウイルスはＨ７Ｎ７亜型である。Ｈ７Ｎ７亜型は主に鳥での感染がみられ、ヒトでは感染がほとんど拡大しない。ヒトで感染が拡大するＨ１Ｎ１亜型等のインフルエンザウイルス、特にはバロキサビル等の薬剤に耐性を有するインフルエンザウイルスに有効な薬剤の開発が重要である。
　本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであり、薬剤耐性を有するインフルエンザウイルスにも高い抗ウイルス活性を示す抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤及び抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の製造のための化合物の使用を提供することを目的とする。
　本発明の第１の観点に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、
　下記式（１）に示す化合物、その薬理学的に許容される塩、式（１）の化合物の水酸基のエステル修飾体、リン酸修飾体若しくは硫酸修飾体、式（１）の化合物のカルボキシ基のエステル修飾体若しくはアミド修飾体、又は式（１）の化合物のアミノ基のイミン修飾体、アミド修飾体若しくは尿素修飾体を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　［式（１）においてＸは水素原子又はハロゲン原子を表す。］
　上記本発明の第１の観点に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、
　ポリメラーゼ酸性サブユニットに変異を有するインフルエンザウイルスに対して使用される、
　こととしてもよい。
　この場合、前記インフルエンザウイルスの前記ポリメラーゼ酸性サブユニットのアミノ酸配列におけるＮ末端から３８番目に位置するイソロイシンがトレオニンに置換されている、
　こととしてもよい。
　また、前記インフルエンザウイルスは、
　Ｈ１Ｎ１亜型である、
　こととしてもよい。
　また、前記式（１）におけるＸがフッ素原子である、
　こととしてもよい。
　本発明の第２の観点に係る使用は、
　抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の製造のための下記式（１）に示す化合物、その薬理学的に許容される塩、式（１）の化合物の水酸基のエステル修飾体、リン酸修飾体若しくは硫酸修飾体、式（１）の化合物のカルボキシ基のエステル修飾体若しくはアミド修飾体、又は式（１）の化合物のアミノ基のイミン修飾体、アミド修飾体若しくは尿素修飾体の使用である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　［式（１）においてＸは水素原子又はハロゲン原子を表す。］
　本発明に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、薬剤耐性を有するインフルエンザウイルスにも高い抗ウイルス活性を示す。
実施例で用いたレポーターアッセイの原理を示す概念図である。 実施例で用いたレポーターアッセイにおけるインフルエンザウイルスのＲＮＡ複製複合体の各タンパク質とルシフェラーゼ活性との関係を示す図である。 試験例２における既存薬のルシフェラーゼ活性を示す図である。 試験例３におけるバロキサビル耐性変異株のＰＡを導入したレポーターアッセイでのルシフェラーゼ活性を示す図である。 試験例４における野生型のＰＡを導入した場合のルシフェラーゼ活性を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれバロキサビル、ファビピラビル及びビドフルディムスの結果を示す。 試験例４におけるバロキサビル耐性変異株のＰＡを導入した場合のルシフェラーゼ活性を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれバロキサビル、ファビピラビル及びビドフルディムスの結果を示す。 試験例５における細胞毒性を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれバロキサビル、ファビピラビル及びビドフルディムスの結果を示す。 試験例６における野生型のＰＡを導入した場合の各薬剤のルシフェラーゼ活性を示す図である。 試験例６におけるバロキサビル耐性変異株のＰＡを導入した場合の各薬剤のルシフェラーゼ活性を示す図である。 試験例７における野生型のＰＡを導入した場合のＢＡＹ２４０２２３４及びビドフルディムスのルシフェラーゼ活性を示す図である。
　本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。
　（実施の形態）
　本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、下記式（１）に示す化合物を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記式（１）においてＸは水素原子又はハロゲン原子を表す。ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子（Ｆ）、塩素原子（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）及びヨウ素（Ｉ）が挙げられる。好ましくは、Ｘはフッ素原子である。Ｘがフッ素原子の場合、上記化合物は、ビドフルディムス（２－［［（３－フルオロ－３’－メトキシ［１，１’－ビフェニル］－４－イル）アミノ］カルボニル］－１－シクロペンテン－１－カルボン酸）である。
　本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤に有効成分として含まれる化合物は、薬剤耐性インフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性を示す限り、上記式（１）に示される化合物の薬理学的に許容される塩であってもよいし、式（１）の化合物の修飾体であってもよい。修飾体としては、式（１）の化合物の水酸基のエステル修飾体、リン酸修飾体及び硫酸修飾体、式（１）の化合物のカルボキシ基のエステル修飾体及びアミド修飾体、式（１）の化合物のアミノ基のイミン修飾体、アミド修飾体及び尿素修飾体が例示される。
　上記式（１）に示される化合物の薬理学的に許容される塩は、薬理学上許容され、かつ薬剤耐性インフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性を示す塩であれば特に限定されない。当該化合物の塩としては、例えば、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩等が挙げられる。アルカリ金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩等が挙げられ、アルカリ土類金属塩としては、マグネシウム塩及びカルシウム塩等が挙げられる。以下、本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤に有効成分として含まれる上記の化合物、その塩、及び上述の修飾体を“化合物等”と総称することもある。
　抗ウイルス活性とは、インフルエンザウイルスの感染性、増殖能又は免疫回避能を低下させる活性を意味する。本実施の形態における抗ウイルス活性は、特には、インフルエンザウイルスの増殖能を低下させる活性を意味する。ウイルスの増殖能は、宿主細胞におけるウイルス粒子の構成タンパク質の合成能、ウイルス粒子の形成能又はウイルス遺伝子の複製能を含み、特には、ウイルス遺伝子の複製能を意味する。この場合、抗ウイルス活性は、例えば、宿主細胞において、ウイルスタンパク質を阻害して成熟したウイルス粒子の形成を抑制する活性を意味する。下記実施例に示すように、本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、インフルエンザウイルスのＲＮＡ複製を阻害する。したがって、上記のウイルスタンパク質は、特には、ウイルス遺伝子の複製に必須であるタンパク質である。
　本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型及びＤ型のいずれのインフルエンザウイルスに対しても使用され得るが、好ましくは、Ａ型及びＢ型、特に好ましくは、Ａ型のインフルエンザウイルスに対して使用される。インフルエンザウイルスのサブタイプも特に限定されず、例えば、抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤はＨ１Ｎ１亜型及びＨ３Ｎ２亜型等のインフルエンザウイルスに対して使用される。好適には、本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、Ｈ１Ｎ１亜型のインフルエンザウイルスに対して使用される。
　本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、薬剤耐性インフルエンザウイルスに対して有効である。薬剤耐性インフルエンザウイルスは、ＲＮＡ複製複合体を構成するポリメラーゼ酸性サブユニット（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ａｃｉｄｉｃ　ｓｕｂｕｎｉｔ；ＰＡ）に変異を有している。これにより、バロキサビル等のキャップ依存性エンドヌクレアーゼ阻害剤の抗ウイルス活性が低減される。
　より詳細には、インフルエンザウイルスは、宿主のｍＲＮＡから切断したキャップ構造を利用して、ＲＮＡ複製複合体によってマイナス鎖ＲＮＡからプラス鎖であるウイルスｍＲＮＡを合成する。ＲＮＡ複製複合体は、ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡから構成されている。ＰＡは宿主のｍＲＮＡからキャップ構造を切断するキャップ依存性エンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｈ１Ｎ１亜型のインフルエンザウイルスの薬剤耐性株は、ＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３８番目に位置するイソロイシン（Ｉ）がトレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）又はフェニルアラニン（Ｆ）に置換した変異（Ｉ３８Ｔ、Ｉ３８Ｍ又はＩ３８Ｆ）を有する。すなわち、インフルエンザウイルスの薬剤耐性株は、ＰＡをコードするＰＡ遺伝子にＩ３８Ｔ、Ｉ３８Ｍ又はＩ３８Ｆに対応する変異を有する。
　抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、ＰＡにＩ３８Ｔ、Ｉ３８Ｍ又はＩ３８Ｆの変異を有するインフルエンザウイルスに対して使用されてもよい。好ましくは、抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、ＰＡにＩ３８Ｔの変異を有するインフルエンザウイルスに対して使用される。なお、本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、例えばＩ３８Ｔ等の変異を有しておらず、薬剤耐性能を獲得していないインフルエンザウイルスにも有効である。
　本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、既知の方法で製造され、有効成分として０．０００００１～９９．９重量％、０．００００１～９９．８重量％、０．０００１～９９．７重量％、０．００１～９９．６重量％、０．０１～９９．５重量％、０．１～９９重量％、０．５～６０重量％、１～５０重量％又は１～２０重量％の化合物等を含む。抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、固形製剤であっても、液状製剤であってもよい。
　抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は化合物等に加え、薬理学上許容される任意の成分を含んでもよい。任意の成分は、例えば、担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等である。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤等の添加物が抗癌作用増強剤に配合されてもよい。
　本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の投与量は、投与対象の性別、年齢、体重及び症状等によって適宜決定される。当該抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、化合物等が有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要な化合物等の量であり、インフルエンザウイルスの増殖の抑制、あるいはインフルエンザウイルスの感染による症状の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量である。
　抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の投与量は、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤を分割して投与する場合、抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、１日に１～４回投与される。また、抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週及び１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
　抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の投与経路は特に限定されない。抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、例えば非経口で投与されてもよいし、経口で投与されてもよい。非経口投与の場合、静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、経皮投与、経鼻投与、経肺投与、経腸投与及び経粘膜投与等であってもよい。抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、点滴を介して投与されてもよい。
　抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、任意の形態の製剤とすることができる。経口投与の場合、抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、糖衣錠、バッカル錠、コーティング錠及びチュアブル錠等の錠剤、トローチ剤、丸剤、散剤及びソフトカプセルを含むカプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤及びドライシロップを含むシロップ剤、並びにエリキシル剤等の液剤であってもよい。非経口投与の場合、抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、注射剤、吸入剤、経皮吸収テープ、エアゾール剤及び坐剤等であってもよい。
　抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、インフルエンザウイルスが感染する対象であれば、任意の対象に投与される。例えば、抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の投与対象は、脊椎動物が好ましく、哺乳類動物がより好ましい。哺乳類動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー及びその他の霊長類、ブタ及びウマに加え、カモ及びニワトリ等の鳥類等が挙げられる。特に好ましい投与対象はヒトである。
　本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、好ましくは、Ｉ３８Ｔの変異を有する、すなわちバロキサビル耐性インフルエンザウイルスに感染した対象又はその感染に起因して感染症を発症した対象に投与される。もちろん当該抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、薬剤耐性能を獲得していないインフルエンザウイルスに感染した対象又はその感染に起因して感染症を発症した対象に投与されてもよい。
　インフルエンザウイルスの感染に起因するヒトにおける感染症には、３７℃以上、特には３８℃以上の発熱、全身倦怠感及び食欲不振等全身症状、咳、喉の痛み及び鼻水等の呼吸器症状、腰痛、悪心及び吐き気等の消化器症状等が含まれる。なお、本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、インフルエンザウイルスが検出された対象に対して、明確な症状がない期間、あるいは感染後の潜伏期間に予防的に投与されてもよい。
　以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、薬剤耐性の有無に関わらずインフルエンザウイルスに対して高い抗ウイルス活性を示す。
　上記式（１）に包含されるビドフルディムスのカルシウム塩を４０ｍｇ／日でヒトに経口投与した場合の最高血中濃度は３０μＭで、定常濃度は１２．７μＭであったことが報告されている（Ａｎｄｒｅａｓ　Ｍｕｅｈｌｅｒ，外４名，「Ｖｉｄｏｆｌｕｄｉｍｕｓ　ｃａｌｃｉｕｍ，　ａ　ｎｅｘｔ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＤＨＯＤＨ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒｅｌａｐｓｉｎｇ－ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，２０２０年，４３，１０２１２９）。下記実施例に示すようにインフルエンザウイルスのＲＮＡ複製の阻害活性に関するビドフルディムスのＥＣ５０は野生型において１．７５μＭ又はＩ３８Ｔにおいて２．６０μＭであった。ヒトでの血中濃度は、ＥＣ５０を十分に上回っており、本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は、臨床上でも高い抗ウイルス活性を有する。
　また、下記実施例に示されるように、ビドフルディムスの細胞毒性濃度（ＣＣ５０）は、ＥＣ５０よりも十分に高かった。よって、本実施の形態に係る抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤は高い抗ウイルス活性と高い安全性とを有する。
　また、他の実施の形態では、抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の製造のための上記化合物等の使用が提供される。別の実施の形態では、薬剤耐性インフルエンザウイルス感染症を治療、改善又は予防する方法が提供される。当該方法は、上記の化合物等を対象に投与する工程を含む。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
［試験例１：アッセイ系の構築］
　（プラスミドの構築）
　ウイルスタンパク質発現プラスミドを次のように構築した。ＲＮＡ複製複合体（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ）及び核タンパク質（ＮＰ）をコードする遺伝子をＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）株の遺伝子情報に基づいて人工合成した。各遺伝子をＰｏｌ－ＩＩプロモーター（ＣＭＶ）を有するｐＣＸ４ｂｓｒベクター（ＧｅｎＢａｎｋ　ＩＤ：ＡＢ０８６３８４）に導入した（ｐＣＸ４ｂｓｒ／ＰＢ１、ｐＣＸ４ｂｓｒ／ＰＢ２、ｐＣＸ４ｂｓｒ／ＰＡ、ｐＣＸ４ｂｓｒ／ＮＰ）。ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号１～４にそれぞれ示す。
　次にＲＮＡ複製複合体依存的に分泌型ルシフェラーゼ（ｓｅｃＮＬｕｃ）を発現する発現ベクターを構築した。ＮＰをｓｅｃＮＬｕｃで置換した図１に示す構成のｖＲＮＡ（ウイルスＲＮＡ）をＨ１Ｎ１株の遺伝子情報に基づいて人工合成し、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ　ＩＤ：Ｙ１４８３７）に導入した（ｐＵＣ５７／ＷＳＮ３３／ｖｓｅｃＮＬｕｃＰｏｌｌ　２５０Ｒｚ）。当該発現ベクターでは、５’ＵＴＲ（ＮＰ）と３’ＵＴＲ（ＮＰ）との間にｓｅｃＮＬｕｃをコードする遺伝子が挿入されている。図１に示すように、この発現ベクターによって、初めに導入した細胞内の宿主のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ－Ｉ）によりｓｅｃＮＬｕｃのマイナス鎖遺伝子が合成される。次にＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）のリボザイム（Ｒｚ）によりマイナス鎖の３’ＵＴＲ末端が切断されたｓｅｃＮＬｕｃのマイナス鎖遺伝子から、ＲＮＡ複製複合体によりｓｅｃＮＬｕｃのプラス鎖遺伝子（ｍＲＮＡ）が合成される。インフルエンザウイルスの複製複合体は、インフルエンザウイルスの３’ＵＴＲを特異的に認識して結合する。
　図１におけるｖＲＮＡに相当するＤＮＡを５’から３’方向に記載した塩基配列を配列番号５に示す。配列番号５に示された塩基配列の５’末端から数えて、１～２５０番目の塩基配列、２５１～８７３番目の塩基配列、８７４～９１８番目の塩基配列、９１９～１００５番目の塩基配列及び１００６～１０４４番目の塩基配列は、それぞれＰｏｌ　Ｉプロモーター（ｈＰｏｌ　Ｉｐ）、５’ＵＴＲ（ＮＰ）、ｓｅｃＮＬｕｃ、３’ＵＴＲ（ＮＰ）、Ｒｚ及びｍＰｏｌ　Ｔの塩基配列に相当する。
　（複製複合体依存的なルシフェラーゼ活性の評価）
　インフルエンザウイルスのポリメラーゼはＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡで構成される複製複合体である。また、構造タンパク質であるＮＰはＲＮＡと結合して安定性に寄与する。そこで、これらの４種類のタンパク質のいずれがｓｅｃＮＬｕｃ活性に必要であるかについて以下のように検討した。
　ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。２４時間後、各プラスミド０．２μｇずつ（ｐＣＸ４ｂｓｒ／ＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ，ｐＵＣ５７／ＷＳＮ３３／ｖｓｅｃＮＬｕｃＰｏｌｌ　２５０Ｒｚ）をＦｕｇｅｎｅ　ＨＤ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞に導入した。４８時間培養後、培養上清を採取し、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。上記で構築した４種類のタンパク質発現ベクターのすべてを細胞に導入したｓｅｃＮＬｕｃ活性と４種類のうちから１種類ずつ除いた場合のｓｅｃＮＬｕｃ活性について比較した。
　（結果）
　図２に示すように、ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡ発現ベクターのいずれか１種類を除くとｓｅｃＮＬｕｃ活性は検出できなかった。ＮＰ発現ベクターを除くと、すべてを導入したときのｓｅｃＮＬｕｃ活性の約１／１００程度に減弱するものの活性が検出された。このことから、本アッセイ系ではインフルエンザウイルスの複製複合体依存的にルシフェラーゼ活性が検出されることが示された。
［試験例２：既存薬の評価］
　試験例１で構築したアッセイ系を用いて、抗インフルエンザ薬としてキャップ依存型エンドヌクレアーゼ阻害剤であるバロキサビル及びノイラミニダーゼ阻害剤であるオセルタミビルのルシフェラーゼ活性を評価した。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。２４時間後、各プラスミド０．２μｇずつ（ｐＣＸ４ｂｓｒ／ＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ，ＮＰ，ｐＵＣ５７／ＷＳＮ３３／ｖｓｅｃＮＬｕｃＰｏｌｌ　２５０Ｒｚ）をＦｕｇｅｎｅ　ＨＤ試薬を用いて細胞に導入した。２４時間後、抗インフルエンザ薬を１０μＭの濃度になるように培地に添加した。２４時間培養後、培養上清を採取し、試験例１と同様にルシフェラーゼ活性を測定した。
　（結果）
　本アッセイ系で評価できる作用機序には、ｍＲＮＡ合成に必要なキャップ依存型エンドヌクレアーゼが関与するが、ノイラミニダーゼは関与しない。図３に示すように、バロキサビルによってルシフェラーゼ活性が抑制されたが、オセルタミビルではルシフェラーゼ活性が抑制されなかった。本試験例により、当該アッセイ系によって、インフルエンザウイルスのＲＮＡ複製を阻害する薬剤をスクリーニングできることが示された。
［試験例３：バロキサビル耐性変異株に対する活性評価系の構築］
　バロキサビル耐性変異はＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３８番目に位置するイソロイシンがトレオニンに置換した変異である。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、ＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から３８番目に位置するイソロイシンに対応するコドン（ａｔａ）をトレオニンに対応するコドン（ａｃａ）に置換し、ｐＣＸ４ｂｓｒ／ＰＡ　ｍｔを構築した。
　ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。２４時間後、各プラスミド０．２μｇずつ（ｐＣＸ４ｂｓｒ／ＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ又はＰＡ　ｍｔ（ＰＡ　Ｉ３８Ｔ），ＮＰ，ｐＵＣ５７／ＷＳＮ３３／ｖｓｅｃＮＬｕｃＰｏｌｌ　２５０Ｒｚ）をＦｕｇｅｎｅ　ＨＤ試薬を用いて細胞に導入した。２４時間後、バロキサビルを１μＭの濃度になるよう培地に添加した。２４時間培養後、培養上清を採取し、試験例１と同様にルシフェラーゼ活性を測定した。
　（結果）
　図４に示すように、変異型ＰＡ（ＰＡ　Ｉ３８Ｔ）を導入した場合、バロキサビルのルシフェラーゼ活性が低下した。この結果から、変異型ＰＡを用いた本アッセイ系によって、バロキサビル耐性インフルエンザウイルスのＲＮＡ複製を阻害することで抗ウイルス活性を示す薬剤をスクリーニングできることが示された。
［試験例４：野生型及び変異型インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性の評価］
　試験例３と同様に、ｐＣＸ４ｂｓｒ／ＰＡ又はＰＡ　ｍｔを導入したＨＥＫ２９３細胞を用いて、所定の濃度のバロキサビル、ファビピラビル及びビドフルディムスのルシフェラーゼ活性を測定した。ビドフルディムスは、本アッセイを用いた約１５００化合物のスクリーニングにより、ルシフェラーゼ活性の抑制を示した化合物である。
　（結果）
　図５は野生型ＰＡを導入した場合のルシフェラーゼ活性を示す。いずれの薬剤も濃度依存的にルシフェラーゼ活性を抑制した。野生型ＰＡの場合、図５（Ａ）に示すように、バロキサビルは、図５（Ｂ）及び図５（Ｃ）にそれぞれ示すファビピラビル及びビドフルディムスよりもルシフェラーゼ活性を大きく抑制した。
　図６は変異型ＰＡを導入した場合のルシフェラーゼ活性を示す。いずれの薬剤も濃度依存的にルシフェラーゼ活性を抑制した。変異型ＰＡの場合、図６（Ｃ）に示すように、ビドフルディムスは、図６（Ａ）及び図６（Ｂ）にそれぞれ示すバロキサビル及びファビピラビルよりもルシフェラーゼ活性を大きく抑制した。野生型ＰＡを導入した場合のビドフルディムスのＥＣ５０は１．７５μＭであったのに対し、変異型ＰＡを導入した場合のビドフルディムスのＥＣ５０は２．６０μＭで大きな違いはみられなかった。
［試験例５：毒性試験］
　ＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレートに５×１０３個播種した。培養２４時間後、所定の濃度のバロキサビル、ファビピラビル又はビドフルディムスを培地に添加した。２４時間培養した後、Ｐｒｅｍｉｘ　ＷＳＴ－１　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）１０μＬを培地に添加して、３７℃で２時間培養後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　（結果）
　図７（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）はそれぞれバロキサビル、ファビピラビル及びビドフルディムスの細胞生存率を示す。バロキサビル、ファビピラビル及びビドフルディムスのＣＣ５０は、それぞれ３４４．６８μＭ、＞４００μＭ及び１３７．６８μＭであった。
［試験例６：血中最高濃度（Ｃｍａｘ）におけるビドフルディムスの抗ウイルス活性の評価］
　臨床応用に際して培養細胞により得られた抗ウイルス活性を示す化合物の濃度が、実際にヒトの血中で得られるかが重要になる。バロキサビル、ファビプラビル、ビドフルディムスのカルシウム塩のヒトでのＣｍａｘは、それぞれ１．７μＭ、２３０μＭ及び３０μＭであると報告されている。Ｃｍａｘで細胞を処理したときの野生型及び変異型インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を試験例４と同様に評価した。
　（結果）
　図８は、野生型ＰＡを導入したＨＥＫ２９３細胞を、バロキサビル、ファビプラビル及びビドフルディムスの濃度をそれぞれのＣｍａｘの濃度とした場合のルシフェラーゼ活性を示す。バロキサビル、ファビプラビル及びビドフルディムスによるルシフェラーゼ活性の抑制は、それぞれ８９％、６０％及び８７％であった。野生型におけるビドフルディムスの抗ウイルス活性はバロキサビルとほぼ同等で、ファビプラビルよりも強いと考えられる。
　図９は、変異型ＰＡを導入したＨＥＫ２９３細胞を、バロキサビル、ファビプラビル及びビドフルディムスの濃度をそれぞれのＣｍａｘの濃度とした場合のルシフェラーゼ活性を示す。バロキサビル、ファビプラビル及びビドフルディムスによるルシフェラーゼ活性の抑制は、それぞれ４０％、４１％及び７９％であった。ビドフルディムスは変異型インフルエンザウイルスに対してＣｍａｘではバロキサビル及びファビプラビルよりも強い抗ウイルス活性を示すと考えられる。
［試験例７：インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性とＤＨＯＤＨ活性との関係］
　ビドフルディムスはＤＨＯＤＨを阻害することでピリミジンの産生を抑制することが知られている。そこで、ＤＨＯＤＨ阻害活性とインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性とが相関するかについて検討した。ビドフルディムスのＤＨＯＤＨ阻害濃度ＩＣ５０は１３４ｎＭであるのに対し、ＢＡＹ２４０２２３４のＤＨＯＤＨ阻害濃度ＩＣ５０は１．２ｎＭで、約１００倍活性が高い。ＤＨＯＤＨ阻害活性が抗ウイルス活性と相関する場合にはＢＡＹ２４０２２３４のほうがビドフルディムスよりも強くルシフェラーゼ活性を抑制するはずである。そこで、１０μＭのＢＡＹ２４０２２３４又はビドフルディムスで細胞を処理したときの野生型のインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を試験例４と同様に評価した。
　（結果）
　図１０に示すように、ＢＡＹ２４０２２３４及びビドフルディムスによるルシフェラーゼ活性の抑制効果はそれぞれ７２％及び８１％で、ビドフルディムスはＢＡＹ２４０２２３４より強くルシフェラーゼ活性を抑制した。この結果は、ＤＨＯＤＨ阻害活性の強さからインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を予想できないことを示している。
　上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本出願は、２０２１年３月１８日に出願された、日本国特許出願２０２１－４４５７５号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０２１－４４５７５号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明は、インフルエンザウイルス感染症の治療に有用である。

Claims (6)

  1. 　下記式（１）に示す化合物、その薬理学的に許容される塩、式（１）の化合物の水酸基のエステル修飾体、リン酸修飾体若しくは硫酸修飾体、式（１）の化合物のカルボキシ基のエステル修飾体若しくはアミド修飾体、又は式（１）の化合物のアミノ基のイミン修飾体、アミド修飾体若しくは尿素修飾体を含む、
    　抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　［式（１）においてＸは水素原子又はハロゲン原子を表す。］
  2. 　ポリメラーゼ酸性サブユニットに変異を有するインフルエンザウイルスに対して使用される、
    　請求項１に記載の抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤。
  3. 　前記インフルエンザウイルスの前記ポリメラーゼ酸性サブユニットのアミノ酸配列におけるＮ末端から３８番目に位置するイソロイシンがトレオニンに置換されている、
    　請求項２に記載の抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤。
  4. 　前記インフルエンザウイルスは、
    　Ｈ１Ｎ１亜型である、
    　請求項１から３のいずれか一項に記載の抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤。
  5. 　前記式（１）におけるＸがフッ素原子である、
    　請求項１から４のいずれか一項に記載の抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤。
  6. 　抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の製造のための下記式（１）に示す化合物、その薬理学的に許容される塩、式（１）の化合物の水酸基のエステル修飾体、リン酸修飾体若しくは硫酸修飾体、式（１）の化合物のカルボキシ基のエステル修飾体若しくはアミド修飾体、又は式（１）の化合物のアミノ基のイミン修飾体、アミド修飾体若しくは尿素修飾体の使用。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　［式（１）においてＸは水素原子又はハロゲン原子を表す。］
PCT/JP2022/006422 2021-03-18 2022-02-17 抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤及び抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の製造のための化合物の使用 WO2022196236A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023506890A JPWO2022196236A1 (ja) 2021-03-18 2022-02-17

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021044575 2021-03-18
JP2021-044575 2021-03-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022196236A1 true WO2022196236A1 (ja) 2022-09-22

Family

ID=83322282

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/006422 WO2022196236A1 (ja) 2021-03-18 2022-02-17 抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤及び抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の製造のための化合物の使用

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2022196236A1 (ja)
WO (1) WO2022196236A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010128050A2 (en) * 2009-05-04 2010-11-11 4Sc Ag Anti-inflammatory agents as virostatic compounds
JP2017513935A (ja) * 2014-04-11 2017-06-01 パノプテス・ファーマ・ゲーエムベーハー ウイルス静止化合物としての抗炎症剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010128050A2 (en) * 2009-05-04 2010-11-11 4Sc Ag Anti-inflammatory agents as virostatic compounds
JP2017513935A (ja) * 2014-04-11 2017-06-01 パノプテス・ファーマ・ゲーエムベーハー ウイルス静止化合物としての抗炎症剤

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2022196236A1 (ja) 2022-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tominack et al. Rimantadine hydrochloride and amantadine hydrochloride use in influenza A virus infections
EP3391888B1 (en) Medicine for treating influenza characterized by comprising combination of cap-dependent endonuclease inhibitor with anti-influenza drug
US8759354B2 (en) Pharmaceutical composition comprising pyrazine derivative, and method of using pyrazine derivative in combination
Hayden Antivirals for influenza: historical perspectives and lessons learned
US20120178749A1 (en) Ns1 protein inhibitors
US9212134B2 (en) Inhibitors of viral entry into mammalian cells
JP2011509928A (ja) ウィルス感染を治療するためのアセチルサリチル酸塩を使用する方法
Matzinger et al. Exogenous IFN-alpha administration reduces influenza A virus replication in the lower respiratory tract of rhesus macaques
CN106232119B (zh) A型流感rna-依赖性rna聚合酶的小分子抑制剂
JPWO2017155082A1 (ja) 抗肝腫瘍ウイルス剤
Cheer et al. Zanamivir: an update of its use in influenza
AU2016287580A2 (en) Compositions and methods for the treatment of viral infection
WO2022196236A1 (ja) 抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤及び抗薬剤耐性インフルエンザウイルス剤の製造のための化合物の使用
Abed et al. Fitness of influenza A and B viruses with reduced susceptibility to baloxavir: A mini‐review
WO2021175224A1 (zh) 抗rna病毒药物及其应用
WO2014146218A1 (zh) 马替麦考酚酯或其盐类用于制备抗流感病毒之药物的用途
JP7369143B2 (ja) ピラジン誘導体と細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを組み合わせてなるｒｎａウイルス感染症治療剤
US20140121237A1 (en) Methods for Inhibiting Virus Replication
Adams et al. Laninamivir-Interferon Lambda 1 Combination treatment promotes resistance by influenza A virus more rapidly than laninamivir alone
CN110870864B (zh) 马来酸卡比沙明在制备抗流感病毒药物中的应用
Hickerson et al. Pleiotropic effects of influenza H1, H3, and B baloxavir-resistant substitutions on replication, sensitivity to baloxavir, and interferon expression
TWI840481B (zh) 衍生物核糖三磷酸體的量增加的化合物而成的ｒｎａ病毒感染症治療劑
CA2780614A1 (en) Treatment of microbial infections
Domínguez et al. Antiviral resistance in influenza viruses
Arora Novel production system for influenza A virus-derived defective interfering particles and analysis of antiviral activity

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22770995

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023506890

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22770995

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1