WO2021194181A1 - Ar 및 mtor를 이중 특이적으로 표적하는 핵산분자를 포함하는 항암바이러스 - Google Patents

Ar 및 mtor를 이중 특이적으로 표적하는 핵산분자를 포함하는 항암바이러스 Download PDF

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WO2021194181A1
WO2021194181A1 PCT/KR2021/003489 KR2021003489W WO2021194181A1 WO 2021194181 A1 WO2021194181 A1 WO 2021194181A1 KR 2021003489 W KR2021003489 W KR 2021003489W WO 2021194181 A1 WO2021194181 A1 WO 2021194181A1
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adenovirus
sequence
tumor
mtor
nucleotide sequence
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PCT/KR2021/003489
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최진우
박성훈
찰스고흐너 피터
유중기
최청갑
엄기환
이의진
이형빈
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㈜큐리진
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Definitions

  • the present invention relates to an antitumor adenovirus and an anticancer composition comprising the same.
  • Cancer is one of the diseases that cause the highest number of deaths worldwide, and the development of innovative cancer treatments can reduce medical costs and create high added value at the same time.
  • molecular therapeutics that can overcome existing anticancer drug resistance accounted for $17.5 billion in 7 major countries (US, Japan, France, Germany, Italy, Spain, UK), and in 2018, about It is expected to show a growth rate of 9.5% compared to 2008, occupying a market size of about $45 billion.
  • Cancer treatment is divided into surgery, radiation therapy, chemotherapy, and biological therapy.
  • chemotherapy is a treatment that suppresses or kills cancer cell proliferation as a chemical substance.
  • RNA interference (hereinafter referred to as RNAi) has been found to act on sequence-specific mRNA in various types of mammalian cells since its role was discovered (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764773).
  • RNAi is a small interfering ribonucleic acid short interfering RNA (small interfering RNA, hereinafter referred to as siRNA) having a double helix structure of 21-25 nucleotides in size is specifically bound to an mRNA transcript having a complementary sequence. It is a phenomenon in which the expression of a specific protein is suppressed by decomposing the transcriptome.
  • RNA double-stranded is processed by an endonuclease called Dicer and converted into 21 to 23 double-stranded (base pair, bp) siRNA, which binds to RISC (RNA-induced silencing complex).
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the guide (antisense) strand recognizes and degrades the target mRNA to sequence-specifically inhibit the expression of the target gene (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503 -514).
  • siRNA for the same target gene has a superior inhibitory effect on mRNA expression in vitro and in vivo compared to antisense oligonucleotide (ASO), and the effect lasts for a long time.
  • ASO antisense oligonucleotide
  • the market for RNAi technology-based therapeutics, including siRNA, has been analyzed to form a total of more than 12 trillion won in the future world market size around 2020. It is being evaluated as a next-generation gene therapy technology that can treat difficult-to-treat diseases.
  • siRNA binds to the target mRNA and regulates the expression of the target gene in a sequence-specific manner. Compared to the development period and development cost of (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670).
  • this ribonucleic acid-mediated interference phenomenon proposes a solution to the problem that occurs in the development of conventional chemical synthesis drugs, while selectively inhibiting the expression of specific proteins at the transcript level, and a study to use them in the development of therapeutic agents for various diseases, especially tumor therapeutics is in progress
  • siRNA therapeutics have the advantage that side effects can be predicted because the target is clear, but this target specificity is a disease caused by problems with various genes. may be the cause
  • the present invention provides an anti-tumor adenovirus comprising a nucleotide sequence having AR as a target sequence and a nucleotide sequence having mTOR as a target sequence.
  • the present invention provides a composition for treating cancer comprising the anti-tumor adenovirus.
  • the adenovirus containing an expression cassette encoding an shRNA containing a double-stranded siRNA that simultaneously inhibits the expression of AR and mTOR of the present invention and an adenovirus containing an hTERT promoter is specifically delivered to cancer cells by avoiding an in vivo immune response. It has a systemic therapeutic effect, can be delivered locally, has excellent selectivity, and exhibits a remarkable anticancer effect even with minimally invasive treatment, so it can be usefully used as an anticancer composition or an anticancer adjuvant for various cancer types.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a map of a vector for intracellular expression of shRNA including a dual target siRNA set of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram confirming the effect of inhibiting the expression of AR gene and mTOR gene by the dual target siRNA set 1 of the present invention in a cancer cell line:
  • siAR siRNA for AR
  • simTOR siRNA for mTOR
  • si-AT1 AR and mTOR dual target siRNA set of the present invention 1.
  • FIG. 3 shows A549 by dual target siRNA sets 1-13 of the present invention. It is a diagram confirming the effect of suppressing the expression of AR gene and mTOR gene in cell lines:
  • si-AT1 to si-AT13 siRNA sets 1 to 13 of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram schematically illustrating the structure of the adenovirus of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing a vector map of the adenovirus vector of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram confirming the effect of inhibiting the expression of AR and mTOR genes by the recombinant adenovirus CA103 of the present invention including the hTERT promoter and the dual target shRNA expression cassette in the prostate cancer cell line LNcap.
  • FIG. 7 is a diagram confirming in vitro the effect of inhibiting the expression of AR and mTOR genes by the recombinant adenovirus CA103 of the present invention including the hTERT promoter and the dual target shRNA expression cassette in prostate cancer cell lines C42B and 22Rv1.
  • FIG. 8 is a diagram confirming in vivo the effect of inhibiting the expression of AR and mTOR genes by the recombinant adenovirus CA103 of the present invention including the hTERT promoter and the dual target shRNA expression cassette.
  • FIG. 9 is a diagram confirming the killing effect of the cancer cell line LNcap by the recombinant adenovirus CA103 of the present invention including the hTERT promoter and the dual target shRNA expression cassette.
  • FIG. 10 is a diagram confirming the killing effect of the cancer cell lines C42B and 22Rv1 cell lines by the recombinant adenovirus CA103 of the present invention containing the hTERT promoter and the dual target shRNA expression cassette.
  • FIG. 11 is a diagram confirming in vivo the therapeutic effect of prostate cancer by the recombinant adenovirus CA103 of the present invention comprising the hTERT promoter and the dual target shRNA expression cassette.
  • nucleic acids are written in a 5' ⁇ 3' direction from left to right.
  • Numerical ranges recited within the specification are inclusive of the numbers defining the range, including each integer or any non-integer fraction within the defined range.
  • the present invention provides a human telomere promoter (hTERT); And it relates to an antitumor adenovirus comprising an expression cassette comprising a nucleotide sequence having AR as a target sequence and a nucleotide sequence having mTOR as a target sequence.
  • hTERT human telomere promoter
  • the nucleotide sequence having AR as the target sequence and the nucleotide sequence having mTOR as the target sequence may partially or 100% complementarily bind to form a double strand during gene expression.
  • the human telomere promoter may be operably linked with an endogenous gene of an adenovirus.
  • operably linked refers to a functional linkage between a gene expression control sequence (eg, an array of promoter, signal sequence, or transcriptional regulatory factor binding sites) and another gene sequence, whereby the Regulatory sequences will control the transcription and/or translation of the other gene sequences.
  • a gene expression control sequence eg, an array of promoter, signal sequence, or transcriptional regulatory factor binding sites
  • the hTERT promoter may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54.
  • the endogenous gene of adenovirus has the structure of 5'ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3'ITR; wherein C1 comprises E1A (SEQ ID NO: 55), E1B (SEQ ID NO: 57) or E1A-E1B; wherein C2 includes E2B-L1-L2-L3-E2A-L4; wherein C3 does not include E3 or includes E3; wherein C4 includes L5; and C5 may not include E4 or may include E4, and may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 58.
  • the adenovirus may have a partial deletion of the E3 region, and the deleted nucleotide sequence may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 60.
  • the expression cassette may be located at the C3 region of the endogenous gene of the adenovirus.
  • the hTERT promoter may be operably linked with E1A and E1B of endogenous genes of adenovirus.
  • an IRES sequence (SEQ ID NO: 56) may be further included between E1A and E1B of the endogenous gene of adenovirus.
  • the expression cassette is capable of encoding and expressing shRNA.
  • the shRNA may simultaneously inhibit the expression of AR and mTOR.
  • the antitumor adenovirus of the present invention can inhibit expression by degrading mRNA of a nucleic acid or inhibiting translation by RNA interference.
  • the expression cassette of the present invention can simultaneously inhibit AR and mTOR by expressing a double-stranded siRNA in which the AR-specific sense strand and the mTOR-specific anti-sense strand are partially complementary.
  • the term “repression of expression” means to cause a decrease in expression or translation of a target gene, and preferably means that the expression of the target gene becomes undetectable or exists at an insignificant level.
  • siRNA small interfering RNA
  • siRNA refers to a short double-stranded RNA capable of inducing an RNA interference (RNAi) phenomenon through cleavage of a specific mRNA.
  • RNAi RNA interference
  • siRNA is composed of a sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of a target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto. antisense strand), and since the antisense RNA strand is an siRNA specific for mTOR (antisense strand for mTOR), the double-stranded siRNA can simultaneously inhibit the expression of AR and mTOR, respectively.
  • RNA short hairpin RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • RNA refers to a single-stranded RNA that partially includes a palindromic nucleotide sequence, has a double-stranded structure in the 3' region, forms a hairpin-like structure, and is expressed in cells It means RNA that can be converted into siRNA after being cut by dicer, a type of RNase present in the cell, and the length of the double-stranded structure is not particularly limited, but is preferably 10 nucleotides or more, more preferably is 20 nucleotides or more.
  • the shRNA may be included in an expression cassette, and the shRNA is TTGGATCCAA (TTGGATCCAA) 3' of the sense strand after converting U to T in the set sequence consisting of the siRNA antisense strand and the sense strand for each gene. loop) or TTCAAGAGAG (TTCAAGAGAG loop), antisense strand and TT are sequentially linked to construct an expression cassette encoding shRNA, and it can be produced by expressing it in a cell.
  • TTGGATCCAA TTGGATCCAA
  • TTCAAGAGAG loop antisense strand and TT are sequentially linked to construct an expression cassette encoding shRNA, and it can be produced by expressing it in a cell.
  • the expression cassette is SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 16, SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 19 and 20, SEQ ID NOs: 21 and 22, SEQ ID NOs: 23 and 24, or SEQ ID NOs: 25 and 26 may include nucleic acids in which U is converted to T .
  • siRNA (Antisense AR) of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 or 25 complementarily binds to the mRNA of AR
  • SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 or 26 siRNA (Antisense mTOR) can complementarily bind to mRNA of mTOR.
  • the DNA encoding the shRNA included in the expression cassette may include any one of the nucleic acids represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 28 to 53.
  • the nucleotide sequence having AR as the target sequence may include a nucleotide sequence having at least 60% complementarity with the reverse complementary sequence of the nucleotide sequence having mTOR as the target sequence, and the nucleotide sequence having mTOR as the target sequence is It may include a nucleotide sequence having a complementarity of 60% or more with a reverse complementary sequence of a nucleotide sequence using AR as a target sequence.
  • the nucleotide sequence having AR as the target sequence is 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of the reverse complementary sequence of the nucleotide sequence targeting mTOR as the target sequence.
  • it may include a nucleotide sequence having at least 99% complementarity
  • the nucleotide sequence targeting mTOR as the target sequence is 70%, 80%, 85%, 90%, 95% of the reverse complementary sequence of the nucleotide sequence targeting AR.
  • %, 96%, 97%, 98% or may include a nucleotide sequence having a complementarity of 99% or more.
  • variants of the nucleotide sequence having AR as the target sequence or mTOR as the target sequence included in the expression cassette are included within the scope of the present invention.
  • the expression cassette of the present invention is a functional equivalent of a nucleic acid molecule constituting it, for example, some nucleotide sequence of a nucleic acid molecule has been modified by deletion, substitution or insertion, but a nucleotide sequence molecule and It is a concept that includes variants capable of performing the same functionally.
  • the "% of sequence homology" for a nucleic acid molecule is determined by comparing two optimally aligned sequences to a comparison region, wherein a portion of the nucleic acid molecule sequence in the comparison region is a reference sequence (additions or deletions) to the optimal alignment of the two sequences. may include additions or deletions (ie, gaps) compared to (not including).
  • the expression cassette may include a nucleotide sequence sequentially encoding a nucleotide sequence having AR as a target sequence, a loop sequence capable of forming a hairpin structure, and a nucleotide sequence having mTOR as a target sequence.
  • expression of the expression cassette may be regulated by a U6 promoter, and the U6 promoter may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27.
  • the adenovirus may be an adenovirus with a serotype 5 of group C.
  • the anti-tumor virus of the present invention may have high oncolytic activity compared to wild-type adenovirus, and may have high oncolytic activity compared to adenovirus in which the hTERT promoter is introduced into wild-type adenovirus.
  • the present invention relates to a composition for treating cancer comprising the anti-tumor virus of the present invention.
  • the composition of the present invention may further include an anticancer agent, for example, acibacin, aclarubicin, acodazole, acronisin, adozelesin, alanosine, aldesleukin, allo Purinol Sodium, Altretamine, Aminoglutethimide, Amonafide, Ampligen, Amsacrine, Androgens, Anguidin, Apidicoline Glycinate, Asaray, Asparaginase, 5-Azacytidine , Azathioprine, Bacillus Calmete-Guerin (BCG), Bakers Antipol, Beta-2-deoxythioguanosine, Bisantrene HCl, Bleomycin Sulfate, Bulsupan, Butionine Sulfoximine, BWA 773U82 , BW 502U83/HCl, BW 7U85 mesylate, cerasemid, carvetimer, carboplatin, carmustine, chloram
  • the cancer is colon cancer, breast cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, brain tumor, head and neck carcinoma, melanoma, myeloma, leukemia, lymphoma, stomach cancer, lung cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, liver cancer, esophageal cancer, small intestine cancer , perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, bone cancer, skin cancer, head cancer, cervical cancer, skin melanoma , intraocular melanoma, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, glioblastoma multiforme and pituitary gland
  • promoter refers to an untranslated nucleic acid upstream of a coding region that includes a binding site for RNA polymerase and has transcription initiation activity into mRNA of a gene downstream of the promoter. say sequence.
  • the promoter may be any promoter capable of initiating the expression of shRNA.
  • a promoter constitutive promoter
  • a promoter inducible promoter
  • Examples include U6 promoter, H1 promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, SV40 promoter, CAG promoter (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991), CaMV 35S promoter (Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985), the Rsyn7 promoter (US Patent Application No.
  • the promoter of the present invention may be a U6 promoter, a HI promoter, or a CMV promoter, and according to a preferred embodiment of the present invention, the U6 promoter may be used.
  • composition of the present invention may further include an adjuvant.
  • the adjuvant may be used without limitation as long as it is known in the art, for example, Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant may be further included to increase the effect.
  • composition according to the present invention may be prepared in a form in which the active ingredient is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical field.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the composition of the present invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • composition of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include at least one excipient in the active ingredient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin. It can be prepared by mixing and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, etc.
  • compositions for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • base of the suppository witepsol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, etc. may be used.
  • the holy material according to the present invention may be administered to an individual by various routes. Any mode of administration can be envisaged, for example, by oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of the individual's age, weight, sex, physical condition, and the like. It is self-evident that the concentration of the single domain antibody included in the pharmaceutical composition can be variously selected depending on the subject, and is preferably included in the pharmaceutical composition at a concentration of 0.01 to 5,000 ⁇ g/ml. If the concentration is less than 0.01 ⁇ g/ml, pharmaceutical activity may not appear, and if it exceeds 5,000 ⁇ g/ml, it may be toxic to the human body.
  • composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of cancer and its complications, and can also be used as an anticancer adjuvant.
  • the present invention also provides a method for preventing and treating cancer comprising administering a pharmaceutically effective amount of the composition of the present invention to a subject.
  • composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level depends on the subject type and severity, age, sex, activity of the drug, and the drug. It can be determined according to factors including sensitivity, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the present invention relates to the use of the anti-tumor adenovirus of the present invention for preventing or treating tumors.
  • the present invention relates to a method of treating a tumor using the anti-tumor adenovirus of the present invention.
  • a double-target siRNA (double strand) set capable of simultaneously inhibiting AR (androgen receptor) and mTOR (mammalian target of rapamycin) was prepared with the sequence shown in Table 1 below (Bioneer, Daejeon, Korea).
  • siRNA set 1 consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2
  • 18mers are complementary to each other
  • the 19mer siRNA set 2 consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4
  • the 17mers are complementary to each other
  • the 18mers consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6 siRNA set 3 of siRNA set 3 is 16mer complementary to each other
  • 17mer siRNA set 4 consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8
  • 19mer siRNA set 5 consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10 is 15mer complementary to each other
  • 18mer siRNA set 6 consisting of SEQ ID NOs: 11 and 12 is 14mer complementary to each other
  • 17mer siRNA set 7 consisting of SEQ ID NOs: 13 and 14 is 13mer complementary to each other
  • 23mer siRNA consisting of SEQ ID NOs: 15 and 16 Set 8 has 19mers complementary to each other
  • 22mer siRNA set 9 consisting of SEQ ID NOs: 17 and 18 is 18mer complementary to each other
  • 22mer siRNA set 9 consisting
  • siRNA (Antisense AR) of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 or 25 of Table 1 is complementary to the mRNA of AR, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 or 26 siRNA (Antisense mTOR) complementarily binds to the mRNA of mTOR. Therefore, siRNA sets 1 to 13 of the present invention simultaneously decrease the expression of AR and mTOR genes.
  • One si-AT1 GCUGCUGCUGCUGCCUGGGG One CCCCAUGCAGCUGCAGCAGC 2 20 18 2 si-AT2 CUGCUGCUGCUGCCUGGGG 3 CCCCAUGCAGCUGCAGGCAG 4 19 17 3 si-AT3 UGCUGCUGCUGCCUGGGG 5 CCCCAUGCAGCUGCAGCA 6 18 16 4 si-AT4 GCUGCUGCUGCCUGGGG 7 CCCCAUGCAGCUGCAGGC 8 17 15 5 si-AT5 CCACCCCCACCACCACCACCACCACCAC 9 GUGGUGGCAGCGGUGGUGG 10 19 15 6 si-AT6 CCACCCCCACCACCACCACCACCACCA 11 UGGUGGCAGCGGUGGUGG 12 18 14 7 si-AT7 CCACCCCCACCACCACCACCACCACCACCA 11 UGGUGGCAGCGGUGGUGG 12
  • an expression cassette expressing shRNA was prepared. Specifically, TTGGATCCAA (TTGGATCCAA loop) or TTCAAGAGAG (TTCAAGAGAG loop), antisense strand and TT are linked to 3' of the sense strand of the siRNA set of Table 1 in the 5' to 3' direction to construct a DNA sequence encoding the shRNA did.
  • shRNA expression cassettes TTGGATCCAA loop shRNA and TTCAAGAGAG loop shRNA containing the double-target siRNA (SEQ ID NOs: 1 and 2) siRNA double-stranded sequence and loop sequence of Set 1 are shown in Table 2 (siRNA is uppercase letter) Additional sequences are indicated in lowercase letters) and the remaining shRNAs are listed in the sequence listing (SEQ ID NOs: 28 to 53).
  • U6 promoter SEQ ID NO: 27
  • PstI and EcoRV of the pE3.1 vector
  • AR and mTOR dual target shRNA sequence (5' ⁇ 3') SEQ ID NO: TTGGATCCAA loop shRNA GCTGCTGCTGCTGCCTGGGGttggatccaaCCCCATGCAGCTGCAGCAGCtt 28 TTCAAGAGAG loop shRNA GCTGCTGCTGCTGCCTGGGGttcaagagagCCCCATGCAGCTGCAGCAGCtt 41
  • h460 and A549 cell lines in a 12-well plate, respectively, in RPMI medium (Hyclone) supplemented with 10% FBS (Hyclone) until the cell density reached 50% at 37°C, 5% CO 2 cultured under conditions. Thereafter, the double target siRNA sets 1 to 13 prepared in Example 1 were transferred to the cell-cultured wells with 80 pmol/well of 3 ⁇ l of lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Speciation knocked down AR and mTOR simultaneously (set 1 in PC3 cell line and h460, set 2-13 in A549 cell line).
  • siRNA for AR and siRNA for mTOR which are commercially available in Table 3 below, were transfected, respectively. 48 hours after transfection, cells were lysed and total RNA was extracted with GeneJET RNA Purification Kit (Invitrogen). Using the extracted total RNA as a template, reverse transcribed into cDNA through RT-PCR reaction, and then each siRNA and mRNA of AR and mTOR by dual target siRNA set 1 (si-AT1) of the present invention through q-PCR reaction The expression level was confirmed.
  • primer set and reaction mixture for AR or mTOR [10X reaction Buffer 2 ⁇ l, HQ Buffer 2 ⁇ l, dNTP 1.6 ⁇ l, Primer (F, R, 10 pmole/ul) 1 ⁇ l, Template (500 ng) 2 ⁇ l, Taq 0.2 ⁇ l, DW 10.2 ⁇ l, Total vol. 20 ⁇ l] was used.
  • mRNA of AR and mTOR in cell lysates knocked down by PCR conditions [2 min at 95°C, 30 cycles at 95°C for 20 sec, 10 sec at 60°C and 30-60 sec at 72°C, 5 min at 72°C] was converted to cDNA.
  • the reaction mixture was subjected to [Template (RT-PCR product) 6 ⁇ l, Taqman probe 3 ⁇ l, 10X reaction Buffer 6 ⁇ l, HQ Buffer 6 ⁇ l, dNTP 4.8 ⁇ l, Taq 0.6 ⁇ l, DW 10.2 ⁇ l, Total vol. 60 ⁇ l] and qPCR was performed [10 min at 95° C., 15 sec at 95° C. and 40 cycles per minute at 60° C. by furnace].
  • the probes used were AR (Thermo, Hs00171172_m1), mTOR (Thermo, Hs00234508_m1), and GAPDH (Thermo, Hs02786624_g1), and it was performed using QS3 equipment. All reactions were repeated three times and their average value was taken. The results obtained in this way were normalized to the mRNA value of GAPDH, a housekeeping gene.
  • both the expression of AR and mTOR were decreased by the dual target siRNA sets 1 and 2 to 13 of the present invention in both PC3 cells and h460 cell lines ( FIGS. 2 and 3 ), and the degree of decrease was determined by the effect of each siRNA and similar or superior.
  • the dual target siRNA of the present invention can effectively inhibit the expression of both genes at the same time.
  • hTERT promoter (SEQ ID NO: 54)-E1A (SEQ ID NO: 55)-IRES (SEQ ID NO: 56)-E1B sequence (SEQ ID NO: 57) (hTERT-E1A-IRES-E1B full sequence: SEQ ID NO: 58) was transferred to SpeI of the adenoviral vector After insertion between and ScaI, the U6 promoter and the AR and mTOR dual target shRNA coding sequence prepared in the above Example (U6 promoter + AR and mTOR dual target shRNA coding sequence: SEQ ID NO: 59) were inserted into the E3 region, respectively.
  • the hTERT promoter and dual target shRNA were expressed by insertion between SpeI, and an infectious recombinant adenovirus was constructed (AR and mTOR dual target shRNA coding (expressing) adenovirus: CA103) (see Fig. 5).
  • AR and mTOR dual target shRNA coding (expressing) adenovirus: CA103) see Fig. 5
  • a recombinant adenovirus into which only hTERT was inserted as a control was prepared (CA10G). Thereafter, the sequence of the prepared adenovirus vector was analyzed, and if there was no abnormality, the virus genome was linearized using PacI restriction enzyme, and 293A cells were transduced using the CaCl 2 method to produce each virus.
  • RNA prep was performed using a prep kit (Takara, 9767A). After that, RNA was quantified using Nanodirp, and 400 ng/20 ul per tube was added using RT premix (intron, 25081), mixed well with the premix contents, and then using a PCR device at 45° C.
  • the recombinant adenovirus CA103 of the present invention encoding and expressing the hTERT promoter and the AR and mTOR dual target shRNA significantly suppressed the expression of AR and mTOR genes compared to the recombinant adenovirus CA10G containing only the hTERT promoter. was found to be (Fig. 6).
  • the recombinant adenovirus CA103 of the present invention significantly suppressed the expression of AR and mTOR genes compared to CA10G ( FIG. 7 ).
  • the recombinant adenoviruses CA10G and CA103 prepared in Example 4 were administered directly intratumorally once ( 2 ⁇ 10 8 pfu/spot, 3 times), the tumor was excised 21 days later, and the expression level of AR and mTOR genes in the tumor was confirmed by Western blot analysis and IHC analysis. As a result of Western blot analysis, it was found that the expression of mTOR and AR was decreased in the CA103-administered group compared to the control group and the CA10G-administered group.
  • the cancer cell killing effects of the recombinant adenoviruses CA10G and CA103 prepared in Example 4 were compared. Specifically, after each dispensing of LNcap, C42B and 22Rv1 cell lines in a 96-well plate at 5X10 3 /well, 1, 2, 5, 10, 20, 40 or 50 MOI of CA10G and CA103 into each well after 1 hour After 72 hours of treatment as much as possible, MTT reagent was added and incubated at 37° C. for 3 hours. After 3 hours, the medium was removed from each well, 100 ul of DMSO was added, and then the absorbance was measured at a wavelength of 540 nm using a microplate reader, followed by MTT analysis.
  • CA103 of the present invention significantly killed cancer cells compared to CA10G in the case of LNcap cell line ( FIG. 9 ), and it was confirmed that CA103 of the present invention significantly killed cancer cells even in the case of C42B and 22Rv1 cell lines. could (Fig. 10).
  • the recombinant adenoviruses CA10G and CA103 prepared in Example 4 were administered directly intratumorally (2 ⁇ 10 8 pfu/spot, 3 times) to observe the growth, the tumor volume and weight were significantly reduced in the CA103-treated group compared to the untreated control group (buffer-treated group) and the vector control group (CA10G-treated group). was confirmed (FIG. 11).

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Abstract

본 발명은 항종양 아데노바이러스 및 이를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 AR 및 mTOR의 발현을 동시에 억제하는 이중 가닥 shRNA를 코딩하는 발현 카세트와 hTERT 프로모터를 포함하는 아데노바이러스는 체내 면역 반응을 회피하여 암세포에 특이적으로 전달되어 전신 치료 효과가 있으며, 국소 전달이 가능하고, 선택성이 뛰어나며, 최소 침습 치료로도 현저한 항암 효과를 나타내, 다양한 암종에 항암용 조성물 또는 항암보조제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

AR 및 MTOR를 이중 특이적으로 표적하는 핵산분자를 포함하는 항암바이러스
본 발명은 항종양 아데노바이러스 및 이를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로, 혁신적인 암 치료제의 개발은 이에 대한 치료시 발생되는 의료비를 절감할 수 있음과 동시에 고부가가치를 창출할 수 있다. 또한, 2008년의 통계에 따르면, 기존항암제 내성을 극복 할 수 있는 분자 치료제는 주요 7개국(US, Japan, France, Germany, Italy, Spain, UK)에서 $17.5 billion을 차지했고, 2018년의 경우 약 $45 billion 정도의 market size를 차지하여, 2008년 대비 9.5%의 성장률을 보일 것이라 예측되고 있다. 암의 치료는 수술, 방사선치료, 화학요법, 생물학적 치료로 구분되는데, 이 중에 화학요법은 화학물질로서 암 세포의 증식을 억제하거나 죽이는 치료법으로 항암제에 의하여 나타나는 독성은 상당부분 정상세포에서도 나타나기 때문에 일정 정도의 독성을 나타내며, 항암제가 효과를 나타내다가도 일정 기간의 사용 후에는 효과가 상실되는 내성이 발생하기 때문에 암세포에 선택적으로 작용하고 내성이 생기지 않는 항암제의 개발이 절실하다 (암 정복의 현주소 Biowave 2004. 6(19)). 최근 암에 대한 분자유전정보의 확보를 통해 암의 분자적 특성을 표적으로 한 새로운 항암제의 개발이 진행되고 있으며, 암세포만이 가지고 있는 특징적인 분자적 표적(molecular target)을 겨냥하는 항암제들은 약제 내성이 생기지 않는다는 보고도 있다.
유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증에서 중요한 도구이다. 간섭 RNA(RNA interference, 이하 RNAi라고 한다)는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물세포(mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764773). RNAi는 21-25개의 뉴클레오타이드 크기의 이중나선 구조를 가진 작은 간섭 리보핵산 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 siRNA라고 한다)이 상보적인 서열을 가지는 전사체(mRNA transcript)에 특이적으로 결합하여 해당 전사체를 분해함으로써 특정 단백질의 발현을 억제하는 현상이다. 세포 내에서는 RNA 이중가닥이 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의해 프로세싱되어 21 내지 23개의 이중가닥(base pair,bp)의 siRNA로 변환되며, siRNA 는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514). 베르트랑(Bertrand) 연구진에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 siRNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 포함하는 것으로 밝혀졌다 (Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2002. 296: 1000-1004). siRNA를 포함하는 RNAi 기술 기반 치료제 시장은 향후 세계 시장규모가 2020년경에 총 12조원 이상을 형성하는 것으로 분석되었으며, 해당 기술을 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대되어 기존의 항체, 화합물 기반 의약품으로 치료하기 어려운 질병을 치료할 수 있는 차세대 유전자 치료기술로 평가되고 있다. 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질(small molecule drug)이 특정한 단백질 표적에 최적화되기까지 오랜 동안의 개발 기간 및 개발 비용이 소요되는 것에 비하여, 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있고, 개발 기간이 단축되면서, 의약화가 불가능한 표적 물질을 포함한 모든 단백질 표적에 대하여 최적화된 리드 화합물을 개발할 수 있다는 장점을 가진다 (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670). 이에, 최근 이 리보핵산 매개 간섭현상이 기존의 화학 합성 의약 개발에서 발생되는 문제의 해결책을 제시하면서 전사체 수준에서 특정 단백질의 발현을 선택적으로 억제하여 각종 질병 치료제, 특히 종양 치료제 개발에 이용하려는 연구가 진행되고 있다. 또한, siRNA 치료제는 기존 항암제와 달리 표적이 명확하여 부작용이 예측 가능하다는 장점이 있으나, 이러한 표적 특이성은 다양한 유전자의 문제에 의해 발생하는 질병인 종양의 경우, 오히려 이러한 표적 특이성은 치료 효과가 높지 않은 원인이 되기도 한다.
본 발명의 목적은 항종양 아데노바이러스를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 AR을 표적서열로 하는 염기 서열 및 mTOR를 표적서열로 하는 염기 서열을 포함하는 항종양 아데노바이러스를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 항종양 아데노바이러스를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 AR 및 mTOR의 발현을 동시에 억제하는 이중 가닥 siRNA를 포함하는 shRNA를 코딩하는 발현 카세트와 hTERT 프로모터를 포함하는 아데노바이러스는 체내 면역 반응을 회피하여 암세포에 특이적으로 전달되어 전신 치료 효과가 있으며, 국소 전달이 가능하고, 선택성이 뛰어나며, 최소 침습 치료로도 현저한 항암 효과를 나타내, 다양한 암종에 항암용 조성물 또는 항암보조제로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 이중 표적 siRNA 세트를 포함하는 shRNA를 세포 내에서 발현하기 위한 벡터의 맵을 나타낸 도이다.
도 2는 암 세포주에서 본 발명의 이중 표적 siRNA 세트 1에 의한 AR 유전자 및 mTOR 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 도이다:
A: h460 세포주;
B: pc3 세포주;
NC: 대조군 siRNA;
siAR: AR에 대한 siRNA;
simTOR: mTOR에 대한 siRNA; 및
si-AT1: 본 발명의 AR 및 mTOR 이중 표적 siRNA 세트 1.
도 3은 본 발명의 이중 표적 siRNA 세트 1-13에 의한 A549 세포주에서의 AR 유전자 및 mTOR 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 도이다:
NC: 대조군 siRNA; 및
si-AT1 내지 si-AT13: 본 발명의 siRNA 세트 1 내지 13.
도 4는 본 발명의 아데노바이러스의 구조를 모식화한 도이다.
도 5는 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 6은 hTERT 프로모터 및 이중 표적 shRNA 발현 카세트를 포함하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 CA103에 의한 AR 및 mTOR 유전자의 발현 억제 효과를 전립선암 세포주 LNcap에서 확인한 도이다.
도 7은 hTERT 프로모터 및 이중 표적 shRNA 발현 카세트를 포함하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 CA103에 의한 AR 및 mTOR 유전자의 발현 억제 효과를 전립선암 세포주 C42B 및 22Rv1에서 in vitro로 확인한 도이다.
도 8은 hTERT 프로모터 및 이중 표적 shRNA 발현 카세트를 포함하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 CA103에 의한 AR 및 mTOR 유전자의 발현 억제 효과를 in vivo로 확인한 도이다.
도 9는 hTERT 프로모터 및 이중 표적 shRNA 발현 카세트를 포함하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 CA103에 의한 암세포주 LNcap의 사멸 효과를 확인한 도이다.
도 10은 hTERT 프로모터 및 이중 표적 shRNA 발현 카세트를 포함하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 CA103에 의한 암세포주 C42B 및 22Rv1 세포주의 사멸 효과를 확인한 도이다.
도 11은 hTERT 프로모터 및 이중 표적 shRNA 발현 카세트를 포함하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 CA103에 의한 전립선암 치료 효과를 in vivo로 확인한 도이다.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 방향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
일 측면에서, 본 발명은 인간 텔로미어 프로모터(hTERT); 및 AR을 표적서열로 하는 염기 서열 및 mTOR를 표적서열로 하는 염기 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 항종양 아데노바이러스에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 AR을 표적서열로 하는 염기서열 및 mTOR를 표적서열로 하는 염기서열은 유전자 발현시, 부분적 또는 100% 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성할 수 있다.
일 구현예에서, 인간 텔로미어 프로모터는 아데노바이러스의 내재적 유전자와 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절 인자 결합 위치의 어레이)과 다른 유전자 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 유전자 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
일 구현예에서, hTERT 프로모터는 서열번호 54의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 아데노바이러스의 내재적 유전자는 5'ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3'ITR의 구조를 가지며; 상기 C1은 E1A (서열번호 55), E1B (서열번호 57) 또는 E1A-E1B를 포함하고; 상기 C2는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며; 상기 C3는 E3를 포함하지 않거나 E3를 포함하고; 상기 C4는 L5를 포함하며; 및 상기 C5는 E4를 포함하지 않거나 E4를 포함할 수 있고, 서열번호 58의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 아데노바이러스는 E3 영역이 일부 결실될 수 있으며, 결실된 염기서열은 서열번호 60의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 발현 카세트가 아데노바이러스의 내재적 유전자의 C3 부위에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, hTERT 프로모터가 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B와 작동가능하게 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B 사이에 IRES 서열 (서열번호 56)이 추가로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발현 카세트는 shRNA를 코딩 및 발현할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 shRNA는 동시에 AR 및 mTOR의 발현을 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 아데노바이러스는 RNA 간섭에 의해 핵산의 mRNA를 분해하거나 번역을 억제함으로써 발현을 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 발현 카세트는 AR에 특이적인 센스 가닥 및 mTOR에 특이적인 안티 센스 가닥이 부분적으로 상보적인 결합을 이루고 있는 이중 가닥 siRNA를 발현시킴으로써 AR 및 mTOR을 동시에 억제할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "발현 억제"란 표적 유전자의 발현 또는 번역 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "siRNA(small interfering RNA)"란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 일반적으로 siRNA는 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성되나, 본 발명의 이중 가닥 siRNA는 센스 RNA 가닥이 AR에 특이적인 siRNA (AR에 대한 안티센스 가닥)이고, 안티센스 RNA 가닥이 mTOR에 특이적인 siRNA(mTOR에 대한 안티센스 가닥)이므로, 이중 가닥의 siRNA가 각각 동시에 AR 및 mTOR의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 용어 "shRNA(short hairpin RNA)"란, 단일가닥 RNA에서 부분적으로 회문상의 염기서열을 포함함으로써, 3´영역에 이중가닥 구조를 가지고 헤어핀과 같은 구조를 형성하고, 세포내에서 발현된 후에 세포내에 존재하는 RNase의 일종인 dicer에 의하여 절단되어 siRNA로 변환될 수 있는 RNA를 의미하는데, 상기 이중가닥 구조의 길이는 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는 10 뉴클레오티드 이상이고, 보다 바람직하게는 20 뉴클레오티드 이상이다. 본 발명에 있어서, 상기 shRNA는 발현 카세트에 포함될 수 있으며, 상기 shRNA는 각 유전자에 대한 siRNA 안티센스 가닥 및 센스 가닥으로 이루어진 세트 서열에서 U를 T로 변환한 뒤, 센스 가닥의 3'에 TTGGATCCAA (TTGGATCCAA 루프) 또는 TTCAAGAGAG (TTCAAGAGAG 루프), 안티센스 가닥 및 TT를 순차적으로 연결하여 shRNA를 코딩하는 발현 카세트를 제작하고 이를 세포 내에서 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 이 경우에 발현 카세트는 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 또는 서열번호 25 및 26의 염기서열에서 U가 T로 변환된 핵산을 포함할 수 있다. 상기에서, 서열번호 1 및 2로 이루어진 20mer의 siRNA 세트 1은 18mer가 서로 상보적이며, 서열번호 3 및 4로 이루어진 19mer의 siRNA 세트 2는 17mer가 서로 상보적이고, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 18mer의 siRNA 세트 3은 16mer가 서로 상보적이며, 서열번호 7 및 8로 이루어진 17mer의 siRNA 세트 4는 15mer가 서로 상보적이고, 서열번호 9 및 10으로 이루어진 19mer의 siRNA 세트 5는 15mer가 서로 상보적이며, 서열번호 11 및 12로 이루어진 18mer의 siRNA 세트 6은 14mer가 서로 상보적이고, 서열번호 13 및 14로 이루어진 17mer의 siRNA 세트 7은 13mer가 서로 상보적이며, 서열번호 15 및 16으로 이루어진 23mer의 siRNA 세트 8은 19mer가 서로 상보적이고, 서열번호 17 및 18로 이루어진 22mer의 siRNA 세트 9는 18mer가 서로 상보적이며, 서열번호 19 및 20으로 이루어진 22mer의 siRNA 세트 10은 18mer가 서로 상보적이고, 서열번호 21 및 22로 이루어진 21mer의 siRNA 세트 11은 17mer가 서로 상보적이며, 서열번호 23 및 24로 이루어진 20mer의 siRNA 세트 12는 16mer가 서로 상보적이고, 및 서열번호 25 및 26으로 이루어진 21mer의 siRNA 세트 13은 17mer가 서로 상보적이다. 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 또는 25의 siRNA (Antisense AR)가 AR의 mRNA에 상보적으로 결합하며, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 26의 siRNA (Antisense mTOR)가 mTOR의 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있다. 또한, 발현 카세트에 포함된 shRNA를 코딩하는 DNA는 서열번호 28 내지 53의 염기서열로 표시되는 핵산 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, AR을 표적서열로 하는 염기 서열은 mTOR를 표적서열로 하는 염기 서열의 역상보 서열과 60% 이상의 상보성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있고, mTOR를 표적서열로 하는 염기 서열은 AR을 표적서열로 하는 염기 서열의 역상보 서열과 60% 이상의 상보성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, AR을 표적서열로 하는 염기 서열은 mTOR를 표적서열로 하는 염기 서열의 역상보 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상보성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있고, mTOR를 표적서열로 하는 염기 서열은 AR을 표적서열로 하는 염기 서열의 역상보 서열과 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상보성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다.
발현 카세트에 포함된 AR을 표적서열로 하는 염기 서열 또는 mTOR를 표적서열로 하는 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 발현 카세트는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 염기 서열 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 핵산 분자에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 핵산 분자 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발현 카세트는 AR을 표적서열로 하는 염기 서열, 헤어핀 구조를 이룰 수 있는 루프 서열, 및 mTOR를 표적서열로 하는 염기 서열을 순차적으로 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 발현 카세트는 U6 프로모터에 의하여 발현이 조절될 수 있으며, U6 프로모터는 서열번호 27의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 아데노바이러스는 그룹 C의 혈청형이 5 타입인 아데노바이러스일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항종양 바이러스는 야생형 아데노바이러스에 비해 종양살상능이 높으며, 야생형 아데노바이러스에 hTERT 프로모터가 도입된 아데노바이러스에 비해 종양살상능이 높을 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항종양 바이러스를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항암제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA 773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5'-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁솔 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 시스플라틴, 파클리탁셀, 5-FU(5-fluorouracil), 메토트렉세이트, 독소루비신, 다우노루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 빈데신, 마이토마이신, 블레오마이신, 타목시펜 및 탁솔이고, 더욱 바람직하게는, 시스플라틴, 파클리탁셀 또는 5-FU(5-fluorouracil)이나, 본 발명의 조성물과 병용 처리하여 항암 효과에 시너지 효과를 나타낼 수 있는 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.
상기 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 다형성교모세포종 및 뇌하수체선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "프로모터"란, RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 다운스트림 (downstream) 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 말한다. 본 발명의 발현 카세트에 있어서, 상기 프로모터는 shRNA의 발현을 개시할 수 있는 어떤 프로모터도 가능하다. 구체적으로, 본 발명의 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 U6 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, CAG 프로모터 (Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991), CaMV 35S 프로모터 (Odell et al.,Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터 (미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴 (rice actin) 프로모터 (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터 (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터 등 당업자에게 자명한 공지의 모든 프로모터를 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 프로모터는 U6 프로모터, HI 프로모터, CMV 프로모터일 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면 U6 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 단일 도메인 항체 의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 조성물은 암 및 이의 합병증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 항암보조제로도 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 조성물를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 발명의 조성물은 치료적 유효량 또는 약학으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항종양 아데노바이러스의 종양 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항종양 아데노바이러스를 이용한 종양의 치료 방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. AR 및 mTOR 이중 표적 siRNA 제작
AR(androgen receptor) 및 mTOR(mammalian target of rapamycin)을 동시에 억제할 수 있는 이중 표적 siRNA(double strand) 세트를 하기 표 1의 서열로 제작하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea). 구체적으로, 서열번호 1 및 2로 이루어진 20mer의 siRNA 세트 1은 18mer가 서로 상보적이며, 서열번호 3 및 4로 이루어진 19mer의 siRNA 세트 2는 17mer가 서로 상보적이고, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 18mer의 siRNA 세트 3은 16mer가 서로 상보적이며, 서열번호 7 및 8로 이루어진 17mer의 siRNA 세트 4는 15mer가 서로 상보적이고, 서열번호 9 및 10으로 이루어진 19mer의 siRNA 세트 5는 15mer가 서로 상보적이며, 서열번호 11 및 12로 이루어진 18mer의 siRNA 세트 6은 14mer가 서로 상보적이고, 서열번호 13 및 14로 이루어진 17mer의 siRNA 세트 7은 13mer가 서로 상보적이며, 서열번호 15 및 16으로 이루어진 23mer의 siRNA 세트 8은 19mer가 서로 상보적이고, 서열번호 17 및 18로 이루어진 22mer의 siRNA 세트 9는 18mer가 서로 상보적이며, 서열번호 19 및 20으로 이루어진 22mer의 siRNA 세트 10은 18mer가 서로 상보적이고, 서열번호 21 및 22로 이루어진 21mer의 siRNA 세트 11은 17mer가 서로 상보적이며, 서열번호 23 및 24로 이루어진 20mer의 siRNA 세트 12는 16mer가 서로 상보적이고, 및 서열번호 25 및 26으로 이루어진 21mer의 siRNA 세트 13은 17mer가 서로 상보적이다. 하기 표 1의 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 또는 25의 siRNA (Antisense AR)가 AR의 mRNA에 상보적으로 결합하며, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 26의 siRNA (Antisense mTOR)가 mTOR의 mRNA에 상보적으로 결합한다. 따라서, 본 발명의 siRNA 세트 1 내지 13은 AR 및 mTOR 유전자의 발현을 동시에 감소시킨다.
set siRNA Sequence(sense), 5'-3' 서열번호 Sequence(antisense), 5'-3' 서열번호 length
(mer) 		상보적 결합 길이
(mer)
1 si-AT1 GCUGCUGCUGCUGCCUGGGG 1 CCCCAUGCAGCUGCAGCAGC 2 20 18
2 si-AT2 CUGCUGCUGCUGCCUGGGG 3 CCCCAUGCAGCUGCAGCAG 4 19 17
3 si-AT3 UGCUGCUGCUGCCUGGGG 5 CCCCAUGCAGCUGCAGCA 6 18 16
4 si-AT4 GCUGCUGCUGCCUGGGG 7 CCCCAUGCAGCUGCAGC 8 17 15
5 si-AT5 CCACCCCCACCACCACCAC 9 GUGGUGGCAGCGGUGGUGG 10 19 15
6 si-AT6 CCACCCCCACCACCACCA 11 UGGUGGCAGCGGUGGUGG 12 18 14
7 si-AT7 CCACCCCCACCACCACC 13 GGUGGCAGCGGUGGUGG 14 17 13
8 si-AT8 UGGAGGCAGAGAGUGAGAGAGAA 15 UUCUCUCAGACGCUCUCCCUCCA 16 23 19
9 si-AT9 GGAGGCAGAGAGUGAGAGAGAA 17 UUCUCUCAGACGCUCUCCCUCC 18 22 18
10 si-AT10 UGGAGGCAGAGAGUGAGAGAGA 19 UCUCUCAGACGCUCUCCCUCCA 20 22 18
11 si-AT11 UGGAGGCAGAGAGUGAGAGAG 21 CUCUCAGACGCUCUCCCUCCA 22 21 17
12 si-AT12 GGAGGCAGAGAGUGAGAGAG 23 CUCUCAGACGCUCUCCCUCC 24 20 16
13 si-AT13 GGAGGCAGAGAGUGAGAGAGA 25 UCUCUCAGACGCUCUCCCUCC 26 21 17
실시예 2. AR 및 mTOR 이중 표적 shRNA 발현 카세트 제작
상기 실시예에서 제작한 siRNA를 세포 내에서 발현할 수 있게 하기 위하여, shRNA를 발현하는 발현 카세트를 제작하였다. 구체적으로, 5'에서 3' 방향으로 상기 표 1의 siRNA 세트의 센스 가닥의 3'에 TTGGATCCAA (TTGGATCCAA 루프) 또는 TTCAAGAGAG (TTCAAGAGAG 루프), 안티센스 가닥 및 TT를 연결하여 shRNA를 코딩하는 DNA 서열을 제작하였다. 대표적으로, 세트 1의 이중 표적 siRNA (서열번호 1 및 2) siRNA 이중 가닥의 서열과 루프 서열을 포함하는 shRNA 발현 카세트들 (TTGGATCCAA 루프 shRNA 및 TTCAAGAGAG 루프 shRNA)을 표 2에 표시하고 (siRNA는 대문자로 추가 서열은 소문자로 표시) 나머지 shRNA들을 서열목록에 기재하였다 (서열번호 28 내지 53). 제작한 shRNA 발현 카세트들을 각각 pE3.1 벡터 (도 1)의 제한효소 PstⅠ 및 EcoRⅤ 절단 위치에 U6 프로모터 (서열번호 27) 이후에 오도록 배치하여, AR 및 mTOR를 표적으로 하는 이중 표적 siRNA를 포함하는 두 종의 shRNA를 세포 내에서 발현하는 재조합 발현 벡터를 제작하였다.
AR 및 mTOR
이중 표적 shRNA 		서열 (5'→3') 서열번호
TTGGATCCAA loop shRNA GCTGCTGCTGCTGCCTGGGGttggatccaaCCCCATGCAGCTGCAGCAGCtt 28
TTCAAGAGAG loop shRNA GCTGCTGCTGCTGCCTGGGGttcaagagagCCCCATGCAGCTGCAGCAGCtt 41
실시예 3. 이중 표적 siRNA 및 shRNA의 유전자 발현 억제 효과 확인
3-1. 이중 표적 siRNA의 유전자 발현 억제 효과
12웰 플레이트에 PC3 세포주, h460 및 A549 세포주를 각각 분주한 뒤, 세포 밀도가 50%가 될 때까지 10% FBS (Hyclone 사)가 첨가된 RPMI 배지 (Hyclone 사)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 그 후, 상기 세포가 배양된 웰에 상기 실시예 1에서 제작한 이중 표적 siRNA 세트 1 내지 13을 웰당 80 pmole씩 3㎕의 리포펙타민(lipofectamine)3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 트랜스펙션하여 AR 및 mTOR를 동시에 낙다운하였다 (세트 1은 PC3 세포주 및 h460에, 세트 2 내지 13은 A549 세포주에). 더불어, 이에 대한 양성 대조군으로서 시판되는 하기 표 3에 기재된 AR에 대한 siRNA와 mTOR에 대한 siRNA를 각각 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 48시간 후, 세포를 파쇄하여 GeneJET RNA Purification Kit (Invitrogen)로 총 RNA를 추출하였다. 추출한 총 RNA를 주형으로 사용하여 RT-PCR 반응을 통해 cDNA로 역전사 한 뒤, q-PCR 반응을 통해 각각의 siRNA와 본 발명의 이중 표적 siRNA 세트 1(si-AT1)에 의한 AR 및 mTOR의 mRNA 발현량을 확인하였다. mRNA 발현량을 확인하기 위해, AR 또는 mTOR에 대한 프라이머 세트와 반응 혼합물[10X reaction Buffer 2 ㎕, HQ Buffer 2 ㎕, dNTP 1.6㎕, Primer(F, R, 10 pmole/ul) 각각 1㎕, Template(500 ng) 2㎕, Taq 0.2㎕, DW 10.2㎕, Total vol. 20㎕]을 이용하였다. PCR 조건으로 [95℃에서 2분, 95℃에서 20초로 30 사이클, 60℃에서 10초 및 72℃에서 30-60초, 72℃에서 5분] 낙다운한 세포 파쇄물에서의 AR 및 mTOR의 mRNA를 cDNA로 변환하였다. 또한, 역전사된 cDNA를 주형으로 이용하여, 반응 혼합물을 [Template(RT-PCR product) 6㎕, Taqman probe 3㎕, 10X reaction Buffer 6㎕, HQ Buffer 6㎕, dNTP 4.8㎕, Taq 0.6㎕, DW 10.2㎕, Total vol.60㎕] 준비하고 qPCR을 수행하였다[95℃에서 10분, 95℃에서 15초 및 로60℃에서 1분당 40사이클]. 참고로, 사용한 프로브는 AR(Thermo, Hs00171172_m1), mTOR(Thermo, Hs00234508_m1), GAPDH(Thermo, Hs02786624_g1)이며, QS3 장비를 이용하여 수행하였다. 모든 반응은 3회씩 반복수행되고 이들의 평균값이 취해졌다. 이렇게 얻은 결과들은 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 mRNA 값에 대해 정규화하였다.
서열 (5'→3')
AR siRNA sense CACAAGUCCCGGAUGUACA(dTdT)
anti-sense UGUACAUCCGGGACUUGUG(dTdT)
mTOR siRNA sense GUGGAAACAGGACCCAUGA(dTdT)
anti-sense UCAUGGGUCCUGUUUCCAC(dTdT)
그 결과, PC3 세포 및 h460 세포주 모두에서 본 발명의 이중 표적 siRNA 세트 1 및 2 내지 13에 의해 AR 및 mTOR의 발현이 모두 감소하였으며 (도 2 및 3), 감소 정도는 각각의 siRNA에 의한 효과와 유사하거나 더 우수하게 나타났다. 이를 통해, 본 발명의 이중 표적 siRNA가 두 유전자의 발현을 동시에 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. 이중 표적 shRNA 코딩 아데노바이러스 제작
hTERT 프로모터 (서열번호 54)-E1A (서열번호 55)-IRES (서열번호 56)-E1B 서열 (서열번호 57) (hTERT-E1A-IRES-E1B 전체 서열: 서열번호 58)을 아데노바이러스 벡터의 SpeⅠ과 ScaⅠ사이에 삽입한 후, U6 프로모터와 상기 실시예에서 제작한 AR 및 mTOR 이중 표적 shRNA 코딩 서열 (U6 프로모터+AR 및 mTOR 이중 표적 shRNA 코딩 서열: 서열번호 59)을 각각 E3 영역(region)에 SpeⅠ사이에 삽입함으로써 hTERT 프로모터 및 이중 표적 shRNA를 발현하고, 감염성이 있는 재조합 아데노바이러스를 제작하였다 (AR 및 mTOR 이중 표적 shRNA 코딩 (발현) 아데노바이러스: CA103) (도 5 참조). 아울러, 대조군으로 hTERT만 삽입한 재조합 아데노바이러스도 제작하였다 (CA10G). 그 후, 제작된 아데노바이러스 벡터의 서열을 분석하여, 이상이 없을 경우 PacⅠ제한효소를 이용하여 바이러스 유전체를 선형화하여 293A 세포에 CaCl2 법을 이용하여 형질도입하여 각 바이러스를 생산하였다.
실시예 5. 이중 표적 shRNA 코딩 아데노바이러스의 유전자 발현 억제 확인
5-1. in vitro
상기 실시예 4에서 제작한 재조합 아데노바이러스 CA103의 표적 유전자 AR 및 mTOR에 대한 발현 억제 효과를 확인하였다. 구체적으로, 인간 전립선암 세포주인 LNcap, C42B 및 22Rv1를 각각 1X105/well로 12 웰 플레이트에 분주한 뒤 1시간 후에 CA10G 및 CA103을 각각의 웰에 2 또는 5 MOI가 되도록 처리하고 72시간 뒤에 RNA prep kit (Takara, 9767A)를 이용하여 RNA prep을 수행하였다. 그 후, Nanodirp을 이용하여 RNA 정량하고 RT 프리믹스 (intron, 25081)를 이용하여 튜브 당 400 ng/20 ul를 넣고 프리믹스(premix) 내용물과 잘 섞어 준 뒤 PCR 기기를 이용하여 45℃에서 1hr 및 95℃에서 5 분간 반응시켜 cDNA을 합성하였다. 합성된 cDNA 2 ul를 주형으로 이용하여 실험군에 해당하는 PCR 혼합물 (총 부피, 20 ul)을 만들었다 (주형 2 ul, 정방향 프라이머 0.5 ul (10 pmole/ul), 역방향 프라이머 0.5 ul (10 pmole/ul), 10 ul 2X master mix(Bioline, BIO-94005) 및 7 ul DW). 만든 PCR 혼합물을 볼텍싱하여 잘 섞고 원심분리한 후 qPCR 기기 (Applied Biosystems, QS3)에서 95℃에서 5분, 95℃에서 10초 및 60℃에서 30초를 40사이클 반응시켰다. 결과는 qPCR 기기에 있는 프로그램을 이용하여 분석하였다.
그 결과, LNcap 세포주에서, hTERT 프로모터와 AR 및 mTOR 이중 표적 shRNA를 코딩 및 발현하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 CA103은 hTERT 프로모터만 포함하는 재조합 아데노바이러스 CA10G에 비해 현저하게 AR 및 mTOR 유전자의 발현을 억제하는 것으로 나타났다 (도 6). 또한, C42B 및 22Rv1 세포주에서도 본 발명의 재조합 아데노바이러스 CA103가 CA10G에 비해 현저하게 AR 및 mTOR 유전자의 발현을 억제하는 것으로 나타났다 (도 7).
5-2. in vivo
balb c nu/nu 마우스에 전립선암 세포주 (22Rv-1)를 피하 이식하여 전립선암 마우스 모델을 구축한 뒤, 상기 실시예 4에서 제작한 재조합 아데노바이러스 CA10G 및 CA103를 각각 종양내 1회 직접 투여 (2×108 pfu/spot, 3 times)하고, 21일 후 종양을 적출하여 종양 내 AR 및 mTOR 유전자의 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석 및 IHC 분석으로 확인하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과, CA103를 투여한 군에서 대조군 및 CA10G 투여군에 비해 mTOR 및 AR의 발현이 감소한 것으로 나타났으며, IHC 분석 결과에서도 CA103를 투여한 군에서 mTOR 및 AR의 형광 발현이 대조군 및 CA10G 투여군에 비해 70~90% 이상 감소한 것으로 나타나, CA103이 종양 내 표적 유전자인 mTOR 및 AR의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다 (도 8)
실시예 6. 이중 표적 shRNA 코딩 아데노바이러스의 항암 효과 확인
6-1. in vitro
상기 실시예 4에서 제작한 재조합 아데노바이러스 CA10G 및 CA103의 암세포 사멸 효과를 비교하였다. 구체적으로, LNcap, C42B 및 22Rv1 세포주를 각각 5X103/well로 96 웰 플레이트에 각각 분주한 뒤 1시간 후에 CA10G 및 CA103을 각각의 웰에 1, 2, 5, 10, 20, 40 또는 50 MOI가 되도록 처리한 후 72시간 뒤에 MTT 시약을 넣고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 3시간 후 각 웰에서 배지를 제거하고 DMSO를 100 ul씩 넣은 뒤, 바로 마이크로플레이트 리더기를 사용해 파장 540 nm에서 흡광도를 측정하여 MTT 분석을 수행하였다.
그 결과, LNcap 세포주의 경우 CA10G에 비해 본 발명의 CA103이 현저하게 암세포들을 사멸하는 것을 확인할 수 있었으며 (도 9), C42B 및 22Rv1 세포주의 경우에도 본 발명의 CA103이 현저하게 암세포들을 사멸하는 것을 확인할 수 있었다 (도 10).
6-2. in vivo
balb c nu/nu 마우스에 전립선암 세포주 (22Rv-1)를 피하 이식하여 전립선암 마우스 모델을 구축한 뒤, 상기 실시예 4에서 제작한 재조합 아데노바이러스 CA10G 및 CA103를 각각 종양내 직접 투여 (2×108 pfu/spot, 3 times)하여 그 생장을 관찰한 결과, 무처리 대조군 (buffer 처리군) 및 벡터 대조군 (CA10G 처리군)에 비해 CA103를 처리한 군에서 종양의 부피 및 무게가 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 11).

Claims (20)

  1. 인간 텔로미어 프로모터(hTERT); 및
    AR(androgen receptor)을 표적서열로 하는 염기 서열 및 mTOR(mammalian target of rapamycin)를 표적서열로 하는 염기 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 항종양 아데노바이러스에 있어서,
    상기 AR을 표적서열로 하는 염기 서열과 mTOR을 표적서열로 하는 염기서열이 발현되는 경우, 각각 발현된 서열이 부분적 또는 100% 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하는 것인, 항종양 아데노바이러스.
  2. 제 1항에 있어서, 인간 텔로미어 프로모터는 아데노바이러스의 내재적 유전자와 작동 가능하게 연결된, 항종양 아데노바이러스.
  3. 제 2항에 있어서, 아데노바이러스의 내재적 유전자는 5'ITR-C1-C2-C3-C4-C5 3'ITR의 구조를 가지며;
    상기 C1은 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고;
    상기 C2는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며;
    상기 C3는 E3가 포함하지 않거나 E3를 포함하고;
    상기 C4는 L5를 포함하며; 및
    상기 C5는 E4를 포함하지 않거나 E4를 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  4. 제 1항에 있어서, 발현 카세트가 아데노바이러스의 내재적 유전자의 C3 부위에 위치하는, 항종양 아데노바이러스.
  5. 제 1항에 있어서, hTERT 프로모터가 아데노바이러스의 내재적 유전자의 E1A 및 E1B와 작동가능하게 연결된, 항종양 아데노바이러스.
  6. 제 5항에 있어서, E1A 및 E1B 사이에 IRES 서열이 추가로 포함된, 항종양 아데노바이러스.
  7. 제 1항에 있어서, 발현 카세트는 shRNA를 코딩하는, 항종양 아데노바이러스.
  8. 제 7항에 있어서, shRNA는 동시에 AR 및 mTOR를 억제하는, 항종양 아데노바이러스.
  9. 제 1항에 있어서, AR을 표적서열로 하는 염기 서열은 mTOR를 표적서열로 하는 염기 서열의 역상보 서열과 60% 이상의 상보성을 갖는 염기서열을 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  10. 제 1항에 있어서, mTOR를 표적서열로 하는 염기 서열은 AR을 표적서열로 하는 염기 서열의 역상보 서열과 60% 이상의 상보성을 갖는 염기서열을 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  11. 제 1항에 있어서, 발현 카세트는 AR을 표적서열로 하는 염기 서열, 헤어핀 구조를 이룰 수 있는 루프 서열, 및 mTOR를 표적서열로 하는 염기 서열을 순차적으로 코딩하는 염기서열을 포함하는, 항종양 아데노바이러스.
  12. 제 1항에 있어서, 발현 카세트는 U6 프로모터에 의하여 발현이 조절되는, 항종양 아데노바이러스.
  13. 제 1항에 있어서, 아데노바이러스는 그룹 C 아데노바이러스인, 항종양 아데노바이러스.
  14. 제 1항에 있어서, 혈청형이 5 타입인, 항종양 아데노바이러스.
  15. 제 1항에 있어서, 항종양 바이러스는 야생형 아데노바이러스에 비해 종양살상능이 높은, 항종양 아데노바이러스.
  16. 제 1항에 있어서, 항종양 바이러스는 야생형 아데노바이러스에 hTERT 프로모터가 도입된 아데노바이러스에 비해 종양살상능이 높은, 항종양 아데노바이러스.
  17. 제 1항의 항종양 아데노바이러스를 포함하는 암 치료용 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 항암제를 추가로 포함하는, 암 치료용 조성물.
  19. 제 1항의 항종양 아데노바이러스의 종양 예방 또는 치료 용도.
  20. 제 1항의 항종양 아데노바이러스를 이용한 종양의 치료 방법.
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