WO2022191431A1 - Kras 및 p53 유전자의 편집 기능이 있는 나노 리포좀 전달체 조성물 - Google Patents

Kras 및 p53 유전자의 편집 기능이 있는 나노 리포좀 전달체 조성물 Download PDF

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WO2022191431A1
WO2022191431A1 PCT/KR2022/001418 KR2022001418W WO2022191431A1 WO 2022191431 A1 WO2022191431 A1 WO 2022191431A1 KR 2022001418 W KR2022001418 W KR 2022001418W WO 2022191431 A1 WO2022191431 A1 WO 2022191431A1
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nano
cas9
gene
kras
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유경남
원은정
심희진
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주식회사 무진메디
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats associated protein 9) system has been extensively developed in gene editing therapeutics. Recent research trends include protein-based Cas9 nucleases and delivery by single guide RNA (sgRNA) complexes (Cas9 ribonucleoprotein, Cas9-RNP) and various carrier systems. Protein-based gene editing tools are less toxic than plasmid-based gene editing methods and have excellent gene editing efficiency such as minimizing off-target effects. Recently, studies on more sophisticated gene editing tools such as base editing have been reported, whose basic editing systems are a cytosine base editor (CBE) that converts C:G to T:A base pairs and A:T to G:C base pairs. It consists of an adenine base editor (ABE) that changes to This basic gene editing is also a gene editing technology that has recently been used as a tool for the treatment of human genetic diseases.
  • CBE cytosine base editor
  • ABE adenine base editor
  • the present invention is a hybrid of Cas9 protein and guide RNA targeting the KRAS gene; And, a hybrid of the guide RNA targeting the ABE protein and the P53 gene; relates to a nano-liposome delivery composition that is enclosed.
  • SEQ ID NO: 1 CUGAAUUAGCUGUAUCGUCA
  • the nano liposome may include lecithin, cholesterol, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-polyethylglycol (2000)amine and metal chelating lipids.
  • one or more proteins selected from the group consisting of EGFR (Epidermal growth factor receptor), EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule), CEA (Carcinoembryonic antigen) and annexins expressed in pancreatic cancer cells can be recognized.
  • EGFR Epidermal growth factor receptor
  • EpCAM EpCAM
  • CEA Carcinoembryonic antigen
  • annexins expressed in pancreatic cancer cells can be recognized.
  • monoclonal or polyclonal antibodies may be bound.
  • SEQ ID NO: 5 GACTTAATCGACATAGCAGT
  • SEQ ID NO: 2 GUGCAUGUUUGUGCCUGUCC
  • SEQ ID NO: 3 is derived from a partial DNA sequence of human ( Homo sapiens ) KRAS .
  • SEQ ID NO: 6 is derived from a partial DNA sequence of human ( Homo sapiens ) P53 .
  • the guide RNA for KRAS applied to the nanoliposome of the present invention is
  • the guide RNA for P53 applied to the nanoliposome of the present invention is as follows
  • 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-polyethylglycol (2000)amine serves as a stabilizer to increase the stability of the aqueous solution phase of the nano-liposomes.
  • the material is not limited to the molecular weight of polyethylglycol (2000), and anything including a polyethylglycol molecule can be used.
  • the 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-polyethylglycol (2000)amine is the first of the guide RNA targeting the anionic Cas9 and KRAS genes in a cationic state.
  • the hybrid and the second hybrid of guide RNA targeting the ABE and P53 genes serve to stably encapsulate inside the liposome.
  • 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid (gadolinium salt).
  • the nanoliposome of the present invention can be stably dispersed for several hours or more in neutral water, cell culture medium, blood, and the like.
  • the Cas9 protein and guide RNA targeting the KRAS gene may be mixed in a molar ratio of 1:1 to 1:3. If it is out of the mixing ratio at this time, the preparation of the hybrid may be difficult.
  • the ABE protein and the guide RNA targeting the P53 gene are preferably mixed in a molar ratio of 1:1 to 1:3.
  • Lecithin, metal chelating lipid, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-polyethylglycol (2000) amine and cholesterol of the first step are 1:0.005:0.1:0.1 to 1:0.02:0.3:0.2 in a molar ratio. Likewise, if the mixing ratio is exceeded at this time, the preparation of lipids constituting the nano-liposome may not be performed well.
  • the process of freezing and thawing in the third step may be repeated 1 to 12 times.
  • a nano-liposome dispersion having a more uniform size can be formed, and the drug encapsulation efficiency of the nano-liposome can be increased.
  • the encapsulation efficiency of the nano-liposome may be rather reduced, so less than 12 times is preferable.
  • the present invention may also provide a pharmaceutical composition containing the nano-liposome delivery system composition, wherein the pharmaceutical composition is a powder, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. orally according to a conventional method, respectively. It can be used by formulating in the form of form formulations, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include at least one excipient in the composition of the present invention, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose; It is prepared by mixing gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the age, sex, weight, specific disease or pathological condition to be treated, the severity of the disease or pathological condition, the route of administration, and the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of one of ordinary skill in the art, and dosages generally range from 0.01 mg/kg/day to approximately 2,000 mg/kg/day. A more preferred dosage is 1 mg/kg/day to 500 mg/kg/day. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • Figure 2a shows the gene mutation type of pancreatic cancer cells
  • Figure 2b shows the results of confirming the expression level of the EGFR membrane protein in each pancreatic cancer cell and normal pancreatic cells.
  • Figure 3a is a result of confirming the expression level of KRAS mRNA for single guide RNA sequence selection
  • Figure 3b is a mammalian cell expression plasmid (pCMV-ABE7.10-P53) of the sequence encoding the P53 sgRNA target sequence candidate and ABE7.10-nCas9. It is a schematic showing the result of cloning in
  • Figure 3c is the result of confirming the expression level of the P53 mutant protein for single guide RNA sequence selection.
  • Figure 4a shows the result of confirming that Cas9 has the function of cutting the target KRAS gene
  • Figure 4b shows the result of confirming that the ABE protein corrected the mutant gene of P53 .
  • Figure 5a shows the structural schematic diagram and cryo-transmission electron microscopy (cryo-EM) analysis results of the nano-liposome of the present invention
  • Figure 5b is the result of confirming the binding properties of the nano-liposome of the present invention to pancreatic cancer cells, PANC1 cells, by FACS.
  • 5c shows the results of immunofluorescence (IF) analysis
  • FIG. 5d shows the results of confirming whether Cas9 and ABE were injected into the nucleus by immunostaining (Cas9 protein-green, ABE protein-red).
  • FIG. 8a and 8b are CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) analysis and qRT-PCR results confirming the expression of protein and mRNA in PANC1 cells after P53 and KRAS gene editing
  • FIG. 8c is KRAS downstream and P53 restoration pathway.
  • PANC1 cells were treated with bare NL-Ab, NL(Cas9)-Ab, NL(ABE)-Ab, and NL(Cas9/ABE)-Ab to confirm the expression level of various signaling proteins.
  • PANC1 cell line is a gemcitabine (GEM) drug-resistant PDAC cell line through WST-8 analysis.
  • GEM gemcitabine
  • Figure 10a shows the results of confirming the cell viability upon treatment with gemcitabine after two kinds of gene editing using NL(Cas9/ABE)-Ab
  • Figure 10b shows the results of co-treatment with NL(Cas9/ABE)-Ab and gemcitabine. shows the cell cycle distribution results
  • FIG. 10c shows the results of various protein expression patterns of cell cycle-related genes through western blotting.
  • Figure 10d is the result of confirming cell cycle checkpoints such as Cyclin A and CDK2 when gemcitabine is treated after NL(Cas9/ABE)-Ab treatment
  • Figure 10e is NL(Cas9/ABE)-Ab and gem
  • 10f and 10g show the results of confirming the effect on various genes involved in the apoptosis pathway
  • FIG. 10h shows the protein expression of various molecular competition-related genes to clarify the role of KRAS and P53 genes in regulating resistance to gemcitabine. show the results.
  • FIG. 13a shows the results of intraperitoneal injection of red fluorescent (RITC)-labeled particles into PANC1 xenograft mice and monitoring the particle distribution in order to confirm the in vivo specific targeting ability of NL particles bound with an antibody
  • FIG. 13b shows This is the result of confirming the tumor tissue by fluorescent immunostaining whether NL(Cas9/ABE)-Ab reached the tumor and the Cas9 and ABE proteins inside the nanoliposome were delivered.
  • Figure 13c is a fluorescence staining photograph confirming the results of inhibition of mutant KRAS and P53 proteins in tumor sections of Group 8 mice treated together with NL(Cas9/ABE)-Ab and gemcitabine
  • Figure 13d is restoration of wild-type P53 in Group 8 mice.
  • FIG. 13e shows various biologics such as GLUT1, TKT, CTPS and ENT1 in KRAS and P53 gene-edited tumor tissues to overcome gemcitabine drug resistance in vivo
  • FIG. 13f is a result of visualizing the tissue using TUNEL analysis and tumor proliferation (Ki67) to evaluate apoptosis of tumors that have overcome gemcitabine drug resistance by gene editing.
  • pCas-Guide-EF1a-GFP (#GE100018) was purchased from Origene.
  • a plasmid encoding the ABE-nCas9 protein (pABE-Guide-EF1a-GFP) was generated by site-directed mutagenesis in the ABE 7.10 sequence provided in a previous study.
  • plasmids (1.0 ⁇ g) were transfected into PANC1 cells (2.5 ⁇ 10 5 cells/12 well plate) using Lipofectamine (Invitrogen).
  • pET28a-Cas9-transformed cells were cultured at 28 °C, and pET42b-ABE-treated cells were cultured at 18 °C for 16 hours.
  • pET28a-Cas9-transformed cells were cultured at 28 °C, and pET42b-ABE-treated cells were cultured at 18 °C for 16 hours.
  • cells were lysed in lysis buffer and then sonicated and centrifuged at 15000 x g, 4 °C for 20 minutes. Thereafter, the supernatant was reacted with Ni-NTA agarose resin (GE Healthcare) and washed in wash buffer before elution.
  • the transfected cells were lysed and the ABE protein was obtained using the same resin as when collecting Cas9.
  • the resin was washed with a buffer before elution, and the sample was eluted using the elution buffer.
  • Lysis buffer 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M NaCl, 20 mM imidazole and 0.5 mM PMSF
  • Washing buffer 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M NaCl, 20% glycerol, 5 mM DTT, 20 mM imidazole and 0.5 mM PMSF
  • Elution buffer 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 20% glycerol, 5 mM DTT and 20 mM imidazole
  • a DNA template for in vitro sgRNA transcription was prepared using PCR with forward primers containing the T7 promoter sequence.
  • the sgRNA DNA template was reacted with T7 RNA polymerase (Takara) in a reaction buffer (rNTP, RNase inhibitor, DTT) at 37 °C for 16 hours.
  • the mixture was treated with DNase I (Takara) to remove the DNA template at 37 °C for 30 min.
  • the synthesized sgRNA was extracted with phenol : chloroform : isoamyl alcohol and then precipitated using 2-propanol.
  • the primers listed in Table 1 below were used to amplify the DNA sequence containing the KRAS target site.
  • Purified Cas9 protein (1.56 ⁇ M) and KRAS sgRNA (1.47 ⁇ M) in KRAS target PCR product (0.5 ⁇ g) were treated in NEB buffer 3 (10 ⁇ L) at 37° C. for 1 hour. The degraded product was confirmed through a 2% agarose gel.
  • sgRNA single guide RNA
  • Forward primer for KRAS sgRNA construction 5'-GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGAATTAGCTGTATCGTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3' (including SEQ ID NO: 3, forward primer for preparing SEQ ID NO: 7)
  • Forward primer for P53 sgRNA construction 5'-GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGCATGTTTGTGCCTGTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3' (including SEQ ID NO: 4, forward primer for preparing SEQ ID NO: 8)
  • Forward Primer for Scramble sgRNA Construction 5’-GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGGGCACTACCAGAGCTAACTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’
  • Reverse primer for sgRNA construction 5'-AAAAGCACCGACTCGGTG-3' (forward primer to produce SEQ ID NOs: 7 and 8)
  • P53 target PCR product 0.5 ⁇ g was treated with purified ABE protein (1.0 ⁇ M) and P53 sgRNA (1.47 ⁇ M) in NEB buffer 3 (10 ⁇ L) at 37° C. for 3 hours.
  • the reaction mixture was purified using Nucleospin PCR Cleanup (MN) at 37 °C for 1 h before incubation with endonuclease V (endoV, NEB). The degraded product was confirmed through a 2% agarose gel.
  • Genomic DNA (10 ⁇ g) of PANC1 cells was purified using NucleoSpin Tissue (MN) and treated with ABE (1.0 ⁇ M) and sgRNA (1.47 ⁇ M) purified in NEB buffer 3 at 37°C for 16 hours. After treatment with RNase A (50 ⁇ g/mL) and proteinase K (20 mg/mL), inosine-containing genomic DNA was extracted with phenol:chloroform:isoamyl alcohol and precipitated with 2-propanol. Purified DNA (6 ⁇ g) was reacted with endoV (10 units) at 37° C. for 6 hours. After that, the reaction product was again extracted with phenol:chloroform:isoamyl alcohol and precipitated with 2-propanol. The P53 mutation target site (818G>A, R273H) of PANC1 cells was identified by Sanger sequencing analysis.
  • H6c7 human pancreatic duct epithelial cell line
  • PANC1 and MIAPaCa-2 cells were cultured in Dulbecco Modified Eagle Medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin.
  • BxPC-3 and Capan-2 cells were cultured in RPMI medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
  • H6c7 cells were cultured in keratinocyte basal medium and supplement (Clonetics KBM, # CC-3111), and all cells were used after confirming that they were mycoplasma-negative.
  • Plasmids pCMV-Cas9-KRAS, pCMV-ABE7.10-P53 and pCMV-ENT1 were transfected into cells using Lipofectamine 3,000 (Invitrogen).
  • PANC1 cells for each experiment were inoculated with 1.5 x 10 6 cells in a 60-mm 2 cell culture plate at 5% CO 2 condition, 37 ° C., and then nanoliposomes were administered, but based on NL(Cas9/ABE)-Ab 68.25 nM of Cas9 and ABE were added and incubated at 37 ° C. If necessary, after 3 hours of nanoliposome treatment, gemcitabine (10 ⁇ M) was administered and the culture was continued for 24 hours.
  • Pancreatic cancer cells have various types of gene mutations as shown in FIG. 2a.
  • PANC1 cells have a KRAS gene point mutation at codon 12 (c.35G>A, p.G12D) and a P53 gene point mutation at codon 273 (c.818G>A, p.R273H).
  • BxPC-3 had a P53 gene mutation and a wild-type KRAS gene, and Capan-2 only had a KRAS gene mutation.
  • PANC1 compared with the expression level of normal pancreatic cells (H6c7) for the expression of EGFR membrane protein for each pancreatic cancer cell (Fig. 2b), PANC1 was determined as the target cell for gene editing, and KRAS and P53 effective for KRAS and P53 gene editing The sgRNA target sequence was selected.
  • the sgRNA sequence for KRAS gene recognition was selected by confirming that the sgKRAS-1 sequence significantly reduced KRAS mRNA expression by qRT-PCR (FIG. 3a).
  • the sgRNA sequence candidates for the P53 target gene selected two different sgP53 sequences, including the P53 point mutation in PANC1 cells (c.818G > A, p.R273H), the P53 sgRNA target sequence candidate and ABE7.10.
  • the sequence encoding -nCas9 was confirmed by cloning into a mammalian cell expression plasmid (pCMV-ABE7.10-P53) (Fig. 3b). After transfecting PANC-1 cells as a vector using lipofectamine, it can be seen that the sgP53-2 sequence significantly reduced the mutant P53 protein level (FIG. 3c).
  • KRAS and P53 mutant genes were edited using sgKRAS-1 (KRAS target sequence: CTGATTAGCTGTATCGTCA) and sgP53-2 (P53 target sequence: GTGCATGTTTGTGCCTGTCC) in PANC-1 cells.
  • the recombinant ABE protein was purified from E. coli after expression of the ABE7.10-nCas9 vector, and the ABE-mediated base conversion ability was detected by in vitro cleavage of the P53 gene PCR product.
  • the target gene is first converted to A-to-I, and the 500bp P53 PCR product is digested with endonuclease V (endoV) to generate a double-stranded break. Aging can be confirmed by Sanger sequencing, and it appears that the ABE-RNP-treated PCR product has a double peak band through the conversion of A to I (Fig. 4b).
  • NL was prepared using the thin film hydration method. Briefly, lecithin:cholesterol:DGS-NTA(Ni):DSPE-PEG(2000)amine (molar ratio 1:0.2:0.0125:0.25) was dissolved in 1 mL of chloroform and the solvent was evaporated. Films were hydrated with purified 383 nM of each of Cas9 and ABE and 625.5 nM sgRNA complexes dispersed in 1 mL phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2. After the freeze-thaw procedure, the NL solution was incubated with sulfo-SMCC at 4 °C for 2 h.
  • PBS phosphate buffered saline
  • sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)
  • the unreacted material was removed by dialysis and thiolated EGFR antibody was bound to NL at 4 °C for 16 hours.
  • the resulting NL-Ab solution was filtered through a 0.2 ⁇ m syringe filter and then dialyzed through a 1,000 kDa membrane at 4 °C for 16 hours.
  • the nano-liposome was prepared similarly to the method disclosed in the existing Korean Patent No. 10-1796036, but the ABE and sgP53 complex were encapsulated in the liposome in addition to the Cas9 and sgKRAS hybrid. The mixing ratio of these two types of composites was added by the same weight.
  • the Cas9 and sgKRAS hybrids were used in which polyethyleneimine was not bound, unlike in Korean Patent Registration No. 10-1796036. Since the Cas9 and ABE proteins to be loaded can sufficiently bind with DGS-NTA-Ni, a compound constituting a nano-liposome, there is no need to use a cationic polymer.
  • DSPE-PEG(2000)-amine was used instead of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE).
  • DSPE-PEG(2000)-PEG(2000) present in amine serves to provide stability of nanoliposomes in an aqueous solution state, increases the encapsulation rate in liposomes without binding polyethyleneimine to Cas9 and sgKRAS hybrids, and liposomes. It serves to introduce the desired antibody through an amine group to the outside.
  • the prepared nano-liposome composition was subjected to 200 nm filtration and 1,000 kDa dialysis, followed by low-temperature conduction electron microscopy (low-temperature conduction electron microscopy), dynamic light scattering (DLS) analysis, zeta potential measurement and Western blot analysis to obtain shape, size, The surface was evaluated.
  • the hydrodynamic size and zeta potential of NL-Ab were measured using a Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments).
  • the morphology of NL-Ab was observed using cryo-transmission electron microscopy (cryo-EM, Tecnai F20 G2, FEI).
  • PANC1 cells were lysed in RIPA buffer with a protease inhibitor and a phosphatase inhibitor (Sigma). Whole cell lysates were normalized using the BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Next, the cell lysate (40 ⁇ g) was loaded on a 12% SDS-PAGE gel under denaturing conditions and transferred to a PVDF membrane (iBlot2 Dry Blotting System, Thermo Scientific).
  • Membranes were blocked with 5% skim milk at room temperature for 1 h and reacted with the following primary antibodies at 4 °C for 16 h: anti-RAS, phospho-ERK, phospho-Rb (Cell Signaling), anti-mutant P53, p27KIP , p21CIP (Abcam), anti-wild-type P53 (Sigma), Cyclin D1, CDK4, GLUT1, TKT, actin (Santa Cruz) and HIF-1 ⁇ , CTPS1 and ENT1 (Proteintech).
  • the membrane was treated with Western ECL and the luminescence image was analyzed using LAS500 (GE Healthcare).
  • NL-Ab was added to genistein (10 ⁇ g/mL), chlorpromazine (20 ⁇ g/mL), nocodazole (1.5 ⁇ g/mL) and cytochalasin B (4.8 ⁇ g/mL). incubated for hours. Next, cells were treated with NL(Cas9/ABE)-Ab (Cas9 and ABE at 68.25 nM each in 2.5 mL opti-MEM). All samples were incubated at 37 °C except for samples at 4 °C, and 24 hours later, they were analyzed by flow cytometry (Accuri C6 Plus, BD).
  • PANC1 and H6c7 cells were analyzed by fluorescence immunoassay (IF).
  • IF fluorescence immunoassay
  • PANC1 cells were seeded into 8-well cell culture slides (4 x 10 4 cells/slide) at 37 °C under 5% CO 2 .
  • Cells were incubated with NL(Cas9/ABE)-Ab (22.75 nM of Cas9 and ABE in 0.2 mL opti-MEM, respectively) at 37 °C for 3 h, then the cells were treated with gemcitabine (10 ⁇ M) and 48 h later. analyzed.
  • NL-Ab-treated cells were immunostained with anti-Myc (Cas9 protein, green) and anti-HA (ABE protein, red), and then visualized by IF. Results A fluorescent signal is detected in the nucleus due to the penetrating ability of the nuclear localization sequence from Cas9 and ABE-RNP (Fig. 5d).
  • clathrin-mediated endocytosis inhibitor chlorpromazine
  • clathrin-mediated endocytosis inhibitor chlorpromazine
  • cytochalasin B phagocytosis inhibitor
  • the inhalation route for foreign substances into the cell can be divided into five major categories. Part of the membrane protrudes from the surface of the cell and surrounds and swallows particles, phagocytosis, and membrane ruffling, actin filaments (actin) Filament) actively polymerizes to inhale particles, macropinocytosis, chlatrin-mediated endocytosis using a protein called chlatrin in the cytoplasm, and cholesterol and caveolin.
  • caveolin-dependent endocytosis which uses a place with a high concentration of membrane protein
  • clatrin and caveolin independent endocytosis which does not use proteins such as clathrin and caveolin.
  • drugs that block each of these inhalation pathways are drugs that block each of these inhalation pathways.
  • Genistein inhibits caveolin-dependent endocytosis
  • chloropromazine inhibits clathrin-dependent endocytosis
  • nocodazole inhibits apoptosis
  • cytochalasin B inhibits phagocytosis.
  • the cells cannot use energy, so it is possible to inhibit the endocytosis in an energy-dependent manner (Dos Santos T et al., 2011).
  • NL, NL-Ab and lipofectamine were administered to PANC1 cells with and without antibody binding over time (0, 0.5, 1, 3, 6 h). After treatment, the number of Cas9/ABE proteins was quantitatively confirmed through fluorescence-activated single cell sorting (FACS) analysis by fluorescence staining, which is shown in FIG. 7 .
  • FACS fluorescence-activated single cell sorting
  • the NL-Ab prepared in the present invention has very good permeability to pancreatic cancer cells.
  • PANC1 cells were treated with bare NL-Ab, NL(Cas9)-Ab, and NL(ABE)-Ab to confirm the expression level of various signaling proteins (FIG. 8c) .
  • Bare NL without gene editing function including scrambled sgRNA (sgScramble) showed no change in the expression of RAS, p-ERK and mutant P53 .
  • NL(Cas9)-Ab and NL(Cas9/ABE)-Ab-treated cells suppressed protein expression of KRAS and p-ERK
  • NL(ABE)-Ab and NL(Cas9/ABE)-Ab treatment The aged cells have decreased mutant P53 and increased levels of wild-type P53 expression and vice versa.
  • Cell viability assay was performed using WST-8 assay.
  • PANC1, MIAPaCa-2, BxPC-3 and Capan-2 cells were treated with NL-Ab and then seeded in 96-well plates (1 ⁇ 10 3 cells/well) for 24 hours.
  • Cells were treated with gemcitabine (0 ⁇ 100 ⁇ M), and after 24 hours of incubation, WST-8 reagent (Dojindo) was added to the medium at 37 °C for 1 hour. After that, the absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader (BioTek) every 24 hours.
  • the PANC1 cell line is a gemcitabine drug-resistant PDAC cell line ( FIG. 9 ).
  • the cell viability is decreased by ⁇ 90% upon treatment with gemcitabine after two kinds of gene editing using NL(Cas9/ABE)-Ab (Fig. 10a). Therefore, it can be confirmed that the KRAS and P53 genes must be edited simultaneously to overcome gemcitabine drug resistance and increase the therapeutic effect in pancreatic cancer.
  • the effect of co-treatment with NL(Cas9/ABE)-Ab and gemcitabine can be evaluated by examining the cell cycle distribution, which was confirmed using flow cytometry.
  • Gemcitabine-resistant cells increase glucose uptake through overexpression and stabilization of HIF-1 ⁇ through genetic mutations in KRAS and P53 . Enhancement of glucose levels induces glucose metabolism, non-oxidative pentose phosphate pathway (PPP) and de novo pyrimidine synthesis. According to this pathway, dCTP is oversynthesized, eventually causing a molecular competitive reaction with dFdCTP of the gemcitabine metabolite and leading to gemcitabine drug resistance.
  • PPP non-oxidative pentose phosphate pathway
  • dCTP is oversynthesized, eventually causing a molecular competitive reaction with dFdCTP of the gemcitabine metabolite and leading to gemcitabine drug resistance.
  • protein expression of various molecular competition-related genes was analyzed ( FIG. 10h ). The results showed that KRAS and P53 gene editing was associated with degradation of HIF-1 ⁇ , reduction of glucose uptake receptor (GLUT1) and inhibition of dCTP synthesis-associated
  • ENT1 increases after gene editing of KRAS or P53 (FIG. 10h). Overexpressed ENT1 increases gemcitabine uptake and high concentration of gemcitabine into cells.
  • H6c7 the cell line
  • BxPC-3 and Capan-2 cell lines without drug resistance showed a large amount of ENT1 receptor protein expression and did not show resistance to the gemcitabine drug ( FIG. 11 ).

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Abstract

본 발명은 Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체; 및, ABE 단백질과 P53 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체;가 동봉된 나노 리포좀 전달체 조성물 또는 이를 함유하는 항암제 저항성 췌장암 치료제에 관한 것이다. 현재 췌장암 치료제로 사용되고 있는 젬시타빈에 대해서 췌장암은 한 개 이상의 유전자 변이가 발생하여 이로 인한 내성을 갖게 되고, 다른 암에 비해 췌장암이 사망률이 높은 주된 원인이 되어 왔다. 이에 본 발명의 나노 리포좀은 KRAS 돌연변이를 제거하고 P53 돌연변이를 정상 유전자로 동시 편집함으로써 췌장암 세포를 근본적으로 치료할 수 있어 매우 효과적인 항암제로 이용가능하다.

Description

KRAS 및 P53 유전자의 편집 기능이 있는 나노 리포좀 전달체 조성물
본 발명은 KRAS 및 P53 유전자의 편집 기능이 있는 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것이다.
보다 자세하게는 본 발명은 Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체; 및, ABE 단백질과 P53 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체;가 동봉된 나노 리포좀 전달체 조성물 또는 이를 함유하는 KRAS 유전자 및 P53 유전자의 편집기능을 이용한 항암제 저항성 췌장암의 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
췌장암(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)은 2020년에 보고된 바로 5년 내 생존율이 9 % 미만이었고, 국소적 종양 절제 수술을 받은 환자라 하더라도 5년 내 생존율은 15 % 미만이다. 젬시타빈(Gemcitabine, GEM)은 DNA 합성을 방해하고 암세포의 아폽토시스를 유도하는 치료제로서, 현재 임상에서 PDAC의 1차 치료는 젬시타빈이라는 약물로서 수행한다. 그러나 췌장암은 유전적 돌연변이로 인해 다른 고형암에 비해 젬시타빈에 대한 내성이 심해, PDAC로 인한 사망률이 높은 주된 이유가 된다. 유전자 중 KRAS 돌연변이는 PDAC 환자의 약 90 %에서 보고되어 있고, 종양억제인자 P53 유전자 돌연변이는 환자의 50 ~ 80 %에서 관찰된다. 또한 PDAC 환자의 55 %는 KRAS 및 P53 유전자 돌연변이를 모두 가지고 있으며 이들에 대한 임상 치료는 상대적으로 나쁜 예후를 나타낸다.
KRAS 또는 P53 유전자 돌연변이는 HIF-1α(hypoxia-causing factor-1α), 해당 과정 및 피리미딘 de novo 생합성의 순차적 안정화로 이어진다. 그 결과, 복제를 위해 핵의 DNA 가닥에 삽입된 deoxycytidine triphosphate (dCTP)의 고유수준이 증가하게 되고, 유전자 돌연변이 매개 dCTP의 과발현이 젬시타빈 대사산물의 젬시타빈 트리포스페이트(dFdCTP)와의 분자경쟁 반응을 통해 젬시타빈 내성을 유발 한다 (도 1). 따라서 효과적인 PDAC 치료는 종양 증식 및 억제와 관련된 KRAS 및 P53 유전자의 동시 유전자 편집을 통해 약물 내성을 극복해야 치료가 가능한 것이다.
CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats associated protein 9) 시스템은 유전자 편집 치료제에서 광범위하게 개발되었다. 최근 연구 동향에는 단백질 기반 Cas9 뉴클레아제 및 단일 가이드 RNA (sgRNA) 복합체 (Cas9 ribonucleoprotein, Cas9-RNP) 및 다양한 운반체 시스템에 의한 전달이 포함된다. 단백질 기반 유전자 편집 도구는 플라스미드 기반 유전자 편집 방법보다 독성이 낮고 표적을 벗어난 효과(off-target effect)를 최소화 하는 등의 유전자 편집 효율성이 뛰어나다. 최근 염기 편집 같은 보다 정교한 유전자 편집 도구에 대한 연구가 보고되었는데, 이의 기본 편집 시스템은 C : G를 T : A 기본 쌍으로 변환하는 사이토신 염기 편집기(CBE)와 A : T를 G : C 기본 쌍으로 변경하는 아데닌 염기 편집기(ABE)로 구성된다. 이 기본 유전자 편집 또한 인간 유전 질환 치료를 위한 도구로서 최근부터 사용되기 시작한 유전자 편집 기술이다.
이에 본 발명에서는 한 개 이상의 유전자 변이에 의한 약물 내성 PDAC의 KRAS 및 P53 유전자 편집을 동시에 수행하기 위해 특정 전달 담체 시스템으로 생체 적용 가능한 나노 리포좀을 개발하고 두가지 서로 다른 유전자 편집 기능을 가지는 Cas9 및 ABE 기반 RNP를 캡슐화하여 동일 세포에 동시에 전달함으로써, 기존 약물에 대한 저항성을 극복하기 위해 본 발명을 완성하게 되었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국 등록특허 제10-1796036호
본 발명의 목적은 KRAS 및 P53 유전자의 편집 기능이 있는 나노 리포좀 전달체 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은 Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체; 및, ABE 단백질과 P53 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체;가 동봉된 나노 리포좀 전달체 조성물 또는 이를 함유하는 KRAS 유전자 억제 및 P53 유전자의 변이 정상화 편집기능을 이용한 항암제 저항성 췌장암의 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체; 및, ABE 단백질과 P53 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체;가 동봉된 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것이다.
상기 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.
서열번호 1 : CUGAAUUAGCUGUAUCGUCA
상기 P53 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.
서열번호 2 : GUGCAUGUUUGUGCCUGUCC
상기 나노 리포좀은 레시틴, 콜레스테롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸글리콜(2000)아민 및 메탈 킬레이팅 지질을 포함할 수 있다.
상기 나노 리포좀에는 췌장암 세포에서 발현하는 EGFR(Epidermal growth factor receptor), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CEA(Carcinoembryonic antigen) 및 아넥신스(Annexins)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질을 인식할 수 있는 단클론성 또는 다클론성 항체가 결합될 수 있다.
상기 나노 리포좀은 10 ~ 2,000 nm의 입자크기를 가질 수 있다.
또한 본 발명은 상기 나노 리포좀 전달체 조성물을 함유하는 KRAS 유전자 및 P53 유전자의 편집기능을 이용한 항암제 저항성 췌장암의 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 젬시타빈에 대한 저항이 있는 췌장암에 대한 약학 조성물일 수 있다. 이에 상기 조성물은 젬시타빈을 추가로 함유하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 KRAS 유전자 및 P53 유전자의 편집기능을 이용하여 치료할 수 있는 모든 암을 대상으로 하는 약학 조성물일 수 있다.
본 발명은 또한 하기와 같은 췌장암 세포를 선택적으로 인식할 수 있는 나노 리포좀 전달체 조성물의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 제1혼성체, 및, ABE 단백질과 P53 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 제2혼성체를 각각 제조하고,
레시틴, 메탈 킬레이팅 지질, 콜레스테롤, 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸글리콜(2000)아민을 클로로포름 상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제1단계;
상기 지질 필름 조성물에, 제1혼성체와 제2혼성체를 혼합하고 넣어 초음파 처리하는 제2단계;
상기 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제3단계;
상기 제3단계에서 얻은 침전물 상태의 나노 리포좀에 가교제를 통해 항체를 결합하는 제4단계; 및,
상기 제4단계에서 얻은 반응물을 투석하여 과량의 항체를 제거하고 항체가 결합된 나노 리포좀을 제5단계;
를 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 보다 자세하게 설명한다.
본 발명은 Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체; 및, ABE 단백질과 P53 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체;가 동봉된 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것이다.
상기 Cas9 단백질은 pET28a/Cas9 플라스미드가 형질전환된 세포 또는 균주에서 획득할 수 있다. 바람직하게는 pET28a/Cas9 플라스미드를 대장균에 형질전환하여 Cas9 단백질을 과발현하여 얻을 수 있다.
pET28a/Cas9 플라스미드 : pET28a(+) 벡터에 Cas9 nuclease-Myc와 His가 삽입된 것.
상기 ABE 단백질 또한 pET42b/ABE 플라스미드가 형질전환된 세포 또는 균주에서 획득할 수 있다. 바람직하게는 pET42b/ABE 플라스미드를 대장균에 형질전환하여 ABE 단백질을 과발현하여 얻을 수 있다.
pET42b/ABE 플라스미드 :pET42b(+) 벡터에 ABE7.10-Cas9 nickase-HA와 His가 삽입된 것.
본 발명에서 적용할 수 있는 KRAS 타켓용 가이드 RNA는 하기의 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 가이드 RNA이고, 서열번호 3의 염기서열으로 부터 유래된 것이며, 서열번호 5를 타겟으로 한다.
서열번호 1 : CUGAAUUAGCUGUAUCGUCA
서열번호 3 : CTGAATTAGCTGTATCGTCA
서열번호 5 : GACTTAATCGACATAGCAGT
본 발명에서 적용할 수 있는 P53 타켓용 가이드 RNA는 하기의 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 가이드 RNA이고, 서열번호 4의 염기 서열으로 부터 유래된 것이며, 서열번호 6을 타겟으로 한다.
서열번호 2 : GUGCAUGUUUGUGCCUGUCC
서열번호 4 : GTGCATGTTTGTGCCTGTCC
서열번호 6 : CACGTACAAACACGGACAGG
상기 서열번호 1과 서열번호 2가 각각 Cas9 와 ABE 단백질이 혼성화되어 포함된 나노 리포좀 전달체 조성물은 KRAS 돌연변이를 억제하고 P53 유전자 돌연변이를 정상화하여 췌장암을 개선 또는 치료할 수 있는 기능을 한다.
서열번호 3은 사람(Homo sapiens) KRAS의 일부 DNA 염기서열로부터 유래된 것이다. 서열번호 6은 사람(Homo sapiens) P53의 일부 DNA 염기서열로부터 유래된 것이다.
상기 서열번호 1의 가이드 RNA 염기서열 이후에는 Cas9 단백질과 혼성체를 형성하기 위해 스캐폴드 염기서열(scaffold sequence)이 포함될 수 있다. 이 때 스캐폴드 염기서열의 종류는 크게 제한되지 않으며, 가이드 RNA의 제조에 이용되는 통상적인 염기서열이라면 어떤 것이든지 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 나노 리포좀에 적용되는 KRAS를 위한 가이드 RNA는 하기의
서열번호 7 :
CTGAATTAGCTGTATCGTCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU 이 적용된 나노 리포좀을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 나노 리포좀에 적용되는 P53을 위한 가이드 RNA는 하기의
서열번호 8 :
GUGCAUGUUUGUGCCUGUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU 이 적용된 나노 리포좀을 제공할 수 있다.
상기 서열번호 1의 가이드 RNA의 염기서열이 타겟으로 하는 서열번호 5의 DNA 염기서열은, 사람의 상기 서열번호 1의 가이드 RNA의 염기서열이 타겟으로 하는 KRAS (Homo sapiens Chromosome 12, NCBI Reference Sequence: NG_007524)의 Exon2에 존재하는 염기서열이다. 즉, 상기 서열번호 1의 가이드 RNA를 통해 상기 Exon2의 DNA가 편집된다. 상기 KRAS 유전자의 돌연변이는 인간 게놈 DNA의 KRAS exon 2의 codon 12번 서열에서 일어난다.
상기 서열번호 1의 가이드 RNA는 T7 RNA 폴리머라아제(polymerase)를 사용한 시험관 내 전사 반응 과정(in vitro transcription)을 통하여 합성할 수 있다.
상기 서열번호 2의 가이드 RNA의 염기서열이 타겟으로 하는 서열번호 6의 DNA 염기서열은, 사람의 상기 서열번호 2의 가이드 RNA의 염기서열이 타겟으로 하는 P53 (Homo sapiens Chromosome 17, NCBI Reference Sequence: NG_017013.2)의 Exon 8에 존재하는 염기서열이다. 즉, 상기 서열번호 2의 가이드 RNA를 통해 상기 Exon 8의 DNA가 편집된다. 상기 P53 유전자의 돌연변이는 인간 게놈 DNA의 P53 exon 8의 codon 273번 서열에서 일어난다.
상기 서열번호 2의 가이드 RNA는 T7 RNA 폴리머라아제(polymerase)를 사용한 시험관 내 전사 반응 과정(in vitro transcription)을 통하여 합성할 수 있다.
상기 나노 리포좀은 레시틴(lecithin, α-phosphatidylcholin), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸글리콜(2000)아민, 콜레스테롤 및 메탈 킬레이팅 지질을 포함할 수 있으며, 이를 통해, 상기 레시틴, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸글리콜(2000)아민, 콜레스테롤 및 메탈 킬레이팅 지질이 나노 리포좀을 형성하는 막을 이룰 수 있다.
레시틴은 동/식물계에 널리 분포되어 있어 생체 적합성이 우수하며 그 안정성에 있어서도 이미 검증되어 식품과 제약의 전달체 기술에 널리 활용되고 있다. 또한 나노 리포좀의 크기 조절과 변형을 용이하게 하는 재료로 사용될 수 있다.
상기 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸글리콜(2000)아민을 사용하는 것은 나노 리포좀의 수용액상의 안정성을 높이는 안정제 역할을 한다. 이 물질의 폴리에틸글리콜(2000)의 분자량에 한정되지 않고, 폴리에틸글리콜 분자를 포함하는 모든 것이 사용 가능하다. 또한 상기 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸글리콜(2000)아민은 양이온성 상태로서 음이온성인 Cas9과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 제1혼성체와 ABE와 P53 유전자를 타켓으로 하는 가이드 RNA의 제2혼성체가 안정적으로 리포좀 내부에 포집될 수 있게 하는 역할을 한다.
메탈 킬레이팅 지질로는 바람직하게는 DGS-NTA-Ni 지질, DMPE-DTPA-Gd 지질, DMPE-DTPA-Cu 지질로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기 DGS-NTA-Ni 지질은 하기의 화학식 1의 화학구조를 갖는 지질로서,
[화학식 1]
Figure PCTKR2022001418-appb-I000001
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카르복시펜틸)이미노디아세트산)숙시닐](니켈염)이라 한다.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl](nikel salt)
DMPE-DTPA-Gd 지질은 하기의 화학식 2의 화학구조를 갖는 지질로서,
[화학식 2]
Figure PCTKR2022001418-appb-I000002
1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-디에틸렌트리아민펜타아세트산(가돌리늄염)이라 한다.
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid(gadolinium salt)
DMPE-DTPA-Cu 지질은 하기의 화학식 3의 화학구조를 갖는 지질로서,
[화학식 3]
Figure PCTKR2022001418-appb-I000003
1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-디에틸렌트리아민펜타아세트산(구리염)이라 한다.
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid(copper salt)
상기 DGS-NTA-Ni 지질은 단백질 정제 방법에서 사용되는 His-Tag(6X histidin)과 Ni2+ 친연성(affinity)을 활용하여 Cas9 단백질 또는 ABE 단백질(His-Tag 포함된 것)이 효과적으로 나노 리포좀 내부로 봉입(encapsulation)되게 하는 역할을 할 수 있다. 더 자세하게는 상기 DGS-NTA-Ni은 18개의 탄소에 이중결합이 1개 있는 구조로 레시틴과 함께 지질(lipid)를 형성할 수 있고, 끝에 Ni2+가 결합되어 있어, Cas9 단백질과 ABE 단백질에 붙어있는 His-tag 2개와 Ni2+ 1개가 결합하여 Cas9 단백질 또는 ABE 단백질이 좀 더 효율적으로 나노 리포좀 안으로 봉입되게 한다. DMPE-DTPA-Gd 지질과 DMPE-DTPA-Cu 지질 또한 이와 동일한 역할을 하며 Cas9 단백질 또는 ABE 단백질이 포함된 각 혼성체들의 나노 리포좀 내 봉입을 효과적으로 유도한다.
상기 나노 리포좀은 10 ~ 2,000 nm의 입자크기를 가질 수 있다. 나노 리포좀의 크기가 10 nm 미만일 경우, 제1혼성체와 제2혼성체가 상기 나노 리포좀에 봉입되기 어려울 수 있으며, 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다. 또한 2,000 nm를 초과할 경우에도 상기 나노 리포좀이 포함된 조성물이 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다.
상기 나노 리포좀에는 췌장암세포에서 발현하는 EGFR(Epidermal growth factor receptor), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CEA(Carcinoembryonic antigen) 및 아넥신스(Annexins)로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 단백질을 인식할 수 있는 단클론성 또는 다클론성 항체가 결합될 수 있다.
상기 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 다클론성 항체는 EGFR, EpCAM, CEA, 아넥신스 등의 1종 단백질을 동물에 주사한 뒤 채혈한 혈청에서 얻을 수 있다. 상기 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용할 수 있다. 상기 단클론성 항체는, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로, 하이브리도마 방법(Kohler G. and Milstein C.), 또는, 파지 항체 라이브러리(Clackson et al.; Marks et al.) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법을 수행하기 위해서는 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포와, 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이 후, 폴리에틸렌글리콜 등을 이용하는 방법, 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로, 이러한 두 종류의 세포들을 융합시킨 후, 항체 생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킬 수 있다. 이 후, 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후, EGFR, EpCAM, CEA, 아넥신스 등의 1종 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양할 수 있다. 상기 파지 항체 라이브러리 방법은, EGFR, EpCAM, CEA, 아넥신스 등의 1종 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여, 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 상기 라이브러리로부터 EGFR, EpCAM, CEA, 아넥신스 등의 1종 단백질과 결합하는 단클론성 항체를 분리 및 제작하여 수행할 수 있다. 상기 방법들에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.
상기 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2, Fv 등이 있다.
본 발명에서 상기 항체는 1,4-비스-말레이미도부탄, 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜, 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드, 숙시니미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]] 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도] 헥사노에이트] 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시니미드 에스터 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 및 숙시미딜[4-(p-말레이미도페닐) 부틸레이트] 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 가교제가 링커로 이용되어 결합될 수 있다.
상기 링커는 나노 리포좀의 아민기가 포함된 인지질과 항체를 연결하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 나노 리포좀은 중성의 물, 세포 배양액, 혈액 등에서 수 시간 이상 안정하게 분산될 수 있다.
본 발명은 상기 나노 리포좀 전달체 조성물을 함유하는 췌장암의 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 조성물은 젬시타빈을 더 포함할 수 있다. 상기 췌장암은 KRAS 돌연변이와 P53 돌연변이 유전자형을 갖는 세포로부터 발현된 것일 수 있다. 즉, 상기 나노 리포좀 전달체 조성물은 KRAS 돌연변이와 P53 돌연변이 유전자형을 가져 젬시타빈에 약물 저항성을 갖는 췌장암의 치료에 효과적이다.
본 발명은 또한 하기와 같은 췌장암 세포를 선택적으로 인식할 수 있는 나노 리포좀 전달체 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 제1혼성체, 및, ABE 단백질과 P53 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 제2혼성체를 제조하고, 레시틴, 메탈 킬레이팅 지질, 콜레스테롤 및 양이온성 인지질을 클로로포름 상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제1단계; 상기 지질 필름 조성물에, Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA와 ABE 단백질과 P53 유전자를 타켓으로 하는 가이드 RNA 복합체를 넣어 초음파 처리하는 제2단계; 상기 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제3단계; 상기 제3단계에서 얻은 침전물 상태의 나노 리포좀에 가교제를 통해 항체를 결합하는 제4단계; 및, 상기 제4단계에서 얻은 반응물을 투석하여 과량의 항체를 제거하고 항체가 결합된 나노 리포좀을 제5단계;를 포함할 수 있다.
상기 제1단계의 제1혼성체 제조시, Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA는 1:1 내지 1:3의 몰 비로 혼합될 수 있다. 이 때의 혼합비를 벗어나게 되면 혼성체의 제조가 잘 되지 않을 수 있다. 제2혼성체도 역시 ABE 단백질과 P53 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA가 1:1 내지 1:3의 몰 비로 혼합되는 것이 좋다.
상기 제1단계의 레시틴, 메탈 킬레이팅 지질, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸글리콜(2000)아민 및 콜레스테롤은 1:0.005:0.1:0.1 내지 1:0.02:0.3:0.2의 몰 비로 혼합되는 것이 좋다. 마찬가지로 이 때의 혼합비를 벗어나게 되면 나노 리포좀을 구성하는 지질의 제조가 잘 되지 않을 수 있다.
이 때, 상기 제3단계에서 동결하고 융해하는 과정은 1 ~ 12회 반복할 수 있다. 지질 필름 조성물을 동결하고 융해하는 단계를 반복함으로써 보다 균일한 크기의 나노 리포좀 분산액이 형성될 수 있고, 나노 리포좀의 약물 봉입 효율을 높일 수 있다. 단, 12회를 초과할 경우에는 나노 리포좀의 봉입 효율이 오히려 줄어들 수 있기 때문에 12회 이내가 바람직하다.
상기 제4단계에서 나노 리포좀에 가교제를 1 ~ 5시간 동안 혼합한 다음 항체를 첨가하여 1 ~ 5시간 동안 혼합하는 것을 특징으로 한다.
상기 제4단계에서 나노 리포좀, 가교제 및 항체는 10:1:1 내지 30:5:1의 중량비로 결합될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 나노 리포좀 전달체 조성물을 함유하는 약학 조성물을 제공할 수 있는데, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01 ㎎/㎏/일 내지 대략 2,000 ㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1 ㎎/㎏/일 내지 500 ㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체; 및, ABE 단백질과 P53 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체;가 동봉된 나노 리포좀 전달체 조성물 또는 이를 함유하는 항암제 저항성 췌장암 치료제에 관한 것이다. 현재 췌장암 치료제로 사용되고 있는 젬시타빈은 다른 항암용 약물치료제와 비교하여 내성이 심해 다른 암에 비해 췌장암이 사망률이 높은 주된 원인이 되어 왔다. 이에 본 발명의 나노 리포좀은 KRAS 돌연변이를 제거하고 P53 돌연변이를 정상 유전자로 편집함으로써 췌장암 세포를 근본적으로 치료할 수 있어 매우 효과적인 항암제로 이용가능하다.
도 1은 췌장암 세포 내에서 일어나는 젬시타빈 내성 과정을 나타낸다.
도 2a는 췌장암 세포의 유전자 돌연변이 타입을 나타내며, 도 2b는 각 췌장암 세포와 일반 췌장세포에서의 EGFR 막 단백질의 발현량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a는 단일 가이드 RNA 서열 선택을 위한 KRAS mRNA 발현량 확인 결과이며, 도 3b는 P53 sgRNA 표적 서열 후보 및 ABE7.10-nCas9를 코딩하는 서열을 포유류 세포 발현 플라스미드 (pCMV-ABE7.10-P53)에 클로닝한 결과를 나타내는 도식이며, 도 3c는 단일 가이드 RNA 서열 선택을 위한 P53 돌연변이 단백질 발현량 확인 결과이다.
도 4a는 Cas9이 표적 KRAS 유전자를 절단하는 기능이 있음을 확인한 결과이며, 도 4b는 ABE 단백질이 P53의 돌연변이 유전자를 교정했음을 나타내는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a는 본 발명의 나노 리포좀의 구조 모식도 및 cryo-transmission electron microscopy (cryo-EM) 분석 결과를 나타내며, 도 5b는 본 발명 나노 리포좀의 췌장암 세포인 PANC1 세포에 대한 결합성을 FACS로 확인한 결과를 나타내고, 도 5c는 이를 면역형광(IF)으로 분석한 결과, 도 5d는 Cas9 및 ABE의 핵 내 투입 여부를 면역 염색법으로 확인한 결과이다 (Cas9 단백질-녹색, ABE 단백질-빨간색).
도 6a는 항체 결합으로 NL (6.1 ± 1.17 mV)과 비교하여 NL-Ab (-6.58 ± 0.10 mV)의 제타 전위가 음전하를 나타냄을 확인한 결과이며, 도 6b는 NL-Ab의 EGFR 항체를 대상으로 웨스턴 블롯팅을 통해 나노 리포좀과 항체가 결합되었음을 확인한 결과, 도 6c는 세포 내 이입 억제제의 존재 하에서 세포 흡수 실험을 수행한 결과, 도 6d는 NL-Ab에 봉입된 Cas9 및 ABE 단백질 양의 정량 결과를 나타낸다.
도 7은 리포펙타민이 처리된 세포, NL만 처리된 세포, NL-Ab가 처리된 세포에서의 Cas9 및 ABE의 세포 내 수송율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8a와 도 8b는 P53 및 KRAS 유전자 편집 후 PANC1 세포에서 단백질 및 mRNA의 발현을 확인한 CLSM(Confocal Laser Scanning Microscopy) 분석 및 qRT-PCR 결과이고, 도 8c는 KRAS 다운 스트림 및 P53 복원 경로를 확인하기 위해, PANC1 세포에 bare NL-Ab, NL(Cas9)-Ab, NL(ABE)-Ab 및 NL(Cas9/ABE)-Ab를 처리하여 다양한 신호전달 단백질의 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 9는 WST-8 분석을 통해 PANC1 세포주가 젬시타빈(GEM) 약물 내성 PDAC 세포주임을 확인한 결과이다.
도 10a는 NL(Cas9/ABE)-Ab를 이용하여 2종의 유전자 편집 후 젬시타빈 처리시 세포 생존율을 확인한 결과를 나타내며, 도 10b는 NL(Cas9/ABE)-Ab 및 젬시타빈 공동 처리 결과에 대한 세포주기 분포 결과를 나타내며, 도 10c는 웨스턴 블롯팅을 통한 세포주기 관련 유전자의 다양한 단백질 발현 패턴 결과를 나타낸다. 또한 도 10d는 NL(Cas9/ABE)-Ab 처리 이후에 젬시타빈을 처리하였을 때, Cyclin A 및 CDK2와 같은 세포주기 체크 포인트를 확인한 결과이며, 도 10e는 NL(Cas9/ABE)-Ab와 젬시타빈이 공동 처리된 세포에서의 세포 아폽토시스 상태를 확인한 결과이다. 도 10f와 도 10g는 세포 사멸 경로에 관련된 다양한 유전자에 대한 영향을 확인한 결과, 도 10h는 젬시타빈에 대한 내성 조절에서 KRAS 및 P53 유전자의 역할을 명확히 하기 위해 다양한 분자 경쟁 관련 유전자의 단백질 발현을 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 각 췌장암 세포와 일반 췌장암 세포에서의 젬시타빈 결합 수용체 단백질(ENT1) 발현정도를 학인한 결과이다.
도 12a는 젬시타빈 내성 PANC1 세포 이식 이종 이식 마우스 모델을 제조하는 과정을 나타내는 도식이고, 도 12b는 실험 처치 후의 마우스의 사진 및 종양 부피를 나타내는 결과를 나타낸다.
도 13a은 항체가 결합된 NL 입자의 생체 내 특이적 표적화 능력을 확인하기 위해 적색 형광 (RITC) 표지된 입자를 PANC1 이종 이식 마우스의 복강 내 주입하고 입자 분포를 모니터링한 결과를 나타내며, 도 13b는 NL(Cas9/ABE)-Ab가 종양에 도달하여 나노리포좀 내부의 Cas9, ABE 단백질이 전달되었는지 종양 조직을 형광 면역 염색으로 확인한 결과이다. 도 13c는 NL(Cas9/ABE)-Ab 및 젬시타빈이 함께 처리된 Group 8 마우스의 종양 섹션에서 돌연변이 KRAS 및 P53 단백질의 억제 결과를 확인한 형광염색 사진, 도 13d는 Group 8 마우스에서 야생형 P53의 복원, P21 단백질의 과발현 및 phospho-ERK의 발현 억제가 확인된 사진, 도 13e는 생체 내에서 젬시타빈 약물 내성을 극복하기 위한 KRAS 및 P53 유전자 편집 종양 조직에서 GLUT1, TKT, CTPS 및 ENT1과 같은 다양한 바이오 마커의 생체 내 발현을 측정한 결과, 도 13f는 유전자 편집에 의해 젬시타빈 약물 내성을 극복한 종양의 세포 사멸을 평가하기 위해 조직을 TUNEL 분석 및 종양 증식 (Ki67)을 사용하여 시각화한 결과이다.
도 14는 젬시타빈 내성 PANC1 세포 이식 이종 이식 마우스 모델에서의 장기 또는 체중의 변화를 기재한 결과이다.
도 15는 본 발명의 나도리포좀 제조시 DSPE-PEG(2000)-아민 대신 DSPE를 사용하였을 때의 나노리포좀의 수용액상 상태를 UV-Vis 스펙트럼으로 확인한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
실시예 1. KRAS 및 P53 표적 단일 가이드 RNA 서열의 선택
pCas-Guide-EF1a-GFP (# GE100018)는 Origene에서 구입했다. ABE-nCas9 단백질 (pABE-Guide-EF1a-GFP)을 암호화하는 플라스미드는 이전 연구에서 제공된 ABE 7.10 서열에서 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 생성되었다. KRAS 및 P53 표적 단일 가이드 RNA 서열의 선택을 수행하기 위해 플라스미드 (1.0 ㎍)를 Lipofectamine (Invitrogen)을 사용하여 PANC1 세포 (2.5 x 105 세포/12 웰 플레이트)로 형질 감염시켰다.
실시예 2. Cas9 및 ABE 7.10의 발현 및 정제
pET28a-Cas9 (# 53261) 및 pET42b-ABE (# 120398)는 Addgene에서 구입했다. Myc- 태그와 HA- 태그를 서브 클로닝하여 각 단백질을 확인하고, Cas9 및 ABE 단백질의 발현을 위해 BL21 StarTM (DE3) (Thermo Fisher)를 플라스미드로 형질 전환하고 600 nm에서 시료의 광학 밀도가 0.5 ~ 0.6이 될 때까지 형질 감염된 세포를 배양했다. 0.5 mM 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드로 유도한 후, pET28a-Cas9로 형질 전환된 세포를 28 ℃에서 배양하고 pET42b-ABE 처리된 세포를 18 ℃에서 16 시간 동안 배양하였다. Cas9 단백질의 정제를 위해 세포를 용해 완충액에 용해시킨 다음 초음파 처리 및 15000 x g, 4 ℃에서 20분 동안 원심 분리하였다. 이 후 상청액을 Ni-NTA 아가로스수지 (GE Healthcare)와 함께 반응시킨 후 용출 전에 세척 완충액에서 세척했다.
ABE 단백질 제조를 위해서도 형질 감염된 세포를 용해시켰고 Cas9 수거시와 같은 레진을 이용해 ABE 단백질을 수득했다. 레진은 용출 전에 완충액으로 세척하고, 용출용 완충액을 이용하여 시료를 용출하였다.
정제된 Cas9 및 ABE 단백질은 저장 완충액에 투석한 후 -80 ℃에 보관하였다.
용해 완충액 : 100mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M NaCl, 20 mM 이미다졸 및 0.5 mM PMSF
세척용 완충액 : 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M NaCl, 20 % 글리세롤, 5 mM DTT, 20 mM 이미다졸 및 0.5 mM PMSF
용출용 완충액 : 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 20 % 글리세롤, 5 mM DTT 및 20 mM 이미다졸
저장 완충액 : 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF 및 20 % 글리세롤
실시예 3. 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 시험관내 T7 전사
시험관 내 sgRNA 전사를 위한 DNA 주형은 T7 프로모터 서열을 포함하는 정방향 프라이머로 PCR을 사용하여 준비하였다. sgRNA DNA 템플릿은 반응 완충액 (rNTP, RNase inhibitor, DTT)에서 T7 RNA 중합 효소 (Takara)와 함께 37 ℃에서 16 시간 동안 반응하였다. 혼합물을 DNase Ⅰ (Takara)로 처리하여 DNA 주형을 37 ℃에서 30 분 동안 제거 하였다. 합성된 sgRNA를 phenol : chloroform : isoamyl alcohol로 추출한 후 2-propanol을 이용하여 침전시켰다.
실시예 4. 정제된 Cas9 및 ABE7.10의 활성
Cas9 절단 테스트를 위해 하기 표 1에 나열된 프라이머를 사용하여 KRAS 표적 부위를 포함하는 DNA 서열을 증폭했다. KRAS 표적 PCR 산물 (0.5 ㎍)에 정제된 Cas9 단백질(1.56 μM) 및 KRAS sgRNA (1.47 μM)를 NEB 버퍼 3 (10 μL) 상에서 37 ℃에서 1 시간 동안 처리하였다. 분해된 산물은 2 % 아가로스겔을 통해 확인하였다.
단일 가이드 RNA(sgRNA)의 시험관내 T7 전사에 사용된 프라이머
KRAS sgRNA 제작을 위한 정방향 프라이머 5’-GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGAATTAGCTGTATCGTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’ (서열번호 3이 포함되며, 서열번호 7을 제작하기 위한 정방향 프라이머)
P53 sgRNA 제작을 위한 정방향 프라이머 5’-GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGCATGTTTGTGCCTGTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’ (서열번호 4가 포함되며, 서열번호 8을 제작하기 위한 정방향 프라이머)
Scramble sgRNA 제작을 위한 정방향 프라이머 5’-GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGGGCACTACCAGAGCTAACTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’
sgRNA 제작을 위한 역방향 프라이머 5’-AAAAGCACCGACTCGGTG-3’ (서열번호 7, 8을 제작하기 위한 정방향 프라이머)
정제된 Cas9 및 ABE7.10의 활성 확인을 위해 사용된 프라이머
KRAS 표적 PCR 산물 제작을 위한 프라이머 (정방향)　5’-CATATAAAGGTGAGTTTGTATTAAAAGG-3’,
(역방향)　5’-CTGAAATACACTTCCAATCAAAATGC-3’
P53 표적 PCR 산물 제작을 위한 프라이머 (정방향) 5’-AATCTCCTTACTGCTCCCACTCAG-3’,
(역방향) 5’-CAAGACTTAGTACCTGAAGGGTG-3’
ABE 활성을 위해서는, P53 표적 PCR 산물 (0.5 ㎍)을 37 ℃에서 3 시간 동안 NEB 완충액 3(10 μL)에서 정제된 ABE 단백질 (1.0 μM) 및 P53 sgRNA (1.47 μM)로 처리했다. 다음으로 엔도뉴클레아제 V (endoV, NEB)와 함께 인큐베이션하기 전에 반응 혼합물을 1 시간 동안 37 ℃에서 Nucleospin PCR Cleanup (MN)을 사용하여 정제했다. 분해된 산물은 2 % 아가로스 겔을 통해 확인하였다.
PANC1 세포의 게놈 DNA (10 ㎍)를 NucleoSpin Tissue (MN)를 사용하여 정제하고 37 ℃에서 16 시간 동안 NEB 버퍼 3에서 정제된 ABE (1.0 μM), sgRNA (1.47 μM)로 처리했다. RNase A (50 ㎍/mL) 및 proteinase K (20 mg/mL) 처리 후, 이노신 함유 게놈 DNA를 페놀:클로로포름:이소아밀알코올로 추출하고 2-프로판올을 사용하여 침전시켰다. 정제된 DNA (6 ㎍)를 37 ℃에서 6 시간 동안 endoV (10 유닛)와 함께 반응하였다. 이 후 반응 생성물을 다시 페놀:클로로포름:이소아밀알코올로 추출하고 2-프로판올을 사용하여 침전시켰다. PANC1 세포의 P53 돌연변이 표적 부위 (818G> A, R273H)는 Sanger 시퀀싱 분석에 의해 확인하였다.
실시예 5. 세포 배양 및 형질 감염
인간 췌관 상피 세포주 (H6c7, Kerafest)를 제외한 모든 세포주는 한국 세포주 은행에서 구매하였다. PANC1 및 MIAPaCa-2 세포는 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco Modified Eagle Medium에서 배양하였다. BxPC-3 및 Capan-2 세포는 10 % FBS 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. H6c7 세포는 keratinocyte basal medium와 보충제 (Clonetics KBM, # CC-3111)에서 배양되었으며 모든 세포는 마이코 플라스마 음성인 것을 확인 후 사용하였다. 플라스미드 (pCMV-Cas9-KRAS, pCMV-ABE7.10-P53 및 pCMV-ENT1)는 Lipofectamine 3,000 (Invitrogen)을 사용하여 세포에 형질 감염시켰다.
각 실험을 위한 PANC1 세포는 5 % CO2 조건, 37 ℃에서 60-mm2 세포 배양 플레이트에 1.5 x 106개의 세포를 접종한 다음 나노리포좀을 투여하되, NL(Cas9/ABE)-Ab 기준으로 68.25 nM의 Cas9 및 ABE를 첨가하고 37 ℃에서 배양하였고, 필요에 따라 나노리포좀 처리 3 시간 후에 젬시타빈(10 μM)을 투여하고 24 시간 동안 계속 배양하였다.
실험예 1. 타겟 유전자 대상 단일 가이드 RNA (sgRNA) 선정 및 합성된 Cas9와 ABE의 시험관 내 기능 확인
췌장암 세포들은 도 2a처럼 다양한 타입의 유전자 돌연변이가 있다. PANC1 세포는 코돈 12에서 KRAS 유전자 점 돌연변이 (c.35G> A, p.G12D) 및 코돈 273에서 P53 유전자 점 돌연변이 (c.818G> A, p.R273H)가 있다. 단일 점 돌연변이 세포주로서 BxPC-3은 P53 유전자 돌연변이와 야생형 KRAS 유전자를 가졌고 Capan-2는 KRAS 유전자 돌연변이만 가지고 있다.
한편, 각 췌장암 세포별로 EGFR 막 단백질의 발현에 대해 일반 췌장 세포 (H6c7)의 발현 수준과 비교하여(도 2b), PANC1을 유전자 편집 대상 세포로 결정하였고, KRAS 및 P53 유전자 편집에 효과적인 KRAS 및 P53 sgRNA 표적 서열을 선택하였다.
KRAS 유전자 인식을 위한 sgRNA 서열은 qRT-PCR 법으로 sgKRAS-1 서열이 KRAS mRNA 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인하여 선택하였다(도 3a).
P53 표적 유전자(sgP53)에 대한 sgRNA 서열 후보는 PANC1 세포의 P53 점돌연변이 (c.818G> A, p.R273H)를 포함하여 두 가지 다른 sgP53 서열을 선택하고, P53 sgRNA 표적 서열 후보 및 ABE7.10-nCas9을 코딩하는 서열을 포유류 세포 발현 플라스미드 (pCMV-ABE7.10-P53)에 클로닝하여 확인하였다(도 3b). 이를 리포펙타민을 사용하여 벡터로서 PANC-1 세포를 형질 감염시킨 후, sgP53-2 서열이 돌연변이 P53 단백질 수준을 현저히 감소시킴을 알 수 있다(도 3c).
이에 본 발명에서는 PANC-1 세포에서 sgKRAS-1 (KRAS 표적 서열 : CTGATTAGCTGTATCGTCA) 및 sgP53-2 (P53 표적 서열 : GTGCATGTTTGTGCCTGTCC)를 사용하여 KRAS 및 P53 돌연변이 유전자를 편집하기로 하였다.
다음으로는 대장균(E. coli)에서 재조합 Cas9를 정제하여 얻은 후 KRAS 유전자(PCR 산물)의 500-bp 단편의 시험관 내 절단을 평가하였다. 그 결과, Cas9이 표적 KRAS 유전자를 절단하는 기능이 있음을 아가로스겔 전기영동 분석을 통해 확인할 수 있다(도 4a).
재조합 ABE 단백질은 ABE7.10-nCas9 벡터 발현 후 대장균에서 정제되었으며, ABE 매개 염기 전환 능력은 P53 유전자 PCR 산물의 시험관 내 절단으로 검출된다. 정제된 재조합 ABE 와 P53 PCR 산물을 반응시키면 표적 유전자를 먼저 A-to-I로 전환하고 500bp P53 PCR 산물을 엔도뉴클레아제 V (endoV)로 절단하여 이중 가닥 파손을 생성하는데, P53 염기 탈아미노화를 Sanger 시퀀싱으로 확인할 수 있으며, ABE-RNP 처리된 PCR 산물이 A에서 I로의 전환을 통해 이중 피크 밴드를 갖는 것으로 나타난다(도 4b).
실험예 2. 나노 리포좀(NL-Ab)의 제조
NL은 박막 수화 방법을 사용하여 준비하였다. 간단히 말해서, 레시틴 : 콜레스테롤 : DGS-NTA (Ni) : DSPE-PEG(2000) 아민 (몰비 1 : 0.2 : 0.0125 : 0.25)을 클로로포름 1 mL에 용해시키고 용매를 증발시켰다. 필름은 정제된 각각의 383 nM의 Cas9 및 ABE 및 1 mL 포스페이트 완충 식염수 (PBS) (pH 7.2)에 분산된 625.5 nM sgRNA 복합체로 수화되었다. 동결-해동 절차 후, NL 용액을 4 ℃에서 2 시간 동안 sulfo-SMCC와 함께 배양하였다.
sulfo-SMCC : (sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)
투석을 통해 미반응물을 제거하고 NL에 4 ℃에서 16 시간 동안 thiolated EGFR 항체를 결합하였다. 생성된 NL-Ab 용액을 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과한 다음 1,000 kDa 멤브레인을 통해 4 ℃에서 16 시간 동안 투석하였다.
이 때, 본 발명에서, 나노 리포좀은 기존의 대한민국 등록특허 제10-1796036호에 공시된 방법과 유사하게 제조하되, 리포좀 내부에 Cas9 및 sgKRAS 혼성체 외에 ABE 및 sgP53 복합체가 봉입되도록 하였다. 이 2종의 복합체의 혼합비는 동일 중량으로 추가하였다.
다만 이 때 Cas9 및 sgKRAS 혼성체에는 대한민국 등록특허 제10-1796036호에서와 달리 폴리에틸렌이민이 결합되지 않은 것을 사용하였다. 탑재되는 Cas9과 ABE 단백질에는 나노 리포좀 구성 화합물인 DGS-NTA-Ni과 결합이 충분히 가능하기 때문에 양이온성 고분자를 사용하지 않아도 된다. 리포좀의 지질층은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE) 대신 DSPE-PEG(2000)-아민을 사용하였다. DSPE-PEG(2000)-아민에 존재하는 PEG(2000)은 수용액 상태에서 나노 리포좀의 안정성을 제공하는 역할을 하고, Cas9 및 sgKRAS 혼성체에 폴리에틸렌이민을 결합하지 않아도 리포좀 내 봉입율을 높이며, 리포좀 외부에 아민기를 통해 원하는 항체를 도입하는 역할을 한다.
실험예 3. 나노 리포좀(NL-Ab)의 성상 확인
제조된 나노 리포좀 조성물은 200 nm 여과 및 1,000 kDa 투석 후, 저온 전도 전자 현미경 확인(저온 전도 전자 현미경 검사), DLS(dynamic light scattering) 분석, 제타 전위 측정 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 형태, 크기, 표면을 평가하였다. NL-Ab의 유체 역학적 크기와 제타 전위는 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments)를 사용하여 측정하였다. NL-Ab의 형태는 cryo-transmission electron microscopy (cryo-EM, Tecnai F20 G2, FEI)를 사용하여 관찰하였다.
그 결과 141.0 ± 1.28 nm의 나노미터 크기를 갖는 구형 입자가 DLS 측정으로 확인된다(도 5a).
웨스턴 블롯은 다음의 방법으로 실시하였다.
PANC1 세포를 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제 (Sigma)와 함께 RIPA 버퍼에서 용해하였다. 전체 세포 용해물은 BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Scientific)를 사용하여 표준화하였다. 다음으로 세포 용해물 (40 ㎍)을 변성 조건 하에서 12 % SDS-PAGE 겔에 로딩하고 PVDF 막 (iBlot2 Dry Blotting System, Thermo Scientific)으로 이동하였다. 막을 5 % 탈지우유로 실온에서 1 시간 동안 차단하고 다음 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 16 시간 동안 반응시켰다 : anti-RAS, phospho-ERK, phospho-Rb (Cell Signaling), anti-mutant P53, p27KIP , p21CIP (Abcam), 안티 야생형 P53 (Sigma), Cyclin D1, CDK4, GLUT1, TKT, 액틴 (Santa Cruz) 및 HIF-1α, CTPS1 및 ENT1 (Proteintech).
HRP- 접합된 이차 항체를 실온에서 2 시간 동안 반응시킨 후 멤브레인에 웨스턴 ECL 처리 후 발광 이미지를 LAS500 (GE Healthcare)을 사용하여 분석하였다.
RNA는 제조업체의 지침에 따라 Trizol (Invitrogen)을 사용한 총 RNA 정제 후 SuprimeScript RT 프리믹스 (GeNetBio) 및 올리고 dT 프라이머로 역전사하였다. SYBR Green Premix (Applied Biosystems)를 사용하여 Quantstudio3에서 정량적 PCR (qPCR)을 수행했다. 관심있는 전사체는 액틴 전사체 수준으로 정규화되어 RNA를 정량하였다. 이 때 사용된 프라이머 서열은 표 2에 나열하였다.
정량적 PCR 분석을 위한 프라이머
타겟 정방향 프라이머 역방향 프라이머
KRAS (G12D) 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA-3’ 5’-TTGGATCATATTCGTCCACAA-3’
β-Actin 5’-ACGTGGACATCCGCAAAGA-3’ 5’-CTCAGGAGGAGCAATGATC-3’
BAX
(origene, #HP207656)		 5’-TCAGGATGCGTCCACCAAGAAG-3’ 5’-TGTGTCCACGGCGGCAATCATC-3’
BCL2
(origene, #HP200598)		 5’-ATCGCCCTGTGGATGACTGAGT-3’ 5’-GCCAGGAGAAATCAAACAGAGGC-3’
PUMA
(origene, #HP210869)		 5’-ACGACCTCAACGCACAGTACGA-3’ 5’-CCTAATTGGGCTCCATCTCGGG-3’
PARP
(origene, #HP205442)		 5’-CCAAGCCAGTTCAGGACCTCAT-3’ 5’-GGATCTGCCTTTTGCTCAGCTTC-3’
Caspase3
(origene, #HP207674)		 5’-GGAAGCGAATCAATGGACTCTGG-3’ 5’-GCATCGACATCTGTACCAGACC-3’
NL-Ab의 세포 내 이입 메커니즘을 확인하기 위해서는 PANC1에 genistein (10 ㎍/mL), chlorpromazine (20 ㎍/mL), nocodazole (1.5 ㎍/mL) 및 cytochalasin B (4.8 ㎍/mL)에 첨가해 2 시간 동안 배양하였다. 다음으로, 세포에 NL(Cas9/ABE)-Ab (2.5 mL opti-MEM에서 각각 68.25 nM의 Cas9 및 ABE)를 처리하였다. 모든 샘플은 4 ℃의 샘플을 제외하고 37 ℃에서 배양되었고, 24 시간 후에 flow cytometry (Accuri C6 Plus, BD)로 처리한 후 분석하였다.
또한 이렇게 제조된 NL-Ab가 항체가 결합되어 있기 때문에 PANC1 및 H6c7 세포를 형광면역법(IF)으로 분석하였다. 세포 형광면역법은 다음의 방법으로 실험을 수행하였다. 이를 위해, PANC1 세포를 5 % CO2 하에서 37 ℃ 에서 8-웰 세포 배양 슬라이드 (4 x 104 세포/슬라이드)에 분주했다. 세포를 NL(Cas9/ABE)-Ab (각각 22.75 nM의 Cas9 및 ABE in 0.2 mL opti-MEM)와 함께 37 ℃에서 3 시간 동안 배양 한 다음 세포에 젬시타빈 (10 μM)을 처리하고 48 시간 후에 분석했다. 세포는 파라 포름 알데히드로 세포 고정 후 permeabilization (0.01 % Triton X-100)과 blocking (TBST의 3 % BSA)하였다. 4 ℃에서 16 시간 동안 1 차 항체와 함께 배양한 후, 세포를 형광 결합 2 차 항체와 함께 실온에서 2 시간 동안 배양했다. 세포는 형광 현미경 (LSM800, Carl Zeiss)으로 관찰하였다.
실험 결과, 도 5b와 도 5c에서와 같이 NL-Ab의 EGFR 항체가 H6c7 세포에 비해 PANC1 세포와 더 결합을 잘 하는 것을 확인할 수 있다. Cas9 및 ABE-RNP의 핵 내 투입 여부를 확인하기 위해 NL-Ab가 처리된 세포를 anti-Myc (Cas9 단백질, 녹색) 및 anti-HA (ABE 단백질, 빨간색)로 면역 염색한 후 IF로 시각화한 결과 Cas9 및 ABE-RNP로부터 핵 위치 서열의 침투 능력으로 인해 핵에서 형광 신호가 검출된다(도 5d).
또한, 항체 결합으로 인해 NL (6.1 ± 1.17 mV)과 비교하여 NL-Ab (-6.58 ± 0.10 mV)의 제타 전위가 음전하를 나타냄을 파악하였다(도 6a). 이 때 NL-Ab의 EGFR 항체를 대상으로 웨스턴 블롯팅을 통해 측정되어 나노입자 제조가 잘 되었음을 다시 한번 확인할 수 있다(도 6b).
세포 내 이입 억제제의 존재 하에서 세포 흡수 실험을 수행한 경우에는(도 6c). 클라트린 매개 세포 내 이입 억제제 (클로르프로마진)에서 NL-Ab의 세포 흡수를 극적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있고, 반대로, caveolae-dependent endocytosis inhibitor (genistein), macro-pinocytosis inhibitor (nocodazole) 및 phagocytosis inhibitor (cytochalasin B)는 NL-Ab의 흡수에 영향을 미치지 않는다(4 ℃에서는 세포활성이 억제되기 때문에 NL-Ab의 흡수가 없다). 따라서, NL-Ab의 세포 흡수가 클라트린-매개 세포 내 이입에 의존하는 것을 알 수 있다. 외부 물질이 세포 안으로 들어가는 흡입 경로는 크게 5가지로 나눌 수가 있는데, 세포의 표면에서 막의 일부가 밖으로 돌출되면서 입자를 둘러싸서 삼키는 식세포작용(phagocytosis), 막루플링(membrane ruffling)으로 인해 액틴필라멘트(actin filament)가 활발하게 중합하면서 입자를 흡입하는 대음세포작용(macropinocytosis), 세포질 쪽의 클라스린(chlatrin)이라는 단백질을 이용하는 클라스린 의존성 세포내흡입(chlatrin mediated endocytosis), 콜레스테롤과 카베올린(caveolin)이라는 막단백질의 농도가 높은 곳을 이용하는 카베올린 의존성 세포내흡입(caveolin-dependent endocytosis), 클라스린과 카베올린 등과 같은 단백질을 사용하지 않는 흡입방법 (clatrin and caveolin independent endocytosis)이 있다. 이러한 각각의 흡입 경로를 막는 약물들이 있는데, genistein은 카베올린 의존성 세포내 흡입을 방해하고, chloropromazine은 클라스린 의존성 세포내흡입을 방해, nocodazole은 대음세포작용을 억제, cytochalasin B 는 식세포작용을 억제한다. 한편, 4 ℃ 에서는 세포가 에너지를 사용하지 못하므로 에너지 의존적으로 세포내흡입작용을 억제할 수가 있다(Dos Santos T et al., 2011).
다음으로 웨스턴 블로팅을 통해 봉입 전의 Cas9 및 ABE 단백질 시료와 NL-Ab을 동일 중량으로 로딩하여 NL-Ab에 봉입된 Cas9 및 ABE 단백질의 양을 정량화한 바, 약 89.3 %가 봉입된 것을 확인할 수 있다(도 6d).
이 외에도, 세포 흡수 효율(또는 세포내 수송 효율)을 비교하기 위해 항체 결합 유무에 따라 NL, NL-Ab 및 리포펙타민을 PANC1 세포에 시간 별(0, 0.5, 1, 3, 6 시간)로 처리한 후 형광 염색하여 FACS(fluorescence-activated single cell sorting) 분석을 통해 Cas9/ABE 단백질 수를 정량적으로 확인하였고, 이를 도 7에 나타냈다.
그 결과 리포펙타민 처리를 한 세포는 단백질이 세포투과를 거의 하지 않은 것으로 확인되며, NL만 처리된 세포에 비해 NL-Ab가 처리된 세포가 Cas9/ABE이 세포 내에서 다량 검출되었다.
따라서 지금까지의 결과를 통해 본 발명에서 제조한 NL-Ab가 췌장암 세포에 대한 투과성이 매우 우수함을 입증할 수 있다.
실험예 4. 체외 유전자 편집 능력 확인 i
PANC1 세포를 NL-Ab로 처리한 후 NGS(Next Generation Sequencing) 분석으로 유전자 상태를 확인하였다. 이를 위해, PANC1 세포 또는 이종 이식 종양을 NL(Cas9/ABE)-Ab로 처리한 후, 제조업체의 지침에 따라 Nucleospin Tissue(Macherey-Nagel)를 사용하여 게놈 DNA (gDNA)를 분리했다. Covaris 시스템을 사용하여 총 1 ㎍ gDNA를 단편화하였고, 이러한 라이브러리는 Macrogen에서 HiSeq X Ten Sequencer (Illumina)를 사용하여 전체 게놈 시퀀싱을 수행했으며 Cas-OFFinder (www.rgenome.net)를 사용하여 최대 3 bp의 불일치를 가진 잠재적인 오프 타겟 사이트를 식별했다.
이에 대한 분석 결과는 표 3 및 표 4에 나타내었다.
In vitro KRAS target sequence PAM Indels
Control CTGAATTAGCTGTATCG -TCA AGG WT -
NL-Ab treated CTGAATTAGCTGTAT_ _ -TCA AGG -2 24.4 %
CTGAATTAGCTGTATCGA-TCA AGG +1 13.4 %
CTGAATTAGCTGTATCGT-TCA AGG +1 13.4 %
Total Indel efficacy 51.2 %
In vitro P53 target sequence PAM Base edited efficacy
Control GTGCATGTTTGTGCCTGTCC TGG -
NL-Ab treated GTGCGTGTTTGTGCCTGTCC TGG 53.6 %
분석 결과, NL-Ab 처리 후 48 시간에, KRAS 유전자 편집 효율은 51.2 %로 높게 나타났고, P53 유전자에서도 53.6 %의 A-to-G에 대한 염기 전환이 확인된다.
또한, Cas9 및 ABE-RNP 편집의 효과를 확인하기 위해 인간 게놈에서 최대 3bp의 불일치를 포함하는 오프 타겟 효과 분석을 수행한 결과, 전체 게놈 시퀀싱은 KRAS indel(insertion-deletion) editing에서 오프 타겟 효과를 나타내지 않는다 (표 5 및 표 6). 이는 본 발명에서 사용되는 단일 가이드 sgRNA의 염기서열이 매우 효과적으로 KRAS 또는 P53 유전자 부위를 선택적으로 인지하여, 원하는 않는 부위의 유전자는 전혀 편집하지 않았음을 의미한다.
Off-target sites - KRAS
In vitro sample Chr Position Sequence Strand Mis-
Matches		 Total Count Indel Count Indel Efficacy
NL-Ab treated 1 Chr1 74,955,086 CaGAATTAGCTGTATCtaCA + 3 43 0 0
2 Chr3 45,705,927 CTGAcTTAGCTaTATCtTCA + 3 20 0 0
3 Chr4 113,644,828 tTtAATTAGCTGTcTCGTCA + 3 21 0 0
4 Chr5 82,986,242 CaGAATTAGCTGTtTgGTCA + 3 40 0 0
5 Chr16 68,389,103 CTGAcTTAGCTcTATcTCA + 3 29 0 0
Off-target sites - P53
In vitro sample Chr Position Sequence Strand Mis-
Matches		 Total Count Indel Count Indel Efficacy
NL-Ab treated 1 Chr1 3,045,635 GTGCATGTgTGTGCgTtTCC + 3 63 0 0
2 Chr6 44,246,698 cTGCATGTgTGTGCCTGTCt + 3 32 0 0
3 Chr9 116,287,425 GTGCATGTgTcTGCCTGcCC + 3 29 0 0
4 Chr10 64,380,311 GTGCATGTTTGTGtgTGTCC + 2 74 0 0
5 Chr19 44,273,497 GTGCATGTccaTGCCTGTCC + 3 27 0 0
NL 기반 입자에 의한 돌연변이 P53 및 KRAS 유전자 편집 후, 처리된 PANC1 세포에서 단백질 및 mRNA의 발현은 CLSM 분석 및 qRT-PCR에 의해 결정되었다 (도 8a, 8b). 양성 NL(Cas9/ABE)-Ab 처리된 PANC1 세포는 NL(Cas9)-Ab 및 NL(ABE)-Ab 처리된 세포와 비교하여 돌연변이 KRAS 및 돌연변이 P53의 유의미한 하향 조절을 나타냈다.
KRAS 다운 스트림 및 P53 복원 경로를 확인하기 위해, PANC1 세포에 bare NL-Ab, NL(Cas9)-Ab 및 NL(ABE)-Ab를 처리하여 다양한 신호전달 단백질의 발현 정도를 확인하였다 (도 8c). 스크램블된 sgRNA (sgScramble)를 포함하여 유전자 편집 기능이 없는 bare NL는 RAS, p-ERK 및 돌연변이 P53의 발현에 변화가 없음을 보여주었다. 또한, NL(Cas9)-Ab 및 NL(Cas9/ABE)-Ab가 처리된 세포는 KRAS 및 p-ERK의 단백질 발현이 억제되었고, NL(ABE)-Ab 및 NL(Cas9/ABE)-Ab 처리된 세포는 돌연변이 P53이 감소하고 야생형 P53 발현 수준이 증가하며 그 반대도 마찬가지다. 이러한 결과는 Cas9와 ABE가 동시에 한 입자에 함께 포함되어 있어도 유전자 편집에 대한 활성이 변경되지 않았음을 나타낸다.
실험예 5. 체외 유전자 편집 능력 확인 ii
세포 생존력 분석은 WST-8 분석을 이용하였다. 이를 위해, PANC1, MIAPaCa-2, BxPC-3 및 Capan-2 세포를 NL-Ab로 처리한 후 24 시간 동안 96-웰 플레이트 (1 x 103 세포/웰)에 접종했다. 세포에 젬시타빈 (0 ~ 100 μM)에 처리하고 24 시간 배양 후 WST-8 시약 (Dojindo)을 37 ℃에서 1 시간 동안 배지에 첨가하였다. 이 후 24 시간마다 마이크로 플레이트 리더 (BioTek)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, PANC1 세포주가 젬시타빈 약물 내성 PDAC 세포주임을 확인할 수 있다(도 9). 그러나, NL(Cas9/ABE)-Ab를 이용하여 2종의 유전자 편집 후 젬시타빈 처리시 세포 생존율이 ~ 90 % 감소하는 것이 관찰된다(도 10a). 따라서, 췌장암에서 젬시타빈 약물 내성을 극복하고 치료 효과를 높이려면 KRAS와 P53 유전자를 동시에 편집해야 한다는 것을 확인할 수 있다.
NL(Cas9/ABE)-Ab 및 젬시타빈 공동 처리 효과는 세포주기 분포를 조사하여 평가할 수 있는데, 세포주기는 Flow cytometry를 이용하여 확인했다.
측정결과, 세포주기가 NL(Cas9/ABE)-Ab 매개 KRAS 및 P53 편집 과정 동안 G0/G1 단계에서 축적되는 것으로 확인된다(도 10b). 또한, 웨스턴 블롯팅을 통한 세포주기 관련 유전자의 다양한 단백질 발현 패턴도 확인할 수 있다(도 10c).
이 외, NL(Cas9/ABE)-Ab에 의한 유전자 편집은 Cyclin D1 및 CDK4와 같은 G0/G1 세포주기 체크 포인트를 담당하는 유전자의 하향 조절을 초래했고, 나노 리포좀 처리된 세포는 P27KIP 및 P21CIP의 단백질 발현 증가를 보였으며, 이는 phospho-Rb 발현 수준과 역상관 관계가 있었다. NL(Cas9/ABE)-Ab 및 젬시타빈이 함께 처리된 세포에서 S 기 체크 포인트 단백질은 Cyclin A 및 CDK2의 발현 수준이 감소한 것으로 나타났다 (도 10d). 이러한 결과는 세포 생존력 결과와 유사하게 NL(Cas9/ABE)-Ab 및 젬시타빈이 공동 처리된 세포는 젬시타빈 또는 NL(Cas9/ABE)-Ab를 사용한 단일 처리보다 더 높은 세포 사멸을 이끌었다(도 10e).
또한 세포 사멸 경로에 관련된 다양한 유전자에 대한 영향을 확인한 바(도 10f 및 도 10g), BAX, PUMA, PARP, Caspase-3, BAD의 apoptotic marker는 증가하였고, anti-apoptotic marker (BCL2)는 NL(Cas9/ABE)-Ab와 젬시타빈 동시 처리 후 감소하였다. 결과적으로 유전자 편집과 치료 약물의 병용 치료는 약물 내성 암의 시너지적 세포 사멸을 유도할 수 있다.
젬시타빈 내성 세포는 KRAS 및 P53의 유전자 변이를 통해 HIF-1α의 과발현 및 안정화를 통해 포도당 흡수를 증가시킨다. 포도당 수준의 향상은 포도당 대사, 비산 화성 오탄당 인산 경로 (PPP) 및 de novo pyrimidine 합성을 유도한다. 이 경로에 따르면 dCTP가 과도 합성되어 결국 젬시타빈 대사 산물의 dFdCTP와 분자 경쟁 반응을 일으키고 젬시타빈 약물 내성을 유발한다. 젬시타빈에 대한 내성 조절에서 KRAS 및 P53 유전자의 역할을 명확히 하기 위해 다양한 분자 경쟁 관련 유전자의 단백질 발현을 분석했다(도 10h). 결과는 KRAS 및 P53 유전자 편집이 HIF-1α의 분해, 포도당 흡수 수용체 (GLUT1)의 감소 및 dCTP 합성 관련 효소 (TKT 및 CTPS)의 억제와 관련이 있음을 보여주었다.
한편, KRAS 또는 P53의 유전자 편집 후 젬시타빈 결합 수용체 단백질 수송체 (ENT1) 가 증가하는 것을 알 수 있는데(도 10h), 과다 발현된 ENT1이 젬시타빈 흡수를 증가시키고 세포로의 높은 농도의 젬시타빈 산물 (dFdCTP)을 초래하게 되고, 젬시타빈 민감도와 ENT1 발현 수준의 상관 관계를 이해하기 위해 다양한 췌장암 세포의 생존력을 평가한 결과, KRAS 및 P53 유전자 돌연변이가 있는 PANC1 세포는 일반적인 젬시타빈 약물 내성과 정상 세포주 (H6c7)와 유사한 ENT1의 낮은 발현을 나타냈다. 대조적으로, 약물 내성이 없는 BxPC-3 및 Capan-2 세포주는 다량의 ENT1 수용체 단백질 발현을 보였고 젬시타빈 약물의 저항성을 나타내지 않았다(도 11).
실험예 6. PDAC에 대한 생체 내 치료 적용
젬시타빈 내성 PANC1 세포 이식 이종 이식 마우스 모델은 도 12a의 스케쥴을 따라 제조하였다. 이후 종양이 150 ~ 200 ㎣에 도달하면 NL-Ab 입자 용액을 복강 내로 주사하였고, 4 주 동안 주 2회 젬시타빈 (50 mg/kg)을 투여하였다.
마우스는 다음과 같은 군으로 구분되었고 도 12b에 나타내었다.
실험군 마우스 처치 상태
Group 1 non-treatment
Group 2 only GEM
Group 3 Cas9/ABE RNP + Gem
Group 4 NL(Cas9/ABE) without Ab + GEM
Group 5 bare NL-Ab + GEM
Group 6 NL(only Cas9)-Ab + Gem
Group 7 NL(only ABE)-Ab + Gem
Group 8 NL(Cas9/ABE)-Ab + Gem
Group 9 only NL(Cas9/ABE)-Ab
모든 동물 복지 및 실험 절차는 서울 성모 병원 규정 (IACUC 승인 번호 : 2020-0078-01)에 따라 수행되었다. 이종 이식 마우스 모델의 경우, PANC1 세포 (50 % Matrigel 용액 중 1 x 107 세포)를 5 주령 암컷 BALB/c 누드 마우스의 왼쪽 허벅지에 피하 이식했다. 실험은 종양의 크기가 150 ~ 200 mm3에 도달했을 때 진행되었다. 생체 내 NL-Ab 표적화 효능 평가를 위해 마우스에 RITC가 캡슐화된 NL-Ab (525 mg/kg)를 복강 주사하고 이소플루란으로 마취한 다음 IVIS (Xenogen Spectrum)를 사용하여 이미지를 캡처했다. 또한, 생체 내 치료 효능을 평가하기 위해 마우스에 Cas9/ABE 등이 포함되지 않은 bare NL-Ab, Ab가 없는 NL(Cas9/ABE),NL(Cas9 단독)-Ab, NL(ABE 단독)-Ab, NL(Cas9/ABE)-Ab를 그룹별로 복강 내로 주사했으며(0.25 mL PBS), NL(Cas9/ABE)-Ab 기준 (2.0 μM Cas9, ABE 및 3.75 μM sgRNA 포함), 젬시타빈(GEM)의 치료 효과를 확인하기 위해 젬시타빈 (50 mg/kg)을 4 주 동안 주 2 회 투여했다 (그룹 당 마우스 5 마리). 종양 성장은 2 ~ 3 일마다 캘리퍼스로 확인하였다. 종양 부피는 다음 공식을 사용하여 측정하였다 : 부피 (mm3) = (L × W2)/2. (L : 길이, W : 폭)
그 결과, NL(Cas9/ABE)-Ab 및 젬시타빈이 같이 처리된 마우스에서 종양 성장 억제 효과가 가장 우수하였다(대조군 Group 1 대비 84 % 감소). 젬시타빈 (Group 2) 또는 NL (Group 9) 처리된 마우스는 28 일 치료 후 경미한 억제 현상만 나타났고, NL(Cas9)-Ab 또는 NL(ABE)-Ab와 함께 젬시타빈이 동시 처리된 마우스 (Group 6 및 Group7)는 종양 부피가 상대적으로 감소되었으나 종양 성장을 완전히 억제하지는 못했다. 젬시타빈 단독, RNP 단독, 항체가 결합되지 않은 NL 또는 내용물이 봉입되지 않은 NL-Ab 처리 마우스 (Group 2 ~ Group5)에서는 거의 치료 효과를 나타내지 않았다.
다음으로는 이 마우스에서 항체가 결합된 NL 입자의 생체 내 특이적 표적화 능력을 확인하였다.
이를 위해, 조직학적 검사를 위해 기관과 종양을 10 % 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매하였다. 조직 절편을 3 μm 두께의 절편으로 자르고 자일렌에서 탈파라핀화 한 후 에탄올을 사용하여 재-수화하였고, 다음으로, 헤마톡실린&에오신(H&E)으로 염색하였다.
염색한 섹션은 항원 추척을 위해 unmarking 하고(0.01 M 시트르산 나트륨 완충액, pH 6.0), 3 % 과산화수소에 반응시킨 후, 1 차 항체 반응 전에 Tris 완충 식염수 (TBS)에서 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 blocking 하였다. 1 차 항체는 다음의 것을 사용하였다 : anti-RAS, anti-mutant-P53, anti-P21 (Abcam), anti-p-ERK (Cell Signaling), anti-TKT, anti-GLUT1 (Santa Cruz), anti- HIF-1a, anti-ENT1, anti-CTPS (Proteintech) 및 anti-Ki67 (Thermo). 다음으로, 면역 조직 화학적 분석을 위해 조직 절편을 anti-mouse/rabbit horseradish peroxidase (HRP) (Santacruz)와 함께 반응시킨 후 3,3'-diaminobenzidine(DAB)과 반응시키고 hematoxylin으로 대조 염색하고, 슬라이드 스캐너 (3DHISTECH)를 사용하여 슬라이드를 관찰하였다. 또한, 슬라이스 된 종양 조직을 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 16 시간 동안 배양 한 다음 면역 형광을 위해 Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 594가 접합된 2 차 항체와 함께 반응시켰다. 슬라이드에 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Immunobioscience)을 장착하고 LSM800 공 초점 현미경 (Carl Zeiss)을 사용하여 시료를 확인하였다.
이에 도 13a에서와 같이 항체가 결합되지 않은 NL은 2 시간 이내에 종양 근처에서 발견되지만 곧바로 사라지며, NL-Ab가 주입된 마우스의 경우, 입자가 종양 부위에 확연하게 축적되는 것으로 보인다. 이 때, 활성 표적화 효율을 확인하기 위해 도 13b와 같이 NL-Ab가 투입된 마우스 내의 종양 조직을 Cas9 및 ABE 단백질을 면역 염색 후 이를 다시 한번 확인하였다. 한편 NL-Ab가 주입된 마우스에서 종양 조직 내에서 강한 발광 현상이 72 시간 동안 유지되었고 7 일 후에 모두 사라졌다.
이러한 현상은 항체 결합 입자에 의한 능동적 표적 전달의 특징으로 전달 및 치료 효과를 극대화할 수 있음을 입증한다.
한편, 7 일째 NL(Cas9/ABE)-Ab 처리된 마우스를 안락사하여 종양의 KRAS 및 P53 유전자의 NGS를 분석하였다. 생체 내 유전자 편집 효율은 KRAS 유전자의 프레임 시프트 인델 (62.5 %)에서 측정되었으며 P53 유전자의 A-to-G에 대해 64.7 % 기본 편집을 보존했다 (표 8 및 표 9).
In vivo KRAS target sequence PAM Indels
Control CTGAATTAGCTGTATCG -TCA AGG WT -
NL-Ab treated CTGAATTAGCTGTATC_ -TCA AGG -1 25.0 %
CTGAATTAGCTGTAT__ -TCA AGG -2 12.5 %
CTGAATTAGCTGTATCGA-TCA AGG +1 12.5 %
CTGAATTAGCTGTATCGT-TCA AGG +1 12.5 %
Total Indel efficacy 62.5 %
In vivo P53 target sequence PAM Base edited efficacy
Control GTGCATGTTTGTGCCTGTCC TGG -
NL-Ab treated GTGCGTGTTTGTGCCTGTCC TGG 64.7 %
다음으로 원하지 않는 유전자를 편집하는 효율 (off-target) 분석을 수행한 결과, 3bp 불일치를 포함하는 다른 오프 타겟 사이트에서 indel 편집 효과가 나타나지 않은 것을 확인하여 원하는 KRAS 또는 P53 부위 (on-target)에만 편집이 되었음을 의미한다.(표 10 및 표 11).
In vitro sample Chr Position Sequence Strand Mis-Matches Total Count Indel Count Indel Efficacy
NL-Ab treated 1 Chr1 74,955,086 CaGAATTAGCTGTATCtaCA + 3 14 0 0
2 Chr3 45,705,927 CTGAcTTAGCTaTATCtTCA + 3 19 0 0
3 Chr4 113,644,828 tTtAATTAGCTGTcTCGTCA + 3 11 0 0
4 Chr5 82,986,242 CaGAATTAGCTGTtTgGTCA + 3 13 0 0
5 Chr16 68,389,103 CTGAcTTAGCTcTATcTCA + 3 10 0 0
In vitro sample Chr Position Sequence Strand Mis-Matches Total Count Indel Count Indel Efficacy
NL-Ab treated 1 Chr1 3,045,635 GTGCATGTgTGTGCgTtTCC + 3 17 0 0
2 Chr6 44,246,698 cTGCATGTgTGTGCCTGTCt + 3 12 0 0
3 Chr9 116,287,425 GTGCATGTgTcTGCCTGcCC + 3 19 0 0
4 Chr10 64,380,311 GTGCATGTTTGTGtgTGTCC + 2 16 0 0
5 Chr19 44,273,497 GTGCATGTccaTGCCTGTCC + 3 11 0 0
한편, NL(Cas9/ABE)-Ab 및 젬시타빈이 함께 처리된 마우스 (Group 8)는 종양 섹션에서 돌연변이 KRAS 및 P53 단백질의 억제를 나타냈다 (도 13c). 또한, Group 8 마우스에서 야생형 P53의 복원, P21 단백질의 증가 및 phospho-ERK의 감소 과정이 확인되었다 (도 13d). 이는 본 발명의 NL 기반 입자 시스템이 생체 내에서 동시에 이중 유전자 편집을 성공적으로 유도할 수 있음을 입증한다.
또한 생체 내에서 젬시타빈 약물 내성을 극복하기 위한 KRAS 및 P53 유전자 편집 종양 조직에서 GLUT1, TKT, CTPS 및 ENT1과 같은 다양한 바이오 마커의 생체 내 발현을 측정한 바(도 13e), 시험관 내 결과와 유사하게 G8 마우스에서 HIF-1α, GLUT1, TKT 및 CTPS의 발현이 유의하게 억제되는 것으로 나타났으며, ENT1 발현이 현저하게 증가하였다. 이는 CTPS 발현이 낮아져, dCTP의 생체 내 수준이 감소하고 이후 종양에서 ENT1 수준이 향상되어 젬시타빈 대사 산물 수준 (dFdCTP)이 증가했음을 보여준다.
유전자 편집을 통해 젬시타빈 약물 내성을 극복한 종양 세포 사멸효과를 평가하기 위해, 마우스 조직을 TUNEL 분석 및 종양 증식(Ki67)을 사용하여 시각화하였다. TUNEL 분석을 위해서는 BrdU-Red DNA 단편화 분석 키트를 사용(Abcam)하였다.
그 결과, G8 마우스의 조직은 G1 마우스의 조직에 비해 세포 자멸사 향상과 세포 증식 억제를 나타냈다(도 13f). 이와 대비하여, 다양한 장기의 체중 및 조직 형태 변화는 치료 후 거의 변화가 없다 (도 14).
이상과 같은 결과를 통해, Cas9/ABE 단일 가이드 RNA가 포함된 나노 리포좀을 이용한 KRAS 및 P53 유전자의 편집 및 젬시타빈의 동시 처리를 통해, 췌장암 또는 KRAS와 P53 관련 이슈가 있는 다른 고형암에 대해 본 발명의 치료제가 매우 우수한 항암 효능이 있음을 입증할 수 있다.
실험예 7. 나노리포좀 조성 성분에 따른 안정도 비교 확인
기존에 나노리포좀 제조시 DSPE(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민) 또는 DPPE(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)를 사용하였다. 그러나 본 발명에서는 Cas9/gRNA와 ABE/gRNA의 동시 내포를 위해 나노리포좀의 안정화에 적절한 소재로서 DSPE-PEG(2000)-아민을 사용하였다.
이는 도 15에 개시된 바와 같이 나노 리포좀을 수용액상에 분산하고 UV-Vis 스펙트럼 흡광도를 이용하여 분산 상태를 확인하였을 때, DSPE를 나노리포좀 원료로 사용한 것은 시간에 따라 점차 가라앉는 것으로 확인되나 DSPE-PEG(2000)-아민이 원료로 사용된 나노 리포좀은 시간이 지나도 침전되지 않고 수용액 상에서 안정적으로 유지되었기 때문이다.
이 결과를 통해, 나노리포좀의 형상이 시간이 지나도 온전히 유지되기에 좋은 조건으로 DSPE-PEG(2000)-아민을 사용하는 것이 바람직함을 확인할 수 있다.

Claims (7)

  1. Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체; 및, ABE 단백질과 P53 유전자를 타겟으로 하는 가이드 RNA의 혼성체;가 동봉된 나노 리포좀 전달체 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노 리포좀은 레시틴, 콜레스테롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸글리콜(2000)아민 및 메탈 킬레이팅 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀 전달체 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 나노 리포좀에는 대장암 세포에서 발현하는 EGFR(Epidermal growth factor receptor), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CEA(Carcinoembryonic antigen) 및 아넥신스(Annexins)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질을 인식할 수 있는 단클론성 또는 다클론성 항체가 결합된 것을 특징으로 하는 나노 리포좀 전달체 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노 리포좀은 10 ~ 2,000 nm의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀 전달체 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 나노 리포좀 전달체 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 췌장암의 개선 또는 치료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 나노 리포좀 전달체 조성물에 젬시타빈이 첨가된 것을 특징으로 하는 췌장암의 개선 또는 치료용 조성물.
  7. Cas9 단백질과 KRAS 유전자를 타겟으로 하는 단일 가이드 RNA의 제1혼성체, 및, ABE 단백질과 P53 유전자를 타겟으로 하는 단일 가이드 RNA의 제2혼성체를 각각 제조하고,
    레시틴, 메탈 킬레이팅 지질, 콜레스테롤 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸글리콜(2000)아민을 클로로포름 상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제1단계;
    상기 지질 필름 조성물에, 제1혼성체와 제2혼성체를 혼합하고 넣어 초음파 처리하는 제2단계;
    상기 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제3단계;
    상기 제3단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 원심분리하고 침전물 상태의 나노 리포좀을 회수하는 제4단계; 및,
    상기 제4단계에서 얻은 침전물 상태의 나노 리포좀에 가교제를 통해 항체를 결합하는 제5단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장암 세포를 선택적으로 인식할 수 있는 나노 리포좀 전달체 조성물의 제조방법.
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