WO2022102962A1 - 카우다틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

카우다틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2022102962A1
WO2022102962A1 PCT/KR2021/013456 KR2021013456W WO2022102962A1 WO 2022102962 A1 WO2022102962 A1 WO 2022102962A1 KR 2021013456 W KR2021013456 W KR 2021013456W WO 2022102962 A1 WO2022102962 A1 WO 2022102962A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
caudatin
compound
carcinoma
growth inhibition
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/013456
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이동선
최학선
Original Assignee
제주대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제주대학교 산학협력단 filed Critical 제주대학교 산학협력단
Publication of WO2022102962A1 publication Critical patent/WO2022102962A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/24—Apocynaceae (Dogbane family), e.g. plumeria or periwinkle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/308—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on cancer prevention

Definitions

  • the present invention relates to novel uses of a caudatin compound, and specifically, the present invention relates to a pharmaceutical for the prevention, improvement or treatment of cancer containing a caudatin compound as an active ingredient by confirming the cancer stem cell growth inhibitory activity of the caudatin compound It relates to a red composition and a health functional food.
  • cancer stem cells have a characteristic that they proliferate slowly, so there is a problem in that conventional anticancer therapies that induce toxicity to rapidly proliferating cancer cells cannot suppress cancer stem cells. Therefore, in order to effectively and completely prevent or treat cancer, it is necessary to develop a new anticancer agent capable of targeting not only cancer cells but also cancer stem cells.
  • Cancer stem cells have drug resistance and radiation resistance to chemotherapy and radiation therapy, and cause cancer recurrence and metastasis. Therefore, targeted therapy for cancer stem cells is essential for cancer treatment.
  • Cancer stem cells are known to express specific proteins including Oct4, Sox2, Nanog and aldehyde dehydrogenase-1 (ALDH).
  • ALDH is an enzyme that oxidizes genotoxic aldehydes, and its enzyme activity is widely used as a cancer stem cell (CSC) marker for leukemia, head and neck, bladder, bone, colon, liver, lung, pancreas, prostate, thyroid and cervical cancer.
  • CSC cancer stem cell
  • Basal cell phenotype breast cancer is thought to originate from early mammary progenitor cells in the early stage of differentiation, and the prognosis is poor. It is known to show resistance to existing anticancer therapies, and the cause of the failure of anticancer treatments is that targeted therapies for cancer stem cells are not properly performed.
  • cancer stem cells were identified in myeloid leukemia, and then were found in a variety of solid cancer populations, such as breast, brain, colon, ovarian, pancreatic, and prostate cancers. Cancer stem cells are also called tumor-initiating cells and cancer stem-like cells. It has also been shown that various cancer types, including breast cancer, are derived from cancer stem cells (CSCs), which are a subpopulation of tumors. This population is known to induce changes in tumor volume through self-renewal and differentiation.
  • CSCs cancer stem cells
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer through cancer stem cell growth inhibition, comprising a Caudatin compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • another object of the present invention is to include, as an active ingredient, an ethyl acetate fraction obtained by adding ethyl acetate to a water fraction for a methanol extract of bifolium cowpea, for the prevention or treatment of cancer through cancer stem cell growth inhibition. It is to provide an enemy composition.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for inhibiting the growth of cancer stem cells, comprising a Caudatin compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or improving cancer through cancer stem cell growth inhibition, comprising a Caudatin compound or a salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to include an ethyl acetate fraction obtained by adding ethyl acetate to a water fraction for a methanol extract of bifolium cowpea as an active ingredient, health function for preventing or improving cancer through cancer stem cell growth inhibition to provide food.
  • Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting the growth of cancer stem cells in vitro, comprising the step of treating the cancer stem cells with a caudatin compound.
  • the present invention provides a pharmaceutical for preventing or treating cancer through cancer stem cell growth inhibition, comprising a Caudatin compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. Provides an enemy composition.
  • the caudatin compound may be derived from a methanol extract of bileaf cow (Cynanchum auriculatum).
  • the caudatin compound is derived from an ethyl acetate fraction obtained by adding and mixing water to the methanol extract of bileaf cattleya, evaporating methanol and adding ethyl acetate to the remaining water fraction. It may have been
  • the caudatin compound growth inhibition of cancer stem cells; inhibition of proliferation of cancer cells; growth inhibition of cancer cells expressing CD44 + /CD24 ⁇ and dehydrogenase (ALDH); Inhibition of formation of mammospheres or growth inhibition of mammospheres; or blockade of ubiquitin-dependent glucocorticoid receptor (GR) degradation activity and glucocorticoid receptor (GR) signaling pathway; It may be one with activity.
  • ADH dehydrogenase
  • the cancer is colon cancer, breast cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, brain tumor, head and neck carcinoma, melanoma, myeloma, leukemia, lymphoma, stomach cancer, lung cancer, pancreatic cancer, liver cancer, Esophageal cancer, small intestine cancer, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, bone cancer, skin cancer, head cancer, neck cancer , cutaneous melanoma, intraocular melanoma, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem It may be selected from the group consisting of glioma
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer through cancer stem cell growth inhibition, comprising as an active ingredient an ethyl acetate fraction obtained by adding ethyl acetate to a water fraction for a methanol extract of bilepisophyll do.
  • the ethyl acetate fraction may contain a Caudatin compound.
  • the present invention also provides a composition for inhibiting the growth of cancer stem cells, comprising a Caudatin compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the cancer is colon cancer, breast cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, brain tumor, head and neck carcinoma, melanoma, myeloma, leukemia, lymphoma, stomach cancer, lung cancer, pancreatic cancer, liver cancer, Esophageal cancer, small intestine cancer, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, bone cancer, skin cancer, head cancer, neck cancer , cutaneous melanoma, intraocular melanoma, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem It may be selected from the group consisting of glioma
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving cancer through cancer stem cell growth inhibition, comprising a Caudatin compound or a salt thereof as an active ingredient.
  • the caudatin compound may be derived from a methanol extract of bileaf cow (Cynanchum auriculatum).
  • the caudatin compound is derived from an ethyl acetate fraction obtained by adding and mixing water to the methanol extract of bileaf cattleya, evaporating methanol and adding ethyl acetate to the remaining water fraction. It may have been
  • the caudatin compound growth inhibition of cancer stem cells; inhibition of proliferation of cancer cells; growth inhibition of cancer cells expressing CD44 + /CD24 ⁇ and dehydrogenase (ALDH); Inhibition of formation of mammosphere or growth inhibition of mammosphere; or blocking ubiquitin-dependent glucocorticoid receptor (GR) degradation activity and glucocorticoid receptor (GR) signaling pathway; It may be one with activity.
  • ADH dehydrogenase
  • the cancer is colon cancer, breast cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, brain tumor, head and neck carcinoma, melanoma, myeloma, leukemia, lymphoma, stomach cancer, lung cancer, pancreatic cancer, liver cancer, Esophageal cancer, small intestine cancer, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, bone cancer, skin cancer, head cancer, neck cancer , cutaneous melanoma, intraocular melanoma, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brain stem It may be selected from the group consisting of glioma and
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving cancer through cancer stem cell growth inhibition, comprising, as an active ingredient, an ethyl acetate fraction obtained by adding ethyl acetate to a water fraction for a methanol extract of bileaf cowpea. do.
  • the ethyl acetate fraction may contain a Caudatin compound.
  • the present invention provides a method for inhibiting the growth of cancer stem cells in vitro, comprising the step of treating the cancer stem cells with a caudatin compound.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to an individual a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer.
  • the ethyl acetate fraction for the methanol extract of bifolium calf according to the present invention and the caudatin compound isolated from the fraction can inhibit the proliferation and growth of cancer stem cells, and can inhibit the expression of marker genes of cancer stem cells. It inhibits the formation of mammoth pairs in breast cancer stem cells, induces the degradation of ubiquitin-dependent GR (glucocorticoid receptor), and has the activity to inhibit cancer stem cells by blocking the GR signaling pathway. And there is an effect that can be usefully used in industries such as health functional food.
  • A is the ethyl acetate fraction with silica It is the result of performing gel column chromatography, B shows the TLC separation and UV irradiation results for a total of 5 fractions obtained by the silica gel column chromatography, and C shows the cancer stem cell inhibitory ability for a total of 5 fractions. The results of the analysis are shown.
  • Figure 2 is the result of analyzing the cancer stem cell inhibitory ability of the second fraction among the total of 5 fractions obtained in Figure 1,
  • A shows the result of separating the second fraction by reverse-phase C18 (ODS) gel chromatography;
  • B shows the results of analyzing the cancer stem cell inhibitory ability of the fraction separated by reverse-phase C18 (ODS) gel chromatography of the second fraction.
  • FIG. 3 is a fraction (30-50%) showing cancer stem cell inhibitory ability in FIG. 2 was again separated into three fractions using Sephadex LH-20 gel chromatography, and the cancer stem cell inhibitory ability for each fraction was analyzed.
  • A shows the results of Sephadex LH-20 gel chromatography
  • B shows the TLC separation and UV irradiation results for a total of three fractions obtained by Sephadex LH-20 gel chromatography
  • C is Shows the results of analyzing the cancer stem cell inhibitory ability for all three fractions.
  • FIG. 4 shows the results of fluorescence visualization by UV irradiation after TLC separation of the first fraction having inhibitory ability against cancer stem cells among the three fractions separated by Sephadex LH-20 gel chromatography in FIG. 3 and (A and B), C shows the results of analyzing the cancer stem cell inhibitory ability of the fractions for a total of four bands obtained by the TLC separation.
  • FIG. 5 shows the results of separating the active ingredient compounds by performing high-performance liquid chromatography (HPLC) on fraction 3, which showed cancer stem cell inhibitory ability in FIG. 4, where A shows the HPLC chromatogram, and B shows the HPLC It is the result of performing TLC separation of the fraction containing the active ingredient eluted by the chromatogram, and C shows the result of analyzing the cancer stem cell inhibitory ability.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • Figure 7a is the extraction process of the fraction containing the caudatin compound of the present invention
  • Figure 7b is the cancer stem cell inhibitory ability analysis results of the caudatin compound
  • Figure 7c shows the chemical structural formula of the caudatin compound.
  • FIG. 8 is an analysis of the effect of the caudatin compound of the present invention on the proliferation and mammosphere formation of breast cancer cells.
  • FIG. 8b shows the results of MFE (mammosphere formation efficiency) analysis of the degree of mammosphere formation derived from MDA-MB-231 cells treated with caudatin and ciclesonide, respectively, and a photograph observed under a microscope
  • FIG. 8c is caudatin It is the result of confirming the degree of apoptosis for MDA-MB-231 cells treated with Annexin V/propidium iodide (PI) staining
  • FIG. PI Annexin V/propidium iodide
  • FIG. 8d is a photograph observed by staining the cells killed by caudatin with Hoechst 33,342 reagent.
  • 8e shows the results of confirming the degree of cell migration depending on whether or not the caudatin compound was treated with respect to MDA-MB-231 cells by the treatment concentration of the compound and the scratch analysis by time
  • FIG. 8f is the cancer cell migration by caudatin and Infiltration was confirmed by transwell analysis
  • FIG. 8g is a photograph showing whether colony formation was observed under a microscope after caudatin was treated with MDA-MB-231 cells for each concentration.
  • FIG. 9 is a view illustrating the tumor suppression effect of caudatin treatment in a mouse animal model. After MDA-MB-231 cancer cells were injected into female nude mice, caudatin was administered and DMSO was administered as a control group. , changes in body weight (Fig. 9a), tumor volume change (Fig. 9b), and tumor weight (Fig. 9c) are respectively measured.
  • FIG. 10 is an analysis of changes in CD44high/CD24low and aldehyde dehydrogenase (ALDH) positive cell populations according to caudatin treatment in a cancer cell line (MDA-MB-231), and FIG. 10a shows caudatin treated group and control group through flow cytometry.
  • the CD44high/CD24low cell population was analyzed in Fig. 10b shows the ALDEFLUOR analysis and FACS analysis results.
  • the graphs on the right show the analysis of the ALDH-positive cell population in the group treated with the ALDH inhibitor DEAB, and the graphs on the left are DEAB This is an analysis of the ALDH-positive cell population in the untreated group.
  • FIG. 11 confirms the inhibitory activity of glucocorticoid receptor (GR) signaling through ubiquitin-dependent GR degradation of caudatin.
  • FIG. 11b is the result of confirming the transcript level of the GR gene in mammospheres after caudatin treatment by performing RT-qPCR
  • FIG. 11d shows the results of Western blotting after reacting mammospheres with caudatin and MG132 for 24 hours.
  • FIG. 11e is a Western blot showing the expression level of GR in the cytoplasmic fraction and nuclear fraction of mammospheres derived from MDA-MB-231 after reacting mammospheres with caudatin
  • FIG. 11f is caudatin-treated MDA-
  • FIG. 11g is a result of analyzing the effect on mammospheres formation during GR knockdown by GR-specific siRNA
  • FIG. 11h is an antagonist for GR
  • the results of analysis of the effect on mammospheres formation by RU-486 treatment are shown.
  • FIG. 12 is a result of analyzing the YAP localization inhibitory activity of caudatin into the nucleus and the ability to control the formation of cancer stem cells. The level was confirmed by western blot, FIG. 12b is RT-qPCR to measure the transcript level of the YAP gene, and FIG. 12c is the expression of YAP in caudatin-treated MDA-MB-231 (red) and The location was confirmed by immunofluorescence analysis, and FIG. 12d shows the cytoplasmic fraction and nuclear fraction of mammospheres derived from MDA-MB-231 after caudatin treatment on mammospheres. The expression level of YAP was confirmed by Western blot, FIG.
  • FIG. 12e is a Western blot confirming the expression levels of GR and YAP in MDA-MB-231 cells treated with GR-specific siRNA
  • FIG. 12f is an analysis of the effect on mammosphere formation by YAP-specific siRNA treatment
  • 12g is an analysis of the effect on mammosphere formation by treatment with verteporfin, an inhibitor of the YAP/TEAD complex
  • FIGS. 12h ⁇ j are RT the expression levels of CYR61 and CTGF genes in the groups treated with caudatin, GR siRNA and verteporfin, respectively. The results of -qPCR are shown.
  • FIG. 13 is an analysis of the effect of a caudatin compound on the expression of cancer stem cell marker protein and growth of mammospheres. It is the result of analysis by blot, and FIG. 13b is the result of measuring the number of cells separated into single cells by time for the group treated with caudatin and the group not treated with mammospheres, respectively, and FIG. 13c is the GR degradation action of caudatin and This shows a model of the apoptosis mechanism of cancer stem cells through regulation of the YAP signaling pathway.
  • the present invention has confirmed that the Cynanchum auriculatum extract and the Caudatin compound isolated from the extract have excellent growth inhibitory activity against cancer stem cells (CSC) and can be used as a new anticancer agent. .
  • CSC cancer stem cells
  • the present inventors added and mixed water to the methanol extract of bifolium cattle, evaporated the methanol, and again obtained an ethyl acetate fraction from the remaining water fraction. From the ethyl acetate fraction, the active ingredient Caudatin compound was isolated, and their anticancer activity was analyzed.
  • an ethyl acetate fraction was obtained for the water fraction of the methanol extract of bifoliar cow piso, and the fraction was subjected to silica gel column chromatography to obtain a total of five fractions, and then, among them, cancer A total of 4 fractions were obtained from the second fraction showing stem cell inhibitory activity through C18 open column chromatography, and among them, 30-50% fractions showing cancer stem cell inhibitory activity were again subjected to Sephadex LH-20 column chromatography. A total of 3 fractions were obtained. The first fraction among the three fractions was confirmed to have inhibitory ability against cancer stem cells, and HPLC was performed on the first fraction to finally separate and identify the caudatin compound of the present invention.
  • the proliferation inhibitory ability and the mammosphere formation inhibitory ability for cancer cell lines according to the caudatin compound treatment are analyzed.
  • caudatin treatment concentration-dependently inhibited proliferation of cancer cell lines, induced apoptosis of cancer cell lines, and inhibited growth and mammosphere formation on cancer stem cells. appeared to be excellent.
  • Tumus pair refers to a tumor sphere developed by proliferation of one cancer stem cell or cancer progenitor cell.
  • breast cancer cell lines can form sub-colonies of cells with stem cell-like ability to grow in an oval shape without apoptosis without attachment in vitro.
  • a condition without a base layer is artificially created by suspension culture, cells with stem cell properties are attached to each other to form a spherical cell mass, and this cell mass is called a neurosphere.
  • the application of this concept to human breast stem cells is "mammosphere".
  • Mammoth pair has 8 times more progenitor cells than normal human breast cells and can be continuously subcultured, and 100% of all cells grow into bi-potent precursors after several subcultures.
  • Mammoth pair can be differentiated into adult breast cells, mammary gland epithelial cells, ductal epithelial cells, and alveolar epithelial cells, and within Matrigel. It is observed to form a complex functional breast structure while forming a three-dimensional structure.
  • Mammoth pairs have the property of self-proliferation, which is one of the most characteristic of stem cells, so that several mammoth pairs or breast stem cells can be obtained in large amounts from one mammoth pair.
  • the standard analysis method for the self-renewal ability of cancer stem cells is to analyze the in vivo transplantation and in vitro mammoth pair formation.
  • the caudatin compound of the present invention can effectively inhibit the formation of mammoth pairs, which are breast cancer stem cells, and can inhibit both colony formation, migration and invasion of cancer cell lines.
  • the CD44 + /CD24 - phenotype and ALDH1 As a result of treatment with a caudatin compound on breast cancer stem cells that express the CD44 + /CD24 - phenotype and ALDH1 to maintain the characteristics of a malignant tumor, the CD44 + /CD24 - phenotype and ALDH1 It was confirmed that the number of expressing breast cancer stem cells was significantly reduced.
  • the caudatin compound can be used as a more effective new cancer treatment targeting cancer stem cells.
  • the present inventors confirmed the mechanism of activity of the caudatin compound on cancer stem cells.
  • the expression change of GR (glucocorticoid receptor) by caudatin treatment was measured in MDA-MB-231 mammoth pair, a breast cancer cell line.
  • the caudatin compound of the present invention has an activity of suppressing the expression of marker genes for cancer stem cells.
  • the expression of stem cell marker proteins including c-Myc, Oct4, Sox2 and CD44 is suppressed. confirmed to be.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer through cancer stem cell growth inhibition, comprising a Caudatin compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the caudatin compound may be derived from a methanol extract of bileaf cowpea (Cynanchum auriculatum), preferably water is added to the methanol extract of bileaf cowphys, mixed, and then the methanol is evaporated and the remaining water It may be derived from an ethyl acetate fraction obtained by adding ethyl acetate to the fraction.
  • the caudatin compound of the present invention inhibits the growth of cancer stem cells; inhibition of proliferation of cancer cells; growth inhibition of cancer cells expressing CD44 + /CD24 ⁇ and dehydrogenase (ALDH); Inhibition of formation of mammosphere or growth inhibition of mammosphere; or blockade of ubiquitin-dependent glucocorticoid receptor (GR) degradation activity and glucocorticoid receptor (GR) signaling pathway; It has activity and can effectively prevent, ameliorate or treat cancer.
  • ADH dehydrogenase
  • the "cancer” generally refers to or describes a physiological condition in a mammal that is characterized by unregulated cell growth.
  • “Cancer” refers to a condition in which a problem occurs in the control function of normal division, differentiation, and death of cells, causes abnormal hyperproliferation, infiltrates surrounding tissues and organs, forms a mass, and destroys or deforms the existing structure.
  • the "cancer stem cells” are undifferentiated cells having the ability to differentiate into various cancer cells, and the cancers include colorectal cancer, breast cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer including colon cancer and rectal cancer.
  • CNS central nervous system
  • cancer stem cell growth inhibition includes inhibition of cancer stem cell maintenance, inhibition of cancer stem cell malignance, and inhibition of cancer stem cell migration and cancer stem cell invasive activity (invasive).
  • cancer stem cell prevention may refer to any action that prevents or delays the growth or proliferation of cancer stem cells by administering the composition according to the present invention to an individual.
  • the "pharmaceutically acceptable salt” of the present invention means any salt that retains the desired biological and/or physiological activity of the compound and exhibits minimal undesired toxicological effects. It refers to a salt prepared according to a method conventional in the art, and the preparation method is known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, salts derived from pharmacologically or physiologically acceptable inorganic acids, organic acids, and bases.
  • salts derived from inorganic bases may include, but are not limited to, sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, and magnesium salts.
  • Salts derived from organic bases include, but are not limited to, primary, secondary and tertiary amines; substituted amines, including naturally occurring substituted amines; and isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, ethanolamine, 2-dimethylaminoethanol, tromethamine, lysine, arginine, histidine, caffeine, procaine, hydrabamine, choline, betaine, ethylenediamine, glucosamine, N-alkylglucamine, theobromine, purine, piperazine, piperidine, and/or N-ethyl piper salts of cyclic amines including din.
  • other carboxylic acid derivatives may be included,
  • salts derived from inorganic acids include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like.
  • Salts derived from organic acids include acetic acid, propionic acid, glycolic acid, pyruvic acid, oxalic acid, malic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid , mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and/or salicylic acid, and the like, but may not be limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier (carrier) or additives.
  • carrier pharmaceutically acceptable means that it does not inhibit the activity of the active ingredient and does not have toxicity beyond what the application (prescription) target can adapt.
  • carrier is defined as a compound that facilitates the addition of the compound into a cell or tissue.
  • the caudatin of the present invention may be administered alone or mixed with any convenient carrier, and the dosage form may be a single-dose or repeated-dose dosage form.
  • the pharmaceutical composition may be a solid formulation or a liquid formulation.
  • Solid preparations include, but are not limited to, powders, granules, tablets, capsules, suppositories, and the like.
  • Solid formulations may include, but are not limited to, carriers, flavoring agents, binders, preservatives, disintegrants, lubricants, fillers, and the like.
  • Liquid formulations include, but are not limited to, solutions such as water and propylene glycol solution, suspensions, and emulsions, and may be prepared by adding suitable colorants, flavoring agents, stabilizers, and viscosifying agents.
  • the powder can be prepared by simply mixing the active ingredient of the present invention, PAA, with a suitable pharmaceutically acceptable carrier such as lactose, starch, microcrystalline cellulose.
  • Granules include the active ingredient of the present invention; a suitable pharmaceutically acceptable carrier; And after mixing a suitable pharmaceutically acceptable binder such as polyvinylpyrrolidone and hydroxypropyl cellulose, wet granulation method using a solvent such as water, ethanol, isopropanol, or dry granulation method using compression can
  • a suitable pharmaceutically acceptable binder such as polyvinylpyrrolidone and hydroxypropyl cellulose
  • wet granulation method using a solvent such as water, ethanol, isopropanol
  • dry granulation method using compression can
  • tablets may be prepared by mixing the granules with a suitable pharmaceutically acceptable lubricant such as magnesium stearate, and then tableting the granules using a tablet press.
  • the active ingredient of the present invention is an oral agent, injection (eg, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, infusion, subcutaneous injection, implant), inhalant, nasal administration agent, depending on the disease to be treated and the condition of the subject. , vaginal, rectal, sublingual, transdermal, topical, etc., but is not limited thereto.
  • injection eg, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, infusion, subcutaneous injection, implant
  • inhalant e.g., inhalant, nasal administration agent, depending on the disease to be treated and the condition of the subject. , vaginal, rectal, sublingual, transdermal, topical, etc., but is not limited thereto.
  • it may be formulated into a suitable dosage unit formulation comprising a commonly used, non-toxic, pharmaceutically acceptable carrier, excipient, and vehicle.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a daily dose of about 0.0001 mg/kg to about 10 g/kg, and may be administered in a daily dose of about 0.001 mg/kg to about 1 g/kg.
  • the dosage may vary depending on the degree of purification of the mixture, the patient's condition (age, sex, weight, etc.), and the severity of the condition being treated. If necessary, for convenience, the total daily dose may be divided and administered several times during the day.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer through cancer stem cell growth inhibition, comprising as an active ingredient an ethyl acetate fraction obtained by adding ethyl acetate to a water fraction for a methanol extract of bilepisophyll can do.
  • the ethyl acetate fraction of the water fraction of the methanol extract of bileaf cowpea of the present invention had cancer stem cell growth inhibitory activity through the following Examples, and the ethyl acetate fraction contained a caudatin compound.
  • the present invention may provide a composition for inhibiting the growth of cancer stem cells, comprising a Caudatin compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention comprises administering to an individual a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer through cancer stem cell growth inhibition comprising a Caudatin compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, A method for preventing or treating cancer is provided.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer through cancer stem cell growth inhibition comprising an ethyl acetate fraction obtained by adding ethyl acetate to the water fraction for the methanol extract of bilepiso as an active ingredient. It provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering.
  • the term "individual” refers to a subject in need of a method for preventing, controlling or treating a disease, and may be used without limitation, such as humans, dogs, monkeys, cats, rodents, such as mice, genetically engineered mice, and the like. More specifically, it refers to mammals such as human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, and cattle.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount.
  • the term "therapeutically effective amount” means an amount of a pharmaceutically acceptable salt of a composition effective for preventing or treating a target disease
  • the therapeutically effective amount of the composition of the present invention is determined by several factors, for example, It may vary depending on the method of administration, the target site, the condition of the patient, etc. Therefore, when used in the human body, the dosage should be determined as an appropriate amount in consideration of both safety and efficiency. It is also possible to estimate the amount used in humans from the effective amount determined through animal experiments. These considerations in determining effective amounts are found, for example, in Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; and E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.
  • the term "pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and not to cause side effects, and the effective dose level is determined by the patient's health condition , disease type, severity, drug activity, sensitivity to drug, administration method, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including drugs used in combination or concurrently, and other factors well known in the medical field can be decided.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the present invention can provide a health functional food for the prevention or improvement of cancer through cancer stem cell growth inhibition comprising a Caudatin compound or a salt thereof as an active ingredient, and water It is possible to provide a health functional food for preventing or improving cancer through cancer stem cell growth inhibition comprising an ethyl acetate fraction obtained by adding ethyl acetate to the fraction as an active ingredient.
  • a composition comprising a Caudatin compound or a salt thereof of the present invention may be used as a food composition, in this case, an acceptable food supplement additive may be included, and a suitable carrier commonly used in the manufacture of food; It may further include excipients and diluents.
  • food means a natural product or processed product containing one or more nutrients, and specifically means a state that can be eaten directly through some processing process, and in a conventional sense, various foods, Functional foods, beverages, food additives and beverage additives are used in the sense of including all.
  • the food include various foods, beverages, gum, tea, vitamin complexes, functional foods, and the like.
  • the food of the present invention includes special nutritional food (eg, formula milk, infant food, etc.), processed meat products, fish meat products, tofu, jelly, noodles (eg, ramen, noodles, etc.), health supplements, seasoned foods ( Ex, soy sauce, soybean paste, red pepper paste, mixed soy sauce, etc.), sauces, confectionery products (eg snacks), dairy products (eg fermented milk, cheese, etc.), other processed foods, kimchi, pickled foods (various kimchi, pickles, etc.), beverages ( Examples include, but are not limited to, fruit and vegetable beverages, soy milk, fermented beverages, ice cream, etc.), natural seasonings (eg, ramen soup, etc.), vitamin complexes, alcoholic beverages, alcoholic beverages and other health supplements.
  • the functional food, beverage, food additive or beverage additive may be prepared by a conventional manufacturing method.
  • the term "functional food” refers to the biological defense rhythm control, disease prevention and recovery of a food group or food composition that has added added value to the food to act and express the function of the food for a specific purpose using physical, biochemical, and bioengineering methods, etc. It refers to a food that is designed and processed to sufficiently express the control function of the body with respect to the living body, and specifically may be a health functional food.
  • health functional food used in the present invention refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. using raw materials or ingredients useful in the human body.
  • function refers to obtaining a useful effect for health purposes, such as regulating nutrients or physiological action with respect to the structure and function of the human body.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and during the manufacture, it can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art. In addition, if the formulation of the health functional food is also recognized as a health functional food, it may be manufactured without limitation.
  • composition for food of the present invention can be prepared in various forms, and unlike general drugs, it has the advantage that there are no side effects that may occur during long-term administration of the drug using food as a raw material, and it is excellent in portability, and the present invention health functional food can be taken as a supplement to enhance the effect of breast cancer stem cell growth inhibition.
  • the functional food may include a food pharmaceutically acceptable food supplement additive, and may further include an appropriate carrier, excipient and diluent commonly used in the manufacture of functional food.
  • the food composition of the present invention may contain sweeteners, flavoring agents, physiologically active ingredients, minerals, etc. in addition to the active ingredients thereof.
  • the present invention may provide a method for inhibiting the growth of cancer stem cells in vitro, comprising the step of treating the cancer stem cells with a caudatin compound.
  • Human breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7 cells, were obtained from the American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) and used with 10% (V/V) fetal bovine serum (FBS; HyClone, Thermo Fisher Scientific, CA, USA) and 1% penicillin/streptomycin (Gibco, Thermo Fisher Scientific, CA, USA) were used in DMEM medium and cultured in a 5% CO 2 incubator.
  • FBS fetal bovine serum
  • Hibco Thermo Fisher Scientific, CA, USA
  • DMEM medium fetal bovine serum
  • Breast cancer cell lines were cultured at 1x10 4 cells per well in 6-well plates for ultra-low adhesion, and MammoCult was supplemented with hydrocortisone (0.48ug/mL), heparin (4ug/mL) and caudatin (100uM).
  • MFE (%) [Number of spheres in control group or drug treatment group/Number of spheres in control group (DMSO treatment group)] x 100
  • MDA-MB-231 cells were incubated with caudatin (100 uM) in 6-well plates for 24 hours. Then, apoptosis analysis was performed using Annexin V / PI staining kit according to the manufacturer's instructions (BD, San Jose, CA, USA). Stained cells were analyzed with Accuri C6 (BD, San Jose, CA, USA). In addition, MDA-MB-231 cells were incubated with 100 uM caudatin for 24 h, and then the cells were stained with Hoechst 33,342 staining solution (Invitrogen TM, Thermo Fisher Scientific, CA) for 10 min at 37 °C, followed by staining. The cells were analyzed with CELENA® S Digital Imaging System (Logos Biosystems, Anyang, Korea).
  • MDA-MB-231 cancer cells were seeded in a 6-well plate with DMEM/10% FBS at the number of 2 ⁇ 10 6 cells. When the cells grew into monolayers, a scratch was given using a microtip. After washing twice with 1X PBS, 50 or 100 uM of caudatin was added to the cells together with fresh DMEM/0.5% FBS medium and incubated for 12 hours. Micrographs of the wound site were analyzed with an optical microscope. The white line moved across the cells was measured for 5 arbitrarily selected regions, and the inhibition rate (%) was calculated with 100% of the wells untreated.
  • MDA-MB-231 cells (5x10 2 cells/well) were cultured in 6-well plates with concentration-specific (50, 100, 150, 300 and 400 uM) caudatin compounds for 7 days. Thereafter, colonies were fixed with 3.7% formaldehyde for 10 minutes and stained with 0.05% crystal violet for 30 minutes. The grown colonies were analyzed using a scanner (Umax PowerLook 1100, lasersoft Imaging, Seoul, Korea).
  • MDA-MB-231 cells were obtained by treatment with 1X trypsin / EDTA, anti-CD24 PE-conjugated antibody and anti-CD44 FITC-conjugated antibody (BD, San Jose, CA, USA) and reacted on ice for 20 minutes. Then, the cancer cells were washed three times with FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) buffer and analyzed with an Accuri C6 cytometer (BD, San Jose, CA, USA). The ALDH activity of MDA-MB-231 cells was performed using the ALDEFUOR TM-Assay Kit (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada).
  • Cancer cells were treated with caudatin (100uM) for 24 hours, and 37° in ALDH assay buffer. The reaction was carried out at a temperature of C for 30 minutes. Thereafter, ALDH-positive cells were analyzed using Accuri C6 (BD, San Jose, CA, USA).
  • Lysis buffer was used to obtain protein samples from mammospheres and cancer cells. After performing 10% SDS gel electrophoresis (SDS-PAGE), the protein was transferred to a PVDF membrane (Millipore, Burlington, MA, USA). Thereafter, the membrane was blocked with Odyssey blocking buffer at room temperature for 1 hour, and then reacted with the primary antibody overnight.
  • SDS-PAGE SDS gel electrophoresis
  • the antibody is anti-c-Myc (551101, BD, San Jose, CA, USA), anti-Oct4 (LF-MA30482) and anti-GAPDH (LF-PA0018) (AbFrontier, Seoul, Korea); anti-YAP (sc-101199), anti-Lamin B (sc-365962), anti-CD44 (sc-7297) and anti-Sox2 (sc-365923) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) and anti- GR (# 12041, Cell Signaling Technology, Danvers, MA USA) was used.
  • Protein samples were extracted from mammospheres using IP lysis buffer containing protease inhibitors. After the protein concentration was detected, all samples (450 ug per sample) were reacted with 30 ul of Puredown Protein A/G-Agarose (GenDEPOT, DAWINbio, Hanam, Korea) to remove non-specific proteins. Then, according to the manufacturer's protocol, anti-GR monoclonal antibody (mAb) (# 12041, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) was added to the protein sample and incubated at 4 °C overnight. Then, 50 uL of Puredown Protein A/G-Agarose was mixed with each sample and gently spun at 4 °C for 4 h. After centrifugation, western blot analysis was performed on all samples after washing with IP lysis buffer.
  • mAb monoclonal antibody
  • RNA was isolated and purified from MDA-MB-231 cells and mammospheres After RNA was isolated and purified from MDA-MB-231 cells and mammospheres, real-time RT-qPCR was performed using a one-step RT-qPCR kit (Enzynomics, Daejeon, Korea). The primers used at this time are shown in Table 1 below.
  • MDA-MB-231 cells were fixed with 3.7% paraformaldehyde, then permeabilized with 0.5% Triton X-100 for 15 minutes, and 3% bovine serum albumin (BSA). Blocking was performed for 60 minutes.
  • MDA-MB-231 cells were treated with human GR- and YAP-specific siRNA (Bioneer, Daejeon, Korea) to analyze the effects of GR and YAP proteins on mammosphere formation.
  • Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was treated with siRNA in a cancer cell line according to the manufacturer's instructions, and the levels of GR and YAP proteins were confirmed by Western blot analysis.
  • mice 4-week-old female nude mice were obtained from OrientBio (Seoul, Korea) and used. The mice were bred while receiving food and water for a week in each independent case. MDA-MB-231 cells (2x10 6 cells/mouse) were injected into 14 female nude mice, and they were divided into a negative control group and a caudatin compound-treated group (10 mg/kg). Then, the tumor volume in each mouse group for 1 month was measured by the formula [(width 2 X length)/2]. Animal experiments were performed in accordance with the guidelines approved by the Animal Care Committee (IACUC) of Jeju National University Animal Hospital.
  • IACUC Animal Care Committee
  • methanol extraction was performed. 7.5 L of methanol was added to 1 kg of pulverized bifoliate cow to obtain a methanol extract, which was then concentrated and mixed with water. Methanol was evaporated. Ethyl acetate was added to the methanol-evaporated water fraction to obtain an ethyl acetate fraction, which was then concentrated and the concentrate was loaded on a silica gel column (3x30 cm), followed by an elution solvent (chloroform: methanol, 20:1 mixed solvent) fractionated with Mammosphere formation was analyzed for a total of 5 fractions obtained by the above process, and it was found that the second fraction had mammosphere formation inhibitory activity (see FIG.
  • the second fraction was loaded onto a reversed-phase C18 open column (5x10 cm) to obtain four fractions, and whether mammospheres were formed in these fractions was analyzed (see FIG. 2 ).
  • FIG. 2 it was found that the formation of mammospher was inhibited in a fraction of 30-50%, and the fraction of 30-50% was loaded again on a Sephadex LH-20 column (2.5x30 cm) to obtain three fractions (Fig. 3). reference).
  • the first fraction was found to have mammospher-forming activity.
  • the first fraction was loaded again on TLC (glass plate; 20x20, layer thickness; 210-270um) and developed with a mixed solvent of chloroform and methanol (20:1) in a TLC glass chamber for 2 hours. After the plate was removed and dried, it was visualized with fluorescence by irradiating UV radiation (UV254 nm and UV365 nm). Each band was separated from the silica gel plate and eluted with methanol. Each fraction was analyzed for mammosphere formation (see FIG. 4 ). The third fraction was loaded on a Shimadzu HPLC 20A instrument (Shimadzu, Tokyo, Japan) and separated on an ODS 10x250 mm C18 column (flow rate, 2 mL/min).
  • the sample for loading on the column was prepared by filtration with a 0.2m syringe filter, and 500 uL was injected.
  • Water (solvent A) and acetonitrile (solvent B) were used as mobile phase solvents, and the elution was such that the acetonitrile solvent was initially 20%, then 80% in 20 minutes, and 100% in the final 30 minutes. .
  • the fraction containing the active ingredient was detected at a retention time of 35 minutes (see FIG. 5).
  • HMQC heteronuclear multiple quantum coherence
  • the mammosphere formation inhibitory ability analysis was performed on the solvent extracts and fractions of bilobed cowpea obtained in Example 1, and as a result, the methanol extract of bilobed cowpea inhibited the formation of mammospheres in the MDA-MB-231 cell line. It was confirmed that there is activity (Fig. 7b), and as a result of separating the active ingredient from the ethyl acetate fraction of the methanol extract, a caudatin compound having the chemical structural formula shown in Fig. 7c was identified.
  • Example 1 In order to confirm whether the caudatin compound isolated and identified from the extract of bifolium oxifolia in Example 1 has anticancer activity, the ability to inhibit proliferation and mammosphere formation against cancer cell lines was analyzed. To this end, the MDA-MB-231 breast cancer cell line was treated with a caudatin compound by concentration, and then cancer cell proliferation was analyzed. As a result, it was found that the growth of the breast cancer cell line was inhibited in a concentration-dependent manner (Fig. ).
  • the caudatin compound of the present invention induces apoptosis (apoptosis) of cancer cells.
  • apoptosis apoptosis
  • the caudatin compound-treated MDA-MB-231 cells were initially apoptotic. was shown to increase (FIG. 8c), and it was shown that the formation of apoptosis was induced through Hoechst staining (FIG. 8d).
  • the caudatin compound can inhibit all colony formation, migration and invasion of breast cancer cells (FIGS. 8e-g).
  • the caudatin compound of the present invention can inhibit both the growth and mammosphere formation of cancer cells, as well as colony formation, cancer cell migration and invasion.
  • the caudatin compound showed a significant anticancer effect in vitro, an experiment was performed to more closely check the effect of the compound on tumor growth through an in vivo study.
  • the body weight of each mouse, the tumor volume and the weight were measured for the control group and the caudatin-treated mouse group (experimental group) for mouse animals, respectively.
  • the caudatin compound of the present invention has an activity to effectively reduce tumor growth.
  • a population of breast cancer stem cells maintains the characteristics of a malignant tumor by expressing a CD44 + /CD24 ⁇ phenotype and ALDH1. Therefore, in order to determine whether the caudatin compound can attenuate the characteristics of these malignancies, the present inventors treated a breast cancer cell line having a CD44 + /CD24 - phenotype with a caudatin compound, and then calculated the number of CD44 + /CD24 - phenotype cells. measured.
  • the number of breast cancer cells having the CD44 + /CD24 ⁇ phenotype was reduced from 75.8% to 68.6% by treatment with the caudatin compound.
  • the number of cells expressing ALDH was significantly reduced from 14.4% to 1.4% (FIG. 10b).
  • the caudatin compound of the present invention can effectively suppress the marker expression of breast cancer stem cells, and ultimately can have anticancer activity through the inhibitory activity on breast cancer stem cells. there was.
  • glucocorticoid receptor (GR) levels were measured in MDA-MB-231 mammospheres.
  • cytoplasmic and nuclear expression level of GR protein in mammospheres (FIG. 11e) and the expression level of GR in MDA-MB-231 cells (FIG. 11f) were analyzed through immunofluorescence analysis. As a result, caudatin treatment It was found that both the expression level of GR in the cytoplasm and nucleus decreased.
  • FIG. 11g To confirm the role of GR protein in breast cancer stem cells (BCSC), mammosphere formation by GR-specific siRNA was analyzed. ) was found to be reduced by 50% (FIG. 11g). It was shown that mammosphere formation in breast cancer cells was inhibited even when RU486, an antagonist of GR, was treated ( FIG. 11h ).
  • FIG. 12A protein levels in nuclear extracts of mammospheres (Fig. 12d) and immunofluorescence (IF) levels of YAP in MDA-MB-231 cells (Fig. 12c) were significantly reduced by caudatin treatment.
  • YAP protein expression was reduced in MDA-MB-231 cells in which GR was knocked down by GR-specific siRNA treatment (Fig. 12e), and MDA-MB-231 cells treated with YAP-specific siRNA were It was found that the formation capacity was reduced by 50% (Fig. 12f). Verteporfin, an inhibitor of YAP-TEAD interaction, was shown to significantly inhibit mammosphere formation in breast cancer cells ( FIG. 12g ).
  • CTGF and CYR61 YAP target genes
  • CSC cancer stem cell
  • CSC cancer stem cells
  • stem cell marker proteins including c-Myc, Oct4, Sox2 and CD44 was reduced in mammospheres derived from MDA-MB-231 cells ( FIG. 13A ).
  • caudatin was treated on mammospheres and the number of breast cancer cells derived from mammospheres was quantitatively analyzed. As a result, apoptosis of cancer cells was increased by caudatin treatment, and the number of cancer cells was decreased in mammospheres ( FIG. 13b ).
  • the caudatin compound can inhibit the growth of cancer stem cells through inhibition of the GR/YAP signaling pathway ( FIG. 13c ).

Abstract

본 발명은 카우다틴片；111（1때11）화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로，구체적으로 본 발명은 카 우다틴 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는，암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성 물 및 건강기능식품에 관한 것이며，또한 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수 득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는，암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성 물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

카우다틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물
본 발명은 카우다틴 화합물의 신규 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 카우다틴 화합물의 암 줄기세포 성장억제 활성을 확인함으로써 카우다틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
종래 개발된 항암제들은 종양 내 암 세포들을 표적화하여 효과적으로 치료하지 못하고, 종양의 재발 및 전이가 진행됨에 따라 최근에는 암 줄기세포를 타겟으로 하는 새로운 항암제의 개발에 대한 연구가 대두되고 있다. 특히 암 줄기세포는 천천히 증식하는 특징을 가지고 있어 빠르게 증식하는 암 세포에 독성을 유발하는 종래의 항암요법으로는 암 줄기세포를 억제하지 못하는 문제점이 있다. 따라서 암을 효과적으로 완전하게 예방 또는 치료하기 위해서는 암 세포뿐만 아니라 암 줄기세포에 대한 표적치료도 가능한 새로운 항암제의 개발이 필요하다.
암 줄기세포는 화학 요법과 방사선 치료에 대한 약제 내성 및 방사선 내성을 가지고 있고, 암의 재발과 전이를 유발한다. 따라서 암 줄기세포에 대한 표적 치료는 암 치료에 필수적이다. 암 줄기세포는 Oct4, Sox2, Nanog 및 알데히드 탈수소효소-1 (ALDH)을 포함하는 특정 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다. ALDH는 유전 독성의 알데히드를 산화하는 효소이며, 이의 효소 활성은 백혈병, 두경부, 방광, 뼈, 결장, 간, 폐, 췌장, 전립선, 갑상선 및 자궁경부암의 암 줄기세포 (CSC) 마커로 널리 사용되고 있고, 암 줄기세포의 치료표적으로 알려져 있다. 또한, 임상 표본에서 CD44 high /CD24 low를 발현하는 유방암 집단에서 종양을 형성하는 능력이 뛰어난 것으로 알려져 있다.
암 줄기세포에 대한 항암제의 필요는 유방암 치료에 있어서 더욱 필요한데, 기저세포형 (basal cell phenotype) 유방암은 분화과정의 초기 단계의 유선 모세포 (earliest mammary progenitor cell)에서 기원한 것으로 여겨지며, 예후가 불량하고 기존의 항암요법에 내성을 나타낸다고 알려져 있으며, 항암 치료의 실패원인이 암 줄기세포에 대한 표적치료가 제대로 이루어지지 못하고 있기 때문이다.
한편, 유방암은 여성에서 흔한 암이며, 여성 암 환자에서 주요 사망의 원인으로 알려져 있다. 조기 유방암에 폴리항암화학요법 (polychemotherapy), 타목시펜과 함께 광범위한 유방 X 선 촬영 및 보조 요법이 유방암의 사망률을 줄였으나, 유방암은 여전히 재발과 전이로 인해 가장 위험한 질병으로 알려져 있다. 최초로 암 줄기세포 (Cancer stem cell, CSCs)가 골수성 백혈병에서 확인되었고, 이후, 유방, 뇌, 결장, 난소, 췌장, 및 전립선 암 등 다양한 고형암의 집단에서 발견되었다. 암 줄기세포는 종양-시작 세포 (tumor initiating cells)와 암 줄기 유사 세포 (cancer stem-like cell)로도 불린다. 또한 유방암을 포함한 다양한 암 유형이 종양의 소집단이라고 할 수 있는 암 줄기세포 (CSC; cancer stem cell)로부터 유래되는 것으로 나타났다. 이러한 집단은 자가 재생 (self-renewal) 및 분화를 통해 종양 부피에 변화를 유발하는 것으로 알려져 있다.
그러므로 암 줄기세포에 대한 효과적인 억제제를 개발한다면 유방, 뇌, 결장, 난소, 췌장, 및 전립선 암 등 다양한 고형암에 대한 효과적인 암 치료가 가능할 것이다.
이에 본 발명자들은 암 줄기세포를 타겟으로 하는 효과적인 새로운 항암제를 개발하기 위해 연구하던 중, 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 추출물로부터 분리한 카우다틴 (Caudatin) 화합물이 암 줄기세포의 성장 및 증식을 억제하는 활성이 있음을 확인함으로써 암 줄기세포를 타겟으로 하는 새로운 항암제로 사용 가능함을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포의 성장억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 줄기세포에 카우다틴 화합물을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 메탄올 추출물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은, 암 줄기세포의 성장억제; 암 세포의 증식억제; CD44+/CD24- 및 탈수소효소 (ALDH)를 발현하는 암 세포의 성장억제; 맘모스페어(mammosphere)의 형성 억제 또는 맘모스페어의 성장억제; 또는 유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor) 분해 활성 및 GR (glucocorticoid receptor) 신호경로 차단; 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계 (central nervous system;CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체선종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물에는 카우다틴 (Caudatin) 화합물을 포함하고 있는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포의 성장억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계 (central nervous system;CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체선종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 메탄올 추출물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 카우다틴 화합물은, 암 줄기세포의 성장억제; 암 세포의 증식억제; CD44+/CD24- 및 탈수소효소 (ALDH)를 발현하는 암 세포의 성장억제; 맘모스페어 (mammosphere)의 형성억제 또는 맘모스페어의 성장억제; 또는 유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor) 분해 활성 및 GR (glucocorticoid receptor) 신호경로 차단; 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계 (central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체선종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물에는 카우다틴 (Caudatin) 화합물을 포함하고 있는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은 암 줄기세포에 카우다틴 화합물을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 에틸아세테이트 분획물 및 상기 분획물로부터 분리한 카우다틴 화합물은 암 줄기세포의 증식 및 성장을 억제할 수 있고, 암 줄기세포의 마커 유전자들의 발현을 억제할 수 있으며, 유방암 줄기세포의 맘모스페어 형성을 억제하고 유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor)의 분해를 유도하며 GR 신호경로 차단을 통해 암 줄기세포를 억제할 수 있는 활성이 있어, 암을 예방 또는 치료하기 위한 의약품 및 건강기능식품 등의 산업에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 이엽우피소의 메탄올 추출물의 물 분획물에 대한 에틸아세테이트 분획물을 컬럼크로마토그래피로 총 5개 분획물을 수득하고 각 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과로서, A는 에틸아세테이트 분획물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 수행한 결과이고, B는 상기 실리카 겔 컬럼크로마토그래피로 수득한 총 5개의 분획물에 대한 TLC 분리 및 UV 조사 결과를 나타낸 것이며, C는 총 5개의 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 도 1에서 수득한 총 5개 분획물 중에서 2번째 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과로서, A는 2번째 분획물을 역상 C18 (ODS) 겔 크로마토그래피로 분리한 결과를 나타낸 것이고, B는 상기 2번째 분획물의 역상 C18 (ODS) 겔 크로마토그래피로 분리된 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 도 2에서 암 줄기세포 억제능을 보이는 분획물 (30~50%)을 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피를 이용하여 다시 3개의 분획물로 분리하고 각 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 것으로, A는 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피를 수행한 결과를 나타낸 것이고, B는 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피로 수득한 총 3개의 분획물에 대한 TLC 분리 및 UV 조사 결과를 나타낸 것이며, C는 상기 총 3개의 분획물에 대한 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 도 3에서 Sephadex LH-20 겔 크로마터그래피로 분리된 3개의 분획물 중, 암 줄기세포에 대한 억제능을 갖는 1번째 분획물을 다시 TLC 분리를 수행한 후 UV 조사하여 형광 가시화한 결과를 나타낸 것이고 (A 및 B), C는 상기 TLC 분리로 얻은 총 4개의 밴드에 대한 분획물에 대하여 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 도 4에서 암 줄기세포 억제능을 보인 3번 분획물을 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)를 수행하여 활성성분의 화합물을 분리한 결과를 나타낸 것으로, A는 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이고, B는 HPLC 크로마토그램으로 용출된 활성 성분을 포함한 분획에 대한 TLC 분리를 수행한 결과이며, C는 암 줄기세포 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 이엽우피소 추출물로부터 분리된 활성 성분인 카우다틴 화합물에 대한 NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 본 발명의 카우다틴 화합물을 함유한 분획물의 추출공정, 도 7b는 카우다틴 화합물의 암 줄기세포 억제능 분석결과, 도 7c는 카우다틴 화합물의 화학 구조식을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 카우다틴 화합물의 유방암 세포의 증식 및 mammosphere 형성에 미치는 영향을 분석한 것으로, 도 8a는 MDA-MB-231 세포에 카우다틴을 농도별로 처리한 후 세포 증식 정도를 분석한 결과이고, 도 8b는 카우다틴 및 ciclesonide을 각각 처리하고 MDA-MB-231 세포 유래의 mammosphere 형성 정도를 MFE (mammosphere formation efficiency)로 분석한 결과 및 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이고, 도 8c는 카우다틴에 처리된 MDA-MB-231 세포에 대한 세포사멸 정도를 Annexin V/propidium iodide (PI) 염색으로 확인한 결과이며, 도 8d는 카우다틴에 의해 사멸된 세포를 Hoechst 33,342 시약으로 염색하여 관찰한 사진을 나타낸 것이고, 도 8e는 MDA-MB-231 세포에 대하여 카우다틴 화합물 처리 여부에 따른 세포 이동정도를 화합물의 처리 농도 및 시간별 스크래치 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 8f는 카우다틴에 의한 암세포 이동 및 침윤 여부를 트랜스웰 분석으로 확인한 것이며, 도 8g는 카우다틴을 농도별 MDA-MB-231 세포에 처리한 후, 콜로니의 형성여부를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 마우스 동물모델에서 카우다틴 처리에 따른 종양 억제 효과를 확인한 것으로, MDA-MB-231 암세포를 암컷 누드 마우스에 주입한 후, 카우다틴을 투여한 군 및 대조군으로 DMSO를 투여한 군에 대하여, 체중의 변화 (도 9a), 종양 부피변화 (도 9b) 및 종양의 무게 (도 9c)를 각각 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 암 세포주 (MDA-MB-231)에서 카우다틴 처리에 따른 CD44high/CD24low 및 ALDH (aldehyde dehydrogenase) 양성 세포 집단의 변화를 분석한 것으로, 도 10a는 유세포 분석기를 통해 카우다틴 처리군 및 대조군에서 CD44high/CD24low 세포집단을 분석한 것이고, 도 10b는 ALDEFLUOR 분석 및 FACS 분석결과를 나타낸 것으로, 오른쪽 그래프들은 ALDH 억제제인 DEAB를 처리한 군에서의 ALDH 양성 세포집단을 분석한 것이고, 왼쪽 그래프들은 DEAB를 처리하지 않은 군에서의 ALDH 양성 세포집단을 분석한 것이다.
도 11은 카우다틴의 유비퀴틴 의존적 GR 분해를 통한 GR (glucocorticoid receptor) 신호전달의 억제활성을 확인한 것으로, 도 11a는 카우다틴 처리에 따른 MDA-MB-231 유래 mammospheres에서 GR 단백질의 발현정도를 웨스턴블럿으로 확인한 것이고, 도 11b는 카우다틴 처리 후, mammospheres에서 GR 유전자의 전사체 수준을 RT-qPCR을 수행하여 확인한 결과이며, 도 11c는 mammospheres를 카우다틴과 반응시킨 후, anti-GR 항체로 면역침강 수행 후, anti-ubiquitin 및 anti-GR 항체를 이용한 웨스턴블럿 결과를 나타낸 것이며, 도 11d는 mammospheres를 카우다틴 및 MG132와 24시간 동안 반응시킨 후 웨스턴블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도 11e는 mammospheres를 카우다틴과 반응시킨 후, MDA-MB-231로부터 유래된 mammospheres의 세포질 분획 및 핵 분획에 대해 GR의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 것이고, 도 11f는 카우다틴이 처리된 MDA-MB-231에서 GR의 발현 및 위치를 면역형광분석을 통해 확인한 것이며, 도 11g는 GR 특이적 siRNA에 의한 GR 넉다운 시, mammospheres 형성에 미치는 영향을 분석한 결과이고, 도 11h는 GR에 대한 길항제인 RU-486 처리에 의한 mammospheres 형성에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 카우다틴의 YAP 핵 내로의 위치 억제활성 및 암 줄기세포의 형성 제어능을 분석한 결과로서, 도 12a는 mammospheres에 카우다틴을 처리하고 MDA-MB-231로부터 유래된 mammospheres에서 YAP의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 결과이고, 도 12b는 RT-qPCR을 수행하여 YAP 유전자의 전사체 수준을 측정한 것이며, 도 12c는 카우다틴이 처리된 MDA-MB-231에서 YAP의 발현 (빨간색) 및 위치를 면역형광분석을 통해 확인한 것이고, 도 12d는 mammospheres에 카우다틴을 처리 후, MDA-MB-231로부터 유래된 mammospheres의 세포질 분획 및 핵 분획에 대해 YAP 의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 것이고, 도 12e는 GR 특이적 siRNA가 처리된 MDA-MB-231 세포에서 GR 및 YAP의 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 것이며, 도 12f는 YAP 특이적 siRNA 처리에 의한 mammosphere 형성에 미치는 영향을 분석한 것이며, 도 12g는 YAP/TEAD 복합체의 억제제인 verteporfin 처리에 의한 mammosphere 형성에 미치는 영향을 분석한 것이고, 도 12h~j는 카우다틴, GR siRNA 및 verteporfin를 각각 처리한 군에서 CYR61 및 CTGF 유전자의 발현수준을 RT-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 암 줄기세포의 마커 단백질의 발현 및 mammospheres 성장에 대한 카우다틴 화합물의 영향을 분석한 것으로, 도 13a는 카우다틴이 처리된 mammospheres 에서 c-Myc, Oct4, Sox2 및 CD44의 단백질 수준을 웨스턴블럿으로 분석한 결과이며, 도 13b는 mammospheres에 카우다틴을 처리한 군과 처리하지 않은 군에 대하여 시간별 단일세포로 분리되어진 세포수를 각각 측정한 결과이고, 도 13c는 카우다틴의 GR 분해작용 및 YAP 신호경로 조절을 통한 암 줄기세포의 세포사멸 메커니즘 모델을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum) 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 카우다틴 (Caudatin) 화합물이 암 줄기세포 (cancer stem cells; CSC)에 대한 성장억제 활성이 우수하여 새로운 항암제로 사용 가능함을 규명하였다.
본 발명자들은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 대하여 다시 에틸아세테이트 분획물을 수득하였고, 상기 에틸아세테이트 분획물로부터 활성성분인 카우다틴 (Caudatin) 화합물을 분리하였고, 이들에 대한 항암 활성을 분석하였다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에 의하면, 이엽우피소의 메탄올 추출물의 물 분획물에 대한 에틸아세테이트 분획물을 수득하고, 상기 분획물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 통해 총 5개의 분획물을 얻은 다음, 이 중에서 암 줄기세포 억제능을 보이는 2번째 분획물을 다시 C18 오픈 컬럼크로마토그래피를 통해 총 4개의 분획물을 얻었으며, 이 중 암 줄기세포 억제능을 보이는 30~50% 분획물에 대하여 다시 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 통해 총 3개의 분획물을 수득하였다. 상기 3개의 분획물 중에서 1번째 분획물이 암 줄기세포에 대한 억제능이 있는 것으로 확인되어, 상기 1번째 분획물에 대한 HPLC를 수행하여 본 발명의 카우다틴 화합물을 최종적으로 분리 및 동정하였다.
나아가 본 발명의 다른 일실시예에서는, 본 발명에서 분리된 카우다틴 화합물에 대한 항암 활성여부를 확인하기 위하여, 카우다틴 화합물 처리에 따른 암 세포주에 대한 증식 억제능 및 맘모스페어 (mammosphere) 형성 억제능을 분석하였는데, 그 결과, 카우다틴 처리 농도 의존적으로 암 세포주에 대한 증식을 억제하고, 암 세포주의 세포사멸 (apoptosis)을 유도할 뿐만 아니라 암 줄기세포에 대한 성장 억제 및 맘모스페어 (mammosphere) 형성 억제 활성이 우수한 것으로 나타났다.
유방암 세포주 뿐만 아니라 폐암을 비롯한 다양한 암 세포주의 경우, 줄기세포의 성질을 가지는 세포들이 서로 부착되어 구형의 세포 덩어리를 형성할 수 있는데, 이를 투머스페어 (tumorsphere)라 한다. 상기 투머스페어는 하나의 암 줄기세포 또는 암 전구세포의 증식에 의해 발달된 종양구를 의미한다.
또한, 유방암 세포주는 시험관 내에서 부착 없이도 세포사멸하지 않고 타원 형태로의 성장을 할 수 있는 줄기세포와 유사한 능력을 가진 세포의 부분집락을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 부유배양으로 기층이 없는 조건을 인공적으로 만들면 줄기세포의 성질을 가지는 세포들은 서로 부착되어 구형의 세포 덩어리를 만들게 되며, 이러한 세포 덩어리를 뉴로스페어 (neurosphere)라 불린다. 인간의 유방 줄기세포에 이러한 개념을 적용한 것이 "맘모스페어 (mammosphere)"이다.
맘모스페어는 일반 인간 유방 세포보다 8배 많은 전구 세포들이 존재하며 지속적으로 계대 배양이 가능하고, 여러 번의 계대 배양 후에는 100%의 세포가 모두 bi-potent 전구체로 자라는 특징이 있다. 맘모스페어는 성인 유방 세포인 유선 상피세포 (mammary gland epitherlial cell), 관 상피세포 (ductal epithelial cell), 엘비올라 상피세포 (alveolar epitherlial cell)들로 모두 분화가 가능하며, 마트리겔 (Matrigel) 내에서 삼차원 구조를 이루면서 복잡한 기능성 유방 구조물을 형성하는 것이 관찰된다. 맘모스페어는 줄기세포의 가장 특징 중의 하나인 자가 증식을 할 수 있는 성질이 있어서 하나의 맘모스페어에서 여러 개의 맘모스페어 또는 유방줄기세포를 다량으로 얻을 수 있다. 또한 조혈모 세포, 신경 줄기세포, 배아 줄기세포 등과 비교하여 많은 발현 유전자가 중복되는 것이 확인되어, 맘모스페어가 실제적인 유방암 줄기세포인 것으로 보고 되었다. 이러한, 암 줄기세포의 자가 재생 능력의 표준 분석 방법은 in vivo 에서의 이식 (transplantation) 및 in vitro에서의 맘모스페어 형성을 분석하는 것이다.
이러한 점에서 본 발명의 카우다틴 화합물은 유방암 줄기세포인 맘모스페어의 형성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 암 세포주의 콜로니 형성, 이동 및 침윤을 모두 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는, CD44+/CD24- 표현형과 ALDH1을 발현하여 악성종양의 특성을 유지하는 유방암 줄기세포에 대해 카우다틴 화합물을 처리한 결과, CD44+/CD24- 표현형과 ALDH1을 발현하는 유방암 줄기세포의 세포수가 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 본 발명자들은 카우다틴 화합물이 암 줄기세포를 타겟팅하는 보다 효과적인 새로운 암 치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 암 줄기세포에 대한 카우다틴 화합물의 활성 메커니즘을 확인하였는데, 이를 위해 유방암 세포주인 MDA-MB-231 맘모스페어에서 카우다틴 처리에 의한 GR (glucocorticoid receptor)의 발현변화를 측정하였다.
그 결과, 카우다틴 처리에 의해 총 GR의 단백질 수준이 감소한 것으로 나타났으며, 유비퀴틴화된 GR의 수준이 증가한 것으로 나타났고, 반면, 프로테아좀 억제제인 MG132를 처리한 군에서는 카우다틴에 의한 GR 분해가 억제되는 것으로 나타났다. 이를 통해 카우다틴이 유비퀴틴 (Ub) 관련 GR의 분해를 활성화시킬 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 유방암 줄기세포 (BCSC)에 GR-특이적 siRNA를 처리하여 GR 유전자의 발현을 넉다운 시킨 결과, 종양구 (tumorsphere)의 형성능이 현저하게 감소한 것으로 나타났고 맘모스페어의 형성이 억제되는 것으로 나타났다. 또한, GR 신호경로의 하위 인자인 YAP (Yes-associated protein)에 대한 카우다틴의 영향을 분석한 결과, 카우다틴이 처리된 맘모스페어에서 전사보조 활성화 인자 (transcription co-activator)인 YAP의 수준이 감소되어 있는 것으로 나타났고, 유방암 줄기세포의 형성에 관여하는 YAP의의 타겟 유전자인 CTGF 및 CYR61의 전사체 수준이 카우다틴 처리에 의해 감소되는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 GR/YAP의 신호전달 경로가 맘모스페어 형성에 관여하며 조절자로 작용한다는 것을 의미하며, 카우다틴 화합물이 암 줄기세포, 특히 유방암 줄기세포에서 유비퀴틴 의존적 분해를 통해 GR 신호전달의 이상을 유도하며, 암 줄기세포에 필요한 유전자들의 발현을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 카우다틴 화합물은 암 줄기세포에 대한 마커 유전자들의 발현 억제 활성이 있음을 확인하였는데, 카우다틴 처리 시, c-Myc, Oct4, Sox2 및 CD44를 포함한 줄기세포 마커 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
그러므로 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 메탄올 추출물로부터 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 카우다틴 화합물은, 암 줄기세포의 성장억제; 암 세포의 증식억제; CD44+/CD24- 및 탈수소효소 (ALDH)를 발현하는 암 세포의 성장억제; 맘모스페어 (mammosphere)의 형성 억제 또는 맘모스페어의 성장억제; 또는 유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor) 분해 활성 및 GR (glucocorticoid receptor) 신호경로 차단; 활성을 가지고 있어 효과적으로 암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서, 상기 "암"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. "암"이란 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로 과다증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미한다.
본 발명에서, 상기 "암 줄기세포"는 다양한 암세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화세포로, 상기 암으로는 결장암 및 직장암을 포함하는 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계 (central nervous system;CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 또는 뇌하수체선종일 수 있다. 보다 바람직하게는 유방암 일 수 있다.
본 발명에서 "암 줄기세포 성장 억제"는 암 줄기세포 유지 (maintenance) 억제, 암 줄기세포 악성화 (malignance) 억제, 암 줄기세포 이동 및 암 줄기세포 침윤활성 (invasive) 억제를 포함한다.
또한 "암 줄기세포 예방"은 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 암 줄기세포의 성장 또는 증식을 방지시키거나, 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 상기 "약학적으로 허용되는 염"은 상기 화합물의 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조된 염을 의미하며, 이러한 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용되는 염은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다.
예를 들어, 약제학적으로 허용되는 염기 부가 염들은 무기 및 유기 염기들로부터 제조될 수 있다. 무기 염기들로부터 유도된 염들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 및 마그네슘 염들을 포함할 수 있다. 유기 염기들로부터 유도된 염들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 일차, 이차 및 삼차 아민; 천연적으로 발생하는 치환된 아민들을 포함하는 치환된 아민들; 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민 (tromethamine), 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인 (procaine), 히드라바민 (hydrabamine), 콜린 (choline), 베타인 (betaine), 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민 (theobromine), 퓨린, 피페라진, 피페리딘, 및/또는 N-에틸피페리딘을 포함하는 시클릭 아민들의 염들을 포함할 수 있다. 또한, 다른 카르복실산 유도체, 예를 들어 카르복사미드 (carboxamides), 저급 알킬 카르복사미드, 디 (저급 알킬) 카르복사미드 등을 포함하는 카르복실산 아미드도 포함될 수 있다.
예를 들어, 약학적으로 허용되는 산 부가 염들은 무기 및 유기산들로부터 제조될 수 있다. 무기산들로부터 유도된 염들은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 유기산들로부터 유도된 염들은 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산 (malic acid), 말론산, 숙신산, 말레산 (maleic acid), 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산 (cinnamic acid), 만델산 (mandelic acid), 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔 술폰산, 및/또는 살리실산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 (carrier) 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용 (처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 "담체"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.
본 발명의 카우다틴은 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다. 상기 약학 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효성분인 PAA와 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 유효성분; 약학적으로 허용되는 적당한 담체; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용되는 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 유효성분은 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입 (infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태 (연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.
또한 본 발명은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 이엽우피소 메탄올 추출물에 대한 물 분획물의 에틸아세테이트 분획물은 암 줄기세포의 성장 억제 활성이 있음을 하기 실시예를 통해 확인하였고, 상기 에틸아세테이트 분획물에는 카우다틴 화합물이 포함되어 있다.
또한 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포의 성장억제용 조성물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "개체"란 질병의 예방, 조절 또는 치료방법을 필요로 하는 대상을 의미하고, 사람, 개, 원숭이, 고양이, 설치류, 예컨대 마우스, 유전자 조작된 마우스 등 제한 없이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "치료학적으로 유효한 양"은 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 조성물의 약학적으로 허용가능한 염의 양을 의미하며, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명에서, 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
나아가 본 발명은 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있으며, 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
본 발명의 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물은 식품 조성물로 이용될 수 있는데, 이 경우, 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 구체적으로 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 기능성 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 식품의 예로서 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명의 식품에는 특수영양식품 (예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류 (예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품 (예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류 (예, 스넥류), 유가공품 (예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품 (각종 김치류, 장아찌 등), 음료 (예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료 (예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 기능성 식품, 음료, 식품첨가제 또는 음료첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 "기능성 식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병 방지와 회복등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강기능식품일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 "기능"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 유방암 줄기세포 성장 억제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
또한, 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.
나아가 본 발명은 암 줄기세포에 카우다틴 화합물을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 실험방법>
1) 시약
실리카 겔 60 및 박층 크로마토그래피 (TLC) 플레이트는 MERK (Darmstadt, 독일) 사에서 구입한 것을 사용하였고, Sephadex LH-20은 Pharmacia (스웨덴 웁살라) 사에서 구입하여 사용하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 Shimadzu 적용 시스템 (Shimadzu, Kyoto, 일본) 제품을 사용하였다. 세포 생존율 분석은 EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit (DoGenBio, Seoul, 대한민국) 제품을 사용하였고, Caudatin (순도는> 98%)은 ChemFaces Co. (중국 후베이) 사에서 구입하여 사용하였는데, 100% DMSO를 이용하여 100mM 농도로 용해한 후, -20°C에서 보관하였고, 최종 DMSO의 농도는 0.1 % 미만으로 사용하였으며, 대조군은 DMSO만 처리한 군을 사용하였다.
2) 식물준비
이엽우피소 (C. auriculatum)는 대구 시장에서 구입한 것을 사용하였고, 시료(2018_03 호)는 제주 대학교 바이오소재학과에 기탁되어 있다.
3) 세포배양 및 맘모스페어 (mammosphere) 형성 분석
인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포는 American Type Culture Collection (미국 메릴랜드 주 Rockville)에서 수득하여 사용하였고, 10% (V/V) 소태아 혈청 (FBS; HyClone, Thermo Fisher Scientific, CA, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, CA, USA)이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 유방암 세포주들은 초저 부착용 6-웰 플레이트에 웰당 1x104개 세포수로 배양하였는데, hydrocortisone (0.48ug/mL), heparin (4ug/mL) 및 caudatin (100uM)이 첨가된 MammoCult. culture medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada) 배지를 이용하여 7일 동안 배양하였다. 2 차 mammosphere 형성을 위해 1차 mammosphere를 개별적으로 코니칼 튜브에 수집한 후, 1000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 이후 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 1X EDTA/Trypsin으로 처리하고 단일 세포 현탁액을 2mL의 complete MammoCultTM 배지가 첨가된 6-웰 플레이트에 웰당 1x104개 세포수로 분주하여 배양하였고, 5일 동안 mammosphere 의 수와 크기를 대조군과 비교하여 분석하였다. Mammosphere의 형성은 NIST의 NICE (integrated colony enumerator) 프로그램을 이용하여 정량화 하였고, MFE%(mammosphere formation efficiency)로 측정하였다. 여기서 상기 MFE(%)는 하기 계산식으로 계산하였다.
MFE (%)= [대조군 또는 약물 처리군에서의 sphere 수/대조군(DMSO 처리군)에서의 sphere 수] x100
4) 세포증식 분석
유방암 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 1.5x104개 세포로 분주하고 24시간 동안 배양 후, 농도별 카우다틴 화합물 (25, 50, 100, 150, 300 및 400uM)을 상기 세포에 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 이후 EZ-Cytox kit (DoGenBio, Seoul, Korea)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 세포증식 정도를 분석하였으며 OD450 값은VERSA max 마이크로 플레이트리더기 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
5) Annexin V / PI (Propidium Iodide)을 이용한 세포 아폽토시스 및 Hoechst을 이용한 아폽토시스 핵의 염색
MDA-MB-231 세포를 6웰 플레이트에서 24시간 동안 카우다틴 (100uM)과 함께 배양하였다. 이후 Annexin V / PI 염색 키트를 사용하여 제조사 (BD, San Jose, CA, USA)의 지침에 따라 아폽토시스 분석을 수행하였다. 염색된 세포는 Accuri C6 (BD, San Jose, CA, USA)으로 분석하였다. 또한, MDA-MB-231 세포를 100uM caudatin과 함께 24시간 동안 배양한 다음, 세포를 37°C에서 10 분 동안 Hoechst 33,342 염색용액 (Invitrogen TM, 미국 캘리포니아주 Thermo Fisher Scientific)으로 염색한 후, 염색된 세포를 CELENA® S Digital Imaging System (Logos Biosystems, 안양, 한국)으로 분석하였다.
6) 스크래치 분석
MDA-MB-231 암세포를 DMEM/10% FBS와 함께 2×106개 세포수로 6-웰 플레이트에 분주하였다. 세포가 단층으로 성장하면, 마이크로 팁을 사용하여 스크래치를 주었다. 1X PBS로 2회 세척 후, 상기 세포에 50 또는 100uM의 카우다틴을 신선한 DMEM/0.5% FBS 배지와 함께 첨가하고 12시간 동안 배양하였다. 상처 부위에 대한 현미경 사진은 광학현미경으로 분석하였다. 세포들이 가로질러 이동한 흰색 선은 임의적으로 선택한 5개 영역에 대하여 측정하였고, 억제율 (%)은 아무것도 처리하지 않은 웰을 100%로 하여 계산되었다.
7) 트랜스웰 분석
새포 침윤 및 세포이동 분석은 8um 기공을 갖는 폴리카보네이트 멤브레인 (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)으로 상기 막은 24 웰 삽입물에 Matrigel 매트릭스 기저 (BD, San Jose, CA, USA)로 코팅된 것과 코팅되지 않은 것을 사용하였다. 0.5% FBS가 포함된 DMEM에 100uM 카우다틴 화합물이 처리된 200ul의 MDA-MB-231 세포 현탁액 (1x105 세포)을 상부 챔버에 첨가하였다. 그런 다음 화학주성인자 (chemoattractant)로서 20% FBS를 포함하는 900uL의 DMEM을 하부 챔버에 첨가하였다. 암 세포는 2일 동안 5% CO2 배양기에서 37℃ 온도 하에 배양하였다. 이후 막을 통과한 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정하고 0.03% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 이미지는 역광 현미경으로 수득하였다.
8) 콜로니 형성능 분석
MDA-MB-231 세포 (5x102개 세포/웰)를 6웰 플레이트에서 농도별 (50, 100, 150, 300 및 400uM) 카우다틴 화합물과 함께 7일 동안 배양하였다. 이후 콜로니는 3.7 % 포름알데히드로 10분 동안 고정하고 0.05 % 크리스탈 바이올렛으로 30분 동안 염색하였다. 성장한 콜로니는 스캐너 (Umax PowerLook 1100, lasersoft Imaging, 서울, 한국)를 이용하여 분석하였다.
9) 유세포 분석 및 ALDH1 활성분석
유세포 분석은 24시간 동안 카우다틴 (100uM) 처리 후, MDA-MB-231 세포를 1X 트립신/ EDTA를 처리하여 수득한 후, 항-CD24 PE-접합 항체 및 항-CD44 FITC-접합 항체 (BD, San Jose, CA, USA)를 처리하고 얼음 위에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 암세포를 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) 버퍼로 3회 세척하고 Accuri C6 세포 계측기 (BD, San Jose, CA, USA)로 분석하였다. MDA-MB-231 세포의 ALDH 활성은 ALDEFUOR TM-분석키트 (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada)를 사용하여 수행하는데, 암세포에 카우다틴 (100uM)을 24시간 동안 처리하고 ALDH 분석 버퍼에서 37°C의 온도로 30분 동안 반응시켰다. 이후 ALDH 양성 세포를 Accuri C6 (BD, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
10) 웨스턴 블럿
용해 버퍼를 사용하여 mammospheres 및 암 세포로부터 단백질 샘플을 수득하였다. 10% SDS 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 수행한 후, 단백질을 PVDF멤브레인 (Millipore, Burlington, MA, USA)으로 이동시켰다. 이후 멤브레인을 Odyssey 블록킹 버퍼로 실온에서 1시간 동안 블록킹 한 다음, 1차 항체로 밤새도록 반응시켰다. 이때 상기 항체는 항-c-Myc (551101, BD, San Jose, CA, 미국), anti-Oct4 (LF-MA30482) 및 anti-GAPDH (LF-PA0018) (AbFrontier, Seoul, Korea); anti-YAP (sc-101199), anti-Lamin B (sc-365962), anti-CD44 (sc-7297) 및 anti-Sox2 (sc-365923) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 및 anti-GR (# 12041, Cell Signaling Technology, Danvers, MA 미국)을 사용하였다. Tris-buffered saline/Tween 20을 사용하여 상기 멤브레인을 3회 세척한 후, 모든 멤브레인을 IRDye 680RD- 및 IRDye 800W- 표지된 2차 항체로 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 신호 이미지는 Odyssey CLx (Li-Cor, Lincoln, NE, USA)로 분석하였고, 웨스턴 블럿의 농도 측정은 Odyssey CLx의 Image Studio Ver 5.2 프로그램 (Li-Cor, Lincoln, NE, USA)을 사용하여 분석하였다.
11) 면역침강 (Immunoprecipitation; IP)
단백질 샘플은 프로테아제 억제제를 포함하는 IP 용해버퍼를 사용하여 mammospheres로부터 추출하였다. 단백질 농도 검출 후, 모든 샘플 (샘플 당 450ug)을 30ul의 Puredown Protein A/G-Agarose (GenDEPOT, DAWINbio, Hanam, Korea)와 반응시켜 비특이적 단백질을 제거하였다. 이후 제조업체의 프로토콜에 따라 anti-GR 단일클론항체(mAb) (# 12041, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 상기 단백질 샘플에 첨가하고 4°C에서 밤새도록 반응시켰다. 그 다음, 50uL의 Puredown Protein A/G-Agarose를 각 샘플과 혼합하고 4°C에서 4시간 동안 부드럽게 회전시켰다. 원심 분리 후, IP 용해버퍼로 세척 후 모든 샘플을 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
12) 유전자 발현분석
MDA-MB-231 세포 및 mammospheres 로부터 RNA를 분리하고 정제한 후, one-step RT-qPCR kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 실시간 RT-qPCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 하기 표 1에 기재하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2021013456-appb-img-000001
Real-time RT-qPCR에 사용한 프라이머들의 서열
13) 면역형광분석 (Immunofluorescence; IF)
24 시간 동안 카우다틴 (100uM) 처리 후, MDA-MB-231 세포를 3.7% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 0.5 % Triton X-100으로 15분 동안 permeabilized 시키고, 3% 소혈청 알부민 (BSA)으로 60분 동안 블록킹을 수행하였다. 이후 토끼 anti-GR mAb (# 12041, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 및 마우스 anti-YAP mAb (sc-101199, Santa Cruz Biotechnology, 댈러스, 텍사스, 미국)로 염색하였고, 이후 anti-토끼 Alexa 488-접합 이차 항체 (A32731) 및 anti-마우스 Alexa 555-접합 이차 항체 (A32727) (ThermoFisher, Waltham, MA, 미국)로 염색하였다. 마지막으로 암세포의 핵을 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 염색하고, GR 및 YAP는 형광 현미경 (Lionheart, Biotek, VT, USA)으로 시각화하였다.
14) siRNA 처리
MDA-MB-231 세포에 human GR- 및 YAP-특이적 siRNA (Bioneer, Daejeon, 한국)를 처리하여 mammosphere 형성에 대한 GR 및 YAP 단백질의 영향을 분석하였다. siRNA의 처리는 암 세포주에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 제조사의 지침에 따라 처리하였고, GR 및 YAP 단백질의 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.
15) 이종이식 (Xenograft Transplantation)
누드 마우스 실험은 4주된 암컷 누드 마우스를 OrientBio (대한민국 서울)로부터 수득하여 사용하였다. 상기 마우스는 각 독립된 케이스에서 일주일 동안 음식과 물을 섭취하도록 하면서 사육하였다. 14마리의 암컷 누드 마우스에MDA-MB-231 세포 (2x106 개의 세포/마우스)를 주입시키고, 음성 대조군과 카우다틴 화합물 처리군 (10mg/kg) 으로 나눴다. 이후 1달 동안 각 마우스 군에서의 종양부피를 계산식 [(width2 X length)/2]으로 측정하였다. 동물실험은 제주 대학교 동물병원 동물관리위원회 (IACUC)의 승인된 지침사항에 따라 수행하였다.
16) 통계처리
모든 데이터는 GraphPad Prism 7.0 소프트웨어 (GraphPad Prism, Inc., San Diego, CA, 미국)를 이용하여 분석하였다. 세 번의 독립적인 실험의 모든 데이터는 평균±표준편차 (SD)로 표시하였다. 데이터는 일원 분산분석을 사용하여 분석하였다. 0.05 미만의 p-value 값은 유의미한 값으로 간주하였다.
<실시예 1>
이엽우피소로부터 카우다틴 화합물의 분리 및 동정
<1-1> 이엽우피소로부터 카우다틴 화합물의 분리
이엽우피소 (C. auriculatum)를 분쇄한 후, 메탄올 추출을 수행하였는데, 분쇄한 이엽우피소 1kg에 메탄올 7.5L를 첨가하여 메탄올 추출물을 수득한 다음, 이를 농축하고 물을 첨가하여 혼합한 다음, 메탄올을 증발시켰다. 메탄올이 증발된 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 에틸아세테이트 분획물을 수득한 다음, 이를 농축하고 농축액을 실리카 겔 컬럼 (3x30 cm)에 로딩한 다음, 용출용매 (클로로포름:메탄올, 20:1 혼합용매)로 분획화하였다. 상기 과정으로 수득한 총 5개 분획물에 대해 mammosphere 형성 여부를 분석하였으며, 2번째 분획물이 mammosphere 형성 억제 활성이 있는 것으로 나타났다 (도 1 참조). 이후 2번째 분획물을 역상 C18 오픈 컬럼 (5x10 cm)에 로딩하여 4개의 분획물을 얻었으며, 이들 분획물에 대한 mammosphere 형성 여부를 분석하였다 (도 2 참조). 그 결과, 30~50%의 분획물에서 mammospher의 형성이 억제되는 것으로 나타났고, 30~50%의 분획물을 다시 Sephadex LH-20 컬럼 (2.5x30 cm)에 로딩하여 3개의 분획물을 수득하였다(도 3 참조). 3개의 분획물 중에서 1번째 분획물이 mammospher의 형성 활성이 있는 것으로 나타났다. 상기 1번째 분획물을 다시 TLC (glass plate; 20x20, layer thickness; 210-270um)에 로딩하고 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매 (20:1)로 TLC 유리 챔버에서 2시간 동안 현상화시켰다. 이후 플레이트를 제거하고 건조한 후, UV 방사선 (UV254 nm 및 UV365 nm)을 조사하여 형광으로 가시화시켰다. 각각의 밴드를 실리카겔 플레이트로부터 분리하고 메탄올로 용리시켰다. 각 분획물은 mammosphere 형성 여부를 분석하였다 (도 4 참조). 3번째 분획물을 Shimadzu HPLC 20A 기기 (Shimadzu, Tokyo, Japan)에 로딩하고 ODS 10x250 mm C18 컬럼(유속, 2 mL/분) 상에서 분리하였으며. 이때 상기 컬럼에 로딩하기 위한 시료는 0.2m 주사기 필터로 여과시켜 준비하였고, 500 uL를 주입하였다. 이동상 용매로 물 (용매 A)과 아세토니트릴 (용매 B)를 사용하였고, 용출은 아세토니트릴 용매가 초기에 20%로 시작하여 20 분에는 80%가 되도록 하였고, 최종 30 분에는 100%가 되도록 하였다. 그 결과, 유효성분이 포함된 분획물은 머무름 시간은 35 분에서 검출되었다 (도 5 참조).
<1-2> 카우다틴 화합물의 구조분석
상기에서 최종적으로 분리된 분획물에 함유된 화합물의 규명을 위해, QTRAP-3200 기기 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용한 ESI (Electrospray ionization) 질량분석으로 수행하였다. NMR 스펙트라는 JEOL JNM-ECA 600 퓨리에 변환-핵자기 공명 스팩트럼 (FT-NMR)에서 수득하였는데, 1HNMR는 600MHz에서, 13C NMR는 150MHz에서 CD3OD 하에서 분석하였다. 분획물에 함유된 화합물의 분자구조는 질량분석법 및 NMR 분석으로 결정하였다. 분자량은 ESI 질량분석에 의해 포지티브 모드에서 m/z 513.0 [M+Na]+ 네거티브 모드에서 m/z 489.0 [M-H]- 이온 피크로 나타나 490Da으로 확인되었다. CDCl3에서의 1HNMR 스펙트럼은 δ5.46 및 5.31에서 2개의 올레핀계 메틴 양성자가 확인되었고, δ4.50 및 3.53에서 2개의 산화된 메틴 양성자가, δ1.05-2.81에서 2개의 메틴 및 7개의 메틸렌 양성자가, δ2.12, 2.07, 1.36, 1.08, 1.01 및 1.01에서 6개의 메틸 양성자 신호가 확인되었다. 13CNMR 스펙트럼에서는 28개의 탄소 피크가 검출되었는데, δ208.8 및 165.8에서 두 개의 카르보닐 탄소가 포함되어 있고, δ166.7 및 140.4에서 2개의 sp2 4차 탄소; δ117.6 및 112.8에서 2개의 sp2 메틴 탄소; δ91.4, 88.0 및 74.1에서 3개의 산화된 4차 탄소; δ71.4 및 70.6에서 두 개의 산화된 메틴 탄소; δ57.7 및 37.0에서 두 개의 4차 탄소; δ43.6 및 38.0에서 두 개의 메틴 탄소; δ38.6, 38.5, 34.1, 33.0, 31.7, 28.7 및 24.1에서 7개의 메틸렌 탄소; 및 δ27.0, 20.8, 20.7, 18.4, 16.4 및 9.3에서 6개의 메틸 탄소가 검출되었다(도 6 참조). 모든 양성자 베어링 탄소는 HMQC (heteronuclear multiple quantum coherence) 스펙트럼에 의해 어사인 되었고, 1H-1H COZY 스펙트럼은 6개의 부분 구조를 보였으며, 추가 구조규명은 이종 핵 다중결합 상관관계 (HMBC) 스펙트럼으로 수행하였는데, δ1.08의 메틸 양성자에서 δ140.4, 43.6, 38.6 및 37.0의 탄소까지; δ1.36의 메틸 양성자에서 δ91.4, 88.0, 71.4 및 57.7의 탄소까지; δ2.07 양성자에서 δ166.7, 112.8 및 38.0 탄소까지; δ 5.31의 메틴 양성자에서 δ 74.1 및 37.0의 탄소까지; δ5.46 및 4.50 메틴 양성자에서 δ165.8 에스테르 카보닐 탄소까지; 및 δ2.81/1.77의 메틸렌 양성자와 δ 2.12의 메틸 양성자에서 δ208.8의 케톤 카보닐 탄소까지 장거리 (long range) 상관관계를 보였다 (도 6 참조). 이러한 구조 분석을 통해 본 발명의 분획물에 포함된 유효성분의 화합물은 카우다틴 (caudatin)인 것으로 확인되었다.
상기 본 발명의 방법에 있어서, 카우다틴을 함유한 분획물의 추출공정 및 분리된 카우다틴 화합물의 구조식은 도 7a 및 도 7c에 나타내었다.
<실시예 2>
이엽우피소 추출물의 유방암 줄기세포 (BCSC) 억제능 분석
상기 실시예 1에서 수득한 이엽우피소의 용매 추출물 및 분획물에 대하여 mammosphere 형성 억제능 분석을 수행하였는데, 그 결과, 이엽우피소의 메탄올 추출물이 MDA-MB-231 세포주를 대상으로 mammosphere의 형성을 억제하는 활성이 있는 것으로 확인되었고 (도 7b), 메탄올 추출물의 에틸아세테이트의 분획물로부터 활성성분을 분리한 결과, 도 7c에 기재된 화학구조식을 갖는 카우다틴 화합물을 동정하였다.
<실시예 3>
이엽우피소 추출물에서 분리한 카우다틴 화합물의 암세포 증식억제 및 맘모스페어 형성 억제능 분석
상기 실시예 1에서 이엽우피소 추출물로부터 분리 및 동정한 카우다틴 화합물이 항암 활성이 있는지를 확인하기 위해, 암 세포주에 대한 증식 억제능 및 mammosphere 형성 억제능 여부를 분석하였다. 이를 위해 MDA-MB-231 유방암 세포주에 카우다틴 화합물을 농도별로 처리한 후, 암세포 증식 억제 여부를 분석하였는데, 그 결과, 카우다틴 화합물 처리 농도 의존적으로 유방암 세포주의 성장이 억제되는 것으로 나타났다 (도 8a). 또한 MDA-MB-231 및MCF-7로부터 형성된 mammosphere에 카우다틴 화합물을 농도별 처리한 결과, 처리 농도 의존적으로 mammosphere의 형성이 억제되는 것으로 나타났으며, 2차의 mammosphere 형성도 억제하는 것으로 나타났다. 또한 카우다틴 화합물은 mammosphere의 수 및 크기를 모두 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다 (도 8b). 이러한 본 발명의 카우다틴 화합물의 활성은 mammosphere에 대한 억제제로 알려진 ciclesonide을 처리한 군과 거의 유사한 활성을 나타내었다 (도 8b).
나아가 본 발명의 카우다틴 화합물은 암세포의 세포사멸 (아폽토시스)을 유도하는 것으로 나타났는데, Annexin V-FITC 및 PI 염색 수행 결과, 카우다틴 화합물이 처리된 MDA-MB-231 세포에서는 초기 세포사멸된 세포가 증가하는 것으로 나타났고 (도 8c), Hoechst 염색을 통해 세포사멸체의 형성이 유도되는 것으로 나타났다 (도 8d). 또한 카우다틴 화합물은 유방암 세포의 콜로니 형성, 이동 및 침윤을 모두 억제할 수 있는 것으로 나타났다 (도 8e~g).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 카우다틴 화합물이 암 세포의 성장 및 mammosphere 형성을 억제할 뿐만 아니라 콜로니 형성, 암세포 이동 및 침윤도 모두 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4>
카우다틴 화합물의 이종이식 종양 성장의 억제활성 분석
카우다틴 화합물이 in vitro에서 유의미한 항암 효과를 보였기 때문에 in vivo 연구를 통해 상기 화합물의 종양 성장에 대한 영향을 더 면밀히 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 마우스 동물을 대상으로 대조군과 카우다틴을 처리한 마우스 군 (실험군)에 대하여 각 마우스의 체중, 종양의 부피와 무게를 각각 측정하였다.
그 결과, 대조군과 실험군 간의 체중의 차이는 거의 없는 것으로 나타났다 (도 9a). 한편, 종양의 부피 (도 9b) 및 무게 (도 9c)는 키우다틴 화합물을 처리한 군에서 대조군에 비해 유의하게 감소되어 있는 것으로 나타났다.
이를 통해 본 발명의 카우다틴 화합물이 종양의 성장을 효과적으로 감소시키는 활성이 있음을 동물실험을 통해 다시 한번 확인할 수 있었다.
<실시예 5>
카우다틴 화합물의 CD44 + /CD24 - 및 ALDH 발현 암세포의 집단 억제능 분석
유방암 줄기세포의 집단은 CD44+/CD24- 표현형과 ALDH1을 발현하여 악성종양의 특성을 유지한다. 이에 본 발명자들은 카우다틴 화합물이 이러한 악성종양의 특성을 약화시킬 수 있는지 확인하기 위해, CD44+/CD24- 표현형을 갖는 유방암 세포주에 카우다틴 화합물을 처리한 후, CD44+/CD24- 표현형 세포수를 측정하였다.
그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, CD44+/CD24- 표현형을 갖는 유방암 세포수가 카우다틴 화합물 처리에 의해 75.8%에서 68.6%로 감소한 것으로 나타났다. 또한, ALDH을 발현하는 세포수는 14.4%에서 1.4%로 현저하게 감소한 것으로 나타났다 (도 10b).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 카우다틴 화합물이 유방암 줄기세포의 마커 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었고 궁극적으로 유방암 줄기세포에 대한 억제 활성을 통해 항암 활성을 가질 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 6>
유방암 줄기세포에서 카우다틴 화합물의 유비퀴틴 의존적 GR 분해를 통한 GR 신호 차단능 분석
유방암 줄기세포 (BCSC)에 대한 카우다틴 화합물의 활성 메커니즘을 분석하기 위하여, MDA-MB-231 mammospheres에서 GR (glucocorticoid receptor) 수준을 측정하였다.
그 결과, 카우다틴 화합물 처리에 의해 유의미하게 총 GR의 단백질 수준이 감소한 것으로 나타났고 (도 11a), 이를 보상하기 위한 작용으로 카우다틴 화합물 처리군에서의 GR 유전자의 전사체의 수준은 증가한 것으로 나타났다 (도 11b).
또한 mammosphere 샘플을 대상으로 카우다틴 화합물을 처리한 후, GR에 대한 면역침강 및 웨스턴 블럿을 anti-ubiquitin 항체를 이용하여 수행하였는데, 그 결과, 유비퀴틴화된 GR의 수준이 증가한 것으로 나타났다 (도 11c). 프로테아좀 억제제인 MG132를 처리한 군의 경우, 카우다틴에 의한 GR의 분해가 억제되는 것으로 나타나 이를 통해 카우다틴이 Ub- 관련 GR의 분해를 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 즉, 카우다틴으로 유도된 GR의 하향조절은 MG132에 의해 상당히 억제되는 것으로 나타났다 (도 11d).
나아가 mammospheres 에서 GR 단백질의 세포질 및 핵에서의 발현수준 (도 11e) 및 MDA-MB-231 세포에서 GR의 발현수준 (도 11f)을 면역형광분석을 통해 분석하였는데, 그 결과, 카우다틴 처리에 의해 세포질 및 핵에서 GR의 발현수준이 모두 감소하는 것으로 나타났다.
유방암 줄기세포 (BCSC)에서 GR 단백질의 역할을 확인하기 위해, GR- 특이적 siRNA에 의한 mammosphere 형성을 분석하였는데, GR-특이적 siRNA를 MDA-MB-231 세포에 처리한 결과, 종양구 (tumorsphere)의 형성능이 50% 감소한 것으로 나타났다 (도 11g). GR에 대한 길항제인 RU486을 처리한 경우에도 유방암 세포에서 mammosphere 형성이 억제되는 것으로 나타났다 (도 11h).
이러한 결과들로 GR의 신호전달은 mammosphere 형성을 조절할 수 있다는 것을 알 수 있었고, 카우다틴이 BCSC에서 Ub 의존적 분해를 통해 GR 신호전달의 이상을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 7>
카우다틴 화합물의 GR-YAP 신호전달 경로조절
카우다틴 화합물이 GR-YAP 신호전달 경로를 억제하여 BCSC의 형성을 억제할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
그 결과, 카우다틴의 처리에 의해 YAP의 총 단백질 수준 (도 12a) 및 YAP의 전사체 수준 (도 12b)에는 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 한편, mammospheres의 핵 추출물에서의 단백질 수준 (도 12d) 및 MDA-MB-231 세포에서 YAP의 면역형광 (IF) 수준 (도 12c)은 카우다틴 처리에 의해 유의미하게 감소되는 것으로 나타났다.
또한 GR-특이적 siRNA 처리로 GR이 넉다운된 MDA-MB-231 세포에서는 YAP 단백질 발현이 감소된 것으로 나타났고 (도 12e), YAP-특이적 siRNA가 처리된 MDA-MB-231 세포는 종양구의 형성능이 50% 감소된 것으로 나타났다 (도 12f). YAP-TEAD 상호작용의 억제제인 Verteporfin은 유방암 세포에서 mammosphere 형성을 현저하게 억제하는 것으로 나타났다 (도 12g).
YAP 타겟 유전자들 (CTGF 및 CYR61)을 mammosphere에서 분석하였는데, CTGF 및 CYR61 유전자의 전사체 수준이 카우다틴, GR-특이적 siRNA 또는 Verteporfin 처리에 의해 감소되는 것으로 나타났다 (도 12h~j). 이러한 결과는 카우다틴이 유방암 줄기세포 (BCSC) 형성에 필요한 GR-YAP 신호전달 경로를 조절하고 있음을 의미한다.
<실시예 8>
카우다틴 화합물의 암 줄기세포 (CSC) 마커 단백질 발현수준 및 맘모스페어 성장에 대한 조절능 분석
카우다틴이 암 줄기세포 (CSC)에 대한 마커 유전자의 발현을 조절할 수 있는지 확인하기 위해 웨스턴 블럿을 통해 마커 유전자들의 단백질 발현수준을 분석하였다.
그 결과, 카우다틴 처리 시, c-Myc, Oct4, Sox2 및 CD44를 포함한 줄기세포 마커 단백질의 발현이 MDA-MB-231 세포로부터 유래된 mammospheres에서 감소되는 것으로 나타났다 (도 13a).
다음으로, 카우다틴이 mammospheres를 억제하는지 확인하기 위해, mammospheres에 카우다틴을 처리하고 mammospheres 유래의 유방암 세포수를 정량분석하였다. 그 결과, 카우다틴 처리에 의해 암세포의 사멸이 증가한 것으로 나타났고 mammospheres에서 암 세포수가 감소한 것으로 나타났다 (도 13b).
이상의 결과들을 통해 본 발명자들은 카우다틴 화합물이 GR/YAP의 신호전달경로 억제를 통해 암 줄기세포의 성장을 억제할 수 있음을 알 수 있었다 (도 13c).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (19)

  1. 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 메탄올 추출물로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포 성장 억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 카우다틴 화합물은,
    암 줄기세포의 성장억제;
    암 세포의 증식억제;
    CD44+/CD24- 및 탈수소효소 (ALDH)를 발현하는 암 세포의 성장억제;
    맘모스페어 (mammosphere)의 형성 억제 또는 맘모스페어의 성장억제; 또는
    유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor) 분해 활성 및 GR (glucocorticoid receptor) 신호경로 차단; 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계 (central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체선종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포 성장 억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 에틸아세테이트 분획물에는 카우다틴 (Caudatin) 화합물을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포의 성장억제용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계 (central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체선종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포의 성장억제용 조성물.
  10. 카우다틴 (Caudatin) 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소 (Cynanchum auriculatum)의 메탄올 추출물로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 카우다틴 화합물은 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대하여 물을 첨가하고 혼합한 다음, 메탄올을 증발시키고 남은 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 카우다틴 화합물은,
    암 줄기세포의 성장억제;
    암 세포의 증식억제;
    CD44+/CD24- 및 탈수소효소 (ALDH)를 발현하는 암 세포의 성장억제;
    맘모스페어 (mammosphere)의 형성 억제 또는 맘모스페어의 성장억제; 또는
    유비퀴틴 의존적 GR (glucocorticoid receptor) 분해 활성 및 GR (glucocorticoid receptor) 신호경로 차단; 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계 (central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체선종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  15. 이엽우피소의 메탄올 추출물에 대한 물 분획물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 에틸아세테이트 분획물에는 카우다틴 (Caudatin) 화합물을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포 성장억제를 통한 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  17. 암 줄기세포에 카우다틴 (Caudatin) 화합물을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법.
  18. 제1항 내지 제5항 중 선택되는 어느 한 항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법.
  19. 제6항 또는 제7항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법.
PCT/KR2021/013456 2020-11-16 2021-09-30 카우다틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 WO2022102962A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0152598 2020-11-16
KR1020200152598A KR102467971B1 (ko) 2020-11-16 2020-11-16 카우다틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022102962A1 true WO2022102962A1 (ko) 2022-05-19

Family

ID=81601387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/013456 WO2022102962A1 (ko) 2020-11-16 2021-09-30 카우다틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (2) KR102467971B1 (ko)
WO (1) WO2022102962A1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101011404A (zh) * 2007-02-07 2007-08-08 江苏省中医药研究院 告达庭－3－O－β－D－磁麻糖苷作为***药物的用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170076487A (ko) 2015-12-24 2017-07-04 주식회사 엘지생활건강 카우다틴을 포함하는 피부상태 개선용 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101011404A (zh) * 2007-02-07 2007-08-08 江苏省中医药研究院 告达庭－3－O－β－D－磁麻糖苷作为***药物的用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DENG, HONG-YUAN: " Purification and structure analysis of mammosphere-forming inhibitors derived from Cynanchum auriculatum.", MASTER’S THESIS, JEJU NATIONAL UNIVERSITY., 1 February 2017 (2017-02-01), pages 1 - 62, XP055929834, [retrieved on 20220610] *
LI XIAOFENG, ZHANG XIAOTING, LIU XIZHI, TAN ZHIWEN, YANG CELI, DING XIAOFENG, HU XIANG, ZHOU JIANLIN, XIANG SHUANGLIN, ZHOU CHANG,: "Caudatin induces cell apoptosis in gastric cancer cells through modulation of Wnt/β-catenin signaling", ONCOLOGY REPORTS, vol. 30, 1 January 2013 (2013-01-01), pages 677 - 684, XP055929856 *
PENG, Y.-R. ; LI, Y.-B. ; LIU, X.-D. ; ZHANG, J.-F. ; DUAN, J.-A.: "Antitumor activity of C-21 steroidal glycosides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight", PHYTOMEDICINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 15, no. 11, 1 November 2008 (2008-11-01), AMSTERDAM, NL , pages 1016 - 1020, XP025560101, ISSN: 0944-7113, DOI: 10.1016/j.phymed.2008.02.021 *
XING ZHEN, HACK SUN CHOI, JI‐HYANG KIM, SU‐LIM KIM, REN LIU , YU‐CHAN KO, BONG‐SIK YUN , DONG‐SUN LEE: "Caudatin isolated from Cynanchum auriculatum inhibits breast cancer stem cell formation via a GR/YAP signaling.", BIOMOLECULES, vol. 10, no. 925, 18 June 2020 (2020-06-18), pages 1 - 22, XP055929864, DOI: 10.3390/biom10060925 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220066499A (ko) 2022-05-24
KR102467971B1 (ko) 2022-11-16
KR20220124128A (ko) 2022-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018182329A1 (ko) S1pr4를 타겟으로 하는 비알코올성 지방간염 예방 또는 치료용 조성물
WO2013176471A1 (ko) 곰보배추의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, stat3 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
AU2005328327A1 (en) Novel lipoxygenase inhibitors
WO2018194309A1 (ko) 인디루빈 유도체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물
KR20100073528A (ko) 디에콜 화합물을 함유하는 퇴행성 신경질환 치료 및 예방용조성물
WO2024039164A1 (ko) 스테포게닌을 유효성분으로 포함하는 암 예방, 개선, 또는 치료용 조성물
KR20130106600A (ko) 헤디치움 코로나리움 유래 랍단 디터펜 화합물 및 이의 용도
WO2013054998A1 (ko) 신규한 칼콘 유도체 및 이를 유효성분으로 하는 항암제 조성물
WO2022102962A1 (ko) 카우다틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물
WO2017188690A1 (ko) 페닐아세트알데히드를 포함하는, 유방암 줄기세포 성장 억제용 조성물
WO2020166779A1 (ko) 하이드란제놀을 유효성분으로 하는 지방형성 억제 및 체지방 감소용 조성물
KR102334943B1 (ko) 신규 이소퀴놀린 유도체, 이의 제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는 오토파지 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2014042392A1 (ko) 메트포민을 이용한 루프스를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20140045894A (ko) 개머루덩굴 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 ｉｌ-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
AU2019381050B2 (en) Anticancer composition
KR101716560B1 (ko) 페녹시아크릴 유도체 및 이의 용도
WO2016171291A1 (ko) 지방줄기세포의 증식 억제 및 지방 조직의 갈색화 촉진용 조성물
WO2015111971A1 (ko) Gpr119 리간드를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US9458086B1 (en) Compositions and methods for adipocyte modulation
KR101712184B1 (ko) Nrf2 활성화 효능의 세스퀴터핀 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학조성물
WO2023224163A1 (ko) 제주쑥 추출물을 함유하는 항암용 조성물
JP2022527329A (ja) 神経疾患を処置するために有用なレトロマー安定化剤としてのアミノグアニジンヒドラゾン
EP3750904A1 (en) Therapeutic drug for neurodegenerative disease and application thereof
WO2011074881A2 (ko) 알레르기 질환 감수성 유전자 발현 억제 물질
WO2023113129A1 (ko) Surf4 억제제를 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21892132

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21892132

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1