WO2022138507A1 - 細胞膜透過ペプチドを利用した遺伝子組換えに頼らない植物ゲノム編集技術 - Google Patents

細胞膜透過ペプチドを利用した遺伝子組換えに頼らない植物ゲノム編集技術 Download PDF

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WO2022138507A1
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genome editing
cpp
complex
enzyme
gene
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崇 岩崎
昂誠 大村
淑乃 田中
吉彦 七里
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国立大学法人鳥取大学
国立研究開発法人森林研究・整備機構
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    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Definitions

  • the present invention relates to a genome editing technique using a novel complex. Specifically, the present invention relates to a technique for directly introducing a genome editing enzyme and nucleic acid into a plant cell without using genetic recombination.
  • This application claims priority over Japanese Patent Application No. 2020-21301, and the entire contents of Japanese Patent Application No. 2020-211301 are integrated into this application by reference.
  • Geno editing technology is being used in a wide range of fields from basic research to applied research (for example, medical treatment and crop breeding) as an innovative technology for modifying biological functions.
  • the conventional genome editing technology for plants has a fatal problem that "the operation requires a great deal of time and complexity".
  • the main reason for this is that conventional plant genome editing techniques rely on genetic recombination techniques.
  • a genome editing cassette gene (a gene that synthesizes a genome editing enzyme and a nucleic acid specific to a target gene) is introduced into a plant cell by gene recombination, and after inducing genome editing, the genome A method of acquiring genome editing cells is adopted by selecting cells lacking the editing enzyme gene.
  • the genome editing cassette gene cannot be introduced into plant species to which gene recombination technology cannot be applied, the number of plant species to which genome editing is possible is currently limited.
  • the genome editing enzyme gene which is a foreign gene, is once introduced into plant cells, it is treated as a genetically modified organism unless this foreign gene is removed, so that it is extremely difficult to use it for commercial purposes as it is.
  • the removal of foreign genes is possible only by repeating mating, and therefore, as described above, there is a problem that it takes a long time to remove the genome editing cassette gene.
  • Non-Patent Document 1 a method has been proposed in which a genome editing enzyme is directly introduced into a plant cell in the form of a protein to induce genome editing without mediating gene recombination.
  • Non-Patent Document 1 since plant cells have a strongly negatively charged cell wall, when an attempt is made to introduce a protein into a plant cell, the basic protein is trapped in the cell wall, while the acidic protein is repelled by the cell wall. It ends up.
  • a particle gun or electroporation method special and expensive specialized equipment is required.
  • the present inventors have conducted extensive research to solve the above problems, and have conducted extensive research on a complex containing a genome editing enzyme and a cell membrane permeation peptide (hereinafter, may be referred to as "CPP"), and a genome editing cassette (with a genome editing enzyme).
  • CPP cell membrane permeation peptide
  • a genome editing cassette can be directly introduced into plant cells without the need for gene recombination by using a complex containing a target gene-specific nucleic acid) and CPP, and have completed the present invention.
  • the present invention provides: (1) A complex containing a genome editing enzyme and a CPP, in which the CPP is fused to the genome editing enzyme. (2) A complex containing a genome editing enzyme, a nucleic acid specific to a target gene, and CPP, in which CPP is fused to a nucleic acid specific to the genome editing enzyme and / or the target gene. (3) The complex according to (1) or (2), wherein the CPP is covalently bound to a genome editing enzyme and / or a nucleic acid specific to the target gene. (4) The complex according to (3), wherein the CPP is covalently bound to a genome editing enzyme.
  • a genome editing enzyme or a genome editing cassette can be directly introduced into a plant cell without requiring genetic recombination. Therefore, a genome editing enzyme or a genome editing cassette can be introduced into a plant species to which the gene recombination technique cannot be applied, and genome editing can be performed.
  • a genome editing enzyme or a genome editing cassette can be introduced into a plant cell simply by incubating the complex of the present invention and a plant cell in a medium.
  • genome editing according to the present invention is highly efficient. In short, by using the complex of the present invention, genome editing can be easily and efficiently performed on a wide range of plant species without requiring genetic recombination. Since the genome-edited plant obtained by the present invention does not carry a foreign gene and does not correspond to a genetically modified organism, it can be immediately commercialized and has extremely high commercial value.
  • Direct introduction of genome editing enzyme into plant cells means introduction of genome editing enzyme into plant cells as an active protein.
  • "Introducing a genome editing cassette directly into a plant cell” means introducing a complex of a genome editing enzyme and a nucleic acid specific to a target gene into the plant cell, and activating the complex of the genome editing enzyme and the nucleic acid. Introducing into plant cells as a certain protein complex.
  • FIG. 1 is a diagram for comparative explanation of a genome editing method using the complex of the present invention and a conventional method.
  • FIG. 2 is a diagram showing the base sequence of the Sugimagnesium kiratase gene (CjCHLI gene) used as the target gene in the examples.
  • CjCHLI gene Sugimagnesium kiratase gene
  • gRNA1 and gRNA2 indicate recognition sites of gRNA1 and gRNA2, respectively.
  • FIG. 3 is a diagram showing the base sequence of the region recognized by gRNA1 in which genome editing (gene deletion) was confirmed in the examples. The site where genome editing (gene deletion) occurred is indicated by "-".
  • Samples shows the conditions when plant cells are processed, Reads shows the number of sequences for which nucleotide sequence analysis was performed and the number of sequences for which genome editing (gene deletion) was confirmed, and Efficiency shows the efficiency of genome editing.
  • the underline shows the conditions under which significant genome editing (gene deletion) was confirmed.
  • FIG. 4 is a diagram showing the base sequence of the region recognized by gRNA2 in which genome editing (gene deletion) was confirmed in the examples. The site where genome editing (gene deletion) occurred is indicated by "-”.
  • Samples shows the conditions when plant cells are processed, Reads shows the number of sequences for which nucleotide sequence analysis was performed and the number of sequences for which genome editing (gene deletion) was confirmed, and Efficiency shows the efficiency of genome editing.
  • FIG. 5 is a diagram showing the base sequence of the region recognized by gRNA2 in which genome editing (gene deletion) was confirmed in the examples.
  • the site where genome editing (gene deletion) occurred is indicated by "-”.
  • Samples shows the conditions when plant cells are processed, Reads shows the number of sequences for which nucleotide sequence analysis was performed and the number of sequences for which genome editing (gene deletion) was confirmed, and Efficiency shows the efficiency of genome editing.
  • the underline shows the conditions under which significant genome editing (gene deletion) was confirmed.
  • FIG. 6 is a diagram showing the base sequence of the region recognized by gRNA2 in which genome editing (gene deletion) was confirmed in the examples.
  • FIG. 7 is a diagram showing the base sequence of the region recognized by gRNA2 in which genome editing (gene deletion) was confirmed in the examples.
  • the site where genome editing (gene deletion) occurred is indicated by "-”.
  • FIG. 8A is a diagram showing the base sequence of the rice E3 ubiquitin-protein ligase GW2 gene (OsGW2 gene) as the target gene in the examples.
  • OsGW2 gene ubiquitin-protein ligase GW2 gene
  • FIG. 8B is a continuation of FIG.
  • FIG. 8A is a diagram showing the base sequence of the rice E3 ubiquitin-protein ligase GW2 gene (OsGW2 gene) used as the target gene in the examples.
  • FIG. 9 is a diagram showing the base sequence of the region recognized by gRNA3 in which genome editing (gene deletion) was confirmed in the examples. The site where genome editing (gene deletion) occurred is indicated by "-".
  • Samples shows the conditions when plant cells are processed, Reads shows the number of sequences for which nucleotide sequence analysis was performed and the number of sequences for which genome editing (gene deletion) was confirmed, and Efficiency shows the efficiency of genome editing.
  • the underline shows the conditions under which significant genome editing (gene deletion) was confirmed.
  • FIG. 10 is a diagram showing the base sequence of the region recognized by gRNA3 in which genome editing (gene deletion) was confirmed in the examples.
  • the site where genome editing (gene deletion) occurred is indicated by "-”.
  • Samples shows the conditions when plant cells are processed, Reads shows the number of sequences for which nucleotide sequence analysis was performed and the number of sequences for which genome editing (gene deletion) was confirmed, and Efficiency shows the efficiency of genome editing.
  • the underline shows the conditions under which significant genome editing (gene deletion) was confirmed.
  • FIG. 11 is a diagram showing the base sequence of the region recognized by gRNA3 in which genome editing (gene deletion) was confirmed in the examples. The site where genome editing (gene deletion) occurred is indicated by "-”.
  • Samples shows the conditions when plant cells are processed, Reads shows the number of sequences for which nucleotide sequence analysis was performed and the number of sequences for which genome editing (gene deletion) was confirmed, and Efficiency shows the efficiency of genome editing.
  • the underline shows the conditions under which significant genome editing (gene deletion) was confirmed.
  • FIG. 12 is a diagram showing the base sequence of the region recognized by gRNA3 in which genome editing (gene deletion) was confirmed in the examples. The site where genome editing (gene deletion) occurred is indicated by "-”.
  • Samples shows the conditions when plant cells are processed, Reads shows the number of sequences for which nucleotide sequence analysis was performed and the number of sequences for which genome editing (gene deletion) was confirmed, and Efficiency shows the efficiency of genome editing.
  • FIG. 13 is a diagram showing the base sequence of the region recognized by gRNA3 in which genome editing (gene deletion) was confirmed in the examples.
  • the site where genome editing (gene deletion) occurred is indicated by "-”.
  • Samples shows the conditions when plant cells are processed, Reads shows the number of sequences for which nucleotide sequence analysis was performed and the number of sequences for which genome editing (gene deletion) was confirmed, and Efficiency shows the efficiency of genome editing.
  • the underline shows the conditions under which significant genome editing (gene deletion) was confirmed.
  • the present invention provides, in one embodiment, a complex comprising a genome editing enzyme and a CPP in which the CPP is fused to the genome editing enzyme.
  • the fusion of CPP will be described later.
  • Typical examples of genome editing enzymes in the complex of this embodiment are TALENs and ZFNs.
  • the invention is a complex comprising a genome editing enzyme, a target gene specific nucleic acid, and a CPP in which the CPP is fused to a genome editing enzyme and / or a target gene specific nucleic acid.
  • a complex comprising a genome editing enzyme, a target gene specific nucleic acid, and a CPP in which the CPP is fused to a genome editing enzyme and / or a target gene specific nucleic acid.
  • the fusion of CPP may be in any manner as long as it does not interfere with the introduction of the complex into plant cells and genome editing.
  • the fusion may be due to a covalent bond such as a peptide bond or a non-covalent bond such as an electrostatic bond or a van der Waals force.
  • the covalent bond may be in any form, but is typically a peptide bond.
  • the genome editing enzyme and CPP may have any positional relationship.
  • the CPP may be fused to the N-terminus of the genome-editing enzyme, to the C-terminus of the genome-editing enzyme, to both the N-terminus and the C-terminus of the genome-editing enzyme, or It may be fused to amino acid residues other than the N-terminal and C-terminal of the genome editing enzyme.
  • CPP is fused to the N-terminus or C-terminus of the genome editing enzyme.
  • the fusion of the genome editing enzyme and CPP may be via a linker.
  • Various linkers are known and can be used. Preferred linkers do not interfere with the introduction of the complex of the invention into plant cells and genome editing.
  • linkers include, but are not limited to, peptides consisting of one to several glycine residues.
  • One CPP may be fused to one genome editing enzyme, or two or more CPPs may be fused.
  • CPP may be fused with a nucleic acid specific to the target gene.
  • the fusion may be carried out at the 3'end of the nucleic acid, at the 5'end, or at any other moiety, such as the sugar and / or base moiety of the nucleic acid.
  • the fusion is carried out at the 3'end of the nucleic acid.
  • a known method such as organic synthesis may be used.
  • One CPP may be fused to one nucleic acid, or two or more CPPs may be fused.
  • CPPs are known.
  • the CPP used in the present invention may be any peptide as long as the complex of the present invention can be directly introduced into plant cells and does not interfere with genome editing.
  • Examples of CPPs that can be used in the present invention include, but are not limited to, peptides rich in basic amino acids (eg, arginine, lysine, histidine), polyhistidine, and the like.
  • the length of CPP that can be used in the present invention is not particularly limited, but is typically several amino acids or more, for example, several amino acids to several tens of amino acids.
  • it may be 6 amino acids to 40 amino acids, 7 amino acids to 30 amino acids, 8 amino acids to 20 amino acids, and for example, 6 amino acids, 7 amino acids, 8 amino acids, 9 amino acids, 10 amino acids, 11 amino acids, 12 amino acids, 13 amino acids, 14 amino acids.
  • amino acids may be present, or it may be 30 amino acids or more. As used herein, a few amino acids mean 2, 3, 4, 5, 5, 6, 7, 8 or 9 amino acids. As used herein, the term tens of amino acids means any number of amino acids in the range of 10 to 100.
  • the constituent amino acid residues are histidine residues, more preferably about 90% or more of the constituent amino acid residues are histidine residues, and even more preferable.
  • examples include peptides (polyhistidine) in which all constituent amino acid residues are histidine residues.
  • the length of polyhistidine is similar to the length of CPP described above.
  • the amino acid residue other than histidine constituting CPP that can be used in the present invention may be any amino acid residue.
  • the amino acid residue other than histidine constituting CPP that can be used in the present invention is a basic amino acid residue such as arginine or lysine, or an amino acid residue having properties similar to histidine.
  • the amino acid residues constituting the CPP that can be used in the present invention may be natural amino acid residues, unnatural amino acid residues, modified amino acid residues, or synthetic amino acid residues. Amino acids can be synthesized and modified by those skilled in the art as appropriate.
  • the CPP that can be used in the present invention can be prepared by a known method such as a peptide synthesis method such as Fmoc solid phase synthesis method or a gene recombination method.
  • the efficiency of introducing the complex of the present invention into plant cells can be increased, and as a result, the efficiency of genome editing is increased.
  • the genome editing enzyme used in the present invention may be any genome editing enzyme and is not particularly limited. Various genome editing enzymes are known. Examples of genome editing enzymes that can be used in the present invention include Cas family nucleases such as Cas9, Cas12, Cas13, Cas ⁇ , and TiD, nucleases such as TALEN and ZFN, activated-induced cytidine deaminase (AID), and Target-G. Deaminase and the like, but are not limited thereto. As used herein, genome editing enzymes include wild-type and mutant forms. Mutant genome editing enzymes include both natural and artificial variants. The mutant genome editing enzyme may be one in which the editing efficiency is increased, decreased, or eliminated as compared with the original enzyme.
  • Methods for producing a mutant genome editing enzyme include, but are not limited to, gene recombination, peptide chemical synthesis, and chemical modification. Further, the genome editing enzyme may be one that cleaves single-stranded DNA, or may be one that cleaves double-stranded DNA.
  • the genome editing enzyme is Cas9. Further in a particular embodiment of the invention, the genome editing enzyme is AID bound to Cas9 whose cleavage activity has been regulated by functional modification.
  • the genome editing enzyme is TALEN or ZFN
  • design these proteins according to the target gene can be performed by a method known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid specific to the target gene is a nucleic acid in which the genome editing enzyme can be placed at the site where a mutation is desired to occur in the target gene.
  • a typical example of a nucleic acid specific to a target gene is, but is not limited to, guide RNA (gRNA).
  • Nucleic acid specific to the target gene can be designed and prepared by using a known method in consideration of the base sequence of the target gene.
  • the gRNA can be designed using known software such as CRISPRdirect, CRISPR-P2.0, Geneius, ApE.
  • the nucleic acid specific for the target gene is specific for the genome editing enzyme and forms a complex with the genome editing enzyme by incubating with the genome editing enzyme. Examples of such nucleic acids and genome editing enzymes include, but are not limited to, gRNA and Cas9.
  • the plants for which genome editing is performed according to the present invention include all kinds of plants.
  • Plants include seed plants as well as fern plants and moss plants.
  • Seed plants include angiosperms and gymnosperms.
  • Angiosperms include dicotyledons and monocotyledons.
  • Dicotyledons include sympetalaes and sympetalaes. Examples of sympetalaes include, but are not limited to, plants such as Bellflower, Ericaceae, Labiatae, Labiatae, Morningglories, Goma, Sakurasou, and Bellflower.
  • petal flowers include plants such as Abrana, Rose, Tsubaki, Nadeshiko, Suberihiyu, Yamamomo, Uri, Mikan, Seri, Mame, and Kusunoki. Not limited.
  • monocotyledons include, but are not limited to, plants such as Iridaceae, Rice, Igusa, Satoimo, Ginger, Tsuyukusa, Hynapple, Basho, Yuri, and Orchid.
  • gymnosperms include, but are not limited to, plants such as Cupressaceae, Pinaceae, Taxodiaceae, Yews, Ginkgoaceae, and Sotetsu.
  • fern plants include, but are not limited to, Asian royal fern, bracken, davallia mariesii, dryopteris crass, horsetail, horsetail, and the like.
  • moss plants include, but are not limited to, liverwort, Juniper haircap, Schistostega, and sphagnum moss.
  • genome editing enzymes may be introduced into various edible plants, horticultural plants, ornamental plants, trees for building materials, trees for roadside trees and windbreak forests, and genome editing may be performed.
  • applications of genome editing include, but are not limited to, breeding and genetic research.
  • the complex of the present invention may be used not only for plants but also for genome editing of microorganisms such as animals, filamentous fungi, yeasts, bacteria and actinomycetes, and algae.
  • the above complex can be produced by using a known method such as a chemical synthesis method or a gene recombination method.
  • a fusion of genome editing enzyme and CPP is obtained by a gene recombination method using a fusion of DNA encoding genome editing enzyme and DNA encoding CPP, and the nucleic acid specific to the target gene is incubated with this fusion.
  • Incubation is usually carried out in aqueous solution at room temperature to about 37 ° C.
  • the aqueous solution may be a buffer solution.
  • the complex may be purified by using a known means such as column chromatography.
  • the polycation moiety is fused to the CPP, and the polycation moiety is electrostatically bound to a nucleic acid specific to the target gene.
  • the complex that is present is mentioned.
  • the genome editing cassette and the CPP are fused via a polycation moiety.
  • the polycation moiety is a moiety having two or more positively charged groups under physiological conditions and can electrostatically bind to a nucleic acid specific to the target gene.
  • Physiological conditions may be, for example, pH conditions in which plant cells can survive or proliferate, or pH conditions in plant cells.
  • Electrostatic binding means that a negatively charged nucleic acid and a positively charged polycation moiety are bound by electrostatic attraction under physiological conditions.
  • the fusion of the polycation moiety and the CPP may be in any manner as long as it does not interfere with the introduction of the complex of the present invention into plant cells and genome editing.
  • the fusion may be, for example, a covalent bond, an electrostatic bond, or a van der Waals force bond.
  • the fusion of the polycation moiety with the CPP is by covalent bond.
  • a typical example of a covalent bond is a peptide bond.
  • the polycation moiety and the CPP may have any positional relationship.
  • the polycation moiety may be attached to the N-terminus of the CPP, to the C-terminus of the CPP, to both the N-terminus and the C-terminus of the CPP, or to the N-terminus of the CPP.
  • linkers are known and can be used. Preferred linkers do not interfere with the introduction of the complex into plant cells and genome editing. In the case of fusion via peptide bonds, examples of linkers include, but are not limited to, peptides consisting of one to several glycine residues.
  • One polycation moiety may be fused to one CPP, or two or more polycation moieties may be fused. Further, one CPP may be fused to one polycation moiety, or two or more CPPs may be fused.
  • the polycation moiety may be of any type as long as it does not interfere with the introduction of the complex of the present invention into plant cells and genome editing.
  • Examples of the polycationic moiety include, but are not limited to, positively charged peptides (preferably polycationic peptides), oligosaccharides, cationic polymers, etc. under physiological conditions.
  • Peptides and oligosaccharides may be wild-type, mutant or modified. Mutant peptides and mutant oligosaccharides, as well as modifications thereof, are capable of electrostatically binding to nucleic acids specific to the target gene equal to or greater than the original peptides and oligosaccharides.
  • the cationic polymer may be of natural origin or may be chemically synthesized.
  • Polycationic peptides are peptides with two or more amino acid residues that are positively charged under physiological conditions, and such peptides are known.
  • Examples of polycationic peptides include, but are not limited to, peptides rich in basic amino acids (eg, lysine, arginine, histidine).
  • the length of the polycation peptide is not particularly limited as long as it does not interfere with the introduction of the complex into plant cells and genome editing, but is typically several amino acids to several tens of amino acids, for example, 6 amino acids to 40 amino acids.
  • polycationic peptides include peptides consisting of lysine and / or arginine residues. Specific examples of the peptide consisting of lysine and / or arginine residue include K8, K9, K10, K11, K12, R8, R9, R10, R11, R12 and the like. Further specific examples of the polycationic peptide include a peptide consisting of several KH repeat sequences.
  • the polycationic peptide is not limited to the above examples.
  • the amino acid residues constituting the polycationic peptide that can be used in the present invention may be natural amino acid residues, unnatural amino acid residues, modified amino acid residues, or synthetic amino acid residues. Amino acids can be synthesized and modified by those skilled in the art as appropriate.
  • Examples of positively charged oligosaccharides include, but are not limited to, polymers of hexosamines such as glucosamine, fructosamine, galactosamine, and mannosamine, such as chitosan.
  • the number of sugar residues of the positively charged oligosaccharide is not particularly limited as long as it does not interfere with the introduction of the complex of the present invention into plant cells and genome editing.
  • cationic polymers include, but are not limited to, polyethyleneimine, polypropyleneimine, poly ( ⁇ -amino ester), polylactic acid / polyglycolic acid, 2-hydroxypropylmethacrylamide, and the like.
  • the length of the cationic polymer is not particularly limited as long as it does not interfere with the introduction of the complex of the present invention into plant cells and genome editing.
  • Polycationic peptides, positively charged oligosaccharides, and cationic polymers can be produced or extracted from nature by methods known to those of skill in the art.
  • the above complex can be produced by a known method. For example, (i) a complex (genome editing cassette) obtained by incubating a nucleic acid specific to a genome editing enzyme and a target gene, and (ii) a fusion of a polycation moiety and CPP are incubated to obtain nucleic acid.
  • the above-mentioned complex may be produced by electrostatically binding the negative charge and the positive charge of the polycation portion. Incubation is usually carried out in aqueous solution at room temperature to about 37 ° C.
  • the aqueous solution may be a buffer solution.
  • the fusion of the polycation moiety and the CPP can be prepared by a known method, for example, a peptide synthesis method such as the Fmoc method, a gene recombination method, or the like. If necessary, the complex may be purified by using a known means such as column chromatography.
  • fusion of the polycation peptide and CPP examples include K10 (G) H8, K10 (G) H12, K10 (G) H16, K10 (G) H20, R10 (G) H20, and the like. Not limited. The parentheses indicate that the glycine residue may or may not be present.
  • the complex of the present invention may further contain a signal sequence.
  • the signal sequence is also called a signal peptide.
  • the complex of the present invention can be localized to the desired intracellular compartment.
  • Various types of signal sequences are known, and examples of the signal sequence include nuclear localization signal sequence (NLS), mitochondrial localization signal sequence (MLS), chloroplast transfer signal sequence (CLS), and the like. Not limited to.
  • the signal sequence can be selected according to the desired localization location in the cell and fused to the complex of the present invention.
  • the complex of the invention, further comprising a signal sequence can be used to perform genome editing at the desired location within the cell.
  • the complex of the present invention containing a nuclear localization signal can be used to perform genome editing in the nucleus without using genetic recombination.
  • the complex of the present invention containing the mitochondrial translocation signal sequence can be used to perform genome editing within mitochondria without the use of genetic recombination.
  • genome editing can be performed in mitochondria without using gene recombination.
  • the signal sequence may be fused to any part of the complex of the present invention such as a genome editing enzyme, a nucleic acid specific to a target gene, and a subdomain (described later).
  • the fusion mode of the signal sequence is of any mode as long as it localizes the complex to the desired location within the cell and does not interfere with the introduction of the complex into plant cells and genome editing. You may.
  • the fusion may be due to a covalent bond such as a peptide bond or a non-covalent bond such as an electrostatic bond or a van der Waals force.
  • the signal sequence is covalently fused to the complex.
  • the covalent bond may be in any form, but is typically a peptide bond.
  • the genome editing enzyme and the signal sequence may have any positional relationship.
  • the signal sequence may be fused to the N-terminus of the genome-editing enzyme, to the C-terminus of the genome-editing enzyme, or to both the N-terminus and the C-terminus of the genome-editing enzyme. Alternatively, it may be fused at amino acid residues other than the N-terminal and C-terminal of the genome editing enzyme.
  • the signal sequence may be inserted within the amino acid sequence of the genome editing enzyme.
  • the signal sequence is fused to the N-terminus or C-terminus of the genome editing enzyme. More preferably, the signal sequence is fused to the N-terminus of the genome editing enzyme.
  • the fusion of the genome editing enzyme and the signal sequence may be via a linker.
  • Various linkers are known and can be used. Preferred linkers are those that localize the complex to the desired location within the cell and do not interfere with the introduction of the complex into plant cells and genome editing. In the case of fusion via peptide bonds, examples of linkers include, but are not limited to, peptides consisting of one to several glycine residues.
  • One signal sequence may be fused to one genome editing enzyme, or two or more signal sequences may be fused.
  • the signal sequence may be fused with the subdomain. Fusion may be performed at the N-terminus of the subdomain, at the C-terminus, or at amino acid residues other than the N-terminus and C-terminus. For the fusion, a known method such as gene recombination or organic synthesis may be used. The fusion of the signal sequence to the subdomain may be via a linker. One signal sequence may be fused to one subdomain, or two or more signal sequences may be fused.
  • the signal sequence may be fused with a nucleic acid specific to the target gene.
  • the fusion may be carried out at the 3'end of the nucleic acid, at the 5'end, or at any other moiety, such as the sugar and / or base moiety of the nucleic acid.
  • the fusion is carried out at the 3'end of the nucleic acid.
  • a known method such as organic synthesis may be used.
  • the fusion of the signal sequence with the nucleic acid may be via a linker.
  • One signal sequence may be fused to one nucleic acid, or two or more signal sequences may be fused.
  • the complex of the present invention may further contain a subdomain.
  • a subdomain refers to a protein having a function.
  • various types of desired genome editing can be performed.
  • the type of subdomain is not particularly limited, and examples thereof include a base substitution enzyme, a DNA methylase, a DNA demethylase, a transcriptional activator, and a transcriptional repressor.
  • Those skilled in the art can appropriately select subdomains and use them in the complex of the present invention.
  • the complex of the present invention containing a base-replacement enzyme as a subdomain can be used to perform base-replacement of the genome without using gene recombination.
  • the complex of the present invention containing DNA methylase as a subdomain can be used to methylate the genome without using gene recombination.
  • the complex of the present invention containing DNA demethylase as a subdomain can be used to demethylate the genome without the use of gene recombination.
  • Using the complex of the present invention containing a transcriptional activating enzyme as a subdomain transcriptional activation of the genome can be performed without using gene recombination.
  • transcriptional repression of the genome can be performed without using gene recombination.
  • Both the signal sequence and the subdomain may be included in the complex of the present invention.
  • a desired type of genome editing can be performed within a desired intracellular compartment.
  • the complex of the present invention containing a nuclear localization signal sequence and a base-replacement enzyme can be used to perform base-replacement of the nuclear genome without using gene recombination.
  • the complex of the present invention containing the nuclear localization signal sequence and DNA methylase can be used to methylate the nuclear genome without the use of gene recombination.
  • the complex of the invention containing the nuclear localization signal sequence and DNA demethylase can be used to demethylate the nuclear genome without the use of gene recombination.
  • the complex of the present invention containing a nuclear localization signal and a transcriptional activating enzyme can be used to carry out transcriptional activation of the nuclear genome without the use of gene recombination.
  • the complex of the present invention containing the mitochondrial transfer signal sequence and the base-substituting enzyme can be used to perform base substitution of the mitochondrial genome without using gene recombination.
  • Using the complex of the present invention containing a chloroplast transfer signal sequence and a transcriptional repressor enzyme transcriptional repression of the chloroplast genome can be performed without using gene recombination.
  • the subdomain may be fused to any part of the complex of the present invention.
  • subdomains are fused to genome editing enzymes.
  • the subdomain may be fused to the N-terminus of the genome-editing enzyme, to the C-terminus of the genome-editing enzyme, or to both the N-terminus and the C-terminus of the genome-editing enzyme.
  • it may be fused at amino acid residues other than the N-terminal and C-terminal of the genome editing enzyme.
  • the subdomain is fused to the N-terminus or C-terminus of the genome editing enzyme.
  • the fusion mode of the genome editing enzyme and the subdomain may be any mode as long as it does not interfere with the function of the subdomain and also does not interfere with the introduction of the complex into plant cells and the genome editing.
  • the fusion may be due to a covalent bond such as a peptide bond or a non-covalent bond such as an electrostatic bond or a van der Waals force.
  • the signal sequence is covalently fused to the complex.
  • the covalent bond may be in any form, but is typically a peptide bond.
  • the fusion of the genome editing enzyme and the subdomain may be via a linker.
  • Various linkers are known and can be used. Preferred linkers do not interfere with the function of the subdomain and do not interfere with the introduction of the complex into plant cells and genome editing. In the case of fusion via peptide bonds, examples of linkers include, but are not limited to, peptides consisting of one to several glycine residues.
  • One subdomain may be fused to one genome editing enzyme, or two or more subdomains may be fused.
  • CPP may be fused to the subdomain.
  • the explanation regarding the fusion between the genome editing enzyme and CPP applies.
  • CPP is fused to a genome editing enzyme
  • the above description relates to the introduction of the complex of the present invention into plant cells, but since the complex of the present invention is highly permeable to cells of all organism species, not only plants but also animals and filaments It can be introduced into cells such as fungi, bacteria, actinomycetes, yeasts, and algae, and is useful for genome editing in a wide range of organisms.
  • the complex of the present invention is highly permeable to plant cells, algae cells, filamentous fungal cells and yeast cells having a cell wall, and is therefore suitable for genome editing of these species.
  • the present invention provides, in a further aspect, a method for genome editing, which comprises introducing the complex of the present invention into a cell.
  • the complex of the present invention may be introduced into cells by incubating the complex of the present invention and cells in a medium.
  • Those skilled in the art can appropriately select and change the method for introducing the complex of the present invention into cells, the type of medium, and the conditions for incubation according to the type of cells.
  • the cells are typically plant cells.
  • the complex of the present invention can be introduced into any form of plant cell or any plant tissue.
  • the complex of the present invention can be introduced into leaves, stems, shoot apex, winter buds, roots, seeds, spores, pollen, cultured cells and the like of plants.
  • plant leaves, stems, shoot apex, winter buds, roots, seeds, spores, pollen, cultured cells and the like may be collectively referred to as plant cells.
  • nucleic acids specific to one or more types of target genes may be introduced.
  • one or more kinds of genome editing enzymes may be introduced. That is, one kind of complex of the present invention may be used for genome editing, or two or more kinds of the complex of the present invention may be used.
  • the present invention in a further aspect, provides a genome editing kit containing the complex of the present invention or a component thereof.
  • the constituent components of the complex of the present invention include CPP, a polycation moiety, a fusion of a genome editing enzyme and CPP, and a fusion of a polycation moiety and CPP.
  • the complex of the present invention may be obtained by combining the constituent components of the complex of the present invention.
  • an instruction manual is attached to the kit.
  • the species whose genome can be edited using the kit of the present invention is not particularly limited as described above.
  • the kit of the present invention is suitably used for genome editing of plants, algae, filamentous fungi and yeast having a cell wall.
  • the present invention relates to a complex obtained by fusing a genome editing cassette (for example, genome editing enzymes Cas9 and gRNA) with a CPP (for example, H8 to H20 peptides), and for a plant by directly introducing the complex into a plant cell.
  • a genome editing cassette for example, genome editing enzymes Cas9 and gRNA
  • CPP for example, H8 to H20 peptides
  • Fusion of CPPs can be done by covalent or non-covalent bonds (eg, electrostatic bonds).
  • Specific examples of the fusion method include a method of preparing and using a recombinant protein in which the genome editing enzyme Cas9 and CPP are genetically engineered (recombinant protein method), and an electrostatic binding of CPP to a genome editing cassette. There is a method (peptide method).
  • the complex of the present invention can be prepared using these methods.
  • a Cas9-CPP recombinant fusion protein (eg, a fusion protein of Cas9 and H8 to H20 CPP) is prepared using an Escherichia coli expression system and incubated with gRNA for cleaving the target region.
  • the complex can be formed in this way, and the resulting complex can be introduced into plant cells for genome editing.
  • the genome editing enzyme Cas9 and gRNA are incubated to form a complex, and a fusion of a polycation moiety and CPP (for example, a fusion of K10 and H8 to H20 and CPP) is obtained from the complex.
  • a fusion of a polycation moiety and CPP for example, a fusion of K10 and H8 to H20 and CPP
  • the complex thus obtained can be introduced into plant cells for genome editing.
  • the genome editing enzyme cassette is directly introduced into the plant cells without relying on gene recombination, so that all the problems of the conventional genome editing technology can be overcome and the genome editing cells can be easily and quickly introduced. Can be obtained.
  • the numerical values in the present specification may include numerical values in the range of ⁇ 5%, ⁇ 10% or ⁇ 20%.
  • Amino acid notation in the present specification uses a known one-letter method or three-letter method.
  • a number is added to the right of the amino acid indicated by the one-letter method.
  • H20 means a peptide consisting of 20 histidine residues.
  • K10 means a peptide consisting of 10 lysine residues.
  • K10H20 means a peptide in which the N-terminal of a peptide consisting of 20 histidine residues is bound to the C-terminal of a peptide consisting of 10 lysine residues.
  • K10GH20 means a peptide in which a peptide consisting of 10 lysine residues, a peptide consisting of 1 glycine residue, and a peptide consisting of 20 histidine residues are bound from the N-terminal to the C-terminal.
  • the peptide may contain a bond other than the peptide bond. Unless otherwise specified, a bond between amino acid residues in a peptide is a peptide bond.
  • a fusion of a genome editing enzyme and CPP is represented by using a hyphen (-).
  • Cas9-H20 means a fusion in which CPP (H20) is bound to the C-terminal of the genome editing enzyme Cas9.
  • the binding between the genome editing enzyme and CPP is a peptide bond.
  • BL21 (DE3) strain was used as Escherichia coli expressing the test cells Cas9 and CPP fusion Cas9.
  • plant cells callus and callus-derived cells of cedar (Cryptomeria japonica), which is a tree plant, and cultured cells of rice (Oryza sativa), which is a herbaceous plant, were used.
  • 1 / 2MD agar medium was used for passage of Sugikarus, and passage was performed at weekly intervals.
  • 1 / 2MD liquid medium was used for suspension and testing of cells derived from sugikarus, and the cells were cultured with shaking at 25 ° C. and 120 rpm in the dark.
  • MS liquid medium was used for subculture of cultured rice cells, and subculture was performed at weekly intervals.
  • MS liquid medium was used for suspension and testing of cultured rice cells, and the cells were cultured with shaking at 27 ° C. and 120 rpm in the dark.
  • Cas9-H8 Cas9-H12, Cas9-H16, and Cas9-H20 fused with cell-penetrating peptides (CPPs) H8, H12, H16, and H20 peptides were prepared as recombinant proteins. ..
  • the expression plasmid used pET24b and the host E. coli strain BL21 (DE3) was used.
  • the recombinant protein was expressed in cells at 20 ° C. for 18 hours, and the cell disruption solution was purified with a Co (cobalt) ion-immobilized resin (manufactured by GE Healthcare).
  • CPP fusion Cas9 (Cas9-H8, Cas9-H12, Cas9-H16, Cas9-H20) (20 ⁇ M) dissolved in SEC Buffer (20 mM HEPES-KOH, 500 mM KCl, pH 7.5) and Duplex Buffer (30 mM HEPES-KOH). , 100 mM potassium acetate, pH 7.5) was mixed in equal amounts of gRNA (20 ⁇ M) and incubated at room temperature for 15 minutes to prepare a gRNA + CPP fusion Cas9 complex (10 ⁇ M).
  • gRNA + Cas9 complex (10 ⁇ M) was prepared in a similar manner.
  • Three types of gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) were used (the same applies to the following experiments).
  • These gRNAs are a sugimagamma kiratase gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 1): a specific site of the CjCHLI gene (sites labeled as gRNA1 and gRNA2 in FIG. 2) and rice E3 ubiquitin-protein ligase GW2.
  • Gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 2): Targets a specific site of the OsGW2 gene (site labeled gRNA3 in FIG. 8).
  • the gRNA1 site and the gRNA2 site are represented by the bases 56 to 78 and 1094 to 1116 of SEQ ID NO: 1, respectively.
  • the gRNA3 site is represented by the 1796-1818 base of SEQ ID NO: 2.
  • gRNA1 and gRNA2 were designed using known software (ApE), and gRNA3 was designed using known software (CRISPRdirect and CRISPR-P2.0).
  • K10G-CPP K10GH8, K10H12, K10H16, K10H20 peptide (20, 200, 2000 ⁇ M) dissolved in Duplex Buffer (30 mM HEPES-KOH, 100 mM potassium acetate, pH 7.5) was added to the gRNA + Cas9 complex, etc.
  • the gRNA + Cas9 + CPP complex was prepared by mixing the amounts and incubating at room temperature for 60 minutes.
  • the gRNA used was the above gRNA1, gRNA2, and gRNA3.
  • Genome editing test 360 ⁇ L of cedar cells (20 mg / mL in 1 / 2MD liquid medium) or 360 ⁇ L of rice cells (20 mg / mL in MS liquid medium) 1 week after passage was dispensed into a 5 mL falcon round tube made of polystyrene. did. 40 ⁇ L of the gRNA + CPP fusion Cas9 complex or gRNA + Cas9 + CPP complex prepared above was mixed with 360 ⁇ L of Sugi cells or 360 ⁇ L of rice cells. Then, the cells were shake-cultured at 25 ° C. and 120 rpm for 24-72 hours in the dark. Under the above experimental conditions, it was confirmed that the fluorescently modified gRNA + CPP fusion Cas9 complex or gRNA + Cas9 + CPP complex was incorporated into Sugi cells and rice cells.
  • Sugi cells or rice cells after culturing were collected by centrifugation (500 g ⁇ 10 min, 4 ° C) and washed multiple times with 1 / 2MD liquid medium.
  • genomic DNA was extracted from cedar cells or rice cells, and the gene region targeted for genome editing was amplified by PCR. ..
  • the presence or absence of genome editing was evaluated by subjecting this PCR product to amplicon sequence analysis.
  • the presence or absence of genome editing was evaluated by cloning the PCR product and subjecting it to Sanger sequence analysis.
  • gRNA1 or gRNA2 corresponding to the target gene
  • CjCHLI gene the target gene
  • four types of genome editing were confirmed in the recombinant protein method (gRNA + CPP fusion Cas9 complex) (gene deletion). 3, FIG. 4, and FIG. 7).
  • gRNA + CPP fusion Cas9 complex the recombinant protein method
  • FIG. 7 the peptide method
  • 6 types of genome editing were confirmed (FIGS. 3, FIG. 4, FIG. 5, FIG. 6, FIG. 7).
  • genome editing was performed when four types of CPP fusion Cas9 (Cas9-H8, Cas9-H12, Cas9-H16, Cas9-H20) were used. ) was confirmed.
  • CPP fusion Cas9 Cas9-H8, Cas9-H12, Cas9-H16, Cas9-H20
  • peptide method gRNA + Cas9 + CPP complex
  • K10GH8, K10GH12, K10GH16, K10GH20 peptide were used.
  • gRNA3 corresponding to the target gene OsGW2 gene
  • five kinds of genome editing were confirmed by the recombinant protein method (gRNA + CPP fusion Cas9 complex) (FIGS. 8, FIG. 9, FIG. 10). , FIG. 11, FIG. 12).
  • gRNA + CPP fusion Cas9 complex genome editing (gene deletion) was confirmed when three types of CPP fusion Cas9 (Cas9-H8, Cas9-H16, Cas9-H20) were used.
  • the cedar used in the examples of the present invention is an agricultural product that takes an extremely long time per generation, and when a conventional genome editing technique dependent on gene recombination is used, a foreign gene (genome editing enzyme Cas9) by mating is used. Breeding was impractical because it would take decades to remove the gene).
  • the present invention is considered to exert tremendous power even in genome editing of such crops with a long generation time (molecular breeding using genome editing, for example, breeding).
  • the present invention can be used in fields such as agriculture, forestry, food, pharmaceuticals, and plant research, breeding, and breeding.

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Abstract

本発明は、ゲノム編集酵素および細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む複合体であって、ＣＰＰがゲノム編集酵素に融合している複合体；ゲノム編集酵素、標的遺伝子に特異的な核酸、およびＣＰＰを含む複合体であって、ＣＰＰがゲノム編集酵素および／または標的遺伝子に特異的な核酸に融合している複合体；ポリカチオン部分がＣＰＰに融合しており、ポリカチオン部分が標的遺伝子に特異的な核酸と静電気的に結合している上記複合体；上記複合体を用いるゲノム編集方法；ならびにこれらの複合体を含むゲノム編集用キットを提供する。

Description

細胞膜透過ペプチドを利用した遺伝子組換えに頼らない植物ゲノム編集技術
　本発明は、新規複合体を用いるゲノム編集技術に関する。詳細には、本発明は、遺伝子組換えによらず、ゲノム編集酵素と核酸を植物細胞に直接導入する技術に関する。
　本願は、日本国特許出願である特願２０２０－２１１３０１に対して優先権主張するものであり、参照により特願２０２０－２１１３０１の全内容を本願に一体化させる。
　「ゲノム編集技術」は、生物機能を改変する革新的技術として、基礎研究から応用研究（例えば医療や農作物育種）までの幅広い分野で利用されつつある。しかし、植物を対象とした従来のゲノム編集技術には、「操作に多大なる時間と煩雑さを伴う」という致命的な課題が存在している。この最大の理由として、従来の植物ゲノム編集技術は遺伝子組換え技術に依存している点が挙げられる。従来の植物ゲノム編集技術では、遺伝子組換えにより、ゲノム編集カセット遺伝子（ゲノム編集酵素と標的遺伝子に特異的な核酸を合成する遺伝子）を植物細胞内に導入し、ゲノム編集を誘発した後に、ゲノム編集酵素遺伝子を欠失した細胞を選抜することで、ゲノム編集細胞を取得するという手法がとられている。しかし、遺伝子組換え技術が適用できない植物種にはゲノム編集カセット遺伝子が導入できないため、現在、ゲノム編集が可能な植物種は一部に限られている。また、外来遺伝子であるゲノム編集酵素遺伝子を植物細胞に一度導入するため、この外来遺伝子を除去しない限りは遺伝子組換え生物として扱われるため、このままでは商業利用は極めて困難である。外来遺伝子の除去は、交配を繰り返すことでのみ可能であり、ゆえに上述のごとくゲノム編集カセット遺伝子の除去には多大なる時間を要するという問題点が存在する。
　上記のような従来の植物ゲノム編集技術の諸問題点を克服するために、遺伝子組換えに頼らないゲノム編集技術の開発が盛んに行われている。具体的には、ゲノム編集酵素をタンパク質の状態で植物細胞内に直接導入することで、遺伝子組換えを介さずにゲノム編集を誘発する手法が提案されている（非特許文献１）。しかしながら、植物細胞は強い負電荷を帯びた細胞壁を有しているため、タンパク質を植物細胞内へ導入しようとした場合、塩基性タンパク質は細胞壁にトラップされ、一方で酸性タンパク質は細胞壁にはじかれてしまう。パーティクルガンやエレクトロポレーション法を用いて強制的に植物細胞内にタンパク質を導入することはできるが、特殊・高価な専用装置を必要とする。これまでのところ、細胞壁を有した状態の植物細胞内に簡便にタンパク質を導入する汎用的な手法は皆無である。ゆえに、ゲノム編集酵素を簡便に植物細胞内へ導入する手法もまた皆無であり、このような現状がゲノム編集技術を利用した植物機能改変（特に農作物育種）を極めて大幅に遅らせている要因である。
Svitashev S. et al., Nat. Commun. 2016; 7: 13274.
　遺伝子組換えによらずに、しかも広範な植物種において簡便に植物ゲノム編集を可能ならしめる技術が求められている。
　本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、ゲノム編集酵素と細胞膜透過ペプチド（以下において「ＣＰＰ」と称することがある）を含む複合体、ならびにゲノム編集カセット（ゲノム編集酵素と標的遺伝子に特異的な核酸）とＣＰＰを含む複合体を用いることにより、遺伝子組換えを要することなくゲノム編集カセットを植物細胞に直接導入できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のものを提供する：
　（１）ゲノム編集酵素およびＣＰＰを含む複合体であって、ＣＰＰがゲノム編集酵素に融合している複合体。
　（２）ゲノム編集酵素、標的遺伝子に特異的な核酸、およびＣＰＰを含む複合体であって、ＣＰＰがゲノム編集酵素および／または標的遺伝子に特異的な核酸に融合している複合体。
　（３）ＣＰＰがゲノム編集酵素および／または標的遺伝子に特異的な核酸に共有結合している、（１）または（２）記載の複合体。
　（４）ＣＰＰがゲノム編集酵素に共有結合している、（３）記載の複合体。
　（５）ポリカチオン部分がＣＰＰに融合しており、ポリカチオン部分が標的遺伝子に特異的な核酸と静電気的に結合している、（２）記載の複合体。
　（６）ポリカチオン部分がＣＰＰに共有結合している、（５）記載の複合体。
　（７）ポリカチオン部分がポリカチオンペプチドである、（６）記載の複合体。
　（８）ポリカチオンペプチドが１０個以上のリジン残基または１０個以上のアルギニン残基を含む、（７）記載の複合体。
　（９）ＣＰＰの８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、ＣＰＰの長さが８アミノ酸～数十アミノ酸である、（１）～（８）のいずれか記載の複合体。
　（１０）ＣＰＰのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である、（９）記載の複合体。
　（１１）さらにシグナル配列を含む、（１）～（１０）のいずれか記載の複合体。
　（１２）さらにサブドメインを含む、（１）～（１１）のいずれか記載の複合体。
　（１３）（１）～（１２）のいずれか記載の複合体を細胞に導入することを含む、ゲノム編集方法。
　（１４）細胞が、植物細胞、藻類細胞、糸状菌細胞、または酵母細胞である、（１３）記載の方法。
　（１５）（１）～（１２）のいずれか記載の複合体またはその構成成分を含む、ゲノム編集用キット。
　（１６）植物、藻類、糸状菌、または酵母のゲノム編集用である、（１５）記載のキット。
　本発明によれば、遺伝子組換えを要することなくゲノム編集酵素やゲノム編集カセットを植物細胞に直接導入できる。したがって、遺伝子組換え技術が適用できない植物種に対してもゲノム編集酵素やゲノム編集カセットを導入でき、ゲノム編集を行うことができる。本発明の複合体と植物細胞を培地中でインキュベーションするだけで、ゲノム編集酵素やゲノム編集カセットを植物細胞に導入することができる。また、本発明によるゲノム編集は効率が高い。要するに、本発明の複合体を用いることにより、遺伝子組換えを要することなく、広範な植物種に対して簡便かつ効率よくゲノム編集を行うことができる。本発明により得られたゲノム編集植物は外来遺伝子を保有せず、遺伝子組換え生物に該当しないため、即座に商業利用することが可能であり、商業価値は極めて高い。
　「ゲノム編集酵素を植物細胞に直接導入」とは、ゲノム編集酵素を活性のあるタンパク質として植物細胞内に導入することをいう。「ゲノム編集カセットを植物細胞に直接導入」とは、ゲノム編集酵素と標的遺伝子に特異的な核酸の複合体を植物細胞に導入することであって、ゲノム編集酵素と核酸の複合体を活性のあるタンパク質複合体として植物細胞内に導入することをいう。
図１は、本発明の複合体を用いたゲノム編集法と従来法の比較説明のための図である。 図２は、実施例において標的遺伝子としたスギマグネシウムキラターゼ遺伝子（ＣｊＣＨＬＩ遺伝子）の塩基配列を示す図である。図中、「ｇＲＮＡ１」および「ｇＲＮＡ２」は、それぞれｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２の認識部位を示す。 図３は、実施例においてゲノム編集（遺伝子欠失）が確認されたｇＲＮＡ１が認識する領域の塩基配列を示す図である。ゲノム編集（遺伝子欠失）が発生した部位を「－」で示す。また、Ｓａｍｐｌｅｓは植物細胞を処理した際の条件を示し、Ｒｅａｄｓは塩基配列解析を実施した配列数とゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された配列数を示し、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙはゲノム編集効率を示す。下線は有意にゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された条件を示す。 図４は、実施例においてゲノム編集（遺伝子欠失）が確認されたｇＲＮＡ２が認識する領域の塩基配列を示す図である。ゲノム編集（遺伝子欠失）が発生した部位を「－」で示す。また、Ｓａｍｐｌｅｓは植物細胞を処理した際の条件を示し、Ｒｅａｄｓは塩基配列解析を実施した配列数とゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された配列数を示し、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙはゲノム編集効率を示す。下線は有意にゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された条件を示す。 図５は、実施例においてゲノム編集（遺伝子欠失）が確認されたｇＲＮＡ２が認識する領域の塩基配列を示す図である。ゲノム編集（遺伝子欠失）が発生した部位を「－」で示す。また、Ｓａｍｐｌｅｓは植物細胞を処理した際の条件を示し、Ｒｅａｄｓは塩基配列解析を実施した配列数とゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された配列数を示し、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙはゲノム編集効率を示す。下線は有意にゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された条件を示す。 図６は、実施例においてゲノム編集（遺伝子欠失）が確認されたｇＲＮＡ２が認識する領域の塩基配列を示す図である。ゲノム編集（遺伝子欠失）が発生した部位を「－」で示す。また、Ｓａｍｐｌｅｓは植物細胞を処理した際の条件を示し、Ｒｅａｄｓは塩基配列解析を実施した配列数とゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された配列数を示し、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙはゲノム編集効率を示す。下線は有意にゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された条件を示す。 図７は、実施例においてゲノム編集（遺伝子欠失）が確認されたｇＲＮＡ２が認識する領域の塩基配列を示す図である。ゲノム編集（遺伝子欠失）が発生した部位を「－」で示す。また、Ｓａｍｐｌｅｓは植物細胞を処理した際の条件を示し、Ｒｅａｄｓは塩基配列解析を実施した配列数とゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された配列数を示し、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙはゲノム編集効率を示す。下線は有意にゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された条件を示す。 図８Ａは、実施例において標的遺伝子としたイネＥ３ユビキチン－プロテインリガーゼＧＷ２遺伝子（ＯｓＧＷ２遺伝子）の塩基配列を示す図である。図中、「ｇＲＮＡ３」はｇＲＮＡ３の認識部位を示す。 図８Ｂは、図８Ａの続きであり、実施例において標的遺伝子としたイネＥ３ユビキチン－プロテインリガーゼＧＷ２遺伝子（ＯｓＧＷ２遺伝子）の塩基配列を示す図である。 図９は、実施例においてゲノム編集（遺伝子欠失）が確認されたｇＲＮＡ３が認識する領域の塩基配列を示す図である。ゲノム編集（遺伝子欠失）が発生した部位を「－」で示す。また、Ｓａｍｐｌｅｓは植物細胞を処理した際の条件を示し、Ｒｅａｄｓは塩基配列解析を実施した配列数とゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された配列数を示し、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙはゲノム編集効率を示す。下線は有意にゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された条件を示す。 図１０は、実施例においてゲノム編集（遺伝子欠失）が確認されたｇＲＮＡ３が認識する領域の塩基配列を示す図である。ゲノム編集（遺伝子欠失）が発生した部位を「－」で示す。また、Ｓａｍｐｌｅｓは植物細胞を処理した際の条件を示し、Ｒｅａｄｓは塩基配列解析を実施した配列数とゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された配列数を示し、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙはゲノム編集効率を示す。下線は有意にゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された条件を示す。 図１１は、実施例においてゲノム編集（遺伝子欠失）が確認されたｇＲＮＡ３が認識する領域の塩基配列を示す図である。ゲノム編集（遺伝子欠失）が発生した部位を「－」で示す。また、Ｓａｍｐｌｅｓは植物細胞を処理した際の条件を示し、Ｒｅａｄｓは塩基配列解析を実施した配列数とゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された配列数を示し、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙはゲノム編集効率を示す。下線は有意にゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された条件を示す。 図１２は、実施例においてゲノム編集（遺伝子欠失）が確認されたｇＲＮＡ３が認識する領域の塩基配列を示す図である。ゲノム編集（遺伝子欠失）が発生した部位を「－」で示す。また、Ｓａｍｐｌｅｓは植物細胞を処理した際の条件を示し、Ｒｅａｄｓは塩基配列解析を実施した配列数とゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された配列数を示し、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙはゲノム編集効率を示す。下線は有意にゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された条件を示す。 図１３は、実施例においてゲノム編集（遺伝子欠失）が確認されたｇＲＮＡ３が認識する領域の塩基配列を示す図である。ゲノム編集（遺伝子欠失）が発生した部位を「－」で示す。また、Ｓａｍｐｌｅｓは植物細胞を処理した際の条件を示し、Ｒｅａｄｓは塩基配列解析を実施した配列数とゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された配列数を示し、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙはゲノム編集効率を示す。下線は有意にゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された条件を示す。
　本発明は、１の態様において、ゲノム編集酵素およびＣＰＰを含む複合体であって、ＣＰＰがゲノム編集酵素に融合している複合体を提供する。ＣＰＰの融合については後で説明する。この態様の複合体中のゲノム編集酵素の典型例はＴＡＬＥＮやＺＦＮである。
　本発明は、さらなる態様において、ゲノム編集酵素、標的遺伝子に特異的な核酸、およびＣＰＰを含む複合体であって、ＣＰＰがゲノム編集酵素および／または標的遺伝子に特異的な核酸に融合している複合体を提供する。
　ＣＰＰの融合は、複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げないかぎり、いずれの様式によるものであってもよい。融合は、例えばペプチド結合などの共有結合によるものであってもよく、静電気的結合、ファンデルワールス力などの非共有結合によるものであってもよい。ＣＰＰがゲノム編集酵素に共有結合する場合、共有結合はいずれの形態であってもよいが、典型的にはペプチド結合である。
　ゲノム編集酵素とＣＰＰはいずれの位置関係にあってもよい。ＣＰＰがゲノム編集酵素のＮ末端に融合していてもよく、ゲノム編集酵素のＣ末端に融合していてもよく、ゲノム編集酵素のＮ末端およびＣ末端の両方に融合していてもよく、あるいはゲノム編集酵素のＮ末端およびＣ末端以外のアミノ酸残基に融合していてもよい。好ましくは、ＣＰＰがゲノム編集酵素のＮ末端またはＣ末端に融合している。ゲノム編集酵素とＣＰＰの融合はリンカーを介するものであってもよい。様々なリンカーが知られており、使用することができる。好ましいリンカーは、本発明の複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げないものである。ペプチド結合を介する融合の場合、リンカーの例として、１個～数個のグリシン残基からなるペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。１個のゲノム編集酵素に１個のＣＰＰが融合していてもよく、２個以上のＣＰＰが融合していてもよい。
　ＣＰＰを標的遺伝子に特異的な核酸と融合させてもよい。融合は、核酸の３’末端で行ってもよく、５’末端で行ってもよく、これら以外の部分、例えば核酸の糖部分および／または塩基部分にて行ってもよい。好ましくは、融合は、核酸の３’末端にて行われる。融合には、例えば有機合成などの公知の方法を用いてもよい。１個の核酸に１個のＣＰＰが融合していてもよく、２個以上のＣＰＰが融合していてもよい。
　様々なＣＰＰが公知である。本発明に用いるＣＰＰは、本発明の複合体を植物細胞に直接導入でき、ゲノム編集を妨げないものであれば、いずれのペプチドであってもよい。本発明において使用しうるＣＰＰの例としては、塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン）に富むペプチド、あるいはポリヒスチジンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明において使用しうるＣＰＰのさらなる例としては、長さが数アミノ酸以上で、構成アミノ酸の半数以上がヒスチジンであるペプチドが挙げられる。このようなペプチドは優れた細胞膜透過性を有する。
　本発明において使用しうるＣＰＰの長さは特に限定されないが、典型的には数アミノ酸以上、例えば数アミノ酸～数十アミノ酸である。例えば６アミノ酸～４０アミノ酸、７アミノ酸～３０アミノ酸、８アミノ酸～２０アミノ酸であってもよく、例えば６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２２アミノ酸、２３アミノ酸、２４アミノ酸、２５アミノ酸、２６アミノ酸、２７アミノ酸、２８アミノ酸、２９アミノ酸、３０アミノ酸であってもよく、あるいは３０アミノ酸以上であってもよい。本明細書において、数アミノ酸はアミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個を意味する。本明細書において、数十アミノ酸とは、１０～１００個の範囲の任意のアミノ酸数を意味する。
　本発明において使用しうるＣＰＰの好ましい例としては、構成アミノ酸残基の約８０％以上がヒスチジン残基であり、より好ましくは構成アミノ酸残基の約９０％以上がヒスチジン残基であり、さらに好ましくはすべての構成アミノ酸残基がヒスチジン残基であるペプチド（ポリヒスチジン）が挙げられる。ポリヒスチジンの長さは、上で説明したＣＰＰの長さと同様である。
　本発明において使用しうるＣＰＰを構成するヒスチジン以外のアミノ酸残基はいずれのアミノ酸残基であってもよい。好ましくは、本発明において使用しうるＣＰＰを構成するヒスチジン以外のアミノ酸残基は、アルギニン、リジンなどの塩基性アミノ酸残基、あるいはヒスチジンと類似の特性を有するアミノ酸残基である。本発明において使用しうるＣＰＰを構成するアミノ酸残基は天然アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、修飾アミノ酸残基、あるいは合成アミノ酸残基であってもよい。アミノ酸の合成や修飾は当業者が適宜行いうる。
　本発明において使用しうるＣＰＰは、Ｆｍｏｃ固相合成法などのペプチド合成法や遺伝子組換え法などの公知の方法により調製することができる。
　細胞膜透過性の高いペプチド（上で説明したようなペプチド）を用いることにより、本発明の複合体の植物細胞への導入効率を高めることができ、その結果ゲノム編集効率が高くなる。
　本発明に使用されるゲノム編集酵素はいずれのゲノム編集酵素であってもよく、特に限定されない。ゲノム編集酵素は様々なものが公知である。本発明に使用可能なゲノム編集酵素の例としては、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓφ、ＴｉＤなどのＣａｓファミリーのヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなどのヌクレアーゼ、Activated-induced cytidine deaminase（ＡＩＤ）やTarget-Gなどのデアミナーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において、ゲノム編集酵素は野生型および変異型を包含する。変異型ゲノム編集酵素は自然変異体および人工変異体の両方を包含する。変異型ゲノム編集酵素は、元の酵素と比較して、編集効率が増大したもの、減じられたもの、あるいは消失したものであってもよい。変異型ゲノム編集酵素の製造方法は公知であり、遺伝子組換え、ペプチド化学合成、化学修飾などが挙げられるが、これらの方法に限定されない。また、ゲノム編集酵素は、一本鎖ＤＮＡを切断するものであってもよく、二本鎖ＤＮＡを切断するものであってもよい。
　本発明の特別な具体例において、ゲノム編集酵素はＣａｓ９である。さらなる本発明の特別な具体例において、ゲノム編集酵素は、機能改変により切断活性を調節されたＣａｓ９に結合しているＡＩＤである。
　ゲノム編集酵素がＴＡＬＥＮやＺＦＮである場合は、標的遺伝子に合わせてこれらのタンパク質を設計する。このような設計は当業者に公知の方法にて行うことができる。
　標的遺伝子に特異的な核酸は、標的遺伝子中の変異を生じさせたい部位にゲノム編集酵素を配置することができる核酸である。標的遺伝子に特異的な核酸の典型例としてはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が挙げられるが、これに限定されない。標的遺伝子に特異的な核酸は、標的遺伝子の塩基配列を考慮して、公知の方法を用いて設計、作成することができる。ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ２．０、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、ＡｐＥなどの公知のソフトウェアを用いてｇＲＮＡを設計することができる。好ましくは、標的遺伝子に特異的な核酸は、ゲノム編集酵素に対して特異的であって、ゲノム編集酵素とインキュベートすることによりゲノ編集酵素と複合体を形成するものである。このような核酸とゲノム編集酵素の例としては、ｇＲＮＡとＣａｓ９が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明によりゲノム編集が行われる植物はあらゆる種類の植物を包含する。植物は、種子植物ならびにシダ植物、およびコケ植物を包含する。種子植物は被子植物および裸子植物を包含する。被子植物は双子葉類および単子葉類を包含する。双子葉類は合弁花類および離弁花類を包含する。合弁花類の例としてはキク科、ツツジ科、シソ科、ナス科、ヒルガオ科、ゴマ科、サクラソウ科、キキョウ科などの植物が挙げられるが、これらに限定されない。離弁花類の例としてはアブラナ科、バラ科、ツバキ科、ナデシコ科、スベリヒユ科、ヤマモモ科、ウリ科、ミカン科、セリ科、マメ科、クスノキ科などの植物が挙げられるが、これらに限定されない。単子葉類の例としてはアヤメ科、イネ科、イグサ科、サトイモ科、ショウガ科、ツユクサ科、ハイナップル科、バショウ科、ユリ科、ラン科などの植物が挙げられるが、これらに限定されない。裸子植物の例としてはヒノキ科、マツ科、スギ科、イチイ科、イチョウ科、ソテツ科などの植物が例示されるが、これらに限定されない。シダ植物の例としてはゼンマイ、ワラビ、シノブ、オシダ、スギナ、トクサなどが挙げられるが、これらに限定されない。コケ植物の例としてはゼニゴケ、スギゴケ、ヒカリゴケ、ミズゴケなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明を用いて様々な食用植物、園芸植物、観賞用植物、建材用の樹木、街路樹や防風林用の樹木などにゲノム編集酵素を導入し、ゲノム編集を行ってもよい。ゲノム編集の応用例として品種改良や遺伝学的研究などが挙げられるが、これに限定されない。
　本発明の複合体を植物のみならず、動物、糸状菌、酵母、細菌および放線菌などの微生物、ならびに藻類のゲノム編集に用いてもよい。
　上記複合体は、化学合成法や遺伝子組換え法などの公知の方法を用いて製造することができる。例えば、ゲノム編集酵素をコードするＤＮＡおよびＣＰＰをコードするＤＮＡの融合物を用いる遺伝子組換え法により、ゲノム編集酵素とＣＰＰの融合物を得て、これと標的遺伝子に特異的な核酸とをインキュベーションすることにより、上記複合体を得てもよい。インキュベーションは、通常は、水溶液中で室温ないし約３７℃で行われる。水溶液は緩衝液であってもよい。必要に応じて、カラムクロマトグラフィー等の公知の手段を用いて複合体を精製してもよい。
　ＣＰＰが非共有結合にて融合している本発明の複合体の例としては、ポリカチオン部分がＣＰＰに融合しており、ポリカチオン部分が標的遺伝子に特異的な核酸と静電気的に結合している複合体が挙げられる。上記複合体において、ゲノム編集カセットとＣＰＰはポリカチオン部分を介して融合されている。
　ポリカチオン部分は、生理学的条件下において、２つ以上の正電荷を有する基を有する部分であって、標的遺伝子に特異的な核酸に静電気的に結合しうる部分である。生理学的条件下は、例えば植物細胞が生存または増殖可能なｐＨの条件下、あるいは植物細胞中のｐＨの条件下であってもよい。
　静電気的に結合するとは、生理学的条件下で負電荷を帯びた核酸と正電荷を帯びたポリカチオン部分が静電気的引力によって結合することをいう。
　ポリカチオン部分とＣＰＰとの融合は、本発明の複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げないかぎり、いずれの様式によるものであってもよい。融合は、例えば共有結合、静電気的結合、ファンデルワールス力による結合によるものであってもよい。典型的には、ポリカチオン部分とＣＰＰとの融合は共有結合による。共有結合の典型例はペプチド結合である。ポリカチオン部分とＣＰＰはいずれの位置関係にあってもよい。ポリカチオン部分がＣＰＰのＮ末端に結合していてもよく、ＣＰＰのＣ末端に結合していてもよく、ＣＰＰのＮ末端およびＣ末端の両方に結合していてもよく、あるいはＣＰＰのＮ末端およびＣ末端以外のアミノ酸残基に結合していてもよい。ポリカチオン部分とＣＰＰの結合はリンカーを介するものであってもよい。様々なリンカーが知られており、使用することができる。好ましいリンカーは、複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げないものである。ペプチド結合を介する融合の場合、リンカーの例として、１個～数個のグリシン残基からなるペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。１つのＣＰＰに１つのポリカチオン部分が融合していてもよく、２つ以上のポリカチオン部分が融合していてもよい。また、１つのポリカチオン部分に１つのＣＰＰが融合していてもよく、２つ以上のＣＰＰが融合していてもよい。
　ポリカチオン部分は、本発明の複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げないかぎり、いずれの種類であってもよい。ポリカチオン部分の例としては、生理学的条件下で正電荷を帯びたペプチド（好ましくはポリカチオンペプチド）、オリゴ糖、カチオン性ポリマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドおよびオリゴ糖は野生型であってもよく、変異型または修飾体であってもよい。変異型ペプチドおよび変異型オリゴ糖、ならびにそれらの修飾体は、元のペプチドおよびオリゴ糖と同等またはそれ以上の標的遺伝子に特異的な核酸との静電気的結合能を有するものである。カチオン性ポリマーは、天然由来のものであってもよく、化学合成されたものであってもよい。
　ポリカチオンペプチドは、生理学的条件下で正電荷を有する２つ以上のアミノ酸残基を有するペプチドであり、そのようなペプチドは公知である。ポリカチオンペプチドの例としては、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）に富むペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ポリカチオンペプチドの長さは、複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げないかぎり、特に限定されないが、典型的には数アミノ酸～数十アミノ酸であり、例えば６アミノ酸～４０アミノ酸であってもよく、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、あるいは２０アミノ酸以上であってもよい。ポリカチオンペプチドの例としては、リジンおよび／またはアルギニン残基からなるペプチドなどが挙げられる。リジンおよび／またはアルギニン残基からなるペプチドの具体例としては、Ｋ８、Ｋ９、Ｋ１０、Ｋ１１、Ｋ１２、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２などが挙げられる。ポリカチオンペプチドのさらなる具体例としては、数個のＫＨ繰り返し配列からなるペプチドが挙げられる。ポリカチオンペプチドは上例に限定されない。本発明において使用しうるポリカチオンペプチドを構成するアミノ酸残基は天然アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、修飾アミノ酸残基、あるいは合成アミノ酸残基であってもよい。アミノ酸の合成や修飾は当業者が適宜行いうる。
　正電荷を帯びたオリゴ糖の例としては、グルコサミン、フルクトサミン、ガラクトサミン、マンノサミンなどのヘキソサミンの重合体、例えばキトサンなどが挙げられるが、これらに限定されない。正電荷を帯びたオリゴ糖の糖残基数は、本発明の複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げないかぎり、特に限定されない。
　カチオン性ポリマーの例としては、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリ（β-アミノエステル）、ポリ乳酸/ポリグリコール酸、２－ヒドロキシプロピルメタアクリルアミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性ポリマーの長さは、本発明の複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げないかぎり、特に限定されない。
　ポリカチオンペプチド、正電荷を帯びたオリゴ糖、およびカチオン性ポリマーは、当業者に公知の方法にて製造あるいは天然から抽出されうる。
　上記複合体は公知の方法を用いて製造することができる。例えば、（ｉ）ゲノム編集酵素と標的遺伝子に特異的な核酸をインキュベーションして得られた複合体（ゲノム編集カセット）と、（ｉｉ）ポリカチオン部分とＣＰＰの融合物をインキュベーションして、核酸の負電荷とポリカチオン部分の正電荷を利用して静電気的に結合させることにより、上記複合体を作製してもよい。インキュベーションは、通常は、水溶液中で室温ないし約３７℃で行われる。水溶液は緩衝液であってもよい。ポリカチオン部分とＣＰＰの融合物は、公知の方法、例えばＦｍｏｃ法などのペプチド合成法あるいは遺伝子組換え法などによって作製することができる。必要に応じて、カラムクロマトグラフィー等の公知の手段を用いて複合体を精製してもよい。
　ポリカチオンペプチドとＣＰＰの融合物の具体例としては、Ｋ１０（Ｇ）Ｈ８、Ｋ１０（Ｇ）Ｈ１２、Ｋ１０（Ｇ）Ｈ１６、Ｋ１０（Ｇ）Ｈ２０、Ｒ１０（Ｇ）Ｈ２０などが挙げられるがこれらに限定されない。なお、括弧書きはグリシン残基が存在してもよく、存在しなくてもよいことを示す。
　本発明の複合体は、さらにシグナル配列を含むものであってもよい。シグナル配列はシグナルペプチドともいう。本発明の複合体にシグナル配列を含めることにより、本発明の複合体を所望の細胞内区画に局在化させることができる。様々な種類のシグナル配列が公知であり、シグナル配列の例としては、核移行シグナル配列（ＮＬＳ）、ミトコンドリア移行シグナル配列（ＭＬＳ）、葉緑体移行シグナル配列（ＣＬＳ）などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞内の所望の局在化場所に応じてシグナル配列を選択し、本発明の複合体に融合させることができる。シグナル配列をさらに含む本発明の複合体を用いて、細胞内の所望の場所においてゲノム編集を行うことができる。例えば、核移行シグナルを含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずに核内でゲノム編集を行うことができる。ミトコンドリア移行シグナル配列を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずにミトコンドリア内でゲノム編集を行うことができる。葉緑体移行シグナル配列を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずにミトコンドリア内でゲノム編集を行うことができる。
　シグナル配列は、ゲノム編集酵素、標的遺伝子に特異的な核酸、サブドメイン（後述）など本発明の複合体のいずれの部分に融合していてもよい。シグナル配列の融合様式は、複合体を細胞内の所望の場所に局在化させ、しかも複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げずないものであるかぎり、いずれの様式によるものであってもよい。融合は、例えばペプチド結合などの共有結合によるものであってもよく、静電気的結合、ファンデルワールス力などの非共有結合によるものであってもよい。典型的には、シグナル配列は共有結合にて複合体に融合している。シグナル配列がゲノム編集酵素に共有結合する場合、共有結合はいずれの形態であってもよいが、典型的にはペプチド結合である。
　ゲノム編集酵素とシグナル配列はいずれの位置関係にあってもよい。シグナル配列がゲノム編集酵素のＮ末端に融合していてもよく、ゲノム編集酵素のＣ末端に融合していてもよく、ゲノム編集酵素のＮ末端およびＣ末端の両方に融合していてもよく、あるいはゲノム編集酵素のＮ末端およびＣ末端以外のアミノ酸残基にて融合していてもよい。あるいはシグナル配列がゲノム編集酵素のアミノ酸配列内に挿入されていてもよい。好ましくは、シグナル配列がゲノム編集酵素のＮ末端またはＣ末端に融合している。より好ましくは、シグナル配列はゲノム編集酵素のＮ末端に融合している。ゲノム編集酵素とシグナル配列の融合はリンカーを介するものであってもよい。様々なリンカーが知られており、使用することができる。好ましいリンカーは、複合体を細胞内の所望の場所に局在化させ、複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げないものである。ペプチド結合を介する融合の場合、リンカーの例として、１個～数個のグリシン残基からなるペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。１個のゲノム編集酵素に１個のシグナル配列が融合していてもよく、２個以上のシグナル配列が融合していてもよい。
　シグナル配列をサブドメインと融合させてもよい。融合は、サブドメインのＮ末端で行ってもよく、Ｃ末端で行ってもよく、あるいはＮ末端およびＣ末端以外のアミノ酸残基にて行ってもよい。融合には、例えば遺伝子組換えや有機合成などの公知の方法を用いてもよい。シグナル配列とサブドメインとの融合はリンカーを介するものであってもよい。１個のサブドメインに１個のシグナル配列が融合していてもよく、２個以上のシグナル配列が融合していてもよい。
　シグナル配列を標的遺伝子に特異的な核酸と融合させてもよい。融合は、核酸の３’末端で行ってもよく、５’末端で行ってもよく、これら以外の部分、例えば核酸の糖部分および／または塩基部分にて行ってもよい。好ましくは、融合は、核酸の３’末端にて行われる。融合には、例えば有機合成などの公知の方法を用いてもよい。シグナル配列と核酸との融合はリンカーを介するものであってもよい。１個の核酸に１個のシグナル配列が融合していてもよく、２個以上のシグナル配列が融合していてもよい。
　本発明の複合体は、さらにサブドメインを含むものであってもよい。本明細書において、サブドメインは機能を有するタンパク質をいう。このような本発明の複合体を用いることにより、所望する様々なタイプのゲノム編集を行うことができる。サブドメインの種類は特に限定されないが、例えば塩基置換酵素、ＤＮＡメチル化酵素、ＤＮＡ脱メチル化酵素、転写活性化酵素、転写抑制酵素などが挙げられる。当業者は、適宜サブドメインを選択し、本発明の複合体に使用することができる。例えば、サブドメインとして塩基置換酵素を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずにゲノムの塩基置換を行うことができる。サブドメインとしてＤＮＡメチル化酵素を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずにゲノムのメチル化を行うことができる。サブドメインとしてＤＮＡ脱メチル化酵素を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずにゲノムの脱メチル化を行うことができる。サブドメインとして転写活性化酵素を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずにゲノムの転写活性化を行うことができる。サブドメインとして転写抑制酵素を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずにゲノムの転写抑制を行うことができる。
　シグナル配列およびサブドメインの両方が本発明の複合体に含まれていてもよい。このような本発明の複合体を用いることにより、所望の細胞内区画内で、所望のタイプのゲノム編集を行うことができる。例えば、核移行シグナル配列および塩基置換酵素を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずに核ゲノムの塩基置換を行うことができる。核移行シグナル配列およびＤＮＡメチル化酵素を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずに核ゲノムのメチル化を行うことができる。核移行シグナル配列およびＤＮＡ脱メチル化酵素を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずに核ゲノムの脱メチル化を行うことができる。核移行シグナルおよび転写活性化酵素を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずに核ゲノムの転写活性化を行うことができる。ミトコンドリア移行シグナル配列および塩基置換酵素を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずにミトコンドリアゲノムの塩基置換を行うことができる。葉緑体移行シグナル配列および転写抑制酵素を含む本発明の複合体を用いて、遺伝子組換えを使わずに葉緑体ゲノムの転写抑制を行うことができる。
　サブドメインは本発明の複合体のいずれの部分に融合していてもよい。典型的には、サブドメインはゲノム編集酵素に融合している。サブドメインがゲノム編集酵素のＮ末端に融合していてもよく、ゲノム編集酵素のＣ末端に融合していてもよく、ゲノム編集酵素のＮ末端およびＣ末端の両方に融合していてもよく、あるいはゲノム編集酵素のＮ末端およびＣ末端以外のアミノ酸残基にて融合していてもよい。好ましくは、サブドメインがゲノム編集酵素のＮ末端またはＣ末端に融合している。
　ゲノム編集酵素とサブドメインの融合様式は、サブドメインの機能を妨げず、しかも複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げないかぎり、いずれの様式によるものであってもよい。融合は、例えばペプチド結合などの共有結合によるものであってもよく、静電気的結合、ファンデルワールス力などの非共有結合によるものであってもよい。典型的には、シグナル配列は共有結合にて複合体に融合している。シグナル配列がゲノム編集酵素に共有結合する場合、共有結合はいずれの形態であってもよいが、典型的にはペプチド結合である。
　ゲノム編集酵素とサブドメインの融合はリンカーを介するものであってもよい。様々なリンカーが知られており、使用することができる。好ましいリンカーは、サブドメインの機能を妨げず、複合体の植物細胞への導入およびゲノム編集を妨げないものである。ペプチド結合を介する融合の場合、リンカーの例として、１個～数個のグリシン残基からなるペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。１個のゲノム編集酵素に１個のサブドメインが融合していてもよく、２個以上のサブドメインが融合していてもよい。
　サブドメインにＣＰＰが融合していてもよい。サブドメインとＣＰＰとの融合様式、融合部分については、ゲノム編集酵素とＣＰＰとの融合に関する説明があてはまる。
　サブドメインを含む本発明の複合体において、ＣＰＰがサブドメインに融合しており、サブドメインがゲノム編集酵素に融合している場合、ＣＰＰはサブドメインを介してゲノム編集酵素に融合していると解すことができる。したがって、本明細書において、「ＣＰＰがゲノム編集酵素に融合している」とは、上記のような場合を包含するものとする。
　上記説明は、本発明の複合体を植物細胞に導入することに関するものであるが、本発明の複合体はあらゆる生物種の細胞に対して透過性が高いので、植物のみならず、動物、糸状菌、細菌、放線菌、酵母、藻類などの細胞に導入することができ、広範な生物種におけるゲノム編集に有用である。とりわけ本発明の複合体は、細胞壁を有する植物細胞、藻類細胞、糸状菌細胞および酵母細胞に対して透過性が高いので、これらの生物種のゲノム編集に好適である。
　したがって、本発明は、さらなる態様において、本発明の複合体を細胞に導入することを含む、ゲノム編集方法を提供する。本発明の複合体と細胞を培地中でインキュベーションすることにより本発明の複合体を細胞に導入してもよい。細胞への本発明の複合体の導入方法、培地の種類、インキュベーションの条件は、細胞の種類に応じて当業者が適宜選択、変更することができる。この態様のゲノム編集方法において、典型的には、細胞は植物細胞である。
　植物のゲノム編集を行う場合は、本発明の複合体をあらゆる形態の植物細胞、あらゆる植物組織に導入することができる。例えば、植物の葉、茎、茎頂、冬芽、根、種子、胞子、花粉、培養細胞などに本発明の複合体を導入することができる。本明細書において、植物の葉、茎、茎頂、冬芽、根、種子、胞子、花粉、培養細胞などを植物細胞と総称することがある。
　本発明のゲノム編集方法において、１種類以上の標的遺伝子に特異的な核酸を導入してもよい。また、１種類以上のゲノム編集酵素を導入してもよい。すなわち、ゲノム編集に１種類の本発明の複合体を用いてもよく、２種類以上の本発明の複合体を用いてもよい。
　本発明は、さらなる態様において、本発明の複合体またはその構成成分を含む、ゲノム編集用キットを提供する。本発明の複合体の構成成分としては、ＣＰＰ、ポリカチオン部分、ゲノム編集酵素とＣＰＰの融合物、ポリカチオン部分とＣＰＰの融合物などが例示される。該キットにおいて、本発明の複合体の構成成分を組み合わせて本発明の複合体が得られるようになっていてもよい。通常は、該キットに取扱説明書が添付される。本発明のキットを用いてゲノム編集可能な生物種は、上述のとおり特に限定されない。本発明のキットは、細胞壁を有する植物、藻類、糸状菌および酵母のゲノム編集に好適に使用される。
　以下において、本発明の複合体を用いるゲノム編集方法（組換えタンパク質法・ペプチド法）と従来のゲノム編集方法を、図１を参照しつつ比較説明する。以下の説明は本発明を具体的にわかりやすく説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
　従来のゲノム編集技術には以下のような問題点がある：
　遺伝子組換え技術に依存する技術であるため、遺伝子組換えが適用できる植物種のゲノム編集のみ可能である。
　ゲノム編集された植物は外来遺伝子を保有することとなるため、ゲノム編集された植物は遺伝子組換え生物として扱われ、商業利用は極めて困難である。
　外来遺伝子の除去は交配を繰り返すことのみで可能であり、ゲノム編集カセットの除去には多大なる時間を要する。
　本発明は、ゲノム編集カセット（例えばゲノム編集酵素Ｃａｓ９とｇＲＮＡ）にＣＰＰ（例えばＨ８～Ｈ２０ペプチド）を融合させることで得られる複合体、および該複合体を植物細胞に直接導入することによる植物のゲノム編集方法等に関する。ＣＰＰの融合は、共有結合または非共有結合（例えば静電気的な結合）により行われ得る。融合手法の具体例としては、ゲノム編集酵素Ｃａｓ９とＣＰＰを遺伝子工学的に融合した組換えタンパク質を調製し利用する手法（組換えタンパク質法）と、ゲノム編集カセットにＣＰＰを静電的に結合させる手法（ペプチド法）がある。これらの手法を用いて本発明の複合体を調製することができる。
　組換えタンパク質法によれば、例えば大腸菌発現系を用いてＣａｓ９－ＣＰＰ組換え融合タンパク質（例えばＣａｓ９とＨ８～Ｈ２０のＣＰＰとの融合タンパク質）を調製し、標的領域を切断するためのｇＲＮＡとともにインキュベーションして複合体を形成させ、かくして得られた複合体を植物細胞に導入してゲノム編集を行うことができる。
　ペプチド法によれば、例えばゲノム編集酵素Ｃａｓ９とｇＲＮＡをインキュベーションして複合体を形成させ、ポリカチオン部分とＣＰＰの融合物（例えばＫ１０とＨ８～Ｈ２０とＣＰＰとの融合物）を上記複合体の核酸に静電的に結合させる手法である（ｇＲＮＡの塩基の負電荷とポリカチオン部分のリジン残基の正電荷を利用する）。かくして得られた複合体を植物細胞に導入してゲノム編集を行うことができる。
　両手法ともに、遺伝子組換えに頼らずにゲノム編集酵素カセットを植物細胞内に直接導入するため、従来のゲノム編集技術の諸問題点をすべて克服できることに加え、簡便かつ短時間でゲノム編集細胞を取得することができる。
　本明細書中の用語は、特に断らない限り、生物学、生化学、化学、薬学、医学等の分野において通常に理解されている意味に解される。
　本明細書における数値は、その数値±５％、±１０％または±２０％の範囲の数値を包含し得る。
　本明細書におけるアミノ酸の標記には、公知の１文字法または３文字法を用いる。本明細書において、ペプチドを表す場合は、１文字法で示すアミノ酸の右に数字を付す。例えばＨ２０は２０個のヒスチジン残基からなるペプチドを意味する。Ｋ１０は１０個のリジン残基からなるペプチドを意味する。Ｋ１０Ｈ２０は、１０個のリジン残基からなるペプチドのＣ末端に２０個のヒスチジン残基からなるペプチドのＮ末端が結合したペプチドを意味する。Ｋ１０ＧＨ２０は、Ｎ末端からＣ末端へ、１０個のリジン残基からなるペプチド、１個のグリシン残基、および２０個のヒスチジン残基からなるペプチドが結合したペプチドを意味する。本明細書において、ペプチドはペプチド結合以外の結合を含んでいてもよい。特に断らない限り、ペプチド中のアミノ酸残基間の結合はペプチド結合である。
　本明細書において、ゲノム編集酵素とＣＰＰの融合物を、ハイフン（－）を用いて表す。例えば、Ｃａｓ９－Ｈ２０は、ゲノム編集酵素Ｃａｓ９のＣ末端にＣＰＰ（Ｈ２０）を結合させた融合物を意味する。特に断らない限り、ゲノム編集酵素とＣＰＰとの結合はペプチド結合である。
　以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　１）供試細胞
　Ｃａｓ９およびＣＰＰ融合Ｃａｓ９を発現させる大腸菌としてＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用した。植物細胞としては、樹木植物であるスギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）のカルスおよびカルス由来細胞と、草本植物であるイネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）の培養細胞を使用した。スギカルスの継代には、１／２ＭＤ寒天培地を使用し、１週間間隔で継代した。スギカルス由来細胞の懸濁および試験には１／２ＭＤ液体培地を使用し、遮光、２５℃、１２０ｒｐｍにて振とう培養した。イネ培養細胞の継代には、ＭＳ液体培地を使用し、１週間間隔で継代した。イネ培養細胞の懸濁および試験にはＭＳ液体培地を使用し、遮光、２７℃、１２０ｒｐｍにて振とう培養した。
　２）ＣＰＰ融合Ｃａｓ９の発現
　細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）であるＨ８、Ｈ１２、Ｈ１６、およびＨ２０ペプチドを融合したＣａｓ９－Ｈ８、Ｃａｓ９－Ｈ１２、Ｃａｓ９－Ｈ１６、およびＣａｓ９－Ｈ２０を組換えタンパク質として調製した。発現プラスミドはｐＥＴ２４ｂを使用し、宿主大腸菌はＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用した。組換えタンパク質は、２０℃、１８時間の条件で菌体内発現し、菌体破砕液をＣｏ（コバルト）イオン固定化樹脂（ＧＥヘルスケア社製）により精製した。
　３）Ｃａｓ９の発現
　ＣＰＰの代わりに、細胞膜透過能を有していないペプチドタグであるＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を融合したＣａｓ９を組換えタンパク質として調製した。発現プラスミドはｐＥＴ２４ｂを使用し、宿主大腸菌はＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用した。組換えタンパク質は、２０℃、１８時間の条件で菌体内発現し、菌体破砕液を抗ＦＬＡＧ抗体固定化樹脂（ＭＢＬ社製）により精製した。
　４）ｇＲＮＡ＋ＣＰＰ融合Ｃａｓ９複合体の調製（組換えタンパク質法に用いる複合体の調製）
　ＳＥＣ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ，５００ｍＭ　ＫＣｌ，ｐＨ７．５）に溶解したＣＰＰ融合Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－Ｈ８、Ｃａｓ９－Ｈ１２、Ｃａｓ９－Ｈ１６、Ｃａｓ９－Ｈ２０）（２０μＭ）と、Ｄｕｐｌｅｘ　Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ，１００ｍＭ　酢酸カリウム，ｐＨ７．５）に溶解したｇＲＮＡ（２０μＭ）を等量混合し、室温で１５分間インキュベーションすることで、ｇＲＮＡ＋ＣＰＰ融合Ｃａｓ９複合体（１０μＭ）を調製した。同様の手法で、ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９複合体（１０μＭ）を調製した。３種類のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３）を用いた（以下の実験でも同じ）。これらのｇＲＮＡは、スギマグネシウムキラターゼ遺伝子（その塩基配列を配列番号：１に示す）：ＣｊＣＨＬＩ遺伝子の特定の部位（図２中、ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２と表示した部位）およびイネＥ３ユビキチン－プロテインリガーゼＧＷ２遺伝子（その塩基配列を配列番号：２に示す）：ＯｓＧＷ２遺伝子の特定の部位（図８中、ｇＲＮＡ３と表示した部位）を標的とする。ｇＲＮＡ１部位およびｇＲＮＡ２部位は、それぞれ配列番号：１の５６～７８番目、１０９４～１１１６番目の塩基で示される。ｇＲＮＡ３部位は、配列番号：２の１７９６～１８１８番目の塩基で示される。ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２は公知のソフトウェア（ＡｐＥ）を用いて、ｇＲＮＡ３は公知のソフトウェア（ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｐ２．０）を用いて設計した。
　５）ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９＋ＣＰＰ複合体の調製（ペプチド法に用いる複合体の調製）
　ＳＥＣ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ，５００ｍＭ　ＫＣｌ，ｐＨ７．５）に溶解したＣａｓ９（２０μＭ）とＤｕｐｌｅｘ　Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ，１００ｍＭ　酢酸カリウム，ｐＨ７．５）に溶解したｇＲＮＡ（２０μＭ）を等量混合し、室温で１５分間インキュベーションすることで、ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９複合体（１０μＭ）を調製した。次いで、ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９複合体に対して、Ｄｕｐｌｅｘ　Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ，１００ｍＭ　酢酸カリウム，ｐＨ７．５）に溶解したＫ１０Ｇ－ＣＰＰ（Ｋ１０ＧＨ８、Ｋ１０Ｈ１２、Ｋ１０Ｈ１６、Ｋ１０Ｈ２０ペプチド）（２０、２００、２０００μＭ）を等量混合し、室温で６０分間インキュベーションすることで、ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９＋ＣＰＰ複合体を調製した。使用したｇＲＮＡは上記ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３であった。
　６）ゲノム編集試験
　継代１週間後のスギ細胞（１／２ＭＤ液体培地中２０ｍｇ／ｍＬ）３６０μＬまたはイネ細胞（ＭＳ液体培地中２０ｍｇ／ｍＬ）３６０μＬを、ポリスチレン製の５ｍＬファルコンラウンドチューブに分注した。このスギ細胞３６０μＬまたはイネ細胞３６０μＬに対して、上記で調製したｇＲＮＡ＋ＣＰＰ融合Ｃａｓ９複合体またはｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９＋ＣＰＰ複合体を４０μＬ混合した。その後、遮光、２５℃、１２０ｒｐｍにて２４～７２時間振とう培養した。上記実験条件において、蛍光修飾したｇＲＮＡ＋ＣＰＰ融合Ｃａｓ９複合体またはｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９＋ＣＰＰ複合体がスギ細胞・イネ細胞内に取り込まれることを確認した。
　培養後のスギ細胞またはイネ細胞を、遠心分離（５００ｇ×１０ｍｉｎ、４℃）により回収し、１／２ＭＤ液体培地にて複数回洗浄をした。植物細胞用のゲノムＤＮＡ抽出キット（ＤＮＡすいすいＰ：株式会社リーゾ社製）を使用して、スギ細胞またはイネ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノム編集の標的とした遺伝子領域をＰＣＲにて増幅した。このＰＣＲ産物をアンプリコンシークエンス解析に供することで、ゲノム編集の有無を評価した。また、ＰＣＲ産物をクローニングし、サンガーシークエンス解析に供することで、ゲノム編集の有無を評価した。
　７）結果
　組換えタンパク質法（ｇＲＮＡ＋ＣＰＰ融合Ｃａｓ９複合体）にて処理したスギ細胞またはペプチド法（ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９＋ＣＰＰ複合体）にて処理したスギ細胞において、ｇＲＮＡのみまたはｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９複合体処理細胞では検出されなかったゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された。一方で、組換えタンパク質法（ｇＲＮＡ＋ＣＰＰ融合Ｃａｓ９複合体）にて処理したイネ細胞において、ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９複合体処理細胞では検出されなかったゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された。
　標的遺伝子（ＣｊＣＨＬＩ遺伝子）に対応する２種類のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１またはｇＲＮＡ２）を使用した結果、組換えタンパク質法（ｇＲＮＡ＋ＣＰＰ融合Ｃａｓ９複合体）では４通りのゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された（図３、図４、図７）。一方で、ペプチド法（ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９＋ＣＰＰ複合体）では６通りのゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された（図３、図４、図５、図６、図７）。また、組換えタンパク質法（ｇＲＮＡ＋ＣＰＰ融合Ｃａｓ９複合体）では、４種類のＣＰＰ融合Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－Ｈ８、Ｃａｓ９－Ｈ１２、Ｃａｓ９－Ｈ１６、Ｃａｓ９－Ｈ２０）を使用した場合において、ゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された。ペプチド法（ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９＋ＣＰＰ複合体）では、４種類のＫ１０Ｇ－ＣＰＰ（Ｋ１０ＧＨ８、Ｋ１０ＧＨ１２、Ｋ１０ＧＨ１６、Ｋ１０ＧＨ２０ペプチド）を使用した場合において、ゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された。
　標的遺伝子（ＯｓＧＷ２遺伝子）に対応するｇＲＮＡ３を使用した結果、組換えタンパク質法（ｇＲＮＡ＋ＣＰＰ融合Ｃａｓ９複合体）では５通りのゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された（図８、図９、図１０、図１１、図１２）。組換えタンパク質法（ｇＲＮＡ＋ＣＰＰ融合Ｃａｓ９複合体）では、３種類のＣＰＰ融合Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－Ｈ８、Ｃａｓ９－Ｈ１６、Ｃａｓ９－Ｈ２０）を使用した場合において、ゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された。
　ゲノム編集（遺伝子欠失）が確認された領域は、ｇＲＮＡの認識領域と一致したことから、狙った領域にゲノム編集を誘導できたことが確認された。
　これらの結果から、本発明の複合体を用いたゲノム編集の効果が実証された。すなわち、本発明の複合体を利用することで植物細胞への直接導入が困難とされているゲノム編集酵素の導入と、ゲノム編集の誘導を実証した。
　本発明を利用することで、遺伝子組換えに頼らない農作物の品種改良が実現する。本発明により得られる農作物は遺伝子組換え生物に該当しないので商品価値が高い。特に、本発明の実施例で使用したスギは、一世代あたりの時間が極めて長い農作物であり、従来の遺伝子組換えに依存したゲノム編集技術を利用した場合、交配による外来遺伝子（ゲノム編集酵素Ｃａｓ９遺伝子）の除去に数十年単位の時間を要するため、品種改良は非現実的であった。このような世代時間が長い農作物のゲノム編集（ゲノム編集を利用した分子育種、例えば品種改良）においても、本発明は絶大な威力を発揮すると考えられる。
　本発明は、農業、林業、食品、医薬品、ならびに植物の研究、育種、品種改良などの分野に利用可能である。

Claims (16)

  1. 　ゲノム編集酵素および細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む複合体であって、ＣＰＰがゲノム編集酵素に融合している複合体。
  2. 　ゲノム編集酵素、標的遺伝子に特異的な核酸、およびＣＰＰを含む複合体であって、ＣＰＰがゲノム編集酵素および／または標的遺伝子に特異的な核酸に融合している複合体。
  3. 　ＣＰＰがゲノム編集酵素および／または標的遺伝子に特異的な核酸に共有結合している、請求項１または２記載の複合体。
  4. 　ＣＰＰがゲノム編集酵素に共有結合している、請求項３記載の複合体。
  5. 　ポリカチオン部分がＣＰＰに融合しており、ポリカチオン部分が標的遺伝子に特異的な核酸と静電気的に結合している、請求項２記載の複合体。
  6. 　ポリカチオン部分がＣＰＰに共有結合している、請求項５記載の複合体。
  7. 　ポリカチオン部分がポリカチオンペプチドである、請求項６記載の複合体。
  8. 　ポリカチオンペプチドが１０個以上のリジン残基または１０個以上のアルギニン残基を含む、請求項７記載の複合体。
  9. 　ＣＰＰの８０％以上のアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、ＣＰＰの長さが８アミノ酸～数十アミノ酸である、請求項１～８のいずれか１項記載の複合体。
  10. 　ＣＰＰのすべてのアミノ酸残基がヒスチジン残基である、請求項９記載の複合体。
  11. 　さらにシグナル配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項記載の複合体。
  12. 　さらにサブドメインを含む、請求項１～１１のいずれか１項記載の複合体。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項記載の複合体を細胞に導入することを含む、ゲノム編集方法。
  14. 　細胞が、植物細胞、藻類細胞、糸状菌細胞、または酵母細胞である、請求項１３記載の方法。
  15. 　請求項１～１２のいずれか１項記載の複合体またはその構成成分を含む、ゲノム編集用キット。
  16. 　植物、藻類、糸状菌、または酵母のゲノム編集用である、請求項１５記載のキット。
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