WO2022154692A1 - Consortium of bifidobacteria and strains comprising said consortium - Google Patents

Consortium of bifidobacteria and strains comprising said consortium Download PDF

Info

Publication number
WO2022154692A1
WO2022154692A1 PCT/RU2021/000582 RU2021000582W WO2022154692A1 WO 2022154692 A1 WO2022154692 A1 WO 2022154692A1 RU 2021000582 W RU2021000582 W RU 2021000582W WO 2022154692 A1 WO2022154692 A1 WO 2022154692A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strain
consortium
bifidobacteria
bifidobacterium
strains
Prior art date
Application number
PCT/RU2021/000582
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Владимир Владимирович БЕСПАЛОВ
Ирина Валерьевна КАЗАКОВА
Людмила Владимировна МЕРКУЛОВА
Алексей Александрович РОГОВ
Вера Васильевна ЧЕШЕВА
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение Бифилайф"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение Бифилайф" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение Бифилайф"
Publication of WO2022154692A1 publication Critical patent/WO2022154692A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the group of inventions connected by a single inventive concept relates to biotechnology, food industry, pharmacology, cosmetology and can be used to obtain bifid-containing products.
  • Bifidobacteria are the most important symbionts of the human gastrointestinal tract. In children by the age of 3 months, their share in the microbiome is more than 90%, which indicates the leading role of this group of bacteria in the formation and development of human homeostasis systems from an early age. They have a morphokinetic effect, form enzymes involved in the metabolism of proteins, carbohydrates, lipids and nucleic acids, produce biologically active compounds, in particular vitamins PP, B1, B6, B9, B 12.
  • Bifidobacteria perform immunogenic and antimutagenic functions, and also participate in detoxification of exogenous and endogenous toxic agents, which is becoming especially relevant in modern conditions of massive anthropogenic impact on the biosphere, in which not only nature suffers, but also man himself.
  • a multifaceted positive effect on the human body allows us to consider bifidobacteria as an effective basis for designing bifid-containing products for various purposes based on promising strains of bifidobacteria.
  • the biocenosis is dominated by the species Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium infantis (Bifidobacterium longum spp. infantis) and Bifidobacterium breve. It is these five species of bifidobacteria that are dominant and, in various combinations, create conditions formation of the composition and normal state of the microbiota of a healthy person. (Kozlova E.P., Kurnosova N.A., Feklisova L.V.
  • the bifidoflora has a certain structure, according to which only a consortium of bifidobacteria has a dominant influence on the formation of the microbiota characteristic of a healthy intestine (proven in 88% of the cases studied), while the presence of one or two strains always leads to dysbiosis ( proven in 42% of cases of type 1-2 dysbiosis and in 86% of type 3 dysbiosis).
  • Ivanova E.V The role of bifidoflora in the associative symbiosis of the human intestinal microbiota. Abstract of the thesis ... Doctor of Medical Sciences. Chelyabinsk 2009, p 13).
  • Bifidobacterium longum spp.infantis strains 73-15 and 79-43 Bifidobacterium bifidum strains 1 and 791, 791 BAG, LVA-3, RO71, 8-3; Bifidobacterium breve strain 79-88, 79-119, RO70; Bifidobacterium animalis spp.animalis strain DN-173010 (Danone/Dannon); Bifidobacterium animalis spp. lactis Bbl 2 (Chr. Hansen), HN019 (DR10) (Danisco); Bifidobacterium adolescentis strain G7513, GO-13, MC-42.
  • Bifidobacterium animalis subsp. lactis in various variations of the name, isolated from the rumen of an animal, has the smallest genome size. This is due to the fact that it lives in an environment with a constant and simple composition of the nutrient substrate, in conditions that do not require constant adaptation of the microbial cell. This is confirmed by the presence of only two complete copies of rRNA operons, while other species have up to four to five rRNA operons. Reduced adaptive properties of strains of B. animalis subsp. lactis do not lead to the formation of sustainable eubiosis (Bukharin O.V., Perumova N.B., Ivanova E.V. Bioflora in human associative symbiosis. - Ekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2014. - p. eleven)
  • the closest analogue (prototype) of the claimed consortium in terms of species composition is a consortium of five types of breeding strains of bifidobacteria: Bifidobacterium bifidum 791-MB, Bifidobacterium longum B 379M-MB, Bifidobacterium adolescentis G 7513-MB, Bifidobacterium infantis 73-15-MB, Bifidobacterium breve 79 -119- MB used for the preparation of sour-milk, non-fermented products, dietary supplements, bifid-containing preparations, cosmetic and hygiene products (RU 2261909 C1, publ. 10.10.2005).
  • the strains that make up the consortium have similar cultural and biological properties; when co-cultivated, the consortium actively reproduces on nutrient media with the accumulation of production biomass in a short cultivation period, and has specific activity.
  • the finished product contains 10 9 living cells of bifidobacteria in 1 ml.
  • the disadvantage of this consortium is the difficulty of obtaining selection strains, which involves 50 cycles of sequential lyophilized drying and recovery on a thioglycol medium and defatted milk, while the maximum titer of bifidobacteria is only 10 9 living cells of bacteria in 1 ml of the finished product.
  • the technical problem solved as a result of the creation of the present invention is the development of a consortium that includes selection strains selected in composition not only taking into account biocompatibility, but also giving the consortium resistance to a wide range of antibiotics, damaging factors that ensure the process of digestion in the gastrointestinal tract, expressed antagonistic activity with the presence of a high titer of bifidobacteria 10 p CFU per 1 g of dry biomass and the production of bifidus-containing products with high therapeutic and prophylactic properties on its basis, as well as simplification of obtaining a consortium.
  • the technical result lies in the fact that the proposed consortium of bifidobacteria used for the preparation of bifid-containing products, and the strains included in its composition, are able to actively accumulate microbial biomass on various nutrient media to a high concentration, have high antagonistic activity in relation to the main test cultures, which is the cause of food poisoning, and, in addition, they have high superoxide dismutase activity with pronounced antioxidant activity, while superoxide dismutase activity is not lower than 37 U/mg of microbial mass protein.
  • strains included in the consortium can be easily identified based on the proposed nucleotide sequences of their DNA fragments.
  • the Bifidobacterium longum B379M-BL strain used to obtain the consortium was deposited in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIGenetika" under registration No. Ac-2037, and the nucleotide sequence of the genome fragment of this strain SEQ ID NO: 2.
  • the known production strains of five species of bifidobacteria are initially selected without the use of genetic modification methods as a result of 30 cycles of sequential lyophilized drying and recovery on the Bifilife M medium, and then a consortium is obtained by co-cultivation of strains.
  • the method used for selecting breeding strains took into account the study of their antibiotic resistance, cultural, antagonistic, morphological, physiological and biochemical properties, molecular genetic identification and biocompatibility in the co-cultivation of strains, taking into account the growth kinetics of each of them. This made it possible to create a consortium capable of correcting microecological disturbances more efficiently and safely.
  • figure 1 shows a phylogenetic tree for a strain of Bifidobacterium bifidum 791-BL
  • figure 2 shows a phylogenetic tree for a strain of Bifidobacterium longum In 379M-BL
  • fig.3 shows the phylogenetic tree for the Bifidobacterium adolescentis G 7513-BL strain
  • figure 4 shows the phylogenetic tree for the strain Bifidobacterium infantis 73-15-BL
  • figure 5 shows the phylogenetic tree for the strain Bifidobacterium breve 79-119-BL
  • figure 6 presents a graph of the content of bifidobacteria from the time of cultivation.
  • VZ (calcium pantothenate) - 0.001 g
  • the primary inoculum of the production strain Bifidobacterium bifidum 791-MB in a volume of 5% of the volume of the cultivation medium was introduced into the above medium and cultivated at a temperature of 37-38°C for 24 hours. Then 30 cycles of drying-recovery were carried out on the nutrient medium "Bifilife M".
  • strain Bifidobacterium bifidum 791-BL are rod-shaped variable cells with V-shaped bifurcations at one or two ends, immobile, form clusters in the smear, sometimes chains, gram-positive. Facultative anaerobe, the optimum cultivation temperature is 37-38°C, pH 7.0 ⁇ 0.2.
  • Ferment milk with the formation of a stable clot by 16-18 hours. Gas-forming ability, catalase-forming ability, gelatin liquefaction are absent. Acid-forming activity: by 24 h - 70 ° T, by 72 h - 90-100 ° T (on Blaurock's hepatic medium), on hydrolysate-milk medium - up to 100 ° T and 180 ° T, respectively.
  • the maximum titer of bifidobacteria in a hydrolysate-milk medium after 24 hours of cultivation is 1x10 10 CFU/ml; the maximum titer of bifidobacteria in sterile skimmed milk without growth factors after 24 hours of cultivation is 1-3x10 10 cfu/ml.
  • the strain grows on nutrient media used in production with biomass accumulation of at least 1g 9.8-10.2 microbial number for 16-18 hours of cultivation.
  • the claimed strain has a pronounced antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Shigella flexneri, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis.
  • Table 1 shows the antagonistic activity of the strain against some of the aforementioned microorganisms.
  • the antagonistic activity of a monostrain of bifidobacteria was determined by the zone of growth inhibition of test cultures of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms by the method of perpendicular strokes.
  • a production-useful feature of the B. bifidum 791-BL strain which distinguishes it from the B. bifidum 791-MB strain, is that the culture grown under stationary conditions on the Bifilife M medium in a volume of 300 cm 3 has an increased superoxide dismutase activity. .
  • the SOD activity of the B. bifidum 791-BL strain is 27.7 U/mg of the protein contained in the bacterial mass.
  • the revealed SOD activity of the culture of bifidobacteria indicates that the strain has a pronounced probiotic effect, which can manifest itself both in vivo and in vitro.
  • the high activity of acid formation, the resistance of the strain to major antibiotics contributes to the effective restoration of normal intestinal microflora against the background of antibiotic therapy.
  • Freshly prepared strain B. bifidum 791-BL is stored on a nutrient medium with the addition of a protective medium containing sucrose, gelatin, sodium citrate, and freeze-dried in ampoules. The strain is well stored at a temperature of 6-8 °C without loss of activity during the year.
  • the studied strain of Bifidobacterium bifidum 791-BL belongs to the following systematic group: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium, and the homology with the species Bifidobacterium bifidum is 97%. Analysis in the RDP II 16S rRNA database showed homology with the same bacterial species Bifidobacterium bifidum.
  • the tested Bifidobacterium bifidum 791-BL strain can be attributed to the Bifidobacterium bifidum species (97%).
  • Pavlicek A et al "Free-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap ⁇ ackknife analysis of tree robustness".
  • the strain is not genetically modified and does not contain genes from other organisms; transferred resistance genes; genetic changes associated with the use of genetic engineering techniques; the strain is not zoopathogenic and phytopathogenic.
  • strain Bifidobacterium longum B 379M-BL the selection of the strain Bifidobacterium longum B 379M-MB was carried out, which was deposited on July 15, 2004 in the VKPM Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under No. Ac-1689.
  • the original strain is protected by RF patent No. genetic modification through multiple cycles of lyophilized drying and recovery on the previously mentioned nutrient medium "Bifilife M".
  • the primary inoculum of the production strain Bifidobacterium longum B 379M-MB in a volume of 5% of the volume of the cultivation medium was introduced into the above medium and cultivated at a temperature of 37-38°C for 24 hours. Then 30 cycles of drying-recovery were carried out on the nutrient medium "Bifilife M".
  • Facultative anaerobe optimum temperature 37 - 38°C, pH 7.0 ⁇ 0.2.
  • Acid-forming activity when cultivated on sterile skimmed milk, titratable acidity reaches 100° T by 18 hours, 120° T by 20 hours, and 145° T by 24 hours.
  • the maximum titer of bifidobacteria in the milk clot reaches 18 hours of cultivation and is 10 9 CFU/ml.
  • the strain grows on nutrient media used in production with biomass accumulation of at least 1g 9-10 microbial number for 16-18 hours of cultivation.
  • the strain has a pronounced antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Candida albicans, Proteus vulgaris., Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis.
  • Table 4 shows the antagonistic activity against some of the aforementioned microorganisms.
  • the antagonistic activity of a monostrain of bifidobacteria was determined by the zone of growth inhibition of test cultures of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms by the method of perpendicular strokes.
  • Determination of the level of resistance of the strain to antibiotics was carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium - sterile skimmed milk. Various concentrations of sterile solutions of antibiotics and a 16-hour culture of bifidobacteria in an amount of 5% were introduced into the nutrient medium. Stability was determined by the change in titratable acidity in the samples after 48 h of incubation at a temperature of 37-38°C.
  • a production-useful feature of the B. longum B379M-BL strain which distinguishes it from the B. longum B379M-MB strain, is that the culture grown under stationary conditions on a nutrient medium "Bifilife M" in a volume of 300 cm 3 has a pronounced superoxide dismutase activity.
  • SOD - the activity of the strain B. longum B379M-BL is 32.0 units/mg of the protein contained in the bacterial mass.
  • the revealed SOD activity of the culture of bifidobacteria indicates that the strain has a pronounced probiotic effect, which can manifest itself both in vivo and in vitro.
  • the high activity of acid formation, the resistance of the strain to major antibiotics contributes to the effective restoration of normal intestinal microflora against the background of antibiotic therapy.
  • the strain is well stored at a temperature of 6-8°C without loss of activity during the year.
  • the studied strain of Bifidobacterium longum V379M-BL belongs to the following systematic group: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium.
  • Analysis of the no RDP II 16S pRNA database showed the best homology with the bacterial species Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium subtile, Bifidobacterium pseudoIongum, Bifidobacterium pullorum.
  • a phylogenetic tree with homologous strains was constructed (Fig. 2).
  • the strain Bifidobacterium longum V379M-BL can be attributed to the species Bifidobacterium longum (99%).
  • Pavlicek A et al "Free-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap ⁇ ackknife analysis of tree robustness.”
  • the strain is not genetically modified and does not contain genes from other organisms; transferred resistance genes; genetic changes associated with the use of genetic engineering techniques; the strain is not zoopathogenic and phytopathogenic.
  • strain Bifidobacterium adolescentis G 7513-BL the selection of the strain Bifidobacterium adolescentis G 7513-MB was carried out, which was deposited on July 15, 2004 in the VKPM FSUE GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under No. Ac-1690.
  • the original strain of Bifidobacterium adolescentis G 7513-MB is protected by RF patent No.
  • the selection was carried out without the use of genetic modification methods by means of multiple cycles of lyophilized drying and recovery on the previously mentioned nutrient medium "Bifilife M".
  • the primary inoculum of the production strain Bifidobacterium adolescentis G 7513-MB in a volume of 5% of the volume of the cultivation medium was introduced into the above medium and cultivated at a temperature of 37-38°C for 24 hours. Then 30 cycles of drying-recovery were carried out on the nutrient medium "Bifilife M".
  • Ferment sterile milk with the formation of a stable dense clot by 22-24 hours. Gas-forming ability, catalase-forming ability, gelatin liquefaction are absent.
  • Acid-forming activity when cultivated in sterile skimmed milk, titratable acidity reaches 70 ° T by 24 hours, and accumulates the microbial mass of bifidobacteria in 1 ml of 1g 9.0-9.4 microbial cells.
  • Acid-forming activity by 24 hours - 70 ° T, by 72 hours - 90-100 ° T (on a liver medium), on a hydrolyzate-milk medium - up to 100 ° T and 180 ° T, respectively.
  • the maximum titer of bifidobacteria in a hydrolysate-milk medium after 24 hours of cultivation is 1x10 10 CFU/ml.
  • the strain grows on nutrient media used in production with biomass accumulation of at least 1g 9.8-10.0 microbial number for 18-20 hours of cultivation.
  • the strain has a pronounced antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis.
  • Table 7 shows the antagonistic activity against some of the aforementioned microorganisms.
  • the antagonistic activity of a monostrain of bifidobacteria was determined by the zone of growth retardation of test cultures of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms by the method of perpendicular strokes.
  • Determination of the level of resistance of the strain to antibiotics was carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium - sterile skimmed milk. Various concentrations of sterile solutions of antibiotics and a 16-hour culture of bifidobacteria in an amount of 5% were introduced into the nutrient medium. Stability was determined by the change in titratable acidity in the samples after 48 hours of incubation at a temperature of 37-38°C.
  • a production-useful feature of the strain B. adolescentis G 7513 - BL which distinguishes it from the strain B. adolescentis G 7513-MB, is that the culture grown under stationary conditions on a nutrient medium "Bifilife M" in a volume of 300 cm 3 has pronounced superoxide dismutase activity.
  • SOD - the activity of the strain B. adolescentis G 7513-BL is 25.0 units/mg of the protein contained in the bacterial mass.
  • the revealed SOD activity of the culture of bifidobacteria indicates that the strain has a pronounced probiotic effect, which can manifest itself both in vivo and in vitro.
  • the high activity of acid formation, the resistance of the strain to major antibiotics contributes to the effective restoration of normal intestinal microflora against the background of antibiotic therapy.
  • Freshly prepared strain B. adolescentis G 7513 - BL is stored on a nutrient medium with the addition of a protective medium containing sucrose, gelatose, sodium citrate, dried by sublimation in ampoules. The strain is well kept at a temperature of 6-8 °C without loss of activity during the year.
  • the studied strain of Bifidobacterium adolescentis G7513-BL belongs to the following systematic group: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium, and the homology with the species Bifidobacterium adolescentis is 97%.
  • the tested Bifidobacterium adolescentis G7513-BL strain can be attributed to the Bifidobacterium adolescentis species (97%).
  • Pavlicek A et al "Free-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap ⁇ ackknife analysis of tree robustness.”
  • the strain is not genetically modified and does not contain genes from other organisms; transferred resistance genes; genetic changes associated with the use of genetic engineering techniques; the strain is not zoopathogenic and phytopathogenic.
  • strain Bifidobacterium infantis 73-15-BL selection was carried out strain Bifidobacterium infantis 73-15-MB, which was deposited on July 15, 2004 in VKPM Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under No. Ac-1692.
  • the original strain Bifidobacterium infantis 73-15-MB is protected by RF patent No. 2261906. lyophilized drying and recovery on the previously mentioned nutrient medium "Bifilife M".
  • the primary inoculum of the production strain Bifidobacterium infantis 73-15-MB in a volume of 5% of the volume of the cultivation medium was introduced into the above medium and cultivated at a temperature of 37-38 °C for 24 hours. Then 30 cycles of drying-recovery were carried out on the nutrient medium "Bifilife M".
  • Acid-forming activity when cultivated on sterile skimmed milk, titratable acidity reaches 24 h - 80 ° T and the strain accumulates a microbial mass of bifidobacteria in 1 ml of 1 g of 10.2-10.6 microbial cells.
  • the strain grows on nutrient media used in production with biomass accumulation of at least 1g 9-10 microbial number for 18-22 hours of cultivation.
  • the strain has a pronounced antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis.
  • Table 10 shows the antagonistic activity against some of the aforementioned microorganisms.
  • the antagonistic activity of a monostrain of bifidobacteria was determined by the zone of growth inhibition of test cultures of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms. by the method of perpendicular strokes.
  • Determination of the level of resistance of the strain to antibiotics was carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium - sterile skimmed milk. Various concentrations of sterile solutions of antibiotics and a 16-hour culture of bifidobacteria in an amount of 5% were introduced into the nutrient medium. Stability was determined by the change in titratable acidity in the samples after 48 h of incubation at a temperature of 37-38°C.
  • a production-useful feature of the B. infantis 73-15-BL strain which distinguishes it from the B. infantis 73-15-MB strain, is that it is grown under stationary conditions on a nutrient medium "Bifilife M" in a volume of 300 cm 3 culture has a pronounced superoxide dismutase activity.
  • SOD - the activity of the strain B. infantis 73-15-BL is 29 units/mg of protein contained in the bacterial mass.
  • the revealed SOD activity of the culture of bifidobacteria indicates that the strain has a pronounced probiotic effect, which can manifest itself both in vivo and in vitro.
  • the high activity of acid formation, the resistance of the strain to major antibiotics contributes to the effective restoration of normal intestinal microflora against the background of antibiotic therapy.
  • a freshly prepared strain of B. infantis 73-15-BL is stored on a nutrient medium with the addition of a protective medium containing sucrose, gelatin, sodium citrate, and freeze-dried in ampoules.
  • the strain is well stored at temperature of 6-8 °C without loss of activity during the year.
  • the studied strain of Bifidobacterium infantis 73-15-BL belongs to the following systematic group: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Analysis of the no RDP II 16S rRNA database showed the best homology with the bacterial species Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium pseudoIongum.
  • the studied strain of Bifidobacterium infantis 73-15-BL belongs to the species Bifidobacterium infantis.
  • the species Bifidobacterium infantis is currently referred to as Bifidobacterium longum subsp. infantis.
  • the tested strain Bifidobacterium infantis 73-15-BL can be assigned to the species Bifidobacterium longum subsp. infantis (97%).
  • Pavlicek A et al "Free-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap ⁇ ackknife analysis of tree robustness.”
  • the strain is not genetically modified and does not contain genes from other organisms; transferred genes resistance; genetic changes associated with the use of genetic engineering techniques; the strain is not zoopathogenic and phytopathogenic.
  • strain Bifidobacterium breve 79-119-BL the selection of the strain Bifidobacterium breve 79-119-MB was carried out, which was deposited on July 15, 2004 in the VKPM Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under registration No. Ac-1691. patent of the Russian Federation No. 2261905. Selection was carried out without the use of genetic modification methods by means of multiple cycles of lyophilized drying and recovery on the previously mentioned nutrient medium "Bifilife M".
  • the primary inoculum of the production strain Bifidobacterium breve 79-119-MB in a volume of 5% of the volume of the cultivation medium was introduced into the above medium and cultivated at 37-38°C for 24 hours. Then 30 drying-recovery cycles were carried out on the nutrient medium "Bifilife M".
  • Ferment milk with the formation of a dense clot by 16-18 hours. Gas-forming ability, catalase-forming ability, gelatin liquefaction are absent.
  • Acid-forming activity when cultivated on sterile skimmed milk, titratable acidity reaches 120° T by 18 hours, 140° T by 24 hours. .
  • the strain grows on nutrient media used in production with biomass accumulation of at least 1g 10.2 microbial number for 16-18 hours of cultivation.
  • the strain has a pronounced antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis.
  • Table 13 shows the antagonistic activity against some of the aforementioned microorganisms.
  • the antagonistic activity of a monostrain of bifidobacteria was determined by the zone of growth retardation of test cultures of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms by the method of perpendicular strokes.
  • Determination of the level of resistance of the strain to antibiotics was carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium - sterile skimmed milk. Various concentrations of sterile solutions of antibiotics and a 16-hour culture of bifidobacteria in an amount of 5% were introduced into the nutrient medium. Stability was determined by the change in titratable acidity in the samples after 48 hours of incubation at a temperature of 37-38°C.
  • a production-useful feature of the B. breve 79-119-BL strain which distinguishes it from the B. breve 79-119-MB strain, is that it is grown under stationary conditions on a nutrient medium "Bifilife M" in a volume of 300 cm 3 culture has a pronounced superoxide dismutase activity.
  • the detected SOD activity of the B. breve 79-119-BL strain indicates that the strain has a pronounced probiotic effect, which can manifest itself both in vivo and in vitro.
  • the high activity of acid formation, the resistance of the strain to major antibiotics contributes to the effective restoration of normal intestinal microflora against the background of antibiotic therapy.
  • the claimed strain has a pronounced antioxidant activity: superoxide dismutase the activity of the strain is 27.0 units/mg of microbial mass protein.
  • Freshly prepared strain B. breve 79-119-BL is stored on a nutrient medium with the addition of a protective medium containing sucrose, gelatin, sodium citrate, and freeze-dried in ampoules.
  • the strain is well stored at a temperature of 6-8 °C without loss of activity during the year.
  • the studied strain Bifidobacterium breve 79-119-BL belongs to the following systematic group: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Analysis of the no RDP II 16S pRNA database showed homology with the same bacterial species Bifidobacterium breve.
  • the tested strain Bifidobacterium breve 79-119-BL can be attributed to the species Bifidobacterium breve (97%).
  • Pavlicek A et al "Free-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap ⁇ ackknife analysis of tree robustness.”
  • Information about the safety of using the strain the strain is not genetically modified and does not contain genes from other organisms; transferred resistance genes; genetic changes associated with the use of genetic engineering techniques; the strain is not zoopathogenic and phytopathogenic.
  • 3rd passage - Sowing of inoculums of monocultures into the fermenter is carried out in stages in the amount of 3-5% of each strain of the volume of the nutrient medium.
  • the process of co-cultivation lasts 10-12 hours, the pH of the finished biomass is 4, 6-5, 2.
  • Protective media (sucrose-gelatin, skim milk) are added to the resulting biomass, the suspension is frozen at a temperature not higher than minus 45 ° C, lyophilized, a dry concentrate is obtained with the content of bifidobacteria not less than 10 11 CFU/g.
  • the consortium is well stored at a temperature of 6-8 °C without loss of activity within one year.
  • the created consortium of bifidobacteria showed a high compatibility of five strains of bifidobacteria with each other. Co-cultivation of a mixed population of all five strains proceeds much faster compared to separate cultivation of strains.
  • Acid-forming activity by 24 hours - - 150 ° T, by 72 hours - 180 ° T (on the nutrient medium "Bifilife M"), on the hydrolyzate-milk medium - up to 140-160 0 T and 170-190 ° T, respectively.
  • the consortium actively reproduces on media of different composition.
  • the consortium In vitro on standard nutrient media, at a temperature of T 37° C, the consortium accumulates biomass to a high concentration of probiotic microorganisms - 10 11 CFU per 1 g of biomass due to the absence of mutual inhibition of individual strains. (Fig 6)
  • the maximum titer of bifidobacteria of the consortium in sterile skimmed milk without growth factors by 22 hours is 2x10 10 CFU / ml, on corn-lactose medium by 20 hours it is 2x10 10 CFU / ml, on the nutrient medium "Bifilife M" after lyophilization, a dry concentrate is obtained containing bifidobacteria not less than 10 11 CFU/g.
  • Bifidobacteria of the consortium are able to utilize free amino acids in sterile skimmed milk, such as: valine, methionine, alanine, arginine, isoleucine, glycine.
  • the consortium exhibits antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Escherichia coli, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Shigella fexneri, Candida albicans, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis.
  • Table 17 shows antagonistic activity against some of the aforementioned microorganisms.
  • the antagonistic activity of a consortium of bifidobacteria strains was determined by the method of developing mixed populations in co-cultivation with pathogenic microorganisms in the growth retardation zone of test cultures by the method of perpendicular strokes.
  • the synergistic effect of the consortium is also manifested in the greater antagonistic activity of the consortium compared to the prototype.
  • Determination of levels of resistance of strains of bifidobacteria to antibiotics was carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium for each strain separately. Sterile skimmed milk was used as a nutrient medium.
  • Table 18 shows the resistance to antibiotics of individual strains of the proposed consortium.
  • V379M-BL longum V379M-BL - to amikacin, ampicillin, benzylpenicillin, gentamicin, kanamycin, lincomycin, oleandomycin, ofloxacin, streptomycin, tetracycline, sulfadimidine, benzathine benzylpenicillin.
  • the consortium can be cultured on various nutrient media with consistently high CFU/ml of probiotic microorganisms and produced organic acids.
  • the culture results are shown in Table 20.
  • the resulting consortium and the strains included in the consortium can be used as a biologically active principle of probiotic orientation in the production of food products, functional foods, dietary (therapeutic and preventive) foods, biologically active additives (BAA), cosmetics, hygiene products, medical products. and veterinary drugs.
  • BAA biologically active additives
  • the use of the claimed consortium and the strains that make up the consortium in the production of fermented, non-fermented food products, dietary supplements, bifid-containing preparations, cosmetic and hygiene products - creams, wipes, tampon lotions, nourishing masks, feminine pads, soap, cosmetic milk provides a probiotic and bacteriological effect , contributes to the restoration of the normal microflora of the skin and mucous membranes, and is also aimed at expanding the arsenal of similar tools.
  • Example 1 The use of the proposed consortium of strains of bifidobacteria in the composition of the starter for the preparation of fermented milk products.
  • 3rd passage - inoculation of inoculums of monocultures into the fermenter is carried out in stages in the amount of 3-5% of each strain of the volume of the nutrient medium.
  • the process of co-cultivation lasts 10-12 hours.
  • the pH of the finished biomass is 4.6-5.2.
  • the biomass of the consortium of bifidobacteria, obtained as shown above, in a volume of not more than 5% (of the volume of milk) is introduced into sterile milk and cultivated until a clot is formed, which is poured into containers and cooled.
  • Example 2 The use of a consortium of strains of bifidobacteria in the composition of dietary supplements.
  • a dry biologically active additive for this, protective media (sucrose-gelatin, skim milk) are added to the biomass obtained according to Example 1, the suspension is frozen at a temperature not exceeding minus 45 ° C, lyophilized, sealed and a dry concentrate is obtained with a content of bifidobacteria of at least 10 11 CFU/g, which can be used as a biologically active additive by adding it to food raw materials immediately before use.
  • protective media sucrose-gelatin, skim milk
  • Example 3 Use of a consortium of strains of bifidobacteria to obtain a bifid-containing medical preparation.
  • Example 1 In the biomass of the consortium of bifidobacteria obtained according to Example 1, which is a liquid concentrate with a high titer of bifidobacteria, protective media (sucrose gelatin, skim milk) are added. The resulting suspension is frozen at a temperature not exceeding minus 45°C, lyophilized, sealed and a dry concentrate is obtained with a bifidobacteria content of at least 10 11 CFU/g, which can be used as a bifid-containing medical product.
  • protective media sucrose gelatin, skim milk
  • Example 4 Use of a consortium of strains of bifidobacteria to produce kvass or juice.
  • the biomass of the consortium of bifidobacteria obtained according to Example 1, in in a volume of not more than 5% of the volume of the normalized mixture (kvass or juice) is added to bread kvass or juice after pasteurization so that the content of bifidobacteria in 1 ml of kvass or juice is at least 10 7 CFU / ml. Kvass or juice is cooled and consumed without subsequent fermentation.
  • Example 5 Use of a consortium of strains of bifidobacteria to obtain a cosmetic product.
  • the biomass of the consortium of bifidobacteria obtained according to Example 1 is destroyed by heating in an autoclave or membrane filtration is carried out.
  • the resulting biologically active components are cooled and mixed with a cream base in a ratio of 1:2-1:20, depending on the purpose of the cream being produced.
  • Example 6 Use of a consortium of strains of bifidobacteria for the production of cooked smoked sausages.
  • the biomass of the consortium of bifidobacteria obtained according to Example 1, in a volume of not more than 5% of the minced meat volume, is added to the prepared sausage minced meat after adding salt, spices and sodium nitrite solution. After shaping, sausage sticks are sent to the draft, which is carried out on frames at a temperature of 22 ° C, humidity 90%. Rainfall duration 6 hours. Cooking and smoking are carried out according to standard technology.
  • Example 7 Use of a consortium of strains of bifidobacteria for the production of raw smoked sausages.
  • the consortium of bifidobacteria in dry form obtained according to Example 2, is preliminarily restored in boiled chilled water at a temperature of 37 ° C, or activated in sterile cow's skimmed milk at a temperature of 37 ° C for 8-10 hours to an acidity of 60-65 ° T.
  • the biomass of the consortium of bifidobacteria is introduced into the prepared sausage mince, while the dosage of the introduced reduced consortium is 0.1-0.2% of the mince mass, and the dosage of the activated consortium is 2-5% of the mince mass.
  • enriched sausage raw materials are processed according to the traditional scheme according to the technology for producing raw smoked sausages.
  • Example 8 Use of a consortium of bifidobacteria strains for the production of fortified dry infant formula.
  • a small amount of dry milk mixture is thoroughly mixed with a dry concentrate of a consortium of bifidobacteria obtained according to Example 2 with a bifidobacteria content of at least 10 11 CFU / g based on at least 100 g of concentrate per 1 ton of dry milk formula. Then, the entire remaining batch of the milk mixture is thoroughly mixed with enriched dry milk mixture to achieve a content of bifidobacteria of at least 10 7 CFU / g.
  • Example 9 Use of a consortium of bifidobacteria strains to produce fortified beer.
  • Example 10 Use of a consortium of bifidobacteria strains for the production of ice cream.
  • ice cream is added to milk, the resulting mixture is heated to a temperature of 35 ° C, dry ingredients are added: granulated sugar, a stabilizer, heated to a temperature of 85 ° C, homogenized, cooled to a temperature of 6 ° C, a dry bacterial concentrate of a consortium of bifidobacteria is added, obtained according to Example 2 with a content of bifidobacteria of at least 10 11 CFU / g in the amount of 1-5% by weight of the mixture.
  • Example 11 The use of a consortium of strains of bifidobacteria for the production of feed additives in animal husbandry and poultry farming.
  • Example 12 Use of a consortium of bifidobacteria strains for the production of toothpaste.
  • Example 13 Use of a consortium of bifidobacteria strains for the production of soft rennet cheese.
  • Normalized milk is subjected to heat treatment at a temperature of 74-76 ° C for 1-5 minutes and cooled to a fermentation temperature of 37-38 ° C, a 40% aqueous solution of calcium chloride is added at the rate of 50 ml per 100 kg of milk, 1% dry bacterial concentrate of a consortium of bifidobacteria obtained according to Example 2, with a bifidobacteria content of at least 10 11 CFU/g. The mixture is stirred and a solution of a milk-clotting enzyme is added at the rate of 1.0-1.2 g per 100 kg of milk, then coagulation is carried out. The subsequent production of soft cheese is carried out according to standard technology.
  • Example 14 Use of a consortium of bifidobacteria strains for the production of brine mature cheese.
  • Coagulation of milk is carried out at a temperature of 32-34 ° C for 30-45 minutes, a combined starter is added in the amount of 1.0-2.0%, consisting of salt-tolerant pure cultures of mesophilic lactic streptococci; a consortium of bifidobacteria obtained according to Example 1; mesophilic lactic acid bacilli. Starter cultures of bifidobacteria, streptococci and mesophilic lactobacilli are prepared separately. Streptococci, bifidobacteria and mesophilic lactic acid bacilli are added to the production starter. Then calcium chloride and rennet are added to the resulting mixture to obtain a clot. The subsequent production of brine mature cheese is carried out according to standard technology.
  • consortium based on five breeding strains of bifidobacteria was obtained, which is more resistant to damaging factors of the aggressive environment of the gastrointestinal tract during the passage of bifidobacteria in the gastrointestinal tract, which is expressed in increased colonizing activity.
  • the consortium has a pronounced antioxidant activity and probiotic action in the absence of mutual inhibition of individual strains.
  • the proposed consortium is high-tech, accumulates biomass on nutrient media in a short period of cultivation with a high concentration of probiotic microorganisms - 10 11 CFU / g
  • the method used for selecting breeding strains which involves the study of their antibiotic resistance, cultural, antagonistic, morphological, physiological and biochemical properties and molecular genetic identification, made it possible to create a consortium capable of correcting microecological disorders more effectively and safely and expanding the arsenal of probiotic agents.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The group of inventions, linked by a single general inventive concept, relates to biotechnology, the food industry, pharmacology and cosmetology, and can be used to produce products containing bifidobacteria. To produce a consortium, selection strains of bifidobacteria are used: Bifidobacterium bifidum 791-BL, Bifidobacterium longum V 379М-BL, Bifidobacterium adolescentis G 7513-BL, Bifidobacterium infantis 73-15-BL, Bifidobacterium breve 79-119-BL, the characteristic feature of which is the ability to actively accumulate microbial biomass on different nutrient media to a high concentration, and high antibiotic resistance with pronounced antioxidant activity. The superoxide dismutase activity of the consortium is not less than 37 U/mg of microbial mass protein. The specific activity exhibited by the consortium and the strains included in the consortium are an ability to utilize a broad spectrum of amino acids, antibiotic resistance, resistance to damaging factors of the aggressive media of the gastrointestinal tract, and high colonizing capability, which have made it possible to increase its effectiveness for prophylactic and therapeutic purposes.

Description

КОНСОРЦИУМ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ШТАММЫ, ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ КОНСОРЦИУМА CONSORTIUM OF BIFIDOBACTERIA AND STRAINS INCLUDED IN THE CONSORTIUM
Область техники Technical field
Группа изобретений, связанных единым изобретательским замыслом, относится к биотехнологии, пищевой промышленности, фармакологии, косметологии и может быть использована для получения бифидосодержащих продуктов. The group of inventions connected by a single inventive concept relates to biotechnology, food industry, pharmacology, cosmetology and can be used to obtain bifid-containing products.
Предшествующий уровень техники Prior Art
Бифидобактерии являются важнейшими симбионтами желудочно-кишечного тракта человека. У детей к 3-х месячному возрасту их доля в микробиоме составляет более 90 %, что свидетельствует о ведущей роли этой группы бактерий в становлении и развитии систем гомеостаза человека с раннего возраста. Они обладают морфокинетическим действием, образуют ферменты, участвующие в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот, продуцируют биологически активные соединения, в частности витамины РР, В1, В6, В9, В 12. Бифидобактерии выполняют иммуногенную и антимутагенную функции, а также участвуют в детоксикации экзо- и эндогенных токсических агентов, что становится особенно актуальным в современных условиях массированного антропогенного воздействия на биосферу, при котором страдает не только природа, но и сам человек. Bifidobacteria are the most important symbionts of the human gastrointestinal tract. In children by the age of 3 months, their share in the microbiome is more than 90%, which indicates the leading role of this group of bacteria in the formation and development of human homeostasis systems from an early age. They have a morphokinetic effect, form enzymes involved in the metabolism of proteins, carbohydrates, lipids and nucleic acids, produce biologically active compounds, in particular vitamins PP, B1, B6, B9, B 12. Bifidobacteria perform immunogenic and antimutagenic functions, and also participate in detoxification of exogenous and endogenous toxic agents, which is becoming especially relevant in modern conditions of massive anthropogenic impact on the biosphere, in which not only nature suffers, but also man himself.
Многоплановое позитивное воздействие на организм человека позволяет рассматривать бифидобактерии как эффективную основу для конструирования бифидосодержащей продукции различного назначения на основе перспективных штаммов бифидобактерий. A multifaceted positive effect on the human body allows us to consider bifidobacteria as an effective basis for designing bifid-containing products for various purposes based on promising strains of bifidobacteria.
Кроме того, представителям рода Bifidobacterium присвоен статус безопасности GRAS (generally recognized as safe), что подтверждает возможность применения штаммов и метаболитов (продуцентов) штаммов бифидобактерий в производстве безопасных продуктов питания, медицинских препаратов, БАД, косметических и гигиенических средств. In addition, representatives of the genus Bifidobacterium have been assigned the GRAS (generally recognized as safe) safety status, which confirms the possibility of using strains and metabolites (producers) of bifidobacteria strains in the production of safe food, medicines, dietary supplements, cosmetics and hygiene products.
В кишечнике человека в биоценозе преобладают виды Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium infantis (Bifidobacterium longum spp. infantis) и Bifidobacterium breve. Именно эти пять видов бифидобактерий являются доминантными и в различных сочетаниях создают условия формирования состава и нормального состояния микробиоты здорового человека. (Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериоза кишечника. Сборник трудов. Минздрав РСФСР - М.: 1986 г. стр. 67). In the human intestine, the biocenosis is dominated by the species Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium infantis (Bifidobacterium longum spp. infantis) and Bifidobacterium breve. It is these five species of bifidobacteria that are dominant and, in various combinations, create conditions formation of the composition and normal state of the microbiota of a healthy person. (Kozlova E.P., Kurnosova N.A., Feklisova L.V. Theoretical and biomedical aspects of the use of various types of bifidobacteria as part of means for the prevention and treatment of intestinal dysbacteriosis. Collection of works. Ministry of Health of the RSFSR - M .: 1986 p. 67).
Известны консорциумы пробиотических штаммов различных комбинаций, используемые для приготовления пробиотиков, продуктов лечебного питания, кисломолочных продуктов, биологически активных добавок и бифидосодержащих пищевых продуктов зарубежных и отечественных фирм-разработчиков (RU 2109054 С1, опубл. 20.04.1998; RU 2196173 С1, опубл. 10.01.2003; RU 2196174 С1, опубл. 10.01.2003; RU 2264452 С1, опубл. 20.11.2005; RU 2264450 С1, опубл. 20.11.2005; RU 2261909 С1, опубл. 10.10.2005; RU 2491334 С1, опубл. 27.08.2013; RU 2491333 С1, опубл. 27.08.2013; RU 2491332 С1, опубл. 27.08.2013; WO 2014/021733, опубл. 06.02.2014; US 7,807,440 В2, опубл. 30.10.2008; ЕА 017595 В1 опубл. 30.06.2005). There are known consortia of probiotic strains of various combinations used for the preparation of probiotics, health food products, fermented milk products, dietary supplements and bifid-containing food products of foreign and domestic developers (RU 2109054 C1, publ. 20.04.1998; RU 2196173 C1, publ. 10.01 2003; RU 2196174 C1, published 01/10/2003; RU 2264452 C1, published 11/20/2005; RU 2264450 C1, published 11/20/2005; RU 2261909 C1, published 10/10/2005; 2013; RU 2491333 C1, published 27.08.2013; RU 2491332 C1, published 27.08.2013; WO 2014/021733, pub. 06.02.2014; US 7,807,440 B2, publ. .2005).
В настоящее время в лекарственных препаратах, БАД и пробиотических продуктах, выпускаемых в России и за рубежом, используют ограниченный перечень штаммов бифидобактерий. Currently, a limited list of bifidobacteria strains is used in medicines, dietary supplements and probiotic products manufactured in Russia and abroad.
Было выявлено, что бифидофлора обладает определенной структурой, в соответствии с которой только консорциум бифидобактерий оказывает доминантное влияние на формирование микробиоты, характерной для здорового кишечника (доказано в 88% исследованных случаев), в то время как наличие одного или двух штаммов всегда приводит к дисбиозу (доказано в 42% случаев дисбиоза 1-2 типа и в 86% дисбиоза 3 типа). (Иванова Е.В. Роль бифидофлоры в ассоциативном симбиозе кишечной микробиоты человека. Автореферат дис. ...докт. мед. наук. Челябинск 2009, стр 13). It was found that the bifidoflora has a certain structure, according to which only a consortium of bifidobacteria has a dominant influence on the formation of the microbiota characteristic of a healthy intestine (proven in 88% of the cases studied), while the presence of one or two strains always leads to dysbiosis ( proven in 42% of cases of type 1-2 dysbiosis and in 86% of type 3 dysbiosis). (Ivanova E.V. The role of bifidoflora in the associative symbiosis of the human intestinal microbiota. Abstract of the thesis ... Doctor of Medical Sciences. Chelyabinsk 2009, p 13).
Из них наиболее широко используемыми являются: Bifidobacterium longum spp.longum штаммы АТСС 15707, RO23, ВВ536 (Morinaga Milk Industry), SBT-2928, Я-3, B379M, ДВА-13; Bifidobacterium longum spp.infantis штамм RO3, 35624Of these, the most widely used are: Bifidobacterium longum spp. longum strains ATCC 15707, RO23, BB536 (Morinaga Milk Industry), SBT-2928, I-3, B379M, DVA-13; Bifidobacterium longum spp.infantis strain RO3, 35624
(Procter&Gamble); Bifidobacterium longum spp.infantis штаммы 73-15 и 79-43; Bifidobacterium bifidum штаммы 1 и 791, 791 БАГ, ЛВА-3, RO71, 8-3; Bifidobacterium breve штамм 79-88, 79-119, RO70; Bifidobacterium animalis spp.animalis штамм DN-173010 (Danone/Dannon); Bifidobacterium animalis spp.lactis Bbl 2 (Chr. Hansen), HN019 (DR10) (Danisco); Bifidobacterium adolescentis штамм Г7513, ГО-13, MC-42. (Procter &Gamble); Bifidobacterium longum spp.infantis strains 73-15 and 79-43; Bifidobacterium bifidum strains 1 and 791, 791 BAG, LVA-3, RO71, 8-3; Bifidobacterium breve strain 79-88, 79-119, RO70; Bifidobacterium animalis spp.animalis strain DN-173010 (Danone/Dannon); Bifidobacterium animalis spp. lactis Bbl 2 (Chr. Hansen), HN019 (DR10) (Danisco); Bifidobacterium adolescentis strain G7513, GO-13, MC-42.
Bifidobacterium animalis подвид lactis, в различных вариациях названия, выделенный из рубца животного, имеет наименьший размер генома. Это связано с тем, что он обитает в среде с постоянным и простым составом питательного субстрата, в условиях, не требующих постоянной адаптации микробной клетки. Подтверждением этого является наличие только двух полных копий рРНК оперонов, тогда как иные виды имеют до четырех -пяти рРНК оперонов. Пониженные адаптационные свойства штаммов В. animalis подвид lactis не приводят к формированию устойчивого эубиоза (Бухарин О. В., Перумова Н.Б., Иванова Е.В. Биофлора при ассоциативном симбиозе человека. - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. - стр. 11) Bifidobacterium animalis subsp. lactis, in various variations of the name, isolated from the rumen of an animal, has the smallest genome size. This is due to the fact that it lives in an environment with a constant and simple composition of the nutrient substrate, in conditions that do not require constant adaptation of the microbial cell. This is confirmed by the presence of only two complete copies of rRNA operons, while other species have up to four to five rRNA operons. Reduced adaptive properties of strains of B. animalis subsp. lactis do not lead to the formation of sustainable eubiosis (Bukharin O.V., Perumova N.B., Ivanova E.V. Bioflora in human associative symbiosis. - Ekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2014. - p. eleven)
Традиционно в нашей стране при создании пробиотиков для человека используются штаммы, выделенные от здоровых доноров. Traditionally, in our country, when creating probiotics for humans, strains isolated from healthy donors are used.
Известные полиштаммовые препараты зачастую представляют собой механический набор пробиотических культур без учета их симбиотичности, способности штаммов, вводимых в состав препаратов, развиваться совместно, не подавляя друг друга. Поэтому производители вынуждены культивировать их раздельно и смешивают их непосредственно перед лиофилизацией. Это приводит к недостаточной колонизирующей активности и жизнеспособности пробиотических штаммов и слабой устойчивости к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта. Known polystrain preparations often represent a mechanical set of probiotic cultures without taking into account their symbiotic nature, the ability of strains introduced into preparations to develop together without suppressing each other. Therefore, manufacturers are forced to cultivate them separately and mix them immediately before freeze-drying. This leads to insufficient colonizing activity and viability of probiotic strains and weak resistance to damaging factors of aggressive environments of the gastrointestinal tract.
Наиболее близким аналогом (прототипом) заявленного консорциума по видовому составу является консорциум пяти видов селекционных штаммов бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 791 -МБ, Bifidobacterium longum В 379М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119- МБ, используемый для приготовления кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств (RU 2261909 С1, опубл. 10.10.2005). Штаммы, входящие в состав консорциума, имеют близкие культуральные и биологические свойства, при совместном культивировании консорциум активно размножается на питательных средах с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования, обладает специфической активностью. Готовый продукт содержит в 1 мл 109 живых клеток бифидобактерий . The closest analogue (prototype) of the claimed consortium in terms of species composition is a consortium of five types of breeding strains of bifidobacteria: Bifidobacterium bifidum 791-MB, Bifidobacterium longum B 379M-MB, Bifidobacterium adolescentis G 7513-MB, Bifidobacterium infantis 73-15-MB, Bifidobacterium breve 79 -119- MB used for the preparation of sour-milk, non-fermented products, dietary supplements, bifid-containing preparations, cosmetic and hygiene products (RU 2261909 C1, publ. 10.10.2005). The strains that make up the consortium have similar cultural and biological properties; when co-cultivated, the consortium actively reproduces on nutrient media with the accumulation of production biomass in a short cultivation period, and has specific activity. The finished product contains 10 9 living cells of bifidobacteria in 1 ml.
Отдельные штаммы консорциума, входящие в его состав, получены из аналогичных коллекционных штаммов путем последовательных 50 циклов лиофилизированной сушки и восстановления. Individual strains of the consortium included in its composition were obtained from similar collection strains by successive 50 cycles of lyophilized drying and recovery.
Недостатком данного консорциума является сложность получения селекционных штаммов, предполагающего проведение 50 циклов последовательной лиофилизированной сушки и восстановления на тиогликолевой среде и обезжиренном молоке, при этом максимальный титр бифидобактерий составляет только 109 живых клеток бактерий в 1 мл готового продукта. The disadvantage of this consortium is the difficulty of obtaining selection strains, which involves 50 cycles of sequential lyophilized drying and recovery on a thioglycol medium and defatted milk, while the maximum titer of bifidobacteria is only 10 9 living cells of bacteria in 1 ml of the finished product.
Раскрытие изобретения Disclosure of invention
Технической проблемой, решаемой в результате создания настоящего изобретения, является разработка консорциума, включающего селекционные штаммы, подобранные по составу не только с учетом биосовместимости, но и придающие консорциуму устойчивость к широкому спектру антибиотиков, повреждающим факторам, обеспечивающим процесс пищеварения в желудочно-кишечном тракте, выраженную антагонистическую активность с наличием высокого титра бифидобактерий 10п КОЕ в 1г сухой биомассы и получение на его основе бифидосо держащих продуктов с высокими лечебно-профилактическими свойствами, а также упрощение получения консорциума. The technical problem solved as a result of the creation of the present invention is the development of a consortium that includes selection strains selected in composition not only taking into account biocompatibility, but also giving the consortium resistance to a wide range of antibiotics, damaging factors that ensure the process of digestion in the gastrointestinal tract, expressed antagonistic activity with the presence of a high titer of bifidobacteria 10 p CFU per 1 g of dry biomass and the production of bifidus-containing products with high therapeutic and prophylactic properties on its basis, as well as simplification of obtaining a consortium.
Технический результат заключается в том, что предлагаемый консорциум бифидобактерий, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, и штаммы, входящие в его состав, способны активно накапливать микробную биомассу на различных питательных средах до высокой концентрации, обладают высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, являющимся причиной пищевых отравлений, а, кроме того, обладают высокой супероксиддисмутазной активностью с выраженной антиоксидантной активностью, при этом супероксиддисмутазная активность составляет не ниже 37 ед/мг белка микробной массы. The technical result lies in the fact that the proposed consortium of bifidobacteria used for the preparation of bifid-containing products, and the strains included in its composition, are able to actively accumulate microbial biomass on various nutrient media to a high concentration, have high antagonistic activity in relation to the main test cultures, which is the cause of food poisoning, and, in addition, they have high superoxide dismutase activity with pronounced antioxidant activity, while superoxide dismutase activity is not lower than 37 U/mg of microbial mass protein.
Входящие в состав консорциума штаммы могут быть легко идентифицированы с учетом предлагаемых нуклеотидных последовательностей фрагментов их ДНК. The strains included in the consortium can be easily identified based on the proposed nucleotide sequences of their DNA fragments.
Указанный технический результат достигается за счет того, что предложен консорциум бифидобактерий, содержащий штамм Bifidobacterium bifidum 791-БЛ, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Федерального Государственного Унитарного Предприятия ГосНИИгенетика Минобрнауки (ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика») под регистрационным № Ас-2035, штамм Bifidobacterium longum В379М-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2037, штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2038, штамм Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2039, штамм Bifidobacterium breve 79- 119-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2036, используемый для приготовления ферментированных, неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, медицинских препаратов. The specified technical result is achieved due to the fact that a consortium of bifidobacteria is proposed containing a strain of Bifidobacterium bifidum 791-BL deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms of the Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science (VKPM FSUE "GosNIIgenetika") under registration No. Ac-2035, Bifidobacterium longum strain V379M-BL, deposited in VKPM FSUE "GosNIIGenetika" under registration No. Ac-2037, Bifidobacterium adolescentis strain G 7513-BL, deposited in VKPM FSUE "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2038, Bifidobacterium infantis strain 73-15-BL, deposited in VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2039, strain Bifidobacterium breve 79- 119-BL, deposited in VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2036, used for the preparation of fermented, non-fermented food products, biologically active additives, bifidus-containing preparations, cosmetic and hygiene products, medical preparations.
Указанный технический результат достигается также за счет того, что предложены следующие оригинальные пробиотические штаммы бифидобактерий, используемые для получения указанного консорциума: The specified technical result is also achieved due to the fact that the following original probiotic strains of bifidobacteria are proposed, used to obtain the specified consortium:
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791-БЛ, используемый для получения консорциума депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2035, и нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium bifidum 791-БЛ SEQ ID NO: 1. The strain of bifidobacteria Bifidobacterium bifidum 791-BL, used to obtain the consortium, was deposited in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2035, and the nucleotide sequence of a fragment of the genome of the strain Bifidobacterium bifidum 791-BL SEQ ID NO: 1.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum В379М-БЛ, используемый для получения консорциума депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2037, и нуклеотидная последовательность фрагмента генома этого штамма SEQ ID NO: 2. The Bifidobacterium longum B379M-BL strain used to obtain the consortium was deposited in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIGenetika" under registration No. Ac-2037, and the nucleotide sequence of the genome fragment of this strain SEQ ID NO: 2.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ, используемый для получения консорциума депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2038 и нуклеотидная последовательность фрагмента генома этого штамма SEQ ID NO: 3. The strain of bifidobacteria Bifidobacterium adolescentis G 7513-BL, used to obtain the consortium, was deposited in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2038 and the nucleotide sequence of the genome fragment of this strain SEQ ID NO: 3.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, используемый для получения консорциума депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2039 и нуклеотидная последовательность фрагмента генома этого штамма SEQ ID NO: 4. The strain of bifidobacteria Bifidobacterium infantis 73-15-BL, used to obtain the consortium, was deposited in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2039 and the nucleotide sequence of the genome fragment of this strain SEQ ID NO: 4.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium breve 79- 119-БЛ, используемый для получения консорциума депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2036, и нуклеотидная последовательность фрагмента генома данного штамма SEQ ID NO: 5. The strain of bifidobacteria Bifidobacterium breve 79-119-BL, used to obtain the consortium, was deposited in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2036, and the nucleotide sequence of the genome fragment of this strain SEQ ID NO: 5.
Для получения предлагаемого консорциума первоначально осуществляют селекцию известных производственных штаммов пяти видов бифидобактерий без использования методов генетической модификации в результате 30 циклов последовательной лиофилизированной сушки и восстановления на среде «Бифилайф М», а затем посредством совместного культивирования штаммов получают консорциум. To obtain the proposed consortium, the known production strains of five species of bifidobacteria are initially selected without the use of genetic modification methods as a result of 30 cycles of sequential lyophilized drying and recovery on the Bifilife M medium, and then a consortium is obtained by co-cultivation of strains.
Использованная методика отбора селекционных штаммов учитывала изучение их антибиотикорезистентности, культуральных, антагонистических, морфологических, физиолого-биохимических свойств, молекулярно-генетической идентификации и биосовместимости при совместном культивировании штаммов с учетом кинетики роста каждого из них. Это позволило создать консорциум, способный осуществлять коррекцию микроэкологических нарушений более эффективно и безопасно. The method used for selecting breeding strains took into account the study of their antibiotic resistance, cultural, antagonistic, morphological, physiological and biochemical properties, molecular genetic identification and biocompatibility in the co-cultivation of strains, taking into account the growth kinetics of each of them. This made it possible to create a consortium capable of correcting microecological disturbances more efficiently and safely.
Краткое описание фигур чертежей Brief description of the figures of the drawings
Группа изобретений поясняется чертежами, где: на фиг.1 изображено филогенетическое дерево для штамма Bifidobacterium bifidum 791-БЛ; на фиг.2 изображено филогенетическое дерево для штамма Bifidobacterium longum В 379М-БЛ; на фиг.З изображено филогенетическое дерево для штамма Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ; на фиг.4 изображено филогенетическое дерево для штамма Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ; на фиг.5 изображено филогенетическое дерево для штамма Bifidobacterium breve 79-119-БЛ; на фиг.6 представлен график зависимости содержания бифидобактерий от времени культивирования. The group of inventions is illustrated by drawings, where: figure 1 shows a phylogenetic tree for a strain of Bifidobacterium bifidum 791-BL; figure 2 shows a phylogenetic tree for a strain of Bifidobacterium longum In 379M-BL; fig.3 shows the phylogenetic tree for the Bifidobacterium adolescentis G 7513-BL strain; figure 4 shows the phylogenetic tree for the strain Bifidobacterium infantis 73-15-BL; figure 5 shows the phylogenetic tree for the strain Bifidobacterium breve 79-119-BL; figure 6 presents a graph of the content of bifidobacteria from the time of cultivation.
Осуществление группы изобретений Implementation of a group of inventions
Селекция штаммов и их характеристики Selection of strains and their characteristics
1. Для получения штамма Bifidobacterium bifidum 791-БЛ проводилась селекция штамма Bifidobacterium bifidum 791-МБ, который депонирован 15.07.04 в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас- 1688. Организация, осуществившая депонирование, находится по адресу: Российская Федерация, 117545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1. Исходный штамм Bifidobacterium bifidum 791-МБ охраняется патентом RU 2261908, опубликованным 10.10.2005. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных циклов лиофилизированной сушки и восстановления на питательной среде «Бифилайф М» следующего состава в г/л: 1. To obtain the strain Bifidobacterium bifidum 791-BL, the selection of the strain Bifidobacterium bifidum 791-MB was carried out, which was deposited on July 15, 2004 in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-1688. The organization that carried out the deposit is located at the address: Russian Federation, 117545 , Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1. The original strain of Bifidobacterium bifidum 791-MB is protected by patent RU 2261908 published on 10.10.2005. Selection was carried out without the use of genetic modification methods through multiple cycles of lyophilized drying and recovery on the nutrient medium "Bifilife M" of the following composition in g/l:
Гидролизат казеина неглубокой степени расщепления, ферментативный - 15,0 г;Hydrolyzate of casein of a shallow degree of splitting, enzymatic - 15.0 g;
Дрожжевой экстракт - 5,0 г; Yeast extract - 5.0 g;
Глюкоза - 5,0 г; Натрий хлорид - 2,5 г; Glucose - 5.0 g; Sodium chloride - 2.5 g;
Цистеин гидрохлорид - 0,75 г; Cysteine hydrochloride - 0.75 g;
Натрий углекислый - 0,8 г; Sodium carbonate - 0.8 g;
Агар микробиологический - 0,075 г; Microbiological agar - 0.075 g;
MgS04-0,011 г; MgS0 4 -0.011 g;
К2НРО4 - 0,0001 г; K 2 HPO 4 - 0.0001 g;
FeSO4 Н2О - 0,00009 г; FeSO 4 H 2 O - 0.00009 g;
MnSO4 Н2О - 0,0001 г; MnSO 4 H 2 O - 0.0001 g;
В 1 (тиамина гидрохлорид) - 0,0002 г; In 1 (thiamine hydrochloride) - 0.0002 g;
В6 (пиридоксина гидрохлорид) - 0,0002 г; B6 (pyridoxine hydrochloride) - 0.0002 g;
ВЗ (кальция пантотенат) - 0,001 г; VZ (calcium pantothenate) - 0.001 g;
Вс (фолиевая кислота) - 0,00004 г; Sun (folic acid) - 0.00004 g;
РР (никотинамид) - 0,002 г; PP (nicotinamide) - 0.002 g;
В2 (рибофлавин) - 0,0002 г; B2 (riboflavin) - 0.0002 g;
Глицин - 0,0056 г; Glycine - 0.0056 g;
Глутаминовая кислота - 0,0024 г; Glutamic acid - 0.0024 g;
Аспарагиновая кислота - 0,0003 г; Aspartic acid - 0.0003 g;
ПАБК - 0,1 г; PABA - 0.1 g;
Лимонная кислота - 0,0001 г. Citric acid - 0.0001 g.
Первичный посевной материал производственного штамма Bifidobacterium bifidum 791 -МБ в объеме 5 % от объема среды культивирования вносили в вышеуказанную среду и культивировали при температуре 37-38°С 24 часа. Далее было проведено 30 циклов сушка-восстановление на питательной среде «Бифилайф М». The primary inoculum of the production strain Bifidobacterium bifidum 791-MB in a volume of 5% of the volume of the cultivation medium was introduced into the above medium and cultivated at a temperature of 37-38°C for 24 hours. Then 30 cycles of drying-recovery were carried out on the nutrient medium "Bifilife M".
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium bifidum 791- БЛ, который депонирован 16.11.2016 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным № Ас- 2035. As a result of the selection, a strain of Bifidobacterium bifidum 791-BL was obtained, which was deposited on November 16, 2016 in the VKPM Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika under registration No. Ac-2035.
Культурально-морфологические и биологические признаки штамма Bifidobacterium bifidum 791-БЛ - палочковидные вариабельные клетки с V -образными раздвоениями на одном или двух концах, неподвижные, в мазке образуют скопления, иногда цепочки, грамположительные. Факультативный анаэроб, оптимальная температура культивирования составляет 37-38°С, pH 7,0±0,2. Cultural, morphological and biological features of the strain Bifidobacterium bifidum 791-BL are rod-shaped variable cells with V-shaped bifurcations at one or two ends, immobile, form clusters in the smear, sometimes chains, gram-positive. Facultative anaerobe, the optimum cultivation temperature is 37-38°C, pH 7.0±0.2.
Сквашивает молоко с образованием к 16-18 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют. Кислотообразующая активность: к 24 ч - 70° Т, к 72 ч - 90-100° Т (на печеночной среде Блаурокка), на гидролизатно-молочной среде - до 100° Т и 180° Т, соответственно. Ferment milk with the formation of a stable clot by 16-18 hours. Gas-forming ability, catalase-forming ability, gelatin liquefaction are absent. Acid-forming activity: by 24 h - 70 ° T, by 72 h - 90-100 ° T (on Blaurock's hepatic medium), on hydrolysate-milk medium - up to 100 ° T and 180 ° T, respectively.
Максимальный титр бифидобактерий в гидролизатно-молочной среде через 24 ч культивирования составляет 1х1О10 КОЕ/мл; максимальный титр бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов через 24 ч культивирования составляет 1-ЗхЮ10КОЕ/мл. The maximum titer of bifidobacteria in a hydrolysate-milk medium after 24 hours of cultivation is 1x10 10 CFU/ml; the maximum titer of bifidobacteria in sterile skimmed milk without growth factors after 24 hours of cultivation is 1-3x10 10 cfu/ml.
Штамм растет на используемых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее 1g 9,8-10,2 микробного числа за 16-18 ч культивирования. The strain grows on nutrient media used in production with biomass accumulation of at least 1g 9.8-10.2 microbial number for 16-18 hours of cultivation.
У заявляемого штамма наблюдается выраженная антагонистическая активность к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Shigella flexneri, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 1 представлена антагонистическая активность штамма к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов. The claimed strain has a pronounced antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Shigella flexneri, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. Table 1 shows the antagonistic activity of the strain against some of the aforementioned microorganisms.
Антагонистическую активность моноштамма бифидобактерий определяли по зоне задержки роста тест-культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов. The antagonistic activity of a monostrain of bifidobacteria was determined by the zone of growth inhibition of test cultures of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms by the method of perpendicular strokes.
Таблица 1 Table 1
Сравнение антагонистических свойств штаммов В. bifidum 791-МБ и В. bifidumComparison of antagonistic properties of B. bifidum 791-MB and B. bifidum strains
791-БЛ
Figure imgf000010_0001
791-BL
Figure imgf000010_0001
Анализ данных таблицы 1 показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, являющимся причиной пищевых отравлений. Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5 % от объема среды. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38°С. Analysis of the data in table 1 shows that the claimed strain has a higher antagonistic activity against the main test cultures that cause food poisoning. Determination of the level of resistance of the strain to antibiotics was carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium - sterile skimmed milk. Various concentrations of sterile solutions of antibiotics and a 16-hour culture of bifidobacteria were introduced into the nutrient medium in an amount of 5% of the volume of the medium. Stability was determined by the change in titratable acidity in the samples after 48 h of incubation at a temperature of 37-38°C.
Кроме того, производственно-полезным признаком штамма В. bifidum 791-БЛ, отличающим его от штамма В. bifidum 791-МБ, является то, что выращенная в стационарных условиях на среде «Бифилайф М» в объеме 300 см3 культура обладает повышенной супероксиддисмутазной активностью. СОД-активность штамма В. bifidum 791-БЛ составляет 27,7 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе. In addition, a production-useful feature of the B. bifidum 791-BL strain, which distinguishes it from the B. bifidum 791-MB strain, is that the culture grown under stationary conditions on the Bifilife M medium in a volume of 300 cm 3 has an increased superoxide dismutase activity. . The SOD activity of the B. bifidum 791-BL strain is 27.7 U/mg of the protein contained in the bacterial mass.
Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях как in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника на фоне антибиотикотерапии . The revealed SOD activity of the culture of bifidobacteria indicates that the strain has a pronounced probiotic effect, which can manifest itself both in vivo and in vitro. The high activity of acid formation, the resistance of the strain to major antibiotics contributes to the effective restoration of normal intestinal microflora against the background of antibiotic therapy.
Условия хранения заявляемого штамма. Storage conditions of the proposed strain.
Свежеприготовленный штамм В. bifidum 791-БЛ хранят на питательной среде с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатин, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при температуре 6-8 °C без потери активности в течение года. Freshly prepared strain B. bifidum 791-BL is stored on a nutrient medium with the addition of a protective medium containing sucrose, gelatin, sodium citrate, and freeze-dried in ampoules. The strain is well stored at a temperature of 6-8 °C without loss of activity during the year.
Генетическую идентификацию штамма осуществляли с помощью анализа 16S рРНК. Genetic identification of the strain was carried out using the analysis of 16S rRNA.
Консервативные праймеры для наработки 16S рДНК: Conservative primers for 16S rDNA production:
8f - aga gtt tga tcc tgg etc ag 8f - aga gtt tga tcc tgg etc ag
926r - ccg tea att cct ttr agt tt 926r - ccg tea att cct ttr agt tt
1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt 1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt
Таблица 2 table 2
Г омология секвенированного фрагмента ДНК депонируемого штамма с предполагаемым видом и наиболее близкими видами: Homology of the sequenced DNA fragment of the deposited strain with the putative species and the closest species:
Distance Matrix distance matrix
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000012_0001
Исследуемый штамм Bifidobacterium bifidum 791-БЛ принадлежит к следующей систематической группе: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium, причем гомология с видом Bifidobacterium bifidum составляет 97 %. Анализ по RDP II 16S рРНК базе данных показал гомологию с тем же видом бактерий Bifidobacterium bifidum. The studied strain of Bifidobacterium bifidum 791-BL belongs to the following systematic group: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium, and the homology with the species Bifidobacterium bifidum is 97%. Analysis in the RDP II 16S rRNA database showed homology with the same bacterial species Bifidobacterium bifidum.
По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (фиг.1). According to the analysis was built phylogenetic tree with homologous strains (figure 1).
Таблица 3 Table 3
Sequence description
Figure imgf000012_0002
И
Figure imgf000013_0001
sequence description
Figure imgf000012_0002
And
Figure imgf000013_0001
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК тестируемый штамм Bifidobacterium bifidum 791-БЛ можно отнести к виду Bifidobacterium bifidum (97 %). According to the results of the analysis of sequences of 16S rDNA variable regions, the tested Bifidobacterium bifidum 791-BL strain can be attributed to the Bifidobacterium bifidum species (97%).
Выделение ДНК для ПЦР DNA isolation for PCR
PCR Protocols. A Guide to methods and applications. PCR protocols. A guide to methods and applications.
Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.
Условия ПЦР PCR conditions
Каталог MBI Fermentas 1998\1999, 146-157. Catalog MBI Fermentas 1998\1999, 146-157.
Pavlicek A et al «Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap^ ackknife analysis of tree robustness». Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 199945(3) 97-9. Pavlicek A et al "Free-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap^ ackknife analysis of tree robustness". Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 199945(3) 97-9.
В результате получена нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium bifidum 791-БЛ SEQ ID NO: 1, идентичная таковой, представленной на машиночитаемом носителе. As a result, the nucleotide sequence of a fragment of the genome of the strain Bifidobacterium bifidum 791-BL SEQ ID NO: 1, identical to that presented on a machine-readable medium, was obtained.
Сведения о безопасности использования штамма: штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием геннотехнических методик; штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным. Information about the safety of using the strain: the strain is not genetically modified and does not contain genes from other organisms; transferred resistance genes; genetic changes associated with the use of genetic engineering techniques; the strain is not zoopathogenic and phytopathogenic.
2. Для получения штамма Bifidobacterium longum В 379М-БЛ проводилась селекция штамма Bifidobacterium longum В 379М-МБ, который депонирован 15.07.04 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под № Ас- 1689. Исходный штамм защищен патентом РФ № 2261907. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных циклов лиофилизированной сушки и восстановления на указанной ранее питательной среде «Бифилайф М». 2. To obtain the strain Bifidobacterium longum B 379M-BL, the selection of the strain Bifidobacterium longum B 379M-MB was carried out, which was deposited on July 15, 2004 in the VKPM Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under No. Ac-1689. The original strain is protected by RF patent No. genetic modification through multiple cycles of lyophilized drying and recovery on the previously mentioned nutrient medium "Bifilife M".
Первичный посевной материал производственного штамма Bifidobacterium longum В 379М-МБ в объеме 5 % от объема среды культивирования вносили в вышеуказанную среду и культивировали при температуре 37-38° С 24 часа. Далее было проведено 30 циклов сушка-восстановление на питательной среде «Бифилайф М». The primary inoculum of the production strain Bifidobacterium longum B 379M-MB in a volume of 5% of the volume of the cultivation medium was introduced into the above medium and cultivated at a temperature of 37-38°C for 24 hours. Then 30 cycles of drying-recovery were carried out on the nutrient medium "Bifilife M".
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium longum В 379М-БЛ, который депонирован 16.11.2016 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под регистрационным № Ас- 2037. Культурально-морфологические и биологические признаки - клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2 концах, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка образует колонии в виде комет. As a result of the selection, a strain of Bifidobacterium longum B 379M-BL was obtained, which was deposited on November 16, 2016 in the VKPM Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under registration No. Ac-2037. Cultural, morphological and biological features - cells are Gram-positive polymorphic rods with a bifurcation or thickening at 1-2 ends, prone to the formation of clusters. In the hepatic environment, Blaurock forms colonies in the form of comets.
Факультативный анаэроб, оптимальная температура 37 - 38°С, pH 7,0±0,2. Facultative anaerobe, optimum temperature 37 - 38°C, pH 7.0±0.2.
Сквашивает молоко с образованием к 16-20 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют. It ferments milk with the formation of a stable clot by 16-20 hours. Gas-forming ability, catalase-forming ability, gelatin liquefaction are absent.
Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 18 ч - 100° Т, к 20 ч - 120° Т, к 24 ч - 145° Т. Acid-forming activity: when cultivated on sterile skimmed milk, titratable acidity reaches 100° T by 18 hours, 120° T by 20 hours, and 145° T by 24 hours.
Максимальный титр бифидобактерий в молочном сгустке достигает к 18 ч культивирования и составляет Ю9КОЕ/мл. The maximum titer of bifidobacteria in the milk clot reaches 18 hours of cultivation and is 10 9 CFU/ml.
Штамм растет на используемых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее 1g 9-10 микробного числа за 16-18 ч культивирования. The strain grows on nutrient media used in production with biomass accumulation of at least 1g 9-10 microbial number for 16-18 hours of cultivation.
У штамма наблюдается выраженная антагонистическая активность к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Candida albicans, Proteus vulgaris., Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 4 представлена антагонистическая активность к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов. The strain has a pronounced antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Candida albicans, Proteus vulgaris., Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. Table 4 shows the antagonistic activity against some of the aforementioned microorganisms.
Антагонистическую активность моноштамма бифидобактерий определяли по зоне задержки роста тест-культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов. The antagonistic activity of a monostrain of bifidobacteria was determined by the zone of growth inhibition of test cultures of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms by the method of perpendicular strokes.
Таблица 4 Table 4
Сравнение антагонистических свойств штаммов В. longum В 379М -МБ и В. longum В379М-БЛ
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Comparison of the antagonistic properties of B. longum B 379M-MB and B. longum B379M-BL strains
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, являющимися причиной пищевых отравлений. Analysis of the data in the table shows that the claimed strain has a higher antagonistic activity against the main test cultures that cause food poisoning.
Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5 %. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38 °C. Determination of the level of resistance of the strain to antibiotics was carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium - sterile skimmed milk. Various concentrations of sterile solutions of antibiotics and a 16-hour culture of bifidobacteria in an amount of 5% were introduced into the nutrient medium. Stability was determined by the change in titratable acidity in the samples after 48 h of incubation at a temperature of 37-38°C.
Кроме того, производственно-полезным признаком штамма В. longum В379М- БЛ, отличающим его от штамма В. longum В379М-МБ, является то, что выращенная в стационарных условиях на питательной среде «Бифилайф М» в объеме 300 см3 культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. СОД - активность штамма В. longum В379М-БЛ составляет 32,0 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе. Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника на фоне антибиотикотерапии. In addition, a production-useful feature of the B. longum B379M-BL strain, which distinguishes it from the B. longum B379M-MB strain, is that the culture grown under stationary conditions on a nutrient medium "Bifilife M" in a volume of 300 cm 3 has a pronounced superoxide dismutase activity. SOD - the activity of the strain B. longum B379M-BL is 32.0 units/mg of the protein contained in the bacterial mass. The revealed SOD activity of the culture of bifidobacteria indicates that the strain has a pronounced probiotic effect, which can manifest itself both in vivo and in vitro. The high activity of acid formation, the resistance of the strain to major antibiotics, contributes to the effective restoration of normal intestinal microflora against the background of antibiotic therapy.
Условия хранения заявляемого штамма. Storage conditions of the proposed strain.
Свежеприготовленный штамм В. longum В379М-БЛ на питательной среде с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатин, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при температуре 6-8° С без потери активности в течение года. Freshly prepared strain B. longum B379M-BL on a nutrient medium with the addition of a protective medium containing sucrose, gelatin, sodium citrate, freeze-dried in ampoules. The strain is well stored at a temperature of 6-8°C without loss of activity during the year.
Генетическую идентификацию штамма осуществляли с помощью анализа 16S рРНК. Genetic identification of the strain was carried out using the analysis of 16S rRNA.
Консервативные праймеры для наработки 16S рДНК: Conservative primers for 16S rDNA production:
8f - aga gtt tga tcc tgg etc ag 8f - aga gtt tga tcc tgg etc ag
926r - ccg tea att cct ttr agt tt 926r - ccg tea att cct ttr agt tt
1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt Таблица 5 1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt Table 5
Г омология секвенированного фрагмента ДНК депонируемого штамма с предполагаемым видом и наиболее близкими видами: Homology of the sequenced DNA fragment of the deposited strain with the putative species and the closest species:
Distance Matrix
Figure imgf000016_0001
distance matrix
Figure imgf000016_0001
Исследуемый штамм Bifidobacterium longum В379М-БЛ принадлежит к следующей систематической группе: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Анализ no RDP II 16S pPHK базе данных показал наилучшую гомологию с видами бактерий Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium subtile, Bifidobacterium pseudoIongum, Bifidobacterium pullorum. По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (фиг. 2). The studied strain of Bifidobacterium longum V379M-BL belongs to the following systematic group: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Analysis of the no RDP II 16S pRNA database showed the best homology with the bacterial species Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium subtile, Bifidobacterium pseudoIongum, Bifidobacterium pullorum. According to the analysis, a phylogenetic tree with homologous strains was constructed (Fig. 2).
Таблица 6 Table 6
Sequence description
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000017_0001
sequence description
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000017_0001
По результатам анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК штамм Bifidobacterium longum В379М-БЛ можно отнести к виду Bifidobacterium longum (99 %). Based on the analysis of the sequences of the 16S rDNA variable regions, the strain Bifidobacterium longum V379M-BL can be attributed to the species Bifidobacterium longum (99%).
Выделение ДНК для ПЦР DNA isolation for PCR
PCR Protocols. A Guide to methods and applications. PCR protocols. A guide to methods and applications.
Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.
Условия ПЦР PCR conditions
Каталог MBI Fermentas 1998M999, 146-157. Catalog MBI Fermentas 1998M999, 146-157.
Pavlicek A et al «Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap^ ackknife analysis of tree robustness.» Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol» (Praha) 199945(3) 97-9. Pavlicek A et al "Free-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap^ ackknife analysis of tree robustness." Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol" (Praha) 199945(3) 97-9.
В результате получена нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium longum В 379М-БЛ SEQ ID NO: 2, идентичная таковой, представленной на машиночитаемом носителе. As a result, the nucleotide sequence of the genome fragment of the Bifidobacterium longum B 379M-BL SEQ ID NO: 2, identical to that presented on the machine-readable medium, was obtained.
Сведения о безопасности использования штамма: штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием геннотехнических методик; штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным. Information about the safety of using the strain: the strain is not genetically modified and does not contain genes from other organisms; transferred resistance genes; genetic changes associated with the use of genetic engineering techniques; the strain is not zoopathogenic and phytopathogenic.
3. Для получения штамма Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ проводилась селекция штамма Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, который депонирован 15.07.04 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под № Ас- 1690. Исходный штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ защищен патентом РФ № 2261904. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных циклов лиофилизированной сушки и восстановления на указанной ранее питательной среде «Бифилайф М». Первичный посевной материал производственного штамма Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ в объеме 5 % от объема среды культивирования вносили в вышеуказанную среду и культивировали при температуре 37-38° С 24 часа. Далее было проведено 30 циклов сушка-восстановление на питательной среде «Бифилайф М». 3. To obtain the strain Bifidobacterium adolescentis G 7513-BL, the selection of the strain Bifidobacterium adolescentis G 7513-MB was carried out, which was deposited on July 15, 2004 in the VKPM FSUE GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under No. Ac-1690. The original strain of Bifidobacterium adolescentis G 7513-MB is protected by RF patent No. The selection was carried out without the use of genetic modification methods by means of multiple cycles of lyophilized drying and recovery on the previously mentioned nutrient medium "Bifilife M". The primary inoculum of the production strain Bifidobacterium adolescentis G 7513-MB in a volume of 5% of the volume of the cultivation medium was introduced into the above medium and cultivated at a temperature of 37-38°C for 24 hours. Then 30 cycles of drying-recovery were carried out on the nutrient medium "Bifilife M".
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513 - БЛ, который депонирован 16.11.2016 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под регистрационным № Ас- 2038. As a result of the selection, a strain of Bifidobacterium adolescentis G 7513 - BL was obtained, which was deposited on November 16, 2016 in the VKPM Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under registration No. Ac-2038.
Культурально-морфологические и биологические признаки - клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка и кукурузно-лактозной среде образует колонии в виде гвоздиков. Факультативный анаэроб, оптимальная температура 37-38° С, pH 7,0±0,2. Cultural, morphological and biological features - cells are Gram-positive polymorphic rods with a bifurcation or thickening at 1-2 ends, prone to cluster formation. In Blaurock's liver medium and corn-lactose medium, it forms clove-shaped colonies. Facultative anaerobe, optimum temperature 37-38°C, pH 7.0±0.2.
Сквашивает стерильное молоко с образованием к 22-24 ч стабильного плотного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют. Ferment sterile milk with the formation of a stable dense clot by 22-24 hours. Gas-forming ability, catalase-forming ability, gelatin liquefaction are absent.
Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 24 ч - 70° Т, и накапливает микробную массу бифидобактерий в 1 мл 1g 9, 0-9, 4 микробных клеток. Acid-forming activity: when cultivated in sterile skimmed milk, titratable acidity reaches 70 ° T by 24 hours, and accumulates the microbial mass of bifidobacteria in 1 ml of 1g 9.0-9.4 microbial cells.
Кислотообразующая активность: к 24 ч - 70° Т, к 72 ч - 90-100° Т (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной среде - до 100° Т и 180° Т, соответственно. Максимальный титр бифидобактерий в гидролизатно-молочной среде через 24 ч культивирования составляет 1x1010 КОЕ/мл. Acid-forming activity: by 24 hours - 70 ° T, by 72 hours - 90-100 ° T (on a liver medium), on a hydrolyzate-milk medium - up to 100 ° T and 180 ° T, respectively. The maximum titer of bifidobacteria in a hydrolysate-milk medium after 24 hours of cultivation is 1x10 10 CFU/ml.
Штамм растет на используемых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее 1g 9,8-10,0 микробного числа за 18-20 ч культивирования . The strain grows on nutrient media used in production with biomass accumulation of at least 1g 9.8-10.0 microbial number for 18-20 hours of cultivation.
У штамма наблюдается выраженная антагонистическая активность к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 7 представлена антагонистическая активность к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов. The strain has a pronounced antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. Table 7 shows the antagonistic activity against some of the aforementioned microorganisms.
Антагонистическую активность моноштамма бифидобактерий определяли по зоне задержки роста тест-культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов. Таблица 7 The antagonistic activity of a monostrain of bifidobacteria was determined by the zone of growth retardation of test cultures of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms by the method of perpendicular strokes. Table 7
Сравнение антагонистических свойств штаммов В. adolescentis Г 7513-МБ и В. adolescentis Г 7513-БЛ
Figure imgf000019_0001
Comparison of the antagonistic properties of B. adolescentis G 7513-MB and B. adolescentis G 7513-BL strains
Figure imgf000019_0001
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, вызывающим пищевые отравления. Analysis of the data in the table shows that the claimed strain has a higher antagonistic activity against the main test cultures that cause food poisoning.
Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5 %. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38° С. Determination of the level of resistance of the strain to antibiotics was carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium - sterile skimmed milk. Various concentrations of sterile solutions of antibiotics and a 16-hour culture of bifidobacteria in an amount of 5% were introduced into the nutrient medium. Stability was determined by the change in titratable acidity in the samples after 48 hours of incubation at a temperature of 37-38°C.
Кроме того, производственно-полезным признаком штамма В. adolescentis Г 7513 - БЛ, отличающим его от штамма В. adolescentis Г 7513-МБ, является то, что выращенная в стационарных условиях на питательной среде «Бифилайф М» в объеме 300 см3 культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. СОД - активность штамма В. adolescentis Г 7513-БЛ составляет 25,0 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе. Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника на фоне антибиотикотерапии . In addition, a production-useful feature of the strain B. adolescentis G 7513 - BL, which distinguishes it from the strain B. adolescentis G 7513-MB, is that the culture grown under stationary conditions on a nutrient medium "Bifilife M" in a volume of 300 cm 3 has pronounced superoxide dismutase activity. SOD - the activity of the strain B. adolescentis G 7513-BL is 25.0 units/mg of the protein contained in the bacterial mass. The revealed SOD activity of the culture of bifidobacteria indicates that the strain has a pronounced probiotic effect, which can manifest itself both in vivo and in vitro. The high activity of acid formation, the resistance of the strain to major antibiotics, contributes to the effective restoration of normal intestinal microflora against the background of antibiotic therapy.
Условия хранения заявляемого штамма. Storage conditions of the proposed strain.
Свежеприготовленный штамм В. adolescentis Г 7513 - БЛ хранят на питательной среде с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатозу, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при температуре 6-8 °C без потери активности в течение года. Freshly prepared strain B. adolescentis G 7513 - BL is stored on a nutrient medium with the addition of a protective medium containing sucrose, gelatose, sodium citrate, dried by sublimation in ampoules. The strain is well kept at a temperature of 6-8 °C without loss of activity during the year.
Генетическую идентификацию штамма осуществляли с помощью анализа! 6S рРНК. Genetic identification of the strain was carried out using the analysis! 6S rRNA.
Консервативные праймеры для наработки 16S рДНК Conservative primers for 16S rDNA production
8f - aga gtt tga tcc tgg etc ag 8f - aga gtt tga tcc tgg etc ag
926r - ccg tea att cct ttr agt tt 926r - ccg tea att cct ttr agt tt
1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt 1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt
Таблица 8 Table 8
Гомология секвенированного фрагмента ДНК депонируемого штамма с предполагаемым видом и наиболее близкими видами: Homology of the sequenced DNA fragment of the deposited strain with the putative species and the closest species:
Distance Matrix
Figure imgf000020_0001
distance matrix
Figure imgf000020_0001
Исследуемый штамм Bifidobacterium adolescentis Г7513-БЛ принадлежит к следующей систематической группе: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium, причем гомология с видом Bifidobacterium adolescentis составляет 97 %. The studied strain of Bifidobacterium adolescentis G7513-BL belongs to the following systematic group: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium, and the homology with the species Bifidobacterium adolescentis is 97%.
По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (фиг.З). Таблица 9 According to the analysis, a phylogenetic tree with homologous strains was constructed (Fig. 3). Table 9
Sequence description
Figure imgf000021_0001
sequence description
Figure imgf000021_0001
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК тестируемый штамм Bifidobacterium adolescentis Г7513-БЛ можно отнести к виду Bifidobacterium adolescentis (97 %). According to the results of the analysis of sequences of 16S rDNA variable regions, the tested Bifidobacterium adolescentis G7513-BL strain can be attributed to the Bifidobacterium adolescentis species (97%).
Выделение ДНК для ПЦР DNA isolation for PCR
PCR Protocols. A Guide to methods and applications. PCR protocols. A guide to methods and applications.
Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.
Условия ПЦР PCR conditions
Каталог MBI Fermentas 1998U999, 146-157. Catalog MBI Fermentas 1998U999, 146-157.
Pavlicek A et al «Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap^ ackknife analysis of tree robustness.» Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 199945(3) 97-9. Pavlicek A et al "Free-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap^ ackknife analysis of tree robustness." Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 199945(3) 97-9.
В результате получена нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ SEQ ID NO: 3, идентичная таковой, представленной на машиночитаемом носителе. As a result, the nucleotide sequence of a fragment of the genome of the strain Bifidobacterium adolescentis G 7513-BL SEQ ID NO: 3, identical to that presented on a machine-readable medium, was obtained.
Сведения о безопасности использования штамма: штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием геннотехнических методик; штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным. Information about the safety of using the strain: the strain is not genetically modified and does not contain genes from other organisms; transferred resistance genes; genetic changes associated with the use of genetic engineering techniques; the strain is not zoopathogenic and phytopathogenic.
4. Для получения штамма Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ проводилась селекция штамма Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, который депонирован 15.07.04 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под № Ас- 1692. Исходный штамм Bifidobacterium infantis 73-15-МБ защищен патентом РФ № 2261906. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных циклов лиофилизированной сушки и восстановления на указанной ранее питательной среде «Бифилайф М». 4. To obtain a strain of Bifidobacterium infantis 73-15-BL, selection was carried out strain Bifidobacterium infantis 73-15-MB, which was deposited on July 15, 2004 in VKPM Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under No. Ac-1692. The original strain Bifidobacterium infantis 73-15-MB is protected by RF patent No. 2261906. lyophilized drying and recovery on the previously mentioned nutrient medium "Bifilife M".
Первичный посевной материал производственного штамма Bifidobacterium infantis 73-15-МБ в объеме 5 % от объема среды культивирования вносили в вышеуказанную среду и культивировали при температуре 37-38 °C 24 часа. Далее было проведено 30 циклов сушка-восстановление на питательной среде «Бифилайф М». The primary inoculum of the production strain Bifidobacterium infantis 73-15-MB in a volume of 5% of the volume of the cultivation medium was introduced into the above medium and cultivated at a temperature of 37-38 °C for 24 hours. Then 30 cycles of drying-recovery were carried out on the nutrient medium "Bifilife M".
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium infantis 73- 15-БЛ, который депонирован 16.11.2016 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под регистрационным № Ас- 2039. As a result of the selection, a strain of Bifidobacterium infantis 73-15-BL was obtained, which was deposited on November 16, 2016 in the VKPM Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under registration No. Ac-2039.
Культурально-морфологические и биологические признаки - клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2 концах, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка штамм образует колонии в виде комет. В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Факультативный анаэроб, оптимальная температура выращивания 37-38° С, pH питательных сред 7,0±0,2. Cultural, morphological and biological features - cells are Gram-positive polymorphic rods with a bifurcation or thickening at 1-2 ends, prone to the formation of clusters. In Blaurock's hepatic medium, the strain forms colonies in the form of comets. In liquid nutrient media, it grows along the entire height of the volume, except for the zone of aerobiosis. Facultative anaerobe, optimum growing temperature 37-38°C, nutrient media pH 7.0±0.2.
Сквашивает стерильное молоко к 24-28 ч с образованием плотного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют. Ferment sterile milk by 24-28 hours with the formation of a dense clot. Gas-forming ability, catalase-forming ability, gelatin liquefaction are absent.
Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 24 ч - 80° Т и штамм накапливает микробную массу бифидобактерий в 1 мл 1g 10,2-10,6 микробных клеток. Штамм растет на используемых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее 1g 9-10 микробного числа за 18-22 ч культивирования. Acid-forming activity: when cultivated on sterile skimmed milk, titratable acidity reaches 24 h - 80 ° T and the strain accumulates a microbial mass of bifidobacteria in 1 ml of 1 g of 10.2-10.6 microbial cells. The strain grows on nutrient media used in production with biomass accumulation of at least 1g 9-10 microbial number for 18-22 hours of cultivation.
Штамм обладает выраженной антагонистической активностью к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 10 представлена антагонистическая активность к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов. The strain has a pronounced antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. Table 10 shows the antagonistic activity against some of the aforementioned microorganisms.
Антагонистическую активность моноштамма бифидобактерий определяли по зоне задержки роста тест-культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов. The antagonistic activity of a monostrain of bifidobacteria was determined by the zone of growth inhibition of test cultures of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms. by the method of perpendicular strokes.
Таблица 10 Table 10
Сравнительные данные антагонистической активности штаммов В. infantis 73-15-Comparative data on the antagonistic activity of strains B. infantis 73-15-
МБ и В. infantis 73-15-БЛ
Figure imgf000023_0001
MB and V. infantis 73-15-BL
Figure imgf000023_0001
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, вызывающим пищевые отравления. Analysis of the data in the table shows that the claimed strain has a higher antagonistic activity against the main test cultures that cause food poisoning.
Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5 %. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38 °C. Determination of the level of resistance of the strain to antibiotics was carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium - sterile skimmed milk. Various concentrations of sterile solutions of antibiotics and a 16-hour culture of bifidobacteria in an amount of 5% were introduced into the nutrient medium. Stability was determined by the change in titratable acidity in the samples after 48 h of incubation at a temperature of 37-38°C.
Кроме того, производственно-полезным признаком штамма В. infantis 73-15-БЛ, отличающим его от штамма В. infantis 73-15 -МБ, является то, что выращенная в стационарных условиях на питательной среде «Бифилайф М» в объеме 300 см3 культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. СОД - активность штамма В. infantis 73-15-БЛ составляет 29 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе. Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях как in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника на фоне антибиотикотерапии. In addition, a production-useful feature of the B. infantis 73-15-BL strain, which distinguishes it from the B. infantis 73-15-MB strain, is that it is grown under stationary conditions on a nutrient medium "Bifilife M" in a volume of 300 cm 3 culture has a pronounced superoxide dismutase activity. SOD - the activity of the strain B. infantis 73-15-BL is 29 units/mg of protein contained in the bacterial mass. The revealed SOD activity of the culture of bifidobacteria indicates that the strain has a pronounced probiotic effect, which can manifest itself both in vivo and in vitro. The high activity of acid formation, the resistance of the strain to major antibiotics, contributes to the effective restoration of normal intestinal microflora against the background of antibiotic therapy.
Условия хранения заявляемого штамма. Storage conditions of the proposed strain.
Свежеприготовленный штамм В. infantis 73-15-БЛ хранят на питательной среде с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатин, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при температуре 6-8 °C без потери активности в течение года. A freshly prepared strain of B. infantis 73-15-BL is stored on a nutrient medium with the addition of a protective medium containing sucrose, gelatin, sodium citrate, and freeze-dried in ampoules. The strain is well stored at temperature of 6-8 °C without loss of activity during the year.
Генетическую идентификацию штамма осуществляли с помощью анализа! 6S рРНК. Genetic identification of the strain was carried out using the analysis! 6S rRNA.
Консервативные праймеры для наработки 16S рДНК: Conservative primers for 16S rDNA production:
8f - aga gtt tga tcc tgg etc ag 8f - aga gtt tga tcc tgg etc ag
926r - ccg tea att cct ttr agt tt 926r - ccg tea att cct ttr agt tt
1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt 1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt
Таблица 11 Table 11
Гомология секвенированного фрагмента ДНК депонируемого штамма с предполагаемым видом и наиболее близкими видами: Homology of the sequenced DNA fragment of the deposited strain with the putative species and the closest species:
Distance Matrix
Figure imgf000024_0001
distance matrix
Figure imgf000024_0001
Исследуемый штамм Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ принадлежит к следующей систематической группе: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Анализ no RDP II 16S рРНК базе данных показал наилучшую гомологию с видами бактерий Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium pseudoIongum. The studied strain of Bifidobacterium infantis 73-15-BL belongs to the following systematic group: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Analysis of the no RDP II 16S rRNA database showed the best homology with the bacterial species Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium pseudoIongum.
По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (фиг.4). Таблица 12 According to the analysis was built phylogenetic tree with homologous strains (figure 4). Table 12
Sequence description
Figure imgf000025_0001
sequence description
Figure imgf000025_0001
Исследуемый штамм Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ относится к виду Bifidobacterium infantis. Вид Bifidobacterium infantis в настоящее время относят к виду Bifidobacterium longum subsp. infantis. По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК тестируемый штамм Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ можно отнести к виду Bifidobacterium longum subsp. infantis (97 %). The studied strain of Bifidobacterium infantis 73-15-BL belongs to the species Bifidobacterium infantis. The species Bifidobacterium infantis is currently referred to as Bifidobacterium longum subsp. infantis. According to the results of the analysis of sequences of 16S rDNA variable regions, the tested strain Bifidobacterium infantis 73-15-BL can be assigned to the species Bifidobacterium longum subsp. infantis (97%).
Выделение ДНК для ПЦР DNA isolation for PCR
PCR Protocols. A Guide to methods and applications. PCR protocols. A guide to methods and applications.
Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.
Условия ПЦР PCR conditions
Каталог MBI Fermentas 1998M999, 146-157. Catalog MBI Fermentas 1998M999, 146-157.
Pavlicek A et al «Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap^ ackknife analysis of tree robustness.» Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 199945(3) 97-9. Pavlicek A et al "Free-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap^ ackknife analysis of tree robustness." Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 199945(3) 97-9.
В результате получена нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium infantis 73-15 - БЛ SEQ ID NO: 4, идентичная таковой, представленной на машиночитаемом носителе. As a result, the nucleotide sequence of a fragment of the genome of the strain Bifidobacterium infantis 73-15 - BL SEQ ID NO: 4, identical to that presented on a machine-readable medium, was obtained.
Сведения о безопасности использования штамма: штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием геннотехнических методик; штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным. Information about the safety of using the strain: the strain is not genetically modified and does not contain genes from other organisms; transferred genes resistance; genetic changes associated with the use of genetic engineering techniques; the strain is not zoopathogenic and phytopathogenic.
5. Для получения штамма Bifidobacterium breve 79-119-БЛ проводилась селекция штамма Bifidobacterium breve 79-119-МБ, который депонирован 15.07.04 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под регистрационным № Ас- 1691. Исходный штамм Bifidobacterium breve 79-119-МБ защищен патентом РФ № 2261905. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных циклов лиофилизированной сушки и восстановления на указанной ранее питательной среде «Бифилайф М». 5. To obtain the strain Bifidobacterium breve 79-119-BL, the selection of the strain Bifidobacterium breve 79-119-MB was carried out, which was deposited on July 15, 2004 in the VKPM Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under registration No. Ac-1691. patent of the Russian Federation No. 2261905. Selection was carried out without the use of genetic modification methods by means of multiple cycles of lyophilized drying and recovery on the previously mentioned nutrient medium "Bifilife M".
Первичный посевной материал производственного штамма Bifidobacterium breve 79-119-МБ в объеме 5 % от объема среды культивирования вносили в вышеуказанную среду и культивировали при 37-38 °C 24 часа. Далее было проведено 30 циклов сушка- восстановление на питательной среде «Бифилайф М». The primary inoculum of the production strain Bifidobacterium breve 79-119-MB in a volume of 5% of the volume of the cultivation medium was introduced into the above medium and cultivated at 37-38°C for 24 hours. Then 30 drying-recovery cycles were carried out on the nutrient medium "Bifilife M".
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium breve 79-119- БЛ, который депонирован 16.11.2016 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под регистрационным № Ас- 2036. As a result of the selection, a strain of Bifidobacterium breve 79-119-BL was obtained, which was deposited on November 16, 2016 in the VKPM Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika of the Ministry of Education and Science under registration No. Ac-2036.
Культурально-морфологические и биологические признаки - клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с У-образными раздвоениями на одном или двух концах; неподвижные, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка образует колонии в виде комет. В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Факультативный анаэроб, оптимальная температура выращивания 37-38° С, pH 7,0±0,2. Cultural, morphological and biological characteristics - cells are gram-positive polymorphic rods with Y-shaped bifurcations at one or two ends; immobile, prone to the formation of clusters. In the hepatic environment Blaurokka forms colonies in the form of comets. In liquid nutrient media, it grows along the entire height of the volume, except for the zone of aerobiosis. Facultative anaerobe, optimum growing temperature 37-38°C, pH 7.0±0.2.
Сквашивает молоко с образованием плотного сгустка к 16-18 часам. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют. Ferment milk with the formation of a dense clot by 16-18 hours. Gas-forming ability, catalase-forming ability, gelatin liquefaction are absent.
Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 18 ч - 120° Т, к 24 ч- 140° Т. Штамм максимально накапливает микробную массу бифидобактерий к 18±2 ч культивирования, достигая в 1 мл 109КОЕ/мл. Acid-forming activity: when cultivated on sterile skimmed milk, titratable acidity reaches 120° T by 18 hours, 140° T by 24 hours. .
Штамм растет на используемых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее 1g 10,2 микробного числа за 16-18 ч культивирования. The strain grows on nutrient media used in production with biomass accumulation of at least 1g 10.2 microbial number for 16-18 hours of cultivation.
Штамм обладает выраженной антагонистической активностью к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 13 представлена антагонистическая активность к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов. The strain has a pronounced antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. Table 13 shows the antagonistic activity against some of the aforementioned microorganisms.
Антагонистическую активность моноштамма бифидобактерий определяли по зоне задержки роста тест-культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов. The antagonistic activity of a monostrain of bifidobacteria was determined by the zone of growth retardation of test cultures of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms by the method of perpendicular strokes.
Таблица 13 Table 13
Сравнительные данные антагонистической активности штаммов В. breve 79-119-Comparative data on the antagonistic activity of strains B. breve 79-119-
МБ и В. breve 79-119-БЛ
Figure imgf000027_0001
MB and V. breve 79-119-BL
Figure imgf000027_0001
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, вызывающим пищевые отравления. Analysis of the data in the table shows that the claimed strain has a higher antagonistic activity against the main test cultures that cause food poisoning.
Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5 %. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38° С. Determination of the level of resistance of the strain to antibiotics was carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium - sterile skimmed milk. Various concentrations of sterile solutions of antibiotics and a 16-hour culture of bifidobacteria in an amount of 5% were introduced into the nutrient medium. Stability was determined by the change in titratable acidity in the samples after 48 hours of incubation at a temperature of 37-38°C.
Кроме того, производственно-полезным признаком штамма В. breve 79-119-БЛ, отличающим его от штамма В. breve 79-119-МБ, является то, что выращенная в стационарных условиях на питательной среде «Бифилайф М» в объеме 300 см3 культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. Выявленная СОД- активность штамма В. breve 79-119-БЛ свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях как in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника на фоне антибиотикотерапии. У заявляемого штамма обнаружена выраженная антиоксидантная активность: супероксиддисмутазная активность штамма - 27,0 ед/мг белка микробной массы. In addition, a production-useful feature of the B. breve 79-119-BL strain, which distinguishes it from the B. breve 79-119-MB strain, is that it is grown under stationary conditions on a nutrient medium "Bifilife M" in a volume of 300 cm 3 culture has a pronounced superoxide dismutase activity. The detected SOD activity of the B. breve 79-119-BL strain indicates that the strain has a pronounced probiotic effect, which can manifest itself both in vivo and in vitro. The high activity of acid formation, the resistance of the strain to major antibiotics, contributes to the effective restoration of normal intestinal microflora against the background of antibiotic therapy. The claimed strain has a pronounced antioxidant activity: superoxide dismutase the activity of the strain is 27.0 units/mg of microbial mass protein.
Условия хранения заявляемого штамма. Storage conditions of the proposed strain.
Свежеприготовленный штамм В. breve 79-119-БЛ хранят на питательной среде с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатин, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при температуре 6-8 °C без потери активности в течение года. Freshly prepared strain B. breve 79-119-BL is stored on a nutrient medium with the addition of a protective medium containing sucrose, gelatin, sodium citrate, and freeze-dried in ampoules. The strain is well stored at a temperature of 6-8 °C without loss of activity during the year.
Генетическую идентификацию штамма осуществляли с помощью анализа 16S рРНК. Genetic identification of the strain was carried out using the analysis of 16S rRNA.
Консервативные праймеры для наработки 16S рДНК: Conservative primers for 16S rDNA production:
8f - aga gtt tga tcc tgg etc ag 8f - aga gtt tga tcc tgg etc ag
926r - ccg tea att cct ttr agt tt 926r - ccg tea att cct ttr agt tt
1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt 1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt
Таблица 14 Table 14
Гомология секвенированного фрагмента ДНК депонируемого штамма с предполагаемым видом и наиболее близкими видами: Homology of the sequenced DNA fragment of the deposited strain with the putative species and the closest species:
Distance Matrix
Figure imgf000028_0001
distance matrix
Figure imgf000028_0001
Исследуемый штамм Bifidobacterium breve 79-119-БЛ принадлежит к следующей систематической группе: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Анализ no RDP II 16S pPHK базе данных показал гомологию с тем же видом бактерий Bifidobacterium breve. The studied strain Bifidobacterium breve 79-119-BL belongs to the following systematic group: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Analysis of the no RDP II 16S pRNA database showed homology with the same bacterial species Bifidobacterium breve.
По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (фиг.5) According to the analysis was built phylogenetic tree with homologous strains (figure 5)
Таблица 15 Table 15
RDP ID Sequence description
Figure imgf000029_0001
RDP ID Sequence description
Figure imgf000029_0001
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК тестируемый штамм Bifidobacterium breve 79-119-БЛ можно отнести к виду Bifidobacterium breve (97 %). According to the results of the analysis of sequences of 16S rDNA variable regions, the tested strain Bifidobacterium breve 79-119-BL can be attributed to the species Bifidobacterium breve (97%).
Выделение ДНК для ПЦР DNA isolation for PCR
PCR Protocols. A Guide to methods and applications. PCR protocols. A guide to methods and applications.
Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.
Условия ПЦР PCR conditions
Каталог MBI Fermentas 1998M999, 146-157. Catalog MBI Fermentas 1998M999, 146-157.
Pavlicek A et al «Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap^ ackknife analysis of tree robustness.» Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 199945(3) 97-9. Pavlicek A et al "Free-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap^ ackknife analysis of tree robustness." Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 199945(3) 97-9.
В результате получена нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium breve 79-119 - БЛ SEQ ID NO: 5, идентичная таковой, представленной на машиночитаемом носителе. Сведения о безопасности использования штамма: штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием геннотехнических методик; штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным. As a result, the nucleotide sequence of a fragment of the genome of the strain Bifidobacterium breve 79-119 - BL SEQ ID NO: 5, identical to that presented on a machine-readable medium, was obtained. Information about the safety of using the strain: the strain is not genetically modified and does not contain genes from other organisms; transferred resistance genes; genetic changes associated with the use of genetic engineering techniques; the strain is not zoopathogenic and phytopathogenic.
Получение консорциума и его характеристики Obtaining a consortium and its characteristics
1-й пассаж - Каждый штамм лиофилизированных монокультур Bifidobacterium bifidum 791 -БЛ, Bifidobacterium longum В 379М-БЛ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513- БЛ, Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, Bifidobacterium breve 79-119-БЛ ресуспендируют на питательной среде «Бифилайф М» до восьмой пробирки с последующим инкубированием при температуре 37-38 °C в течение 48 часов. 1st passage - Each strain of lyophilized monocultures of Bifidobacterium bifidum 791-BL, Bifidobacterium longum B 379M-BL, Bifidobacterium adolescentis G 7513-BL, Bifidobacterium infantis 73-15-BL, Bifidobacterium breve 79-119-BL is resuspended on a nutrient medium "Bifilife M» to the eighth tube, followed by incubation at a temperature of 37-38 °C for 48 hours.
2-й пассаж - Полученные культуры каждого штамма из пробирок 10'7 и 10'8 (в посевной дозе 5 % от объема питательной среды «Бифилайф М») инокулируют в отдельные емкости. Время культивирования определяется в соответствии с длительностью экспоненциальной фазы роста каждого из них. 2nd passage - The resulting cultures of each strain from test tubes 10' 7 and 10' 8 (at a seed dose of 5% of the volume of the nutrient medium "Bifilife M") are inoculated into separate containers. The cultivation time is determined in accordance with the duration of the exponential growth phase of each of them.
3-й пассаж - Засев инокулятов монокультур в ферментер производится поэтапно в количестве 3-5 % каждого штамма от объема питательной среды. Процесс совместного культивирования длится 10-12 часов, pH готовой биомассы составляет 4, 6-5, 2. К полученной биомассе добавляют защитные среды (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не выше минус 45° С, лиофилизируют, получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г. Консорциум хорошо хранится при температуре 6-8 °C без потери активности в течение одного года. 3rd passage - Sowing of inoculums of monocultures into the fermenter is carried out in stages in the amount of 3-5% of each strain of the volume of the nutrient medium. The process of co-cultivation lasts 10-12 hours, the pH of the finished biomass is 4, 6-5, 2. Protective media (sucrose-gelatin, skim milk) are added to the resulting biomass, the suspension is frozen at a temperature not higher than minus 45 ° C, lyophilized, a dry concentrate is obtained with the content of bifidobacteria not less than 10 11 CFU/g. The consortium is well stored at a temperature of 6-8 °C without loss of activity within one year.
Созданный консорциум бифидобактерий показал высокую сочетаемость пяти штаммов бифидобактерий между собой. Совместное культивирование смешанной популяции всех пяти штаммов протекает существенно быстрее по сравнению с раздельным культивированием штаммов. The created consortium of bifidobacteria showed a high compatibility of five strains of bifidobacteria with each other. Co-cultivation of a mixed population of all five strains proceeds much faster compared to separate cultivation of strains.
Культурально-морфологические признаки микроорганизмов, входящих в консорциум - клетки штаммов микроорганизмов консорциума представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах, склонные к образованию скоплений. Спор не образуют. Морфология колоний неоднородна и зависит от входящих в консорциум штаммов, сохраняя признаки каждого из них в совокупной культуре. В жидких и полужидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов, входящих в консорциум.Cultural and morphological features of microorganisms included in the consortium - cells of strains of microorganisms of the consortium are gram-positive polymorphic rods with a bifurcation or thickening at 1-2 ends, prone to the formation of clusters. Dispute does not form. The morphology of the colonies is heterogeneous and depends on the strains included in the consortium, retaining the characteristics of each of them in the total culture. In liquid and semi-liquid nutrient media, they grow along the entire height of the volume, except for the aerobiosis zone. Physiological and biochemical characteristics of microorganisms included in the consortium.
Факультативные анаэробы. Оптимальная температура выращивания 37-38° С, pH питательных сред - 7,0±0,2. Каталазу не образуют, разжижение желатины отсутствует. Ферментативная активность отдельных штаммов и консорциума по данным ANAEROtest-23 представлена в таблице 16. В качестве иллюстрации в таблице представлено, как расширяется спектр ферментативной активности штаммов при совместном культивировании: увеличивается число усвоенных субстратов. facultative anaerobes. The optimum growing temperature is 37-38°C, the pH of nutrient media is 7.0±0.2. Catalase is not formed, there is no liquefaction of gelatin. The enzymatic activity of individual strains and the consortium according to ANAEROtest-23 data is presented in Table 16. As an illustration, the table shows how the spectrum of enzymatic activity of strains expands during co-cultivation: the number of assimilated substrates increases.
Таблица 16 Table 16
Ферментативная активность штаммов бифидобактерий при раздельном и совместном культивировании по данным ANAEROtest-23.
Figure imgf000031_0001
Enzymatic activity of bifidobacteria strains during separate and joint cultivation according to ANAEROtest-23 data.
Figure imgf000031_0001
Примечание: (+) -ферментирует; (-) - не ферментирует; (±) - вариабельно; 0 - нет данных. Кислотообразующая активность: к 24 ч - — 150° Т, к 72 ч — 180° Т (на питательной среде «Бифилайф М»), на гидролизатно-молочной среде - до 140-160 0 Т и 170-190° Т, соответственно. Note: (+) -ferments; (-) - does not ferment; (±) - variable; 0 - no data. Acid-forming activity: by 24 hours - - 150 ° T, by 72 hours - 180 ° T (on the nutrient medium "Bifilife M"), on the hydrolyzate-milk medium - up to 140-160 0 T and 170-190 ° T, respectively.
Консорциум активно размножается на средах разного состава. In vitro на стандартных питательных средах, при температуре Т 37° С консорциум накапливает биомассу до высокой концентрации пробиотических микроорганизмов - 1011 КОЕ в 1г биомассы за счет отсутствия взаимного ингибирования отдельных штаммов. ( Фиг 6)The consortium actively reproduces on media of different composition. In vitro on standard nutrient media, at a temperature of T 37° C, the consortium accumulates biomass to a high concentration of probiotic microorganisms - 10 11 CFU per 1 g of biomass due to the absence of mutual inhibition of individual strains. (Fig 6)
Максимальный титр бифидобактерий консорциума в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов к 22 ч составляет 2x1010 КОЕ/мл, на кукурузно-лактозной среде к 20 ч составляет 2x1010 КОЕ/мл, на питательной среде «Бифилайф М» после лиофилизации получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г. The maximum titer of bifidobacteria of the consortium in sterile skimmed milk without growth factors by 22 hours is 2x10 10 CFU / ml, on corn-lactose medium by 20 hours it is 2x10 10 CFU / ml, on the nutrient medium "Bifilife M" after lyophilization, a dry concentrate is obtained containing bifidobacteria not less than 10 11 CFU/g.
Бифидобактерии консорциума способны утилизировать свободные аминокислоты в стерильном обезжиренном молоке, такие как: валин, метионин, аланин, аргинин, изолейцин, глицин. Bifidobacteria of the consortium are able to utilize free amino acids in sterile skimmed milk, such as: valine, methionine, alanine, arginine, isoleucine, glycine.
Консорциум проявляет антагонистическую активность к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Escherichia coli, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Shigella fexneri, Candida albicans, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 17 представлена антагонистическая активность к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов. The consortium exhibits antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms: Escherichia coli, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Shigella fexneri, Candida albicans, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. Table 17 shows antagonistic activity against some of the aforementioned microorganisms.
Антагонистическую активность консорциума штаммов бифидобактерий определяли методом развивающихся смешанных популяций при совместном выращивании с патогенными микроорганизмами по зоне задержки роста тест-культур методом перпендикулярных штрихов. The antagonistic activity of a consortium of bifidobacteria strains was determined by the method of developing mixed populations in co-cultivation with pathogenic microorganisms in the growth retardation zone of test cultures by the method of perpendicular strokes.
Синергидный эффект консорциума проявляется также в большей антагонистической активности консорциума по сравнению с прототипом. The synergistic effect of the consortium is also manifested in the greater antagonistic activity of the consortium compared to the prototype.
Таблица 17
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
Table 17
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый консорциум оказывает наибольшее антагонистическое действие на основные тест-культуры, вызывающие пищевые отравления. Analysis of the table data shows that the claimed consortium has the greatest antagonistic effect on the main test cultures that cause food poisoning.
Определение уровней устойчивости штаммов бифидобактерий к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде для каждого штамма в отдельности. В качестве питательной среды использовали стерильное обезжиренное молоко. Determination of levels of resistance of strains of bifidobacteria to antibiotics was carried out by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium for each strain separately. Sterile skimmed milk was used as a nutrient medium.
В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовые культуры бифидобактерий в количестве 5 % от питательной среды. В контрольный образец вносили только биомассу изучаемого штамма бифидобактерий. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38° С. Штамм устойчив к антибиотикам, когда разница между титруемой кислотностью в контрольном и опытном образцах составляет не более 30° Т. Various concentrations of sterile solutions of antibiotics and 16-hour cultures of bifidobacteria were introduced into the nutrient medium in an amount of 5% of the nutrient medium. Only the biomass of the studied strain of bifidobacteria was added to the control sample. Stability was determined by the change in titratable acidity in the samples after 48 hours of incubation at a temperature of 37-38°C. Strain resistant to antibiotics, when the difference between the titratable acidity in the control and experimental samples is no more than 30 ° T.
В таблице 18 представлена устойчивость к антибиотикам отдельных штаммов заявляемого консорциума. Table 18 shows the resistance to antibiotics of individual strains of the proposed consortium.
Таблица 18 Table 18
Устойчивость к антибиотикам штаммов бифидобактерий, составляющих заявляемый консорциум
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Antibiotic resistance of strains of bifidobacteria that make up the proposed consortium
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Анализ полученных данных свидетельствует о том, что штаммы бифидобактерий устойчивы к наибольшим концентрациям следующих антибиотиков: Analysis of the data obtained indicates that the strains of bifidobacteria are resistant to the highest concentrations of the following antibiotics:
В. bifidum 791-БЛ - к амикацину, ампициллину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, линкомицину, тетрациклину, сульфадимидину, стрептомицину; B. bifidum 791-BL - to amikacin, ampicillin, benzylpenicillin, gentamicin, kanamycin, lincomycin, tetracycline, sulfadimidine, streptomycin;
В. longum В379М-БЛ - к амикацину, ампициллину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, линкомицину, олеандомицину, офлаксацину, стрептомицину, тетрациклину, сульфадимидину, бензатина бензилпенициллину. B. longum V379M-BL - to amikacin, ampicillin, benzylpenicillin, gentamicin, kanamycin, lincomycin, oleandomycin, ofloxacin, streptomycin, tetracycline, sulfadimidine, benzathine benzylpenicillin.
В. adolescentis Г7513-БЛ - к амикацину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, гентамицину, линкомицину, олеандомицину, тетрациклину, офлаксацину, сульфадимидину, стрептомицину, бензатина бензилпенициллину. B. adolescentis G7513-BL - to amikacin, ampicillin, benzylpenicillin, kanamycin, gentamicin, lincomycin, oleandomycin, tetracycline, ofloxacin, sulfadimidine, streptomycin, benzathine benzylpenicillin.
В. infantis 73-15-БЛ - к амикацину, ампициллину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, тетрациклину, линкомицину, сульфадимидину, стрептомицину. B. infantis 73-15-BL - to amikacin, ampicillin, benzylpenicillin, gentamicin, kanamycin, tetracycline, lincomycin, sulfadimidine, streptomycin.
В. breve 79-119-БЛ - к амикацину, ампициллину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, линкомицину, тетрациклину, сульфадимидину, стрептомицину. B. breve 79-119-BL - to amikacin, ampicillin, benzylpenicillin, gentamicin, kanamycin, lincomycin, tetracycline, sulfadimidine, streptomycin.
Аналогичное исследование в отношении заявленного консорциума бифидобактерий показало, что он обладает устойчивостью, по крайней мере, к 12-ти антибиотикам: амикацину, тетрациклину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, офлаксацину, сульфадимидину, стрептомицину, ампициллину, линкомицину, олеандомицину и бензатина бензилпенициллину. A similar study on the claimed consortium of bifidobacteria showed that it was resistant to at least 12 antibiotics: amikacin, tetracycline, benzylpenicillin, gentamicin, kanamycin, ofloxacin, sulfadimidine, streptomycin, ampicillin, lincomycin, oleandomycin and benzathine benzylpenicillin.
Способность консорциума пяти штаммов бифидобактерий Bifidobacteruim bifidum 791-БЛ, Bifidobacterium longum В 379М-БЛ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513- БЛ, Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, Bifidobacterim breve 79-119-БЛ активно накапливать микробную биомассу на различных питательных средах за 20-22 ч выращивания, высокая антибиотическая и супероксиддисмутазная активность с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность консорциума не ниже 37 ед/мг белка микробной массы, проявляемая специфическая активность позволили использовать консорциум в приготовлении ферментированных, неферментированных пищевых продуктов, БАД, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств. The ability of a consortium of five strains of bifidobacteria Bifidobacteruim bifidum 791-BL, Bifidobacterium longum B 379M-BL, Bifidobacterium adolescentis G 7513-BL, Bifidobacterium infantis 73-15-BL, Bifidobacterim breve 79-119-BL to actively accumulate microbial biomass on various nutrient media for 20 -22 hours of cultivation, high antibiotic and superoxide dismutase activity with pronounced antioxidant activity: the superoxide dismutase activity of the consortium is not lower than 37 units / mg of microbial mass protein, the specific activity exhibited made it possible to use the consortium in the preparation of fermented, non-fermented food products, dietary supplements, bifid-containing preparations, cosmetic and hygiene products.
Проведенные исследования показали, что при совместном культивировании консорциума бифидобактерий на питательной среде «Бифилайф М» отмечается более активное развитие биомассы бифидобактерий в консорциуме по сравнению с раздельным культивированием и не происходит взаимного ингибирования культур (таблица 19). The conducted studies have shown that with the joint cultivation of a consortium of bifidobacteria on the nutrient medium "Bifilife M", a more active development of the biomass of bifidobacteria in the consortium is noted in comparison with separate cultivation and there is no mutual inhibition of cultures (Table 19).
Таблица 19 Table 19
Сравнительные данные монокультур и консорциума бифидобактерий
Figure imgf000036_0001
Comparative data of monocultures and a consortium of bifidobacteria
Figure imgf000036_0001
Консорциум можно культивировать на различных питательных средах со стабильно высокими показателями КОЕ/мл пробиотических микроорганизмов и продуцируемых органических кислот. Результаты культивирования представлены в таблице 20. The consortium can be cultured on various nutrient media with consistently high CFU/ml of probiotic microorganisms and produced organic acids. The culture results are shown in Table 20.
Таблица 20 Table 20
Результаты культивирования консорциума на разных питательных средах
Figure imgf000036_0002
Figure imgf000037_0001
The results of cultivation of the consortium on different nutrient media
Figure imgf000036_0002
Figure imgf000037_0001
Полученный консорциум и штаммы, входящие в состав консорциума могут быть использованы в качестве биологически активного начала пробиотической направленности при производстве пищевых продуктов, продуктов функционального питания, продуктов диетического (лечебного и профилактического) питания, биологически активных добавок (БАД), косметических, гигиенических средств, медицинских и ветеринарных препаратов. The resulting consortium and the strains included in the consortium can be used as a biologically active principle of probiotic orientation in the production of food products, functional foods, dietary (therapeutic and preventive) foods, biologically active additives (BAA), cosmetics, hygiene products, medical products. and veterinary drugs.
При этом повышается биологическая ценность продуктов функционального питания и препаратов, изготовленных на его основе. Употребление в пищу продуктов, изготовленных с применением заявленного консорциума, способствует колонизации слизистой кишечника, вытеснению патогенной и условно-патогенной микрофлоры, нормализации кислотности, коррекции кишечного дисбиоза, и восстановлению нормальной микрофлоры. At the same time, the biological value of functional food products and preparations made on its basis increases. Eating products made using the claimed consortium contributes to the colonization of the intestinal mucosa, the displacement of pathogenic and opportunistic microflora, the normalization of acidity, the correction of intestinal dysbiosis, and the restoration of normal microflora.
Использование заявленного консорциума и штаммов, входящих в состав консорциума в производстве ферментированных, неферментированных пищевых продуктов, БАД, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств - кремов, салфеток, лосьонов тампонов, питательных масок, женских прокладок, мыла, косметического молочка обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств. The use of the claimed consortium and the strains that make up the consortium in the production of fermented, non-fermented food products, dietary supplements, bifid-containing preparations, cosmetic and hygiene products - creams, wipes, tampon lotions, nourishing masks, feminine pads, soap, cosmetic milk provides a probiotic and bacteriological effect , contributes to the restoration of the normal microflora of the skin and mucous membranes, and is also aimed at expanding the arsenal of similar tools.
Реализация назначения заявляемого консорциума бифидобактерий представлена на следующих примерах. The implementation of the appointment of the proposed consortium of bifidobacteria is presented in the following examples.
Пример 1. Использование предлагаемого консорциума штаммов бифидобактерий в составе закваски для приготовления кисломолочных продуктов. Example 1. The use of the proposed consortium of strains of bifidobacteria in the composition of the starter for the preparation of fermented milk products.
Получают консорциум следующим образом. Get the consortium as follows.
1-ый пассаж - Каждый штамм лиофилизированных монокультур Bifidobacterium bifidum 791-БЛ, Bifidobacterium longum В 379М-БЛ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513- БЛ, Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, Bifidobacterium breve 79-119-БЛ ресуспендируют до восьмой пробирки на питательной среде «Бифилайф М» с последующим инкубированием при температуре 37-38° С в течение 48 часов. 1st passage - Each strain of lyophilized monocultures of Bifidobacterium bifidum 791-BL, Bifidobacterium longum B 379M-BL, Bifidobacterium adolescentis G 7513-BL, Bifidobacterium infantis 73-15-BL, Bifidobacterium breve 79-119-BL is resuspended up to the eighth tube per feeder medium "Bifilife M" followed by incubation at a temperature of 37-38 ° C for 48 hours.
2-ой пассаж- Полученные культуры каждого штамма из пробирок разведения 10'7 и 10'8 (в посевной дозе 5 % от объема питательной среды «Бифилайф М») инокулируют в отдельные емкости. Время культивирования определяется в соответствии с длительностью экспоненциальной фазы роста каждого из них. 2nd passage - The resulting cultures of each strain from dilution tubes 10' 7 and 10' 8 (in an inoculation dose of 5% of the volume of the nutrient medium "Bifilife M") are inoculated into separate containers. The cultivation time is determined in accordance with the duration of the exponential growth phase of each of them.
3-ий пассаж - засев инокулятов монокультур в ферментер производится поэтапно в количестве 3-5 % каждого штамма от объема питательной среды. Процесс совместного культивирования длится 10-12 часов. pH готовой биомассы составляет 4, 6-5, 2. 3rd passage - inoculation of inoculums of monocultures into the fermenter is carried out in stages in the amount of 3-5% of each strain of the volume of the nutrient medium. The process of co-cultivation lasts 10-12 hours. The pH of the finished biomass is 4.6-5.2.
Биомассу консорциума бифидобактерий, полученную как показано выше, в объеме не более 5 % (от объема молока) вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают. The biomass of the consortium of bifidobacteria, obtained as shown above, in a volume of not more than 5% (of the volume of milk) is introduced into sterile milk and cultivated until a clot is formed, which is poured into containers and cooled.
Пример 2. Использование консорциума штаммов бифидобактерий в составе БАД. Example 2. The use of a consortium of strains of bifidobacteria in the composition of dietary supplements.
В биомассу консорциума бифидобактерий, полученную как показано в примере 1, вносят различные бифидогенные факторы, способствующие стабилизации свойств культуры и лучшей приживаемости штамма в организме. Концентрат, разлитый в емкости, можно непосредственно использовать в качестве БАД лечебнопрофилактического действия. In the biomass of the consortium of bifidobacteria, obtained as shown in example 1, make various bifidogenic factors that help stabilize the properties of the culture and better survival of the strain in the body. The concentrate, poured into containers, can be directly used as a dietary supplement with a therapeutic and prophylactic effect.
Можно получить сухую биологически активную добавку, для этого к биомассе, полученной по Примеру 1 добавляют защитные среды (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не выше минус 45 °C, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г, который можно использовать в качестве биологически активной добавки, внося ее в пищевое сырье непосредственно перед употреблением. You can get a dry biologically active additive, for this, protective media (sucrose-gelatin, skim milk) are added to the biomass obtained according to Example 1, the suspension is frozen at a temperature not exceeding minus 45 ° C, lyophilized, sealed and a dry concentrate is obtained with a content of bifidobacteria of at least 10 11 CFU/g, which can be used as a biologically active additive by adding it to food raw materials immediately before use.
Пример 3. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения бифидосодержащего медицинского препарата. Example 3. Use of a consortium of strains of bifidobacteria to obtain a bifid-containing medical preparation.
В биомассу консорциума бифидобактерий, полученную согласно Примеру 1, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким титром бифидобактерий, добавляют защитные среды (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко). Полученную суспензию замораживают при температуре не выше минус 45° С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г, который можно использовать в качестве бифидосодержащего медицинского препарата. In the biomass of the consortium of bifidobacteria obtained according to Example 1, which is a liquid concentrate with a high titer of bifidobacteria, protective media (sucrose gelatin, skim milk) are added. The resulting suspension is frozen at a temperature not exceeding minus 45°C, lyophilized, sealed and a dry concentrate is obtained with a bifidobacteria content of at least 10 11 CFU/g, which can be used as a bifid-containing medical product.
Пример 4. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения кваса или сока. Example 4. Use of a consortium of strains of bifidobacteria to produce kvass or juice.
Биомассу консорциума бифидобактерий, полученную согласно Примеру 1, в объеме не более 5 % от объема нормализованной смеси (квас или сок) вносят в хлебный квас или сок после их пастеризации из расчета, чтобы содержание бифидобактерий в 1 мл кваса или сока составило не менее 107 КОЕ/мл. Квас или сок охлаждают и употребляют без последующего брожения. The biomass of the consortium of bifidobacteria obtained according to Example 1, in in a volume of not more than 5% of the volume of the normalized mixture (kvass or juice) is added to bread kvass or juice after pasteurization so that the content of bifidobacteria in 1 ml of kvass or juice is at least 10 7 CFU / ml. Kvass or juice is cooled and consumed without subsequent fermentation.
Пример 5. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения косметического средства. Example 5. Use of a consortium of strains of bifidobacteria to obtain a cosmetic product.
Биомассу консорциума бифидобактерий, полученную согласно Примеру 1, разрушают нагреванием в автоклаве или осуществляют мембранную фильтрацию. Полученные биологически активные компоненты охлаждают и смешивают с кремовой основой в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема. The biomass of the consortium of bifidobacteria obtained according to Example 1 is destroyed by heating in an autoclave or membrane filtration is carried out. The resulting biologically active components are cooled and mixed with a cream base in a ratio of 1:2-1:20, depending on the purpose of the cream being produced.
Пример 6. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства варено-копченых колбас. Example 6. Use of a consortium of strains of bifidobacteria for the production of cooked smoked sausages.
Биомассу консорциума бифидобактерий, полученную согласно Примеру 1, в объеме не более 5 % от объема фарша вносят в приготовленный колбасный фарш после добавления соли, пряностей и раствора нитрита натрия. После формования колбасные батоны направляют на осадку, которая осуществляется на рамах при температуре 22° С, влажности 90 %. Продолжительность осадки 6 часов. Варка и копчение осуществляются по стандартной технологии. The biomass of the consortium of bifidobacteria obtained according to Example 1, in a volume of not more than 5% of the minced meat volume, is added to the prepared sausage minced meat after adding salt, spices and sodium nitrite solution. After shaping, sausage sticks are sent to the draft, which is carried out on frames at a temperature of 22 ° C, humidity 90%. Rainfall duration 6 hours. Cooking and smoking are carried out according to standard technology.
Пример 7. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства сырокопченых колбас. Example 7. Use of a consortium of strains of bifidobacteria for the production of raw smoked sausages.
Консорциум бифидобактерий в сухом виде, полученный по Примеру 2, предварительно восстанавливают в кипяченой охлажденной воде при температуре 37° С, либо активизируют на стерильном коровьем обезжиренном молоке при температуре 37° С в течение 8-10 часов до кислотности 60-65° Т. Полученную биомассу консорциума бифидобактерий вносят в приготовленный колбасный фарш, при этом дозировка вносимого восстановленного консорциума составляет 0,1 -0,2 % от массы фарша, а дозировка активизированного консорциума составляет 2-5 % от массы фарша. Затем обогащенное колбасное сырье обрабатывается по традиционной схеме согласно технологии получения сырокопченых колбас. The consortium of bifidobacteria in dry form, obtained according to Example 2, is preliminarily restored in boiled chilled water at a temperature of 37 ° C, or activated in sterile cow's skimmed milk at a temperature of 37 ° C for 8-10 hours to an acidity of 60-65 ° T. the biomass of the consortium of bifidobacteria is introduced into the prepared sausage mince, while the dosage of the introduced reduced consortium is 0.1-0.2% of the mince mass, and the dosage of the activated consortium is 2-5% of the mince mass. Then enriched sausage raw materials are processed according to the traditional scheme according to the technology for producing raw smoked sausages.
Пример 8. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства обогащенной сухой детской молочной смеси. Example 8 Use of a consortium of bifidobacteria strains for the production of fortified dry infant formula.
Небольшое количество сухой молочной смеси тщательно перемешивают с сухим концентратом консорциума бифидобактерий, полученным согласно Примеру 2 с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г из расчета не менее 100 г концентрата на 1 т сухой молочной смеси. Затем всю оставшуюся партию молочной смеси тщательно перемешивают с обогащенной сухой молочной смесью для достижения содержания бифидобактерий не менее 107 КОЕ /г. A small amount of dry milk mixture is thoroughly mixed with a dry concentrate of a consortium of bifidobacteria obtained according to Example 2 with a bifidobacteria content of at least 10 11 CFU / g based on at least 100 g of concentrate per 1 ton of dry milk formula. Then, the entire remaining batch of the milk mixture is thoroughly mixed with enriched dry milk mixture to achieve a content of bifidobacteria of at least 10 7 CFU / g.
Пример 9. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства обогащенного пива. Example 9 Use of a consortium of bifidobacteria strains to produce fortified beer.
К 1 тонне слабоалкогольного пива добавляют 100 г биомассы консорциума, полученного по Примеру 2 и тщательно перемешивают. Титр бифидобактерий в готовом пиве составляет не менее 107 КОЕ/мл. Вкус, цвет, пенообразование и другие характеристики пива не изменяются. To 1 ton of low-alcohol beer add 100 g of the biomass of the consortium obtained according to Example 2 and mix thoroughly. The titer of bifidobacteria in the finished beer is at least 10 7 CFU/ml. The taste, color, foaming and other characteristics of the beer do not change.
Пример 10. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства мороженого. Example 10 Use of a consortium of bifidobacteria strains for the production of ice cream.
Для получения мороженого в молоко вносят сливки, полученную смесь нагревают до температуры 35° С, вносят сухие ингредиенты: сахар-песок, стабилизатор, нагревают до температуры 85° С, гомогенизируют, охлаждают до температуры 6° С, вносят сухой бактериальный концентрат консорциума бифидобактерий, полученный согласно Примеру 2 с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г в количестве 1- 5 % к массе смеси. To obtain ice cream, cream is added to milk, the resulting mixture is heated to a temperature of 35 ° C, dry ingredients are added: granulated sugar, a stabilizer, heated to a temperature of 85 ° C, homogenized, cooled to a temperature of 6 ° C, a dry bacterial concentrate of a consortium of bifidobacteria is added, obtained according to Example 2 with a content of bifidobacteria of at least 10 11 CFU / g in the amount of 1-5% by weight of the mixture.
Пример 11. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства кормовой добавки в животноводстве и птицеводстве. Example 11. The use of a consortium of strains of bifidobacteria for the production of feed additives in animal husbandry and poultry farming.
Для приготовления 100 кг биологически активной кормовой добавки сухой бактериальный концентрат консорциума бифидобактерий, полученный согласно Примеру 2, с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г добавляют в количестве 0,01% - 1 % к массе основного корма и тщательно перемешивают. To prepare 100 kg of a biologically active feed additive, a dry bacterial concentrate of a consortium of bifidobacteria, obtained according to Example 2, with a bifidobacteria content of at least 10 11 CFU / g, is added in an amount of 0.01% - 1% to the mass of the main feed and mixed thoroughly.
Пример 12. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства зубной пасты. Example 12 Use of a consortium of bifidobacteria strains for the production of toothpaste.
Сухой бактериальный концентрат консорциума бифидобактерий, полученный согласно Примеру 2, с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г, вводят в состав зубной пасты из расчета 0,01 г бактериального концентрата на 100 г пасты. Dry bacterial concentrate of a consortium of bifidobacteria, obtained according to Example 2, with a bifidobacteria content of at least 10 11 CFU/g, is added to the toothpaste at the rate of 0.01 g of bacterial concentrate per 100 g of paste.
Пример 13. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства мягкого сычужного сыра. Example 13 Use of a consortium of bifidobacteria strains for the production of soft rennet cheese.
Нормализованное молоко, подвергают тепловой обработке при температуре 74- 76° С в течение 1-5 мин и охлаждают до температуры заквашивания 37-38° С, вносят 40 %-ный водный раствор хлористого кальция из расчета 50 мл на 100 кг молока, 1 % сухого бактериального концентрата консорциума бифидобактерий, полученного согласно Примеру 2, с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г. Смесь перемешивают и вносят раствор молокосвертывающего фермента из расчета 1,0- 1,2 г на 100 кг молока, затем осуществляют свертывание. Последующее получение мягкого сыра осуществляют по стандартной технологии. Normalized milk is subjected to heat treatment at a temperature of 74-76 ° C for 1-5 minutes and cooled to a fermentation temperature of 37-38 ° C, a 40% aqueous solution of calcium chloride is added at the rate of 50 ml per 100 kg of milk, 1% dry bacterial concentrate of a consortium of bifidobacteria obtained according to Example 2, with a bifidobacteria content of at least 10 11 CFU/g. The mixture is stirred and a solution of a milk-clotting enzyme is added at the rate of 1.0-1.2 g per 100 kg of milk, then coagulation is carried out. The subsequent production of soft cheese is carried out according to standard technology.
Пример 14. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства рассольного зрелого сыра. Example 14 Use of a consortium of bifidobacteria strains for the production of brine mature cheese.
Свертывание молока проводят при температуре 32-34° С в течение 30-45 мин, вносят комбинированную закваску в количестве 1 ,0-2,0 %, состоящую из солеустойчивых чистых культур мезофильных молочнокислых стрептококков; консорциума бифидобактерий, полученного по Примеру 1 ; мезофильных молочнокислых палочек. Закваски бифидобактерий, стрептококков и мезофильных молочнокислых палочек готовят отдельно. Стрептококки, бифидобактерии и мезофильные молочнокислые палочки вносят в производственную закваску. Затем к полученной смеси добавляют хлористый кальций и сычужный фермент для получения сгустка. Последующее получение рассольного зрелого сыра осуществляют по стандартной технологии. Coagulation of milk is carried out at a temperature of 32-34 ° C for 30-45 minutes, a combined starter is added in the amount of 1.0-2.0%, consisting of salt-tolerant pure cultures of mesophilic lactic streptococci; a consortium of bifidobacteria obtained according to Example 1; mesophilic lactic acid bacilli. Starter cultures of bifidobacteria, streptococci and mesophilic lactobacilli are prepared separately. Streptococci, bifidobacteria and mesophilic lactic acid bacilli are added to the production starter. Then calcium chloride and rennet are added to the resulting mixture to obtain a clot. The subsequent production of brine mature cheese is carried out according to standard technology.
В результате заявленного изобретения получен консорциум на основе пяти селекционных штаммов бифидобактерий, более устойчивый к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта при прохождении бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте, что выражается в повышенной колонизирующей активности. Консорциум обладает выраженной антиоксидантной активностью и пробиотическим действием при отсутствии взаимного ингибирования отдельных штаммов. Заявляемый консорциум является высокотехнологичным, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки культивирования с высокой концентрацией пробиотических микроорганизмов - 1011 КОЕ/г As a result of the claimed invention, a consortium based on five breeding strains of bifidobacteria was obtained, which is more resistant to damaging factors of the aggressive environment of the gastrointestinal tract during the passage of bifidobacteria in the gastrointestinal tract, which is expressed in increased colonizing activity. The consortium has a pronounced antioxidant activity and probiotic action in the absence of mutual inhibition of individual strains. The proposed consortium is high-tech, accumulates biomass on nutrient media in a short period of cultivation with a high concentration of probiotic microorganisms - 10 11 CFU / g
Используемая методика отбора селекционных штаммов, предполагающая изучение их антибиотикорезистентности, культуральных, антагонистических, морфологических, физиолого-биохимических свойств и молекулярно-генетической идентификации, позволила создать консорциум, способный осуществлять коррекцию микроэкологических нарушений более эффективно и безопасно и расширить арсенал пробиотических средств. The method used for selecting breeding strains, which involves the study of their antibiotic resistance, cultural, antagonistic, morphological, physiological and biochemical properties and molecular genetic identification, made it possible to create a consortium capable of correcting microecological disorders more effectively and safely and expanding the arsenal of probiotic agents.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ CLAIM
1. Штамм бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791-БЛ, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2035 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1. 1. The strain of bifidobacteria Bifidobacterium bifidum 791-BL, used for the preparation of bifid-containing products, deposited in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2035 and containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
2. Штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum В379М-БЛ, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2037 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. 2. The Bifidobacterium longum B379M-BL strain used for the preparation of bifid-containing products, deposited in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2037 and containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
3. Штамм бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2038 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3. 3. The strain of bifidobacteria Bifidobacterium adolescentis G 7513-BL, used for the preparation of bifid-containing products, deposited in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2038 and containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
4. Штамм бифидобактерий Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2039 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4. 4. The strain of bifidobacteria Bifidobacterium infantis 73-15-BL, used for the preparation of bifid-containing products, deposited in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2039 and containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
5. Штамм бифидобактерий Bifidobacterium breve 79-119-БЛ, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2036 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5. 5. The strain of bifidobacteria Bifidobacterium breve 79-119-BL, used for the preparation of bifid-containing products, deposited in the VKPM Federal State Unitary Enterprise "GosNIIgenetika" under registration No. Ac-2036 and containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
6. Консорциум бифидобактерий, содержащий штаммы по пп. 1-5 и используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов. 6. A consortium of bifidobacteria containing strains according to paragraphs. 1-5 and used for the preparation of bifido-containing products.
PCT/RU2021/000582 2021-01-12 2021-12-17 Consortium of bifidobacteria and strains comprising said consortium WO2022154692A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021100360A RU2752891C1 (en) 2021-01-12 2021-01-12 Consortium of bifidobacterium used to prepare bifidobacterium products and strains that are part of consortium
RU2021100360 2021-01-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022154692A1 true WO2022154692A1 (en) 2022-07-21

Family

ID=77349058

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/000582 WO2022154692A1 (en) 2021-01-12 2021-12-17 Consortium of bifidobacteria and strains comprising said consortium

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2752891C1 (en)
WO (1) WO2022154692A1 (en)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044090A1 (en) * 1997-04-01 1998-10-08 Moskovsky Nauchno-Issledovatelsky Institut Epidemiologii I Mikrobiologii Imeni G.N.Gabrichevskogo Combining bifidus bacterial lines for making soured milk, unfermented food product and bacterial preparations
RU2261909C1 (en) * 2004-10-20 2005-10-10 Общество с ограниченной ответственностью "Мир биотехнологий (НПО)" BIFIDUS-BACTERIUM CONSORTIUM OF Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium breve USEFUL IN PREPARATION OF FERMENTED-MILK AND NONFERMENTED PRODUCTS, BIOACTIVE SUPPLEMENT, BIFIDOBACTERIA- CONTAINING PRODUCT, COSMETIC AND TOILETRY AGENTS
RU2264450C2 (en) * 2003-10-08 2005-11-20 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Biopreparation for adults useful in prophylaxis and treatment of dysbacteriosis and infective diseases of gastrointenstinal tract in human of 12 years old or more
RU2491331C1 (en) * 2012-05-14 2013-08-27 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Bifidobacterial and lactobacillary consortium for preparing bacterial preparations and dietary supplements for correcting gastrointestinal microflora in children under age of three, and method for preparing it, dietary supplement and bacterial preparation for treating dysbiotic gastrointestinal conditions in children under age of three

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044090A1 (en) * 1997-04-01 1998-10-08 Moskovsky Nauchno-Issledovatelsky Institut Epidemiologii I Mikrobiologii Imeni G.N.Gabrichevskogo Combining bifidus bacterial lines for making soured milk, unfermented food product and bacterial preparations
RU2264450C2 (en) * 2003-10-08 2005-11-20 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Biopreparation for adults useful in prophylaxis and treatment of dysbacteriosis and infective diseases of gastrointenstinal tract in human of 12 years old or more
RU2261909C1 (en) * 2004-10-20 2005-10-10 Общество с ограниченной ответственностью "Мир биотехнологий (НПО)" BIFIDUS-BACTERIUM CONSORTIUM OF Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium breve USEFUL IN PREPARATION OF FERMENTED-MILK AND NONFERMENTED PRODUCTS, BIOACTIVE SUPPLEMENT, BIFIDOBACTERIA- CONTAINING PRODUCT, COSMETIC AND TOILETRY AGENTS
RU2491331C1 (en) * 2012-05-14 2013-08-27 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Bifidobacterial and lactobacillary consortium for preparing bacterial preparations and dietary supplements for correcting gastrointestinal microflora in children under age of three, and method for preparing it, dietary supplement and bacterial preparation for treating dysbiotic gastrointestinal conditions in children under age of three

Also Published As

Publication number Publication date
RU2752891C1 (en) 2021-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1478246B1 (en) Dietetic and/or pharmaceutical compositions for human and/or animal use based on probiotic microbial preparations
JP2007518693A (en) Stable liquid probiotic composition, its preparation and application
TWI739495B (en) Composition for promoting defecation and use therefor
CN106470552B (en) Probiotic fortified food products and methods of manufacture
EA006509B1 (en) Consortium of bifidobacteria bifidobacterium bifidum 791-mb, bifidobacterium longum b 379m-mb, bifidobacterium adolescentis g 7513-mb, bifidobacterium infantis 73-15-mb, bifidobacterium breve 79-119-mb used for preparing sour milk, nonfermented products, biologically-active additives, bifido-containing preparations, cosmetic and hygiene agents
Araújo et al. Probiotics in dairy fermented products
WO2006073329A1 (en) Bifidobacterium lactis 668 strain used for ar a component for food products, starters, medicinal and cosmetic agents
RU2303058C2 (en) Agent "biobalans-k" for treatment of intestine infections complicated with dysbacteriosis
BG66937B1 (en) Association of probiotic lactic acid microorganisms for producing of dietary dairy products
RU2261908C1 (en) BIFIDUS-BACTERIUM STRAIN Bifidobacterium bifidum USEFUL IN PREPARATION OF FERMENTED-MILK AND NONFERMENTED PRODUCTS, BIOACTIVE SUPPLEMENT, BIFIDOBACTERIA-CONTAINING PRODUCT, COSMETIC AND TOILETRY AGENTS
RU2491336C1 (en) Bifidobacterial and lactobacillary consortium for preparing bacterial preparations and dietary supplements for correcting gastrointestinal microflora in individuals of fourteen and older, and method for preparing it, dietary supplement for correcting gastrointestinal microflora in individuals of fourteen and older and bacterial preparation for treating dysbiotic gastrointestinal conditions in individuals of fourteen and older
RU2752891C1 (en) Consortium of bifidobacterium used to prepare bifidobacterium products and strains that are part of consortium
RU2261904C1 (en) BIFIDUS-BACTERIUM STRAIN Bifidobacterium adolescentis USEFUL IN PREPARATION OF FERMENTED-MILK AND NONFERMENTED PRODUCTS, BIOACTIVE SUPPLEMENT, BIFIDOBACTERIA-CONTAINING PRODUCT, COSMETIC AND TOILETRY AGENTS
RU2307514C1 (en) Method for obtaining of fermented yogurt-type milk product
RU2273662C2 (en) Consortium of microorganisms with probiotic effect
JP2022157465A (en) Defecation promoter for infants
CN108464509B (en) Application of novel lactobacillus fermentum in food field
RU2180915C1 (en) Consortium of bifidobacteria and lactobacilli used for preparing bacterial preparations, ferments for fermented-milk foodstuffs, fermented and nonfermented foodstuffs, biologically active supplements designated for correction of microflora in children in age below 3 years
RU2376366C2 (en) Lactis acid bacillus strains syndicate and production method of biologically active additive or leaven for production of fermented milk products based on this syndicate
EA041668B1 (en) THE CONSORTIUM OF BIFIDOBACTERIA USED FOR THE PREPARATION OF BIFID-CONTAINING PRODUCTS AND THE STRAINS INCLUDED IN THE CONSORTIUM
RU2261907C1 (en) BIFIDUS-BACTERIUM STRAIN Bifidobacterium longum USEFUL IN PREPARATION OF FERMENTED-MILK AND NONFERMENTED PRODUCTS, BIOACTIVE SUPPLEMENT, BIFIDOBACTERIA-CONTAINING PRODUCT, COSMETIC AND TOILETRY AGENTS
RU2264450C2 (en) Biopreparation for adults useful in prophylaxis and treatment of dysbacteriosis and infective diseases of gastrointenstinal tract in human of 12 years old or more
RU2180914C1 (en) Consortium of bifidobacteria and lactobacilli used for preparing bacterial preparations, ferments for fermented-milk foodstuffs, fermented and nonfermented foodstuffs, biologically active supplements designated for correction of microflora in humans in age from 12 years and older
RU2180348C1 (en) Bifidobacterium and lactobacillus consortium used for preparing bacterial preparations, ferments for fermented-milk foodstuffs, fermented and nonfermented foodstuffs, biologically active supplements designated for correction of microflora in children of age from 3 to 12 years
RU2261906C1 (en) BIFIDUS-BACTERIUM STRAIN Bifidobacterium infantis USEFUL IN PREPARATION OF FERMENTED-MILK AND NONFERMENTED PRODUCTS, BIOACTIVE SUPPLEMENT, BIFIDOBACTERIA-CONTAINING PRODUCT, COSMETIC AND TOILETRY AGENTS

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21919977

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21919977

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1