WO2021215878A1 - 미세소포체 분리방법 및 미세소포체 분리장치 - Google Patents

미세소포체 분리방법 및 미세소포체 분리장치 Download PDF

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WO2021215878A1
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신세현
김현성
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고려대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for separating microvesicles from a biological sample and a device for separating microvesicles.
  • Microvesicles are membrane vesicles released by cells and include exosomes or extracellular vesicles. Microvesicles from various cellular sources are attracting attention as novel diagnostic markers of disease because they share the characteristics of parent cells. However, microvesicles are difficult to extract because they have a very small size of 50 ⁇ 200 nm.
  • the immunoaffinity separation method is a method of separating an antibody by attaching an antibody to the extracellular vesicle, and it is possible to separate specific microvesicles with very high specificity. there is In addition, since the process of making the antibody takes a long time and costs a lot, it is not suitable for practical diagnosis.
  • the method using a polymer is a technology that makes the microvesicles sink by adding PEG (polyethylene glycol) to the sample to lower the solubility.
  • PEG polyethylene glycol
  • Another object of the present invention is to provide a method for separating microvesicles and a device for separating microvesicles with high efficiency and for separating microvesicles contained in a biological sample that does not require additional post-treatment.
  • embodiments of the present invention include a method for separating microvesicles and a device for separating microvesicles.
  • An embodiment of the present invention provides a method for separating microvesicles for separating microvesicles contained in a biological sample, the method comprising: (a) adding adsorbent spheres to a biological sample containing microvesicles; (b) maintaining the adsorbent spheres in the biological sample to form an adsorbent sphere complex in which the microvesicles are entrapped on the adsorbent spheres; (c) separating the adsorbent complex from the biological sample; (d) washing the separated adsorbent sphere complex using a first reagent; and (e) eluting the microvesicles from the washed adsorption sphere complex using a second reagent, wherein the adsorption sphere includes a support and one or more polyvalent cations provided on the surface of the support , a method for isolating microvesicles from a biological sample.
  • the biological sample is any one of blood, plasma, serum, urine, saliva, cerebrospinal fluid, tears, sweat, feces, ascites, amniotic fluid, semen, milk, cell medium, tissue extract, and cancer tissue. may include more than one.
  • the support part is polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate, polyethylene glycol, polystyrene vinylbenzene, polystyrene, hydrogel, agarose, ceramic, silica gel, latex, metal particles, glass particles, It may include any one or more of magnetic particles, metal wires, and metal wires to which magnetic nanoparticles are bonded.
  • the polyvalent cation is polylysine, protamine, polyarginine, polyhistidine, cationic dextran, cationic dendrimer, cationic polysaccharide, polyamidoamine, polyethyleneimine, polyquaternium, poly-2 -dimethylaminoethyl methacrylate (PDMAEMA), poly (2-dimethylaminomethyl styrene) (PDMAMS), poly-1-vinylpyrrolidone (p1-VP), poly diethylaminoethyl acrylate (pDEAEA), Poly dimethylaminoethyl acrylate (pDMAEA), poly diethylaminoethyl methacrylate (pDEAMA), lipopolyamines, quaternary ammoniums, guanidine, imidazole, polyaniline ( polyaniline), polypyrrol (polypyrrol), and chitosan (chitosan) may include any one or more.
  • the support portion is provided in a spherical shape, the average diameter of the support portion may be 200 nm or more and 100 ⁇ m or less.
  • the support part may include at least one of porous particles, a membrane, and a mesh.
  • the support part may further include irregularities formed on the surface.
  • the support part is one or more metals selected from the group consisting of iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), manganese (Mn), bismuth (Bi), and zinc (Zn) or these It may comprise an alloy or a magnetic bead containing a metal oxide or alloy oxide selected therefrom.
  • the support portion includes a core portion provided in the center, and a shell portion provided to surround the outer surface of the core portion, the core portion polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate, polyethylene glycol, Polystyrene vinylbenzene, polystyrene, hydrogel, agarose, ceramic, silica gel, any one or more of latex, the shell portion is iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), manganese (Mn), bismuth (Bi) ) and one or more metals or alloys thereof selected from the group consisting of zinc (Zn) or contains a metal oxide or alloy oxide selected from these, and the polyvalent cation is poly-L-lysine polymer (poly-L-lysine, PLL), protamine, quaternary ammoniums, chitosan (chitosan), and may include any one or more of polyhistidine.
  • the core portion polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate, polyethylene glycol, Poly
  • the support portion includes a core portion provided in the center, and a shell portion provided to surround the outer surface of the core portion, the core portion iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), manganese (Mn), bismuth (Bi) and zinc (Zn) at least one metal or alloys thereof selected from the group consisting of or contains a metal oxide or alloy oxide selected from these,
  • the shell portion is polyacrylate, polyacrylamide, Polymethacrylate, polyethylene glycol, polystyrene vinylbenzene, polystyrene, hydrogel, agarose, ceramic, silica gel, any one or more of latex
  • the polyvalent cation is poly-L- lysine polymer (poly-L-lysine, PLL ), protamine (protamine), quaternary ammoniums (quaternary ammoniums), chitosan (chitosan) and may include any one or more of polyhistidine.
  • step (b) maintaining the adsorbent sphere in the biological sample may include stirring at a temperature of 1°C to 8°C at 50rpm to 150rpm for 10 minutes to 2 hours. .
  • the adsorption sphere complex is separated using a separation member, and the separation member is any one of a capture filter, magnetic separation, centrifugal separation, solubility separation, and separation according to particle size. may include more than one.
  • the adsorbent spheres in which the microvesicles are collected include washing under a first condition using a first reagent, wherein the first reagent is CH 3 COO ⁇ , SO 4 2 - , HCO - , SiO - , and OH - including any one or more, wherein the first condition is carried out one or more times within the pH range of any one or more of pH 5.5 to 6.5, and pH 7.5 to 9.5 may include
  • the adsorbent spheres in which the microvesicles are collected include eluting under a second condition using a second reagent, wherein the second reagent is CH 3 COO ⁇ , SO 4 2 - , Cl - , HCO - , SiO - , and OH - including any one or more, provided in a concentration range of 0.2 M to 3 M, the second condition is 500rpm to 2000rpm for a time of 1 minute to 60 minutes It may include being carried out one or more times while mixing.
  • the second reagent is CH 3 COO ⁇ , SO 4 2 - , Cl - , HCO - , SiO - , and OH - including any one or more, provided in a concentration range of 0.2 M to 3 M
  • the second condition is 500rpm to 2000rpm for a time of 1 minute to 60 minutes It may include being carried out one or more times while mixing.
  • step (e) after washing the adsorption sphere complex with the first reagent in step (d), primary auxiliary separation to separate the adsorption sphere complex, and the microvesicles as the second reagent in step (e) It further comprises a secondary auxiliary separation for separating the adsorbent sphere after eluting, wherein the support part is made of any one or more of polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate, polyethylene glycol, polystyrene vinylbenzene, and polystyrene. It is provided in the form of a bead having a circular cross section, and the primary auxiliary separation or secondary auxiliary separation may be performed with a capture filter having pores having a size of 50 nm to 1,000 nm.
  • step (e) after washing the adsorption sphere complex with the first reagent in step (d), primary auxiliary separation to separate the adsorption sphere complex, and the microvesicles as the second reagent in step (e) It further comprises a secondary secondary separation for separating the adsorption sphere after eluting, wherein the support part includes magnetic particles, and the primary secondary separation or secondary secondary separation is generated by flowing a current through an electromagnet, or a magnet It may include a magnetic separation using the.
  • the biological sample further comprises pre-treatment before adding the adsorbent sphere, wherein the pre-treatment of the biological sample is to filter the biological sample to separate materials having an average diameter greater than 0.8 ⁇ m from the biological sample.
  • pre-treatment of the biological sample is to filter the biological sample to separate materials having an average diameter greater than 0.8 ⁇ m from the biological sample.
  • the microvesicles are bound by at least one of electrostatic interaction and intercalation with the adsorbent sphere, and the zeta potential of the adsorbent sphere complex is 0.5mV to 10mV may be included.
  • the microvesicles collected on the adsorbent sphere have an average diameter of 20 nm to 800 nm, and the polyvalent cation is poly-L-lysine polymer (poly-L-lysine, PLL), protamine, It may include any one or more of quaternary ammoniums, chitosan, and polyhistidine.
  • PLL poly-L-lysine polymer
  • protamine It may include any one or more of quaternary ammoniums, chitosan, and polyhistidine.
  • the present invention relates to a reagent kit for separating microvesicles for separating microvesicles contained in a biological sample, comprising: one or more adsorbent spheres having binding to the microvesicles; a first reagent comprising any one or more of CH 3 COO ⁇ , SO 4 2 ⁇ , HCO ⁇ , SiO ⁇ , and OH ⁇ ; And CH 3 COO ⁇ , SO 4 2 - , Cl ⁇ , HCO ⁇ , SiO ⁇ , and a second reagent comprising any one or more of OH ⁇ Containing, the adsorption sphere is provided on the support portion and the surface of the support portion It may contain one or more polyvalent cations.
  • the reagent kit further comprises a separation member for separating the adsorption sphere or the adsorption sphere capturing the microvesicles, the separation member is a capture filter, magnetic separation, centrifugation, solubility separation, and particles It may include any one or more of separation according to size.
  • the support part is provided in the form of a bead having a circular cross-section made of any one or more of polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate, polyethylene glycol, polystyrene vinylbenzene, and polystyrene, and the polyvalent cation contains any one or more of poly-L-lysine polymer (poly-L-lysine, PLL), protamine, quaternary ammoniums, chitosan, and polyhistidine, and the separation member is 50 It may include a capture filter having a pore size of nm to 1,000 nm.
  • the support includes magnetic particles
  • the polyvalent cation is poly-L-lysine polymer (poly-L-lysine, PLL), protamine, quaternary ammoniums, chitosan ( chitosan) and polyhistidine
  • the separation member may include a device for generating current by flowing an electromagnet or magnetic separation using a magnet.
  • microvesicles from a biological sample with high yield and high purity in a short period of time without treatment by expensive equipment such as centrifugation, for on-site diagnosis, etc. where a bulky device such as a centrifuge cannot be disposed. It can be useful.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating a method for separating microvesicles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a view schematically showing an adsorption sphere according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3a is a view schematically showing an adsorption sphere according to another embodiment of the present invention.
  • 3B is a view schematically showing a support according to another embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a view schematically showing a microvesicle separation method according to Example 1.
  • Example 5 is a result of confirming the separation ability of the extracellular vesicles using the PLL-bead according to Example 1 and a bare-bead, which is a bead to which a cationic polymer is not bound.
  • Example 6 is a view schematically showing a state in which the PLL-bead of Example 1 is manufactured.
  • FIG. 7 shows a fluorescent image of PLL-beads prepared by varying PLL concentrations in the manner according to FIG. 6 .
  • Example 8 is a result of confirming the performance according to various first reagents using Example 1.
  • Example 9 is a result of confirming the performance according to the first reagent to which a salt was added using Example 1.
  • Example 10 is a result of confirming the performance according to various second reagents using Example 1.
  • 11 is a graph showing particles, proteins, and purity included in the second reagent according to the type of the first reagent.
  • Example 12 is a result of evaluating the conventional centrifugation method and the separation method according to Example 1 of the present invention.
  • Example 13 is a view schematically showing a method for separating microvesicles according to Example 2.
  • Example 16 shows an SEM image, a fluorescence image, and a cryo-TEM image according to Example 2 and Comparative Example 2.
  • Example 17 is a result of confirming the zeta potential according to Example 2 and the volume change after incubation.
  • Example 20 is a Western blot result of Example 2 and Comparative Examples 2 to 4;
  • Example 21 is a performance evaluation result using the bioanalyzer of Example 2 and Comparative Examples 2 to 4, and exosome miRNA measurement results using RT-qPCR.
  • Example 23 is a graph depicting gene expression using microarrays according to Example 2 and Comparative Examples 2 to 4;
  • step ( 25 is a result of performance evaluation in Example 2 in step (a) of using the first reagent and step (b) of using the second reagent.
  • a range when a range is recited for a variable, that variable will be understood to include all values within the recited range, including the recited endpoints of the range.
  • a range of “5 to 10” includes the values of 5, 6, 7, 8, 9, and 10, as well as any subranges such as 6 to 10, 7 to 10, 6 to 9, 7 to 9, etc. It will be understood to include any value between integers that are appropriate for the scope of the recited range, such as 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 to 8.5 and 6.5 to 9, and the like.
  • a range of “10% to 30%” includes values such as 10%, 11%, 12%, 13%, and all integers up to and including 30%, as well as 10% to 15%, 12% to 18 It will be understood to include any subrange, such as %, 20% to 30%, and the like, and also include any value between reasonable integers within the scope of the stated range, such as 10.5%, 15.5%, 25.5%, and the like.
  • microvesicle is used in the same sense as an extracellular vesicle released from the cell membrane of Archaea, Prokarya, or Eukarya.
  • the microvesicles are exosomes, agrosomes, dexosomes, ectosomes, exovesicles, oncosomes, prominosomes in the present invention.
  • extracellular vesicles, microvesicles, and exosomes may all be used interchangeably to mean microvesicles without distinction of size.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating a method for separating microvesicles according to an embodiment of the present invention.
  • 2 is a view schematically showing an adsorption sphere according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3a is a view schematically showing an adsorption sphere according to another embodiment of the present invention.
  • 3B is a view schematically showing a support according to another embodiment of the present invention.
  • an embodiment of the present invention relates to a microvesicle separation method for separating microvesicles contained in a biological sample, comprising the steps of: (a) adding adsorbent spheres to a biological sample containing microvesicles; (b) maintaining the adsorbent spheres in the biological sample to form an adsorbent sphere complex in which the microvesicles are entrapped on the adsorbent spheres; (c) separating the adsorbent complex from the biological sample; (d) washing the separated adsorbent sphere complex using a first reagent; and (e) eluting the microvesicles from the washed adsorbent sphere complex using a second reagent.
  • the adsorption sphere may include a support and one or more polyvalent cations provided on the surface of the support.
  • adsorbents may be added into the biological sample.
  • the biological sample may include a biological sample including microvesicles or a cell culture solution, a tissue sample, and the like, and specifically, the biological sample includes blood, plasma, serum, urine, saliva, cerebrospinal fluid, tears, sweat, feces, ascites, It may include any one or more of amniotic fluid, semen, milk, cell medium, tissue extract, and cancer tissue.
  • Step (a) may further include preparing the adsorbent sphere.
  • the adsorption sphere 100 may include a support 110 and a polyvalent cation 120 coupled to an outer surface of the support 110 .
  • the adsorption sphere 100 has a support part 110 having a reactive group or functional group having reactivity on the surface, and a polyvalent cation having a group that chemically reacts with the reactive group or functional group of the support part 110 . (120) may be included.
  • the support 110 is polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate, polyethylene glycol, polystyrene vinylbenzene, polystyrene, hydrogel, agarose, ceramic, silica gel, latex, metal particles, glass particles, magnetic particles, It may include any one or more of a metal wire and a metal wire to which magnetic nanoparticles are bonded.
  • the polyvalent cation 120 is polylysine, polyarginine, polyhistidine, protamine, cationic dextran, cationic dendrimer, cationic polysaccharide, polyamidoamine, polyethyleneimine, polyquaternium, poly-2-dimethyl Aminoethyl methacrylate (PDMAEMA), poly(2-dimethylaminomethyl styrene) (PDMAMS), poly-1-vinylpyrrolidone (p1-VP), poly diethylaminoethyl acrylate (pDEAEA), poly dimethyl It may include any one or more of aminoethyl acrylate (pDMAEA), and poly diethylaminoethyl methacrylate (pDEAMA).
  • the polyvalent cation is any one or more of lipopolyamines, quaternary ammoniums, guanidine, imidazole, polyaniline, polypyrrol, and chitosan. may include.
  • the support 110 may have the same form as a polymer having a functional group by itself, or a form in which a functional group is introduced by plasma treatment, surface coating with a polymer having a functional group, or the like.
  • the support 110 may be provided in the form of a hydrogel, the surface area of the adsorption sphere may increase overall due to the porous nature of the hydrogel. Therefore, since the support 110 including the hydrogel increases the area in contact with the microvesicles, the capturing ability of the microvesicles can be further improved.
  • the support part 110 when the support part 110 has a reactive group or a functional group, such as polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate, polyethylene glycol, etc., the support part may be formed by itself.
  • the support part when the support part does not have a reactive group or a functional group by itself, such as metal particles, glass particles, magnetic particles, etc., it may be provided by surface treatment or surface coating with a material having a reactive group or functional group.
  • the polyvalent cation 120 may be provided to cover at least a portion of the surface of the support part 110 by chemical bonding with the support part 110, and the adsorption sphere 100 may have a positive charge by the polyvalent cation.
  • the support part 110 may be provided in a spherical shape, and the average diameter of the support part 110 may be 200 nm or more and 100 ⁇ m or less, and specifically 500 nm or more and 3 ⁇ m or less.
  • the support part 110 may be included within the above-described range.
  • the adsorption sphere 100 should effectively capture microvesicles among various materials included in the biological sample, and it is possible to prevent the attachment of other proteins, etc. included in the biological sample, and effectively remove the microvesicles having a predetermined size.
  • the support is provided in a range of 500 nm or more to 3 ⁇ m or less.
  • the support 110 includes a bead-shaped plastic (eg, polystyrene) or a bead-shaped metal (eg, iron (Fe)) having a surface functionalized with a carboxyl group or an amine group, and the polyvalent
  • the cation 120 may include a cationic polymer.
  • the support part 110 may be a hyaluronic acid microbead, and may include a form in which the polyvalent cation 120 is bonded to the surface.
  • hyaluronic acid microbeads as a support part, referring to Korean Patent Registration No. 10-1212258, a cationic polymer and an aqueous solution of hyaluronic acid are mixed, and then a weakly acidic aqueous solution is added thereto to produce electrospinning.
  • the support may include at least one of porous particles, a membrane, and a mesh.
  • the membrane or mesh may have a pore size of 200 nm or more to 100 ⁇ m or less. Preferably, the pores may have a size of 500 nm or more and 2 ⁇ m or less.
  • the membrane or mesh may be a plastic material, various metal materials, or materials having magnetism, but is not limited thereto.
  • the support may be formed with an uneven surface.
  • the unevenness formed on the surface of the support part increases the surface area of the support part, so that binding force with the polyvalent cation may be improved.
  • the surface area of the adsorption sphere may be increased as a whole. Thereby, the area in which the adsorption sphere can capture the microvesicles is increased, and the microvesicles are combined with multivalent cations on the surface of the adsorption sphere by electrostatic attraction, while at the same time by the surface irregularities of the adsorption sphere. Since it can be captured in the form of being inserted into the space formed concavely inside, it can be structurally fixed, so that the capture of the microvesicles can be performed more firmly.
  • the polyvalent cation 120 is a poly-L-lysine polymer (poly-L-lysine, PLL) having a molecular weight of 150-300 kDa, protamine, quaternary ammoniums, It may include any one or more of chitosan and polyhistidine, and the support 110 may include polystyrene having a carboxyl group.
  • PLL poly-L-lysine polymer having a molecular weight of 150-300 kDa, protamine, quaternary ammoniums
  • the support 110 may include polystyrene having a carboxyl group.
  • the adsorbent 100 is contained in the biological sample at a concentration of 0.5 mg/mL to 20 mg/mL, or 1 mg/mL to 20 mg/mL, or 3 mg/mL to 20 mg/mL, or from 5 mg/mL to 20 mg/mL, alternatively from 0.5 mg/mL to 18 mg/mL, alternatively from 0.5 mg/mL to 15 mg/mL, alternatively from 1 mg/mL to 15 mg/mL.
  • the adsorbent 100 may be included in the biological sample at a concentration of 5 mg/mL to 15 mg/mL.
  • a protein having a smaller size than the microvesicles is contained in the pores formed between the adsorption spheres 100 rather than the surface of the adsorption spheres 100.
  • the capture ability of the ER may be reduced, and when the adsorption sphere 100 is included too little, the adsorption efficiency of the microvesicles is low.
  • the support 110 is one or more metals or alloys thereof selected from the group consisting of iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), manganese (Mn), bismuth (Bi), and zinc (Zn). or a magnetic bead containing a metal oxide or alloy oxide selected from them.
  • the support part 110 When the support part 110 is a magnetic bead, the support part may be provided with a polyvalent cation coated on its surface.
  • the surface of the support part 100 may be provided with a surface modified by plasma treatment, electron beam treatment, or the like.
  • plasma treatment electron beam treatment
  • the support part 100 by providing the support part 100 in a chamber in which plasma is generated and treating it with plasma having a predetermined energy, cations, anions, electrons, or the like are formed on the surface of the support part 100, or functional groups, reaction It may be provided on the genitals and the like.
  • irregularities may be formed on the surface of the support part 100 .
  • the binding force with the polyvalent cations can be improved, and when irregularities are formed on the surface of the support part 100, by increasing the surface area for binding with the polyvalent cations, The support part 100 may be more effectively combined with the polyvalent cation.
  • the support part 100 is a magnetic bead
  • a surface modified with a positive charge (+) may be used.
  • the magnetic beads have a surface coated with silica and positively charged functional groups, for example, 3-aminopropyl group, aminomethyl group, 2-aminoethyl group, N-methyl-3-aminopropyl group, N-(2 -Aminoethyl)-3-aminopropyl group, N-aminoethyl-3-aminopropyl group or N,N-di(2-aminoethyl)-3-aminopropyl group modified with an amine group may be provided.
  • silica and positively charged functional groups for example, 3-aminopropyl group, aminomethyl group, 2-aminoethyl group, N-methyl-3-aminopropyl group, N-(2 -Aminoethyl)-3-aminopropyl group, N-aminoethyl-3-aminopropy
  • the support 210 may be formed by aggregating one or more wires, such as a metal wire or a magnetic wire.
  • the support part 210 may be formed by surface treatment on the surface of the wire before bundling one or more wires, or may be formed by attaching nano-sized magnetic nanoparticles to the surface.
  • the surface of the support portion 210 may be coated with the polyvalent cation 220 to prepare the adsorption sphere 200 .
  • the support part 310 may include a core part 311 provided at the center and a shell part 312 provided to surround the outer surface of the core part 311 .
  • the core part 311 is at least one of polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate, polyethylene glycol, polystyrene vinylbenzene, polystyrene, hydrogel, agarose, ceramic, silica gel, and latex
  • the The shell part 312 is at least one metal selected from the group consisting of iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), manganese (Mn), bismuth (Bi), and zinc (Zn) or an alloy thereof, or is made of these It may contain a metal oxide or alloy oxide selected from
  • the core part 311 is one or more metals selected from the group consisting of iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), manganese (Mn), bismuth (Bi), and zinc (Zn), or their
  • the shell part 312 may include polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate, polyethylene glycol, polystyrene vinylbenzene, polystyrene, hydrogel, agarose.
  • ceramic, silica gel may be any one or more of latex.
  • the core part 311 and the shell part 312 formed to surround the outer surface of the core part 311 may be made of different materials, and in this case, either the core part 311 or the shell part 312 . At least one of them may be made of a material separated by magnetic separation.
  • the magnetic separation may be generated by flowing a current through an electromagnet, or a magnet may be used.
  • the material of the core part 311 and the shell part 312 may be variously selected according to the type of the biological sample and the characteristics of the microvesicles to be captured in the biological sample.
  • the polyvalent cation 320 includes any one or more of poly-L-lysine polymer (poly-L-lysine, PLL), protamine, quaternary ammoniums, chitosan, and polyhistidine. , the polyvalent cation 320 may be provided to cover at least a portion of the shell part 312 to form the adsorption sphere 300 .
  • step (b) the adsorbent sphere is maintained in the biological sample to form an adsorption sphere complex in which the adsorbent sphere and the microvesicle are combined.
  • the adsorbent sphere may have an electrically low (+) characteristic by the polyvalent cation, and the microvesicle may have an electrically negative (-) characteristic.
  • the microvesicles may be bound to the adsorbent spheres by at least one of electrostatic interaction and intercalation.
  • the zeta potential of the adsorbent sphere complex may be 0.5 mV to 10 mV.
  • the adsorbent sphere and the microvesicles each have (+) and (-) characteristics, thereby binding to each other. It is not effectively captured, and a large amount of the microvesicles is lost before eluting with the second reagent, as will be described later, so that the resolution of the microvesicles is reduced.
  • the zeta potential of the adsorbent sphere complex exceeds 10 mV, it is difficult to elute the microvesicles even with the second reagent.
  • the zeta potential of the adsorbent sphere complex may be 1mV to 10mV, or 5mV to 10mV, or 0.5mV to 7mV, or 0.5mV to 5mV.
  • the adsorption sphere has a zeta potential of 10 mV to 30 mV, or 15 mV to 30 mV, or 17 mV to 30 mV, or 20 mV to 30 mV, or 10 mV to 27 mV, or 10 mV to 25 mV, or 12 mV to 25 mV, or 15 mV to 25 mV, or 17 mV to 25 mV, or 20 mV to 25 mV.
  • the adsorbent sphere has a zeta potential within the above-described range, thereby more effectively trapping microvesicles in the biological sample.
  • Microvesicles are not easy to separate from the biological sample by separation using a size, etc. because their size is fine in nanometers.
  • the microvesicles are to capture and separate the microvesicles by attraction by cations and anions, at this time, by controlling the zeta potential of the adsorbent sphere and the zeta potential of the adsorbent sphere complex within the above-mentioned range, the microvesicles in the biological sample can be effectively separated.
  • the microvesicles collected on the adsorbent sphere have an average diameter of 0.5 nm to 1 ⁇ m, and the polyvalent cation includes poly-L-lysine (PLL), and the support portion is carboxyl. polystyrene having groups. More specifically, the microvesicles collected on the adsorption sphere may be 1 nm to 1 ⁇ m, or 10 nm to 1 ⁇ m, or 50 nm to 1 ⁇ m.
  • step (b) maintaining the adsorbent sphere in the biological sample may be stirred at a temperature of 1° C. to 8° C. at 50 rpm to 150 rpm for 10 minutes to 2 hours.
  • the temperature may be 1 °C to 8 °C.
  • the temperature is between 2°C and 8°C, or between 3°C and 8°C, or between 1°C and 7°C, or between 1°C and 6°C, or between 1°C and 5°C, or between 2°C and 7°C, or 3°C. to 6°C.
  • the temperature may be 3.5° C. to 4.5° C., and the temperature range stabilizes the protein acting as an impurity other than the microvesicles, thereby inhibiting the fluidity of the protein. can do it
  • the stirring may be performed at a stirring speed of 50 rpm to 150 rpm and a stirring time of 10 minutes to 2 hours.
  • the stirring speed is less than 50 rpm, the microvesicles are not uniformly adsorbed to the adsorption sphere and may cause problems such as aggregation in some, and when it is more than 150 rpm, the microvesicles are stably bound to the surface of the adsorption sphere It is a problem that is difficult to do.
  • the stirring speed may be 70rpm to 150rpm, or 100rpm to 150rpm, or 50rpm to 170rpm, or 50rpm to 160rpm, or 70rpm to 100rpm.
  • the stirring time may be 10 minutes to 2 hours, if it is less than 10 minutes, it is difficult for the microvesicles to be sufficiently captured in the adsorbent sphere, and if it exceeds 2 hours, it takes time unnecessarily to increase the microvesicle separation time make it Specifically, the stirring time is 30 minutes to 2 hours, or 50 minutes to 2 hours, or 1 hour to 2 hours, or 10 minutes to 1.5 hours, or 10 minutes to 1 hour, or 10 minutes to 50 minutes, or 20 minutes. minutes to 50 minutes.
  • the time required to form the adsorbent sphere complex is significantly reduced compared to the time required in a conventionally used method, for example, an immunoaffinity isolation method.
  • the adsorption sphere complex may include a form in which the microvesicles are bound to the surface of the adsorption sphere.
  • step (c) the adsorption sphere complex is separated using a separation member, and the separation member may use any one or more of a capture filter, magnetic separation, centrifugation, solubility separation, and separation according to particle size. .
  • the capture filter when the separation member is a capture filter, the capture filter may be a membrane having pores having a size of 50 nm to 1,000 nm, or 100 nm to 500 nm, or 150 nm to 300 nm.
  • the pore size of the capture filter is within the aforementioned range, the adsorbent sphere complex may be separated from the biological sample through the capture filter.
  • the method in which the adsorption sphere complex passes through the capture filter is a form in which the biological sample passes through the capture filter by gravity or negative pressure while installed inside a reactor, extraction tube, etc. containing the adsorption sphere complex and the biological sample.
  • the capture filter is installed outside the reactor or extraction tube so as to be adjacent to the outlet of the reactor or extraction tube containing the adsorbent sphere complex and the biological sample, and the biological sample is applied to the capture filter by gravity or negative pressure. It may be in the form of passing.
  • the capture filter may be made of a hydrophilic material or a cation exchange resin so that the adsorption sphere complex having an electrical characteristic (+) is more easily captured.
  • the adsorbent sphere complex can be easily caught in the pores and physically trapped.
  • the hydrophilic material is silver metal, polyethersulfone, glass fiber, polycarbonate track etch (PCTE), polyester, mixed cellulose esters ; MCE), nylon, cellulose acetate, or a combination thereof.
  • the capture filter is a cation exchange resin
  • the adsorption sphere complex is adsorbed to the filter surface by an electrical force by the negatively charged capture filter.
  • the cation exchange resin may be carboxymethyl, methyl sulfonate, a sulphonyl group, or a combination thereof.
  • the capture filter may be formed so that the adsorption sphere complex is captured by an electrical force in a cation exchange resin having a negative charge.
  • microvesicle aggregates can be filtered using a syringe filter having a pore size of about 220 nm.
  • the separation member may include magnetic separation.
  • the support may include magnetic particles, and the adsorption sphere complex may be separated using a device or a magnet for generating a current by flowing an electromagnet.
  • the adsorption sphere complex when using an electromagnet, the adsorption sphere complex is held by electromagnetic waves and movement is limited.
  • the adsorbent sphere complex when using a magnet, can be fixed and separated from the biological sample by providing it at a predetermined position.
  • the magnet may be provided in any one or more of the inside and outside of the reactor provided with the biological sample and the adsorption sphere.
  • the magnet may be provided in the form of a rotatable impeller.
  • the adsorbent sphere complex separated in step (c) may be washed under a first condition using a first reagent.
  • the first reagent separates impurities other than microvesicles captured on the surface of the adsorbent sphere complex, such as proteins having a negative charge, from the adsorbent sphere, thereby finally improving the purity of the separated microvesicles.
  • the first reagent includes any one or more of a chaotropic salt, a protease, CH 3 COO ⁇ , SO 4 2- , HCO ⁇ , SiO ⁇ , and OH ⁇ , and the first condition is Within the pH range of any one or more of pH 5.5 to 6.5, and pH 7.5 to 9.5, it may include performing one or more times.
  • the concentration of the first reagent may be in the range of 0.1 to 4.5 M, 0.5 to 4 M, and 1 to 3 M.
  • the concentration of the first reagent may be provided to gradually decrease.
  • the chaotropic material refers to a material or ion that destabilizes or destroys a cargo structure of water molecules in an aqueous solution. Due to the addition of the chaotropic substance in the aqueous solution, the entropy of water is increased, and the molecular structure thereof is destabilized by influencing the interprotein, hydrogen bonding, Van der Waals force, or hydrophobic bonding.
  • the chaotropic material may be a salt comprising a guanidinium ion, such as guanidinium isothiocyanate, guanidinium thiocyanate, or guanidinium chloride, or guanidine hydrochloride; n-butanol, ethanol, lithium perchlorate, lithium acetate, magnesium chloride, phenol, 2-propanol, sodium dodecyl sulfate, thiourea, urea, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • a guanidinium ion such as guanidinium isothiocyanate, guanidinium thiocyanate, or guanidinium chloride, or guanidine hydrochloride
  • n-butanol ethanol, lithium perchlorate, lithium acetate, magnesium chloride, phenol, 2-propanol, sodium dodecyl sulfate, thiourea, urea, or a
  • the protease may include proteinase K, pepsin, trypsin, or chymotrypsin.
  • the first reagent may separate the other materials from the adsorbent while maintaining the microvesicles as they are in the adsorption sphere complex.
  • the first reagent is provided to maintain the binding force between the microvesicles and the adsorbent sphere, but to separate other substances.
  • the first condition may be carried out within a pH range of any one of pH 5.5 to 6.5, and pH 7.5 to 9.5, and the pH should be performed within the aforementioned range to remove impurities such as proteins from the adsorbent sphere complex. It is easily separated, and impurities such as separated proteins can be prevented from being re-adsorbed to the adsorption sphere.
  • the first reagent may include guanidium thiocyanate at a concentration of 2M.
  • the first reagent may not include a chaotropic agent.
  • the first reagent may have an acidic or neutral pH, for example, a pH of 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0. 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, or 9.0.
  • the first reagent may be used once or multiple times. When the first reagent is used a plurality of times, it may be provided at the same or different pH within the pH range of any one of pH 5.5 to 6.5 and pH 7.5 to 9.5 of each of the first reagents. For example, the pH of each first reagent used multiple times may be gradually decreased or increased.
  • the pH of the first reagent may be acidic from 3 to less than 7 in the first step, and the pH of the first reagent may be basic to more than 7 to 12 in the second step.
  • the pH of the first reagent is 3 to 6, or 3 to 5, or 3 to 4.5 in the first step, and the pH of the first reagent is 7.5 to 12, or 8 to 11, or 9 to 12 in the second step It could be 10.
  • the pH of the first reagent may be performed one or more times in the range of 3 or more to 7 or less in the first, and the pH of the first reagent is more than 7 in the range of 12 or more in the second. can be performed.
  • the first reagent may be used two or more times, and when the first reagent is used two or more times, the pH of the first reagent may be 5.5 to 6.5, and the pH of the second or more reagent may be 5.5 to 6.5 .
  • the pH of the first reagent may be 5.5 to 6.5
  • the pH of the second or more reagent may be 7.5 to 9.5.
  • the temperature in the first condition is 3°C to 30°C, or 4°C to 30°C, or 5°C to 30°C, or 10°C to 30°C, or 15°C to 30°C, or 20°C to 30°C, or It can be carried out at room temperature.
  • the time may be 5 seconds to 24 hours, and may be performed in various ways without being limited thereto.
  • a 0-10 mM NaCl solution of pH 6 or 8.5 may be used as the first reagent, or in another embodiment, the first reagent may be used sequentially at pH 6.0, 8.5, and 13.
  • the isoelectric point properties of the anionic protein aggregated with the microvesicles are changed to separate and release impurities such as proteins from the adsorbent sphere complex for washing.
  • the microvesicles have a stronger negative charge than most proteins, even when the first reagent is acidic (eg, pH 4.0), the microvesicles are not separated from the adsorbent sphere complex and are maintained.
  • the first reagent may include an appropriate salt capable of effectively washing impurities.
  • the salt includes at least one of CH 3 COO ⁇ , SO 4 2- , HCO ⁇ , SiO ⁇ , and OH ⁇ , but may include less than 50 mM.
  • the first reagent may further include Tris-Cl (pH 8), phosphate, or a combination thereof in an amount of 10 to 500 mM, and may further include imidazole in an amount of 10 to 100 mM, but is not limited thereto, and an anion.
  • an additional component capable of effectively separating impurities such as proteins other than microvesicles from the adsorbent sphere complex may be used without limitation.
  • microvesicles may be eluted from the washed adsorbent sphere complex under a second condition using a second reagent.
  • the second reagent includes any one or more of a chaotropic salt, a protease, CH 3 COO ⁇ , SO 4 2- , Cl ⁇ , HCO ⁇ , SiO ⁇ , and OH ⁇ , but 0.2 M It is provided in a concentration range of 3 M to 3 M, and the second condition may be performed one or more times while mixing at 500 rpm to 2000 rpm for a time of 1 minute to 60 minutes.
  • the adsorbent spheres and microvesicles may be separated in a state in which impurities such as proteins that may be included in the adsorbent sphere complex are removed.
  • the second reagent may release the electrical bonding force between the microvesicles and the adsorption spheres in the adsorption sphere complex, and thus the microvesicles may be separated from the adsorption spheres.
  • the adsorbent sphere and the microvesicle are prepared in the form of a complex into the adsorbent sphere, and separated from the biological sample, and later Only microvesicles can be effectively separated with high purity from the adsorbent sphere complex.
  • it since it does not require a large device such as centrifugal separation and can be performed relatively simply from the outside, it can be used as a diagnostic kit for various purposes without space and time restrictions.
  • the second reagent may be made of the same material as the first reagent, and in this case, the pH or concentration may be different from that of the first reagent.
  • the first reagent includes a chaotropic substance or protease
  • the second reagent includes a chaotropic substance or protease, wherein the chaotropic substance and protease included in the second reagent include the first It may be included at a higher concentration than the reagent.
  • the second reagent when the first reagent is a chaotropic material, the second reagent may be a chaotropic material.
  • the concentration of the first reagent may be lower than the concentration of the second reagent.
  • the first reagent can range from 0.1 to 4.5 M, or from 0.5 to 4 M, or from 1 to 3 M
  • the second reagent can range from greater than 4.5 M to 15 M, or from greater than 4.5 M to 10 M, or 4.5 M greater than 8M, or greater than 4.5M to 6M.
  • the first reagent may be 1.5M to 3M
  • the second reagent may be 4M to 7M.
  • the second reagent may further include guanidinium ions.
  • the second reagent may include the chaotropic material at a higher concentration than the first reagent.
  • the second reagent may comprise a substance other than a chaotropic substance. Even if the second reagent is at a pH that can change the isoelectric point of the microvesicles, the microvesicles may not be well separated from the adsorption spheres. can
  • the separate salt may include CH 3 COO ⁇ , SO 4 2- , Cl ⁇ , HCO ⁇ , SiO ⁇ , OH ⁇ or a combination thereof at a concentration of 100 mM to 5 M.
  • the second reagent may include NaCl, CaCl 2 or a combination thereof at a concentration of 250 mM to 5 M.
  • the second reagent may further include Tris-Cl (pH 8), phosphate, or a combination thereof in an amount of 10 to 500 mM, but is not limited thereto, and an additional component capable of effectively eluting microvesicles from an anion exchange resin can be used without restrictions.
  • the second reagent may include a monovalent cation such as NH 4 + , Na + , and K + , a divalent cation such as Ca 2+ , Mg 2+ , or a combination thereof.
  • the salt in the second reagent may be (NH 4 ) 2 SO 4 , Na 2 SO 4 , NaCl, KCl, CH 3 COONH 4 , or a combination thereof.
  • the salt may be equally included in the first reagent, in which case it may be included in 0.1 M or more, 0.25 M or more, 0.5 M or more, or 0.75 M or more, and may be included in 5 M or less, or 4 M or less.
  • the second reagent may include 1 M, 2 M, 3 M or 4 M NaCl.
  • the second reagent may have a pH of 4 to 9.
  • the second reagent induces ion exchange in which various anions are displaced with microvesicles on the sorbent.
  • step (e) is completed with high yield and high purity within a short time.
  • the process from step (a) to step (e) may be completed in less than 60 minutes, preferably less than 45 minutes, more preferably less than 30 minutes, and most preferably less than 20 minutes.
  • the method for separating microvesicles includes a primary auxiliary separation for separating the adsorption sphere complex after washing the adsorbent sphere complex with the first reagent in step (d), (e) step After eluting the microvesicles with the second reagent, it may further include a secondary auxiliary separation for separating the adsorbent spheres.
  • the primary auxiliary separation or secondary separation Auxiliary separation is a capture filter having a pore size of 50 nm to 1,000 nm; and porous anion particles having pores of less than 50 nm in size.
  • step (d) impurities such as proteins other than the microvesicles may be washed with the first reagent and separated.
  • the adsorption sphere complex from which impurities have been removed may be subjected to primary auxiliary separation using a capture filter or the like.
  • the adsorbed sphere complex may be released from the capture filter by passing a buffer solution having a negative charge through the capture filter.
  • the buffer solution is an example that a solution containing at least one of Ca 2+ , Mg 2+ , Na + , K + , NH 4+ ions, or a combination of two or more is applied.
  • the secondary auxiliary separation may be performed to further remove residual impurities after separating the microvesicles and the adsorption spheres.
  • the secondary auxiliary separation may be performed to further improve the purity of the microvesicles, and impurities not removed in step (d), such as fibrinogen (when the biological sample is plasma, for example), etc. can be removed. .
  • the secondary auxiliary separation may include porous anion particles, and the porous anion particles may be used.
  • Protein impurities eg, fibrinogen, etc.
  • the size of the pores of the porous anion particles may be less than 50 nm.
  • the primary auxiliary separation or secondary auxiliary separation may include generating a current by flowing an electromagnet, or magnetic separation using a magnet.
  • the method for separating microvesicles may further include pre-treating the biological sample before the adsorbent is added.
  • the pretreatment of the biological sample includes filtering the biological sample to separate materials having an average diameter greater than 0.8 ⁇ m in the biological sample.
  • the sorbent Before adding the sorbent to the biological sample, if the biological sample is filtered to remove material having an average diameter of more than 0.8 ⁇ m in advance, the sorbent can more easily capture microvesicles in the biological sample have.
  • a reagent kit for separating microvesicles for isolating microvesicles from a biological sample may be included.
  • a reagent kit for separating microvesicles for separating microvesicles contained in a biological sample comprising: one or more adsorbent spheres having binding to the microvesicles; SO 4 2-, Cl -, HCO -, SiO -, and OH - a first reagent containing at least one of; And SO 4 2-, Cl -, HCO -, SiO -, and OH -, but of which include one or more of the second reagent having a higher concentration than the first reagent; including, spheres and the adsorption support with It may include one or more polyvalent cations provided on the surface of the support part.
  • the reagent kit further comprises a separation member for separating the adsorption spheres or the adsorption spheres capturing the microvesicles, the separation member is any one of a capture filter, magnetic separation, centrifugation, solubility separation, and separation according to particle size It may include more than one.
  • the support part may be provided in the form of a bead having a circular cross-section made of any one or more of polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylate, polyethylene glycol, polystyrene vinylbenzene, and polystyrene.
  • the polyvalent cation provided on the surface of the support part is polylysine, polyarginine, polyhistidine, protamine, cationic dextran, cationic dendrimer, cationic polysaccharide, polyamidoamine, polyethyleneimine, polyquaternium, Poly-2-dimethylaminoethyl methacrylate (PDMAEMA), poly (2-dimethylaminomethyl styrene) (PDMAMS), poly-1-vinylpyrrolidone (p1-VP), poly diethylaminoethyl acrylate ( pDEAEA), poly dimethylaminoethyl acrylate (pDMAEA), and poly diethylaminoethyl methacrylate (pDEAMA), wherein the separation member is a trap filter having pores of 50 nm to 1,000 nm in size. may include.
  • the support may include magnetic particles, and a polyvalent cation may be coated on the surface of the support to form an adsorption sphere.
  • the polyvalent cation is polylysine, polyarginine, polyhistidine, protamine, cationic dextran, cationic dendrimer, cationic polysaccharide, polyamidoamine, polyethyleneimine, polyquaternium, poly-2-dimethylaminoethyl meta acrylate (PDMAEMA), poly(2-dimethylaminomethyl styrene) (PDMAMS), poly-1-vinylpyrrolidone (p1-VP), polydiethylaminoethylacrylate (pDEAEA), polydimethylaminoethylacryl rate (pDMAEA), and poly diethylaminoethyl methacrylate (pDEAMA).
  • the separation member may include a device for generating a current by flowing through the electromagnet or magnetic separation using a magnet
  • the reagent kit for separating microvesicles may further include porous particles capable of adsorbing impurities such as proteins other than microvesicles included in the biological sample.
  • Example 1 (ExoCAS-1 separation of extracellular vesicles using PLL-beads)
  • Figure 4 is a view schematically showing a microvesicle separation method according to Example 1.
  • Adsorbed spheres were added to the prepared plasma sample (biological sample) to induce aggregation between the extracellular vesicles and the polymer due to the interaction between charges to form a complex in which beads and microvesicles were combined, and separated using a capture filter.
  • poly-L-lysine (PLL, Sigma-Aldrich, USA) having a molecular weight of 150-300 kDa was used as the cationic polymer.
  • carboxyl group-functionalized beads (1 ⁇ m, Carboxyl polystyrene Beads, EPRUI Nanoparticles & Microspheres Co, Shanghai, China) were added to the PLL stock solution and reacted for 6 hours.
  • the solid containing the beads was separated by centrifugation, and washed with phosphate buffered saline (PBS) to prepare the beads bound to the cationic polymer.
  • PBS phosphate buffered saline
  • 5 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL, and 100 mg/mL of PLL stock solutions were used, respectively, and the reaction times were 3 hours, 6 hours, and 12 hours, and the cationic polymer-bound beads (PLL- beads) were prepared to compare the binding performance of the extracellular vesicles.
  • the maximum performance was obtained in the PLL stock solution at 100 mg/mL, but almost equivalent to the PLL stock solution at 40 mg/mL. performance was confirmed. In addition, after the reaction time showed the maximum performance at 6 hours, the defect performance decreased slightly at 12 hours. Therefore, it was confirmed that the optimal conditions for a 6-hour reaction at a concentration of 40 mg/mL in terms of economics and efficiency.
  • the prepared cationic polymer-bound beads were adjusted to the final bead concentration (5 mg/mL) in each plasma sample.
  • Plasma containing cationic beads was incubated at 4° C. for 10 minutes. After incubation, the mixture was filtered using a syringe filter (220 nm filter, Millex, R8EA69979) having a pore size of 220 nm. After filtration, large bead particles were left on the filter.
  • a syringe filter (220 nm filter, Millex, R8EA69979) having a pore size of 220 nm. After filtration, large bead particles were left on the filter.
  • pH 4.0, 8.5, and 13 (800 ⁇ L each) were sequentially used as the first reagent and flowed to the surface of the beads placed on the filter.
  • the first reagent was acetic acid (Acetic acid, Sigma Aldrich, Cat no: 695092-100 mL) and sodium hydroxide (Sodium hydroxide, Sigma Aldrich, Cat no: S8045-500G) to adjust the pH using.
  • the first reagent is low concentration (10-50 mM) NaCl, 10-50 mM CaCl 2 solution (pH 7.4), 10-500 mM Tris-cl (pH 8), 10-500 mM phosphate, 10-100 mM imidazole can be added to increase the cleaning performance of the protein.
  • Ultracentrifugation (UC) method is a standard method that has been traditionally and widely used for the isolation of extracellular vesicles. Although the UC separation protocol is simple, it is time consuming (average more than 6 hours) and has the disadvantages of being labor intensive.
  • Plasma and phosphate buffered saline (PBS) were mixed at a volume ratio of 1:1, and the mixture was centrifuged to remove residual cell components (4°C, 12,000 g, 30 min). The supernatant was transferred and centrifugation was repeated once under the same conditions. The supernatant was filtered using a syringe filter having a 200 ⁇ m pore size (Merck Millipore, USA), followed by ultracentrifugation at 120,000 g and 4° C.
  • PLL-bead which is a bead to which a cationic polymer is bound
  • bare-bead which is a bead to which a cationic polymer is not bound
  • the first reagent as a chaotropic material guanidinium thiocyanate (GuTc 2M), acetic acid (Acetic acid, Sigma Aldrich, Cat no: 695092-100mL), and sodium hydroxide (Sodium hydroxide, Sigma Aldrich, Cat no: S8045-500G) was used to adjust the pH to 4.0 and 8.5 (800 ⁇ L), respectively.
  • NaCl Sodium chloride, Sigma Aldrich, Cat no: S7653-250G was used as a salt. After each of the beads bound to the cationic polymer was washed using the first reagent, the concentrations of proteins and particles included in the resultant first reagent were checked.
  • acetic acid and sodium hydroxide were mixed at 29 mM and 6.1 mM, respectively, at pH 6, acetic acid and sodium hydroxide were at 29 mM and 29 mM, respectively, and at pH 8.5, acetic acid and sodium hydroxide were at 29 mM and 32.3 mM, respectively, pH 11 Silver acetic acid and sodium hydroxide were prepared at 29 mM and 34 mM, respectively, and at pH 13, acetic acid and sodium hydroxide were prepared at 29 mM and 35 mM, respectively.
  • PLL- in the second reagent was changed to 1M, 2M, 3M, 4M and 5M with different concentrations of NaCl salt using pH 7 as the second reagent, and pH 4 as the first reagent. The concentration of beads was confirmed.
  • an impurity protein is separated from the PLL-bead by using a solution having a pH of 4, 8.5, or 13 without including a chaotropic salt, and as a second reagent, NaCl 3M, pH 7
  • the purity refers to the concentration of the extracellular vesicles (particles/ml) to the protein concentration ( ⁇ g / ml).
  • the protein markers of the extracellular vesicles isolated according to Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 were measured by Western blotting.
  • Exosomes are known to contain protein markers such as Alix (ALG-2-interacting protein X), TSG101 (tumor susceptibility gene 101 protein), HSP70 (heat shock protein), tetraspanins CD63, CD81, and CD9. Accordingly, the characteristics of the isolated extracellular vesicles were analyzed using four reference protein markers (ALIX, TSG101: inner protein markers; CD9, and CD81: surface protein markers) (FIG. 12a).
  • protein samples were separated by gel electrophoresis using SDS-PAGE Mini-PROTEAN® TGXTM Precast Gel (456-1035; Bio-rad, USA), and rabbit polyclonal antibody (1 :2,000 dilution) anti-CD9 (ab92726), anti-CD81 (ab109201), anti-ALIX (ab186429), anti-TSG101 (ab125011), and goat anti-rabbit IgG H&L (HRP) (ab205718) (Abcam, Cambridge, UK) for immunoblotting. Protein bands were analyzed using enhanced chemiluminescence (ECL) solution and ChemiDocTM XRS + System (Bio-Rad, USA). As a result of Western blotting for the marker, the total level of the protein marker can be measured from the intensity of the protein band.
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • ChemiDocTM XRS + System Bio-Rad, USA
  • Re transcription of RNA eluates was performed using TaqMan MicroRNA RT Kit (4366596, Life Technologies, USA) and TaqMan Micro RNA Assay (4427975, Life Technologies, USA).
  • TaqMan Universal Master Mix II, no UNG (4440040, Life Technologies, USA) and miRNA assays hsa-let-7a-5p, ID 000377, and hsa-miR-142-3p, ID 000464 were used. Additional experiments were performed on the RNA eluate using an Agilent Eukaryote Total RNA Pico chip on an Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, USA).
  • Example 1 The evaluation results for Example 1 and Comparative Example 1 are shown below.
  • Example 5 is a result of confirming the separation ability of the extracellular vesicles using the PLL-bead according to Example 1 and a bare-bead, which is a bead to which a cationic polymer is not bound.
  • the effect of incubation at 4° C. was confirmed for bare beads and PLL-beads, respectively, for 1 ml of a plasma sample. It was confirmed that the bare beads were clustered on the lower side of the tube during incubation for 2 hours, and the volume of the bare beads did not change even if the incubation time was increased up to 2 hours. On the other hand, it was confirmed that the volume of the PLL-beads gradually increased as the incubation time was increased to 10 minutes, 30 minutes, and 1 hour.
  • FIG. 6 is a view schematically showing a state in which the PLL-bead of Example 1 is prepared
  • FIG. 7 is a fluorescent image of the PLL-bead prepared by varying the PLL concentration in the manner according to FIG. 6 It was.
  • 5 mg of polystyrene was used for the bare beads
  • the molecular weight 150-300 Kda Poly-L-Lysine was used for the PLL
  • the antibody (lgG [Alexa Flour]) was used for the fluorescence image.
  • the bare bead includes a functional group of -COOH on the surface, and the PLL has -NH 3 at the end, -COOH and -NH 3 may react and bond with each other.
  • the reaction may be performed more efficiently.
  • the normalization intensity gradually increases as the concentration of the PLL stock solution is increased to 5 mg/mL, 10 mg/mL, and 15 mg/mL. That is, it was confirmed that the PLL was effectively attached to the surface of the bare bead (polystyrene), which was dependent on the concentration of the PLL. That is, the PLL-bead according to this example effectively binds to the microvesicles contained in the biological sample could confirm that
  • Example 8 is a result of confirming the performance according to various first reagents using Example 1.
  • 9 is a result of confirming the performance according to the first reagent to which a salt was added using Example 1.
  • the protein concentration was measured using a BCA test, and the particle concentration was confirmed by a nanoparticle tracking analysis (NTA).
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • the concentration of the protein contained in the first reagent is a result of separating the protein, which is a partly captured impurity, in the bead to which the cationic polymer is bound, and the concentration of the particle is the bead to which the cationic polymer is bound.
  • both GuTc and the first reagent at pH 4 and pH 8.5 showed higher concentrations of protein as an impurity than in deionized water (DW). That is, it was confirmed that GuTc, pH 4, and pH 8.5 effectively separated the protein, which is an impurity attached to the PLL-bead. In addition, it was confirmed that the ability to wash and remove impurities from the PLL-beads was similar to GuTc, pH 4, and pH 8.5.
  • a pH of 4 or 8.5 was 85 to 90% compared to GuTC in protein washing ability, and a particle concentration of 4 or 8.5 compared to GuTc was 12.5 to 20.1 times superior.
  • the degree of loss of PLL-beads in the first sample appeared in the order of GuTc ⁇ pH 4, pH 8.5 (including NaCl salt) ⁇ pH 4, pH 8.5 (not including NaCl salt).
  • it shows a tendency according to pH.
  • the degree of loss of PLL-beads increases, but at pH 13, it was confirmed that the results were independent of the inclusion of salts. This is because the salt acts as a base with NaCl, and at pH 13, it is already a strong base, so it is judged that the effect is smaller than when the pH is low.
  • Example 10 is a result of confirming the performance according to various second reagents using Example 1.
  • the concentration of particles included in the second reagent is lower, it means that the microvesicles are separated without being lost into the second reagent.
  • the second reagent was superior to 2M GuTC used as a reference material when the pH was 7, and 1M NaCl was the most excellent.
  • 11 is a graph showing particles, proteins, and purity included in the second reagent according to the type of the first reagent.
  • the first reagent is GuTc 2M, pH 4.0, pH 8.5, pH 13, and pH gradient in order to wash the protein, which is an impurity, before using the second reagent.
  • the particle concentration (extracellular vesicle concentration included in the second reagent) and protein concentration (protein concentration acting as an impurity) contained in the second reagent were indicated.
  • the pH gradient was washed while gradually increasing the pH to pH 4.0, pH 8.5, and pH 13, respectively.
  • the amount of extracellular vesicles included in the second reagent showed the highest purity when used as the first reagent while sequentially increasing the pH using a plurality of first samples having different pH concentrations. That is, it was confirmed that the purity ratio, defined as the value obtained by dividing the number of particles by the protein concentration, exhibited the highest value in the pH gradient when the first reagent was sequentially used as a solution having a pH of 4, 8.5, or 13. .
  • Example 12 is a result of evaluating the conventional centrifugation method and the separation method according to Example 1 of the present invention.
  • RNA inside the microvesicles extracted according to the centrifugation method (Comparative Example 1; UC) and PLL-beads (Example 1; PLL-beads) was extracted, and hsa-let, an extracellular vesicle marker, was extracted.
  • RT-PCR was performed using -7a-5p and hsa-miR-142-3p primers.
  • Example 1 using the adsorbent sphere and the first and second reagents showed the best RNA extraction amount (see FIG. 12 b below).
  • Plasma samples used in the following Examples and Comparative Examples were purchased from Zen-Bio (Research Triangle, NC, USA). Plasma samples were used by removing large-sized specimens using a mesh filter (800 nm pore size mesh, using Sartorius Minisart TM NML, catalog number 16592), and used in a volume of 1 mL for each sample.
  • a mesh filter 800 nm pore size mesh, using Sartorius Minisart TM NML, catalog number 16592
  • Example 2 (ExoCAS-2 separation of extracellular vesicles using PLL-magnetic beads)
  • Example 13 is a view schematically showing a method for separating microvesicles according to Example 2.
  • the adsorbed sphere is added to the prepared plasma sample (biological sample) to induce aggregation between the extracellular vesicle and the polymer by the interaction between charges to form a complex in which the adsorbent sphere and the microvesicle are combined, It was separated using magnetism.
  • PLL Poly-L-lysine (PLL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) polymer is reacted with 40 mg/ml and 5 mg of spherical magnetic beads (magnetic beads with a diameter of 1 ⁇ m) Magnetic beads were prepared and added to the plasma sample.
  • PLL has polycationic properties, and thus PLL-magnetic beads are bound to the negatively charged extracellular vesicles by electrostatic attraction.
  • the PLL-bead-added biological sample was incubated for 30 minutes at 4° C. in a rocking platform mixer at 90 rpm.
  • the PLL-magnetic beads exist in a flowing state in the biological sample and are mixed at a low speed to show excellent binding of the PLL-magnetic beads to the extracellular vesicles (exosomes).
  • Extracellular vesicles Extracellular vesicles
  • the magnet was brought near the tube containing the biological sample to which the PLL-beads were added to separate the PLL-magnetic beads in which the extracellular vesicles were captured.
  • the separation time was very short, about 2 minutes, and then the supernatant was separated using a pipette.
  • the PLL-magnetic beads in which the extracellular vesicles were captured were carefully washed using a first reagent (2 mL) with a pH of 6 to remove non-target proteins, and the PLL-magnetic beads in which the extracellular vesicles were captured were added to the first reagent. resuspended. Using a magnet, the PLL-magnetic beads captured by the extracellular vesicles were aggregated and separated, and in this process, proteins acting as impurities were washed and removed.
  • the PLL-magnetic beads in which the extracellular vesicles were captured were added to a second reagent containing a salt of 1M NaCl, pH 7.0, 200 ⁇ L, and then at 1000 rpm for 5 minutes while vortexing.
  • a second reagent containing a salt of 1M NaCl, pH 7.0, 200 ⁇ L was added to a second reagent containing a salt of 1M NaCl, pH 7.0, 200 ⁇ L, and then at 1000 rpm for 5 minutes while vortexing.
  • PLL-magnetic beads and extracellular vesicles were eluted, and the magnet was kept near the tube for 2 minutes to collect and separate PLL-magnetic beads.
  • the supernatant containing pure extracellular vesicles was collected with a pipette. This whole process was completed in 40 minutes, and molecular analysis and physical property analysis by nanosite (NTA) were performed.
  • NTA nanosite
  • Protamine-magnetic beads which are adsorbed spheres, were prepared in the same manner as in Example 3 except that 80 ⁇ g was used, and adsorbed spheres were added to the prepared plasma sample (biological sample), and the extracellular vesicles and polymers by interaction between charges By inducing liver aggregation, a complex in which adsorbed spheres and microvesicles were combined was formed, and separated using magnetism.
  • Ultracentrifugation (Ultracentrifugation, UC) is the most standard method (gold standard method) used to isolate the extracellular vesicles, but it takes a long time, about 6 hours or more, and is a method that requires a lot of labor.
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • the separated supernatant was filtered using a 220 ⁇ m pore syringe filter (Merck Millipore, Burlington, MA, USA), and the filtered supernatant was filtered using a high-speed centrifuge (CP100WX; Hitachi, Tokyo, Japan) at 4°C, Centrifugation was performed at 12,000 g for 2 hours. After the supernatant was absorbed and separated, the remaining pellet was resuspended, washed with phosphate buffered saline (PBS) at 120,000 g and 4°C for 1 hour, and resuspended in 50 ⁇ L of PBS.
  • PBS phosphate buffered saline
  • ExoQuickTM exosome precipitation solution
  • EXOQ5A-1 System Biosciences, Palo Alto, CA, USA
  • ExoQuickTM plasma samples were mixed with ExoQuick solution, which is a PEG-based solution, and then the mixture was incubated at 4°C for 30 minutes. After the incubation was completed, the mixture was centrifuged at 1500 g for 30 minutes, the supernatant was removed, and the remaining pellet was placed in a tube. After performing a second centrifugation at 1500 g for 5 minutes, all of the remaining ExoQuick solution was removed, and the resulting pellet was resuspended in 200 ⁇ L of PBS.
  • ExoQuickTM plasma samples were mixed with ExoQuick solution, which is a PEG-based solution, and then the mixture was incubated at 4°C for 30 minutes. After the incubation was completed, the mixture was centrifuged at 1500 g for 30 minutes, the supernatant was removed, and the remaining pellet was placed in a tube
  • plasma exosomes were extracted using the exoEasyTM Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). After filtration was performed to remove particles having a diameter of more than 0.8 ⁇ m, the same volume of XBP buffer solution was added and mixed, and the suspension was transferred to an exoEasy spin column and centrifuged at 500 g for 1 minute. After removing the flow-through, 10 mL of XWP buffer solution was added and the suspension was centrifuged at 5000 g for 5 minutes. After removing the flow-through, the spin column was transferred to a new tube, and 100 ⁇ L XE buffer solution was added to prepare a mixture. The mixture was centrifuged at 5000 g for 5 minutes, and the flow-through was collected using exosome resuspension solution B (exo-B).
  • exo-B exosome resuspension solution B
  • PLL-magnetic beads For 5 mg of spherical magnetic beads having an average diameter of 1 ⁇ m, PLL-magnetic beads were prepared by varying the concentration of PLL to 40 mg/ml, 200 mg/ml, and 600 mg/ml, and the extracellular vesicle separation ability was evaluated. Among them, PLL-magnetic beads prepared by reacting 40 mg/ml PLL with 5 mg of spherical magnetic beads with an average diameter of 1 ⁇ m with the best performance were added to the plasma sample, and the incubation time and incubation temperature were followed. Each performance was evaluated.
  • the zeta potential of the extracellular vesicles isolated using Example 2 (PLL-magnetic beads) and Comparative Example 2 (UC) using a zeta potential analyzer (Zetasizer Pro; Malvern Panalytical, Malvern, UK), and the The zeta potential of the micro-sized PLL-magnetic ratio (adsorbent sphere) was measured.
  • Pellet-clustered PLL beads (5 mg/mL) made from 1 mL plasma were resuspended in 10 ⁇ L NaCl solution (1 M) (deionized water (DW) is difficult to resuspend pellet-clustered PLL beads). To this, 990 ⁇ L of deionized water was added.
  • Example 2 PLL-magnetic beads
  • Comparative Example 2 UC
  • VitrobotTM FEI, Hillsboro, OR, USA
  • TEM transmission electron microscope
  • the extracellular vesicles isolated according to Example 2 (PLL-magnetic beads) and Comparative Example 2 (UC) were filtered using an AAO membrane (anodic aluminum oxide membrane) mounted on a gasket. After each filtration, the AAO membrane was incubated in glutaraldehyde solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 30 min. Then, the AAO membranes were sequentially rinsed with 25%, 50%, 75%, 90%, 100% ethanol and incubated overnight at 37°C in a drying oven. After the AAO membrane was coated with Pt, extracellular vesicles and cluster materials on the AAO membrane were identified using SEM (Quanta 250 FEG; FEI, Hillsboro, OR, USA).
  • Example 2 PLL-magnetic bead
  • Example 3 protamine-magnetic bead
  • Comparative Example 2 Comparative Example 2
  • Comparative Example 3 Comparative Example 3 (ExoQuick)
  • Comparative Example 4 ExoEasy obtained by each 1mL was isolated from the extracellular vesicle solution.
  • Samples diluted with PBS were placed in an assembled sample chamber of a NanoSight LM10 system (Malvern Panalytical, Worcestershire, UK), and microparticles were focused using a fingerprint area as a reference. Extracellular vesicle images were recorded, and the mean size and concentration of each were measured.
  • the protein was purified by rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution), anti-TSG101 (ab125011), anti-CD81 (ab109201), anti-ALIX (ab186429), anti-CD9 (ab92726), and goat anti-rabbit IgG H&L ( HRP) (ab205718) (Abcam, Cambridge, UK) was subjected to immunoblotting. Protein bands were identified using an enhanced chemiluminescence reagent and ChemiDoc TM XRS + System (Bio-Rad).
  • Pierce TM BCA Protein Assay Kit (#23225; Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) was used.
  • a standard curve (standard range 0-200 ⁇ g/mL) was made by serial dilutions of bovine serum albumin and 9 working reagents. Three replicates were performed for all samples and standard points. Each 100 ⁇ L sample was mixed with 2.0 mL working reagent and incubated at 37° C. for 30 minutes. After cooling to room temperature, measure the difference between the average absorbance and absorbance value of the blank standard replicate at 562 nm (using a spectrometer, DS-11; Denovix, Wilmington, DE, USA), and measure the difference in absorbance based on the standard curve converted to ⁇ g/mL.
  • the concentration of the sample was diluted to a value within the standard range, and the final sample concentration value was calculated based on the dilution factor. Corrected.
  • SeraMir Exosome RNA purification kit RA806A-1, SBI, Palo Alto, CA, USA. All separation methods were performed according to the manufacturer's manual.
  • RNA elution solution was used using TaqMan MicroRNA RT Kit (4366596, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) and TaqMan Micro RNA Assay (4427975, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). was reverse transcribed.
  • the miRNA expression profile was analyzed using a microarray (Gen-Chip miRNA 4.0 array, Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA). Total RNA (130 ng) including tissue miRNA was labeled with biotin using FlashTag. Samples labeled using the TM Biotin HSR RNA Labeling Kit (Affymetrix) were mixed into Affymetrix miRNA microarrays using the GeneChip® Hybridization Oven according to each manufacturer's manual. The labeled RNA was heated at 99° C. for 5 minutes, followed by heating at 45° C. for 5 minutes. RNA-array hybridization was performed using an Affymetrix® 450 Fluidics station at 48° C. for 16 hours while stirring at 60 rpm.
  • the chips were washed and stained using a Genechip Fluids Station 450 (Affymetrix), and each chip was scanned using an Affymetrix GCS 3000 scanner (Affymetrix). The value of each signal was confirmed using Affymetrix® GeneChip® Command Console software (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA).
  • Example 2 The evaluation results for Example 2 and Comparative Examples 2 to 4 are shown below.
  • FIG. 14a shows that 5 mg of PLL-magnetic beads is added to 1 ml of a plasma sample, and the volume of PLL-magnetic beads is increased by performing incubation while changing the temperature to 10 minutes, 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes, respectively.
  • FIG. 15 b the performance was confirmed by performing incubation for 10 minutes, 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes at different temperatures of 4°C and 24°C, respectively.
  • PLL-magnetic beads were prepared by varying the concentration of PLL to 40 mg/ml, 200 mg/ml, and 600 mg/ml, and the thus prepared PLL-magnetic beads were used in the same manner. This is the result of confirming the miRNA extraction effect after adding it to the plasma sample. Although there was no significant difference overall with respect to the PLL concentration, it was found to be the most excellent at 40 mg/ml. Therefore, in this experiment, PLL-magnetic beads were prepared using a PLL concentration of 40 mg/ml.
  • FIG. 14 d it is a result of confirming the miRNA extraction effect according to the concentration of PLL-magnetic beads.
  • the results were confirmed by changing the concentrations of PLL-magnetic beads to 0.5 mg/ml, 2.5 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, and 25 mg/ml.
  • the concentration of PLL-magnetic beads increased the miRNA extraction ability up to 5 mg/ml, but it was confirmed that there was little change in performance when the concentration was increased from 5 mg/ml. Therefore, the concentration of beads in this experiment was performed at 5 mg/ml.
  • FIG. 15A is a result of evaluation by Hematocrit for incubation times of 3 hours and 6 hours by varying the average diameter of the PLL-magnetic beads to 1 ⁇ m and 40 ⁇ m, respectively.
  • FIG. 16 b is a result of evaluation by a bioanalyzer after setting the average diameter of the PLL-magnetic beads to 0.4 ⁇ m and 1 ⁇ m, respectively.
  • FIG. 15 a when the average diameter of the PLL-magnetic beads was 1 ⁇ m, the extracellular vesicle separation ability was better than that of 40 ⁇ m, and it was more excellent at 6 hours than 3 hours.
  • FIG. 15b it was confirmed that the case where the average diameter of the PLL-magnetic beads was 1 ⁇ m was superior to that of 0.4 ⁇ m in miRNA and purity.
  • Example 16 shows an SEM image, a fluorescence image, and a cryo-TEM image according to Example 2 and Comparative Example 2.
  • Figure 16a is a result of separating the extracellular vesicles (EV) using PLL-magnetic beads (PLL-bead) according to Example 2, PLL-magnetic beads, PLL-magnetic beads, in which the extracellular vesicles are captured, separation With the SEM image of each exosome, it was confirmed that the average diameter of the magnetic beads was 950 nm.
  • FIG. 16 b shows a PLL-magnetic bead (green color), a PLL-magnetic bead in which an exosome is captured (red color), and a combined fluorescence image.
  • 16 c shows a Cryo-TEM image of the extracellular vesicles (EV) isolated according to Example 2 (PLL-bead) and Comparative Example 2 (UC).
  • Example 2 after checking SEM images for PLL-magnetic beads of various sizes of 0.5 ⁇ m to 40 ⁇ m, evaluation was performed by selecting 1 ⁇ m in double size. After adding the PLL-magnetic beads to the plasma sample, it was confirmed that exosomes, which are extracellular vesicles, appeared in a coated form on the surface of the PLL-magnetic beads. In addition, it was confirmed that the size of the exosomes isolated using PLL-magnetic beads was approximately 100 nm.
  • Example 2 Example 2
  • Comparative Example 2 UC
  • Example 17 is a result of confirming the zeta potential according to Example 2 and the volume change after incubation.
  • Figure 17a is a zeta of albumin, ⁇ -globulin and fibrinogen contained in exosomes, Example 2 (PLL-bead), PPL-magnetic beads (EV-captured PLL-bead) with extracellular vesicles, and plasma proteins potential was shown. 17B is a result confirming the volume change according to Example 2 (PLL-bead) before and after incubation in plasma.
  • Isolation of the extracellular vesicles according to Example 2 utilizes anion exchange on the surface of PLL-magnetic beads.
  • the zeta potential of the exosome which is the extracellular vesicle, was formed as an anionic phospholipid bilayer of the extracellular vesicle, indicating -15.0 mV.
  • PLL-magnetic beads exhibit a zeta potential of 22.6 mV due to the hydrophilic amino group that is cationic of PLL.
  • the zeta potential was reduced to 5.4 mV by the binding of the exosomes.
  • the zeta potential of the PLL itself is 42.4 mV.
  • the zeta potential of PLL was reduced to 22.6 mV while binding to the magnetic bead, and the zeta potential of the PLL-magnetic bead was reduced to 5.4 mV because exosomes were captured.
  • Proteins such as albumin, ⁇ -globulin, and fibrinogen were included in the plasma proteins, and it was confirmed that they exhibited negative values with zeta potentials of -6.1mV, 2.4mV, and -18.7mV, respectively.
  • Example 18 shows the average particle size (a), the particle concentration (b), the protein concentration (c), and the purity ratio (particle/protein ratio) for Example 2 and Comparative Examples 2 to 4 (* : p ⁇ 0.05, ** : p ⁇ 0.01, *** : p ⁇ 0.001). In d of FIG. 18, the purity ratio was used as a reference for Comparative Example 2.
  • Example 2 The size distribution, shape, surface and internal protein markers, and exosome RNA of exosomes, which are extracellular vesicles isolated using Example 2, were confirmed, and compared with the ultracentrifugation of Comparative Example 2 (UC) used in the prior art. It was compared with Example 3 (EQ, exoQuick, SBI) and Comparative Example 4 (exoEasy).
  • Comparative Example 3 showing the separation performance of exosomes showed a maximum particle concentration of 22.5 x 10 10 /mL, which was 12.5 times higher than that of Comparative Example 2 of 1.8 x 10 10 /mL.
  • Example 2 was 11.9 x 10 10 /mL, which was about twice as high as that of Comparative Example 2.
  • Comparative Example 3 when compared with Comparative Example 2, it can be seen that shows a bad result in protein contamination, when comparing Comparative Example 2 and Example 2, the degree of protein contamination in Example 2 is about 2 compared to Comparative Example 2 appeared twice. It was confirmed that the purity ratio defined as the ratio of the particle concentration to the protein concentration showed the highest value in Example 2.
  • Example 19 After differentiating the first reagent with respect to Example 2 and Example 3, NaCl 1M, pH 7.0, and 200 ⁇ L as the second reagent were vortexed at room temperature for 5 minutes at 1000 rpm, the separation ability of the extracellular vesicles was evaluated.
  • Table 1 below shows the conditions for washing using the first reagent, respectively.
  • Table 2 shows the results of NTA, BTA and purity (purity ratio) according to Table 1 below.
  • the first reagent represents the pH and volume of the first reagent
  • the first reagent (addition) means washing with the first reagent once and then washing the same sample with additional (two washes) do.
  • Example 2 Temperature first reagent First reagent (additional)
  • Example 2 #One room temp. pH 6 - 2ml - Example 3 #2 room temp. pH 6 - 2ml - #3 room temp. pH 6 - 2ml pH 6 - 2ml #4 room temp. pH 6 - 4ml - #5 room temp. pH 6 - 1ml pH 8.5 - 1ml #6 70°C pH 6 - 2ml -
  • the concentration of particles means the concentration of the extracellular vesicles contained in the second reagent, and a higher value means that a large amount of extracellular vesicles are separated.
  • the protein concentration refers to the concentration of the protein acting as an impurity other than the extracellular endoplasmic reticulum contained in the second reagent. This is shown as a purity ratio (ratio of particles/protein) in (b) of FIG. 19 .
  • Example 3 When 2 ml of the first reagent of pH 6 was used under the same conditions, it was confirmed that Example 3 (#2) exhibited a better effect than Example 2 (#1). As in Example 3, when using a protamine salt as a polyvalent cation, it was confirmed that the separation ability of the extracellular vesicles was superior to that of PLL.
  • Example 3 Comparing Example 3 when washing using the first reagent under different conditions (#2 to #6), 2 ml of pH 6 rather than 2 ml of pH 6 was washed once (#2) It was confirmed that the case (#3) was further washed using the same first reagent after proceeding with a better result.
  • 20 is a Western blot result of Example 2 and Comparative Examples 2 to 4; 21 is a performance evaluation result using the bioanalyzer of Example 2 and Comparative Examples 2 to 4, and exosome miRNA measurement results using RT-qPCR. 22 is an exosome miRNA measurement result using RT-qPCR of Examples 2 and 3. 23 is a graph depicting gene expression using microarrays according to Example 2 and Comparative Examples 2 to 4; 24 is a result of using the micro-array according to Example 3.
  • FIG. 20A and 20B are the results of confirming the protein markers of the extracellular ER by Western blot according to Example 2 and Comparative Examples 2 to 4, and FIG. 20C is the protein extracted from the extracellular ER by Western blot. analysis result.
  • FIG. 21 a is a result of analyzing total exosome RNA using a bioanalyzer using an Agilent eukaryote total RNA pico chip according to Example 2 and Comparative Examples 2 to 4, and FIG. 21 b is RT-qPCR It is a result of analyzing the measured exosome miRNA (hsa-let-7a-5p, hsa-miR-142-3p).
  • Example 2 exhibited strong bands in the reference protein markers (ALIX, TSG101, CD9 and CD81). Further analysis was performed quantitatively on the intensity of the band (Fig. 20b).
  • Example 2 Comparative Example 2 > Comparative Example 4, and separated based on the surface protein markers (CD9 and CD81) and the internal protein markers (TSG101 and ALIX) It was confirmed that the extracellular vesicles were exosomes. That is, the extracellular vesicles isolated according to Example 2 of the present invention represent exosomes.
  • Example 2 Comparative Examples 2 to 4, exosomes were isolated using the same plasma, and the RNA of the exosomes was obtained from the SeraMir Exosome RNA Purification Kit (SBI, Palo Alto, CA, USA). ) was used for extraction. After RNA extraction, total RNA was measured using an Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). It was confirmed that Example 2 showed the highest total RNA value, and Comparative Example 3 showed the lowest.
  • RNA extracted from the exosomes was analyzed using RT-qPCR.
  • the Ct values for the two types of miRNAs showed similar values in the same isolation method, but it was confirmed that there was a significant difference between the respective isolation methods of Example 2 and Comparative Examples 2 to 4.
  • Comparative Example 2 was 31.1 and 30.5 for hsa-let-7a-5p and hsa-miR-142-3p, respectively, and Comparative Example 3 was 37.07 for hsa-let-7a-5p and hsa-miR-142-3p, respectively. and 36.29, which is considered to be high due to high protein contamination.
  • Example 2 showed the lowest Ct values of 22.7 and 21.2, and Comparative Example 4 showed 23.3 and 22.6.
  • Example 2 As a result of evaluation using the Gen-Chip miRNA 4.0 array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA), the extracellular extracted by Example 2, Comparative Example 2, and Comparative Example 4 It was confirmed that a total of 2578 miRNAs were identified in the endoplasmic reticulum. In all of Example 2, Comparative Example 2, and Comparative Example 4, it was confirmed that 92.6% of exosomal miRNAs appeared.
  • Gen-Chip miRNA 4.0 array Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA
  • Example 3 it was confirmed that in Example 3, it was 0.65%, which exhibited substantially similar performance to those of Comparative Examples 2 and 4, which are commonly used in the prior art.
  • step ( 25 is a result of performance evaluation in Example 2 in step (a) of using the first reagent and step (b) of using the second reagent.
  • Example 2 is based on the anion exchange principle and was washed with the first reagent as shown in FIG. 22A to remove proteins, which are impurities attached to the PPL-magnetic beads. At this time, the protein having a negative charge must be removed without affecting the extracellular vesicles captured by the PPL-magnetic beads. Since the pH of the first reagent has the same isoelectric point (pI) and the protein charge becomes neutral, it is easily separated by the ion exchange resin.
  • pI isoelectric point
  • the acetic acid concentration (29 nM) was kept constant and the pH was changed by variously changing the sodium hydroxide concentration (6.135 nM).
  • the washing efficiency defined as the ratio of the protein concentration washed by the first reagent to the total number of particles washed, was highest when the first reagent was pH 6.
  • the extracellular vesicles collected in the PPL-magnetic beads were separated using the second reagent (FIG. 22d).
  • the anion exchange capacity of sodium chloride showed an appropriate result as a second reagent, and sodium chloride was used as a salt. was used.
  • the elution effect defined as the ratio of the number of particles to the concentration of the eluted protein after eluting the extracellular vesicles collected in the PPL-magnetic beads with the second sample, the highest value is obtained when NaCl is 1M. It was confirmed that most of the exosomes were extracted at this time.

Abstract

본 발명은 생물학적 샘플 중에 포함된 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리방법에 있어서, (a) 미세소포체를 포함하는 생물학적 샘플에 흡착구체를 첨가하는 단계; (b) 상기 흡착구체를 상기 생물학적 샘플 내에 유지시켜 상기 흡착구체에 상기 미세소포체가 포획된 흡착구체 복합체를 형성하는 단계; (c) 상기 생물학적 샘플로부터 상기 흡착구체 복합체를 분리하는 단계; (d) 분리된 흡착구체 복합체를 제1 시약을 이용하여 세척하는 단계; 및 (e) 세척된 흡착구체 복합체를 제2 시약을 이용하여 미세소포체를 용리(elution)하는 단계;를 포함하고, 상기 흡착구체는 지지부와 상기 지지부의 표면에 구비되는 하나 이상의 다가 양이온을 포함하는, 생물학적 샘플로부터 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리방법을 포함한다.

Description

미세소포체 분리방법 및 미세소포체 분리장치
본 발명은 생물학적 샘플로부터 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리방법 및 미세소포체 분리장치에 관한 것이다.
미세소포체(microvesicle)는 세포에 의해 방출된 막 소포체로서 엑소좀(exosomes) 또는 세포외 소포체(extracellular vesicle)을 포함한다. 다양한 세포 공급원으로부터의 미세소포체는 모세포의 특성을 공유하기 때문에 질병의 새로운 진단 마커로 주목받고 있다. 그러나, 미세소포체는 50 ~ 200nm의 매우 작은 크기를 갖기 때문에 추출하기 어려운 물질이다.
종래의 세포 밖 소포체를 분리하는 기술로는 초고속 원심분리(ultra-centrifugation isolation), 크기별 제외법(size exclusion), 면역친화성 분리(immunoaffinity isolation), 미세유체 기술(microfluidics chip) 및 폴리머를 이용한 방법(polymeric method) 등이 있다. 이 중에서, 초고속 원심분리는 세포 밖 소포체를 분리하는데 가장 널리 쓰이는 방법이고, 원리가 간단하여 가장 신뢰성 있는 분리 방법이다.
하지만, 이러한 초원심분리를 이용해서 미세소포체를 분리할 경우에는 미세소포체의 수율이 낮을 뿐만아니라, 분리하는데 시간이 많이 소요되며 (8시간 이상), 추출에 숙련된 전문가가 필요하고, 고가의 기기로 인해 비용적 측면에서의 단점이 있다.
크기별 제외법의 경우 주로 초원심분리법과 함께 사용되어, 미세소포체의 순도를 간단히 높일 수 있다는 장점이 있지만, 미세소포체가 필터에 달라붙어 분리 후의 수율이 낮다는 한계가 있다.
면역친화성 분리법은 항체를 세포외 소포체에 붙여서 분리하는 방법으로 특정 미세소포체를 매우 높은 선별성(specificity)으로 분리 가능하지만, 일반적인 미세소포체에 대해 범용적으로 활용가능한 항체가 없기 때문에 추출 효율이 낮은 한계가 있다. 또한, 항체를 만드는 과정이 오래 걸리며 많은 비용이 들기 때문에 실용적인 진단에 적용하는 것은 적합하지 않다.
한편, 폴리머를 이용한 방법은 PEG(polyethylene glycol)를 샘플에 추가하여 용해도를 낮춰 줌으로써 미세소포체를 가라앉게 만들어 주는 기술이다. 이 방법은 여전히 원심분리기를 활용한 침전법으로서 검출 비용이 비싸며, 긴 인큐베이션 시간이 필요하고, 단백질도 함께 가라앉기에 침전물의 순도가 좋지 않아 진단을 위한 활용에 적합하지 않다.
기존의 전기적 하전 특성을 이용하여 미세소포체를 분리하는 방법도 공시되어 있지만, 혈장과 같은 시료에는 피브리노겐과 같은 다수의 혈장단백질이 미세소포체와 비슷한 크기의 제타전위을 띠고 있어 등전점(isoelectric point) 만으로 추출하기에는 다소 어려움이 보고되고 있다.
(선행문헌)
한국공개특허 10-2005-0119128 (2005년12월20일)
본 발명의 목적은 원심 분리과정 없이 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 빠르고 쉽게 수득할 수 있는 미세소포체 분리방법 및 미세소포체 분리장치를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 높은 효율을 갖고, 추가적인 후처리를 필요로 하지 않는 생물학적 샘플 중에 포함된 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리방법 및 미세소포체 분리장치를 제공하기 위함이다.
본 발명의 일측면에 따르면, 본 발명의 실시예들은 미세소포체 분리방법 및 미세소포체 분리장치를 포함한다.
본 발명의 일 실시예는, 생물학적 샘플 중에 포함된 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리방법에 있어서, (a) 미세소포체를 포함하는 생물학적 샘플에 흡착구체를 첨가하는 단계; (b) 상기 흡착구체를 상기 생물학적 샘플 내에 유지시켜 상기 흡착구체에 상기 미세소포체가 포획된 흡착구체 복합체를 형성하는 단계; (c) 상기 생물학적 샘플로부터 상기 흡착구체 복합체를 분리하는 단계; (d) 분리된 흡착구체 복합체를 제1 시약을 이용하여 세척하는 단계; 및 (e) 세척된 흡착구체 복합체를 제2 시약을 이용하여 미세소포체를 용리(elution)하는 단계;를 포함하고, 상기 흡착구체는 지지부와 상기 지지부의 표면에 구비되는 하나 이상의 다가 양이온을 포함하는, 생물학적 샘플로부터 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리방법을 포함한다.
일 실시예에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 뇌척수액, 눈물, 땀, 대변, 복수, 양수, 정액, 유(milk), 세포 배지, 조직 추출물 및 암 조직 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 지지부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 폴리스티렌, 하이드로겔, 아가로오스, 세라믹, 실리카겔, 라텍스, 금속 입자, 유리 입자, 자성 입자, 금속 와이어, 및 자성 나노 입자가 결합된 금속 와이어 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 다가 양이온은 폴리라이신, 프로타민, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, 양이온성 덱스트란, 양이온성 덴드리머, 양이온성 폴리사카라이드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민, 폴리쿼터늄, 폴리-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(PDMAEMA), 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(PDMAMS), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트(pDEAEA), 폴리 다이메틸아미노에틸아크릴레이트(pDMAEA), 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA), 리포폴리아민(lipopolyamines), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 구아니딘(guanidine), 이미다졸(imidazole), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrol), 및 키토산(chitosan) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 지지부는 구형으로 구비되고, 상기 지지부의 평균직경은 200 nm 이상 100 μm 이하일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 지지부는 다공성의 입자, 멤브레인 및 메쉬 중 적어도 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 지지부는 표면에 형성된 요철을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 지지부는 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로 부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 함유하는 자성 비드인 것을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 지지부는 중심에 구비되는 코어부와, 상기 코어부의 외면을 감싸도록 구비되는 쉘부를 포함하고, 상기 코어부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 폴리스티렌, 하이드로겔, 아가로오스, 세라믹, 실리카겔, 라텍스 중 어느 하나 이상이고, 상기 쉘부는 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로 부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 함유하고, 상기 다가 양이온은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 지지부는 중심에 구비되는 코어부와, 상기 코어부의 외면을 감싸도록 구비되는 쉘부를 포함하고, 상기 코어부는 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 함유하고, 상기 쉘부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 폴리스티렌, 하이드로겔, 아가로오스, 세라믹, 실리카겔, 라텍스 중 어느 하나 이상이고, 상기 다가 양이온은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, (b) 단계에서, 상기 흡착구체를 상기 생물학적 샘플 내에 유지시키는 것은, 1℃ 내지 8℃의 온도에서, 50rpm 내지 150rpm으로 10분 내지 2시간 동안 교반하는 것을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, (c) 단계에서, 상기 흡착구체 복합체는 분리부재를 이용하여 분리하고, 상기 분리부재는 포획필터, 자성분리, 원심분리, 용해도분리, 및 입자크기에 따른 분리 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, (d) 단계에서, 상기 미세소포체가 포집된 흡착구체는 제1 시약을 이용하여 제1 조건으로 세척하는 것을 포함하고, 상기 제1 시약은 CH3COO-, SO4 2-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 제1 조건은 pH 5.5 내지 6.5, 및 pH 7.5 내지 9.5 중 어느 하나 이상의 pH 범위 내에서, 1회 이상으로 수행되는 것을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, (e) 단계에서, 상기 미세소포체가 포집된 흡착구체는 제2 시약을 이용하여 제2 조건으로 용리하는 것을 포함하고, 상기 제2 시약은 CH3COO-, SO4 2-, Cl-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하되, 0.2 M 내지 3 M의 농도범위로 구비되고, 상기 제2 조건은 1분 내지 60분의 시간 동안 500rpm 내지 2000rpm으로 혼합하면서 1회 이상 수행되는 것을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, (d) 단계에서 상기 제1 시약으로 상기 흡착구체 복합체를 세척한 후 상기 흡착구체 복합체를 분리하는 1차보조분리와, (e) 단계에서 상기 제2 시약으로 상기 미세소포체를 용리한 후 상기 흡착구체를 분리하는 2차보조분리를 더 포함하고, 상기 지지부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 및 폴리스티렌 중 어느 하나 이상으로 이루어진 단면이 원형인 비드형태로 구비되며, 상기 1차보조분리 또는 2차보조분리는 50 nm 내지 1,000 nm 크기의 공극을 갖는 포획필터로 수행될 수 있다.
일 실시예에 있어서, (d) 단계에서 상기 제1 시약으로 상기 흡착구체 복합체를 세척한 후 상기 흡착구체 복합체를 분리하는 1차보조분리와, (e) 단계에서 상기 제2 시약으로 상기 미세소포체를 용리한 후 상기 흡착구체를 분리하는 2차보조분리를 더 포함하고, 상기 지지부는 자성입자를 포함하고, 상기 1차보조분리 또는 2차보조분리는 전자석에 전류를 흘려 발생시키거나, 또는 자석을 이용하는 자성분리인 것을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 상기 흡착구체가 첨가되기 전 전처리되는 것을 더 포함하고, 상기 생물학적 샘플의 전처리는 상기 생물학적 샘플 중 평균직경이 0.8μm 초과인 물질이 분리되도록 상기 생물학적 샘플을 여과시키는 것을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 미세소포체는 상기 흡착구체와 정전기적 상호작용(electrostatic interaction) 및 인터칼레이션(intercalation) 중 적어도 어느 하나에 의하여 결합되고, 상기 흡착구체 복합체의 제타전위(zeta potential)는 0.5mV 내지 10mV인 것을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 흡착구체에 포집된 미세소포체는 평균직경이 20 nm 내지 800 nm이고, 상기 다가 양이온은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 생물학적 샘플 중에 포함된 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리용 시약 키트에 대한 것으로, 상기 미세소포체와 결합성을 갖는 하나 이상의 흡착구체; CH3COO-, SO4 2-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하는 제1 시약; 및 CH3COO-, SO4 2-, Cl-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하는 제2 시약;을 포함하고, 상기 흡착구체는 지지부와 상기 지지부의 표면에 구비되는 하나 이상의 다가 양이온을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 시약 키트는 상기 흡착구체 또는 상기 미세소포체를 포획한 흡착구체를 분리하는 분리부재를 더 포함하고, 상기 분리부재는 포획필터, 자성분리, 원심분리, 용해도분리, 및 입자크기에 따른 분리 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 지지부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 및 폴리스티렌 중 어느 하나 이상으로 이루어진 단면이 원형인 비드형태로 구비되며, 상기 다가 양이온은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 분리부재는 50 nm 내지 1,000 nm 크기의 공극을 갖는 포획필터를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 지지부는 자성입자를 포함하고, 상기 다가 양이온은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 분리부재는 전자석에 전류를 흘려 발생시키는 장치 또는 자석을 이용하는 자성분리를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 원심 분리 등과 같은 고가의 장비에 의한 처리없이 생물학적 샘플로부터 미세 소포체를 단기간에 고수율 및 고순도로 분리할 수 있어, 원심 분리기 등과 같은 부피가 큰 장치를 배치할 수 없는 현장 진단 등에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 적은 부피의 생물학적 샘플을 사용하면서도 매우 높은 순도로 미세소포체를 분리할 수 있는 미세소포체 분리방법 및 미세소포체 분리장치를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세소포체 분리방법을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 흡착구체를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3a는 본 발명의 다른 실시예에 따른 흡착구체를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3b는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 지지부를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 1에 따른 미세소포체 분리방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 1에 따른 PLL-비드와, 양이온성 폴리머가 결합되지 않은 비드인 베어비드(Bare-bead)를 이용하여 세포외 소포체의 분리능을 확인한 결과이다.
도 6은 실시예 1의 PLL-비드가 제조되는 모습을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 7은 도 6에 따른 방식으로, PLL 농도를 다르게 하여 제조된 PLL-비드의 형광 이미지(fluorescent image)를 나타내었다.
도 8은 실시예 1를 이용하여 다양한 제1 시약에 따른 성능을 확인한 결과이다.
도 9은 실시예 1를 이용하여 염을 추가한 제1 시약에 따른 성능을 확인한 결과이다.
도 10은 실시예 1를 이용하여 다양한 제2 시약에 따른 성능을 확인한 결과이다.
도 11은 제1 시약의 종류에 따른 제2 시약 중에 포함된 입자, 단백질, 및 순도를 나타낸 그래프이다.
도 12는 종래의 원심분리법과 본 발명의 실시예 1에 따른 분리방법을 평가한 결과이다.
도 13는 실시예 2에 따른 미세소포체 분리방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 14는 PLL의 농도, 인큐베인션 온도 및 인큐베이션 시간에 따른 PLL-자성비드의 성능을 평가한 결과이다.
도 15는 PLL-자성비드의 사이즈에 따른 세포외 소포체 분리능을 평가한 결과이다.
도 16은 실시예 2 및 비교예 2에 따른 SEM 이미지, 형광이미지, 및 Cryo-TEM 이미지를 나타내었다.
도 17은 실시예 2에 따른 제타전위와 인큐베이팅 후 부피변화를 확인한 결과이다.
도 18은 실시예 2, 비교예 2 내지 비교예 4의 NTA 및 BCA 분석결과이다.
도 19는 실시예 2와 실시예 3의 제1 시약에 따른 NTA 및 BCA 분석결과이다.
도 20은 실시예 2 및 비교예 2 내지 비교예 4의 웨스턴 블롯 결과이다.
도 21은 실시예 2 및 비교예 2 내지 비교예 4의 바이오 분석장치 (bioanalyzer)를 이용한 성능평가 결과와, RT-qPCR를 이용한 엑소좀 miRNA 측정 결과이다.
도 22는 실시예 2 및 실시예 3의 RT-qPCR를 이용한 엑소좀 miRNA 측정 결과이다.
도 23는 실시예 2 및 비교예 2 내지 비교예 4에 따른 마이크로 에레이를 이용한 유전자 발현을 묘사하는 그래프이다.
도 24는 실시예 3에 따른 마이크로 에레이를 이용한 결과이다.
도 25는 실시예 2에서 제1 시약을 이용하는 단계(a)와 제2 시약을 이용하는 단계(b)에서의 성능평가를 한 결과이다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 이하의 설명에서 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다
또한, 본 발명에서 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들 뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명에서, 용어 “미세소포체(microvesicle)”는 고세균(Archaea), 원핵생물(Prokarya) 또는 진핵생물(Eukarya)의 세포막으로부터 방출되는 세포외 소포체(extracellular vesicle)와 동일한 의미로 사용된다. 상기 미소소포체는 본 발명에서 엑소좀(exosome), 아그로좀(argosomes), 덱소좀(dexosomes), 엑토좀(ectosomes), 엑소베지클(exovesicle), 온코좀(oncosome), 프로미노좀(prominosome), 프로스타좀(prostasome), 톨레로좀(tolerosome), 미세입자(microparticle), 나노소포(nanovesicle), 수포성 소포(blebbing vesicle), 출아성 소포(budding vesicle), 엑소좀-유사 소포(exosome-like vesicle), 매트릭스 소포(matrix vesicle), 막 소포(membrane vesicle), 탈피성 소포(shedding vesicle), 막 입자(membrane particle), 탈피성 미세소포(shedding microvesicle), 막 수포(membrane bleb), 에피디디모좀(epididimosome), 프로미니노좀(promininosome), 텍소좀(texosome) 또는 아키오좀(archeosome)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 특별한 언급이 없는 한 세포외 소포체，미세소포체，및 엑소좀은 크기의 구별 없이 모두 미세소포체를 의미하는 것으로 혼용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세소포체 분리방법을 나타낸 흐름도이다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 흡착구체를 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 3a는 본 발명의 다른 실시예에 따른 흡착구체를 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 3b는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 지지부를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 실시예는 생물학적 샘플 중에 포함된 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리방법에 대한 것으로, (a) 미세소포체를 포함하는 생물학적 샘플에 흡착구체를 첨가하는 단계; (b) 상기 흡착구체를 상기 생물학적 샘플 내에 유지시켜 상기 흡착구체에 상기 미세소포체가 포획된 흡착구체 복합체를 형성하는 단계; (c) 상기 생물학적 샘플로부터 상기 흡착구체 복합체를 분리하는 단계; (d) 분리된 흡착구체 복합체를 제1 시약을 이용하여 세척하는 단계; 및 (e) 세척된 흡착구체 복합체를 제2 시약을 이용하여 미세소포체를 용리(elution)하는 단계;를 포함할 수 있다. 상기 흡착구체는 지지부와 상기 지지부의 표면에 구비되는 하나 이상의 다가 양이온을 포함할 수 있다.
(a) 단계에서는, 생물학적 샘플 내에 흡착구체를 첨가할 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 미세소포체를 포함하는 생체 시료 또는 세포 배양액, 조직 시료 등을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 뇌척수액, 눈물, 땀, 대변, 복수, 양수, 정액, 유(milk), 세포 배지, 조직 추출물 및 암 조직 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
(a) 단계 흡착구체를 제조하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 흡착구체(100)는 지지부(110)와 상기 지지부(110)의 외면에 결합되는 다가 양이온(120)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 흡착구체(100)는 표면에 반응성을 갖는 반응성기 또는 작용기를 구비하는 지지부(110)와, 상기 지지부(110)의 반응성기 또는 작용기와 화학반응하는 그룹(group)를 갖는 다가 양이온(120)을 포함할 수 있다.
상기 지지부(110)는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 폴리스티렌, 하이드로겔, 아가로오스, 세라믹, 실리카겔, 라텍스, 금속 입자, 유리 입자, 자성 입자, 금속 와이어, 및 자성 나노 입자가 결합된 금속 와이어 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 다가 양이온(120)은 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, 프로타민, 양이온성 덱스트란, 양이온성 덴드리머, 양이온성 폴리사카라이드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민, 폴리쿼터늄, 폴리-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(PDMAEMA), 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(PDMAMS), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트(pDEAEA), 폴리 다이메틸아미노에틸아크릴레이트(pDMAEA), 및 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 상기 다가 양이온은 리포폴리아민(lipopolyamines), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 구아니딘(guanidine), 이미다졸(imidazole), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrol), 및 키토산(chitosan) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 지지부(110)는 그 자체로 작용기를 갖는 고분자 등과 같은 형태이거나, 혹은 플라즈마 처리, 작용기를 갖는 고분자에 의한 표면코팅 등에 의하여 작용기가 도입된 형태를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 지지부(110)는 하이드로겔 형태로 구비될 수 있으며, 상기 하이드로겔의 다공성 특성에 의하여 상기 흡착구체의 표면적이 전체적으로 증가할 수 있다. 따라서, 하이드로겔을 포함하는 상기 지지부(110)는 미세소포체와 접촉하는 면적이 증가되므로, 미세소포체의 포획능력이 보다 향상될 수 있다.
예컨대, 상기 지지부(110)가 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 등과 같이 반응성기 또는 작용기를 갖는 경우에는 그 자체로 지지부를 형성할 수 있다. 또한, 상기 지지부가 금속 입자, 유리 입자, 자성 입자 등과 같이 그 자체로 반응성기 또는 작용기를 갖지 못한 경우에는 표면처리, 또는 반응성기 또는 작용기를 갖는 물질에 의한 표면코팅 등에 의하여 구비될 수 있다.
상기 다가 양이온(120)은 상기 지지부(110)와 화학결합하여 상기 지지부(110)의 표면의 적어도 일부를 덮도록 구비될 수 있으며, 상기 다가 양이온에 의하여 상기 흡착구체(100)는 양전하를 구비할 수 있다.
구체적으로, 상기 지지부(110)는 구형으로 구비될 수 있으며, 상기 지지부(110)의 평균직경은 200 nm 이상 내지 100 μm 이하일 수 있으며, 구체적으로 500 nm 이상 내지 3 μm 이하일 수 있다.
본 발명에서, 상기 지지부(110)의 작아질수록 표면적의 크기가 비드 직경의 제곱에 반비례하게 되므로 미세소포체를 포획시켜 흡착구체 복합체를 형성하는 효율이 증가하나, 반면 추후 흡착구체 복합체에서 상기 미세소포체를 분리시킨 후 흡착구체를 효과적으로 회수하기 위해서는 상기 지지부는 전술한 범위 내로 포함될 수 있다.
또한, 흡착구체(100)는 생물학적 샘플 내에 포함되는 다양한 물질 중 미세소포체를 효과적으로 포획해야 하는데, 생물학적 샘플에 포함되는 그 외의 단백질 등이 부착되는 것을 가능한 방지하고, 소정의 크기를 갖는 미세소포체를 효과적으로 포획하기 위해서 상기 지지부는 500 nm 이상 내지 3 μm 이하로 구비되는 것이 바람직하다.
일 실시예에서, 상기 지지부(110)는 카복실기 또는 아민기로 기능화된 표면을 갖는 비드형태의 플라스틱(예컨대, 폴리스티렌), 또는 비드형태의 금속(예컨대, 철(Fe))을 포함하며, 상기 다가 양이온(120)은 양이온성 폴리머를 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 지지부(110)는 히알루론산 마이크로 비드이고, 표면에 상기 다가 양이온(120)이 결합된 형태를 포함할 수 있다. 이와 같이 히알루론산 마이크로 비드를 지지부로 이용하는 경우, 대한민국 등록특허 10-1212258호를 참고하여, 양이온성 폴리머와 히알루론산 수용액을 혼합한 후 약산성 수용액을 가하여 전기방사시켜 생성할 수 있다.
그 외의 실시예에서, 상기 지지부는 다공성 입자, 멤브레인 및 메쉬 중 적어도 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 멤브레인이나 메쉬의 포어 크기가 200 nm 이상 내지 100 μm 이하일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포어는 크기가 500 nm 이상 내지 2 μm 이하일 수 있다. 상기 멤브레인이나 메쉬는 플라스틱 소재, 다양한 금속소재, 자성을 갖는 소재일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
별법으로, 상기 지지부는 표면에 요철이 형성될 수 있다. 상기 지지부의 표면에 형성된 요철은 상기 지지부의 표면적을 증가시키므로 상기 다가 양이온과의 결합력을 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 다가 양이온이 상기 지지부의 표면에 구비된 흡착구체에서도 상기 지지부의 표면에 형성된 요철의 형태가 대략 유사하게 반영되어 형성되므로 전체적으로 흡착구체의 표면적도 함께 증가될 수 있다. 이에 의하여 상기 흡착구체가 상기 미세소포체를 포획할 수 있는 면적이 증가되고, 상기 미세소포체는 상기 흡착구체의 표면에서 상가 다가 양이온과 정전기적 인력에 의하여 결합되면서, 동시에 상기 흡착구체의 표면 요철에 의하여 내측으로 오목하게 형성된 공간 내에 삽입되는 형태로 포획될 수 있어 구조적으로도 고정될 수 있어 상기 미세소포체의 포획이 보다 견고하게 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 다가 양이온(120)은 분자량 150-300 kDa의 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 지지부(110)는 카복실기를 갖는 폴리스티렌을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 흡착구체(100)는 상기 생물학적 샘플 중에 0.5 mg/mL 내지 20 mg/mL의 농도로 포함되거나, 또는 1 mg/mL 내지 20 mg/mL, 또는 3 mg/mL 내지 20 mg/mL, 또는 5 mg/mL 내지 20 mg/mL, 또는 0.5 mg/mL 내지 18 mg/mL, 또는 0.5 mg/mL 내지 15 mg/mL, 또는 1 mg/mL 내지 15 mg/mL로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 흡착구체(100)는 상기 생물학적 샘플 중에 5 mg/mL 내지 15 mg/mL의 농도로 포함될 수 있다.
상기 흡착구체(100)가 상기 생물학적 샘플 중에 과도하게 포함되는 경우, 흡착구체(100)의 표면보다는 흡착구체(100) 사이에 형성된 공극 내에 미세소포체보다는 크기가 더 작은 단백질 등이 더 많이 포함되어 미세소포체의 포획 능력이 저하될 수 있으며, 상기 흡착구체(100)가 너무 적게 포함되는 경우에는 상기 미세소포체의 흡착 효율이 낮다.
또한, 상기 지지부(110)는 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 함유하는 자성 비드일 수 있다.
상기 지지부(110)가 자성비드인 경우, 상기 지지부는 표면에 다가 양이온이 코팅되어 구비될 수 있다. 이때, 상기 지지부(100)의 표면은 플라즈마 처리, 전자빔 처리 등에 의하여 표면이 개질되어 구비될 수 있다. 예컨대, 상기 지지부(100)를 플라즈마가 발생되는 챔버 내에 구비시켜, 소정의 에너지를 갖는 플라즈마로 처리함으로써, 상기 지지부(100)의 표면에는 양이온, 또는 음이온, 전자 등이 형성되거나, 혹은 작용기, 반응성기 등에 구비될 수 있다. 별법으로, 상기 지지부(100)의 표면을 보다 전자빔 등과 같이 보다 강한 에너지를 이용하여 표면처리 하는 경우, 상기 지지부(100)의 표면에 요철을 형성시킬 수 있다. 상기 지지부(100)의 표면을 플라즈마 처리하는 경우, 상기 다가 양이온과의 결합력을 향상시킬 수 있으며, 상기 지지부(100)의 표면에 요철을 형성시키는 경우 상기 다가 양이온과의 결합되는 표면적을 증가시킴으로써, 상기 지지부(100)는 상기 다가 양이온과 보다 효과적으로 결합되도록 할 수 있다.
별법으로, 상기 지지부(100)가 자성비드인 경우, 표면이 양전하(+)로 개질된 것을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 자성비드는 표면이 실리카로 코팅되고 양전하를 띠는 작용기, 예를 들어 3-아미노프로필기, 아미노메틸기, 2-아미노에틸기, N-메틸-3-아미노프로필기, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필기, N-아미노에틸-3-아미노프로필기 또는 N,N-디(2-아미노에틸)-3-아미노프로필기 등의 아민기로 수식되어 구비될 수 있다.
그 외의 방법으로, 도 3a과 같이 지지부(210)는 금속 와이어 또는 자성 와이어와 같이, 하나 이상의 와이어가 뭉쳐서 형성될 수 있다. 이때, 상기 지지부(210)는 하나 이상의 와이어를 뭉치기 전에, 상기 와이어의 표면에 표면처리하여 작용기를 형성시킬 수 있으며, 혹은 나노 사이즈의 자성나노입자를 표면에 부착시켜 형성할 수 있다. 상기 지지부(210)를 뭉쳐서 대략 둥근 형태로 구비시킨 후 표면에 다가 양이온(220)을 코팅시켜 흡착구체(200)로 제조할 수 있다.
또한, 별법으로 상기 지지부(310)는 중심에 구비되는 코어부(311)와, 상기 코어부(311)의 외면을 감싸도록 구비되는 쉘부(312)를 포함할 수 있다.
이때, 상기 코어부(311)가 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 폴리스티렌, 하이드로겔, 아가로오스, 세라믹, 실리카겔, 라텍스 중 어느 하나 이상인 경우, 상기 쉘부(312)는 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로 부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 함유할 수 있다.
또한, 상기 코어부(311)가 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로 부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 함유하는 경우, 상기 쉘부(312)는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 폴리스티렌, 하이드로겔, 아가로오스, 세라믹, 실리카겔, 라텍스 중 어느 하나 이상일 수 있다.
전술한 바와 같이 코어부(311)와 상기 코어부(311)의 외면을 감싸도록 형성되는 쉘부(312)는 서로 다른 물질로 이루어질 수 있으며, 이때 상기 코어부(311) 또는 상기 쉘부(312) 중 적어도 어느 하나는 자성분리에 의하여 분리되는 물질로 이루어질 수 있다. 여기서, 상기 자성분리는 전자석에 전류를 흘려 발생시키거나, 또는 자석을 이용할 수 있다.
상기 코어부(311)와 쉘부(312)의 재료는 상기 생물학적 샘플의 종류, 상기 생물학적 샘플 중 포획하고자 하는 미세소포체의 특성 등에 의하여 다양하게 선택될 수 있다.
상기 다가 양이온(320)은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함하며, 상기 다가 양이온(320)은 상기 쉘부(312)의 적어도 일부를 덥도록 구비되어 흡착구체(300)를 형성할 수 있다.
(b) 단계는 상기 흡착구체를 상기 생물학적 샘플 내에 유지시켜, 상기 흡착구체와 미세소포체가 결합된 형태인 흡착구체 복합체를 형성할 수 있다. 상기 흡착구체는 상기 다가 양이온에 의하여 전기저으로 (+)의 특성을 갖고, 상기 미세소포체는 전기적으로 (-)의 특성을 가질 수 있다. 따라서, 상기 미세소포체는 상기 흡착구체와 정전기적 상호작용(electrostatic interaction) 및 인터칼레이션(intercalation) 중 적어도 어느 하나에 의하여 결합될 수 있다. 상기 흡착구체 복합체의 제타전위(zeta potential)는 0.5mV 내지 10mV일 수 있다.
상기 흡착구체와 상기 미세소포체는 각각 (+)와 (-)의 특성을 갖고, 이에 의하여 서로 결합하게 되는데, 이때 상기 흡착구체 복합체의 제타전위가 0.5mV 미만인 경우에는 상기 미세소포체가 상기 흡착구체에 효과적으로 포획되지 않고, 후술하는 바와 같이 제2 시약으로 용리하기 이전에 상기 미세소포체의 많은 양이 유실되어 미세소포체의 분리능이 저하된다. 반면, 상기 흡착구체 복합체의 제타전위가 10mV을 초과하는 경우에는 상기 제2 시약으로도 상기 미세소포체를 용리하기 어려워 문제된다. 구체적으로, 상기 흡착구체 복합체의 제타전위는 1mV 내지 10mV, 또는 5mV 내지 10mV, 또는 0.5mV 내지 7mV, 또는 0.5mV 내지 5mV일 수 있다.
또한, 상기 흡착구체는 제타전위가 10 mV 내지 30 mV, 또는 15 mV 내지 30 mV, 또는 17 mV 내지 30 mV, 또는 20 mV 내지 30 mV, 또는 10 mV 내지 27 mV, 또는 10 mV 내지 25 mV, 또는 12 mV 내지 25 mV, 또는 15 mV 내지 25 mV, 또는 17 mV 내지 25 mV, 또는 20 mV 내지 25 mV일 수 있다. 상기 흡착구체는 제타전위가 전술한 범위 내에 구비됨으로써, 상기 생물학적 샘플 내에서 미세소포체를 보다 효과적으로 포획할 수 있다.
미세소포체는 그 크기가 나노미터 단위로 미세하여 크기를 이용하는 분리 등으로는 상기 생물학적 샘플 중에서 분리하기 용이하지 않다, 반면, 본 실시예에 따른 미세소포체 분리방법에서는 상기 흡착구체를 이용하여 상기 미세소포체를 양이온 및 음이온에 의한 인력에 의하여 상기 미세소포체를 포획하여 분리하되, 이때 상기 흡착구체의 제타전위 및 상기 흡착구체 복합체의 제타전위를 전술한 범위 내로 제어함으로써, 상기 미세소포체를 상기 생물학적 샘플 내에서 효과적으로 분리할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 흡착구체에 포집된 미세소포체는 평균직경이 0.5nm 내지 1㎛이고, 상기 다가 양이온은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL)를 포함하며, 상기 지지부는 카복실기를 갖는 폴리스티렌을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 흡착구체에 포집되는 미세소포체는 1nm 내지 1㎛, 또는 10nm 내지 1㎛, 또는 50nm 내지 1㎛일 수 있다.
(b) 단계에서, 상기 흡착구체를 상기 생물학적 샘플 내에 유지시키는 것은, 1℃ 내지 8℃의 온도에서, 50rpm 내지 150rpm으로 10분 내지 2시간 동안 교반할 수 있다.
상기 (b) 단계에서, 온도는 1℃ 내지 8℃일 수 있다. 상기 온도가 1℃ 미만인 경우에는 생물학적 샘플이 어는 등의 문제가 발생할 수 있으며, 8℃를 초과하는 경우에는 상기 생물학적 샘플 내에 포함되는 미세소포체, 단백질 등과 같은 물질의 유동성이 높아서 상기 흡착구체에 상기 미세소포체가 포획되는 것을 방해할 수 있다. 구체적으로, 상기 온도는 2℃ 내지 8℃, 또는 3℃ 내지 8℃, 또는 1℃ 내지 7℃, 또는 1℃ 내지 6℃, 또는 1℃ 내지 5℃, 또는 2℃ 내지 7℃, 또는 3℃ 내지 6℃일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 온도는 3.5℃ 내지 4.5℃일 수 있으며, 상기 온도범위는 미세소포체 이외의 불순물로 작용하는 단백질을 안정화시켜 단백질의 유동성이 억제되므로, 미세소포체가 상기 흡착구체로 포획되는 것을 향상시킬 수 있다.
상기 (b) 단계에서, 50rpm 내지 150rpm의 교반속도 및 10분 내지 2시간의 교반시간으로 교반할 수 있다. 교반속도가 50rpm 미만인 경우에는 상기 미세소포체가 상기 흡착구체에 균일하게 흡착되지 못하고 일부에 응집되는 등의 문제가 발생할 수 있고, 150rpm 초과인 경우에는 상기 미세소포체가 상기 흡착구체의 표면에 안정적으로 결합하기 어려워 문제된다. 구체적으로, 상기 교반속도는 70rpm 내지 150rpm, 또는 100rpm 내지 150rpm, 또는 50rpm 내지 170rpm, 또는 50rpm 내지 160rpm, 또는 70rpm 내지 100rpm일 수 있다.
상기 교반시간은 10분 내지 2시간일 수 있는데, 10분 미만인 경우에는 상기 미세소포체가 상기 흡착구체에 충분히 포획되기 어렵고, 2시간을 초과하는 경우에는 불필요하게 시간을 소요하여 미세소포체 분리시간을 증가시킨다. 구체적으로, 상기 교반시간은 30분 내지 2시간, 또는 50분 내지 2시간, 또는 1시간 내지 2시간, 또는 10분 내지 1.5시간, 또는 10분 내지 1시간, 또는 10분 내지 50분, 또는 20분 내지 50분일 수 있다.
상기 흡착구체 복합체를 형성하는 시간은 종래에 사용되는 방법, 예컨대 면역친화성 분리(Immunoaffinity isolation) 방법에서 소요되는 시간과 대비할 때, 그 소요 시간이 현저히 줄어든 장점이 있다.
(c) 단계는 상기 생물학적 샘플로부터 상기 흡착구체 복합체를 분리할 수 있다. 상기 흡착구체 복합체는 흡착구체의 표면에 상기 미세소포체가 결합된 형태를 포함할 수 있다.
상기 (c) 단계에서, 상기 흡착구체 복합체는 분리부재를 이용하여 분리하되, 상기 분래부재는 포획필터, 자성분리, 원심분리, 용해도분리, 및 입자크기에 따른 분리 중 어느 하나 이상을 이용할 수 있다.
예컨대, 상기 분리부재가 포획필터인 경우, 상기 포획필터는 50 nm 내지 1,000 nm, 또는 100 nm 내지 500 nm, 또는 150 nm 내지 300 nm의 크기의 공극을 갖는 멤브레인일 수 있다. 상기 포획필터의 공극이 전술한 범위 내인 경우, 상기 포획필터를 통하여 흡착구체 복합체를 상기 생물학적 샘플 내에서 분리할 수 있다.
상기 흡착구체 복합체가 포획필터를 통과하는 방식은, 상기 흡착구체 복합체와 생물학적 샘플을 담고 있는, 반응기, 추출튜브 등의 내부에 설치된 상태로 생물학적 샘플이 중력 또는 음압에 의하여 포획필터를 통과하는 형태일 수 있다. 또한, 상기 포획필터는 상기 흡착구체 복합체와 생물학적 샘플을 담고 있는, 반응기, 추출튜브 등의 배출구에 인접하도록 상기 반응기, 추출튜브 등의 외부에 설치된 상태로 생물학적 샘플이 중력 또는 음압에 의하여 포획필터를 통과하는 형태일 수 있다.
예컨대, 상기 포획필터는 전기적 특성이(+) 특성을 갖는 흡착구체 복합체가 보다 쉽게 포획되도록 친수성 물질이나 양이온 교환 수지로 마련될 수 있다.
상기 포획필터가 친수성 물질일 경우, 흡착구체 복합체는 공극에 쉽게 걸려 물리적으로 포획될 수 있다. 상기 친수성 물질은 실버 메탈(silver metal), 폴리에테르설폰(polyethersulfone), 유리 파이버(glass fiber), 폴리카보네이트 트렉 에치(polycarbonate track etch; PCTE), 폴리에스터(polyester), 혼합 셀룰로오스 에스터(mixed cellulose esters; MCE), 나일론(nylon), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate) 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 포획필터가 양이온 교환 수지일 경우, 흡착구체 복합체는 음전하로 하전된 포획필터에 의해 전기적인 힘으로 필터 표면에 흡착된다. 상기 양이온 교환 수지는 카복시메틸(carboxymethyl), 메틸 설포네이트(methyl sulfonate), 설포닐 기(sulphonyl group), 또는 이들의 조합일 수 있다.
구체적으로, 상기 포획필터는 음전하를 갖는 양이온 교환 수지에 흡착구체 복합체가 전기적인 힘에 의해 포획되도록 형성된 형태일 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 약 220 nm의 공극 크기를 갖는 시린지 필터를 사용하여 미세소포체 응집체를 여과할 수 있다.
또한, 상기 분리부재는 자성분리를 포함할 수 있다. 상기 지지체는 자성입자를 포함하고, 전자석에 전류를 흘려 발생시키는 장치 또는 자석을 이용하여 상기 흡착구체 복합체를 분리할 수 있다.
구체적으로, 전자석을 이용하는 경우 전자기파에 의하여 상기 흡착구체 복합체는 붙들러 이동이 제한된다. 또한, 자석을 이용하는 경우, 소정의 위치에 구비시킴으로써 상기 흡착구체 복합체를 고정시켜 상기 생물학적 샘플로부터 분리할 수 있다. 상기 자석은 생물학적 샘플과 흡착구체가 구비되는 반응기의 내부 및 외부 중 어느 하나 이상에 구비될 수 있으며, 상기 흡착구체가 반응기의 내벽에 부착되거나, 혹은 반응기의 바닥부 등에서 가라앉는 것을 방지하기 위하여 상기 자석은 회전이 가능한 임팰러의 형태로 구비될 수 있다.
(d) 단계에서는 (c) 단계에서 분리된 흡착구체 복합체를 제1 시약을 이용하여 제1 조건으로 세척할 수 있다. 상기 제1 시약은 상기 흡착구체 복합체의 표면에 포획된 미세소포체 이외의 물질, 예컨대 음전하를 갖는 단백질 등과 같은 불순물을 상기 흡착구체에서 분리시켜, 최종적으로 분리된 미세소포체의 순도를 향상시킬 수 있다.
상기 제1 시약은 카오트로픽 물질(chaotropic salt), 프로테아제(protease), CH3COO-, SO4 2-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 제1 조건은 pH 5.5 내지 6.5, 및 pH 7.5 내지 9.5 중 어느 하나 이상의 pH 범위 내에서, 1회 이상으로 수행되는 것을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 시약의 농도는 0.1 내지 4.5 M, 0.5 내지 4 M, 1 내지 3 M의 범위일 수 있다. 제1 시약이 복수회로 사용될 경우, 상기 제1 시약의 농도는 점차 감소하도록 구비될 수 있다.
상기 카오트로픽 물질이란 수용액내 물분자의 바구니구조(cargo structure)를 불안전하게 하거나 파괴하는 물질 또는 이온을 의미한다. 수용액 내에 카오트로픽 물질의 첨가로 인해, 물의 엔트로피가 증가되고 단백질 간, 수소결합 간, 반데르발스(Van der Waals force)힘 또는 소수결합 등에 영향을 미치게 함으로서 그의 분자구조를 불안정하게 한다.
상기 카오트로픽 물질은 구아니디니움(guanidinium) 이온을 포함하는 염, 예컨대 구아니디니움 이소티오시아네이트, 구아니디니움 티오시아네이트, 또는 구아니디니움 클로라이드, 또는 구아니딘 하이드로클로라이드; n-부탄올, 에탄올, 과염소산 리튬, 아세트산 리튬, 염화마그네슘, 페놀, 2-프로판올, 소듐 도데실 설페이트, 티오우레아, 우레아 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 프로테아제는 프로테나제 K(Proteinase K), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin) 또는 키모트립신(Chymotrypsin)를 포함할 수 있다.
상기 제1 시약은 상기 흡착구체 복합체에서, 상기 미세소포체는 그대로 유지시키되 그 외의 물질을 상기 흡착구체에서 분리시킬 수 있다. 상기 제1 시약은 상기 미세소포체와 상기 흡착구체 사이의 결합력을 유지시키되 그 외의 물질은 분리하도록 구비된다.
상기 제1 조건은 pH 5.5 내지 6.5, 및 pH 7.5 내지 9.5 중 어느 한 조건의 pH 범위 내에서 수행될 수 있는데, 상기 pH가 전술한 범위 내에서 수행되어야, 상기 흡착구체 복합체에서 단백질 등과 같은 불순물을 용이하게 분리하며, 분리된 단백질 등과 같은 불순물이 상기 흡착구체로 재흡착되는 것을 방지할 수 있다.
구체적으로, 상기 제1 시약은 구아니디이움 티오시아네이트를 2M 농도로 포함할 수 있다.
별법으로, 제1 시약은 카오트로픽 물질을 포함하지 않을 수 있다. 또한, 상기 제1 시약은 pH는 산성 또는 중성일 수 있고, 예컨대, pH가 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0. 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 또는 9.0일 수 있다. 상기 제1 시약은 1회 또는 복수회 사용될 수 있다. 제1 시약이 복수회로 사용될 경우, 각각의 제1 시약의 pH 5.5 내지 6.5, 및 pH 7.5 내지 9.5 중 어느 한 조건의 pH 범위 내에서 서로 같거나 또는 다른 pH로 구비될 수 있다. 예컨대, 복수회로 사용되는 각 제1 시약의 pH는 점진적으로 감소되거나 또는 증가될 수 있다.
예컨대, 상기 제1 시약을 1차로 사용할 때, 상기 pH를 낮은 범위로 유지하여 상기 단백질 등과 같은 불순물을 상기 흡착구체 복합체에서 단시간 내에 분리시키고, 상기 제1 시약을 2차로 사용할 때, 상기 pH를 1차보다 높은 범위로 유지시켜 상기 분리된 단백질 등과 같은 불순물이 상기 흡착구체에 재흡착되지 않도록 할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 시약의 pH는 1차에서 3 이상 내지 7 미만의 산성일 수 있으며, 상기 제1 시약의 pH는 2차에서 7 초과 내지 12의 염기성일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 시약의 pH는 1차에서 3 내지 6, 또는 3 내지 5, 또는 3 내지 4.5이고, 상기 제1 시약의 pH는 2차에서 7.5 내지 12, 또는 8 내지 11, 또는 9 내지 10일 수 있다. 또한, 상기 제1 시약의 pH는 1차에서 3 이상 내지 7 이하의 범위로 1회 이상으로 수행될 수 있고, 상기 제1 시약의 pH는 2차에서 7 초과 내지 12의 범위로 1회 이상으로 수행될 수 있다.
일 예로, 상기 제1 시약은 2회 이상 사용될 수 있으며, 상기 제1 시약이 2회 이상 사용되는 경우 1차 시약의 pH는 5.5 내지 6.5이고, 2차 이상의 시약의 pH는 5.5 내지 6.5일 수 있다. 또한, 별법으로 상기 제1 시약이 2회 이상 사용되는 경우 1차 시약의 pH는 5.5 내지 6.5이고, 2차 이상의 시약의 pH는 7.5 내지 9.5 일 수 있다.
상기 제1 조건에서 온도는 3℃ 내지 30℃이거나, 또는 4℃ 내지 30℃, 또는 5℃ 내지 30℃, 또는 10℃ 내지 30℃, 또는 15℃ 내지 30℃, 또는 20℃ 내지 30℃, 또는 상온에서 수행할 수 있다.
상기 제1 조건에서 시간은 5초 내지 24시간일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 다양하게 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 제1 시약을 pH 6 또는 8.5의 0~10 mM NaCl 용액을 사용하거나, 다른 실시예에서 제1 시약을 pH 6.0, 8.5, 13로 하여 순차로 사용할 수 있다.
제1 시약의 pH가 점진적으로 변할 경우, 미소소포체와 함께 응집된 음이온성 단백질의 등전점 특성을 변화시켜 단백질 등과 같은 불순물을 상기 흡착구체 복합체로부터 분리, 이탈시켜 세척할 수 있다. 이때, 미세소포체는 대부분의 단백질보다 강한 음전하를 띠고 있어 제1 시약이 산성인 경우라도(예컨대, pH 4.0) 상기 흡착구체 복합체에서 분리되지 않고 유지된다.
상기 제1 시약은 불순물을 효과적으로 세척할 수 있는 적절한 염을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 염은 CH3COO-, SO4 2-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 적어도 하나 이상을 포함하되, 50 mM 미만으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 제1 시약은 Tris-Cl(pH 8), 인산염 또는 이들의 조합을 10 내지 500 mM로 더 포함할 수 있고, 이미다졸을 10 내지 100mM로 더 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 음이온 교환 수지에서 미세소포체 이외의 단백질 등과 같은 불순물을 효과적으로 상기 흡착구체 복합체에서 분리할 수 있는 추가 성분을 제한 없이 사용할 수 있다.
(e) 단계는 세척된 흡착구체 복합체를 제2 시약을 이용하여 제2 조건으로 미세소포체를 용리(elution)할 수 있다.
상기 제2 시약은 카오트로픽 물질(chaotropic salt), 프로테아제(protease), CH3COO-, SO4 2-, Cl-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하되, 0.2 M 내지 3 M의 농도범위로 구비되고, 상기 제2 조건은 1분 내지 60분의 시간 동안 500rpm 내지 2000rpm으로 혼합하면서 1회 이상 수행될 수 있다.
상기 (e) 단계에서는 상기 흡착구체 복합체에 포함될 수 있는 단백질 등과 같은 불순물이 제거된 상태에서, 상기 흡착구체와 미세소포체를 분리할 수 있다. 상기 제2 시약은 상기 흡착구체 복합체에서 미세소포체와 상기 흡착구체 사이의 전기적 결합력을 해제시킬 수 있으며, 이에 따라 미세소포체를 상기 흡착구체에서 분리할 수 있다.
종래, 미세소포체를 분리하기 위해서 원심분리와 같은 고가의 커다란 부피를 자치하는 장치를 이용하여 수행하였으며, 장시간 소요되어도 높은 순도로 미세소포체를 분리하는 데 어려움을 겪었다.
반면, 본 실시예에서는 상기 흡착구체를 이용하고, 적절하게 제어된 제1 및 제2 시약을 이용함으로써 상기 흡착구체와 상기 미세소포체를 흡착구체로 복합체의 형태로 제조하여 생물학적 샘플로부터 분리하고, 추후 상기 흡착구체 복합체에서 미세소포체만을 높은 순도로 효과적으로 분리할 수 있다. 또한, 원신분리와 같은 대형 장치를 필요로하지 않고, 외부에서도 비교적 단순하게 수행할 수 있어, 공간 및 시간의 제약이 없이 다양한 용도의 진단키트로 사용이 가능하다.
상기 제2 시약은 상기 제1 시약과 동일한 물질로 이루어질 수 있으며, 이때 pH 또는 농도 등을 상기 제1 시약과 다르게 구비될 수 있다.
구체적으로, 상기 제1 시약은 카오트로픽 물질 또는 프로테아제 (protease)를 포함하고, 상기 제2 시약은 카오트로픽 물질 또는 프로테아제를 포함하되, 상기 제2 시약 중 포함되는 카오트로픽 물질 및 프로테아제는 상기 제1 시약보다 높은 농도로 포함될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제1 시약이 카오트로픽 물질인 경우, 상기 제2 시약은 카오트로픽 물질일 수 있다. 상기 제1 및 제2 시약을 동일한 카오트로픽 물질을 이용하는 경우, 상기 제1 시약의 농도는 상기 제2 시약의 농도보다 낮게 구비될 수 있다. 예컨대, 상기 제1 시약은 0.1 내지 4.5 M, 또는 0.5 내지 4 M, 또는 1 내지 3 M의 범위일 수 있으며, 상기 제2 시약은 4.5 M 초과 내지 15M, 또는 4.5 M 초과 내지 10M, 또는 4.5 M 초과 내지 8M, 또는 4.5 M 초과 내지 6M일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 시약은 1.5M 내지 3M이고, 상기 제2 시약은 4M 내지 7M일 수 있다.
상기 제1 및 제2 시약이 카오트로픽 물질로 동일한 경우, 상기 제2 시약은 구아니디니움 이온을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 제2 시약은 상기 제1 시약보다 높은 농도로 상기 카오트로픽 물질을 포함할 수 있다.
별법으로, 상기 제2 시약은 카오트로픽 물질 이외의 물질을 포함할 수 있다. 상기 제2 시약은 미세소포체의 등전점을 변화시킬 수 있는 pH인 경우에도, 상기 미세소포체가 상기 흡착구체에서 잘 분리되지 않을 수 있고, 이때 별도의 염을 더 추가함으로써 상기 미세소포체의 분리능을 향상시킬 수 있다.
상기 별도의 염은 CH3COO-, SO4 2- , Cl-, HCO-, SiO-, OH- 또는 이들의 조합을 100 mM 내지 5 M의 농도로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 제2 시약은 NaCl, CaCl2 또는 이들의 조합을 250 mM 내지 5 M의 농도로 포함할 수 있다. 또한, 상기 제2 시약은 Tris-Cl(pH 8), 인산염 또는 이들의 조합을 10 내지 500 mM로 더 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 음이온 교환 수지에서 미세 소포체를 효과적으로 용리할 수 있는 추가 성분을 제한 없이 사용할 수 있다.
또한, 상기 제2 시약은 NH4 +, Na+, K+와 같은 1가 양이온, Ca2+, Mg2+와 같은 2가 양이온, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 제2 시약 내 염은 (NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl, KCl, CH3COONH4, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 염은 상기 제1 시약에도 동일하게 포함될 수 있는데, 이때에는 0.1 M 이상, 0.25 M 이상, 0.5 M 이상, 또는 0.75 M 이상 포함될 수 있고, 5 M 이하, 또는 4 M 이하로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 제2 시약은 1 M, 2 M, 3 M 또는 4 M의 NaCl을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 제2 시약은 pH는 4 내지 9일 수 있다.
상기 제2 시약은 다양한 음이온이 상기 흡착구체에서 미세소포체와 자리바꿈하는 이온교환을 유도한다.
상기 (a) 단계에서 (e) 단계까지의 과정은 단시간 이내에 고수율 및 고순도로 완결된다. 일 실시예에서, (a) 단계에서 (e) 단계까지의 과정은 60 분 미만, 바람직하게는 45 분 미만, 보다 바람직하게는 30 분 미만, 가장 바람직하게는 20 분 미만으로 완결될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 미세소포체 분리방법은 (d) 단계에서 상기 제1 시약으로 상기 흡착구체 복합체를 세척한 후 상기 흡착구체 복합체를 분리하는 1차보조분리와, (e) 단계에서 상기 제2 시약으로 상기 미세소포체를 용리한 후 상기 흡착구체를 분리하는 2차보조분리를 더 포함할 수 있다.
상기 지지부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 및 폴리스티렌 중 어느 하나 이상으로 이루어진 단면이 원형인 비드형태로 구비되는 경우, 상기 1차보조분리 또는 2차보조분리는 50 nm 내지 1,000 nm 크기의 공극을 갖는 포획필터; 및 50 nm 미만 크기의 공극을 갖는 다공성 음이온 입자 중 어느 하나 이상으로 수행될 수 있다.
상기 (d) 단계에서 상기 제1 시약으로 상기 미세소포체 이외의 단백질 등과 같은 불순물을 세척하여 분리할 수 있다. 이때, 불순물이 제거된 흡착구체 복합체는 포획필터 등을 이용하여 1차보조분리가 수행될 수 있다. 상기 1차보조분리를 포획필터를 이용하는 경우, 상기 포획필터로 음전하를 갖는 버퍼용액을 통과시켜 상기 흡착구체 복합체를 상기 포획필터에서 이탈시킬 수 있다. 상기 버퍼용액은 Ca2+, Mg2+, Na+, K+, NH4+ 이온 중 적어도 하나, 또는 2 이상의 조합을 포함하는 용액이 적용되는 것을 예로 한다.
상기 2차보조분리는 상기 미세소포체와 흡착구체를 분리한 후, 추가로 잔여 불순물을 제거하기 위하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 2차보조분리는 상기 미세소포체의 순도를 보다 향상시키기 위하여 수행될 수 있으며, (d) 단계에서 제거되지 못한 불순물, 예컨대 피브리노겐(생물학적 샘플이 예컨대 혈장인 경우) 등을 제거할 수 있다.
상기 2차보조분리는 다공성 음이온 입자를 포함할 수 있으며, 상기 다공성 음이온 입자를 이용할 수 있다. 상기 다공성 음이온 입자 공극 크기보다 작은 단백질 불순물(예컨대, 피브리노겐 등)을 흡착시켜 제거할 수 있다. 일 실시예에서 상기 다공성 음이온 입자 공극의 크기는 50 nm 미만일 수 있다.
상기 지지부는 자성입자인 경우, 상기 1차보조분리 또는 2차보조분리는 전자석에 전류를 흘려 발생시키거나, 또는 자석을 이용하는 자성분리인 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 미세소포체 분리방법은 상기 생물학적 샘플은 상기 흡착구체가 첨가되기 전 전처리되는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 생물학적 샘플의 전처리는 상기 생물학적 샘플 중 평균직경이 0.8μm 초과인 물질이 분리되도록 상기 생물학적 샘플을 여과시키는 것을 포함한다.
상기 생물학적 샘플 중에 상기 흡착구체를 첨가하기 전, 상기 생물학적 샘플을 여과시켜 평균직경이 0.8μm 초과인 물질을 미리 제거한 경우, 상기 흡착구체가 상기 생믈학적 샘플 중에서 미세소포체의 포획을 보다 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 생물학적 샘플로부터 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리용 시약 키트를 포함할 수 있다.
생물학적 샘플 중에 포함된 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리용 시약 키트로, 상기 미세소포체와 결합성을 갖는 하나 이상의 흡착구체; SO4 2-, Cl-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하는 제1 시약; 및 SO4 2-, Cl-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하되, 상기 제1 시약보다 높은 농도로 구비되는 제2 시약;을 포함하고, 상기 흡착구체는 지지부와 상기 지지부의 표면에 구비되는 하나 이상의 다가 양이온을 포함할 수 있다.
상기 시약 키트는 상기 흡착구체 또는 상기 미세소포체를 포획한 흡착구체를 분리하는 분리부재를 더 포함하고, 상기 분리부재는 포획필터, 자성분리, 원심분리, 용해도분리, 및 입자크기에 따른 분리 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 지지부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 및 폴리스티렌 중 어느 하나 이상으로 이루어진 단면이 원형인 비드형태로 구비될 수 있다. 이때, 상기 지지부의 표면에 구비되는 상기 다가 양이온은 폴리 라이신, 폴리아르기닌, 폴리 히스티딘, 프로타민, 양이온성 덱스트란, 양이온성 덴드리머, 양이온성 폴리사카라이드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민, 폴리쿼터늄, 폴리-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(PDMAEMA), 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(PDMAMS), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트(pDEAEA), 폴리 다이메틸아미노에틸아크릴레이트(pDMAEA), 및 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA) 중 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 분리부재는 50 nm 내지 1,000 nm 크기의 공극을 갖는 포획필터를 포함할 수 있다.
별법으로, 상기 지지부는 자성입자를 포함할 수 있는데, 상기 지지부의 표면에 다가 양이온이 코팅되어 흡착구체를 형성할 수 있다. 상기 다가 양이온은 폴리 라이신, 폴리아르기닌, 폴리 히스티딘, 프로타민, 양이온성 덱스트란, 양이온성 덴드리머, 양이온성 폴리사카라이드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민, 폴리쿼터늄, 폴리-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(PDMAEMA), 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(PDMAMS), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트(pDEAEA), 폴리 다이메틸아미노에틸아크릴레이트(pDMAEA), 및 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 이때, 상기 분리부재는 전자석에 전류를 흘려 발생시키는 장치 또는 자석을 이용하는 자성분리를 포함할 수 있다.
또한, 상기 미세소포체 분리용 시약 키트는 생물학적 샘플 중 포함되는 미세소포체 이외의 단백질 등과 같은 불순물을 흡착할 수 있는 다공성 입자를 더 포함할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명의 권리 범위가 하기 실시예들에 의하여 제한되는 것은 아니다.
1. 다가 양이온이 결합된 고분자 지지부를 흡착구체로 이용한 분리실험
(1) 실시예 1, 비교예 1의 제조
생물학적 샘플(실시예 1, 비교예 1)
본 실험은 고려대학교 안암 병원의 기관생명윤리연구위원회 승인(IRB 프로젝트 No.: 2016AN0090) 및 혈액 샘플에 대한 모든 지원자의 동의서를 받은 후 진행하였다. 각 지원자의 주정중피정맥(median cubital vein)으로부터 혈액 샘플을 취하여 3 mL K2-EDTA 진공 채혈기(vacutainer, Becton Dickinson, USA)에 수집하였다. 전혈을 1,900 g에서 10분 동안 원심분리한 후 12,000g에서 15분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 그 다음, 혈장을 800nm 공극 크기의 메쉬(800nm filter, Sartorius, Cat no : 91133103)로 여과하여 크기가 큰 잔해물을 제거하였다. 각 혈장 샘플을 1 mL씩 분리하여 생물학적 샘플을 준비하였다.
실시예 1(PLL-비드를 이용한 세포외 소포체 분리, ExoCAS-1)
도 4는 실시예 1에 따른 미세소포체 분리방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
준비된 혈장 샘플(생물학적 샘플)에 흡착구체를 첨가하여, 전하간 상호작용에 의한 세포외 소포체 및 폴리머간 응집을 유발하여 비드와 미세소포체가 결합된 복합체를 형성하고 포획필터를 이용하여 분리하였다.
흡착구체로 사용된 양이온성 폴리머가 결합된 비드를 제조하기 위해, 양이온성 폴리머로 분자량 150-300 kDa의 폴리-L-라이신(PLL, Sigma-Aldrich, USA)을 사용하였다. 40 mg/mL 농도의 PLL 스톡 용액을 제조한 후, 카복실기로 기능화된 비드(1μm, Carboxyl polystyrene Beads, EPRUI Nanoparticles & Microspheres Co, Shanghai, China)를 PLL 스톡 용액 중에 추가하고 6시간 동안 반응시켰다. 이후 원심분리하여 비드를 포함하는 고체를 분리하고, 인산완충식염수(PBS)로 세척하여 양이온성 폴리머가 결합된 비드를 제조하였다. 같은 방식으로 5mg/mL, 20mg/mL, 40mg/mL, 100mg/mL의 PLL 스톡 용액을 각각 사용하고, 반응 시간을 3시간, 6시간, 12시간으로 하여 양이온성 폴리머가 결합된 비드(PLL-비드)를 제조하여 세포외 소포체가 결합 성능을 비교하였다.
PLL-비드에 세포외 소포체가 결합되면 체적이 증가하는 특성을 이용하여 결합성능을 분석한 결과, 100mg/mL의 PLL 스톡 용액에서 최대 성능이 나왔으나 40mg/mL의 PLL 스톡 용액과 거의 대등한 결합성능을 보임을 확인할 수 있었다. 또한, 반응시간은 6시간에 최대 성능을 보인 후 12시간에서는 오히려 결함성능이 약간 감소하는 것을 나타났다. 따라서, 경제적인 측면과 효율적 측면에서, 40mg/mL 농도로 6 시간 반응의 최적 조건임을 확인하였다. 제조된 양이온성 폴리머가 결합된 비드를 각 혈장 샘플 내 최종 비드 농도(5 mg/mL)가 되도록 조절하였다.
양이온성 비드가 포함된 혈장을 4℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후, 혼합물을 220nm의 공극 크기를 갖는 시린지 필터(220nm filter, Millex, R8EA69979)를 사용하여 여과하였다. 여과 이후 커다란 비드 입자가 필터에 남겨졌다.
양이온성 폴리머가 결합된 비드에 결합된 혈장 단백질을 포함한 불순물을 세척하기 위하여 제1 시약으로 pH가 4.0, 8.5, 13(각 800μL 씩)을 순차적으로 사용하여 필터 위에 놓인 비드 표면에 흐르게 하였다. 상기 제1 시약은 아세트산(Acetic acid, Sigma Aldrich, Cat no : 695092-100mL)와, 수산화나트륨(Sodium hydroxide, Sigma Aldrich, Cat no : S8045-500G)을 이용하여 pH를 조절하였다. 상기 제1 시약은 낮은 농도(10~50mM)의 NaCl이나, 10~50 mM CaCl2 용액(pH 7.4), 10~500 mM Tris-cl(pH 8), 10-500mM phosphate, 10-100mM의 imidazole을 추가하여 단백질의 세척성능을 증가시킬 수 있다.
양이온성 폴리머가 결합된 비드에 결합된 세포외 소포체를 수득하기 위해, NaCl 수용액 3M(Sodium chloride, Sigma Aldrich, Cat no : S7653-250G) 200μL를 제2 시약으로 사용하여 메쉬 위에 놓인 비드를 흐르게 하였다. 수득된 세포외 소포체를 확인하기 위해 NTA를 실시하여 세포외 소포체의 크기와 입자 농도를 측정하였고, BCA 검사를 통해 제2 시약에 포함된 단백질의 농도를 분석하였다. 또한, SEM 이미지(Quanta 250 FEG; FEI, USA)를 촬영하고 분석하였다.
비교예 1(UC, 초원심분리에 의한 세포외 소포체 분리)
초원심분리(Ultracentrifugation; UC) 방법은 세포외 소포체의 분리를 위해 전통적으로 널리 사용되어온 표준 방법이다. UC의 분리 프로토콜은 간단하지만 시간이 소모되며(평균 6시간 이상), 노동집약적이라는 단점이 있다. 혈장 및 인산완충식염수(PBS)를 1:1의 부피비로 혼합하고, 혼합물을 원심분리하여 잔여 세포 성분들을 제거하였다(4℃, 12,000g, 30min). 상청액을 옮기고 원심분리를 동일 조건 하에서 1회 반복하였다. 상청액을 200μm 공극 크기를 갖는 시린지 필터(Merck Millipore, USA)를 이용하여 여과한 후, 120,000g 및 4℃에서 2시간 동안 초원심분리하였다(CP100WX; Hitachi, Japan). 상청액을 흡입해낸 후, 바닥의 펠렛을 120,000g 및 4℃에서 1 시간 동안 PBS로 조심스럽게 세정한 다음, 50μL의 인산완충식염수(PBS)로 재현탁했다.
(2) 실시예 1, 비교예 1의 실험
실험예 1(흡착구체 복합체 형성)
양이온성 폴리머가 결합된 비드(PLL-bead)인 PLL-비드와, 양이온성 폴리머가 결합되지 않은 비드인 베어비드(Bare-bead)를 각각 혈장 중에 동일한 양으로 첨가한 후, 4℃의 온도에서 다양한 시간으로 인큐베이션을 시키고, 펠렛 형태로 비드와 세포외 소포체의 결합(흡착구체 복합체)을 확인하였다.
실험예 2(제1 시약 평가)
제1 시약으로 카오트로픽 물질인 구아니디니움 티오시아네이트(GuTc 2M)과, 아세트산(Acetic acid, Sigma Aldrich, Cat no : 695092-100mL)과, 수산화나트륨(Sodium hydroxide, Sigma Aldrich, Cat no : S8045-500G)을 이용하여 pH를 4.0, 8.5(800 μL)을 각각 조절하여 이용하였다. 또한, NaCl(Sodium chloride, Sigma Aldrich, Cat no : S7653-250G)을 염으로 이용하였다. 제1 시약을 이용하여 양이온성 폴리머가 결합된 비드를 각각 세척한 후, 결과로 얻어진 제1 시약 중에 포함된 단백질과 입자의 농도를 확인하였다. 여기서, pH 4는 아세트산과 수산화나트륨을 각각 29mM, 6.1mM으로 혼합하였고, pH 6은 아세트산과 수산화나트륨을 각각 29mM, 29mM로, pH 8.5는 아세트산과 수산화나트륨을 각각 29mM, 32.3mM으로, pH 11은 아세트산과 수산화나트륨을 각각 29mM, 34mM로, pH 13은 아세트산과 수산화나트륨을 각각 29mM, 35mM로 제조하였다.
실험예 3(제2 시약 평가)
제1 시약으로는 pH가 4에 염을 포함하지 않는 것으로 동일하게 이용하였고, 제2 시약으로 pH 7로 하여 NaCl 염의 농도를 1M, 2M, 3M, 4M 및 5M로 다르게 하여 제2 시약 중의 PLL-비드의 농도를 확인하였다.
실험예 4(제1 시약에 따른 제2 시약 중 단백질 및 순도 평가)
제1 시약으로는 카오트로픽 염을 포함하지 않으면서 pH가 4 또는 8.5, 13인 용액으로 이용하여 불순물인 단백질을 PLL-비드에서 분리하고, 이에서 제2 시약으로는 NaCl 3M, pH 7를 이용한 경우, 제2 시약 내에서의 단백질 및 미세소포체를 평가하였다. 여기서, 순도(purity ratio)는 단백질 농도(㎍/㎖)에 대한 세포외 소포체의 농도(particles/㎖)를 의미한다.
실험예 5(분리방법 평가)
웨스턴 블롯팅으로 실시예 1, 비교예 1 내지 비교예 3에 의하여 분리된 세포외 소포체의 단백질 마커를 측정하였다. 엑소좀은 Alix(ALG-2-interacting protein X), TSG101(tumor susceptibility gene 101 protein), HSP70(heat shock protein), tetraspanins CD63, CD81, 및 CD9와 같은 단백질 마커를 함유하는 것이 알려져 있다. 이에, 4 가지 기준 단백질 마커(ALIX, TSG101: inner protein markers; CD9, and CD81: surface protein markers)를 사용하여 분리된 세포외 소포체의 특성을 분석하였다(도 12의 a).
웨스턴 블롯팅 과정을 간략히 설명하면, 먼저 단백질 샘플을 SDS-PAGE Mini-PROTEAN®TGX™ Precast Gel(456-1035; Bio-rad, USA)를 이용한 겔 전기영동으로 분리하고, 토끼 폴리클론 항체(1:2,000 희석) 항-CD9(ab92726), 항-CD81(ab109201), 항-ALIX(ab186429), 항-TSG101(ab125011), 및 염소 항-토끼 IgG H&L(HRP) (ab205718) (Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 면역블롯팅하였다. 단백질 밴드를 강화 화학발광(enhanced chemiluminescence; ECL) 용액 및 ChemiDoc™ XRS + System(Bio-Rad, USA)을 이용하여 단백질 밴드를 분석하였다. 상기 마커에 대한 웨스턴 블롯팅 결과, 단백질 밴드의 세기로부터 단백질 마커의 전체 수준을 측정할 수 있다.
RNA 추출 및 정량 과정을 간략히 설명하면, seraMir Exosome RNA 정제 키트(RA806A-1, SBI, USA)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 모든 분리 과정은 제조자 프로토콜에 의거하여 수행하였다. EV miRNA 마커를 정량하기 위해, TaqMan MicroRNA RT 키트(4366596, Life Technologies, USA) 및 TaqMan Micro RNA 어세이(4427975, Life Technologies, USA)를 사용하여 RNA 용출물에 대한 역전사를 수행하였다. 이 과정에 TaqMan Universal Master Mix Ⅱ, no UNG (4440040, Life Technologies, USA)와 miRNA assays hsa-let-7a-5p, ID 000377, 및 hsa-miR-142-3p, ID 000464를 사용하였다. RNA 용출물에 대해 Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, USA) 상에서 Agilent Eukaryote Total RNA Pico chip를 이용하여 추가 실험을 수행하였다.
(3) 실시예 1, 비교예 1의 평가
하기에서는 실시예 1, 비교예 1에 대한 평가 결과를 나타내었다.
도 5는 실시예 1에 따른 PLL-비드와, 양이온성 폴리머가 결합되지 않은 비드인 베어비드(Bare-bead)를 이용하여 세포외 소포체의 분리능을 확인한 결과이다.
도 5를 참조하면, 혈장 샘플 1㎖에 대해서 각각 베어비드와 PLL-비드에 대해서 4℃에서 인큐베이션 효과를 확인하였다. 베어비드는 2시간 동안 인큐베이션을 시키는 동안 튜브의 하부측에 뭉쳐있고, 인큐베이션 시간을 최대 2시간까지 증가시켜도 베어비드의 부피가 변화하지 않음을 확인할 수 있었다. 반면, PLL-비드는 인큐베이션 시간을 10분, 30분 및 1시간까지 증가시킬수록 점점 펠렛형태의 부피가 증가함을 확인할 수 있었다. 즉, 베어비드는 비드 그 자체로만 존재하고 세포외 소포체를 포획하지 못하는 반면, PLL-비드는 혈장 중 포함된 세포외 소포체가 결합되고, 인큐베이션 시간이 증가될수록 세포외 소포체가 결합되는 양이 증가함을 확인할 수 있었다.
도 6은 실시예 1의 PLL-비드가 제조되는 모습을 개략적으로 나타낸 도면이고, 도 7은 도 6에 따른 방식으로, PLL 농도를 다르게 하여 제조된 PLL-비드의 형광 이미지(fluorescent image)를 나타내었다. 여기에서, 베어비드는 폴리스틸렌 5 mg을 이용하고, PLL은 분자량이 150-300 Kda Poly-L-Lysine를 이용하였으며, 형광 이미지는 antibody(lgG [Alexa Flour] )를 이용하였다.
도 6을 참조하면, 베어비드는 표면에 -COOH의 작용기를 포함하고, PLL은 말단에 -NH3를 구비하므로, -COOH 및 -NH3는 서로 반응하여 결합될 수 있다. 이때, 촉매로 EDC 또는 NHS를 더 포함시켜, 반응이 보다 효율적으로 수행되도록 할 수 있다.
도 7의 형광 이미지를 확인하면, PLL 스톡 용액의 농도를 5mg/mL, 10mg/mL, 15mg/mL로 증가시킬수록 노말라이즈 강도가 점점 증가함을 확인할 수 있다. 즉, PLL이 베어비드(폴리스틸렌)의 표면에 효과적으로 부착되고, 이는 PLL의 농도에 의존적으로 나타남을 확인할 수 있었다.즉, 본 실시예에 따른 PLL-비드는 생물학적 샘플 중에 포함된 미세소포체와 효과적으로 결합함을 확인할 수 있었다.
도 8은 실시예 1를 이용하여 다양한 제1 시약에 따른 성능을 확인한 결과이다. 도 9은 실시예 1를 이용하여 염을 추가한 제1 시약에 따른 성능을 확인한 결과이다.
도 8 및 도 9에서, 단백질 농도는 BCA 테스트를 이용하였고, 입자 농도는 나노입자 트래킹 분석법(nanoparticle tracking analysis; NTA)에 의하여 확인하였다.
도 8 및 도 9에서, 제1 시약 중에 포함된 단백질의 농도는 양이온성 폴리머가 결합된 비드 중에 일부 포획된 불순물인 단백질을 분리시킨 결과이고, 입자의 농도는 유실되는 양이온성 폴리머가 결합된 비드를 의미한다.
도 8의 a를 참조하면, GuTc과, pH 4, pH 8.5의 제1 시약 모두 탈이온수(DW)보다는 불순물인 단백질의 농도가 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 즉, GuTc과, pH 4, pH 8.5는 PLL-비드에 부착된 불순물인 단백질을 효과적으로 분리시킴을 확인할 수 있었다. 또한, PLL-비드에서 불순물인 단백질을 세척하여 제거하는 능력은 GuTc과, pH 4, pH 8.5이 모두 유사하게 나타남을 확인할 수 있었다.
도 8의 b를 참조하면, pH가 4 또는 8.5는 단백질 세척능력에서 GuTC 대비 85~90% 수준이고, 입자의 농도가 GuTc 대비 pH가 4 또는 8.5이 12.5~20.1 배 우수한 것을 확인할 수 있었다.
도 9를 참조하면, 제1 시료 중에서 PLL-비드의 유실되는 정도는 GuTc < pH 4, pH 8.5(NaCl 염 포함) < pH 4, pH 8.5(NaCl 염 불포함)의 순으로 나타남을 확인할 수 있었다. 또한, pH에 따른 경향성을 나타내는데, pH가 증가할수록 PLL-비드의 유실되는 정도가 증가하나, pH 13에서는 염의 포함여부와 무관한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이는, 염이 NaCl로 염기성으로 작용하기 때문으로, pH 13에서는 이미 강염기이기 때문에 pH가 낮을 때보다 영향이 작기 때문으로 판단된다.
도 10은 실시예 1를 이용하여 다양한 제2 시약에 따른 성능을 확인한 결과이다.
도 10을 참조하면, 제2 시약 중에 포함된 입자 농도는 낮을수록 미세소포체가 상기 제2 시약 내로 유실되지 않고 분리되었음을 의미한다. 여기서, 제2 시약은 pH 7인 경우에 레퍼런스 물질로 사용된 GuTC 2M보다 우수함을 확인할 수 있었고, 이중 1M의 NaCl이 가장 우수함을 확인할 수 있었다.
도 11은 제1 시약의 종류에 따른 제2 시약 중에 포함된 입자, 단백질, 및 순도를 나타낸 그래프이다.
도 11는 각각 모두 동일한 종류의 제2 시약을 이용하되, 상기 제2 시약을 이용하기 전 불순물인 단백질을 세척하기 위하여 제1 시약을 GuTc 2M, pH 4.0, pH 8.5, pH 13, pH gradient로 모두 다르게 하되 동일한 부피로 이용하여 1회 세척한 후, 제2 시약 중에 포함된 입자 농도(제2 시약 중에 포함된 세포외 소포체 농도), 단백질 농도(불순물로 작용한 단백질 농도)를 나타내었다. 여기서, pH gradient는 각각 pH 4.0, pH 8.5, pH 13로 점차 pH를 증가시키면서 세척한 것이다.
도 11을 참조하면, pH 4.0, pH 8.5, pH 13 및 pH gradient는 모두 레퍼런스인 GuTc 2M보다 더 우수한 성능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
아세트산과 수산화나트륨을 이용하여 pH를 각각 다르게 한 경우, GuTc 2M와 비교했을 때, 단백질 검출량이 더 적게 나타남을 확인할 수 있었다. 특히, 서로 다른 서로 다른 pH를 갖는 복수개의 제1 시료를 이용한 경우(pH gradient)는 가장 적은 단백질 검출량을 나타내었다.
동일한 제2 시약을 사용하였음에도 제1 시약의 종류에 따른 결과가 다르게 나타남을 확인할 수 있다. 즉, 제2 시약을 동일하게 하여도, 이전 단계에서 단백질과 같은 불순물이 효과적으로 제거되어야 함을 확인할 수 있었다.
제2 시약 중에 포함된 세포외 소포체의 양도 서로 다른 pH 농도를 갖는 복수개의 제1 시료를 이용하여, pH를 순차적으로 증가시키면서 제1 시약으로 이용한 경우 가장 높은 순도를 나타냄을 확인할 수 있었다. 즉, 입자수를 단백질 농도로 나눈 값으로 정의된 순도(purity ratio)는 제1 시약의 pH가 4 또는 8.5, 13인 용액으로 순차적으로 이용한 경우인 pH gradient에서 가장 높은 값을 나타냄을 확인할 수 있었다.
도 12는 종래의 원심분리법과 본 발명의 실시예 1에 따른 분리방법을 평가한 결과이다.
이와 같은 방법에 의하여, 원심분리법(비교예 1; UC), PLL-비드(실시예 1; PLL-비드)에 따라 추출된 미세소포체 내부의 총 RNA를 추출하여, 세포외 소포체 마커인 hsa-let-7a-5p와 hsa-miR-142-3p 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, PLL-비드(실시예 1) > 원심분리법(비교예 1)의 순서로 RNA 양이 많이 추출된 것으로 확인하였다. 흡착구체와 제1 및 제2 시약을 사용한 실시예 1이 가장 우수한 RNA 추출량을 보인 것이다(하기, 도 12의 b 참조).
2. 다가 양이온이 결합된 자성 지지부를 흡착구체로 이용한 분리실험
(1) 실시예 2, 실시예 3, 비교예 2 내지 비교예 4의 제조
생물학적 샘플(실시예 2, 실시예 3, 비교예 2 내지 비교예 4)
하기 실시예 및 비교예에서 사용된 혈장 샘플은 Zen-Bio사(Research Triangle, NC, USA)에서 구입한 것을 이용하였다. 혈장 샘플은 메쉬 필터(800nm 기공 크기 메쉬, Sartorius Minisart ™ NML 사용, 카탈로그 번호 16592)를 이용하여 큰 크기의 시편을 제거하여 사용하였으며, 각 샘플 당 1 mL의 부피로 이용하였다.
실시예 2(PLL-자성비드를 이용한 세포외 소포체 분리, ExoCAS-2)
도 13는 실시예 2에 따른 미세소포체 분리방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
흡착구체를 제조한 후, 준비된 혈장 샘플(생물학적 샘플)에 흡착구체를 첨가하여, 전하간 상호작용에 의한 세포외 소포체 및 폴리머간 응집을 유발하여 흡착구체와 미세소포체가 결합된 복합체를 형성하고, 이를 자성을 이용하여 분리하였다.
폴리-L-라이신(PLL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 폴리머를 40㎎/㎖과 구형의 자성비드 5mg(직경 1㎛인 magnetic beads)을 반응시켜 제조된 흡착구체인 PLL-자성비드를 제조하고, 혈장 샘플 중에 첨가하였다. PLL은 다중 양이온성 특성을 갖고, 이에 따라 PLL-자성비드는 음전하를 갖는 세포외 소포체와 정전기적 인력에 의하여 결합된다. 이때, 상기 PLL-비드가 첨가된 생물학적 샘플은 90rpm의 로킹 플랫폼 믹서에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 과정에서 PLL-자성비드는 생물학적 샘플 내에서 유동하는 상태로 존재하고 낮은 속도로 혼합되어 PLL-자성비드와 세포외 소포체(엑소좀)과의 결합이 우수하게 나타난다. 수백개의 나노크기의 세포외 소포체는 PLL-자성비드의 표면에 포착되었다. 이어서, 5분 동안 유지시킨 후, 자석을 PLL-비드가 첨가된 생물학적 샘플이 담겨있는 튜브 근처로 가까이하여, 세포외 소포체가 포획된 PLL-자성비드를 분리하였다. 이때, 분리시간은 2분 정도로 매우 짧은 시간이 소요되었으며, 이후 피펫을 이용하여 상청액을 분리하였다.
세포외 소포체가 포획된 PLL-자성비드를 pH 6인 제1 시약(2 mL)를 사용하여 조심스럽게 세척하여 비표적 단백질을 제거하였고, 세포외 소포체가 포획된 PLL-자성비드를 제1 시약 중에 재현탁시켰다. 자석을 사용하여 세포외 소포체가 포획된 PLL-자성비드를 응집시켜 분리하였고, 이 과정에서 불순물로 작용하는 단백질은 세척되어 제거되었다. 세포외 소포체가 포획된 PLL-자성비드를 분리하고, 분리된 세포외 소포체가 포획된 PLL-자성비드를 NaCl 1M, pH 7.0, 200μL의 염을 포함한 제2 시약 중에 첨가한 후, 1000rpm에서 5분 동안 볼텍싱하였다. 볼텍싱을 하는 과정에서, PLL-자성비드와 세포외 소포체는 용리되었고, 자석을 튜브 근처에 2 분 동안 유지시켜, PLL-자성비드를 수집하여 분리하였다. 순수한 세포외 소포체를 포함하는 상청액을 피펫으로 수집했습니다. 이와 같은 전체 과정은 40분 만에 완료되었고, 나노 사이트(NTA)에 의한 분자 분석 및 물리적 특성 분석을 수행하였다.
실시예 3(프로타민-자성비드를 이용한 세포외 소포체 분리)
폴리-L-라이신(PLL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 폴리머를 40㎎/㎖를 대신, 프로타민 염(protamine salt, #P4505, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 80㎍를 이용하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 흡착구체인 프로타민-자성비드를 제조하고, 준비된 혈장 샘플(생물학적 샘플)에 흡착구체를 첨가하여, 전하간 상호작용에 의한 세포외 소포체 및 폴리머간 응집을 유발하여 흡착구체와 미세소포체가 결합된 복합체를 형성하고, 자성을 이용하여 분리하였다.
비교예 2(UC, 초원심분리를 이용한 세포외 소포체 분리)
초원심분리(Ultracentrifugation, UC)는 세포외 소포체를 분리하는 데 사용되는 가장 표준적인 방법(gold standard method)이나, 대략 6시간 이상으로 장시간이 소요되고, 노동력이 많이 필요한 방법이다. 초원심분리를 이용하기 위하여 혈장 샘플을 인산염완충식염수(PBS)와 부피비로 1 : 1의 비율로 혼합하고 혼합물을 4℃, 12,000g에서 30분 동안 원심분리하여 잔류 세포 성분을 제거하였다. 상청액을 분리하고, 동일한 조건으로 원심분리를 반복수행하였다. 분리된 상청액은 220㎛ 기공의 실린지 필터(Merck Millipore, Burlington, MA, USA)를 이용하여 여과하였으며, 여과된 상층액은 고속원심분리기(CP100WX; Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 4℃, 12,000g에서 2시간 동안 원심분리를 수행하였다. 상층액을 흡수시켜 분리한 후, 잔류한 펠렛을 재현탁시키고 120,000g 및 4℃에서 1시간 동안 인산염완충식염수(PBS)로 세척한 후, 50μL의 PBS에서 다시 현탁시켰다.
비교예 3(EQ, 시판제품을 이용한 세포외 소포체 분리 1)
세포외 소포체를 분리하기 위하여 시판제품인 ExoQuick™ 엑소좀 침전 용액(EXOQ5A-1; System Biosciences, Palo Alto, CA, USA)을 사용하였다. 실험절차는 함께 포함된 매뉴얼을 이용하였다. ExoQuick™를 이용하기 위하여 혈장 샘플을 PEG계 용액인 ExoQuick 용액과 혼합한 후, 혼합물을 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 인큐베이팅이 완료된 혼합물을 1500g에서 30분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거하여 잔류한 펠렛을 튜브에 두었다. 1500g에서 5분 동안 2차 원심분리를 수행한 후, 잔류한 ExoQuick 용액을 모두 제거하고, 얻어진 펠렛을 200μL의 PBS에서 다시 현탁시켰다.
비교예 4(exoEasy, 시판제품을 이용한 세포외 소포체 분리 2)
매뉴얼에 기재된 바와 같이, exoEasyTM Maxi Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 혈장 엑소좀을 추출하였다. 직경이 0.8㎛ 초과인 입자를 제거하기 위하여 여과를 수행한 후, 동일한 부피의 XBP 버퍼용액을 첨가하여 혼합하고, 현탁액을 exoEasy 스핀컬럼으로 옮겨 500g에서 1분 동안 원심분리를 수행하였다. 통과액 (flow-through)을 제거한 후, 10mL의 XWP 버퍼용액을 첨가한 후 현탁액을 5000g에서 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 통과액을 제거하고, 스핀컬럼을 새로운 튜브로 옮긴 후, 100μL XE 버퍼용액을 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 혼합물은 5000g에서 5분 동안 원심분리한 후, 통과액을 엑소좀 재현탁용액 B(exo-B)를 이용하여 수집하였다.
(2) 실시예 2, 실시예 3, 비교예 2 내지 비교예 4의 실험
실험예 6(PLL-자성비드 제조 및 인큐베이팅 조건)
평균직경이 1㎛인 구형의 자성비드 5mg에 대해서 PLL의 농도를 40㎎/㎖, 200㎎/㎖, 600㎎/㎖로 다르게 하여 PLL-자성비드를 제조하고, 세포외 소포체 분리능을 평가하였다. 이중 가장 성능이 좋은 평균직경이 1㎛인 구형의 자성비드 5mg에 대해서 40㎎/㎖의 PLL을 반응시켜 제조된 PLL-자성비드를 이용하여, 혈장 샘플 내에 첨가하고, 인큐베이션 시간, 인큐베이션 온도에 따른 성능을 각각 평가하였다.
실험예 7(제타전위 평가)
제타전위 분석기(Zetasizer Pro; Malvern Panalytical, Malvern, UK)를 사용하여 실시예 2(PLL-자성비드), 비교예 2(UC)를 이용하여 분리된 세포외 소포체의 제타전위와, 실시예 2의 마이크로 크기의 PLL-자성비 (흡착구체)의 제타전위를 측정하였다. 1mL 혈장에서 만들어진 펠렛-클러스터형 PLL 비드 (5mg/mL)를 10μL NaCl 용액(1M)에서 재현탁시켰다(탈이온수 (DW)는 펠렛-클러스터형 PLL 비드를 재현탁하기 어려움). 여기에, 990μL의 탈이온수를 첨가하였다.
실험예 8(Cryo-TEM (Cryo-transmission electron microscopy) 평가)
실시예 2(PLL-자성비드), 비교예 2(UC)에 의하여 분리된 세포외 소포체를 20nm 메쉬 그리드로 옮긴 후, VitrobotTM(FEI, Hillsboro, OR, USA)을 사용하여 동결 배양(-196℃, 2시간)을 수행하였다. 샘플을 준비한 후 투과전자현미경(TEM, Tecnai G2-F20, FEI, Hillsboro, OR, USA)을 사용하여 세포외 소포체를 확인하였다.
실험예 9(SEM (Scanning Electron Microscopy) 평가)
실시예 2(PLL-자성비드) 및 비교예 2(UC)에 의하여 분리된 세포외 소포체를 개스킷에 장착된 AAO 멤브레인(anodic aluminum oxide membrane)을 사용하여 여과하였다. 각각 여과한 후 AAO 멤브레인은 글루타르알데히드 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 이 후, AAO 멤브레인을 25%, 50%, 75%, 90%, 100% 에탄올로 순차적으로 헹구고 건조 오븐에서 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. AAO 멤브레인을 Pt로 코팅 한 후, SEM(Quanta 250 FEG; FEI, Hillsboro, OR, USA)을 사용하여 AAO 멤브레인상의 세포외 소포체와 클러스터 물질을 확인하였다.
실험예 10(NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) 평가)
NTA 분석을 위하여 실시예 2(PLL-자성비드), 실시예 3(프로타민-자성비드), 비교예 2(UC), 비교예 3(ExoQuick), 비교예 4(exoEasy)에 의하여 얻어진 각각의 1mL의 세포외 소포체 용액을 분리하였다. PBS로 희석된 샘플을 NanoSight LM10 시스템(Malvern Panalytical, Worcestershire, UK)의 조립 샘플 챔버 내에 구비시키고, 레퍼런스로 핑거프린트 영역(fingerprint area)을 이용하여 마이크로입자를 포커싱시켰다. 세포외 소포체 이미지를 지록하고, 각 평균 입자 크기(mean size)와 농도를 측정하였다.
실험예 11(웨스턴 블롯 분석키트(Western Blot Analysis) 평가)
용리 버퍼용액 200 μL 중에 현탁된 엑소좀(전술한 실험예 의하여 분리된 엑소좀)에서 분리된 단백질을 2-머캅도에탄올(2-mercaptoethanol)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 포함하는 Laemmli 버퍼용액(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 내에서 95 ℃로 10 분 동안 가열하여 변성시켰다. 단백질은 SDS-PAGE Mini-PROTEAN® TGXTM Precast Gels(456-1035; BioRad)를 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 이어서, 단백질을 rabbit polyclonal antibody(1:2000 dilution), anti-TSG101(ab125011), anti-CD81(ab109201), anti-ALIX(ab186429), anti-CD9(ab92726), 및 goat anti-rabbit IgG H&L(HRP) (ab205718) (Abcam, Cambridge, UK)에 대해서 면역블러팅법(immunoblotting)을 수행하였다. 강화된 화학발광시약(enhanced chemiluminescence reagent)과 ChemiDocTM XRS + System (Bio-Rad)를 이용하여 단백질 밴드를 확인하였다.
실험예 12(단백질 함량 평가)
순도(purity)를 평가하기 위하여 PierceTM BCA Protein Assay Kit(#23225; Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. 표준커브(표준 범위 0-200μg/mL)는 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)과, 워킹 시약을 9가지로 연속적으로 희석시켜 만들었다. 모든 샘플과 표준 포인트에 대해서 3회의 복제를 실시하였다. 100μL 샘플 각각을 2.0mL 워킹 시약과 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 562nm에서 blank standard replicate의 평균흡광도 및 흡광도값 사이의 차이를 측정(spectrometer, DS-11; Denovix, Wilmington, DE, USA)를 이용)하고, 표준커브를 기준으로 흡광도 차이를 μg/mL로 변환하였다. 표준커브를 기준으로 단백질 농도가 표준 곡선의 상한선 (2000 μg/mL)을 초과하는 경우, 샘플의 농도를 표준 범위 내의 값이 되도록 희석하였고, 희석 계수(dilution factor)를 기준으로 최종 샘플 농도값을 보정하였다.
실험예 13(RNA 분석 평가)
RNA는 SeraMir Exosome RNA purification 키트(RA806A-1, SBI, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 분리하였다. 모든 분리방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 세포외 소포체 miRNA 마커를 정량화하기 위하여, TaqMan MicroRNA RT 키트(4366596, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 및 TaqMan Micro RNA 어세이(4427975, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 RNA 용리용액을 역전사(reverse transcription)하였다. TaqMan Universal Master Mix II, no UNG (4440040, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 miRNA hsa-let-7a-5p, ID 000377 및 hsa-miR-142-3p, ID 000464와 함께 사용하였다. 바이오 분석장치(Agilent Eukaryote Total RNA Pico chip on an Agilent 2100 bioanalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 RNA 용리에 대해서 추가로 실험을 수행하였다.
실험예 14(마이크로 어레이를 통한 RNA 분석 평가)
miRNA 발현 프로파일은 마이크로 어레이(Gen-Chip miRNA 4.0 어레이, Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. tissue miRNA를 포함한 전체 RNA(130ng)는 FlashTag를 이용하여 비오틴으로 라벨링하였다. TM Biotin HSR RNA 라벨링 키트(Affymetrix)를 이용하여 라벨링된 샘플은 각 제조업체의 매뉴얼에 따라 GeneChip® Hybridization Oven을 이용하여 Affymetrix miRNA 마이크로 어레이에 혼합하였다. 라벨링된 RNA를 99 ℃에서 5분 동안 가열한 후, 이어서 45 ℃에서 5분 동안 가열하였다. Affymetrix® 450 Fluidics station를 이용하여 48 ℃에서 16 시간 동안 60rpm 로 교반하면서 RNA-어레이 혼성화를 수행하였다. Genechip Fluids Station 450(Affymetrix)를 사용하여 칩을 세척하고 염색하였으며, 각 칩은 Affymetrix GCS 3000 scanner(Affymetrix)을 이용하여 스캔되었다. Affymetrix® GeneChip® Command Console 소프트웨어(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 각 시그널의 값을 확인하였다.
(3) 실시예 2, 실시예 3, 비교예 2 내지 비교예 4의 평가
하기에서는 실시예 2, 비교예 2 내지 비교예 4에 대한 평가 결과를 나타내었다.
도 14는 PLL의 농도, 인큐베인션 온도 및 인큐베이션 시간에 따른 PLL-자성비드의 성능을 평가한 결과이다.
도 14의 a는 PLL-자성비드 5㎎을 혈장 샘플 1㎖에 넣고, 온도를 각각 10분, 30분, 60분, 120분으로 변화시키면서 인큐베이션을 수행하여 PLL-자성비드의 부피가 증가되는 것을 확인하고 도 15의 b에서는 온도를 각각 4℃ 및 24℃로 달리하여 10분, 30분, 60분, 120분 동안 인큐베이션을 수행하여 성능을 확인하였다.
PLL-자성비드의 부피가 증가될수록, PLL-자성비드와 혈장 중에 포함된 세포외 소포체의 결합이 증가됨을 의미하는 데, 인큐베이션 시간이 10분보다는 30분이 명확히 더 우수한 결합성능을 갖는 것으로 보였으며, 30분과 비교하였을 때 60분, 120분과의 결과에서 큰 차이가 없어 30분으로 최적화 조건을 확인하였다. 그러나, 빠른 실험을 위해서는 10분의 인큐베이션도 나쁘지 않은 결과를 얻을 수 있다.
또한, 인큐베이션 온도를 비교했을 때, 24℃보다는 4℃가 더 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이에 본 실험에서는 4℃에서 30분 간 인큐베이션을 수행하였다.
도 14의 c에서는, 동일한 비드에 대해서, PLL의 농도를 40㎎/㎖, 200㎎/㎖, 600㎎/㎖으로 달리하여 PLL-자성비드를 제조하고, 이와 같이 제조된 PLL-자성비드를 동일한 혈장 샘플 중에 첨가한 후 miRNA 추출 효과를 확인한 결과이다. PLL 농도에 대해서 전체적으로 큰 차이를 나타내지는 않았으나, 40㎎/㎖일 때 가장 우수한 것으로 나타났다. 따라서, 본 실험에서 PLL-자성비드는 40㎎/㎖의 PLL 농도를 이용하여 제조하였다.
도 14의 d에서는 PLL-자성비드의 농도에 따른 miRNA 추출 효과를 확인한 결과이다. PLL-자성비드의 농도를 0.5㎎/㎖, 2.5㎎/㎖, 5㎎/㎖, 10㎎/㎖, 및 25㎎/㎖로 변화시켜 결과를 확인하였다. PLL-자성비드의 농도는 5㎎/㎖까지는 miRNA 추출 능력이 증가하나, 5㎎/㎖보다 농도를 증가시킨 경우 성능에서 거의 변화가 없음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 실험에서 비드의 농도는 5㎎/㎖로 하여 수행하였다.
도 15는 PLL-자성비드의 사이즈에 따른 세포외 소포체 분리능을 평가한 결과이다.
도 15의 a는 PLL-자성비드의 평균직경을 각각 1㎛, 40㎛로 다르게 하여, 인큐베이션 시간을 3시간 및 6시간으로 Hematocrit에 의하여 평가한 결과이다. 도 16의 b는 PLL-자성비드의 평균직경을 각각 0.4㎛, 1㎛로 한 후 바이오 분석장치 (Bioanalyzer)에 의하여 평가한 결과이다.
도 15의 a에서, PLL-자성비드의 평균직경이 1㎛인 경우가 40㎛보다 더 세포외 소포체 분리능이 우수하게 나타났으며, 3시간 보다는 6시간에서 보다 우수하게 나타났다. 또한, 도 15의 b에서 PLL-자성비드의 평균직경이 1㎛인 경우가 0.4㎛보다 miRNA과 순도에서 우수함을 확인할 수 있었다.
도 16은 실시예 2 및 비교예 2에 따른 SEM 이미지, 형광이미지, 및 Cryo-TEM 이미지를 나타내었다.
도 16의 a는 실시예 2에 따른 PLL-자성비드(PLL-bead)를 이용한 세포외 소포체(EV)를 분리한 결과로, PLL-자성비드, 세포외 소포체가 포획된 PLL-자성비드, 분리된 엑소좀 각각에 대한 SEM 이미지로, 자성비드의 평균직경은 950nm임을 확인하였다. 도 16의 b는 PLL-자성비드(green color), 엑소좀이 포획된 PLL-자성비드(red color) 및 이들을 합친 형광이미지를 나타내었다. 도 16의 c는 실시예 2(PLL-bead) 및 비교예 2 (UC)에 따라 분리된 세포외 소포체(EV)의 Cryo-TEM 이미지를 나타내었다.
실시예 2에서, 0.5μm 내지 40μm의 다양한 크기의 PLL-자성비드에 대해서 SEM 이미지를 확인한 후, 이중 크기가 1μm를 선택하여 평가를 수행하였다. PLL-자성비드를 혈장 샘플에 첨가한 후, 세포외 소포체인 엑소좀이 PLL-자성비드의 표면에 코팅된 형태로 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, PLL-자성비드를 이용하여 분리한 엑소좀은 대략 크기가 100nm인 것을 확인할 수 있었다.
형광 이미지에서도 SEM과 유사한 결과를 확인할 수 있었다. PLL-자성비드를 FITC로 염색하였고, 엑소좀은 anti-CD 63(Alexa Fluor 647)로 염색하여 형광 이미지를 확인하였다. 형광 이미지는 40μm의 PLL-자성비드를 이용하였다. 녹색은 PLL-자성비드를 나타내며, 붉은색은 세포외 소포체인 엑소좀이 포획된 PLL-자성비드를 나타낸다. 실시예 2(ExoCAS-2) 및 비교예 2(UC)에 의하여 분리된 세포외 소포체를 TEM으로 확인한 결과, 실시예 2 및 비교예 2의 모두에서 직경이 70nm 내지 180nm 범위의 거의 유사한 크기의 세포외 소포체가 분리된 것을 확인할 수 있었다.
도 17은 실시예 2에 따른 제타전위와 인큐베이팅 후 부피변화를 확인한 결과이다.
도 17의 a는 엑소좀, 실시예 2(PLL-bead), 세포외 소포체가 포획된 PPL-자성비드(EV-captured PLL-bead) 및 혈장 단백질 중에 포함된 알부민, γ-글로불린 및 피브리노겐의 제타전위를 나타내었다. 도 17의 b는 혈장 내에서 실시예 2(PLL-bead)를 인큐베이팅 전과 후에 따른 부피변화를 확인한 결과이다.
실시예 2(PLL-bead)에 따른 세포외 소포체의 분리는 PLL-자성비드의 표면에서 음이온 교환을 이용한다. 세포외 소포체인 엑소좀의 제타전위는 세포외 소포체의 음이온성 인지질 이중층으로 형성되어 있어 -15.0mV을 나타내었다. PLL-자성비드는 PLL의 양이온성인 친수성 아미노 그룹에 의하여 22.6mV의 제타전위를 나타낸다. PLL-자성비드의 표면에 엑소좀이 포획된 경우, 엑소좀의 결합에 의하여 제타전위는 5.4mV로 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, PLL 자체의 제타전위는 42.4mV이다.
즉, PLL은 자성비드와 결합하면서 22.6mV로 제타전위가 감소하였고, PLL-자성비드는 엑소좀이 포획되어 5.4mV로 제타전위가 감소하였다. 혈장 단백질 내에는 알부민, γ-글로불린 및 피브리노겐 등의 단백질이 포함되어 있고, 이들은 각각 -6.1mV, 2.4mV 및 -18.7mV의 제타전위로 음의 값을 나타냄을 확인할 수 있었다. 따라서, 음의 제타전위 값을 갖는 단백질은 세포외 소포체인 엑소좀과 함께 PLL-자성비드에 포획될 수 있으므로, 후속하는 단계에서 제1 시약에 의하여 엑소좀 이외의 불순물인 단백질을 제거하는 공정을 필요로 한다.
혈장 내에서 PLL-자성비드를 첨가한 후 인큐베이션 전과 후를 비교하면, PLL-자성비드의 부피변화가 발생함을 확인할 수 있었다. 엑소좀이 PLL-자성비드에 부착되었기 때문으로 판단되며, 이는 인큐베이팅 시간 및 온도에 의하여 제어된다. 실시예 1에서 검토한 바와 같이, 4℃에서 인큐베이팅한 경우는 24℃에서 인큐베이팅한 경우 보다 효과적으로 엑소좀이 PLL-자성비드에 부착되는 것을 확인할 수 있었다. 본 실험에서, 30분 동안 인큐베이팅한 후 부피가 완전 포화된 것을 확인할 수 있었다.
도 18은 실시예 2, 비교예 2 내지 비교예 4의 NTA 및 BCA 분석결과이다.
도 18에서는 실시예 2, 비교예 2 내지 비교예 4에 대하여, 입자의 평균 크기(a), 입자의 농도(b), 단백질의 농도(c) 및 순도 비율(입자/단백질의 비율)을 나타내었다(* : p <0.05, ** : p <0.01, *** : p <0.001). 도 18의 d에서 순도 비율은 비교예 2를 기준으로 사용하였다.
실시예 2를 이용하여 분리한 세포외 소포체인 엑소좀의 크기 분포, 형태, 표면 및 내부 단백질 마커, 엑소좀 RNA에 대해서 확인하고, 종래 이용되는 비교예 2(UC)의 초원심분리와, 비교예 3(EQ, exoQuick, SBI) 및 비교예 4(exoEasy)와 함께 비교하였다.
비교예 3을 제외하고는 각 실시예 2, 비교예 2 및 비교예 4에 의하여 분리된 엑소좀의 크기는 유사한 것으로 판단된다. 반면, 엑소좀 사이의 입자 농도 및 단백질 오염 정도에서는 차이를 나타내었다(도 18의 b, c).
엑소좀의 분리성능을 나타내는 비교예 3은 최대 입자 농도가 22.5 x 1010/mL로 나타났는데, 이는 비교예 2의 1.8 x 1010/mL보다 12.5배 높았다. 실시예 2는 11.9 x 1010/mL로 비교예 2에 대해서 대략 2배 정도의 높은 결과를 나타내었다. 비교예 3은 비교예 2와 비교했을 때, 단백질 오염에서 나쁜 결과를 나타냄을 확인할 수 있고, 비교예 2와 실시예 2를 비교했을 때 단백질 오염 정도는 실시예 2가 비교예 2에 비하여 대략 2배 정도로 나타났다. 단백질 농도에 대한 입자 농도의 비율로 정의되는 순도 비율은 실시예 2가 가장 높은 값을 나타냄을 확인할 수 있었다.
도 19는 실시예 2와 실시예 3의 제1 시약에 따른 NTA 및 BCA 분석결과이다.
도 19에서는 실시예 2와 실시예 3에 대해서 제1 시약을 다르게 한 후, 제2 시약으로 NaCl 1M, pH 7.0, 200μL를 이용하여 상온에서 1000rpm, 5분 동안 볼텍싱하여, 세포외 소포체의 분리능을 평가하였다. 하기 표 1에서는 제1 시약을 이용하여 세척하는 조건을 각각 나타내었다. 표 2에서는 하기 표 1에 따른 NTA, BTA 및 순도(purity ratio)의 결과를 나타내었다. 하기 표 1에서 제1 시약은 제1 시약의 pH, 부피를 나타내었고, 제1 시약(추가)는 제1 시약으로 1회 세척한 후 동일한 샘플에 대해서 추가(2회 세척)로 세척한 것을 의미한다.
구분 1 구분 2 온도 제1 시약 제1 시약(추가)
실시예 2 #1 room temp. pH 6 - 2㎖ -
실시예 3 #2 room temp. pH 6 - 2㎖ -
#3 room temp. pH 6 - 2㎖ pH 6 - 2㎖
#4 room temp. pH 6 - 4㎖ -
#5 room temp. pH 6 - 1㎖ pH 8.5 - 1㎖
#6 70℃ pH 6 - 2㎖ -
구분 1 구분 2 NTA (109/㎖) BCA (㎍/㎖) purity (107 particle/㎍)
실시예 2 #1 1.68 143.05 1.18
실시예 3 #2 3.27 245.21 1.33
#3 2.93 124.87 2.34
#4 3.17 214.97 1.48
#5 3.13 133.26 2.35
#6 2.49 164.05 1.52
도 19의 (a)에서, 입자의 농도는 제2 시약 중에 포함된 세포외 소포체의 농도를 의미하는 것으로, 높을수록 많은 양의 세포외 소포체가 분리되었다는 의미이므로 값이 클수록 분리능이 좋음을 의미하고, 단백질의 농도는 제2 시약 중에 포함되는 세포외 소포체가 아닌 불순물로 작용한 단백질의 농도를 의미하는 것으로 낮을수록 제1 시약에 의하여 세척이 잘 진행되었음을 의미한다. 도 19의 (b)에서 순도 비율(입자/단백질의 비율)로 이를 나타내었다.
동일한 조건에서 pH 6의 2 ㎖의 제1 시약을 이용한 경우, 실시예 2(#1)에 비하여 실시예 3(#2)이 더 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이는 실시예 3과 같이 다가 양이온으로 프로타민 염을 이용하는 경우, PLL보다 세포외 소포체의 분리능이 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 3에 대해서 각각 다른 조건의 제1 시약을 이용하여 세척한 경우(#2 내지 #6)을 비교하면, pH 6의 2 ㎖를 1회로 세척한 경우(#2)보다는 pH 6의 2 ㎖를 진행한 후 추가로 동일한 제1 시약을 이용하여 추가로 세척한 경우(#3)가 더 우수한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
이에, 제1 시약을 2 ㎖로 2회로 나눠서 세척한 경우(#3)와, 2배의 부피인 4 ㎖로 1회로 한번에 세척한 경우(#4)를 비교하면, 2회로 나눠서 세척한 경우(#3)가 더 우수함을 확인할 수 있었다.
제1 시약을 이용하여 2회의 세척을 수행하여 이를 비교하였다(#3 및 #5). #5는 #3보다 적은 부피의 제1 시약을 이용하였음에도 유사한 결과를 나타낸 것으로 보아, #5와 같이 제1 시약을 이용하여 불순물인 단백질을 세척하는 경우, 1차로 약염기인 pH 6로 세척하고, 2차로 약산인 pH 8.5로 세척하는 경우, 세포외 소포체의 분리능이 더 향상됨을 확인할 수 있었다.
온도에 따른 효과를 확인하기 위하여 #6에 대한 실험을 실시하였는데, #2와 거의 유사한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 온도를 향상시켜 제1 시약으로 세척하는 경우에는, 입자의 농도는 감소하나 단백질의 농도는 증가하므로 전체적으로 상온에서 진행한 #2와 유사한 순도를 나타낸다. 반면, #6의 경우에는 고온으로 작업하기 위하여 제1 시약의 처리 및 세척하는 과정에서 온도 유지 등과 같이 추가의 처리 및 시간이 소요되므로 #2에 비하여 전체적인 분리효율은 감소되는 것으로 판단된다.
도 20은 실시예 2 및 비교예 2 내지 비교예 4의 웨스턴 블롯 결과이다. 도 21은 실시예 2 및 비교예 2 내지 비교예 4의 바이오 분석장치(bioanalyzer)를 이용한 성능평가 결과와, RT-qPCR를 이용한 엑소좀 miRNA 측정 결과이다. 도 22는 실시예 2 및 실시예 3의 RT-qPCR를 이용한 엑소좀 miRNA 측정 결과이다. 도 23는 실시예 2 및 비교예 2 내지 비교예 4에 따른 마이크로 에레이를 이용한 유전자 발현을 묘사하는 그래프이다. 도 24는 실시예 3에 따른 마이크로 에레이를 이용한 결과이다.
도 20의 a 및 b는 실시예 2 및 비교예 2 내지 비교예 4에 따른 웨스턴 블롯에 의하여 세포외 소포체의 단백질 마커를 확인한 결과이고, 도 20의 c는 웨스턴 블롯에 의하여 세포외 소포체에서 추출한 단백질 분석 결과이다.
도 21의 a는 실시예 2 및 비교예 2 내지 비교예 4에 따른 Agilent eukaryote total RNA pico chip를 이용한 바이오 분석장치로 전체 엑소좀 RNA를 분석한 결과이고, 도 21의 b는 RT-qPCR에 의하여 측정된 엑소좀 miRNA(hsa-let-7a-5p, hsa-miR-142-3p)를 분석한 결과이다.
도 20에서는, 분리된 세포외 소포체가 엑소좀인지를 확인하기 위하여 단백질 마커의 존재를 웨스턴 블롯팅으로 사용하여 조사하였다. Tetraspanins CD9 및 CD81는 종종 엑소좀 표면 단배질 마커의 역할을 하고, Alix(ALG-2-interacting protein X), 및 TSG101(tumor susceptibility gene 101 protein)는 엑소좀 내부의 단백질 마커의 역할을 한다. 이와 같은 4개의 단백질 마커를 엑소좀 식별을 위한 참조 단백질 마커로 조사하였다. 또한, 본 실험에서 혈장 단백질의 오염 단백질 마커로 알부민을 조사하였다.
실시예 2, 비교예 2, 비교예 4(비교예 3은 상대적으로 성능이 낮아서 제외) 중 실시예 2에서는 참조 단백질 마커(ALIX, TSG101, CD9 및 CD81)에서 강력한 밴드를 나타냄을 확인할 수 있었다. 밴드의 강도에 대해서는 정량적으로 추가 분석을 수행하였다(도 20의 b).
엑소좀 단백질 마커의 강도 정도에 따라서, 실시예 2 > 비교예 2 > 비교예 4의 순서로 나타났으며, 표면 단백질 마커(CD9 및 CD81) 및 내부 단백질 마커(TSG101 및 ALIX)를 기준으로, 분리된 세포외 소포체는 엑소좀인 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 실시예 2에 따라 분리된 세포외 소포체는 엑소좀을 나타낸다.
실시예 2, 비교예 2, 비교예 4의 모두에서 알부민의 밴드 강도가 나타났으나, 낮게 나타났고 실시예 2, 비교예 2, 비교예 4에서 모두 유사하게 나타냈다.
도 21의 a를 참조하면, 실시예 2, 비교예 2 내지 비교예 4는 동일한 혈장을 이용하여 엑소좀을 분리하였고, 엑소좀의 RNA는 SeraMir Exosome RNA Purification 키트(SBI, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 추출하였다. RNA 추출 후, Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 전체 RNA를 측정하였다. 실시예 2는 전체 RNA 값이 가장 높게 나타났고, 비교예 3이 가장 낮게 나타남을 확인할 수 있었다.
도 21의 b를 참조하면, 엑소좀에서 추출된 RNA의 일부를 RT-qPCR를 이용하여 분석하였다. 두 종류의 miRNA에 대한 Ct 값은 동일한 분리방법에서는 유사한 값을 나타내었으나, 각각의 분리방법인 실시예 2, 비교예 2 내지 비교예 4 사이에서는 크게 차이남을 확인할 수 있었다. 비교예 2는 hsa-let-7a-5p 및 hsa-miR-142-3p에 대해 각각 31.1 및 30.5였고, 비교예 3은 hsa-let-7a-5p 및 hsa-miR-142-3p에 대해 각각 37.07 및 36.29로 높게 나타났는데, 이는 단백질 오염이 높기 때문으로 판단된다. 실시예 2는 가장 낮은 Ct 값인 22.7 및 21.2를 나타내었고, 비교예 4는 23.3 및 22.6로 나타났다.
도 22를 참조하면, 실시예 2 및 실시예 3에서 두 종류의 miRNA에 대한 Ct 값이 서로 유사하게 나타남을 확인할 수 있었다.
도 23의 a를 참조하면, Gen-Chip miRNA 4.0 어레이(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 평가한 결과, 실시예 2, 비교예 2, 비교예 4에 의하여 추출된 세포외 소포체에서 총 2578 개의 miRNA가 식별됨을 확인할 수 있었다. 실시예 2, 비교예 2, 비교예 4의 모두에서 exosomal miRNA의 92.6 %가 나타남을 확인할 수 있었다.
도 23의 b를 참조하면, 발현의 차이를 나타낸 26 개의 miRNA 유전자의 경우 암과 관련된 특정 miRNA는 없는 것으로 확인되었다. 실시예 2, 비교예 2, 비교예 4에 의하여 식별된 각각의 miRNA의 비율은 2.5 %를 초과하지 않음을 확인할 수 있었다.
도 23 및 도 24를 참조하면, 실시예 3에서 0.65 %로 종래에 많이 사용되는 비교예 2, 비교예 4와 대략 유사한 성능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
도 25는 실시예 2에서 제1 시약을 이용하는 단계(a)와 제2 시약을 이용하는 단계(b)에서의 성능평가를 한 결과이다.
도 23의 a 내지 c는 혈장 내에 PPL-자성비드를 첨가하여 세포외 소포체가 포획된 PPL-자성비드로 제조한 후, 제1 시약을 이용하여 PPL-자성비드에 세포외 소포체 이외의 불순물인 단백질을 세척하여 제거한 결과로, 입자 농도, 단백질 농도 및 세척 효율(단백질/입자의 비율)을 각각 나타내었고, 도 22의 d 내지 f는 세포외 소포체가 포획된 PPL-자성비드를 제2 시약을 이용하여 용리시킨 결과로, 입자 농도, 단백질 농도 및 세척 효율(단백질/입자의 비율)을 각각 나타내었다(* : p <0.05, ** : p <0.01).
도 23을 참조하면, 실시예 2는 음이온 교환 원리를 바탕으로 하는 것으로 도 22의 a와 같이 제1 시약에 의하여 세척하여 PPL-자성비드에 부착된 불순물인 단백질을 제거하였다. 이때, 음전하를 갖는 단백질을 PPL-자성비드에 포획된 세포외 소포체에 영향을 주지 않고 제거하야 한다. 상기 제1 시약의 pH가 등전점(pI)이 같으며, 단백질 전하가 중성이 되므로, 이온교환수지에 의하여 쉽게 분리된다. 또한, 제2 시약의 경우에서도, pH를 등전점 미만으로 조정하면 단백질의 양전하를 유도할 수 있는데, 혈장 단백질에서는 5 ~ 9까지 광범위한 등전점을 가지고 있어 문제된다.
제1 시약에 대해서 pH를 다양하게 변화시켜, PPL-자성비드에 부착된 불순물인 단백질의 제거능을 확인하였다(도 22의 b). 제1 시약은 아세트산 농도(29 nM)는 일정하게 하고, 수산화나트륨 농도(6.135 nM)를 다양하게 변화시켜 pH를 변화시켰다.
그 결과, 단백질의 농도는 pH 8.5에서 최대값을 나타내었으나, 입자의 농도는 거의 유사함을 확인할 수 있었다. 제1 시약에 의하여 세척된 단백질의 농도와 세척된 총 입자 수의 비율로 정의되는 세척 효율성에서는, 제1 시약이 pH 6일 때 가장 높게 나타났다.
제2 시약을 이용하여 PPL-자성비드에 포집된 세포외 소포체를 분리하였다(도 22의 d). 다양한 염(Na2SO4, (NH4)2SO4, KCl, CH3COONH4 및 NaCl)를 이용하여 실험한 후, 염화나트륨의 음이온교환능을 제2 시약으로 적절한 결과를 나타내어, 염화나트륨을 염으로 이용하였다.
염화나트륨을 이용하여 다양한 농도의 NaCl(200mM 내지 3M) 및 농도 변화(200mM 및 1M)을 준비하여, PPL-자성비드에 포집된 세포외 소포체가 용리되는 정도를 확인하였다.
도 23의 e에서, NaCl 농도가 증가함에 따라 회수된 입자가 증가하나, 1M에서 최대값을 가진 후 다시 3M에서는 감소됨을 확인할 수 있었고, 이는 염석효과(salting-out effect)가 발생하였기 때문으로 판단된다. 반면, 용리를 수행한 제2 시료 중에 포함된 단백질의 농도는 NaCl 농도가 증가함에 따라 증가하였다.
즉, 제2 시료로 PPL-자성비드에 포집된 세포외 소포체를 용리시킨 후, 용리된 단백질의 농도에 대한 입자 수의 비율로 정의되는 용리효과를 고려할 때, NaCl이 1M일 때 가장 높은 값을 가짐을 나타내었고, 이때 대부분의 엑소좀이 추출됨을 확인할 수 있었다.
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[부호의 설명]
100 : 흡착구체
110 : 지지체
120 : 다가 양이온

Claims (23)

  1. 생물학적 샘플 중에 포함된 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리방법에 있어서,
    (a) 미세소포체를 포함하는 생물학적 샘플에 흡착구체를 첨가하는 단계;
    (b) 상기 흡착구체를 상기 생물학적 샘플 내에 유지시켜 상기 흡착구체에 상기 미세소포체가 포획된 흡착구체 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 생물학적 샘플로부터 상기 흡착구체 복합체를 분리하는 단계;
    (d) 분리된 흡착구체 복합체를 제1 시약을 이용하여 세척하는 단계; 및
    (e) 세척된 흡착구체 복합체를 제2 시약을 이용하여 미세소포체를 용리(elution)하는 단계;를 포함하고,
    상기 흡착구체는 지지부와 상기 지지부의 표면에 구비되는 하나 이상의 다가 양이온을 포함하는, 생물학적 샘플로부터 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 뇌척수액, 눈물, 땀, 대변, 복수, 양수, 정액, 유(milk), 세포 배지, 조직 추출물 및 암 조직 중 어느 하나 이상을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 지지부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 폴리스티렌, 하이드로겔, 아가로오스, 세라믹, 실리카겔, 라텍스, 금속 입자, 유리 입자, 자성 입자, 금속 와이어, 및 자성 나노 입자가 결합된 금속 와이어 중 어느 하나 이상을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 다가 양이온은 폴리라이신, 프로타민, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, 양이온성 덱스트란, 양이온성 덴드리머, 양이온성 폴리사카라이드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민, 폴리쿼터늄, 폴리-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(PDMAEMA), 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(PDMAMS), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트(pDEAEA), 폴리 다이메틸아미노에틸아크릴레이트(pDMAEA), 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA), 리포폴리아민(lipopolyamines), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 구아니딘(guanidine), 이미다졸(imidazole), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrol), 및 키토산(chitosan) 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인 미세소포체 분리방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 지지부는 구형으로 구비되고, 상기 지지부의 평균직경은 200 nm 이상 100 μm 이하인 것인, 미세소포체 분리방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 지지부는 다공성의 입자, 멤브레인 및 메쉬 중 적어도 어느 하나 이상을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 지지부는 표면에 형성된 요철을 더 포함하는 미세소포체 분리방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 지지부는 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로 부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 함유하는 자성 비드인 것을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 지지부는 중심에 구비되는 코어부와, 상기 코어부의 외면을 감싸도록 구비되는 쉘부를 포함하고,
    상기 코어부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 폴리스티렌, 하이드로겔, 아가로오스, 세라믹, 실리카겔, 라텍스 중 어느 하나 이상이고,
    상기 쉘부는 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로 부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 함유하고,
    상기 다가 양이온은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 지지부는 중심에 구비되는 코어부와, 상기 코어부의 외면을 감싸도록 구비되는 쉘부를 포함하고,
    상기 코어부는 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로 부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물을 함유하고,
    상기 쉘부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 폴리스티렌, 하이드로겔, 아가로오스, 세라믹, 실리카겔, 라텍스 중 어느 하나 이상이고,
    상기 다가 양이온은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  11. 제1항에 있어서,
    (b) 단계에서,
    상기 흡착구체를 상기 생물학적 샘플 내에 유지시키는 것은,
    1℃ 내지 8℃의 온도에서, 50rpm 내지 150rpm으로 10분 내지 2시간 동안 교반하는 것을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  12. 제1항에 있어서,
    (c) 단계에서,
    상기 흡착구체 복합체는 분리부재를 이용하여 분리하고,
    상기 분리부재는 포획필터, 자성분리, 원심분리, 용해도분리, 및 입자크기에 따른 분리 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 미세소포체 분리방법.
  13. 제1항에 있어서,
    (d) 단계에서,
    상기 미세소포체가 포집된 흡착구체는 제1 시약을 이용하여 제1 조건으로 세척하는 것을 포함하고,
    상기 제1 시약은 CH3COO-, SO4 2-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하고,
    상기 제1 조건은 pH 5.5 내지 6.5, 및 pH 7.5 내지 9.5 중 어느 하나 이상의 pH 범위 내에서, 1회 이상으로 수행되는 것을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  14. 제1항에 있어서,
    (e) 단계에서,
    상기 미세소포체가 포집된 흡착구체는 제2 시약을 이용하여 제2 조건으로 용리하는 것을 포함하고,
    상기 제2 시약은 CH3COO-, SO4 2-, Cl-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하되, 0.2 M 내지 3 M의 농도범위로 구비되고,
    상기 제2 조건은 1분 내지 60분의 시간 동안 500rpm 내지 2000rpm으로 혼합하면서 1회 이상 수행되는 것을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  15. 제1항에 있어서,
    (d) 단계에서 상기 제1 시약으로 상기 흡착구체 복합체를 세척한 후 상기 흡착구체 복합체를 분리하는 1차보조분리와,
    (e) 단계에서 상기 제2 시약으로 상기 미세소포체를 용리한 후 상기 흡착구체를 분리하는 2차보조분리를 더 포함하고,
    상기 지지부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 및 폴리스티렌 중 어느 하나 이상으로 이루어진 단면이 원형인 비드형태로 구비되며,
    상기 1차보조분리 또는 2차보조분리는,
    50 nm 내지 1,000 nm 크기의 공극을 갖는 포획필터로 수행되는 미세소포체 분리방법.
  16. 제1항에 있어서,
    (d) 단계에서 상기 제1 시약으로 상기 흡착구체 복합체를 세척한 후 상기 흡착구체 복합체를 분리하는 1차보조분리와,
    (e) 단계에서 상기 제2 시약으로 상기 미세소포체를 용리한 후 상기 흡착구체를 분리하는 2차보조분리를 더 포함하고,
    상기 지지부는 자성입자를 포함하고,
    상기 1차보조분리 또는 2차보조분리는 전자석에 전류를 흘려 발생시키거나, 또는 자석을 이용하는 자성분리인 것을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 상기 흡착구체가 첨가되기 전 전처리되는 것을 더 포함하고,
    상기 생물학적 샘플의 전처리는 상기 생물학적 샘플 중 평균직경이 0.8μm 초과인 물질이 분리되도록 상기 생물학적 샘플을 여과시키는 것을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 미세소포체는 상기 흡착구체와 정전기적 상호작용(electrostatic interaction) 및 인터칼레이션(intercalation) 중 적어도 어느 하나에 의하여 결합되고,
    상기 흡착구체 복합체의 제타전위(zeta potential)는 0.5mV 내지 10mV인 것을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 흡착구체에 포집된 미세소포체는 평균직경이 20 nm 내지 800 nm이고,
    상기 다가 양이온은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함하는 미세소포체 분리방법.
  20. 생물학적 샘플 중에 포함된 미세소포체를 분리하는 미세소포체 분리용 시약 키트로,
    상기 미세소포체와 결합성을 갖는 하나 이상의 흡착구체;
    CH3COO-, SO4 2-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하는 제1 시약; 및
    CH3COO-, SO4 2-, Cl-, HCO-, SiO-, 및 OH- 중 어느 하나 이상을 포함하는 제2 시약;을 포함하고,
    상기 흡착구체는 지지부와 상기 지지부의 표면에 구비되는 하나 이상의 다가 양이온을 포함하는 미세소포체 분리용 시약 키트.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 시약 키트는 상기 흡착구체 또는 상기 미세소포체를 포획한 흡착구체를 분리하는 분리부재를 더 포함하고,
    상기 분리부재는 포획필터, 자성분리, 원심분리, 용해도분리, 및 입자크기에 따른 분리 중 어느 하나 이상을 포함하는 미세소포체 분리용 시약 키트.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 지지부는 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리스틸렌비닐벤젠, 및 폴리스티렌 중 어느 하나 이상으로 이루어진 단면이 원형인 비드형태로 구비되며,
    상기 다가 양이온은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함하고,
    상기 분리부재는 50 nm 내지 1,000 nm 크기의 공극을 갖는 포획필터를 포함하는 미세소포체 분리용 시약 키트.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 지지부는 자성입자를 포함하고,
    상기 다가 양이온은 폴리-L-라이신 폴리머(poly-L-lysine, PLL), 프로타민(protamine), 4급 암모늄(quaternary ammoniums), 키토산(chitosan) 및 폴리히스티딘 중 어느 하나 이상을 포함하고,
    상기 분리부재는 전자석에 전류를 흘려 발생시키는 장치 또는 자석을 이용하는 자성분리를 포함하는 미세소포체 분리용 시약 키트.
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