WO2022034902A1 - 腎臓濾過機能再現装置、腎臓濾過機能評価装置、及び腎臓濾過機能評価方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a kidney filtration function reproduction device, a kidney filtration function evaluation device, and a kidney filtration function evaluation method.
- This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-136347 filed in Japan on August 12, 2020 and Japanese Patent Application No. 2020-141828 filed in Japan on August 25, 2020. The contents are used here.
- Patent Document 1 discloses a perfusion culture apparatus capable of culturing cells having a multi-layered structure in the realization of regenerative medicine in which iPS cells, ES cells and the like are cultured and the cultures are transplanted to humans.
- a pressure difference is provided on both sides of a sheet-shaped carrier that holds cells, and the medium passes through the carrier according to the pressure difference. Therefore, the medium can be supplied not only to the upper layer of the multi-layered cell but also to the cells in the lower layer and the intermediate layer.
- nephrotic syndrome in renal pathology is a syndrome whose main symptom is proteinuria / hypoalbuminemia caused by damage to glomerular epithelial cells (podocytes), and causes renal death requiring renal replacement therapy. It has become a global problem as a group of diseases. Many of these syndromes are caused by drugs, and are positioned as one of the important evaluation items as "evaluation of the presence or absence of nephrotoxicity" in drug discovery research.
- the development of an application that can artificially reproduce the filtering function of the human kidney is required as an alternative method to animal experiments for verification of the presence or absence of toxicity of candidate compounds to humans in drug discovery research.
- the present invention has been made in view of the above problems, and is a kidney filtration function reproduction device capable of artificially reproducing the filtration function of a human kidney, and a kidney filtration function evaluation device using the kidney filtration function reproduction device. And the purpose is to provide a method for evaluating renal filtration function.
- a first container into which a liquid is introduced, a biofilter for filtering the liquid introduced into the first container, and a filtrate that has passed through the biofilter are introduced.
- the biofilter has a permeable membrane that partitions the first container and the second container, and the biofilter is arranged on a surface of the permeable membrane that faces the second container.
- the two container-side filters and the second container-side filter having the same are formed from podsites.
- the biofilter may have a first container-side filter arranged on the surface of the permeable membrane facing the first container.
- the first container-side filter may be formed from endothelial cells.
- the kidney filtration function reproducing device may have a pressure control device that controls the pressure difference between the first container and the second container.
- the first container seals the first container main body in which the first liquid storage chamber for storing the liquid is formed and the first liquid storage chamber of the first container main body.
- the pressure control device may have an air supply line and a pressure measuring line that penetrate the closed body and are inserted into the first liquid storage chamber.
- the second container includes a second liquid storage chamber into which the filtrate is introduced and a recess communicating with the second liquid storage chamber, and the recess is the first.
- a part of the wall surface of the liquid storage chamber may be formed so as to be recessed outward.
- the bottom of the second container has transparency to visible light and is inserted into the gap between the side wall of the first container and the side wall of the second container, and the second container is inserted.
- An insertion member having a flat surface formed on at least a part of the lower surface facing the bottom of the container may be provided.
- the flat surface portion is formed in a groove portion provided on the lower surface of the insertion member, and the lower surface of the insertion member excluding the groove portion is in contact with the bottom portion of the second container. May be good.
- the filtrate discharge tank communicating with the second container, the dam portion formed between the second container and the filtrate discharge tank, and the insertion member are the dams.
- a flange portion that is provided so as to straddle the portions and guides the filtered liquid from the second container to the filtered liquid discharge tank may be provided.
- the kidney filtration function evaluation device includes the kidney filtration function reproduction device described above, and is an evaluation substance for evaluating the filtration function of the biofilter in the liquid introduced into the first container. At least one of the test substances for verifying the presence or absence of toxicity to the biofilter is added to evaluate the kidney filtration function.
- the kidney filtration function evaluation device may include an evaluator passage amount measuring device that measures the passage amount of the evaluation substance that has passed through the biofilter.
- the evaluation substance contains at least one of the first substance and the second substance, and the first substance is the second container-side filter when the biofilter is in a normal state. The second substance may easily pass through the second container-side filter when the biofilter is in a normal state.
- at least one of the first substance and the second substance is a fluorescent label, and the evaluation substance passing amount measuring device measures the passing amount of the evaluation substance to the fluorescence of the filtrate. It may be measured based on the brightness.
- the second container has a transparent portion, and the evaluation substance passing amount measuring device projects measurement light from the transparent portion onto the filtrate to the evaluation substance. You may measure the passing amount of.
- the kidney filtration function evaluation method is a kidney filtration function evaluation method using the kidney filtration function reproduction device described above, and the biofilter is added to the liquid introduced into the first container.
- the renal filtration function is evaluated by adding at least one of an evaluation substance for evaluating the filtration function of the above and a test substance for verifying the presence or absence of toxicity to the biofilter.
- a kidney filtration function reproduction device capable of artificially reproducing the filtration function of a human kidney, a kidney filtration function evaluation device using the kidney filtration function reproduction device, and a kidney filtration function evaluation method are provided. Can be provided.
- FIG. 36 It is a top view of the multi-well plate provided in the kidney filtration function evaluation apparatus shown in FIG. 36. It is an exploded perspective view of the multi-well plate shown in FIG. 37. It is a bottom side perspective view of the inserter which concerns on 3rd Embodiment. It is sectional drawing of the kidney filtration function evaluation apparatus which arranged the inserter which concerns on the 1st modification of 3rd Embodiment. It is a top side perspective view of the inserter which concerns on 1st modification of 3rd Embodiment. It is sectional drawing of the kidney filtration function evaluation apparatus which arranged the inserter which concerns on the 2nd modification of 3rd Embodiment.
- FIG. 42 It is an exploded perspective view of the multi-well plate provided in the kidney filtration function evaluation apparatus shown in FIG. 42. It is sectional drawing of the kidney filtration function evaluation apparatus which arranged the inserter which concerns on the 3rd modification of 3rd Embodiment. It is a top view of the multi-well plate provided in the kidney filtration function evaluation apparatus shown in FIG. 44. It is an exploded perspective view of the multi-well plate shown in FIG. 45. It is a graph which shows the calibration curve and the coefficient of determination of the serially diluted fluorescent solution using FITC inulin when the inserter which concerns on 3rd Embodiment is used.
- FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a kidney filtration function reproduction device 1 and a kidney filtration function evaluation device 100 according to the first embodiment.
- the kidney filtration function reproducing device 1 has a first container 10, a second container 20, and a biofilter 30.
- the kidney filtration function reproduction device 1 shown in FIG. 1 simulates the renal corpuscle of a human kidney.
- the first container 10 corresponds to the glomerulus of the renal corpuscle.
- the liquid 2 introduced into the first container 10 corresponds to blood.
- the second container 20 corresponds to Bowman's capsule of the renal corpuscle.
- the filtrate 3 that has passed through the biofilter 30 introduced into the second container 20 corresponds to raw urine.
- the biofilter 30 corresponds to the capillary snare wall of the glomerulus.
- the biofilter 30 includes a permeable membrane 31 that partitions the first container 10 and the second container 20, a second container-side filter 32 that is arranged on the surface of the permeable film 31 facing the second container 20, and a permeable membrane 31. It has a first container side filter 33 arranged on a surface facing the first container 10 of the above.
- the permeable membrane 31 corresponds to the glomerular basement membrane of the capillary snare wall.
- the second container-side filter 32 corresponds to the podocyte layer of the capillary snare wall.
- the first container-side filter 33 corresponds to the glomerular endothelial cell layer of the capillary snare wall.
- the second container-side filter 32 is formed, for example, by podocytes of a human kidney cultured by a cell culture technique.
- Podocytes have a morphology (scrum structure) in which several protrusions (primary protrusions) extend from the cell body and a large number of protrusions (podocytes) extending from the primary protrusions are entangled with the adjacent ones.
- a protein called Slim Diaphragm Protein is retained in the gaps between the foot protrusions of the scrum structure, and when blood is filtered, waste products such as urinary toxins and unnecessary electrolytes and plasma necessary for the body are retained.
- This size barrier functions as a size barrier that filters while sorting proteins (albumin, etc.) (urine toxins and electrolytes have a smaller molecular size than plasma proteins). The disappearance of this size barrier is positioned as the main pathophysiology of nephrotic syndrome and leads to clinically causing a large amount of proteinuria.
- the permeable membrane 31 is a scaffold to which podocytes adhere, and has permeability to the fluid so as not to obstruct the passage of the fluid.
- permeability means the property that the membrane allows various fluids, solutes and ions to pass through.
- filtration means that in a situation where a fluid contains a mixture of various sizes, the fluid containing the mixture is mainly selected by a membrane having the properties of a sieve (a substance that can pass through the mesh of the sieve). It refers to a substance that cannot be divided into substances), and refers to a narrow phenomenon among permeation phenomena (a phenomenon in which a fluid passes through a membrane or the like).
- passage refers to the behavior of a fluid when viewed from a membrane when explaining permeation.
- the permeable membrane 31 may be coated with an "extracellular matrix” that promotes cell adhesion.
- the "extracellular matrix” used here is, for example, a gel-like extracellular matrix containing four substances, laminin 521, laminin 511, type 4 collagen, and basement membrane matrix (laminin 111, type 4 collagen ⁇ 1 ⁇ 2 ⁇ 3, heparan sulfate, and nidgen. ) Etc. can be selected.
- the ideal extracellular matrix is a gel-like extracellular matrix reagent containing four types of laminin 521, type IV collagen ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 5, heparan sulfate, and nidgen. It has exactly the same composition as the in vivo glomerular basement membrane (the gel-like plate between podocytes and endothelial cells). Ideally, this is applied to the permeable membrane 31.
- the permeable membrane 31 is formed of a porous membrane having a thickness of about 10 ⁇ m.
- the hole diameter of the porous film is preferably ⁇ 3.0 ⁇ m (porosity 14%) or less, more preferably ⁇ 0.4 ⁇ m (porosity 0.5% for PET film, or 12% for PC film). It should be as follows. Although not present in ready-made products, the ideal hole diameter of the porous membrane is ⁇ 0.1 ⁇ m (porosity is 30% to 50%). Therefore, the hole diameter of the porous membrane is preferably in the range of ⁇ 0.1 ⁇ m or more and ⁇ 3.0 ⁇ m or less, more preferably in the range of ⁇ 0.1 ⁇ m or more and ⁇ 0.4 ⁇ m or less.
- the color of the material of the transmission film 31 may be transparent, but may have the characteristics of a light filter that blocks only black that absorbs visible light or a specific light wavelength.
- a light filter that blocks only black that absorbs visible light or a specific light wavelength.
- the first container-side filter 33 is formed of, for example, the endothelial cells of the glomerulus of the human kidney cultured by the cell culture technique.
- the filter 33 on the first container side is not limited to cells as long as it has a possibility of substituting for endothelial cells.
- a dialysis membrane that allows a substance having a size of up to 200 nm to pass through and may be negatively charged. Or, it may be glass nanofiber or the like.
- the permeation membrane 31 having the above-mentioned substance permeability and serving as a scaffold for cell adhesion may have the function of the first container-side filter 33. .. In this case, it is not necessary to provide the first container-side filter 33, but the permeable membrane 31 is preferably as fine as the above-mentioned ideal porous membrane from the viewpoint of forming a good filtration flow.
- the first container 10 has a first liquid storage chamber 10A for storing the liquid 2.
- the main body of the first container 10 (first container main body) is formed in a cylindrical shape.
- the constituent material of the main body of the first container 10 is not particularly limited, but for example, polycarbonate, polyester, polystyrene and the like can be used.
- the main body of the first container 10 is preferably colorless and transparent. That is, the entire main body of the first container 10 has transparency to visible light (wavelength 380 to 750 nm).
- the main body of the first container 10 When the main body of the first container 10 is colorless and transparent, the amount and level of the liquid inside the main body of the first container 10, the degree of intrusion of the closing body 11 described later, the air supply pipe line 41, the pressure measurement pipe line 42, And the position of the tip of the introduction pipe 51 can be visually confirmed.
- the main body of the first container 10 may have any color as long as the observation light does not pass through.
- the bottom opening of the main body of the first container 10 is covered with the biofilter 30 described above. Further, the upper opening of the main body of the first container 10 is closed by the closing body 11. The space surrounded by the main body of the first container 10, the closing body 11, and the biofilter 30 is the first liquid storage chamber 10A.
- the closing body 11 is entirely made of an elastic member in order to close the first liquid storage chamber 10A and enhance its hermeticity.
- the elastic material constituting the closing body 11 is not particularly limited, but for example, rubber (silicone rubber or the like), elastomer or the like can be used.
- the closing body 11 is also preferably colorless and transparent. That is, the entire closed body 11 has a translucency with respect to visible light (wavelength 380 to 750 nm). When the closing body 11 is colorless and transparent, highly accurate measurement is possible in the evaluation of the filtration function of the biofilter 30 described later.
- the second container 20 has a second liquid storage chamber 20A into which the filtrate 3 is introduced.
- the main body of the second container 20 (second container main body) is formed in the shape of a bottomed cylinder.
- the constituent material of the main body of the second container 20 is not particularly limited, but for example, polycarbonate, polyester, polystyrene and the like can be used.
- the main body of the second container 20 is preferably colorless and transparent. That is, the entire main body of the second container 20 has translucency with respect to visible light (wavelength 380 to 750 nm). When the main body of the second container 20 is colorless and transparent, highly accurate measurement is possible in the evaluation of the filtration function of the biofilter 30 described later.
- the upper opening of the main body of the second container 20 is closed by the lid 21. That is, the space surrounded by the main body of the second container 20 and the lid 21 is the second liquid storage chamber 20A.
- the above-mentioned first container 10 is arranged and inserted in the second liquid storage chamber 20A.
- the lid 21 is fixed to the main body of the second container 20 by screwing, for example, and can be easily removed.
- the second liquid storage chamber 20A does not have to be as tightly sealed as the first liquid storage chamber 10A.
- the elastic material constituting the lid 21 is not particularly limited, but for example, polycarbonate, polyester, polystyrene and the like can be used.
- the lid 21 is also preferably colorless and transparent. That is, the entire lid 21 has transparency to visible light (wavelength 380 to 750 nm). When the lid 21 is colorless and transparent, highly accurate measurement is possible in the evaluation of the filtration function of the biofilter 30 described later.
- the kidney filtration function reproducing device 1 includes a pressure control device 40 that controls the pressure difference between the first container 10 and the second container 20, a liquid introduction device 50 that introduces the liquid 2 into the first liquid storage chamber 10A, and a second. It has a filtrate discharge device 60 for deriving the filtrate 3 from the liquid storage chamber 20A.
- the pressure control device 40 has an air supply line 41 and a pressure measurement line 42 that penetrate the lid 21 and the closing body 11 and are inserted into the first liquid storage chamber 10A.
- the liquid introduction device 50 has an introduction pipe 51 that penetrates the lid 21 and the closing body 11 and is inserted into the first liquid storage chamber 10A.
- the filtrate liquid lead-out device 60 has a second lead-out pipe line 61 that penetrates only the lid 21 and is inserted into the second liquid storage chamber 20A.
- the lower ends of the air supply pipe line 41 and the pressure measurement pipe line 42 are arranged above the liquid level of the liquid 2 in the first liquid storage chamber 10A.
- the lower end of the introduction pipe 51 is arranged in the liquid of the liquid 2 in the first liquid storage chamber 10A.
- the lower end of the second outlet pipe 61 is arranged in the liquid of the filtrate 3 in the second liquid storage chamber 20A.
- a hard pipe As the hard pipeline, a hard resin such as polyetheretherketone (PEEK) is preferable. Further, it is preferable that these hard pipes are also colorless and transparent.
- the hard pipe may be a metal pipe such as a stainless steel tube.
- the stainless steel tube is stronger than the polyetheretherketone (PEEK) tube and can be easily inserted into the lid 21 and the closure 11. For example, by bending the stainless steel tube on the outside of the lid 21, the height position of the tube tip can be strictly controlled. Further, by arranging the stainless steel tube on the outside of the lid 21 so that the optical path is not obstructed, highly accurate measurement becomes possible in the evaluation of the filtration function of the biofilter 30 described later.
- PEEK polyetheretherketone
- the pressure control device 40, the liquid introduction device 50, and the filtrate derivation device 60 form a filtration flow in the human kidney in the kidney filtration function reproduction device 1.
- Filtration flow means that in a healthy human kidney, filtration pressure is generated from the capillaries (biofilter 30) of the glomerulus (first container 10) to Bowman's capsule (second container 20), and blood (liquid 2). Waste products and water contained in the blood flow into Bowman's capsule to become raw urine (filter solution 3), and components such as proteins useful for the living body in the blood circulate in the blood as they are.
- the introduction pipe 51 corresponds to an afferent arteriole that transports blood to the glomerulus (first container 10).
- the second lead-out pipe 61 corresponds to a renal tubule that transports raw urine discharged into Bowman's capsule (second container 20). Regarding the filtered flow, there is a report that some components such as proteins useful for living organisms flow into Bowman's capsule even if they are healthy.
- the second lead-out pipe 61 may be arranged in a second introduction pipe (not shown) in the second container 20 and perfused with a medium having a medium composition suitable for the cells in the second container 20.
- the medium supplied from the second introduction pipe can have a composition different from that of the medium perfused with a medium composition suitable for the cells in the first container 10. This makes it possible to mature and differentiate the cells in the spaces of the first container 10 and the second container 20 under the culture conditions suitable for each.
- the pressure control device 40 has a syringe pump and an air pressurization controller (not shown) connected to the air supply pipe line 41. Further, the pressure control device 40 has a pressure sensor module (not shown) connected to the pressure measurement line 42. The pressure control device 40 supplies gas from the air supply pipe line 41 to the first liquid storage chamber 10A, and feeds back the pressure of the first liquid storage chamber 10A from the pressure measurement pipe line 42 to control the filtration pressure of the filtration flow. To form.
- the filtration pressure pressure difference between the first container 10 and the second container 20
- the filtration pressure is preferably, for example, an upper limit of 10.0 kPa, a lower limit of 0.5 kPa to 7.0 kPa, and a lower limit of 2.5 kPa to 7.0 kPa.
- the most preferable ideal filtration pressure is 5.0 kPa or more and 7.0 kPa or less, which is said to be similar to the intraglomerular pressure in vivo. If the set pressure of the pressure control device 40 and the measured pressure of the first liquid storage chamber 10A are almost the same, the pressure measurement pipe 42 may be omitted and only the air supply pipe 41 may be used. Is.
- the kidney filtration function evaluation device 100 includes the above-mentioned kidney filtration function reproduction device 1 and the evaluation substance 101 for evaluating the filtration function of the biofilter 30 in the liquid 2 introduced into the first container 10 of the kidney filtration function reproduction device 1.
- a substance addition device 70 that adds at least one of a test substance (not shown) for verifying the presence or absence of toxicity to the biofilter 30, an evaluation material passing amount measuring device 80 that measures the passing amount of the evaluation substance 101 that has passed through the biofilter 30. have.
- the substance addition device 70 adds at least one of the evaluation substance 101 and the test substance to the liquid 2 via the introduction pipe 51, and the evaluation substance is manually evaluated from the liquid introduction device 50 or the introduction pipe 51.
- the liquid introduction device 50 may also serve as the substance addition device 70 by having a function of adding at least one of the evaluation substance 101 and the test substance.
- the liquid introduction device 50 includes, for example, a pump (for example, a pressure-sensitive syringe pump or the like) that senses the pressure of the liquid 2 and sends the liquid according to the set pressure, the pressure control device 40 (supply). It may also serve as an air duct 41 and a pressure measuring conduit 42). That is, at least one of the pressure control device 40 and the substance addition device 70 may be integrated into the liquid introduction device 50.
- the evaluation substance 101 contains at least one of the first substance 101a and the second substance 101b (in FIG. 1, both the first substance 101a and the second substance 101b are shown).
- the first substance 101a is a substance that is difficult to pass through the second container-side filter 32 when the biofilter 30 is in the normal state
- the second substance 101b is the second container-side filter 32 when the biofilter 30 is in the normal state. It is a substance that easily passes through.
- the first substance 101a corresponds to a medium molecule of about albumin having a molecular weight of 64 kDa or a polymer of albumin or higher.
- Most proteins in plasma, including albumin are largely blocked on the way to the podocyte layer, leaving only a very small amount to leak. That is, although medium molecules such as albumin and polymers above albumin can pass through the endothelial cells (first container side filter 33) and the porous membrane (permeation membrane 31), most of them pass through the podocyte layer (second container side filter 32). It is a normal physiological phenomenon that cannot pass through.
- the first substance 101a is not completely impassable from passing through the second container-side filter 32, but is difficult to pass through. If the podocyte layer is damaged by the test substance, the leakage of the first substance 101a is often measured by the control experiment, so that the harmfulness of the test substance can be regarded as a phenomenon of podocyte dysfunction.
- the second substance 101b corresponds to inulin, which is a small molecule smaller than albumin having a molecular weight of 64 kDa. It is a normal physiological phenomenon that small molecules such as inulin can almost pass through the endothelial cells (first container side filter 33), the porous membrane (permeability membrane 31), and the podocyte layer (second container side filter 32). Even in a situation where there is little leakage of high molecular weight proteins, endothelial cells may become pathologically impervious in the first place. Clinically there is also the pathological term "intraductal proliferation", in which case even small molecule substances cannot pass through endothelial cells. Naturally, in this case, renal failure worsens in the acute course. As described above, the significance of adding the small molecule second substance 101b is to confirm that the permeability from the endothelial cells to the porous membrane is appropriate.
- the evaluation substance 101 includes inulin (low molecular weight) having a molecular weight of about 5 kDa, albumin having a molecular weight of about 60 kDa and dextran (medium molecule) having a molecular weight of about 60 kDa, and dextran (high molecular weight) having a molecular weight of about 200 kDa.
- the evaluation substance may be contained. Even if the three types of evaluation substances 101 are added, it is possible to measure the three types of evaluation substances 101 by shifting the wavelength of the fluorescent tag. When a difference in leakage is observed between a medium molecule having a molecular weight of 60 kDa and a polymer having a molecular weight of 200 kDa, it is possible to judge that a higher degree of renal damage is caused.
- the evaluation substance 101 There are several methods for measuring the evaluation substance 101. For example, by recovering the filtrate 3 and using liquid chromatography or the like, it can be measured by a mass spectrometer that analyzes the mass of various separated components. Further, as a method of measuring the evaluation substance 101 without collecting the filtrate 3, there is a method of attaching a marker to the evaluation substance 101. Examples of the marker include a fluorescent label described later and staining of cells with a live cell staining kit (for example, PHK26 or the like) having less cytotoxicity. Here, a method using a fluorescent label as a marker will be described. That is, the evaluation substance 101 is a fluorescent label.
- the fluorescent label examples include those in which a high molecular compound such as albumin or dextran is labeled with FITC (fluorescein isothiocyanate) or RITC (rhodamine B isothiocyanate) by a chemical bond.
- FITC fluorescein isothiocyanate
- RITC rhodamine B isothiocyanate
- Both the first substance 101a and the second substance 101b may be used as fluorescent labels, or may have different fluorescent colors. Further, only the first substance 101a may be used as a fluorescent label in order to clearly capture the disorder of the podocyte layer, or only the second substance 101b may be used as a fluorescent label in order to clearly capture the proliferation of the endothelial cells.
- the evaluation object passing amount measuring device 80 projects the measurement light from the bottom (transparent portion) of the second container 20 onto the filtrate 3 and measures the passing amount of the evaluation substance 101.
- the evaluation object passing amount measuring device 80 performs fluorescence observation in real time in a region where the first container 10 is not reflected from the bottom (transparent portion) of the second container 20.
- the evaluation object passing amount measuring device 80 is a light source that emits the measurement light, a fluorescence brightness sensor that measures the fluorescence brightness of the filtrate 3 illuminated by the measurement light, and the evaluation substance 101 based on the measurement results of the fluorescence brightness sensor. It has a calculation unit and the like for calculating the passing amount.
- the evaluation object passing amount measuring device 80 may be a fluorescence microscope or the like.
- the evaluation object passing amount measuring device 80 includes not only a fluorescence microscope but also a detection system using a CCD camera, a CMOS sensor, and a photomultiplier tube.
- kidney filtration function evaluation method operation of the kidney filtration function evaluation device 100 using the kidney filtration function reproduction device 1 having the above configuration will be described.
- FIG. 2 is a flowchart showing an example of the kidney filtration function evaluation method (measurement of the amount of passage through the evaluated object) according to the first embodiment.
- the kidney filtration function evaluation method shown in FIG. 2 it is first determined whether or not the above-mentioned filtration pressure is applied to the biofilter 30 (step S1). If YES in step S1, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S2: filtration pressure loading step). In addition, the load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each step up to the option (step S5) for determining whether or not to load the filtration pressure on the next biofilter 30, but basically. Continue to load the filtration pressure until step S5.
- step S3 the evaluation substance 101 is added to the liquid 2 introduced into the first container 10 (substance addition step). If NO in step S1, the process proceeds to step S3, and the evaluation substance 101 is added to the liquid 2.
- step S4 cells (podocytes, endothelial cells, etc.) are cultured for a certain period of time in the experimental environment of the kidney filtration function reproduction device 1 (cell culture step).
- step S5 it is determined whether or not the filtration pressure is applied to the biofilter 30. If YES in step S5, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S6: filtration pressure loading step).
- the load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each subsequent step, but basically the load of the filtration pressure is continued until the measurement is completed.
- the significance of providing the option of the filtration pressure load in steps S2 and S5 is that it may not be preferable to load the filtration pressure on the biofilter 30 in advance depending on the experimental conditions, the cell culture conditions in step S4, and the like. be.
- step S7 the amount of passage of the evaluation substance 101 that has passed through the biofilter 30 is measured (measurement step of measuring the amount of passage of the evaluation substance).
- the passing amount of the evaluation substance 101 is determined by the evaluation object passing amount measuring device 80 shown in FIG. 1 by projecting measurement light onto the filtrate 3 from the bottom (transparent portion) of the second container 20 to obtain the fluorescence brightness of the filtrate 3. Measure based on. If NO in step S5, the process proceeds to step S7, and the passing amount of the evaluation substance 101 is also measured.
- step S8 it is determined whether or not to continue the measurement of the passing amount of the evaluation substance 101. If YES in step S8, the process returns to step S7 and the measurement is continued. On the other hand, if NO in step S8, this evaluation flow ends.
- FIG. 3 is a flowchart showing another example of the kidney filtration function evaluation method (measurement of the amount of passage through the evaluated object) according to the first embodiment.
- the test substance is first added to the liquid 2 introduced into the first container 10 (step S9: substance addition step).
- the test substance is a substance that verifies the presence or absence of toxicity to the biofilter 30. Examples of the test substance include puromycin nucleoside (PAN), which causes cell damage to podocytes.
- PAN puromycin nucleoside
- step S10 it is determined whether or not the filtration pressure is applied to the biofilter 30. If YES in step S10, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S11: filtration pressure loading step). In addition, the load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each step up to the option (step S16) for determining whether or not to load the filtration pressure on the next biofilter 30, but basically. Continues to load the filtration pressure until step S16. In the next step S12, cells (podocytes, endothelial cells, etc.) are cultured for a certain period of time in the experimental environment of the kidney filtration function reproduction device 1 (exposure step). This exposure step is the period of exposure of the cells to the liquid 2 to which the test substance is added. If NO in step S10, the process proceeds to step S12, and the cells are exposed to the liquid 2 to which the test substance is added.
- step S11 filtration pressure loading step
- step S13 it is determined whether or not to remove the test substance according to the experimental conditions. If YES in step S13, the test substance is removed from the liquid 2 introduced into the first container 10 (step S14: substance removal step). In the next step S15, the evaluation substance 101 is added to the liquid 2 introduced into the first container 10 (substance addition step). If NO in step S13, the process proceeds to step S15, and the evaluation substance 101 is added to the liquid 2.
- step S16 it is determined whether or not the filtration pressure is applied to the biofilter 30. If YES in step S15, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S17: filtration pressure loading step). The load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each subsequent step, but basically the load of the filtration pressure is continued until the measurement is completed.
- the significance of providing the option of the filtration pressure load in steps S10 and S16 is that it may not be preferable to load the filtration pressure on the biofilter 30 in advance depending on the experimental conditions, the cell culture conditions in step S12, and the like. be.
- step S18 the amount of passage of the evaluation substance 101 that has passed through the biofilter 30 is measured (measurement step of measuring the amount of passage of the evaluation substance). If NO in step S16, the process proceeds to step S18, and the passing amount of the evaluation substance 101 is also measured.
- step S19 it is determined whether or not to continue the measurement of the passing amount of the evaluation substance 101. If YES in step S19, the process returns to step S18 and the measurement is continued. On the other hand, if NO in step S19, this evaluation flow ends.
- FIG. 4 is a flowchart showing another example of the kidney filtration function evaluation method (measurement of the amount of passage through the evaluated object) according to the first embodiment.
- the evaluation substance 101 and the test substance are added to the liquid 2 introduced into the first container 10 at the same timing (step S20: substance addition step).
- step S21 it is determined whether or not the filtration pressure is applied to the biofilter 30. If YES in step S21, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S22: filtration pressure loading step).
- the load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each step up to the option (step S26) for determining whether or not to load the filtration pressure on the next biofilter 30, but basically. Continues to load the filtration pressure until step S26.
- step S23 cells (podocytes, endothelial cells, etc.) are cultured for a certain period of time in the experimental environment of the kidney filtration function reproduction device 1 (exposure step). If NO in step S21, the process proceeds to step S23, and the cells are exposed to the liquid 2 to which the test substance is added. In the next step S24, it is determined whether or not to remove the test substance according to the experimental conditions. If YES in step S24, the test substance is removed from the liquid 2 introduced into the first container 10 (step S25: substance removal step).
- step S26 it is determined whether or not the filtration pressure is applied to the biofilter 30. If YES in step S26, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S27: filtration pressure loading step). The load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each subsequent step, but basically the load of the filtration pressure is continued until the measurement is completed.
- the significance of providing the option of the filtration pressure load in steps S21 and S26 is that it may not be preferable to load the filtration pressure on the biofilter 30 in advance depending on the experimental conditions, the cell culture conditions in step S23, and the like. be.
- step S28 the amount of passage of the evaluation substance 101 that has passed through the biofilter 30 is measured (measurement step of measuring the amount of passage of the evaluation substance). If NO in step S26, the process proceeds to step S28, and the passing amount of the evaluation substance 101 is also measured.
- step S29 it is determined whether or not to continue the measurement of the passing amount of the evaluation substance 101. If YES in step S29, the process returns to step S28 and the measurement is continued. On the other hand, if NO in step S29, this evaluation flow ends.
- FIG. 5 is a flowchart showing an example of the kidney filtration function evaluation method (cell damage marker measurement) according to the first embodiment.
- this evaluation flow may be performed together with the evaluation flow of the said evaluation thing passing amount measurement.
- the kidney filtration function evaluation method shown in FIG. 5 it is first determined whether or not the above-mentioned filtration pressure is applied to the biofilter 30 (step S30). If YES in step S30, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S31: filtration pressure loading step). In addition, the load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each step up to the option (step S33) for determining whether or not to load the filtration pressure on the next biofilter 30, but basically. Continues to load the filtration pressure until step S33.
- step S32 cells (podocytes, endothelial cells, etc.) are cultured for a certain period of time in the experimental environment of the kidney filtration function reproduction device 1 (cell culture step). If NO in step S30, the process proceeds to step S32 and the cells are cultured for a certain period of time.
- step S33 it is determined whether or not the filtration pressure is applied to the biofilter 30. If YES in step S33, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S34: filtration pressure loading step).
- the load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each subsequent step, but basically the load of the filtration pressure is continued until the measurement is completed.
- the significance of providing the option of the filtration pressure load in steps S30 and S33 is that it may not be preferable to load the filtration pressure on the biofilter 30 in advance depending on the experimental conditions, the cell culture conditions in step S32, and the like. be.
- step S35 a part of the filtrate 3 is recovered from the second container 20 via the second outlet pipe 61 and the like (filter solution recovery step). If NO in step S33, the process proceeds to step S35, and a part of the filtrate 3 is collected.
- the damage markers of the cells discharged from the first container-side filter 33 (endothelial cells) and the second container-side filter 32 (podocytes) contained in the filtrate 3 collected from the second container 20 are measured.
- Cell damage marker measurement step Specifically, at least one of the first container-side filter 33 and the second container-side filter 32 is pre-stained, and the filtrate 3 containing the cells (cell damage marker) discharged into the second container 20 is cytotoxic. It is placed in a marker measuring device, a cytotoxic marker contained in the filtrate 3 is detected, cell death is directly measured, intracellular metabolic function is measured, and the decrease is captured to estimate cytotoxicity.
- step S37 it is determined whether or not to continue the measurement of the cell damage marker. If YES in step S37, the process returns to step S32 and repeats a series of steps from cell culture to measurement of the cytotoxic marker in step S36. On the other hand, if NO in step S37, this evaluation flow ends.
- FIG. 6 is a flowchart showing another example of the kidney filtration function evaluation method (cell damage marker measurement) according to the first embodiment.
- the test substance is added to the liquid 2 introduced into the first container 10 (step S38: substance addition step).
- the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S40: filtration pressure loading step).
- the load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each step up to the option (step S42) for determining whether or not to load the filtration pressure on the next biofilter 30, but basically. Continues to load the filtration pressure until step S42.
- step S41 cells (podocytes, endothelial cells, etc.) are cultured for a certain period of time in the experimental environment of the kidney filtration function reproduction device 1 (exposure step). If NO in step S39, the process proceeds to step S41, and the cells are exposed to the liquid 2 to which the test substance is added.
- step S42 it is determined whether or not the filtration pressure is applied to the biofilter 30. If YES in step S42, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S43: filtration pressure loading step). The load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each subsequent step, but basically the load of the filtration pressure is continued until the measurement is completed.
- the significance of providing the option of the filtration pressure load in steps 39 and S42 is that it may not be preferable to load the filtration pressure on the biofilter 30 in advance depending on the experimental conditions, the cell culture conditions in step S41, and the like. be.
- step S44 a part of the filtrate 3 is recovered from the second container 20 via the second outlet pipe 61 and the like (filter solution recovery step). If NO in step S42, the process proceeds to step S44, and a part of the filtrate 3 is collected.
- the damage markers of the cells discharged from the first container-side filter 33 (endothelial cells) and the second container-side filter 32 (podocytes) contained in the filtrate 3 collected from the second container 20 are measured. (Cell damage marker measurement step).
- step S46 it is determined whether or not to continue the measurement of the cell damage marker. If YES in step S46, the process returns to step S41 and repeats a series of steps from cell culture (exposure step) to measurement of the cytotoxic marker in step S45. On the other hand, if NO in step S46, this evaluation flow ends.
- FIG. 7 is a flowchart showing an example of the kidney filtration function evaluation method (cell morphology change measurement) according to the first embodiment.
- this evaluation flow may be performed together with the evaluation flow of the said evaluation material passage amount measurement and the evaluation flow of the said cell damage marker measurement.
- the kidney filtration function evaluation method shown in FIG. 7 it is first determined whether or not the above-mentioned filtration pressure is applied to the biofilter 30 (step S47). If YES in step S47, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S48: filtration pressure loading step). In addition, the load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each step up to the option (step S50) for determining whether or not to load the filtration pressure on the next biofilter 30, but basically. Continues to load the filtration pressure until step S50.
- step S49 cells (podocytes, endothelial cells, etc.) are cultured for a certain period of time in the experimental environment of the kidney filtration function reproduction device 1 (cell culture step). If NO in step S47, the process proceeds to step S49 and the cells are cultured for a certain period of time.
- step S50 it is determined whether or not the filtration pressure is applied to the biofilter 30. If YES in step S50, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S51: filtration pressure loading step). The load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each subsequent step, but basically the load of the filtration pressure is continued until the measurement is completed. Step S47 The significance of providing the option of the filtration pressure load in step S50 is that it may not be preferable to load the filtration pressure on the biofilter 30 in advance depending on the experimental conditions, the cell culture conditions in step S49, and the like. ..
- step S52 changes in the cell morphology of at least one of the first container-side filter 33 (endothelial cells) and the second container-side filter 32 (podocytes) are measured (cell change measurement step).
- a live cell staining kit for example, PHK26, etc.
- cell changes are performed from the bottom or side wall of the second container 20.
- a measuring device for example, a fluorescence microscope
- the transmission membrane 31 may have non-translucency with respect to visible light.
- the black permeable membrane 31 can make the contrast with the fluorescent-colored cells stand out.
- step S53 it is determined whether or not to continue the measurement of the cell morphological change. If YES in step S53, the process returns to step S49 and repeats a series of steps from cell culture to measurement of cell morphology change in step S53. On the other hand, if NO in step S53, this evaluation flow ends.
- FIG. 8 is a flowchart showing another example of the kidney filtration function evaluation method (cell morphology change measurement) according to the first embodiment.
- the test substance is added to the liquid 2 introduced into the first container 10 (step S55: substance addition step).
- step S56 it is determined whether or not the above-mentioned filtration pressure is applied to the biofilter 30. If YES in step S56, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S57: filtration pressure loading step).
- the load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each step up to the option (step S59) for determining whether or not to load the filtration pressure on the next biofilter 30, but basically. Continues to load the filtration pressure until step S59.
- step S58 cells (podocytes, endothelial cells, etc.) are cultured for a certain period of time in the experimental environment of the kidney filtration function reproduction device 1 (exposure step). If NO in step S56, the process proceeds to step S58, and the cells are exposed to the liquid 2 to which the test substance is added.
- step S59 it is determined whether or not the filtration pressure is applied to the biofilter 30. If YES in step S59, the pressure control device 40 loads the biofilter 30 with the filtration pressure (step S60: filtration pressure loading step). The load of the filtration pressure may be temporarily stopped for the work in each subsequent step, but basically the load of the filtration pressure is continued until the measurement is completed.
- the significance of providing the options for the filtration pressure load in steps S56 and S59 is that it may not be preferable to load the filtration pressure on the biofilter 30 in advance depending on the experimental conditions, the cell culture conditions in step S58, and the like. be.
- next step S61 changes in the cell morphology of at least one of the first container-side filter 33 (endothelial cells) and the second container-side filter 32 (podocytes) are measured (cell change measurement step).
- step S62 it is determined whether or not to continue the measurement of the cell morphological change. If YES in step S62, the process returns to step S58 and repeats a series of steps from cell culture to measurement of cell morphology change in step S61. On the other hand, if NO in step S62, this evaluation flow ends.
- the kidney filtration function reproduction device 1 and the kidney filtration function evaluation device 100 of the present embodiment the filtration function of the human kidney can be artificially reproduced, and the candidate compound in the drug discovery research can be applied to humans. It can bring great benefits as an alternative to animal testing for validation of toxicity. Further, the kidney filtration function reproduction device 1 of the present embodiment does not use polydimethylsiloxane (PDMS), which is often used in incubators for the purpose of conventional bioimitation systems, and is applied to the surface of the container of the test substance. Problems such as siege can be eliminated. Therefore, there is an advantage that the throughput and usability of screening are remarkably high.
- PDMS polydimethylsiloxane
- the kidney filtration function reproduction device 1 and the kidney filtration function evaluation device 100 can also adopt the configurations described below.
- the same or equivalent configurations as those in the above-described embodiment are designated by the same reference numerals, and the description thereof will be simplified or omitted.
- FIG. 9 is a schematic configuration diagram showing a modified example of the kidney filtration function reproduction device 1 and the kidney filtration function evaluation device 100 according to the first embodiment.
- a part of the main body of the second container 20 has a protruding portion 22 protruding to the outside of the container.
- the protruding portion 22 is a portion of the side wall portion of the main body of the second container 20 protruding to the outside of the container, and the internal space 22A thereof is filled with the filtrate 3.
- the evaluation object passing amount measuring device 80 is arranged to project the measurement light from the bottom of the projecting portion 22 toward the internal space 22A. According to this configuration, the fluorescence brightness of the filtrate 3 is not affected by the meniscus on the liquid surface of the filtrate 3, so that the measurement accuracy can be improved.
- the side wall portion of the main body of the second container 20 is covered with a black black case 90.
- the black case 90 is formed with a recess 91 that covers other than the bottom of the protrusion 22. According to this configuration, since the background of the filtrate 3 filled in the internal space 22A becomes black, the contrast with the fluorescent color can be emphasized and the measurement accuracy can be further improved.
- FIG. 10 is a schematic configuration diagram showing another modification of the kidney filtration function reproduction device 1 and the kidney filtration function evaluation device 100 according to the first embodiment.
- the kidney filtration function reproducing device 1 shown in FIG. 10 has a liquid out-delivery device 110 that draws out the liquid 2 from the first liquid storage chamber 10A.
- the liquid take-out device 110 has a first take-out pipe line 111 that penetrates the lid 21 and the closing body 11 and is inserted into the first liquid storage chamber 10A to take out the liquid 2.
- the lower end of the first lead-out pipe 111 is arranged in the liquid of the liquid 2 in the first liquid storage chamber 10A.
- At least a portion of the first lead-out pipe line 111 that penetrates the lid 21 and the closing body 11 may be formed from a hard pipe line such as PEEK described above. Further, it is preferable that the first lead-out pipe 111 is also colorless and transparent.
- the liquid derivation device 110 can form a circulating flow that returns the blood (liquid 2) filtered by the capillaries (biofilter 30) of the glomerulus (first container 10) to the living body in the above-mentioned filtration flow. ..
- the first lead-out line 111 corresponds to an efferent arteriole that returns blood from the glomerulus (first container 10). According to this configuration, a filtration flow closer to a living body can be formed, which can bring great benefits as an alternative method to animal experiments for verification of the presence or absence of toxicity of a candidate compound to humans in drug discovery research.
- the liquid take-out device 110 is useful for maintaining the liquid level height (basal side liquid level) of the liquid 2 in the first liquid storage chamber 10A during pressure-controlled perfusion. If the suction speed of the liquid take-out device 110 is higher than the liquid feed rate of the liquid introduction device 50, the liquid level height of the liquid 2 is maintained at the tip position of the first take-out pipe line 111. As a result, it is possible to prevent the liquid 2 from coming into contact with the closed body 11, and it is also possible to prevent the liquid level of the liquid 2 from lowering and reaching the biofilter 30. When perfusing in such a pressure-controlled manner, it is basically desirable to maintain the liquid level height of the liquid 2 as described above by the introduction pipe 51 and the first outlet pipe 111.
- the first embodiment is not limited to the following examples, and can be appropriately modified and implemented without changing the gist thereof.
- the same or equivalent configurations as those in the above-described embodiment are designated by the same reference numerals, and the description thereof will be simplified or omitted.
- FIG. 11 is a cross-sectional configuration diagram of the kidney filtration function reproduction device 1 and the kidney filtration function evaluation device 100 according to the embodiment of the first embodiment.
- FIG. 12 is an exploded perspective view of the kidney filtration function reproduction device 1 and the kidney filtration function evaluation device 100 according to the embodiment of the first embodiment.
- the kidney filtration function evaluation device 100 shown in FIG. 11 has a plurality of kidney filtration function reproduction devices 1.
- the pressure adjusting mechanism 43 such as the syringe pump of the pressure control device 40 and the pressure sensor module 44 described above are illustrated by blocks.
- the kidney filtration function evaluation device 100 shown in FIG. 11 has a multi-well plate 120 in which a second container 20 of a plurality of kidney filtration function reproduction devices 1 is integrated.
- the multi-well plate 120 includes a bottom wall portion 121 in which the bottom portions of the plurality of second containers 20 are integrated, and a side wall portion 122 rising from the peripheral edge portion of the bottom wall portion 121.
- the bottom wall portion 121 of the multi-well plate 120 is supported by a measuring unit 180 in which the above-mentioned evaluation material passing amount measuring device 80, cell change measuring device, and the like are integrated.
- the lid 21 of the second container 20 is also integrated, and constitutes a lid member 130 that covers the entire multi-well plate 120.
- the lid member 130 is formed in a ridged cylinder shape and engages with a top wall portion 131 that covers the entire upper opening (side wall portion 122 and its inner region) of the multi-well plate 120 and a side wall portion 122 of the multi-well plate 120. It has a peripheral wall portion 132 and a peripheral wall portion 132.
- the lid member 130 is detachably fixed to the multi-well plate 120 with screws.
- the multi-well plate 120 has a plurality of second containers 20 (wells) arranged in a matrix.
- the multi-well plate 120 shown in FIG. 12 has 24 wells arranged in a 4 ⁇ 6 matrix.
- the number of wells is not particularly limited. The number of wells may be 1 as in the above embodiment, or may be 2 or more as in this embodiment.
- the number of first containers 10 (culture inserts) inserted into the wells is the same as the number of wells, except that even if there are a plurality of wells, only some of the wells are used (wells in which the culture inserts are not inserted are used). Experiment in the presence).
- FIG. 13 is an enlarged cross-sectional configuration diagram of one element (one of the kidney filtration function reproduction devices 1) of the kidney filtration function evaluation device 100 according to the embodiment of the first embodiment.
- FIG. 14 is an exploded view of the kidney filtration function reproducing device 1 shown in FIG.
- FIG. 15 is a perspective view of the closed body 11 included in the kidney filtration function reproducing device 1 according to the embodiment of the first embodiment.
- FIG. 16 is an enlarged perspective view of a main part of the closing body 11 shown in FIG.
- the first container 10 of the kidney filtration function reproducing device 1 has a cylindrical portion 10a, a tapered portion 10b, a flange portion 10c, and a reinforcing portion 10d.
- the cylindrical portion 10a constitutes the lower half of the main body of the first container 10.
- the biofilter 30 described above is provided at the lower end of the cylindrical portion 10a.
- the inner diameter of the cylindrical portion 10a is constant.
- the tapered portion 10b is continuously provided at the upper end of the cylindrical portion 10a, and the inner diameter increases toward the upper side.
- the flange portion 10c is continuously provided at the upper end of the tapered portion 10b, extends radially outward, and is placed on the top of the side wall of the main body of the second container 20.
- the flange portion 10c is formed with a through hole 10c1 that penetrates in the vertical direction.
- the above-mentioned second lead-out pipe line 61 is inserted into the through hole 10c1.
- the reinforcing portion 10d is a rib connecting the lower surface of the flange portion 10c and the outer peripheral surface of the tapered portion 10b, and is formed in plurality at intervals in the circumferential direction.
- the closing body 11 is formed in an inverted truncated cone shape in which the lower surface 11b is smaller than the upper surface 11a.
- the closing body 11 is formed with a plurality of through holes 11d1 to 11d3 penetrating from the upper surface 11a to the lower surface 11b.
- the above-mentioned air supply pipe line 41 is inserted into the through hole 11d1.
- the pressure measuring pipeline 42 described above is inserted into the through hole 11d2.
- the above-mentioned introduction pipe 51 is inserted into the through hole 11d3.
- the through holes 11d1 to 11d3 are arranged in a staggered pattern as shown in FIG.
- the inner diameters of the through holes 11d1 to 11d3 may be the same as or slightly smaller than the outer diameters of the air supply pipe 41, the pressure measurement pipe 42, and the introduction pipe 51. If the inner diameters of the through holes 11d1 to 11d3 are small, the air supply line 41, the pressure measurement tube 42, and the pressure measurement tube are each in an elastically deformed state due to the insertion of the air supply line 41, the pressure measurement line 42, and the introduction line 51. It adheres to the outer peripheral surfaces of the road 42 and the introduction pipe 51, and the sealing property is enhanced.
- the lid body 21 (cover member 130) is also formed with a plurality of through holes 21a1 to 21a4 penetrating in the vertical direction.
- the above-mentioned air supply pipe line 41 is inserted into the through hole 21a1.
- the pressure measuring pipeline 42 described above is inserted into the through hole 21a2.
- the above-mentioned introduction pipe 51 is inserted into the through hole 21a3.
- the above-mentioned second lead-out pipe line 61 is inserted into the through hole 21a4.
- the peripheral surface 11c of the closing body 11 includes a first diameter-reduced portion 11c1, a first fixed-diameter portion 11c2, a second fixed-diameter portion 11c3, and a second reduced-diameter portion 11c4. ,have.
- the outer diameter of the first reduced diameter portion 11c1 decreases toward the bottom.
- the first fixed diameter portion 11c2 is connected to the upper end of the first reduced diameter portion 11c1 and extends upward with the same diameter as the maximum diameter of the first reduced diameter portion 11c1.
- the second fixed diameter portion 11c3 is connected to the lower end of the first reduced diameter portion 11c1 and extends downward with a diameter smaller than the minimum diameter of the first reduced diameter portion 11c1. That is, a step is formed between the first reduced diameter portion 11c1 and the second fixed diameter portion 11c3.
- the second reduced diameter portion 11c4 is connected to the lower end of the second fixed diameter portion 11c3.
- the second diameter-reduced portion 11c4 is not reduced in diameter at a constant ratio, but is curved so as to be scooped inward in the radial direction. According to the shape of the second reduced diameter portion 11c4, the center point (axis) of the closed body 11 and the first container 10 in a plan view is easily aligned.
- FIG. 17 is a cross-sectional view showing an engaged state between the first container 10 and the closed body 11 according to the embodiment of the first embodiment.
- the closing body 11 is engaged with the inside of the tapered portion 10b of the first container 10.
- the center point (axis) of the closed body 11 and the first container 10 in a plan view becomes easy to match. That is, when there is no tapered portion 10b, the first container is simply placed with the closing body 11 placed before the closing body 11 is pushed in so that the inner wall of the second fixed diameter portion 11c3 and the cylindrical portion 10a are in contact with each other. If the axes of the closing body 11 and the closing body 11 are too misaligned, the closing body 11 is pushed in while being tilted, which causes a problem that it is difficult to secure airtightness.
- the first fixed diameter portion 11c2 of the closing body 11 projects upward from the first container 10.
- the upper surface 11a of the closing body 11 can be pressed by the lid body 21.
- the first reduced diameter portion 11c1 of the closing body 11 comes into close contact with the inner wall portion of the tapered portion 10b, so that the airtightness of the first container 10 can be further improved.
- the second reduced diameter portion 11c4 of the closing body 11 is arranged so as to face the step 10ab formed between the tapered portion 10b and the cylindrical portion 10a of the first container 10 in the vertical direction.
- the second fixed-diameter portion 11c3 of the closing body 11 can easily enter the cylindrical portion 10a of the first container 10.
- the second diameter-reduced portion 11c4 also has a function of relaxing stress concentration on the closed body 11 due to the edge of the step 10ab and enabling the closed body 11 to be used repeatedly.
- FIG. 18 is a graph showing the results of albumin leakage evaluation in the PAN toxicity test in the kidney filtration function evaluation device 100 according to the first embodiment.
- first container side filter 33 first container side filter 33
- second container side filter 32 second container side filter 32
- the evoked puromycin nucleoside (PAN) was exposed from the basal side and then perfused with a medium containing a fluorescently labeled high molecular protein [here, albumin (Rhodamine-Albumin: R-Alb)] from the basal side.
- the solid line shown in FIG. 18 shows the change in the fluorescence brightness of the group (PAN + & Press group) in which R-Alb was perfused with a pressure-controlled solution after PAN exposure.
- the dotted line shown in FIG. 18 shows the change in the fluorescence brightness of the group (PAN + & Static group) in which R-Alb was perfused only with hydrostatic pressure after PAN exposure.
- the fluorescence brightness on the apical side increased earlier than in the group in which R-Alb was perfused only with hydrostatic pressure. It can be said that the device can detect drug toxicity more sensitively. Further, in the toxicity test using this apparatus, it is possible to evaluate over time (in this example, every two hours), and it is also novel that such evaluation over time is possible.
- FIG. 19 is a graph showing the measurement results of the internal pressure of the culture insert having different membrane resistances in the simultaneous pressure-controlled liquid feeding in the kidney filtration function evaluation device 100 according to the embodiment of the first embodiment.
- FIG. 19 is a graph showing the case where porous films having different porosities (membrane resistances) (C3413 (indicated by a dotted line) and C3470 (indicated by a solid line) manufactured by Corning Inc.) are used for the transmission film 31 of each culture insert. ..
- the internal pressures of both have almost the same waveform and a plateau pressure of 1 kPa, indicating that the pressure-controlled liquid feeding method allows the same pressurization between each sample in this device. ..
- FIG. 20 is a graph showing the results of an albumin leakage test conducted with a plate reader in the kidney filtration function evaluation device 100 according to the first embodiment.
- FIG. 21 is a graph showing the results of an albumin leakage test conducted with a fluorescence microscope in the kidney filtration function evaluation device 100 according to the first embodiment.
- the solid line, alternate long and short dash line, and dotted line shown in FIGS. 20 and 21 show the results for each test.
- this apparatus can be carried out in real time without sampling the culture medium on the apical side in the method for evaluating the leakage of fluorescently labeled polymer protein.
- FIG. 20 shows a graph obtained by sampling the apical medium in the above-mentioned PAN toxicity test as a comparative example, and then measuring the fluorescence luminance of fluorescently labeled albumin with a plate reader (ARVO: manufactured by PerkinElmer). be.
- FIG. 21 is a graph obtained by performing fluorescence luminance measurement in an all-in-one microscope manufactured by Keyence in the same toxicity test by providing ROI (Region of interest) in a region where a well insert is not reflected.
- ROI Region of interest
- the second embodiment relates to a culture vessel and a measurement method using the same.
- the culture vessel described below is applicable to the second vessel 20, the black case 90, and the multi-well plate 120 of the first embodiment. Further, the measurement method described below is applicable to the method for evaluating the renal filtration function of the first embodiment.
- a multi-well plate having a plurality of wells as liquid storage portions has been widely used as a culture container for culturing various cells for investigation of diseases of various tissues, screening of drugs effective for treatment, and the like (for example,). See JP-A-2018-141693).
- the target compound in the medium was fluorescently labeled, and the fluorescence intensity of the medium (fluorescence in the well). ) Is widely used. Further, as a method for quantifying the fluorescence brightness, a method such as a plate reader (measurement of absorbance), a spectrophotometer, and fluorescence observation is used.
- FIG. 22 is the first diagram showing a state in which the wells of the conventional multi-well plate are filled with the FITC solution and the entire wells are photographed.
- FIG. 23 is a diagram showing a state in which the wells of the conventional multi-well plate are filled with the FITC solution and the entire wells are photographed.
- (a) is a fluorescence image of the entire one well of the 48-well multi-well plate
- (b) is a fluorescence image of the entire one well of the 24-well multi-well plate
- (c) is a fluorescence image.
- A) is a graph showing the fluorescence brightness on the center line A
- (d) is a graph showing the fluorescence brightness on the center line A in (b).
- FIG. 23 (a) is a fluorescence image obtained by photographing one well of a 48-well multi-well plate, and (b) is a graph showing fluorescence luminance on the center lines A and B in (a).
- FIG. 22 shows a 48-well multi-well plate, which is a multi-well plate having 48 wells, and a 24-well multi-well plate, which is a multi-well plate having 24 wells, and FITC (fluorescein), which is a protein fluorescent labeling reagent, on the 24-well multi-well plate.
- the liquid level in each well becomes a concave meniscus, and due to the influence of the meniscus, as shown in FIGS. 22 (c) and 22 (d), depending on the position on the center line A.
- the value of fluorescence brightness changes.
- FIG. 23 shows two different centers of the circular bottom surface of the well based on a fluorescence image obtained by filling a 48-well multi-well plate with the FITC solution and photographing the entire one well from the bottom surface side. It is a graph of the fluorescence brightness on the lines A and B. As shown in FIG. 23 (b), not only the value of the fluorescence luminance changes depending on the position on the center line A and the center line B, but also the value of the fluorescence luminance on the center line A and the center line B is changed. The change pattern is different.
- a culture container capable of accurately measuring the state of the solution in the liquid container without being affected by the meniscus by solving the problems of the above-mentioned conventional technique was used. It is an object of the present invention to provide a measuring method.
- the liquid storage portion in the culture container having the liquid storage portion, includes a liquid storage unit main body and a recess, and the recess is outside a part of the wall surface of the liquid storage portion main body. It is a portion formed so as to be recessed in the direction, and is in contact with the main body of the liquid accommodating portion.
- the recess is further formed at a position adjacent to the lower end of the liquid container body, and the bottom surface of the recess is flush with the bottom surface of the liquid container body.
- the recess is formed at a position adjacent to the lower end of the liquid storage portion main body, and the bottom surface of the recess is located above the bottom surface of the liquid storage portion main body.
- the shape of the recess in plan view is approximately an isosceles right triangle.
- the shape of the recess in the side view is substantially rectangular, and the top surface of the recess is located below the gas-liquid interface of the solution contained in the main body of the liquid container.
- a partition wall for blocking communication between the liquid storage unit main body and the recess is further inserted in the liquid storage unit.
- the liquid storage portion includes a liquid storage portion main body and a recess, and the concave portion is a part of the wall surface of the liquid storage portion main body in the outward direction.
- a culture container which is formed so as to be recessed and is in contact with the main body of the liquid storage portion is prepared, a solution is supplied into the liquid storage portion, and a measurement target area is set in the liquid storage portion. Then, the state of the solution in the recess is measured from above or below the culture vessel.
- the state of the solution is further fluorescence luminance or absorbance.
- a mask having a plurality of openings formed at positions corresponding to the measurement target areas set in the recesses of each liquid storage portion is further attached to the lower surface of the culture container.
- a fluorescent image of a region corresponding to each opening of the mask is taken from below the culture vessel to measure the fluorescent brightness of the solution.
- the light beam passing through the recess is further irradiated from below the culture vessel, and the amount of light passing through the recess is measured above the culture vessel to determine the absorbance of the solution. Measure.
- the state of the solution in the liquid container can be accurately measured without being affected by the meniscus.
- FIG. 24 is a photograph showing a prototype of the multi-well plate according to the second embodiment.
- FIG. 25 is a perspective view of the multi-well plate according to the second embodiment.
- FIG. 26 is a schematic side sectional view of a well of the multi-well plate according to the second embodiment.
- (a) is a photograph taken from diagonally above
- (b) is a photograph taken from diagonally below
- (c) is an enlarged photograph of part C in (b).
- FIG. 25 (a) is a perspective view seen from diagonally above, (b) is a true perspective view seen from diagonally below, and (c) is an enlarged view of a main part in (b).
- the multi-well plate 210 is a culture container according to the present embodiment, and includes a plate main body 211 which is a thick flat plate-shaped rectangular parallelepiped and a well 212 as a liquid storage portion formed in a plurality of plate main bodies 211.
- the culture vessel in the present embodiment is not necessarily limited to the multi-well plate, and may be any kind as long as it is a vessel used for culturing various cells, for example, culturing. It may be a dish, a culture flask, or the like.
- the liquid accommodating portion in the present embodiment is not necessarily limited to a cylindrical shape such as the well 212, and may have any kind of shape as long as it can accommodate the liquid inside.
- the shape in the plan view may be a polygonal cylinder
- the shape in the side view may be a conical shape
- the overall shape may be a thin dish shape. It may be.
- the liquid accommodating portion in the present embodiment does not necessarily have to be a plurality of liquid accommodating portions as in the well 212, and may be a single unit.
- the culture container is a multi-well plate 210
- the liquid storage portion is a cylindrical well 212, and a plurality of the culture containers are formed on the plate main body 211 will be described.
- a multi-well plate is a member that is commercially available and widely used as a cell incubator for culturing various cells, having wells having a plurality of depressions or holes, and is a microplate or a microtiter plate. Also called.
- Commercially available multi-well plates are generally referred to as 24-well multi-well plates, which are multi-well plates with 6 to 384 wells, eg 24 wells, and are multi-wells with 48 wells. Although it is called a 48-well multi-well plate, which is a plate, the number of wells is not limited, and there are 9600 wells.
- the material of the multi-well plate is generally transparent glass, polyethylene, polypropylene, polystyrene or the like, but may be of any kind.
- the multi-well plate 210 shown in FIG. 24 was manufactured by the inventor as a prototype based on the figure shown in FIG. 25, and the plate body 211 is made of an opaque resin and includes 24 wells 212.
- the plate body 211 may be made of a transparent material, and the number of wells 212 is not limited to 24.
- the expressions indicating the directions of upper, lower, left, right, front, back, etc. used to explain the configuration and operation of each part of the multi-well plate 210 are absolute. It is not relative, and is appropriate when each part of the multi-well plate 210 is in the posture shown in the figure, but when the posture changes, it should be changed and interpreted according to the change in posture. It is a thing.
- the plate body 211 has a flat upper surface 211a and a flat lower surface 211b parallel to the upper surface 211a, and each well 212 is a cylinder extending in the thickness direction of the plate body 211 from the upper surface 211a to the lower surface 211b. It has a well body 212c as a liquid storage body that is a cylindrical through hole.
- the top surface 212a (upper end surface) of the well body 212c is open at the upper surface 211a, but the bottom surface 212b (lower end surface) thereof is closed by a flat plate-shaped transparent bottom plate 213 attached to the lower surface 211b. That is, as shown in FIG. 26, the well body 212c of each well 212 is a flat-bottomed cylindrical or cylindrical recess.
- Each well 212 contains a solution 215 such as a culture medium or a culture medium used for cell culture or the like inside the well body 212c, and an objective lens 221 is arranged so as to be located below a microscope (not shown). Through the bottom plate 213, cells in the solution 215 can be observed, and the fluorescence brightness of the fluorescently labeled compound in the solution 215 can be measured. When measuring the fluorescence brightness, a fluorescence microscope is used as the microscope.
- each well 212 is formed with a recess 214 as a measuring portion.
- the recess 214 is a cylindrical wall surface adjacent to the lower end of the well body 212c, that is, a portion formed so that a part of the side surface is recessed outward, specifically, radially outward. It is in contact with the well body 212c. Therefore, the solution 215 contained in the well body 212c flows into the recess 214.
- the shape of the recess 214 in a plan view is a shape like a substantially right-angled isosceles triangle, and the portion corresponding to the hypotenuse is the cylindrical side surface. It has an arc shape corresponding to.
- the shape of the recess 214 in a plan view is such that the space efficiency is improved when a large number of wells 212 are formed on the plate body 211 having a predetermined area.
- the shape of the recess 214 in a plan view is not limited to this, and may be a semicircular shape, a quadrangular shape, or may be appropriately set.
- the number of recesses 214 formed in each well 212 does not have to be singular as in the examples shown in FIGS. 24 (c) and 25 (c), and may be plural.
- the recess 214 does not have to be formed on a part of the side surface of the well body 212c, and may be formed over the entire circumference of the side surface.
- the shape of the recess 214 in the side view is rectangular as shown in FIG. 26, and the bottom surface 214b thereof is the same plane as the bottom surface 212b of the well 212 (well body 212c).
- the top surface 214a of the recess 214 is set to be a plane parallel to the bottom surface 214b and to be located below the gas-liquid interface 215a (liquid surface) which is the upper surface of the solution 215 contained in the well body 212c. ing.
- the inside of the recess 214 is filled with the solution 215, and the upper surface of the solution 215 in the recess 214 coincides with the top surface 214a of the recess 214, and is flat and does not generate meniscus.
- the distance from the bottom surface 214b to the top surface 214a, that is, the height of the recess 214 is 3.5 [mm] in the prototype shown in FIG. 24, but it is shorter than the distance to the gas-liquid interface 215a.
- any value may be used and can be adjusted as appropriate.
- the solution 215 in the recess 214 is not affected by the meniscus, when the target compound in the solution 215 is fluorescently labeled and the fluorescence brightness is measured, as shown in FIG. 24 (c).
- ROI 216 which is a fluorescence measurement target region
- a hydrophilization treatment for example, oxygen or argon plasma treatment, silane coupling treatment, etc.
- a hydrophilization treatment for example, oxygen or argon plasma treatment, silane coupling treatment, etc.
- a hydrophilization treatment for example, oxygen or argon plasma treatment, silane coupling treatment, etc.
- FIG. 27 is a diagram showing a state in which the fluorescence brightness of the well into which the culture insert according to the second embodiment is inserted is measured.
- FIG. 28 is a diagram showing the measurement result of the fluorescence brightness of the well into which the culture insert according to the second embodiment is inserted.
- (a) is a schematic side sectional view of a well into which a culture insert is inserted
- (b) is a fluorescence image of the entire well into which a culture insert is inserted.
- FIG. 28 (a) is a fluorescence image of the D portion in FIG. 27 (b),
- (b) is a fluorescence image of the E portion in FIG. 27 (b), and
- (c) is on a straight line F in (a).
- (d) is a graph showing the fluorescence brightness on the straight line G in (b).
- the multi-well plate 210 in the present embodiment can be used in a state where only a solution 215 such as a culture medium or a medium containing cells or the like is contained in each well 212.
- a solution 215 such as a culture medium or a medium containing cells or the like
- the culture insert 217 containing a tissue such as a cell can be used in a state of being inserted.
- the material of the culture insert 217 is transparent glass, polyethylene, polypropylene, polystyrene or the like, but may be of any kind.
- a cell culture apparatus used by inserting an insertion member such as a culture insert 217 into a cavity such as a well 212 is already known (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2018-042556).
- both the culture insert 217 and the well 212 are filled with the FITC solution as the solution 215. Then, when the entire well 212 into which the culture insert 217 is inserted is photographed from the bottom surface 212b side of the well 212 by the objective lens 221 of the fluorescence microscope arranged below the lower surface 211b of the plate main body 211, FIG. 27 (b) shows. A fluorescence image as shown could be obtained.
- FIG. 28 (a) is a fluorescence image of the D portion surrounded by a rectangular frame in FIG. 27 (b), and FIG. 28 (b) is an E portion surrounded by a rectangular frame in FIG. 27 (b). It is a fluorescent image of.
- the D portion is a region substantially corresponding to a portion between the cylindrical side surface of the culture insert 217 and the cylindrical side surface of the well body 212c on the bottom surface 212b of the well 212 shown in FIG. 27 (a).
- the E portion is a region substantially corresponding to the recess 214 in the bottom surface 212b of the well 212 shown in FIG. 27 (a).
- the dotted circle shown in FIG. 28B indicates the ROI 216 set in the recess 214.
- FIG. 28 (c) is a graph of the fluorescence brightness on the straight line F passing through substantially the center of the fluorescence image shown in FIG. 28 (a), which is the fluorescence image of the D portion. Since the D portion is a region substantially corresponding to the portion between the cylindrical side surface of the culture insert 217 and the cylindrical side surface of the well body 212c, it is affected by the meniscus at the gas-liquid interface 215a of the solution 215. It can be seen from FIG. 28 (c) that the fluorescence brightness is non-uniform.
- FIG. 28 (d) is a graph of the fluorescence brightness on the straight line G passing through substantially the center of the fluorescence image shown in FIG. 28 (b), which is the fluorescence image of the E portion.
- the straight line G is set so as to pass through the center of ROI 216 as well. Since the E portion is a region substantially corresponding to the recess 214, the fluorescence brightness is uniform over almost the entire range without being affected by the meniscus at the gas-liquid interface 215a of the solution 215. It can be seen from (d). In particular, it can be said that the fluorescence brightness is substantially uniform in the range corresponding to ROI 216.
- the fluorescence brightness becomes non-uniform because it is affected by the meniscus. Therefore, even if the concentration of the fluorescent labeling evaluation substance of the solution 215 is the same, as shown in FIG. 28 (c), depending on the method of inserting the culture insert 217 and factors such as the height of the gas-liquid interface 215a. It is expected that the waveform of the fluorescence intensity graph can change.
- ROI 216 which is a fluorescence measurement target region
- ROI 216 which is a fluorescence measurement target region
- FIG. 29 is a diagram showing a mask attached to the bottom plate of the multi-well plate according to the second embodiment.
- FIG. 30 is a fluorescence image of a concave portion taken with a mask attached to the bottom plate of the multi-well plate according to the second embodiment.
- the mask 222 shown in FIG. 29 is a thin plate-shaped or film-shaped mask, and is attached to the lower surface of the transparent bottom plate 213 of the multi-well plate 210.
- the material of the mask 222 is opaque glass, polyethylene, polypropylene, polystyrene or the like, but any kind may be used as long as it has a light-shielding property.
- the overall dimensions and shape of the mask 222 are the same dimensions and shapes as the lower surface 211b of the plate body 211 of the corresponding multi-well plate 210.
- the mask 222 is formed with a plurality of openings 223 so as to correspond to each of all the wells 212 of the multi-well plate 210.
- Each opening 223 includes a main opening 223a corresponding to almost the entire well body 212c and a photographing point opening 223b formed at a position corresponding to ROI 216 in the recess 214.
- the opening 223, which is a light transmission hole, may be a through hole through which the mask 222 penetrates in the plate thickness direction, or may be a transparent member such as a transparent film.
- each imaging location opening 223b is preferably a circular opening having a diameter of about 1 [mm], and is formed so as to correspond to the center position of the recess 214.
- FIG. 30 corresponds to the recess 214 of one well 212 with the mask 222 attached to the lower surface of the transparent bottom plate 213 of the multi-well plate 210 and each well 212 filled with a solution 215 containing a fluorescent substance. It is a fluorescence image taken from below the area.
- the cross-shaped dotted line indicated by H is a grid for positioning, and in the grid H, it is shown that the intersection of the two dotted lines is the center of the image. It can be seen that an image of the imaging location opening 223b exists in the center of the image.
- the positional relationship between the objective lens 221 of the fluorescence microscope and the multi-well plate 210 is adjusted in advance so that the aperture 223b at the imaging location is at the center of the image, and the ROI 216 in each well 212 is adjusted. It is desirable to store the location in the driving software of the fluorescence microscope. This makes it possible to automatically photograph the location of ROI 216 in each well 212, so that the procedure of manually positioning the location of ROI 216 in each experiment can be omitted.
- FIG. 31 is a diagram showing the verification results of the fluorescence luminance measurement / calibration curve of the serially diluted solution using FITC inulin according to the second embodiment.
- FIG. 32 is a diagram showing the verification results of the fluorescence luminance measurement / calibration curve of the serially diluted solution using RITC dextran according to the second embodiment.
- (a) is a fluorescence image obtained by photographing the concave portion of the well
- (b) is a graph showing a calibration curve.
- the inventor conducted an experiment to measure the fluorescence brightness of the solution 215 contained in the well 212 by using the multi-well plate 210 as shown in FIG. 24 manufactured as a prototype.
- an all-in-one fluorescence microscope (Keyence BZX-700) sold by KEYENCE CORPORATION was used as a microscope for measuring the fluorescence brightness.
- the actual fluorescence luminance measurement was performed by the following procedures (1) to (3).
- ROI 216 a fluorescence brightness evaluation region common to the images of, and the fluorescence brightness in ROI 216 is quantified in all images by using the "Measure” function provided by ImageJ Fiji (NIH). Then, among the values obtained by the "Measure” function, the average value is picked up, statistical processing is performed using the average value, and a significant difference is determined.
- FIG. 31 and 32 show the verification results of the fluorescence brightness measurement / calibration curve of the serially diluted solution using the solution 215 containing the fluorescent labeling evaluation substance obtained by the experiment thus performed. ..
- FIG. 31 shows the verification results of the fluorescence brightness measurement / calibration curve of the serially diluted solution when FITC inulin (molecular weight 5.5 [kDa]: low molecular weight evaluation substance) is used.
- FIG. 32 shows the verification results of the fluorescence brightness measurement / calibration curve of the serially diluted solution when RITC dextran (molecular weight 70 [kDa]: polymer evaluation substance) is used.
- the multi-well plate 210 in the present embodiment can provide high accuracy in the fluorescence brightness measurement of the fluorescent label evaluation substance while being simple.
- FIG. 33 is a schematic side sectional view of a well when the absorbance is measured using the multi-well plate according to the second embodiment.
- the multi-well plate 210 in this embodiment can be used not only for measuring fluorescence brightness but also for measuring absorbance.
- an absorbance meter 224 is arranged above the upper surface 211a of the plate body 211, and is indicated by an arrow emitted from a light source (not shown) arranged below the lower surface 211b of the plate body 211.
- the absorbance of the solution 215 can be measured by measuring the amount of the light ray J that has passed through the solution 215 in the well 212 with the absorbance meter 224.
- the plate body 211 is made of a transparent material. Further, it is assumed that the light ray J does not pass through the gas-liquid interface 215a which is the upper surface of the solution 215 but passes through the recess 214. It is desirable that the light ray J passes through the ROI 216 in the recess 214 as shown in FIGS. 24 (c), 7 (b) and the like. As a result, the absorbance of the solution 215 can be measured with high accuracy without being affected by the meniscus at the gas-liquid interface 215a of the solution 215.
- the multi-well plate 210 in the present embodiment has the well 212, the well 212 includes the well body 212c and the recess 214, and the recess 214 is a part of the side surface of the well body 212c. Is a portion formed so as to be recessed in the outward direction, and is in contact with the well body 212c.
- the multi-well plate 210 having the well 212 includes the well body 212c and the recess 214, and the recess 214 is a part of the wall surface of the well body 212c.
- a multi-well plate 210 is prepared which is formed so as to be recessed in the outward direction and is in contact with the well body 212c, the solution 215 is supplied into the well 212, and the ROI 216 is formed in the recess 214. It is set and the state of the solution 215 in the recess 214 is measured from above or below the multi-well plate 210.
- the state of the solution 215 in the well 212 can be accurately measured without being affected by the meniscus at the gas-liquid interface 215a.
- the recess 214 is formed at a position adjacent to the lower end of the well body 212c, and the bottom surface 214b of the recess 214 is flush with the bottom surface 212b of the well body 212c.
- the shape of the recess 214 in a plan view is approximately an isosceles right triangle.
- the shape of the recess 214 in the side view is substantially rectangular, and the top surface 214a of the recess 214 is located below the gas-liquid interface 215a of the solution 215 housed in the well body 212c.
- the state of the solution 215 is fluorescence luminance or absorbance.
- a mask 222 having a plurality of imaging location openings 223b formed at positions corresponding to ROI 216 set in the recess 214 of each well 212 is attached to the lower surface 211b of the plate body 211, and is below the multi-well plate 210.
- the fluorescence brightness of the solution 215 is measured by taking a fluorescence image of the region corresponding to each imaging location opening 223b of the mask 222.
- the light beam J passing through the recess 214 is irradiated from below the multi-well plate 210, and the light amount of the light ray J passing through the recess 214 is measured above the multi-well plate 210 to measure the absorbance of the solution 215.
- FIG. 34 is a schematic side sectional view of the well of the multi-well plate in the first modification of the second embodiment.
- the recess 214 formed in the well 212 has a part of the cylindrical side surface of the well body 212c outside in the radial direction, similarly to the recess 214 according to the present embodiment described above. It is a part formed so as to be recessed in the well, has a rectangular shape in a side view, and its top surface 214a is located below the gas-liquid interface 215a of the solution 215 contained in the well 212. It is set.
- the bottom surface 214b is flush with the bottom surface 212b of the well 212, whereas the recess 214 in the first modification of the second embodiment is shown in the figure.
- the bottom surface 214b is set to be located above the bottom surface 212b of the well 212.
- the plate main body 211 is made of a transparent material.
- the recess 214 is formed at a position adjacent to the lower end of the well body 212c, and the bottom surface 214b of the recess 214 is located above the bottom surface 212b of the well body 212c.
- FIG. 35 is a schematic side sectional view of a well of a multi-well plate in a second modification of the second embodiment.
- the recess 214 formed in the well 212 is a part of the cylindrical side surface adjacent to the lower end of the well body 212c, similarly to the recess 214 according to the present embodiment described above. Is a portion formed so as to be recessed outward in the radial direction, the shape in the side view is rectangular, the bottom surface 214b thereof is the same plane as the bottom surface 212b of the well 212, and the top surface 214a is inside the well 212. It is set to be located below the gas-liquid interface 215a of the solution 215 contained in.
- a partition wall 225 that blocks communication between the recess 214 and the well body 212c is removed inside each well 212. It is installed as possible.
- the partition wall 225 has an arcuate shape when viewed from the vertical direction, and is a curved plate-like plate material extending in the vertical direction, and can be slid vertically along the cylindrical side surface of the well body 212c. ing.
- the partition wall 225 is inserted into the well 212 from above along the side surface of the well body 212c, and when the lower end thereof abuts on the bottom plate 213 that closes the bottom surface 212b of the well 212, the recess 214 and the well body 212c are formed. It is designed to block the contact of.
- the partition wall 225 that blocks the communication between the well body 212c and the recess 214 is inserted into the well 212.
- the liquid accommodating portion includes a liquid accommodating portion main body and a recess.
- the recess is a portion formed so that a part of the wall surface of the liquid storage portion main body is recessed in the outward direction, and is in contact with the liquid storage portion main body.
- Appendix 2 The culture vessel according to Appendix 1, wherein the recess is formed at a position adjacent to the lower end of the liquid storage portion main body, and the bottom surface of the recess is flush with the bottom surface of the liquid storage portion main body.
- Appendix 3 The culture vessel according to Appendix 1, wherein the recess is formed at a position adjacent to the lower end of the liquid storage portion main body, and the bottom surface of the recess is located above the bottom surface of the liquid storage portion main body.
- a culture container having a liquid storage portion wherein the liquid storage portion includes a liquid storage portion main body and a recess, and the recess is such that a part of the wall surface of the liquid storage portion main body is recessed outward.
- a solution is supplied into the liquid container, and the solution is supplied.
- a measuring method comprising setting a measurement target area in the liquid container and measuring the state of the solution in the recess from above or below the culture vessel.
- Appendix 8 The measuring method according to Appendix 7, wherein the state of the solution is fluorescence luminance or absorbance.
- a mask having a plurality of openings formed at positions corresponding to the measurement target areas set in the recesses of the liquid storage portions is attached to the lower surface of the culture container, and each opening of the mask is attached from below the culture container.
- Appendix 10 The measuring method according to Appendix 7, wherein a light beam passing through the recess is irradiated from below the culture vessel, and the amount of light passing through the recess is measured above the culture vessel to measure the absorbance of the solution.
- the third embodiment relates to an inserter (inserting member) inserted in the gap between each well (second container) and the culture insert (first container) of the multi-well plate.
- FIG. 36 is a cross-sectional configuration diagram of the kidney filtration function evaluation device 300 in which the inserter 420 according to the third embodiment is arranged.
- FIG. 37 is a plan view of the multi-well plate 390 included in the kidney filtration function evaluation device 300 shown in FIG. 36.
- FIG. 38 is an exploded perspective view of the multi-well plate 390 shown in FIG. 37.
- FIG. 39 is a bottom perspective view of the inserter 420 according to the third embodiment.
- the inserter 420 insertion member for measuring fluorescence brightness is inserted in the gap between the side wall of the culture insert 310 (first container) and the side wall of the well 320 (second container). ) Is provided.
- the kidney filtration function evaluation device 300 in which the inserter 420 shown in FIG. 36 is arranged has the same configuration as that of the first embodiment described above, and is the kidney filtration function reproduction device 301 and the kidney filtration function reproduction device 301.
- a substance addition device (FIG. 36) in which at least one of an evaluation substance for evaluating the filtration function of the biofilter 330 and a test substance (not shown) for verifying the presence or absence of toxicity to the biofilter 330 is added to the liquid 302 introduced into the culture insert 310. It has an evaluation object passing amount measuring device 380 for measuring the passing amount of the evaluation substance that has passed through the biofilter 330.
- the culture insert 310 has the same configuration as the first container 10 shown in FIG. 13 of the first embodiment described above. Specifically, the culture insert 310 has a biofilter 330 including a permeable membrane 331, a second container-side filter 332, and a first container-side filter 333 at the bottom opening. Further, the upper opening of the culture insert 310 is closed by the closing body 311. A lid body 321 is mounted on the closing body 311.
- the air supply pipe 341, the pressure measurement pipe 342, the introduction pipe 351 and the second outlet pipe 361 are arranged through the lid 321.
- the air supply line 341, the pressure measurement line 342, and the introduction line 351 penetrate the lid 321 and are inserted inside the culture insert 310.
- the liquid 302 is stored inside the culture insert 310.
- the multi-well plate 390 has a plurality of wells 320.
- the wells 320 of the third embodiment are provided in two rows on the multi-well plate 390.
- a filter liquid discharge tank 392 is provided in the vicinity of each row of the wells 320.
- the filtrate discharge tank 392 extends parallel to the row of wells 320 and communicates with each adjacent well 320 via a communication flow path 393.
- the communication flow path 393 is formed by partially removing the partition wall of the multi-well plate 390 that separates the well 320 and the filtrate discharge tank 392. As a result, the filtrate 303 accumulated in the well 320 is discharged to the filtrate discharge tank 392.
- the bottom 401 of the well 320 of the third embodiment is formed of a cover glass having transparency to visible light.
- the bottom 401 of the well 320 may be a transparent resin plate or the like as long as it has transparency to visible light.
- a recess for arranging the cover glass (bottom 401) is formed via the O-ring 402.
- the multi-well plate 390 excluding the bottom 401 may have translucency to visible light, or may have non-translucency to visible light in order to emphasize the contrast with the fluorescent color. ..
- a fixing plate 410 for maintaining the liquidtightness at the bottom 401 of the well 320 is attached to the bottom of the multi-well plate 390.
- the fixing plate 410 is provided with a window portion 411 that exposes the bottom portion 401 of the well 320, an annular protrusion 412 provided on the peripheral edge of the window portion 411, and a fixing plate 410 as a multi-well plate 390.
- a fixing hole 413 in which a screw (not shown) is arranged is provided.
- the window portion 411 is open to the same size as the inner diameter of the O-ring 402.
- the annular protrusion 412 is inserted into a recess provided at the bottom of the multi-well plate 390, presses the peripheral edge of the bottom 401 of the well 320 to crush the O-ring 402, and the well 320. Maintains liquidtightness at the bottom 401.
- An inserter 420 for measuring fluorescence brightness is inserted in the gap between the side wall of the culture insert 310 and the side wall of the well 320.
- the inserter 420 for measuring fluorescence brightness is inserted at a certain height from the bottom 401 of the well 320 in the gap between the side wall of the culture insert 310 and the side wall of the well 320. Since the amount of the filtrate 303 accumulated in the well 320 changes depending on the system for evaluating the renal filtration function, the height of the inserter 420 is suitable for each system for evaluating the renal filtration function so that the fluorescence brightness can be easily measured. It is advisable to use the inserter 420 of.
- the inserter 420 is formed in a ring shape into which the culture insert 310 can be inserted inside.
- the inserter 420 of the present embodiment can be mounted on the outer periphery of the side wall of the culture insert 310 without a gap.
- the gap between the outer periphery of the side wall of the inserter 420 and the culture insert 310 may be a gap in which the inserter 420 can be easily attached and the filtrate 303 is filled.
- the inserter 420 has an upper surface 421 and a lower surface 422 parallel to each other.
- the upper surface 421 of the inserter 420 is not limited to a plane parallel to the lower surface 422, but a part or all of the lower surface 422 of the inserter 420 is formed to be at least parallel to the bottom 401 of the well 320 and flat.
- a groove portion 423 is formed on the lower surface 422 of the inserter 420 of the present embodiment.
- the flat surface portion forming the bottom surface of the groove portion 423 is also parallel and flat with respect to the bottom portion 401 of the well 320.
- the flat surface portion of the groove portion 423 serves as an observation region of the evaluation object passing amount measuring device 380 shown in FIG. 36.
- the lower surface 422 of the inserter 420, excluding the groove 423, is in contact with the bottom 401 of the well 320.
- the groove portion 423 has a certain distance from the bottom portion 401 of the well 320, and the gap thereof is filled with the filtrate 303.
- the lower surface 422 of the inserter 420 may not be in contact with the bottom 401 of the well 320.
- at least a hydrophilization treatment oxygen plasma, argon plasma treatment, silane coupling treatment, etc.
- a hydrophilization treatment for the purpose of suppressing the generation of bubbles in the groove 423 of the inserter 420 and hindering the fluorescence brightness measurement is performed. It may be applied to the groove portion 423.
- a fitting projection 391 that fits into the inserter 420 is formed on the inner wall of the side wall of the well 320.
- the fitting projection 391 projects inward from the inner wall of the well 320.
- a plurality of fitting protrusions 391 are provided on the circular wall surface of the well 320 in a plan view (four at 90 ° intervals in the present embodiment) at intervals in the circumferential direction.
- the four contact surfaces 424 that come into contact with the fitting projection 391 of the inserter 420 are formed in a planar shape as shown in FIG. 39.
- the contact surface 424 is a partially flattened peripheral surface of the inserter 420.
- the inserter 420 having the above configuration may be made of resin or glass, but ideally, a material (polycarbonate, PEEK, polyacetal, etc.) that is chemically stable and resistant to high temperature sterilization is preferable.
- the color of the inserter 420 may be transparent or colored, but black is preferable for the purpose of fluorescence observation. Further, it is desirable that the specific gravity of the material of the inserter 420 is as high as possible so as not to float on water. From this point of view, the entire inserter 420 may have a structure such that the metal such as stainless steel or the resin contains the metal as "interesting". By doing so, the distance between the groove portion 423 and the bottom portion 401 does not need to be separated, and the change in the optical path length can be prevented.
- the bottom 401 of the well 320 (second container) has transparency to visible light, and the side wall of the culture insert 310 (first container).
- An inserter 420 (insertion member) for measuring fluorescence brightness is provided, which is inserted into the gap between the well 320 and the side wall of the well 320 and has a flat surface portion (groove portion 423) formed in at least a part of the lower surface 422 facing the bottom portion 401 of the well 320. ..
- the observation region (groove portion 423) that is not affected by the meniscus on the liquid surface can be formed in the gap between the culture insert 310 and the well 320 without forming the recess 214 on the wall surface of the well 212 as in the second embodiment. ..
- the observation region (groove portion 423) of the third embodiment does not have a dead end (dead end) unlike the recess 214 of the second embodiment, and is close to the bottom opening (leakage portion) of the culture insert 310.
- the evaluation substance leaked from the bottom opening of the culture insert 310 quickly reaches the observation area. Therefore, in the evaluation object passing amount measuring device 380, the timing of detecting the increase in the degree of leakage of the evaluation substance from the culture insert 310 is accelerated.
- the third embodiment since the volume in the well 320 is reduced by inserting the inserter 420, the diffusion space of the evaluation substance is reduced as compared with the second embodiment. Therefore, the diffusion of the evaluation substance is suppressed, and the detection sensitivity of the evaluation object passing amount measuring device 380 is increased. Further, since the inserter 420 can be attached and detached, it is easy to change the position of the observation area.
- the flat surface portion for measuring the fluorescence luminance is formed in the groove portion 423 provided on the lower surface portion 422 of the inserter 420, and the lower surface portion 422 of the inserter 420 excluding the groove portion 423 contacts the bottom portion 401 of the well 320. is doing.
- the groove portion 423 observation region
- the groove portion 423 can be positioned at a constant distance from the bottom 401 of the well 320, and observation can be performed in each well 320 under the same conditions. Further, since the groove portion 423 is separated from the bottom portion 401 of the well 320, the evaluation substance can easily reach the gap.
- the inserter 420 is formed in a ring shape that can be attached to the side wall of the culture insert 310. According to this configuration, since the culture insert 310 can be inserted inside the inserter 420, the positioning of the culture insert 310 becomes easy.
- a fitting projection 391 for fitting the inserter 420 is formed on the side wall of the well 320. According to this configuration, it is possible to prevent vibration, misalignment, and the like of the inserter 420 and the culture insert 310.
- the contact surface 424 in contact with the fitting projection 391 of the inserter 420 is formed in a planar shape. According to this configuration, it is possible to prevent the inserter 420 from rotating, and it is possible to prevent the groove portion 423 (observation region) from being displaced in the circumferential direction.
- FIG. 40 is a cross-sectional configuration diagram of the kidney filtration function evaluation device 300 in which the inserter 420 according to the first modification of the third embodiment is arranged.
- FIG. 41 is a perspective view of the upper surface of the inserter 420 according to the first modification of the third embodiment.
- a penetration portion 425 penetrating from the upper surface 421 to the lower surface 422 is formed in a portion other than the insertion portion of the culture insert 310 of the inserter 420.
- the second lead-out pipe line 361 is inserted into the penetrating portion 425.
- the penetration portion 425 has a first flow path 425a extending from the upper surface 421 of the inserter 420 toward the lower surface 422 and a second flow extending from the lower end of the first flow path 425a to the inner peripheral surface of the inserter 420. It has a road 425b and.
- the first flow path 425a is a through hole having a circular shape in a plan view.
- the second flow path 425b is a groove having a rectangular bottom view formed on the lower surface 422 of the inserter 420.
- the filtrate 303 leaking from the bottom opening of the culture insert 310 flows in and is guided to the second outlet line 361 inserted in the first flow path 425a.
- the place where the penetrating portion 425 is formed is not particularly limited as long as it is a place other than the place where the groove portion 423 is formed. Further, one or more penetration portions 425 may be formed on the inserter 420.
- a penetration portion 425 in which the second lead-out pipe line 361 can be easily inserted, and connection can be easily performed.
- a plurality of second outlet pipes 361 may be provided and connected to the plurality of penetration portions 425 to promote the discharge of the filtrate 303.
- a tube or a pipe for diffusing the evaluation substance in the filtrate 303 may be inserted into the penetrating portion 425.
- the second introduction is arranged in the well 320 by being inserted into another penetration portion 425 in the same manner as the second lead-out pipe 361.
- a pipeline may be provided.
- a medium having a medium composition suitable for the cells in the well 320 may be supplied from the second introduction pipe, and the excess medium in the well 320 may be drained from the second outlet pipe 361.
- FIG. 42 is a cross-sectional configuration diagram of the kidney filtration function evaluation device 300 in which the inserter 420 according to the second modification of the third embodiment is arranged.
- FIG. 43 is an exploded perspective view of the multi-well plate 390 included in the kidney filtration function evaluation device 300 shown in FIG. 42.
- the lower surface 422 of the inserter 420 is not in contact with the bottom 401 of the well 320 and is supported in a state of being suspended from the step portion 394 of the well 320.
- the entire lower surface 422 of the inserter 420 is a flat surface portion (observation region).
- a hydrophilization treatment for the purpose of suppressing the generation of bubbles on the lower surface 422 of the inserter 420 and hindering the fluorescence brightness measurement is performed. It may be applied to at least the lower surface 422.
- the step portion 394 is provided in an annular shape inside the side wall of the well 320.
- the inserter 420 has a flange portion 426 mounted on the step portion 394. As shown in FIG. 43, the flange portion 426 is formed in an annular shape so as to project radially outward from the upper end portion of the inserter 420.
- the second modification as described above, since the entire lower surface 422 of the inserter 420 is a flat surface portion (observation region), the circumference of the inserter 420 as shown in FIG. 37 described above A stop structure is not required, but a stop structure may be provided for fixing the inserter 420 or the like.
- a fillet 427 is formed on the inner diameter side of the inserter 420 of the second modification.
- the fillet 427 is a rounded corner of the upper end opening edge of the insertion portion of the inserter 420 into which the culture insert 310 is inserted. According to this configuration, the culture insert 310 can be easily inserted inside the inserter 420, and the biofilter 330 at the bottom opening of the culture insert 310 can be prevented from coming into contact with the inserter 420 and being damaged at the time of insertion. ..
- FIG. 44 is a cross-sectional configuration diagram of the kidney filtration function evaluation device 300 in which the inserter 420 according to the third modification of the third embodiment is arranged.
- FIG. 45 is a plan view of the multi-well plate 390 included in the kidney filtration function evaluation device 300 shown in FIG. 44.
- FIG. 46 is an exploded perspective view of the multi-well plate 390 shown in FIG. 45.
- the inserter 420 has a collar portion 428.
- the flange portion 428 is arranged so as to straddle the weir portion 393a formed between the well 320 and the filtrate discharge tank 392.
- the weir portion 393a is a part of a communication flow path 393 that communicates between the well 320 and the filtrate discharge tank 392, and is formed higher than the bottom portion 401 of the well 320 and the bottom surface of the filtrate discharge tank 392.
- the flange portion 428 has a first portion 428a extending radially outward from the upper end portion of the inserter 420, and a second portion 428b bent from the tip of the first portion 428a and extending downward.
- the weir portion 393a is inserted (arranged) in an inverted U-shaped gap surrounded by the outer wall of the inserter 420 and the flange portion 428.
- a minute gap through which 303 can flow is formed.
- the filtrate 303 flows out from the well 320 to the filtrate discharge tank 392 as shown by an arrow in FIG. 44 due to the capillary phenomenon caused by the minute gap.
- a medium having a medium composition suitable for the cells in the well 320 is supplied in parallel with or in place of the second out-out line 361 (not shown) arranged in the well 320 (not shown).
- a second introduction pipe may be arranged to allow the excess medium in the well 320 to flow out to the filtrate discharge tank 392. That is, in the situation where the cell layer (biofilter 330) of the culture insert 310 (first container) and the well 320 (second container) is co-cultured with individual medium compositions, the second lead-out pipe line 361 is omitted. You may.
- the filter liquid discharge tank 392 communicating with the well 320, the dam portion 393a formed between the well 320 and the filter liquid discharge tank 392, and the inserter 420 have the dam portion 393a. It is provided so as to straddle and has a flange portion 428 that guides the filtrate 303 from the well 320 to the filtrate discharge tank 392. According to this configuration, the surplus liquid of the filtrate 303 can be led out from the well 320 to the filtrate discharge tank 392 while keeping the liquid level of the filtrate 303 in the well 320 constant.
- the liquid level of the filtrate 303 in the well 320 is higher than the upper surface 421 of the inserter 420 due to the large contact angle of the filtrate 303, and exceeds a certain height. By the way, it flows out to the filtrate discharge tank 392. Therefore, the height of the liquid level of the filtrate 303 in the well 320 fluctuates and becomes unstable.
- the filtrate 303 advances through the gap formed between the inserter 420 and the flange portion 428 and the dam portion 393a by the capillary phenomenon, and constantly flows out to the filter liquid discharge tank 392. , The height of the liquid level of the filtrate 303 in the well 320 can be kept constant. This enables fluorescence observation at the same liquid level.
- FIG. 47 is a graph showing the calibration curve and the coefficient of determination of the serially diluted fluorescent solution using FITC inulin when the inserter 420 according to the third embodiment is used.
- FIG. 48 is a graph showing the calibration curve and the coefficient of determination of the serially diluted fluorescent solution using FITC inulin when a plate reader is used as a comparative example.
- FIG. 49 is a graph showing the calibration curve and the coefficient of determination of the serially diluted fluorescent solution using RITC dextran when the inserter 420 according to the third embodiment is used.
- FIG. 50 is a graph showing a calibration curve and a coefficient of determination of a serially diluted fluorescent solution using RITC dextran when a plate reader is used as a comparative example.
- the calibration curve and the coefficient of determination regarding the fluorescence brightness of the serially diluted solution using the medium containing the fluorescence labeling evaluation substance similar to the verification using the inserter 420 are determined.
- the coefficient R 2 itself has a high accuracy of 0.99 or more in both FITC and RITC, but it is conspicuous that the standard deviation increases as the concentration increases.
- the inserter 420 according to the third embodiment is used, as shown in FIGS. 47 and 49, the standard deviation does not spread even when the concentration is high, which is an advantage over the existing plate reader. It can be said that there is.
- the recess 214 on the side wall is eliminated, and the volume of the inserter 420 is increased. Therefore, the amount of the solution in the well 320 can be reduced, whereby the diffusion of the fluorescently labeled compound leaked or transported from the culture insert 310 is suppressed, and the sensitivity of detecting the fluorescently labeled compound is increased.
- FIGS. 51 and 52 similarly to the recess-mounted multi-well of the second embodiment, the coordinates of the fluorescence luminance measurement area are recorded in the fluorescence microscope software, and the measurement frequency and the measurement time are specified. Even in the third embodiment, it is possible to measure the change in fluorescence luminance time of a plurality of samples over a long period of time.
- FIG. 51 is a graph showing the results of a leak test handling a plurality of samples by automatic observation using FITC inulin when the inserter 420 according to the third embodiment is used.
- FIG. 52 is a graph showing the results of a leak test handling a plurality of samples by automatic observation using RITC dextran when the inserter 420 according to the third embodiment is used.
- the present invention can provide a kidney filtration function reproduction device capable of artificially reproducing the filtration function of a human kidney, a kidney filtration function evaluation device using the kidney filtration function reproduction device, and a kidney filtration function evaluation method.
- Kidney filtration function reproduction device 2 Liquid 3 Filtration liquid 10 1st container 10A 1st liquid storage chamber 11 Closed body 20 2nd container 20A 2nd liquid storage chamber 21 Lid 30 Biofilter 31 Permeation film 32 2nd container side filter 33 1st container side filter 40 Pressure control device 41 Air supply line 42 Pressure measurement line 51 Introductory line 61 2nd out-line line 70 Material addition device 80 Evaluation material passage amount measuring device 100 Kidney filtration function evaluation device 101 Evaluation substance 101a No.
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Abstract
この腎臓濾過機能再現装置は、液体が導入される第1容器と、前記第1容器に導入された液体を濾過するバイオフィルターと、前記バイオフィルターを通過した濾過液が導入される第2容器と、を有し、前記バイオフィルターは、前記第1容器と前記第2容器との間を仕切る透過膜と、前記透過膜の前記第2容器を向く面に配置された第2容器側フィルターと、有し、前記第2容器側フィルターは、ポドサイトから形成されている。
Description
本発明は、腎臓濾過機能再現装置、腎臓濾過機能評価装置、及び腎臓濾過機能評価方法に関するものである。
本願は、2020年8月12日に日本に出願された特願2020-136347号、及び、2020年8月25日に日本に出願された特願2020-141828号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、2020年8月12日に日本に出願された特願2020-136347号、及び、2020年8月25日に日本に出願された特願2020-141828号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
下記特許文献1には、iPS細胞やES細胞等を培養し、その培養物を人に移植する再生医療の実現にあたり、多層構造の細胞の培養が可能な灌流培養装置が開示されている。
この灌流培養装置は、細胞を保持するシート状の担体の両側に圧力差を設け、この圧力差に応じて培地が当該担体を通過する。このため、多層構造の細胞の上層だけでなく下層や中間層の細胞に対しても培地を供給できる。
この灌流培養装置は、細胞を保持するシート状の担体の両側に圧力差を設け、この圧力差に応じて培地が当該担体を通過する。このため、多層構造の細胞の上層だけでなく下層や中間層の細胞に対しても培地を供給できる。
ところで、上述した細胞培養技術は、再生医療だけでなく、創薬研究における毒性試験や病態の解明において、大きな恩恵をもたらすことが期待されている。特に、腎臓病学におけるネフローゼ症候群は、糸球体上皮細胞(ポドサイト)が障害されることにより惹起される蛋白尿・低アルブミン血症を主な症状とする症候群であり、腎代替療法を要する腎死に至る疾患群として世界的に問題となっている。そして、この症候群は、薬剤を原因とするものも多く知られ、創薬研究においては「腎毒性有無の評価」として、重要な評価項目の一つに位置付けられている。このような背景から、創薬研究における候補化合物のヒトへの毒性有無の検証に関し、動物実験に代わる方法として、人工的にヒトの腎臓の濾過機能を再現できるアプリケーションの開発が求められている。
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、人工的にヒトの腎臓の濾過機能を再現できる腎臓濾過機能再現装置、及び、その腎臓濾過機能再現装置を用いた腎臓濾過機能評価装置及び腎臓濾過機能評価方法の提供を目的とする。
本発明の一態様に係る腎臓濾過機能再現装置は、液体が導入される第1容器と、前記第1容器に導入された液体を濾過するバイオフィルターと、前記バイオフィルターを通過した濾過液が導入される第2容器と、を有し、前記バイオフィルターは、前記第1容器と前記第2容器との間を仕切る透過膜と、前記透過膜の前記第2容器を向く面に配置された第2容器側フィルターと、有し、前記第2容器側フィルターは、ポドサイトから形成されている。
上記腎臓濾過機能再現装置においては、前記バイオフィルターは、前記透過膜の前記第1容器を向く面に配置された第1容器側フィルターを有してもよい。
上記腎臓濾過機能再現装置においては、前記第1容器側フィルターは、内皮細胞から形成されていてもよい。
上記腎臓濾過機能再現装置においては、前記第1容器と前記第2容器との圧力差を制御する圧力制御装置を有してもよい。
上記腎臓濾過機能再現装置においては、前記第1容器は、前記液体を収容する第1液体収容室が形成された第1容器本体と、前記第1容器本体の前記第1液体収容室を密閉する閉止体と、を有し、前記圧力制御装置は、前記閉止体を貫通し、前記第1液体収容室に挿入された給気管路及び圧力測定管路を有してもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記第2容器は、前記濾過液が導入される第2液体収容室と、前記第2液体収容室に連通する凹部と、を含み、前記凹部は、前記第2液体収容室の壁面の一部を外側方向に凹入させるように形成されていてもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記第2容器の底部は、可視光に対する透光性を有し、前記第1容器の側壁と前記第2容器の側壁との隙間に挿入され、前記第2容器の底部と対向する下面の少なくとも一部に平面部が形成された挿入部材を備えてもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記平面部は、前記挿入部材の下面に設けられた溝部に形成され、前記溝部を除く前記挿入部材の下面は、前記第2容器の底部に接触していてもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記第2容器と連通する濾過液排出槽と、前記第2容器と前記濾過液排出槽との間に形成された堰部と、前記挿入部材は、前記堰部を跨ぐように設けられ、前記第2容器から前記濾過液排出槽に前記濾過液を導く鍔部を有してもよい。
上記腎臓濾過機能再現装置においては、前記第1容器側フィルターは、内皮細胞から形成されていてもよい。
上記腎臓濾過機能再現装置においては、前記第1容器と前記第2容器との圧力差を制御する圧力制御装置を有してもよい。
上記腎臓濾過機能再現装置においては、前記第1容器は、前記液体を収容する第1液体収容室が形成された第1容器本体と、前記第1容器本体の前記第1液体収容室を密閉する閉止体と、を有し、前記圧力制御装置は、前記閉止体を貫通し、前記第1液体収容室に挿入された給気管路及び圧力測定管路を有してもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記第2容器は、前記濾過液が導入される第2液体収容室と、前記第2液体収容室に連通する凹部と、を含み、前記凹部は、前記第2液体収容室の壁面の一部を外側方向に凹入させるように形成されていてもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記第2容器の底部は、可視光に対する透光性を有し、前記第1容器の側壁と前記第2容器の側壁との隙間に挿入され、前記第2容器の底部と対向する下面の少なくとも一部に平面部が形成された挿入部材を備えてもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記平面部は、前記挿入部材の下面に設けられた溝部に形成され、前記溝部を除く前記挿入部材の下面は、前記第2容器の底部に接触していてもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記第2容器と連通する濾過液排出槽と、前記第2容器と前記濾過液排出槽との間に形成された堰部と、前記挿入部材は、前記堰部を跨ぐように設けられ、前記第2容器から前記濾過液排出槽に前記濾過液を導く鍔部を有してもよい。
本発明の一態様に係る腎臓濾過機能評価装置は、先に記載の腎臓濾過機能再現装置を備え、前記第1容器に導入される前記液体に、前記バイオフィルターの濾過機能を評価する評価物質及び前記バイオフィルターに対する毒性の有無を検証する被験物質の少なくとも一方を添加して腎臓濾過機能を評価する。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記バイオフィルターを通過した前記評価物質の通過量を測定する評価物通過量測定装置を有してもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記評価物質には、第1物質及び第2物質の少なくとも一方が含まれ、前記第1物質は、前記バイオフィルターが正常状態のとき、前記第2容器側フィルターを通過困難であり、前記第2物質は、前記バイオフィルターが正常状態のとき、前記第2容器側フィルターを通過容易であってもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記第1物質及び前記第2物質の少なくとも一方は、蛍光標識とされ、前記評価物通過量測定装置は、前記評価物質の通過量を、前記濾過液の蛍光輝度に基づいて測定してもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記第2容器は、透明部を有しており、前記評価物通過量測定装置は、前記透明部から前記濾過液に測定光を投光し、前記評価物質の通過量を測定してもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記評価物質には、第1物質及び第2物質の少なくとも一方が含まれ、前記第1物質は、前記バイオフィルターが正常状態のとき、前記第2容器側フィルターを通過困難であり、前記第2物質は、前記バイオフィルターが正常状態のとき、前記第2容器側フィルターを通過容易であってもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記第1物質及び前記第2物質の少なくとも一方は、蛍光標識とされ、前記評価物通過量測定装置は、前記評価物質の通過量を、前記濾過液の蛍光輝度に基づいて測定してもよい。
上記腎臓濾過機能評価装置においては、前記第2容器は、透明部を有しており、前記評価物通過量測定装置は、前記透明部から前記濾過液に測定光を投光し、前記評価物質の通過量を測定してもよい。
本発明の一態様に係る腎臓濾過機能評価方法は、先に記載の腎臓濾過機能再現装置を用いた腎臓濾過機能評価方法であって、前記第1容器に導入される前記液体に、前記バイオフィルターの濾過機能を評価する評価物質及び前記バイオフィルターに対する毒性の有無を検証する被験物質の少なくとも一方を添加して腎臓濾過機能を評価する。
上記本発明の態様によれば、人工的にヒトの腎臓の濾過機能を再現できる腎臓濾過機能再現装置、及び、その腎臓濾過機能再現装置を用いた腎臓濾過機能評価装置及び腎臓濾過機能評価方法を提供できる。
以下、本発明の各実施形態について図面を参照して説明する。
(第1実施形態)
図1は、第1実施形態に係る腎臓濾過機能再現装置1及び腎臓濾過機能評価装置100の概略構成図である。
図1に示すように、腎臓濾過機能再現装置1は、第1容器10と、第2容器20と、バイオフィルター30と、を有している。
図1は、第1実施形態に係る腎臓濾過機能再現装置1及び腎臓濾過機能評価装置100の概略構成図である。
図1に示すように、腎臓濾過機能再現装置1は、第1容器10と、第2容器20と、バイオフィルター30と、を有している。
図1に示す腎臓濾過機能再現装置1は、ヒトの腎臓の腎小体を模擬している。具体的に、第1容器10は、腎小体の糸球体に該当する。第1容器10に導入される液体2は、血液に該当する。第2容器20は、腎小体のボーマン嚢に該当する。第2容器20に導入されるバイオフィルター30を通過した濾過液3は、原尿に該当する。バイオフィルター30は、糸球体の毛細血管係蹄壁に該当する。
バイオフィルター30は、第1容器10と第2容器20との間を仕切る透過膜31と、透過膜31の第2容器20を向く面に配置された第2容器側フィルター32と、透過膜31の第1容器10を向く面に配置された第1容器側フィルター33と、を有している。透過膜31は、毛細血管係蹄壁の糸球体基底膜に該当する。第2容器側フィルター32は、毛細血管係蹄壁のポドサイト層に該当する。第1容器側フィルター33は、毛細血管係蹄壁の糸球体内皮細胞層に該当する。
第2容器側フィルター32は、例えば細胞培養技術で培養したヒトの腎臓のポドサイトによって形成されている。ポドサイトは、細胞体より数本の突起(一次突起)が伸長し、一次突起より伸長する多数の突起(足突起)が隣のそれと絡み合った形態(スクラム構造)を有している。スクラム構造の足突起間に生じた隙間にSlit Diaphragm Proteinと称される蛋白質が保持され、血液を濾過する際には、老廃物である尿毒素や不要な電解質等と生体内にとっては必要な血漿蛋白(アルブミン等)とを選別しながら濾過するサイズバリアとして機能する(尿毒素や電解質は血漿蛋白よりも分子サイズが小さい)。このサイズバリアの消失は、ネフローゼ症候群の主要な病態生理として位置づけられており、臨床的に多量の蛋白尿を惹起する事に繋がる。
透過膜31は、ポドサイトが接着する足場であり、また、流体の通過を阻害しないように、流体に対する透過性を有している。ここで言う透過性とは、膜が種々の流体や溶質・イオンを通過させる性質を意味する。なお、濾過とは、流体に大小様々な混合物が含まれる状況において、主にサイズによって混合物が含まれる流体が、篩の性質を持つ膜により選別される(篩の目を通り抜ける事が出来る物質と出来ない物質とに分けられる)事を指し、透過現象(膜等を流体が通過する現象)の中でも狭い現象を指す。ちなみに、通過とは、透過を説明する際に、膜から見た場合の流体の挙動を指す。
透過膜31には、細胞接着を促進する「細胞外マトリクス」がコーティングされていてもよい。ここで用いられる「細胞外マトリクス」は、例えば、ラミニン521、ラミニン511、4型コラーゲン、基底膜マトリクス(ラミニン111、4型コラーゲンα1α2α3、ヘパラン硫酸、ニドゲンの四つの物質を含むゲル状細胞外マトリクス)等から選択できる。なお、細胞外マトリクスの理想は、ラミニン521・IV型コラーゲンα3α4α5・ヘパラン硫酸・ニドゲンの四種を含むゲル状細胞外マトリクス試薬になる。これは、生体内の糸球体基底膜(ポドサイトと内皮細胞の間にあるゲル状板)と全く同じ成分構成になる。これが透過膜31に塗布されている状態が理想的である。
透過膜31は、厚みが10μm程の多孔膜から形成されている。多孔膜の穴径は、好ましくはφ3.0μm(空隙率で14%)以下、より好ましくはφ0.4μm(空隙率で、PET膜の場合0.5%、若しくは、PC膜の場合12%)以下であるとよい。なお、既製品では存在しないが、多孔膜の理想の穴径は、φ0.1μm(空隙率で30%~50%)である。よって、多孔膜の穴径は、φ0.1μm以上且つφ3.0μm以下の範囲内、より好ましくは、φ0.1μm以上且つφ0.4μm以下の範囲内であるとよい。この透過膜31の素材の色は、透明でも良いが、可視光を吸収する黒や特異的な光波長のみを阻む光フィルターの特性を有していても良い。ポドサイトの細胞器官が、後述する評価物質の光波長とは異なる蛍光で標識されていた場合、透過膜31が例えば黒であれば、その蛍光標識された細胞器官の局在変化等が観察できる。また、透過膜31がある特異的な光波長のみを阻むフィルターである場合も黒と同様の理由で、細胞器官の局在変化等が観察できる。
第1容器側フィルター33は、例えば細胞培養技術で培養したヒトの腎臓の糸球体の内皮細胞によって形成されている。なお、第1容器側フィルター33は、内皮細胞の代替可能性があるものであれば細胞に限られず、例えば、サイズが直径200nmまでの物質を通過させ、また陰性荷電を帯びる事もある透析膜や、グラスナノファイバー等であっても構わない。なお、第1容器側フィルター33が細胞でなければ、上述した物質透過性を有して細胞接着の足場となる透過膜31が、第1容器側フィルター33の機能を有していても構わない。この場合は、第1容器側フィルター33を設けなくても構わないが、透過膜31は、濾過流を良好に形成する観点から、上述した理想の多孔膜のようなきめ細かいものであるとよい。
第1容器10は、液体2を収容する第1液体収容室10Aを有している。第1容器10の本体(第1容器本体)は、筒状に形成されている。第1容器10の本体の構成材料は特に限定されないが、例えば、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリスチレン等が使用できる。第1容器10の本体は、無色透明であることが好ましい。つまり、第1容器10の本体全体は、可視光(波長380~750nm)に対する透光性を有している。第1容器10の本体が無色透明であると、第1容器10の本体内部の液量・液面や、後述する閉止体11の陥入度合い、また給気管路41、圧力測定管路42、及び導入管路51の先端位置の目視確認が可能となる。なお、第1容器10の本体は、観察光が通過しなければ、何色であっても構わない。
第1容器10の本体の底部開口は、上述したバイオフィルター30によって覆われている。また、第1容器10の本体の上部開口は、閉止体11によって閉止されている。第1容器10の本体、閉止体11、及びバイオフィルター30によって囲まれた空間が、第1液体収容室10Aとなっている。
閉止体11は、第1液体収容室10Aを閉塞し、その密閉性を高めるため、全体が弾性部材で構成されていることが好ましい。閉止体11を構成する弾性材料は特に限定されないが、例えば、ゴム(シリコーンゴム等)、エラストマ等が使用できる。閉止体11も、無色透明であることが好ましい。つまり、閉止体11の全体は、可視光(波長380~750nm)に対する透光性を有している。閉止体11が無色透明であると、後述するバイオフィルター30の濾過機能の評価において、精度の高い測定が可能となる。
第2容器20は、濾過液3が導入される第2液体収容室20Aを有している。第2容器20の本体(第2容器本体)は、有底筒状に形成されている。第2容器20の本体の構成材料は特に限定されないが、例えば、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリスチレン等が使用できる。第2容器20の本体は、無色透明であることが好ましい。つまり、第2容器20の本体全体は、可視光(波長380~750nm)に対する透光性を有している。第2容器20の本体が無色透明であると、後述するバイオフィルター30の濾過機能の評価において、精度の高い測定が可能となる。
第2容器20の本体の上部開口は、蓋体21によって閉塞されている。つまり、第2容器20の本体、及び蓋体21によって囲まれた空間が、第2液体収容室20Aとなっている。この第2液体収容室20Aには、上述した第1容器10が配置・挿入されている。蓋体21は、例えば、第2容器20の本体に対してねじ止めによって固定され、取り外しも容易になっている。なお、第2液体収容室20Aは、第1液体収容室10Aほど密閉性が高くなくても構わない。
蓋体21を構成する弾性材料は特に限定されないが、例えば、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリスチレン等が使用できる。蓋体21も、無色透明であることが好ましい。つまり、蓋体21の全体は、可視光(波長380~750nm)に対する透光性を有している。蓋体21が無色透明であると、後述するバイオフィルター30の濾過機能の評価において、精度の高い測定が可能となる。
腎臓濾過機能再現装置1は、第1容器10と第2容器20との圧力差を制御する圧力制御装置40と、第1液体収容室10Aに液体2を導入する液体導入装置50と、第2液体収容室20Aから濾過液3を導出する濾過液導出装置60と、を有している。圧力制御装置40は、蓋体21及び閉止体11を貫通し、第1液体収容室10Aに挿入された給気管路41及び圧力測定管路42を有している。液体導入装置50は、蓋体21及び閉止体11を貫通し、第1液体収容室10Aに挿入された導入管路51を有している。また、濾過液導出装置60は、蓋体21のみを貫通し、第2液体収容室20Aに挿入された第2導出管路61を有している。
給気管路41及び圧力測定管路42の下端は、第1液体収容室10Aにおいて液体2の液面よりも上方に配置されている。導入管路51の下端は、第1液体収容室10Aにおいて液体2の液中に配置されている。また、第2導出管路61の下端は、第2液体収容室20Aにおいて濾過液3の液中に配置されている。給気管路41、圧力測定管路42、導入管路51、及び第2導出管路61の、少なくとも蓋体21及び閉止体11を貫通する部分は、硬質管路から形成されているとよい。硬質管路としては、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)等の硬質樹脂が好ましい。また、これら硬質管路も、無色透明であることが好ましい。なお、硬質管路は、ステンレスチューブ等の金属管であっても構わない。ステンレスチューブは、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)のチューブよりもこしが強く、蓋体21及び閉止体11に対する挿入が容易になる。例えば、ステンレスチューブを蓋体21の外側で折り曲げておくことで、チューブ先端の高さ位置を厳密に統制できる。また、ステンレスチューブを蓋体21の外側において光路が邪魔されないように配設することで、後述するバイオフィルター30の濾過機能の評価において、精度の高い測定が可能となる。
圧力制御装置40、液体導入装置50、及び濾過液導出装置60は、腎臓濾過機能再現装置1においてヒトの腎臓における濾過流を形成する。濾過流とは、健康なヒトの腎臓において、糸球体(第1容器10)の毛細血管(バイオフィルター30)からボーマン嚢(第2容器20)に対して濾過圧が生じ、血液(液体2)に含まれる老廃物や水分がボーマン嚢に流れて、原尿(濾過液3)になり、血液中の生体に有用な蛋白質等の成分はそのまま血液を循環する流れである。ちなみに、導入管路51は、糸球体(第1容器10)に血液を輸送する輸入細動脈に該当する。また、第2導出管路61は、ボーマン嚢(第2容器20)に排出された原尿を輸送する尿細管に該当する。なお、濾過流に関しては、健康であっても、生体に有用な蛋白質等の成分の一部がボーマン嚢に流れるという報告がある。なお、第2導出管路61とは別に、第2容器20に図示しない第2導入管路に配置し、第2容器20内の細胞に適した培地組成の培地を灌流させてもよい。この第2導入管路から供給する培地は、第1容器10内の細胞に適した培地組成で灌流する培地とは異なる組成とすることができる。これにより、第1容器10と第2容器20の空間内の細胞を各々に適した培養条件で成熟・分化させる事が可能となる。
圧力制御装置40は、給気管路41に接続された図示しないシリンジポンプや空気加圧制御器を有している。また、圧力制御装置40は、圧力測定管路42に接続された図示しない圧力センサモジュールを有している。圧力制御装置40は、給気管路41から第1液体収容室10Aにガスを供給し、また圧力測定管路42から第1液体収容室10Aの圧力をフィードバックすることで、上記濾過流の濾過圧を形成する。この濾過圧(第1容器10と第2容器20との圧力差)は、例えば上限を10.0kPaとして、下限が0.5kPa~7.0kPaが好ましく、下限が2.5kPa~7.0kPaがより好ましい。最も好ましい理想的な濾過圧は、in vivoの糸球体内圧と同様と言われる5.0kPa以上且つ7.0kPa以下である。なお、圧力制御装置40の設定圧力と第1液体収容室10Aの実測圧力とが殆ど同一になるような場合には、圧力測定管路42は省略し、給気管路41のみとすることも可能である。
続いて、腎臓濾過機能評価装置100の構成について説明する。
腎臓濾過機能評価装置100は、上述した腎臓濾過機能再現装置1と、腎臓濾過機能再現装置1の第1容器10に導入される液体2に、バイオフィルター30の濾過機能を評価する評価物質101及びバイオフィルター30に対する毒性の有無を検証する図示しない被験物質の少なくとも一方を添加する物質添加装置70と、バイオフィルター30を通過した評価物質101の通過量を測定する評価物通過量測定装置80と、を有している。なお、物質添加装置70は、導入管路51を介して液体2に評価物質101及び被験物質の少なくとも一方を添加するものであるが、液体導入装置50もしくは導入管路51から手作業で評価物質101及び被験物質の少なくとも一方を添加してもよい。また、閉止体11及び蓋体21を取り外して、第1容器10内に評価物質101及び被験物質の少なくとも一方を直接投入してもよい。その他、液体導入装置50が評価物質101及び被験物質の少なくとも一方を添加する機能を備えることで、物質添加装置70を兼ねてもよい。さらに、液体導入装置50が、例えば、液体2の圧力を感知し、設定圧に合わせて送液を行うポンプ(例えば圧力感知型のシリンジポンプ等)を備える場合には、圧力制御装置40(給気管路41,圧力測定管路42)を兼ねてもよい。すなわち、液体導入装置50に、圧力制御装置40及び物質添加装置70の少なくとも一方が統合されてもよい。
腎臓濾過機能評価装置100は、上述した腎臓濾過機能再現装置1と、腎臓濾過機能再現装置1の第1容器10に導入される液体2に、バイオフィルター30の濾過機能を評価する評価物質101及びバイオフィルター30に対する毒性の有無を検証する図示しない被験物質の少なくとも一方を添加する物質添加装置70と、バイオフィルター30を通過した評価物質101の通過量を測定する評価物通過量測定装置80と、を有している。なお、物質添加装置70は、導入管路51を介して液体2に評価物質101及び被験物質の少なくとも一方を添加するものであるが、液体導入装置50もしくは導入管路51から手作業で評価物質101及び被験物質の少なくとも一方を添加してもよい。また、閉止体11及び蓋体21を取り外して、第1容器10内に評価物質101及び被験物質の少なくとも一方を直接投入してもよい。その他、液体導入装置50が評価物質101及び被験物質の少なくとも一方を添加する機能を備えることで、物質添加装置70を兼ねてもよい。さらに、液体導入装置50が、例えば、液体2の圧力を感知し、設定圧に合わせて送液を行うポンプ(例えば圧力感知型のシリンジポンプ等)を備える場合には、圧力制御装置40(給気管路41,圧力測定管路42)を兼ねてもよい。すなわち、液体導入装置50に、圧力制御装置40及び物質添加装置70の少なくとも一方が統合されてもよい。
評価物質101には、第1物質101a及び第2物質101bの少なくとも一方が含まれている(図1では、第1物質101a及び第2物質101bの両方を示している)。第1物質101aは、バイオフィルター30が正常状態のとき、第2容器側フィルター32を通過困難な物質であり、第2物質101bは、バイオフィルター30が正常状態のとき、第2容器側フィルター32を通過容易な物質である。
例えば、第1物質101aには、分子量64kDaであるアルブミン程度の中分子やアルブミン以上の高分子が該当する。アルブミンを含む血漿中の大部分の蛋白は、ポドサイト層までの過程で大部分が通過を阻まれ、極わずかの量が漏出する程度に留まる。つまり、アルブミン程度の中分子やアルブミン以上の高分子は、内皮細胞(第1容器側フィルター33)と多孔膜(透過膜31)は通過できるものの、ポドサイト層(第2容器側フィルター32)を殆ど通過できないのが正常な生理現象である。このように、第1物質101aは、バイオフィルター30が正常状態のとき、第2容器側フィルター32を完全に通過不能ではないが、通過困難である。被験物質により、ポドサイト層が障害を受ければ、この第1物質101aのリークが対照実験によって多く測定されるため、被験物質の有害性をポドサイト機能障害の現象として捉える事ができる。
例えば、第2物質101bには、分子量64kDaであるアルブミン未満の低分子であるイヌリンが該当する。イヌリン等の低分子は、内皮細胞(第1容器側フィルター33)、多孔膜(透過膜31)、及びポドサイト層(第2容器側フィルター32)を殆ど通過できるのが正常な生理現象である。なお、高分子蛋白のリークが少ない状況においても、そもそも内皮細胞が病的に透過性を失う場合があり得る。臨床的にも「管内増殖」という病理用語があり、この場合、低分子物質でさえも内皮細胞を通過できなくなる。当然この場合は、急性の経過で腎不全が増悪する。このように、低分子の第2物質101bを添加する意義は、内皮細胞から多孔膜までの透過性が適切である事を確認する事である。
なお、評価物質101には、分子量5kDa前後のイヌリン(低分子)、分子量60kDa前後のアルブミンや同程度のデキストラン(中分子)に加え、さらに分子量200kDa程度のデキストラン(高分子)の計3種類の評価物質が含まれていてもよい。3種類の評価物質101を添加しても蛍光タグの波長をずらすことで三種類の評価物質101を測定することが可能である。分子量60kDaの中分子と分子量200kDaの高分子とで漏出の差が見られた場合、より高度な腎障害が惹起されているという判断が可能となる。
評価物質101を計測する方法としては、いくつか挙げられる。例えば、濾過液3を回収し、液体クロマトグラフィー等を用いることで、分離した種々の成分の質量を分析する質量分析装置で計測することができる。また、濾過液3を回収せずに、評価物質101を計測する方法として、評価物質101にマーカーをつける方法がある。マーカーとしては、例えば、後述する蛍光標識や、細胞毒性の少ない生細胞染色キット(例えばPHK26等)で細胞を染色すること等が挙げられる。ここでは、マーカーとしては、蛍光標識を用いる方法を説明する。つまり、評価物質101は、蛍光標識とされている。蛍光標識としては、例えば、アルブミンやデキストラン等の高分子化合物をFITC(フルオレセインイソチアネート)やRITC(ローダミンBイソチアネート)を化学結合によって標識したものが挙げられる。なお、第1物質101a及び第2物質101bの両方を蛍光標識としてもよく、異なる蛍光色としてもよい。また、上記ポドサイト層の障害を明確に捉えるために第1物質101aのみを蛍光標識としてもよいし、上記内皮細胞の増殖を明確に捉えるために第2物質101bのみを蛍光標識としてもよい。
評価物通過量測定装置80は、第2容器20の底部(透明部)から濾過液3に測定光を投光し、評価物質101の通過量を測定する。評価物通過量測定装置80は、第2容器20の底部(透明部)から第1容器10が映り込まない領域においてリアルタイムで蛍光観察を行う。評価物通過量測定装置80は、測定光を投光する光源、測定光に照らされた濾過液3の蛍光輝度を測定する蛍光輝度センサ、蛍光輝度センサの測定結果に基づいて、評価物質101の通過量を算出する演算部等を有している。なお、評価物通過量測定装置80は、蛍光顕微鏡等であってもよい。ちなみに、評価物質101の測定方法としては、第2導出管路61から濾過液3をサンプリングして評価する方法もあるが、リアルタイムで蛍光観察できる評価物通過量測定装置80を用いて評価するのが理想的である。なお、評価物通過量測定装置80に関しては、蛍光顕微鏡のみならず、CCDカメラ、CMOSセンサ、光電子倍増管(Photomultiplier Tube)を用いた検出系も含む。
続いて、上記構成の腎臓濾過機能再現装置1を用いた腎臓濾過機能評価方法(腎臓濾過機能評価装置100の動作)について説明する。
図2は、第1実施形態に係る腎臓濾過機能評価方法(評価物通過量測定)の一例を示すフローチャートである。
図2に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ずバイオフィルター30に上述した濾過圧を負荷するか否かを判断する(ステップS1)。ステップS1においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS2:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS5)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS5まで濾過圧の負荷を継続する。
図2に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ずバイオフィルター30に上述した濾過圧を負荷するか否かを判断する(ステップS1)。ステップS1においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS2:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS5)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS5まで濾過圧の負荷を継続する。
次のステップS3では、第1容器10に導入される液体2に評価物質101を添加する(物質添加工程)。なお、ステップS1においてNOの場合、ステップS3に移行し、液体2に評価物質101を添加する。次のステップS4では、腎臓濾過機能再現装置1の実験環境内で細胞(ポドサイト、内皮細胞等)を一定期間培養する(細胞培養工程)。
次のステップS5では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。
ステップS5においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS6:濾過圧負荷工程)。なお、以降の各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的には測定が終了するまで濾過圧の負荷を継続する。ステップS2及びステップS5で濾過圧負荷の選択肢を設ける意義は、実験条件やステップS4における細胞の培養条件等によっては、予めバイオフィルター30に濾過圧を負荷するのが好ましくない場合もあり得るためである。
ステップS5においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS6:濾過圧負荷工程)。なお、以降の各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的には測定が終了するまで濾過圧の負荷を継続する。ステップS2及びステップS5で濾過圧負荷の選択肢を設ける意義は、実験条件やステップS4における細胞の培養条件等によっては、予めバイオフィルター30に濾過圧を負荷するのが好ましくない場合もあり得るためである。
次のステップS7では、バイオフィルター30を通過した評価物質101の通過量を測定する(評価物通過量測定工程)。評価物質101の通過量は、図1に示す評価物通過量測定装置80が、第2容器20の底部(透明部)から濾過液3に測定光を投光し、濾過液3の蛍光輝度に基づいて測定する。なお、ステップS5においてNOの場合、ステップS7に移行し、同じく評価物質101の通過量を測定する。
次のステップS8では、上記評価物質101の通過量の測定を継続するか否か判断する。ステップS8においてYESの場合、ステップS7に戻り測定を継続する。一方、ステップS8においてNOの場合、本評価フローは終了となる。
図3は、第1実施形態に係る腎臓濾過機能評価方法(評価物通過量測定)の他の例を示すフローチャートである。
図3に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ず第1容器10に導入される液体2に被験物質を添加する(ステップS9:物質添加工程)。被験物質は、バイオフィルター30に対する毒性の有無を検証する物質である。被験物質としては、例えばポドサイトに対して細胞障害を惹起するピューロマイシンヌクレオシド(PAN)等を例示できる。
図3に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ず第1容器10に導入される液体2に被験物質を添加する(ステップS9:物質添加工程)。被験物質は、バイオフィルター30に対する毒性の有無を検証する物質である。被験物質としては、例えばポドサイトに対して細胞障害を惹起するピューロマイシンヌクレオシド(PAN)等を例示できる。
次のステップS10では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。ステップS10においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS11:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS16)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS16まで濾過圧の負荷を継続する。次のステップS12では、腎臓濾過機能再現装置1の実験環境内で細胞(ポドサイト、内皮細胞等)を一定期間培養する(曝露工程)。この曝露工程は、被験物質を添加した液体2に細胞を曝す期間である。なお、ステップS10においてNOの場合、ステップS12に移行し、被験物質を添加した液体2に細胞を曝す。
次のステップS13では、実験条件に応じて被験物質を取り除くか否かを判断する。ステップS13においてYESの場合、第1容器10に導入される液体2から被験物質を取り除く(ステップS14:物質除去工程)。次のステップS15では、第1容器10に導入される液体2に評価物質101を添加する(物質添加工程)。なお、ステップS13においてNOの場合、ステップS15に移行し、液体2に評価物質101を添加する。
次のステップS16では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。ステップS15においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS17:濾過圧負荷工程)。なお、以降の各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的には測定が終了するまで濾過圧の負荷を継続する。ステップS10及びステップS16で濾過圧負荷の選択肢を設ける意義は、実験条件やステップS12における細胞の培養条件等によっては、予めバイオフィルター30に濾過圧を負荷するのが好ましくない場合もあり得るためである。
次のステップS18では、バイオフィルター30を通過した評価物質101の通過量を測定する(評価物通過量測定工程)。なお、ステップS16においてNOの場合、ステップS18に移行し、同じく評価物質101の通過量を測定する。
次のステップS19では、上記評価物質101の通過量の測定を継続するか否か判断する。ステップS19においてYESの場合、ステップS18に戻り測定を継続する。一方、ステップS19においてNOの場合、本評価フローは終了となる。
図4は、第1実施形態に係る腎臓濾過機能評価方法(評価物通過量測定)の他の例を示すフローチャートである。
図4に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ず第1容器10に導入される液体2に評価物質101及び被験物質を同じタイミングで添加する(ステップS20:物質添加工程)。
次のステップS21では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。
ステップS21においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS22:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS26)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS26まで濾過圧の負荷を継続する。
図4に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ず第1容器10に導入される液体2に評価物質101及び被験物質を同じタイミングで添加する(ステップS20:物質添加工程)。
次のステップS21では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。
ステップS21においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS22:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS26)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS26まで濾過圧の負荷を継続する。
次のステップS23では、腎臓濾過機能再現装置1の実験環境内で細胞(ポドサイト、内皮細胞等)を一定期間培養する(曝露工程)。なお、ステップS21においてNOの場合、ステップS23に移行し、被験物質を添加した液体2に細胞を曝す。次のステップS24では、実験条件に応じて被験物質を取り除くか否かを判断する。ステップS24においてYESの場合、第1容器10に導入される液体2から被験物質を取り除く(ステップS25:物質除去工程)。
次のステップS26では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。ステップS26においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS27:濾過圧負荷工程)。なお、以降の各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的には測定が終了するまで濾過圧の負荷を継続する。ステップS21及びステップS26で濾過圧負荷の選択肢を設ける意義は、実験条件やステップS23における細胞の培養条件等によっては、予めバイオフィルター30に濾過圧を負荷するのが好ましくない場合もあり得るためである。
次のステップS28では、バイオフィルター30を通過した評価物質101の通過量を測定する(評価物通過量測定工程)。なお、ステップS26においてNOの場合、ステップS28に移行し、同じく評価物質101の通過量を測定する。
次のステップS29では、上記評価物質101の通過量の測定を継続するか否か判断する。ステップS29においてYESの場合、ステップS28に戻り測定を継続する。一方、ステップS29においてNOの場合、本評価フローは終了となる。
図5は、第1実施形態に係る腎臓濾過機能評価方法(細胞障害マーカー測定)の例を示すフローチャートである。なお、本評価フローは、上記評価物通過量測定の評価フローと共に行っても構わない。
図5に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ずバイオフィルター30に上述した濾過圧を負荷するか否かを判断する(ステップS30)。ステップS30においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS31:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS33)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS33まで濾過圧の負荷を継続する。
図5に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ずバイオフィルター30に上述した濾過圧を負荷するか否かを判断する(ステップS30)。ステップS30においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS31:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS33)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS33まで濾過圧の負荷を継続する。
次のステップS32では、腎臓濾過機能再現装置1の実験環境内で細胞(ポドサイト、内皮細胞等)を一定期間培養する(細胞培養工程)。なお、ステップS30においてNOの場合、ステップS32に移行し、細胞を一定期間培養する。
次のステップS33では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。ステップS33においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS34:濾過圧負荷工程)。なお、以降の各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的には測定が終了するまで濾過圧の負荷を継続する。ステップS30及びステップS33で濾過圧負荷の選択肢を設ける意義は、実験条件やステップS32における細胞の培養条件等によっては、予めバイオフィルター30に濾過圧を負荷するのが好ましくない場合もあり得るためである。
次のステップS35では、第2容器20から第2導出管路61等を介して濾過液3の一部を回収する(濾過液回収工程)。なお、ステップS33においてNOの場合、ステップS35に移行し、濾過液3の一部を回収する。
次のステップS36では、第2容器20から回収した濾過液3に含まれる第1容器側フィルター33(内皮細胞)や第2容器側フィルター32(ポドサイト)から排出された細胞の障害マーカーを測定する(細胞障害マーカー測定工程)。具体的には、第1容器側フィルター33及び第2容器側フィルター32の少なくとも一方を予め染色しておき、第2容器20に排出された細胞(細胞障害マーカー)を含む濾過液3を細胞障害マーカー測定装置に入れ、当該濾過液3に含まれる細胞障害マーカーを検出し、細胞死を直接的に測定したり、細胞内の代謝機能を測定し、その減少をとらえて細胞毒性を見積もる。
次のステップS37では、上記細胞障害マーカーの測定を継続するか否か判断する。ステップS37においてYESの場合、ステップS32に戻り細胞の培養からステップS36の細胞障害マーカーの測定までの一連の流れを繰り返す。一方、ステップS37においてNOの場合、本評価フローは終了となる。
図6は、第1実施形態に係る腎臓濾過機能評価方法(細胞障害マーカー測定)の他の例を示すフローチャートである。
図6に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ず第1容器10に導入される液体2に被験物質を添加する(ステップS38:物質添加工程)。次のステップS39では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。ステップS39においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS40:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS42)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS42まで濾過圧の負荷を継続する。
図6に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ず第1容器10に導入される液体2に被験物質を添加する(ステップS38:物質添加工程)。次のステップS39では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。ステップS39においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS40:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS42)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS42まで濾過圧の負荷を継続する。
次のステップS41では、腎臓濾過機能再現装置1の実験環境内で細胞(ポドサイト、内皮細胞等)を一定期間培養する(曝露工程)。なお、ステップS39においてNOの場合、ステップS41に移行し、被験物質を添加した液体2に細胞を曝す。
次のステップS42では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。ステップS42においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS43:濾過圧負荷工程)。なお、以降の各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的には測定が終了するまで濾過圧の負荷を継続する。ステップ39及びステップS42で濾過圧負荷の選択肢を設ける意義は、実験条件やステップS41における細胞の培養条件等によっては、予めバイオフィルター30に濾過圧を負荷するのが好ましくない場合もあり得るためである。
次のステップS44では、第2容器20から第2導出管路61等を介して濾過液3の一部を回収する(濾過液回収工程)。なお、ステップS42においてNOの場合、ステップS44に移行し、濾過液3の一部を回収する。
次のステップS45では、第2容器20から回収した濾過液3に含まれる第1容器側フィルター33(内皮細胞)や第2容器側フィルター32(ポドサイト)から排出された細胞の障害マーカーを測定する(細胞障害マーカー測定工程)。
次のステップS46では、上記細胞障害マーカーの測定を継続するか否か判断する。ステップS46においてYESの場合、ステップS41に戻り細胞の培養(曝露工程)からステップS45の細胞障害マーカーの測定までの一連の流れを繰り返す。一方、ステップS46においてNOの場合、本評価フローは終了となる。
図7は、第1実施形態に係る腎臓濾過機能評価方法(細胞形態変化測定)の例を示すフローチャートである。なお、本評価フローは、上記評価物通過量測定の評価フローや、上記細胞障害マーカー測定の評価フローと共に行っても構わない。
図7に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ずバイオフィルター30に上述した濾過圧を負荷するか否かを判断する(ステップS47)。ステップS47においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS48:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS50)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS50まで濾過圧の負荷を継続する。
図7に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ずバイオフィルター30に上述した濾過圧を負荷するか否かを判断する(ステップS47)。ステップS47においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS48:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS50)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS50まで濾過圧の負荷を継続する。
次のステップS49では、腎臓濾過機能再現装置1の実験環境内で細胞(ポドサイト、内皮細胞等)を一定期間培養する(細胞培養工程)。なお、ステップS47においてNOの場合、ステップS49に移行し、細胞を一定期間培養する。
次のステップS50では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。ステップS50においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS51:濾過圧負荷工程)。なお、以降の各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的には測定が終了するまで濾過圧の負荷を継続する。ステップS47ステップS50で濾過圧負荷の選択肢を設ける意義は、実験条件やステップS49における細胞の培養条件等によっては、予めバイオフィルター30に濾過圧を負荷するのが好ましくない場合もあり得るためである。
次のステップS52では、第1容器側フィルター33(内皮細胞)及び第2容器側フィルター32(ポドサイト)の少なくとも一方の細胞形態の変化を測定する(細胞変化測定工程)。具体的には、第1容器側フィルター33及び第2容器側フィルター32の少なくとも一方を、生細胞染色キット(例えばPHK26等)で予め染色しておき、第2容器20の底部や側壁から細胞変化測定装置(例えば蛍光顕微鏡等)で観察・撮像し、直接的に細胞形態の変化を測定する。ここで細胞形態の変化を好適に観察・撮像するために、透過膜31は、可視光に対する非透光性を有してもよい。例えば、黒色の透過膜31であれば、蛍光色の細胞とのコントラストを際立たせることができる。なお、ステップS59においてNOの場合、ステップS52に移行し、細胞形態の変化を測定する。
次のステップS53では、上記細胞形態変化の測定を継続するか否か判断する。ステップS53においてYESの場合、ステップS49に戻り細胞の培養からステップS53の細胞形態変化の測定までの一連の流れを繰り返す。一方、ステップS53においてNOの場合、本評価フローは終了となる。
図8は、第1実施形態に係る腎臓濾過機能評価方法(細胞形態変化測定)の他の例を示すフローチャートである。
図8に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ず第1容器10に導入される液体2に被験物質を添加する(ステップS55:物質添加工程)。次のステップS56では、バイオフィルター30に上述した濾過圧を負荷するか否かを判断する。ステップS56においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS57:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS59)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS59まで濾過圧の負荷を継続する。
図8に示す腎臓濾過機能評価方法では、先ず第1容器10に導入される液体2に被験物質を添加する(ステップS55:物質添加工程)。次のステップS56では、バイオフィルター30に上述した濾過圧を負荷するか否かを判断する。ステップS56においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS57:濾過圧負荷工程)。なお、次のバイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する選択肢(ステップS59)までの各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的にはステップS59まで濾過圧の負荷を継続する。
次のステップS58では、腎臓濾過機能再現装置1の実験環境内で細胞(ポドサイト、内皮細胞等)を一定期間培養する(曝露工程)。なお、ステップS56においてNOの場合、ステップS58に移行し、被験物質を添加した液体2に細胞を曝す。
次のステップS59では、バイオフィルター30に濾過圧を負荷するか否かを判断する。ステップS59においてYESの場合、圧力制御装置40によって、バイオフィルター30に濾過圧を負荷する(ステップS60:濾過圧負荷工程)。なお、以降の各ステップでの作業のために一時的に濾過圧の負荷を止めることがあるが、基本的には測定が終了するまで濾過圧の負荷を継続する。ステップS56及びステップS59で濾過圧負荷の選択肢を設ける意義は、実験条件やステップS58における細胞の培養条件等によっては、予めバイオフィルター30に濾過圧を負荷するのが好ましくない場合もあり得るためである。
次のステップS61では、第1容器側フィルター33(内皮細胞)及び第2容器側フィルター32(ポドサイト)の少なくとも一方の細胞形態の変化を測定する(細胞変化測定工程)。
次のステップS62では、上記細胞形態変化の測定を継続するか否か判断する。ステップS62においてYESの場合、ステップS58に戻り細胞の培養からステップS61の細胞形態変化の測定までの一連の流れを繰り返す。一方、ステップS62においてNOの場合、本評価フローは終了となる。
以上説明したように、本実施形態の腎臓濾過機能再現装置1及び腎臓濾過機能評価装置100によれば、人工的にヒトの腎臓の濾過機能を再現でき、創薬研究における候補化合物のヒトへの毒性有無の検証に関し、動物実験に代わる方法として、大きな恩恵をもたらすことができる。また、本実施形態の腎臓濾過機能再現装置1は、従来の生体模倣システムを目的とした培養器で良く使用されているポリジメチルシロキサン(PDMS)を使用しておらず、被験物質の容器表面への収着等の問題を払拭できる。このため、スクリーニングのスループット性やユーザビリティが著しく高いという利点がある。
なお、腎臓濾過機能再現装置1及び腎臓濾過機能評価装置100は、以下に説明するような構成も採用することができる。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。
図9は、第1実施形態に係る腎臓濾過機能再現装置1及び腎臓濾過機能評価装置100の変形例を示す概略構成図である。
図9に示す腎臓濾過機能再現装置1は、第2容器20の本体の一部が、容器外側に突出した突出部22を有している。
図9に示す腎臓濾過機能再現装置1は、第2容器20の本体の一部が、容器外側に突出した突出部22を有している。
突出部22は、第2容器20の本体の側壁部の一部が、容器外側に突出したものであり、その内部空間22Aは、濾過液3で満たされている。そして、評価物通過量測定装置80は、突出部22の底部からその内部空間22Aに向かって測定光を投光する配置となっている。この構成によれば、濾過液3の蛍光輝度が、濾過液3の液面におけるメニスカスの影響を受けないことから、測定精度を高めることができる。
また、図9に示す腎臓濾過機能再現装置1は、第2容器20の本体の側壁部が黒色のブラックケース90に覆われている。ブラックケース90には、突出部22の底部以外を覆う窪み91が形成されている。この構成によれば、内部空間22Aに満たされた濾過液3の背景が黒色になるため、蛍光色とのコントラストを際立たせ、測定精度をさらに高めることができる。
図10は、第1実施形態に係る腎臓濾過機能再現装置1及び腎臓濾過機能評価装置100の他の変形例を示す概略構成図である。
図10に示す腎臓濾過機能再現装置1は、第1液体収容室10Aから液体2を導出する液体導出装置110を有している。
図10に示す腎臓濾過機能再現装置1は、第1液体収容室10Aから液体2を導出する液体導出装置110を有している。
液体導出装置110は、蓋体21及び閉止体11を貫通し、第1液体収容室10Aに挿入され、液体2を導出する第1導出管路111を有している。第1導出管路111の下端は、第1液体収容室10Aにおいて液体2の液中に配置されている。第1導出管路111の少なくとも蓋体21及び閉止体11を貫通する部分は、上述したPEEK等の硬質管路から形成されているとよい。また、第1導出管路111も、無色透明であることが好ましい。
液体導出装置110は、上述した濾過流において、糸球体(第1容器10)の毛細血管(バイオフィルター30)で濾過された血液(液体2)を生体内に戻す循環流を形成することができる。第1導出管路111は、糸球体(第1容器10)から血液を戻す輸出細動脈に該当する。この構成によれば、より生体に近い濾過流を形成することができ、創薬研究における候補化合物のヒトへの毒性有無の検証に関し、動物実験に代わる方法として、大きな恩恵をもたらすことができる。また、液体導出装置110は、従圧式灌流の際、第1液体収容室10Aの液体2の液面高さ(基底側液面高さ)の維持に有用である。液体導入装置50の送液速度よりも液体導出装置110の吸引速度が高ければ、液体2の液面高さは第1導出管路111の先端位置に維持される。これにより、液体2が閉止体11に接液することを防止でき、また、液体2の液面が下がってバイオフィルター30に達することも防止できる。このように従圧式で灌流する際には、基本的に導入管路51と第1導出管路111によって、上記のように液体2の液面高さを維持する事が望ましい。
[実施例]
以下、第1実施形態の一実施例について説明する。なお、第1実施形態は、以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することができる。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。
以下、第1実施形態の一実施例について説明する。なお、第1実施形態は、以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することができる。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。
図11は、第1実施形態の一実施例に係る腎臓濾過機能再現装置1及び腎臓濾過機能評価装置100の断面構成図である。図12は、第1実施形態の一実施例に係る腎臓濾過機能再現装置1及び腎臓濾過機能評価装置100の分解斜視図である。
図11に示す腎臓濾過機能評価装置100は、複数の腎臓濾過機能再現装置1を有している。なお、図11では、上述した圧力制御装置40のシリンジポンプ等の圧力調節機構43及び圧力センサモジュール44をブロックで図示している。
図11に示す腎臓濾過機能評価装置100は、複数の腎臓濾過機能再現装置1を有している。なお、図11では、上述した圧力制御装置40のシリンジポンプ等の圧力調節機構43及び圧力センサモジュール44をブロックで図示している。
図11に示す腎臓濾過機能評価装置100は、複数の腎臓濾過機能再現装置1の第2容器20を一体化したマルチウェルプレート120を有している。マルチウェルプレート120は、複数の第2容器20の底部を一体化した底壁部121と、底壁部121の周縁部から立ち上がった側壁部122と、を備えている。マルチウェルプレート120の底壁部121は、上述した評価物通過量測定装置80や細胞変化測定装置等を一体化した測定ユニット180に支持されている。
また、第2容器20の蓋体21も一体化されており、マルチウェルプレート120の全体を覆う蓋部材130を構成している。蓋部材130は、有頂筒状に形成され、マルチウェルプレート120の上部開口全体(側壁部122及びその内側の領域)を覆う天壁部131と、マルチウェルプレート120の側壁部122に係合する周壁部132と、を有している。蓋部材130は、図示しないが、マルチウェルプレート120にねじで着脱可能に固定されている。
図12に示すように、マルチウェルプレート120は、マトリクス状に配置された複数の第2容器20(ウェル)を有している。図12に示すマルチウェルプレート120は、4×6のマトリクス状に配置された24個のウェルを有している。なお、ウェルの数は特に限定されない。ウェルの数は、上記実施形態のように1でもよいし、本実施例のように2以上であっても構わない。なお、ウェルに挿入される第1容器10(カルチャーインサート)は、ウェルと同数であるが、例外として、ウェルが複数あっても、その一部のウェルしか使用しない(カルチャーインサートを挿入しないウェルが存在する状態で実験をする)ことはある。
図13は、第1実施形態の一実施例に係る腎臓濾過機能評価装置100の一要素(腎臓濾過機能再現装置1の1つ)を拡大した断面構成図である。図14は、図13に示す腎臓濾過機能再現装置1の分解図である。図15は、第1実施形態の一実施例に係る腎臓濾過機能再現装置1が備える閉止体11の斜視図である。図16は、図15に示す閉止体11の要部を拡大した斜視図である。
図13に示すように、腎臓濾過機能再現装置1の第1容器10は、円筒部10aと、テーパ部10bと、フランジ部10cと、補強部10dと、を有している。
図13に示すように、腎臓濾過機能再現装置1の第1容器10は、円筒部10aと、テーパ部10bと、フランジ部10cと、補強部10dと、を有している。
円筒部10aは、第1容器10の本体の下半分を構成している。円筒部10aの下端には、上述したバイオフィルター30が設けられている。円筒部10aの内径は、一定である。テーパ部10bは、円筒部10aの上端に連設され、上方に向かうに従って内径が大きくなっている。
フランジ部10cは、テーパ部10bの上端に連設され、径方向外側に延在し、第2容器20の本体の側壁頂部に載置されている。フランジ部10cには、上下方向に貫通する貫通孔10c1が形成されている。貫通孔10c1には、上述した第2導出管路61が挿入されている。補強部10dは、フランジ部10cの下面と、テーパ部10bの外周面とを接続するリブであり、周方向に間隔をあけて複数形成されている。
閉止体11は、図14に示すように、上面11aよりも下面11bが小さい逆円錐台状に形成されている。閉止体11には、上面11aから下面11bまで貫通する複数の貫通孔11d1~11d3が形成されている。貫通孔11d1には、上述した給気管路41が挿入されている。貫通孔11d2には、上述した圧力測定管路42が挿入されている。貫通孔11d3には、上述した導入管路51が挿入されている。
貫通孔11d1~11d3は、図16に示すように、千鳥状に配置されている。なお、貫通孔11d1~11d3の内径は、給気管路41、圧力測定管路42、及び導入管路51の外径と同一、もしくはやや小さいとよい。貫通孔11d1~11d3の内径が小さければ、給気管路41、圧力測定管路42、及び導入管路51の挿入によって、それぞれの内周面は弾性変形した状態で給気管路41、圧力測定管路42、及び導入管路51の外周面に密着し、シール性が高められる。なお、貫通孔11d1~11d3の内径が同一の場合でも、シール性は問題ない。閉止体11の組み付け状態では、後述する図17に示す第2定径部11c3の少なくとも一部が、第1容器10の円筒部10aまで入り込む。このため、貫通孔11d1~11d3は給気管路41、圧力測定管路42、及び導入管路51の挿入時には外側から圧迫される仕様になっている。
図14に示すように、蓋体21(蓋部材130)にも、上下方向に貫通する複数の貫通孔21a1~21a4が形成されている。貫通孔21a1には、上述した給気管路41が挿入されている。貫通孔21a2には、上述した圧力測定管路42が挿入されている。貫通孔21a3には、上述した導入管路51が挿入されている。貫通孔21a4には、上述した第2導出管路61が挿入されている。
閉止体11の周面11cは、詳細には図15に示すように、第1縮径部11c1と、第1定径部11c2と、第2定径部11c3と、第2縮径部11c4と、を有している。第1縮径部11c1は、下方に向かうに従って外径が小さくなっている。第1定径部11c2は、第1縮径部11c1の上端に連接され、第1縮径部11c1の最大径と同じ径で上方に延びている。
第2定径部11c3は、第1縮径部11c1の下端に連接され、第1縮径部11c1の最小径より小さい径で下方に延びている。つまり、第1縮径部11c1と第2定径部11c3との間には、段差が形成されている。第2縮径部11c4は、第2定径部11c3の下端に連接されている。第2縮径部11c4は、一定の比率で縮径しておらず、径方向内側に抉れるように湾曲している。このような第2縮径部11c4の形状によれば、平面視における閉止体11と第1容器10との中心点(軸)が合い易くなる。
図17は、第1実施形態の一実施例に係る第1容器10と閉止体11との係合状態を示す断面図である。
図17に示すように、閉止体11は、第1容器10のテーパ部10bの内側に係合している。これにより、平面視における閉止体11と第1容器10との中心点(軸)が合い易くなる。つまり、テーパ部10bが無い場合には、閉止体11を押し込み、第2定径部11c3と円筒部10aの内壁が接する状態にする前に、閉止体11をただ置いた状態で、第1容器10と閉止体11の軸がずれ過ぎていると、閉止体11が傾いたまま押し込むことになり、気密性を確保しにくくなるという不具合が生じる。
図17に示すように、閉止体11は、第1容器10のテーパ部10bの内側に係合している。これにより、平面視における閉止体11と第1容器10との中心点(軸)が合い易くなる。つまり、テーパ部10bが無い場合には、閉止体11を押し込み、第2定径部11c3と円筒部10aの内壁が接する状態にする前に、閉止体11をただ置いた状態で、第1容器10と閉止体11の軸がずれ過ぎていると、閉止体11が傾いたまま押し込むことになり、気密性を確保しにくくなるという不具合が生じる。
また、閉止体11の第1定径部11c2は、第1容器10よりも上方に突出している。これにより、閉止体11の上面11aが蓋体21によって押圧可能となる。蓋体21の押圧により、閉止体11の第1縮径部11c1が、テーパ部10bの内壁部に密着するため、第1容器10の密閉性をより高めることができる。
閉止体11の第2縮径部11c4は、第1容器10のテーパ部10bと円筒部10aとの間に形成された段差10abに上下方向で対向して配置されている。第2縮径部11c4が、段差10abに接触することで、閉止体11の第2定径部11c3が、第1容器10の円筒部10aまで入り込み易くなる。なお、第2縮径部11c4は、段差10abのエッジによる閉止体11への応力集中を緩和し、閉止体11の繰り返し使用を可能とする機能も有する。
図18は、第1実施形態の一実施例に係る腎臓濾過機能評価装置100において、PAN毒性試験におけるアルブミン漏出評価を行った結果を示すグラフである。
この実験では、基底側(第1容器側フィルター33)に糸球体内皮細胞、頂端側(第2容器側フィルター32)に温度感受性不死化ポドサイトの共培養を実施しながら、ポドサイトに対し細胞障害を惹起するピューロマイシンヌクレオシド(PAN)を基底側から曝露し、その後基底側より蛍光標識した高分子蛋白[ここではアルブミン(Rhodamine-Albumin:R-Alb)]を含む培地を灌流させた。
この実験では、基底側(第1容器側フィルター33)に糸球体内皮細胞、頂端側(第2容器側フィルター32)に温度感受性不死化ポドサイトの共培養を実施しながら、ポドサイトに対し細胞障害を惹起するピューロマイシンヌクレオシド(PAN)を基底側から曝露し、その後基底側より蛍光標識した高分子蛋白[ここではアルブミン(Rhodamine-Albumin:R-Alb)]を含む培地を灌流させた。
図18に示す実線は、PAN曝露後、R-Albを従圧式送液により灌流させた群(PAN+&Press群)の蛍光輝度の変化を示している。また、図18に示す点線は、PAN曝露後、R-Albを静水圧のみで灌流させた群(PAN+&Static群)の蛍光輝度の変化を示している。図18に示すように、R-Albを従圧式送液により灌流させた群は、R-Albを静水圧のみで灌流させた群よりも早期に頂端側の蛍光輝度が上昇しており、本装置において、より鋭敏に薬剤毒性を検出できる事がいえる。また、本装置を用いた毒性試験においては、経時的な評価(本実施例では、二時間間隔)が可能であり、このような経時的評価が可能である点も新規である。
図19は、第1実施形態の一実施例に係る腎臓濾過機能評価装置100において、同時従圧式送液における異なる膜抵抗を有するカルチャーインサート内圧の測定結果を示すグラフである。
図19に示すように、本装置においては、従圧式(圧力制御)により送液を行った際、各カルチャーインサート内には同じ圧力が負荷される事が分かる。各カルチャーインサートの透過膜31に互いに異なる空隙率(膜抵抗)の多孔膜(コーニング社製のC3413(点線で示す)とC3470(実線で示す))を使用した場合が、図19のグラフである。このグラフに示される通り、両者の内圧はほぼ同一波形かつ1kPaのプラトー圧を示しており、本装置において従圧式送液法が各サンプル間における同一の加圧が可能である事を示している。
図19に示すように、本装置においては、従圧式(圧力制御)により送液を行った際、各カルチャーインサート内には同じ圧力が負荷される事が分かる。各カルチャーインサートの透過膜31に互いに異なる空隙率(膜抵抗)の多孔膜(コーニング社製のC3413(点線で示す)とC3470(実線で示す))を使用した場合が、図19のグラフである。このグラフに示される通り、両者の内圧はほぼ同一波形かつ1kPaのプラトー圧を示しており、本装置において従圧式送液法が各サンプル間における同一の加圧が可能である事を示している。
図20は、第1実施形態の一実施例に係る腎臓濾過機能評価装置100において、プレートリーダーでアルブミン漏出試験を行った結果を示すグラフである。図21は、第1実施形態の一実施例に係る腎臓濾過機能評価装置100において、蛍光顕微鏡でアルブミン漏出試験を行った結果を示すグラフである。なお、図20及び図21に示す実線、一点鎖線、点線は、試験毎の結果を示している。
上述したように、本装置は、蛍光標識した高分子蛋白の漏出を評価する方法において、頂端側の培地をサンプリングする事なく、リアルタイムに実施する事が可能である。
上述したように、本装置は、蛍光標識した高分子蛋白の漏出を評価する方法において、頂端側の培地をサンプリングする事なく、リアルタイムに実施する事が可能である。
図20は、比較例として上述したPAN毒性試験において頂端側培地をサンプリングした上で、それをプレートリーダー(ARVO:パーキンエルマー社製)にて蛍光標識アルブミンの蛍光輝度測定を行いグラフ化したものである。
図21は、同毒性試験において、Keyence社製オールインワン顕微鏡内で、ウェルのインサートが映り込まない領域にROI(Region of interest)を設けて蛍光輝度測定を実施しグラフ化したものである。
両モダリティの比較において、PAN曝露+圧力負荷群が他の群に比し有意に頂端側蛍光輝度が上昇する結果となり、本装置が上記実施形態で述べた通り簡便な毒性試験評価法が可能である事を示している。
図21は、同毒性試験において、Keyence社製オールインワン顕微鏡内で、ウェルのインサートが映り込まない領域にROI(Region of interest)を設けて蛍光輝度測定を実施しグラフ化したものである。
両モダリティの比較において、PAN曝露+圧力負荷群が他の群に比し有意に頂端側蛍光輝度が上昇する結果となり、本装置が上記実施形態で述べた通り簡便な毒性試験評価法が可能である事を示している。
(第2実施形態)
次に、本発明の第2実施形態について説明する。
次に、本発明の第2実施形態について説明する。
第2実施形態は、培養容器及びそれを用いた測定方法に関するものである。以下説明する培養容器は、第1実施形態の第2容器20、ブラックケース90、マルチウェルプレート120に適用可能である。また、以下説明する測定方法は、第1実施形態の腎臓濾過機能評価方法に適用可能である。
従来、各種組織の疾患の究明、治療に有効な薬剤のスクリーニング等のために各種の細胞を培養する培養容器として液体収容部であるウェルを複数備えるマルチウェルプレートが広く使用されている(例えば、特開2018-141693号公報参照。)。
培養細胞を用いた実験における培養細胞の増殖能、細胞の機能に応じたタンパク分泌や代謝産物等の評価項目に関しては、培地中における目的の化合物を蛍光標識し、培地の蛍光輝度(ウェル内蛍光)を測定する方法が広く行われている。また、蛍光輝度を定量化する方法としては、プレートリーダー(吸光度測定)、分光光度計、蛍光観察等の方法が用いられている。
しかしながら、上記従来の技術では、ウェル内の液面のメニスカスの影響によって、測定される蛍光輝度に誤差が生じてしまう。
図22は、従来のマルチウェルプレートのウェルにFITC溶液を満たしてウェル全体を撮影した状態を示す第1の図である。図23は、従来のマルチウェルプレートのウェルにFITC溶液を満たしてウェル全体を撮影した状態を示す図である。なお、図22において、(a)は48ウェルマルチウェルプレートの1つのウェル全体を撮影した蛍光画像、(b)は24ウェルマルチウェルプレートの1つのウェル全体を撮影した蛍光画像、(c)は(a)における中心線A上の蛍光輝度を示すグラフ、(d)は(b)における中心線A上の蛍光輝度を示すグラフである。また、図23において、(a)は48ウェルマルチウェルプレートの1つのウェル全体を撮影した蛍光画像、(b)は(a)における中心線A及びB上の蛍光輝度を示すグラフである。
図22は、48個のウェルを備えるマルチウェルプレートである48ウェルマルチウェルプレート、及び、24個のウェルを備えるマルチウェルプレートである24ウェルマルチウェルプレートに、タンパク質蛍光標識試薬であるFITC(フルオレセインイソチオシアネート)溶液を満たし、底面側から1つのウェル全体を撮影して得られた蛍光画像に基づいて、前記ウェルの円形の底面の直径に相当する中心線A上の蛍光輝度をグラフ化したものである。通常のマルチウェルプレートでは、各ウェル内の液面が凹型のメニスカスとなるので、該メニスカスの影響によって、図22(c)及び(d)に示されるように、中心線A上の位置により、蛍光輝度の値が変化してしまう。
また、図23は、48ウェルマルチウェルプレートに、FITC溶液を満たし、底面側から1つのウェル全体を撮影して得られた蛍光画像に基づいて、前記ウェルの円形の底面の2本の異なる中心線A及びB上の蛍光輝度をグラフ化したものである。図23(b)に示されるように、中心線A及び中心線B上の位置によって、蛍光輝度の値が変化するだけでなく、中心線A上と中心線B上とでは蛍光輝度の値の変化パターンが相違している。
このように、従来のマルチウェルプレートを用いた測定では、メニスカスの影響により、蛍光の測定対象領域であるROI(Region of Interest)の設定位置によって、計測される蛍光輝度に誤差が生じてしまう。
そこで第2実施形態では、上記従来の技術の問題点を解決して、液体収容部内の溶液の状態を、メニスカスの影響を受けずに、正確に測定することができる培養容器及びそれを用いた測定方法を提供することを目的とする。
そのために、培養容器においては、液体収容部を有する培養容器において、前記液体収容部は、液体収容部本体と、凹部とを含み、該凹部は、前記液体収容部本体の壁面の一部を外側方向に凹入させるようにして形成された部分であって、前記液体収容部本体と連絡している。
他の培養容器においては、さらに、前記凹部は液体収容部本体の下端に隣接した位置に形成され、前記凹部の底面は液体収容部本体の底面と同一平面である。
更に他の培養容器においては、さらに、前記凹部は液体収容部本体の下端に隣接した位置に形成され、前記凹部の底面は液体収容部本体の底面より上方に位置する。
更に他の培養容器においては、さらに、前記凹部の平面視における形状は概略直角二等辺三角形である。
更に他の培養容器においては、さらに、前記凹部の側面視における形状は概略矩形であり、前記凹部の天面は液体収容部本体内に収容される溶液の気液界面よりも下方に位置する。
更に他の培養容器においては、さらに、前記液体収容部内には、前記液体収容部本体と凹部との連絡を遮断する仕切壁が挿入される。
測定方法においては、液体収容部を有する培養容器であって、前記液体収容部は、液体収容部本体と凹部とを含み、該凹部は、前記液体収容部本体の壁面の一部を外側方向に凹入させるようにして形成された部分であって、前記液体収容部本体と連絡している培養容器を用意し、前記液体収容部内に溶液を供給し、前記液体収容部内に測定対象領域を設定し、前記培養容器の上方又は下方から前記凹部内の溶液の状態を測定する。
他の測定方法においては、さらに、前記溶液の状態は蛍光輝度又は吸光度である。
更に他の測定方法においては、さらに、各液体収容部の凹部内に設定された測定対象領域にそれぞれ対応する位置に形成された複数の開口を有するマスクを前記培養容器の下面に貼付し、前記培養容器の下方から前記マスクの各開口に対応する領域の蛍光画像を撮影して前記溶液の蛍光輝度を測定する。
更に他の測定方法においては、さらに、前記培養容器の下方から前記凹部を通過する光線を照射し、前記培養容器の上方において、前記凹部を通過した光線の光量を測定して前記溶液の吸光度を測定する。
第2実施形態によれば、液体収容部内の溶液の状態を、メニスカスの影響を受けずに、正確に測定することができる。
以下、第2実施形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
図24は、第2実施形態に係るマルチウェルプレートの試作品を示す写真である。図25は、第2実施形態に係るマルチウェルプレートの斜視図である。図26は、第2実施形態に係るマルチウェルプレートのウェルの模式側断面図である。なお、図24において、(a)は斜め上方から撮影した写真、(b)は斜め下方から撮影した写真、(c)は(b)におけるC部拡大写真である。また、図25において、(a)は斜め上方から見た斜視図、(b)は斜め下方から見た斜視図真、(c)は(b)における要部拡大図である。
マルチウェルプレート210は、本実施の形態における培養容器であり、厚みのある平板状の直方体であるプレート本体211と、プレート本体211に複数形成された液体収容部としてのウェル212とを備える。
なお、本実施の形態における培養容器は、必ずしもマルチウェルプレートに限定されるものでなく、各種の細胞の培養に使用される容器であれば、いかなる種類のものであってもよく、例えば、培養皿(ディッシュ)、培養フラスコ等であってもよい。また、本実施の形態における液体収容部は、必ずしも、ウェル212のように円筒状の形状のものに限定されるものでなく、内部に液体を収容可能な形状であれば、いかなる種類の形状であってもよく、例えば、平面視における形状が多角形の筒状のものであってもよいし、側面視における形状が円錐形のものであってもよいし、全体的な形状が薄い皿状のものであってもよい。さらに、本実施の形態における液体収容部は、必ずしも、ウェル212のように複数である必要はなく、単数であってもよい。ここでは、説明の都合上、培養容器がマルチウェルプレート210であって、液体収容部が円筒状のウェル212であって、プレート本体211に複数形成されたものである場合について説明する。
上述したように、マルチウェルプレートは、複数の窪み又は穴であるウェルを備え、各種の細胞を培養する細胞培養器として市販され、広く使用されている部材であって、マイクロプレート又はマイクロタイタープレートとも称される。市販されているマルチウェルプレートは、一般に、6~384個のウェルを備え、例えば、24個のウェルを備えるマルチウェルプレートである24ウェルマルチウェルプレートと称され、48個のウェルを備えるマルチウェルプレートである48ウェルマルチウェルプレートと称されているが、ウェルの数に限定はなく、9600個のものも存在する。また、マルチウェルプレートの材質は、一般的には、透明なガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等であるが、いかなる種類のものであってもよい。
図24に示されるマルチウェルプレート210は、図25に示される図に基づいて、発明者が試作品として製作したものであり、プレート本体211が不透明な樹脂から成り、24個のウェル212を備えるものであるが、プレート本体211は透明な材質から成るものであってもよいし、ウェル212の数は、24個に限定されるものではない。
なお、本実施の形態において、マルチウェルプレート210の各部の構成及び動作を説明するために使用される上、下、左、右、前、後等の方向を示す表現は、絶対的なものでなく相対的なものであり、マルチウェルプレート210の各部が図に示される姿勢である場合に適切であるが、その姿勢が変化した場合には姿勢の変化に応じて変更して解釈されるべきものである。
プレート本体211は、平坦な上面211aと、上面211aに平行な平坦な下面211bとを有し、各ウェル212は、上面211aから下面211bまで、プレート本体211の厚さ方向に延在する円柱乃至円筒状の貫通孔である液体収容部本体としてのウェル本体212cを有する。ウェル本体212cの天面212a(上端面)は上面211aにおいて開口しているが、その底面212b(下端面)は下面211bに取り付けられた平板状の透明な底板213によって閉止されている。すなわち、各ウェル212のウェル本体212cは、図26に示されるように、平底の円柱乃至円筒状の凹部である。そして、各ウェル212は、細胞培養等に使用される培養液又は培地のような溶液215をウェル本体212cの内部に収容し、下方に位置するように対物レンズ221が配設された図示されない顕微鏡によって、底板213を通して、溶液215内の細胞を観察したり、溶液215中の蛍光標識された化合物の蛍光輝度等を測定することができる。なお、蛍光輝度を測定する場合、前記顕微鏡として蛍光顕微鏡を使用する。
本実施の形態においては、各ウェル212に測定部としての凹部214が形成されている。凹部214は、ウェル本体212cの下端に隣接した円筒状の壁面、すなわち、側面の一部を外側方向、具体的には、半径方向外側に凹入させるようにして形成された部分であって、ウェル本体212cと連絡している。したがって、ウェル本体212c内に収容された溶液215は、凹部214内に流入する。平面視における凹部214の形状は、図24(c)及び図25(c)に示されるように、概略直角二等辺三角形のような形状であって、斜辺に相当する部分が前記円筒状の側面に対応する円弧状となっている。凹部214の平面視における形状が、このようになっているので、多数のウェル212を所定の面積のプレート本体211に形成する場合、スペース効率が向上する。なお、平面視における凹部214の形状は、これに限定されるものでなく、半円状であってもよいし、四角形状であってもよいし、適宜設定することができる。また、各ウェル212に形成される凹部214の数は、図24(c)及び図25(c)に示される例のように単数である必要はなく、複数であってもよい。さらに、凹部214は、ウェル本体212cの側面の一部に形成されたものである必要はなく、前記側面の全周に亘って形成されたものであってもよい。
また、側面視における凹部214の形状は、図26に示されるように矩形であり、その底面214bはウェル212(ウェル本体212c)の底面212bと同一平面である。凹部214の天面214aは、底面214bと平行な平面であって、ウェル本体212c内に収容された溶液215の上面である気液界面215a(液面)よりも下方に位置するように設定されている。これにより、凹部214内は溶液215によって満たされた状態となり、凹部214内の溶液215の上面は、凹部214の天面214aに一致し、平坦であってメニスカスが生じることがない。なお、底面214bから天面214aまでの距離、すなわち、凹部214の高さは、図24に示される試作品においては、3.5〔mm〕であるが、気液界面215aまでの距離より短ければ、いかなる値であってもよく、適宜調整することができる。
このように、凹部214内の溶液215はメニスカスの影響を受けることがないので、溶液215中における目的の化合物を蛍光標識して蛍光輝度を測定する場合、図24(c)に示されるように、平面視における凹部214内の位置に蛍光の測定対象領域であるROI216を設定することによって、蛍光輝度を誤差なく正確に測定することが可能となる。なお、溶液215をウェル212へ注入する際、凹部214での気泡発生を抑制する事を目的とした親水化処理(例えば、酸素又はアルゴンプラズマ処理、シランカップリング処理等)を、少なくとも凹部214の壁面に施す場合もある。
次に、ウェル212内にカルチャーインサートを挿入した場合について説明する。
図27は、第2実施形態に係るカルチャーインサートを挿入したウェルの蛍光輝度を測定する状態を示す図である。図28は、第2実施形態に係るカルチャーインサートを挿入したウェルの蛍光輝度の測定結果を示す図である。なお、図27において、(a)はカルチャーインサートを挿入したウェルの模式側断面図、(b)はカルチャーインサートを挿入したウェル全体を撮影した蛍光画像である。また、図28において、(a)は図27(b)におけるD部分の蛍光画像、(b)は図27(b)におけるE部分の蛍光画像、(c)は(a)における直線F上の蛍光輝度を示すグラフ、(d)は(b)における直線G上の蛍光輝度を示すグラフである。
本実施の形態におけるマルチウェルプレート210は、図26に示されるように、各ウェル212内に細胞等を含む培養液又は培地のような溶液215だけを収容した状態で使用することもできるが、図27(a)に示されるように、溶液215に加えて、内部に細胞等の組織を収容したカルチャーインサート217を挿入した状態で使用することもできる。カルチャーインサート217の材質は、透明なガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等であるが、いかなる種類のものであってもよい。なお、カルチャーインサート217のような挿入部材をウェル212のような空洞内に挿入して使用する細胞培養装置は、既に知られている(例えば、特開2018-042556号公報参照。)。
図27(a)に示されるウェル212においては、カルチャーインサート217及びウェル212には、ともに、溶液215としてFITC溶液が充填されている。そして、プレート本体211の下面211bの下方に配設された蛍光顕微鏡の対物レンズ221によって、ウェル212の底面212b側からカルチャーインサート217が挿入されたウェル212全体を撮影すると、図27(b)に示されるような蛍光画像を得ることができた。
図28(a)は、図27(b)において矩形の枠で囲まれたD部分の蛍光画像であり、図28(b)は、図27(b)において矩形の枠で囲まれたE部分の蛍光画像である。前記D部分は、図27(a)に示されるウェル212の底面212bにおけるカルチャーインサート217の円筒状の側面とウェル本体212cの円筒状の側面との間の部分にほぼ対応する領域である。前記E部分は、図27(a)に示されるウェル212の底面212bにおける凹部214にほぼ対応する領域である。なお、図28(b)に示される点線の円は、凹部214内に設定されたROI216を示している。
図28(c)は、D部分の蛍光画像である図28(a)に示される蛍光画像のほぼ中心を通る直線F上の蛍光輝度をグラフ化したものである。前記D部分は、カルチャーインサート217の円筒状の側面とウェル本体212cの円筒状の側面との間の部分にほぼ対応する領域であるので、溶液215の気液界面215aにおけるメニスカスの影響を受けて、蛍光輝度が不均一となっていることが、図28(c)から分かる。
図28(d)は、E部分の蛍光画像である図28(b)に示される蛍光画像のほぼ中心を通る直線G上の蛍光輝度をグラフ化したものである。なお、直線Gは、ROI216の中心をも通るように設定されている。前記E部分は、凹部214にほぼ対応する領域であるので、溶液215の気液界面215aにおけるメニスカスの影響を受けず、ほぼ全範囲に亘って蛍光輝度が均一となっていることが、図28(d)から分かる。特に、ROI216に対応する範囲では、蛍光輝度が実質的に均一である、と言える。
このように、ウェル212の底面212bにおける溶液215の気液界面215aに対応する領域を下方から撮影した蛍光画像の場合は、メニスカスの影響を受けるので、蛍光輝度が不均一となる。そのため、溶液215の蛍光標識評価物質濃度が同じであっても、カルチャーインサート217の挿入の仕方や、気液界面215aの高さのような因子によって、図28(c)に示されるように、蛍光輝度のグラフの波形が変わり得ることが予想される。これに対し、ウェル212の底面212bにおける凹部214に対応する領域を下方から撮影した蛍光画像の場合は、メニスカスの影響を受けないので、蛍光輝度が均一となることが分かる。したがって、溶液215の蛍光標識評価物質濃度が同じであれば、前記因子によっても、図28(d)に示されるように、蛍光輝度のグラフの波形に変化がないと予想される。
以上のように、平面視における凹部214内に蛍光の測定対象領域であるROI216を設定し、ROI216での蛍光輝度を測定することによって、各ウェル212内の溶液215の蛍光輝度を、メニスカスの影響を受けずに、常に高精度で測定することができる。
次に、マルチウェルプレート210のすべてのウェル212において、ROI216の設定位置を同様にする手段について説明する。
図29は、第2実施形態に係るマルチウェルプレートの底板に貼付するマスクを示す図である。図30は、第2実施形態に係るマルチウェルプレートの底板にマスクを貼付した状態で撮影した凹部の蛍光画像である。
図29に示すマスク222は、薄板状又はフィルム状のマスクであり、マルチウェルプレート210の透明な底板213の下面に貼付される。マスク222の材質は、不透明なガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等であるが、遮光性を有するものであれば、いかなる種類のものであってもよい。また、マスク222の全体的な寸法及び形状は、対応するマルチウェルプレート210のプレート本体211の下面211bと同様の寸法及び形状である。
そして、マスク222には、マルチウェルプレート210のすべてのウェル212のそれぞれに対応するように、複数の開口223が形成されている。各開口223は、ウェル本体212cのほぼ全体に対応する主開口223aと、凹部214内のROI216に対応する位置に形成された撮影箇所開口223bとを含んでいる。なお、光透過孔である開口223は、マスク222を板厚方向に貫通する素通しの貫通孔であってもよいし、透明フィルム等の透光性部材が貼られたものであってもよい。また、各撮影箇所開口223bは、望ましくは、直径が約1〔mm〕の円形の開口であり、凹部214の中心位置に対応するように形成される。
図30は、マスク222をマルチウェルプレート210の透明な底板213の下面に貼付し、各ウェル212に蛍光性物質を含有する溶液215を充填した状態で、1つのウェル212の凹部214に対応する領域を下方から撮影した蛍光画像である。図30において、Hで示される十文字状の点線は位置決め用のグリッドであり、該グリッドHにおいては、2本の点線の交点が画像の中心であることを示している。該画像の中心には、撮影箇所開口223bの像が存在することが分かる。
そこで、図30に示されるように、撮影箇所開口223bが画像の中心となるように、あらかじめ、蛍光顕微鏡の対物レンズ221とマルチウェルプレート210との位置関係を調整し、各ウェル212におけるROI216の箇所を蛍光顕微鏡の駆動用ソフトウェアに記憶させておくことが望ましい。これにより、各ウェル212におけるROI216の箇所を自動的に撮影することが可能となるので、実験毎に手動でROI216の箇所を位置決めする、という手順を省略することができる。
次に、溶液215として蛍光標識評価物質を含有する培地を用いた段階希釈溶液の蛍光輝度測定・検量線の検証結果について説明する。
図31は、第2実施形態に係るFITCイヌリンを用いた段階希釈溶液の蛍光輝度測定・検量線の検証結果を示す図である。図32は、第2実施形態に係るRITCデキストランを用いた段階希釈溶液の蛍光輝度測定・検量線の検証結果を示す図である。なお、図31及び図32において、(a)はウェルの凹部を撮影した蛍光画像、(b)は検量線を示すグラフである。
発明者は、試作品として製作した図24に示されるようなマルチウェルプレート210を使用して、ウェル212内に収容された溶液215の蛍光輝度を測定する実験を行った。該実験においては、蛍光輝度を測定するための顕微鏡として、株式会社キーエンスが販売するオールインワン蛍光顕微鏡(Keyence BZX-700)を使用した。そして、実際の蛍光輝度測定は、以下の(1)~(3)の手順で行われた。
(1)位置決め:実験を行う前に、底板213の下面にマスク222が貼付されたマルチウェルプレート210のウェル212に蛍光性の溶液215を満たす。そして、各ウェル212の凹部214の中心(直径が約1〔mm〕の円形の開口であるマスク222の撮影箇所開口223b)をグリッドHの点線の交点に合わせるように調整し、その位置をソフトウェアに記憶させる(Keyence BZX-700では、「多点」機能がそれに該当する。また、設定を保存することによって、次回以降同じデバイスを用いれば、記憶した位置を順番に、設定された時間間隔で撮影していくことができる「タイムラプス」機能も含んでいる。)。
(2)蛍光標識評価物質を含有する溶液215を用いた実験時の操作:マルチウェルプレート210のウェル212内に挿入されたカルチャーインサート217内に蛍光標識評価物質を含有する溶液215を充填する。そして、マルチウェルプレート210をKeyence BZX-700のステージにセットし、(1)で定めた各ウェル212における撮影箇所を所定の時間間隔で撮影する。
(3)実験終了後の画像解析(蛍光輝度測定):撮影した蛍光画像に対して、画像処理ソフトウェアであるImage J Fiji(NIH)を用いて、蛍光輝度測定を行う。具体的には、Image J Fiji(NIH)が備える「Oval」機能を用いて、画像中央に円を描き、該円を、Image J Fiji(NIH)が備える「ROI manager 」機能を用いて、すべての画像に共通する蛍光輝度評価領域としてのROI216として保存し、すべての画像において、ROI216における蛍光輝度を、Image J Fiji(NIH)が備える「Measure 」機能を用いて、定量する。そして、「Measure 」機能で得られた各値の中で、平均値をピックアップし、該平均値でもって統計処理を行い、有意差を判定する。
(2)蛍光標識評価物質を含有する溶液215を用いた実験時の操作:マルチウェルプレート210のウェル212内に挿入されたカルチャーインサート217内に蛍光標識評価物質を含有する溶液215を充填する。そして、マルチウェルプレート210をKeyence BZX-700のステージにセットし、(1)で定めた各ウェル212における撮影箇所を所定の時間間隔で撮影する。
(3)実験終了後の画像解析(蛍光輝度測定):撮影した蛍光画像に対して、画像処理ソフトウェアであるImage J Fiji(NIH)を用いて、蛍光輝度測定を行う。具体的には、Image J Fiji(NIH)が備える「Oval」機能を用いて、画像中央に円を描き、該円を、Image J Fiji(NIH)が備える「ROI manager 」機能を用いて、すべての画像に共通する蛍光輝度評価領域としてのROI216として保存し、すべての画像において、ROI216における蛍光輝度を、Image J Fiji(NIH)が備える「Measure 」機能を用いて、定量する。そして、「Measure 」機能で得られた各値の中で、平均値をピックアップし、該平均値でもって統計処理を行い、有意差を判定する。
図31及び図32には、このようにして行われた実験によって得られた蛍光標識評価物質を含有する溶液215を用いた段階希釈溶液の蛍光輝度測定・検量線の検証結果が示されている。図31は、FITCイヌリン(分子量5.5〔kDa〕:低分子評価物質)を用いた場合の段階希釈溶液の蛍光輝度測定・検量線の検証結果を示している。図32は、RITCデキストラン(分子量70〔kDa〕:高分子評価物質)を用いた場合の段階希釈溶液の蛍光輝度測定・検量線の検証結果を示している。
図31(b)及び図32(b)に示されるように、ウェル212の凹部214の中心をROI216として蛍光輝度を測定することによって、FITCイヌリンを用いた場合も、RITCデキストランを用いた場合も、決定係数R2の値が0.99以上と、高い信頼性を示す結果となった。
これにより、本実施の形態におけるマルチウェルプレート210が、蛍光標識評価物質の蛍光輝度測定において、簡便でありながら、高い精度を提供することができることが示された。
次に、マルチウェルプレート210を使用して吸光度を測定する方法について説明する。
図33は、第2実施形態に係るマルチウェルプレートを使用して吸光度を測定する場合のウェルの模式側断面図である。
本実施の形態におけるマルチウェルプレート210は、蛍光輝度の測定のみならず、吸光度の測定にも使用することができる。例えば、図に示されるように、プレート本体211の上面211aの上方に吸光度計224を配設し、プレート本体211の下面211bの下方に配設された図示されない光源から照射された矢印で示される光線Jであってウェル212内の溶液215を通過した光線Jの光量を吸光度計224によって測定することにより、溶液215の吸光度を測定することができる。
この場合、プレート本体211は透明な材質から成るものであるとする。また、光線Jは、溶液215の上面である気液界面215aを通過せず、凹部214を通過するものとする。なお、光線Jは、図24(c)、7(b)等に示されるような凹部214におけるROI216を通過することが望ましい。これにより、溶液215の気液界面215aにおけるメニスカスの影響を受けることなく、溶液215の吸光度を高精度で測定することができる。
このように、本実施の形態におけるマルチウェルプレート210は、ウェル212を有するものであって、ウェル212は、ウェル本体212cと凹部214とを含み、凹部214は、ウェル本体212cの側面の一部を外側方向に凹入させるようにして形成された部分であって、ウェル本体212cと連絡している。
また、本実施の形態における測定方法においては、ウェル212を有するマルチウェルプレート210であって、ウェル212は、ウェル本体212cと凹部214とを含み、凹部214は、ウェル本体212cの壁面の一部を外側方向に凹入させるようにして形成された部分であって、ウェル本体212cと連絡しているマルチウェルプレート210を用意し、ウェル212内に溶液215を供給し、凹部214内にROI216を設定し、マルチウェルプレート210の上方又は下方から凹部214内の溶液215の状態を測定する。
これにより、ウェル212内の溶液215の状態を、気液界面215aのメニスカスの影響を受けずに、正確に測定することができる。
また、凹部214はウェル本体212cの下端に隣接した位置に形成され、凹部214の底面214bはウェル本体212cの底面212bと同一平面である。さらに、凹部214の平面視における形状は概略直角二等辺三角形である。さらに、凹部214の側面視における形状は概略矩形であり、凹部214の天面214aはウェル本体212c内に収容される溶液215の気液界面215aよりも下方に位置する。さらに、溶液215の状態は蛍光輝度又は吸光度である。さらに、各ウェル212の凹部214内に設定されたROI216にそれぞれ対応する位置に形成された複数の撮影箇所開口223bを有するマスク222をプレート本体211の下面211bに貼付し、マルチウェルプレート210の下方からマスク222の各撮影箇所開口223bに対応する領域の蛍光画像を撮影して溶液215の蛍光輝度を測定する。さらに、マルチウェルプレート210の下方から凹部214を通過する光線Jを照射し、マルチウェルプレート210の上方において、凹部214を通過した光線Jの光量を測定して溶液215の吸光度を測定する。
次に、第2実施形態の第1変形例について説明する。なお、上述した本実施の形態と同じ構造を有するものについては、同じ符号を付与することによってその説明を省略する。また、上述した本実施の形態と同じ動作及び同じ効果についても、その説明を省略する。
図34は、第2実施形態の第1変形例におけるマルチウェルプレートのウェルの模式側断面図である。
第2実施形態の第1変形例において、ウェル212に形成された凹部214は、上述した本実施の形態に係る凹部214と同様に、ウェル本体212cの円筒状の側面の一部を半径方向外側に凹入させるようにして形成された部分であり、側面視における形状が矩形であり、その天面214aがウェル212内に収容された溶液215の気液界面215aよりも下方に位置するように設定されている。
しかしながら、上述した本実施の形態に係る凹部214では、その底面214bがウェル212の底面212bと同一平面であるのに対し、第2実施形態の第1変形例における凹部214では、図に示されるように、その底面214bがウェル212の底面212bよりも上方に位置するように設定されている。また、第2実施形態の第1変形例において、プレート本体211は透明な材質から成るものであるとする。
なお、その他の点の構成及び動作については、上述した本実施の形態と同様であるので、その説明を省略する。
このように、第2実施形態の第1変形例においては、凹部214はウェル本体212cの下端に隣接した位置に形成され、凹部214の底面214bはウェル本体212cの底面212bより上方に位置する。
次に、第2実施形態の第2変形例について説明する。なお、上述した本実施の形態及び第2実施形態の第1変形例と同じ構造を有するものについては、同じ符号を付与することによってその説明を省略する。また、上述した本実施の形態及び第2実施形態の第1変形例と同じ動作及び同じ効果についても、その説明を省略する。
図35は、第2実施形態の第2変形例におけるマルチウェルプレートのウェルの模式側断面図である。
第2実施形態の第2変形例において、ウェル212に形成された凹部214は、上述した本実施の形態に係る凹部214と同様に、ウェル本体212cの下端に隣接した円筒状の側面の一部を半径方向外側に凹入させるようにして形成された部分であり、側面視における形状が矩形であり、その底面214bはウェル212の底面212bと同一平面であり、その天面214aがウェル212内に収容された溶液215の気液界面215aよりも下方に位置するように設定されている。
しかしながら、第2実施形態の第2変形例におけるマルチウェルプレート210では、図に示されるように、各ウェル212の内部に、凹部214とウェル本体212cとの連絡を遮断する仕切壁225が、取り外し可能に取り付けられている。仕切壁225は、上下方向から観た形状が円弧状であって、上下方向に延在する曲板状の板材であり、ウェル本体212cの円筒状の側面に沿って上下方向にスライド可能となっている。そして、仕切壁225は、上方からウェル本体212cの側面に沿うようにウェル212内に挿入され、その下端がウェル212の底面212bを閉止する底板213に当接すると、凹部214とウェル本体212cとの連絡を遮断するようになっている。
したがって、例えば、ウェル212内に収容された培地である溶液215中に細胞218を播種するような場合に、播種された細胞218が凹部214内に入り込んでしまうことを防止することができる。
なお、その他の点の構成及び動作については、上述した本実施の形態と同様であるので、その説明を省略する。
このように、第2実施形態の第2変形例においては、ウェル212内には、ウェル本体212cと凹部214との連絡を遮断する仕切壁225が挿入される。
上述した第2実施形態の一部又は全部は、以下の付記のようにも記載され得るが、以下には限られない。
(付記1)
液体収容部を有する培養容器において、
前記液体収容部は、液体収容部本体と、凹部とを含み、
該凹部は、前記液体収容部本体の壁面の一部を外側方向に凹入させるようにして形成された部分であって、前記液体収容部本体と連絡していることを特徴とする培養容器。
液体収容部を有する培養容器において、
前記液体収容部は、液体収容部本体と、凹部とを含み、
該凹部は、前記液体収容部本体の壁面の一部を外側方向に凹入させるようにして形成された部分であって、前記液体収容部本体と連絡していることを特徴とする培養容器。
(付記2)
前記凹部は液体収容部本体の下端に隣接した位置に形成され、前記凹部の底面は液体収容部本体の底面と同一平面である付記1に記載の培養容器。
前記凹部は液体収容部本体の下端に隣接した位置に形成され、前記凹部の底面は液体収容部本体の底面と同一平面である付記1に記載の培養容器。
(付記3)
前記凹部は液体収容部本体の下端に隣接した位置に形成され、前記凹部の底面は液体収容部本体の底面より上方に位置する付記1に記載の培養容器。
前記凹部は液体収容部本体の下端に隣接した位置に形成され、前記凹部の底面は液体収容部本体の底面より上方に位置する付記1に記載の培養容器。
(付記4)
前記凹部の平面視における形状は概略直角二等辺三角形である付記1~3のいずれか1項に記載の培養容器。
前記凹部の平面視における形状は概略直角二等辺三角形である付記1~3のいずれか1項に記載の培養容器。
(付記5)
前記凹部の側面視における形状は概略矩形であり、前記凹部の天面は液体収容部本体内に収容される溶液の気液界面よりも下方に位置する付記1~4のいずれか1項に記載の培養容器。
前記凹部の側面視における形状は概略矩形であり、前記凹部の天面は液体収容部本体内に収容される溶液の気液界面よりも下方に位置する付記1~4のいずれか1項に記載の培養容器。
(付記6)
前記液体収容部内には、前記液体収容部本体と凹部との連絡を遮断する仕切壁が挿入される付記1~5のいずれか1項に記載の培養容器。
前記液体収容部内には、前記液体収容部本体と凹部との連絡を遮断する仕切壁が挿入される付記1~5のいずれか1項に記載の培養容器。
(付記7)
液体収容部を有する培養容器であって、前記液体収容部は、液体収容部本体と凹部とを含み、該凹部は、前記液体収容部本体の壁面の一部を外側方向に凹入させるようにして形成された部分であって、前記液体収容部本体と連絡している培養容器を用意し、
前記液体収容部内に溶液を供給し、
前記液体収容部内に測定対象領域を設定し、前記培養容器の上方又は下方から前記凹部内の溶液の状態を測定することを特徴とする測定方法。
液体収容部を有する培養容器であって、前記液体収容部は、液体収容部本体と凹部とを含み、該凹部は、前記液体収容部本体の壁面の一部を外側方向に凹入させるようにして形成された部分であって、前記液体収容部本体と連絡している培養容器を用意し、
前記液体収容部内に溶液を供給し、
前記液体収容部内に測定対象領域を設定し、前記培養容器の上方又は下方から前記凹部内の溶液の状態を測定することを特徴とする測定方法。
(付記8)
前記溶液の状態は蛍光輝度又は吸光度である付記7に記載の測定方法。
前記溶液の状態は蛍光輝度又は吸光度である付記7に記載の測定方法。
(付記9)
各液体収容部の凹部内に設定された測定対象領域にそれぞれ対応する位置に形成された複数の開口を有するマスクを前記培養容器の下面に貼付し、前記培養容器の下方から前記マスクの各開口に対応する領域の蛍光画像を撮影して前記溶液の蛍光輝度を測定する付記7に記載の測定方法。
各液体収容部の凹部内に設定された測定対象領域にそれぞれ対応する位置に形成された複数の開口を有するマスクを前記培養容器の下面に貼付し、前記培養容器の下方から前記マスクの各開口に対応する領域の蛍光画像を撮影して前記溶液の蛍光輝度を測定する付記7に記載の測定方法。
(付記10)
前記培養容器の下方から前記凹部を通過する光線を照射し、前記培養容器の上方において、前記凹部を通過した光線の光量を測定して前記溶液の吸光度を測定する付記7に記載の測定方法。
前記培養容器の下方から前記凹部を通過する光線を照射し、前記培養容器の上方において、前記凹部を通過した光線の光量を測定して前記溶液の吸光度を測定する付記7に記載の測定方法。
(第3実施形態)
次に、本発明の第3実施形態について説明する。
次に、本発明の第3実施形態について説明する。
第3実施形態は、マルチウェルプレートの各ウェル(第2容器)とカルチャーインサート(第1容器)との隙間に挿入されるインサータ(挿入部材)に関するものである。
図36は、第3実施形態に係るインサータ420を配置した腎臓濾過機能評価装置300の断面構成図である。図37は、図36に示す腎臓濾過機能評価装置300が備えるマルチウェルプレート390の平面図である。図38は、図37に示すマルチウェルプレート390の分解斜視図である。図39は、第3実施形態に係るインサータ420の下面側斜視図である。
図36に示すように、第3実施形態では、カルチャーインサート310(第1容器)の側壁とウェル320(第2容器)の側壁との隙間に挿入される蛍光輝度測定用のインサータ420(挿入部材)を備えている。
図36に示すように、第3実施形態では、カルチャーインサート310(第1容器)の側壁とウェル320(第2容器)の側壁との隙間に挿入される蛍光輝度測定用のインサータ420(挿入部材)を備えている。
なお、図36に示すインサータ420が配置される腎臓濾過機能評価装置300は、上述した第1実施形態と同様の構成を有しており、腎臓濾過機能再現装置301と、腎臓濾過機能再現装置301のカルチャーインサート310に導入される液体302に、バイオフィルター330の濾過機能を評価する評価物質及びバイオフィルター330に対する毒性の有無を検証する図示しない被験物質の少なくとも一方を添加する物質添加装置(図36において符号略)と、バイオフィルター330を通過した評価物質の通過量を測定する評価物通過量測定装置380と、を有している。
カルチャーインサート310は、上述した第1実施形態の図13に示す第1容器10と同様の構成を有している。具体的に、カルチャーインサート310は、底部開口に透過膜331、第2容器側フィルター332、及び第1容器側フィルター333を含むバイオフィルター330を有している。また、カルチャーインサート310の上部開口は、閉止体311によって閉塞されている。閉止体311には、蓋体321が載せられている。
蓋体321には、給気管路341、圧力測定管路342、導入管路351、及び第2導出管路361が貫通して配置されている。給気管路341、圧力測定管路342、及び導入管路351は、蓋体321を貫通し、カルチャーインサート310の内部に挿入されている。カルチャーインサート310の内部には、液体302が貯留されている。
マルチウェルプレート390は、図37に示すように、複数のウェル320を有している。第3実施形態のウェル320は、マルチウェルプレート390に二列で設けられている。ウェル320の各列の近傍には、濾過液排出槽392が設けられている。濾過液排出槽392は、ウェル320の列と平行に延びており、隣接する各ウェル320と連通流路393を介して連通している。連通流路393は、図38に示すように、ウェル320と濾過液排出槽392とを隔てるマルチウェルプレート390の隔壁を一部除去することで形成されている。これにより、ウェル320に溜まった濾過液303が、濾過液排出槽392に排出される。
図36に示すように、第3実施形態のウェル320の底部401は、可視光に対する透光性を有するカバーガラスによって形成されている。なお、ウェル320の底部401は、可視光に対する透光性を有すれば、透明な樹脂板等であってもよい。マルチウェルプレート390の底部には、Oリング402を介してカバーガラス(底部401)を配置する窪みが形成されている。なお、底部401を除くマルチウェルプレート390は、可視光に対する透光性を有してもよいし、蛍光色とのコントラストを際立たせるために、可視光に対する非透光性を有してもよい。
マルチウェルプレート390の底部には、ウェル320の底部401における液密性を保持するための固定板410が取り付けられている。固定板410には、図38に示すように、ウェル320の底部401を露出させる窓部411と、窓部411の周縁部に設けられた環状突起部412と、固定板410をマルチウェルプレート390に取り付ける図示しないネジが配置される固定孔413と、が設けられている。
窓部411は、Oリング402の内径と同程度の大きさに開口している。環状突起部412は、図36に示すように、マルチウェルプレート390の底部に設けられた窪みに挿入され、ウェル320の底部401の周縁部を押圧してOリング402を押し潰し、ウェル320の底部401における液密性を保持する。
カルチャーインサート310の側壁とウェル320の側壁との隙間には、蛍光輝度測定用のインサータ420が挿入されている。蛍光輝度測定用のインサータ420は、カルチャーインサート310の側壁とウェル320の側壁との隙間のうち、ウェル320の底部401から一定の高さの位置に挿入されている。腎臓濾過機能評価を行う系によってウェル320に溜まる濾過液303の量が変わることから、インサータ420の高さは、蛍光輝度測定が行いやすいように腎臓濾過機能評価を行う系毎に適した高さのインサータ420を使用するとよい。
インサータ420は、カルチャーインサート310を内側に挿入可能なリング状に形成されている。本実施形態のインサータ420は、カルチャーインサート310の側壁の外周に隙間なく装着することができる。なお、インサータ420とカルチャーインサート310の側壁の外周の隙間は、インサータ420を装着しやすく、濾過液303が満たされる隙間があってもよい。インサータ420は、互いに平行な上面421及び下面422を有している。なお、インサータ420の上面421は、下面422と平行な平面に限定されないが、インサータ420の下面422の一部または全ては、少なくともウェル320の底部401に対して平行かつ平面に形成されている。
図39に示すように、本実施形態のインサータ420の下面422には、溝部423が形成されている。溝部423の底面を形成する平面部も、ウェル320の底部401に対して平行かつ平面となっている。この溝部423の平面部は、図36に示す評価物通過量測定装置380の観察領域となる。溝部423を除くインサータ420の下面422は、ウェル320の底部401に接触している。一方、溝部423は、ウェル320の底部401から一定の距離をあけており、その隙間が濾過液303で満たされている。なお、インサータ420の溝部423とウェル320の底部401が平行になっていれば、インサータ420の下面422はウェル320の底部401に接触していなくてもよい。また、インサータ420の溝部423に気泡が発生し、蛍光輝度計測に支障を来す事を抑制する事を目的とした親水化処理(酸素プラズマやアルゴンプラズマ処理、シランカップリング処理等)を、少なくとも溝部423に施してもよい。
図36に示すように、ウェル320の側壁の内壁には、インサータ420に嵌合する嵌合突起391が形成されている。嵌合突起391は、ウェル320の内壁から内側に突出している。この嵌合突起391は、図37に示すように、ウェル320の平面視円形の壁面において、周方向に間隔をあけて複数(本実施形態では90°間隔で4つ)設けられている。
対して、インサータ420の嵌合突起391と接触する4つの接触面424は、図39に示すように、平面状に形成されている。接触面424は、インサータ420の周面を部分的に平面化したものである。嵌合突起391とインサータ420の接触面424とを平面で接触させることで、インサータ420の回り止めが可能となる。つまり、評価物通過量測定装置380に対する溝部423(観察領域)の位置ずれを防止できる。なお、溝部423(観察領域)の位置ずれを防止できれば、ウェル320とインサータ420の嵌合場所の形や組み合わせは、特に限定されず、例えば、平面状と平面状や、突起状と突起状や、凹部と凸部によって嵌合してもよい。
上記構成のインサータ420は、樹脂製やガラス製でも良いが、理想的には化学的に安定で、高温滅菌に耐性を有する素材(ポリカーボネート、PEEK、ポリアセタール等)が好ましい。また、インサータ420の色は、透明でも、有色でも良いが、蛍光観察を目的とした場合には黒が望ましい。また、インサータ420の素材の比重は、水に浮かないように、なるべく高比重である事が望ましい。この観点からは、インサータ420の全体がステンレス鋼のような金属、または、樹脂の中に「おもし」として金属を包含しているような構造でも良い。そうすることで、溝部423と底部401との間の距離が離れずに済み、光路長の変化を防止できる。
このような第3実施形態によれば、図36に示すように、ウェル320(第2容器)の底部401が、可視光に対する透光性を有し、カルチャーインサート310(第1容器)の側壁とウェル320の側壁との隙間に挿入され、ウェル320の底部401と対向する下面422の少なくとも一部に平面部(溝部423)が形成された蛍光輝度測定用のインサータ420(挿入部材)を備える。したがって、第2実施形態のようにウェル212の壁面に凹部214を形成せずに、カルチャーインサート310とウェル320との隙間に液面のメニスカスの影響を受けない観察領域(溝部423)を形成できる。
第3実施形態の観察領域(溝部423)は、第2実施形態の凹部214のようにデッドエンド(袋小路)になっておらず、また、カルチャーインサート310の底部開口(漏出部)に近いため、カルチャーインサート310の底部開口から漏出した評価物質が、観察領域に速やかに到達する。したがって、評価物通過量測定装置380において、カルチャーインサート310からの評価物質の漏出度の上昇を検出するタイミングが早まる。また、第3実施形態においては、インサータ420の挿入によりウェル320内の体積が縮小されるため、評価物質の拡散スペースが、第2実施形態に比べて縮小されている。このため、評価物質の拡散が抑制され、評価物通過量測定装置380の検出感度の上昇をもたらす。さらに、インサータ420の着脱が可能であるため、観察領域の位置の変更等も容易である。
また、本実施形態においては、蛍光輝度測定用の平面部は、インサータ420の下面422に設けられた溝部423に形成され、溝部423を除くインサータ420の下面422は、ウェル320の底部401に接触している。この構成によれば、ウェル320の底部401から一定の距離で溝部423(観測領域)を位置決めでき、各ウェル320において同条件下で観察を行える。また、溝部423は、ウェル320の底部401から離間しているため、その隙間に評価物質が到達し易くなる。
また、本実施形態においては、インサータ420は、カルチャーインサート310の側壁に装着可能なリング状に形成されている。この構成によれば、インサータ420の内側にカルチャーインサート310を挿入できるため、カルチャーインサート310の位置決めが容易になる。
また、本実施形態においては、ウェル320の側壁には、インサータ420を嵌合する嵌合突起391が形成されている。この構成によれば、インサータ420及びカルチャーインサート310の振動や位置ずれ等を防止できる。
また、本実施形態においては、インサータ420の嵌合突起391と接触する接触面424は、平面状に形成されている。この構成によれば、インサータ420の回り止めが可能となり、溝部423(観察領域)の周方向の位置ずれを防止できる。
次に、第3実施形態の第1変形例について説明する。なお、上述した本実施形態と同じ構造を有するものについては、同じ符号を付与することによってその説明を省略する。また、上述した本実施形態と同じ動作及び同じ効果についても、その説明を省略する。
図40は、第3実施形態の第1変形例に係るインサータ420を配置した腎臓濾過機能評価装置300の断面構成図である。図41は、第3実施形態の第1変形例に係るインサータ420の上面側斜視図である。
図40に示すように、第3実施形態の第1変形例では、インサータ420のカルチャーインサート310の挿入部以外の部分で上面421から下面422まで貫通する貫通部425が形成されている。図40に示す例では、貫通部425に、第2導出管路361が挿入されている。
図40に示すように、第3実施形態の第1変形例では、インサータ420のカルチャーインサート310の挿入部以外の部分で上面421から下面422まで貫通する貫通部425が形成されている。図40に示す例では、貫通部425に、第2導出管路361が挿入されている。
図41に示すように、貫通部425は、インサータ420の上面421から下面422に向かって延びる第1流路425aと、第1流路425aの下端からインサータ420の内周面まで延びる第2流路425bと、を有している。第1流路425aは、平面視円形の貫通孔である。第2流路425bは、インサータ420の下面422に形成された底面視矩形の溝である。
第2流路425bからは、カルチャーインサート310の底部開口から漏出する濾過液303が流入し、第1流路425aに挿入された第2導出管路361まで導かれる。このように、インサータ420に貫通部425を設けることで、第2導出管路361を介して濾過液303の排出を促進させることができる。なお、貫通部425は、溝部423の形成場所以外の場所であれば、その形成場所は特に限定されない。また、インサータ420に、1つ以上の貫通部425を形成してもよい。例えば貫通部425を複数形成することで、第2導出管路361を挿入しやすい貫通部425を選択でき、接続を容易に行うことができる。その他、第2導出管路361を複数設け、複数の貫通部425に接続して濾過液303の排出を促進させてもよい。また、貫通部425に、濾過液303中の評価物質を拡散させるチューブまたは配管を挿入してもよい。さらに、貫通部425に挿入された第2導出管路361と並行して、第2導出管路361と同様に他の貫通部425に挿入されるなどしてウェル320に配置された第2導入管路を設けてもよい。この第2導入管路からウェル320内の細胞に適した培地組成の培地を供給し、第2導出管路361からウェル320の余剰培地を廃液してもよい。
次に、第3実施形態の第2変形例について説明する。なお、上述した本実施形態及び第1変形例と同じ構造を有するものについては、同じ符号を付与することによってその説明を省略する。また、上述した本実施形態及び第1変形例と同じ動作及び同じ効果についても、その説明を省略する。
図42は、第3実施形態の第2変形例に係るインサータ420を配置した腎臓濾過機能評価装置300の断面構成図である。図43は、図42に示す腎臓濾過機能評価装置300が備えるマルチウェルプレート390の分解斜視図である。
図42に示すように、第3実施形態の第2変形例では、インサータ420の下面422がウェル320の底部401に接触しておらず、ウェル320の段差部394に吊り下げられた状態で支持されている。この第2変形例では、インサータ420の下面422の全体が、平面部(観察領域)となっている。この場合、インサータ420の下面422に気泡が発生し、蛍光輝度計測に支障を来す事を抑制する事を目的とした親水化処理(酸素プラズマやアルゴンプラズマ処理、シランカップリング処理等)を、少なくとも下面422に施してもよい。
図42に示すように、第3実施形態の第2変形例では、インサータ420の下面422がウェル320の底部401に接触しておらず、ウェル320の段差部394に吊り下げられた状態で支持されている。この第2変形例では、インサータ420の下面422の全体が、平面部(観察領域)となっている。この場合、インサータ420の下面422に気泡が発生し、蛍光輝度計測に支障を来す事を抑制する事を目的とした親水化処理(酸素プラズマやアルゴンプラズマ処理、シランカップリング処理等)を、少なくとも下面422に施してもよい。
段差部394は、ウェル320の側壁の内側に環状に設けられている。インサータ420は、段差部394上に載置されるフランジ部426を有する。フランジ部426は、図43に示すように、インサータ420の上端部から径方向外側に突出する環状に形成されている。このような、第2変形例(吊り下げ方式)によれば、インサータ420の下面422の全体が、平面部(観察領域)となっているため、上述した図37に示すようなインサータ420の回り止め構造は不要となるが、インサータ420を固定等のために回り止め構造があってもよい。
第2変形例のインサータ420の内径側には、図43に示すように、フィレット427が形成されている。フィレット427は、カルチャーインサート310が挿入されるインサータ420の挿入部の上端開口縁の角を丸めたものである。この構成によれば、インサータ420の内側にカルチャーインサート310を挿入し易くなり、カルチャーインサート310の底部開口のバイオフィルター330が、挿入時にインサータ420に接触し損傷してしまうことを防止することができる。
次に、第3実施形態の第3変形例について説明する。なお、上述した本実施形態及び第1~2変形例と同じ構造を有するものについては、同じ符号を付与することによってその説明を省略する。また、上述した本実施形態及び第1~2変形例と同じ動作及び同じ効果についても、その説明を省略する。
図44は、第3実施形態の第3変形例に係るインサータ420を配置した腎臓濾過機能評価装置300の断面構成図である。図45は、図44に示す腎臓濾過機能評価装置300が備えるマルチウェルプレート390の平面図である。図46は、図45に示すマルチウェルプレート390の分解斜視図である。
これらの図に示すように、第3実施形態の第3変形例では、インサータ420が鍔部428を有している。鍔部428は、ウェル320と濾過液排出槽392との間に形成された堰部393aを跨ぐように配置されている。堰部393aは、ウェル320と濾過液排出槽392との間を連通させる連通流路393の一部であり、ウェル320の底部401及び濾過液排出槽392の底面よりも高く形成されている。
これらの図に示すように、第3実施形態の第3変形例では、インサータ420が鍔部428を有している。鍔部428は、ウェル320と濾過液排出槽392との間に形成された堰部393aを跨ぐように配置されている。堰部393aは、ウェル320と濾過液排出槽392との間を連通させる連通流路393の一部であり、ウェル320の底部401及び濾過液排出槽392の底面よりも高く形成されている。
鍔部428は、図44に示すように、インサータ420の上端部から径方向外側に延びる第1部分428aと、第1部分428aの先端から屈曲し下方に延びる第2部分428bと、を有する。堰部393aは、インサータ420の外壁と鍔部428によって囲まれた逆さU字状の隙間に挿入(配置)されている。
堰部393aとインサータ420の外壁との間、堰部393aと鍔部428の第1部分428aとの間、及び、堰部393aと鍔部428の第2部分428bとの間には、濾過液303が流通できる微小隙間が形成されている。濾過液303は、この微小隙間による毛管現象によって、図44において矢印で示すように、ウェル320から濾過液排出槽392に流出する。
なお、ウェル320内に配置された図示しない第2導出管路361と並行に、またはこの第2導出管路361に代えて、ウェル320内の細胞に適した培地組成の培地を供給する図示しない第2導入管路を配置し、ウェル320内の余剰培地を濾過液排出槽392に流出させてもよい。つまり、カルチャーインサート310(第1容器)、ウェル320(第2容器)の細胞層(バイオフィルター330)を個別の培地組成でもって共培養するという状況下において、第2導出管路361を省略してもよい。
なお、ウェル320内に配置された図示しない第2導出管路361と並行に、またはこの第2導出管路361に代えて、ウェル320内の細胞に適した培地組成の培地を供給する図示しない第2導入管路を配置し、ウェル320内の余剰培地を濾過液排出槽392に流出させてもよい。つまり、カルチャーインサート310(第1容器)、ウェル320(第2容器)の細胞層(バイオフィルター330)を個別の培地組成でもって共培養するという状況下において、第2導出管路361を省略してもよい。
このように第3変形例においては、ウェル320と連通する濾過液排出槽392と、ウェル320と濾過液排出槽392との間に形成された堰部393aと、インサータ420は、堰部393aを跨ぐように設けられ、ウェル320から濾過液排出槽392に濾過液303を導く鍔部428を有する。この構成によれば、ウェル320内における濾過液303の液面を一定に維持しつつ、ウェル320内から濾過液排出槽392へ濾過液303の余剰液を導出することができる。
すなわち、鍔部428が無い場合、ウェル320内の濾過液303の液面は、濾過液303の接触角が大きい理由から、インサータ420の上面421よりも高くなり、ある一定の高さを超えたところで、濾過液排出槽392に流れ出す。したがって、ウェル320内の濾過液303の液面の高さが変動し、一定でなくなる。対して、鍔部428があることで、濾過液303が、インサータ420及び鍔部428と堰部393aとの間に形成された隙間を毛管現象によって進み、濾過液排出槽392に常時に流れ出るため、ウェル320内の濾過液303の液面の高さを一定に保つことができる。これにより、同液面高さでの蛍光観察が可能となる。
次に、第3実施形態のインサータ420(図39に示す溝部423付き)を用いて、蛍光標識評価物質を含有する培地を用いた段階希釈溶液の蛍光輝度を測定した検量線の検証結果について説明する。
図47は、第3実施形態に係るインサータ420を使用した場合のFITCイヌリンを用いた段階希釈蛍光溶液の検量線及び決定係数を示すグラフである。図48は、比較例として、プレートリーダーを使用した場合のFITCイヌリンを用いた段階希釈蛍光溶液の検量線及び決定係数を示すグラフである。
図49は、第3実施形態に係るインサータ420を使用した場合のRITCデキストランを用いた段階希釈蛍光溶液の検量線及び決定係数を示すグラフである。図50は、比較例として、プレートリーダーを使用した場合のRITCデキストランを用いた段階希釈蛍光溶液の検量線及び決定係数を示すグラフである。
図48及び図50に示すように、比較例としてインサータ420を用いた検証と同様の蛍光標識評価物質を含有する培地を用いた段階希釈溶液の蛍光輝度に関する検量線及び決定係数であるが、決定係数R2自体は、FITC・RITCの両者においても0.99以上と高精度ではあるが、濃度が濃くなるにつれ、標準偏差が大きくなる事が目立つ。
一方で、第3実施形態に係るインサータ420を使用した場合、図47及び図49に示すように、標準偏差は濃度が濃くなっても広がる事はなく、その点で既存のプレートリーダーより優位性があると言える。
一方で、第3実施形態に係るインサータ420を使用した場合、図47及び図49に示すように、標準偏差は濃度が濃くなっても広がる事はなく、その点で既存のプレートリーダーより優位性があると言える。
このように、第3実施形態のインサータ420を使用することにより、下の点が解決される。
(1)インサータ420の仕様においては、第2実施形態の凹部214が形成されたマルチウェルプレート210(以下、凹部搭載マルチウェルと言う)に比べ、側壁の凹部214が無くなり、またインサータ420の体積の分、ウェル320内の溶液量は少なく済み、それにより、カルチャーインサート310から漏出若しくは輸送してきた蛍光標識化合物の拡散が抑制され、蛍光標識化合物検出感度上昇をもたらす。
(2)バイオフィルター330から、蛍光観察領域までの距離が縮まる事により、蛍光標識化合物の漏出・輸送度上昇を検出するタイミングが早まる。
(3)第2実施形態の凹部搭載マルチウェルに比べ、測定領域内にデッドエンド構造が無いため、観察領域への蛍光標識化合物の拡散が相対的に促進されやすくなる。
(4)バイオフィルターを構成する細胞群同士の液性因子分泌(Autocrine、Paracrine)を介した(相互)作用を期待した場合、その培養液の拡散スペースが縮小する事により、その効果促進が期待できる。
(5)図51及び図52に示すように、第2実施形態の凹部搭載マルチウェル同様、蛍光輝度計測エリアの座標を蛍光顕微鏡ソフトウェアへ記録し、測定頻度と測定時間を規定する事によって、第3実施形態でも複数サンプルの蛍光輝度時間変化を長時間に渡り計測する事が可能である。
図51は、第3実施形態に係るインサータ420を使用した場合のFITCイヌリンを用いた自動観察による複数サンプルを扱う漏出試験結果を示すグラフである。図52は、第3実施形態に係るインサータ420を使用した場合のRITCデキストランを用いた自動観察による複数サンプルを扱う漏出試験結果を示すグラフである。
図51は、第3実施形態に係るインサータ420を使用した場合のFITCイヌリンを用いた自動観察による複数サンプルを扱う漏出試験結果を示すグラフである。図52は、第3実施形態に係るインサータ420を使用した場合のRITCデキストランを用いた自動観察による複数サンプルを扱う漏出試験結果を示すグラフである。
以上、本発明の好ましい実施形態、実施例及び変形例を記載し説明してきたが、これらは本発明の例示的なものであり、限定するものとして考慮されるべきではないことを理解すべきである。追加、省略、置換、およびその他の変更は、本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。従って、本発明は、前述の説明によって限定されていると見なされるべきではなく、特許請求の範囲によって制限されている。
本発明は、人工的にヒトの腎臓の濾過機能を再現できる腎臓濾過機能再現装置、及び、その腎臓濾過機能再現装置を用いた腎臓濾過機能評価装置及び腎臓濾過機能評価方法を提供できる。
1 腎臓濾過機能再現装置
2 液体
3 濾過液
10 第1容器
10A 第1液体収容室
11 閉止体
20 第2容器
20A 第2液体収容室
21 蓋体
30 バイオフィルター
31 透過膜
32 第2容器側フィルター
33 第1容器側フィルター
40 圧力制御装置
41 給気管路
42 圧力測定管路
51 導入管路
61 第2導出管路
70 物質添加装置
80 評価物通過量測定装置
100 腎臓濾過機能評価装置
101 評価物質
101a 第1物質
101b 第2物質
111 第1導出管路
210 マルチウェルプレート(培養容器)
212 ウェル(第2容器)
212a 天面
212b 底面
212c ウェル本体(液体収容部本体、第2液体収容室)
213 底板
214 凹部
214a 天面
214b 底面
215a 気液界面
217 カルチャーインサート(第1容器)
225 仕切壁
303 濾過液
310 カルチャーインサート(第1容器)
320 ウェル(第2容器)
391 嵌合突起
392 濾過液排出槽
393a 堰部
394 段差部
401 底部
420 インサータ(挿入部材)
422 下面
423 溝部
424 接触面
427 フィレット
428 鍔部
2 液体
3 濾過液
10 第1容器
10A 第1液体収容室
11 閉止体
20 第2容器
20A 第2液体収容室
21 蓋体
30 バイオフィルター
31 透過膜
32 第2容器側フィルター
33 第1容器側フィルター
40 圧力制御装置
41 給気管路
42 圧力測定管路
51 導入管路
61 第2導出管路
70 物質添加装置
80 評価物通過量測定装置
100 腎臓濾過機能評価装置
101 評価物質
101a 第1物質
101b 第2物質
111 第1導出管路
210 マルチウェルプレート(培養容器)
212 ウェル(第2容器)
212a 天面
212b 底面
212c ウェル本体(液体収容部本体、第2液体収容室)
213 底板
214 凹部
214a 天面
214b 底面
215a 気液界面
217 カルチャーインサート(第1容器)
225 仕切壁
303 濾過液
310 カルチャーインサート(第1容器)
320 ウェル(第2容器)
391 嵌合突起
392 濾過液排出槽
393a 堰部
394 段差部
401 底部
420 インサータ(挿入部材)
422 下面
423 溝部
424 接触面
427 フィレット
428 鍔部
Claims (15)
- 液体が導入される第1容器と、
前記第1容器に導入された液体を濾過するバイオフィルターと、
前記バイオフィルターを通過した濾過液が導入される第2容器と、を有し、
前記バイオフィルターは、
前記第1容器と前記第2容器との間を仕切る透過膜と、
前記透過膜の前記第2容器を向く面に配置された第2容器側フィルターと、有し、
前記第2容器側フィルターは、ポドサイトから形成されている、腎臓濾過機能再現装置。 - 前記バイオフィルターは、前記透過膜の前記第1容器を向く面に配置された第1容器側フィルターを有する、請求項1に記載の腎臓濾過機能再現装置。
- 前記第1容器側フィルターは、内皮細胞から形成されている、請求項2に記載の腎臓濾過機能再現装置。
- 前記第1容器と前記第2容器との圧力差を制御する圧力制御装置を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の腎臓濾過機能再現装置。
- 前記第1容器は、
前記液体を収容する第1液体収容室が形成された第1容器本体と、
前記第1容器本体の前記第1液体収容室を密閉する閉止体と、を有し、
前記圧力制御装置は、
前記閉止体を貫通し、前記第1液体収容室に挿入された給気管路及び圧力測定管路を有する、請求項4に記載の腎臓濾過機能再現装置。 - 前記第2容器は、
前記濾過液が導入される第2液体収容室と、
前記第2液体収容室に連通する凹部と、を含み、
前記凹部は、前記第2液体収容室の壁面の一部を外側方向に凹入させるように形成されている、請求項1~5のいずれか一項に記載の腎臓濾過機能再現装置。 - 前記第2容器の底部は、可視光に対する透光性を有し、
前記第1容器の側壁と前記第2容器の側壁との隙間に挿入され、前記第2容器の底部と対向する下面の少なくとも一部に平面部が形成された挿入部材を備える、請求項1~5のいずれか一項に記載の腎臓濾過機能再現装置。 - 前記平面部は、前記挿入部材の下面に設けられた溝部に形成され、
前記溝部を除く前記挿入部材の下面は、前記第2容器の底部に接触している、請求項7に記載の腎臓濾過機能再現装置。 - 前記第2容器と連通する濾過液排出槽と、
前記第2容器と前記濾過液排出槽との間に形成された堰部と、
前記挿入部材は、前記堰部を跨ぐように設けられ、前記第2容器から前記濾過液排出槽に前記濾過液を導く鍔部を有する、請求項7または8に記載の腎臓濾過機能再現装置。 - 請求項1~9のいずれか一項に記載の腎臓濾過機能再現装置を備え、
前記第1容器に導入される前記液体に、前記バイオフィルターの濾過機能を評価する評価物質及び前記バイオフィルターに対する毒性の有無を検証する被験物質の少なくとも一方を添加して腎臓濾過機能を評価する、腎臓濾過機能評価装置。 - 前記バイオフィルターを通過した前記評価物質の通過量を測定する評価物通過量測定装置を有する、請求項10に記載の腎臓濾過機能評価装置。
- 前記評価物質には、第1物質及び第2物質の少なくとも一方が含まれ、
前記第1物質は、前記バイオフィルターが正常状態のとき、前記第2容器側フィルターを通過困難であり、
前記第2物質は、前記バイオフィルターが正常状態のとき、前記第2容器側フィルターを通過容易である、請求項11に記載の腎臓濾過機能評価装置。 - 前記第1物質及び前記第2物質の少なくとも一方は、蛍光標識とされ、
前記評価物通過量測定装置は、前記評価物質の通過量を、前記濾過液の蛍光輝度に基づいて測定する、請求項12に記載の腎臓濾過機能評価装置。 - 前記第2容器は、透明部を有しており、
前記評価物通過量測定装置は、前記透明部から前記濾過液に測定光を投光し、前記評価物質の通過量を測定する、請求項11~13のいずれか一項に記載の腎臓濾過機能評価装置。 - 請求項1~9のいずれか一項に記載の腎臓濾過機能再現装置を用いた腎臓濾過機能評価方法であって、
前記第1容器に導入される前記液体に、前記バイオフィルターの濾過機能を評価する評価物質及び前記バイオフィルターに対する毒性の有無を検証する被験物質の少なくとも一方を添加して腎臓濾過機能を評価する、腎臓濾過機能評価方法。
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