WO2022195994A1 - 分析装置及び分析方法 - Google Patents
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Definitions
- the present disclosure relates to analysis devices and analysis methods for analyzing biological substances such as antigens or antibodies.
- Patent Document 1 describes an analyzer that counts biological substances fixed to optical discs as substances to be detected.
- a plurality of antibodies are immobilized on the optical disc.
- the detection target substance is immobilized on the optical disk by binding the antigen, which is the detection target substance, to the antibody.
- Each antigen is bound as a label to fine particles called nanobeads, which are larger than the antigen.
- the analyzer indirectly counts the detection target substance by irradiating the optical disc with laser light and detecting the number of nanobeads based on the reflected light from the optical disc.
- Multiple detection target substances labeled with nanobeads are not necessarily immobilized on the optical disk in a state where each detection target substance is sufficiently separated from other detection target substances.
- Two or more nanobeads may be immobilized on an optical disc in close proximity (including contact) at very close distances.
- the received light level signals which indicate the received light level of the reflected light, optically interfere with each other.
- the analyzer described in Patent Document 1 is configured to correctly count nanobeads even when two or more nanobeads are in close proximity and the received light level signals interfere with each other.
- the number of nanobead-bound detection target substances fixed in each unit domain i.e., the number of nanobeads
- the distribution of the number of nanobeads in each unit domain (0, 1, 2, etc.) can be determined by injecting a sample solution containing a substance to be detected into a well arranged on an optical disk. It depends on the concentration of the substance to be detected in the sample liquid when the substance is immobilized on the optical disk.
- the distribution of the number of nanobeads in each unit domain does not accurately depend on the concentration of the substance to be detected in the sample liquid. This is because nanobeads tend to aggregate easily, and there may be two or more nanobeads in an aggregated state within a unit domain.
- noise generated during the process (assay) of immobilizing specimens or beads on optical discs may be erroneously counted as nanobeads.
- assay noise may result from precipitation of salts or other components contained in washing solutions or reagents, or from detachment of beads due to contact of the pipette tip for injecting reagents with the optical disk during the assay process.
- various noise components such as protein clumps
- these assay noises can be erroneously counted as nanobeads.
- nanobeads substances to be detected
- aggregated nanobeads or assay noise are counted, and the substances to be detected may not be counted correctly.
- One or more embodiments exist alone and not within close interference distance to optically interfere with other microparticles while avoiding the effects of agglomeration and assay noise of microparticles that label the substance to be detected. It is an object of the present invention to provide an analysis apparatus and an analysis method capable of counting single particles and two or more adjacent particles within an interference distance more accurately than before.
- An object of one or more embodiments is to further provide an analysis apparatus and an analysis method capable of quantitatively evaluating the degree of aggregation of microparticles that label a substance to be detected.
- a sample analysis disk having a reaction region in which a plurality of substances to be detected to which microparticles serving as labels are bound is immobilized is irradiated with a laser beam, and a sample is detected from the reaction region.
- an optical pickup that detects the received light level of the reflected light to generate a received light level signal, and from the waveform of the received light level signal, a single pulse waveform indicating a single particle existing alone and an adjacent particle interference distance
- a pulse detection circuit for detecting (n ⁇ 1) types of proximity pulse-shaped waveforms representing 2 to n proximity fine particles, which are an integer, within the range of the reaction region and generating each detection value; and a particle counting unit that generates a count value of the particles.
- the particle counter divides the reaction region into a plurality of unit domains, and based on the detected values, the number of unit domains in which the monopulse-shaped waveform is detected and the (n-1) kinds of types and the number of unit domains in which the proximate pulse-shaped waveform is detected for each unit are individually aggregated, and the actual measurement aggregate value of the unit domains in which the single fine particles are present and the unit in which the 2 to n proximate fine particles are present and the number of unit domains in which the monopulse-shaped waveform was detected from the number of all the unit domains in the reaction area, and each of the (n-1) kinds of types. by subtracting the number of unit domains in which the adjacent pulse-shaped waveform was detected from the above Generating an aggregate measured value for a unit area free of particulates.
- the particle counting unit calculates a total measured value of a unit domain in which the particle does not exist, a total measured value of a unit domain in which the single particle exists, and a unit domain in which the 2 to n neighboring particles exist.
- Second array data of a theoretical total value of the compartment, a theoretical total value of the unit domain in which the single particle exists, and a theoretical total value of the unit domain in which the 2 to n neighboring particles exist. is created or selected, and based on the theoretical total value of the unit domain in which the single particle exists and the theoretical total value of the unit domain in which the 2 to n adjacent particles exist, in the reaction region Calculate the number of fine particles.
- the optical pickup irradiates a sample analysis disc having a reaction region in which a plurality of detection target substances bound to microparticles serving as labels are immobilized with a laser beam
- the optical pickup detects the light reception level of the reflected light from the reaction area to generate a light reception level signal
- the pulse detection circuit detects a single particle existing alone from the waveform of the light reception level signal.
- Each detected value is generated by detecting a pulse-shaped waveform and (n-1) kinds of proximity pulse-shaped waveforms indicating an integer number of 2 to n proximate microparticles in which the adjacent microparticles are within the interference distance.
- the control unit that acquires each of the detected values divides the reaction region into a plurality of unitary domains, and based on each of the detected values, the number of unitary domains in which the monopulse-shaped waveform is detected, and the ( n-1)
- the number of unit domains in which the proximate pulse-shaped waveform is detected is individually tallied for each type of type, and the measured aggregate value of the unit domains in which the single particles are present, and the 2 to n number of unit domains of the unit domains in which adjacent fine particles are present, and from the number of all the unit domains in the reaction region, the number of unit domains in which the monopulse-shaped waveform is detected, and the (n -1) by subtracting the number of unit domains in which the proximate pulse-shaped waveform was detected for each type, the number of unit domains in which neither the monopulse-shaped waveform nor the proximate pulse-shaped waveform was detected; The number of particles is calculated to generate an aggregated measured value
- a method of analysis is provided for generating a count value of the particles in the reaction area by calculating the number of the particles in the reaction area based on a statistical aggregate value.
- a sample analysis disk having a reaction region in which a plurality of substances to be detected bound to microparticles serving as labels are immobilized is irradiated with a laser beam, and a sample is detected from the reaction region.
- An analysis device includes a degree-of-aggregation generator that calculates a degree of aggregation indicating the degree of aggregation of the fine particles.
- the cohesion degree generator divides the reaction region into a plurality of unit domains, and based on the respective detection values, the number of unit domains in which the monopulse-shaped waveform is detected, and the (n-1) types of unit domains.
- the number of unit domains in which the proximate pulse-shaped waveform is detected is individually tallied for each type, and the actually measured total value of the unit domains in which the single fine particles are present and the number of the 2 to n proximate fine particles are present.
- the cohesion degree generation unit generates a total measured value of unit blocks in which the fine particles are not present, a total measured value of unit blocks in which the single fine particles are present, and a unit in which the 2 to n adjacent fine particles are present.
- First array data is created in combination with the actually measured aggregated value of the section, and the array data of the theoretically aggregated value based on the probability distribution according to the probability theory, wherein the fine particles that are most similar to the first sequence data do not exist.
- Data is created or selected, and the quantitative difference between the first sequence data and the second sequence data is calculated by calculating the measured total value of the unitary domain in which the single particles are present and the proximity from 2 to n.
- the number of particles in the reaction area is divided by the calculated count value based on the actual measurement total value of the unitary domain where the particles are present.
- the optical pickup irradiates a sample analysis disc having a reaction region in which a plurality of target substances to be detected bound to microparticles serving as labels are immobilized with a laser beam
- the optical pickup detects the light reception level of the reflected light from the reaction area to generate a light reception level signal
- the pulse detection circuit detects a single particle existing alone from the waveform of the light reception level signal.
- Each detected value is generated by detecting a pulse-shaped waveform and (n-1) kinds of proximity pulse-shaped waveforms indicating an integer number of 2 to n proximate microparticles in which the adjacent microparticles are within the interference distance.
- the control unit that acquires each of the detected values divides the reaction region into a plurality of unitary domains, and based on each of the detected values, the number of unitary domains in which the monopulse-shaped waveform is detected, and the ( n-1)
- the number of unit domains in which the proximate pulse-shaped waveform is detected is individually tallied for each type of type, and the measured aggregate value of the unit domains in which the single particles are present, and the 2 to n number of unit domains of the unit domains in which adjacent fine particles are present, and from the number of all the unit domains in the reaction region, the number of unit domains in which the monopulse-shaped waveform is detected, and the (n -1) by subtracting the number of unit domains in which the proximate pulse-shaped waveform was detected for each type, the number of unit domains in which neither the monopulse-shaped waveform nor the proximate pulse-shaped waveform was detected; The number of particles is calculated to generate an aggregated measured value
- Second sequence data with the theoretical total values of the compartments, and calculating the quantitative difference between the first sequence data and the second sequence data by actual measurement of the unit compartment where the single particles are present; Aggregation of the fine particles by dividing the number of the fine particles in the reaction region by a count value calculated based on the aggregated value and the actually measured aggregated value of the unitary domain in which the 2 to n adjacent fine particles are present.
- An analysis method is proposed to calculate the degree of agglomeration, which indicates the degree of provided.
- the analysis device and the analysis method of one or more embodiments while avoiding the influence of agglomeration and assay noise of the microparticles labeling the substance to be detected, other microparticles are close within the interference distance of optically interfering with each other. It is possible to more accurately count a single particle that exists alone without interference and two or more adjacent particles that are within an interference distance from each other. In addition, according to the analysis device and analysis method of one or more embodiments, it is possible to quantitatively evaluate the degree of agglutination of the microparticles that label the substance to be detected.
- FIG. 1 is a plan view of the detection target substance capturing unit viewed from the cartridge side.
- FIG. 2 is a plan view of the detection target substance capturing unit viewed from the sample analysis disk side.
- FIG. 3 is a cross-sectional view of the detection target substance capturing unit shown in FIG. 1 taken along line AA.
- FIG. 4 is a cross-sectional view showing a state in which the cartridge is removed from the sample analysis disk.
- FIG. 5 is an enlarged perspective view partially showing the spiral recesses and protrusions formed on the surface of the sample analysis disk, showing the sample analysis disk in a broken state.
- FIG. 6 is a plan view conceptually showing the surface of the sample analysis disk in the well provided in the detection target substance capturing unit.
- FIG. 7A is a partially enlarged cross-sectional view showing a state in which antibodies are immobilized on the protrusions and recesses on the bottom surface of the well.
- FIG. 7B is a partially enlarged cross-sectional view showing a state in which a substance to be detected is bound to an antibody.
- FIG. 7C is a partially enlarged cross-sectional view showing a state in which fine particles are bound to a substance to be detected.
- FIG. 8 is a plan view conceptually showing a state in which a plurality of microparticles are trapped in recesses in wells.
- FIG. 9 is a configuration diagram showing the analysis apparatus of the first to third embodiments.
- FIG. 9 is a configuration diagram showing the analysis apparatus of the first to third embodiments.
- FIG. 10 is a waveform diagram showing an example of waveforms of light reception level signals of a single particle, a double particle, and a triple particle.
- FIG. 11 is a partially enlarged plan view showing a state in which the reaction area is divided into a plurality of mesh-like unitary divisions.
- FIG. 12 is a block diagram showing a control section of the analyzer of the first embodiment, which has a fine particle counting section as a functional configuration.
- FIG. 13 is a flow chart showing the processing executed by the analysis device of the first embodiment and the analysis method of the first embodiment.
- FIG. 14 is a diagram showing arrangement data of measured total values and theoretical total values of no particles, single particles, double particles, and triple particles.
- FIG. 15 is a diagram showing the relationship between the sample concentration of the substance to be detected, the fine particle count value based on the actually measured total value obtained at each sample concentration, and the fine particle count value based on the theoretical total value at each sample concentration.
- FIG. 16 is a block diagram showing a control section of an analysis apparatus according to the second embodiment, which has a cohesion generation section as a functional configuration.
- FIG. 17 is a flow chart showing the processing executed by the analysis device of the second embodiment and the analysis method of the second embodiment.
- FIG. 18 is a diagram showing an example of plotting the relationship between the count value of fine particles and the degree of agglomeration.
- FIGS. It will be described how to make a disc for sample analysis with a substance immobilized on its surface.
- FIG. 1 shows a detection target substance capturing unit 60 (hereinafter referred to as capturing unit 60) for producing a sample analysis disc 70 having a detection target substance immobilized on its surface, viewed from the cartridge 80 side.
- FIG. 2 shows the capture unit 60 viewed from the sample analysis disk 70 side.
- FIG. 3 shows a cross section of the capture unit 60 taken along line AA of FIG.
- FIG. 4 shows the cartridge 80 removed from the sample analysis disc 70 .
- the capture unit 60 includes a sample analysis disk 70, a cartridge 80 and a sealing member 90.
- the sample analysis disc 70 has a disk shape equivalent to optical discs such as Blu-ray Discs (BD), DVDs, Compact Discs (CDs), for example.
- the sample analysis disc 70 is made of a resin material such as polycarbonate resin or cycloolefin polymer, which is generally used for optical discs. Note that the sample analysis disk 70 is not limited to the optical disk described above, and may be in another form, and an optical disk conforming to another predetermined standard can also be used.
- FIG. 5 is a partially enlarged view of the surface of the sample analysis disc 70.
- FIG. 5 As shown in FIG. 5, on the surface of the sample analysis disk 70, one convex portion 73 and one concave portion 74 are formed in a spiral shape from the inner peripheral portion to the outer peripheral portion while being adjacent to each other. ing.
- the convex portion 73 corresponds to the land of the optical disc, and the concave portion 74 corresponds to the groove of the optical disc.
- One track is one circumference at each position in the radial direction of the spirally formed convex portion 73 and concave portion 74 adjacent to each other. That is, at a certain position in the circumferential direction, scanning of the concave portion 74 by irradiation of the laser beam is started, the disk for sample analysis 70 rotates 360 degrees, and the laser beam reaches the same position in the circumferential direction although the position in the radial direction is shifted. is one track.
- a track pitch corresponding to the radial pitch of the recesses 74 is, for example, 320 nm.
- the sample analysis disk 70 has a central hole 71 formed in the center and a notch 72 formed in the outer periphery.
- a notch 72 is a reference position identification portion for identifying the reference position of the sample analysis disk 70 .
- the reference position identification portion may be formed other than the notch 72 .
- the cartridge 80 has a plurality of cylindrical through holes 81 formed in the circumferential direction.
- the plurality of through holes 81 are formed at regular intervals so that their respective centers are located on the same circumference.
- the cartridge 80 has a convex portion 82 formed in the central portion and a convex portion 83 formed in the outer peripheral portion.
- the sealing member 90 is arranged between the cartridge 80 and the sample analysis disk 70.
- the seal member 90 is a ring-shaped packing made of an elastic deformation member such as silicone rubber.
- a seal member 90 is arranged around each through hole 81 .
- the capture unit 60 is a cylinder formed by the through hole 81 , the seal member 90 , and the surface of the sample analysis disk 70 . It has a plurality of shaped wells 61 .
- the inner peripheral surfaces of the through hole 81 and the sealing member 90 constitute the inner peripheral surface of the well 61
- the surface of the sample analysis disk 70 constitutes the bottom surface of the well 61 .
- a well 61 functions as a container for storing a solution such as a sample solution or a buffer solution. Since the cartridge 80 is brought into close contact with the surface of the sample analysis disk 70 by the sealing member 90 , the solution hardly leaks from the wells 61 .
- the trapping unit 60 shown in FIG. 1 has eight wells 61, at least one well 61 is sufficient, and the number of wells 61 is not limited.
- FIG. 6 conceptually shows the surface of the sample analysis disk 70 in the well 61.
- FIG. The plurality of tracks on the bottom surface of each well 61 are strictly arcuate.
- FIG. 6 shows the protrusions 73 and recesses 74 enlarged, and each well 61 has about 20,000 tracks.
- the operator uses the capture unit 60 configured as described above to inject and incubate a buffer solution containing the antibody 62 (see FIG. 7A) into the well 61 . Then, as shown in FIG. 7A, the antibody 62 is immobilized on the protrusions 73 and recesses 74 on the bottom surface of the well 61 . The operator drains the buffer solution to wash the inside of the well 61, and injects and incubates a sample liquid containing a detection target substance 63 (see FIG. 7B), which is an antigen. Then, as shown in FIG. 7B, the substance to be detected 63 specifically binds to the antibody 62 through an antigen-antibody reaction with the antibody 62 .
- a detection target substance 63 see FIG. 7B
- the substance to be detected 63 is any biological substance such as an antigen or antibody, typically an exosome. Exosomes are present in body fluids such as blood. If blood is used as a sample, the sample liquid is a liquid containing blood. The size of exosomes is about 100 nm.
- the operator discharges the sample liquid to wash the inside of the well 61, injects a buffer solution containing the microparticles 64 (see FIG. 7C) serving as labels into the well 61, and incubates it.
- Microparticles 64 are sometimes referred to as nanobeads.
- An antibody 65 that specifically binds to the substance 63 to be detected by an antigen-antibody reaction is immobilized on the surface of the fine particle 64 .
- the microparticles 64 are captured in the recesses 74 while being bound to the substance to be detected 63 .
- the size of the fine particles 64 is about 200 nm.
- FIG. 8 shows a state in which a plurality of fine particles 64 are captured in recesses 74 within wells 61 .
- the plurality of particles 64 are fixed in a generally distributed manner over multiple tracks, two or more particles 64 may be fixed in the recesses 74 in close proximity or contact at a very close distance.
- reaction regions 66 are formed corresponding to the positions of the wells 61 and capturing a plurality of fine particles 64 bound to the detection target substance 63 .
- Eight reaction regions 66 are formed on the surface of the sample analysis disk 70 by using the capture unit 60 shown in FIG. After drying, the sample analysis disk 70 is analyzed by an analyzer 100 shown in FIG. 9, which is the analyzer of the first and second embodiments.
- the analysis apparatus 100 includes a turntable 1, a clamper 2, a turntable drive section 3, a turntable drive circuit 4, an optical pickup drive circuit 5, a reference position detection sensor 6, a guide shaft 7, and a pulse detection circuit. 8, a control unit 9, a storage unit 10, a display unit 11, and an optical pickup 20.
- the turntable driving section 3 can be configured by a spindle motor.
- the pulse detection circuit 8 is composed of an integrated circuit, for example, an FPGA (Field Programmable Gate Array).
- the pulse detection circuit 8 may be composed of an ASIC (Application Specific Integrated Circuit) or a microprocessor.
- the control unit 9 is composed of a CPU (Central Processing Unit). The pulse detection circuit 8 and the control section 9 may be integrated.
- a sample analysis disk 70 is placed on the turntable 1 so that the reaction area 66 faces downward.
- the clamper 2 is driven toward or away from the turntable 1 .
- the clamper 2 is driven toward the turntable 1 with the sample analysis disk 70 placed on the turntable 1 , the sample analysis disk 70 is held by the turntable 1 and the clamper 2 . .
- the turntable drive unit 3 rotates the turntable 1 together with the sample analysis disk 70 and the clamper 2 around the rotation axis C1.
- the turntable driving circuit 4 controls rotation of the turntable 1 by the turntable driving section 3 based on control by the control section 9 .
- the turntable driving circuit 4 controls the turntable driving section 3 so that the turntable 1 rotates together with the sample analysis disk 70 and the clamper 2 at a constant linear velocity.
- the reference position detection sensor 6 is arranged near the outer periphery of the sample analysis disk 70 .
- the reference position detection sensor 6 is, for example, a reflective optical sensor such as a photoreflector.
- the reference position detection sensor 6 irradiates the outer peripheral portion of the sample analysis disc 70 with the detection light 6a and receives the reflected light from the sample analysis disc 70 while the sample analysis disc 70 is rotating.
- the reference position detection sensor 6 detects the notch 72 of the sample analysis disk 70 to generate a reference position detection signal Sp and supplies it to the control unit 9 .
- the reference position detection signal Sp is a pulse signal that becomes low (or high) for each rotation of the sample analysis disk 70 .
- the notch 72 of the rotating sample analysis disk 70 is positioned below the reference position detection sensor 6 and the detection light 6a is non-reflected by the notch 72, it falls from high to low, and the notch 72
- the detection light 6a passes below the reference position detection sensor 6 and is reflected, the signal rises from low to high.
- a pulse signal having a polarity opposite to the pulse signal generated by the reference position detection sensor 6 may be supplied to the control section 9 .
- a photointerrupter which is a transmissive optical sensor, may be used as the reference position detection sensor 6 .
- the reference position detection sensor 6 rises from low to high when the detection light 6a passes through the notch 72, and falls from high to low when the detection light 6a is blocked by the sample analysis disk 70. Generate a signal Sp. Also in this case, a pulse signal having a polarity opposite to that of the pulse signal generated by the reference position detection sensor 6 may be supplied to the control section 9 .
- the control unit 9 detects the reference position for each rotation period and track of the sample analysis disk 70 based on the reference position detection signal Sp.
- the guide shaft 7 is arranged parallel to the sample analysis disk 70 and along the radial direction of the sample analysis disk 70 .
- the radial direction of the sample analysis disk 70 is a direction perpendicular to the rotation axis C1 of the turntable 1.
- the optical pickup 20 is supported by the guide shaft 7 .
- the optical pickup drive circuit 5 moves the optical pickup 20 along the guide shaft 7 in the radial direction of the sample analysis disk 70 under the control of the control unit 9 .
- the optical pickup 20 has an objective lens 21 .
- the optical pickup drive circuit 5 moves the objective lens 21 in a direction approaching or separating from the sample analysis disc 70 in order to focus-control the laser beam 20a irradiated onto the sample analysis disc 70 .
- the optical pickup drive circuit 5 performs tracking control so that the laser light 20 a is irradiated onto the concave portion 74 of the sample analysis disk 70 .
- the disk 70 for sample analysis is rotated at a constant linear velocity by the turntable 1, and the laser beam 20a is irradiated onto the concave portion 74 while being track-controlled. It is scanned by light 20a.
- the optical pickup 20 receives the reflected light of the laser light 20a from the sample analysis disk 70.
- the optical pickup 20 detects the light reception level of the reflected light, generates a light reception level signal Sr, and supplies it to the pulse detection circuit 8 .
- the pulse detection circuit 8 Based on the waveform of the received light level signal Sr that detects the received light level of the reflected light from the reaction area 66, the pulse detection circuit 8 exists alone without being within the interference distance where it optically interferes with other fine particles 64. and particles 64 where two or more particles 64 are within an interference distance.
- a state in which three or more particles 64 are within the interference distance is a state in which two adjacent particles 64 among the three or more particles 64 are within the interference distance. Also, the state in which two or more particles 64 are in close proximity includes the state in which two or more particles 64 are in contact with each other.
- a fine particle 64 that does not come close to another fine particle 64 within the interference distance and exists alone is called a single fine particle.
- a single fine particle is sometimes referred to as a single bead.
- a neighboring microparticle in which two microparticles 64 are close to each other within the interference distance is called a double microparticle, and a neighboring microparticle in which three microparticles 64 are close to each other within the interference distance is called a triple microparticle.
- Two or more contiguous microparticles are sometimes referred to as contiguous beads, and bi- and triplicate microparticles are sometimes referred to as bi- and tri-beads, respectively.
- FIG. 10 shows an example of waveforms of the received light level signal Sr for single beads, double beads, and triple beads.
- the light-receiving level signal Sr is a constant value of level Vm in a state where the fine particles 64 are not irradiated with the laser light 20a.
- a single bead waveform Sr1 single pulse waveform
- the single-bead waveform Sr1 is a waveform in which the level drops from the level Vm to the extreme point PV1, which is the position of the minimum amplitude value, and then returns to the level Vm.
- the extremum point PV1 has a level Vb sufficiently smaller than the level Vth, which is, for example, half the amplitude of the pulse.
- the pulse detection circuit 8 detects the single bead captured in the concave portion 74 based on the single bead waveform Sr1 appearing in the received light level signal Sr.
- the pulse detection circuit 8 detects a single bead, the time Td1 from the level Vth to the extreme point PV1 and the time Tu1 from the extreme point PV1 to the level Vth are substantially the same. , whether or not it is a single bead.
- a double bead waveform Sr2 (two adjacent pulse-like waveforms) appears in the received light level signal Sr.
- the double bead waveform Sr2 is a waveform in which the level drops from the level Vm to the extreme point PV1, rises to the extreme point PM1, drops again to the extreme point PV2, and then returns to the level Vm.
- the extreme point PM1 has a level sufficiently lower than the level Vth.
- the extreme point PV2 has level Vb.
- the pulse detection circuit 8 detects the double bead captured in the concave portion 74 based on the double bead waveform Sr2 appearing in the received light level signal Sr.
- the pulse detection circuit 8 may determine whether or not it is a double bead by adding the following conditions.
- the time Td1 from the level Vth to the extreme point PV1 and the time Tu2 from the extreme point PV2 to the level Vth are substantially the same.
- the time Tu1 from the extreme point PV1 to the extreme point PM1 and the time Td2 from the extreme point PM1 to the extreme point PV2 are substantially the same.
- a triple bead waveform Sr3 (triple adjacent pulse waveform) appears in the received light level signal Sr.
- the level decreases from the level Vm to the extreme point PV1, then rises to the extreme point PM1, decreases again to the extreme point PV3, further increases to the extreme point PM2, and reaches the extreme point PM2.
- the extreme points PM1 and PM2 have levels well below the level Vth.
- the extreme point PV3 has level Vb.
- the pulse detection circuit 8 detects the triple bead captured in the concave portion 74 based on the triple bead waveform Sr3 appearing in the received light level signal Sr.
- the pulse detection circuit 8 detects a triplet of beads, the following conditions may be added to determine whether or not it is a triplet of beads.
- the time Td1 from the level Vth to the extreme point PV1 and the time Tu2 from the extreme point PV2 to the level Vth are substantially the same.
- the time Tu1 from the extreme point PV1 to the extreme point PM1 and the time Td2 from the extreme point PM1 to the extreme point PV3 are substantially the same.
- the time Tu3 from the extreme point PV3 to the extreme point PM2 and the time Td3 from the extreme point PM2 to the extreme point PV2 are substantially the same.
- the pulse detection circuit 8 may detect quadruple or more adjacent beads in a manner similar to detecting doublet and triplet beads.
- the pulse detection circuit 8 detects a maximum of n consecutive beads, where n is an integer of 2 or more.
- the pulse detection circuit 8 detects (n-1) types of adjacent pulse-shaped waveforms and distinguishes between the single pulse-shaped waveform and (n-1) types of adjacent pulse-shaped waveforms. In reality, there are almost no neighboring beads with four or more strings, so it is sufficient for the pulse detection circuit 8 to set the maximum number n to 3 and detect single beads, double beads, and triple beads.
- the pulse detection circuit 8 supplies each detection value from a single bead to n-beads to the control unit 9 . Assuming that n is 3, the pulse detection circuit 8 detects a single bead when each track in each reaction area 66 is scanned by the laser beam 20a. If a double bead is detected, the controller 9 outputs a second detection value indicating that a double bead has been detected, and if a triple bead is detected, a third detection value indicating that a triple bead has been detected. supply to
- the control unit 9 divides the reaction region 66 into a plurality of mesh-like unitary domains Uc, and acquires the detection value supplied from the pulse detection circuit 8 for each unitary domain Uc.
- the controller 9 recognizes the position in the circumferential direction within the reaction area 66 based on the reference position detection signal Sp, and recognizes the track scanned by the laser beam 20a through tracking control by the optical pickup drive circuit 5. Therefore, the reaction area 66 can be divided into a plurality of unitary domains Uc.
- the unitary domain Uc has a length in the radial direction that includes the width of the recess 74 of one track, and a length in the circumferential direction that accommodates a triple bead. .
- the size of the unitary domain Uc is not limited to this. may have a circumferential length large enough to accommodate adjacent beads.
- the first embodiment is an analysis that can more accurately count single beads, double beads, and n-strand beads than in the past while avoiding the effects of aggregation of fine particles 64 that label a substance to be detected 63 and assay noise.
- An object is to provide an apparatus and an analysis method.
- the control unit 9 in the analysis device 100 of the first embodiment has a fine particle counting unit 901 as a functional configuration.
- the fine particle counting unit 901 has an actual aggregate value array data creation unit 91 , a theoretical aggregate value array data creation unit 92 , a theoretical aggregate value determination unit 93 , a count value generation unit 94 , and a count value output unit 95 .
- step S1 the pulse detection circuit 8 acquires detection values of a single bead and up to n consecutive adjacent beads.
- the control unit 9 calculates the actual measurement total values C1 to Cn of unitary domains Uc from a single bead to n-beads in one reaction region 66.
- the measured total value C1 is the number of unitary domains Uc in which single beads are detected, out of the number M of all unitary domains Uc in one reaction region 66 .
- the measured total value C2 is the number of unitary domains Uc in which double beads are detected, out of the number M of unitary domains Uc.
- the measured total value C3 is the number of unitary domains Uc in which triple beads are detected, out of the number M of unitary domains Uc.
- the control unit 9 calculates the actual measurement total value C0 of the unitary domain in which the beads (fine particles 64) do not exist.
- the actual measurement total value C0 is the number of unitary domains Uc in which the particles 64 are not present, out of the number M of unitary domains Uc. If k is a variable from 1 to n, the aggregated measured value C0 is obtained by M ⁇ (Ck) obtained by subtracting the total value of the aggregated measured values C1 to Cn from the number M.
- the control unit 9 creates array data (first array data) of the measured total values C0 to Cn. The processing of steps S1 to S4 is executed by the actual total value array data creation unit 91.
- the control unit 9 executes steps S5 to S7 in parallel with steps S2 to S4.
- step S5 the controller 9 sets the density ⁇ of beads (fine particles 64) in the unitary domain Uc to a predetermined value.
- step S6 the control unit 9 calculates the theoretical total values P0 to Pn of the unitary domain Uc in which no bead exists and the unitary domain Uc from the single bead to the n-strand bead based on the probability distribution based on the Poisson distribution theory. do.
- the theory of the Poisson distribution is a classic example of probability theory.
- control unit 9 calculates the theoretical total values P0 to Pn based on the following formula (1) based on the Poisson distribution theory.
- k is a variable from 0 to n.
- e is the base of natural logarithms (Napier's number).
- Pk( ⁇ ) M ⁇ k ⁇ e ⁇ ⁇ / k ! ...(1)
- step S7 the control unit 9 creates array data (second array data) of the theoretical total values P0 to Pn.
- the processing of steps S5 to S7 is executed by the theoretical total value array data creation unit 92.
- step S8 the control unit 9 calculates the error between the array data of the actually measured total values C0 to Cn and the array data of the theoretical total values P0 to Pn.
- step S9 the control unit 9 determines whether or not the density ⁇ that minimizes the difference Diff has been obtained.
- the processing of steps S ⁇ b>8 and S ⁇ b>9 is executed by the theoretical total value determination unit 93 . If the density ⁇ that minimizes the difference Diff has not been obtained (NO), the control unit 9 returns the process to step S5. The density ⁇ that minimizes the difference Diff cannot be obtained by executing the process of step S8 only once.
- step S5 the control unit 9 newly sets the value of the density ⁇ , and executes the processing of steps S5 to S8 again.
- the controller 9 may first set the density ⁇ to a very small value close to 0, and gradually increase the value of the density ⁇ . If the density ⁇ that minimizes the difference Diff has not been obtained, the theoretical total value determination unit 93 sets a new value of the density ⁇ , and uses the new value of the density ⁇ to obtain the theoretical total values P0 to The theoretical total value array data creation unit 92 is controlled to calculate Pn.
- the control unit 9 repeats the processing of steps S5 to S8 while updating the value of the density ⁇ , thereby obtaining the density ⁇ that minimizes the difference Diff. If the density ⁇ that minimizes the difference Diff has been obtained in step S9 (YES), the controller 9 determines the density ⁇ that minimizes the difference Diff as the density ⁇ fix in step S10. The process of step S ⁇ b>10 is executed by the theoretical total value determination unit 93 .
- step S11 the control unit 9 calculates the number of beads (particles 64) in one reaction region 66 (total number) based on the theoretical total values P0 to Pn when the density is ⁇ fix, and counts the beads. Generate a number Vbc.
- the processing of step S ⁇ b>11 is executed by the count value generator 94 .
- step S12 the control unit 9 outputs the bead count value Vbc and terminates the process.
- the processing of step S ⁇ b>12 is executed by the count value output unit 95 .
- the control unit 9 supplies the bead count value Vbc to the storage unit 10 to store it in the storage unit 10 .
- the control unit 9 displays the bead count value Vbc on the display unit 11 so that the operator can confirm the bead count value Vbc.
- FIG. 13 shows the generation and output processing of the bead count value Vbc in one reaction area 66.
- the controller 9 executes the processing shown in FIG. 13 for each reaction region 66.
- the storage unit 10 stores the bead count value Vbc for each reaction area 66 .
- the display unit 11 displays the bead count value Vbc for each reaction area 66 .
- the actual measurement aggregate value C0 in one reaction region 66 ⁇ Cn was determined, and the following values were obtained.
- the measured aggregated value C0 is 9.1 ⁇ 10 7
- the measured aggregated value C1 is 3.2 ⁇ 10 7
- the measured aggregated value C2 is 1.8 ⁇ 10 7
- the measured aggregated value C3 is 6.9 ⁇ 10 6 was individual.
- the density ⁇ fix that minimizes the difference Diff was found to be 0.4566.
- the theoretical total values P0 to Pn at this time are as follows: the theoretical total value P0 is 9.1 ⁇ 10 7 , the theoretical total value P1 is 3.2 ⁇ 10 7 , and the theoretical total value P2 is 1.8 ⁇ The number was 10 7 and the theoretical aggregate value P3 was 6.9 ⁇ 10 6 .
- the array data of the measured total values C0 to Cn and the theoretical total values P0 to Pn are as shown in FIG.
- the difference Diff based on Equation (2) is 14489226.89.
- the measured aggregate value C1 is less than the theoretical aggregate value P1
- the measured aggregate values C2 and C3 are greater than the theoretical aggregate values P2 and P3, respectively.
- the control unit 9 calculates the theoretical total values P0 to Pn that are closest to the actual measurement total values C0 to Cn.
- a bead count value Vbc is generated based on the objective total values P1-Pn. Therefore, according to the analyzer 100, the microparticles 64 immobilized in the reaction region 66 can be counted more accurately than before while avoiding the effects of aggregation of the microparticles 64 that label the detection target substance 63 and assay noise. .
- a particle 64 that exists alone without being within an interference distance that optically interferes with another particle 64, and two or more particles 64 that are adjacent to each other within an interference distance. can be counted more accurately than before.
- FIG. 15 shows the total measured values obtained at each concentration when the concentration (sample concentration) of the substance to be detected 63 in the sample liquid injected into the well 61 is increased to 0, 1, 2, 4, and 8.
- the bead count value Vbc based on C1-Cn and the bead count value Vbc based on theoretical total values P1-Pn are shown.
- the unit of concentration is a. u. is.
- a concentration of 0 is a state in which only the diluted solution does not contain the detection target substance 63 .
- the sample concentration shown in FIG. 15 is about 1/100 of the sample concentration in the above specific example. Therefore, the bead count value Vbc is much smaller than the bead count value Vbc calculated in the above specific example.
- the value R2 indicating the linearity of the approximate straight line represented by equation (4) is 0.9981
- the value R2 indicating the linearity of the approximate straight line represented by equation ( 5 ) is 0.9983.
- the value R2 which indicates linearity, is preferably close to one.
- the bead count value Vbc at a concentration of 0 indicates background noise.
- generating the bead count Vbc based on the theoretical aggregates P1-Pn reduces the background noise by 56% compared to generating the bead count Vbc based on the measured aggregates C1-Cn. has decreased to some extent.
- the slope of the approximate straight line of equation (5) is reduced to 82% compared to the slope of the approximate straight line of equation (4).
- the analyzer 100 has a good S/N ratio and is less susceptible to noise.
- An object of the second embodiment is to provide an analysis apparatus and an analysis method capable of quantitatively evaluating the degree of aggregation of the fine particles 64 that label the substance 63 to be detected.
- the control unit 9 in the analysis device 100 of the second embodiment includes a cohesion degree generation unit 902 as a functional configuration.
- the same parts as those in the fine particle counting unit 901 are denoted by the same reference numerals, and the description thereof may be omitted.
- the cohesion generation unit 902 has a cohesion calculation unit 96 and a cohesion output unit 97 instead of the count value generation unit 94 and the count value output unit 95 .
- the control unit 9 calculates the degree of aggregation indicating the degree of aggregation of the fine particles 64 in step S21. .
- the aggregation degree calculator 96 calculates the aggregation degree Agg indicating the degree of aggregation of the fine particles 64 using the following equation (6).
- Diff( ⁇ fix) is the difference Diff in the density ⁇ fix.
- the degree of cohesion Agg is the quantitative difference Diff ( ⁇ fix) between the array data of the measured total values C0 to Cn and the array data of the theoretical total values P0 to Pn
- the measured total value C0 is a value divided by the count value of fine particles 64 based on Cn.
- the count values of the fine particles 64 based on the actual measurement total values C0 to Cn are the actual measurement total value C1 for the unitary domain in which the single bead exists and the actual measurement total value C2 to Cn for the unitary domain in which 2 to n adjacent beads exist. is a count value obtained by calculating the number of fine particles 64 in the reaction region 66 based on .
- step S22 the control unit 9 (aggregation level output unit 97) outputs the aggregation level Agg and terminates the process.
- the control unit 9 supplies the aggregation degree Agg to the storage unit 10 to store it in the storage unit 10 .
- the control unit 9 displays the aggregation degree Agg on the display unit 11 so that the operator can confirm the aggregation degree Agg.
- FIG. 17 shows the generation and output processing of the cohesion degree Agg in one reaction area 66 .
- the controller 9 executes the processing shown in FIG. 17 for each reaction region 66.
- FIG. The storage unit 10 stores the aggregation degree Agg for each reaction area 66 .
- the display unit 11 displays the aggregation degree Agg for each reaction area 66 .
- the aggregation degree Agg is 0.1695 when calculated based on the formula (6).
- the value of the degree of aggregation Agg varies depending on variations in the process of producing the fine particles 64 having the antibodies 65 immobilized on their surfaces. That is, the value of the degree of aggregation Agg may vary depending on the lot when the fine particles 64 are produced. Therefore, it is preferable that the control unit 9 associates the lot identification number for identifying the lot when the fine particles 64 are produced with the degree of aggregation Agg and stores it in the storage unit 10 .
- the display unit 11 preferably displays the aggregation degree Agg in association with the lot identification number.
- the process of producing the fine particles 64 can be improved so as to minimize the aggregation degree Agg. Further, when there are multiple suppliers of the fine particles 64, it is possible to select a supplier that manufactures the fine particles 64 with a small degree of agglomeration Agg.
- FIG. 18 shows the relationship between the bead count value Vbc and the aggregation degree Agg when the sample analysis disk 70 is analyzed using the microparticles 64 of different lots, with the horizontal axis representing the bead count value Vbc and the vertical axis representing the aggregation degree Agg.
- An example of plotting is shown. For example, if the degree of aggregation Agg is 0.08 or less, it can be determined that the degree of aggregation Agg is good, and if the degree of aggregation Agg exceeds 0.08, it can be determined that the degree of aggregation Agg is not good.
- the control unit 9 may cause the storage unit 10 to store the determination result as to whether the degree of cohesion Agg is good.
- the judgment result can be a judgment value of "0" when the degree of cohesion Agg is good and "1" when the degree of cohesion Agg is not good.
- the control unit 9 may display the determination result on the display unit 11 based on the determination value of whether the degree of cohesion Agg is good.
- the third embodiment aims to achieve both the object of the first embodiment and the object of the second embodiment.
- the control unit 9 includes a cohesion calculation unit 96 and a cohesion output unit 97 in parallel with the count value generation unit 94 and the count value output unit 95 . That is, the analyzer 100 of the third embodiment has both the fine particle counting unit 901 of the first embodiment and the cohesion degree generating unit 902 of the second embodiment.
- the analyzer 100 of the third embodiment stores the bead count value Vbc and the aggregation degree Agg in the storage unit 10 and displays them on the display unit 11 .
- the analysis method of the third embodiment analyzes the sample analysis disk 70 based on the bead count value Vbc and the aggregation degree Agg.
- the present invention is not limited to the first to third embodiments described above, and various modifications can be made without departing from the gist of the present invention.
- the control unit 9 calculates the theoretical aggregate values P0 to Pn to create array data.
- a plurality of sets of array data of theoretical aggregated values P0 to Pn for different densities ⁇ may be created in advance and stored in the storage unit 10 .
- the theoretical total value determination unit 93 selects the array data of the theoretical total values P0 to Pn that are most similar to the array data of the actually measured total values C0 to Cn from the multiple sets of array data read from the storage unit 10. do.
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Abstract
制御部(9)は反応領域を複数の単位区画に分割する。制御部(9)は、微粒子が存在しない単位区画の実測集計値と、単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値との第1の配列データを作成する。制御部(9)は、確率理論による確率分布に基づき、第1の配列データと最も近似する、微粒子が存在しない単位区画の理論的集計値と、単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と、2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値との第2の配列データを作成する。制御部(9)は、単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値とに基づいて、反応領域内の微粒子の計数値を生成する。
Description
本開示は、抗原または抗体等の生体物質を分析するための分析装置及び分析方法に関する。
特許文献1には、光ディスクに固定された生体物質を検出対象物質として計数する分析装置が記載されている。光ディスクには複数の抗体が固定されている。検出対象物質である抗原が抗体と結合することによって、検出対象物質は光ディスクに固定されている。各抗原には、抗原よりも大きい、ナノビーズと称される微粒子が標識として結合している。分析装置は、光ディスクにレーザ光を照射し、光ディスクからの反射光に基づいてナノビーズの個数を検出することによって、検出対象物質を間接的に計数する。
ナノビーズで標識された複数の検出対象物質は、光ディスク上に個々の検出対象物質が他の検出対象物質と十分に離れた状態で固定されているとは限らない。2つまたはそれ以上のナノビーズが極めて近い距離で近接した状態(接触した状態を含む)で光ディスク上に固定されることがある。2つまたはそれ以上のナノビーズが近接していると、反射光の受光レベルを示す受光レベル信号が光学的に互いに干渉する。特許文献1に記載の分析装置は、2つまたはそれ以上のナノビーズが近接して受光レベル信号が互いに干渉しても、ナノビーズを正しく計数するように構成されている。
光ディスクの表面を所定の面積の単位区画に分割すると、各単位区画内に、ナノビーズが結合した検出対象物質が固定されている数(即ち、ナノビーズの個数)は、理論的には確率理論による確率分布に従う。従って、本来であれば、各単位区画内のナノビーズの個数(0個、1個、2個…)の分布は、光ディスク上に配置したウェルに検出対象物質を含む試料液を注入して検出対象物質を光ディスクに固定するときの、試料液中の検出対象物質の濃度に依存する。
しかしながら、実際には、各単位区画内のナノビーズの個数の分布は、確率理論に反して試料液中の検出対象物質の濃度に正確には依存しない。これは、ナノビーズは凝集しやすい性質を有するため、単位区画内に凝集した状態の2つまたはそれ以上のナノビーズが存在することがあるからである。
また、光ディスク上に、検体またはビーズを固定する処理(アッセイ)を実施中に発生するノイズ(以後、アッセイノイズと呼ぶ)を誤ってナノビーズとして計数することもある。例えば、洗浄液または試薬に含まれる塩またはそのほかの成分の析出によるもの、アッセイ処理中に試薬を注入するためのピペットチップが光ディスクに触れ、ビーズがはがれることによるものがアッセイノイズとなることがある。さらに、試薬に含まれる様々なノイズ成分(タンパク質の塊等)が光ディスクに付着し、信号として検出されることがアッセイノイズとなることがある。これらのアッセイノイズが誤ってナノビーズとして計数されることがある。
よって、特許文献1に記載の分析装置によってナノビーズ(検出対象物質)を計数すると、凝集したナノビーズまたはアッセイノイズを計数して、検出対象物質を正しく計数できないことがある。
1またはそれ以上の実施形態は、検出対象物質を標識する微粒子の凝集及びアッセイノイズの影響を回避しながら、他の微粒子と光学的に干渉する干渉距離以内に近接せず単独で存在している単微粒子と、互いに干渉距離以内に近接する2つまたはそれ以上の近接微粒子とを、従来よりも正しく計数することができる分析装置及び分析方法を提供することを目的とする。
検出対象物質を標識する微粒子の凝集の程度を定量的に評価することができれば、微粒子の品質を向上させたり、凝集を抑制するための方法の開発に貢献できたりする。そこで、微粒子の凝集の程度を定量的に評価することができる分析装置及び分析方法の登場が望まれる。1またはそれ以上の実施形態は、検出対象物質を標識する微粒子の凝集の程度を定量的に評価することができる分析装置及び分析方法をさらに提供することを目的とする。
1またはそれ以上の実施形態の第1の態様によれば、標識となる微粒子が結合した検出対象物質が複数固定された反応領域を有する試料分析用ディスクにレーザ光を照射し、前記反応領域からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号を生成する光ピックアップと、前記受光レベル信号の波形から、単独で存在している単微粒子を示す単パルス状波形と、隣接する微粒子が干渉距離以内に近接する、整数である2個からn個の近接微粒子を示す(n-1)種類の近接パルス状波形をそれぞれ検出して各検出値を生成するパルス検出回路と、前記反応領域内の前記微粒子の計数値を生成する微粒子計数部とを備える分析装置が提供される。
前記微粒子計数部は、前記反応領域を複数の単位区画に分割し、前記各検出値に基づいて、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを個別に集計して、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個の近接微粒子が存在する単位区画の各実測集計値とを生成し、前記反応領域内の全ての前記単位区画の個数から、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを減算することにより、前記単パルス状波形と前記近接パルス状波形とのいずれも検出されなかった単位区画の個数を演算して、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値を生成する。
さらに、前記微粒子計数部は、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値との第1の配列データを作成し、確率理論による確率分布に基づく理論的集計値の配列データであって、前記第1の配列データと最も近似する、前記微粒子が存在しない単位区画の理論的集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値との第2の配列データを作成または選択し、前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値とに基づいて前記反応領域内の前記微粒子の個数を演算する。
1またはそれ以上の実施形態の第2の態様によれば、光ピックアップが、標識となる微粒子と結合した検出対象物質が複数固定された反応領域を有する試料分析用ディスクにレーザ光を照射し、前記光ピックアップが、前記反応領域からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号を生成し、パルス検出回路が、前記受光レベル信号の波形から、単独で存在している単微粒子を示す単パルス状波形と、隣接する微粒子が干渉距離以内に近接する、整数である2個からn個の近接微粒子を示す(n-1)種類の近接パルス状波形をそれぞれ検出して各検出値を生成し、前記各検出値を取得する制御部が、前記反応領域を複数の単位区画に分割し、前記各検出値に基づいて、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを個別に集計して、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個の近接微粒子が存在する単位区画の各実測集計値とを生成し、前記反応領域内の全ての前記単位区画の個数から、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを減算することにより、前記単パルス状波形と前記近接パルス状波形とのいずれも検出されなかった単位区画の個数を演算して、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値を生成し、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値との第1の配列データを作成し、確率理論による確率分布に基づく理論的集計値の配列データであって、前記第1の配列データと最も近似する、前記微粒子が存在しない単位区画の理論的集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値との第2の配列データを作成または選択し、前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値とに基づいて前記反応領域内の前記微粒子の個数を演算することにより、前記反応領域内の前記微粒子の計数値を生成する分析方法が提供される。
1またはそれ以上の実施形態の第3の態様によれば、標識となる微粒子と結合した検出対象物質が複数固定された反応領域を有する試料分析用ディスクにレーザ光を照射し、前記反応領域からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号を生成する光ピックアップと、前記受光レベル信号の波形から、単独で存在している単微粒子を示す単パルス状波形と、隣接する微粒子が干渉距離以内に近接する、整数である2個からn個の近接微粒子を示す(n-1)種類の近接パルス状波形をそれぞれ検出して各検出値を生成するパルス検出回路と、前記反応領域内の前記微粒子の凝集の程度を示す凝集度を算出する凝集度生成部とを備える分析装置が提供される。
前記凝集度生成部は、前記反応領域を複数の単位区画に分割し、前記各検出値に基づいて、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを個別に集計して、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個の近接微粒子が存在する単位区画の各実測集計値とを生成し、前記反応領域内の全ての前記単位区画の個数から、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを減算することにより、前記単パルス状波形と前記近接パルス状波形とのいずれも検出されなかった単位区画の個数を演算して、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値を生成する。
さらに、前記凝集度生成部は、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値との第1の配列データを作成し、確率理論による確率分布に基づく理論的集計値の配列データであって、前記第1の配列データと最も近似する、前記微粒子が存在しない単位区画の理論的集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値との第2の配列データを作成または選択し、前記第1の配列データと前記第2の配列データとの定量的な差分を、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値とに基づいて前記反応領域内の前記微粒子の個数を演算した計数値で除算する。
1またはそれ以上の実施形態の第4の態様によれば、光ピックアップが、標識となる微粒子と結合した検出対象物質が複数固定された反応領域を有する試料分析用ディスクにレーザ光を照射し、前記光ピックアップが、前記反応領域からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号を生成し、パルス検出回路が、前記受光レベル信号の波形から、単独で存在している単微粒子を示す単パルス状波形と、隣接する微粒子が干渉距離以内に近接する、整数である2個からn個の近接微粒子を示す(n-1)種類の近接パルス状波形をそれぞれ検出して各検出値を生成し、前記各検出値を取得する制御部が、前記反応領域を複数の単位区画に分割し、前記各検出値に基づいて、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを個別に集計して、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個の近接微粒子が存在する単位区画の各実測集計値とを生成し、前記反応領域内の全ての前記単位区画の個数から、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを減算することにより、前記単パルス状波形と前記近接パルス状波形とのいずれも検出されなかった単位区画の個数を演算して、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値を生成し、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値との第1の配列データを作成し、確率理論による確率分布に基づく理論的集計値の配列データであって、前記第1の配列データと最も近似する、前記微粒子が存在しない単位区画の理論的集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値との第2の配列データを作成または選択し、前記第1の配列データと前記第2の配列データとの定量的な差分を、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値とに基づいて前記反応領域内の前記微粒子の個数を演算した計数値で除算することにより、前記微粒子の凝集の程度を示す凝集度を算出する分析方法が提供される。
1またはそれ以上の実施形態の分析装置及び分析方法によれば、検出対象物質を標識する微粒子の凝集及びアッセイノイズの影響を回避しながら、他の微粒子と光学的に干渉する干渉距離以内に近接せず単独で存在している単微粒子と、互いに干渉距離以内に近接する2つまたはそれ以上の近接微粒子とを、従来よりも正しく計数することができる。また、1またはそれ以上の実施形態の分析装置及び分析方法によれば、検出対象物質を標識する微粒子の凝集の程度を定量的に評価することができる。
以下、第1及び第2実施形態の分析装置及び分析方法について、添付図面を参照して説明する。第1及び第2実施形態の分析装置の構成及び動作を説明する前に、図1~図6を用いて、第1及び第2実施形態の分析装置によって分析される光ディスクであって、検出対象物質が表面に固定されている試料分析用ディスクをどのように作製するのかを説明する。
[検出対象物質捕捉ユニットの構成]
図1は、検出対象物質が表面に固定されている試料分析用ディスク70を作製するための検出対象物質捕捉ユニット60(以下、捕捉ユニット60)をカートリッジ80側から見た状態を示している。図2は捕捉ユニット60を試料分析用ディスク70側から見た状態を示している。図3は、捕捉ユニット60を図1のA-A線で切断した断面を示している。図4は、カートリッジ80を試料分析用ディスク70から取り外した状態を示している。
図1は、検出対象物質が表面に固定されている試料分析用ディスク70を作製するための検出対象物質捕捉ユニット60(以下、捕捉ユニット60)をカートリッジ80側から見た状態を示している。図2は捕捉ユニット60を試料分析用ディスク70側から見た状態を示している。図3は、捕捉ユニット60を図1のA-A線で切断した断面を示している。図4は、カートリッジ80を試料分析用ディスク70から取り外した状態を示している。
図1~図4に示すように、捕捉ユニット60は、試料分析用ディスク70、カートリッジ80及びシール部材90を備える。試料分析用ディスク70は、例えば、ブルーレイディスク(BD)、DVD、コンパクトディスク(CD)等の光ディスクと同等の円盤形状を有する。試料分析用ディスク70は、例えば、一般的に光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂またはシクロオレフィンポリマー等の樹脂材料で形成されている。なお、試料分析用ディスク70は、上記の光ディスクに限定されるものではなく、他の形態であってもよく、他の所定の規格に準拠した光ディスクを用いることもできる。
図5は、試料分析用ディスク70の表面の部分的な拡大図である。図5に示すように、試料分析用ディスク70の表面には、1本の凸部73と1本の凹部74とが互いに隣接した状態で内周部から外周部に向かってスパイラル状に形成されている。凸部73は光ディスクのランドに相当し、凹部74は光ディスクのグルーブに相当する。
スパイラル状に形成された互いに隣接する凸部73及び凹部74の半径方向の各位置における1周が1つのトラックである。即ち、周方向のある位置でレーザ光の照射による凹部74の走査を開始して試料分析用ディスク70が360度回転し、レーザ光が半径方向の位置はずれているものの周方向の同じ位置に至るまでが1つのトラックである。凹部74の半径方向のピッチに相当するトラックピッチは例えば320nmである。
図2~図4に示すように、試料分析用ディスク70は、中心部に形成された中心孔71と、外周部に形成された切欠き72とを有する。切欠き72は試料分析用ディスク70の基準位置を識別するための基準位置識別部である。基準位置識別部を切欠き72以外で形成してもよい。
図1に示すように、カートリッジ80は、周方向に形成された複数の円筒状の貫通孔81を有する。複数の貫通孔81は、それぞれの中心が同一円周上に位置するように等間隔に形成されている。図1~図4に示すように、カートリッジ80は、中心部に形成された凸部82と、外周部に形成された凸部83とを有する。凸部82を試料分析用ディスク70の中心孔71に挿入し、凸部83を切欠き72に挿入することにより、試料分析用ディスク70にカートリッジ80が位置決めされて両者が一体化される。
図3に示すように、シール部材90はカートリッジ80と試料分析用ディスク70との間に配置されている。シール部材90は例えばシリコーンゴム等の弾性変形部材で作製したリング状のパッキンである。シール部材90は各貫通孔81の周囲に配置されている。試料分析用ディスク70にカートリッジ80を取り付けると、シール部材90は、試料分析用ディスク70の表面に形成された凹部74を埋めるように弾性変形する。
図1及び図3に示すように、試料分析用ディスク70にカートリッジ80を取り付けた状態で、捕捉ユニット60は、貫通孔81とシール部材90と試料分析用ディスク70の表面とで形成される円筒状の複数のウェル61を有する。貫通孔81及びシール部材90の内周面はウェル61の内周面を構成し、試料分析用ディスク70の表面はウェル61の底面を構成する。ウェル61は試料液または緩衝液等の溶液を溜めるための容器として機能する。シール部材90によって試料分析用ディスク70の表面にカートリッジ80が密着することによって、ウェル61から溶液が漏れることはほとんどない。
図1に示す捕捉ユニット60は8個のウェル61を備えるが、ウェル61は少なくとも1つあればよく、ウェル61の個数は限定されない。
図6は、ウェル61内の試料分析用ディスク70の表面を概念的に示している。各ウェル61の底面には、試料分析用ディスク70に形成されている全てのトラックのうちの一部のトラックであり、周方向に部分的な複数のトラックが存在している。各ウェル61の底面の複数のトラックは、厳密にはほぼ円弧状である。図6は凸部73及び凹部74を拡大して図示しており、各ウェル61内には2万本程度のトラックが存在する。
[反応領域の形成方法]
オペレータは、以上のように構成される捕捉ユニット60を用い、抗体62(図7A参照)を含む緩衝液をウェル61に注入してインキュベートする。すると、図7Aに示すように、抗体62は、ウェル61の底面の凸部73及び凹部74に固定される。オペレータは、緩衝液を排出してウェル61内を洗浄し、抗原である検出対象物質63(図7B参照)を含む試料液をウェル61に注入してインキュベートする。すると、図7Bに示すように、検出対象物質63は、抗体62との抗原抗体反応によって抗体62と特異的に結合する。
オペレータは、以上のように構成される捕捉ユニット60を用い、抗体62(図7A参照)を含む緩衝液をウェル61に注入してインキュベートする。すると、図7Aに示すように、抗体62は、ウェル61の底面の凸部73及び凹部74に固定される。オペレータは、緩衝液を排出してウェル61内を洗浄し、抗原である検出対象物質63(図7B参照)を含む試料液をウェル61に注入してインキュベートする。すると、図7Bに示すように、検出対象物質63は、抗体62との抗原抗体反応によって抗体62と特異的に結合する。
検出対象物質63は抗原または抗体等の任意の生体物質であり、典型的にはエクソソームである。エクソソームは血液等の体液に存在する。血液を試料とすれば、試料液は血液を含む液体である。エクソソームの大きさは100nm程度である。
オペレータは、試料液を排出してウェル61内を洗浄し、標識となる微粒子64(図7C参照)を含む緩衝液をウェル61に注入してインキュベートする。微粒子64はナノビーズと称されることがある。微粒子64の表面には、検出対象物質63との抗原抗体反応によって特異的に結合する抗体65が固定されている。すると、図7Cに示すように、微粒子64は検出対象物質63と結合した状態で凹部74に捕捉される。微粒子64の大きさは200nm程度である。
なお、図7Bにおいて、凸部73に固定されている抗体62に検出対象物質63が結合することがあるが、ウェル61内を洗浄することによって凸部73上の検出対象物質63は大方除去される。よって、図7Cにおいて、ほとんどの微粒子64は凹部74に捕捉される。
図8は、ウェル61内の凹部74に複数の微粒子64が捕捉されている状態を示している。複数の微粒子64は、複数のトラックに大方分散して固定されているものの、2つまたはそれ以上の微粒子64が極めて近い距離で近接または接触した状態で凹部74に固定されることがある。
オペレータは、微粒子64を含む緩衝液を排出してウェル61内を洗浄する。その後、図4に示すように、オペレータは、カートリッジ80及びシール部材90を試料分析用ディスク70から取り外す。試料分析用ディスク70の表面には、ウェル61の位置に対応して、検出対象物質63と結合した状態の複数の微粒子64が捕捉されている反応領域66が形成される。図1に示す捕捉ユニット60を用いることにより、試料分析用ディスク70の表面には、反応領域66が8か所形成される。試料分析用ディスク70は、乾燥の後に、第1及び第2実施形態の分析装置である図9に示す分析装置100によって分析される。
[分析装置の構成及び動作]
図9に示すように、分析装置100は、ターンテーブル1、クランパ2、ターンテーブル駆動部3、ターンテーブル駆動回路4、光ピックアップ駆動回路5、基準位置検出センサ6、ガイド軸7、パルス検出回路8、制御部9、記憶部10、表示部11、光ピックアップ20を備える。ターンテーブル駆動部3は、スピンドルモータによって構成することができる。
図9に示すように、分析装置100は、ターンテーブル1、クランパ2、ターンテーブル駆動部3、ターンテーブル駆動回路4、光ピックアップ駆動回路5、基準位置検出センサ6、ガイド軸7、パルス検出回路8、制御部9、記憶部10、表示部11、光ピックアップ20を備える。ターンテーブル駆動部3は、スピンドルモータによって構成することができる。
パルス検出回路8は、一例としてFPGA(Field Programmable Gate Array)である集積回路で構成されている。パルス検出回路8は、ASIC(Application Specific Integrated Circuit)で構成されていてもよく、マイクロプロセッサで構成されていてもよい。制御部9は、CPU(Central Processing Unit)で構成されている。パルス検出回路8と制御部9とが一体化されていてもよい。
ターンテーブル1上には、試料分析用ディスク70が、反応領域66が下向きになるように載置されている。クランパ2は、ターンテーブル1に接近または離隔する方向に駆動される。ターンテーブル1上に試料分析用ディスク70が載置された状態でクランパ2がターンテーブル1に接近する方向に駆動されると、試料分析用ディスク70はターンテーブル1とクランパ2とによって保持される。
ターンテーブル駆動部3は、ターンテーブル1を試料分析用ディスク70及びクランパ2と共に、回転軸C1回りに回転させる。ターンテーブル駆動回路4は、制御部9による制御に基づき、ターンテーブル駆動部3によるターンテーブル1の回転を制御する。例えば、ターンテーブル駆動回路4は、ターンテーブル1が試料分析用ディスク70及びクランパ2と共に一定の線速度で回転するようターンテーブル駆動部3を制御する。
基準位置検出センサ6は試料分析用ディスク70の外周部近傍に配置されている。基準位置検出センサ6は、例えばフォトリフレクタ等の反射型の光センサである。基準位置検出センサ6は、試料分析用ディスク70が回転している状態で試料分析用ディスク70の外周部に検出光6aを照射し、試料分析用ディスク70からの反射光を受光する。
基準位置検出センサ6は試料分析用ディスク70の切欠き72を検出して基準位置検出信号Spを生成して、制御部9に供給する。基準位置検出信号Spは、試料分析用ディスク70の1回転ごとにロー(またはハイ)となるパルス信号である。回転している試料分析用ディスク70の切欠き72が基準位置検出センサ6の下方に位置し、検出光6aが切欠き72によって非反射状態となると、ハイからローに立ち下がり、切欠き72が基準位置検出センサ6の下方を過ぎて検出光6aが反射状態となると、ローからハイへと立ち上がる。制御部9に、基準位置検出センサ6が生成するパルス信号とは逆極性のパルス信号が供給されてもよい。
基準位置検出センサ6として透過型の光センサであるフォトインタラプタを用いてもよい。この場合、基準位置検出センサ6は、検出光6aが切欠き72を通過するとローからハイへと立ち上がり、検出光6aが試料分析用ディスク70で遮断されるとハイからローに立ち下がる基準位置検出信号Spを生成する。この場合においても、制御部9に、基準位置検出センサ6が生成するパルス信号とは逆極性のパルス信号が供給されてもよい。
制御部9は、基準位置検出信号Spに基づいて、試料分析用ディスク70の回転周期及びトラックごとに基準位置を検出する。
ガイド軸7は、試料分析用ディスク70と平行に、かつ、試料分析用ディスク70の半径方向に沿って配置されている。試料分析用ディスク70の半径方向は、ターンテーブル1の回転軸C1に直交する方向である。光ピックアップ20はガイド軸7に支持されている。光ピックアップ駆動回路5は、制御部9による制御に基づき、光ピックアップ20をガイド軸7に沿って試料分析用ディスク70の半径方向に移動させる。光ピックアップ20は対物レンズ21を有する。光ピックアップ駆動回路5は、試料分析用ディスク70に照射するレーザ光20aをフォーカス制御するために対物レンズ21を試料分析用ディスク70に接近または離隔する方向に移動させる。
光ピックアップ駆動回路5は、レーザ光20aを試料分析用ディスク70の凹部74に照射せるようトラッキング制御する。試料分析用ディスク70がターンテーブル1によって一定の線速度で回転し、レーザ光20aが凹部74にトラッキング制御されながら照射されるので、スパイラル状の凹部74は内周部から外周部に向かってレーザ光20aによって走査される。
光ピックアップ20は、試料分析用ディスク70からのレーザ光20aの反射光を受光する。光ピックアップ20は、反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号Srを生成して、パルス検出回路8に供給する。
パルス検出回路8は、反応領域66からの反射光の受光レベルを検出した受光レベル信号Srの波形に基づいて、他の微粒子64と光学的に干渉する干渉距離以内に近接せず単独で存在している微粒子64と、2つまたはそれ以上の微粒子64が干渉距離以内に近接している微粒子64とを検出する。3つ以上の微粒子64が干渉距離以内に近接している状態は、3つ以上の微粒子64における隣接する2つの微粒子64が干渉距離以内に近接している状態である。また、2つまたはそれ以上の微粒子64が近接している状態には、2つまたはそれ以上の微粒子64が互いに接触している状態が含まれる。
他の微粒子64と干渉距離以内に近接せず単独で存在している微粒子64を単微粒子と称することとする。単微粒子を単ビーズと称することがある。2つの微粒子64が干渉距離以内に近接している近接微粒子を2連微粒子、3つの微粒子64が干渉距離以内に近接している近接微粒子を3連微粒子と称することとする。2つまたはそれ以上の近接微粒子を近接ビーズ、2連微粒子及び3連微粒子をそれぞれ2連ビーズ及び3連ビーズと称することがある。
図10は、単ビーズ、2連ビーズ、3連ビーズの受光レベル信号Srの波形の一例を示している。受光レベル信号Srは、レーザ光20aが微粒子64に照射されていない状態では、ほぼレベルVmの一定値である。レーザ光20aが単ビーズに照射されると、受光レベル信号Srには、振幅方向として下に凸のパルス状波形である単ビーズ波形Sr1(単パルス状波形)が現れる。単ビーズ波形Sr1は、レベルが、レベルVmから振幅の極小値の位置である極値点PV1まで低下し、その後、レベルVmに戻る波形である。極値点PV1は、パルスの振幅の例えば半値であるレベルVthより十分に小さいレベルVbを有する。
パルス検出回路8は、受光レベル信号Srに現れる単ビーズ波形Sr1に基づいて、凹部74に捕捉されている単ビーズを検出する。パルス検出回路8は、単ビーズを検出するときに、レベルVthから極値点PV1までの時間Td1と、極値点PV1からレベルVthまでの時間Tu1とがほぼ同じ時間であるという条件を加えて、単ビーズであるか否かを判定してもよい。
レーザ光20aが2連ビーズに照射されると、受光レベル信号Srには2連ビーズ波形Sr2(2連の近接パルス状波形)が現れる。2連ビーズ波形Sr2は、レベルが、レベルVmから極値点PV1まで低下した後に極値点PM1まで上昇し、再び極値点PV2まで低下し、その後、レベルVmに戻る波形である。極値点PM1はレベルVthより十分に小さいレベルを有する。極値点PV2はレベルVbを有する。
パルス検出回路8は、受光レベル信号Srに現れる2連ビーズ波形Sr2に基づいて、凹部74に捕捉されている2連ビーズを検出する。パルス検出回路8は、2連ビーズを検出するとき、次の条件を加えて2連ビーズであるか否かを判定してもよい。レベルVthから極値点PV1までの時間Td1と、極値点PV2からレベルVthまでの時間Tu2とがほぼ同じ時間である。さらに、極値点PV1から極値点PM1までの時間Tu1と、極値点PM1から極値点PV2までの時間Td2とがほぼ同じ時間である。
レーザ光20aが3連ビーズに照射されると、受光レベル信号Srには3連ビーズ波形Sr3(3連の近接パルス状波形)が現れる。3連ビーズ波形Sr3は、レベルが、レベルVmから極値点PV1まで低下した後に極値点PM1まで上昇し、再び極値点PV3まで低下し、さらに極値点PM2まで上昇して極値点PV2まで低下し、その後、レベルVmに戻る波形である。極値点PM1及びPM2はレベルVthより十分に小さいレベルを有する。極値点PV3はレベルVbを有する。
パルス検出回路8は、受光レベル信号Srに現れる3連ビーズ波形Sr3に基づいて、凹部74に捕捉されている3連ビーズを検出する。パルス検出回路8は、3連ビーズを検出するとき、次の条件を加えて3連ビーズであるか否かを判定してもよい。レベルVthから極値点PV1までの時間Td1と、極値点PV2からレベルVthまでの時間Tu2とがほぼ同じ時間である。極値点PV1から極値点PM1までの時間Tu1と、極値点PM1から極値点PV3までの時間Td2とがほぼ同じ時間である。さらに、極値点PV3から極値点PM2までの時間Tu3と、極値点PM2から極値点PV2までの時間Td3とがほぼ同じ時間である。
パルス検出回路8は、2連ビーズ及び3連ビーズを検出するのと同様の検出方法で4連またはそれ以上の近接ビーズを検出してもよい。nを2以上の整数として、パルス検出回路8は最大でn連ビーズを検出する。パルス検出回路8は、(n-1)種類の近接パルス状波形を検出し、単パルス状波形と(n-1)種類の近接パルス状波形とを互いに区別する。現実的には、4連またはそれ以上の近接ビーズはほとんど存在しないので、パルス検出回路8は、最大数nを3として、単ビーズと2連ビーズ及び3連ビーズを検出すれば十分である。
パルス検出回路8は、単ビーズからn連ビーズまでの各検出値を制御部9に供給する。nを3とすれば、パルス検出回路8は、各反応領域66における各トラックがレーザ光20aによって走査されるときに、単ビーズを検出すれば単ビーズを検出したことを示す第1の検出値を、2連ビーズを検出すれば2連ビーズを検出したことを示す第2の検出値を、3連ビーズを検出すれば3連ビーズを検出したことを示す第3の検出値を制御部9に供給する。
図11に示すように、制御部9は、反応領域66をメッシュ状の複数の単位区画Ucに分割し、単位区画Ucごとにパルス検出回路8から供給される検出値を取得する。制御部9は、基準位置検出信号Spに基づいて反応領域66内の周方向の位置を認識しており、光ピックアップ駆動回路5によるトラッキング制御によってレーザ光20aが走査しているトラックを認識しているから、反応領域66を複数の単位区画Ucに分割することができる。
図11に示す例では、単位区画Ucは、半径方向の長さが1トラックの凹部74の幅を含む長さを有し、周方向の長さが3連ビーズが収まる程度の長さを有する。単位区画Ucの大きさはこれに限定されず、半径方向の長さが2トラックの凹部74の幅を含む長さを有してもよいし、周方向の長さが4連ビーズまたはそれ以上の近接ビーズが収まる程度の周方向の長さを有してもよい。
[第1実施形態の分析装置及び分析方法]
第1実施形態は、検出対象物質63を標識する微粒子64の凝集及びアッセイノイズの影響を回避しながら、単ビーズと2連ビーズからn連ビーズとを、従来よりも正しく計数することができる分析装置及び分析方法を提供することを目的とする。
第1実施形態は、検出対象物質63を標識する微粒子64の凝集及びアッセイノイズの影響を回避しながら、単ビーズと2連ビーズからn連ビーズとを、従来よりも正しく計数することができる分析装置及び分析方法を提供することを目的とする。
図12に示すように、第1実施形態の分析装置100における制御部9は、機能的な構成として微粒子計数部901を備える。微粒子計数部901は、実集計値配列データ作成部91、理論的集計値配列データ作成部92、理論的集計値決定部93、計数値生成部94、計数値出力部95を有する。
図13に示すフローチャートを用いて、制御部9(微粒子計数部901)が実行する具体的な処理を説明する。制御部9は、処理を開始すると、ステップS1にて、パルス検出回路8より単ビーズ及びn連までの近接ビーズの各検出値を取得する。制御部9は、ステップS2にて、1つの反応領域66において、単ビーズからn連ビーズまでの単位区画Ucの実測集計値C1~Cnを演算する。
実測集計値C1は、1つの反応領域66内の全ての単位区画Ucの個数Mのうちの、単ビーズが検出された単位区画Ucの個数である。実測集計値C2は、単位区画Ucの個数Mのうちの、2連ビーズが検出された単位区画Ucの個数である。実測集計値C3は、単位区画Ucの個数Mのうちの、3連ビーズが検出された単位区画Ucの個数である。このように、制御部9は、単ビーズが検出された単位区画Ucからn連ビーズが検出された単位区画Ucまで、単位区画Ucの個数を個別に集計する。
制御部9は、ステップS3にて、ビーズ(微粒子64)が存在しない単位区画の実測集計値C0を演算する。実測集計値C0は、単位区画Ucの個数Mのうちの、微粒子64が存在しない単位区画Ucの個数である。kを1~nの変数とすれば、実測集計値C0は、個数Mから実測集計値C1~Cnの合計値を減算したM-Σ(Ck)で求められる。制御部9は、ステップS4にて、実測集計値C0~Cnの配列データ(第1の配列データ)を作成する。ステップS1~S4の処理は、実集計値配列データ作成部91で実行される。
制御部9は、ステップS2~S4と並行して、ステップS5~S7の処理を実行する。制御部9は、ステップS5にて、単位区画Uc内のビーズ(微粒子64)の密度λを所定の値に設定する。制御部9は、ステップS6にて、ポアソン分布の理論による確率分布に基づき、ビーズが存在しない単位区画Ucと、単ビーズからn連ビーズまでの単位区画Ucの理論的集計値P0~Pnを演算する。ポアソン分布の理論は典型的な確率理論の例である。
具体的には、制御部9は、次のポアソン分布の理論による式(1)に基づき、理論的集計値P0~Pnを演算する。ここでは、kは0~nの変数である。eは自然対数の底(ネイピア数)である。
Pk(λ)=M×λk×e-λ/k! …(1)
Pk(λ)=M×λk×e-λ/k! …(1)
制御部9は、ステップS7にて、理論的集計値P0~Pnの配列データ(第2の配列データ)を作成する。ステップS5~S7の処理は、理論的集計値配列データ作成部92で実行される。
制御部9は、ステップS8にて、実測集計値C0~Cnの配列データと、理論的集計値P0~Pnの配列データとの誤差を演算する。一例として、制御部9は、次の式(2)を用いて差分Diffを定量化する。
Diff=(Σk(|Pk(λ)-Ck|2))1/2 …(2)
Diff=(Σk(|Pk(λ)-Ck|2))1/2 …(2)
制御部9は、ステップS9にて、差分Diffが最小となる密度λが求められたか否かを判定する。ステップS8及びS9の処理は、理論的集計値決定部93で実行される。差分Diffが最小となる密度λが求められていなければ(NO)、制御部9は、処理をステップS5に戻す。ステップS8の処理を1回実行したのみでは差分Diffが最小となる密度λが求められない。
そこで、制御部9は、ステップS5にて新たに密度λの値を設定し、再びステップS5~S8の処理を実行する。例えば、制御部9は、最初に、0に近い極めて小さな値を密度λに設定し、密度λの値を徐々に大きくしていけばよい。理論的集計値決定部93は、差分Diffが最小となる密度λが求められていなければ、新たに密度λの値を設定して、新たに密度λの値を用いて理論的集計値P0~Pnを演算するよう理論的集計値配列データ作成部92を制御する。
制御部9が、密度λの値を更新しながらステップS5~S8の処理を繰り返すことにより、差分Diffが最小となる密度λが求められる。ステップS9にて差分Diffが最小となる密度λが求められていれば(YES)、制御部9は、ステップS10にて、差分Diffが最小となる密度λを密度λfixと決定する。ステップS10の処理は、理論的集計値決定部93で実行される。
制御部9は、ステップS11にて、密度λfixとしたときの理論的集計値P0~Pnに基づき、1つの反応領域66内のビーズ(微粒子64)の個数(集計個数)を演算してビーズ計数値Vbcを生成する。ステップS11の処理は、計数値生成部94で実行される。
ビーズ計数値Vbcは次の式(3)で表される。理論的集計値P0は微粒子64が存在しない単位区画Ucの理論的集計値であるので、式(3)で得られるビーズ計数値Vbcは理論的集計値P1~Pnに基づく集計個数と等価である。
Vbc=Σk(k×Pk(λfix)) …(3)
Vbc=Σk(k×Pk(λfix)) …(3)
制御部9は、ステップS12にて、ビーズ計数値Vbcを出力して処理を終了させる。ステップS12の処理は、計数値出力部95で実行される。制御部9は、ビーズ計数値Vbcを記憶部10に供給して記憶部10に記憶させる。図13では図示していないが、制御部9は、オペレータがビーズ計数値Vbcを確認できるよう、ビーズ計数値Vbcを表示部11に表示する。
図13は、1つの反応領域66におけるビーズ計数値Vbcの生成及び出力の処理を示している。試料分析用ディスク70に複数の反応領域66を形成した場合には、制御部9は反応領域66ごとに図13に示す処理を実行する。記憶部10は反応領域66ごとのビーズ計数値Vbcを記憶する。表示部11は反応領域66ごとのビーズ計数値Vbcを表示する。
次に、具体例を説明する。ウェル61の直径を6mm、単位区画Ucの大きさを320nm×600nm、1つの反応領域66における単位区画Ucの個数Mを1.47×108個として、1つの反応領域66における実測集計値C0~Cnを求めたところ、以下の値が得られた。実測集計値C0が9.1×107個、実測集計値C1が3.2×107個、実測集計値C2が1.8×107個、実測集計値C3が6.9×106個であった。
差分Diffが最小となる密度λfixは0.4566と求められた。このときの理論的集計値P0~Pnは、理論的集計値P0が9.1×107個、理論的集計値P1が3.2×107個、理論的集計値P2が1.8×107個、理論的集計値P3が6.9×106個であった。
よって、実測集計値C0~Cnと理論的集計値P0~Pnの配列データは、図14に示すとおりとなる。このときの、式(2)に基づく差分Diffは14489226.89である。図14に示すように、単ビーズでは、実測集計値C1は理論的集計値P1より少なく、2連ビーズ及び3連ビーズでは、実測集計値C2及びC3はそれぞれ理論的集計値P2及びP3より多い。
2連ビーズ及び3連ビーズで実測集計値C2及びC3がそれぞれ理論的集計値P2及びP3より多いのは、微粒子64の凝集及びアッセイノイズの影響によるものと考えられる。単ビーズで実測集計値C1が理論的集計値P1より少ないのは、本来単ビーズが検出されるべき単位区画Ucにおいて2連ビーズまたは3連ビーズが検出されているからである。
制御部9(計数値生成部94)は、実測集計値C1~Cnに基づいてビーズ計数値Vbcを生成する代わりに、実測集計値C0~Cnと最も近似する理論的集計値P0~Pnにおける理論的集計値P1~Pnに基づいてビーズ計数値Vbcを生成する。よって、分析装置100によれば、検出対象物質63を標識する微粒子64の凝集及びアッセイノイズの影響を回避しながら、反応領域66に固定されている微粒子64を従来よりも正しく計数することができる。
分析装置100によれば、他の微粒子64と光学的に干渉する干渉距離以内に近接せず単独で存在している微粒子64と、互いに干渉距離以内に近接する2つまたはそれ以上の微粒子64とを、従来よりも正しく計数することができる。
図15は、ウェル61に注入する試料液中の検出対象物質63の濃度(サンプル濃度)を、濃度0、1、2、4、8と上昇させたときに、各濃度で得られる実測集計値C1~Cnに基づくビーズ計数値Vbcと、理論的集計値P1~Pnに基づくビーズ計数値Vbcを示している。濃度の単位はa.u.である。濃度0とは、希釈液のみで検出対象物質63を含まない状態である。
なお、図15に示すサンプル濃度は、上記の具体例におけるサンプル濃度の1/100程度の濃度である。よって、ビーズ計数値Vbcは上記の具体例で計算されるビーズ計数値Vbcと比較して格段に小さい。
横軸のサンプル濃度をx、縦軸のビーズ計数値Vbcをyとすると、実測集計値C1~Cnに基づいて得られるビーズ計数値Vbcの近似直線は、式(4)で表される。理論的集計値P1~Pnに基づいて得られるビーズ計数値Vbcの近似直線は、式(5)で表される。
y=60637x+31165 …(4)
y=49815x+17469 …(5)
y=60637x+31165 …(4)
y=49815x+17469 …(5)
式(4)で表される近似直線の直線性を示す値R2は0.9981であり、式(5)で表される近似直線の直線性を示す値R2は0.9983である。直線性を示す値R2は1に近い値であることが好ましい。制御部9が、実測集計値C1~Cnの代わりに理論的集計値P1~Pnに基づいてビーズ計数値Vbcを生成することにより、サンプル濃度を変化させたときの直線性が改善される。
濃度0のときのビーズ計数値Vbcは、バックグラウンドノイズを示す。図15において、理論的集計値P1~Pnに基づいてビーズ計数値Vbcを生成すると、実測集計値C1~Cnに基づいてビーズ計数値Vbcを生成するのと比較して、バックグラウンドノイズは56%程度低減している。式(5)の近似直線の傾きは、式(4)の近似直線の傾きと比較して82%に低減している。しかしながら、バックグラウンドノイズが大きく低減していることから、分析装置100はS/N比が良好で、ノイズの影響を受けにくい。
[第2実施形態の分析装置及び分析方法]
第2実施形態は、検出対象物質63を標識する微粒子64の凝集の程度を定量的に評価することができる分析装置及び分析方法を提供することを目的とする。
第2実施形態は、検出対象物質63を標識する微粒子64の凝集の程度を定量的に評価することができる分析装置及び分析方法を提供することを目的とする。
図16に示すように、第2実施形態の分析装置100における制御部9は、機能的な構成として凝集度生成部902を備える。凝集度生成部902において、微粒子計数部901と同一部分には同一符号を付し、その説明を省略することがある。凝集度生成部902は、計数値生成部94及び計数値出力部95の代わりに、凝集度演算部96及び凝集度出力部97を有する。
図17に示すフローチャートを用いて、制御部9(凝集度生成部902)が実行する具体的な処理を説明する。図17において、図13に示す処理と同一部分には同一符号を付し、その説明を省略することがある。
制御部9(凝集度演算部96)は、ステップS10にて、差分Diffが最小となる密度λを密度λfixと決定したら、ステップS21にて、微粒子64の凝集の程度を示す凝集度を演算する。凝集度演算部96は次の式(6)を用いて、微粒子64の凝集の程度を示す凝集度Aggを算出する。式(6)において、Diff(λfix)は密度λfixにおける差分Diffである。
Agg=Diff(λfix)/Σk(k×Ck)
=(Σk(|Pk(λfix)-Ck|2))1/2/Σk(k×Ck) …(6)
Agg=Diff(λfix)/Σk(k×Ck)
=(Σk(|Pk(λfix)-Ck|2))1/2/Σk(k×Ck) …(6)
式(6)より分かるように、凝集度Aggは、実測集計値C0~Cnの配列データと理論的集計値P0~Pnの配列データとの定量的な差分Diff(λfix)を、実測集計値C0~Cnに基づく微粒子64の計数値で除算した値である。実測集計値C0~Cnに基づく微粒子64の計数値は、単ビーズが存在する単位区画の実測集計値C1と、2個からn個までの近接ビーズが存在する単位区画の実測集計値C2~Cnとに基づいて反応領域66内の微粒子64の個数を演算した計数値である。
制御部9(凝集度出力部97)は、ステップS22にて、凝集度Aggを出力して処理を終了させる。制御部9は、凝集度Aggを記憶部10に供給して記憶部10に記憶させる。図17では図示していないが、制御部9は、オペレータが凝集度Aggを確認できるよう、凝集度Aggを表示部11に表示する。
図17は、1つの反応領域66における凝集度Aggの生成及び出力の処理を示している。試料分析用ディスク70に複数の反応領域66を形成した場合には、制御部9は反応領域66ごとに図17に示す処理を実行する。記憶部10は反応領域66ごとの凝集度Aggを記憶する。表示部11は反応領域66ごとの凝集度Aggを表示する。
図14に示す具体例において、凝集度Aggを式(6)に基づいて計算すると、凝集度Aggは0.1695となる。
ところで、凝集度Aggは、表面に抗体65が固定されている微粒子64を作製する工程のばらつきによってその値が変化する。即ち、微粒子64を作製するときのロットによって凝集度Aggの値がばらつくことがある。そこで、制御部9は、微粒子64を作製するときのロットを識別するロット識別番号に凝集度Aggを対応させて記憶部10に記憶させるのがよい。表示部11は、ロット識別番号に対応させて凝集度Aggを表示するのがよい。
このようにすれば、凝集度Aggをできるだけ小さくするよう、微粒子64を作製する工程を改善することができる。また、微粒子64の購入先が複数存在する場合に、凝集度Aggの小さい微粒子64を作製する購入先を選択することができる。
図18は、横軸にビーズ計数値Vbcとし、縦軸を凝集度Aggとして、ロットが異なる微粒子64を用いて試料分析用ディスク70を分析したときのビーズ計数値Vbcと凝集度Aggとの関係をプロットした一例を示している。例えば、凝集度Aggが0.08以下であれば凝集度Aggは良好であり、凝集度Aggが0.08を超えれば凝集度Aggが良好でないと判定できる。
制御部9は、凝集度Aggが良好であるか否かの判定結果を記憶部10に記憶させてもよい。判定結果は、凝集度Aggが良好であるときに値“0”、凝集度Aggが良好でないときに値“1”である判定値とすることができる。制御部9は、凝集度Aggが良好であるか否かの判定値に基づき、表示部11に判定結果を表示してもよい。
[第3実施形態の分析装置及び分析方法]
第3実施形態は、第1実施形態の目的及び第2実施形態の目的との双方を達成することを目的とする。
第3実施形態は、第1実施形態の目的及び第2実施形態の目的との双方を達成することを目的とする。
制御部9は、計数値生成部94及び計数値出力部95と並列的に凝集度演算部96及び凝集度出力部97を備える。即ち、第3実施形態の分析装置100は、第1実施形態の微粒子計数部901と第2実施形態の凝集度生成部902との双方を備える構成である。第3実施形態の分析装置100は、ビーズ計数値Vbc及び凝集度Aggを記憶部10に記憶させ、表示部11に表示する。第3実施形態の分析方法は、ビーズ計数値Vbc及び凝集度Aggに基づいて試料分析用ディスク70を分析する。
本発明は以上説明した第1~第3実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。
図12及び図16の構成においては、制御部9(理論的集計値配列データ作成部92)が、理論的集計値P0~Pnを演算して配列データを作成している。密度λの値を異ならせたときの理論的集計値P0~Pnの複数セットの配列データを予め作成しておき、記憶部10に記憶しておいてもよい。この場合、理論的集計値決定部93は、記憶部10より読み出した複数セットの配列データから、実測集計値C0~Cnの配列データと最も近似する理論的集計値P0~Pnの配列データを選択する。
本願は、2021年3月18日に日本国特許庁に出願された、特願2021-044920号及び特願2021-044933号に基づく優先権を主張するものであり、それらの全ての開示内容は引用によりここに援用される。
Claims (6)
- 標識となる微粒子が結合した検出対象物質が複数固定された反応領域を有する試料分析用ディスクにレーザ光を照射し、前記反応領域からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号を生成する光ピックアップと、
前記受光レベル信号の波形から、単独で存在している単微粒子を示す単パルス状波形と、隣接する微粒子が干渉距離以内に近接する、整数である2個からn個の近接微粒子を示す(n-1)種類の近接パルス状波形をそれぞれ検出して各検出値を生成するパルス検出回路と、
前記反応領域内の前記微粒子の計数値を生成する微粒子計数部と、
を備え、
前記微粒子計数部は、
前記反応領域を複数の単位区画に分割し、
前記各検出値に基づいて、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを個別に集計して、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個の近接微粒子が存在する単位区画の各実測集計値とを生成し、
前記反応領域内の全ての前記単位区画の個数から、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを減算することにより、前記単パルス状波形と前記近接パルス状波形とのいずれも検出されなかった単位区画の個数を演算して、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値を生成し、
前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値との第1の配列データを作成し、
確率理論による確率分布に基づく理論的集計値の配列データであって、前記第1の配列データと最も近似する、前記微粒子が存在しない単位区画の理論的集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値との第2の配列データを作成または選択し、
前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値とに基づいて前記反応領域内の前記微粒子の個数を演算する
分析装置。 - 標識となる微粒子と結合した検出対象物質が複数固定された反応領域を有する試料分析用ディスクにレーザ光を照射し、前記反応領域からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号を生成する光ピックアップと、
前記受光レベル信号の波形から、単独で存在している単微粒子を示す単パルス状波形と、隣接する微粒子が干渉距離以内に近接する、整数である2個からn個の近接微粒子を示す(n-1)種類の近接パルス状波形をそれぞれ検出して各検出値を生成するパルス検出回路と、
前記反応領域内の前記微粒子の凝集の程度を示す凝集度を算出する凝集度生成部と、
を備え、
前記凝集度生成部は、
前記反応領域を複数の単位区画に分割し、
前記各検出値に基づいて、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを個別に集計して、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個の近接微粒子が存在する単位区画の各実測集計値とを生成し、
前記反応領域内の全ての前記単位区画の個数から、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを減算することにより、前記単パルス状波形と前記近接パルス状波形とのいずれも検出されなかった単位区画の個数を演算して、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値を生成し、
前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値との第1の配列データを作成し、
確率理論による確率分布に基づく理論的集計値の配列データであって、前記第1の配列データと最も近似する、前記微粒子が存在しない単位区画の理論的集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値との第2の配列データを作成または選択し、
前記第1の配列データと前記第2の配列データとの定量的な差分を、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値とに基づいて前記反応領域内の前記微粒子の個数を演算した計数値で除算する
分析装置。 - 前記理論的集計値を算出する際の前記確率分布にポアソン分布を用いる請求項1または2に記載の分析装置。
- 前記微粒子計数部は、前記反応領域を、3個の近接微粒子が収まる大きさを有する単位区画に分割する請求項1に記載の分析装置。
- 光ピックアップが、標識となる微粒子と結合した検出対象物質が複数固定された反応領域を有する試料分析用ディスクにレーザ光を照射し、
前記光ピックアップが、前記反応領域からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号を生成し、
パルス検出回路が、前記受光レベル信号の波形から、単独で存在している単微粒子を示す単パルス状波形と、隣接する微粒子が干渉距離以内に近接する、整数である2個からn個の近接微粒子を示す(n-1)種類の近接パルス状波形をそれぞれ検出して各検出値を生成し、
前記各検出値を取得する制御部が、
前記反応領域を複数の単位区画に分割し、
前記各検出値に基づいて、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを個別に集計して、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個の近接微粒子が存在する単位区画の各実測集計値とを生成し、
前記反応領域内の全ての前記単位区画の個数から、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを減算することにより、前記単パルス状波形と前記近接パルス状波形とのいずれも検出されなかった単位区画の個数を演算して、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値を生成し、
前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値との第1の配列データを作成し、
確率理論による確率分布に基づく理論的集計値の配列データであって、前記第1の配列データと最も近似する、前記微粒子が存在しない単位区画の理論的集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値との第2の配列データを作成または選択し、
前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値とに基づいて前記反応領域内の前記微粒子の個数を演算することにより、前記反応領域内の前記微粒子の計数値を生成する
分析方法。 - 光ピックアップが、標識となる微粒子と結合した検出対象物質が複数固定された反応領域を有する試料分析用ディスクにレーザ光を照射し、
前記光ピックアップが、前記反応領域からの反射光の受光レベルを検出して受光レベル信号を生成し、
パルス検出回路が、前記受光レベル信号の波形から、単独で存在している単微粒子を示す単パルス状波形と、隣接する微粒子が干渉距離以内に近接する、整数である2個からn個の近接微粒子を示す(n-1)種類の近接パルス状波形をそれぞれ検出して各検出値を生成し、
前記各検出値を取得する制御部が、
前記反応領域を複数の単位区画に分割し、
前記各検出値に基づいて、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを個別に集計して、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個の近接微粒子が存在する単位区画の各実測集計値とを生成し、
前記反応領域内の全ての前記単位区画の個数から、前記単パルス状波形が検出された単位区画の個数と、前記(n-1)種類の種類ごとに前記近接パルス状波形が検出された単位区画の個数とを減算することにより、前記単パルス状波形と前記近接パルス状波形とのいずれも検出されなかった単位区画の個数を演算して、前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値を生成し、
前記微粒子が存在しない単位区画の実測集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値との第1の配列データを作成し、
確率理論による確率分布に基づく理論的集計値の配列データであって、前記第1の配列データと最も近似する、前記微粒子が存在しない単位区画の理論的集計値と、前記単微粒子が存在する単位区画の理論的集計値と、前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の理論的集計値との第2の配列データを作成または選択し、
前記第1の配列データと前記第2の配列データとの定量的な差分を、前記単微粒子が存在する単位区画の実測集計値と前記2個からn個までの近接微粒子が存在する単位区画の実測集計値とに基づいて前記反応領域内の前記微粒子の個数を演算した計数値で除算することにより、前記微粒子の凝集の程度を示す凝集度を算出する
分析方法。
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