WO2022009992A1 - 環状ペプチド、ペプチド複合体、並びに、当該環状ペプチド及び／又は当該ペプチド複合体を含む医薬組成物 - Google Patents

環状ペプチド、ペプチド複合体、並びに、当該環状ペプチド及び／又は当該ペプチド複合体を含む医薬組成物 Download PDF

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WO2022009992A1
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WO
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peptide
cyclic
xaa
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cyclic peptide
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裕明 菅
マイニ ルミット
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国立大学法人東京大学
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a cyclic peptide, a peptide complex, and a pharmaceutical composition containing the cyclic peptide and / or the peptide complex.
  • Non-Patent Document 1 brain-derived neurotrophic factor
  • TrkB tropomyosin-related kinase receptor type B
  • TrkB neurotrophine receptor p75
  • TrkB and its ligand, BDNF are widely expressed in the brains of adult mammals including the cerebral cortex, hippocampus, brain stem and spinal cord nucleus (Non-Patent Document 4).
  • TrkB is a transmembrane tyrosine kinase receptor protein that belongs to the tropomyosin-related kinase (TrK) family, and when bound to BDNF, tyrosine residues near the C-terminal domain on the cytoplasmic side undergo autophosphorylation (Fig. 1 (Fig. 1). a)) (Non-Patent Documents 1 and 5). Phosphorylation of TrkB by BDNF activates three major downstream pathways, the PLC ⁇ , PI3K, and MEK-ERK pathways (Non-Patent Document 1).
  • Phosphorylation of phospholipase C- ⁇ 1 results in the production of inositol trisphosphate (InsP 3 ) and diacylglycerol (DAG). This production affects synaptic plasticity through activation of calcium-dependent protein kinases by releasing the intracellular calcium store. Activation of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) results in stimulation of protein kinase B (AKT), which results in suppression of apoptotic proteins and ultimately promotes cell survival (Non-Patent Document 6).
  • BDNF-related neurite outgrowth, cell differentiation, and neuronal survival at the developmental stage are downstream of mitogen-activated kinase kinase 1/2 (MEK1 / 2) and extracellular signaling kinase 1/2 (ERK1 / 2). Stimulation in is involved. Furthermore, activation of the MEK-ERK pathway is associated with maintenance of neuronal structure and function in the adult brain (Non-Patent Documents 1 and 6).
  • Non-Patent Documents 7-11 BDNF's neurotrophic effects have been shown to have a positive effect on a variety of neurological disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Parkinson's disease, and Alzheimer's disease.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Non-Patent Documents 7-11 administration of BDNF led to the survival of degenerative motor neurons and restored axotomized motor neurons.
  • non-Patent Document 7 In non-human primates, infusion of BDNF protein showed beneficial anatomical and behavioral effects, and in rodents, BDNF treatment prevented the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra. Both models are chemically induced Parkinson's syndrome (Non-Patent Documents 9 and 10).
  • BDNF improved learning and memory and suppressed neuronal cell death in adult rats after penetrating fiber lesions (Non-Patent Document 11).
  • Non-Patent Documents 12, 13, 14 disclose BDNF therapy.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a novel compound capable of binding to TrkB and / or a compound capable of selectively inducing downstream TrkB signal transduction.
  • a cyclic peptide having a specific structure binds to TrkB, and a peptide complex of the cyclic peptide having a specific structure is used for downstream TrkB signal transduction.
  • TrkB TrkB signal transduction
  • Xaa 1 is a basic amino acid and Xaa 2 is an arbitrary amino acid and Xaa 3 and Xaa 4 are independently basic amino acids or aromatic amino acids, respectively.
  • n1 represents an integer from 0 to 10.
  • the structure represented by the above formula (1) is the following formula (2): (In equation (2), Xaa 2 and n1 have the same meanings as described above. ) The cyclic peptide according to [1], or a pharmacologically acceptable salt thereof, which is any of the structures represented by.
  • a pharmaceutical composition comprising at least one selected from the group consisting of pharmacologically acceptable salts thereof.
  • the pharmaceutical composition according to [13] which is used for the treatment or prevention of neurodegenerative diseases, neurodevelopmental disorders, or neuropsychiatric disorders.
  • the present invention also provides the following further embodiments.
  • [15] The cyclic peptide according to any one of [1] to [7], a pharmacologically acceptable salt thereof, and the peptide complex according to any one of [9] to [12].
  • a pharmacologically acceptable pharmaceutical composition comprising at least one selected from the group consisting of a pharmacologically acceptable salt thereof and a pharmacologically acceptable additive thereof.
  • TrkB binder comprising at least one selected from the group consisting of and pharmacologically acceptable salts thereof.
  • TrkB binder comprising at least one selected from the group consisting of and pharmacologically acceptable salts thereof.
  • [16C] The cyclic peptide according to any one of [1] to [7], a pharmacologically acceptable salt thereof, and the peptide complex according to any one of [9] to [12].
  • a method for treating or preventing a neurodegenerative disease, a neurodevelopmental disorder, or a neuropsychiatric disorder which comprises administering at least one selected from the group consisting of and a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • [20] The cyclic peptide according to any one of [1] to [7] for treating or preventing a neurodegenerative disease, a neurodevelopmental disorder, or a neuropsychiatric disorder, and a pharmacologically acceptable salt thereof, and a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the present invention may be the following further embodiments.
  • the TrkB binding agent, TrkB phosphorylation inducing agent, neuronal gene activation inducing agent, or axon elongation promoting agent in [16] to [16C] may be used for neurodegenerative diseases, neurodevelopmental disorders, or neuropsychiatric disorders. It may be used for treatment or prevention.
  • At least one selected from the group consisting of the body and its pharmaceutically acceptable salts is binding to TrkB (preferably binding to human TrkB), inducing TrkB phosphorylation, inducing activation of neuronal genes. , Or by promoting axonal elongation, it may be used for the treatment or prevention of neurodegenerative diseases, neurodevelopmental disorders, or neuropsychiatric disorders in [17] to [20].
  • the present invention can provide novel compounds capable of binding to TrkB and / or compounds capable of selectively inducing downstream TrkB signaling.
  • BDNF induces phosphorylation of TrkB, resulting in phospholipase C ⁇ (PLC ⁇ ), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), and mitogen-activated kinase kinase and extracellular signal control kinase (MEK-ERK). Activates two major downstream pathways. In the present specification, we mainly focused on the MEK-ERK pathway and clarified that it is involved in neurite outgrowth, cell differentiation, and nerve cell survival at the developmental stage.
  • PEG polyethylene glycol
  • the resulting homodimer peptide was further utilized in the discovery of BDNF mimetics.
  • a method for synthesizing a homodimer macrocyclic peptide using solid phase peptide synthesis chemistry is shown.
  • A Strategy for generating a thioether-cyclic peptide library using a flexible in vitro translation (FIT) system.
  • B Schematic of the RaPID screening approach used herein. Peptide sequence selection results identified from initial RaPID screening for affinity for TrkB. Binding the progress of affinity selection to the TrkB-bead complex (red) or just beads (blue) for the total number of molecules generated by the affinity selection in each round for each of the D-library and L-library. It was expressed as the ratio of the number of molecules.
  • the SPR sensorgram of the TrkB-binding monomer peptide analyzed by Biacore T200 is displayed in the concentration range of 1 to 1000 nM. The measured curve and the fitted curve are shown in blue and red, respectively.
  • the SPR sensorgram of the TrkB-binding homodimer peptide analyzed by Biacore T200 is displayed in the concentration range of 1 to 1000 nM. The measured curve is shown in blue, and the fitted curve is shown in red.
  • P-Trk Representative results of screening of DiTrbL3 by Western blotting of phosphorylated Trk
  • One-way ANOVA was used for statistical analysis, and then Tukey / Kramer's multiple comparison test was performed.
  • Mouse primary cultured hippocampal neurons (DIV6) were treated with DMSO (negative control of peptide), BDNF (0.1 nM), or DiTrbL3 (1 nM) for 15 minutes.
  • ANA12 100 ⁇ M was added to the medium 30 minutes prior to peptide treatment.
  • FIG. 1 A Representative Western blots for phosphorylated Akt (P-Akt in S473).
  • the red squares indicate overlapping TrkB spots.
  • the densitometry analysis of TrkB in the RTK array is shown.
  • the phosphorylation level of each spot of TrkB was normalized by the average of the DMSO-treated group.
  • the error bar indicates the standard error (s.e.m.) of the mean value. **: p ⁇ 0.01 (compared to DMSO).
  • pharmacologically acceptable salt includes, for example, salts with pharmaceutically acceptable bases and acids.
  • Non-limiting specific examples of pharmacologically acceptable salts include addition salts of inorganic acids (hydrochloride, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc.) and organic acids (p-toluene sulfone).
  • Xaa 1 is a basic amino acid and Xaa 2 is an arbitrary amino acid and Xaa 3 and Xaa 4 are independently basic amino acids or aromatic amino acids, respectively.
  • n1 represents an integer from 0 to 10.
  • cyclic peptide means having at least a cyclic structure formed by 5 or more amino acids in the molecule.
  • the molecular structure of the cyclic peptide may have a chain structure in which amino acids are linked by peptide bonds, in addition to the cyclic structure, or may have a structure other than the peptide structure.
  • cyclic structure refers to a closed ring structure formed in a linear peptide by binding two amino acids separated by 3 amino acid residues or more directly or via a linker or the like. Means.
  • “separated by 3 amino acid residues or more” means that the number of amino acid residues existing between the two amino acids forming the ring-closed structure is at least 3.
  • the ring-closed structure in the cyclic structure is not particularly limited, but is formed by covalently bonding two amino acids via a linker or the like, if necessary.
  • the covalent bond between the two amino acids include a disulfide bond, a peptide bond, an alkyl bond, an alkenyl bond, an ester bond, a thioester bond, an ether bond, a thioether bond, a phosphonate ether bond, an azo bond, and a CSC bond.
  • the covalent bond between the two amino acids may be formed by the side chains of the two amino acids, the main chains of the two amino acids, or the side chains of the two amino acids and the main chain.
  • the peptide bond forms a ring-closed structure.
  • the cyclic structure is not limited to the bond between the N-terminal and C-terminal amino acids of the linear peptide, and may be formed by the bond between the terminal amino acid and the amino acid other than the terminal, or the bond between the amino acids other than the terminal.
  • the cyclic peptide has a structure in which a linear peptide is attached to the cyclic structure like a tail.
  • the linear peptide is bound to the C-terminal of the amino acids constituting the cyclic structure in the linear peptide.
  • the N-terminal of the linear peptide and amino acids other than the C-terminal are bound to form a cyclic structure.
  • the amino acids forming the cyclic structure include, in addition to natural amino acids, artificial amino acid variants and / or derivatives, for example, natural proteinaceous L-amino acids, unnatural amino acids, and properties known in the art as characteristics of amino acids. Examples thereof include chemically synthesized compounds having. Proteinogenic amino acids are represented by the three-letter notation well known in the art, Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, and Val.
  • proteinaceous amino acids are represented by one-letter notation well known in the art, R, H, K, D, E, S, T, N, Q, C, G, P, A, I, L, M. , F, W, Y, and V.
  • the non-proteinogenic amino acids mean natural or non-natural amino acids other than proteinogenic amino acids.
  • Examples of unnatural amino acids include amino acids having a main chain structure different from that of the natural type ( ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids ( ⁇ -methylalanine, etc.), N-alkyl amino acids, D-amino acids, ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids).
  • ⁇ -amino acids and ⁇ -hydroxyic acid, etc.
  • Amino acids with different side chain structures (norleucine, homohistidine, etc.); Amino acids with excess methylene in the side chains (“homo” amino acids, homophenylalanine, etc.) And homohistidine, etc.); and amino acids (such as cysteine acid) in which the carboxylic acid functional group in the side chain is replaced with a sulfonic acid group can be mentioned.
  • Specific examples of the unnatural amino acid include the amino acids described in International Publication No. 2015/030014.
  • the number of amino acid residues forming the cyclic structure is not particularly limited as long as it is 5 or more, but may be, for example, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more, and 30 or less, 25 or less. It may be 20 or less, 17 or less, or 15 or less.
  • the number of amino acids forming a cyclic structure is usually 5 or more and 30 or less, and the number of amino acids forming a cyclic structure may be 6 or more, 8 or more, or 10 or more within the range of 5 or more and 30 or less. Hereinafter, it may be 25 or less, 20 or less, or 15 or less.
  • the number of amino acids forming the cyclic structure may be 6 or more and 20 or less, 8 or more and 20 or less, 8 or more and 19 or less, 9 or more and 18 or less, and 9 or more and 17 or less. It may be 10 or more and 17 or less, or 10 or more and 16 or less.
  • the number of amino acids forming the cyclic structure is preferably 8 or more and 17 or less, more preferably 9 or more and 15 or less, and still more preferably 10 or more and 14 or less, from the viewpoint of further enhancing the affinity with TrkB.
  • the cyclic peptide may be modified such as phosphorylation, methylation, acetylation, adenylylation, ADP ribosylation, glycosylation, and addition of polyethylene glycol, and other peptides. And / or may be fused with a protein.
  • the cyclic peptide may also be biotinylated via a suitable linker.
  • the cyclic peptide may be a dimer having two cyclic structures in the molecule, in which two cyclic peptides having one cyclic structure are bound via a linker structure. It may have an intramolecular lactam bridge structure in which a lactam structure is formed.
  • the dimer of the cyclic peptide in which two cyclic peptides having a cyclic structure represented by the above formula (1) are bound via a linker structure is described as described later. It is referred to as "peptide complex".
  • the linker structure connecting the two cyclic peptides is not particularly limited, and a linker having a well-known structure as a linker connecting the peptides in the field of peptide synthesis can be adopted.
  • the intramolecular lactam bridge structure may be formed by binding the side chains of amino acids constituting the cyclic peptide, for example, the amino group of the side chain of Lys and the carboxyl group of the side chain of Asp or Glu are bonded.
  • an intramolecular lactam structure may be formed.
  • Such a cyclic peptide has another cyclic structure as a bridge structure in the molecule.
  • Lys for example, DAP, DAB, or Orn may be bound to Asp or Glu.
  • the basic amino acid is not particularly limited as long as it is an amino acid having a side chain showing basicity in the molecule, but if it is a proteinaceous amino acid, for example, Arg, Lys, His, and Examples include Trp.
  • the aromatic amino acid is not particularly limited as long as it is an amino acid having an aromatic ring in the side chain in the molecule, but for example, it is a proteinaceous amino acid such as Trp, His, Phe, and. Examples include Tyr.
  • Xaa 1 is a basic amino acid, which may be Arg, Lys, His, or Trp, preferably Arg or Lys, and more preferably Arg.
  • Xaa 3 and Xaa 4 are independently basic amino acids or aromatic amino acids
  • Xaa 3- Xaa 4 is a basic amino acid-basic amino acid. It can be any combination of basic amino acid-aromatic amino acid, aromatic amino acid-basic amino acid, or aromatic amino acid-aromatic amino acid.
  • the basic amino acid may be Arg, Lys, His, or Trp, preferably Arg and Lys
  • the aromatic amino acid may be Trp, His, Phe, or Tyr. , Trp, Phe, and Tyr are preferred, and Trp and Phe are more preferred.
  • any combination in which the basic amino acid is Lys or Arg and the aromatic amino acid is Phe, Trp, or Tyr may be any combination, for example, Phe-Trp, Phe-Arg, Tyr-Arg. , Arg-Tyr, Tyr-Trp, Trp-Phe, Arg-Lys, Arg-Phe and the like.
  • Preferred embodiments of Xaa 3- Xaa 4 include, for example, Phe-Trp, Arg-Tyr, and Trp-Phe.
  • n1 represents an integer of 0 to 10, but is 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, or 6 or more within the range. Is preferable, and it is preferably 9 or less, or 8 or less.
  • Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4 and n1 may be a structure having any combination of preferred embodiments described as Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4 and n1. ..
  • the structure represented by the above formula (1) is preferably the following formula (2) :. It is a structure represented by.
  • Xaa 2 and n1 are synonymous with the above with respect to Xaa 2 and n1 described in the structure represented by the above formula (1), and any combination of preferred embodiments described as Xaa 2 and n1. It can be a structure having.
  • the cyclic peptide of the present invention preferably has the following formula (9):
  • the structure represented by is included as a cyclic structure.
  • Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4 , and n1 are described in the structure represented by the above formula (1), Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4 , and n1. It is synonymous with the above with respect to, and may be a structure having any combination of preferred embodiments described as Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4, and n1.
  • the above formula (9) is a structure in which (Z 1 ) m is bonded to the N-terminal side of the structure represented by the above formula (1) and (Z 2 ) n is bonded to the C-terminal side.
  • m and n are arbitrary integers of 1 or more.
  • Z 1 and Z 2 are independently selected from arbitrary amino acids, and one amino acid in each of Z 1 and Z 2 forms a cyclic structure to form a cyclic peptide.
  • the cyclic structure may be formed by binding Z 1 at the N-terminal to Z 2 at the C-terminal or by binding Z 1 at the N-terminal to Z 2 at the non-C terminal.
  • the non-N-terminal Z 1 may be formed by binding to the C-terminal Z 2, and the non-N-terminal Z 1 may be formed by binding to the non-C-terminal Z 2. .. Since the cyclic peptide has a structure in which a linear peptide is attached like a tail to a cyclic structure by binding to the non-terminal Z 1 or Z 2 , preferably, the N-terminal Z 1 is a non-C-terminal. It combines with Z 2 to form a cyclic structure. Further, Z 1 and Z 2 may have a cyclic structure via a linker.
  • m + n is 2 or more, but it is preferable that m and n are independently selected within a range in which m + n is 2 or more and 20 or less. It is preferable that m and n are independently selected so that the number of amino acids forming the cyclic structure is within the above-mentioned preferable range in the range where m + n is 2 or more and 20 or less.
  • Z 1 and Z 2 include amino acids having a branched chain side chain such as Leu, Val, and Ile, amino acids having a hydroxyl group in the side chain such as Ser, Thr, and basic amino acids. It may contain aromatic amino acids, preferably Leu or Ser.
  • Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4 , Z 1 , Z 2 , m, n and n1 are Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4 , Z 1 , Z 2 , It can be a structure having any combination of preferred embodiments described as m, n and n1.
  • the partial structure of ⁇ Xaa 1 ⁇ (Xaa 2 ) n1 ⁇ Xaa 3 ⁇ Xaa 4 ⁇ is preferably a structure represented by the above formula (2).
  • the cyclic peptide of the present invention has the following formula (10): The structure represented by is included as a cyclic structure.
  • Xaa 2, Z 1, Z 2, m, n and n1 are, Xaa 2, Z 1 described in the structure represented by the above formula (1) and the formula (9), Z 2 , M, n and n1 are synonymous with the above and may be a structure having any combination of preferred embodiments described as Xaa 2 , Z 1 , Z 2, m, n and n1.
  • the cyclic peptide preferably has an N-CO-CH 2- S structure (that is, an -NH-CO-CH 2 -S- structure), and forms a cyclic structure by the N-CO-CH 2-S structure. You may be doing it.
  • the cyclic structure includes an acetyl group in which H is substituted with a leaving group X, which is bonded to an amino group at the N-terminal of the peptide before forming the cyclic structure, and a thiol group in cysteine (Cys) on the C-terminal side. It is preferably formed by binding to.
  • the acetyl group in which H is substituted with the leaving group X is not particularly limited, and examples thereof include a chloroacetyl group and the like.
  • Z 3 , Z 4 , Z 5 , and Xaa' are independent amino acids, where p represents an integer of m-1 and q represents an integer of n-1. It is shown, and each shows an integer of 0 or more and 18 or less. P and q are independently and appropriately selected so that the number of amino acids forming the cyclic structure is within the above-mentioned preferable range, preferably in the range where p + q is 0 or more and 18 or less.
  • Xaa 1, Xaa 2, Xaa 3, Xaa 4 and n1 are, Xaa 1, Xaa 2, Xaa 3 described in the structure represented by the above formula (1) and the formula (9), Any of the preferred embodiments described above as Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4 and n1 which are synonymous with the above with respect to Xaa 4 and n1 and are described in the structures represented by the above formulas (1) and (9). It can be a structure having a combination of. Further, in the above formula (11), Z 4 and Z 5 may be a structure having any combination of preferred embodiments described as Z 1 and Z 2 described in the structure represented by the above formula (9).
  • Z 3 is preferably Tyr, and may be D-form or L-form. It is preferable that Xaa'is Gly or Ser independently. r is not particularly limited as long as it is an integer of 0 or more, but may be 20 or less, 10 or less, 1 or more, 3 or more, or 5 or more. You may. r is preferably 0 to 20. Examples of the (Xaa') r include a structure represented by (-Gly-Ser) r1 (r1 indicates an integer of 0 to 10). In the present specification, when r is 0, the cyclic peptide does not have Xaa', and when r is an integer of 1 or more, (Xaa') r in the cyclic peptide is an amino acid. It corresponds to a chain structure linked by peptide bonds.
  • the cyclic structure in the cyclic peptide may be other than the cyclic structure formed by the N-CO-CH 2-S structure.
  • the amino acid having the functional group 1 shown in Table 1 below and the amino acid having the corresponding functional group 2 can be a cyclic peptide.
  • at least one Z 1 is an amino acid having a functional group 1 and at least one Z 2 is a corresponding functional group 2.
  • it may be an amino acid in which at least one Z 1 has a functional group 2 and at least one Z 2 has a corresponding functional group 1.
  • Either of the functional groups 1 and 2 may be on the N-terminal side, may be arranged at the N-terminal and the C-terminal, one may be a terminal amino acid, the other may be a non-terminal amino acid, and both may be non-terminal amino acids. May be good. It can be said that the bond formed by the functional group 1 and the functional group 2 is a chemically crosslinked structure for forming a molecular cyclic structure in a cyclic peptide.
  • X 1 is a leaving group and Ar is an aromatic ring which may have a substituent.
  • the leaving group include halogen atoms such as Cl, Br and I.
  • a chloroacetylated amino acid for example, a chloroacetylated amino acid can be used.
  • Chloroacetylated amino acids include N-chloroacetyl-L-alanine, N-chloroacetyl-L-phenylalanine, N-chloroacetyl-L-tyrosine, N-chloroacetyl-L-tryptophan, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl- L-phenylalanine, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl-L-tyrosine, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl-L-tryptophan, ⁇ -N-chloroacetyl-L-diaminopropanoic acid, ⁇ -N-chloroacetyl -L-diaminobutyric acid, ⁇ -N-chloroacetyl-
  • amino acid having the functional group (A-2) examples include cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, 2-amino-8-mercaptooctanoic acid and the like. Cysteine is preferably used as the amino acid having the functional group (A-2).
  • the cyclization method using the amino acid having the functional group of (A-1) and the amino acid having the functional group of (A-2) is, for example, Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009). Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009); Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7923-7934 (2008); Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008); Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008), and the methods described in International Publication No. 2008/117833 and the like.
  • amino acid having the functional group (B-1) examples include propargylglycine, homopropargylglycine, 2-amino-6-heptynoic acid, 2-amino-7-octynoic acid, 2-amino-8-nonynoic acid and the like. Be done. 4-pentynoylized or 5-hexynoylated amino acids may be used. Examples of 4-pentynoylated amino acids include N- (4-pentenoyl) -L-alanine, N- (4-pentenoyl) -L-phenylalanine, N- (4-pentenoyl) -L-tyrosine, and N- (4).
  • Examples of the 5-hexynoylated amino acid include amino acids in which the 4-pentynoyl group is replaced with a 5-hexynoyl group in the compound exemplified as the 4-pentynoylated amino acid.
  • amino acid having the functional group of (B-2) examples include azidoalanine, 2-amino-4-azidobutanoic acid, azidoptonorvaline, azidonorleucine, 2-amino-7-azidoheptanoic acid, 2-amino-8-azidooctanoic acid and the like. Can be mentioned. Amino acids converted to azidoacetyl or 3-azidopentanoyl can also be used.
  • azidoacetylated amino acids examples include N-azidoacetyl-L-alanine, N-azidoacetyl-L-phenylalanine, N-azidoacetyl-L-tyrosine, N-azidoacetyl-L-tryptophan, and N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl.
  • 3-azidopentanoylated amino acid examples include amino acids in which the azidoacetyl group is replaced with the 3-azidopentanoyl group in the compound exemplified as the azidoacetylated amino acid.
  • the cyclization method using the amino acid having the functional group of (B-1) and the amino acid having the functional group of (B-2) is, for example, Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7923-7934 ( 2008), and the methods described in International Publication No. 2008/117833 and the like can be mentioned.
  • Examples of the amino acid having the functional group of (C-1) include N- (4-aminomethyl-benzoyl) -phenylalanine (AMBF) and 3-aminomethyltyrosine.
  • Examples of the amino acid having the functional group (C-2) include 5-hydroxytryptophan (WOH) and the like. Cyclization methods using amino acids having a functional group of (C-1) and amino acids having a functional group of (C-2) are described, for example, in Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009) and internationally. Examples thereof include the methods described in Publication No. 2008/117383.
  • Examples of the amino acid having the functional group of (D-1) include 2-amino-6-chloro-hexynoic acid, 2-amino-7-chloro-heptynoic acid, 2-amino-8-chloro-octynoic acid and the like. Can be mentioned.
  • Examples of the amino acid having the functional group (D-2) include cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, 2-amino-8-mercaptooctanoic acid and the like.
  • Examples of the cyclization method using the amino acid having the functional group (D-1) and the amino acid having the functional group (D-2) include the method described in International Publication No. 2012/074129.
  • Examples of the amino acid of (E-1) include N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine, N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine, N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophan, and the corresponding D-amino acid. Derivatives and the like can be mentioned.
  • Examples of the amino acid of (E-2) include cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, 2-amino-8-mercaptooctanoic acid and the like.
  • the cyclization method using the amino acid having the functional group of (E-1) and the amino acid having the functional group of (E-2) is, for example, the cyclization method of (A-1) and (A-2) or (D-). This can be done with reference to the cyclization methods of 1) and (D-2).
  • cyclic peptide of the present invention include those represented by the following formula (12).
  • Tyr may be a D-form or an L-form.
  • S means a thiol group of Cys.
  • the structure represented by -CH 2- CO- in the above structure is also referred to as Ac.
  • the portion represented by "Variable region” represents an arbitrary portion as long as it includes one or more structures represented by the above formula (1).
  • Xaa'and r are synonymous with those described above, and preferred embodiments are also the same.
  • the "Variable region” is the following formula (13): It is preferably represented by.
  • Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4 , n1, Z 4 , Z 5 , p, and q are the structures represented by the above formula (1) and the above formula (11).
  • Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4 , n1, Z 4 , Z 5 , p, and q are synonymous with the above, and in the structures represented by the above formulas (1) and (11).
  • p is preferably an integer of 0 to 3, more preferably an integer of 0 to 2, and even more preferably 0 or 1.
  • q is preferably an integer of 0 to 3, more preferably an integer of 0 to 2, and even more preferably 0 or 1.
  • Z 4 and Z 5 are each independently or amino acids with Leu, Val, branched side chain of Ile, etc., Ser, Thr Amino acids having a hydroxyl group in the side chain, basic amino acids and aromatic amino acids may be contained, and Leu or Ser is preferable.
  • Variable region in the above formula (12) include structures represented by the following formulas (13) to (16).
  • Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4 , n1, Z 4 , Z 5 , p, and q are represented by the above formula (1) and the above formula (11).
  • Xaa 1 , Xaa 2 , Xaa 3 , Xaa 4 , n1, Z 4 , Z 5 , p, and q are synonymous with the above, and are represented by the above formulas (1) and (11).
  • cyclic peptide represented by the above formula (12) include those having any of the structures represented by the following formulas (3) to (8).
  • the linear structural portion corresponding to (Xaa') r bonded to Cys in the above formula (12) is omitted. Therefore, in the following formulas (3) to (8), (Xaa') r may be bound to C (Cys) bound to S (Xaa' and r are those of the above formula (12). Is synonymous with.).
  • the cyclic peptide of the present invention can be suitably produced by a translational synthesis method using a cell-free translation system. It can be prepared by preparing a nucleic acid encoding a cyclic peptide and translating the nucleic acid with a cell-free translation system.
  • the nucleic acid encoding the cyclic peptide can be appropriately designed by those skilled in the art using the genetic code used in the translation system of a living body, the reprogrammed genetic code, or a combination thereof.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA.
  • tRNA aminoacylated with an unnatural amino acid can be used to efficiently introduce an unnatural amino acid into a peptide in addition to the natural amino acid.
  • the artificial aminoacyl-tRNA synthase flexizyme developed by the present inventors, it is possible to aminoacylate a tRNA having an arbitrary anticodon with any natural or unnatural amino acid. Therefore, using this technique, the genetic code consisting of triplets of mRNA can be reprogrammed to encode amino acids different from those of the biological translation system (International Publication No. 2008/059823).
  • the peptide complex of the invention and a pharmacologically acceptable salt thereof, comprises two cyclic peptides of the invention, one cyclic peptide linked to the other cyclic peptide by a linker.
  • BDNF is known to bind to the extracellular domain of TrkB, cause homodimerization of TrkB, and activate downstream signaling via autophosphorylation of TrkB. .. Since the peptide complex of the present invention and its pharmacologically acceptable salt have the above-mentioned constitution, each cyclic peptide in the peptide complex binds to the extracellular domain of TrkB, respectively, and the TrkB It is believed that it can cause homodimerization. Therefore, it is believed that the peptide complexes of the invention, and pharmacologically acceptable salts thereof, can activate downstream signal transduction via autophosphorylation of TrkBs.
  • the peptide complex of the present invention and its pharmacologically acceptable salts can stimulate various cellular responses such as neurite branching, neuronal survival, and axonal elongation. Conceivable. Therefore, the peptide complex of the present invention preferably induces phosphorylation of TrkB.
  • the peptide complex of the invention binds to the extracellular domain of TrkB, causing homodimerization of TrkB and causing self-phosphorylation of TrkB, the peptide complex.
  • SH2 src homology-type
  • shc protein containing src homology domain
  • IRS1 / 2 insulin receptor substrate 1/2
  • the peptide complex of the present invention is not particularly limited as long as it contains two cyclic peptides of the present invention and one cyclic peptide is linked to the other cyclic peptide by a linker, and the two cyclic peptides are the same. It may or may not be different. From the viewpoint of further promoting homodimerization of TrkB, it is preferable that the two cyclic peptides are the same in the peptide complex.
  • the linker connecting the two cyclic peptides in the peptide complex is not particularly limited, and a linker having a well-known structure as a linker connecting peptides in the field of peptide synthesis can be adopted, but the length is 20 ⁇ or more and 200 ⁇ or less. It is preferable to use a linker which is. According to such an embodiment, there is a tendency that the homodimerization of TrkB can be further promoted. From the same viewpoint, the length of the linker is more preferably 30 ⁇ or more and 150 ⁇ or less, and further preferably 40 ⁇ or more and 100 ⁇ or less.
  • Non-limiting examples of linkers linking two cyclic peptides in a peptide complex include, for example, polymers such as polyethylene glycol (PEG), peptides, nucleic acids, sugars, and combinations thereof.
  • PEG polyethylene glycol
  • Examples of the linker containing PEG include those in which two PEGs are bound to a small molecule having two or more functional groups, and a non-limiting example is a carboxylic acid to the amino group of 2,3-diaminopropionic acid. Examples thereof include those to which acid-modified PEG is bound.
  • the number of polymerizations of ethylene glycol may be 2 or more and 20 or less, 3 or more and 15 or less, or 4 or more and 10 or less.
  • the peptide complex of the present invention may be produced by linking the cyclic peptide of the present invention obtained as described above with an appropriate linker.
  • the step of connecting the cyclic peptide of the present invention with a linker can be carried out by those skilled in the art by using a known method for connecting the linker and the peptide, or a method similar thereto, depending on the type of the linker.
  • the linker is a linker containing the above-mentioned PEG
  • the two cyclic peptides of the present invention can be linked by the linker by the method shown in FIG.
  • the linker is a peptide
  • the two nucleic acids encoding the cyclic peptide of the present invention and the nucleic acid encoding the linker peptide are ligated to express the fusion protein of the cyclic peptide and the linker peptide of the present invention. May be good.
  • the cyclic peptide in the present invention and a pharmacologically acceptable salt thereof have a high affinity for TrkB, can strongly bind to TrkB, and can act as a TrkB agonist.
  • the peptide complex containing the cyclic peptide of the present invention induces homodimerization of TrkB by binding to the extracellular domain of TrkB, thereby selectively inducing downstream TrkB signaling.
  • the peptide complexes of the invention can stimulate various cellular responses such as neurite branching, neuronal survival, and axon elongation.
  • the cyclic peptides of the present invention have low pharmacokinetic properties, especially cell permeability, and therefore, they are treated for neurological diseases by an approach different from existing methods. Laws and research methods can be provided.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises at least one selected from the group consisting of a cyclic peptide and a pharmacologically acceptable salt thereof, and a peptide complex and a pharmacologically acceptable salt thereof. .. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is preferably used for the treatment or prevention of neurodegenerative diseases, neurodevelopmental disorders, or neuropsychiatric disorders.
  • the pharmaceutical composition is the same as at least one selected from the group consisting of a cyclic peptide as an active ingredient, a pharmacologically acceptable salt thereof, and a peptide complex and a pharmacologically acceptable salt thereof. It may be used, or it may be formulated by adding a pharmaceutically acceptable additive or the like.
  • Dosage forms of pharmaceutical preparations include, for example, liquid preparations (for example, injections), dispersants, suspensions, tablets, pills, powders, suppositories, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, etc. Examples thereof include troches, inhalants, ointments, eye drops, nasal drops, ear drops, and poultices.
  • Formulations include, for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, solubilizers, solubilizers, colorants, flavoring agents, stabilizers, emulsifiers, absorption promoters, surfactants, pH adjustments. It can be carried out by a conventional method by appropriately using additives such as an agent, a preservative, a wetting agent, a dispersant, and an antioxidant.
  • the additives used for formulation are not particularly limited, but are, for example, pharmaceutically acceptable organic solvents such as purified water, saline solution, phosphate buffer, dextrose, glycerol, and ethanol, and animal and vegetable oils. , Lactose, mannitol, glucose, sorbitol, crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, starch, corn starch, silicic anhydride, aluminum magnesium silicate, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethyl cellulose, sodium polyacrylate, Sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl cellulose, pectin, methyl cellulose, ethyl cellulose, xanthan gum, gum arabic, tragant, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, vaseline, paraffin, octyldodecyl myri
  • Surfactants such as polyoxyethylene lauryl ethers, sodium lauryl sulfate, and saponin; bile acids such as glycocholic acid, deoxycholic acid, and taurocholic acid; EDTA and salicylic acids, etc. Chelating agents; fatty acids such as caproic acid, capric acid, lauric acid, oleic acid, linoleic acid, and mixed micelles; enamine derivatives, N-acylcollagen peptides, N-acylamino acids, cyclodextrins, chitosans, and 1.
  • a nitrogen oxide donor or the like may be used.
  • the tablet or pill may be a coated tablet or the like coated with a sugar coating, a gastrosoluble substance, an enteric substance or the like.
  • the liquid may contain distilled water for injection, physiological saline, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil, alcohols and the like.
  • a wetting agent, an emulsifier, a dispersant, a stabilizer, a solubilizing agent, a solubilizing agent, a preservative and the like may be added.
  • the present invention also provides a method of administering a pharmaceutical composition to a patient in need thereof to treat or prevent a disease in the patient.
  • the disease may be a neurodegenerative disease, a neurodevelopmental disorder, or a neuropsychiatric disorder.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately determined by a person skilled in the art according to the symptoms, age, gender, body weight, sensitivity difference, administration method, administration interval, type of pharmaceutical product, etc. of the patient who requires it. can do.
  • the patient is a mammal, preferably a human.
  • D-ClAcTyr D-ClAcTyr
  • the mRNA library corresponding to the thioether-cyclic peptide library is, in order, an AUG start codon encoding L-ClAcTyr or D-ClAcTyr, and 8 to 15 NNK random codons (N) encoding random proteinaceous amino acid residues.
  • N NNK random codons
  • a thioether bond was naturally formed between the acetyl chloride group of the Tyr residue at the N-terminal and the sulfhydryl group (thiol group) of the downstream cysteine residue.
  • hTrkB human TrkB
  • affinity selection is performed using the RaPID (random non-standard peptides integrated discovery) system in the L-library and D-library.
  • RaPID random non-standard peptides integrated discovery
  • Fig. 3 Hayashi, Y .; Morimoto, J .; Suga, H., In vitro selection of anti-Akt2 thioether-macrocyclic peptides leading to isoform-selective inhibitors.
  • a library of cyclic peptides was prepared and a cyclic peptide to be bound to hTrkB was selected as follows.
  • the mRNA library, as well as ClAc-L-Tyr-tRNA fMet CAU , and ClAc-D-Tyr-tRNA fMet CAU were prepared as previously reported (Hayashi, Y .; Morimoto, J .; Suga, H). ., In vitro selection of anti-Akt2 thioether-macrocyclic peptides leading to isoform-selective inhibitors. ACS Chem Biol 2012, 7 (3), 607-13 .; Hipolito, CJ & Suga, H.
  • the product was subsequently tagged with the mRNA- cDNA hybrid by reverse transcription with RNase-H minus reverse transcriptase (Promega) at 42 ° C. for 1 hour.
  • the buffer was then replaced with one containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05 vol% tween-20.
  • affinity selection was performed on the obtained peptide-mRNA / cDNA conjugate library.
  • the peptide-mRNA / cDNA conjugate library was passed through His pull-down Dynabeads (Life Technologies) three times (each passage was performed under 4 ° C. conditions for 10 minutes).
  • the round was performed 5 times, with library preparation, pre-clearance, and positive selection as one round. After 5 rounds, significant enrichment of cDNA was observed (compared to the case where the extracellular domain of TrkB was not immobilized on the beads in positive selection) (FIG. 4).
  • the recovered cDNA was amplified by PCR, purified using a column (Numery-Nagel), and then sequenced using a high-throughput sequencer (MiSeq (Illumina)). Data analysis was performed using software (CLC sequence viewer 7 (Qiagen)).
  • the leftmost M is L-ClAcTyr
  • the other alphabetic characters indicate amino acids based on the one-letter notation of amino acids.
  • a thioether bond was formed between the leftmost L-ClAcTyr and the first downstream cysteine residue.
  • the GSGSGS sequence downstream of each peptide is a linear structure that binds to a cyclic structure and may or may not be present.
  • the peptides in Table 2 correspond to SEQ ID NOs: 1 to 13, respectively, in order from the top.
  • the leftmost M is D-ClAcTyr
  • the other alphabetic characters indicate amino acids based on the one-letter notation of amino acids.
  • a thioether bond was formed between the leftmost D-ClAcTyr and the first downstream cysteine residue.
  • the GSGSGS sequence downstream of each peptide is a linear structure that binds to a cyclic structure and may or may not be present.
  • cyclic peptides were synthesized by Fmoc solid phase peptide synthesis (SPPS) using a Syro Wave automated peptide synthesizer (Biotage) according to a known method (Ito, K. et al. Artificial human Met agonists). based on macrocycle scaffolds. Nature Communications 6, 6372, 2015). Specifically, after the automatic synthesis of each peptide, a chloroacetyl group for cyclization was attached to an N-terminal amide group to the obtained product.
  • SPPS Fmoc solid phase peptide synthesis
  • Biotage Syro Wave automated peptide synthesizer
  • the peptide was cleaved from the solid phase with a solution of 92.5% trifluoroacetic acid (TFA), 2.5% water, 2.5% triisopropylsilane, and 2.5% ethanedithiol and with diethyl ether. Precipitated.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the peptide pellet was dissolved in 10 ml of triethylamine containing DMSO and incubated at 25 ° C. for 1 hour. TFA was added to the reaction solution to acidify the peptide suspension and terminate the cyclization reaction.
  • Peptides were subsequently purified by subjecting them to reverse phase HPLC (RP-HPLC) under linear gradient conditions using a Prominence HPLC system (Shimazu).
  • a gradient was realized by mixing mobile phase A containing water containing 0.1% TFA with mobile phase B which is acetonitrile containing 0.1% TFA.
  • the purified peptide was freeze-dried in vacuum, and the molecular weight was confirmed by performing MALDI-TOF mass spectrometry using AutoFlex II (Bruker Daltonics).
  • hTrkA-C protein The binding kinetics (binding affinity) of the cyclic peptide to the extracellular domain of hTrkA, hTrkC, and hTrkB immobilized on the sensor chip via His6-tag. about sex (dissociation constant) K D), by performing a quantitative measurement using surface plasmon resonance (SPR), for hTrkA and HTrkC, it was evaluated strength and selectivity of binding of hTrkB and cyclic peptides.
  • SPR surface plasmon resonance
  • NB means non-binding, that is, no SPR response was detected in the range where the hTrkA-C protein was 1 to 1000 nM.
  • a peptide complex (homodimer peptide) containing these cyclic peptides was prepared by the following procedure.
  • a peptide complex (homodimer peptide) obtained by dimerizing each of TrbL1 to 3 and TrbD1 to 3 with a linker was prepared for TrbL1 to 3 and TrbD1 to 3, respectively, with DiTrbL1 to 3 and DiTrbD1. It is called ⁇ 3.
  • Fmoc-DAP Fmoc
  • Fmoc-NH- (PEG) 5- COOH linker Fmoc-protected amino acid couplings
  • other Fmoc-protected amino acid couplings are 0 in DMF on NovaPEG Link Amide resin that has absorbed DMF.
  • the pellets were dissolved in DMSO with 0.1% TFA, the solution was added TEA until (was confirmed using H 2 O and pH indicator paper.) Basic, cyclization of the peptide was induced. After cyclization for 30 minutes at room temperature under basic conditions, the mass of the peptide and the completion of cyclization were confirmed by a MALDI-TOF mass spectrometer (AutoFlex II (Bruker Daltonics)).
  • TrbL1 to 3 PEG 5 -DAP-PEG 5 linker (length 58 ⁇ ) by dimerized peptide complexes (homodimer peptide), DiTrbL1 1-3 , And DiTrbD1 ⁇ 3.
  • SPR Surface Plasmon Resonance: Evaluation of the binding kinetics (binding affinity K D)) Cyclic peptides (TrbL1 ⁇ 3, and TrbD1 ⁇ 3) in place, except for using peptide complexes (DiTrbL1 ⁇ 3, and DiTrbD1 ⁇ 3), evaluate the binding kinetics of cyclic peptides (binding affinity K D) It was in the same manner as described above, was assessed binding kinetics (binding affinity K D) of each peptide conjugate (DiTrbL1 ⁇ 3, and DiTrbD1 ⁇ 3).
  • Hippocampal neurons of DIV6 (6 days in vitro) were treated with DMSO, BDNF, or peptide complex (DiTrbL3) for 15 minutes.
  • ANA-12 100 ⁇ M was added 30 minutes prior to treatment with BDNF, or peptide.
  • PBS 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0.5% Na-deoxycholic acid, 0.1.
  • Radioimmunity Precipitation Assay (RIPA) buffer containing% SDS, 50 mM NaF, 0.2 mM Na 3 VO 4 , 10 ⁇ g / mL aprotinin, 10 ⁇ g / mL leupeptin, and 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride.
  • RIPA Radioimmunity Precipitation Assay
  • Cytolysis (protein content: 20 ⁇ g for P-TrkB, 10 ⁇ g for TrkB, 5 ⁇ g for Akt and Erk) was separated using an 8% polyacrylamide gel and onto a polyvinylidene difluoride membrane (Merck Millipore, Massachusetts, USA). Moved. The membrane was blocked with a blocking buffer (5% bovine serum albumin (BSA) Tris buffered physiological saline (TBST) containing 0.05% tween-20) for 1 hour, followed by a primary antibody (rabbit anti-TrkB antibody, 1).
  • BSA bovine serum albumin
  • TST Tris buffered physiological saline
  • the membrane was subjected to secondary antibody (goat anti-rabbit IgG antibody bound with peroxidase, 1: 10,000 diluted, Cat # 111-035-003 (Jackson Immuno Research); peroxidase.
  • the sheep anti-mouse IgG antibody bound to 1: 10,000 diluted was incubated with Cat # NA9310 (GE Healthcare) for 1 hour at room temperature.
  • an immunopositive band was detected by chemiluminescence using a Luminata Crescendo HPR substrate (Merck Millipore). The relative phosphorylation level of each kinase was calculated as a phosphorylation kinase / total kinase ratio.
  • Hippocampal neurons of DIV6 were incubated with DMSO, BDNF (0.1 nM), or DiTrbL3 (1 nM) at 37 ° C. for 15 minutes at 5% CO 2.
  • ANA-12 100 ⁇ M was added 30 minutes prior to DiTrbL3 treatment.
  • Comprehensive studies of phosphorylated tyrosine kinase receptors were performed using phosphorylated RTK arrays according to the manufacturer's protocol (Proteome Profiler Mouse Phospho-RTK Array Kit, ARY014, R & D Systems). Phosphorylation levels were assessed by pixel intensity and quantified by ImageJ software.
  • RNA extraction and qRT-PCR After treating the primary cultured cortical neurons of DIV6 with BDNF or peptide complex (DiTrbL3) for 1 hour, total RNA was extracted from the primary cultured neurons using SV Total RNA Isolation System (Z3105, Promega). Total RNA was quantitatively and qualitatively verified by NanoDrop spectrometer (Thermo Fisher Scientific) and electrophoresis in a formaldehyde gel. Next, 500 ng of total RNA was reverse transcribed using SuperScript II (Thermo Fisher Scientific).
  • Quantitative PCR was performed using the SYBR Green real-time PCR system as previously reported (Akashi, M .; Takumi, T., The orphan nuclear receptor RORalpha regulates circadian transcription of the mammalian core-clock). Bmal1. Nat Struct Mol Biol 2005, 12 (5), 441-8.).
  • the Gapdh gene was used as an internal control.
  • the following primer sequences were used: Gapdh (Forward: 5'-ACGGAAGCTCACTCAGGCATGCATGCCTT-3', and reverse: 5'-CATGAGGTCCCCCCCCCCTGTTTGCTGCTG-3') (shown in SEQ ID NOs: 14 and 15, respectively), c-fos (Forward).
  • 5'-AGTTTTCTCTACTACTACTACTACATCC-3' 5'-AGTTTTCTCTACTACTACTACTACATCC-3', and reverse: 5'-AAAAGTTGGCACTAGACGACGACGACGAC-3') (shown in SEQ ID NOs: 16 and 17, respectively), Arc (Forward: 5'-GGTGAGCTGACTGACCAAAT-3' and reverse: 5'- TTCACTGGTATCATCACTGATCACTGCTGCTG-3') (shown in SEQ ID NOs: 18 and 19, respectively).
  • Hippocampal primary neurons of DIV0 were treated with DMSO, BDNF, or DiTrbL3 peptide and immunocytochemical analysis was performed with DIV3.
  • Cells were washed twice with 0.1 M phosphate buffered saline (PBS) and fixed with 2% paraformaldehyde (PFA) / 4% sucrose (in 0.1 M PBS) for 15 minutes. After washing 3 times with PBS, cells are permeated with PBS containing 0.2% Triton-X (PBST) for 3 minutes and a blocking solution (PBST containing 5% normal goat serum) to prevent non-specific binding. ) For 1 hour.
  • PBS phosphate buffered saline
  • PFA paraformaldehyde
  • PBST Triton-X
  • NB means non-binding, that is, no SPR response was detected in the range where the hTrkA-C protein was 1-100 nM.
  • binding affinity K D for hTrkB of each peptide conjugate (DiTrbL1 ⁇ 3, and DiTrbD1 ⁇ 3) are substantially the same as the monomeric form (cyclic peptides), which It shows that the ability to bind to hTrkB did not change with dimerization. Surprisingly, the selectivity for hTrkB was significantly changed by dimerization. Four of the six peptides did not bind to hTrkC or were weakly bound (DiTrbD1), while they bound strongly to hTrkA. On the other hand, DiTrbL3, the most potent hTrkB binder, retained high selectivity for hTrkB and no binding to hTrkA and hTrkC was observed on the SPR sensor chip.
  • TrkA is not normally expressed in hippocampal neurons
  • the anti-phosphorylated Trk antibody used in this analysis recognizes not only TrkB but also TrkA and TrkC. It was confirmed that it has specificity for the induction of oxidation.
  • Western blotting using an anti-phosphorylated Trk antibody was carried out in the same manner as above except that ANA-12, a specific kinase inhibitor for the intracellular catalytic domain of TrkB, was used.
  • DiTrbL3 is considered to be a selective agonist for TrkB phosphorylation and against both mouse and human TropB proteins. It was found to show cross-reactivity.
  • BDNF plays an important role in the regulation of synaptic plasticity in response to pre-early genes such as c-fos and Arc
  • mRNA expression levels of c-fos and Arc under treatment with DiTrbL3 were quantified.
  • Primary cultured cortical neurons were treated with BDNF (1 nM) or DiTrbL3 (1 nM) for 1 hour, then RNA extraction and qRT-PCR measurements were performed by the method described above (RNA extraction and qRT-PCR).
  • RNA extraction and qRT-PCR RNA extraction and qRT-PCR

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Abstract

本発明は、下記式（１）： （式（１）中、Ｘａａ１は、塩基性アミノ酸であり、Ｘａａ２は、任意のアミノ酸であり、Ｘａａ３、及びＸａａ４は、各々独立に、塩基性アミノ酸、又は芳香族アミノ酸であり、ｎ１は、０～１０の整数を示す。）で表される構造を含む、環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩に関する。

Description

環状ペプチド、ペプチド複合体、並びに、当該環状ペプチド及び／又は当該ペプチド複合体を含む医薬組成物
　本発明は、環状ペプチド、ペプチド複合体、並びに、当該環状ペプチド及び／又は当該ペプチド複合体を含む医薬組成物等に関する。
　ニューロトロフィンは、脳の全域におけるニューロン細胞及びネットワークについて、発生、機能及び生存を調節する内因性ポリペプチドである。近年、ニューロトロフィンファミリーメンバーの中で、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、神経学的障害及び精神医学的障害のための潜在的治療の主要な候補として浮上している（非特許文献１、２）。
　ＢＤＮＦは、異なるクラスの２つの受容体であるトロポミオシン関連キナーゼ受容体Ｂ型（ＴｒｋＢ）及びニューロトロフィン受容体ｐ７５に対する天然リガンドとして作用し、ｐ７５よりも少なくとも１０倍高い親和性でＴｒｋＢに結合することが知られている（非特許文献３）。ＴｒｋＢ、及びそのリガンドであるＢＤＮＦは、大脳皮質、海馬、脳幹及び脊髄核を含む成体哺乳類の脳で広く発現している（非特許文献４）。
　ＴｒｋＢは、膜貫通型チロシンキナーゼ受容体蛋白質であり、トロポミオシン関連キナーゼ（ＴｒＫ）ファミリーに属し、ＢＤＮＦに結合すると、細胞質側のＣ末端ドメイン近傍のチロシン残基が自己リン酸化を受ける（図１（ａ））（非特許文献１、５）。ＢＤＮＦによるＴｒｋＢのリン酸化により、ＰＬＣγ、ＰＩ３Ｋ、及びＭＥＫ－ＥＲＫ経路という３つの主要な下流経路が活性化される（非特許文献１）。
　ホスホリパーゼＣ－γ１（ＰＬＣγ１）のリン酸化は、イノシトール三リン酸（ＩｎｓＰ３）とジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の生成をもたらす。この生成は、細胞内カルシウムストアを放出することにより、カルシウム依存性プロテインキナーゼの活性化を介してシナプス可塑性に影響を与える。ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化は、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）の刺激をもたらすが、それはアポトーシス促進性タンパク質の抑制をもたらし、最終的に細胞生存を促進する（非特許文献６）。発生段階における、ＢＤＮＦが関連する神経突起伸長、細胞分化、及びニューロンの生存は、マイトジェン活性化キナーゼキナーゼ１／２（ＭＥＫ１／２）及び細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）の下流での刺激が関係している。更に、ＭＥＫ－ＥＲＫ経路の活性化は、成体脳におけるニューロンの構造及び機能の維持と関連している（非特許文献１、６）。
　これに関連し、ＢＤＮＦの神経栄養作用が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、及びアルツハイマー病等の種々の神経学的疾患にポジティブな影響を及ぼすことが示されている（非特許文献７～１１）。
　げっ歯類ＡＬＳモデルでは、ＢＤＮＦを投与することにより、変性運動ニューロンの生存を導き、軸索切断した運動ニューロンを回復させた（非特許文献７）。非ヒト霊長類では、ＢＤＮＦタンパク質の注入が有益な解剖学的及び行動学的効果を示し、げっ歯類では、ＢＤＮＦ処置により黒質でのドーパミン作動性ニューロンの喪失が予防された。なお、両モデルともパーキンソン症候群が化学的に誘発されたものである（非特許文献９、１０）。アミロイド前駆体タンパク質の突然変異型を発現するトランスジェニックマウスモデルでは、ＢＤＮＦは学習と記憶を改善し、貫通線維病変後の成体ラットでは、神経細胞死を抑制した（非特許文献１１）。
　以上のように、ＢＤＮＦ療法は、様々な神経学的疾患に対する治療方法として大きな可能性を持つため、これまで、組換えＢＤＮＦを用いた臨床試験を含む、ＢＤＮＦ療法に関する種々の研究がなされている（非特許文献１２、１３、１４）。
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　しかしながら、従来のＢＤＮＦ療法は、ＢＤＮＦの不十分な送達性と短いｉｎ　ｖｉｖｏ半減期のために、十分効果を有する治療方法として確立されていない（非特許文献１２、１３）。また、ＢＤＮＦがｐ７５に結合すると細胞死経路が活性化されることが知られており（非特許文献１４）、オフターゲット効果を緩和するために用量調節が必要である。
　したがって、ＢＤＮＦに代わる、ＴｒｋＢに結合し得る新規な化合物が求められている。
　本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、ＴｒｋＢに結合し得る新規な化合物、及び／又は下流のＴｒｋＢシグナル伝達を選択的に誘起し得る化合物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の構造を有する環状ペプチドがＴｒｋＢに結合し、また、特定の構造を有する環状ペプチドのペプチド複合体が下流のＴｒｋＢシグナル伝達を選択的に誘起しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］
　下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式（１）中、
　Ｘａａ１は、塩基性アミノ酸であり、
　Ｘａａ２は、任意のアミノ酸であり、
　Ｘａａ３、及びＸａａ４は、各々独立に、塩基性アミノ酸、又は芳香族アミノ酸であり、
　ｎ１は、０～１０の整数を示す。）
　で表される構造を含む、環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
［２］
　前記式（１）で表される構造は、下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式（２）中、
　Ｘａａ２及びｎ１は、前記と同義である。）
で表される構造のいずれかである、［１］に記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
［３］
　前記環状ペプチドの環状構造がＮ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造を含む、［１］又は［２］に記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
［４］
　前記Ｎがチロシンのアミノ基に由来する、［３］に記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
［５］
　前記Ｓがシステインのチオール基に由来する、［３］又は［４］に記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
［６］
　前記環状ペプチドの環状構造を形成するアミノ酸残基の数が、６～２０個である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
［７］
　下記式（３）～（８）で表される環状構造のいずれか１つを含む、環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式（３）～（８）中、Ａｃは－ＣＨ２－ＣＯ－であり、ＹはＬ－チロシンであり、ｙはＤ－チロシンである。）
［８］
　前記環状ペプチドが更に１～２０のアミノ酸で構成される直鎖状構造を含む、［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
［９］
　２つの［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチドを含み、一方の環状ペプチドが他方の環状ペプチドとリンカーにより連結している、ペプチド複合体、又はその薬理学的に許容可能な塩。
［１０］
　前記２つの環状ペプチドが同一である、［９］に記載のペプチド複合体、又はその薬理学的に許容可能な塩。
［１１］
　前記リンカーの長さが２０Å以上２００Å以下である、［９］又は［１０］に記載のペプチド複合体、又はその薬理学的に許容可能な塩。
［１２］
　ＴｒｋＢのリン酸化を誘導する、［９］～［１１］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、又はその薬理学的に許容可能な塩。
［１３］
　［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、［９］～［１２］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つを含む、医薬組成物。
［１４］
　神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患の治療又は予防に用いられる、［１３］に記載の医薬組成物。
　本発明は以下の更なる実施態様をも提供する。
［１５］
　［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、［９］～［１２］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つと、薬理学的に許容可能な添加剤と、を含む、医薬組成物。
［１５Ａ］
　神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患の治療又は予防に用いられる、［１５］に記載の医薬組成物。
［１６］
　［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、［９］～［１２］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つを含む、ＴｒｋＢ結合剤。
［１６Ａ］
　ヒトＴｒｋＢ結合剤である、［１６］に記載のＴｒｋＢ結合剤。
［１６Ｂ］
　ＴｒｋＢのリン酸化を誘導する、［１６］又は［１６Ａ］に記載のＴｒｋＢ結合剤。
［１６Ｃ］
　［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、［９］～［１２］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つを含む、ＴｒｋＢのリン酸化誘導剤、ニューロン遺伝子の活性化誘導剤、又は軸索の伸長促進剤。
［１７］
　［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、［９］～［１２］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つを投与することを含む、神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患の治療又は予防方法。
［１８］
　神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患の治療又は予防のための医薬組成物を製造するための、［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、［９］～［１２］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つの使用。
［１９］
　神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患の治療又は予防のための、［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、［９］～［１２］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つ。
［１９Ａ］
　神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患の治療又は予防のための、［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、若しくはその薬理学的に許容可能な塩、又は、［９］～［１２］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、若しくはその薬理学的に許容可能な塩。
［２０］
　神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患の治療又は予防のための、［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、［９］～［１２］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つの使用。
　本発明は以下の更なる実施態様であってもよい。
　［１６］～［１６Ｃ］におけるＴｒｋＢの結合剤、ＴｒｋＢのリン酸化誘導剤、ニューロン遺伝子の活性化誘導剤、又は軸索の伸長促進剤は、神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患の治療又は予防に用いられるものであってよい。
　また、［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、［９］～［１２］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つは、ＴｒｋＢへの結合（好ましくはヒトＴｒｋＢへの結合）、ＴｒｋＢのリン酸化誘導、ニューロン遺伝子の活性化誘導、又は軸索の伸長促進により、［１７］～［２０］における神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患の治療又は予防に用いられてもよい。
　［１］～［７］のいずれか１つに記載の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、［９］～［１２］のいずれか１つに記載のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩としては、本明細書において記載する態様、並びに本明細書において好ましい、より好ましい、及び更に好ましいとして記載する態様（これらの全ての態様を総称して、好ましい態様ともいう）の任意の組み合わせであり得る。
　本発明は、ＴｒｋＢに結合し得る新規な化合物、及び／又は下流のＴｒｋＢシグナル伝達を選択的に誘起し得る化合物を提供することができる。
（ａ）ＢＤＮＦはＴｒｋＢのリン酸化を誘導し、その結果、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、並びに、マイトジェン活性化キナーゼキナーゼ及び細胞外シグナル制御キナーゼ（ＭＥＫ－ＥＲＫ）の３つの主要な下流経路を活性化する。本明細書中、主にＭＥＫ－ＥＲＫ経路に着目し、発生段階の神経突起の伸長、細胞分化、及び神経細胞の生存に関与していることを明らかにした。（ｂ）ＲａＰＩＤシステムで発見された抗ＴｒｋＢ大環状ペプチドを、適当な長さのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを用いて、ホモ二量体の大環状体に変換した。得られたホモ二量体ペプチドは、さらにＢＤＮＦ模倣体の発見に利用された。 固相ペプチド合成化学を用いたホモ二量体大環状ペプチドの合成方法を示す。 （ａ）フレキシブルインビトロ翻訳（ＦＩＴ）システムを用いたチオエーテル－環状ペプチドライブラリーの生成戦略。（ｂ）本明細書中で使用したＲａＰＩＤスクリーニングアプローチの模式図。 ＴｒｋＢへの親和性のための最初のＲａＰＩＤスクリーニングから同定されたペプチド配列の選択結果。アフィニティー選択の進捗状況を、Ｄ－ライブラリーおよびＬ－ライブラリーのそれぞれについて、各ラウンドのアフィニティー選択で生成された総分子数に対する、ＴｒｋＢ－ビーズ複合体（赤）または単なるビーズ（青）に結合した分子数の比率として表した。 Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００で分析したＴｒｋＢ結合モノマーペプチドのＳＰＲセンサーグラムを１～１０００ｎＭの濃度範囲で表示する。測定した曲線とフィッティングした曲線をそれぞれ青と赤で示す。 Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００で分析したＴｒｋＢ結合ホモ二量体ペプチドのＳＰＲセンサーグラムを１～１０００ｎＭの濃度範囲で表示する。測定した曲線を青、フィッティングした曲線を赤で示す。 （ａ）リン酸化されたＴｒｋ（Ｐ－Ｔｒｋ）のウェスタンブロットによるＤｉＴｒｂＬ３のスクリーニングの代表的な結果。マウス初代培養海馬ニューロン（ＤＩＶ６）をＤＭＳＯ、ＢＤＮＦ（０．１ｎＭ）、又はＤｉＴｒｂＬ３（１ｎＭ）で１５分間処理した。内部コントロール（ＴｒｋＢ）には抗ＴｒｋＢ抗体を使用した。（ｂ）ＴｒｋＢのキナーゼドメインに対する選択的阻害剤であるＡＮＡ－１２を用いて、ＤｉＴｒｂＬ３の標的特異性を評価した。ペプチド処理の３０分前にＡＮＡ－１２（１００μＭ）を培地に添加した。（ｃ）Ｔｒｋのリン酸化の半定量的結果。ＴｒｋＢのリン酸化レベルを総ＴｒｋＢで正規化し、その後、ＤＭＳＯ処理群の平均で正規化した。エラーバーは平均値の標準誤差（s.e.m.）を示し、各グループｎ＝３である。＊＊：ｐ＜０．０１（ＤＭＳＯと比較）、＃＃：ｐ＜０．０１（１００μＭ　ＡＮＡ－１２及び１ｎＭ　ＤｉＴｒｂＬ３と、１ｎＭ　ＤｉＴｒｂＬ３との間で比較）。統計解析には、一方向ＡＮＯＶＡを用い、その後、Ｔｕｋｅｙ／Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定を行った。 マウス初代培養海馬ニューロン（ＤＩＶ６）をＤＭＳＯ（ペプチドのネガティブコントロール）、ＢＤＮＦ（０．１ｎＭ）、又はＤｉＴｒｂＬ３（１ｎＭ）で１５分間処理した。ペプチドを処理する３０分前にＡＮＡ１２（１００μＭ）を培地に添加した。（ａ）リン酸化Ａｋｔ（Ｓ４７３におけるＰ－Ａｋｔ）についての代表的なウェスタンブロット。（ｂ）リン酸化Ｅｒｋ１／２（Ｐ－Ｅｒｋ１／２）についての代表的なウェスタンブロット。（ｃ－ｅ）（ｃ）Ａｋｔ、（ｄ）Ｅｒｋ１、（ｅ）Ｅｒｋ２のリン酸化レベルの定量的結果。矢印はそれぞれＥｒｋ１（４４ｋＤａ）、Ｅｒｋ２（４２ｋＤａ）を示す。各キナーゼの相対的なリン酸化レベルは、ＤＭＳＯ処理群の平均で正規化した。エラーバーは標準誤差（s.e.m.）を示し、各グループｎ＝３である。＊＊：ｐ＜０．０１（ＤＭＳＯと比較）、＃＃：ｐ＜０．０１、＃：ｐ＜０．０５（ＡＮＡ－１２及び１ｎＭ　ＤｉＴｒｂＬ３と、１ｎＭ　ＤｉＴｒｂＬ３との間で比較）。統計解析には、一方向ＡＮＯＶＡを用い、その後、Ｔｕｋｅｙ／Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定を行った。 リン酸化ＲＴＫアレイの結果を示す。４０種類のＲＴＫが含まれる市販のリン酸化ＲＴＫアレイを用いた（下段）。初代培養海馬ニューロン（ＤＩＶ６）を刺激剤で１５分間インキュベートした。ＤｉＴｒｂＬ３処理の３０分前にＡＮＡ－１２（１００μＭ）を添加した。各スポットは各ＲＴＫのリン酸化レベルを示す。赤色の四角い部分は、重複したＴｒｋＢスポットを示している。 ＲＴＫアレイにおけるＴｒｋＢのデンシトメトリー分析を示す。ＴｒｋＢの各スポットのリン酸化レベルをＤＭＳＯ処理群の平均で正規化した。 培養した皮質ニューロン（ＤＩＶ６）を、ＢＤＮＦ（１ｎＭ）またはＤｉＴｒｂＬ３（１ｎＭ）で１時間処理し、その後、（ａ）ｃ－ｆｏｓ、（ｂ）ＡｒｃのｍＲＮＡ発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより評価した。各処理についてｎ＝３である。エラーバーは平均値の標準誤差（s.e.m.）を示す。＊＊：ｐ＜０．０１（ＤＭＳＯと比較）。統計解析には、一方向ＡＮＯＶＡを用い、その後、Ｔｕｋｅｙ／Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定を行った。 （ａ）ＤｉＴｒｂＬ３ペプチドで処理した初代培養海馬ニューロンの代表的な画像。海馬ニューロンを、１、１０、若しくは１００ｎＭのＤｉＴｒｂＬ３、又は２ｎＭのＢＤＮＦでＤＩＶ０から３まで処理し、核染色（ＤＡＰＩ；青）と共に、抗Ｔａｕ抗体（赤）、及び抗ＭＡＰ２抗体（緑）を用いて免疫細胞化学を行った。軸索は、Ｔａｕ陽性およびＭＡＰ２陰性のニューライトとして同定した。各軸索の長さをＮｅｕｒｏｎ　Ｊ４４で定量した。スケールバーは５０μｍを示す。（ｂ）軸索伸長実験の定量的結果（ＤＭＳＯはｎ＝６０、ＢＤＮＦはｎ＝２０、ＤｉＴｒｂＬ３の各濃度はｎ＝３０）。エラーバーは平均値の標準誤差（s.e.m.）を示す。＊＊：ｐ＜０．０１（ＤＭＳＯと比較）。統計解析には、一方向ＡＮＯＶＡを用い、その後、Ｔｕｋｅｙ／Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定を行った。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施形態に制限されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
　本明細書中、「薬理学的に許容可能な塩」とは、例えば、医薬として許容される塩基や酸との塩を含むものである。
　薬理学的に許容可能な塩の非限定的な具体例としては、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）の付加塩、及びアミノ酸の付加塩等が挙げられる。
［環状ペプチド］
　本発明の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩は、下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 で表される構造を環状構造の部分構造として含む。
　上記式（１）中、
　Ｘａａ１は、塩基性アミノ酸であり、
　Ｘａａ２は、任意のアミノ酸であり、
　Ｘａａ３、及びＸａａ４は、各々独立に、塩基性アミノ酸、又は芳香族アミノ酸であり、
　ｎ１は、０～１０の整数を示す。
　本明細書において、「環状ペプチド」とは、５以上のアミノ酸により形成される環状構造を分子内に少なくとも有することを意味する。環状ペプチドの分子構造は、環状構造以外に、アミノ酸がペプチド結合により連結した鎖状構造を有していてもよく、また、ペプチド構造以外の構造を有していてもよい。
　本明細書において、「環状構造」とは、直鎖状ペプチドにおいて、３アミノ酸残基以上離れた２つのアミノ酸が直接に、又はリンカー等を介して結合することによって分子内に形成される閉環構造を意味する。
　本明細書において、「３アミノ酸残基以上離れた」とは、閉環構造を形成する２つのアミノ酸の間に存在するアミノ酸残基の個数が、少なくとも３であることを意味する。
　環状構造における閉環構造は特に限定されないが、２つのアミノ酸が、必要に応じてリンカー等を介して共有結合することにより形成される。
　２つのアミノ酸間の共有結合としては、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、Ｃ－Ｓ－Ｃ結合、Ｃ－Ｎ－Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ－Ｃ結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、及びチオアミド結合等が挙げられる。
　また、２つのアミノ酸間の共有結合は、２つのアミノ酸の側鎖同士、２つのアミノ酸の主鎖同士、又は、２つのアミノ酸の側鎖と主鎖との結合等により形成されてもよい。２つのアミノ酸がアミノ酸の主鎖において結合する場合、ペプチド結合により閉環構造が形成される。
　環状構造は、直鎖状ペプチドのＮ末端とＣ末端のアミノ酸の結合に限られず、末端のアミノ酸と末端以外のアミノ酸との結合、又は末端以外のアミノ酸同士の結合により形成されてもよい。環状構造を形成のために結合するアミノ酸の一方が末端アミノ酸で、他方が非末端アミノ酸である場合、環状ペプチドは、環状構造に直鎖のペプチドが尾のように付いた構造を有する。
　環状構造に直鎖のペプチドが尾のように付いた構造を有する場合、直鎖状ペプチドにおける環状構造を構成するアミノ酸のＣ末端に直鎖のペプチドが結合していることが好ましい。言い換えれば、直鎖状ペプチドにおけるＮ末端と、Ｃ末端以外のアミノ酸とが結合して環状構造を形成することが好ましい。
　環状構造を形成するアミノ酸としては、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体及び／又は誘導体を含み、例えば、天然タンパク質性Ｌ－アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸の特徴として当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられる。
　タンパク質性アミノ酸（proteinogenic amino acids）は、当業界に周知の３文字表記により表すと、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌである。また、タンパク質性アミノ酸は、当業界に周知の１文字表記により表すと、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶである。
　非タンパク質性アミノ酸（non-proteinogenic amino acids）としては、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を意味する。
　非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（α，α－二置換アミノ酸（α－メチルアラニン等）、Ｎ－アルキルアミノ酸、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、δ－アミノ酸、及びα－ヒドロキシ酸等）；側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、及びホモヒスチジン等）；側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、及びホモヒスチジン等）；及び、側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されているアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられる。非天然アミノ酸の具体例としては、国際公開第２０１５／０３００１４号に記載のアミノ酸が挙げられる。
　環状構造を形成するアミノ酸残基の数は５以上であれば特に限定されないが、例えば、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上であってもよく、３０以下、２５以下、２０以下、１７以下、又は１５以下であってもよい。
　環状構造を形成するアミノ酸の数は、通常５以上３０以下であり、５以上３０以下の範囲内で、環状構造を形成するアミノ酸の数を６以上、８以上、又は１０以上としてもよく、３０以下、２５以下、２０以下、又は１５以下としてもよい。
　環状構造を形成するアミノ酸の数は、６以上２０以下としてもよく、８以上２０以下としてもよく、８以上１９以下としてもよく、９以上１８以下としてもよく、９以上１７以下としてもよく、１０以上１７以下としてもよく、１０以上１６以下としてもよい。
　環状構造を形成するアミノ酸の数は、ＴｒｋＢとの親和性をより高める観点から、好ましくは８以上１７以下、より好ましくは９以上１５以下、さらに好ましくは１０以上１４以下である。
　本発明において、環状ペプチドは、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ＡＤＰリボシル化、糖鎖付加、及びポリエチレングリコールの付加等の修飾が加えられたものであってもよく、他のペプチド及び／又はタンパク質と融合させたものであってもよい。また、環状ペプチドは、適当なリンカーを介して、ビオチン化されていてもよい。
　また、本発明において、環状ペプチドは、１つの環状構造を有する環状ペプチド２つがリンカー構造を介して結合している、分子内に２つの環状構造を有する二量体であってもよく、分子内でラクタム構造を形成した分子内ラクタムブリッジ構造を有していてもよい。なお、本明細書中、上記式（１）で表される構造を有する環状構造を含む環状ペプチド２つが、リンカー構造を介して結合している環状ペプチドの二量体は、後述するように「ペプチド複合体」と称する。
　２つの環状ペプチドを繋ぐリンカー構造としては、特に限定されず、ペプチド合成分野においてペプチド同士を繋ぐリンカーとして周知の構造のものを採用することができる。
　分子内ラクタムブリッジ構造は、環状ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖同士が結合することによって形成されてよく、例えば、Ｌｙｓの側鎖のアミノ基と、Ａｓｐ又はＧｌｕの側鎖のカルボキシル基が結合して、ペプチド結合を形成することにより、分子内ラクタム構造が形成されてもよい。そのような環状ペプチドは、分子内にブリッジ構造として、もう１つの環状構造を有する。Ｌｙｓに代えて、例えば、ＤＡＰ、ＤＡＢ、又はＯｒｎがＡｓｐ又はＧｌｕと結合していてもよい。
　本明細書において、塩基性アミノ酸とは、分子内に塩基性を示す側鎖をもつアミノ酸であれば特に限定されるものではないが、タンパク質性アミノ酸で例示すれば、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＴｒｐ等が挙げられる。
　本明細書において、芳香族アミノ酸とは、分子内に芳香族環を側鎖にもつアミノ酸であれば特に限定されるものではないが、タンパク質性アミノ酸で例示すれば、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、及びＴｙｒ等が挙げられる。
　上記式（１）で表される構造において、Ｘａａ１は、塩基性アミノ酸であり、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、又はＴｒｐであってよく、好ましくはＡｒｇ又はＬｙｓであり、より好ましくはＡｒｇである。
　上記式（１）で表される構造において、Ｘａａ３、及びＸａａ４は、各々独立に、塩基性アミノ酸、又は芳香族アミノ酸であり、Ｘａａ３－Ｘａａ４は、塩基性アミノ酸－塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸－芳香族アミノ酸、芳香族アミノ酸－塩基性アミノ酸、又は芳香族アミノ酸－芳香族アミノ酸として任意の組み合わせであり得る。Ｘａａ３－Ｘａａ４中、塩基性アミノ酸としては、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、又はＴｒｐであってよく、Ａｒｇ及びＬｙｓが好ましく、芳香族アミノ酸としては、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、又はＴｙｒであってよく、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、及びＴｙｒが好ましく、Ｔｒｐ及びＰｈｅがより好ましい。Ｘａａ３－Ｘａａ４中、塩基性アミノ酸がＬｙｓ又はＡｒｇであり、芳香族アミノ酸がＰｈｅ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒである任意の組み合わせであってよく、例えば、Ｐｈｅ－Ｔｒｐ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｔｙｒ－Ａｒｇ、Ａｒｇ－Ｔｙｒ、Ｔｙｒ－Ｔｒｐ、Ｔｒｐ－Ｐｈｅ、Ａｒｇ－Ｌｙｓ、及びＡｒｇ－Ｐｈｅ等が挙げられる。Ｘａａ３－Ｘａａ４の好ましい一態様としては、例えばＰｈｅ－Ｔｒｐ、Ａｒｇ－Ｔｙｒ、及びＴｒｐ－Ｐｈｅが挙げられる。
　上記式（１）で表される構造において、ｎ１は、０～１０の整数を示すが、当該範囲内で、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、又は６以上であることが好ましく、９以下、又は８以下であることが好ましい。
　上記式（１）中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４及びｎ１は、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４及びｎ１として記載する好ましい態様の任意の組み合わせを有する構造であり得る。
　本発明において、上記式（１）で表される構造は、好ましくは、下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 で表される構造である。
　上記式（２）中、Ｘａａ２及びｎ１は、上記式（１）で表される構造において記載するＸａａ２及びｎ１に関する前記と同義であり、Ｘａａ２及びｎ１として記載する好ましい態様の任意の組み合わせを有する構造であり得る。
　本発明の環状ペプチドは、好ましくは、下記式（９）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 で表される構造を環状構造として含む。
　上記式（９）中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、及びｎ１は、上記式（１）で表される構造において記載するＸａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、及びｎ１に関する前記と同義であり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、及びｎ１として記載する好ましい態様の任意の組み合わせを有する構造であり得る。
　すなわち、上記式（９）は、上記式（１）で表される構造のＮ末端側に、（Ｚ１）ｍを、Ｃ末端側に（Ｚ２）ｎを結合した構造である。
　上記式（９）において、ｍ及びｎは、任意の１以上の整数である。
　Ｚ１とＺ２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸から選択され、Ｚ１とＺ２それぞれにおける１のアミノ酸が環状構造を形成することにより、環状ペプチドを形成することが好ましい。当該環状構造は、Ｎ末端のＺ１が、Ｃ末端のＺ２と結合して形成されていてもよく、Ｎ末端のＺ１が、非Ｃ末端のＺ２と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＺ１が、Ｃ末端のＺ２と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＺ１が、非Ｃ末端のＺ２と結合して形成されていてもよい。
　非末端のＺ１又はＺ２が結合することにより、環状ペプチドは環状構造に直鎖のペプチドが尾のように付いた構造を有するため、好ましくは、Ｎ末端のＺ１が、非Ｃ末端のＺ２と結合して環状構造が形成される。また、Ｚ１とＺ２とが、リンカーを介して環状構造となっていてもよい。
　ｍ及びｎについて、ｍ＋ｎが２以上であるが、ｍ及びｎは、ｍ＋ｎが２以上２０以下となるような範囲でそれぞれ独立して選択されることが好ましい。ｍ及びｎは、ｍ＋ｎが２以上２０以下となるような範囲で、環状構造を形成するアミノ酸の数が上述の好ましい範囲内となるようにそれぞれ独立して選択されることが好ましい。
　Ｚ１とＺ２は、環状構造を形成するアミノ酸以外に、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ等の分岐鎖側鎖を有するアミノ酸や、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等の側鎖に水酸基を有するアミノ酸や、塩基性アミノ酸や芳香族アミノ酸を含んでいてもよく、Ｌｅｕ又はＳｅｒを含むことが好ましい。
　上記式（９）中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｚ１、Ｚ２、ｍ、ｎ及びｎ１は、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｚ１、Ｚ２、ｍ、ｎ及びｎ１として記載する好ましい態様の任意の組み合わせを有する構造であり得る。
　上記式（９）中、－Ｘａａ１－（Ｘａａ２）ｎ１－Ｘａａ３－Ｘａａ４－の部分構造は、上記式（２）で表される構造であることが好ましい。この場合、本発明の環状ペプチドは、下記式（１０）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 で表される構造を環状構造として含む。
　上記式（１０）中、Ｘａａ２、Ｚ１、Ｚ２、ｍ、ｎ及びｎ１は、上記式（１）及び上記式（９）で表される構造において記載するＸａａ２、Ｚ１、Ｚ２、ｍ、ｎ及びｎ１に関する前記と同義であり、Ｘａａ２、Ｚ１、Ｚ２、ｍ、ｎ及びｎ１として記載する好ましい態様の任意の組み合わせを有する構造であり得る。
　環状ペプチドは、Ｎ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造（すなわち、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ－構造）を有していると好ましく、Ｎ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造により環状構造を形成していてもよい。また、当該環状構造は、環状構造を形成する前のペプチドのＮ末端のアミノ基に結合した、Ｈが脱離基Ｘで置換されたアセチル基と、Ｃ末端側のシステイン（Ｃｙｓ）におけるチオール基との結合により形成されることが好ましい。Ｈが脱離基Ｘで置換されたアセチル基としては、特に限定されず、例えば、クロロアセチル基等が挙げられる。そのような態様としては、例えば、下記式（１１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 で表されるペプチドにおいて、ＸＣＨ２ＣＯと、Ｃｙｓのチオール基とが結合することにより環状構造が形成される場合が挙げられる。
　上記式（１１）中、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＸａａ’は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｐはｍ－１の整数を示し、ｑはｎ－１の整数を示し、それぞれ、０以上１８以下の整数を示す。ｐ及びｑは、好ましくは、ｐ＋ｑが０以上１８以下となるような範囲で、環状構造を形成するアミノ酸の数が上述の好ましい範囲内となるように独立して適宜選択される。
　上記式（１１）中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４及びｎ１は、上記式（１）及び上記式（９）で表される構造において記載するＸａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４及びｎ１に関する前記と同義であり、上記式（１）及び上記式（９）で表される構造において記載するＸａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４及びｎ１として記載する好ましい態様の任意の組み合わせを有する構造であり得る。また、上記式（１１）中、Ｚ４及びＺ５は、上記式（９）で表される構造において記載するＺ１及びＺ２として記載する好ましい態様の任意の組み合わせを有する構造であり得る。
　Ｚ３は、Ｔｙｒであることが好ましく、Ｄ体であってもＬ体であってよい。
　Ｘａａ’は、各々独立に、Ｇｌｙ又はＳｅｒであることが好ましい。
　ｒは０以上の整数であれば特に限定されないが、２０以下であってもよく、１０以下であってもよく、１以上であってもよく、３以上であってもよく、５以上であってもよい。ｒは０～２０であることが好ましい。
　（Ｘａａ’）ｒとしては、例えば、（－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｒ１（ｒ１は０～１０の整数を示す。）で表される構造が挙げられる。
　本明細書において、ｒが０である場合には、環状ペプチドはＸａａ’を有せず、また、ｒが１以上の整数である場合には、環状ペプチドにおける（Ｘａａ’）ｒは、アミノ酸がペプチド結合により連結した鎖状構造に相当する。
　環状ペプチドにおける環状構造は、Ｎ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造により形成される環状構造以外のものであってもよい。例えば、下記表１に示す官能基１を有するアミノ酸と、対応する官能基２を有するアミノ酸が環状化した環状ペプチドとすることができる。この態様において、例えば上記式（１０）で表される構造を環状構造として含む場合、少なくとも１つのＺ１が官能基１を有するアミノ酸であり、かつ、少なくとも１つのＺ２が対応する官能基２を有するアミノ酸であってもよく、あるいは、少なくとも１つのＺ１が官能基２を有するアミノ酸であり、かつ、少なくとも１つのＺ２が対応する官能基１を有するアミノ酸であってもよい。
　官能基１と２はどちらがＮ末端側にきてもよく、Ｎ末端とＣ末端に配置してもよいし、一方を末端アミノ酸、他方を非末端アミノ酸としてもよいし、両方を非末端アミノ酸としてもよい。
　官能基１と官能基２により形成される結合が、環状ペプチドにおける分子環状構造を形成するための化学架橋構造といえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
 　表１の化学構造式中、Ｘ１は脱離基であり、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香環である。脱離基としては、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ等のハロゲン原子が挙げられる。
　（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、クロロアセチル化したアミノ酸を用いることができる。クロロアセチル化アミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-alanine、N-chloroacetyl-L-phenylalanine、N-chloroacetyl-L-tyrosine、N-chloroacetyl-L-tryptophan、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-chloroacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-chloroacetyl-L-diaminobutyric acid、δ-N-chloroacetyl-L-ornithine、ε-N-chloroacetyl-L-lysine、及びこれらに対応するＤ－アミノ酸誘導体等が挙げられる。
　（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-tyrosine、及びN-chloroacetyl-D-tyrosineが好適に用いられる。
　（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8-mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
　（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、cysteineが好適に用いられる。
　（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009)；Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)；Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)；Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008)；Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)、及び国際公開第２００８／１１７８３３号等に記載された方法が挙げられる。
　（Ｂ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、propargylglycine、homopropargylglycine、2-amino-6-heptynoic acid、2-amino-7-octynoic acid、及び2-amino-8-nonynoic acid等が挙げられる。
　4-pentynoyl化や5-hexynoyl化したアミノ酸を用いてもよい。
　4-pentynoyl化アミノ酸としては、例えば、N-(4-pentenoyl)-L-alanine、N-(4-pentenoyl)-L-phenylalanine、N-(4-pentenoyl)-L-tyrosine、N-(4-pentenoyl)-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-(4-pentenoyl)-L-diaminopropanoic acid、γ-N-(4-pentenoyl)-L-diaminobutyric acid、σ-N-(4-pentenoyl)-L-ornithine、ε-N-(4-pentenoyl)-L-lysine、及びこれらに対応するＤ－アミノ酸誘導体等が挙げられる。
　5-hexynoyl化アミノ酸としては、4-pentynoyl化アミノ酸として例示した化合物において、4-pentynoyl基が、5-hexynoyl基に置換されたアミノ酸が挙げられる。
　（Ｂ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、azidoalanine、2-amino-4-azidobutanoic acid、azidoptonorvaline、azidonorleucine、2-amino-7-azidoheptanoic acid、及び2-amino-8-azidooctanoic acid等が挙げられる。
　azidoacetyl化や3-azidopentanoyl化したアミノ酸を用いることもできる。
　azidoacetyl化アミノ酸としては、例えば、N-azidoacetyl-L-alanine、N-azidoacetyl-L-phenylalanine、N-azidoacetyl-L-tyrosine、N-azidoacetyl-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-azidoacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-azidoacetyl-L-diaminobutyric acid、σ-N-azidoacetyl-L-ornithine、ε-N-azidoacetyl-L-lysine、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体等が挙げられる。
　3-azidopentanoyl化アミノ酸としては、azidoacetyl化アミノ酸として例示した化合物において、azidoacetyl基が、3-azidopentanoyl基に置換されたアミノ酸が挙げられる。
　（Ｂ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｂ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)、及び国際公開第２００８／１１７８３３号等に記載された方法が挙げられる。
　（Ｃ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、N-(4-aminomethyl-benzoyl)-phenylalanine (AMBF)及び3-aminomethyltyrosine等が挙げられる。
　（Ｃ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、5-hydroxytryptophan(WOH)等が挙げられる。
　（Ｃ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｃ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)及び国際公開第２００８／１１７８３３号に記載された方法等が挙げられる。
　（Ｄ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、2-amino-6-chloro-hexynoic acid、2-amino-7-chloro-heptynoic acid、及び2-amino-8-chloro-octynoic acid等が挙げられる。
　（Ｄ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8-mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
　（Ｄ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｄ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、国際公開第２０１２／０７４１２９号に記載された方法等が挙げられる。
　（Ｅ－１）のアミノ酸としては、例えば、N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophan、及びこれらに対応するＤ－アミノ酸誘導体等が挙げられる。
　（Ｅ－２）のアミノ酸としては、例えば、cysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、 mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8-mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
　（Ｅ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｅ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、（Ａ－１）と（Ａ－２）の環状化方法や（Ｄ－１）と（Ｄ－２）の環状化方法を参考にして行うことができる。
　本発明の環状ペプチドの具体例として、下記式（１２）で表されるものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　上記式（１２）において、ＴｙｒはＤ体であってもよく、Ｌ体であってもよい。また、Ｓは、Ｃｙｓのチオール基を意味する。本明細書及びこれに添付される図中では、上記構造における－ＣＨ2－ＣＯ－で表される構造は、Ａｃとも記載される。
　また、上記式（１２）において、「Variable region」と表される部分は、上記式（１）で表される構造を１つ以上含む限りにおいて任意の部分を表す。
　Ｘａａ’、及びｒは上述したものと同義であり、好ましい態様も同様である。
　上記式（１２）において、「Variable region」は、下記式（１３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 で表されることが好ましい。
　上記式（１３）中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、ｎ１、Ｚ４、Ｚ５、ｐ、及びｑは、上記式（１）及び上記式（１１）で表される構造において記載するＸａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、ｎ１、Ｚ４、Ｚ５、ｐ、及びｑに関する前記と同義であり、上記式（１）及び上記式（１１）で表される構造において記載するＸａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、ｎ１、Ｚ４、Ｚ５、ｐ、及びｑとして記載する好ましい態様の任意の組み合わせを有する構造であり得る。
　上記式（１３）中、ｐは、０～３のいずれかの整数であることが好ましく、０～２のいずれかの整数であることがより好ましく、０又は１であることが更に好ましい。
　上記式（１３）中、ｑは、０～３のいずれかの整数であることが好ましく、０～２のいずれかの整数であることがより好ましく、０又は１であることが更に好ましい。
　上記式（１３）中、ｐ及び／又はｑが１以上である場合、Ｚ４とＺ５は、それぞれ独立して、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ等の分岐鎖側鎖を有するアミノ酸や、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等の側鎖に水酸基を有するアミノ酸や、塩基性アミノ酸や芳香族アミノ酸を含んでいてもよく、Ｌｅｕ又はＳｅｒであることが好ましい。
　上記式（１２）における、「Variable region」の好ましい例示としては、下記式（１３）～（１６）で表される構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　上記式（１３）～（１６）中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、ｎ１、Ｚ４、Ｚ５、ｐ、及びｑは、上記式（１）及び上記式（１１）で表される構造において記載するＸａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、ｎ１、Ｚ４、Ｚ５、ｐ、及びｑに関する前記と同義であり、上記式（１）及び上記式（１１）で表される構造において記載するＸａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、ｎ１、Ｚ４、Ｚ５、ｐ、及びｑとして記載する好ましい態様の任意の組み合わせを有する構造であり得る。
　上記式（１２）で表される環状ペプチドの好適な具体例としては、下記式（３）～（８）で表される構造のいずれかを有するものが挙げられる。ただし、下記式（３）～（８）において、上記式（１２）のＣｙｓに結合する（Ｘａａ’）ｒに該当する直鎖状構造部分は省略している。したがって、下記式（３）～（８）中、Ｓに結合するＣ（Ｃｙｓ）には、（Ｘａａ’）ｒが結合していてもよい（Ｘａａ’及びｒは、上記式（１２）のものと同義である。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 　上記式（３）～（８）中、Ａｃは－ＣＨ２－ＣＯ－であり、ＹはＬ－チロシンであり、ｙはＤ－チロシンである。上記式（３）～（５）の構造におけるアミノ酸配列を配列番号２０～２２に示す。
［環状ペプチドの製造方法］
　本発明の環状ペプチドは、無細胞翻訳系による翻訳合成法により好適に製造できる。
　環状ペプチドをコードする核酸を調製し、当該核酸を無細胞翻訳系で翻訳することによって調製することができる。環状ペプチドをコードする核酸は、生体の翻訳系で用いられる遺伝暗号、リプログラミングした遺伝暗号、又はこれらの組み合わせを用いて、当業者が適宜設計することができる。核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
　無細胞翻訳系を用いる方法によれば、非天然アミノ酸でアミノアシル化したｔＲＮＡを使用して、天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸をペプチドに効率よく導入することができる。例えば、本発明者らが開発した人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素フレキシザイムを用いれば、任意の天然又は非天然のアミノ酸で、任意のアンチコドンを有するｔＲＮＡをアミノアシル化することが可能である。したがって、この技術を用いて、ｍＲＮＡのトリプレットからなる遺伝暗号が、生体の翻訳系とは異なるアミノ酸をコードするように、リプログラミングすることができる（国際公開第２００８／０５９８２３号）。
［ペプチド複合体］
　本発明のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩は、２つの、本発明の環状ペプチドを含み、一方の環状ペプチドが他方の環状ペプチドとリンカーにより連結している。
　図１に示すように、ＢＤＮＦはＴｒｋＢの細胞外ドメインに結合し、ＴｒｋＢのホモ二量体化を引き起こし、ＴｒｋＢの自己リン酸化を介して下流のシグナル伝達を活性化することが知られている。
　本発明のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩は、上記のような構成を備えるため、ペプチド複合体中のそれぞれの環状ペプチドがＴｒｋＢの細胞外ドメインにそれぞれ結合し、ＴｒｋＢのホモ二量体化を引き起こすことができると考えられる。したがって、本発明のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩は、ＴｒｋＢの自己リン酸化を介して下流のシグナル伝達を活性化することができると考えられる。その結果、本発明のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩は、神経突起の分枝、ニューロンの生存、及び軸索の伸長等の種々の細胞応答を刺激することができると考えられる。したがって、本発明のペプチド複合体は、好ましくは、ＴｒｋＢのリン酸化を誘導するものである。
　本発明のペプチド複合体、又はその薬理学的に許容可能な塩が、ＴｒｋＢの細胞外ドメインに結合し、ＴｒｋＢのホモ二量体化を引き起こし、ＴｒｋＢの自己リン酸化を生じる場合、ペプチド複合体は、ｓｈｃ（ｓｒｃ相同ドメイン含有（src homology domain containing）タンパク質）及びＩＲＳ１／２（インスリン受容体基質１／２（insulin receptor substrate 1/2））等のＳＨ２（ｓｒｃ相同型２（src homology-type 2））リンカータンパク質の会合を誘導し、ＰＩ３Ｋ及びＥＲＫシグナル伝達経路の活性化をもたらす。
　本発明のペプチド複合体は、２つの、本発明の環状ペプチドを含み、一方の環状ペプチドが他方の環状ペプチドとリンカーにより連結していれば特に限定されず、２つの環状ペプチドは、同一であってもよく、異なっていてもよい。ＴｒｋＢのホモ二量体化を一層促進する観点から、ペプチド複合体中、２つの環状ペプチドが同一であることが好ましい。
　ペプチド複合体における、２つの環状ペプチドを繋ぐリンカーとしては、特に限定されず、ペプチド合成分野においてペプチド同士を繋ぐリンカーとして周知の構造のものを採用することができるが、長さが２０Å以上２００Å以下であるリンカーを用いることが好ましい。そのような態様によれば、ＴｒｋＢのホモ二量体化を一層促進することができる傾向にある。同様の観点から、リンカーの長さは、より好ましくは３０Å以上１５０Å以下であり、更に好ましくは４０Å以上１００Å以下である。
　ペプチド複合体における、２つの環状ペプチドを繋ぐリンカーの非限定的な例示としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマー、ペプチド、核酸、糖、及びこれらの組合せが挙げられる。
　ＰＥＧを含むリンカーとしては、２以上の官能基を有する小分子に、２つのＰＥＧがそれぞれ結合したものが挙げられ、非限定的な例示としては、２，３－ジアミノプロピオン酸のアミノ基にカルボン酸変性ＰＥＧが結合したものが挙げられる。
　ＰＥＧを含むリンカーにおいて、エチレングリコールの重合数は、２以上２０以下であってもよく、３以上１５以下であってもよく、４以上１０以下であってもよい。
［ペプチド複合体の製造方法］
　本発明のペプチド複合体は、上記のようにして得られる本発明の環状ペプチドを適当なリンカーによりつなぐことで、製造すればよい。
　本発明の環状ペプチドをリンカーでつなぐ工程は、リンカーの種類に応じて、リンカーとペプチドをつなぐ公知の方法、又はそれに準ずる方法を用いて、当業者が行うことができる。
　例えば、リンカーが上述のＰＥＧを含むリンカーである場合は、図２に示す方法により、２つの、本発明の環状ペプチドをリンカーでつなぐことができる。
　また、リンカーがペプチドである場合は、２つの、本発明の環状ペプチドをコードする核酸と、リンカーペプチドをコードする核酸とを連結し、本発明の環状ペプチドとリンカーペプチドの融合タンパク質を発現させてもよい。
　本発明における環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩は、ＴｒｋＢと高い親和性を有し、ＴｒｋＢと強力に結合することができ、ＴｒｋＢアゴニストとして作用することができる。
　また、本発明の環状ペプチドを含むペプチド複合体は、ＴｒｋＢの細胞外ドメインに結合することにより、ＴｒｋＢのホモ二量体化を引き起こし、それにより下流のＴｒｋＢシグナル伝達を選択的に誘起する。したがって、本発明のペプチド複合体は、神経突起の分枝、ニューロンの生存、及び軸索の伸長等の種々の細胞応答を刺激することができる。
　更に、本発明の環状ペプチドは、従来研究されてきた小分子のＴｒｋＢアゴニストと異なり、薬物動態学的特性、特に細胞透過性が低いため、既存の方法とは異なるアプローチで神経学的疾患に対する治療法、及び研究法を提供することができる。
［医薬組成物］
　本発明の医薬組成物は、環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、ペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つを含む。したがって、本発明の医薬組成物は、好ましくは、神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患の治療又は予防に用いられる。
　医薬組成物は、有効成分として環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、ペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つをそのまま用いてもよいし、医薬的に許容可能な添加剤等を加えて製剤化してもよい。
　医薬製剤の剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、及びパップ剤等が挙げられる。
　製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、及び抗酸化剤等の添加剤を適宜使用して、常法により行うことができる。
　製剤化に用いられる添加剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の医薬的に許容可能な有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、及びヒト血清アルブミン等が挙げられる。
　経粘膜吸収における吸収促進剤として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類、ラウリル硫酸ナトリウム、及びサポニン等の界面活性剤；グリココール酸、デオキシコール酸、及びタウロコール酸等の胆汁酸塩；ＥＤＴＡ及びサリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、及び混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体、Ｎ－アシルコラーゲンペプチド、Ｎ－アシルアミノ酸、シクロデキストリン類、キトサン類、並びに一酸化窒素供与体等を用いてもよい。
　錠剤又は丸剤は、糖衣、胃溶性、及び腸溶性物質等で被覆されたコート錠等であってもよい。
　液剤は、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びアルコール類等を含んでもよい。液剤は、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、及び防腐剤等を加えてもよい。
　本発明は、医薬組成物を、それを必要とする患者に投与して、患者における疾患を治療又は予防する方法も提供する。上記疾患は、神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患であってもよい。
　本発明の医薬組成物の投与量は、当業者が、それを必要とする患者の症状、年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、及び製剤の種類等に応じて、適宜決定することができる。
　患者は、哺乳動物であり、ヒトであることが好ましい。
　以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより具体的に説明する。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
［環状ペプチドの調製］
　環状ペプチドは、以下の手順によって調製した。
（環状ペプチドのライブラリーの調製、及びｈＴｒｋＢに結合する環状ペプチドの選択）
　２つのチオエーテル－環状ペプチドライブラリー（Ｌ－ライブラリー及びＤ－ライブラリー）は、フレキシブルインビトロ翻訳（ＦＩＴ）システムを用いて構築した。以前に報告された方法を用いて、Ｌ－ライブラリー、及びＤ－ライブラリーに、それぞれ、Ｎ－（２－クロロアセチル）－Ｌ－チロシン（Ｌ－ＣｌＡｃＴｙｒ）、及びＮ－（２－クロロアセチル）－Ｄ－チロシン（Ｄ－ＣｌＡｃＴｙｒ）を導入した（Kawakami, T.; Murakami, H.; Suga, H., Messenger RNA-programmed incorporation of multiple N-methyl-amino acids into linear and cyclic peptides. Chem Biol 2008, 15 (1), 32-42.;　Morimoto, J.; Hayashi, Y.; Suga, H., Discovery of macrocyclic peptides armed with a mechanism-based warhead: isoform-selective inhibition of human deacetylase SIRT2. Angew Chem Int Ed Engl 2012, 51 (14), 3423-7.;　Goto, Y.; Katoh, T.; Suga, H., Flexizymes for genetic code reprogramming. Nat Protoc 2011, 6 (6), 779-90.;　Hayashi, Y.; Morimoto, J.; Suga, H., In vitro selection of anti-Akt2 thioether-macrocyclic peptides leading to isoform-selective inhibitors. ACS Chem Biol 2012, 7 (3), 607-13.）。
　チオエーテル－環状ペプチドライブラリーに対応するｍＲＮＡライブラリーは、順に、Ｌ－ＣｌＡｃＴｙｒ又はＤ－ＣｌＡｃＴｙｒをコードするＡＵＧ開始コドン、ランダムなタンパク質性アミノ酸残基をコードする８～１５個のＮＮＫランダムコドン（ＮはＧ、Ｃ、Ａ又はＵ；ＫはＧ又はＵ）、ＣｙｓをコードするＵＧＣコドンを持つようにデザインされた。なお、インビトロでの翻訳の後、Ｎ末端にあるＴｙｒ残基のアセチルクロライド基と、下流のシステイン残基のスルフヒドリル基（チオール基）との間で、チオエーテル結合が自然に形成された。
　ヒトＴｒｋＢ（ｈＴｒｋＢ）に結合する環状ペプチドの選択（以下、「アフィニティー選択」ともいう。）は、ＲａＰＩＤ（random non-standard peptides integrated discovery）システムを用いて、Ｌ－ライブラリー、及びＤ－ライブラリーについて、それぞれ独立に行った（図３）（Hayashi, Y.; Morimoto, J.; Suga, H., In vitro selection of anti-Akt2 thioether-macrocyclic peptides leading to isoform-selective inhibitors. ACS Chem Biol 2012, 7 (3), 607-13.; Hipolito, C.J. & Suga, H. Ribosomal production and in vitro selection of natural product-like peptidomimetics: the FIT and RaPID systems. Curr Opin Chem Biol. 16, 196-203, 2012）。
　より詳細には、以下のようにして、環状ペプチドのライブラリーの調製、及びｈＴｒｋＢに結合する環状ペプチドの選択を行った。
　ｍＲＮＡライブラリー、並びに、ClAc-L-Tyr-tRNAfMet CAU、及びClAc-D-Tyr-tRNAfMet CAUは以前に報告されたように調製した（Hayashi, Y.; Morimoto, J.; Suga, H., In vitro selection of anti-Akt2 thioether-macrocyclic peptides leading to isoform-selective inhibitors. ACS Chem Biol 2012, 7 (3), 607-13.;　Hipolito, C.J. & Suga, H. Ribosomal production and in vitro selection of natural product-like peptidomimetics: the FIT and RaPID systems. Curr Opin Chem Biol. 16, 196-203, 2012）。
　４μＭのｍＲＮＡライブラリーを、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼを用いて１．５μＭのピューロマイシンリンカーと２５℃で３０分間連結した。上記ピューロマイシンリンカーのＤＮＡは、ｍＲＮＡライブラリーの３’末端定常領域に結合した。フェノール－クロロホルム抽出及びエタノール沈殿による精製後、１．２μＭの得られたｍＲＮＡ－ピューロマイシンコンジュゲートと、２５μＭのClAc-L-Tyr-tRNAfMet CAU、又はClAc-D-Tyr-tRNAfMet CAUとを用いて、メチオニン欠損ＦＩＴ系で、３７℃で３０分間翻訳した。次いで、反応物を２５℃で１２分間更にインキュベートすることで、ｍＲＮＡ－ペプチドコンジュゲートの形成を促進した。更に、２０ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下で、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、生成物をＲＮａｓｅ－Ｈマイナス型逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、４２℃で１時間逆転写することにより、環状ペプチドをｍＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドにタグ付けした。その後、緩衝液を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．４）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５ｖｏｌ％ｔｗｅｅｎ－２０を含むものに交換した。
　次いで、得られたペプチド－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡコンジュゲートライブラリーに対して、アフィニティー選択を行った。まず、対照選択として、ペプチド－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡコンジュゲートライブラリーをＨｉｓプルダウンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して３回通過させた（各通過は、４℃の条件下、１０分間行った。）。このプロセスは、プレクリアランス（ｐｒｅ－ｃｌｉａｒａｎｃｅ）又はネガティブ選択と呼ばれるものであり、望ましくないビーズ結合を除去するものである。次いで、プレクリアランスをしたペプチド－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡコンジュゲートライブラリーに対して、上記のビーズに２００ｎＭのＴｒｋＢの細胞外ドメインを固定化したものを用いて、４℃の条件下、３０分間アフィニティー選択を行った。このプロセスは、ポジティブ選択と呼ばれる。
　９５℃で５分間加熱することにより、ｃＤＮＡをビーズから溶出させ、溶出したｃＤＮＡの一部を、Ｓｙｂｒ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ及びサーマルサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ））を用いた定量的ＰＣＲにより評価した。残りのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、次のラウンドのアフィニティー選択に用いるｍＲＮＡライブラリーを転写するために用いた。
　ライブラリーの調製、プレクリアランス、及びポジティブ選択を１つのラウンドとして、当該ラウンドを５回行った。５回のラウンドの後、ｃＤＮＡの有意な濃縮が観察された（ポジティブ選択においてＴｒｋＢの細胞外ドメインをビーズ上に固定化しなかった場合との比較に対して。）（図４）。回収したｃＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅し、カラム（ヌクレオスピン（Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ））を用いて精製した後、ハイスループットシーケンサー（ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ））を用いて配列決定した。データ分析は、ソフトウェア（ＣＬＣシーケンスビューア７（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて行った。
　ＲａＰＩＤシステムによって選択された、ｈＴｒｋＢに結合する環状ペプチドを形成するペプチドの構造の一例を以下の表２、３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
 　ただし、表２の配列中、最左端のＭはＬ－ＣｌＡｃＴｙｒであり、その他の英文字は、アミノ酸の１文字表記に拠るアミノ酸を示す。表２のペプチドにおいて、最左端のＬ－ＣｌＡｃＴｙｒと、下流の最初のシステイン残基との間でチオエーテル結合が形成された。各ペプチドの下流におけるＧＳＧＳＧＳ配列は、環状構造に結合する直鎖状構造であり、あってもなくてもよい。表２中のペプチドは、上から順に、それぞれ配列番号１～１３に対応する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
 　ただし、表３の配列中、最左端のＭはＤ－ＣｌＡｃＴｙｒであり、その他の英文字は、アミノ酸の１文字表記に拠るアミノ酸を示す。表３のペプチドにおいて、最左端のＤ－ＣｌＡｃＴｙｒと、下流の最初のシステイン残基との間でチオエーテル結合が形成された。各ペプチドの下流におけるＧＳＧＳＧＳ配列は、環状構造に結合する直鎖状構造であり、あってもなくてもよい。
（環状ペプチドの化学合成）
　配列が決定された環状ペプチドの中から、Ｌ－ライブラリー及びＤ－ライブラリーのそれぞれにおいて最も割合の多かった３つを化学合成により得た。すなわち、公知の方法に準拠して、Ｓｙｒｏ　Ｗａｖｅ自動化ペプチド合成機（Ｂｉｏｔａｇｅ）を用い、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって環状ペプチドの合成を行った（Ito, K. et al. Artificial human Met agonists based on macrocycle scaffolds. Nature Communications 6, 6372, 2015）。
　具体的には、各ペプチドの自動合成後、得られた生成物に対し、環状化のためのクロロアセチル基をN末端アミド基に結合させた。９２．５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％の水、２．５％のトリイソプロピルシラン、及び２．５％のエタンジチオールの溶液によってペプチドを固相から切断し、ジエチルエーテルで沈殿させた。環化反応を実施するために、ペプチドペレットを、ＤＭＳＯを含む１０ｍｌのトリエチルアミンに溶解し、２５℃で１時間インキュベートした。反応溶液にＴＦＡを添加して、ペプチド懸濁液を酸性化し、環化反応を停止した。
　続いて、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ　ＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｚｕ）を用いて、線形グラジエント条件で逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）にかけることによりペプチドを精製した。０．１％ＴＦＡを含む水を含む移動相Ａに、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルである移動相Ｂを混合させて、グラジエントを実現した。精製したペプチドを真空中で凍結乾燥し、ＡｕｔｏＦｌｅｘ　ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を行うことにより分子量を確認した。
　ＲａＰＩＤシステムによって選択され、化学合成された、ｈＴｒｋＢに結合する環状ペプチドの構造を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
 　表中、Ａｃは－ＣＨ２－ＣＯ－であり、ＹはＬ－チロシンであり、ｙはＤ－チロシンを意味する。また、「Ａｂｕｎｄａｎｃｅ」は、アフィニティー選択で得られたＬ－ペプチド、又はＤ－ペプチドの総計に対する当該ペプチドが占める割合を示しており、数値が高いほど、そのペプチドのＴｒｋＢとの結合力が強いことを示唆するものである。
［環状ペプチドの評価］
　上述のようにして得られた環状ペプチドＴｒｂＬ１～３、及びＴｒｂＤ１～３について、活性試験を行った。
（ｈＴｒｋＢに対する親和性の評価）
　Ｈｉｓ６－ｔａｇを介してセンサーチップ上に固定化されたｈＴｒｋＡ、ｈＴｒｋＣ、及びｈＴｒｋＢ（以下、これらを総称として「ｈＴｒｋＡ－Ｃタンパク質」ともいう。）の細胞外ドメインに対する環状ペプチドの結合動態（結合親和性（解離定数）ＫＤ）について、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した定量測定を行うことにより、ｈＴｒｋＡ及びｈＴｒｋＣに対する、ｈＴｒｋＢと環状ペプチドとの結合の強度及び選択性を評価した。
　ｈＴｒｋＡ－Ｃタンパク質に対する各ペプチドの結合動態は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。０．１ｖｏｌ％ＤＭＳＯおよび１ｍＭ　ｂ－ドデシル－マルトシドを含有するＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、及び０．０５ｖｏｌ％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ　７．４）を緩衝液として用いた。１００ｎＭ　ｈＴｒｋＡ－Ｃタンパク質は、製造元の説明書に従って、Ｎｉ２＋処理ＮＴＡチップ上に固定化された（ベースライン応答１０００～３０００屈折単位）。流速６０ｍＬ・ｍｉｎ－１で、ペプチドをアナライトとして注入し、１：１結合モデルを用いて結合動態をモデル化した。
　各環状ペプチド（ＴｒｂＬ１～３、及びＴｒｂＤ１～３）のｈＴｒｋＢに対するＳＰＲ応答を図５に、ｈＴｒｋＡ－Ｃタンパク質に対する結合親和性ＫＤを表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　表中、「Ｎ．Ｂ．」はnon-binding、すなわち、ｈＴｒｋＡ－Ｃタンパク質が１－１０００ｎＭである範囲において、ＳＰＲ応答が検出されなかったことを意味する。
　全てのペプチド（ＴｒｂＬ１～３、及びＴｒｂＤ１～３）について、ｈＴｒｋＢに対するＫＤ値は１．５～７０ｎＭであり、全てのペプチド（ＴｒｂＬ１～３、及びＴｒｂＤ１～３）がｈＴｒｋＢに対して強力な親和性を示した。中でも、３つのペプチド（ＴｒｂＬ１、ＴｒｂＬ３、及びＴｒｂＤ２）は、ｈＴｒｋＢに対して高い選択性を示し、ｈＴｒｋＡ及びｈＴｒｋＣに対して、ＳＰＲによるシグナルを示さなかった。特に、ＴｒｂＬ３はｈＴｒｋＢに対するＫＤが１．５ｎＭであり、非常に高いｈＴｒｋＢ選択性を有していた。
［ペプチド複合体の調製］
　上述のようにして得られた環状ペプチドＴｒｂＬ１～３、及びＴｒｂＤ１～３に関して、これらの環状ペプチドを含むペプチド複合体（ホモ二量体ペプチド）を、以下の手順によって調製した。
　以下、ＴｒｂＬ１～３、及びＴｒｂＤ１～３の各々をリンカーにより二量体化したペプチド複合体（ホモ二量体ペプチド）を、ＴｒｂＬ１～３、及びＴｒｂＤ１～３に対し、それぞれＤｉＴｒｂＬ１～３、及びＤｉＴｒｂＤ１～３と称する。
　全ての二量体ペプチドは、以前に報告されたように、Ｓｙｒｏ　Ｉ自動ペプチド合成機（Ｂｉｏｔａｇｅ）によって、従来のＦｍｏｃベースのＳＰＰＳを用いて合成した（Bashiruddin, N. K.; Matsunaga, Y.; Nagano, M.; Takagi, J.; Suga, H., Facile Synthesis of Dimeric Thioether-Macrocyclic Peptides with Antibody-like Affinity against Plexin-B1. Bioconjug Chem 2018, 29 (6), 1847-1851.）（図２）。
　図２中、Ｆｍｏｃ－ＤＡＰ（Ｆｍｏｃ）、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－（ＰＥＧ）５－ＣＯＯＨリンカー、及び他のＦｍｏｃ－保護アミノ酸のカップリングは、ＤＭＦを吸収したＮｏｖａＰＥＧ　Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ樹脂上で、ＤＭＦ中、０．５Ｍ　Ｆｍｏｃ－保護アミノ酸、０．５Ｍ　ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、及び０．５Ｍ　ＤＩＰＥＡの存在下で、行った。ＤＭＦによる３回のプログラム洗浄の後、Ｆｍｏｃ－脱保護を、ＤＭＦ中の４０％ピペリジンによる３０分間のＲＴ処理によって実施した。二重カップリングを全ての段階に使用した。全てのアミノ酸をカップリングした後、ＤＭＦ中の０．２Ｍクロロアセチル－ＮＨＳを用いて、各ペプチドのＮ末端にクロロアセチル基を付加した。この工程を２回繰り返し、次いで、３回のＤＭＦ洗浄、６回のＤＣＭ洗浄、及び真空乾燥を行った。次いで、乾燥したペプチド結合樹脂を全体的に脱保護（Global deprotection）し、予め冷却したＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９２．５：２．５：２．５：２．５）混合物中にて室温で１時間処理することにより、二量体ペプチドを樹脂から切断した。脱保護溶液を冷却ジエチルエーテルで沈殿させ、ペレットをヒュームフード中で乾燥した。
　これらのペレットを、０．１％ＴＦＡを有するＤＭＳＯに溶解した後、溶液が塩基性（Ｈ２Ｏ及びｐＨインジケーターペーパーを用いて確認した。）になるまでＴＥＡを添加して、ペプチドの環化を誘導した。塩基性条件下、室温で３０分環化させた後、ペプチドの質量及び環化の完了をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析機（ＡｕｔｏＦｌｅｘ　ＩＩ　（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ））により確認した。
　ペプチドの質量及び環化の完了を確認した後、ペプチド溶液をＴＦＡにより酸性状態に戻し（Ｈ２Ｏ及びｐＨインジケーターペーパーを用いて確認した。）、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ　ＯＤＣカラムに接続したＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ　ＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｚｕ）を用いて、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）にかけることによりペプチドを精製した。流速を２５ｍＬ／分、グラジエントを脱イオン化Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ含有）中、３２分間で１０－７０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ含有）とした。
　これにより、ＴｒｂＬ１～３、及びＴｒｂＤ１～３の各々がＰＥＧ５－ＤＡＰ－ＰＥＧ５リンカー（長さ５８Å）により二量体化されたペプチド複合体（ホモ二量体ペプチド）である、ＤｉＴｒｂＬ１～３、及びＤｉＴｒｂＤ１～３を得た。
［ペプチド複合体の評価方法］
　上述のようにして得られたペプチド複合体について、各種活性試験を行った。各種活性試験の詳細は以下の通りであった。
（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：結合動態（結合親和性ＫＤ）の評価）
　環状ペプチド（ＴｒｂＬ１～３、及びＴｒｂＤ１～３）に代えて、ペプチド複合体（ＤｉＴｒｂＬ１～３、及びＤｉＴｒｂＤ１～３）を用いたこと以外は、環状ペプチドの結合動態（結合親和性ＫＤ）を評価した上述の方法と同様にして、各ペプチド複合体（ＤｉＴｒｂＬ１～３、及びＤｉＴｒｂＤ１～３）の結合動態（結合親和性ＫＤ）を評価した。
（ウェスタンブロッティング法）
　ＤＩＶ６（6 days in vitro）の海馬ニューロンを、ＤＭＳＯ、ＢＤＮＦ、又はペプチド複合体（ＤｉＴｒｂＬ３）で、１５分間処理した。ＡＮＡ－１２（１００μＭ）は、ＢＤＮＦ、又はペプチドの処理の３０分前に添加した。
　細胞を０．１Ｍ　ＰＢＳで２回洗浄した後、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．４）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０、０．５％Ｎａ－デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ　ＮａＦ、０．２ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液中、氷上で、３０分間細胞を溶解させた。超音波処理、及び２０，０００×ｇでの３０分間の遠心分離の後、上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに用いた。タンパク質量はＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｋｉｔ（ＢＣＡ－１、Ｓｉｇｍａ）で定量した。
　細胞溶解物（タンパク質量：Ｐ－ＴｒｋＢで２０μｇ、ＴｒｋＢで１０μｇ、Ａｋｔ及びＥｒｋで５μｇ）を、８％ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，　ＵＳＡ）に移した。当該膜をブロッキング緩衝液（０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０を含む、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ））で１時間ブロックした後、一次抗体（ウサギ抗ＴｒｋＢ抗体、１：１，０００希釈、Ｃａｔ＃４６０３；ウサギ抗リン酸化Ｔｒｋ抗体、１：１，０００希釈、Ｃａｔ＃９１４１；マウス抗ｐａｎ－Ａｋｔ抗体、１：２，０００希釈、Ｃａｔ＃２９２０；ウサギ抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓ４７３）抗体、１：２，０００希釈、Ｃａｔ＃４０６０；ウサギ抗Ｅｒｋ１／２抗体、１：２，０００希釈、Ｃａｔ＃４６９５；マウス抗リン酸化Ｅｒｋ１／２抗体、１：２，０００希釈、Ｃａｔ＃９１０６（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を含むブロッキング緩衝液中で、４℃で、一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで１０分間の洗浄を４回した後、当該膜を二次抗体（ペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、１：１０，０００希釈、Ｃａｔ＃１１１－０３５－００３（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；ペルオキシダーゼと結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体、１：１０，０００希釈、Ｃａｔ＃ＮＡ９３１０（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））と共に室温で１時間インキュベートした。
　最後に、当該膜をＴＢＳＴで洗浄した後、Ｌｕｍｉｎａｔａ　Ｃｒｅｓｃｅｎｄｏ　ＨＰＲ　基質（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた化学発光法により、免疫陽性バンドを検出した。各キナーゼの相対的リン酸化レベルは、リン酸化キナーゼ／全キナーゼの比として計算した。
（リン酸化ＲＴＫアレイ評価）
　ＤＩＶ６の海馬ニューロンを、ＤＭＳＯ、ＢＤＮＦ（０．１ｎＭ）、又はＤｉＴｒｂＬ３（１ｎＭ）と共に３７℃、５％ＣＯ２で１５分間インキュベートした。ＡＮＡ－１２（１００μＭ）は、ＤｉＴｒｂＬ３処理の３０分前に添加した。リン酸化チロシンキナーゼ受容体の包括的調査を、製造元のプロトコル（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｐｒｏｆｉｌｅｒ　マウス　Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＲＴＫ　Ａｒｒａｙ　Ｋｉｔ，ＡＲＹ０１４，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、リン酸化ＲＴＫアレイを用いて実施した。リン酸化レベルは、画素強度によって評価し、Ｉｍａｇｅ　Ｊソフトウェアによって定量した。
（ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲ）
　ＤＩＶ６の初代培養皮質ニューロンをＢＤＮＦ、又はペプチド複合体（ＤｉＴｒｂＬ３）で１時間処理した後、ＳＶ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｚ３１０５、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて初代培養ニューロンから全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びホルムアルデヒドゲル中の電気泳動で、定量的及び定性的に検証した。
　次に、Ｓｕｐｅｒ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写した。定量的ＰＣＲは、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲシステムを用いて、以前に報告された方法で実施した（Akashi, M.; Takumi, T., The orphan nuclear receptor RORalpha regulates circadian transcription of the mammalian core-clock Bmal1. Nat Struct Mol Biol 2005, 12 (5), 441-8.）。内部対照としてＧａｐｄｈ遺伝子を用いた。以下のプライマー配列をそれぞれ用いた：Gapdh（Forward: 5'-ACGGAAGCTCACTCAGGCATGCATGCCTT-3'、及びreverse: 5'-CATGAGGTCCCCCCACCCTGTTTGCTGCTG-3'）（それぞれ、配列番号１４及び１５に示す。）、c-fos（Forward: 5'-AGTTTTCTCTACTACTACTACATCC-3'、及びreverse: 5'-AAAAGTTGGCACTAGACGACGACGACGAC-3'）（それぞれ、配列番号１６及び１７に示す。）、Arc（Forward: 5'-GGTGAGCTGACTGACCAAAT-3'及びreverse: 5'-TTCACTGGTATCATCACTGATCACTGCTGCTG-3'）（それぞれ、配列番号１８及び１９に示す。）。
（軸索伸長の評価のための免疫細胞化学）
　ＤＩＶ０の海馬初代ニューロンを、ＤＭＳＯ、ＢＤＮＦ、又はＤｉＴｒｂＬ３ペプチドで処理し、ＤＩＶ３で免疫細胞化学分析を行った。
　細胞を０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／４％ショ糖（０．１Ｍ　ＰＢＳ中）で１５分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３分間透過処理し、非特異的結合を防止するためにブロッキング溶液（５％正常ヤギ血清を含むＰＢＳＴ）と共に１時間インキュベートした。続いて、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体（ウサギ抗Ｔａｕポリクローナル抗体、１：１，０００希釈；ｃａｔ＃ａｂ６４１９３（ａｂｃａｍ）；マウス抗ＭＡＰ２モノクローナル抗体、１：１，０００希釈、Ｍ４４０３（Ｓｉｇｍａ））と共に、細胞を４℃で一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳＴで１０分間、４回洗浄した後、ブロック溶液で希釈した蛍光標識二次抗体（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、１：１，０００希釈、Ａ－１１０２９；Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、１：１，０００希釈、Ａ－２１０６９（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））と共に、室温で２時間インキュベートした。
　次に、細胞をＰＢＳＴで１０分間、４回洗浄した後、ＤＡＰＩ（Ｈ－１２００（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤでマウントし、２０倍の対物レンズを有するバーチャルスライド顕微鏡システム（ＶＳ１２０（Ｏｌｙｍｐｕｓ））を用いて画像を得た。ＩｍａｇｅＪソフトウェアのニューロンＪプラグインを用いて画像を解析し、神経突起長のトレースと定量を行った（Meijering, E.; Jacob, M.; Sarria, J. C.; Steiner, P.; Hirling, H.; Unser, M., Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A 2004, 58 (2), 167-76.）。
（統計手法）
　統計解析はＳｔａｔＶｉｅｗ　５．０（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　Ｃａｒｙ，　ＮＣ，　ＵＳＡ）により行った。データを一方向ＡＮＯＶＡで分析し、事後比較（post hoc comparison）としてＴｕｋｅｙ／Ｋｒａｍｅｒ検定を行った。有意基準はｐ＜０．０５とした。
［ペプチド複合体の評価結果］
　上述のようにして得られたペプチド複合体について、上述の各方法を用いて、各種活性試験を行った。
（ｈＴｒｋＢに対する親和性の評価）
　上記（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：結合動態（結合親和性ＫＤ）の評価）に記載の方法を用いて、ＤｉＴｒｂＬ１～３、及びＤｉＴｒｂＤ１～３のｈＴｒｋＡ－Ｃタンパク質の細胞外ドメインに対するペプチド複合体の結合動態（結合親和性ＫＤ）を測定した。これにより、ｈＴｒｋＡ及びｈＴｒｋＣに対する、ｈＴｒｋＢとペプチド複合体との結合の強度及び選択性を評価した。
　各ペプチド複合体（ＤｉＴｒｂＬ１～３、及びＤｉＴｒｂＤ１～３）のｈＴｒｋＢに対するＳＰＲ応答を図６に、ｈＴｒｋＡ－Ｃタンパク質に対する結合親和性ＫＤを表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　表中、「Ｎ．Ｂ．」はnon-binding、すなわち、ｈＴｒｋＡ－Ｃタンパク質が１－１００ｎＭである範囲において、ＳＰＲ応答が検出されなかったことを意味する。
　予想されるように、各ペプチド複合体（ＤｉＴｒｂＬ１～３、及びＤｉＴｒｂＤ１～３）のｈＴｒｋＢに対する結合親和性ＫＤは、単量体形態（環状ペプチド）の場合と実質的に同じであり、これはｈＴｒｋＢに結合する能力が二量化により変化しなかったことを示す。
　驚くべきことに、ｈＴｒｋＢに対する選択性は、二量体化によって有意に変化した。６つのペプチドのうちの４つは、ｈＴｒｋＣに結合しなかったか、又は弱く結合した（ＤｉＴｒｂＤ１）一方で、ｈＴｒｋＡには強く結合した。他方、最も強力なｈＴｒｋＢ結合剤であるＤｉＴｒｂＬ３は、ｈＴｒｋＢに対する高い選択性を保持し、ｈＴｒｋＡ及びｈＴｒｋＣに対する結合はＳＰＲセンサーチップ上に観測されなかった。
（ＴｒｋＢのリン酸化の誘導能の評価）
　最もＴｒｋＢへの選択性が高かったＤｉＴｒｂＬ３について、マウス初代培養海馬ニューロンにおいてマウスＴｒｋＢのリン酸化を誘導させることにより、ＴｒｋＢに対するアゴニスト活性を調べた。具体的には、陽性対照実験として天然タンパク質アゴニストであるＢＤＮＦ（０．１ｎＭ、１５分間）を、陰性対照実験としてＤＭＳＯ溶液を用いて、１ｎＭのＤｉＴｒｂＬ３が、ＴｒｋＢのリン酸化を誘導するか否かを確かめた。具体的には、抗リン酸化Ｔｒｋ抗体を用いて、上記（ウェスタンブロッティング法）に記載の方法によりＴｒｋＢのリン酸化が誘導されているか否かを確かめた。
　天然タンパク質アゴニストであるＢＤＮＦの外因性適用がＴｒｋのリン酸化を誘導することが明確に検出された（図７（ａ）、レーン２）。一方、陰性ＤＭＳＯ対照はＴｒｋのリン酸化を全く誘導しなかった（図７（ａ）、レーン１）。１ｎＭの濃度でのＤｉＴｒｂＬ３の外因性適用は、当該濃度においてＴｒｋＢのリン酸化を誘導することができることを見出した（図７（ａ）レーン３）。
　海馬ニューロンではＴｒｋＡは通常発現しないが、本解析（ウェスタンブロット法）で用いた抗リン酸化Ｔｒｋ抗体は、ＴｒｋＢだけでなくＴｒｋＡ及びＴｒｋＣも認識するため、以下のようにして、ＤｉＴｒｂＬ３がＴｒｋＢのリン酸化の誘導に対して特異性を有することを確かめた。
　具体的には、ＴｒｋＢの細胞内触媒ドメインに対する特異的キナーゼ阻害剤ＡＮＡ－１２を用いたこと以外は上記と同様にして、抗リン酸化Ｔｒｋ抗体を用いたウェスタンブロット法を実施した。
　海馬ニューロンに対するＡＮＡ－１２の処理は、ＤｉＴｒｂＬ３によって誘導されるＴｒｋのリン酸化を減少させた（図７（ｂ）、レーン３対レーン４）。このことは、ＤｉＴｒｂＬ３が選択的にＴｒｋＢのリン酸化を誘発することを示唆している。ＤｉＴｒｂＬ３の用量滴定におけるＴｒｋＢリン酸化の定量分析は、ＤｉＴｒｂＬ３がナノモル以下の濃度（０．２ｎＭ、ｐ＜０．０１）であっても、明らかにＴｒｋＢのリン酸化を誘導することを明らかにした（図７（ｃ））。
　ＤｉＴｒｂＬ３のｈＴｒｋＢへの選択的結合に対するｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価及び上記の細胞アッセイと合わせて考えると、ＤｉＴｒｂＬ３は、ＴｒｋＢリン酸化に対する選択的アゴニストであると考えられ、マウス及びヒトのＴｒｋＢタンパク質の両方に対して交差反応性を示すことがわかった。
（ＴｒｋＢの下流のシグナル伝達キナーゼの活性化についての評価）
　上記（ＴｒｋＢのリン酸化の誘導能の評価）と同様に、上記（ウェスタンブロッティング法）に記載の方法を用いて、ＴｒｋＢの下流のシグナル伝達キナーゼがＤｉＴｒｂＬ３の外因性処理によって活性化されるかどうかを調べた。
　予想されたように、ＤｉＴｒｂＬ３は初代培養海馬ニューロンにおけるＡｋｔ及びＥｒｋ１／２のリン酸化を劇的に活性化し（図８（ａ）及び（ｂ）、レーン３）、ＡＮＡ－１２の存在下ではそのリン酸化活性は低下した（図８（ａ）及び（ｂ）、レーン４）。これは、下流のシグナル伝達がＴｒｋＢに依存することを強く示唆する。
　定量的結果は、Ａｋｔ及びＥｒｋ１／２の活性化について、ＤＭＳＯ及びＤｉＴｒｂＬ３の誘導間で有意な違いを示した（図８（ｃ）－（ｅ），ｐ＜０．０１）。更に、これらのキナーゼのリン酸化はＡＮＡ－１２処理によって抑制され（図８（ｃ）－（ｅ）、Ａｋｔでｐ＜０．０５、Ｅｒｋ１／２でｐ＜０．０１）、下流のシグナル伝達カスケードがＤｉＴｒｂＬ３によって開始され、ＴｒｋＢの自己リン酸化を誘導することが示唆された。
　また、他の受容体チロシンキナーゼによるＤｉＴｒｂＬ３のオフターゲット活性を、上記（リン酸化ＲＴＫアレイ評価）に記載した方法、すなわち、４０種類の異なるＲＴＫを含むアレイベースの実験により測定した。
　ＢＤＮＦと初代培養海馬ニューロンを１時間インキュベートすると、ＴｒｋＢのリン酸化が起こった（図９、左下）。この観察結果と非常によく似て、ＤｉＴｒｂＬ３はＴｒｋＢのみをリン酸化した（図９、右上）。更に、ＡＮＡ－１２処理したサンプルについて、ＲＴＫアレイ及びそのデンシトメトリー分析の両方において、ＤｉＴｒｂＬ３によって誘導されるＴｒｋＢリン酸化のシグナルが低下した（図９、右下、及び図１０）。
　以上の結果から、ＤｉＴｒｂＬ３が特異的なＴｒｋＢアゴニストであることが強く証明される。
（ＤｉＴｒｂＬ３処理によるニューロン遺伝子の活性化誘導、及び軸索伸長の促進）
　ＢＤＮＦがｃ－ｆｏｓやＡｒｃのような前初期遺伝子に応答するシナプス可塑性の調節に重要な役割を果たしていることから、ＤｉＴｒｂＬ３の処理下でのｃ－ｆｏｓ及びＡｒｃのｍＲＮＡ発現レベルを定量した。
　初代培養皮質ニューロンをＢＤＮＦ（１ｎＭ）、又はＤｉＴｒｂＬ３（１ｎＭ）で１時間処理した後、上記（ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲ）に記載の方法で、ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲ測定を行った。その結果、ｃ－ｆｏｓ及びＡｒｃの発現が、ＤｉＴｒｂＬ３処理により有意に上昇した（図１１，ｐ＜０．０１）。
　次に、初代培養ニューロンに対するＤｉＴｒｂＬ３処理の細胞レベルの効果を検証した。上記（軸索伸長の評価のための免疫細胞化学）に記載の方法により、初代培養ニューロンをＤｉＴｒｂＬ３で３日間処理すると、ＢＤＮＦ処理と同様に、初代培養ニューロンの軸索長が伸長した（図１２（ａ））。定量的結果は、１０ｎＭ及び１００ｎＭのＤｉＴｒｂＬ３が軸索伸長を有意に増強することを示した（図１２（ｂ）、ＤＭＳＯ処理と比較、ｐ＜０．０１）。

Claims (14)

  1. 　下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（１）中、
    　Ｘａａ１は、塩基性アミノ酸であり、
    　Ｘａａ２は、任意のアミノ酸であり、
    　Ｘａａ３、及びＸａａ４は、各々独立に、塩基性アミノ酸、又は芳香族アミノ酸であり、
    　ｎ１は、０～１０の整数を示す。）
    　で表される構造を含む、環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
  2. 　前記式（１）で表される構造は、下記式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（２）中、
    　Ｘａａ２及びｎ１は、前記と同義である。）
    で表される構造のいずれかである、請求項１に記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
  3. 　前記環状ペプチドの環状構造がＮ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造を含む、請求項１又は２に記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
  4. 　前記Ｎがチロシンのアミノ基に由来する、請求項３に記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
  5. 　前記Ｓがシステインのチオール基に由来する、請求項３又は４に記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
  6. 　前記環状ペプチドの環状構造を形成するアミノ酸残基の数が、６～２０個である、請求項１～５のいずれか１項に記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
  7. 　下記式（３）～（８）で表される環状構造のいずれか１つを含む、環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （式（３）～（８）中、Ａｃは－ＣＨ２－ＣＯ－であり、ＹはＬ－チロシンであり、ｙはＤ－チロシンである。）
  8. 　前記環状ペプチドが更に１～２０のアミノ酸で構成される直鎖状構造を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の環状ペプチド、又はその薬理学的に許容可能な塩。
  9. 　２つの請求項１～７のいずれか１項に記載の環状ペプチドを含み、一方の環状ペプチドが他方の環状ペプチドとリンカーにより連結している、ペプチド複合体、又はその薬理学的に許容可能な塩。
  10. 　前記２つの環状ペプチドが同一である、請求項９に記載のペプチド複合体、又はその薬理学的に許容可能な塩。
  11. 　前記リンカーの長さが２０Å以上２００Å以下である、請求項９又は１０に記載のペプチド複合体、又はその薬理学的に許容可能な塩。
  12. 　ＴｒｋＢのリン酸化を誘導する、請求項９～１１のいずれか１項に記載のペプチド複合体、又はその薬理学的に許容可能な塩。
  13. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の環状ペプチド、及びその薬理学的に許容可能な塩、並びに、請求項９～１２のいずれか１項に記載のペプチド複合体、及びその薬理学的に許容可能な塩からなる群より選択される少なくとも１つを含む、医薬組成物。
  14. 　神経変性疾患、神経発達障害、又は神経精神疾患の治療又は予防に用いられる、請求項１３に記載の医薬組成物。
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