WO2022092169A1 - 骨形成組成物およびその用途 - Google Patents

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present
cells
differentiation
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真弓 岩竹
吉慶 住田
泉 朝比奈
真 佐竹
靖子 間
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国立大学法人 長崎大学
株式会社メガカリオン
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a bone-forming composition and its use.
  • tissue regeneration As a therapeutic agent for regenerative medicine, attempts are being made to develop cells that promote tissue regeneration such as mesenchymal stem cells as cell preparations. Further, it is considered that the cells promoting tissue regeneration promote tissue regeneration by releasing proteins having physiological activities such as growth factors.
  • platelet-rich plasma In regenerative medicine in the dental field, platelet-rich plasma is used in bone growth (reconstruction) treatment and the like. However, since platelet-rich plasma is prepared by separation and centrifugal concentration from isolated human blood, the number of platelets is not unified and its efficacy is unknown.
  • an object of the present invention is to provide a composition having cell-derived bone-forming activity.
  • the bone-forming composition of the present invention includes a processed product of megakaryocytes or a culture thereof.
  • the bone formation kit of the present invention (hereinafter, also referred to as "kit”) includes a bone formation composition and a scaffold material for bone formation, and the bone formation composition is the bone formation composition of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the enrichment system in Example 1.
  • 2A and 2B are graphs showing the proliferation activity of cells in Example 1, where FIG. 2A shows relative values of proliferation activity and FIG. 2B shows doubling time.
  • FIG. 3 is a photograph showing a stained image of alkaline phosphatase in Example 1.
  • FIG. 4 is a photograph showing a stained image of calcium in Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the calcium ion concentration in the medium in Example 1.
  • 6A and 6B are graphs showing the proliferation activity of cells in Example 2, where FIG. 6A shows a relative value of proliferation activity and FIG. 6B shows a doubling time.
  • FIG. 7 is a photograph showing a stained image of calcium in Example 2.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the enrichment system in Example 1.
  • 2A and 2B are graphs showing the proliferation activity of cells in Example 1, where FIG. 2A shows relative values of proliferation activity and FIG. 2B shows doubling time.
  • FIG. 8 is a photograph showing a stained image of calcium in Example 2.
  • FIG. 9 is a graph showing the calcium ion concentration in the medium in Example 2.
  • FIG. 10 is a graph showing the number of cells in Example 3.
  • FIG. 11 is a graph showing the ALP activity in Example 3.
  • FIG. 12 is a graph showing the number of cells in Example 3.
  • FIG. 13 is a graph showing the ALP activity in Example 3.
  • FIG. 14 is a photograph showing bone formation in Example 4.
  • FIG. 15 is a graph showing the amount of bone formation or the amount of bone growth in Example 4.
  • FIG. 16 is a schematic diagram and a graph showing the outline of the experiment in Example 5 and the expression level of the cytokine gene.
  • FIG. 17 is a schematic diagram and a graph showing the outline of the experiment in Example 5 and the expression level of the cytokine gene.
  • FIG. 18 is a photograph showing bone formation at 4 weeks after transplantation in Example 6.
  • FIG. 19 is a graph showing bone mass, bone mineral content, ratio of defective bone mass to new bone mass, and bone density at 4 weeks after transplantation in Example 6.
  • the bone-forming composition of the present invention comprises a processed product of megakaryocytes or a culture thereof, as described above.
  • the composition of the present invention is characterized by containing a processed product of megakaryocytes or a culture thereof, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • a composition having a physiological activity derived from cells can be provided.
  • bone formation can be induced, for example, by promoting differentiation into osteoblasts.
  • bone formation may be an increase in existing bone, that is, “bone augmentation” (bone formation), or a new bone formation, that is, “bone renewal”. It may be used to mean that the lost (defective) bone or a part thereof is recovered, that is, “bone regeneration”. Therefore, the bone formation composition of the present invention can also be referred to as a bone augmentation (bone formation) composition, a bone renewal composition, and / or a bone regeneration composition.
  • the composition of the present invention is presumed to induce bone formation by promoting, accelerating (promoting induction), enhancing, enhancing, and / or enhancing the differentiation of osteoblasts. Therefore, the composition of the present invention can also be said to be a composition that promotes, accelerates (promotes induction), enhances, enhances, and / or enhances the differentiation of osteoblasts, and also induces, promotes, and accelerates bone formation. It can also be referred to as a (promoting induction), enhancing, enhancing, and / or enhancing composition.
  • megakaryocyte is the largest cell present in the bone marrow in the living body, and means a cell that releases platelets and a cell having an equivalent function.
  • the cell having the same function means a cell having an ability to produce platelets.
  • the megakaryocyte may be an immature megakaryocyte or a proliferating megakaryocyte, that is, a megakaryocyte before polynuclearization (multipolyplasia), or a megakaryocyte after polynuclearization (multinuclearization megakaryocyte). But it may be.
  • the megakaryocyte may be, for example, a promegakaryoblast, a megakaryoblast, a promegakaryocyte, or a mature megakaryocyte.
  • the number of sets of chromosomes contained in the megakaryocytes after polynuclearization may exceed 2 sets, and as a specific example, 16 to 32 sets.
  • the origin of the megakaryocytes is not particularly limited, and examples thereof include humans and non-human animals.
  • Examples of the non-human animal include primates such as monkeys, gorillas, chimpanzees and marmosets, mice, rats, dogs, cats, rabbits, sheep, horses and guinea pigs.
  • the origin of the megakaryocytes may be, for example, the same as or different from the administration target of the composition of the present invention.
  • the megakaryocytes can be identified by a cell surface marker.
  • the cell surface markers include CD41a, CD42a and CD42b. That is, the megakaryocytes are cells positive for CD41a, CD42a and CD42b.
  • the cell surface marker is at least one selected from the group consisting of, for example, CD9, CD61, CD62p, CD42c, CD42d, CD49f, CD51, CD110, CD123, CD131, and CD203c. There may be.
  • the megakaryocyte may be a megakaryocyte isolated from a living body, or may be a megakaryocyte derived from a cell undifferentiated from a megakaryocyte such as a pluripotent cell (hereinafter, also referred to as “progenitor cell”).
  • the "cell undifferentiated from megakaryocytes” means a cell capable of differentiating into the megakaryocyte.
  • the megakaryocyte When the megakaryocyte is a megakaryocyte isolated from a living body, the megakaryocyte can be isolated from the bone marrow because it is present in the bone marrow, for example. In this case, the megakaryocyte may contain other cells derived from a living body.
  • the megakaryocyte When the megakaryocyte is a megakaryocyte derived from a progenitor cell, the megakaryocyte can be induced in vitro as described later.
  • the megakaryocytes may contain the progenitor cells.
  • the progenitor cells include hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells, CD34-positive cells, megakaryocyte-erythroid progenitor (MEP), megakaryocyte progenitor cells and the like.
  • the precursor cells may be isolated from, for example, bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood, etc., ES cells (embryonic stem cells), artificial pluripotent stem cells (iPS cells), and the like. It may be derived from pluripotent cells such as nuclear transplanted ES cells (ntES cells), reproductive stem cells, somatic stem cells, and embryonic tumor cells.
  • the megakaryocyte is preferably an immortalized megakaryocyte.
  • the immortalized megakaryocytes have higher homogeneity in the cell differentiation stage than, for example, megakaryocytes induced by other methods of inducing megakaryocytes, and thus suppress the fluctuation of the component composition in the obtained processed product. can.
  • the immortalized megakaryocyte is, for example, a megakaryocyte induced by introducing an oncogene and a polycomb gene, or an oncogene, a polycomb gene, and an apoptosis-suppressing gene into the progenitor cell, as described later.
  • the "oncogene” means a gene capable of inducing canceration of cells in vivo, and for example, MYC family genes such as c-MYC, N-MYC, and L-MYC, SRC family genes, and RAS family genes. Examples thereof include protein kinase family genes such as RAF family genes, c-kit (CD117), PDGFR (platelet growth factor receptor), and Abl (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog).
  • the "polycomb gene” means a gene known to negatively regulate CDKN2a (cyclin-dependent kinase inhibition 2A, INK4a / ARF) and function to avoid cellular senescence (references 1 to 3 below).
  • the polycomb gene may be, for example, BMI1 (Polycomb complex protein BMI-1, polycomb group RING finger protein 4 (PCGF4), RING finger protein 51 (RNF51)), Mel18 (Polycomb group RING finger protein 2), Ring.
  • the "apoptosis-suppressing gene” means a gene having a function capable of suppressing cell apoptosis, for example, BCL2 (B-cell lymphoma 2), Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large), Survivin (Baculo viral). IAPRepeatContaining5), MCL1 (BCL2FamilyApoptosisRegulator), etc.
  • the immortalized megakaryocyte is preferably a megakaryocyte containing an exogenous BMI1 gene, a MYC gene, and a Bcl-xL gene.
  • the "foreign" means that it was introduced into the cell from the outside of the cell.
  • the exogenous gene may be present on the chromosome of the cell or in the nucleus or cytoplasm.
  • the exogenous gene can be detected, for example, by measuring the number of the gene.
  • the gene is a gene on an autosomal chromosome, one gene is present on each autosomal chromosome, so that one cell has two genes. Therefore, in the absence of the exogenous gene, two of the genes are detected in one cell.
  • the exogenous gene when the exogenous gene is present, three or more of the genes are detected in one cell.
  • the exogenous gene can be detected by using, for example, PCR using a primer, a probe, or a combination thereof.
  • the detection of the exogenous gene may be carried out by the detection of the tag sequence or the detection of the selectable marker.
  • the exogenous gene can be detected, for example, by using an antibody or the like against a protein translated from the gene.
  • the culture of megakaryocytes is, for example, a culture produced by culturing the megakaryocytes.
  • the culture of the megakaryocytes can be carried out, for example, by culturing the megakaryocytes in the presence of a medium, as described later.
  • the culture of megakaryocytes is obtained by culturing the megakaryocytes, for example, it is a mixture containing the megakaryocytes and platelets produced from the megakaryocytes as cell components.
  • the cellular component means cells and platelets.
  • the megakaryocytes can be induced from cells that are less differentiated than the megakaryocytes. Therefore, when the megakaryocytes for producing the culture of the megakaryocytes include megakaryocytes derived from cells undifferentiated from the megakaryocytes, the culture of the megakaryocytes is undifferentiated from the megakaryocytes. Cells may be included.
  • the culture of the megakaryocytes may be the culture itself obtained by culturing the megakaryocytes, or may be a processed product of the culture.
  • Processing of the culture includes, for example, removal of a liquid fraction, extraction of a cellular component fraction, modification of the composition of cellular components including platelets, and the like.
  • Changes in the composition of the cellular components include, for example, removal of cells and / or platelets in the mixture, extraction of cells and / or platelets in the mixture, addition of cells and / or platelets to the mixture, and the like.
  • the "platelet” is one of the cellular components in blood and means a cellular component that is positive for CD41a and CD42b.
  • the platelets for example, do not have a cell nucleus and are smaller in size than the megakaryocytes. Therefore, the platelet and the megakaryocyte can be distinguished from each other by, for example, the presence or absence and / or size of a cell nucleus. It is known that the platelets play an important role in thrombus formation and hemostasis, and are also involved in the pathophysiology of tissue regeneration and inflammation after injury.
  • the treated product may be prepared from the megakaryocytes or may be prepared from a culture of the megakaryocytes.
  • the culture of the megakaryocyte may be processed.
  • the processed product may be, for example, a processed product of a cell fraction of the megakaryocyte or a culture thereof, or a processed product of a processed product obtained by processing the megakaryocyte or the culture thereof.
  • the treatment in the preparation of the treated product is not particularly limited, and for example, a treatment for changing the density of cell components such as a concentration treatment; a drying treatment, a freezing treatment, a freeze-drying treatment, a solvent treatment, a surfactant treatment, an enzyme treatment, etc.
  • Extraction treatment for extracting cell components such as protein fraction extraction treatment; crushing treatment such as grinding treatment and crushing treatment; and the like can be mentioned.
  • the treated product include, for example, concentrates, dried products, frozen products, freeze-dried products, solvent-treated products, surfactant-treated products, enzyme-treated products, and protein fractions of the giant nuclei or culture thereof.
  • Extracts such as sonicated products; Grinded products such as ground products and crushed products; Concentrates, dried products, frozen products, freeze-dried products, solvents of cell fractions of the giant nuclei or their cultures. Examples thereof include treated products, solvent-treated products, enzyme-treated products, protein fractions, sonicated products extracts; crushed products, crushed products such as crushed products; and the like.
  • the processed product may be composed of one type of processed product, or may be a mixture of two or more types of processed products. The mixture is not particularly limited and may be a mixture mixed in any combination and ratio of processed products.
  • the treated product comprises, for example, one or more growth factors and at least one of a growth factor receptor.
  • the treated product has physiological activities such as cell proliferation promoting activity and osteoblast differentiation promoting activity.
  • the treated product can be produced, for example, by treating the megakaryocytes or a culture thereof, as described above. Therefore, in the present invention, the processed product can be defined by using, for example, the following conditions (1) to (3).
  • the processed product may be specified by any of the following conditions (1) to (3), may be specified by a plurality of conditions, or may be specified by all conditions. As a specific example, the processed product can be defined by, for example, a combination of conditions.
  • condition (1) Content of growth factors and / or growth factor receptors; (2) Biological activity of the treated product; (3) Manufacturing method of processed product (combination of conditions) Conditions (1), (2), or (3); Conditions (1) and (2), conditions (1) and (3), or conditions (2) and (3); Conditions (1), (2), and (3)
  • Condition (1) is a condition relating to the content of the growth factor and / or the growth factor receptor as described above.
  • the condition (1) may define the content of the growth factor or the content of the growth factor receptor, or may define the content of the growth factor and the content of the growth factor receptor. good.
  • the growth factor used in the regulation of the above condition (1) may be one kind or two or more kinds.
  • the growth factor receptor used in the regulation of the above condition (1) may be one kind or two or more kinds.
  • the growth factors are basic fibroblast growth factor (bFGF), insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1), and insulin-like growth factor-binding protein-2 (IGFBP-2).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • IGFBP-1 insulin-like growth factor-binding protein-1
  • IGFBP-2 insulin-like growth factor-binding protein-2
  • IGFBP-3 Insulin-like growth factor-binding protein-3
  • IGFBP-6 insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth
  • the growth factor receptor includes a stem cell factor receptor (SCFR), an epidermal growth factor receptor (EGFR), a vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2), and the like.
  • SCFR stem cell factor receptor
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor 2
  • the content may be, for example, the weight of each growth factor and each growth factor receptor in the treated product, or the weight of each growth factor and each growth factor receptor relative to the weight of the total protein of the treated product (per total protein). Content), but the latter is preferred.
  • the weight of the total protein can be determined, for example, by the BCA protein quantification method.
  • the BCA protein quantification method is a protein quantification method using a coordinate bond between a monovalent copper ion and two molecules of bicinchoninic acid.
  • the sample to be subjected to the BCA protein quantification method preferably does not contain, for example, a reducing agent and / or a copper ion chelating agent.
  • the BCA protein quantification method can be carried out according to Reference 4 below, and for example, a commercially available kit or the like may be used.
  • As the kit for the BCA protein quantification method Pierce TM BCA Protein Assay Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and the like can be used.
  • Reference 4 Shunji Hase et al., "Protein Science Experimental Method Based on Easy Principles 1 Extraction, Purification and Synthesis to Create Proteins", Chemistry Doujin, December 13, 2008
  • the total protein concentration in the treated product can be appropriately set, for example, depending on the number of cells to be treated and the volume of the solvent in the treated product.
  • the total protein concentration in the treated product is, for example, the total protein concentration in the treated product by increasing the number of cells to be subjected to the treatment, reducing the volume of the solvent in the treated product, or extracting from the megakaryocytes. Can be relatively high.
  • the total protein concentration in the treated product is, for example, by reducing the number of cells to be subjected to the treatment, increasing the volume of the solvent in the treated product, or extracting from the culture of megakaryocytes.
  • the total protein concentration in is relatively low.
  • the total protein concentration in the treated product is, for example, 0.1 to 200 mg / ml.
  • the solvent is, for example, an aqueous solvent described later.
  • the weights of the growth factor and the growth factor receptor can be determined, for example, by the sandwich ELISA method.
  • the sandwich ELISA method can be carried out according to Reference 5 below, and for example, a commercially available kit or the like may be used.
  • As the sandwich ELISA kit Quantibody (registered trademark) Human Growth Factor Array 1 (manufactured by RayBiotech) and the like can be used.
  • Reference 5 Edited by Biochemical Measurement Study Group, "Immunometry from Basic to Advanced", Kodansha, December 20, 2014
  • Examples of the content of the growth factor and the content of the growth factor receptor in the treated product include the following examples.
  • the treated product contains, for example, 2000 to 20000 pg, 5000 to 20000 pg, or 10000 to 20000 pg of bFGF per 1 mg of total protein.
  • the treated product exhibits cell proliferation promoting activity and osteoblast differentiation promoting activity, as will be described later.
  • the treated product comprises, for example, 0-200 pg, 0.01-200 pg, 0.01-100 pg, or 0.01-50 pg of IGFBP-1 per 1 mg of total protein. ..
  • the treated product comprises, for example, 8000-80000 pg, 10000-80000 pg, or 20000-80,000 pg of IGFBP-2 per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises, for example, 1-60 pg, 1-30 pg, or 1-20 pg PIGF per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises, for example, 20-800 pg, 20-600 pg, or 20-400 pg of VEGF per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises, for example, 1000-10000 pg, 1000-5000 pg, or 2000-5000 pg of GDF-15 per 1 mg of total protein.
  • the treated product contains, for example, 0 to 16 pg, 0.01 to 16 pg, 0.1 to 16 pg, or 1 to 16 pg of AR per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises, for example, 0-100 pg, 0.01-100 pg, 0.01-50 pg, or 0.01-30 pg of HGF per 1 mg of total protein.
  • the treated product contains, for example, 0 to 1000 pg and 0.01 to 1000 pg of BMP-7 per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises, for example, 200-2000 pg, 300-1500 pg, or 400-1000 pg of SCFR per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises, for example, 0-60 pg, 0.01-60 pg, 1-50 pg, 1-45 pg, or 10-40 pg per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises, for example, 20-400 pg, 50-350 pg, or 100-300 pg of VEGFR2 per 1 mg of total protein.
  • condition (1) may be defined by the content of one or more types of growth factors, or may be defined by the content of one or more types of growth factor receptors. However, these contents may be specified in any combination.
  • the condition (1) is, for example, at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 selected from the group consisting of the following conditions (A1) to (A9) and (B1) to (B3). , 8, 9, 10, 11 or 12 conditions.
  • the following combinations can be exemplified as the combination of the content of the growth factor and / or the content of the growth factor receptor.
  • (Combination of growth factor content and / or growth factor receptor content) One of the conditions of (A1) to (A9) and (B1) to (B3): (A1) bFGF content, (A2) IGFBP-1, (A3) IGFBP-2 content, (A4) PIGF content, (A6) VEGF content, (A6) GDF-15 Content, (A7) AR content, (A8) HGF content, (A9) BMP-7 content, (B1) SCFR content, (B2) EGFR content, or (B3) Content of VEGFR2; Any two conditions of (A1) to (A9) and (B1) to (B3): (A1) and (A2), (A1) and (A3), (A1) and (A4), (A1) and (A5), (A1) and (A6), (A1) and (A7), (A1) ) And (A8), (A1) and (A9), (A1) and (B1), (A1) and (B2), (A1) and (B3), (A2) and (A3), (
  • the content per total protein may be adjusted, for example, by adding or removing proteins other than the growth factor and the growth factor receptor, depending on the use of the composition of the present invention.
  • proteins other protein include proteins that do not affect the activities of the growth factor and the growth factor receptor, and specific examples thereof include serum albumin such as human serum albumin and gamma globulin such as human gamma globulin. Be done.
  • the removal of the protein include removal using a column, removal using an antibody, and the like.
  • condition (2) is, as described above, a condition relating to the physiological activity of the treated product.
  • the physiological activity of the treated product means, for example, an activity of regulating the function of a cell, tissue, or organ.
  • the functions of the cells include, for example, proliferation, differentiation and the like.
  • Examples of the physiological activity of the treated product include cell proliferation promoting activity, osteoblast differentiation promoting activity, and bone progenitor cell to osteoblast differentiation promoting activity.
  • the cells are not particularly limited in the growth promoting activity of the cells, and examples thereof include mesenchymal stem cells and the like.
  • examples of the bone progenitor cells include mesenchymal stem cells and osteoblasts.
  • the treated product may have, for example, one activity or a plurality of activities.
  • the mesenchymal stem cells are cells having self-renewal ability and ability to differentiate into bone, cartilage, and adipocytes.
  • the mesenchymal stem cells can be identified by cell surface markers.
  • the mesenchymal stem cells are, for example, CD73, CD90, and CD105 positive, and CD14, CD34, and CD45 negative.
  • the osteoblasts are cells capable of synthesizing and secreting bone matrix.
  • the osteoblasts can be identified as, for example, alkaline phosphatase-positive and osteocalcin-positive cells.
  • the cell proliferation promoting activity may be improved, for example, as compared with the same control group except that the composition of the present invention is not added.
  • cell proliferation may be improved from the start.
  • the ability may be reduced.
  • the "proliferation-promoting activity" can be said to be, for example, suppression of a decrease in the growth-promoting activity.
  • the mesenchymal stem cells decrease in proliferative activity with each passage.
  • the composition of the present invention it is possible to suppress a decrease in the proliferative activity of the mesenchymal stem cells. Therefore, for example, it can be said that the composition of the present invention exhibits proliferative activity.
  • the cell growth promoting activity can be measured, for example, under culture conditions in which the target cell proliferates.
  • the culture conditions can be appropriately set, for example, according to the type of the cells.
  • the ability to promote differentiation into osteoblasts may be improved as compared with the same control group except that the composition of the present invention is not added.
  • the improvement of the differentiation potential may mean, for example, that the rate of differentiation into the osteoblasts is increased and the proportion of cells that differentiate into the osteoblasts is increased.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-120529 can be referred to.
  • the method for inducing osteoblasts from mesenchymal stem cells can be carried out, for example, based on Example 2 described later.
  • Condition (3) is a condition relating to a method for producing a processed product, as described above.
  • the method for producing the processed product in the composition of the present invention the following description of the method for producing the composition of the present invention can be incorporated.
  • composition of the present invention may be used in vitro or in vivo .
  • the administration target includes, for example, cells, tissues, organs and the like, and the cells include, for example, cells collected from a living body, cultured cells and the like.
  • the administration target includes, for example, humans or non-human animals other than humans.
  • the non-human animal include mice, rats, rabbits, dogs, sheep, horses, cats, goats, monkeys, guinea pigs and the like.
  • compositions of the present invention are not particularly limited, and for example, the administration form, administration time, dosage and the like can be appropriately set according to the type of administration target and the like.
  • the composition of the present invention can be used, for example, by adding it to the medium of the progenitor cell of interest.
  • the composition of the present invention may be added to, for example, a maintenance medium used for maintaining the progenitor cells, or may be added for use in differentiating the progenitor cells into the osteoblasts.
  • the maintenance medium and the differentiation medium may be added.
  • differentiation can be promoted when the progenitor cells are subsequently differentiated into osteoblasts.
  • the final concentration of the total protein derived from the composition of the present invention in the maintenance medium is, for example, 10 to 1000 ⁇ g / ml, 10 to 500 ⁇ g / ml, or 10 to 300 ⁇ g / ml.
  • the final concentration of the total protein derived from the composition of the present invention in the differentiation medium is, for example, 10 to 1000 ⁇ g / ml, 10 to 500 ⁇ g / ml, or 10 to 300 ⁇ g / ml.
  • the daily dose of the composition is not particularly limited to the total amount of total protein derived from the composition, and can be appropriately set, for example, depending on the intended use. Specific examples include 10 ng to 100 mg.
  • the daily dose of the composition is not particularly limited to the total amount of total protein derived from the composition, and can be appropriately set according to the intended use, as a specific example. 10 ng to 100 g can be mentioned.
  • the number of administrations per day is, for example, 1 to 5 times, 1 to 3 times, 1 time or 2 times.
  • the administration form of the composition of the present invention is not particularly limited. When the composition of the present invention is administered in vivo , it may be administered orally or parenterally.
  • the parenteral administration includes, for example, intravenous injection (intravenous administration), intramuscular injection (intramuscular administration), transdermal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, enteral administration, rectal administration, vaginal administration, nasal administration, etc. Enteral administration, intraperitoneal administration, local administration and the like can be mentioned.
  • the dosage form of the composition of the present invention is not particularly limited and can be appropriately determined, for example, according to the administration form.
  • the dosage form may be, for example, liquid or solid.
  • composition of the present invention may contain additives, for example, if necessary.
  • the additive is preferably a pharmaceutically acceptable additive or a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the method for producing the composition of the present invention includes a treatment step for treating megakaryocytes or a culture thereof.
  • the treatment target in the treatment step is megakaryocytes or a culture thereof. Therefore, the production method of the present invention includes a megakaryocyte induction step of inducing the megakaryocytes from cells undifferentiated from the megakaryocytes and / or a production step of producing a culture of the megakaryocytes prior to the treatment step. But it may be.
  • the method for inducing megakaryocytes is not particularly limited and can be carried out by a known induction method.
  • the method for inducing megakaryocytes is, for example, International Publication No. 2011/034073 (US Patent Application Publication No. 2012/0238023), International Publication No. 2012/157586 (US Patent Application Publication No. 2014/0127815). , International Publication No. 2014/123242 (US Patent Application Publication No. 2016/0002599) and other methods for inducing immortalized megakaryocytes; the method for inducing megakaryocytes described in Reference 6 below; Incorporated as a part of this specification.
  • the oncogene and the polycomb gene may be forcibly expressed in cells undifferentiated from the megakaryocytes.
  • an immortalized megakaryocyte that proliferates infinitely can be obtained.
  • the immortalized megakaryocytes can be induced into the polynuclearized megakaryocytes to produce platelets.
  • the apoptosis-suppressing gene may be forcibly expressed in the megakaryocyte progenitor cells.
  • the immortalized megakaryocyte can be obtained. Further, for example, by releasing the forced expression of the immortalized megakaryocytes, polynuclearized megakaryocytes can be induced from the immortalized megakaryocytes to produce platelets.
  • Reference 6 Ann-Kathrin Borger et.al., “Generation of HLA-Universal iPSC-Derived Megakaryocytes and Platelets for Survival Under Refractoriness Conditions”, Mol. Med., 2016, vol. 22, pages 274-288
  • the oncogene, the polycomb gene, and the apoptosis-suppressing gene may be forcibly expressed.
  • the oncogene, the polycomb gene, and the apoptosis-suppressing gene may be forcibly expressed simultaneously or separately.
  • the oncogene and the polycomb gene may be forcibly expressed, then the forcible expression may be released, and then the apoptosis-suppressing gene may be forcibly expressed.
  • the polycomb gene and the apoptosis-suppressing gene may be forcibly expressed, or the oncogene and the polycomb gene may be forcibly expressed, and the apoptosis-suppressing gene may be further expressed.
  • the immortalized megakaryocyte can be obtained.
  • polynuclearized megakaryocytes can be induced from the immortalized megakaryocytes to produce platelets.
  • the giant nucleus sphere induction step can improve the introduction efficiency of each gene, for example, the first expression step of forcibly expressing the cancer gene and the polycomb gene in the cells undifferentiated from the giant nucleus sphere, and the undifferentiated cell.
  • forced expression of each gene and the release of the forced expression for example, the methods described in International Publication No. 2011/034073, International Publication No. 2012/157586, International Publication No. 2014/123242, or Reference 7 below are known. It can be carried out by the method of the above, or a method equivalent thereto, which is incorporated herein by reference as a part of the present specification.
  • forced expression and release of forced expression of each gene can be carried out using, for example, a drug-responsive gene expression induction system.
  • the gene expression induction system include a Tet-on (registered trademark) system and a Tet-off (registered trademark) system.
  • Tet-on system for example, in the step of forced expression, culture is carried out in the presence of a drug that induces gene expression such as tetracycline and doxycycline, and in the step of releasing the forced expression, the drug is used.
  • the culture is carried out in the absence.
  • Reference 7 Nakamura S et al, “Expandable megakaryocyte cell lines enable clinically applicable generation of platelets from human induced pluripotent stem cells.”, Cell Stem Cell, 2014, vol.14, No.4, pages 535-548
  • the production step can be carried out, for example, by culturing the megakaryocytes in the presence of a medium.
  • the culture of megakaryocytes may be carried out, for example, on feeder cells or without feeder cells. Since the megakaryocytes can be cultured in suspension, for example, they can be cultured without the feeder cells.
  • the culture of megakaryocytes contains, for example, the platelets.
  • the culture conditions for the megakaryocytes are not particularly limited, and normal culture conditions for the megakaryocytes can be adopted.
  • the culture temperature is, for example, about 35 to about 42 ° C, about 36 to about 40 ° C, and about 37 to about 39 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 5 to about 15%.
  • the O2 concentration is, for example, about 15 to about 25% and about 20%.
  • the culture period is not particularly limited, and is, for example, about 1 day to about 2 weeks and about 4 to about 8 days.
  • the medium is not particularly limited, and examples thereof include a known medium suitable for producing platelets from the megakaryocytes and a medium similar thereto.
  • the medium can be prepared, for example, as a basal medium used for culturing animal cells.
  • the basal medium is, for example, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's F12 medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal (registered trademark). Examples thereof include a single medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and a mixed medium thereof.
  • the medium may contain, for example, serum or plasma, or may be a serum-free medium containing no of these.
  • the origin of the serum and plasma is preferably the same as the origin of the megakaryocytes.
  • the megakaryocytes are of human origin
  • the serum and plasma are preferably of human origin, respectively.
  • the medium may contain, for example, other components.
  • the other components are not particularly limited, and are, for example, albumin, insulin, transferase, selenium, fatty acid, trace element, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, monothioglycerol (MTG), lipid, amino acid (eg, L-glutamine). ), Ascorbic acid, heparin, non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, cytokines and the like.
  • the other components may be, for example, one kind or two or more kinds.
  • the cytokine is, for example, a substance that promotes the differentiation of blood cell lineage cells, and specific examples thereof include vascular endothelial growth factor (VEGF), thrombopoietin (TPO), various TPO-like agents, StemCellFactor (SCF), and ITS.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TPO thrombopoietin
  • SCF StemCellFactor
  • ITS Insulin-Transferin-Serenite
  • ADAM inhibitors ADAM inhibitors, FLT inhibitors, WNT inhibitors, ROCK inhibitors, aromatic hydrocarbon receptor (AhR) inhibitors and the like.
  • the medium is preferably an IMDM medium containing, for example, serum, insulin, transferrin, serine, thiolglycerol, ascorbic acid, and TPO.
  • the medium may further contain, for example, SCF, and may further contain heparin.
  • concentration of the other components is not particularly limited.
  • the concentration of the TPO is, for example, about 10 ng / ml to about 200 ng / ml and about 50 ng / ml to about 100 ng / ml.
  • the concentration of the SCF is, for example, about 10 ng / ml to about 200 ng / ml and about 50 ng / ml.
  • the concentration of the heparin is, for example, about 10 U / ml to about 100 U / ml and about 25 U / ml.
  • the medium may further contain, for example, a phorbol ester (eg, phorbol-12-millistart-13-acetate; PMA).
  • the megakaryocytes or a culture thereof are treated.
  • a biopolymer such as a protein is extracted by destroying the cell membrane of the cell contained in the megakaryocyte or its culture.
  • the treatment in the treatment step is not particularly limited, and for example, a treatment for changing the density of cell components such as a concentration treatment; drying treatment, freezing treatment, freeze-drying treatment, solvent treatment, surfactant treatment, enzyme. Examples thereof include an extraction process for extracting cell components such as a treatment, a protein fraction extraction process, and an ultrasonic treatment; a crushing process such as a grinding process and a crushing process; and the like.
  • the treatment performed in the treatment step may be one type or two or more types. Further, in the treatment step, the treatment may be carried out once or twice or more.
  • the concentration treatment can be carried out, for example, by centrifuging the megakaryocytes or a culture thereof.
  • the centrifugation condition for example, a condition for precipitating cells or platelets can be adopted.
  • the drying treatment can be carried out, for example, by drying the megakaryocytes or a culture thereof with a dry spray, a drum dryer, or the like.
  • the freeze-drying treatment can be carried out using, for example, a freeze-dryer.
  • the solvent is, for example, an organic solvent such as phenol or chloroform; an aqueous solvent such as water, physiological saline, or a buffer solution.
  • the solvent treatment is preferably used in combination with, for example, a surfactant treatment, an enzyme treatment, and / or an ultrasonic treatment described later.
  • the solvent treatment can be carried out, for example, by mixing the megakaryocytes or a culture thereof with the solvent.
  • the surfactant is, for example, an ionic surfactant such as sodium lauryl sulfate; a nonionic surfactant such as NP-40, Triton X-100, Tween 20, n-Dodecyl- ⁇ -D-maltopyranoside and the like.
  • the concentration of the surfactant is, for example, a concentration capable of destroying the cell membrane of the cell component in the megakaryocyte or its culture.
  • the surfactant treatment can be carried out, for example, by contacting the megakaryocytes or a culture thereof with the surfactant in the presence of an aqueous solvent. Contact with the surfactant is carried out, for example, at about 0 to about 10 ° C.
  • the aqueous solvent include water, physiological saline, and a buffer solution.
  • the enzyme in the enzyme treatment include peptidase, protease and the like.
  • the enzyme treatment can be carried out, for example, by contacting the megakaryocytes or a culture thereof with the enzyme in the presence of the aqueous solvent.
  • the conditions for the enzyme treatment are, for example, conditions under which the enzyme exhibits activity.
  • the protein fraction extraction treatment can be carried out, for example, by subjecting the megakaryocytes or a culture thereof to osmotic shock, freeze-thaw, or the like.
  • the ultrasonic treatment can be performed using, for example, an ultrasonic generator.
  • the conditions for the ultrasonic treatment for example, conditions for disrupting cells can be used.
  • the processing conditions and processing time in various processing can be appropriately determined according to, for example, the type of processing. Further, in the treatment step, for example, the concentration of the total protein in the treated product can be adjusted by adjusting the amount of the aqueous solvent.
  • the megakaryocytes or a culture thereof may be processed (pre-treated) prior to the treatment.
  • the culture of the megakaryocytes the culture itself obtained by culturing the megakaryocytes may be used, or the processed mixture may be used.
  • Processing of the culture includes, for example, removal of a liquid fraction, extraction of a cellular component fraction, modification of the composition of cellular components including platelets, and the like. Changes in the composition of the cellular components include, for example, removal of cells and / or platelets in the mixture, extraction of cells and / or platelets in the mixture, addition of cells and / or platelets to the mixture, and the like.
  • the production method of the present invention may include a removal step of removing platelets from the megakaryocytes or a culture thereof.
  • the treatment step the treatment is carried out using the megakaryocytes from which the platelets have been removed or the culture thereof, or the platelets from which the platelets have been removed, as the megakaryocytes or a culture thereof.
  • the megakaryocytes after the release of platelets have, for example, a high content of bFGF. Therefore, the production method of the present invention can produce a composition having a high content of bFGF, for example, by removing the platelets. By removing the platelets, the platelets can be separated from other cell fractions.
  • the removal step can be, for example, a platelet separation step or a platelet separation step of separating other cellular components.
  • the method for separating platelets from the culture of megakaryocytes is a known method such as the method described in International Publication No. 2017/065280 (US Patent Application Publication No. 2018/282697). , Or a method equivalent thereto, which is incorporated herein by reference.
  • the removal rate (separation rate) of platelets in the removal step is, for example, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98%. Or more, or 99% or more.
  • the removal rate of the platelets is, for example, 60 to 90%.
  • the production method of the present invention may include a storage step for preserving the megakaryocytes or a culture thereof, the megakaryocytes from which the platelets have been removed or a culture thereof, or the platelets from which the platelets have been removed.
  • Examples of the storage in the storage step include refrigerated storage (about 1 to about 10 ° C.) and frozen storage (about ⁇ 200 to about -4 ° C.).
  • the storage period in the storage step is not particularly limited. Since the storage step can also serve as, for example, a freezing treatment in the processing step, freezing storage is preferable.
  • the manufacturing method of the present invention can be carried out as follows.
  • the present invention is not limited to the following examples.
  • the medium containing the megakaryocytes or a culture thereof is subjected to a concentration treatment by centrifugation to concentrate the cell components.
  • the centrifugation is, for example, a condition under which the cellular components precipitate.
  • the centrifugation can be carried out, for example, by centrifuging at 1000 to 3000 ⁇ g for 5 to 20 minutes.
  • the precipitate is collected after centrifugation, and the obtained precipitate is frozen by quick freezing.
  • the freezing treatment can be carried out, for example, by bringing the precipitate into contact with a liquefied gas such as liquid nitrogen.
  • the precipitate after freezing is treated with a surfactant by dissolving it in an aqueous solvent containing the surfactant. Centrifuge the resulting solution to precipitate contaminants.
  • the centrifugation is a condition under which contaminants such as cell membranes are precipitated, for example.
  • the centrifugation can be carried out by centrifuging at 10,000 to 20,000 xg for 3 to 10 minutes, for example. Since the protein is present in the supernatant after the centrifugation, the treated product can be obtained by collecting the supernatant as a protein fraction.
  • the composition of the present invention can be used, for example, as an osteoblast differentiation promoting composition, as will be described later.
  • the following description of the cell proliferation promoting composition and the osteoblast differentiation promoting composition can be incorporated.
  • the composition of the present invention also comprises, for example, jawbone defect due to jawbone tumor, cyst, osteonecrosis, trauma, bone system disease (ectodermal dysplasia, labial-maxillofacial fissure, etc.); periodontal disease or alveolar bone defect associated therewith.
  • Alveolar bone defects such as alveolar bone defects due to caries or trauma
  • Osteoporosis such as primary osteoporosis (postmenopausal osteoporosis, senile osteoporosis, etc.), secondary osteoporosis (osteoporosis, etc.); , Glandular dysfunction), intractable fractures due to trauma, etc .
  • rib junction due to open chest surgery; bone defect due to craniotomy; systemic bone defect due to tumor resection or cystectomy; etc.
  • the composition for promoting osteoblast differentiation of the present invention contains the composition of the present invention as described above.
  • the differentiation-promoting composition of the present invention is characterized by containing the composition of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited. According to the differentiation promoting composition of the present invention, differentiation into osteoblasts, particularly from mesenchymal stem cells to osteoblasts, can be promoted.
  • the differentiation-promoting composition of the present invention can be referred to the description of the composition of the present invention.
  • the differentiation-promoting composition of the present invention may be used in vitro or in vivo .
  • the administration target includes, for example, cells, tissues, organs, etc.
  • the cells include, for example, cells collected from a living body, cultured cells, and the like. ..
  • the administration target includes, for example, humans or non-human animals other than humans.
  • the non-human animal include mice, rats, rabbits, dogs, sheep, horses, cats, goats, monkeys, guinea pigs and the like.
  • the conditions for using the differentiation-promoting composition of the present invention are not particularly limited, and for example, the administration form, administration time, dose, etc. can be appropriately set according to the type of administration target and the like.
  • administration conditions of the differentiation-promoting composition of the present invention the description of the composition of the present invention can be incorporated.
  • the differentiation-promoting composition of the present invention can be used, for example, by adding it to the medium of the target progenitor cells.
  • the differentiation-promoting composition of the present invention may be added to, for example, a maintenance medium used for maintaining the progenitor cells, or may be added for use in differentiating the progenitor cells into the osteoblasts. Alternatively, it may be added to both the maintenance medium and the differentiation medium.
  • differentiation-promoting composition of the present invention for example, by maintaining the progenitor cells in a maintenance medium containing the differentiation-promoting composition, differentiation is also performed when the progenitor cells are subsequently differentiated into osteoblasts. Can be promoted.
  • the final concentration of the total protein derived from the differentiation promoting composition of the present invention in the maintenance medium is, for example, 10 to 1000 ⁇ g / ml, 10 to 500 ⁇ g / ml, or 10 to 300 ⁇ g / ml.
  • the final concentration of the total protein derived from the differentiation promoting composition of the present invention in the differentiation medium is, for example, 10 to 1000 ⁇ g / ml, 10 to 500 ⁇ g / ml, or 10 to 300 ⁇ g / ml.
  • the effect of promoting the differentiation of progenitor cells into osteoblasts is, for example, when the mesenchymal stem cells and the test subject coexist, as compared with the absence of the test subject (control group). It can be evaluated by whether it can promote the differentiation of leaf stem cells into osteoblasts. Specifically, the action of promoting differentiation into osteoblasts can be evaluated using the concentration of calcium ions in the medium of the cell group after inducing differentiation of the mesenchymal stem cells into osteoblasts as an index.
  • the method for inducing differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts and the method for measuring the concentration of calcium ions can be carried out according to Example 1 (6) described later.
  • the calcium concentration in the group coexisting with the test object is 90% or less, 85% or less, 80% or less as compared with the calcium concentration in the group in the absence of the test object. , 75% or less, 70% or less, 65% or less, 60% or less, 55% or less, 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15
  • it is% or less, 10% or less, or 5% or less it can be evaluated that the test substance has an effect of promoting differentiation into osteoblasts.
  • the differentiation-promoting composition of the present invention has, for example, a calcium concentration of 90% or less, 85% or less, 80% or less, 75% or less, 70% or less in the assay for inducing differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. , 65% or less, 60% or less, 55% or less, 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, or It has an osteoblast differentiation promoting activity that suppresses it to 5% or less.
  • the assay for inducing differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts can be carried out according to Example 1 (6) described later.
  • the differentiation promoting composition of the present invention When used in vivo , it can be appropriately determined, for example, depending on the type, symptom, age, administration method and the like of the administration target. As a specific example, when administered to humans, the daily dose of the differentiation-promoting composition is not particularly limited to the total amount of the total protein derived from the differentiation-promoting composition, and is appropriately, for example, depending on the intended use. Can be set. The number of administrations per day is, for example, 1 to 5 times, 1 to 3 times, 1 time or 2 times.
  • the administration form of the differentiation promoting composition of the present invention is not particularly limited.
  • the differentiation-promoting composition of the present invention may be administered orally or parenterally.
  • the parenteral administration includes, for example, intravenous injection (intravenous administration), intramuscular injection (intramuscular administration), transdermal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, enteral administration, rectal administration, vaginal administration, nasal administration, etc. Enteral administration, intraperitoneal administration, local administration and the like can be mentioned.
  • the dosage form of the differentiation-promoting composition of the present invention is not particularly limited and can be appropriately determined, for example, according to the administration form.
  • the dosage form may be, for example, liquid or solid.
  • the differentiation-promoting composition of the present invention may contain, for example, an additive, if necessary.
  • the additive is preferably a pharmaceutically acceptable additive or a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the bone formation kit of the present invention includes a bone formation composition and a scaffold material for bone formation, and the bone formation composition is the bone formation composition of the present invention.
  • the kit of the present invention is characterized by containing the bone-forming composition of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the kit of the present invention can easily induce bone formation by combining the composition of the present invention with the scaffolding material.
  • the kit of the present invention can be referred to the description of the composition of the present invention and the differentiation promoting composition.
  • the scaffolding material for example, a scaffolding material used for bone or cartilage regeneration can be used.
  • the scaffolding material can also be, for example, a material to which bone cells or osteoblasts, or progenitor cells thereof can attach, proliferate, and / or differentiate.
  • the scaffold material is, for example, a structure (structure) having a three-dimensional hollow structure or a porous structure, and specific examples thereof include a porous body, a porous support, and a porous three-dimensional structure (structure). Examples include gels (hydrogels) and sponge structures.
  • the scaffolding material is placed in a living body together with the composition of the present invention, for example, it is preferable to exhibit biocompatibility and / or biodegradability.
  • biocompatibility means, for example, that it has an affinity with tissues and / or organs in a living body and does not cause a foreign body reaction or rejection reaction.
  • biodegradable means, for example, that the constituents thereof can be decomposed in a living body.
  • the components of the scaffold material are, for example, proteins such as collagen, gelatin, albumin, keratin, fibrin, and fibroin; polysaccharides such as agarose, dextran, carboxymethyl cellulose, xanthan gum, chitosan, chondroitin sulfate, heparin, hyaluronic acid, and alginic acid; Polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), copolymer of polyglycolic acid and polylactic acid, polyhydroxybutyric acid, polydioxanone, polyethylene glycol (PEG), polycaprolactone, polybutylene succinate, calcium phosphate (eg ⁇ - (Tricalcium phosphate), calcium carbonate, hydroxyapatite, polyether ketone, polyether ether ketone and the like.
  • proteins such as collagen, gelatin, albumin, keratin, fibrin, and fibroin
  • polysaccharides such as agarose, dextran,
  • the scaffolding material can be prepared, for example, by cross-linking or compounding the constituent components of the scaffolding material.
  • the scaffold material examples include neoborn (made by hydroxyapatite, manufactured by Aimdic MMT), APACERAM (registered trademark, manufactured by hydroxyapatite, manufactured by HOYA Co., Ltd.), and bonark (manufactured by collagen / calcium octaphosphate, manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.). , Osferion ( ⁇ TCP, Olympus Thermobiomaterial Co., Ltd.), Cytrans Granule (carbonated apatite, GC Co., Ltd.), Refit (collagen / apatite, HOYA Co., Ltd.), etc.
  • the composition and the scaffolding material may exist independently or integrally.
  • the kit of the present invention can be said to be, for example, a bone-forming scaffold material.
  • the composition and the scaffolding material are integrated, the composition may be adsorbed on the surface of the scaffolding material or may be included in the scaffolding material, for example.
  • the kit of the present invention may contain, for example, a physiologically active substance in addition to the above composition.
  • the bioactive substance is, for example, a substance that promotes bone formation or osteoblasts or osteoblast differentiation.
  • the physiologically active substance is, for example, vascular endothelial cell growth factor (VEGF), platelet-derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocellular growth factor (HGF), insulin-like. Examples include growth factor (IGF), brain-derived neuronutrient factor (BDNF), growth differentiation factor-5 (GDF5), erythropoiesis promoting factor (EPO), transformed growth factor (TGF) and bone-forming protein (BMP). .
  • the physiologically active substance may be used alone or in combination of two or more.
  • the kit of the present invention can be used, for example, by transplanting (embedding, embedding) the composition and the scaffolding material at a desired place where bone formation is desired to be induced in the administration subject.
  • the scaffolding material when the composition and the scaffolding material are independent, can be used by impregnating the scaffolding material with the composition and then transplanting the scaffolding material.
  • the scaffold material when the composition and the scaffold material are independent, the scaffold material is transplanted and then used by introducing the composition of the present invention into the transplant site. May be good.
  • the scaffolding material can be used by transplanting the scaffolding material.
  • the content of the composition can be set according to, for example, the dose in the composition of the present invention.
  • the present invention provides, in another embodiment, a composition having a cell-derived immune cell activation inhibitory activity.
  • the immune cell activation-suppressing composition of the present invention (hereinafter, also referred to as "activation-suppressing composition”) includes a processed product of megakaryocytes or a culture thereof.
  • the activation-suppressing composition of the present invention is characterized by containing a processed product of megakaryocytes or a culture thereof, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • a composition having an activation-suppressing activity of cell-derived immune cells can be provided.
  • the description of the composition of the present invention, the differentiation-promoting composition, and the bone formation kit can be incorporated.
  • the activation-suppressing composition of the present invention can, for example, suppress the production of inflammatory cytokines in immune cells. Therefore, the activation-suppressing composition of the present invention can be said to be, for example, a composition that suppresses the production of inflammatory cytokines in immune cells.
  • activation of immune cells is used in any sense of inducing the expression of activation markers or the expression of cytokines such as inflammatory cytokines in immune cells, for example. May be good.
  • cytokines such as inflammatory cytokines in immune cells, for example. May be good.
  • the inflammatory cytokine include TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, IFN- ⁇ and the like.
  • the effect of suppressing the activation of the immune cells is, for example, when the immune cells are allowed to coexist under the conditions for activating the immune cells, as compared with the absence of the test subject.
  • Control group it can be evaluated by whether the concentration of inflammatory cytokine in the medium after culturing the immune cells can be suppressed.
  • the inhibitory effect on the activation of immune cells can be evaluated based on the suppression rate of the production amount of inflammatory cytokines.
  • the type of immune cells, activation conditions, and amount of inflammatory cytokines produced can be measured according to Example 5 described later.
  • the suppression rate of the production amount of any one or more cytokines is 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more. , 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 99% or more, it can be evaluated that the test substance has an immune cell activation inhibitory effect.
  • the concentration of at least one inflammatory cytokine is 90% or less, 85% or less, 80% or less, as compared with the control group. 75% or less, 70% or less, 65% or less, 60% or less, 55% or less, 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% below, it has an effect of suppressing the activation of immune cells, which suppresses it to 10% or less, or 5% or less.
  • the immune cell activation assay can be performed according to Example 5 described later.
  • examples of the immune cells include lymphocytes such as T cells; macrophages such as inflammatory macrophages; and the like.
  • the activation-suppressing composition of the present invention may be used in vitro or in vivo .
  • the administration target includes, for example, cells, tissues, organs, etc.
  • the cells include, for example, cells collected from a living body, cultured cells, and the like. Be done.
  • the administration target includes, for example, humans or non-human animals other than humans.
  • the non-human animal include mice, rats, rabbits, dogs, sheep, horses, cats, goats, monkeys, guinea pigs and the like.
  • the conditions for using the activation-suppressing composition of the present invention are not particularly limited, and for example, the administration form, administration time, dose, etc. can be appropriately set according to the type of administration target and the like.
  • the activation-suppressing composition of the present invention can be used, for example, by adding it to the medium of the target cell.
  • the final concentration of the total protein derived from the activation-suppressing composition of the present invention in the medium is, for example, 10 to 1000 ⁇ g / ml, 10 to 500 ⁇ g / ml. Alternatively, it is 10 to 300 ⁇ g / ml.
  • the activation-suppressing composition of the present invention when used in vivo , it can be appropriately determined, for example, depending on the type, symptom, age, administration method and the like of the administration target.
  • the daily dose of the activation-suppressing composition when administered to humans, is not particularly limited to the total amount of total protein derived from the activation-suppressing composition, and is, for example, depending on its use. Can be set as appropriate.
  • the number of administrations per day is, for example, 1 to 5 times, 1 to 3 times, 1 time or 2 times.
  • the administration conditions and dosage form of the activation-suppressing composition of the present invention can be referred to the description of the composition of the present invention.
  • the present invention provides, in another embodiment, a composition having cell-derived anti-inflammatory activity.
  • the anti-inflammatory composition of the present invention comprises a processed product of megakaryocytes or a culture thereof.
  • the anti-inflammatory composition of the present invention is characterized by containing a processed product of megakaryocytes or a culture thereof, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • a composition capable of suppressing inflammation can be provided.
  • the anti-inflammatory composition of the present invention can be referred to the description of the composition of the present invention, the differentiation promoting composition, the bone formation kit, and the activation suppressing composition.
  • anti-inflammatory means suppressing inflammation, and for example, suppression of induction of expression of inflammatory cytokines or suppression of production of inflammatory cytokines can be used as an index for examination.
  • the anti-inflammatory composition of the present invention may be used in vitro or in vivo .
  • the subject, administration conditions, and dosage form of the anti-inflammatory composition of the present invention can be referred to the description of the composition of the present invention and the composition that suppresses the activation of immune cells.
  • the bone formation method of the present invention uses the bone formation composition of the present invention.
  • the bone forming method of the present invention is characterized by using the composition of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • bone formation can be induced, for example, by promoting the differentiation into osteoblasts, particularly from mesenchymal stem cells to osteoblasts.
  • the bone formation method of the present invention can be referred to the description of the composition of the present invention, the differentiation promoting composition, and the bone formation kit.
  • the bone formation method of the present invention comprises, for example, an administration step of administering the bone formation composition of the present invention to an administration subject.
  • the administration position of the composition of the present invention can be a desired position for bone formation.
  • the subject and conditions of administration can be referred to the description of the subject and conditions of administration of the composition of the present invention.
  • the bone formation kit of the present invention may be used as the bone formation composition of the present invention.
  • the method for promoting the differentiation of osteoblasts of the present invention uses the cell differentiation promoting composition of the present invention.
  • the differentiation promoting method of the present invention is characterized by using the differentiation promoting composition of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • differentiation into osteoblasts particularly from mesenchymal stem cells to osteoblasts, can be promoted.
  • the description of the composition, the composition for promoting differentiation, the bone formation kit, and the method for promoting bone formation of the present invention can be incorporated.
  • the method for promoting differentiation of the present invention may be carried out in vitro or in vivo , for example.
  • the method for promoting differentiation of the present invention comprises, for example, an administration step of administering the differentiation-promoting composition of the present invention to an administration subject.
  • the method for promoting differentiation of the present invention comprises, for example, a differentiation step of differentiating progenitor cells into osteoblasts in the presence of the differentiation-promoting composition.
  • the differentiation promoting method of the present invention may include a maintenance step of maintaining and culturing progenitor cells in the presence of the differentiation promoting composition prior to the differentiation step.
  • the administration subject and administration condition of the differentiation-promoting composition of the present invention for example, the description of the administration subject and administration condition in the differentiation-promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the present invention provides, in another embodiment, a method of suppressing the activation of immune cells.
  • the method for suppressing activation of immune cells of the present invention (hereinafter, also referred to as “method for suppressing activation”) uses the above-mentioned composition for suppressing activation of immune cells of the present invention.
  • the activation-suppressing method of the present invention is characterized by using the activation-suppressing composition of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. According to the activation suppressing method of the present invention, the activation of immune cells can be suppressed.
  • the description of the composition of the present invention, the differentiation promoting composition, the bone formation kit, the activation suppressing composition, the anti-inflammatory composition, the bone forming method, and the differentiation promoting method can be incorporated.
  • the activation suppressing method of the present invention may be carried out in vitro or in vivo , for example.
  • the activation-suppressing method of the present invention comprises, for example, an administration step of administering the activation-suppressing composition of the present invention to an administration subject.
  • the activation-suppressing method of the present invention comprises, for example, a culture step of culturing immune cells in the presence of the activation-suppressing composition.
  • the administration subject, administration condition, and dosage form of the activation inhibitory composition of the present invention for example, the description of the administration subject, administration condition, and dosage form in the activation inhibitory composition of the present invention can be incorporated.
  • the present invention provides, in another embodiment, a method of suppressing inflammation.
  • the method for suppressing inflammation of the present invention (hereinafter, also referred to as “method for suppressing inflammation”) uses the anti-inflammatory composition of the present invention.
  • the method for suppressing inflammation of the present invention is characterized by using the anti-inflammatory composition of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. According to the method for suppressing inflammation of the present invention, inflammation can be suppressed.
  • the method for suppressing inflammation of the present invention is the composition of the present invention, a differentiation promoting composition, a bone formation kit, an activation suppressing composition, an anti-inflammatory composition, a bone forming method, a differentiation promoting method, and an activation suppressing method.
  • the explanation can be used.
  • the method for suppressing inflammation of the present invention may be carried out in vitro or in vivo , for example.
  • the method for suppressing inflammation of the present invention comprises, for example, an administration step of administering the anti-inflammatory composition of the present invention to an administration subject.
  • the method for suppressing inflammation of the present invention comprises, for example, a culturing step of culturing an administration subject in the presence of the anti-inflammatory adult.
  • the subject, administration condition, and dosage form of the anti-inflammatory composition of the present invention can be referred to, for example, the description of the subject, administration condition, and dosage form in the anti-inflammatory composition of the present invention.
  • the present invention is a composition or use thereof comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use for bone formation.
  • the present invention is a composition or use thereof comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use for promoting the differentiation of osteoblasts.
  • the present invention is a composition or use thereof comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use for suppressing the activation of immune cells.
  • the present invention is a composition or use thereof comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use for suppressing inflammation.
  • the present invention is the use of a composition comprising a treated megakaryocyte or a culture thereof as an active ingredient for producing a bone-forming composition.
  • the present invention is also the use of a composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for producing an osteoblast differentiation promoting composition.
  • the present invention is the use of a composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for producing an immune cell activation inhibitory composition.
  • the present invention is the use of a composition comprising a treated megakaryocyte or a culture thereof as an active ingredient for producing an anti-inflammatory composition.
  • the present invention relates to the composition of the present invention, a differentiation promoting composition, a bone formation kit, an activation suppressing composition, an anti-inflammatory composition, a bone forming method, a differentiation promoting method, an activation suppressing method, and an inflammation suppressing method.
  • the explanation can be used.
  • composition of the present invention was produced and confirmed to contain a growth factor and a growth factor receptor, and to have an activity for promoting cell proliferation and an activity for promoting differentiation into osteoblasts.
  • TKDN SeV2 and NIH5 human fetal skin fibroblast-derived iPS cells established using Sendai virus
  • differentiation culture into blood cells was carried out. Specifically, human ES / iPS cell colonies were co-cultured with C3H10T1 / 2 feeder cells for 14 days in the presence of 20 ng / ml VEGF (manufactured by R & D SYSTEMS) to prepare hematopoietic progenitor cells (HPC). ..
  • the gene transfer system used the lentiviral vector system.
  • the lentiviral vector is a Tetracycline-regulated Tet-on® gene expression induction system vector. It was made by recombining the mOKS cassette of LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G (Reference 9 below) with c-MYC, BMI1, or BCL-xL. Vectors with c-MYC, BMI1, or BCL-xL introduced into LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G, LVTRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G, and LV-TRE-BCL-, respectively.
  • the c-MYC, BMI1, and BCL-xL viruses were prepared by gene transfer into 293T cells with the lentiviral vector. By infecting the cells of interest with the resulting virus, the c-MYC, BMI1, and BCL-xL genes are introduced into the genomic sequence of the cells of interest. These genes, which have been stably introduced into the genomic sequence, can be forcibly expressed by adding doxycycline (clontech # 631311) to the medium.
  • Reference 9 Kobayashi, T. et al., “Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells.”, Cell, 2010, vol.142, No.5, pages 787-799
  • the spin infection was performed twice every 12 hours.
  • the medium was basal medium (15% Fetal Bovine Serum (GIBCO), 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO), 1% Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS-G) (GIBCO), 0.45 mmol / l 1-Thioglycerol).
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • L-Ascorbic Acid Sigma-Aldrich
  • TPO Human thrombopoietin
  • the final concentration of Proteinine was added to a medium (hereinafter referred to as differentiation medium) to which 50 ng / ml Human Stem Cell Factor (SCF) (R & D SYSTEMS) and 2 ⁇ g / ml Doxycycline (Dox, clontech # 631311) were added.
  • SCF Human Stem Cell Factor
  • Dox Dox, clontech # 631311
  • virus-infected blood cells obtained by the above method were collected by pipetting, and the supernatant was removed by centrifugation at 1200 rpm for 5 minutes. It was then suspended in a new differentiation medium and seeded on new C3H10T1 / 2 feeder cells (6 well plate). The passage was carried out by performing the same operation on the 9th day of infection. At the time of re-seeding, after counting the number of cells, the cells were seeded on C3H10T1 / 2 feeder cells so as to have 1 ⁇ 10 5 cells / 2 ml / well (6 well plate).
  • BCL-xL virus infection in megakaryocyte autoproliferation strain BCL-xL was introduced into the megakaryocyte autoproliferation strain on the 14th day of infection by the lentivirus method using BCL-xL virus.
  • Virus particles were added to the medium to achieve MOI 10 and infected by spin infection (32 ° C, 900 rpm, centrifuge for 60 minutes). Forced expression of the BCL-xL gene was carried out by adding DOX to the medium to a concentration of 1 ⁇ g / ml DOX.
  • SeV2-MKCL and NIH5-MKCL were statically cultured in a 10 cm dish (10 ml / dish).
  • IMDM was used as the basic medium, and the following components were added (concentration is final concentration).
  • the culture conditions were 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • human plasmA 6% L-Glutamin (Gibco # 25030-081) 4 mmol / l ITS (Gibco # 41400-045) 100-fold dilution MTG (monothioglycerol, sigma # M6145-25ML) 450 ⁇ mol / l Ascorbic acid (sigma # A4544) 50 ⁇ g / ml SCF (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the cells were cultured in the presence of the platelet production medium for 6 days to produce platelets, thereby producing a culture of megakaryocytes.
  • the megakaryocyte culture obtained in (2) above was introduced into a culture bag.
  • the culture bag was then connected to a concentration system as shown in FIG.
  • the cleaning storage liquid bags 1 and 2 include a cleaning storage liquid.
  • 20% ACD and 2.5% human serum albumin were added to a bicanate infusion solution (bicarbon infusion solution, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), and the pH was adjusted to 7.2 with NaOH.
  • the culture of megakaryocytes was concentrated using a hollow fiber membrane (Plasmaflow OP, manufactured by Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), and the obtained concentrate of the culture of megakaryocytes was placed in a storage bag. Collected.
  • a hollow fiber membrane Pullasmaflow OP, manufactured by Asahi Kasei Medical Co., Ltd.
  • the cell bag containing the culture to which the ACD-A solution was added was joined to the ACP215 disposable set.
  • I started ACP215 in service mode and set the rotation speed to 2500 rpm (350 x g).
  • ACP215 was started and the culture in the cell bag was introduced into a separation bowl at about 100 ml / min. The liquid component flowing out of the separation bowl was collected in a collection bag. After introducing the entire amount of the culture in the cell bag into the separation bowl, an additional 500 ml of a wash storage solution was introduced into the separation bowl. After introducing the washing and preserving solution into the separation bowl, centrifugation was stopped and the recovery bag containing the recovery liquid (recovered liquid component including platelets) was separated using a tube sealer.
  • a recovery bag containing a recovery solution (including platelets) was joined to the new ACP215 disposable set using the aseptic joining device.
  • the recovery bag containing the recovery liquid was installed on the stand.
  • centrifugation speed of ACP215 was changed to 5000 rpm (1398.8 x g), and centrifugation was started.
  • automatic injection was changed to manual injection.
  • the recovered liquid was introduced into the separation bowl at an introduction rate of about 100 ml / min. After adding the entire amount of the recovered liquid to the separation bowl, an additional 500 ml of a washing and preserving liquid was added.
  • Each raw material was washed twice with a cleaning solution.
  • the cleaning solution used was that the pH was adjusted to the range of 7.0 to 7.4 by adding ACD-A solution to the vicanate infusion solution so as to be about 20 (v / v)%, and then adding NaOH. board. After the washing, each raw material was centrifuged at 2000 ⁇ g for 10 minutes at room temperature (about 25 ° C.). After the centrifugation, the precipitate was collected and frozen using liquid nitrogen. Next, a cytolysis buffer was added to the frozen precipitate and lysed by shaking at 50 rpm and 4 ° C. for 30 minutes.
  • the cell lysis buffer is a commercially available cell lysis buffer (2 ⁇ Cell Lysis Buffer, RayBiotech, Cat.No .: AA-LYS) and a protease inhibitor cocktail (Protease Inhibitor Cocktail, RayBiotech, Cat.No .:). AA-PI) was added.
  • the obtained lysate was centrifuged at 14000 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C. After the centrifugation, the supernatant was recovered as a treated product of the example.
  • the total protein concentration of the processed material obtained from each raw material was measured using the Pierce TM BCA Protein Assay Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific). As a result, when an immortalized megakaryocyte cell line was used, 2.604 mg of total protein was extracted from 2.2 ⁇ 107 cells. When platelets were used, 1.187 mg of total protein was extracted from 2.5 ⁇ 108 cells.
  • the concentrations (pg / total protein 5 mg) of PIGF, VEGF, GDF-15, AR, BMP-7, HGF) and growth factor receptors (SCFR, EGFR, VEGFR2) were measured. These results are shown in Table 2 below. In addition, Table 2 below can also be said to be the concentration per 5 mg of total protein.
  • Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were seeded in a 10 cm dish so as to be 2.4 to 4.8 ⁇ 10 5 cells / 10 ml medium / dish.
  • mesenchymal stem cells commercially available human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Cat. No .: C-12977, manufactured by Takara Bio) were subcultured twice and then recovered. ..
  • the medium is prepared by freezing the composition prepared from the platelet-depleted macronuclear cell culture 2 in Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2, manufactured by Takara Bio, Cat. No .: C-28009). , The dissolved medium was added.
  • the composition was added so that the total protein concentration derived from the composition in the medium was a predetermined concentration (0, 125, 250, or 500 ⁇ g / ml).
  • the medium is a maintenance medium.
  • the mesenchymal stem cells were cultured for 3 days at 37 ° C. under a wet condition of 5% CO 2 . After the culture, the mesenchymal stem cells were collected, seeded under the same conditions, and cultured again for 3 days at 37 ° C. under 5% CO 2 wetting. Next, the mesenchymal cells after the culture were collected and the number of cells was counted. Then, a relative value of the number of cells at the time of recovery when the number of cells at the time of seeding was used as a reference (1) was calculated, and this was used as a relative value of the proliferative activity. In addition, the time required for the cells to proliferate once (doubling time) was calculated based on the number of cells at the time of seeding and the number of cells at the time of recovery. These results are shown in FIG.
  • FIG. 2 is a graph showing cell proliferation activity.
  • (A) shows proliferative activity and (B) shows doubling time.
  • the horizontal axis represents the total protein concentration derived from the composition
  • the vertical axis represents the relative value of the growth activity.
  • the horizontal axis indicates the total protein concentration derived from the composition
  • the vertical axis indicates the doubling time
  • the numerical value in the figure indicates the doubling time.
  • FIG. 2A when the composition of the present invention was added, the proliferative activity of mesenchymal stem cells increased depending on the total protein concentration derived from the composition.
  • the doubling time after the third passage was 21 hours in the mesenchymal stem cells to which the composition was not added.
  • the doubling time of the mesenchymal stem cells was extended by about 1.5 times.
  • the composition of the present invention when the composition of the present invention is added, it is necessary for mesenchymal stem cells to proliferate once, depending on the total protein concentration derived from the composition. The time has been shortened.
  • the composition of the present invention was cultured in a medium to which no addition was added, the doubling time of the mesenchymal stem cells was extended when the number of passages was obtained.
  • the composition of the present invention was added, the elongation of the doubling time was almost suppressed. Therefore, it was found that the composition of the present invention can exhibit cell growth promoting activity and suppress a decrease in growth activity.
  • the mesenchymal stem cells were maintained and cultured in the same manner as in (5) above. Next, the medium of each well was replaced with an equal amount of differentiation medium (0th day after the start of differentiation).
  • the differentiation medium is a composition prepared from thrombocytopenic giant nucleus sphere culture 2 in a mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium (Cat. No .: C-28013, manufactured by Takara Bio). After freezing, the thawed product was added.
  • the total protein concentration derived from the composition in the differentiation medium is a predetermined concentration (0, 125, or 250 ⁇ g / ml), and the combination with the total protein concentration derived from the composition in the maintenance medium is as follows. It was added so as to have the combination shown in Table 3.
  • the mesenchymal stem cells were cultured for 14 days at 37 ° C. under a wet condition of 5% CO 2 . During the culture, the medium was changed every 3 or 4 days. On the 7th day after the start of differentiation, the expression of alkaline phosphatase was confirmed for each sample by staining with a staining kit (TRACP & ALP double-stain Kit, Takara Bio, Cat. No .: MK300). bottom. Negative control was carried out in the same manner except that only the maintenance medium was added instead of the differentiation medium. The result is shown in FIG.
  • TRACP & ALP double-stain Kit Takara Bio, Cat. No .: MK300
  • FIG. 3 shows a stained image of ALP. As shown in FIG. 3, it was confirmed that all the samples were ALP positive and the differentiation into osteoblasts was induced. In addition, when the composition of the present invention was added to the maintenance medium or the differentiation medium, the mesenchymal stem cells after culturing were compared with the case where the composition of the present invention was not added to the maintenance medium and the differentiation medium, and compared with the negative control. ALP was strongly stained, suggesting that differentiation into osteoblasts was promoted.
  • FIG. 4 shows a stained image of calcium.
  • calcium was hardly stained in the sample and the negative control to which the composition of the present invention was not added to either the maintenance medium or the differentiation medium.
  • the sample to which the composition of the present invention was added to at least one of the maintenance medium and the differentiation medium it was confirmed that calcium was stained and the formation of the bone substrate occurred. That is, it was found that the composition of the present invention promoted differentiation into osteoblasts.
  • the calcium ion concentration in the medium was measured on the 10th, 14th and 18th days after the start of differentiation.
  • the calcium ion concentration in the medium was measured using an ion-selective electrode (BIOPROFILE (registered trademark) FLEX, manufactured by NOVA BIOMEDICAL).
  • the calcium ion concentration in the medium at the start of culture was 0.88 mmol / l.
  • FIG. 5 is a graph showing the calcium ion concentration in the medium.
  • the horizontal axis shows the total protein concentration derived from the composition in the maintenance medium and the differentiation medium, and the measured value of the calcium ion concentration on each measurement day, and the vertical axis shows the calcium ion concentration.
  • the sample to which the composition of the present invention was added had a calcium ion concentration equal to or lower than that of the sample to which the composition of the present invention was not added.
  • the sample to which the composition of the present invention was added had a significantly lower calcium ion concentration than the sample to which the composition of the present invention was not added.
  • the sample to which the composition of the present invention was added had a calcium ion concentration equal to or lower than that of the sample to which the composition of the present invention was not added. From these results, it was found that the addition of the composition of the present invention promotes the differentiation into osteoblasts and osteoocytes at an early stage, and the uptake of calcium in the medium is started at an earlier stage. From these results, it was found that the composition of the present invention has an activity of promoting differentiation into osteoblasts.
  • composition of the present invention has a cell proliferation promoting activity and an osteoblast differentiation promoting activity.
  • FIG. 6 is a graph showing the proliferative activity of cells.
  • (A) shows the proliferation activity
  • (B) shows the doubling time.
  • the horizontal axis represents the total protein concentration derived from the composition
  • the vertical axis represents the relative value of the growth activity.
  • the horizontal axis represents the total protein concentration derived from the composition
  • the vertical axis represents the doubling time.
  • the composition of the present invention when added, the proliferative activity of mesenchymal stem cells increases depending on the total protein concentration derived from the composition, and in particular, the total protein concentration is 31.
  • the proliferative activity of mesenchymal stem cells was remarkably increased.
  • the doubling time after the third passage was 17 hours in the mesenchymal stem cells to which the composition was not added.
  • the doubling time of the mesenchymal stem cells was extended by about 1.5 times.
  • the composition of the present invention when the composition of the present invention is added, it is necessary for mesenchymal stem cells to proliferate once, depending on the total protein concentration derived from the composition.
  • the composition of the present invention was cultured in a medium to which no addition was added, the doubling time of the mesenchymal stem cells was extended when the number of passages was obtained.
  • the composition of the present invention was added, the elongation of the doubling time was almost suppressed, and this effect was remarkable when the total protein concentration derived from the composition was 31.3 ⁇ g / ml or more. there were. Therefore, it was found that the composition of the present invention can exhibit cell growth promoting activity and suppress a decrease in growth activity.
  • Example 2 (2) Confirmation of differentiation promoting activity
  • the mesenchymal stem cells were maintained and cultured in the same manner as in Example 2 (1).
  • the medium of each well was replaced with an equal amount of differentiation medium (0th day after the start of differentiation).
  • As the differentiation medium a composition prepared from platelet-removed megakaryocyte culture 2 was frozen and then thawed in a mesenchymal stem cell osteoblast differentiation medium.
  • the composition has a total protein concentration derived from the composition in the differentiation medium at a predetermined concentration (0, 0.2, 1.3, 31.3, 62.5, or 125 ⁇ g / ml) and is in the maintenance medium.
  • the combination with the total protein concentration derived from the composition was added so as to be the combination shown in Table 4 below.
  • Example 1 (6) After the sowing, the cells were cultured in the same manner as in Example 1 (6). Next, on the 14th and 18th days after the start of differentiation, the formation of bone matrix was confirmed by staining each sample with calcium in the same manner as in Example 1 (6). The results are shown in FIGS. 7 and 8.
  • FIGS. 7 and 8 show a stained image of calcium.
  • calcium was hardly stained in the sample and the negative control to which the composition of the present invention was not added to either the maintenance medium or the differentiation medium.
  • the sample to which the composition of the present invention was added to at least one of the maintenance medium and the differentiation medium it was confirmed that calcium was stained and the formation of the bone substrate occurred. That is, it was found that the composition of the present invention promoted differentiation into osteoblasts.
  • FIG. 9 is a graph showing the calcium ion concentration in the medium.
  • the horizontal axis shows the total protein concentration derived from the composition in the maintenance medium and the differentiation medium, and the measured value of the calcium ion concentration on each measurement day, and the vertical axis shows the calcium ion concentration.
  • the sample to which the composition of the present invention was added had a calcium ion concentration equal to or lower than that of the sample to which the composition of the present invention was not added.
  • the sample to which the composition of the present invention was added had a significantly lower calcium ion concentration than the sample to which the composition of the present invention was not added, and in particular, the differentiation medium.
  • the total protein concentration derived from the composition in was remarkable in the sample of 1.3 ⁇ g / ml.
  • the sample to which the composition of the present invention was added had a calcium ion concentration equal to or lower than that of the sample to which the composition of the present invention was not added. From these results, it was found that the addition of the composition of the present invention promotes the differentiation into osteoblasts and osteoocytes at an early stage, and the uptake of calcium in the medium is started at an earlier stage.
  • the activity of promoting differentiation into osteoblasts by the composition of the present invention can be obtained even under the condition that the total protein concentration derived from the composition is as low as 0.2 ⁇ g / ml. From these results, it was found that the composition of the present invention has an activity of promoting differentiation into osteoblasts.
  • composition of the present invention has a cell proliferation promoting activity and an osteoblast differentiation promoting activity.
  • BMMSC Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • PromoCell Cat No. C-12974
  • Medium exchange was performed by exchanging 2/3 of the medium with fresh medium every 3 days.
  • the basal medium of BMMSC was DMEM medium (low-glucose) containing 10% FBS and 1% antibacterial agent (Ab).
  • the composition derived from the platelet-removed megakaryocyte culture prepared in Example 1 (4) had a total protein concentration derived from the composition in the basal medium set to a predetermined concentration (0, 125). , 250, or 500 ⁇ g / ml). Then, on the 3, 5, or 7th day after the addition of the composition, the cell count was attached using a cell count kit (WST8, Cell Counting Kit-8, Dojindo, Cat No. 347-07621). Calculated using the protocol of. The ALP activity was examined by measuring the absorbance at 405 nm using p-nitrophenyl phosphat (SIGMAFAST TM p-nitrophenyl phosphat tablet, SIGMA, Cat No. N1891). Then, the ALP activity value per cell was calculated. These results are shown in FIGS. 10 and 11.
  • FIG. 10 is a graph showing the number of cells.
  • the horizontal axis indicates the number of days after the addition of the composition, and the vertical axis indicates the number of cells.
  • the concentration in the figure indicates the total protein concentration (hereinafter, the same applies).
  • FIG. 10 when cultured in a medium containing the composition of the present invention, cell proliferation was promoted in a concentration-dependent manner. .. In the group to which 500 ⁇ g / ml was added, the number of cells decreased on the 7th day, because it became confluent on the 5th day.
  • FIG. 11 is a graph showing ALP activity.
  • the horizontal axis indicates the number of days after the addition of the composition, and the vertical axis indicates the ALP activity (absorbance OD405).
  • the horizontal axis indicates the number of days after the addition of the composition, and the vertical axis indicates the ALP activity (ALP activity value per cell number).
  • ALP activity value per cell number As shown in FIG. 11B, in the case of well units, ALP activity was maximized on day 5 and decreased on day 7.
  • FIG. 11 (A) in the case of cell units, the ALP activity decreased with time under any culture condition.
  • MSC MSC, ALP activity increases over time because differentiation progresses with proliferation.
  • composition of the present invention exhibits cell growth promoting activity.
  • the medium of each well is replaced with the basal medium or the basal medium (differentiation medium) containing 100 ⁇ g / ml ascorbic acid as an osteoblast differentiation factor and the composition, and the cells are cultured for 2 weeks. By doing so, osteoblasts were induced.
  • Medium exchange was performed by exchanging 2/3 of the medium with fresh medium every 3 days.
  • the composition was added so that the total protein concentration derived from the composition in the basal medium was a predetermined concentration (0, 125, 250, or 500 ⁇ g / ml).
  • the composition derived from the platelet-depleted megakaryocyte culture prepared in Example 1 (4) was used as the composition.
  • the cell number and ALP activity were measured on the 7th, 10th or 14th day based on the induction start date.
  • the cell number was calculated using the attached protocol using the cell number counting kit.
  • the ALP activity was examined by measuring the absorbance at 405 nm using p-nitrophenyl phosphat (SIGMAFAST TM p-nitrophenyl phosphat tablet, SIGMA, Cat No. N1891). Then, the ALP activity value per cell was calculated.
  • FIG. 12 is a graph showing the number of cells.
  • the horizontal axis indicates the number of days after the start of induction of osteoblast differentiation
  • the vertical axis indicates the number of cells.
  • FIG. 12 (A) in the case of no osteoblast differentiation factor, when cultured in a medium containing the composition of the present invention, an increase in the number of cells with time was observed.
  • FIG. 12 (B) when the osteoblast differentiation factor was contained, the decrease in the number of cells over time was suppressed in a concentration-dependent manner when cultured in the medium containing the composition of the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing ALP activity.
  • the horizontal axis represents the number of days after the start of osteoblast differentiation induction, and the vertical axis represents ALP activity (absorbance OD405).
  • the horizontal axis indicates the number of days after the addition of the composition, and the vertical axis indicates the ALP activity (ALP activity value per cell number).
  • the activity of ALP increases with time, but the activity of the present invention is increased.
  • the composition of the present invention can promote the induction of osteoblast differentiation even in the osteoblast differentiation induction system by ascorbic acid. It was also found that the composition of the present invention promotes the induction of differentiation into osteoblasts induced by osteoblast differentiation factors. Therefore, it can be said that the composition of the present invention has an activity of promoting differentiation into osteoblasts.
  • composition of the present invention promotes bone formation and bone formation in vivo.
  • a model in which bone formation was performed on the skull of a nude mouse was used.
  • the composition of the present invention was applied to a nude mouse (8-week-old BALB / cAJCL-nu / nu) on the skull (subperiosteum) under general anesthesia (mixture of 3 types) together with an artificial bone material. It was used as a transplant sample and transplanted. Specifically, the following four groups were set.
  • ⁇ Negative control group (n 5)
  • Transplant samples prepared from only 25 mg ⁇ -TCP ( ⁇ -tricalcium phosphate) granules ( ⁇ -TCP granules, OSferion G1, manufactured by Oympus Terumo) were transplanted.
  • Platelet-rich plasma was prepared by preparing a transplant sample from the peripheral blood of a mouse and using a concentrate of platelets so as to have a concentration 6 times the platelet concentration in the peripheral blood, and transplanted.
  • Each artificial bone material was prepared as follows. ⁇ Negative control group On a dappen glass, mix 25 ⁇ l of sterilized TCP with 50 ⁇ l bovine fibrinogen (10 mg / ml) (Sigma, F8630) and add 5 ⁇ l bovine thrombin (100 U / ml) (Sigma, T9549) to gel. rice field. These steps were performed in the animal center for immediate transplantation after gelation. -Positive control group In a low protein adsorbing tube, 100 ⁇ l of the platelet-rich plasma (PRP) was impregnated into 25 mg of ⁇ -TCP granules.
  • PRP platelet-rich plasma
  • Example 4A In a low protein adsorptive tube, 8 ⁇ l of the composition of the invention was mixed with 32 ⁇ l of sterile water (DW) and then impregnated with 25 mg TCP. After the impregnation, the mixture was mixed with 10 ⁇ l fibrinogen (10 mg / ml), and 5 ⁇ l thrombin (100 U / ml) was added for gelation. These steps were performed in the animal center for immediate transplantation after gelation.
  • Example 4B In a low protein adsorptive tube, 40 ⁇ l of the composition of the invention was impregnated with 25 mg TCP. After the impregnation, the mixture is mixed with 10 ⁇ l fibrinogen (10 mg / ml), and 5 ⁇ l thrombin (100 U / ml) is added to gel. These steps were performed in the animal center for immediate transplantation after gelation.
  • the transplanted sample including the surrounding skull was removed 4 or 8 weeks after the transplantation, and then histological observation by HE staining was performed.
  • the amount of bone formation and the amount of bone formation were examined by counting the regions where bone formation or bone growth occurred in pixel units using software (ImageJ).
  • the amount of bone formation was the new bone portion newly formed in the transplanted sample, and the amount of bone formation was the target area of new bone, bone marrow and artificial bone around it.
  • the amount of bone formation and the amount of bone growth were corrected by the amount of bone formation and the amount of bone growth in the negative control group.
  • FIG. 14 is a photograph showing bone formation.
  • each photograph is a photograph showing the results of Example 4A, Example 4B, positive control group and negative control group from the left. Further, in the photographs of each group, the upper row is a photograph taken with an objective lens having a magnification of 20 times, and the lower row is a photograph taken with an objective lens having a magnification of 100 times. It is a photograph.
  • FIGS. 14 (A) to 14 (C) in Examples 4 (A) and (B) and in the positive control, the bone is in the region shown in dark gray around the remaining portion of the light gray artificial bone. Was newly formed.
  • FIG. 15 is a graph showing the amount of bone formation and the amount of bone growth.
  • (A) shows the amount of bone formation
  • (B) shows the amount of bone growth.
  • the horizontal axis indicates the period after transplantation of the transplant material
  • the vertical axis indicates the amount of bone formation.
  • the horizontal axis indicates the period after transplantation of the transplant material
  • the vertical axis indicates the amount of bone growth.
  • Example 4A showed the same degree of new bone formation as the positive control group and bone marrow including bone marrow and artificial bone around the new bone from 4 to 8 weeks after transplantation. Admitted.
  • Example 4B bone formation and bone growth exceeding the positive control group were observed at 4 weeks after transplantation, but at 8 weeks after transplantation, bone formation and bone growth were similar to those of the positive control group. It was the amount of bone growth. It was presumed that this was because in Example 4B, a plateau of bone formation and bone growth similar to that of the positive control group and Example 4A had already been reached at 4 weeks after transplantation.
  • composition of the present invention has anti-inflammatory activity.
  • FIGS. 16 (A) and 17 (A) (1) Activation of immune cells Activation of immune cells was carried out as shown in FIGS. 16 (A) and 17 (A). Specifically, first, a 15 ng / ml anti-human CD3 antibody (eBioscience, Cat No .: 2045756) and a 5 ng / ml anti-human CD28 antibody (eBioscience, Cat No .: 1928813) were placed on a 24-well plate. ) was seeded and incubated overnight (about 12 hours) to solidify these antibodies on the plate. Peripheral blood mononuclear cells were then isolated from peripheral blood collected from volunteers using Ficoll (Histopaque® 1077, SigmaAldrich).
  • peripheral blood mononuclear cells were seeded on the 24-well plate at 2.5 ⁇ 106 cells / wel, and culture was started.
  • As the medium for the peripheral blood mononuclear cells an RPMI medium containing 10% FBS and 1% Ab (Cat No .: 20621736, manufactured by gibco) was used.
  • the composition (iMDF) was added to each well so that the total protein concentration derived from the composition in the medium became a predetermined concentration (0, 125, 250, or 500 ⁇ g / ml). bottom.
  • the composition derived from the platelet-depleted megakaryocyte culture prepared in Example 1 (4) was used.
  • the cells were further cultured for 1 hour or 3 hours.
  • the peripheral blood mononuclear cells were collected, and then Total RNA was extracted from the peripheral blood mononuclear cells using an mRNA extraction reagent (Trizol (registered trademark), manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • CDNA was synthesized using the obtained RNA and reverse transcriptase (SuperScript TM III First-Strand Synthesis System, manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • 16 and 17 are schematic diagrams and graphs showing the outline of the experiment and the expression level of the cytokine gene.
  • the horizontal axis indicates the type of sample, and the vertical axis indicates the relative expression level of each gene.
  • the composition of the present invention contains TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ and TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ by peripheral blood mononuclear cells in a concentration-dependent manner 3 hours after stimulation. The induction of IL-6 expression was suppressed.
  • FIGS. 17 (B) to 17 (E) the composition of the present invention contains TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ and TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ by peripheral blood mononuclear cells in a concentration-dependent manner 3 hours after stimulation. The induction of IL-6 expression was suppressed.
  • the composition of the present invention has TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL- by peripheral blood mononuclear cells in a concentration-dependent manner 1 hour after stimulation.
  • the induction of expression of 6 was suppressed.
  • the induction of IFN- ⁇ expression was not suppressed 1 hour after stimulation, but the induction of IFN- ⁇ expression was suppressed 3 hours after stimulation. Therefore, the IFN according to the composition of the present invention was used. It was found that the suppression of the expression induction of - ⁇ was effective at a later timing than that of other inflammatory cytokines.
  • the composition of the present invention suppresses the activation of immune cells such as T cells and the induction of their cytokine gene expression. By doing so, it was presumed to suppress it.
  • composition of the present invention promotes bone formation and bone formation at the site of skull defect in vivo.
  • OCP Octacalcium phosphate
  • Col Collagen
  • Example 6 8.25 ⁇ 10
  • a composition (total protein of about 25 mg) prepared from a platelet-depleted megakaryocyte culture corresponding to 8 platelet-rich plasma is impregnated and adsorbed on an OCP / Col carrier to prepare a transplant sample, and transplanted. bottom.
  • Each artificial bone material was prepared as follows. -Negative control group OCP granules (diameter 300-500 ⁇ m) and 3% porcine-derived telocolasen were mixed, and after the mixing, freeze-drying was performed. After the freeze-drying, thermal cross-linking was performed to prepare an OCP / Col carrier (OCP carrier, containing 77% OCP by weight; diameter 5 mm, thickness 1 mm). -Example 6 An OCP carrier was impregnated with 20 ⁇ l of the composition of the present invention (corresponding to 8.25 ⁇ 10 8 platelet-rich plasma) to obtain an OCP carrier containing the composition of the present invention.
  • the transplanted sample including the surrounding skull was removed at 4 or 8 weeks based on the time of transplantation to the defect site, and then ⁇ CT imaging was performed on the obtained removed part. After the imaging, a specimen was prepared from the excised part, and histological observation by HE staining or Masson trichrome staining and immunostaining were performed. In addition, the bone mass and bone mineral content of the bone reborn from the transplant material (new bone) and the bone mass of the bone reborn from the transplant material ( B ) with respect to the bone mass (BS) of the bone removed at the time of creating the defect site. The ratio to R ) ( BR / BS ) and bone density were evaluated.
  • FIG. 18 is a photograph showing bone formation at 4 weeks after transplantation.
  • the upper part of each photograph shows the negative control group
  • the lower part shows the result of the group of Example 6.
  • the photographs of each group from the left, it is a photograph of a cross section including the entire excised part, the left side of the defective part, the right side of the defective part, and the defective part of the excised part.
  • the group of Example 6 it was found that bone was newly formed at the defect site of the skull.
  • FIG. 19 is a graph showing bone mass, bone mineral mass, ratio of defective bone mass to new bone mass, and bone density at 4 weeks after transplantation.
  • (A) shows the bone mass
  • ( B ) shows the bone mineral mass
  • ( C ) shows the ratio of the defective bone mass to the new bone mass (BR / BS).
  • (D) shows the bone density.
  • the horizontal axis indicates the type of the experimental group
  • the vertical axis indicates the bone mass (BV) (cm 3 ).
  • FIG. 19B the horizontal axis indicates the type of the experimental group
  • the vertical axis indicates the bone mineral content (BMC) (mg).
  • BMC bone mineral content
  • the horizontal axis shows the type of the experimental group, and the vertical axis shows the ratio (%) of the missing bone mass and the new bone mass.
  • the horizontal axis indicates the type of the experimental group, and the vertical axis indicates the bone density BMD (mg / cm 3 ).
  • the bone mass, the bone mineral content, the ratio of the defective bone mass to the new bone mass, and the bone density were increased on both the left and right sides of the defective portion as compared with the negative control group. From the above, it was found that the composition of the present invention can newly form bone at the defect site of the skull.
  • composition of the present invention can induce bone formation and bone growth, and can promote bone formation and bone growth by increasing the content of the components thereof.
  • Appendix 1 A bone-forming composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof.
  • Appendix 2 The bone-forming composition according to Appendix 1, wherein the treated product is an extract of a cell fraction of a megakaryocyte or a culture thereof.
  • Appendix 3 The bone-forming composition according to Supplementary note 1 or 2, wherein the treated product contains 2000 to 20000 pg of basic fibroblast growth factor (bFGF) per 1 mg of total protein.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • (Appendix 10) The bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 9, wherein the treated product contains 0 to 1000 pg of bone-forming protein-7 (BMP-7) per 1 mg of total protein.
  • (Appendix 11) The bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 10, wherein the treated product contains 0 to 16 pg of ampphiregulin (AR) per 1 mg of total protein.
  • (Appendix 12) The bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 11, wherein the treated product contains 0 to 60 pg of epidermal growth factor receptor (EGFR) per 1 mg of total protein.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • (Appendix 13) The bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 12, wherein the treated product contains 0 to 100 pg of hepatocyte growth factor (HGF) per 1 mg of total protein.
  • (Appendix 14) The bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 13, wherein the treated product contains 0 to 200 pg of insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) per 1 mg of total protein.
  • IGFBP-1 insulin-like growth factor-binding protein-1
  • (Appendix 16) The bone-forming composition according to Appendix 15, wherein the cells are mesenchymal stem cells.
  • (Appendix 17) The bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 16, which has an ability to promote the differentiation of osteoblast progenitor cells into osteoblasts.
  • (Appendix 18) The bone-forming composition according to Appendix 17, wherein the osteoblast progenitor cells are mesenchymal stem cells.
  • (Appendix 19) The bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 18, wherein the culture of megakaryocytes is a culture from which platelets have been removed.
  • (Appendix 20) The bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 19, wherein the megakaryocyte is an immortalized megakaryocyte.
  • (Appendix 21) The bone-forming composition according to Appendix 20, wherein the immortalized megakaryocyte is a megakaryocyte containing an exogenous BMI1 gene, a MYC gene, and a Bcl-xL gene.
  • (Appendix 22) The bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 21, wherein the megakaryocyte is an in vitro -induced megakaryocyte.
  • (Appendix 23) The bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 22, wherein the megakaryocytes are derived from pluripotent cells.
  • (Appendix 24) 23 The bone-forming composition according to Appendix 23, wherein the pluripotent cells are induced pluripotent stem (iPS) cells.
  • iPS induced pluripotent stem
  • the processed product is Treat megakaryocytes or their cultures and The treatments are concentration treatment, drying treatment, freezing treatment, freeze-drying treatment, solvent treatment, surfactant treatment, enzyme treatment, protein fraction extraction treatment, sonication treatment, and / or crushing treatment, Appendix 1 to 24.
  • the bone-forming composition according to any one of. (Appendix 26)
  • the processed product is Platelets are removed from the megakaryocytes or culture thereof and 25.
  • the processed product is Preserving the platelet-depleted megakaryocytes or culture thereof, 26.
  • the bone-forming composition according to Appendix 26 which treats the preserved megakaryocytes or a culture thereof.
  • Appendix 28 The processed product is Preserve the megakaryocytes or cultures thereof and 27.
  • Appendix 29 Containing a bone-forming composition and a scaffolding material for bone-forming, The bone formation kit, wherein the bone formation composition is the bone formation composition according to any one of Supplementary note 1 to 28.
  • the scaffold material is collagen, gelatin, albumin, keratin, dextran, carboxymethyl cellulose, xanthan gum, chitosan, chondroitin sulfate, heparin, hyaluronic acid, polyglycolic acid, polylactic acid, polyglycolic acid and polylactic acid copolymer, polyhydroxy.
  • the kit according to Appendix 29 or 30, comprising at least one selected from the group consisting of butyric acid, polydioxanone, polycaprolactone, polybutylene succinate, calcium phosphate, hydroxyapatite, polyetherketone, and polyetheretherketone.
  • VEGF Vascular endothelial cell growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF hepatocellular growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • brain-derived Addendum 29 comprising at least one selected from the group consisting of neurotrophic factor (BDNF), growth differentiation factor-5 (GDF5), erythropoiesis promoting factor (EPO), transformed growth factor (TGF) and bone-forming protein.
  • BDNF neurotrophic factor
  • GDF5 growth differentiation factor-5
  • EPO erythropoiesis promoting factor
  • TGF transformed growth factor
  • bone-forming protein bone-forming protein
  • a composition for promoting osteoblast differentiation which comprises the bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 28.
  • Appendix 36 An immune cell activation inhibitory composition comprising a treated product of megakaryocytes or a culture thereof.
  • Appendix 37 The composition for suppressing activation of immune cells according to Appendix 36, wherein the treated product is an extract of a cell fraction of a megakaryocyte or a culture thereof.
  • Appendix 38 The immune cell activation inhibitory composition according to Supplementary note 36 or 37, wherein the treated product contains 2000 to 20000 pg of basic fibroblast growth factor (bFGF) per 1 mg of total protein.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • (Appendix 42) The immune cell activation inhibitory composition according to any one of Supplementary note 36 to 41, wherein the treated product contains 20 to 800 pg of vascular endothelial growth factor (VEGF) per 1 mg of total protein.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • (Appendix 43) The immune cell activation inhibitory composition according to any one of Supplementary note 36 to 42, wherein the treated product contains 20 to 400 pg of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) per 1 mg of total protein.
  • (Appendix 44) The immune cell activation inhibitory composition according to any one of Supplementary note 36 to 43, wherein the treated product contains 1000 to 10000 pg of differentiation growth factor-15 (GDF-15) per 1 mg of total protein.
  • GDF-15 differentiation growth factor-15
  • (Appendix 45) The immune cell activation inhibitory composition according to any one of Supplementary note 36 to 44, wherein the treated product contains 0 to 16 pg of amphiregulin (AR) per 1 mg of total protein.
  • (Appendix 46) The immune cell activation inhibitory composition according to any one of Supplementary note 36 to 45, wherein the treated product contains 0 to 60 pg of epidermal growth factor receptor (EGFR) per 1 mg of total protein.
  • (Appendix 47) The immune cell activation inhibitory composition according to any one of Supplementary note 36 to 46, wherein the treated product contains 0 to 100 pg of liver growth factor (HGF) per 1 mg of total protein.
  • HGF liver growth factor
  • (Appendix 48) The immune cell activation inhibitory composition according to any one of Supplementary note 36 to 47, wherein the treated product contains 0 to 200 pg of insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) per 1 mg of total protein. ..
  • (Appendix 49) The composition for suppressing activation of immune cells according to any one of Supplementary note 36 to 48, wherein the immune cells are T cells.
  • (Appendix 50) The composition for suppressing the activation of immune cells according to any one of Supplementary note 36 to 49, wherein the megakaryocyte is an immortalized megakaryocyte.
  • (Appendix 51) The composition for suppressing the activation of immune cells according to any one of Supplementary note 36 to 50, wherein the megakaryocyte is an in vitro -induced megakaryocyte.
  • (Appendix 52) An anti-inflammatory composition comprising the composition for suppressing the activation of immune cells according to any one of Supplementary note 36 to 51.
  • (Appendix 53) A method for promoting osteoblast differentiation using the bone-forming composition according to any one of Supplementary note 1 to 28.
  • (Appendix 54) The method for promoting osteoblast differentiation according to Appendix 53, wherein the bone-forming composition is used in vitro or in vivo .
  • (Appendix 55) A method for promoting osteoblast differentiation using the osteoblast differentiation promoting composition according to Appendix 35.
  • (Appendix 56) The method for promoting osteoblast differentiation according to Appendix 55, wherein the osteoblast differentiation promoting composition is used in vitro or in vivo .
  • (Appendix 57) A method for suppressing the activation of immune cells, which comprises the composition for suppressing the activation of immune cells according to any one of Supplementary note 36 to 51.
  • (Appendix 58) The method for promoting osteoblast differentiation according to Appendix 57, wherein the immune cell activation inhibitory composition is used in vitro or in vivo .
  • (Appendix 59) A method for suppressing inflammation using the anti-inflammatory composition according to Appendix 52.
  • (Appendix 60) The method for suppressing inflammation according to Appendix 59, wherein the anti-inflammatory composition is used in vitro or in vivo .
  • (Appendix 61) A composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use for bone formation.
  • (Appendix 62) A composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use in promoting the differentiation of osteoblasts.
  • (Appendix 63) A composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use for suppressing the activation of immune cells.
  • (Appendix 64) A composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use for suppressing inflammation.
  • the present invention it is possible to provide a composition having reticular cell-derived bone-forming activity.
  • the composition of the present invention has, for example, a cell proliferation promoting activity and an osteoblast differentiation promoting activity. Therefore, the present invention is extremely useful in the fields of pharmaceuticals, regenerative medicine, and the like.

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Abstract

細胞由来の生理活性を有する組成物を提供する　本発明の骨形成組成物は、巨核球またはその培養物の処理物を含む。

Description

骨形成組成物およびその用途
　本発明は、骨形成組成物およびその用途に関する。
　再生医療用の治療薬として、間葉系幹細胞等の組織再生を促す細胞を細胞製剤として開発することが試みられている。また、前記組織再生を促す細胞は、成長因子等の生理活性を有するタンパク質を放出することにより、組織再生を促進していると考えられている。
　また、歯科領域の再生医療では、骨増生（造成）治療等において、多血小板血漿が用いられている。しかしながら、多血小板血漿は、単離されたヒトの血液から分離および遠心濃縮で調製するため、血小板数が統一されておらず、その効能が不明である。
　そこで、本発明は、細胞由来の骨形成活性を有する組成物を提供することを目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の骨形成組成物（以下、「組成物」ともいう）は、巨核球またはその培養物の処理物を含む。
　本発明の骨形成キット（以下、「キット」ともいう）は、骨形成組成物と、骨形成の足場材料とを含み、前記骨形成組成物は、本発明の骨形成組成物である。
　本発明によれば、細胞由来の骨形成活性を有する組成物を提供できる。
図１は、実施例１における濃縮システムの構成を示す模式図である。 図２は、実施例１における細胞の増殖活性を示すグラフであり、（Ａ）は、増殖活性の相対値を示し、（Ｂ）は、倍加時間を示す。 図３は、実施例１におけるアルカリフォスファターゼの染色像を示す写真である。 図４は、実施例１におけるカルシウムの染色像を示す写真である。 図５は、実施例１における培地中のカルシウムイオン濃度を示すグラフである。 図６は、実施例２における細胞の増殖活性を示すグラフであり、（Ａ）は、増殖活性の相対値を示し、（Ｂ）は、倍加時間を示す。 図７は、実施例２におけるカルシウムの染色像を示す写真である。 図８は、実施例２におけるカルシウムの染色像を示す写真である。 図９は、実施例２における培地中のカルシウムイオン濃度を示すグラフである。 図１０は、実施例３における細胞数を示すグラフである。 図１１は、実施例３におけるＡＬＰ活性を示すグラフである。 図１２は、実施例３における細胞数を示すグラフである。 図１３は、実施例３におけるＡＬＰ活性を示すグラフである。 図１４は、実施例４における骨形成を示す写真である。 図１５は、実施例４における骨形成量または骨増生量を示すグラフである。 図１６は、実施例５における実験の概要およびサイトカイン遺伝子の発現量を示す模式図およびグラフである。 図１７は、実施例５における実験の概要およびサイトカイン遺伝子の発現量を示す模式図およびグラフである。 図１８は、実施例６における移植後４週目における、骨形成を示す写真である。 図１９は、実施例６における移植後４週目における、骨量、骨塩量、欠損骨量と新生骨量との比、および骨密度を示すグラフである。
＜骨形成組成物＞
　本発明の骨形成組成物は、前述のように、巨核球またはその培養物の処理物を含む。本発明の組成物は、巨核球またはその培養物の処理物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の組成物によれば、例えば、細胞由来の生理活性を有する組成物を提供できる。本発明の組成物によれば、例えば、骨芽細胞への分化を促進することにより、骨形成を誘導できる。
　本発明において、「骨形成」は、既にある骨が増えること、すなわち、「骨増生」（骨造成）でもよいし、新たに骨が形成されること、すなわち、「骨新生」でもよいし、喪失（欠損）された骨またはその部分が回復すること、すなわち、「骨再生」のいずれの意味で用いてもよい。このため、本発明の骨形成組成物は、骨増生（骨造成）組成物、骨新生組成物、および／または骨再生組成物ということもできる。
　本発明の組成物は、後述するように、骨芽細胞の分化誘導を促進、加速（誘導促進）、亢進、増強、および／または強化することにより、骨形成を誘導すると推定される。このため、本発明の組成物は、骨芽細胞の分化誘導を促進、加速（誘導促進）、亢進、増強、および／または強化組成物ということもでき、また、骨形成の誘導、促進、加速（誘導促進）、亢進、増強、および／または強化組成物ということもできる。
　本発明において、「巨核球」は、生体内においては骨髄中に存在する最大の細胞であり、血小板を放出する細胞および同等の機能を有する細胞を意味する。前記同等の機能を有する細胞は、血小板の産生能を有する細胞を意味する。本発明において、巨核球は、多核化（多倍体化）前の巨核球、すなわち、未成熟な巨核球または増殖期の巨核球でもよいし、多核化後の巨核球（多核化巨核球）でもよい。具体例として、前記巨核球は、例えば、前巨核芽球、巨核芽球、前巨核球、および成熟巨核球のいずれでもよい。前記多核化後の巨核球が有する染色体のセット数は、２セットを超えればよく、具体例として、１６～３２セットである。
　前記巨核球の由来は、特に制限されないが、例えば、ヒトおよび非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、サル、ゴリラ、チンパンジー、マーモセット等の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ウマ、モルモット等があげられる。前記巨核球の由来は、例えば、本発明の組成物の投与対象と同じでもよいし、異なってもよい。
　本発明において、前記巨核球は、細胞表面マーカーにより特定できる。前記巨核球がヒト由来の場合、前記細胞表面マーカーは、CD41a、CD42aおよびCD42bがあげられる。すなわち、前記巨核球は、CD41a、CD42aおよびCD42bが陽性の細胞である。前記巨核球がヒト由来の場合、前記細胞表面マーカーは、例えば、CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131、およびCD203cからなる群から選択された少なくとも１つであってもよい。
　前記巨核球は、生体から単離した巨核球でもよいし、多能性細胞等の巨核球より未分化な細胞（以下、「前駆細胞」ともいう）から誘導された巨核球でもよい。前記「巨核球より未分化な細胞」は、前記巨核球への分化能を有する細胞を意味する。
　前記巨核球が生体から単離した巨核球である場合、前記巨核球は、例えば、骨髄中に存在するため、骨髄から単離できる。この場合、前記巨核球は、生体由来の他の細胞を含んでもよい。
　前記巨核球が前駆細胞から誘導された巨核球である場合、前記巨核球は、後述のように、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導できる。この場合、前記巨核球は、前記前駆細胞を含んでもよい。前記前駆細胞は、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、ＣＤ３４陽性細胞、巨核球・赤芽球前駆細胞（megakaryocyte-erythroid progenitor：MEP）、巨核球前駆細胞等があげられる。前記前駆細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血等から単離してもよいし、ＥＳ細胞（胚性幹細胞、embryonic stem cells）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells、iPS細胞）、核移植ＥＳ細胞（ntES細胞）、生殖性幹細胞、体性幹細胞、胚性腫瘍細胞等の多能性細胞から誘導してもよい。
　前記巨核球が前駆細胞から誘導された巨核球である場合、前記巨核球は、不死化巨核球が好ましい。前記不死化巨核球は、例えば、他の巨核球の誘導方法により誘導された巨核球と比較して、細胞の分化段階の均質性が高いため、得られた処理物における成分組成の変動を抑制できる。前記不死化巨核球は、例えば、後述のように、前記前駆細胞に、癌遺伝子およびポリコーム遺伝子、または、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、およびアポトーシス抑制遺伝子を導入することにより誘導される巨核球である。
　前記「癌遺伝子」は、生体内で細胞の癌化を誘導可能な遺伝子を意味し、例えば、ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、Ｌ－ＭＹＣ等のＭＹＣファミリー遺伝子、ＳＲＣファミリー遺伝子、ＲＡＳファミリー遺伝子、ＲＡＦファミリー遺伝子、ｃ－ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＰＤＧＦＲ（血小板成長因子受容体）、Ａｂｌ（Abelson murine leukemia viral oncogene homolog）等のプロテインキナーゼファミリー遺伝子等があげられる。
　前記「ポリコーム遺伝子」は、ＣＤＫＮ２ａ（サイクリン依存性キナーゼ阻害２Ａ、ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ）を負に制御し、細胞老化を回避するために機能すると知られている遺伝子を意味する（下記参考文献１～３）。具体例として、前記ポリコーム遺伝子は、例えば、BMI1（Polycomb complex protein BMI-1、polycomb group RING finger protein 4 (PCGF4)、RING finger protein 51 (RNF51)）、Mel18（Polycomb group RING finger protein 2）、Ring（Ring Finger Protein）1a/b、Phc（Polyhomeotic Homolog）1/2/3、Cbx（Chromobox）2/4/6/7/8、Ezh2（Enhancer Of Zeste 2 Polycomb Repressive Complex 2 Subunit）、Eed（Embryonic Ectoderm Development）、Suz12（SUZ12 Polycomb Repressive Complex 2 Subunit）、HADC（Histone deacetylases）、Dnmt（DNA (cytosine-5)-methyltransferase）1/3a/3b等があげられる。
参考文献１：小黒秀行ら、「ポリコーム群蛋白複合体による幹細胞の老化制御」、再生医療、２００７年、第６巻、第４号、２６－３２頁
参考文献２：Jesus Gil et.al, “ Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all”, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2007, vol.7, pages 667-677
参考文献３：Soo-Hyun Kim et.al., “ Absence of p16INK4a and truncation of ARF tumor suppressors in chickens”, PNAS, 2003, vol.100, No.1, pages 211-216
　前記「アポトーシス抑制遺伝子」は、細胞のアポトーシスを抑制可能な機能を有する遺伝子を意味し、例えば、BCL2（B-cell lymphoma 2）、Bcl-xL（B-cell lymphoma-extra large）、Survivin（Baculoviral IAP Repeat Containing 5）、MCL1（BCL2 Family Apoptosis Regulator）等があげられる。
　前記不死化巨核球は、外来性のＢＭＩ１遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、およびＢｃｌ－ｘＬ遺伝子を含む巨核球であることが好ましい。前記「外来性」は、細胞外から細胞内に導入されたことを意味する。前記外来性の遺伝子は、前記細胞の染色体上に存在してもよいし、核または細胞質内に存在してもよい。前記外来性の遺伝子は、例えば、当該遺伝子の数を測定することにより検出できる。前記遺伝子が常染色体上の遺伝子の場合、前記遺伝子は、各常染色体上に１つ存在するため、１つの細胞には、２つの遺伝子が存在する。このため、前記外来性の遺伝子が存在しないと、前記遺伝子は、１つの細胞において２つ検出される。他方、前記外来性の遺伝子が存在する場合、前記遺伝子は、１つの細胞において３つ以上検出される。この場合、前記外来性の遺伝子は、例えば、プライマーを用いたＰＣＲ、プローブ、またはこれらの組合せ等を用いて検出できる。前記外来性の遺伝子がタグ配列や選択マーカーを有する場合、前記外来性の遺伝子の検出は、前記タグ配列の検出または選択マーカーの検出により実施してもよい。また、前記外来性の遺伝子は、例えば、前記遺伝子から翻訳されるタンパク質に対して、抗体等を用いて検出できる。
　前記巨核球の培養物は、例えば、前記巨核球を培養することにより生産される培養物である。前記巨核球の培養は、例えば、後述のように、培地の存在下、前記巨核球を培養することにより実施できる。
　前記巨核球の培養物は、前記巨核球を培養して得られる物であるため、例えば、細胞成分として、前記巨核球および巨核球から産生される血小板を含む混合物である。前記細胞成分は、細胞および血小板を意味する。前述のように、前記巨核球は、前記巨核球より未分化な細胞より誘導できる。このため、前記巨核球の培養物を生産するための巨核球として、前記巨核球より未分化な細胞より誘導された巨核球を含む場合、前記巨核球の培養物は、前記巨核球より未分化な細胞を含んでもよい。
　本発明において、前記巨核球の培養物は、前記巨核球を培養して得られた培養物そのものでもよいし、前記培養物を加工したものでもよい。前記培養物の加工は、例えば、液体画分の除去、細胞成分画分の抽出、血小板を含む細胞成分の組成の変更等があげられる。前記細胞成分の組成の変更は、例えば、前記混合物における細胞および／または血小板の除去、前記混合物における細胞および／または血小板の抽出、前記混合物への細胞および／または血小板の追加等があげられる。
　前記「血小板」は、血液中の細胞成分の一つであり、CD41aおよびCD42bが陽性である細胞成分を意味する。前記血小板は、例えば、細胞核を有さず、また、前記巨核球と比較して、大きさが小さい。このため、前記血小板と前記巨核球とは、例えば、細胞核の有無および／または大きさにより区別できる。前記血小板は、血栓形成と止血において重要な役割を果たすとともに、損傷後の組織再生や炎症の病態生理にも関与することが知られている。また、前記血小板は、出血等により血小板が活性化されると、その膜上にIntegrin αIIBβ3（glycoprotein IIb/IIIa; CD41aとCD61の複合体）等の細胞接着因子の受容体が発現することが知られている。また、前記血小板が活性化されると、血小板同士が凝集し、血小板から放出される各種の血液凝固因子によってフィブリンが凝固することにより、血栓が形成され、止血が進む。本発明において、前記血小板の由来は、前記巨核球の由来と同じである。
　本発明において、前記処理物は、前記巨核球から調製してもよいし、前記巨核球の培養物から調製してもよい。また、前記巨核球の培養物から調製する場合、前記巨核球の培養物は加工されてもよい。具体例として、前記処理物は、例えば、前記巨核球またはその培養物の細胞画分の処理物でもよいし、前記巨核球またはその培養物を加工した加工物の処理物でもよい。前記処理物の調製における処理は、特に制限されず、例えば、濃縮処理等の細胞成分の密度を変更する処理；乾燥処理、凍結処理、凍結乾燥処理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理、タンパク質画分抽出処理等の細胞の成分を抽出する抽出処理；磨砕処理、粉砕処理等の破砕処理；等があげられる。前記処理物の具体例としては、例えば、前記巨核球またはその培養物の濃縮物、乾燥物、凍結物、凍結乾燥物、溶媒処理物、界面活性剤処理物、酵素処理物、タンパク質分画物、超音波処理物等の抽出物；磨砕処理物、粉砕処理物等の破砕処理物；前記巨核球またはその培養物の細胞画分の濃縮物、乾燥物、凍結物、凍結乾燥物、溶媒処理物、界面活性剤処理物、酵素処理物、タンパク質分画物、超音波処理物の抽出物；磨砕処理物、粉砕処理物等の破砕処理物；等があげられる。前記処理物は、１種類の処理物から構成されてもよいし、２種類以上の処理物の混合物でもよい。前記混合物は、特に制限されず、任意の処理物の組み合わせおよび比率で混合した混合物とすることができる。
　前記処理物は、例えば、１以上の成長因子および成長因子受容体の少なくとも一方を含む。また、前記処理物は、例えば、細胞の増殖促進活性、骨芽細胞の分化促進活性等の生理活性を有する。さらに、前記処理物は、例えば、前述のように、前記巨核球またはその培養物を処理することにより製造できる。このため、本発明において、前記処理物は、例えば、下記条件（１）～（３）を用いて規定できる。前記処理物は、例えば、下記条件（１）～（３）のいずれかにより規定されてもよいし、複数の条件により規定されてもよいし、全ての条件により規定されてもよい。具体例として、前記処理物は、例えば、条件の組合せにより規定できる。
（条件）
（１）成長因子および／または成長因子受容体の含有量；
（２）処理物の生理活性；
（３）処理物の製造方法
（条件の組合わせ）
条件（１）、（２）、または（３）；
条件（１）および（２）、条件（１）および（３）、または条件（２）および（３）；
条件（１）、（２）、および（３）
（１）条件（１）
　条件（１）は、前述のように、成長因子および／または成長因子受容体の含有量に関する条件である。前記条件（１）は、前記成長因子の含有量または前記成長因子受容体の含有量を規定してもよいし、前記成長因子の含有量および前記成長因子受容体の含有量を規定してもよい。また、前記条件（１）の規定に用いる成長因子は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。前記条件（１）の規定に用いる成長因子受容体は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。
　前記条件（１）において、前記成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ－１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－２（ＩＧＦＢＰ－２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－３（ＩＧＦＢＰ－３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－６（ＩＧＦＢＰ－６）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、内分泌腺由来血管内皮増殖因子（ＥＧ－ＶＥＧＦ）、分化増殖因子－１５（ＧＤＦ－１５）、アンフィレグリン（ＡＲ）、骨形成タンパク質－５（ＢＭＰ－５）、骨形成タンパク質－７（ＢＭＰ－７）、肝臓増殖因子（ＨＧＦ）、ＴＧＦβ１（トランスフォーミング成長因子β１）等があげられる。
　前記条件（１）において、前記成長因子受容体は、幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）等があげられる。
　前記含有量は、例えば、前記処理物における各成長因子および各成長因子受容体の重量でもよいし、前記処理物の総タンパク質の重量に対する各成長因子および各成長因子受容体の重量（総タンパク質あたりの含有量）でもよいが、後者が好ましい。
　前記総タンパク質の重量は、例えば、ＢＣＡタンパク質定量法により決定できる。前記ＢＣＡタンパク質定量法は、１価の銅イオンと、２分子のビシンコニン酸との配位結合を利用したタンパク質の定量方法である。前記ＢＣＡタンパク質定量法に供するサンプルは、例えば、還元剤および／または銅イオンのキレート剤を含まないことが好ましい。前記ＢＣＡタンパク質定量法は、下記参考文献４に準じて実施でき、例えば、市販のキット等を用いてもよい。前記ＢＣＡタンパク質定量法のキットとしては、Pierce（商標） BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社製）等が利用できる。
参考文献４：長谷　俊治ら、「やさしい原理からはいるタンパク質科学実験法1 タンパク質をつくる 抽出・精製と合成」、化学同人、2008年12月13日
　前記処理物における総タンパク質濃度は、例えば、処理に供する細胞数と、処理物における溶媒の体積により適宜設定できる。前記処理物における総タンパク質濃度は、例えば、前記処理に供する細胞数を増加させる、前記処理物における溶媒の体積を低減する、または前記巨核球から抽出することにより、前記処理物における総タンパク質濃度を相対的に高くできる。また、前記処理物における総タンパク質濃度は、例えば、前記処理に供する細胞数を低減する、前記処理物における溶媒の体積を増加させる、または前記巨核球の培養物から抽出することにより、前記処理物における総タンパク質濃度を相対的に低くできる。具体例として、前記処理に供する細胞数が１×１０８細胞であり、前記処理物における溶媒の体積が１００μｌの場合、前記処理物における総タンパク質濃度は、例えば、０．１～２００ｍｇ／ｍｌである。前記溶媒は、例えば、後述の水性溶媒である。
　前記成長因子および成長因子受容体の重量は、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定できる。前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、下記参考文献５に準じて実施でき、例えば、市販のキット等を用いてもよい。前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法のキットとしては、Quantibody（登録商標） Human Growth Factor Array 1（RayBiotech社製）等が利用できる。
参考文献５：生物化学的測定研究会編集、「免疫測定法　基礎から先端まで」、講談社、２０１４年１２月２０日
　前記処理物における前記成長因子の含有量および成長因子受容体の含有量としては、例えば、以下の例が挙げられる。
　前記成長因子がｂＦＧＦの場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、２０００～２００００ｐｇ、５０００～２００００ｐｇ、または１００００～２００００ｐｇのｂＦＧＦを含む。前記処理物は、例えば、ｂＦＧＦを含有することにより、後述のように、細胞増殖の促進活性および骨芽細胞への分化促進活性を示す。
　前記成長因子がＩＧＦＢＰ－１の場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、０～２００ｐｇ、０．０１～２００ｐｇ、０．０１～１００ｐｇ、または０．０１～５０ｐｇのＩＧＦＢＰ－１を含む。
　前記成長因子がＩＧＦＢＰ－２の場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、８０００～８００００ｐｇ、１００００～８００００ｐｇ、または２００００～８００００ｐｇのＩＧＦＢＰ－２を含む。
　前記成長因子がＰＩＧＦの場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、１～６０ｐｇ、１～３０ｐｇ、または１～２０ｐｇのＰＩＧＦを含む。
　前記成長因子がＶＥＧＦの場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～８００ｐｇ、２０～６００ｐｇ、または２０～４００ｐｇのＶＥＧＦを含む。
　前記成長因子がＧＤＦ－１５の場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、１０００～１００００ｐｇ、１０００～５０００ｐｇ、または２０００～５０００ｐｇのＧＤＦ－１５を含む。
　前記成長因子がＡＲの場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１６ｐｇ、０．０１～１６ｐｇ、０．１～１６ｐｇ、または１～１６ｐｇのＡＲを含む。
　前記成長因子がＨＧＦの場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１００ｐｇ、０．０１～１００ｐｇ、０．０１～５０ｐｇ、または０．０１～３０ｐｇのＨＧＦを含む。
　前記成長因子がＢＭＰ－７の場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１０００ｐｇ、０．０１～１０００ｐｇのＢＭＰ－７を含む。
　前記成長因子受容体がＳＣＦＲの場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、２００～２０００ｐｇ、３００～１５００ｐｇ、または４００～１０００ｐｇのＳＣＦＲを含む。
　前記成長因子受容体がＥＧＦＲの場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、０～６０ｐｇ、０．０１～６０ｐｇ、１～５０ｐｇ、１～４５ｐｇ、または１０～４０ｐｇのＥＧＦＲを含む。
　前記成長因子受容体がＶＥＧＦＲ２の場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～４００ｐｇ、５０～３５０ｐｇ、または１００～３００ｐｇのＶＥＧＦＲ２を含む。
　前記条件（１）は、前述のように、１または２種類以上の成長因子の含有量で規定してもよいし、１または２種類以上の成長因子受容体の含有量で規定してもよいし、これらの含有量を任意に組合わせて規定してもよい。この場合、前記条件（１）は、例えば、下記条件（Ａ１）～（Ａ９）および（Ｂ１）～（Ｂ３）からなる群から選択された少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の条件で規定される。具体例として、前記成長因子の含有量および／または成長因子受容体の含有量の組合せとしては、下記の組合せが例示できる。
（成長因子の含有量および／または成長因子受容体の含有量の組合せ）
（Ａ１）～（Ａ９）および（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれか１つの条件：
（Ａ１）ｂＦＧＦの含有量、（Ａ２）ＩＧＦＢＰ－１の含有量、（Ａ３）ＩＧＦＢＰ－２の含有量、（Ａ４）ＰＩＧＦの含有量、（Ａ６）ＶＥＧＦの含有量、（Ａ６）ＧＤＦ－１５の含有量、（Ａ７）ＡＲの含有量、（Ａ８）ＨＧＦの含有量、（Ａ９）ＢＭＰ－７の含有量、（Ｂ１）ＳＣＦＲの含有量、（Ｂ２）ＥＧＦＲの含有量、または（Ｂ３）ＶＥＧＦＲ２の含有量；
（Ａ１）～（Ａ９）および（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれか２つの条件：
（Ａ１）および（Ａ２）、（Ａ１）および（Ａ３）、（Ａ１）および（Ａ４）、（Ａ１）および（Ａ５）、（Ａ１）および（Ａ６）、（Ａ１）および（Ａ７）、（Ａ１）および（Ａ８）、（Ａ１）および（Ａ９）、（Ａ１）および（Ｂ１）、（Ａ１）および（Ｂ２）、（Ａ１）および（Ｂ３）、
（Ａ２）および（Ａ３）、（Ａ２）および（Ａ４）、（Ａ２）および（Ａ５）、（Ａ２）および（Ａ６）、（Ａ２）および（Ａ７）、（Ａ２）および（Ａ８）、（Ａ２）および（Ａ９）、（Ａ２）および（Ｂ１）、（Ａ２）および（Ｂ２）、（Ａ２）および（Ｂ３）、
（Ａ３）および（Ａ４）、（Ａ３）および（Ａ５）、（Ａ３）および（Ａ６）、（Ａ３）および（Ａ７）、（Ａ３）および（Ａ８）、（Ａ３）および（Ａ９）、（Ａ３）および（Ｂ１）、（Ａ３）および（Ｂ２）、（Ａ３）および（Ｂ３）、
（Ａ４）および（Ａ５）、（Ａ４）および（Ａ６）、（Ａ４）および（Ａ７）、（Ａ４）および（Ａ８）、（Ａ４）および（Ａ９）、（Ａ４）および（Ｂ１）、（Ａ４）および（Ｂ２）、（Ａ４）および（Ｂ３）、
（Ａ５）および（Ａ６）、（Ａ５）および（Ａ７）、（Ａ５）および（Ａ８）、（Ａ５）および（Ａ９）、（Ａ５）および（Ｂ１）、（Ａ５）および（Ｂ２）、（Ａ５）および（Ｂ３）、
（Ａ６）および（Ａ７）、（Ａ６）および（Ａ８）、（Ａ６）および（Ａ９）、（Ａ６）および（Ｂ１）、（Ａ６）および（Ｂ２）、（Ａ６）および（Ｂ３）、
（Ａ７）および（Ａ８）、（Ａ７）および（Ａ９）、（Ａ７）および（Ｂ１）、（Ａ７）および（Ｂ２）、（Ａ７）および（Ｂ３）、
（Ａ８）および（Ａ９）、（Ａ８）および（Ｂ１）、（Ａ８）および（Ｂ２）、（Ａ８）および（Ｂ３）、
（Ａ９）および（Ｂ１）、（Ａ９）および（Ｂ２）、（Ａ９）および（Ｂ３）、
（Ｂ１）および（Ｂ２）、（Ｂ１）および（Ｂ３）、または
（Ｂ２）および（Ｂ３）。
　前記総タンパク質あたりの含有量は、例えば、本発明の組成物の用途に応じて、前記成長因子および成長因子受容体以外の他のタンパク質を追加または除去することにより、調整してもよい。前記他のタンパク質は、例えば、前記成長因子および成長因子受容体の活性に影響を与えないタンパク質があげられ、具体例として、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、ヒトガンマグロブリン等のガンマグロブリン等があげられる。前記タンパク質の除去は、例えば、カラムを用いた除去、抗体を用いた除去等があげられる。
（２）条件（２）
　条件（２）は、前述のように、処理物の生理活性に関する条件である。前記条件（２）において、前記処理物の生理活性は、例えば、細胞、組織、または臓器の機能を調節する活性を意味する。前記細胞の機能は、例えば、増殖、分化等があげられる。
　前記処理物の生理活性は、例えば、細胞の増殖促進活性、骨芽細胞への分化促進活性、骨前駆細胞から骨芽細胞への分化促進活性があげられる。前記細胞の増殖促進活性において、前記細胞は、特に制限されず、例えば、間葉系幹細胞等があげられる。前記骨芽細胞への分化促進活性において、前記骨前駆細胞は、例えば、間葉系幹細胞、骨芽細胞等があげられる。前記処理物は、例えば、１つの活性を有してもよいし、複数の活性を有してもよい。
　前記間葉系幹細胞は、自己複製能を有し、骨、軟骨、および脂肪細胞への分化能を有する細胞である。前記間葉系幹細胞は、細胞表面マーカーにより特定できる。前記間葉系幹細胞は、例えば、CD73、CD90、およびCD105陽性、ならびにCD14、CD34およびCD45陰性である。
　前記骨芽細胞は、骨基質を合成および分泌可能な細胞である。前記骨芽細胞は、例えば、アルカリフォスファターゼ陽性およびオステオカルシン陽性の細胞として特定できる。
　前記細胞の増殖促進活性は、例えば、本発明の組成物を添加しない以外は同様の対照群と比較して、細胞の増殖能が向上していればよく、例えば、開始時より、細胞の増殖能が低下していてもよい。この場合、前記「増殖促進活性」は、例えば、増殖活性の低下の抑制ということもできる。具体例として、前記間葉系幹細胞は、継代を行なう毎に増殖活性が低下する。本発明の組成物によれば、前記間葉系幹細胞の増殖活性の低下を抑制できるため、例えば、本発明の組成物は、増殖促進活性を示すといえる。前記細胞の増殖促進活性は、例えば、対象の細胞が増殖する培養条件下で測定できる。前記培養条件は、例えば、前記細胞の種類に応じて、適宜設定できる。
　前記骨芽細胞への分化促進活性は、例えば、本発明の組成物を添加しない以外は同様の対照群と比較して、骨芽細胞への分化能が向上していればよい。前記分化能の向上は、例えば、前記骨芽細胞への分化速度が早くなること、および前記骨芽細胞に分化する細胞の割合が向上することのいずれの意味でもよい。前記骨芽細胞への分化は、例えば、特開２０１２-１２０５２９号公報を参照できる。具体例として、間葉系幹細胞から骨芽細胞の誘導方法は、例えば、後述の実施例２に基づき実施できる。
（３）条件（３）
　条件（３）は、前述のように、処理物の製造方法に関する条件である。本発明の組成物における処理物の製造方法については、後述の本発明の組成物の製造方法の説明を援用できる。
　本発明の組成物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用してもよい。
　本発明の組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、細胞、組織、器官等があげられ、前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞、培養細胞等があげられる。
　本発明の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、ヒト、またはヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ネコ、ヤギ、サル、モルモット等があげられる。
　本発明の組成物の使用条件（投与条件）は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。
　本発明の組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、本発明の組成物は、例えば、対象とする前駆細胞の培地に添加することで使用できる。本発明の組成物は、例えば、前記前駆細胞を維持する際に使用する維持培地に添加してもよいし、前記前駆細胞を前記骨芽細胞に分化する際に使用する添加してもよいし、前記維持培地および前記分化培地の両者に添加してもよい。本発明の組成物によれば、例えば、前記組成物を含む維持培地で、前記前駆細胞を維持することにより、その後、前記前駆細胞を骨芽細胞に分化させる際にも分化を促進できる。前記維持培地における本発明の組成物由来の総タンパク質の終濃度は、例えば、１０～１０００μｇ／ｍｌ、１０～５００μｇ／ｍｌ、または１０～３００μｇ／ｍｌである。前記分化培地における本発明の組成物由来の総タンパク質の終濃度は、例えば、１０～１０００μｇ／ｍｌ、１０～５００μｇ／ｍｌ、または１０～３００μｇ／ｍｌである。
　本発明の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、例えば、投与対象の種類、症状、年齢、投与方法等により適宜決定できる。具体例として、マウスに投与する場合、１日にあたりの組成物の投与量は、前記組成物由来の総タンパク質量の合計は、特に制限されず、例えば、その用途に応じて適宜設定できるが、具体例として、１０ｎｇ～１００ｍｇがあげられる。ヒトに投与する場合、１日あたりの組成物の投与量は、前記組成物由来の総タンパク質量の合計は、特に制限されず、例えば、その用途に応じて適宜設定できるが、具体例として、１０ｎｇ～１００ｇがあげられる。１日あたりの投与回数は、例えば、１～５回、１～３回、１回または２回である。
　本発明の組成物の投与形態は、特に制限されない。本発明の組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで投与する場合、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、静脈注射（静脈内投与）、筋肉注射（筋肉内投与）、経皮投与、皮下投与、皮内投与、経腸投与、直腸投与、経膣投与、経鼻投与、経肺投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。
　本発明の組成物の剤型は、特に制限されず、例えば、前記投与形態に応じて適宜決定できる。前記剤型は、例えば、液体状または固体状があげられる。
　本発明の組成物は、例えば、必要に応じて、添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、薬学的に許容可能な添加剤または薬学的に許容可能な担体であることが好ましい。
　本発明の組成物の製造方法（以下、「製造方法」ともいう）は、巨核球またはその培養物を処理する処理工程を含む。本発明の製造方法において、前記処理工程における処理対象は、巨核球またはその培養物である。このため、本発明の製造方法は、前記処理工程に先立ち、巨核球より未分化な細胞から前記巨核球を誘導する巨核球誘導工程および／または前記巨核球の培養物を生産する生産工程を含んでもよい。
　前記巨核球誘導工程において、前記巨核球の誘導方法は、特に制限されず、公知の誘導方法により実施できる。具体例として、前記巨核球の誘導方法は、例えば、国際公開第２０１１／０３４０７３号（米国特許出願公開2012/0238023号公報）、国際公開２０１２／１５７５８６号（米国特許出願公開2014/0127815号公報）、国際公開第２０１４／１２３２４２号（米国特許出願公開2016/0002599号公報）等の不死化巨核球の誘導方法；下記参考文献６に記載された巨核球の誘導方法；等を参照でき、ここに本明細書の一部を構成するものとして援用する。具体例として、前記巨核球誘導工程では、例えば、前記巨核球より未分化な細胞に、前記癌遺伝子および前記ポリコーム遺伝子を強制発現させてもよい。これにより、前記巨核球誘導工程では、例えば、無限に増殖する不死化巨核球を得ることができる。さらに、例えば、前記不死化巨核球の前記強制発現を解除することにより、前記不死化巨核球を多核化巨核球に誘導し、血小板を産生させることができる。また、前記巨核球誘導工程では、例えば、前記巨核球前駆細胞に前記アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよい。これにより、前記巨核球誘導工程では、前記不死化巨核球を得ることができる。さらに、例えば、前記不死化巨核球の前記強制発現を解除することにより、前記不死化巨核球から多核化巨核球を誘導し、血小板を産生させることができる。
参考文献６：Ann-Kathrin Borger et.al., “Generation of HLA-Universal iPSC-Derived Megakaryocytes and Platelets for Survival Under Refractoriness Conditions”, Mol. Med., 2016, vol. 22, pages 274-288
　前記巨核球誘導工程では、例えば、前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよい。この場合、前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子の強制発現は、同時に行なってもよいし、別個に行なってもよい。具体例として、前記巨核球誘導工程では、前記癌遺伝子および前記ポリコーム遺伝子を強制発現後、前記強制発現を解除し、つぎに、前記アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよいし、前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよいし、前記癌遺伝子および前記ポリコーム遺伝子を強制発現させ、さらに、前記アポトーシス抑制遺伝子を発現させてもよい。これにより、前記巨核球誘導工程では、前記不死化巨核球を得ることができる。さらに、例えば、前記不死化巨核球の前記強制発現を解除することにより、前記不死化巨核球から多核化巨核球を誘導し、血小板を産生させることができる。
　前記巨核球誘導工程は、例えば、各遺伝子の導入効率を向上できることから、前記巨核球より未分化な細胞に、癌遺伝子およびポリコーム遺伝子を強制発現させる第１の発現工程と、前記未分化な細胞において、Ｂｃｌ－ｘＬ遺伝子等のアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させる第２の発現工程と、前記強制発現を全て解除する解除工程とを含むことが好ましい。
　各遺伝子の強制発現および強制発現の解除は、例えば、国際公開第２０１１／０３４０７３号、国際公開第２０１２／１５７５８６号、国際公開第２０１４／１２３２４２号または下記参考文献７に記載された方法等の公知の方法、またはそれに準ずる方法で実施でき、ここに本明細書の一部を構成するものとして援用する。具体例として、各遺伝子の強制発現および強制発現の解除は、例えば、薬剤応答性の遺伝子発現誘導システムを用いて実施できる。前記遺伝子発現誘導システムは、例えば、Ｔｅｔ－ｏｎ（登録商標）システム、Ｔｅｔ－ｏｆｆ（登録商標）システム等があげられる。前記Ｔｅｔ－ｏｎシステムを用いる場合、例えば、前記強制発現する工程では、テトラサイクリン、ドキシサイクリン等の遺伝子発現を誘導する薬剤の存在下、培養を実施し、前記強制発現を解除する工程では、前記薬剤の非存在下で、前記培養を実施する。
参考文献７：Nakamura S et al, “Expandable megakaryocyte cell lines enable clinically applicable generation of platelets from human induced pluripotent stem cells.”, Cell Stem Cell, 2014, vol.14, No.4, pages 535-548
　つぎに、前記生産工程では、前記巨核球の培養物を生産する。前記生産工程は、例えば、培地の存在下、前記巨核球を培養することにより実施できる。前記巨核球の培養は、例えば、フィーダ細胞上で実施してもよいし、フィーダ細胞なしで実施してもよい。前記巨核球は、例えば、浮遊培養できるため、前記フィーダ細胞なしで培養できる。前記巨核球の培養物は、例えば、前記血小板を含む。
　前記巨核球の培養条件は、特に制限されず、前記巨核球の通常の培養条件を採用できる。具体例として、培養温度は、例えば、約３５～約４２℃、約３６～約４０℃、約３７～約３９℃である。ＣＯ２濃度は、例えば、約５～約１５％である。Ｏ２濃度は、例えば、約１５～約２５％、約２０％である。培養期間は、特に制限されず、例えば、約１日～約２週間、約４～約８日である。
　前記培地は、特に制限されず、例えば、前記巨核球から血小板が産生するのに好適な公知の培地およびそれに準ずる培地があげられる。具体例として、前記培地は、例えば、動物細胞の培養に用いる培地を基礎培地として調製することができる。前記基礎培地は、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle’s Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco’s modified Eagle’s Medium（DMEM）、Ham’s F12培地、RPMI1640培地、Fischer’s培地、Neurobasal（登録商標） Medium（Thermo Fisher Scientific社製）等の単独培地またはこれらの混合培地があげられる。前記培地は、例えば、血清または血漿を含んでもよいし、これらを含まない無血清培地でもよい。前記血清および血漿の由来は、前記巨核球の由来と同じ由来であることが好ましい。具体例として、前記巨核球がヒト由来である場合、前記血清および血漿は、それぞれ、ヒト由来であることが好ましい。
　前記培地は、例えば、他の成分を含んでもよい。前記他の成分は、特に制限されず、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、脂質、アミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、アスコルビン酸、ヘパリン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカイン等があげられる。前記他の成分は、例えば、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。前記サイトカインは、例えば、血球系細胞の分化を促進する物質であり、具体例として、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、各種ＴＰＯ様作用物質、Stem Cell Factor（SCF）、ITS（インスリン－トランスフェリン－セレナイト）サプリメント、ADAM阻害剤、FLT阻害剤、WNT阻害剤、ROCK阻害剤、芳香族炭化水素受容体（AhR）阻害剤等があげられる。前記培地は、例えば、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、アスコルビン酸、ＴＰＯを含むIMDM培地が好ましい。前記培地は、例えば、さらにSCFを含んでいてもよく、さらにヘパリンを含んでいてもよい。前記他の成分の濃度は、特に制限されない。前記TPOの濃度は、例えば、約10ng/ml～約200ng/ml、約50ng/ml～約100ng/mlである。前記SCFの濃度は、例えば、約10ng/ml～約200ng/ml、約50ng/mlである。前記ヘパリンの濃度は、例えば、約10U/ml～約100U/ml、約25U/mlである。前記培地は、例えば、さらに、ホルボールエステル（例えば、ホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート；PMA）を含んでもよい。
　つぎに、前記処理工程では、前記巨核球またはその培養物を処理する。前記処理工程では、例えば、前記巨核球またはその培養物が含有する細胞の細胞膜を破壊することにより、タンパク質等の生体高分子を抽出する。具体例として、前記処理工程における処理は、特に制限されず、例えば、濃縮処理等の細胞成分の密度を変更する処理；乾燥処理、凍結処理、凍結乾燥処理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理、タンパク質画分抽出処理、超音波処理等の細胞の成分を抽出する抽出処理；磨砕処理、粉砕処理等の破砕処理；等があげられる。前記処理工程において実施する処理は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。また、前記処理工程では、前記処理を１回実施してもよいし、２回以上実施してもよい。
　前記濃縮処理は、例えば、前記巨核球またはその培養物を、遠心等することにより実施できる。前記遠心の条件は、例えば、細胞または血小板を沈殿させる条件を採用できる。前記乾燥処理は、例えば、前記巨核球またはその培養物に対してドライスプレー、ドラムドライヤー等で乾燥させることにより実施できる。前記凍結乾燥処理は、例えば、凍結乾燥機を用いて実施できる。前記溶媒処理において、前記溶媒は、例えば、フェノール、クロロホルム等の有機溶媒；水、生理的食塩水、緩衝液等の水性溶媒；である。前記溶媒として水性溶媒を用いる場合、前記溶媒処理は、例えば、後述の界面活性剤処理、酵素処理、および／または超音波処理と併用することが好ましい。前記溶媒処理は、例えば、前記巨核球またはその培養物を、前記溶媒と混合することにより実施できる。前記界面活性剤処理において、前記界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等のイオン系界面活性剤；NP-40、Triton X-100、Tween 20、n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside等の非イオン系界面活性剤；CHAPS等の両性イオン界面活性剤；等があげられる。前記界面活性剤の濃度は、例えば、前記巨核球またはその培養物における細胞成分の細胞膜を破壊可能な濃度である。前記界面活性剤処理は、例えば、水性溶媒の存在下、前記巨核球またはその培養物を、前記界面活性剤と接触させることにより実施できる。前記界面活性剤との接触は、例えば、約０～約１０℃で実施する。前記水性溶媒は、例えば、水、生理的食塩水、緩衝液等があげられる。前記酵素処理における酵素は、例えば、ペプチダーゼ、プロテアーゼ等があげられる。前記酵素処理は、例えば、前記水性溶媒の存在下、前記巨核球またはその培養物を、前記酵素と接触させることにより実施できる。前記酵素処理の条件は、例えば、前記酵素が活性を示す条件である。前記タンパク質画分抽出処理は、例えば、前記巨核球またはその培養物に対して、浸透圧ショック、凍結融解等を行なうことにより実施できる。前記超音波処理は、例えば、超音波発生装置を用いて実施できる。前記超音波処理の条件は、例えば、細胞を破砕する条件を使用できる。
　各種処理における処理条件および処理時間は、例えば、前記処理の種類に応じて適宜決定できる。また、前記処理工程では、例えば、前記水性溶媒の量を調整することにより、前記処理物における総タンパク質の濃度を調整できる。
　前記巨核球またはその培養物は、前記処理に先立ち、加工（前処理）を実施してもよい。この場合、前記巨核球の培養物としては、前記巨核球を培養して得られた培養物そのものを用いてもよいし、前記混合物を加工したものでものを用いてもよい。前記培養物の加工は、例えば、液体画分の除去、細胞成分画分の抽出、血小板を含む細胞成分の組成の変更等があげられる。前記細胞成分の組成の変更は、例えば、前記混合物における細胞および／または血小板の除去、前記混合物における細胞および／または血小板の抽出、前記混合物への細胞および／または血小板の追加等があげられる。
　本発明の製造方法が前記前処理を含む場合、本発明の製造方法は、前記巨核球またはその培養物から血小板を除去する除去工程を含んでもよい。この場合、前記処理工程では、前記巨核球またはその培養物として、前記血小板が除去された巨核球もしくはその培養物、または除去された血小板を用いて処理を実施する。前記血小板放出後の巨核球は、例えば、ｂＦＧＦの含有量が高い。このため、本発明の製造方法は、例えば、前記血小板を除去することにより、ｂＦＧＦの含有量が高い組成物を製造できる。前記血小板の除去により、前記血小板と、その他の細胞分画とを分離することができる。このため、前記除去工程は、例えば、血小板の分離工程または血小板と他の細胞成分との分離工程ということもできる。前記除去工程において、前記巨核球の培養物からの血小板の分離方法は、例えば、国際公開第２０１７／０６５２８０号公報（米国特許出願公開2018/282697号公報）に記載された方法等の公知の方法、またはそれに準ずる方法で実施でき、ここに本明細書の一部を構成するものとして援用する。
　前記除去工程における血小板の除去率（分離率）は、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である。前記血小板の除去率は、例えば、６０～９０％である。
　本発明の製造方法は、前記巨核球もしくはその培養物、前記血小板が除去された巨核球もしくはその培養物、または除去された血小板を保存する保存工程を有してもよい。前記保存工程における保存は、例えば、冷蔵保存（約１～約１０℃）、冷凍保存（約－２００～約－４℃）があげられる。前記保存工程における保存期間は、特に制限されない。前記保存工程は、例えば、前記処理工程における凍結処理を兼ねられることから、冷凍保存が好ましい。
　本発明の製造方法は、一例として、下記のように実施できる。ただし、本発明は、以下の例示に何ら制限されない。まず、前記巨核球またはその培養物を含む培地について、遠心により濃縮処理を行ない、細胞成分を濃縮する。前記遠心処理は、例えば、前記細胞成分が沈殿する条件である。具体例として、前記遠心処理は、例えば、１０００～３０００×ｇで、５～２０分遠心することに実施できる。つぎに、遠心後に沈殿物を回収し、得られた沈殿物を急速凍結することで凍結処理する。前記凍結処理は、例えば、前記沈殿物を液体窒素等の液化ガスと接触させることにより実施できる。さらに、凍結後の沈殿物を、前記界面活性剤を含む水性溶媒で溶解させることにより、界面活性剤処理する。得られた溶液について、遠心し、夾雑物を沈殿させる。前記遠心処理は、例えば、細胞膜等の夾雑物が沈殿する条件である。具体例として、前記遠心処理は、例えば、１００００～２００００×ｇで、３～１０分間遠心することにより実施できる。前記遠心後、タンパク質は上清に存在するため、上清をタンパク質分画として回収することにより、前記処理物を得ることができる。
　本発明の組成物は、例えば、後述するように、骨芽細胞の分化促進組成物として使用できる。本発明の使用方法については、後述の細胞の増殖促進組成物および骨芽細胞の分化促進組成物の説明を援用できる。また、本発明の組成物は、例えば、顎骨腫瘍、嚢胞、骨壊死、外傷、骨系統疾患（外胚葉異形成症、唇顎口蓋裂等）による顎骨欠損；歯周病またはそれに伴う歯槽骨欠損、う蝕または外傷による歯槽骨欠損等の歯槽骨欠損；原発性骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症等）、続発性骨粗鬆症（骨形成不全症等）等の骨粗鬆症；甲状腺機能亢進症、Cushing症候群、性腺機能低下症）、外傷等による難治性骨折；開胸手術による肋骨接合；開頭手術による骨欠損；腫瘍切除または嚢胞摘出による全身の骨欠損；等に好適に使用できると推定される。
＜骨芽細胞の分化促進組成物＞
　本発明の骨芽細胞の分化促進組成物は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。本発明の分化促進組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の分化促進組成物によれば、骨芽細胞への分化、特に、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を促進できる。本発明の分化促進組成物は、前記本発明の組成物の説明を援用できる。
　本発明の分化促進組成物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用してもよい。
　本発明の分化促進組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、細胞、組織、器官等があげられ、前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞、培養細胞等があげられる。
　本発明の分化促進組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、ヒト、またはヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ネコ、ヤギ、サル、モルモット等があげられる。
　本発明の分化促進組成物の使用条件（投与条件）は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。本発明の分化促進組成物の投与条件は、前記本発明の組成物の説明を援用できる。
　本発明の分化促進組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、本発明の分化促進組成物は、例えば、対象とする前駆細胞の培地に添加することで使用できる。本発明の分化促進組成物は、例えば、前記前駆細胞を維持する際に使用する維持培地に添加してもよいし、前記前駆細胞を前記骨芽細胞に分化する際に使用する添加してもよいし、前記維持培地および前記分化培地の両者に添加してもよい。本発明の分化促進組成物によれば、例えば、前記分化促進組成物を含む維持培地で、前記前駆細胞を維持することにより、その後、前記前駆細胞を骨芽細胞に分化させる際にも分化を促進できる。前記維持培地における本発明の分化促進組成物由来の総タンパク質の終濃度は、例えば、１０～１０００μｇ／ｍｌ、１０～５００μｇ／ｍｌ、または１０～３００μｇ／ｍｌである。前記分化培地における本発明の分化促進組成物由来の総タンパク質の終濃度は、例えば、１０～１０００μｇ／ｍｌ、１０～５００μｇ／ｍｌ、または１０～３００μｇ／ｍｌである。
　前駆細胞の骨芽細胞への分化促進作用は、例えば、間葉系幹細胞と被検物とを共存させた際に、前記被検物の非存在下（対照群）と比較して、前記間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を促進できるかにより評価できる。具体的には、前記骨芽細胞への分化促進作用は、前記間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導した後の細胞群の培地におけるカルシウムイオンの濃度を指標に、評価できる。前記間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導方法およびカルシウムイオンの濃度の測定方法は、後述の実施例１（６）に準じて、実施できる。そして、前記評価では、例えば、前記被検物との共存群におけるカルシウムの濃度が、前記被検物非存在下の群におけるカルシウム濃度と比較して、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下である場合、前記被検物は、骨芽細胞への分化促進作用があると評価できる。
　本発明の分化促進組成物は、例えば、前記間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導アッセイにおいて、カルシウム濃度を、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下に抑制する骨芽細胞の分化促進活性を有する。前記間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導アッセイは、後述の実施例１（６）に準じて実施できる。
　本発明の分化促進組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、例えば、投与対象の種類、症状、年齢、投与方法等により適宜決定できる。具体例として、ヒトに投与する場合、１日あたりの分化促進組成物の投与量は、前記分化促進組成物由来の総タンパク質量の合計は、特に制限されず、例えば、その用途に応じて適宜設定できる。１日あたりの投与回数は、例えば、１～５回、１～３回、１回または２回である。
　本発明の分化促進組成物の投与形態は、特に制限されない。本発明の分化促進組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで投与する場合、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、静脈注射（静脈内投与）、筋肉注射（筋肉内投与）、経皮投与、皮下投与、皮内投与、経腸投与、直腸投与、経膣投与、経鼻投与、経肺投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。
　本発明の分化促進組成物の剤型は、特に制限されず、例えば、前記投与形態に応じて適宜決定できる。前記剤型は、例えば、液体状または固体状があげられる。
　本発明の分化促進組成物は、例えば、必要に応じて、添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、薬学的に許容可能な添加剤または薬学的に許容可能な担体であることが好ましい。
＜骨形成キット＞
　本発明の骨形成キットは、骨形成組成物と、骨形成の足場材料とを含み、前記骨形成組成物は、前記本発明の骨形成組成物である。本発明のキットは、前記本発明の骨形成組成物を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のキットは、前記本発明の組成物と前記足場材料とを組み合わせることにより、簡便に骨形成を誘導できる。本発明のキットは、前記本発明の組成物および分化促進組成物の説明を援用できる。
　本発明のキットにおいて、前記足場材料は、例えば、骨または軟骨再生に用いられる足場材料を用いることができる。前記足場材料は、例えば、骨細胞もしくは骨芽細胞、またはこれらの前駆細胞が付着、増殖、および／または分化可能な材料ということもできる。前記足場材料は、例えば、三次元の中空構造または多孔質構造を有する構造体（構造物）であり、具体例として、多孔質体、多孔性支持体、多孔性立体構造体（構造物）、ゲル（ハイドロゲル）、スポンジ構造物等があげられる。
　前記足場材料は、例えば、前記本発明の組成物とあわせて生体内に留置されることから、生体適合性および／または生分解性を示すことが好ましい。前記「生体適合性」は、例えば、生体における組織および／または器官と親和性があり、異物反応や拒絶反応などを生じないことを意味する。前記「生分解性」とは、例えば、生体内において、その構成成分が分解可能であることを意味する。
　前記足場材料の構成成分は、例えば、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ケラチン、フィブリン、フィブロイン等のタンパク質；アガロース、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、キトサン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸等の多糖類；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸とポリ乳酸の共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリジオキサノン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、リン酸カルシウム（例えば、β－リン酸三カルシウム）、炭酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、ポリエーテルケトン、およびポリエーテルエーテルケトン等があげられる。前記構成成分は、１種類を単独で用いてもいし、複数種類を併用してもよい。
　前記足場材料は、例えば、前記足場材料の構成成分を架橋または複合化することにより、調製できる。
　前記足場材料としては、例えば、ネオボーン（ハイドロキシアパタイト製、Aimdic MMT社製）、APACERAM（登録商標、ハイドロキシアパタイト製、HOYA株式会社社製）、ボナーク（コラーゲン／オクタリン酸カルシウム製、東洋紡株式会社社製）、オスフェリオン（βTCP製、オリンパステルモバイオマテリアル株式会社社製）、サイトランスグラニュール（炭酸アパタイト製、株式会社ジーシー社製）、リフィット（コラーゲン／アパタイト製、HOYA株式会社社製）等があげられる。
　本発明のキットにおいて、前記組成物と、前記足場材料とは、独立して存在してもよいし、一体で存在してもよい。後者の場合、本発明のキットは、例えば、骨形成足場材料ということもできる。前記組成物と、前記足場材料とが一体の場合、前記組成物は、例えば、前記足場材料の表面に吸着されてもよいし、前記足場材料内に包含されてもよい。
　本発明のキットは、例えば、前記組成物に加えて、生理活性物質を含んでもよい。前記生理活性物質は、例えば、骨形成または骨芽細胞もしくは骨細胞の分化を促進する物質である。前記生理活性物質は、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、増殖分化因子－５（ＧＤＦ５）、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等があげられる。前記生理活性物質は、１種類を単独で用いてもよいし、複数種類を併用してもよい。
　本発明のキットは、例えば、前記投与対象において、骨形成を誘導したい所望の場所に、前記組成物および足場材料を移植（埋設、包埋）することにより使用できる。具体的に、本発明のキットにおいて、前記組成物と、前記足場材料とが独立している場合、前記足場材料に前記組成物を含浸させ、ついで、前記足場材料を移植することにより使用できる。また、本発明のキットにおいて、前記組成物と、前記足場材料とが独立している場合、前記足場材料を移植後、前記移植部位に、前記本発明の組成物を導入することにより使用してもよい。また、本発明のキットにおいて、前記組成物と前記足場材料とが一体の場合、前記足場材料を移植することにより使用できる。
　本発明のキットにおいて、前記組成物の含有量は、例えば、前記本発明の組成物における投与量に準じて設定できる。
＜免疫細胞の活性化抑制組成物＞
　本発明は、別の態様において、細胞由来の免疫細胞の活性化抑制活性を有する組成物を提供する。この場合、本発明の免疫細胞の活性化抑制組成物（以下、「活性化抑制組成物」ともいう。）は、巨核球またはその培養物の処理物を含む。本発明の活性化抑制組成物は、巨核球またはその培養物の処理物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の活性化抑制組成物によれば、例えば、細胞由来の免疫細胞の活性化抑制活性を有する組成物を提供できる。本発明の活性化抑制組成物は、前記本発明の組成物、分化促進組成物、および骨形成キットの説明を援用できる。
　本発明の活性化抑制組成物は、例えば、免疫細胞における炎症性サイトカインの産生を抑制できる。このため、本発明の活性化抑制組成物は、例えば、免疫細胞における炎症性サイトカインの産生抑制組成物ということもできる。
　本発明において、「免疫細胞の活性化」は、例えば、免疫細胞において、活性化マーカーの発現が誘導されること、炎症性サイトカイン等のサイトカインの発現が誘導されることのいずれの意味で用いてもよい。前記炎症性サイトカインは、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ等があげられる。
　前記免疫細胞の活性化抑制作用は、例えば、前記免疫細胞を活性化させる条件下において、前記免疫細胞と被検物とを共存させた際に、前記被検物の非存在下と比較して（対照群）、前記免疫細胞の培養後の培地における炎症性サイトカインの濃度を抑制できるかにより評価できる。具体的には、前記免疫細胞の活性化抑制作用は、炎症性サイトカインの産生量の抑制率に基づき、評価できる。前記免疫細胞の種類、活性化の条件、および炎症性サイトカインの産生量は、後述の実施例５に準じて、測定できる。そして、前記評価では、例えば、いずれか１つ以上のサイトカインの産生量の抑制率が、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の場合、前記被検物は、免疫細胞の活性化抑制作用があると評価できる。
　本発明の活性化抑制組成は、例えば、前記免疫細胞の活性化アッセイにおいて、少なくとも１種類の炎症性サイトカインの濃度を、対照群と比較して、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下に抑制する免疫細胞の活性化抑制作用を有する。前記免疫細胞の活性化アッセイは、後述の実施例５に準じて実施できる。
　本発明において、前記免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞等のリンパ球；炎症性マクロファージ等のマクロファージ；等があげられる。
　本発明の活性化抑制組成物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用してもよい。
　本発明の活性化抑制組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、細胞、組織、器官等があげられ、前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞、培養細胞等があげられる。
　本発明の活性化抑制組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、ヒト、またはヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ネコ、ヤギ、サル、モルモット等があげられる。
　本発明の活性化抑制組成物の使用条件（投与条件）は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。
　本発明の活性化抑制組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、本発明の活性化抑制組成物は、例えば、対象とする細胞の培地に添加することで使用できる。本発明の活性化抑制組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、前記培地における本発明の活性化抑制組成物由来の総タンパク質の終濃度は、例えば、１０～１０００μｇ／ｍｌ、１０～５００μｇ／ｍｌ、または１０～３００μｇ／ｍｌである。
　本発明の活性化抑制組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、例えば、投与対象の種類、症状、年齢、投与方法等により適宜決定できる。具体例として、ヒトに投与する場合、１日あたりの活性化抑制組成物の投与量は、前記活性化抑制組成物由来の総タンパク質量の合計は、特に制限されず、例えば、その用途に応じて適宜設定できる。１日あたりの投与回数は、例えば、１～５回、１～３回、１回または２回である。
　本発明の活性化抑制組成物の投与条件および剤型は、前記本発明の組成物の説明を援用できる。
＜抗炎症組成物＞
　本発明は、別の態様において、細胞由来の抗炎症活性を有する組成物を提供する。この場合、本発明の抗炎症組成物は、巨核球またはその培養物の処理物を含む。本発明の抗炎症組成物は、巨核球またはその培養物の処理物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の抗炎症組成物によれば、例えば、炎症を抑制可能な組成物を提供できる。本発明の抗炎症組成物は、前記本発明の組成物、分化促進組成物、骨形成キット、および活性化抑制組成物の説明を援用できる。
　本発明において、「抗炎症」は、炎症を抑制することを意味し、例えば、炎症性サイトカインの発現誘導の抑制または炎症性サイトカインの産生抑制等を指標に検討できる。
　本発明の抗炎症組成物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用してもよい。
　本発明の抗炎症組成物の投与対象、投与条件、および剤型は、前記本発明の組成物および免疫細胞の活性化抑制組成物の説明を援用できる。
＜骨形成方法＞
　本発明の骨形成方法は、前記本発明の骨形成組成物を使用する。本発明の骨形成方法は、前記本発明の組成物を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の骨形成方法によれば、例えば、骨芽細胞への分化、特に、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を促進することにより、骨形成を誘導できる。本発明の骨形成方法は、前記本発明の組成物、分化促進組成物、および骨形成キットの説明を援用できる。
　本発明の骨形成方法は、例えば、投与対象に、本発明の骨形成組成物を投与する投与工程を含む。本発明の骨形成方法により、ｉｎ　ｖｉｖｏで骨形成を行なう場合、前記本発明の組成物の投与位置は、骨形成を行なう所望の位置とできる。本発明の骨形成方法において、前記投与対象および投与条件は、前記本発明の組成物の投与対象および投与条件の説明を援用できる。
　本発明の骨形成方法において、前記本発明の骨形成組成物として、前記本発明の骨形成キットを用いてもよい。
＜骨芽細胞の分化促進方法＞
　本発明の骨芽細胞の分化促進方法（以下、「分化促進方法」ともいう）は、前記本発明の細胞の分化促進組成物を使用する。本発明の分化促進方法は、前記本発明の分化促進組成物を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の分化促進方法によれば、骨芽細胞への分化、特に、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を促進できる。本発明の分化促進方法は、前記本発明の組成物、分化促進組成物、骨形成キット、および骨形成方法の説明を援用できる。
　本発明の分化促進方法は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで実施してもよい。本発明の分化促進方法は、例えば、投与対象に、本発明の分化促進組成物を投与する投与工程を含む。
　本発明の分化促進方法をｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施する場合、本発明の分化促進方法は、例えば、前記分化促進組成物の存在下、前駆細胞を骨芽細胞に分化させる分化工程を含む。本発明の分化促進方法は、前記分化工程に先立ち、前記分化促進組成物の存在下、前駆細胞を維持培養する維持工程を含んでもよい。前記本発明の分化促進組成物の投与対象および投与条件は、例えば、本発明の分化促進組成物における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
＜免疫細胞の活性化抑制方法＞
　本発明は、別の態様において、免疫細胞の活性化を抑制する方法を提供する。本発明の免疫細胞の活性化抑制方法（以下、「活性化抑制方法」ともいう）は、前記本発明の免疫細胞の活性化抑制組成物を使用する。本発明の活性化抑制方法は、前記本発明の活性化抑制組成物を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の活性化抑制方法によれば、免疫細胞の活性化を抑制できる。本発明の活性化抑制方法は、前記本発明の組成物、分化促進組成物、骨形成キット、活性化抑制組成物、抗炎症組成物、骨形成方法、および分化促進方法の説明を援用できる。
　本発明の活性化抑制方法は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで実施してもよい。本発明の活性化抑制方法は、例えば、投与対象に、本発明の活性化抑制組成物を投与する投与工程を含む。
　本発明の活性化抑制方法をｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施する場合、本発明の活性化抑制方法は、例えば、前記活性化抑制組成物の存在下、免疫細胞を培養する培養工程を含む。前記本発明の活性化抑制組成物の投与対象、投与条件、および剤型は、例えば、本発明の活性化抑制組成物における投与対象、投与条件、および剤型の説明を援用できる。
＜炎症の抑制方法＞
　本発明は、別の態様において、炎症を抑制する方法を提供する。本発明の炎症の抑制方法（以下、「抑制方法」ともいう）は、前記本発明の抗炎症組成物を使用する。本発明の炎症の抑制方法は、前記本発明の抗炎症組成物を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の炎症の抑制方法によれば、炎症を抑制できる。本発明の炎症の抑制方法は、前記本発明の組成物、分化促進組成物、骨形成キット、活性化抑制組成物、抗炎症組成物、骨形成方法、分化促進方法、および活性化抑制方法の説明を援用できる。
　本発明の炎症の抑制方法は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで実施してもよい。本発明の炎症の抑制方法は、例えば、投与対象に、本発明の抗炎症組成物を投与する投与工程を含む。
　本発明の炎症の抑制方法をｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施する場合、本発明の炎症の抑制方法は、例えば、前記抗炎症成物の存在下、投与対象を培養する培養工程を含む。前記本発明の抗炎症組成物の投与対象、投与条件、および剤型は、例えば、本発明の抗炎症組成物における与対象、投与条件、および剤型の説明を援用できる。
＜組成物の使用＞
　本発明は、骨形成のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物またはその使用である。本発明は、骨芽細胞の分化促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物またはその使用である。本発明は、免疫細胞の活性化抑制のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物またはその使用である。本発明は、炎症の抑制のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物またはその使用である。本発明は、骨形成組成物を製造するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物の使用である。また、本発明は、骨芽細胞の分化促進組成物を製造するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物の使用である。本発明は、免疫細胞の活性化抑制組成物を製造するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物の使用である。本発明は、抗炎症組成物を製造するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物の使用である。本発明は、前記本発明の組成物、分化促進組成物、骨形成キット、活性化抑制組成物、抗炎症組成物、骨形成方法、分化促進方法、活性化抑制方法、および炎症の抑制方法の説明を援用できる。
　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
［実施例１］
　本発明の組成物を製造し、成長因子および成長因子受容体を含むこと、細胞の増殖促進活性および骨芽細胞への分化促進活性を有することを確認した。
（１）不死化巨核球細胞の作製
　不死化巨核球は、以下の手順で作製した。
（１－１）iPS細胞からの造血前駆細胞の調製
　ヒトiPS細胞（TKDN SeV2およびNIH5：センダイウイルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来iPS細胞）から、下記参考文献８に記載の方法に従って、血球細胞への分化培養を実施した。具体的には、ヒトES/iPS細胞コロニーを20ng/ml VEGF（R&D SYSTEMS社製）存在下でC3H10T1/2フィーダ細胞と１４日間共培養して造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cells；HPC）を作製した。培養条件は、３７℃、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２で実施した（特に記載がない限り、以下同条件）。
参考文献８：Takayama N. et al., “Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells”, J. Exp. Med., 2010, vo.13, pages 2817-2830
（１－２）遺伝子導入システム
　遺伝子導入システムは、レンチウイルスベクターシステムを利用した。レンチウイルスベクターは、Tetracycline制御性のTet-on（登録商標）遺伝子発現誘導システムベクターである。LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G（下記参考文献９）のmOKSカセットをc-MYC、BMI1、またはBCL-xLに組み替えることで作製した。c-MYC、BMI1、またはBCL-xLが導入されたベクターを、それぞれ、LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G、LVTRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G、およびLV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2Gとした。c-MYC、BMI1、およびBCL-xLウイルスは、293T細胞へ前記レンチウイルスベクターで遺伝子導入することにより作製した。得られたウイルスを目的の細胞に感染させることによって、c-MYC、BMI1、およびBCL-xL遺伝子が目的の細胞のゲノム配列に導入される。安定的にゲノム配列に導入されたこれらの遺伝子は、培地にドキシサイクリン（clontech#631311）を加えることによって強制発現させることができる。
参考文献９：Kobayashi, T.et al., “Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells.”, Cell, 2010, vol.142, No.5, pages 787-799
（１－３）造血前駆細胞へのc-MYCおよびBMI1ウイルスの感染
　予めC3H10T1/2フィーダ細胞を播種した6 well plate上に、前記（１－１）の方法で得られたHPCを5×104cells/wellとなるように播種し、BMI1ウイルスおよびc-MYCウイルスを用いたレンチウイルス法にてc-MYCおよびBMI1を強制発現させた。このとき、細胞株１種類につき6 wellずつ使用した。具体的には、それぞれMOI（multiplicity of infection）20となるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（32℃、900rpm、６０分間遠心）で感染させた。前記スピンインフェクションは、１２時間おきに２回実施した。培地は、基本培地（15% Fetal Bovine Serum (GIBCO)、1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO)、1% Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS-G) (GIBCO)、0.45 mmol/l 1-Thioglycerol (Sigma-Aldrich)、50μg/ml L-Ascorbic Acid (Sigma-Aldrich)を含有するIMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) (Sigma-Aldrich)）に、50 ng/ml Human thrombopoietin (TPO)(R&D SYSTEMS)、50 ng/ml Human Stem Cell Factor (SCF) (R&D SYSTEMS)および2μg/ml Doxycycline (Dox、clontech #631311)となるようにそれぞれを添加した培地（以下、分化培地）に、さらに、Protamineを最終濃度が10 μg/mlとなるように添加した培地を用いた。
（１－４）巨核球自己増殖株の作製および維持培養
　前記（１－３）の方法でc-MYCおよびBMI1ウイルスの感染を実施した日を感染0日目として、以下の通り、c-MYC遺伝子およびBMI1遺伝子が導入されたHPCを培養することで、巨核球自己増殖株をそれぞれ作製した。c-MYC遺伝子およびBMI1遺伝子の強制発現は、培地に1μg/ml DOXとなるようにDOXを添加することにより実施した。
・感染２日目～感染１１日目
　感染２日目に、ピペッティングにて上記の方法で得られたウイルス感染済み血球細胞を回収し、1200rpm、５分間遠心操作を行って上清を除去した後、新しい分化培地で懸濁して新しいC3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(6well plate)。感染９日目に同様の操作をすることによって継代を実施した。前記再播種時は、細胞数を計測後、1×105 cells/2ml/wellとなるようにC3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(6well plate)。
・感染１２日目～感染１３日目
　感染２日目と同様の操作を実施した。細胞数を計測後3×105 cells/10ml/100mm dishとなるように、C3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(100mm dish)。
・感染１４日目
　ウイルス感染済み血球細胞を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、および抗ヒトCD235ab-pacific blue（BioLegend）抗体を、それぞれ2μl、1μl、および1μlを用いて、前記血球細胞と抗体とを反応させた。前記反応後、FACS Verse（商標）（BD Biosciences）を用いて解析した。感染１４日目において、CD41a陽性率が５０%以上である細胞を、巨核球自己増殖株とした。
（１－５）巨核球自己増殖株へのBCL-xLウイルス感染
　前記感染１４日目の巨核球自己増殖株に、BCL-xLウイルスを用いたレンチウイルス法にてBCL-xLを遺伝子導入した。MOI 10になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（32℃、900rpm、６０分間遠心）で感染させた。BCL-xL遺伝子の強制発現は、培地に1μg/ml DOXとなるようにDOXを添加することにより実施した。
（１－６）巨核球不死化株の作成および維持培養
・感染１４日目～感染１８日目
　前記（１－５）の方法で得られたBCL-xL遺伝子を導入した巨核球自己増殖株を回収し、1200rpm、5分間遠心操作を行った。前記遠心後、沈殿した細胞を新しい分化培地で懸濁した後、新しいC3H10T1/2フィーダ細胞上に2×105cells/2ml/wellとなるように播種した（6well plate）。
・感染１８日目：継代
　BCL-xL遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、3×105 cells/10ml/100mm dishとなるように播種した。
・感染２４日目：継代
　BCL-xL遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、1×105 cells/10ml/100mm dishとなるように播種した。以後、４－７日毎に同様にして継代を行い、維持培養を行った。なお、継代時には、新たな分化培地に懸濁の上、播種した。
　感染２４日目にBCL-xLを遺伝子導入した巨核球自己増殖株を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、および抗ヒトCD235ab-Pacific Blue（Anti-CD235ab-PB; BioLegend）抗体を、それぞれ、2μl、1μl、および1μlを用いて、免疫染色した後にFACS Verse（商標）を用いて解析した。そして、感染２４日目において、CD41a陽性率が50%以上である株を不死化巨核球細胞株とした。感染後２４日以上増殖することができたこれらの細胞を、不死化巨核球細胞株SeV2-MKCLおよびNIH5-MKCLとした。
　得られたSeV2-MKCLおよびNIH5-MKCLを、10cmディッシュ（10ml/ディッシュ）で静置培養した。培地は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は終濃度）。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。
FBS（シグマ#172012 lot.12E261）15％
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 2mmol/l
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μmol/l
アスコルビン酸(sigma #A4544) 50μg/ml
Puromycin (sigma #P8833-100MG) 2μg/ml
SCF (和光純薬#193-15513) 50ng/ml
TPO様作用物質200ng/ml
（２）巨核球の培養物の生産
　DOXを含まない培地で培養することで強制発現を解除した。具体的には、前記（１）の方法で得た不死化巨核球細胞株（SeV2-MKCLおよびNIH5-MKCL）を、PBS(-)で2度洗浄し、下記血小板生産培地に懸濁した。細胞の播種密度は、1.0×105 cells/mlとした。
　前記血小板生産培地は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は、終濃度）。
human plasmＡ６％
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 4mmol/l
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μmol/l
アスコルビン酸 (sigma #A4544) 50μg/ml
SCF (和光純薬#193-15513) 50ng/ml
TPO様作用物質200ng/ml
ADAM阻害剤15μmol/l
GNF351（Calbiochem #182707）500nmol/LY39983（Chemscene LLC #CS-0096）500nmol/l
Urokinase 5U/ml
低分子heparin（SANOFI、クレキサン）1U/ml
　そして、前記血小板生産培地存在下で６日間培養して、血小板を産生させることにより、巨核球の培養物を生産させた。
（３）精製血小板の製造
　前記（２）で得られた巨核球の培養物について、以下の手順で、血小板を製造（精製）した。なお、同様の精製を２回実施した。
（３－１）巨核球の培養物の濃縮
　前記（２）で得られた巨核球の培養物について、培養物バッグに導入した。そして、前記培養物バッグについて、図１のように、濃縮システムに接続した。図１において、洗浄保存液バッグ１および２は、洗浄保存液を含む。前記洗浄保存液は、ビカネイト輸液（ビカーボン輸液、大塚製薬社製）に２０％ＡＣＤおよび2.5％ヒト血清アルブミンを添加し、ＮａＯＨでｐＨ7.2に調整したものを使用した。そして、下記表１にしたがって、中空糸膜（プラズマフローＯＰ、旭化成メディカル社製）を用いて、前記巨核球の培養物を濃縮し、得られた巨核球の培養物の濃縮液を貯蔵バッグに回収した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（３－２）血小板の遠心分離
　まず、無菌接合装置を用いて、ACP215ディスポーザブルセットの廃液バッグを回収用バッグに置換した。前記回収用バッグは、ハイカリックＩＶＨバック（テルモ　HC-B3006A）を用いた。つぎに、前記巨核球の培養物の濃縮液に対して10％量のACD-A液（テルモ社製）を添加した。前記添加後、ACD-A液を添加した濃縮液を、細胞バッグに注入した。前記細胞バッグは、ハイカリックIVHバック（テルモ　HC-B3006A）を用いた。
　つぎに、無菌接合装置を用いて、ACD-A液を添加した培養物を含む細胞バッグをACP215ディスポーザブルセットに接合した。そして、ACP215をサービスモードで立ち上げ、回転数を2500rpm（350×g）にセットした。ACP215をスタートさせ、前記細胞バッグ中の培養物を約100ml/minで分離ボウルに導入した。前記分離ボウルより流出する液体成分は、回収バッグに回収した。前記細胞バッグ中の培養物の全量を分離ボウルに導入後、さらに500mlの洗浄保存液を前記分離ボウルに導入した。前記分離ボウルに前記洗浄保存液を導入後、遠心を止めてチューブシーラーを用いて回収液（血小板を含む回収された液体成分）を含む回収バッグを切り離した。
　新しいACP215ディスポーザブルセットに、前記無菌接合装置を用いて回収液（血小板を含む）を含んだ回収バッグを接合した。ACP215を通常モードで立ち上げた。プログラム設定はWPCを選択し、機器の指示に従い、前記回収バッグを接合したACP215ディスポーザブルセットをセットした。なお、回収液を含んだ回収バッグはスタンドに設置した。
　つぎに、ACP215の遠心速度を5000rpm（1398.8×g）に変更し、遠心をスタートさせた。前記分離ボウルへ前記回収液が導入され始めたとき、自動注入から手動注入に変更した。具体的には、前記回収液を約100ml/minの導入速度で前記分離ボウルに導入した。前記回収液全量を分離ボウルに添加後、さらに500mlの洗浄保存液を追加した。
（３－３）血小板の洗浄
　洗浄は、ACP215のプログラムに従って、2000mlの前記洗浄保存液で洗浄した。
（３－４）血小板の回収
　ACP215のプログラムに従って、200mlの洗浄済み血小板を血小板製剤バッグに回収した。
（３－５）血小板の分離
　前記血小板製剤バッグについて、前記中空糸膜を用いて、常法により血小板を分離し、回収用バッグに回収した。
（４）抽出物の製造
　前記巨核球またはその培養物としては、前記（１）の方法で得た不死化巨核球細胞株、前記（３－５）で得られた血小板製剤バッグに回収した血小板、および排液バッグに回収された血小板が除去された巨核球の培養物（以下、まとめて「原材料」ともいう）を用いた。血小板が除去された巨核球の培養物については、別個に調製した４サンプルを用いた（血小板除去巨核球培養物１～４）。
　各原材料について、洗浄液で２回洗浄した。前記洗浄液は、ビカネイト輸液に約２０（v/v）％になるようにACD-A液を添加後、NaOHを添加して、pHを７．０～７．４の範囲に調整したものを用いた。前記洗浄後、各原材料を、２０００×ｇ、１０分、室温（約２５℃）の条件で遠心した。前記遠心後、沈殿物を回収し、液体窒素を用いて、前記沈殿物を凍結した。つぎに、凍結した沈殿物に、細胞溶解バッファーを添加し、５０ｒｐｍ、４℃で３０分間振盪することにより溶解した。前記細胞溶解バッファーは、市販の細胞溶解バッファー（2× Cell Lysis Buffer、RayBiotech社製、Cat.No.: AA-LYS）に、プロテアーゼインヒビターカクテル（Protease Inhibitor Cocktail 、RayBiotech社製、Cat.No.: AA-PI）を添加したものを用いた。
　得られた溶解液について、１４０００×ｇ、５分間、４℃の条件で遠心した。前記遠心後、上清を、実施例の処理物として回収した。各原材料から得られた処理物について、Pierce（商標） BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、総タンパク質濃度を測定した。この結果、不死化巨核球細胞株を用いた場合、２．２×１０７細胞から、２．６０４ｍｇの総タンパク質が抽出された。また、血小板を用いた場合、２．５×１０８細胞から、１．１８７ｍｇの総タンパク質が抽出された。さらに、血小板除去巨核球培養物１～４を用いた場合、１．９７×１０８細胞、５．２５×１０８細胞、３．６４×１０８細胞、６．２２×１０８細胞から、それぞれ、２．８、５．９４４、３．６、および４．４９６ｍｇの総タンパク質が抽出された。そして、総タンパク質濃度を、５ｍｇ／ｍｌに調整した後、各処理物について、Quantibody（登録商標） Human Growth Factor Array 1（RayBiotech社製）を用いて、成長因子（ｂＦＧＦ、ＩＧＦＢＰ－１、ＩＧＦＢＰ－２、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＧＤＦ－１５、ＡＲ、ＢＭＰ－７、ＨＧＦ）および成長因子受容体（ＳＣＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２）の濃度（ｐｇ／総タンパク質５ｍｇ）を測定した。これらの結果を下記表２に示す。なお、下記表２は、総タンパク質５ｍｇあたりの濃度ということもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（５）細胞の増殖促進活性の確認
　ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を、１０ｃｍディッシュに、２．４～４．８×１０５細胞／１０ｍｌ　培地／ディッシュとなるように播種した。なお、前記間葉系幹細胞としては、市販のヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（Takara Bio社製、Cat. No.: C-12977）を２回継代培養した後に、回収した細胞を用いた。前記培地は、間葉系幹細胞増殖培地2（Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2、Takara Bio社製、Cat. No.: C-28009）に、血小板除去巨核球培養物２から調製した組成物を凍結後、溶解したものを添加した。前記組成物は、培地における前記組成物由来の総タンパク質濃度が、所定濃度（０、１２５、２５０、または５００μｇ／ｍｌ）となるように添加した。なお、前記培地は、維持培地である。
　前記播種後、前記間葉系幹細胞を３日間、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤下で培養した。前記培養後、前記間葉系幹細胞を回収し、同様の条件で播種し、再度３日間、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤下で培養した。つぎに、前記培養後の間葉系細胞を回収し、細胞数をカウントした。そして、前記播種時の細胞数を基準（１）とした際の回収時の細胞数の相対値を算出し、これを増殖活性の相対値とした。また、前記播種時の細胞数と、前記回収時の細胞数に基づき、細胞が一回増殖するために必要な時間（倍加時間）を算出した。これらの結果を図２に示す。
　図２は、細胞の増殖活性を示すグラフである。図２において、（Ａ）は、増殖活性を示し、（Ｂ）は、倍加時間を示す。図２（Ａ）において、横軸は、前記組成物由来の総タンパク質濃度を示し、縦軸は、増殖活性の相対値を示す。図２（Ｂ）において、横軸は、前記組成物由来の総タンパク質濃度を示し、縦軸は、倍加時間を示し、図中の数値は、倍加時間を示す。図２（Ａ）に示すように、本発明の組成物を添加した場合、前記組成物由来の総タンパク質濃度依存的に、間葉系幹細胞の増殖活性が増加した。また、図示していないが、前記組成物を添加していない間葉系幹細胞において、３回目の継代後の倍加時間は、２１時間であった。図２（Ｂ）に示すように、本発明の組成物を添加しない場合、間葉系幹細胞の倍加時間は、約１．５倍に延伸した。これに対して、図２（Ｂ）に示すように、本発明の組成物を添加した場合、前記組成物由来の総タンパク質濃度依存的に、間葉系幹細胞が一回増殖するために必要な時間が短縮した。また、本発明の組成物が未添加の培地で培養した場合、間葉系幹細胞は、継代回数を得ると倍加時間が延びた。これに対して、本発明の組成物を添加した場合、前記倍加時間の伸びがほぼ抑制された。このため、本発明の組成物は、細胞の増殖促進活性を示すこと、および増殖活性の低下を抑制できることがわかった。
（６）分化促進活性の確認
　前記（５）と同様にして、前記間葉系幹細胞を維持培養した。つぎに、各ウェルの培地を、等量の分化培地に交換した（分化開始０日目）。前記分化培地は、間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地（Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium、Takara Bio社製、Cat. No.: C-28013）に血小板除去巨核球培養物２から調製した組成物を凍結後、溶解したものを添加した。前記組成物は、分化培地における前記組成物由来の総タンパク質濃度が、所定濃度（０、１２５、または２５０μｇ／ｍｌ）となり、かつ維持培地における前記組成物由来の総タンパク質濃度との組合せが、下記表３の組合せとなるように添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　前記播種後、前記間葉系幹細胞を１４日間、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤下で培養した。前記培養中、３または４日毎に培地交換を行なった。分化開始後、７日目に、各サンプルについて、アルカリフォスファターゼの発現を、染色キット（TRACP & ALP double-stain Kit、Takara Bio社製、Cat. No.: MK300）を用いて染色することにより確認した。ネガティブコントロールは、前記分化培地に代えて前記維持培地のみを添加した以外は同様にして実施した。この結果を図３に示す。
　図３は、ＡＬＰの染色像を示す。図３に示すように、いずれのサンプルにおいても、ＡＬＰ陽性であり、骨芽細胞への分化が誘導されていることが確認できた。また、本発明の組成物を維持培地または分化培地に添加した場合、本発明の組成物を維持培地および分化培地に添加しなかった場合およびネガティブコントロールと比較して、培養後の間葉系幹細胞では、ＡＬＰが強く染色されており、骨芽細胞への分化が促進されていることが示唆された。
　また、分化開始後、１４日目に、各サンプルについて、アリザリンレッドＳを用いてカルシウムを染色することにより、骨基質の形成を確認した。ネガティブコントロールは、前記分化培地に代えて前記維持培地のみを添加した以外は同様にして実施した。この結果を図４に示す。
　図４は、カルシウムの染色像を示す。図４に示すように、維持培地および分化培地のいずれに対しても本発明の組成物を添加していないサンプルおよびネガティブコントロールでは、カルシウムがほとんど染色されなかった。これに対して、維持培地および分化培地の少なくとも一方に本発明の組成物を添加したサンプルでは、カルシウムが染色され、骨基質の形成が生じていることが確認できた。すなわち、本発明の組成物により、骨芽細胞への分化が促進されていることがわかった。
　さらに、分化開始後、１０、１４および１８日目に、培地中のカルシウムイオン濃度を測定した。前記培地中のカルシウムイオン濃度は、イオン選択型電極（BIOPROFILE（登録商標）FLEX、NOVA BIOMEDICAL社製）を用いて測定した。なお、培養開始時の培地中のカルシウムイオン濃度は、０．８８ｍｍｏｌ／ｌであった。また、前記間葉系幹細胞が骨芽細胞および骨芽細胞に分化した場合、培地中のカルシウムを利用して、骨基質を形成する。このため、カルシウムイオン濃度の低下を指標に、骨芽細胞および骨細胞への分化を評価できる。これらの結果を図５に示す。
　図５は、培地中のカルシウムイオン濃度を示すグラフである。図５において、横軸は、維持培地および分化培地における組成物由来の総タンパク質濃度と、各測定日におけるカルシウムイオン濃度の実測値を示し、縦軸は、カルシウムイオン濃度を示す。図５に示すように、分化開始１０日目において、本発明の組成物を添加したサンプルは、本発明の組成物を添加していないサンプルと同等以下のカルシウムイオン濃度であった。また、分化開始１４日目において、本発明の組成物を添加したサンプルは、本発明の組成物を添加していないサンプルと比較して、顕著にカルシウムイオン濃度が低下した。そして、分化開始１８日目において、本発明の組成物を添加したサンプルは、本発明の組成物を添加していないサンプルと同等以下のカルシウムイオン濃度であった。これらの結果から、本発明の組成物を添加すると、骨芽細胞および骨細胞への分化が早期に進み、培地中のカルシウムの取り込みがより早期に開始されることがわかった。これらの結果から、本発明の組成物は、骨芽細胞への分化促進活性を有することがわかった。
［実施例２］
　本発明の組成物が、細胞の増殖促進活性および骨芽細胞への分化促進活性を有することを確認した。
（１）細胞の増殖促進活性の確認
　前記間葉系幹細胞として、２回継代培養した後、回収して凍結保存した。前記凍結保存した細胞を解凍後、１回継代培養した細胞を用い、前記維持培地における前記組成物由来の総タンパク質濃度を、所定濃度（０、０．２、１．３、３１．３、６２．５、または１２５μｇ／ｍｌ）となるように添加した以外は、前記実施例１（５）と同様にして、増殖活性および倍加時間を算出した。これらの結果を図６に示す。
　図６は、細胞の増殖活性を示すグラフである。図６において、（Ａ）は、増殖活性を示し、（Ｂ）は、倍加時間を示す。図６（Ａ）において、横軸は、前記組成物由来の総タンパク質濃度を示し、縦軸は、増殖活性の相対値を示す。図６（Ｂ）において、横軸は前記組成物由来の総タンパク質濃度を示し、縦軸は、倍加時間を示す。図６（Ａ）に示すように、本発明の組成物を添加した場合、前記組成物由来の総タンパク質濃度依存的に、間葉系幹細胞の増殖活性が増加し、特に、総タンパク質濃度が３１．３μｇ／ｍｌ以上である場合、顕著に、間葉系幹細胞の増殖活性が増加した。また、図示していないが、前記組成物を添加していない間葉系幹細胞において、３回目の継代後の倍加時間は、１７時間であった。図６（Ｂ）に示すように、本発明の組成物を添加しない場合、間葉系幹細胞の倍加時間は、約１．５倍に延伸した。これに対して、図６（Ｂ）に示すように、本発明の組成物を添加した場合、前記組成物由来の総タンパク質濃度依存的に、間葉系幹細胞が一回増殖するために必要な時間が短縮し、特に、総タンパク質濃度が３１．３μｇ／ｍｌ以上である場合、顕著に、間葉系幹細胞が一回増殖するために必要な時間が短縮した。また、本発明の組成物が未添加の培地で培養した場合、間葉系幹細胞は、継代回数を得ると倍加時間が延びた。これに対して、本発明の組成物を添加した場合、前記倍加時間の伸びがほぼ抑制され、この効果は、前記組成物由来の総タンパク質濃度を３１．３μｇ／ｍｌ以上とした場合、顕著であった。このため、本発明の組成物は、細胞の増殖促進活性を示すこと、および増殖活性の低下を抑制できることがわかった。
（２）分化促進活性の確認
　前記実施例２（１）と同様にして、前記間葉系幹細胞を維持培養した。つぎに、各ウェルの培地を、等量の分化培地に交換した（分化開始０日目）。前記分化培地は、間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地に血小板除去巨核球培養物２から調製した組成物を凍結後、溶解したものを添加した。前記組成物は、分化培地における前記組成物由来の総タンパク質濃度が、所定濃度（０、０．２、１．３、３１．３、６２．５、または１２５μｇ／ｍｌ）となり、かつ維持培地における前記組成物由来の総タンパク質濃度との組合せが、下記表４の組合せとなるように添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　前記播種後、前記実施例１（６）と同様にして培養した。つぎに、分化開始後、１４および１８日目に、各サンプルについて、前記実施例１（６）と同様にしてカルシウムを染色することにより、骨基質の形成を確認した。この結果を図７および８に示す。
　図７および８は、カルシウムの染色像を示す。図７および８に示すように、維持培地および分化培地のいずれに対しても本発明の組成物を添加していないサンプルおよびネガティブコントロールでは、カルシウムがほとんど染色されなかった。これに対して、維持培地および分化培地の少なくとも一方に本発明の組成物を添加したサンプルでは、カルシウムが染色され、骨基質の形成が生じていることが確認できた。すなわち、本発明の組成物により、骨芽細胞への分化が促進されていることがわかった。
　さらに、分化開始後、６、１０、１４および１８日目に、前記実施例１（６）と同様にして、培地中のカルシウムイオン濃度を測定した。これらの結果を図９に示す。
　図９は、培地中のカルシウムイオン濃度を示すグラフである。図９において、横軸は、維持培地および分化培地における組成物由来の総タンパク質濃度と、各測定日におけるカルシウムイオン濃度の実測値を示し、縦軸は、カルシウムイオン濃度を示す。図９に示すように、分化開始６および１０日目において、本発明の組成物を添加したサンプルは、本発明の組成物を添加していないサンプルと同等以下のカルシウムイオン濃度であった。また、分化開始１４日目において、本発明の組成物を添加したサンプルは、本発明の組成物を添加していないサンプルと比較して、顕著にカルシウムイオン濃度が低下し、特に、前記分化培地における組成物由来の総タンパク質濃度が１．３μｇ／ｍｌのサンプルにおいて顕著であった。そして、分化開始１８日目において、本発明の組成物を添加したサンプルは、本発明の組成物を添加していないサンプルと同等以下のカルシウムイオン濃度であった。これらの結果から、本発明の組成物を添加すると、骨芽細胞および骨細胞への分化が早期に進み、培地中のカルシウムの取り込みがより早期に開始されることがわかった。また、本発明の組成物による骨芽細胞への分化促進活性は、組成物由来の総タンパク質濃度が０．２μｇ／ｍｌと低い条件でも得られることがわかった。これらの結果から、本発明の組成物は、骨芽細胞への分化促進活性を有することがわかった。
［実施例３］
　本発明の組成物が、細胞の増殖促進活性および骨芽細胞への分化促進活性を有することを確認した。
（１）細胞の増殖促進活性の確認
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ、PromoCell社製、Cat No. C-12974）を5×104 cells/wellとなるように２４ウェルプレートに播種し、７日間培養した。培地交換は、３日毎に、培地の２／３の量を新たな培地に交換することにより実施した。なお、前記播種密度で培養を開始した場合、約７日程度で８０％コンフルエントに達する細胞密度である。ＢＭＭＳＣの基本培地は、１０％ＦＢＳおよび１％抗菌薬（Ａｂ）を含有するＤＭＥＭ培地（low-glucose）とした。
　前記培養開始後２４時間において、前記実施例１（４）で調製した血小板除去巨核球培養物由来の組成物を、前記基本培地における前記組成物由来の総タンパク質濃度が、所定濃度（０、１２５、２５０、または５００μｇ／ｍｌ）となるように添加した。そして、前記組成物の添加後、３、５、または７日目に細胞数を、細胞数カウントキット（WST8、Cell Counting Kit-8、Dojindo社製、Cat No. 347-07621）を用い、添付のプロトコルにして算出した。また、ＡＬＰ活性は、ｐ－ニトロフェニルホスファート（SIGMAFAST（商標）p－ニトロフェニルホスファートタブレット、SIGMA社製、Cat No. N1891）を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、検討した。そして、細胞１個あたりのＡＬＰ活性値を算出した。これらの結果を、図１０および図１１に示す。
　図１０は、細胞数を示すグラフである。図１０において、横軸は、組成物添加後の日数を示し、縦軸は、細胞数を示す。また、図中の濃度は、総タンパク質濃度を示す（以下、同様。）図１０に示すように、本発明の組成物を含む培地で培養した場合、濃度依存的に細胞の増殖が促進された。なお、５００μｇ／ｍｌを添加した群では、７日目において、細胞数が減少しているが、これは、５日目にコンフルエントになったためである。
　つぎに、図１１は、ＡＬＰ活性を示すグラフである。図１１（Ａ）において、横軸は、組成物添加後の日数を示し、縦軸は、ＡＬＰ活性（吸光度ＯＤ４０５）を示す。図１１（Ｂ）において、横軸は、組成物添加後の日数を示し、縦軸は、ＡＬＰ活性（細胞数あたりのＡＬＰ活性値）を示す。図１１（Ｂ）に示すように、ウェル単位の場合、ＡＬＰ活性は５日目に最大となり、７日目に低下した。他方、図１１（Ａ）に示すように、細胞単位の場合、いずれの培養条件においても、ＡＬＰ活性は、経時的に低下した。一般的に、ＭＳＣでは、増殖とともに、分化が進むため、経時的にＡＬＰ活性が上昇する。しかしながら、本発明の組成物の存在下では、強い増殖が誘導される一方、ＡＬＰ活性が抑制されることから、分化誘導は抑制されていると推定された。これらのことから、本発明の組成物は、本発明の組成物は、細胞の増殖促進活性を示すことがわかった。
（２）分化促進活性の確認
　前記実施例３（１）と同様にして、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞について、７日間培養した。
　前記培養後、各ウェルの培地を、前記基本培地、または骨芽細胞分化因子として、１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸と、前記組成物とを含有する基本培地（分化培地）に交換し、２週間培養することで、骨芽細胞を誘導した。培地交換は、３日毎に、培地の２／３の量を新たな培地に交換することにより実施した。前記組成物は、前記基本培地における前記組成物由来の総タンパク質濃度が、所定濃度（０、１２５、２５０、または５００μｇ／ｍｌ）となるように添加した。前記組成物は、前記実施例１（４）で調製した血小板除去巨核球培養物由来の組成物を用いた。
　前記誘導開始日を基準として、７、１０または１４日に、細胞数とＡＬＰ活性とを測定した。前記細胞数は、前記細胞数カウントキットを用い、添付のプロトコルにして算出した。ＡＬＰ活性は、ｐ－ニトロフェニルホスファート（SIGMAFAST（商標）p－ニトロフェニルホスファートタブレット、SIGMA社製、Cat No. N1891）を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、検討した。そして、細胞１個あたりのＡＬＰ活性値を算出した。これらの結果を、図１２および１３に示す。
　図１２は、細胞数を示すグラフである。図１２において、横軸は、骨芽細胞の分化誘導開始後の日数を示し、縦軸は、細胞数を示す。図１２（Ａ）に示すように、骨芽細胞分化因子を含まない場合、本発明の組成物を含む培地で培養すると、経時的な細胞数の増加が観察された。他方、図１２（Ｂ）に示すように、骨芽細胞分化因子を含むと、本発明の組成物を含む培地で培養した場合、経時的な細胞数の減少が濃度依存的に抑制された。
　つぎに、図１３は、ＡＬＰ活性を示すグラフである。図１３（Ａ）および（Ｃ）において、横軸は、骨芽細胞の分化誘導開始後の日数を示し、縦軸は、ＡＬＰ活性（吸光度ＯＤ４０５）を示す。図１３（Ｂ）および（Ｄ）において、横軸は、組成物添加後の日数を示し、縦軸は、ＡＬＰ活性（細胞数あたりのＡＬＰ活性値）を示す。図１３（Ａ）および（Ｂ）に示すように、骨芽細胞分化因子を含まない場合、本発明の組成物を含む培地で培養すると、経時的にＡＬＰの活性は増加するものの、本発明の組成物を含まない比較例の培地（０μｇ／ｍｌ）との間でＡＬＰ活性の差は、観察されなかった。他方、図１３（Ｃ）および（Ｄ）に示すように、骨芽細胞分化因子を含む場合、本発明の組成物を含む培地で培養すると、分化誘導開始後１４日目において、本発明の組成物を含まない比較例の培地（０μｇ／ｍｌ）で培養した場合と比較して、ＡＬＰ活性が有意に上昇した。なお、比較例の培地（０μｇ／ｍｌ）について、分化誘導開始後１０日目において、吸光度の上昇が見られるのは、細胞増殖による細胞数の増加に起因するものと推定される。これらの結果から、本発明の組成物は、アスコルビン酸による骨芽細胞の分化誘導系においても、骨芽細胞の分化誘導を促進できることがわかった。また、本発明の組成物は、骨芽細胞分化因子により誘導される骨芽細胞への分化誘導を促進することがわかった。したがって、本発明の組成物が、骨芽細胞への分化促進活性を有するといえる。
［実施例４］
　本発明の組成物が、in vivoで骨形成および骨造成を促進することを確認した。
　骨形成モデルとしては、ヌードマウス頭蓋骨上で骨形成を行なうモデルを使用した。具体的には、ヌードマウス（８週齢BALB/cAJCL-nu/nu）の頭蓋骨上（骨膜下）に、全身麻酔（３種混合）下にて、本発明の組成物を人工骨材料とともに、移植試料とし、移植した。具体的には、下記４群を設定した。
・ネガティブコントロール群（ｎ＝５）
　２５ｍｇのβ－ＴＣＰ（β－リン酸三カルシウム）顆粒（β-TCP granules、OSferion G1、Oympus Terumo社製)のみから調製した移植試料を移植した。
・ポジティブコントロール群（ｎ＝９）
　２５ｍｇのβ－ＴＣＰ顆粒および多血小板血漿（ＰＲＰ）を移植した。多血小板血漿は、マウスの末梢血から、末梢血における血小板濃度の６倍の濃度となるように血小板を濃縮した物を用いて、移植試料を調製し、移植した。
・実施例４Ａ（ｎ＝５）
　２５ｍｇのβ－ＴＣＰ顆粒と、ポジティブコントロールと同数の細胞（１．６５×１０８個）を含む血小板除去巨核球培養物から調製した組成物（総タンパク質約２ｍｇ）を用いて、移植試料を調製し、移植した。
・実施例４Ｂ（ｎ＝１６）
　２５ｍｇのβ－ＴＣＰ顆粒と、ポジティブコントロールの５倍の細胞（８．２５×１０８個）を含む血小板除去巨核球培養物から調製した組成物を用いて、移植試料を調製し、移植した。
　各人工骨材料は以下のようにして、調製した。
・ネガティブコントロール群
　ダッペングラス上で、滅菌済みTCP 25mg を50μl bovine fibrinogen （10mg/ml） （Sigma, F8630）と混和し、5μl bovine thrombin (100U/ml)（Sigma, T9549）を添加してゲル化させた。ゲル化後は速やかに移植するため、これらの工程は、動物センター内で実施した。
・ポジティブコントロール群
　低蛋白吸着性チューブにて、１００μlの前記多血小板血漿（PRP）を２５ｍｇのβ－ＴＣＰ顆粒に含浸させた。前記含浸後、１０μｌの自己血清（１０ｍｇ／ｍｌ）と混和し、５μｌ thrombin（１００　Ｕ／ｍｌ）を添加してゲル化させた。ゲル化後は速やかに移植するため、これらの工程は、動物センター内で実施した。
・実施例４Ａ
　低蛋白吸着性チューブにて、8μlの本発明の組成物と、32μlの滅菌水（ＤＷ）を混和し、ついで、25mg TCPに含浸させた。前記含浸後、10μl fibrinogen (10mg/ml)と混和し、5μl thrombin（100U/ml）を添加してゲル化させた。ゲル化後は速やかに移植するため、これらの工程は、動物センター内で実施した。
・実施例４Ｂ
　低蛋白吸着性チューブにて、40μlの本発明の組成物に、25mg TCP を含浸させた。前記含浸後、10μl fibrinogen (10mg/ml)と混和し、5μl thrombin（100U/ml）を添加してゲル化させる。ゲル化後は速やかに移植するため、これらの工程は、動物センター内で実施した。
　前記移植後、４または８週目に、周囲頭蓋骨含む移植試料を摘出後、HE染色による組織学的な観察を行った。また、あわせて、骨形成または骨増生が生じている領域について、ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）を用いてピクセル単位でカウントすることにより、骨形成量および骨造成量を検討した。なお、骨形成量は、移植試料内に新たに形成された新生骨部であり、骨造成量は、新生骨、骨髄およびその周囲の人工骨を対象領域とした。なお、骨形成量および骨増生量は、ネガティブコントロール群における骨形成量および骨増生量により補正した。これらの結果を、図１４および１５に示す。
　図１４は、骨形成を示す写真である。図１４において、各写真は、左から、実施例４Ａ、実施例４Ｂ、ポジティブコントロール群およびネガティブコントロール群の結果を示す写真である。また、各群の写真において、上段は、倍率２０倍の対物レンズで撮像した写真であり、下段は、倍率１００倍の対物レンズで撮像した写真であり、上段の破線部で示した領域の拡大写真である。図１４（Ａ）～（Ｃ）に示すように、実施例４（Ａ）および（Ｂ）と、ポジティブコントロールでは、薄いグレーの人工骨の残存部の周囲に、濃いグレーで示される領域に骨が新たに形成されていた。
　つぎに、図１５は、骨形成量および骨増生量を示すグラフである。図１５において、（Ａ）は、骨形成量を示し、（Ｂ）は、骨増生量を示す。図１５（Ａ）において、横軸は、移植材の移植後の期間を示し、縦軸は、骨形成量を示す。また、図１５（Ｂ）において、横軸は、移植材の移植後の期間を示し、縦軸は、骨増生量を示す。図１４および図１５に示すように、実施例４Ａは、移植後４～８週目にかけて、ポジティブコントロール群と、同程度の新生骨形成、および新生骨周囲の骨髄や人工骨を含む骨増生を認めた。さらに、実施例４Ｂでは、移植後４週目において、ポジティブコントロール群を超える骨形成量および骨増生量を認めたが、移植後８週目においては、ポジティブコントロール群と、同程度骨形成量および骨増生量であった。これは、実施例４Ｂでは、移植後４週目において、既に、ポジティブコントロール群および実施例４Ａと同程度の骨形成量および骨増生量のプラトーに達しているためと推定された。
［実施例５］
　本発明の組成物が、抗炎症活性を有することを確認した。
（１）免疫細胞の活性化
　免疫細胞の活性化は、図１６（Ａ）および図１７（Ａ）に示すように実施した。具体的には、まず、２４ウェルプレートに、１５ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体（eBioscience社製、Cat No.：2045756）および５ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ２８抗体（eBioscience社製、Cat No.：1928813）を含むリン酸緩衝液を播種し、オーバーナイト（約１２時間）でインキュベートすることにより、これらの抗体をプレートに固相化した。ついで、ボランティアより採取した末梢血から末梢血単核球を、フィコール（Histopaque（登録商標）1077、SigmaAldrich）を用いて単離した。前記末梢血単核球を、前記２４ウェルプレートに、２．５×１０６cells/welとなるように播種し、培養を開始した。前記末梢血単核球の培地は、１０％ＦＢＳおよび１％Ａｂ含有ＲＰＭＩ培地（gibco社製、Cat No.：20621736）を用いた。
　前記培養開始後１時間に、各ウェルに、前記培地における組成物由来の総タンパク質濃度が、所定濃度（０、１２５、２５０、または５００μｇ／ｍｌ）となるように、組成物（ｉＭＤＦ）を添加した。前記組成物は、前記実施例１（４）で調製した血小板除去巨核球培養物由来の組成物を用いた。前記組成物の添加後、さらに１時間または３時間培養した。前記培養後、前記末梢血単核球を回収し、ついで、ｍＲＮＡ抽出試薬（Trizol（登録商標）、Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、前記末梢血単核球からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡと、逆転写酵素（SuperScript（商標） III First-Strand Synthesis System、Thermo Fisher Scientific社製）とを用いて、ｃＤＮＡを合成した。
（２）サイトカイン発現量の測定
　得られたｃＤＮＡ、下記プライマーセット、およびＤＮＡポリメラーゼ（Takara-Taq、タカラバイオ社製）を用い、ｑＰＣＲ装置（Mx3000P QPCR System、アジレント・テクノロジー株式会社製）により、各遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。前記測定後、内部標準遺伝子（ＧＡＰＤＨ遺伝子）の発現量に基づき、各遺伝子の相対的な発現量を算出した。ネガティブコントロールは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を固相化しなかった以外（Unstimulated）は、同様にして実施した。これらの結果を図１６および図１７に示す。
・ＴＮＦ－α用プライマーセット
　フォワードプライマー（配列番号１）
　5'-AATGGCGTGGAGCTGAGA-3'
　リバースプライマー（配列番号２）
　5'-TAGACCTGCCCAGACTCGG-3'
・ＩＦＮ－γ用プライマーセット
　フォワードプライマー（配列番号３）
　5'-CTGTTACTGCCAGGACCCAT-3'
　リバースプライマー（配列番号４）
　5'-ACACTCTTTTGGATGCTCTGGT-3'
・ＩＬ－１β用プライマーセット
　フォワードプライマー（配列番号５）
　5'-CACAGACCTTCCAGGAGAAT-3'
　リバースプライマー（配列番号６）
　5'-TTCAACACGCAGGACAGGTA-3'
・ＩＬ－６用プライマーセット
　フォワードプライマー（配列番号７）
　5'-GTACATCCTCGACGGCATC-3'
　リバースプライマー（配列番号８）
　5'-AGCCACTGGTTCTGTGCCT-3'
・ＧＡＰＤＨ用プライマーセット
　フォワードプライマー（配列番号９）
　5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3'
　リバースプライマー（配列番号１０）
　5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3'
　図１６および図１７は、実験の概要およびサイトカイン遺伝子の発現量を示す模式図およびグラフである。図１６（Ｂ）～（Ｅ）および図１７（Ｂ）～（Ｅ）において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、各遺伝子の相対的発現量を示す。図１７（Ｂ）～（Ｅ）に示すように、本発明の組成物は、刺激後３時間において、濃度依存的に、末梢血単核球によるＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１βおよびＩＬ－６の発現誘導を抑制した。他方、図１６（Ｂ）～（Ｅ）に示すように、本発明の組成物は、刺激後１時間において、濃度依存的に、末梢血単核球によるＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－６の発現誘導を抑制した。なお、刺激後１時間においては、ＩＦＮ－γの発現誘導が抑制されていないが、刺激後３時間においては、ＩＦＮ－γの発現誘導が抑制されていることから、本発明の組成物によるＩＦＮ－γの発現誘導の抑制は、他の炎症性サイトカインと比較して、遅いタイミングで効果が表れることがわかった。本実施例において使用した抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、Ｔ細胞を活性化することから、本発明の組成物は、Ｔ細胞等の免疫細胞の活性化を、そのサイトカイン遺伝子の発現誘導を抑制することにより、抑制すると推定された。
［実施例６］
　本発明の組成物が、in vivoで頭蓋骨欠損部位の骨形成および骨造成を促進することを確認した。
　骨形成モデルとしては、ヌードラット頭蓋骨欠損部で骨形成を行なうモデルを使用した。具体的には、ヌードラット（８週齢、F344/NJcl-rnu/nu）の頭蓋骨に、全身麻酔（３種混合）下にて、４ｍｍの欠損部位を作成し、本発明の組成物を人工骨材料とともに、移植試料とし、移植した。具体的には、下記２群を設定した。
・ネガティブコントロール群（ｎ＝１７）
　径４ｍｍのリン酸オクタカルシウム（Octacalcium phosphate：ＯＣＰ）/Collagen（Ｃｏｌ）担体にPBSを含侵させ、調製した移植試料を移植した。
・実施例６（ｎ＝８）
　８．２５×１０８個の多血小板血漿に相当する血小板除去巨核球培養物から調製した組成物（総タンパク質約２５ｍｇ）をＯＣＰ／Ｃｏｌ担体に含侵・吸着させ、移植試料を調製し、移植した。
　各人工骨材料は以下のようにして、調製した。
・ネガティブコントロール群
　ＯＣＰ顆粒（径３００～５００μｍ）と、３％ブタ由来テロコラーゼンとを混合し、前記混合後、凍結乾燥を行った。前記凍結乾燥後、熱架橋を行い、ＯＣＰ／Ｃｏｌ担体（ＯＣＰ担体、重量比７７％ＯＣＰ含有；直径５ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を作製した。
・実施例６
　２０μｌの本発明の組成物（８．２５×１０８個の多血小板血漿に相当）をＯＣＰ担体に含浸させ、本発明の組成物を含んだＯＣＰ担体を得た。
　ネガティブコントロール群および実施例６について、前記欠損部位に移植時を基準として、４または８週目に、周囲頭蓋骨含む移植試料を摘出後、得られた摘出部について、μＣＴ撮影を行った。前記撮影後、前記摘出部から標本を作製し、HE染色またはマッソントリクローム（Masson trichrome）染色による組織学的な観察、および免疫染色を行った。また、移植材料から新生された骨（新生骨）の骨量および骨塩量と、欠損部位の作成時に摘出した骨の骨量（ＢＳ）に対する移植材料から新生された骨の骨量（ＢＲ）との比（ＢＲ／ＢＳ）と、骨密度とを評価した。前記評価では、３Ｄ骨解析ソフト（TRI/3D-BON;Ratoc System Engineering社製）を用い、骨形態（骨量：ＢＶ（ｃｍ3）、骨塩量：ＢＭＣ（ｍｇ）、骨密度：ＢＭＤ（ｍｇ／ｃｍ3））の計測を行った。前記欠損部位の作成時に摘出した骨の骨量（ＢＳ）に対する移植材料から新生された骨の骨量（ＢＲ）との比（ＢＲ／ＢＳ）は、欠損骨量を１００％とした場合の比として、算出した。これらの結果を、図１８および図１９に示す。
　図１８は、移植後４週目における、骨形成を示す写真である。図１８において、各写真は、上段は、ネガティブコントロール群を示し、下段は、実施例６の群の結果を示す写真である。また、各群の写真において、左から、前記摘出部全体、前記欠損部位のうち左側、前記欠損部位のうち右側、および前記摘出部のうち欠損部位を含む断面の写真である。図１８に示すように、実施例６の群では、頭蓋骨の欠損部位に、骨が新たに形成されていたことがわかった。
　つぎに、図１９は、移植後４週目における、骨量、骨塩量、欠損骨量と新生骨量との比、および骨密度を示すグラフである。図１９において、（Ａ）は、骨量を示し、（Ｂ）は、骨塩量を示し、（Ｃ）は、欠損骨量と新生骨量との比（ＢＲ／ＢＳ）を示し、（Ｄ）は、骨密度を示す。図１９（Ａ）において、横軸は、実験群の種類を示し、縦軸は、骨量（ＢＶ）（ｃｍ３）を示す。図１９（Ｂ）において、横軸は、実験群の種類を示し、縦軸は、骨塩量（ＢＭＣ）（ｍｇ）を示す。図１９（Ｃ）において、横軸は、実験群の種類を示し、縦軸は、欠損骨量と新生骨量との比（％）を示す。図１９（Ｄ）において、横軸は、実験群の種類を示し、縦軸は、骨密度ＢＭＤ（ｍｇ／ｃｍ３）を示す。図１９に示すように、ネガティブコントロール群と比べて、実施例６は、欠損部の左右共に、骨量、骨塩量、欠損骨量と新生骨量との比、および骨密度が増加した。以上のことから、本発明の組成物は、頭蓋骨の欠損部位に、骨を新たに形成できることがわかった。
　以上のことから、本発明の組成物は、骨形成および骨増生を誘導できること、およびその成分含有量を増加させることにより、骨形成および骨増生を促進できることがわかった。
　以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０２０年１０月２７日に出願された日本出願特願２０２０－１８００４２を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
＜付記＞
　上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
巨核球またはその培養物の処理物を含む、骨形成組成物。
（付記２）
前記処理物は、巨核球またはその培養物の細胞画分の抽出物である、付記１記載の骨形成組成物。
（付記３）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０００～２００００ｐｇの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、付記１または２記載の骨形成組成物。
（付記４）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、８０００～８００００ｐｇのインスリン様増殖因子結合タンパク質－２（ＩＧＦＢＰ－２）を含む、付記１から３のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記５）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１～６０ｐｇの胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）を含む、付記１から４のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記６）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２００～２０００ｐｇの幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）を含む、付記１から５のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記７）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～８００ｐｇの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、付記１から６のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記８）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～４００ｐｇの血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）を含む、付記１から７のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記９）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１０００～１００００ｐｇの分化増殖因子－１５（ＧＤＦ－１５）を含む、付記１から８のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記１０）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１０００ｐｇの骨形成タンパク質－７（ＢＭＰ－７）を含む、付記１から９のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記１１）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１６ｐｇのアンフィレグリン（ＡＲ）を含む、付記１から１０のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記１２）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～６０ｐｇの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を含む、付記１から１１のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記１３）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１００ｐｇの肝臓増殖因子（ＨＧＦ）を含む、付記１から１２のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記１４）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～２００ｐｇのインスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ－１）を含む、付記１から１３のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記１５）
細胞の増殖促進活性を有する、付記１から１４のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記１６）
前記細胞は、間葉系幹細胞である、付記１５記載の骨形成組成物。
（付記１７）
骨芽細胞の前駆細胞から骨芽細胞への分化促進能を有する、付記１から１６のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記１８）
前記骨芽細胞の前駆細胞は、間葉系幹細胞である、付記１７記載の骨形成組成物。
（付記１９）
前記巨核球の培養物は、血小板が除去された培養物である、付記１から１８のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記２０）
前記巨核球は、不死化巨核球である、付記１から１９のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記２１）
前記不死化巨核球は、外来性のＢＭＩ１遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、およびＢｃｌ－ｘＬ遺伝子を含む巨核球である、付記２０記載の骨形成組成物。
（付記２２）
前記巨核球は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導された巨核球である、付記１から２１のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記２３）
前記巨核球は、多能性細胞由来である、付記１から２２のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記２４）
前記多能性細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、付記２３記載の骨形成組成物。
（付記２５）
前記処理物は、
　巨核球またはその培養物を処理し、
　前記処理は、濃縮処理、乾燥処理、凍結処理、凍結乾燥処理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理、タンパク質分画抽出処理、超音波処理、および／または破砕処理である、付記１から２４のいずれかに記載の骨形成組成物。
（付記２６）
前記処理物は、
　前記巨核球またはその培養物から血小板を除去し、
　前記血小板が除去された巨核球またはその培養物を処理する、付記２５記載の骨形成組成物。
（付記２７）
前記処理物は、
　前記血小板が除去された巨核球またはその培養物を保存し、
　前記保存された巨核球またはその培養物を処理する、付記２６記載の骨形成組成物。
（付記２８）
前記処理物は、
　前記巨核球またはその培養物を保存し、
　前記保存された巨核球またはその培養物を破砕処理する、付記２７記載の骨形成組成物。
（付記２９）
骨形成組成物と、骨形成の足場材料とを含み、
前記骨形成組成物は、付記１から２８のいずれかに記載の骨形成組成物である、骨形成キット。
（付記３０）
前記足場材料は、生体適合性および／または生分解性を示す、付記２９記載のキット。
（付記３１）
前記足場材料は、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ケラチン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、キトサン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸とポリ乳酸の共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、ポリエーテルケトン、およびポリエーテルエーテルケトンからなる群から選択される少なくとも１つから構成される、付記２９または３０記載のキット。
（付記３２）
前記足場材料は、多孔質構造を有する、付記２９から３１のいずれかに記載のキット。
（付記３３）
生理活性物質を含む、付記２９から３２のいずれかに記載のキット。
（付記３４）
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、増殖分化因子－５（ＧＤＦ５）、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）および骨形成タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つを含む、付記２９から３３のいずれかに記載のキット。
（付記３５）
付記１から２８のいずれかに記載の骨形成組成物を含む、骨芽細胞の分化促進組成物。
（付記３６）
巨核球またはその培養物の処理物を含む、免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記３７）
前記処理物は、巨核球またはその培養物の細胞画分の抽出物である、付記３６記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記３８）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０００～２００００ｐｇの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、付記３６または３７記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記３９）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、８０００～８００００ｐｇのインスリン様増殖因子結合タンパク質－２（ＩＧＦＢＰ－２）を含む、付記３６から３８のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記４０）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１～６０ｐｇの胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）を含む、付記３６から３９のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記４１）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２００～２０００ｐｇの幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）を含む、付記３６から４０のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記４２）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～８００ｐｇの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、付記３６から４１のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記４３）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～４００ｐｇの血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）を含む、付記３６から４２のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記４４）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１０００～１００００ｐｇの分化増殖因子－１５（ＧＤＦ－１５）を含む、付記３６から４３のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記４５）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１６ｐｇのアンフィレグリン（ＡＲ）を含む、付記３６から４４のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記４６）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～６０ｐｇの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を含む、付記３６から４５のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記４７）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１００ｐｇの肝臓増殖因子（ＨＧＦ）を含む、付記３６から４６のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記４８）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～２００ｐｇのインスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ－１）を含む、付記３６から４７のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記４９）
前記免疫細胞は、Ｔ細胞である、付記３６から４８のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記５０）
前記巨核球は、不死化巨核球である、付記３６から４９のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記５１）
前記巨核球は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導された巨核球である、付記３６から５０のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物。
（付記５２）
付記３６から５１のいずれか一項に記載の免疫細胞の活性化抑制組成物を含む、抗炎症組成物。
（付記５３）
付記１から２８のいずれかに記載の骨形成組成物を使用する、骨芽細胞の分化促進方法。
（付記５４）
前記骨形成組成物を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで使用する、付記５３記載の骨芽細胞の分化促進方法。
（付記５５）
付記３５記載の骨芽細胞の分化促進組成物を使用する、骨芽細胞の分化促進方法。
（付記５６）
前記骨芽細胞の分化促進組成物を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで使用する、付記５５記載の骨芽細胞の分化促進方法。
（付記５７）
付記３６から５１のいずれかに記載の免疫細胞の活性化抑制組成物を使用する、免疫細胞の活性化抑制方法。
（付記５８）
前記免疫細胞の活性化抑制組成物を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで使用する、付記５７記載の骨芽細胞の分化促進方法。
（付記５９）
付記５２記載の抗炎症組成物を使用する、炎症の抑制方法。
（付記６０）
前記抗炎症組成物を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで使用する、付記５９記載の炎症の抑制方法。
（付記６１）
骨形成のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物。
（付記６２）
骨芽細胞の分化促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物。
（付記６３）
免疫細胞の活性化抑制のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物。
（付記６４）
炎症の抑制のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物。
　以上のように、本発明によれば、細細胞由来の骨形成活性を有する組成物を提供できる。また、本発明の組成物は、例えば、細胞の増殖促進活性および骨芽細胞への分化促進活性を有する。このため、本発明は、医薬分野、再生医療分野等において極めて有用である。

 

Claims (20)

  1. 巨核球またはその培養物の処理物を含む、骨形成組成物。
  2. 前記処理物は、巨核球またはその培養物の細胞画分の抽出物である、請求項１記載の骨形成組成物。
  3. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０００～２００００ｐｇの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、請求項１または２記載の骨形成組成物。
  4. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、８０００～８００００ｐｇのインスリン様増殖因子結合タンパク質－２（ＩＧＦＢＰ－２）を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  5. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１～６０ｐｇの胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  6. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２００～２０００ｐｇの幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  7. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～８００ｐｇの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  8. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～４００ｐｇの血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  9. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１０００～１００００ｐｇの分化増殖因子－１５（ＧＤＦ－１５）を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  10. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１６ｐｇのアンフィレグリン（ＡＲ）を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  11. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～６０ｐｇの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  12. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１００ｐｇの肝臓増殖因子（ＨＧＦ）を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  13. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～２００ｐｇのインスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ－１）を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  14. 細胞の増殖促進活性を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  15. 前記細胞は、間葉系幹細胞である、請求項１４記載の骨形成組成物。
  16. 骨芽細胞の前駆細胞から骨芽細胞への分化促進能を有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  17. 前記骨芽細胞の前駆細胞は、間葉系幹細胞である、請求項１６記載の骨形成組成物。
  18. 前記巨核球は、不死化巨核球である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  19. 前記巨核球は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導された巨核球である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の骨形成組成物。
  20. 骨形成組成物と、骨形成の足場材料とを含み、
    前記骨形成組成物は、請求項１から１９のいずれか一項に記載の骨形成組成物である、骨形成キット。
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