WO2022154287A1 - 엔테로코쿠스 패슘 균에 대하여 용균활성을 갖는 항균단백질 efl200 - Google Patents
엔테로코쿠스 패슘 균에 대하여 용균활성을 갖는 항균단백질 efl200 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2022154287A1 WO2022154287A1 PCT/KR2021/019368 KR2021019368W WO2022154287A1 WO 2022154287 A1 WO2022154287 A1 WO 2022154287A1 KR 2021019368 W KR2021019368 W KR 2021019368W WO 2022154287 A1 WO2022154287 A1 WO 2022154287A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- efl200
- enterococcus
- antibacterial protein
- fasium
- infection
- Prior art date
Links
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 92
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 83
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 title abstract description 11
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 title description 8
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 claims abstract description 82
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 25
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 claims description 5
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 claims description 4
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 4
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- -1 antibiotic Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 10
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000520130 Enterococcus durans Species 0.000 description 2
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 206010014666 Endocarditis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 206010014889 Enterococcal infections Diseases 0.000 description 1
- 241001522957 Enterococcus casseliflavus Species 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000337007 Oceania Species 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 208000009361 bacterial endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 208000010217 blepharitis Diseases 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003340 calcium silicate Drugs 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 description 1
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 201000007119 infective endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000404 tripotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Definitions
- the present invention relates to Enterococcus fasium faecium ) relates to an antibacterial protein EFL200 having lytic activity against bacteria, and more particularly, has the ability to specifically lyse Enterococcus fasium bacteria, which can cause diseases by infecting animals, including humans, SEQ ID NO: By Enterococcus fasium bacteria containing the Enterococcus fasium species-specific antibacterial protein EFL200, and the Enterococcus fasium bacteria-specific antibacterial protein EFL200 as an active ingredient, comprising the amino acid sequence represented by 1. It relates to a pharmaceutical composition for treating induced infections and diseases, and a method for producing the antibacterial protein EFL200.
- Enterococcus ( Enterococci ) is a facultative anaerobic Gram-positive coli that resides in the gastrointestinal tract and urogenital system.
- Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis
- Enterococcus fasium Enterococcus faecium
- Enterococcus Durans Enterococcus Durans
- Enterococcus casseliflavus including about 19 species (Species) have been reported, and among them, the major bacterial species that actually cause infection are Enterococcus faecalis and Enterococcus fasium. can present
- infection by Enterococcus faecalis was very common, but recently, infection by Enterococcus faecium has been relatively increasing.
- Enterococcus is relatively weak and does not cause disease in normal people, but it causes various opportunistic infections such as urinary tract infections, wound infections, bacteremia, and endocarditis in the elderly, immunocompromised patients, chronic underlying diseases, or hospitalized patients.
- enterococci may induce infectious diseases by acquiring virus factors through gene hybridization from the outside. Among the infections caused by enterococci, urinary tract infection is the most frequent, followed by wound infection. Other major infections caused by enterococci may suggest endocarditis, and 5-20% of bacterial endocarditis is caused by enterococci.
- Enterococci are known to acquire new DNA (plasmid, transposons) or to acquire antibiotic resistance by using mutations.
- Enterococci which have acquired resistance to aminoglycosides, cause endocarditis or severe infections, it is difficult to succeed in treatment because they cannot be sterilized.
- VRE Vancomycin-Resistance Enterococci
- Vancomycin-resistant VRE was first reported in France in 1986, and VRE was first isolated in Korea in 1992. In the United States, since VRE was first isolated in 1988, according to NNIS (National Nosocomial Infection Surveillance) data, 1-15% of Enterococcus isolated between 1990-1997 were VRE, and 25% in 1999 and 2003 It is increasing at 28.5% per year. Recently, the appearance of VRE is increasing worldwide, not only in Europe and the United States, but also in Asia and Oceania including Korea. Accordingly, it is necessary to develop a drug that can be used to prevent or treat antibiotic-resistant enterococcal infection. In particular, it is very urgent to develop a pharmaceutical formulation that can provide a rapid therapeutic effect.
- NNIS National Nosocomial Infection Surveillance
- the present inventors provide an antibacterial protein capable of specifically lysing Enterococcus fasium bacteria, and further It contains as an active ingredient and provides a pharmaceutical composition that can be used to treat Enterococcus fasium infection, and further effectively treats Enterococcus fasium infection or disease using the pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition that can be used to treat Enterococcus fasium infection, and further effectively treats Enterococcus fasium infection or disease using the pharmaceutical composition
- an antibacterial protein EFL200 having an activity capable of specifically lysing Enterococcus fasium and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- Another object of the present invention is to provide a method for efficiently producing the antibacterial protein EFL200 having the activity to specifically lyse the Enterococcus fasium bacteria and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of Enterococcus fasium infection comprising the antibacterial protein EFL200 capable of specifically lysing the Enterococcus fasium bacteria as an active ingredient.
- Another object of the present invention is to provide a method for treating Enterococcus fasium infection or disease using a pharmaceutical composition comprising the antibacterial protein EFL200 as an active ingredient.
- Another object of the present invention is to provide a food composition comprising the antibacterial protein EFL200 as an active ingredient and a method for improving infection or disease of Enterococcus fasium using the same.
- the inventors of the present invention prepared various antibacterial protein candidates in the form of recombinant proteins by utilizing various antibacterial protein information known to have antibacterial activity against various bacterial species, and their lysis against Enterococcus fasium bacteria. Antibacterial proteins with excellent lytic activity were selected by examining their activity, and a method for efficiently manufacturing them was developed. The present invention was completed by developing a composition.
- the present invention provides an amino acid sequence of the antibacterial protein EFL200 capable of specifically lysing Enterococcus fasium bacteria.
- EFL200 an antibacterial protein capable of specifically lysing Enterococcus fasium, is composed of 284 amino acid residues and has a molecular weight of about 30.7 kDa.
- amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be partially modified by those skilled in the art using known techniques. Such modifications include partial substitutions of amino acid sequences, partial additions of amino acid sequences, and partial deletions of amino acid sequences. However, it is most preferable to apply the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 disclosed in the present invention mutatis mutandis.
- the present invention provides a strain TOP10-EFL200 that can be used for the production of the antibacterial protein EFL200 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- the strain TOP10-EFL200 is a strain prepared to produce the antibacterial protein EFL200 by transforming E. coli using a plasmid containing the gene sequence of SEQ ID NO: 2 prepared by the present inventors.
- This E. coli TOP10-EFL200 was deposited at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resources Center on November 10, 2020 by the present inventors (accession number KCTC 14364BP).
- the term "gene” has a meaning comprehensively including DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic building blocks of genes, are natural nucleotides as well as modified sugars or base sites. Also includes analogs ( Chemical Reviews 90:543-584, 1990).
- the present invention is Enterococcus fasium bacteria characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and comprising the antibacterial protein EFL200 having a specific lytic ability against Enterococcus fasium bacteria as an active ingredient.
- a pharmaceutical composition that can be effectively used for treatment of infection or disease.
- the antibacterial protein EFL200 having a specific lytic ability against Enterococcus fasium, characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to the present invention, contained in the pharmaceutical composition of the present invention is Enterococcus fasium as described above. Because it specifically lyses, it shows an effect in the treatment of various diseases caused by Enterococcus fasium bacteria. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be utilized for the treatment of diseases caused by Enterococcus fasium bacteria. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention is implemented as an antibiotic, disinfectant, bactericide, therapeutic agent, etc., can be utilized for the treatment of various diseases caused by Enterococcus fasium bacteria.
- the present invention provides an antibacterial protein EFL200 specific to Enterococcus fasium, characterized in that it has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and various types caused by Enterococcus fasium.
- an antibacterial protein EFL200 specific to Enterococcus fasium characterized in that it has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and various types caused by Enterococcus fasium.
- a method of treating various diseases caused by Enterococcus fasium by administering to a subject having a disease.
- disease caused by Enterococcus fasium refers to a disease caused by Enterococcus fasium infection, including urinary tract infection, wound infection, bacteremia, endocarditis, and the like, but is not limited thereto. does not
- Enterococcus fasium bacteria is not sensitive to existing antibiotics or resistant bacteria with resistance to existing antibiotics. That is, it does not matter whether resistance to existing antibiotics is acquired.
- prevention refers to (i) prevention of Enterococcus fasium infection; and (ii) inhibiting the development of a disease caused by Enterococcus fasium infection.
- treatment refers to any action that reduces the pathological condition of an infection or disease caused by Enterococcus faecium, and a disease caused by Enterococcus fasium. it means.
- antibacterial substances capable of providing antibacterial activity against other bacterial species may be added to the pharmaceutical composition of the present invention.
- Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered through oral administration or parenteral administration, and in the case of parenteral administration, it may be administered using intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or local administration, It may also be used as a method of application or spraying outside the diseased area, but is not limited thereto.
- the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by being formulated using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. Alternatively, it may be prepared by placing it in a multi-dose container.
- the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in oil or an aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or stabilizer.
- suitable application, spraying and dosage of the pharmaceutical composition depend on factors such as formulation method, administration method, age, weight, sex, degree of disease symptoms, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity. , and an ordinarily skilled physician or veterinarian can readily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be embodied as an antibiotic, an antiseptic, a bactericide, a therapeutic agent, and the like.
- the term 'antibiotic' refers to a preservative, a disinfectant, and an antibacterial agent.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be implemented in the form of a food composition.
- Enterococcus fasium infection and disease treatment method using a pharmaceutical composition comprising the antibacterial protein EFL200 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 according to the present invention as an active ingredient, as well as general Enterococcus fasium bacteria, as well as existing antibiotics It can also effectively act on Enterococcus fasium bacteria, which have acquired resistance to bacteria and antibacterial substances.
- the Enterococcus fasium-specific antibacterial protein EFL200 of the present invention does not affect the normal flora in the body other than Enterococcus fasium. can be minimized.
- Existing antibiotics have a disadvantage of causing adverse effects on beneficial bacteria in the body, causing various side effects.
- Lanes 1 to 3 are chromatography flow-throughs during purification, and lanes 4 to 10 are purification fractions.
- FIG. 2 is a result showing the antibacterial activity (lytic activity) of the antibacterial protein EFL200 against Enterococcus fasium (VRE indicated at the bottom), and the transparent part is generated by the antibacterial activity (lytic activity) of the antibacterial protein EFL200.
- a control Buffer control
- a buffer solution not containing the antibacterial protein EFL200 was used, and the presence or absence of the lysis ring indicates the antibacterial activity of the antibacterial protein EFL200.
- Figure 3 is a result showing the experimental results of the turbidity reduction assay (Turbidity reduction assay) performed on Enterococcus fasium bacteria of the antibacterial protein EFL200.
- the negative control group used the buffer itself without antibacterial protein EFL200.
- the horizontal axis is time (minutes) and the vertical axis is absorbance at 600 nm.
- Lane M is a protein size marker, and lanes 1 to 7 are samples obtained every 10 minutes.
- EFL200 Enterococcus fasium-specific antibacterial protein EFL200
- an expression plasmid having the gene sequence of SEQ ID NO: 2 was prepared through a conventional molecular biological method, and transformed by introducing it into E. coli Strain TOP10-EFL200 (Accession No. KCTC 14364BP) was prepared.
- culture was carried out at 37°C.
- anhydrotetracycline was added so that the final concentration was 0.2 ⁇ g/ml to induce the expression of the antibacterial protein EFL200 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. did.
- culture was further performed for 3 hours.
- the cell culture solution was taken and centrifuged at 7,000 rpm at 4° C. for 15 minutes to recover cell precipitates, and the recovered cell precipitates were suspended in 30 ml of buffer (50 mM K 3 PO 4 , pH 7.0).
- the cell suspension thus prepared was disrupted by sonication, and the sonication method was repeated in an ice bath for a total of 5 minutes under the condition that ultrasonic waves were applied for 3 seconds to break the cells and stopped for 3 seconds.
- the supernatant obtained by centrifuging the cell disruption solution at 7,000 rpm for 15 minutes at 4° C. was purified through a conventional cation-exchange chromatography purification process.
- fractions containing the antimicrobial protein EFL200 at a high concentration were collected, and a buffer (50 mM K 3 PO 4 , pH 7.0) was subjected to dialysis to perform medium exchange. Through this, it was possible to secure an antibacterial protein EFL200 solution having a purity of 90% or more.
- the present inventors investigated the antibacterial activity of the antibacterial protein EFL200 through a conventional spot-on-lawn assay.
- Enterococcus faecium 5 weeks Enterococcus faecium ( Enterococcus ) faecalis ) 2 weeks, Staphylococcus aureus ) 2 weeks, Salmonella 2 weeks, and Escherichia coli 2 weeks were the subjects.
- the bacteria were purchased from an external institution such as The American Type Culture Collection (ATCC) in the United States, or those isolated and identified by the present inventors.
- ATCC American Type Culture Collection
- the antibacterial protein EFL200 had antibacterial activity (dissolution power) only against Enterococcus fasium bacteria, and had no antibacterial activity against other bacterial species. Antibacterial activity against Enterococcus fasium was confirmed for all 5 strains of Enterococcus fasium that were the subject of the experiment. The results of the antimicrobial activity of the antibacterial protein EFL200 against Enterococcus fasium bacteria are presented in FIG. 2 .
- the antibacterial protein EFL200 can provide excellent bactericidal power (antibacterial power) against Enterococcus faecium, and can also be effectively used for preventing or treating infectious diseases caused by Enterococcus faecium. there was.
- Example 3 Investigation of antibacterial activity of antibacterial protein EFL200 through turbidity reduction investigation method
- the antibacterial activity of the antibacterial protein EFL200 was investigated through a turbidity reduction assay for 5 Enterococcus fasium strains tested in Example 2.
- the experimental method of the turbidity reduction investigation method is as follows. After suspending the test bacteria in physiological saline so that the absorbance at 600 nm becomes about 0.7, 0.1 ml of antibacterial protein EFL200 solution is added to 0.9 ml of this suspension (final concentration: 10 ⁇ g/ml), and the absorbance at 600 nm is measured. It was carried out in a manner of measuring for 30 minutes. As a negative control, a buffer solution (50 mM K 3 PO 4 , pH 7.0) not containing the antimicrobial protein EFL200 was used instead of the antimicrobial protein EFL200 solution.
- the Enterococcus fasium-specific antibacterial protein EFL200 of the present invention could eventually be killed by lysing the Enterococcus fasium bacteria.
- a pharmaceutical composition containing the Enterococcus fasium-specific antibacterial protein EFL200 can be utilized for the purpose of killing Enterococcus fasium during Enterococcus fasium infection, and also Enterococcus fasium It shows that it can be used in the same way as conventional antibiotics for the purpose of treating infections.
- the stability of the antibacterial protein EFL200 to the digestive enzymes was investigated by conducting a digestion test by digestive enzymes.
- the experimental method was as follows.
- a SIF-P solution was prepared by dissolving 0.05 g of Pancreatin (Sigma-Aldrich, Cat. No. P1625) in 5 ml of Simulated Intestinal Fluids (SIF, 50 mM KH 2 PO 4 , 0.015 N NaOH, pH 6.8) solution. .
- SIF Simulated Intestinal Fluids
- the negative control group used a buffer solution (50 mM K 3 PO 4 , pH 7.0) not containing the antibacterial protein EFL200 instead of the antibacterial protein EFL200 solution, and the positive control group added the antibacterial protein EFL200 solution to the SIF solution and reacted for 60 minutes. liquid was used.
- Example 5 Enterococcus fasium fungal specific antibacterial protein EFL200's Enterococcus Investigation of the therapeutic effect on Pasium infection
- mice Five-week-old ICR mice [specific pathogen-free (SPF) grade] weighing about 20 g were used as experimental animals. After dividing a total of 20 animals into 2 groups (10 mice per group), 1 ⁇ 10 8 cfu of Enterococcus fasium (ie, 1 ⁇ 10 8 cfu/mouse) was administered to each mouse by intravenous administration to prevent infection. induced. For one group (treatment group), 0.2 ml of antimicrobial protein EFL200 solution (10 mg/ml) was intravenously administered at 30 minutes, 12 hours, and 24 hours after forced bacterial infection. For another group (control group), only buffer (50 mM K 3 PO 4 , pH 7.0) was intravenously administered in the same volume.
- buffer 50 mM K 3 PO 4 , pH 7.0
- Buffer administration was performed at 30 minutes, 12 hours, and 24 hours after forced bacterial infection in the same manner as the administration of the antimicrobial protein EFL200 solution.
- the number of deaths was investigated every day for 5 days after the forced bacterial infection, and the results are presented in Table 1.
- the observation of unusual phenomena was also investigated twice a day, in the morning and in the afternoon.
- the antibacterial protein EFL200 of the present invention was effective in treating Enterococcus fasium infection.
- the pharmaceutical composition containing the antibacterial protein EFL200 of the present invention as an active ingredient can be used for the purpose of treating Enterococcus fasium infection, and also a common antibiotic for the purpose of treating Enterococcus fasium infection. It shows that it can be utilized in the same way.
- this specific technique is only a preferred embodiment, and thus It is clear that the scope is not limited. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Mycology (AREA)
Abstract
본 발명은 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus
faecium) 균에 대하여 특이적인 항균활성을 갖는 항균단백질 EFL200에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 엔테로코쿠스 패슘 균을 특이적으로 용균시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 패슘 균에 특이적인 항균단백질 EFL200과 이의 제조방법, 및 상기 엔테로코쿠스 패슘 균 특이적인 항균단백질 EFL200을 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발되는 감염 또는 질환 처치용 약학적 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium) 균에 대하여 용균활성을 갖는 항균단백질 EFL200에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간을 포함한 동물에 감염하여 질환을 일으킬 수 있는 엔테로코쿠스 패슘 균을 특이적으로 용균시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 패슘 균종에 특이적인 항균단백질 EFL200, 및 상기 엔테로코쿠스 패슘 균 특이적인 항균단백질 EFL200을 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발되는 감염 및 질환 처치용 약학적 조성물, 및 항균단백질 EFL200의 제조방법에 관한 것이다.
장알균(Enterococcus; Enterococci)은 위장관과 비뇨생식계에 상재하는 통성혐기성 그람 양성 알균이다. 장알균 속(Genus)에는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium), 엔테로코쿠스 두란스(Enterococcus durans), 엔테로코쿠스 카쎄리프라부스(Enterococcus casseliflavus)를 포함하여 약 19가지 종(Species)이 보고되고 있으며, 이 중에 실제 감염을 일으키는 주요 균종으로는 엔테로코쿠스 패칼리스와 엔테로코쿠스 패슘을 제시할 수 있다. 과거에는 엔테로코쿠스 패칼리스에 의한 감염이 매우 흔하였지만 최근에는 엔테로코쿠스 패슘에 의한 감염이 상대적으로 늘고 있다.
장알균은 비교적 독성이 약하여 정상인에서는 질병을 일으키지 않으나 노인이나 면역저하 환자, 만성 기저질환자 또는 병원에 입원중인 환자에서는 요로감염, 창상감염, 균혈증, 심내막염 등의 각종 기회감염증을 유발한다. 또한, 장알균은 외부로부터 유전자 교잡을 통하여 병독인자(Virulence factor)를 획득하여 감염성 질환(Infectious disease)을 유발할 수도 있다. 장알균에 의한 감염증 중에 요로감염이 가장 빈번하며, 그 다음으로 창상감염이 흔하다. 장알균에 의한 그 밖의 주요감염으로 심내막염을 제시할 수 있는데, 세균성 심내막염의 5-20%가 장알균에 의한 것이다.
한편, 일반적으로 장알균 처치에 사용되는 항생제로는 아미노글리코사이드(Aminoglycosides), 세팔로스포린(Cephalosporins), 클린다마이신(Clindamycin) 및 반합성 페니실린 제제들이 사용되나, 이들 항생제에 대한 내성균 발생이 자주 보고 되고 있다. 장알균은 새로운 DNA(플라스미드, Transposons)를 얻거나, 돌연변이를 이용하여 항생제 내성을 획득한다고 알려져 있다. 특히 아미노글리코사이드에 대한 내성을 획득한 장알균이 심내막염이나 중증 감염을 일으킨 경우에는 이 장알균을 살균할 수 없기 때문에 치료에 성공하기 어렵다. 반코마이신 내성 장알균(Vancomycin-Resistance Enterococci, 이하 VRE)에 원인한 균혈증이 있는 경우는 사망률이 67%에 달하는 것으로 보고되고 있다. 1986년 프랑스에서 처음으로 반코마이신에 내성을 보이는 VRE가 보고되었고 국내에서는 1992년에 VRE가 처음으로 분리되었다. 미국의 경우, 1988년 처음으로 VRE가 분리된 이래, NNIS(National Nosocomial Infection Surveillance)의 자료에 따르면 1990-1997년 사이에 분리된 엔테로코쿠스 중 1-15%가 VRE였으며 1999년 25%, 2003년 28.5%로 증가되고 있는 추세이다. 최근에는 유럽, 미국 뿐 아니라 한국을 포함한 아시아 및 오세아니아를 비롯하여 전 세계적으로 VRE의 출현이 증가하고 있다. 이에 따라 항생제 내성 장알균 감염 예방 또는 치료에 활용할 수 있는 약제의 개발이 필요하다. 특히, 신속한 치료 효과를 제공해 줄 수 있는 약학적 제제의 개발이 매우 절실한 형편이다.
이에, 유해 병원성 박테리아인 엔테로코쿠스 패슘 균에 대한 기존 항생제 사용에 의해 발생하는 문제점의 해결 방안으로서, 본 발명자들은 엔테로코쿠스 패슘 균을 특이적으로 용균시킬 수 있는 항균단백질을 제공하고, 나아가 이를 유효성분으로 포함하고 엔테로코쿠스 패슘 균의 감염을 처치하는 데에 활용될 수 있는 약학적 조성물을 제공하며, 더 나아가 상기 약학적 조성물을 활용한 엔테로코쿠스 패슘 균의 감염 또는 질환을 효과적으로 처치하는 방법을 제공하고자 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 엔테로코쿠스 패슘 균을 특이적으로 용균시킬 수 있는 활성을 갖고 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균단백질 EFL200을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 엔테로코쿠스 패슘 균을 특이적으로 용균시킬 수 있는 활성을 갖고 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항균단백질 EFL200을 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 엔테로코쿠스 패슘 균을 특이적으로 용균시킬 수 있는 항균단백질 EFL200을 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패슘 감염 처치 목적의 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 항균단백질 EFL200을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이용하여 엔테로코쿠스 패슘 균의 감염 또는 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 항균단백질 EFL200을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물 및 이를 이용하여 엔테로코쿠스 패슘 균의 감염 또는 질환을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적들을 달성하고자, 본 발명의 발명자들은 여러 균종들에 대하여 항균활성을 가진다고 알려진 다양한 항균단백질 정보를 활용하여, 여러 항균단백질 후보들을 재조합 단백질 형태로 제조하였고 이들의 엔테로코쿠스 패슘 균에 대한 용균활성을 조사하여 우수한 용균활성을 갖는 항균단백질을 선별하였고, 이를 효율적으로 제조할 수 있는 방법까지 개발하였으며, 마지막으로 이를 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패슘 균 감염 처치 목적으로 활용될 수 있는 약학적 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 엔테로코쿠스 패슘 균을 특이적으로 용균시킬 수 있는 항균단백질 EFL200의 아미노산 서열을 제공한다. 구체적으로는, 서열번호 1의 아미노산 서열이 이에 해당한다. 엔테로코쿠스 패슘 균을 특이적으로 용균시킬 수 있는 항균단백질 EFL200은 284개의 아미노산 잔기로 구성되며, 분자량은 약 30.7 kDa이다.
서열번호 1의 아미노산 서열은 당업자에 의해 공지의 기술을 이용하여 일부 변형될 수 있음이 자명하다. 상기 변형은 아미노산 서열의 일부 치환, 아미노산 서열의 일부 첨가, 및 아미노산 서열의 일부 결실을 포함한다. 그렇지만 본 발명에서 개시하고 있는 서열번호 1의 아미노산 서열을 준용하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균단백질 EFL200의 생산에 이용될 수 있는 균주 TOP10-EFL200을 제공한다. 상기 균주 TOP10-EFL200은 본 발명자들에 의해 제작된 서열번호 2의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드를 사용하여 대장균을 형질전환시켜 항균단백질 EFL200을 생산하도록 제작된 균주이다. 이 대장균 TOP10-EFL200은 본 발명자들에 의해 2020년 11월 10일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 14364BP).
본 명세서에서 사용된 "유전자"라는 용어는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 유전자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Chemical Reviews 90:543-584, 1990).
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 특징지어지고 엔테로코쿠스 패슘 균에 대하여 특이적 용균능을 갖는 항균단백질 EFL200을 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패슘 균의 감염 또는 질환에 대한 치료에 효과적으로 활용될 수 있는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는, 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 특징지어지는 엔테로코쿠스 패슘 균에 대하여 특이적 용균능을 갖는 항균단백질 EFL200은 상술한 바와 같이 엔테로코쿠스 패슘 균을 특이적으로 용균시키므로, 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발되는 다양한 질환의 처치에 있어 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발되는 질환의 처치에 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 항생제, 소독제, 살균제, 치료제 등으로 구현되어 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발되는 다양한 질환들의 처치에 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 패슘 균에 특이적인 항균단백질 EFL200을 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발되는 다양한 질환을 가진 개체에 투여하여 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발되는 다양한 질환들을 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 “엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발되는 질환”이란 엔테로코쿠스 패슘 균 감염에 의해 유발되는 질환으로서 요로감염, 창상감염, 균혈증, 심내막염 등을 포함하는 질환을 총칭하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서의 엔테로코쿠스 패슘 균은 기존 항생제에 대하여 민감하든지 또는 기존 항생제에 대하여 내성을 가진 내성균이든지 상관이 없다. 즉, 기존 항생제에 대한 내성 획득 여부는 상관이 없다.
본 명세서에서 사용된 "방지" 또는 "예방"이라는 용어는 (i) 엔테로코쿠스 패슘 감염의 방지; 및 (ii) 엔테로코쿠스 패슘 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발된 감염 또는 질환의 억제, 및 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발된 질환의 병적상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.
이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균 종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 항균물질들이 본 발명의 약학적 조성물에 추가될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있으며, 그 밖에 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로도 이용될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
또한, 상기 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 항생제, 소독제, 살균제, 치료제 등으로 구현될 수 있다. 본 명세서에 있어서, '항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 식품 조성물 형태로도 구현될 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 항균단백질 EFL200을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘 균의 감염 및 질환 치료 방법은 일반적인 엔테로코쿠스 패슘 균뿐만 아니라 기존 항생제들이나 항균물질들에 대하여 내성을 획득한 엔테로코쿠스 패슘 균에도 효과적으로 작용할 수 있다. 한편, 본 발명의 엔테로코쿠스 패슘 균 특이 항균단백질 EFL200은 엔테로코쿠스 패슘 균 외의 다른 체내의 정상 상재균에는 영향을 주지 않아 항균단백질 EFL200을 유효성분으로 포함하고 있는 약학적 조성물의 사용에 따른 부작용을 최소화 시켜 줄 수 있다. 기존 항생제들의 경우에는 체내의 유익균들에도 악영향을 초래하여 여러 가지의 부작용을 유발시키는 단점을 나타내었다.
도 1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 패슘 균 특이적 항균단백질 EFL200을 재조합 단백질 형태로 제조한 결과를 보여주는 전기영동 사진으로서, 레인 M은 단백질 크기 마커이고, 레인 1부터 레인 3은 정제 시의 크로마토그래피 통과액이고, 레인 4부터 레인 10은 정제 분획이다.
도 2는 항균단백질 EFL200의 엔테로코쿠스 패슘 균 (하단에 VRE 표시)에 대한 항균활성(용균활성)을 보여주는 결과로서, 투명한 부분은 항균단백질 EFL200의 항균활성(용균활성)에 의해 생성된 것이다. 대조군(Buffer control)은 항균단백질 EFL200을 포함하지 않은 완충액 자체를 사용하였으며, 용균환의 형성 유무가 항균단백질 EFL200의 항균활성을 나타낸다.
도 3은 항균단백질 EFL200의 엔테로코쿠스 패슘 균을 대상으로 실시한 탁도감소조사법(Turbidity reduction assay)의 실험 결과를 보여주는 결과이다. 음성대조군(Negative control)은 항균단백질 EFL200을 포함하지 않은 완충액 자체를 사용하였으며, 가로축은 시간(분)이고 세로축은 600 nm에서의 흡광도이다.
도 4는 항균단백질 EFL200의 엔테로코쿠스 패슘 균을 대상으로 실시한 소화효소에 대한 분해 조사법(Digestive enzyme degradation test)의 실험 결과이다. 음성대조군(Negative control)은 항균단백질 EFL200을 포함하지 않은 소화효소만을 사용하였으며, 양성대조군(Positive control)은 항균단백질 EFL200만을 포함한다. 레인 M은 단백질 크기 마커이고, 레인 1부터 레인 7번까지는 10분마다 얻은 시료이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 엔테로코쿠스 패슘 균 특이적 항균단백질 EFL200의 제조
엔테로코쿠스 패슘 균 특이적 항균단백질 EFL200의 제조에 대하여 이하에 설명한다. 본 발명자들이 최종 고안한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균단백질 EFL200의 제조를 위하여 서열번호 2의 유전자 서열을 갖는 발현 플라스미드를 통상의 분자생물학적 방법을 통하여 제작하였고 이를 대장균에 도입시켜 형질전환된 생산균주 TOP10-EFL200(수탁번호 KCTC 14364BP)을 제작하였다.
이하 생산균주 TOP10-EFL200(수탁번호 KCTC 14364BP)을 사용한 항균단백질 EFL200 제조에 대하여 설명한다. 50 μg/ml 카나마이신이 포함된 LB배지(Tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 10 g/L) 20 ml에 TOP10-EFL200(수탁번호 KCTC 14364BP)을 20 μl 첨가하여 접종한 다음 37℃에서 한밤 동안 진탕 배양하였다. 다음날, 50 μg/ml 카나마이신이 포함된 LB배지 0.5 L에 한밤 배양한 배양액을 1/100 부피비로 첨가하였다. 220 rpm의 교반속도로, 37℃ 온도 조건에서 배양을 실시하였다. 세포 농도가 600 nm에서의 흡광도 기준으로 0.5가 되었을 때, 최종 농도가 0.2 μg/ml이 되도록 언하이드로테트라사이클린(Anhydrotetracycline)을 첨가하여 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 항균단백질 EFL200의 발현을 유도하였다. 발현 유도 후에 3시간 배양을 추가 실시하였다.
배양 종료 후, 세포 배양액을 취하여 7,000 rpm에서 15분간 4℃에서 원심분리하여 세포 침전물을 회수하였고, 회수한 세포 침전물은 30 ml의 완충액(50 mM K3PO4, pH 7.0)에 부유시켰다. 이렇게 준비된 세포 부유액을 초음파 분쇄법을 이용하여 세포를 파쇄하였고, 상기 초음파 분쇄법은 3초간 초음파를 가하여 세포를 깨고, 3초간 멈추는 조건으로 총 5분간 반복하여 얼음조(Ice bath)에서 실시하였다. 세포 파쇄 후에 세포 파쇄액을 7,000 rpm에서 15분간 4℃에서 원심분리하여 얻어진 상등액을 통상의 양이온-교환 크로마토그래피(Cation-exchange chromatography) 정제 공정을 통하여 정제하였다.
정제 공정을 간단히 설명하면 다음과 같다. 본 실시예에서는 양이온-교환수지(Cation-exchange resin)로 5 ml의 HiTrapTM SP FF(GE Healthcare)를 사용하였다. 크로마토그래피는 칼럼을 Buffer A(50 mM K3PO4, pH 7.0)로 미리 평형화시킨 후에 실시하였고, 시료를 칼럼에 적하(Loading)한 다음에는 5 ml/min의 유량(Flow rate)으로 상기 buffer A를 10 CV(Column Volume) 흘려주어 세척을 실시하였다. 세척 후에는 5 ml/min의 유량으로 buffer A에서 buffer B(50 mM K3PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)로의 농도 기울기(Gradient)가 0%에서 100%가 되게 하는 조건으로 크로마토그래피를 수행하였다. 이 과정에서 목적하는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 항균단백질 EFL200의 용출이 달성되었다. 도 1에 크로마토그래피 정제 공정을 이용하여 정제한 항균단백질 EFL200의 전기영동 분석 결과가 제시되어 있다.
확보된 정제 분획 중에 항균단백질 EFL200을 고농도로 포함하고 있는 분획들(도 1에서의 레인 4부터 레인 9에 상응하는 정제 분획들)을 모았고, 완충액(50 mM K3PO4, pH 7.0)에 대하여 투석(Dialysis)을 실시하여 매질 교환을 수행하였다. 이를 통하여 90% 이상의 순도를 갖는 항균단백질 EFL200 용액을 확보할 수 있었다.
실시예 2: 점적 실험을 통한 항균단백질 EFL200의 항균활성 조사
본 발명자들은 항균단백질 EFL200의 항균활성을 통상의 점적 실험(Spot-on-lawn assay)을 통하여 조사해 보았다. 실험에서는 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium) 5주, 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 2주, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 2주, 살모넬라(Salmonella) 2주, 및 대장균 2주를 대상으로 하였다. 상기 박테리아는 미국의 The American Type Culture Collection(ATCC) 등의 외부기관으로부터 분양을 받았거나, 또는 본 발명자들에 의해 분리 및 동정된 것들이었다.
실험 방법은 TSA 배지에 37℃ 배양기에서 한밤 진탕 배양한 박테리아 배양액 1 mL을 각각 다른 평판배지에 도말한 후 잘 건조되도록 약 30분간 상온 방치시켰다. 건조된 TSA 배지를 37℃ 배양기에서 5시간 배양하여 꺼낸 후 평판배지에서 박테리아가 자란 것을 확인한 다음에 항균단백질 EFL200 용액(농도: 1 μg/μl) 10 μL씩을 떨어뜨렸다. 대조군(Buffer control)은 EFL200이 포함되지 않은 완충액(50 mM K3PO4 , pH 7.0)을 사용하였다. 점적한 후 건조될 때까지 약 30분간 상온 방치한 다음 각 박테리아의 용균 정도를 관찰하였다. 그 결과, 항균단백질 EFL200은 엔테로코쿠스 패슘 균에 대해서만 항균활성(용균력)이 있었고 다른 균종들에 대해서는 항균활성이 없었다. 엔테로코쿠스 패슘 균에 대한 항균활성은 실험에서 대상이 된 엔테로코쿠스 패슘 5주 모두에 대해서 확인되었다. 항균단백질 EFL200의 엔테로코쿠스 패슘 균에 대한 항균활성 실험 결과를 도 2에 제시하였다.
이로부터 항균단백질 EFL200은 엔테로코쿠스 패슘 균에 대하여 우수한 용균력(항균력)을 제공할 수 있으며, 또한 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 탁도감소조사법을 통한 항균단백질 EFL200의 항균활성 조사
실시예 2에서 시험대상이 된 엔테로코쿠스 패슘 균주 5종에 대하여 탁도감소조사법(Turbidity reduction assay)을 통해 항균단백질 EFL200의 항균활성을 조사하였다. 탁도감소조사법의 실험 방법은 다음과 같다. 생리식염수에 시험대상 박테리아를 600 ㎚에서 흡광도가 0.7 정도가 되도록 부유시킨 다음에 이 부유액 0.9 ml에 항균단백질 EFL200 용액을 0.1 ml을 첨가(최종 농도: 10 μg/ml)한 후에 600 ㎚에서 흡광도를 30분간 측정하는 방식으로 실시하였다. 음성대조로는 항균단백질 EFL200 용액 대신에 항균단백질 EFL200을 포함하지 않은 완충액(50 mM K3PO4, pH 7.0)을 사용하였다.
실험 결과, 5개 균주에 대하여 유사한 실험 결과를 확인할 수 있었는데, 항균단백질 EFL200은 시험대상 박테리아를 신속히 용균시켜 흡광도를 떨어뜨렸다. 이러한 신속한 용균 효과는 기존의 어떤 항생제들도 제공하지 못했던 본 발명에 따른 항균단백질 EFL200의 특성이라 할 수 있다. 엔테로코쿠스 패슘 균주 5종에 대한 실험 결과를 도 3에 제시하였다.
이상의 결과로 본 발명의 엔테로코쿠스 패슘 균 특이적 항균단백질 EFL200이 엔테로코쿠스 패슘 균을 용균시킴으로 결국 사멸시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 특성은 엔테로코쿠스 패슘 균 특이적 항균단백질 EFL200을 포함하는 약학적 조성물이 엔테로코쿠스 패슘 균 감염 시에 엔테로코쿠스 패슘 균 사멸 목적으로 활용될 수 있음을 보여 주고, 또한 엔테로코쿠스 패슘 균 감염 처치 목적으로 통상의 항생제와 같은 방식으로 활용될 수 있음을 보여준다.
실시예
4: 소화효소에 의한 분해 실험을 통한
항균단백질
EFL200의
소화효소에 대한 안정성 조사
소화효소에 의한 분해 실험을 진행하여 항균단백질 EFL200의 소화효소에 대한 안정성을 조사하였다. 실험 방법은 다음과 같았다. 5 ml의 Simulated Intestinal Fluids(SIF, 50 mM KH2PO4, 0.015 N NaOH, pH 6.8) 용액에 0.05 g의 Pancreatin(Sigma-Aldrich, Cat. No. P1625)을 용해시켜 SIF-P 용액을 제조하였다. 이렇게 준비된 SIF-P 용액 200 μl에 항균단백질 EFL200의 최종 양이 100 μg이 되도록 첨가한 후, 37℃ 조건에서 60분간 정치하였다. 음성대조군은 항균단백질 EFL200 용액 대신에 항균단백질 EFL200을 포함하지 않은 완충액(50 mM K3PO4, pH 7.0)을 사용하였고, 양성대조군은 SIF 용액에 항균단백질 EFL200 용액을 첨가하여 60분간 반응시킨 반응액을 사용하였다. 60 μl의 0.1 N HCl이 분주된 1.5 ml tube에 매 10분마다 회수한 반응액 20 μl를 넣은 후, 그 중 32 μl를 취해 8 μl의 5× sample buffer [10% SDS, 500 mM DTT, 50% glycerol, 0.5% bromophenol blue dye, 250 mM Tris-HCl(pH 6.8)]가 담겨진 1.5 ml tube에 첨가 (EFL200의 양: 1 μg/SDS-PAGE well)하였다. 그리고 위 tube들을 95℃에서 4분간 끓인 후 전기영동을 실시하였다. 실험 결과, 항균단백질 EFL200이 소화효소(Pancreatin)에 대하여 30분 동안 안정적임을 확인할 수 있었다. 실험 결과를 도 4에 제시하였다.
실시예
5:
엔테로코쿠스
패슘
균 특이적
항균단백질
EFL200의
엔테로코쿠스
패슘 균 감염에 대한 치료적 효과 조사
엔테로코쿠스 패슘 균 특이적 항균단백질 EFL200의 엔테로코쿠스 패슘 균 감염에 대한 치료적 효과를 감염 동물 모델을 사용하여 조사하였다.
약 20 g 내외 체중의 5주령 ICR 마우스[specific pathogen-free(SPF) grade]를 실험동물로 사용하였다. 총 20마리를 2개의 군으로 분리(군당 10마리씩)한 다음에 정맥투여 방식으로 각 마우스에 엔테로코쿠스 패슘 균 1× 108 cfu(즉, 1× 108 cfu/mouse)를 투여하여 감염을 유도하였다. 하나의 군(처치군)에 대해서는 균 강제 감염 후에 30분 경과 시점, 12시간 경과 시점, 및 24시간 경과 시점에 항균단백질 EFL200 용액(10 mg/ml) 0.2 ml을 정맥 투여하였다. 또 다른 군(대조군)에 대해서는 완충액(50 mM K3PO4, pH 7.0)만을 동일 부피로 정맥 투여하였다. 완충액 투여는 항균단백질 EFL200 용액 투여와 동일하게 균 강제 감염 후에 30분 경과 시점, 12시간 경과 시점, 및 24시간 경과 시점에 실시하였다. 균 강제 감염 후로부터 5일 동안 매일 사망 개체 수를 조사하였고 그 결과를 표 1에 제시하였다. 또한, 특이 현상의 관찰여부도 매일 오전 및 오후로 하루에 2번씩 조사하였다.
실험 결과로서, 확연한 치료 효과가 확인되었다. 본 발명의 항균단백질 EFL200의 투여가 감염 동물의 생존율에서 확연한 개선을 제공하였다. 또한, 대조군에서는 안검염의 발적(Erythema of lid margin), 활동성 감소 등의 다양한 특이 반응들이 관찰됨에 비교하여 항균단백질 EFL200 투여군에서는 그러한 특이 반응이 관찰되지 않았다.
군 | 사망 개체 수 | 사망 개체 수 /시험 개체 수 | 폐사율 (%) | ||||
균 강제 감염 후 경과 일 | |||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||
대조군 | 0 | 3 | 3 | 1 | 0 | 7/10 | 70 |
처치군 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0/10 | 0 |
이상의 결과로 본 발명의 항균단백질 EFL200이 엔테로코쿠스 패슘 균의 감염 치료에 효과적임을 확인할 수 있었다. 이러한 특성은 본 발명의 항균단백질 EFL200을 유효성분으로 포함된 약학적 조성물이 엔테로코쿠스 패슘 균 감염 치료 목적으로 활용될 수 있음을 보여주고, 또한 엔테로코쿠스 패슘 균의 감염 치료 목적으로 통상의 항생제와 같은 방식으로 활용될 수 있음을 보여 준다.이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (6)
- 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium) 균 특이적 항균활성을 갖고 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 엔테로코쿠스 패슘 균 특이적 항균단백질 EFL200.
- 제1항에 있어서, 상기 항균단백질 EFL200은 284개의 아미노산으로 구성되며 분자량이 30.7 kDa인 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 패슘 균 특이적 항균단백질 EFL200.
- 제1항의 엔테로코쿠스 패슘 균 특이적 항균단백질 EFL200을 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패슘 균 감염 또는 질환 처치용 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 질환은 요로감염, 창상감염, 균혈증 및 심내막염으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환인 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 패슘 균 감염 또는 질환 처치용 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물, 항생제, 소독제, 살균제 또는 치료제 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 패슘 균 감염 또는 질환 처치용 약학적 조성물.
- 서열번호 2의 유전자 서열로 표시되는 플라스미드를 사용하여 대장균을 형질전환시켜 제작한 균주 TOP10-EFL200(수탁번호: KCTC 14364BP)을 이용하여 제1항의 엔테로코쿠스 패슘 균 특이적 항균단백질 EFL200을 제조하는 방법.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2021-0005635 | 2021-01-15 | ||
KR20210005635 | 2021-01-15 | ||
KR1020210180284A KR20220103619A (ko) | 2021-01-15 | 2021-12-16 | 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium) 균에 대하여 용균활성을 갖는 항균단백질 EFL200 |
KR10-2021-0180284 | 2021-12-16 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2022154287A1 true WO2022154287A1 (ko) | 2022-07-21 |
Family
ID=82447218
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/KR2021/019368 WO2022154287A1 (ko) | 2021-01-15 | 2021-12-20 | 엔테로코쿠스 패슘 균에 대하여 용균활성을 갖는 항균단백질 efl200 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
WO (1) | WO2022154287A1 (ko) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070025978A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-02-01 | Pauline Yoong | Bactiophage lysins for Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium and other bacteria |
KR100988771B1 (ko) * | 2008-09-29 | 2010-10-20 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스 특이적 사멸능을 갖는 신규한 리신 단백질 |
KR101957266B1 (ko) * | 2017-02-22 | 2019-03-13 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 용균력을 가지는 신규한 항균단백질 efal-2 |
US20190330608A1 (en) * | 2016-10-20 | 2019-10-31 | Lysando Ag | New antimicrobial agents against enterococcus bacteria |
-
2021
- 2021-12-20 WO PCT/KR2021/019368 patent/WO2022154287A1/ko active Application Filing
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070025978A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-02-01 | Pauline Yoong | Bactiophage lysins for Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium and other bacteria |
KR100988771B1 (ko) * | 2008-09-29 | 2010-10-20 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스 특이적 사멸능을 갖는 신규한 리신 단백질 |
US20190330608A1 (en) * | 2016-10-20 | 2019-10-31 | Lysando Ag | New antimicrobial agents against enterococcus bacteria |
KR101957266B1 (ko) * | 2017-02-22 | 2019-03-13 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 용균력을 가지는 신규한 항균단백질 efal-2 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ANONYMOUS: "Intron Biotechnology, VRE Infection Treatment EFL200 Proved the Efficacy of Patient-Derived Clinical Isolates", 2 November 2021 (2021-11-02), XP055950693, Retrieved from the Internet <URL:www.healthinnews.co.kr/news/articlePrint.html?idxno=26085> * |
DATABASE PROTEIN 20 September 2021 (2021-09-20), ANONYMOUS : "NlpC/P60 family protein [Enterococcus faecium] ", XP055950692, retrieved from NCBI Database accession no. WP_123838437 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100781669B1 (ko) | 황색포도상구균 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지 | |
WO2010079858A1 (ko) | 박테리아 특이적 넓은 항균 활성을 갖는 신규한 리신 단백질 | |
WO2018155813A2 (ko) | 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 용균력을 가지는 신규한 항균단백질 efal-2 | |
WO2016108538A1 (ko) | 신규한 장출혈성 대장균 박테리오파지 Esc-CHP-1 및 이의 장출혈성 대장균 증식 억제 용도 | |
WO2016114517A1 (ko) | 신규한 락토코커스 가르비에 박테리오파지 Lac-GAP-1 및 이의 락토코커스 가르비에 균 증식 억제 용도 | |
KR101822812B1 (ko) | 신규한 엔테로코쿠스 패슘 박테리오파지 Ent-FAP-4 및 이의 엔테로코쿠스 패슘 증식 억제 용도 | |
WO2016108542A1 (ko) | 신규한 장침입성 대장균 박테리오파지 Esc-COP-4 및 이의 장침입성 대장균 증식 억제 용도 | |
WO2016126009A1 (ko) | 신규한 에드와드시엘라 타르다 박테리오파지 EdW-TAP-1 및 이의 에드와드시엘라 타르다 균 증식 억제 용도 | |
WO2020013451A1 (ko) | 대장균 박테리오파지 esc-cop-14 및 이의 병원성 대장균 증식 억제 용도 | |
WO2017217726A1 (ko) | 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-5 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 | |
WO2017111305A1 (ko) | 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-2 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 | |
WO2017111304A1 (ko) | 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-1 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 | |
WO2018151416A1 (ko) | 신규한 녹농균 박테리오파지 Pse-AEP-3 및 이의 녹농균 증식 억제 용도 | |
WO2018151417A1 (ko) | 신규한 녹농균 박테리오파지 Pse-AEP-4 및 이의 녹농균 증식 억제 용도 | |
WO2013035906A1 (ko) | 살모넬라 티피무륨 감염을 방지 및 처치하는 방법 | |
WO2018208001A1 (ko) | 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-7 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 | |
WO2018236085A1 (ko) | 신규한 에로모나스 하이드로필라 박테리오파지 Aer-HYP-1 및 이의 에로모나스 하이드로필라 균 증식 억제 용도 | |
WO2017061733A1 (ko) | 신규한 스트렙토코커스 이니에 박테리오파지 Str-INP-1 및 이의 스트렙토코커스 이니에 균 증식 억제 용도 | |
WO2021246670A1 (ko) | 클로스트리디오이데스 디피실리 균에 대하여 용균 활성을 갖는 항균단백질 | |
WO2022154287A1 (ko) | 엔테로코쿠스 패슘 균에 대하여 용균활성을 갖는 항균단백질 efl200 | |
WO2021215687A1 (ko) | 클로스트리디오이데스 디피실리 균에 대하여 용균 활성을 갖는 항균단백질 cdl200 | |
WO2019164195A1 (ko) | 신규한 에로모나스 하이드로필라 박테리오파지 aer-hyp-3 및 이의 에로모나스 하이드로필라 균 증식 억제 용도 | |
WO2017061732A1 (ko) | 바실러스 균종 특이적 용균 활성을 갖는 신규한 항균 단백질 bps13 | |
WO2018117462A2 (ko) | 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-4 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 | |
WO2021010595A1 (ko) | 신규한 엔테로박터 애로진스 박테리오파지 ent-aep-1 및 이의 엔테로박터 애로진스 균과 엔테로박터 클로아카 균 증식 억제 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 21919911 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 21919911 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |