WO2021230705A1 - 신규 재조합 융합단백질 및 그의 용도 - Google Patents

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WO2021230705A1
WO2021230705A1 PCT/KR2021/006069 KR2021006069W WO2021230705A1 WO 2021230705 A1 WO2021230705 A1 WO 2021230705A1 KR 2021006069 W KR2021006069 W KR 2021006069W WO 2021230705 A1 WO2021230705 A1 WO 2021230705A1
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fusion protein
protein
bispecific fusion
glp
amino acid
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PCT/KR2021/006069
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최보경
진현탁
남은주
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주식회사 프로젠
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Definitions

  • the present invention relates to a novel recombinant fusion protein and its use, and specifically, to a recombinant bispecific fusion protein comprising a glucagon-like peptide 2 analog, and use of the fusion protein for treatment and prevention of inflammatory bowel disease or short bowel syndrome is about
  • GLP-2 is a 33 aa peptide corresponding to amino acid positions 126-158 of proglucagon and is produced by enzymatic cleavage of proglucagon (Drucker, Endocrinol. 142(2): 521-527, 2001). GLP-2 binds to GLP-2R, a member of the gut-expressed G-protein-coupled receptor superfamily (Monroe et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1569-1573, 1999). GLP-2 has a half-life in serum of only 7 minutes due to cleavage by dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV) and clearance by the kidney (Brubaker, Endocrinol .
  • DPP-IV dipeptidyl peptidase-IV
  • Teduglutide has been approved for marketing by the US FDA in several rodent models and clinical trials in patients with short bowel syndrome (Kochar and Herfarth, Expert Opin. Drug Saf ., 17(7): 733-739, 2018). However, since the in vivo half-life of teduglutide is still short, it has a problem that it must be administered frequently.
  • GLP-2-Mimetibody, etc. fused with the Fc domain of IgG has been developed to further extend the half-life of Teduglutide (US7812121B2).
  • GLP-2 is known to form a dimer by non-covalent bonding again between the dimer upon fusion with the Fc domain, which has the disadvantage of reducing the yield of protein production.
  • IL-10 is also known as cytokine synthesis inhibitory factor (CSIF) as one of the cytokines.
  • IL-10 is an anti-inflammatory cytokine and synthesizes pro-inflammatory cytokines such as IFN- ⁇ , IL-2, IL-3, TNF ⁇ and GM-CSF produced by macrophages and Th1 T cells.
  • pro-inflammatory cytokines such as IFN- ⁇ , IL-2, IL-3, TNF ⁇ and GM-CSF produced by macrophages and Th1 T cells.
  • Th2 T cells and mast cells are known to activate certain immune cells. Because of this immunosuppressive activity, clinical trials for the use of recombinant IL-10 for the treatment of various autoimmune diseases are being attempted, but, contrary to expectations, recombinant human IL-10 is used in Crohn's disease (Schreiber et al ., Gastroenterol.
  • An object of the present invention is to solve various problems, including the above-mentioned problems, and to provide a novel recombinant fusion protein capable of more efficiently treating inflammatory bowel disease or short bowel syndrome, and uses thereof.
  • the protection scope of the present invention is not limited to the above purpose.
  • a recombinant bispecific fusion protein in which GLP-2 or an analog thereof is linked to an IL-10 protein.
  • a recombinant bispecific fusion protein in which GLP-2 or an analog thereof is linked to the N-terminus of the antibody Fc region and IL-10 protein is linked to the C-terminus of the antibody Fc.
  • a bispecific fusion protein dimer produced by dimerization of the recombinant bispecific fusion protein.
  • a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • composition for treating and preventing inflammatory bowel disease comprising the recombinant bispecific fusion protein or the bispecific fusion protein dimer as an active ingredient.
  • composition for treating and preventing short bowel syndrome comprising the recombinant bispecific fusion protein or the bispecific fusion protein dimer as an active ingredient.
  • a method of treatment comprising administering a therapeutically effective amount of the bispecific fusion protein or the bispecific fusion protein dimer to the subject suffering from inflammatory bowel disease.
  • a method of treating short bowel syndrome in an individual comprising administering a therapeutically effective amount of the bispecific fusion protein or the bispecific fusion protein dimer to an individual suffering from short bowel syndrome this is provided
  • the recombinant dual specificity fusion protein according to an embodiment of the present invention properly exerts the function of GLP-2 and has an increased in vivo half-life, and has immunomodulatory functions such as inhibition of inflammation, short bowel syndrome and various inflammatory bowel diseases. can be used as a treatment for
  • FIG. 1 is a schematic diagram schematically showing the structure of a dual specificity fusion protein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an SDS-PAGE gel photograph (left) showing the production result of the fusion protein (PG-72) prepared according to an embodiment of the present invention and the image analysis program (Image J) for the left gel photograph of the protein. It is a figure (right) showing the result of measuring purity.
  • FIG. 3 is an SDS-PAGE gel photograph (left) showing the production result of the fusion protein (PG-73) prepared according to an embodiment of the present invention and the image analysis program (Image J) for the left gel photograph of the protein. It is a figure (right) showing the result of measuring purity.
  • FIGS. 2 and 3 are analysis diagrams showing the analysis results for the cleaved form of the fusion protein from the results of FIGS. 2 and 3 .
  • FIG. 5 is a SDS-PAGE gel photograph (left) and size exclusion high performance liquid chromatography (SEC-HPLC) results showing the production results of the dual specificity fusion protein (PG-210-5) prepared according to an embodiment of the present invention; (right) is shown.
  • FIG. 6 is a SDS-PAGE gel photograph (left) and size exclusion high performance liquid chromatography (SEC-HPLC) results showing the production results of the dual specificity fusion protein (PG-210-6) prepared according to an embodiment of the present invention; (right) is shown.
  • Figure 7a is a photograph showing the result of performing SDS-PAGE analysis after primary purification of the dual specificity fusion protein (PG-210-8) prepared according to an embodiment of the present invention by Protein A affinity chromatography;
  • Figure 7b is a chromatogram showing the result of analyzing the first purified fusion protein (PG-210-8) by HPLC analysis,
  • Figure 7c is the size exclusion of the first purified fusion protein (PG-210-8)
  • SEC-HPLC high performance liquid chromatography
  • FIG. 7d is a chromatogram showing the result of high performance liquid chromatography to confirm the purity of the secondary purified fusion protein.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of analyzing the GLP-2 activity of the dual specificity fusion proteins (PG-210-5 and PG-210-6) according to an embodiment of the present invention by cAMP Hunter TM eXpress GPCR assay.
  • the graphs on the left and right show the results of two analyzes, respectively.
  • Figure 9a is a schematic diagram showing an experimental schedule for the STAT3 reporter analysis performed to investigate the IL-10 activity of the dual specificity fusion protein according to an embodiment of the present invention
  • Figure 9b is a dual according to an embodiment of the present invention It is a graph showing the results of STAT3 reporter analysis after treatment with specific fusion proteins (PG-210-6 and PG-210-8).
  • FIG. 10 is a graph showing the results of analyzing the immunosuppressive activity by IL-10 of the dual specificity fusion protein (PG-210-6) according to an embodiment of the present invention by measuring the degree of TNF- ⁇ secretion in macrophages; am.
  • FIG. 11a schematically shows an experimental schedule for examining the binding activity of the dual specificity fusion proteins (PG-210-6 and PG-210-7) to the GLP-2 receptor (GLP-2R) according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 11b is the result of measuring the binding activity of the dual specificity fusion proteins (PG-210-6 and PG-210-7) to the GLP-2 receptor according to an embodiment of the present invention at various concentrations. It is a graph representing
  • FIG. 12 is a graph showing the results of pharmacokinetics analysis of dual specificity fusion proteins (PG-210-6 and PG-210-8) according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13A is a schematic diagram schematically showing an experimental schedule for examining the distribution in vivo after administration of a dual specificity fusion protein (PG-210) according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 13B is a dual specificity fusion protein according to an embodiment of the present invention. It is a graph showing the biodistribution analysis result after administration of the protein (PG-210).
  • Figure 15a is an animal for analyzing whether colitis symptoms are improved after administration of the dual specificity fusion protein (PG-210) according to an embodiment of the present invention to a disease model animal induced by colitis by administration of T reg CD4 + T cells. It is a schematic diagram schematically showing the experimental schedule, and FIG. 15b is a control group and a positive control group (anti-TNF ⁇ antibody administered group) and an embodiment of the present invention on the 20th (D20) and 27th (D27) of the experiment in the animal experiment. It is a graph showing the result of measuring the diarrhea index after administration of the dual specificity fusion protein (PG-210), and FIG. 15c is a graph recording the change in body weight over time of the experimental animal.
  • PG-210 dual specificity fusion protein
  • Figure 16a is a representative photograph for each group taken by excision of the colon after administration of the dual specificity fusion protein (PG-210) according to an embodiment of the present invention to an inflammatory bowel disease (IBD) model animal for 4 weeks
  • Figure 16b is It is a graph showing the result of measuring the length of the large intestine in each experimental group in the animal experiment
  • FIG. 16C is a representative photograph showing the result of performing histochemical analysis on a slice of colon tissue in each experimental group.
  • GLP-2 is a 33 amino acid long peptide produced by a special post-translational cleavage process of proglucagon like GLP-1. It is produced by enteroendocrine L cells of the small intestine and various neurons of the central nervous system. becomes this GLP-2 is secreted together with GLP-1 when food is ingested. In the case of GLP-2, when administered, it is known to improve small intestine growth and function, reduce bone destruction, and act as a neuroprotective agent.
  • GLP-2 analogue or "GLP-2 receptor agonist” refers to a protein that biologically performs the function of GLP-2 and the GLP-2 receptor. It refers to a protein capable of binding to and mediating downstream signaling.
  • Teduglutide is a GLP-2 analogue sold under the trade name of Gattex in the United States and Revestive in Europe as a treatment for short bowel syndrome.
  • Glepaglutide used in this document is a GLP-2 analogue with improved half-life, which was developed as a treatment for short bowel syndrome and is currently undergoing phase 3 clinical trials for short bowel syndrome.
  • GLP-2 analogue 10 is one of the GLP-2 analogues, and is an intramolecular lipid lipidated through the thiol groups of two substituted cysteines by replacing the 11th and 18th amino acids of GLP-2 with cysteines. It has a stabilized structure by linking with a crosslinking agent, and is characterized by adding 9 amino acids at the C-terminus of Exendin 4 to the C-terminus (Yang et al ., J. Med. Chem . 61: 3218-3223, 2018).
  • fusion protein refers to a recombinant protein in which two or more proteins or domains responsible for a specific function in the protein are linked so that each protein or domain takes on its original function.
  • antibody Fc region refers to a crystallized fragment among fragments generated when an antibody is cleaved with papain, and a cell surface receptor called Fc receptor and some of the complement system. interacts with proteins.
  • the antibody Fc region exhibits a homodimeric structure in which fragments comprising the second and third constant regions (CH2 and CH3) of the heavy chain are linked by intermolecular disulfide bonds at the hinge region.
  • the Fc region of IgG has a number of N-glycan attachment sites, which are known to play an important role in Fc receptor-mediated action, and IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, and IgD may be used.
  • modified antibody Fc region refers to an Fc region peptide produced by a combination of parts of various subtypes of Ig Fc region, and Fc receptors and complement and It may exhibit a difference from the wild-type antibody Fc region in its binding ability, and may be representative of those disclosed in Korean Patent No. 897938.
  • linker peptide is an unstructured peptide used to prepare a fusion protein by linking two or more proteins or peptides having different biological activities.
  • the term “dual specificity fusion protein” refers to a protein in which polypeptides or domains having two or more different biological functions are linked directly or by a linker peptide to simultaneously exert two biological functions.
  • the term “dual-specificity fusion protein dimer” refers to a homologous or heterodimeric protein having a structure similar to that of an antibody generated by intermolecular interaction of the bispecific fusion protein. Such dimerization is known to be achieved by intermolecular disulfide bonds generated in the hinge region present in the antibody Fc region and intermolecular hydrophobic interactions by CH2 and CH3 domains.
  • NTIG refers to the modified Fc region described in WO2020231199A1.
  • the NTIG is a fusion of two or more isotypes of Ig Fc regions in a hybrid form, and while increasing affinity for FcRn, inhibits effector functions such as ADCC or CDC, thereby minimizing side effects and fused to a physiologically active protein ( It is a platform protein that can significantly increase the half-life of API).
  • a recombinant bispecific fusion protein in which GLP-2 or an analog thereof is linked to an IL-10 protein.
  • the GLP-2 or its analog may include an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 7.
  • the IL-10 protein may be a mutant and/or a monomeric mutant in which an immune activity enhancing action is suppressed.
  • the mutant in which the immune activity enhancing action is suppressed may be one in which isoleucine (I), the 87th amino acid of the wild-type human IL-10 protein, is substituted with alanine (A), and the monomeric mutant is a wild-type human IL-10 protein Length 6 to 12 aa, 7 to 11 aa, 8 to 10 aa between asparagine (N), the 134th amino acid, and lysine (K), the 135th amino acid of
  • the linker peptide of 9 a.a. may be inserted.
  • the IL-10 protein may include an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 11.
  • a recombinant bispecific fusion protein in which GLP-2 or an analog thereof is linked to the N-terminus of the antibody Fc region and IL-10 protein is linked to the C-terminus of the antibody Fc.
  • the GLP-2 or an analog thereof may include an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 7.
  • the IL-10 protein may be a mutant and/or a monomeric mutant in which an immune activity enhancing action is suppressed.
  • the mutant in which the immune activity enhancing action is suppressed may be one in which isoleucine (I), which is the 87th amino acid of the wild-type human IL-10 protein, is substituted with alanine (A), and the monomeric mutant is a wild-type human IL-10 protein
  • a linker peptide having a length of 6 to 12 aa may be inserted between asparagine (N), the 134th amino acid, and lysine (K), the 135th amino acid.
  • the IL-10 protein may include an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 11.
  • the monomeric variant IL-10 protein (IL-10Vm) is described in detail in Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2021-0006302. This document is incorporated by reference in the above patent document.
  • the antibody Fc region may be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, or IgD Fc region or a hybrid antibody Fc region in which Fc regions of two or more isotypes are mixed.
  • the antibody Fc region may include an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12 to 16, 63 and 64.
  • a linker peptide having a generally flexible structure may be inserted between two or more proteins or domains in the fusion protein according to an embodiment of the present invention.
  • the linker peptide is GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP (SEQ ID NO: 17), RNTGRGGEEKKGSKEKEEQEERETKTPECP (SEQ ID NO: 18), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 19), GSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 20), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 21), EPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 22), EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 23), GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEKEEQEERTHTCPPCP (SEQ ID NO: 24), A (EAAAK) 4 ALEA (EAAAK) 4 A
  • the recombinant bispecific fusion protein of the present invention may be in the form of a first linker peptide between the GLP-2 analogue and the antibody Fc region and a second linker peptide between the antibody Fc region and the IL-10 protein.
  • the first linker peptide may be any of the above linker peptides, but it may be preferable to use the linker peptide set forth in SEQ ID NO: 29, and the second linker peptide has a length of 1 to 20 aa. It was confirmed that there was no significant difference in the stability and activity of the protein no matter which one was used, and it was confirmed that there was no significant difference in protein production even when the 40 aa linker was applied.
  • the second linker has a length of 1 to 40 aa. Any peptide having a
  • a bispecific fusion protein dimer produced by dimerization of the recombinant bispecific fusion protein.
  • a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • the treatment of inflammatory bowel disease in an individual comprising administering a therapeutically effective amount of the bispecific fusion protein or the bispecific fusion protein dimer to the subject suffering from inflammatory bowel disease
  • a method is provided.
  • a bispecific fusion protein dimer produced by dimerization of the bispecific fusion protein.
  • a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • the polynucleotide may be included in the form of a gene construct operably linked to a regulatory sequence.
  • operably linked to means that a nucleic acid sequence of interest (eg, in an in vitro transcription/translation system or in a host cell) is regulated in such a way that its expression can be achieved. It means that it is connected to the sequence.
  • regulatory sequence is meant to include promoters, enhancers and other regulatory elements (eg, polyadenylation signals). Regulatory sequences include instructing that a target nucleic acid can be constitutively expressed in many host cells, instructing the expression of a target nucleic acid only in specific tissue cells (eg, tissue-specific regulatory sequences), and This includes directing expression to be induced by a specific signal (eg, an inducible regulatory sequence). It can be understood by those skilled in the art that the design of the expression vector may vary depending on factors such as the selection of the host cell to be transformed and the level of desired protein expression.
  • the expression vector of the present invention can be introduced into a host cell to express the fusion protein.
  • Regulatory sequences enabling expression in eukaryotic and prokaryotic cells are well known to those skilled in the art. As described above, they usually contain regulatory sequences responsible for initiation of transcription and, optionally, poly-A signals responsible for termination and stabilization of the transcript. Additional regulatory sequences may include, in addition to transcriptional regulators, translation enhancers and/or natively-combined or heterologous promoter regions.
  • Possible regulatory sequences enabling expression in, for example, mammalian host cells are the CMV-HSV thymidine kinase promoter, SV40, RSV-promoter (Rous sarcoma virus), human kidney element 1 ⁇ -promoter, glucocorticoid-inducible MMTV- promoters (Moloni mouse tumor virus), metallothionein-inducible or tetracycline-inducible promoters, or amplifying agents such as CMV amplifiers or SV40-amplifiers.
  • neurofilament-promoter For intraneuronal expression, it is contemplated that neurofilament-promoter, PGDF-promoter, NSE-promoter, PrP-promoter or thy-1-promoter may be used.
  • Such promoters are known in the art and are described in Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995.
  • a number of promoters have been disclosed, including the lac-promoter, the tac-promoter or the trp promoter.
  • the regulatory sequences include transcription termination signals such as SV40-poly-A site or TK-poly-A site downstream of the polynucleotide according to an embodiment of the present invention.
  • suitable expression vectors are known in the art, examples of which are Okayama-Berg cDNA expression vectors pcDV1 (Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pSPORT1 (GIBCO BRL), pGX-27 (Patent No.
  • the vector may further comprise a polynucleotide encoding a secretion signal.
  • the secretion signals are well known to those skilled in the art.
  • a leader sequence capable of guiding the recombinant protein to the cell compartment is combined with the coding sequence of the polynucleotide according to an embodiment of the present invention, preferably the translated protein or its It is a leader sequence capable of direct secretion of proteins into the periplasmic or extracellular medium.
  • the vector of the present invention can be prepared by, for example, standard recombinant DNA techniques, and standard recombinant DNA techniques include, for example, blunt-end and adherent ligation, treatment with restriction enzymes to provide appropriate ends, inappropriate In order to prevent binding, phosphate group removal by alkaline forstase treatment and enzymatic linkage by T4 DNA ligase are included.
  • the vector of the present invention is prepared by recombination of a DNA encoding a signal peptide obtained by chemical synthesis or genetic recombination technology, a recombinant fusion protein of the present invention, or a DNA encoding a fusion protein containing the same into a vector containing an appropriate regulatory sequence.
  • the vector containing the control sequence can be purchased or prepared commercially, and in an embodiment of the present invention, pBispecific backbone vector (Genexine, Inc., Korea) or pAD15 vector was used as a backbone vector.
  • the expression vector may further include a polynucleotide encoding a secretion signal sequence, wherein the secretion signal sequence induces secretion of a recombinant protein expressed in the cell out of the cell, and a tissue plasminogen activator (tPA) signal sequence; It may be an HSV gDs (herpes simplex virus glycoprotein Ds) signal sequence or a growth hormone signal sequence.
  • tPA tissue plasminogen activator
  • the expression vector according to an embodiment of the present invention may be an expression vector capable of expressing the protein in a host cell, and the expression vector is a plasmid vector, a viral vector, a cosmid vector, a phagemid vector, an artificial human chromosome. It is free to show any form, etc.
  • composition comprising the recombinant bispecific fusion protein or the bispecific fusion protein dimer as an active ingredient.
  • the composition may be a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of short bowel syndrome or inflammatory bowel disease.
  • the composition may include a pharmaceutically acceptable carrier, and may further include a pharmaceutically acceptable adjuvant, excipient or diluent in addition to the carrier.
  • the term “pharmaceutically acceptable” refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause gastrointestinal disorders, allergic reactions such as dizziness or similar reactions when administered to humans.
  • examples of such carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-agglomeration agents, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions according to an embodiment of the present invention may be formulated using a method known in the art to enable rapid, sustained or delayed release of the active ingredient when administered to a mammal.
  • Formulations include powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, and sterile powder forms.
  • composition according to an embodiment of the present invention may be administered by various routes, for example, oral, parenteral, for example, suppository, transdermal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, nasal, intravertebral administration may be administered, and may also be administered using an implantable device for sustained release or continuous or repeated release.
  • the number of administration may be administered once a day or divided into several times within a desired range, and the administration period is not particularly limited.
  • composition according to an embodiment of the present invention may be formulated in a suitable form together with a commonly used pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycol, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives are benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • composition according to the present invention may contain a suspending agent, a solubilizing agent, a stabilizer, an isotonic agent, a preservative, an adsorption inhibitor, a surfactant, a diluent, an excipient, a pH adjuster, an analgesic agent, a buffer, Antioxidants and the like may be included as appropriate.
  • a suspending agent e.g., a solubilizing agent, a stabilizer, an isotonic agent, a preservative, an adsorption inhibitor, a surfactant, a diluent, an excipient, a pH adjuster, an analgesic agent, a buffer, Antioxidants and the like may be included as appropriate.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and agents suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition.
  • the dosage of the composition to a patient will depend on many factors, including the patient's height, body surface area, age, the particular compound being administered, sex, time and route of administration, general health, and other drugs being administered concurrently.
  • the pharmaceutically active protein may be administered in an amount of 100 ng/body weight (kg) - 10 mg/body weight (kg), more preferably 1 to 500 ⁇ g/kg (body weight), and most Preferably, it may be administered at 5 to 50 ⁇ g/kg (body weight), and the dosage may be adjusted in consideration of the above factors.
  • a therapeutically effective amount of any one or more of the above bispecific fusion proteins or the bispecific fusion protein dimer comprising administering to an individual suffering from inflammatory bowel disease.
  • the inflammatory bowel disease may be Crohn's disease, ulcerative colitis, or Behcet's disease.
  • the present invention comprising administering to an individual suffering from short bowel syndrome a therapeutically effective amount of any one or more of the bispecific fusion proteins or the bispecific fusion protein dimer.
  • a method of treating the syndrome is provided.
  • short bowel syndrome is a malabsorption disease, which may be caused by surgical removal of a part of the small intestine or dysfunction of a segment of the intestine.
  • Crohn's disease inflammatory disorders of the digestive tract, volvulus, spontaneous twisting of the small intestine resulting in tissue death due to an interruption of blood supply, tumors of the small intestine, small intestine
  • Most disorders are caused by surgery related to wounds or traumas, necrotizing enterocolitis, bypass surgery to treat obesity, disease of the small intestine, and surgery to remove the damaged area. Also, some infants are born with short intestines.
  • malabsorption refers to a disease caused by partial or complete non-absorption of nutrients in the intestinal tract, particularly the small intestine.
  • causes are: First, as a primary congenital abnormality, a deficiency of disaccharide degrading enzymes such as lactose and sugar, a deficiency of digestive enzymes such as pancreas and small intestine, and transmission disorders of the small intestine mucosa such as glucose and vitamin B12. Second, as secondary causes In case of continuous malabsorption due to intestinal disease, etc.
  • inflammatory bowel disease used in this document is a disease in which abnormal chronic inflammation in the intestinal tract repeats improvement and recurrence. have. Diagnosis of inflammatory bowel disease is made by synthesizing clinical symptoms, endoscopy and histopathological findings, blood test findings, and radiology findings. The purpose of treatment is to control symptoms, prevent complications, and improve quality of life rather than cure.
  • the term "ulcerative colitis” is one of inflammatory bowel diseases along with Crohn's disease and Behcet's disease, and is a disease in which inflammation or ulceration of unknown cause occurs chronically in the large intestine. The exact cause is still unknown. In most cases, symptoms worsen and improve repeatedly, and it is an incurable disease that is difficult to cure with modern medicine.
  • Bechete's disease is an autoimmune disease in which the mucous membranes in the body, especially the mucous membranes of the gastrointestinal tract, are broken by autoimmunity. It is an intractable disease that can develop fatally when it appears in areas such as the nervous system, gastrointestinal system, eye system, and vascular system, and there is no fundamental treatment until now.
  • the term "therapeutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level depends on the type and severity of the subject; Age, sex, drug activity, sensitivity to drug, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including concomitant drugs and other factors well known in the medical field.
  • the therapeutically effective amount of the composition of the present invention may be 0.1 mg/kg to 1 g/kg, more preferably 1 mg/kg to 500 mg/kg, but the effective dosage may vary depending on the age, sex and condition of the patient. can be appropriately adjusted.
  • IL-10 as a candidate material for treating inflammatory bowel disease, but there were side effects such as anemia and thrombocytopenia due to systemic reactions. This was a case of oral administration of genetically modified Lactobacillus lactis lactic acid bacteria, which was genetically engineered to prevent adverse effects.
  • the present inventors have focused on the fact that the receptor of GLP-2, which is being studied as a candidate for the treatment of IBD, is most expressed in the intestine, and minimized the side effects that occur during systemic administration of IL-10, and
  • the present invention by designing a dual specificity fusion protein in which GLP-2 and IL-10 are linked to the N-terminus and C-terminus of NTIG, an immunoglobulin Fc domain mutant protein developed by the present inventors, respectively, in anticipation of a synergistic effect according to the present invention was completed.
  • the fusion protein of the present invention has a high specific binding degree to FcRn and a very low binding affinity to other Fc ⁇ receptors. Therefore, for short bowel syndrome or inflammatory bowel disease, it is expected to be more effective than conventional biopharmaceuticals for these diseases, and the possibility of side effects is expected to be low.
  • NTIG immunoglobulin Fc domain variant protein
  • Example code construct (SEQ ID NO:) GLP-2 (SEQ ID NO:) IL-10 (SEQ ID NO:) Total Protein (after Protein A) Purity (SE-HPLC)
  • GLP-2 SEQ ID NO:
  • IL-10 SEQ ID NO:
  • Total Protein After Protein A) Purity (SE-HPLC)
  • Comparative examples include GLP-2G-NTIG fusion protein (PG-22, Comparative Example 1), GLP-2V-NTIG fusion protein (PG-22V, Comparative Example 2) as a fusion protein to which IL-10 protein is not added, and addition NTIG-IL-10Vm (PG-010, Comparative Example 3), which is not a fusion protein, was used.
  • GLP-2V a 3-point mutation
  • Comparative Example 3 only IL-10Vm was linked to NTIG protein.
  • the fusion protein is a first linker peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 at the N-terminus of the NTIG protein shown in SEQ ID NO: 13 by using a GLP-2 (HA deleted) variant having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a second linker peptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29 to human wild-type IL-10 protein (IL-10wt) having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 at the C-terminus of the NTIG protein.
  • GLP-2 HA deleted
  • IL-10wt human wild-type IL-10 protein
  • GLP-2 sub-vector After synthesizing a polynucleotide encoding each component peptide of the fusion protein or amplifying it by PCR and preparing it, GLP-2 sub-vector, NTIG sub-vector, and IL-10 sub-vector and backbone vector After subcloning in (pBispecific vector, Genexine, Inc.), it was reacted in one tube to prepare a final vector construct.
  • Recombinant expression vector constructs capable of expressing the fusion proteins of Examples 2 to 4 were prepared in the same manner as above.
  • Example 2 the difference from the fusion protein of Example 1 was that Teduglutide (SEQ ID NO: 3) in which the second amino acid was substituted with glycine was used, not the form in which the two amino acids at the N-terminus of GLP-2 were removed.
  • Examples 3 and 4 are 3-point mutants (L17Q) in which the 16th amino acid, asparagine, is substituted with glycine (N16G) and the 17th amino acid, leucine, is substituted with glutamine to prevent self-dimer formation in the Teduglutide (L17Q) SEQ ID NO: 4) was used.
  • Example 5 Teduglutide of SEQ ID NO: 3 was used instead of the 3-point mutant of GLP-2 in Example 4, and in Example 6, KIH (Knobs-into-Holes) in which the GLP-2 3-point mutant was introduced into NTIG Designed to form a heterodimer by the structure, IL-10Vm was linked to a hybrid Fc region (NTIG Knob ) into which Knob was introduced by a linker peptide of SEQ ID NO: 29 with a length of 20 aa, and a hybrid Fc region into which a Hole was introduced.
  • NTIG Knob hybrid Fc region
  • NTIG Hole was designed to connect only GLP-2V and not IL-10Vm.
  • the linker lengths in the heterodimeric fusion protein of Example 6 are 1 aa (G), 5 aa (GGGGS, SEQ ID NO: 26) and 10 aa (GGGGSGGGGS, SEQ ID NO: 65), respectively. will be replaced with Among the vector constructs prepared as described above, the constructs of Examples 1 and 2 were transiently expressed using Thermo Fisher's ExpiCHO kit.
  • the supernatant obtained through the above culture was appropriately diluted with 4X LDS sample buffer and water for injection with fusion proteins purified through Protein A column and secondary column (referred to as 'PG-72' and 'PG-73', respectively). It was prepared so that it might become the final 3-10 microgram/20 microliters.
  • 4X LDS sample buffer, 10X reducing agent, and water for injection were appropriately diluted to make a final 3-10 ⁇ g/20 ⁇ L, and heated in a heating block at 70° C. for 10 minutes.
  • 20 ⁇ L of the prepared sample was loaded into each well of the gel fixed on the pre-installed electrophoresis equipment. For size markers, 3-5 ⁇ L/well were loaded. After setting the power supply to 120 V, 90 minutes, electrophoresis was performed. After the electrophoresis was completed, the gel was separated and stained using a staining solution and a de-staining solution, and the results were analyzed.
  • the present inventors replaced the linker used between GLP-2 and NTIG in PG-72 and PG-73 with the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 20 and 21, respectively, and formed a dimer upon expression of the existing protein.
  • IL-10wt which is known to cause a decrease in protein production yield
  • IL-10Vm monomeric IL-10 variant designed by the present inventors
  • the protein production yield is significantly increased by changing the linker between the GLP-2 analog and the NTIG protein and changing the IL-10 protein type to the monomeric variant.
  • the obtained gene construct encoding the bispecific fusion protein was inserted into the pAD15 expression vector (WO2015/009052A), and then transfected into CHO DG44 (from Dr. Chasin, Columbia University, USA) cells, A cell line stably expressing the dual specificity fusion protein was constructed.
  • the present inventors prepared the gene construct encoding the fusion protein (PG-210-8) of Example 6 in the same manner as described above, and then transduced it into HEK-293F host cells, followed by transient gene expression was induced.
  • the culture supernatant was first purified by chromatography using a Protein A column as described above, followed by SDS PAGE analysis and HPLC analysis. did.
  • the present inventors further purified the first purified fusion protein using size exclusion HPLC (SEC-HPLC), and the purified protein was analyzed by SDS PAGE and HPLC analysis as described above ( FIGS. 7c and 7d ).
  • SEC-HPLC size exclusion HPLC
  • FIGS. 7c and 7d the recovery rate of the protein was 61.3% and the purity was 96.72%.
  • Example 1 In order to confirm whether the fusion protein purified in Example 1 normally exhibits GLP-2 activity, the present inventors analyzed the GLP-2 in vitro activity of the dual specificity fusion protein prepared in Example 1 with cAMP. was investigated by analysis. Specifically, in order to evaluate the degree of cAMP induction by GLP-2 specific reaction, cAMP Hunter TM eXpress GLP2R CHO-K1 GPCR Assay kit (DiscoverX, Cat# 95-0062E2CP2M) was used.
  • cAMP Hunter TM eXpress Assay cells were inoculated into 96-well plates and incubated for 16 hours, fusion proteins of Examples 3 and 4 (PG-210-5 and PG-210-6) and PG-22 used as Comparative Examples were 0.1 Each was treated at a concentration of 10 to 10 nM and incubated for 30 minutes. The biological activity (EC 50 ) of the drug was evaluated by measuring the luminescent signal 1 hour after adding the anti-cAMP antibody and the cAMP detection reagent.
  • PG210-6 among the fusion proteins prepared according to an embodiment of the present invention had almost similar activity to PG-22 and GLP-2, which is a comparative example, and PG-210- 5 was confirmed to exhibit half the activity compared to PG-210-6.
  • PG-210-5 is a protein to which the linker peptide used in the prior patent document (US7812121B2) is applied, and the productivity of PG-210-6 to which the (G 4 S) 3 + IgG1 hinge mixed linker peptide used in the present invention is applied It can be said that the excellent GLP-2 activity is a very encouraging phenomenon.
  • Example 3 (PG-210-5) 4 (PG-210-6) comparative example (PG-22) Primary EC 50 (nM) 7.44 2.46 2.84 Relative activity (%) 38.1% 115% 100% Secondary EC 50 (nM) 5.95 2.93 2.65 Relative activity (%) 44.5% 90% 100% Average activity (%) 41% 102.5% 100%
  • the STAT3 reporter gene which is a sub-signal of the IL-10 receptor and IL-10, was HEK-Blue IL-10 Cells (invivogen, Cat# hkb-IL10) using the transfected HEK-293 cell line were used.
  • HEK-Blue IL-10 Cells invivogen, Cat# hkb-IL10
  • fusion proteins PG210-6 and PG210-8
  • recombinant IL-10 protein as a positive control were treated at a concentration of 0.001 to 10 nM, respectively, and Incubated for 18 hours in a 37 °C incubator (Fig. 9a).
  • the reacted supernatant was transferred to a new 96-well plate, a detection reagent was added, and the luminescence signal was measured at 630 nm after 1 hour to evaluate the biological activity (EC 50 ) of the drug.
  • PG-210-6 showed about 1/3 activity compared to the control recombinant IL-10 protein, and in the case of PG-210-8, PG- It exhibited a 3.4-fold lower activity compared to 210-6.
  • the present inventors analyzed the in vitro immunosuppressive activity of the dual specificity fusion protein (PG-210-6) according to an embodiment of the present invention.
  • the PG-210-6 prepared in Example 4 was sequentially diluted to various concentrations (0 to 1,000 nM), and 50 ⁇ l of each of the Raw264.7 macrophages was treated in a 96-well plate. After 20 minutes, the final concentration of LPS (lipopolysaccharide) was 400 ng/ml, treated with 50 ⁇ l each, and incubated at 37° C. for 16 hours. The next day, after collecting the supernatant, TNF- ⁇ ELISA analysis was performed according to the protocol of the manufacturer (Biolegend, USA).
  • the dual specificity fusion protein according to an embodiment of the present invention inhibited the secretion of TNF- ⁇ in macrophages in a concentration-dependent manner. This means that even if the monomeric IL-10 variant protein (IL-10Vm) linked to the dual specificity fusion protein according to an embodiment of the present invention is linked to the C-terminus of the NTIG protein, it works properly.
  • IL-10Vm monomeric IL-10 variant protein
  • the present inventors evaluated the binding ability of the PG-210 fusion protein prepared in the above Example using FACS (flow cytometry) to determine whether it binds to the GLP-2 receptor (GLP-2R).
  • the present inventors confirmed the binding using the HEK-293 cell line expressing the GLP-2 receptor.
  • the HEK-293 cell line was cultured and then the fusion protein (PG210-6) according to an embodiment of the present invention.
  • the negative control PG-11 did not bind to the GLP-2 receptor at 1-1000 nM concentration, and PG-210 and PG-22 did not bind the GLP-2 receptor. It was confirmed that binding to a similar level to HEK-293 cells expressed on the cell membrane surface.
  • the present inventors performed pharmacokinetic analysis to confirm how stable the fusion protein of the present invention is when administered in vivo.
  • the fusion proteins (PG-210-6 and PG-210-8) of the present invention were injected intravenously at a dose of 1 mg/kg for 3 SD rats in each group for 0 min, 5 min. Serum was collected at 1 hour, 5 hours, 10 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, 120 hours, and 168 hours, and the fusion protein was quantified using human IgG4 Fc ELISA.
  • the fusion protein of the present invention showed a modest decrease over time, indicating that the fusion protein is stably maintained in the body for a considerable period of time.
  • CF750 fluorophore was conjugated to PG-210-6 according to an embodiment of the present invention using the VivoBrite rapid antibody labeling kit (Biotium, Cat 92161).
  • the fluorescence/protein molar ratio (degree of labeling, DOL) was measured according to the expected ratio recommended according to the formula provided in the kit.
  • Normal C57BL/6 mice were intravenously injected with CF750 fluorescence-labeled PG-010 and PG-210-6 at a dose of 100 ⁇ g/100 ⁇ l ( FIG. 13a ).
  • the fluorescence signal emitted from the mouse was detected using a small animal bioimaging system. It was confirmed, and fluorescence signal analysis was performed using living imaging software.
  • PG-210-6 showed a lower fluorescence intensity in blood compared to PG-010, and it was confirmed that it was more distributed in the liver and intestines.
  • the present inventors collected a blood sample (200 ⁇ l) and measured the fluorescence intensity with an optical imaging device.
  • the present inventors performed the analysis on the 12th day after intravenous administration of PG-210 at 29.4 nmol/kg to 8-week-old male C57BL/6 mice to confirm the GLP-2 activity of PG-210-6 in vivo. did.
  • the fusion protein according to an embodiment of the present invention actually exhibits GLP-2 activity in vivo.
  • Figure 16a is a schematic diagram of this analysis. Using Rag1 ko mice, 5x10 5 naive CD4 + T reg cells were intravenously administered on day 0 to induce a colitis model, and at the same time various doses of PG-210-6 and a positive control, TNF ⁇ . The antibody was administered once a week for 3 weeks to confirm the efficacy of the administered drug (FIG. 15a).
  • the efficacy of the administered drug was evaluated by measuring a diarrhea score and a weight loss rate, which was evaluated according to the criteria described at the bottom of FIG. 15B .
  • FIG. 15b it was confirmed that the diarrhea index decreased in a concentration-dependent manner in the PG-210 administration group compared to the disease induction group and the anti-TNF ⁇ antibody administration group.
  • FIG. 15c the disease induction group and It was confirmed that there was less weight loss in a concentration-dependent manner in the PG-210-6 administration group compared to the anti-TNF ⁇ antibody administration group.
  • the present inventors evaluated the GLP-2 activity by examining the change in the length of the colon during in vivo administration of the fusion protein (PG-210-6) according to an embodiment of the present invention.
  • mice after administration of an anti-TNF antibody as a positive control and a fusion protein (PG-210) according to an embodiment of the present invention at various concentrations to mice (manufactured by Pohang University of Science and Technology) for IBD disease model once a week for 4 weeks , After sacrificing the mice, the length of the changed intestine for each experimental group was measured, and tissue staining was performed on the section of the intestinal tissue to observe the change in the thickness of the colon.
  • PG-210 fusion protein
  • the fusion protein according to an embodiment of the present invention was able to confirm a statistically significant increase in intestinal length in the 10 mg/kg body weight administration group, and as shown in FIG. 16c, PG -210-6 3 and 10 mg/kg body weight administration group showed a decrease in intestinal thickness.
  • the recombinant dual specificity fusion protein according to an embodiment of the present invention can be used in the pharmaceutical field, in particular, for the development of a therapeutic agent for short bowel syndrome or inflammatory bowel disease.

Abstract

본 발명은 염증성 장질환 또는 단장증후군의 치료 및 예방에 사용되는 GLP-2 또는 그의 유사체가 IL-10 단백질에 연결된 신규 재조합 융합단백질에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 항체 Fc 영역의 N-말단에 GLP-2 또는 그의 유사체가 연결되고 상기 항체 Fc의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 재조합 이중 특이성 융합단백질 및 그를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 재조합 융합단백질 및 그의 용도
본 발명은 신규 재조합 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는 글루카곤-유사 펩타이드 2 유사체를 포함하는 재조합 이중 특이성 융합단백질 및 상기 융합단백질의 염증성 장질환 또는 단장 증후군 등의 치료 및 예방에 관한 용도에 관한 것이다.
GLP-2는 프로글루카곤의 아미노산 위치 126-158에 상응하는 33 a.a. 펩타이드이며 프로글루카곤의 효소적 절단에 의해 생성된다(Drucker, Endocrinol. 142(2): 521-527, 2001). GLP-2는 장에서 발현된 G-단백질-연결 수용체 슈퍼패밀리 구성원인 GLP-2R에 결합한다(Monroe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1569-1573, 1999). GLP-2는 디펩티딜 펩티데이즈-IV(DPP-IV)에 의한 절단 및 신장에 의한 제거로 인해 혈청에서 반감기가 7분에 불과하다(Brubaker, Endocrinol. 142(2): 521-527, 2001; Dube and Brubaker, Am. J. Physiol-Endoc. M. 293(2): E460-E465, 2007). 이는, 치료목적의 GLP-2 작용제는 반감기가 연장되어야 비로소 치료적 목적을 달성할 수 있음을 보여주는 것이다. 때문에, 반감기가 향상된 GLP-2 유사체 또는 변이체에 대한 연구가 이루어지고 있다. GLP-2의 두 번째 아미노산인 알라닌(A)이 글리신(G)으로 치환된 인간 GLP-2의 변이체인 Teduglutide는 디펩티딜 펩티데이즈-IV 절단 부위가 없어 1 내지 3 시간의 반감기를 갖는 것으로 알려지고 있다(DaCambra et al., Biochem. 39(30): 8888-8894, 2000; Drucker, Endocrinol. 142(2): 521-527, 2001; Marier et al., J. Clin. Pharmacol. 50(1): 36-49, 2010). Teduglutide는 몇몇 설치류 모델 및 단장증후군 환자에 대한 임상시험을 통해 미국 FDA에 의한 판매 승인을 받았다(Kochar and Herfarth, Expert Opin. Drug Saf., 17(7): 733-739, 2018). 그러나, Teduglutide의 생체 내 반감기는 여전히 짧기 때문에 자주 투여받아야 한다는 문제점을 가지고 있다.
이러한 문제점으로 인해 Teduglutide의 반감기를 더 연장하기 위해 IgG의 Fc 도메인과 융합시킨 새로운 제형(GLP-2-Mimetibody 등)이 개발된 바 있다(US7812121B2). 그러나, GLP-1과는 달리 GLP-2는 Fc 도메인과 융합 시 이량체 사이에 다시 비공유 결합에 의한 이량체를 형성하는 것으로 알려지고 있는데, 이는 단백질 생산 수율을 감소시키는 단점을 갖게 한다.
한편, IL-10은 사이토카인 중의 하나로서 사이토카인 합성 억제 인자(cytokine synthesis inhibitory factor, CSIF)로도 알려져 있다. IL-10은 항-염증성 사이토카인으로서, 대식세포 및 Th1 T 세포에 의해 생성되는 IFN-γ, IL-2, IL-3, TNFα 및 GM-CSF와 같은 염증촉진(pro-inflammatory) 사이토카인 합성을 억제하는 반면, Th2 T 세포나 비만세포와 같은 특정 면역세포는 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 면역 억제 활성 때문에 재조합 IL-10을 다양한 자가면역 질환의 치료에 사용하려는 임상시험이 시도 중이나 기대와는 달리 재조합 인간 IL-10은 크론병(Schreiber et al., Gastroenterol. 119(6): 1461-1467, 2000) 또는 류마티스성 관절염(van Roon et al., J. Rheumatol. 30(4): 648-651, 2003)의 치료에 있어서 유의한 효과를 나타내지 못하였고, 오히려 최근 연구에 의하면 염증을 억제하기 보다는 전-염증 반응을 유발하는 것으로 보고된 바 있는 등(Lauw et al., J. Immunol. 165(5): 2783-2789, 2000), 그 작용 효과에 있어서 논란이 있는 물질이다.
본 발명은 상술한 문제점을 포함하여 여러 가지 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적으로 염증성 장질환 또는 단장 증후군을 치료할 수 있는 신규 재조합 융합단백질 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나, 본 발명의 보호범위가 상기 목적으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, GLP-2 또는 그의 유사체가 IL-10 단백질에 연결된 재조합 이중 특이성 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항체 Fc 영역의 N-말단에 GLP-2 또는 그의 유사체가 연결되고 상기 항체 Fc의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 재조합 이중 특이성 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 이중 특이성 융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질 이량체가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 이중 특이성 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 이중 특이성 융합단백질 또는 상기 이중 특이성 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 이중 특이성 융합단백질 또는 상기 이중 특이성 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 단장증후군 치료 및 예방용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질 또는 상기 이중 특이성 융합단백질 이량체를 염증성 장질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 염증성 장질환의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질 또는 상기 이중 특이성 융합단백질 이량체를 단장 증후군에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 단장증후군의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 이중 특이성 융합단백질은 GLP-2의 기능을 제대로 발휘하고 생체 내 반감기가 증가된 형태로서, 염증 억제와 같은 면역 조절 기능을 가지고 있어서, 단장 증후군 및 다양한 염증성 장질환의 치료제로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 구조를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 융합단백질(PG-72)의 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 젤 사진(좌측) 및 좌측의 젤 사진에 대하여 이미지 분석 프로그램(Image J)으로 단백질의 순도를 측정한 결과를 나타내는 그림(우측)이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 융합단백질(PG-73)의 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 젤 사진(좌측) 및 좌측의 젤 사진에 대하여 이미지 분석 프로그램(Image J)으로 단백질의 순도를 측정한 결과를 나타내는 그림(우측)이다.
도 4는 상기 도 2 및 3의 결과로부터 융합단백질의 절단 형태에 대한 분석 결과를 나타낸 분석도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 이중 특이성 융합단백질(PG-210-5)의 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 젤 사진(좌측) 및 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 결과(우측)를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 이중 특이성 융합단백질(PG-210-6)의 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 젤 사진(좌측) 및 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 결과(우측)를 나타낸다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 이중 특이성 융합단백질(PG-210-8)을 Protein A 친화성 크로마토그래피로 1차 정제한 후 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이고, 도 7b는 상기 1차 정제된 융합단백질(PG-210-8)을 HPLC 분석으로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이며, 도 7c는 상기 1차 정제된 융합단백질(PG-210-8)을 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 2차 정제한 결과를 나타내는 SDS-PAGE 겔 사진이고, 도 7d는 상기 2차 정제된 융합단백질의 순도를 확인하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피 분석결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210-5 및 PG-210-6)의 GLP-2 활성을 cAMP HunterTM eXpress GPCR assay로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 좌우측 그래프는 두 차례 분석한 결과를 각각 나타낸다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 IL-10 활성을 조사하기 위해 수행된 STAT3 리포터 분석을 위한 실험 스케쥴을 나타내는 개요도이고, 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210-6 및 PG-210-8) 처리 후 STAT3 리포터 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210-6)의 IL-10에 의한 면역억제 활성을 대식세포에서의 TNF-α 분비 정도를 측정함으로써 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210-6 및 PG-210-7)의 GLP-2 수용체(GLP-2R)에 대한 결합 활성을 조사하기 위한 실험 스케쥴을 개략적으로 나타낸 개요도이고, 도 11b는 본 발명의 다양한 농도의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210-6 및 PG-210-7)의 GLP-2 수용체에 대한 결합 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210-6 및 PG-210-8)의 약물 동태학(pharmacokinetics) 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13a는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210)의 투여 후 생체 내 분포도를 조사하기 위한 실험 스케쥴을 개략적으로 나타난 개요도이고, 도 13b는 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210)의 투여 후 생체 내 분포도 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210)의 생체 내 투여 시 생리활성을 분석한 결과로 소장의 중량 및 길이의 변화 그리고 대장의 중량 및 길이의 변화를 측정한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210)을 Treg CD4+ T 세포의 투여로 대장염을 유도한 질환 모델 동물에 투여 후 대장염 증상의 개선 여부를 분석하기 위한 동물 실험 스케쥴을 개략적으로 나타낸 개요도이고, 도 15b는 상기 동물 실험에서 실험개시 20일째(D20) 및 27일째(D27)에서 대조군과 양성대조군(anti-TNFα 항체 투여군) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210) 투여 후 설사 지수를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 15c는 상기 실험 동물의 시간 경과에 따른 체중 변화를 기록한 그래프이다.
도 16a는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210)을 4주간 염증성 대장 질환(IBD) 모델 동물에 투여한 후 대장을 적출하여 촬영한 그룹별 대표 사진이고, 도 16b는 상기 동물 실험에서 각 실험군의 대장의 길이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 16c는 상기 각 실험군에서 대장 조직의 박편에 대한 조직화학분석을 수행한 결과를 나타내는 대표 사진이다.
용어의 정의:
본 발명에서 사용되는 용어 "GLP-2"는 GLP-1과 마찬가지로 프로글루카곤의 특별한 번역 후 절단 공정에 의해 생성되는 33 아미노산 길이의 펩타이드로서 소장의 장내분비 L 세포와 중추신경계의 다양한 신경세포에서 생산이 된다. GLP-2는 음식 섭취 시 GLP-1과 함께 분비가 된다. GLP-2의 경우 투여 시 소장 성장 및 기능을 향상시키고, 뼈의 파괴를 감소시키며 신경보호작용을 하는 것으로 알려지고 있어, 현재 단장증후군이나 크론병, 골다공증과 같은 질환의 치료제로 개발되고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-2 유사체(GLP-2 analogue)" 또는 "GLP-2 수용체 작용제(GLP-2 receptor agonist)"는 생물학적으로 GLP-2의 기능을 수행하는 단백질로서 GLP-2 수용체에 결합하여 하류 신호전달을 매개할 수 있는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Teduglutide"는 미국에서는 Gattex라는 상표명으로, 유럽에서는 Revestive라는 상표명으로 단장증후군 치료제로 판매되고 있는 GLP-2 유사체이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Glepaglutide"는 반감기가 향상된 GLP-2 유사체로 단장증후군 치료제로 개발되어 현재 단장증후군에 대하여 임상 3상 시험을 진행중인 약물이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-2 analogue 10"은 GLP-2 유사체 중 하나로서 GLP-2의 11번째 및 18번째 아미노산을 시스테인으로 치환하여 두 개의 치환된 시스테인의 티올기를 통해 지질화된 분자내 가교제가 연결됨으로써 안정화된 구조를 갖게 되고, C-말단에 Exendin 4의 C-말단의 9개 아미노산을 부가한 것을 특징으로 한다(Yang et al., J. Med. Chem. 61: 3218-3223, 2018).
본 발명에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 각각의 단백질 또는 도메인이 본연의 기능을 담당하도록 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체 Fc 영역"은 항체를 파파인으로 절단하였을 때 생성되는 단편 중 결정화되는 단편(crystalized fragment)을 의미하며, Fc 수용체라고 지칭되는 세포 표면 수용체 및 보체계(complement system)의 몇몇 단백질과 상호작용을 한다. 항체 Fc 영역은 중쇄의 두 번째 및 세 번째 불변 영역(CH2 및 CH3)을 포함하는 단편이 힌지 부분에서 분자 간 이황화 결합에 의해 연결된 동형 이량체 구조를 나타낸다. IgG의 Fc 영역은 다수의 N-글리칸 부착 부위를 가지고 있으며, 이는 Fc 수용체-매개 작용에 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으며, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 IgD 등이 사용될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "변형 항체 Fc 영역"은 다양한 서브타입의 Ig Fc 영역의 부분들의 조합에 의해 생성된 Fc 영역 펩타이드를 의미하며, 이러한 항체 Fc 영역의 부분들의 조합에 의해 Fc 수용체 및 보체와의 결합능에 있어서 야생형 항체 Fc 영역과 차이를 나타낼 수 있으며, 대표적으로는 대한민국 특허 제897938호에 개시된 것들일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "링커 펩타이드"는 둘 이상의 다른 생물학적 활성을 가진 단백질 또는 펩타이드를 연결하여 융합단백질을 제조할 때 사용되는 비구조화된 펩타이드이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "이중 특이성 융합단백질"은 둘 이상의 다른 생물학적 기능을 갖는 폴리펩타이드 또는 도메인이 직접 또는 링커 펩타이드에 의해 연결되어 두 가지 생물학적 기능을 동시에 발휘하는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "이중 특이성 융합단백질 이량체"는 상기 이중 특이성 융합단백질의 분자간 상호작용에 의해 생성되는 항체와 유사한 구조를 가지는 동형 또는 이형 이량체 단백질을 의미한다. 이러한 이량체화는 항체 Fc 영역에 존재하는 힌지 부분에서 생성되는 분자간 이황화 결합과 CH2 및 CH3 도메인에 의한 분자간 소수성 상호작용에 의해 달성되는 것으로 알려지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "NTIG"는 WO2020231199A1에 기재된 변형 Fc 영역을 의미한다. 상기 NTIG는 두 가지 이상의 아이소타입의 Ig Fc 영역이 하이브리드 형태로 융합이 된 것으로서 FcRn에 대한 친화도를 증가시키면서도 ADCC나 CDC와 같은 효과기 기능을 억제함으로써 부작용을 최소화하면서도 이에 융합되는 생리학적 활성 단백질(API)의 반감기를 현저하게 증가시킬 수 있는 플랫폼 단백질이다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, GLP-2 또는 그의 유사체가 IL-10 단백질에 연결된 재조합 이중 특이성 융합단백질이 제공된다.
상기 재조합 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 GLP-2 또는 그의 유사체는 서열번호 1 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 재조합 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 IL-10 단백질은 면역 활성 증진 작용이 억제된 변이체 및/또는 단량체성 변이체일 수 있다. 이때, 상기 면역 활성 증진 작용이 억제된 변이체는 야생형 인간 IL-10 단백질의 87번째 아미노산인 이소류신(I)이 알라닌(A)로 치환된 것일 수 있고, 상기 단량체성 변이체는 야생형 인간 IL-10 단백질의 134번째 아미노산인 아스파라긴(N)과 135번째 아미노산인 라이신(K) 사이에 길이 6 내지 12 a.a., 7 내지 11 a.a., 8 내지 10 a.a. 또는 9 a.a.의 링커 펩타이드가 삽입된 것일 수 있다. 더 구체적으로 상기 IL-10 단백질은 서열번호 8 내지 11로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항체 Fc 영역의 N-말단에 GLP-2 또는 그의 유사체가 연결되고 상기 항체 Fc의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 재조합 이중 특이성 융합단백질이 제공된다.
상기 재조합 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 GLP-2 또는 그의 유사체는 서열번호 1 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 재조합 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 IL-10 단백질은 면역 활성 증진 작용이 억제된 변이체 및/또는 단량체성 변이체일 수 있다. 이때, 상기 면역 활성 증진 작용이 억제된 변이체는 야생형 인간 IL-10 단백질의 87번째 아미노산인 이소류신(I)이 알라닌(A)으로 치환된 것일 수 있고, 상기 단량체성 변이체는 야생형 인간 IL-10 단백질의 134번째 아미노산인 아스파라긴(N)과 135번째 아미노산인 라이신(K) 사이에 길이 6 내지 12 a.a.의 링커 펩타이드가 삽입된 것일 수 있다. 더 구체적으로 상기 IL-10 단백질은 서열번호 8 내지 11으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 단량체성 변이체 IL-10 단백질(IL-10Vm)은 대한민국 공개특허공보 제10-2021-0006302호에 상세히 기재되어 있다. 본 문서는 상기 특허문헌을 참조로 삽입한다.
상기 재조합 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 항체 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgD의 Fc 영역 또는 2종 이상의 아이소타입의 Fc 영역이 혼합된 하이브리드 형태의 항체 Fc 영역일 수 있다.
상기 재조합 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 항체 Fc 영역은 서열번호 12 내지 16, 63 및 64로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질 내의 둘 이상의 단백질 또는 도메인 사이에는 통상적으로 유연한 구조를 갖는 링커 펩타이드(linker peptide)가 삽입될 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 17), RNTGRGGEEKKGSKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 18), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 19), GSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP(서열번호 20), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 21), EPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 22), EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 23), GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 24), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 25), (G4S)n(n은 1 ~ 10의 정수임, 단위체 서열번호 26), (GSSGGS)n(단위체: 서열번호 27, n은 1 내지 10의 정수), SGGGSGGGGSGGGGSGGEEQEEGGS(서열번호 28), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 29) KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 30), EGKSSGSGSESKST(서열번호 31), GSAGSAAGSGEF(서열번호 32), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 33, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 34), GGGGGGGG(서열번호 35), GGGGGG(서열번호 36), PAPAP(서열번호 37), (Ala-Pro)n(n은 1 ~ 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 38, PLGLWA(서열번호 39), TRHRQPRGWE(서열번호 40), AGNRVRRSVG(서열번호 41), RRRRRRRR(서열번호 42), GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 43), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 45), GFLG(서열번호 46), AKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 47), GGSGG(서열번호 48), GGSGGSGGS(서열번호 49), GGGSGG(서열번호 50), GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 51) 및 GGGGSGGGGS(서열번호 65) 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 재조합 이중 특이성 융합단백질은 GLP-2 유사체와 항체 Fc 영역 사이에 제1링커 펩타이드 그리고 항체 Fc 영역과 IL-10 단백질 사이에 제2링커 펩타이드가 연결된 형태일 수 있다. 이 때 상기 제1링커 펩타이드는 상술한 것 중 어떠한 링커 펩타이드가 와도 무방하나 서열번호 29로 기재되는 링커 펩타이드를 사용하는 것이 바람직할 수 있고, 상기 제2링커 펩타이드는 길이가 1 내지 20 a.a.인 것이라면 그 어떠한 것을 사용하더라도 단백질의 안정성 및 활성에 있어서 큰 차이가 없음을 확인하였으며, 40 a.a 링커를 적용하였을 때에도 단백질의 생산에 큰 차이가 없을 확인한 바, 상기 제2링커는 1 내지 40 a.a.이내의 길이를 갖는 펩타이드라면 어느 것이든 적용가능하고, 1 내지 20 a.a 이내 길이의 펩타이드를 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 이중 특이성 융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질 이량체가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 이중 특이성 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질 또는 상기 이중 특이성 융합단백질 이량체를 염증성 장질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 염증성 장질환 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 이중 특이성 융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질 이량체가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 이중 특이성 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
상기 재조합 벡터에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 조절서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트 형태로 포함될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995)에 기술되어 있다. 원핵세포 내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(Invitrogen), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX-27(특허 제1442254호), pX(Pagano et al., Science 255: 1144-1147, 1992), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris et al., Cell 75: 791-803, 1995) 또는 원핵 발현벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 재조합 단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더 서열이다.
또한, 본 발명의 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 재조합 융합단백질 또는 이를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 pBispecific backbone vector(Genexine, Inc., 대한민국) 또는 pAD15 vector를 골격 벡터로 사용하였다.
상기 발현벡터는 분비 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 분비 신호서열은 세포 내에서 발현되는 재조합 단백질의 세포 밖으로의 분비를 유도하며, tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 발현벡터는 숙주세포에서 상기 단백질을 발현하도록 할 수 있는 발현벡터일 수 있으며, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체 등 그 어떠한 형태를 나타내더라도 무방하다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 이중 특이성 융합단백질 또는 상기 이중 특이성 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 조성물이 제공된다.
상기 조성물은 단장증후군 또는 염증성 장질환의 치료 또는 예방을 위한 용도의 약학적 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육 내, 병변 내, 비강, 척추관 내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코즈 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
상기 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다. 약학적으로 활성인 단백질은 100 ng/체중(kg) - 10 ㎎/체중(㎏)의 양으로 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 1 내지 500 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 50 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있는데, 상기 요소들을 고려하여 투여량이 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질 또는 상기 이중 특이성 융합단백질 이량체를 염증성 장질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 염증성 장질환의 치료방법이 제공된다.
상기 치료방법에 있어서, 상기 염증성 장질환은 크론병, 궤양성 대장염, 또는 베체트병일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질 또는 상기 이중 특이성 융합단백질 이량체를 단장증후군에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 단장증후군의 치료방법이 제공된다.
본 문서에서 사용되는 "단장증후군(short bowel syndrome)"은 흡수장애 질환으로, 소장의 일부를 수술에 의해 제거하거나 또는 상기 창자의 분절(segment)의 기능이상(dysfunction)에 의해서 유발될 수 있다. 예를 들면, 크론병(Crohn's disease), 소화관의 염증 장애, 창자꼬임(volvulus), 혈액공급이 차단되어 조직사 (tissue death)를 초래하는 소장의 자연 꼬임(spontaneous twisting), 소장의 종양, 소장의 상처 또는 외상, 괴사성 장염(necrotizing enterocolitis), 비만을 치료하기 위한 우회술(bypass surgery), 소장의 질병 및 손상된 부위를 제거하기 위한 수술과 관련된 수술에 의해서 대부분의 장애가 유발된다. 또한, 일부 유아는 선천적으로 짧은 창자를 가지고 태어나기도 한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "흡수불량(malabsorption)"은 장관 특히, 소장에서 영양소가 일부 또는 전부 흡수되지 않아 생기는 질환을 말한다. 원인은 첫째, 1차적 선천적 이상으로서 젖당·설탕 등 이당류 분해효소의 결핍, 췌장·소장 등의 소화효소 결핍, 포도당과 비타민 B12 등 소장 점막의 전송장애 등을 들 수 있고, 둘째, 2차적 원인으로서 장질환 등으로 계속 흡수불량이 일어나는 경우로서, 이 밖에 장관 내의 효소가 부족하거나 정상 상태의 장내 세균이 변하는 경우, 췌장·간·담낭 등의 질환으로 소화가 잘 되지 않는 경우, 기생충·복통 등 장관 벽의 질환이 있는 경우, 장관절제 수술로 흡수 면적이 줄었을 경우 등을 들 수 있다. 위험 인자로는 알코올 과다섭취, 장관 수술, 가족 중 흡수불량이나 낭포성 섬유증 환자가 있는 경우, 광유 또는 다른 완화제를 사용한 경우 등이 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "염증성 장질환(inflammatory bowel disease)"은 장관 내 비정상적인 만성 염증이 호전과 재발을 반복하는 질환으로 흔히 궤양성 대장염과 크론병이 대표적이며 아직까지 명확한 발병기전은 밝혀져 있지 않고 있다. 염증성 장질환의 진단은 임상 증상, 내시경 및 조직병리 소견, 혈액검사소견, 영상의학검사 소견을 종합하여 이루어지며, 염증성 장질환은 증상이 없어지는 관해기와 악화되는 활동기가 반복되는 만성 질환으로 질환의 완치보다는 증상의 조절과 합병증 예방 및 삶의 질을 향상시키는 것을 치료 목적으로 하고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "궤양성 대장염(ulcerative colitis)"은 크론병, 베체트병과 함께 염증성 장질환의 하나로, 대장에 원인 불명의 염증 또는 궤양이 만성적으로 생기는 질환이다. 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았다. 대부분의 경우 증상의 악화와 호전이 반복되는데, 현대의학으로는 완치가 어려운 난치성 질환이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "베체트병(Bechete's disease)"은 자가면역질환의 하나로 자가면역에 의해 신체에 존재하는 점막 특히 위장관의 점막이 헐게 되는 질병으로, 증상이 다양하고, 병소가 나타나는 부위 역시 개인에 따라 다르며, 신경계나 위장관계, 안구계, 혈관계와 같은 부위에 나타날 경우 치명적으로 발전할 수 있는 난치성 질환으로 현재까지 근본적인 치료법이 존재하지 않고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg일 수 있으나, 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
현재까지 염증성 장질환 치료제 후보물질로 IL-10에 대한 다수의 임상시험이 수행되어 왔으나, 전신반응으로 인한 빈혈과 혈소판감소증이 발생되는 부작용이 있었으며, 그나마 효과가 있었던 임상시험은 IL-10을 발현하도록 유전자 조작된 유전자 변형 Lactobacillus lactis 유산균을 경구투여한 경우로서 이 경우 부작용은 그리 크지 않았다. 이에, 본 발명자들은 IBD 치료용 후보물질로 연구되고 있는 GLP-2의 수용체가 장에서 가장 많이 발현된다는 점에 착안하여 IL-10의 전신성 투여 시 나타나는 부작용을 최소화하고 GLP-2와 IL-10의 혼용에 따른 상승작용을 기대하면서 GLP-2와 IL-10을 본 발명자들이 개발한 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질인 NTIG의 N-말단과 C-말단에 각각 연결한 이중 특이성 융합단백질을 고안함으로써 본 발명을 완성하였다. 뿐만 아니라, 본 발명의 융합단백질은 FcRn에 대한 특이적 결합도가 높고 다른 Fcγ 수용체에 대한 결합친화도가 매우 낮아 체내 반감기가 수분에 불과한 GLP-2 수용체 작용제의 체내 반감기를 극대화할 수 있을 것으로 판단되기 때문에, 단장증후군이나 염증성 장질환에 대하여 이들 질환에 대한 종래 생물의약에 비하여 더 효율적일 뿐 아니라, 부작용 가능성이 낮을 것으로 예상된다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예: 이중 특이성 융합단백질의 고안
본 발명자들은 다양한 GLP-2 유사체와 다양한 IL-10 단백질을 각각 본 발명자들에 의해 고안된 FcRn에 특이적 결합 친화도가 향상되어 반감기가 증가하고 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도가 낮아 ADCC(antibody-dependent cellular cytotoxicity)나 CDC(complement-dependent cytotoxicity)와 같은 부작용의 위험이 감소한 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질(이하, "NTIG"로 명명함)의 N-말단 및 C-말단에 연결함으로써 다양한 이중 특이성 융합단백질을 고안하였다(도 1 및 표 1).
본 발명의 다양한 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 구성
실시예 코드 컨스트럭트
(서열번호)		 GLP-2
(서열번호)		 IL-10
(서열번호)		 Total Protein
(after Protein A)
Purity (SE-HPLC)
1 PG-72 GLP-2(HA deletion)-NTIG-IL-10 wt (52) HA deletion (2) wt
(8)		 (100 ml TX) 0.6 mg (66.4%)
Cleavage form
2 PG-73 GLP-2G-NTIG-IL-10wt (53) A2G mutant (3) wt
(8)		 (100 ml TX) 0.5 mg (66.7%)
Cleavage form
3 PG-210-5 GLP-2 variant(3 point mutation)-NTIG-IL-10Vm(Ig joining linker) (54) 3 point mutation
(4)		 IL-10Vm
(11)		 (240 ml TX) 3.48 mg (88.3%)
4 PG-210-6 GLP-2 variant(3 point mutation)-NTIG-IL-10Vm (IgG1 hinge) (55) 3 point mutation
(4)		 IL-10Vm
(11)		 (240 ml TX) 5 mg (90.7%)
5 PG-210-7 GLP-2G-NTIG-IL-10Vm (56) A2G mutant (3) IL-10Vm
(11)
6 PG-210-8 GLP-2 variant(3 point mutation)-NTIGKnob-20 a.a. linker-IL-10Vm (57)
GLP-2 variant(3 point mutation)-NTIGHole (58)		 3 point mutation
(4)		 IL-10Vm
(11)
7 PG-210-9 GLP-2 variant(3 point mutation)-NTIGKnob-1 a.a linker-IL-10Vm (59)
GLP-2 variant(3 point mutation)-NTIGHole (58)		 3 point mutation
(4)		 IL-10Vm
(11)
8 PG-210-10 GLP-2 variant(3 point mutation)-NTIGKnob-5 a.a linker-IL-10Vm (60)
GLP-2 variant(3 point mutation)-NTIGHole (58)		 3 point mutation
(4)		 IL-10Vm
(11)
9 PG-210-11 GLP-2 variant(3 point mutation)-NTIGKnob-10 a.a linker-IL-10Vm (61)
GLP-2 variant(3 point mutation)-NTIGHole (58)		 3 point mutation
(4)		 IL-10Vm
(11)
비교예 1 PG-22 GLP-2G-NTIG (62) A2G mutant (3) -
비교예 2 PG-22V GLP-2 variant(3 point mutation)-NTIG 3 point mutation (4) -
비교예 3 PG-010 NTIG-IL-10Vm - IL-10Vm (11)
비교예로는 IL-10 단백질이 부가되지 않은 융합단백질로 GLP-2G-NTIG 융합단백질(PG-22, 비교예 1), GLP-2V-NTIG 융합단백질(PG-22V, 비교예 2) 및 부가되지 않은 융합단백질인 NTIG-IL-10Vm(PG-010, 비교예 3)을 사용하였다. 비교예 2의 경우 PG-22에서 GLP-2G 대신에 3 포인트 돌연변이인 GLP-2V를 사용한 것이고, 비교예 3의 경우 NTIG 단백질에 IL-10Vm만 연결한 형태를 사용하였다.구체적으로 실시예 1의 융합단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 GLP-2(HA deleted) 변이체를 서열번호 13으로 기재되는 NTIG 단백질의 N-말단에 서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 제1링커펩타이드로 연결하고, 상기 NTIG 단백질의 C-말단에 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 인간 야생형 IL-10 단백질(IL-10wt)을 서열번호 29로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 제2링커 펩타이드에 의해 연결되도록 고안하였고, 상기 융합단백질의 각 구성요소 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 합성하거나 PCR로 증폭하여 제조한 후, GLP-2 sub-vector, NTIG sub-vector, 및 IL-10 sub-vector 및 골격벡터(pBispecific vector, Genexine, Inc.)에 서브클로닝한 후, 한 tube에서 반응시켜 최종 벡터 컨스트럭트를 제조하였다. 상기와 마찬가지로 실시예 2 내지 4의 융합단백질을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터 컨스트럭트를 제조하였다. 실시예 2의 경우 실시예 1의 융합단백질과의 차이점은 GLP-2의 N-말단의 두 아미노산이 제거된 형태가 아니라 두 번째 아미노산이 글리신으로 치환된 Teduglutide(서열번호 3)을 사용하였다는 점이고, 실시예 3 및 4는 상기 Teduglutide에서 자가 이량체 형성을 방지하기 위해 16번째 아미노산인 아스파라긴이 글리신으로 치환되고(N16G) 및 17번째 아미노산인 류신이 글루타민으로 치환된(L17Q) 3 포인트 돌연변이체(서열번호 4)가 사용되었다는 점이다. 실시예 3 및 4의 차이는 GLP-2 변이체와 NTIG를 연결하는 링커 펩타이드가 각각 서열번호 20 및 서열번호 21로 기재되는 펩타이드를 사용하였다는 점이다. 실시예 5는 실시예 4에서 GLP-2를 3 포인트 돌연변이체 대신에 서열번호 3의 Teduglutide를 사용하였으며, 실시예 6은 GLP-2 3 포인트 돌연변이체가 NTIG 내에 도입된 KIH(Knobs-into-Holes) 구조에 의해 이형 이량체를 형성하도록 고안되었는데, IL-10Vm은 Knob이 도입된 하이브리드 Fc 영역(NTIGKnob)에 서열번호 29의 20 a.a. 길이의 링커 펩타이드에 의해 연결되었고, Hole이 도입된 하이브리드 Fc 영역(NTIGHole)에는 GLP-2V만 연결이 되고 IL-10Vm이 연결되지 않도록 고안하였다. 실시예 7 내지 9의 융합단백질은 상기 실시예 6의 이형 이량체형 융합단백질에서 링커의 길이만 각각 1 a.a.(G), 5 a.a(GGGGS, 서열번호 26) 및 10 a.a(GGGGSGGGGS, 서열번호 65)로 교체한 것이다. 상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트들 중 실시예 1 및 2의 컨스트럭트를 Thermo Fisher사의 ExpiCHO kit를 이용하여 일시적 발현을 수행하였다. 구체적으로 ExpiCHO-S cell에 상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트와 키트 내에 포함되어 있는 ExpiFectamine 시약을 혼합한 후 8% CO2 및 37℃의 조건을 갖춘 배양기에서 1일간 배양 후 온도를 32℃로 낮춰서 7일 차까지 배양을 진행하였다.
상기 배양을 통해 얻어진 상층액을 Protein A 칼럼 및 이차 칼럼을 통해 정제된 융합단백질(각각, 'PG-72', 및 'PG-73'로 명명함)을 4X LDS 시료 완충액과 주사용수로 적절히 희석하여 최종 3-10 μg/20 μL이 되도록 조제하였다. 환원조건 시료의 경우 각 분석하고자 하는 물질과 4X LDS 시료 완충액, 10X 환원제와 주사용수를 적절히 희석하여 최종 3-10 μg/20 μL이 되도록 조제하고 70℃ 가열블록에서 10분간 가열하였다. 준비된 시료를 미리 설치된 전기영동 장비에 고정된 겔의 각 웰에 20 μL씩 적재하였다. 사이즈 마커의 경우 3~5 μL/well을 적재하였다. 전원공급장치를 120 V, 90분으로 설정한 후 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 완료된 겔을 분리한 후 염색용액 및 탈-염색 용액을 이용하여 염색하고, 결과를 분석하였다.
우선 PG-72 및 PG-73의 발현을 조사하였는데, 도 2 및 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질이 정상적으로 발현이 됨을 확인할 수 있었다. 특히, 맨 앞쪽 두 개의 아미노산(HA)이 결실된 형태의 GLP-2 유사체를 사용하는 것이나 2번째 아미노산이 변이된 GLP-2-2G를 사용하는 것에 의한 차이는 나타나지 않았다. 따라서, GLP-2 자체의 변이는 구조에 큰 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다. 그러나, 비환원 조건의 SDS-PAGE 결과 주 밴드 아래쪽에 다수의 결실된 형태의 밴드가 확인되었으며, 이는 도 4에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라 생산된 융합단백질의 이량체에서 하나 또는 두 개의 GLP-2가 절단된 형태가 존재함을 시사하는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 GLP-2와 NTIG 사이에 삽입된 링커 펩타이드가 다소 불안정한 것으로 판단하였다.
이에, 본 발명자들은 PG-72 및 PG-73에서 GLP-2와 NTIG 사이에 사용하였던 링커를 각각 서열번호 20 및 21로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것으로 교체하고, 기존에 단백질 발현 시 이량체를 형성함으로써 단백질 생산 수율의 저하를 가져오는 것으로 알려진 IL-10wt를 본 발명자들이 고안한 단량체성 IL-10 변이체(IL-10Vm)으로 교체한 새로운 이중 특이성 융합단백질을 고안하여(PG-210-5 및 PG210-6), 이를 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 상술한 방법과 유사하게 제조한 후, 발현벡터에 삽입하여 일시적 발현을 진행하였다.
그 결과, 도 5 및 6에서 확인되는 바와 같이, PG-210-5의 경우 비환원 조건에서의 절단된 형태가 감소하여 240 ml 배양액에서 3.48 mg을 수득할 수 있었고, 순도는 88.3%를 달성할 수 있었고, Nano drop을 이용한 정량분석 결과 0.695 mg/ml의 시료를 확보할 수 있었으며, PG-210-6의 경우 240 ml 배양액에서 5 mg을 수득할 수 있었고, 순도는 90.7%를 달성할 수 있었고, Nano drop을 이용한 정량분석 결과 0.63 mg/ml 농도의 시료를 확보할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질은 GLP-2 유사체와 NTIG 단백질 사이의 링커의 변화 및 IL-10 단백질의 종류를 단량체성 변이체로 변경함으로서 단백질 생산 수율이 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다.
이후, 상기 확보된 이중 특이성 융합단백질을 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 pAD15 발현벡터(WO2015/009052A)에 삽입한 후, CHO DG44(from Dr. Chasin, Columbia University, USA) 세포에 형질감염시킨 후, 이중 특이성 융합단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 구축하였다.
아울러, 본 발명자들은 상기 실시예 6의 융합단백질(PG-210-8)을 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 상술한 방법과 유사하게 제조한 후 이를 HEK-293F 숙주세포에 형질도입시킨 후 일시적 유전자 발현을 유도하였다.
상기와 같이 형질도입된 숙주세포를 6 일간 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양한 후 배양상등액을 상술한 바와 같이 Protein A 컬럼을 이용한 크로마토그래피로 1차 정제한 후 SDS PAGE 분석 및 HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과 도 7a에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 6의 융합단백질(PG-210-8)은 환원조건에서는 두 개의 Fc 쇄가 명확하게 구분이 되었고 비환원 조건에서는 하나의 밴드로 나타나 이형 이량체를 형성하고 있음을 확인할 수 있었다. 한편, HPLC 분석 결과 순도는 약 85.69%인 것으로 드러났다(도 7b).
이에 본 발명자들은 상기 1차 정제한 융합단백질을 크기배제 HPLC(SEC-HPLC)를 이용하여 추가적으로 정제하였으며, 정제된 단백질을 상술한 바와 같이 SDS PAGE 및 HPLC 분석으로 분석하였다(도 7c 및 7d). 그 결과, 표 2 및 도 7d에서 나타난 바와 같이, 단백질의 회수율은 61.3%, 순도는 96.72%로 확인되었다.
2차 정제 결과
실시예 농도(mg/ml) 단백질량(mg) 회수율(%) 순도 (%)
6 1.88 8.46 61.3 96.72
실험예 1: 시험관 내 GLP-2 활성 분석1-1: cAMP 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 정제된 융합단백질이 GLP-2 활성을 정상적으로 나타내는지 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예에서 제조된 이중 특이성 융합단백질의 GLP-2 시험관내(in vitro) 활성을 cAMP 분석으로 조사하였다. 구체적으로, GLP-2 특이적인 반응에 의해 cAMP가 유도되는 정도를 평가하기 위해, cAMP HunterTM eXpress GLP2R CHO-K1 GPCR Assay kit(DiscoverX, Cat# 95-0062E2CP2M)를 사용하였다. cAMP HunterTM eXpress Assay cell을 96 웰 플레이트에 접종하여 16 시간 배양 후, 상기 실시예 3 및 4의 융합단백질(PG-210-5 및 PG-210-6) 및 비교예로 사용한 PG-22를 0.1 내지 10 nM의 농도로 각각 처리하고 30분간 배양하였다. 항-cAMP 항체와 cAMP 검출시약을 넣고 1 시간 이후에 발광신호(luminescent signal)를 측정하여 약물의 생물학적 활성(EC50)을 평가하였다.
그 결과, 도 8 및 표 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 융합단백질 중 PG210-6은 비교예인 PG-22와 GLP-2 활성이 거의 유사하였고, PG-210-5는 PG-210-6에 비해 절반 정도의 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
특히 PG-210-5는 종래 특허문헌(US7812121B2)에서 사용된 링커 펩타이드가 적용된 단백질로서, 본 발명에서 사용한 (G4S)3 + IgG1 힌지의 혼합 링커 펩타이드가 적용된 PG-210-6의 생산성 및 GLP-2 활성이 우수한 것은 매우 고무적인 현상이라고 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 GLP-2 활성 분석
실시예 3
(PG-210-5)		 4
(PG-210-6)		 비교예
(PG-22)
1차 EC50 (nM) 7.44 2.46 2.84
상대활성 (%) 38.1% 115% 100%
2차 EC50 (nM) 5.95 2.93 2.65
상대활성 (%) 44.5% 90% 100%
평균활성 (%) 41% 102.5% 100%
1-2: STAT3 리포터 분석
본 발명자들은 정제된 융합단백질(PG-210-8)이 IL-10 활성을 정상적으로 나타내는지 여부를 확인하기 위해 상기 실험예 1-1과 별도로 IL-10의 하위단계 신호인 STAT3 전사 활성을 시험관내(in vitro) 분석을 통해 조사하였다.
이를 위해 구체적으로 실시예 4의 PG-210-6 및 실시예 6의 PG-210-8의 IL-10 활성여부를 확인하기 위해, IL-10 수용체 및 IL-10의 하위 신호인 STAT3 리포터 유전자를 형질감염시킨 HEK-293 세포주를 이용한 HEK-Blue IL-10 Cells(invivogen, Cat# hkb-IL10)를 사용하였다. HEK-Blue IL-10 Cell을 96 웰 플레이트에 5x104으로 파종한 뒤, 융합단백질(PG210-6 및 PG210-8) 및 양성 대조군으로서 재조합 IL-10 단백질을 0.001 ~ 10 nM의 농도로 각각 처리하고 37℃ 배양기에서 18시간 동안 배양하였다(도 9a).
다음 날 반응시킨 상층액을 새로운 96 웰 플레이트에 옮겨준 뒤 검출시약을 넣고 1시간 이후에 630 nm에서 발광신호를 측정하여 약물의 생물학적 활성(EC50)을 평가하였다.
그 결과 도 9b 및 표 4에서 나타난 바와 같이, 제조된 융합단백질 중 PG-210-6은 대조군인 재조합 IL-10 단백질 대비 1/3정도의 활성을 나타내었고, PG-210-8의 경우 PG-210-6 대비 3.4배 정도 낮은 활성을 나타냈다.
물질 rhIL-10 PG-210-6 PG-210-8
EC50(pM) 45.8 149 505
상대활성(%) 100 30.7 9.06
실험예 2: PG-210-6의 면역억제 활성 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-210-6)의 시험관 내 면역억제 활성을 분석하였다.
이를 위해 구체적으로, 배양 중인 대식세포 Raw264.7가 들어 있는 T75 플라스크에서 상등액을 제거해준 후 PBS로 1회 세척한 후, TrypLETM Select Enzyme 3 ml을 첨가하고 37℃에서 3 내지 5분간 반응시켰다. 그런 다음 새로운 배지 10 ml을 T75 플라스크에 첨가하고 플라스크 바닥에서 떨어진 세포부유액을 50 ml 코니칼 튜브에 옮긴 후 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 이어, 상층액을 제거하고 튜브를 가볍게 두드려줘서 세포를 풀어주었다. 그런 다음 새로운 배지 5 ml을 혼합하고 세포를 계수하였다. 세포의 농도가 1x105 cells/ml이 되도록 조정한 후 96-웰 평편바닥 플레이트에 100 μl 씩 분주하였다.
그런 다음, 실시예 4에서 제조된 PG-210-6을 다양한 농도(0 내지 1,000 nM)로 순차 희석한 후 상기 Raw264.7 대식세포가 분주된 96-웰 플레이트에 50 μl 씩 처리하였다. 20분 경과 후 LPS(lipopolysaccharide)를 최종 농도가 400 ng/ml이 되도록 하여 50 μl 씩 처리해주고 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 다음날, 상등액을 모아준 후 제조사(Biolegend, USA)의 프로토콜에 따라서 TNF-α ELISA 분석을 수행하였다.
그 결과 도 10에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질은 농도 의존적으로 대식세포에서의 TNF-α의 분비를 억제하는 것으로 확인되었다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질에 연결된 단량체성 IL-10 변이체 단백질(IL-10Vm)이 NTIG 단백질의 C-말단에 연결되더라도 적절하게 작동함을 의미하는 것이다.
실험예 3: GLP-2R에 대한 결합능 분석
본 발명자들은 상기 실시예에서 제조된 PG-210 융합단백질의 GLP-2 수용체(GLP-2R)에 대한 결합여부를 확인하기 위해 FACS(유세포분석기)를 이용하여 결합능을 평가하였다.
이를 위해, 본 발명자들은 GLP-2 수용체를 발현하고 있는 HEK-293 세포주를 사용하여 결합여부를 확인하였는데, 우선 HEK-293 세포주를 배양한 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG210-6, PG210-7) 및 대조군인 GLP-1(PG-11)와 비교예로서 비교예 1(PG-22) 및 비교예 2(PG-22V)를 다양한 농도(1, 10, 100, 1000 nM)로 30분간 처리하여 반응 시켰다(도 11a).
그 후 미 반응 단백질을 세척으로 제거한 다음, PE-결합 IgG4 항체를 20분간 처리하여 염색을 수행하였고 FACS(유세포분석기)를 이용하여 결과를 측정하였다.
그 결과 도 11b 및 표 5에서 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 PG-11의 경우 1-1000 nM 농도에서 GLP-2 수용체에 전혀 결합을 하지 않았고 PG-210 및 PG-22의 경우 GLP-2 수용체를 세포막 표면에 발현하는 HEK-293 세포에 유사한 수준으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
GLP-2R 결합력 분석 결과
실시예 처리농도 (nM)
0 1 10 100 1000
PG-11 (GLP-1) 3.99 5.14 3.99 6 6.79
비교예 1 (PG-22) 3.99 12.2 64.8 89.2 91.6
실시예 5 (PG-210-7) 3.99 8.78 51 86.6 91.7
비교예 2 (PG-22V) 3.99 10.1 51.4 79.9 82.8
실시예 4 (PG-210-6) 3.99 8.89 48.6 78.9 85.5
실험예 4: 생체 내 활성 분석
4-1: 약물 동태학 분석
본 발명자들은 본 발명의 융합단백질이 체내 투여 시 안정성이 얼마나 되는지 확인하기 위해, 약물 동태학 분석을 수행하였다.
이를 위해 구체적으로, 각 그룹당 3두의 SD 랫트를 대상으로 본 발명의 융합단백질(PG-210-6 및 PG-210-8)을 1 mg/kg의 투여량으로 정맥 주사하여 0분, 5분, 1시간, 5시간, 10시간, 24시간, 48시간, 72시간, 120시간, 및 168시간에 혈청을 채취해서 인간 IgG4 Fc ELISA를 이용하여 상기 융합단백질을 정량하였다.
그 결과, 도 12 및 표 6에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 융합단백질은 시간의 경과에 따라서 완만한 감소양상을 나타냈는데, 이는 해당 융합단백질이 체내에서 상당 기간 안정적으로 유지됨을 보여주는 것이다.
Fc ELISA 반감기 (hr) Cmax (ng/ml) AUClast (ng*hr/mL)
PG-210-6 87.7 ± 14.4 19126.0 ± 1642.1 556369.1 ± 36297.3
PG-210-8 209.5 ± 59.6 20294.5 ± 2655.8 793289.1 ± 37933.2
비율 2.4 1 1.4
4-2: 생체 내 약물 분포 분석
본 발명 융합단백질의 체내 분포도를 확인하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따른 PG-210-6에 CF750 형광단을 VivoBrite rapid antibody labeling kit(Biotium, Cat 92161)를 이용하여 접합하였다.
형광/단백질 몰랄 비율(degree of labeling, DOL)은 키트에서 제공하는 공식에 따라 권장하는 예상 비율에 맞게 측정하여 진행하였다. 정상 C57BL/6 마우스에 CF750 형광이 표지된 PG-010 및 PG-210-6을 100 μg/100 μl의 용량으로 정맥 주사하였다(도 13a).
주사 후 24시간이 경과된 시점에 소동물 생체 이미징 시스템을 이용하여 마우스로부터 방출되는 형광 신호를 검출하였으며, 간, 신장, 폐, 비장, 소장, 대장 등을 적출하여 조직별 항체 분포의 형광 신호를 확인하였으며, 형광 신호 분석은 living imaging software를 이용하여 수행하였다.
실험 결과 도 13b에서 확인되는 바와 같이, PG-210-6은 PG-010 대비 혈액에서 낮은 형광 강도를 나타냈고 간과 장쪽에 더 분포하는 것을 확인할 수 있었다.
아울러 본 발명자들은 혈액 시료(200 μl)를 채취하여 광학 이미징 장비로 형광강도를 측정하였다.
그 결과 도 13c 및 표 7에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 PG-210은 비교예 3(PG-010) 대비 낮은 형광 강도를 나타냈다.
분석 물질 24시간 경과시 형광강도
(x106 p/s/cm2/sr)		 비율
음성 대조군(PBS) 0.91 -
비교예 3(PG-010) 6.97 ± 0.802576 1
실시예 4(PG-210-6) 3.60 ± 0.447867 0.44
4-3: 생체 내 GLP-2 활성 분석
이어 본 발명자들은 생체 내에서 PG-210-6의 GLP-2 활성을 확인하기 위하여 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 PG-210을 29.4 nmol/kg으로 정맥 투여한 뒤 12일째 되는 날 분석을 진행하였다.
분석항목으로는 GLP-2의 주요 활성 지표인 장 길이 및 무게 증가여부를 확인하였다.
그 결과, 도 14에서 나타난 바와 같이, 대조군(vehicle) 대비 PG-210-6 투여군에서 소장 중량은 40% 증가하였고, 대장 길이는 18% 증가하여 유의성 있는 장 무게 및 길이 증가를 확인하였고, 이를 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질이 실제 생체 내에서 GLP-2 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
4-4: T 세포-유도 대장염 모델 분석
도 16a는 본 분석의 개요도로 Rag1 ko 마우스를 사용하여 day 0에 naive CD4+ Treg 세포 5x105 개를 정맥투여하여 대장염 모델을 유도하였고 동시에 다양한 투여량의 PG-210-6 및 양성 대조군인 TNFα 항체를 일주일에 한번씩 3주 동안 투여하여 투여된 약물의 효능을 확인하였다(도 15a).
투여된 약물의 효능은 설사 지수(diarrhea score)와 체중 감소율을 측정함으로써 평가하였는데, 설사 지수는 도 15b의 하단에 기재된 기준에 따라 평가였다. 분석 결과, 도 15b에서 나타난 바와 같이, 질환 유도군 및 항-TNFα 항체 투여군 대비 PG-210 투여군에서 농도 의존적으로 설사 지수가 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 마찬가지로 도 15c에서 나타난 바와 같이, 질환 유도군 및 항-TNFα 항체 투여군 대비 PG-210-6 투여군에서 농도 의존적으로 체중 감소가 적은 것을 확인할 수 있었다.
4-5: 대장 길이에 미치는 영향 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-210-6)의 생체 내 투여 시 대장 길이의 변화를 조사함으로써 GLP-2 활성을 평가하였다.
구체적으로 IBD 질환 모델 마우스(포항공과대학교에서 제조)에 양성 대조군인 항-TNF 항체와 다양한 농도의 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-210)를 4주간 주 1회 씩 투여한 후, 마우스를 희생시킨 후 각 실험군 별로 변화된 장의 길이를 측정하였고, 장 조직의 박편에 대한 조직염색을 수행하여 대장 두께의 변화를 관찰하였다.
그 결과 도 16a 및 16b에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질은 10 mg/kg 체중 투여군에서 통계적으로 유의한 장 길이의 증가를 확인할 수 있었고, 도 16c에서 나타난 바와 같이, PG-210-6 3 및 10 mg/kg 체중 투여군에서 장 두께의 감소를 확인할 수 있었다.
상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 이중 특이성 융합단백질은 약학 분야 특히, 단장증후군이나 염증성 장질환의 치료제 개발에 활용될 수 있다.

Claims (21)

  1. GLP-2 또는 그의 유사체가 IL-10 단백질에 연결된 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 GLP-2 또는 그의 유사체는 서열번호 1 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 IL-10 단백질은 면역 활성 증진 작용이 억제된 변이체 및/또는 단량체성 변이체인, 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 면역 활성 증진 작용이 억제된 변이체는 야생형 인간 IL-10 단백질의 87번째 아미노산인 이소류신(I)가 알라닌(A)로 치환된 것인, 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 단량체성 변이체는 야생형 인간 IL-10 단백질의 134번째 아미노산인 아스파라긴(N)과 135번째 아미노산인 라이신(K) 사이에 길이 6 내지 12 a.a.의 링커 펩타이드가 삽입된 것인, 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 IL-10 단백질은 서열번호 8 내지 11로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  7. 항체 Fc 영역의 N-말단에 GLP-2 또는 그의 유사체가 연결되고 상기 항체 Fc의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 GLP-2 또는 그의 유사체는 서열번호 1 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 IL-10 단백질은 면역 활성 증진 작용이 억제된 변이체 및/또는 단량체성 변이체인, 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 면역 활성 증진 작용이 억제된 변이체는 야생형 인간 IL-10 단백질의 87번째 아미노산인 이소류신(I)가 알라닌(A)로 치환된 것인, 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 단량체성 변이체는 야생형 인간 IL-10 단백질의 134번째 아미노산인 아스파라긴(N)과 135번째 아미노산인 라이신(K) 사이에 길이 6 내지 12 a.a.의 링커 펩타이드가 삽입된 것인, 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 항체 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgD의 Fc 영역 또는 2종 이상의 아이소타입의 Fc 영역이 혼합된 하이브리드 항체 Fc 영역인, 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  13. 제7항에 있어서,
    상기 항체 Fc 영역은 서열번호 12 내지 16, 63 및 64로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 이중 특이성 융합단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 이중 특이성 융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질 이량체.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 이중 특이성 융합단백질을 암호호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제15항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 이중 특이성 융합단백질 또는 이를 포함하는 이량체를 유효성분으로 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    염증성 장질환 또는 단장증후군의 치료에 사용되는, 조성물.
  19. 치료적으로 유효한 양의 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 이중 특이성 융합단백질 또는 상기 이중 특이성 융합단백질을 포함하는 이량체를 염증성 장질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 염증성 장질환의 치료방법.
  20. 제19항에 잇어서,
    상기 염증성 장질환은 크론병, 궤양성 대장염, 또는 베체트병인, 치료방법.
  21. 치료적으로 유효한 양의 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 이중 특이성 융합단백질 또는 상기 이중 특이성 융합단백질을 포함하는 이량체를 단장증후군에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 단장증후군의 치료방법.
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