WO2021193606A1 - Mammalian cell preservative solution containing acarbose and dextran - Google Patents

Abstract

The present invention addresses the problem of providing: a substance which can effectively prevent the decrease in cell survival rate which has been conventionally observed when a mammalian cell is preserved in a liquid, and which is less likely to adversely affect a living body of a mammal when the substance is administered to the mammal in vivo; a mammalian cell preservative solution containing the substance; and others.　When a solution containing acarbose or a salt thereof and dextran or a salt thereof is used for the preservation of a mammalian cell, it becomes possible to effectively prevent the decrease in cell survival rate which has been conventionally observed when the mammalian cell is preserved in a liquid. A mammalian cell preserved in the solution can be directly administered to a mammal in vivo without requiring the transfer of the mammalian cell into another liquid for transplantation.

Description

アカルボース及びデキストランを含む哺乳動物細胞保存用液Mammalian cell preservation solution containing acarbose and dextran

　本発明は、アカルボース又はその塩（以下、「アカルボース類」ということがある）と、デキストラン又はその塩（以下、「デキストラン類」ということがある）を含む哺乳動物細胞保存用液（以下、「本件哺乳動物細胞保存用液」ということがある）や、本件哺乳動物細胞保存用液を用いて哺乳動物細胞を保存する方法等に関する。 The present invention is a mammalian cell preservation solution (hereinafter, "" (Sometimes referred to as the "Mammalian Cell Preservation Solution"), and a method for preserving mammalian cells using the Mammalian Cell Preservation Solution.

　近年、幹細胞研究の急速な発展によって再生医療への気運は高まっており、その知識や理解は、研究者のみならず、一般にも広く普及してきている。幹細胞を用いた再生医療は、幹細胞が有する自己複製能と多分化能や、幹細胞が分泌する因子を利用して、様々な疾患で損傷を受けた細胞や組織の機能を回復させることを目的とした医療である。白血病や再生不良性貧血などの血液難病の患者に骨髄移植をすると、造血系幹細胞が患者体内に生着し、ほぼ一生にわたって造血能の維持が可能となる。また、最近では多くの研究者が造血幹細胞以外の幹細胞を用いた臨床応用を目指し、中枢神経、末梢神経、骨髄、小腸などにおける幹細胞を同定し、外傷性疾患や組織変性疾患に対する組織幹細胞の移植治療が実践され始めている（非特許文献１～３）。他方、がん免疫細胞療法は、がんを攻撃する働きを有する免疫細胞を体外に取り出し、その働きを強化後、再び体内に戻すという最先端の細胞医療であり、樹状細胞ワクチン療法、アルファ・ベータＴ細胞療法（αβＴ細胞療法）、ガンマ・デルタＴ細胞療法（γδＴ細胞療法）、ＣＴＬ療法、ナチュラルキラー細胞療法（ＮＫ細胞療法）などのＴ細胞を用いた療法が実践されている。 In recent years, the rapid development of stem cell research has increased the momentum for regenerative medicine, and its knowledge and understanding have become widespread not only for researchers but also for the general public. Regenerative medicine using stem cells aims to restore the functions of cells and tissues damaged by various diseases by utilizing the self-renewal ability and pluripotency of stem cells and the factors secreted by stem cells. It is medical treatment. When bone marrow transplantation is performed on patients with intractable blood diseases such as leukemia and aplastic anemia, hematopoietic stem cells engraft in the patient's body, and hematopoietic ability can be maintained for almost a lifetime. Recently, many researchers have identified stem cells in the central nerve, peripheral nerve, bone marrow, small intestine, etc., aiming for clinical application using stem cells other than hematopoietic stem cells, and transplanted tissue stem cells for traumatic diseases and tissue degenerative diseases. Treatment has begun to be practiced (Non-Patent Documents 1 to 3). On the other hand, cancer immuno-cell therapy is a state-of-the-art cell medicine in which immune cells that have a function of attacking cancer are taken out of the body, strengthened, and then returned to the body. Dendritic cell vaccine therapy, alpha -Therapies using T cells such as beta T cell therapy (αβ T cell therapy), gamma delta T cell therapy (γδ T cell therapy), CTL therapy, and natural killer cell therapy (NK cell therapy) are practiced.

　移植治療に用いる幹細胞やＴ細胞を長期保存する場合、液体中での保存では細胞生存率を良好に保つことができない。例えば、ヒト骨髄幹細胞を生理食塩水中に冷蔵保存（４℃）すると、細胞生存率が４８時間後には４０％以下まで低下し、７２時間後には２０％以下まで低下することが報告されている（非特許文献４）。このため、移植用幹細胞や移植用Ｔ細胞を長期保存する場合、凍結保存することが一般的である。しかし、凍結保存液中には、通常ＤＭＳＯ、グリセロール等の凍結保存剤が添加されているため、凍結保存した幹細胞やＴ細胞を解凍した後、移植治療を行う前に移植凍結保存剤を除去する必要があり、手間がかかることが問題とされていた。また、凍結保存液に凍結保存剤を添加しても凍結時の水の結晶化による細胞骨格のダメージが大きく、凍結融解後の細胞生存率が低下することも問題とされていた。このため、簡便性に優れ、且つ細胞生存率の低下を抑制できる細胞保存液の開発が急務とされていた。 When stem cells and T cells used for transplantation treatment are stored for a long period of time, the cell viability cannot be maintained well by storage in liquid. For example, it has been reported that when human bone marrow stem cells are stored refrigerated in physiological saline (4 ° C.), the cell viability decreases to 40% or less after 48 hours and to 20% or less after 72 hours (72 hours). Non-Patent Document 4). Therefore, when the stem cells for transplantation and the T cells for transplantation are stored for a long period of time, they are generally cryopreserved. However, since cryopreservatives such as DMSO and glycerol are usually added to the cryopreservation solution, the transplant cryopreservative is removed after the cryopreserved stem cells and T cells are thawed and before transplantation treatment is performed. The problem was that it was necessary and time-consuming. In addition, even if a cryopreservative is added to the cryopreservation solution, the cytoskeleton is significantly damaged by the crystallization of water during freezing, and the cell viability after freezing and thawing is lowered. Therefore, there is an urgent need to develop a cell preservation solution that is excellent in convenience and can suppress a decrease in cell viability.

　本発明者らは、トレハロースやデキストランには、哺乳動物細胞を液体中で保存したときに生じる細胞生存率低下を、抑制する作用があることを報告している（特許文献１及び２）。しかしながら、アカルボース及びデキストランを併用すると、かかる抑制作用が向上することについてはこれまで知られていなかった。 The present inventors have reported that trehalose and dextran have an effect of suppressing a decrease in cell viability that occurs when mammalian cells are stored in a liquid (Patent Documents 1 and 2). However, it has not been known so far that the combined use of acarbose and dextran improves such inhibitory effect.

特開２０１２－１１５２５３号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2012-11253 国際公開第２０１４／２０８０５３号パンフレットInternational Publication No. 2014/208053 Pamphlet

　本発明の課題は、哺乳動物細胞を液体中で保存したときに生じる細胞生存率低下を効果的に抑制でき、かつ、哺乳動物の生体内に投与した場合に、哺乳動物の生体に悪影響を及ぼす可能性の低い物質や、かかる物質を含む哺乳動物細胞保存用液等を提供することにある。 An object of the present invention is that the decrease in cell viability that occurs when mammalian cells are stored in a liquid can be effectively suppressed, and when administered into the living body of a mammal, it adversely affects the living body of the mammal. It is an object of the present invention to provide a substance having a low possibility, a solution for preserving mammalian cells containing such a substance, and the like.

　本発明者らは、最近、哺乳動物細胞を含む液を保存したときに生じる細胞生存率低下を、トレハロースより効率よく抑制する糖類として、アカルボースを同定している（ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／３７２２３）。そこで、アカルボースとデキストランとを併用したところ、デキストラン単独で使用した場合よりも、細胞保存液中に生じる細胞生存率低下を効果的に抑制できることを見いだすとともに、アカルボースとデキストランによる併用効果は、トレハロースとデキストランによる併用効果よりも高いことを確認し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have recently identified acarbose as a saccharide that suppresses the decrease in cell viability that occurs when a solution containing mammalian cells is stored more efficiently than trehalose (PCT / JP2019 / 37223). Therefore, when acarbose and dextran were used in combination, it was found that the decrease in cell viability that occurred in the cell preservation solution could be effectively suppressed as compared with the case where dextran was used alone, and the combined effect of acarbose and dextran was that of trehalose. It was confirmed that the combined effect of dextran was higher than that of dextran, and the present invention was completed.

　すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕アカルボース又はその塩と、デキストラン又はその塩とを含む哺乳動物細胞保存用液。
〔２〕アカルボース又はその塩と、デキストラン又はその塩とを等張液中に含む、上記〔１〕に記載の液。
〔３〕等張液が、乳酸リンゲル液である、上記〔２〕に記載の液。
〔４〕哺乳動物細胞を３～１４日間保存するための、上記〔１〕～〔３〕のいずれか１つに記載の液。
〔５〕哺乳動物細胞の生存率低下を抑制するために用いられる、上記〔１〕～〔４〕のいずれか１つに記載の液。
〔６〕哺乳動物細胞が、哺乳動物幹細胞である、上記〔１〕～〔５〕のいずれか１つに記載の液。
〔７〕哺乳動物幹細胞が、哺乳動物間葉系幹細胞である、上記〔６〕に記載の液。
〔８〕アカルボース又はその塩と、デキストラン又はその塩とを含む液中で、哺乳動物細胞を保存する工程を含む、哺乳動物細胞の保存方法。
〔９〕液が、等張液である、上記〔８〕に記載の保存方法。
〔１０〕等張液が、乳酸リンゲル液である、上記〔９〕に記載の保存方法。
〔１１〕哺乳動物細胞を３～１４日間保存することを特徴とする、上記〔８〕～〔１０〕のいずれか１つに記載の保存方法。
〔１２〕哺乳動物細胞が、哺乳動物幹細胞である、上記〔８〕～〔１１〕のいずれか１つに記載の保存方法。
〔１３〕哺乳動物幹細胞が、哺乳動物間葉系幹細胞である、上記〔１２〕に記載の保存方法。
〔１４〕アカルボース又はその塩と、デキストラン又はその塩とを含む、上記〔１〕～〔７〕のいずれか１つに記載の液を調製するための粉末製剤。 That is, the present invention is as follows.
[1] A mammalian cell preservation solution containing acarbose or a salt thereof and dextran or a salt thereof.
[2] The liquid according to the above [1], which comprises acarbose or a salt thereof and dextran or a salt thereof in an isotonic liquid.
[3] The liquid according to [2] above, wherein the isotonic liquid is Ringer's lactate liquid.
[4] The solution according to any one of the above [1] to [3] for storing mammalian cells for 3 to 14 days.
[5] The liquid according to any one of the above [1] to [4], which is used for suppressing a decrease in the survival rate of mammalian cells.
[6] The liquid according to any one of the above [1] to [5], wherein the mammalian cell is a mammalian stem cell.
[7] The liquid according to [6] above, wherein the mammalian stem cells are mammalian mesenchymal stem cells.
[8] A method for preserving mammalian cells, which comprises a step of preserving the mammalian cells in a liquid containing acarbose or a salt thereof and dextran or a salt thereof.
[9] The storage method according to [8] above, wherein the liquid is an isotonic liquid.
[10] The storage method according to [9] above, wherein the isotonic solution is Ringer's lactate solution.
[11] The storage method according to any one of the above [8] to [10], which comprises storing mammalian cells for 3 to 14 days.
[12] The storage method according to any one of the above [8] to [11], wherein the mammalian cell is a mammalian stem cell.
[13] The preservation method according to the above [12], wherein the mammalian stem cell is a mammalian mesenchymal stem cell.
[14] A powder preparation for preparing the liquid according to any one of the above [1] to [7], which comprises acarbose or a salt thereof and dextran or a salt thereof.

　また本発明の実施の他の形態として、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液を、哺乳動物細胞の移植を必要とする対象（例えば、外傷性疾患患者、組織変性疾患患者、がん患者）へ投与する工程を含む、哺乳動物細胞の移植方法；や、
アカルボース類及びデキストラン類を含む液（好ましくは、等張液）に、哺乳動物細胞を加えるか、或いは、哺乳動物細胞を含む液（好ましくは、等張液）に、アカルボース類及びデキストラン類を加えることにより、本件哺乳動物細胞保存用液を調製する工程と、調製した本件哺乳動物細胞保存用液中で、哺乳動物細胞を保存する工程と、保存した哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液を、哺乳動物細胞の移植を必要とする対象（例えば、外傷性疾患患者、組織変性疾患患者、がん患者）へ投与する工程とを含む、哺乳動物細胞の移植方法；や、
本件哺乳動物細胞保存用液の製造における、アカルボース類及びデキストラン類の使用や、液体中の哺乳動物細胞の生存率低下を抑制するための、アカルボース類及びデキストラン類の使用；や、
哺乳動物細胞移植治療を必要とする疾患（例えば、外傷性疾患、組織変性疾患、がん）の治療における使用のための、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液；や、
アカルボース類及びデキストラン類を含む液（好ましくは、等張液）に、哺乳動物細胞を加えるか、或いは、哺乳動物細胞を含む液（好ましくは、等張液）に、アカルボース類及びデキストラン類を加えることにより、本件哺乳動物細胞保存用液を調製する工程を含む、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液の調製方法；や、
哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液；
を挙げることができる。なお、上記移植方法の、哺乳動物細胞を保存する工程は、通常、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液を、当該保存用液が液体の状態で存在する温度条件下で保存するものであり、当該保存用液が固体の状態で保存する工程（例えば、凍結保存する工程、凍結乾燥保存する工程等の哺乳動物細胞を休眠状態で保存する工程）を含まない。 Further, as another embodiment of the present invention, the present mammalian cell preservation solution containing a mammalian cell is used for a subject requiring transplantation of the mammalian cell (for example, a patient with a traumatic disease, a patient with a tissue degenerative disease, a cancer). Methods of transplanting mammalian cells, including the step of administering to the patient);
Add mammalian cells to a solution containing acarboses and dextrans (preferably isotonic solution), or add acarboses and dextrans to a solution containing mammalian cells (preferably isotonic solution). Thereby, a step of preparing the present mammalian cell preservation solution, a step of preserving the mammalian cells in the prepared present mammal cell preservation solution, and a step of preserving the present mammalian cells including the preserved mammalian cells. A method for transplanting mammalian cells;
Use of acarboses and dextrans in the production of the liquid for preserving mammalian cells, and use of acarboses and dextrans to suppress a decrease in the viability of mammalian cells in the liquid;
Mammalian Cell Preservation Solution Containing Mammalian Cells for Use in the Treatment of Diseases Requiring Mammalian Cell Transplantation Treatment (eg, Traumatic Diseases, Tissue Degenerative Diseases, Cancer);
Add mammalian cells to a solution containing acarboses and dextrans (preferably isotonic solution), or add acarboses and dextrans to a solution containing mammalian cells (preferably isotonic solution). Thereby, a method for preparing the present mammalian cell preservation solution containing the mammalian cells, which comprises the step of preparing the present mammalian cell preservation solution;
Mammalian cell preservation solution containing mammalian cells;
Can be mentioned. In the step of preserving the mammalian cells in the above transplantation method, the animal cell preservation solution containing the mammalian cells is usually preserved under the temperature condition in which the preservation solution exists in a liquid state. This does not include a step of preserving the storage liquid in a solid state (for example, a step of preserving mammalian cells in a dormant state such as a step of cryopreserving and a step of cryodrying).

　本発明によると、アカルボース類及びデキストラン類を液体中に加えることにより、哺乳動物細胞を液体中に保存したときに生じる細胞生存率低下を効果的に抑制することができる。さらに、これらアカルボース類及びデキストラン類は、哺乳動物の生体内に投与した場合に、哺乳動物の生体に悪影響を及ぼす可能性の低い糖類であることから、哺乳動物細胞を本件哺乳動物細胞保存用液中で保存した後、新しい移植用液に置換することなく、そのまま哺乳動物の生体内へ投与することができる。 According to the present invention, by adding acarboses and dextrans to a liquid, it is possible to effectively suppress the decrease in cell viability that occurs when mammalian cells are stored in the liquid. Furthermore, since these acarboses and dextrans are saccharides that are unlikely to adversely affect the living body of the mammal when administered into the living body of the mammal, the mammalian cell preservation solution for the present mammal cell is used. After being stored in, it can be directly administered into the living body of a mammal without being replaced with a new transplant solution.

図１Ａは、保存前（図中の「Ｐｒｅ」）の骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ；Human Mesenchymal Stem Cell）の細胞生存率（平均値±標準偏差［ＳＤ］）を、トリパンブルー染色法により解析した結果（ｎ＝３）を示す図である。図１Ｂ～Ｃは、ｈＭＳＣを、３種類の被験用等張液（５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［図中の「ＬＲＤ」］；８８ｍＭのトレハロース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［図中の「ＬＲＤ＋Ｔ」］；並びに、８８ｍＭのアカルボース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［図中の「ＬＲＤ＋Ａ」］）中に５℃で３日間（図１Ｂ）、７日間（図１Ｃ）、及び１４日間（図１Ｄ）保存後の細胞生存率（平均値±標準偏差［ＳＤ］）を、トリパンブルー染色法により解析した結果（ｎ＝３）を示す図である。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、Tukey type多重比較検定を行い、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）ことを示す。なお、図１Ｂ～Ｄは、表１に示す結果を基に作成したものである。FIG. 1A shows the cell viability (mean ± standard deviation [SD]) of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (hMSC; Human Mesenchymal Stem Cell) before storage (“Pre” in the figure) by trypan blue staining. It is a figure which shows the result (n = 3) of the analysis by. 1B-C show hMSC in three test isotonic solutions (isotonic solution containing 5 [w / v]% dextran [“LRD” in the figure]; 88 mM trehalose and 5 [w / v]. ] 5 in isotonic solution containing% dextran [“LRD + T” in the figure]; and isotonic solution containing 88 mM acarbose and 5 [w / v]% dextran [“LRD + A” in the figure)) Results of analysis of cell viability (mean ± standard deviation [SD]) after storage at ° C. for 3 days (FIG. 1B), 7 days (FIG. 1C), and 14 days (FIG. 1D) by trypan blue staining (FIG. 1B). It is a figure which shows n = 3). “**” and “***” in the figure indicate that Tukey's type multiple comparison test is performed and there is a statistically significant difference (p <0.01 and p <0.001), respectively. Note that FIGS. 1B to 1D were created based on the results shown in Table 1. 保存前のｈＭＳＣ（図中の「ｐｒｅ」）の細胞生存率（平均値±標準偏差［ＳＤ］）と、ｈＭＳＣを８種類の被験用等張液（アカルボース及びデキストラン不含の等張液［図中の「ＬＲ」］；８８ｍＭのアカルボースを含む等張液［図中の「ＬＲ＋８８Ａ」］；５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［図中の「ＬＲＤ」］；５．５ｍＭのアカルボース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［図中の「ＬＲＤ＋５．５Ａ」］；１１ｍＭのアカルボース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［図中の「ＬＲＤ＋１１Ａ」］；２２ｍＭのアカルボース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［図中の「ＬＲＤ＋２２Ａ」］；４４ｍＭのアカルボース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［図中の「ＬＲＤ＋４４Ａ」］；並びに、８８ｍＭのアカルボース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［図中の「ＬＲＤ＋８８Ａ」］）中に５℃で７日間保存後の細胞生存率（平均値±標準偏差［ＳＤ］）を、トリパンブルー染色法により解析した結果（ｎ＝３）を示す図である。図２Ａ中の「＊」は、Studentのt検定を行い、統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５）ことを示し、図２Ｂ中の「＊」及び「＊＊＊」は、Dunnetの多重比較検定を行い、ＬＲＤに対してそれぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１）ことを示す。なお、図２Ａは、表２に示す結果を基に作成したものであり、図２Ｂは、表３に示す結果を基に作成したものである。Cell viability (mean ± standard deviation [SD]) of hMSC (“pre” in the figure) before storage and 8 types of test isotonic solution (acarbose and dextran-free isotonic solution [Fig.]] "LR" in the figure; isotonic solution containing 88 mM acarbose ["LR + 88A" in the figure]; isotonic solution containing 5 [w / v]% dextran ["LRD" in the figure]; 5.5 mM Acarbose and 5 [w / v]% dextran-containing isotonic solution [“LRD + 5.5A” in the figure]; 11 mM acarbose and 5 [w / v]% dextran-containing isotonic solution [in the figure. "LRD + 11A"]; isotonic solution containing 22 mM acarbose and 5 [w / v]% dextran [“LRD + 22A” in the figure]; isotonic solution containing 44 mM acarbose and 5 [w / v]% dextran [“LRD + 44A” in the figure]; and cell survival after storage at 5 ° C. for 7 days in an isotonic solution containing 88 mM acarbose and 5 [w / v]% dextran [“LRD + 88A” in the figure). It is a figure which shows the result (n = 3) which analyzed the rate (mean value ± standard deviation [SD]) by the tripan blue staining method. “*” In FIG. 2A indicates that there is a statistically significant difference (p <0.05) by performing Student's t-test, and “*” and “***” in FIG. 2B are Dunnet's multiple comparison test is performed to show that there are statistically significant differences (p <0.05 and p <0.001) for LRD, respectively. Note that FIG. 2A was created based on the results shown in Table 2, and FIG. 2B was created based on the results shown in Table 3.

　本発明の哺乳動物細胞保存用液は、「哺乳動物細胞を保存するため」という用途に特定された、アカルボース類及びデキストラン類を含む液（すなわち、本件哺乳動物細胞保存用液）である。 The animal cell preservation solution of the present invention is a solution containing acarboses and dextrans (that is, the present mammal cell preservation solution) specified for the purpose of "preserving mammalian cells".

　本件哺乳動物細胞保存用液としては、哺乳動物細胞の保存が可能な液（例えば、等張液、低張液、高張液）であればよく、等張液を好適に例示することができる。本明細書において「等張液」とは、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じ浸透圧を有する液を意味し、具体的には、２５０～３８０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内の浸透圧を有する液を意味する。また、本明細書において「低張液」とは、体液や細胞液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する液を意味し、具体的には、２５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の浸透圧を有する液を意味する。かかる低張液としては、細胞が破裂しない程度の低張液（具体的には、１００～２５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満の範囲内の浸透圧を有する液）が好ましい。また、本明細書において「高張液」とは、体液や細胞液の浸透圧よりも高い浸透圧を有する液を意味し、具体的には、浸透圧が３８０ｍＯｓｍ／Ｌ超（好ましくは、３８０ｍＯｓｍ／Ｌ超～１０００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内）を意味する。 The mammalian cell preservation solution may be any solution that can preserve mammalian cells (for example, isotonic solution, hypotonic solution, hypertonic solution), and the isotonic solution can be preferably exemplified. In the present specification, the "isotonic liquid" means a liquid having an osmotic pressure substantially the same as the osmotic pressure of a body fluid or a cell fluid, and specifically, a liquid having an osmotic pressure in the range of 250 to 380 mOsm / L. Means. Further, in the present specification, the “hypotonic liquid” means a liquid having an osmotic pressure lower than the osmotic pressure of a body fluid or a cell fluid, and specifically, a liquid having an osmotic pressure of less than 250 mOsm / L. do. As such a hypotonic solution, a hypotonic solution that does not cause cell rupture (specifically, a solution having an osmotic pressure within the range of 100 to 250 mOsm / L) is preferable. Further, in the present specification, the “hypertonic liquid” means a liquid having an osmotic pressure higher than the osmotic pressure of a body fluid or a cell fluid, and specifically, the osmotic pressure is more than 380 mOsm / L (preferably 380 mOsm /). It means (within the range of more than L to 1000 mOsm / L).

　上記等張液としては、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じになるようにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等によって塩濃度や糖濃度等を調整した等張液であれば特に制限されず、具体的には生理食塩水や、緩衝効果のある生理食塩水（例えば、ＰＢＳ、トリス緩衝生理食塩水［Tris Buffered Saline；ＴＢＳ］、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、５％グルコース水溶液、動物細胞培養用基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９）、等張剤（例えば、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム）等を挙げることができ、これらの中でも乳酸リンゲル液が好ましい。等張液は、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販のものとしては、大塚生食注（大塚製薬工場社製）（生理食塩液）、リンゲル液「オーツカ」（大塚製薬工場社製）（リンゲル液）、ラクテック（登録商標）注（大塚製薬工場社製）（乳酸リンゲル液）、乳酸リンゲル液「ＫＳ」（共立製薬社製）（乳酸リンゲル液）、ヴィーンＦ輸液（扶桑薬品工業社製）（酢酸リンゲル液）、大塚糖液５％（大塚製薬工場社製）（５％グルコース水溶液）、ビカネイト輸液（大塚製薬工場社製）（重炭酸リンゲル液）を挙げることができる。 The isotonic solution is not particularly limited as long as it is an isotonic solution in which the salt concentration, sugar concentration, etc. are adjusted by sodium ion, potassium ion, calcium ion, etc. so as to be substantially the same as the osmotic pressure of body fluid or cell fluid. , Specifically, physiological saline, physiological saline having a buffering effect (for example, PBS, Tris Buffered Saline; TBS, HEPES buffered saline), Ringer's solution, Ringer's lactate, Ringer's acetate, Ringer's bicarbonate solution, 5% glucose aqueous solution, basal medium for animal cell culture (eg, DMEM, EMEM, RPMI-1640, α-MEM, F-12, F-10, M-199), isotonic (eg, glucose) , D-sorbitol, D-mannitol, lactose, sodium chloride), and among these, Ringer's lactate solution is preferable. The isotonic liquid may be a commercially available product or a self-prepared product. Commercially available products include Otsuka Raw Food Injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory) (physiological saline), Ringer's solution "Otsuka" (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory) (Ringer's solution), and Lactec (registered trademark) Note (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory). (Lactated ringer solution), Lactated ringer solution "KS" (manufactured by Kyoritsu Pharmaceutical Co., Ltd.) (Lactated ringer solution), Vein F infusion solution (manufactured by Fuso Pharmaceutical Co., Ltd.) (Ringel acetate solution), Otsuka sugar solution 5% (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory) (5) % Glucose aqueous solution), Vicanate infusion solution (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory, Ltd.) (Ringel bicarbonate solution).

　上記アカルボース（Acarbose）とは、Ｄ－グルコース、Ｄ－グルコース、Ｄ－グルコース、及び(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-トリヒドロキシ-3-(ヒドロキシメチル)-2-シクロヘキセンが連なった四糖であり、より具体的には、以下の式で表される物質である。アカルボースは、化学合成、微生物による生産（例えば、アクチノプラネス［Actinoplanes］属のアミノ糖産生菌の培養）、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、アカルボース（富士フイルム和光純薬社製）、アカルボース（商品名：グルコバイ）（バイエル薬品社製）等の市販品を挙げることができる。 The above-mentioned acarbose is D-glucose, D-glucose, D-glucose, and (1S, 4R, 5S, 6S) -4,5,6-trihydroxy-3- (hydroxymethyl) -2-cyclohexene. It is a tetrasaccharide in which is connected, and more specifically, it is a substance represented by the following formula. Acarbose can be produced by any known method such as chemical synthesis, production by microorganisms (for example, culture of amino sugar-producing bacteria of the genus Actinoplanes), production by enzymes, etc., but commercially available products are used. You can also do it. For example, commercially available products such as acarbose (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and acarbose (trade name: Glucobay) (manufactured by Bayer Pharmaceutical Co., Ltd.) can be mentioned.

　上記アカルボースの塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩；ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩；などを挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用は、アカルボースと同効なものが好ましい。これらの塩類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。 Examples of the salt of acarbose include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate, acetate, propionate, toluenesulfonate, succinate, and shu. Acid addition salts such as acid salts, lactates, tartrates, glycolates, methanesulfonates, butyrates, valerates, citrates, fumarates, maleates, malates; sodium salts, potassium Metal salts such as salts and calcium salts; ammonium salts, alkylammonium salts; and the like can be mentioned. In addition, these salts are used as a solution at the time of use, and the action thereof is preferably the same as that of acarbose. These salts may form a hydrate or a solvate, and either one may be used alone or two or more thereof may be used in combination as appropriate.

　本発明において、アカルボース類の濃度としては、アカルボース類による細胞生存率低下の抑制効果が発揮される濃度であればよく、例えば、少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ等である。また、費用対効果の面から、等張液中のアカルボース類の濃度は、例えば、１０００ｍＭ以下、好ましくは７００ｍＭ以下、より好ましくは６００ｍＭ以下、さらに好ましくは５００ｍＭ以下、さらにより好ましくは４５０ｍＭ以下、最も好ましくは４００ｍＭである。したがって、等張液中のアカルボース類濃度は、例えば、０．５～１０００ｍＭの範囲内、好ましくは１～７００ｍＭ、より好ましくは２～６００ｍＭ、さらに好ましくは３ｍ～５００ｍＭ、さらにより好ましくは４～４５０ｍＭ、最も好ましくは５～４００ｍＭである。 In the present invention, the concentration of acarboses may be any concentration as long as it exerts the effect of suppressing the decrease in cell viability due to acarboses, for example, at least 0.5 mM, at least 1 mM, at least 2 mM, at least 3 mM, at least 4 mM. At least 5 mM and the like. From the viewpoint of cost effectiveness, the concentration of acarbose in the isotonic solution is, for example, 1000 mM or less, preferably 700 mM or less, more preferably 600 mM or less, still more preferably 500 mM or less, still more preferably 450 mM or less, most preferably. It is preferably 400 mM. Therefore, the concentration of acarbose in the isotonic solution is, for example, in the range of 0.5 to 1000 mM, preferably 1 to 700 mM, more preferably 2 to 600 mM, still more preferably 3 m to 500 mM, still more preferably 4 to 450 mM. , Most preferably 5 to 400 mM.

　上記デキストランとしては、Ｄ－グルコースからなる多糖（Ｃ_６Ｈ_１０Ｏ_５）_ｎであって、α１→６結合を主鎖とするもの又はその誘導体であれば特に制限されず、ここで誘導体としては、例えば、デキストラン硫酸、カルボキシル化デキストラン［例えば、カルボキシメチルデキストラン］、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－デキストラン、ヒドロキシプロピルトリアンモニウムデキストラン等を挙げることができる。デキストランの重量平均分子量（Ｍｗ）としては、例えば、デキストラン４０（Ｍｗ＝４００００）、デキストラン７０（Ｍｗ＝７００００）等を挙げることができる。これらデキストランは、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法で製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、低分子デキストランＬ注(大塚製薬工場社製、１００ｇ／Ｌ　デキストラン４０、０．２ｇ／Ｌ　塩化カルシウム水和物、０．３ｇ／Ｌ　塩化カリウム、６．０ｇ／Ｌ　塩化ナトリウム、３．１ｇ／Ｌ　Ｌ－乳酸ナトリウム)、デキストラン７０（東京化成工業社製）、ＤＥＡＥ－デキストラン（MP Biomedicals社製）、カルボキシメチルデキストランナトリウム（Sigma-Aldrich社製）等の市販品を挙げることができる。 The dextran is not particularly limited as long as it is a polysaccharide (C ₆ H ₁₀ O ₅ ) _n composed of D-glucose and has an α1 → 6 bond as a main chain or a derivative thereof, and the derivative here is not particularly limited. For example, dextran sulfate, carboxylated dextran [for example, carboxymethyl dextran], diethylaminoethyl (DEAE) -dextran, hydroxypropyltriammonium dextran and the like can be mentioned. Examples of the weight average molecular weight (Mw) of dextran include dextran 40 (Mw = 40,000) and dextran 70 (Mw = 70000). These dextran can be produced by any known method such as chemical synthesis, production by microorganisms, production by enzymes, etc., but commercially available products can also be used. For example, low molecular weight dextran L injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory, 100 g / L dextran 40, 0.2 g / L calcium chloride hydrate, 0.3 g / L potassium chloride, 6.0 g / L sodium chloride 3.1 g / LL-Sodium Lactate), Dextran 70 (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.), DEAE-Dextran (manufactured by MP Biomedicals), Sodium Carboxymethyl Dextran (manufactured by Sigma-Aldrich) and other commercially available products can be mentioned.

　上記デキストランの塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などを挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用は、デキストランの場合と同効なものが好ましい。これらの塩類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。 Examples of the dextran salt include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate, acetate, propionate, toluenesulfonate, succinate, and oxalic acid. Acid addition salts such as salt, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, malate, sodium salt, potassium Examples thereof include metal salts such as salts and calcium salts, ammonium salts and alkylammonium salts. In addition, these salts are used as a solution at the time of use, and it is preferable that the action is the same as that of dextran. These salts may form a hydrate or a solvate, and either one may be used alone or two or more thereof may be used in combination as appropriate.

　本発明において、デキストラン類の濃度としては、デキストラン類による細胞生存率低下の抑制効果が発揮される濃度であればよく、例えば、デキストラン換算で０．１（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．３（ｗ／ｖ）％以上、より好ましくは０．６（ｗ／ｖ）％以上、さらに好ましくは１（ｗ／ｖ）％以上、さらにより好ましくは２（ｗ／ｖ）％以上、最も好ましくは４（ｗ／ｖ）％以上である。また、細胞への悪影響を回避する観点から、例えば、デキストラン換算で５０（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは２０（ｗ／ｖ）％以下、より好ましくは１５（ｗ／ｖ）％以下、さらに好ましくは１２％（ｗ／ｖ）％以下、さらにより好ましくは９％（ｗ／ｖ）％以下、最も好ましくは７（ｗ／ｖ）％以下である。したがって、等張液中のデキストラン類の濃度としては、例えば、デキストラン換算で０．１～５０（ｗ／ｖ）％の範囲内、好ましくは０．３～２０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．６～１５（ｗ／ｖ）％、さらに好ましくは１～１２（ｗ／ｖ）％、さらにより好ましくは２～９（ｗ／ｖ）％、最も好ましくは４～７（ｗ／ｖ）％である。 In the present invention, the concentration of dextran may be any concentration as long as it exerts the effect of suppressing the decrease in cell viability due to dextran, for example, 0.1 (w / v)% or more, preferably 0 in terms of dextran. .3 (w / v)% or more, more preferably 0.6 (w / v)% or more, still more preferably 1 (w / v)% or more, even more preferably 2 (w / v)% or more, most It is preferably 4 (w / v)% or more. Further, from the viewpoint of avoiding adverse effects on cells, for example, in terms of dextran, 50 (w / v)% or less, preferably 20 (w / v)% or less, more preferably 15 (w / v)% or less, and further. It is preferably 12% (w / v)% or less, even more preferably 9% (w / v)% or less, and most preferably 7 (w / v)% or less. Therefore, the concentration of dextran in the isotonic solution is, for example, in the range of 0.1 to 50 (w / v)% in terms of dextran, preferably 0.3 to 20 (w / v)%, more preferably. Is 0.6 to 15 (w / v)%, more preferably 1 to 12 (w / v)%, even more preferably 2 to 9 (w / v)%, and most preferably 4 to 7 (w / v). )%.

　本件哺乳動物細胞保存用液は、哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液が液体の状態で存在する温度条件下で任意の期間保存するために用いるものである。本件哺乳動物細胞保存用液中に含まれるアカルボース類及びデキストラン類は、哺乳動物細胞を液体中で保存したときに生じる細胞生存率低下を効果的に抑制する作用を有し、かつ、哺乳動物の生体内に投与した場合に、哺乳動物の生体に悪影響を及ぼす可能性の低い物質である。このため、本件哺乳動物細胞保存用液は、「哺乳動物細胞の生存率低下を抑制するため」という用途；及び／又は「哺乳動物細胞を移植するため」という用途；にさらに特定されたものが好ましい。 The Mammalian Cell Preservation Solution is used for preserving mammalian cells for an arbitrary period under temperature conditions in which the Mammalian Cell Preservation Solution containing the mammalian cells exists in a liquid state. The acarboses and dextrans contained in the Mammalian Cell Preservation Solution have the effect of effectively suppressing the decrease in cell viability that occurs when mammalian cells are stored in the solution, and also have the effect of suppressing the decrease in cell viability. It is a substance that is unlikely to have an adverse effect on the living body of mammals when administered in vivo. For this reason, the Mammalian Cell Preservation Solution is further specified for the purpose of "suppressing the decrease in the viability of the mammalian cell"; and / or the use of "for transplanting the mammalian cell". preferable.

　本件哺乳動物細胞保存用液は、アカルボース類及びデキストラン類以外にも、哺乳動物細胞の生存率低下抑制作用を有する成分を含むものであってもよいが、アカルボース類及びデキストラン類だけでも、哺乳動物細胞の生存率低下抑制効果を発揮するため、アカルボース類及びデキストラン類以外に、哺乳動物細胞の生存率低下抑制作用を有する成分（例えば、トレハロース、ヒドロキシエチルスターチ［Hydroxyethyl starch；ＨＥＳ］、グルコース）を含まないものであってもよい。 In addition to acarboses and dextrans, the mammalian cell preservation solution may contain a component having an inhibitory effect on the decrease in the viability of mammalian cells, but the acarboses and dextran alone may be used for mammals. In addition to acarboses and dextrans, components having an inhibitory effect on the decrease in the viability of mammalian cells (for example, trehalose, hydroxyethyl starch [HES], glucose) are used to exert the effect of suppressing the decrease in the viability of the cells. It may not be included.

　本件哺乳動物細胞保存用液は、通常、哺乳動物細胞を凍結保存又は凍結乾燥保存したときの哺乳動物細胞の生存率低下を抑制する作用を有する成分、例えば、ジメチルスルホキシド［Dimethyl sulfoxide；ＤＭＳＯ］、グリセリン、エチレングリコール、トリメチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］、ポリビニルピロリドン、血清又は血清由来成分（例えば、アルブミン）等の凍結保護剤又は凍結乾燥保護剤を含まないものであってもよい。 The present mammalian cell preservation solution is usually a component having an action of suppressing a decrease in the viability of mammalian cells when the mammalian cells are cryopreserved or cryopreserved, for example, dimethylsulfoxide [DMSO],. It may be free of cryoprotectants such as glycerin, ethylene glycol, trimethylene glycol, dimethylacetamide, polyethylene glycol [PEG], polyvinylpyrrolidone, serum or serum-derived components (eg, albumin) or cryoprotectants. ..

　本件哺乳動物細胞保存用液としては、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液をそのまま移植に用いる場合、哺乳動物細胞移植に適した液が好ましく、かかる哺乳動物細胞移植に適した液は、哺乳動物細胞移植に適さない物質、例えば、生体由来の成分（例えば、血清又は血清由来成分［例えば、アルブミン］）や、前述の凍結保護剤又は凍結乾燥保護剤を含まないことが好ましい。 As the animal cell preservation solution, when the mammalian cell preservation solution containing mammalian cells is used as it is for transplantation, a solution suitable for mammalian cell transplantation is preferable, and a solution suitable for such mammalian cell transplantation is preferable. , It is preferable that the substance not suitable for mammalian cell transplantation, for example, a biological component (for example, serum or a serum-derived component [for example, albumin]) or the above-mentioned cryoprotectant or cryoprotectant is not contained.

　本件哺乳動物細胞保存用液としては、アカルボース類及びデキストラン類から選択される２種類以上の糖を含む液や、アカルボース類及びデキストラン類以外に、さらに任意成分を含む液であってもよい。 The mammalian cell preservation solution may be a solution containing two or more kinds of sugars selected from acarboses and dextrans, and a solution containing any component in addition to acarboses and dextrans.

　本明細書において「任意成分」としては、例えば、等張剤（例えば、グルコース、ソルビトール、マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、サリチレート）、溶解補助剤、保存剤、酸化防止剤、アミノ酸（例えば、プロリン、グルタミン）、ポリマー（例えば、ポリエーテル）、リン脂質（例えば、リゾホスファチジン酸［ＬＰＡ；Lysophosphatidic acid］）を挙げることができる。本明細書において「任意成分」とは、含んでもよいし含まなくてもよい成分のことを意味する。
　また、本発明には、アカルボース類及びデキストラン類を含む、本件哺乳動物細胞保存用液を調製するための粉末製剤が含まれる。当該粉末製剤には上記の任意成分を含んでいてもよい。 In the present specification, "optional component" includes, for example, isotonic agents (for example, glucose, sorbitol, mannitol, lactose, sodium chloride), chelating agents (for example, EDTA, EGTA, citric acid, salicylate), solubilizing agents, and the like. Preservatives, antioxidants, amino acids (eg, proline, glutamine), polymers (eg, polyether), phospholipids (eg, lysophosphatidic acid [LPA]) can be mentioned. As used herein, the term "arbitrary component" means a component that may or may not be contained.
In addition, the present invention includes a powder preparation for preparing the present mammalian cell preservation solution containing acarboses and dextrans. The powder formulation may contain the above-mentioned optional components.

　本発明の哺乳動物細胞の保存方法は、アカルボース類及びデキストラン類を含む液（すなわち、本件哺乳動物細胞保存用液）中で、哺乳動物細胞を任意の期間保存する工程を含むもの（以下、「本件保存方法」ということがある）である。本件保存方法は、通常、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液を、当該保存用液が液体の状態で存在する温度条件下で保存するものであり、当該保存用液が固体の状態で存在する温度条件下で保存する工程（例えば、凍結保存する工程、凍結乾燥保存する工程等の哺乳動物細胞を休眠状態で保存する工程）を含まない。また、本件哺乳動物細胞保存用液中の哺乳動物細胞の密度は、例えば、１０^３～１０^１０個／ｍＬの範囲内である。 The method for preserving mammalian cells of the present invention includes a step of preserving mammalian cells for an arbitrary period in a solution containing acarboses and dextrans (that is, the solution for preserving mammalian cells of the present invention) (hereinafter, "" This is sometimes called "the storage method"). The preservation method is usually to preserve the mammalian cell preservation solution containing the mammalian cells under the temperature condition in which the preservation solution exists in a liquid state, and the preservation solution is in a solid state. It does not include a step of preserving under the temperature conditions existing in (for example, a step of preserving mammalian cells in a dormant state such as a step of cryopreserving and a step of cryodrying). The density of mammalian cells in the Mammalian Cell Preservation Solution is, for example, in ^{the range of 10 3} to 10 ¹⁰ cells / mL.

　本件保存方法としては、本件哺乳動物細胞保存用液中で哺乳動物細胞を保存する前に、アカルボース類及びデキストラン類を含む液（好ましくは、等張液）に、哺乳動物細胞を加えるか、或いは、哺乳動物細胞を含む液（好ましくは、等張液）に、アカルボース類及びデキストラン類を加えることにより、アカルボース類及びデキストラン類を含む液を調製する工程を、さらに含むものであってもよい。 As the preservation method, before storing the mammalian cells in the mammalian cell preservation solution, the mammalian cells are added to a solution containing acarboses and dextrans (preferably an isotonic solution), or the mammalian cells are added. , A step of preparing a solution containing acarboses and dextrans by adding acarboses and dextrans to a solution containing mammalian cells (preferably an isotonic solution) may be further included.

　本発明において、哺乳動物細胞を保存する任意の期間としては、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液を液体の状態で保存したときに、当該保存用液中の哺乳動物細胞の細胞生存率低下を抑制し、生細胞の割合を高めることができる期間が好ましく、例えば、６時間以上、１２時間以上、２４時間（１日）以上、３６時間（１．５日）以上、４８時間（２日）以上、６０時間（２．５日）、３日以上であり、また、哺乳動物細胞の保存期間が長すぎると細胞の生存に悪影響を及ぼす可能性があるため、細胞の生存率への悪影響を回避する観点から、通常は３０日以下、好ましくは２０日以下、より好ましくは１６日以下、さらに好ましくは１４日以下である。したがって、上記任意の保存期間としては、通常、６時間～３０日の範囲内、１２時間～３０日の範囲内、２４時間～３０日の範囲内、３６時間～３０日の範囲内、４８時間～３０日の範囲内、６０時間～３０日、又は３～３０日の範囲内であり、好ましくは、６時間～２０日、１２時間～２０日、２４時間～２０日、３６時間～２０日、４８時間～２０日、６０時間～２０日、又は３～２０日であり、より好ましくは、６時間～１６日、１２時間～１６日、２４時間～１６日、３６時間～１６日、４８時間～１６日、６０時間～１６日であり、さらに好ましくは、６時間～１４日、１２時間～１４日、２４時間～１４日、３６時間～１４日、４８時間～１４日、６０時間～１４日、又は３～１４日である。 In the present invention, as an arbitrary period for storing mammalian cells, when the present mammalian cell preservation solution containing the mammalian cells is stored in a liquid state, the cell survival of the mammalian cells in the preservation solution A period during which the rate decrease can be suppressed and the proportion of living cells can be increased is preferable, for example, 6 hours or more, 12 hours or more, 24 hours (1 day) or more, 36 hours (1.5 days) or more, 48 hours ( 2 days) or more, 60 hours (2.5 days), 3 days or more, and if the storage period of mammalian cells is too long, it may adversely affect the survival of the cells. From the viewpoint of avoiding the adverse effects of the above, it is usually 30 days or less, preferably 20 days or less, more preferably 16 days or less, still more preferably 14 days or less. Therefore, the above-mentioned arbitrary storage period is usually within the range of 6 hours to 30 days, within the range of 12 hours to 30 days, within the range of 24 hours to 30 days, within the range of 36 hours to 30 days, and 48 hours. Within the range of ~ 30 days, 60 hours to 30 days, or 3 to 30 days, preferably 6 hours to 20 days, 12 hours to 20 days, 24 hours to 20 days, 36 hours to 20 days. , 48 hours to 20 days, 60 hours to 20 days, or 3 to 20 days, more preferably 6 hours to 16 days, 12 hours to 16 days, 24 hours to 16 days, 36 hours to 16 days, 48. Hours to 16 days, 60 hours to 16 days, more preferably 6 hours to 14 days, 12 hours to 14 days, 24 hours to 14 days, 36 hours to 14 days, 48 hours to 14 days, 60 hours to 14 days, or 3-14 days.

　本発明において、「哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液が液体の状態で存在する温度」としては、哺乳動物細胞を含む本件哺乳動物細胞保存用液が、凍結せずに液体の状態で存在し、かつ当該保存用液中の哺乳動物細胞が生育可能な温度であればよく、通常０～４０℃の範囲内、好ましくは０～３０℃（室温）の範囲内である。 In the present invention, the "temperature at which the animal cell preservation solution containing the mammalian cells exists in a liquid state" is defined as the state in which the mammalian cell preservation solution containing the mammalian cells is in a liquid state without freezing. It suffices as long as it exists at a temperature at which the mammalian cells in the storage solution can grow, and is usually in the range of 0 to 40 ° C., preferably in the range of 0 to 30 ° C. (room temperature).

　本発明の哺乳動物細胞としては、例えば、哺乳動物細胞移植治療を必要とする疾患（がん；Ｉ型糖尿病；肝疾患等の臓器疾患；など）に対する再生医療において、血管経由で投与される哺乳動物細胞、具体的には、幹細胞；膵島細胞；肝細胞；白血球（例えば、樹状細胞、リンパ球細胞、マクロファージ、好中球、好酸球）；等を例示することができ、好ましくは、幹細胞、リンパ球細胞、又は肝細胞である。ここで「リンパ球細胞」とは、哺乳動物細胞の免疫系における白血球のサブタイプの１つであり、抗原を認識し、免疫能を有する細胞を意味する。リンパ球細胞には、具体的には、Ｔ細胞（例えば、アルファ・ベータ［αβ］Ｔ細胞、ガンマ・デルタ［γδ］Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞［cytotoxic T lymphocyte；ＣＴＬ］、ヘルパーＴ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。 The mammalian cells of the present invention include, for example, mammals administered via blood vessels in regenerative medicine for diseases requiring mammalian cell transplantation treatment (cancer; type I diabetes; organ diseases such as liver disease; etc.). Animal cells, specifically stem cells; pancreatic islet cells; hepatocytes; leukocytes (eg, dendritic cells, lymphocyte cells, macrophages, neutrophils, eosinophils); etc. can be exemplified, preferably. Stem cells, lymphocyte cells, or hepatocytes. Here, "lymphocyte cell" is one of the subtypes of leukocytes in the immune system of mammalian cells, and means a cell that recognizes an antigen and has immunity. Specific examples of lymphocytes include T cells (for example, alpha beta [αβ] T cells, gamma delta [γδ] T cells, cytotoxic T cells [cytotoxic T lymphocytes; CTL], and helper T cells. ), B cells, and natural killer (NK) cells.

　上記哺乳動物細胞は、公知の一般的な方法で単離することができる。例えば、白血球や、白血球に包含されるリンパ球細胞（例えば、Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、γδＴ細胞）は、溶血処理した末梢血又は臍帯血試料から、必要に応じて、ＩＬ－２や抗ＣＤ３抗体の存在下で拡大培養した後、白血球の細胞表面マーカー（ＣＤ４５）、Ｔ細胞の細胞表面マーカー（ＣＤ３）、ヘルパーＴ細胞の細胞表面マーカー（ＣＤ４）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）、γδＴ細胞の細胞表面マーカー（ＣＤ３９）に対する抗体を用いた蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）や、蛍光物質やビオチン、アビジン等の標識物質で標識した上記細胞表面マーカーに対する抗体と、かかる標識物質に対する抗体とＭＡＣＳビーズ（磁性ビーズ）とのコンジュゲート抗体とを用いた自動磁気細胞分離装置（ａｕｔｏＭＡＣＳ）により、それぞれのマーカーが陽性の細胞として単離することができる。上記蛍光物質としては、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＰＥ－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＰＥ－Ｃｙ５、ＰＥ－Ｃｙ７等を挙げることができる。 The mammalian cells can be isolated by a known general method. For example, leukocytes and lymphocyte cells contained in leukocytes (eg, T cells, helper T cells, cytotoxic T cells, γδ T cells) can be obtained from hemolytically treated peripheral blood or umbilical cord blood samples as needed. After expansion culture in the presence of IL-2 or anti-CD3 antibody, leukocyte cell surface marker (CD45), T cell cell surface marker (CD3), helper T cell cell surface marker (CD4), cytotoxic T cell A fluorescent activated cell sorter (FACS) using an antibody against a cell (CD8) or γδT cell cell surface marker (CD39), or an antibody against the above cell surface marker labeled with a fluorescent substance or a labeling substance such as biotin or avidin. Each marker can be isolated as a positive cell by an automatic magnetic cell separator (autoMACS) using an antibody against a labeling substance and a conjugate antibody of MACS beads (magnetic beads). Examples of the fluorescent substance include allophycocyanin (APC), phycocyanin (PE), FITC (fluorescein isothiocyanate), Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, PE-Texas Red, PE-Cy5, PE-Cy7 and the like. be able to.

　また上記「幹細胞」とは、自己複製能及び分化・増殖能を有する未熟な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem ce11）、複能性幹細胞（multipotent stem ce11）、単能性幹細胞（unipotent stem ce11）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、それ自体では個体になることができないが、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。 The above-mentioned "stem cell" means an immature cell having self-renewal ability and differentiation / proliferation ability. Stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells (pluripotent stem ce11), multipotent stem cells (multipotent stem ce11), and monopotent stem cells (unipotent stem ce11), depending on their ability to differentiate. Pluripotent stem cells mean cells that cannot become individuals by themselves, but have the ability to differentiate into all the tissues and cells that make up the living body. Multipotent stem cells mean cells that have the ability to differentiate into multiple types of tissues and cells, but not all types. A monopoly stem cell means a cell having the ability to differentiate into a specific tissue or cell.

　多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（Embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、ＥＧ細胞（Embryonic germ cell）、誘導多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）等を挙げることができる。ＥＳ細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はＬＩＦを含む培地中で培養することにより製造することができる。ＥＳ細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することができる（Ce11,70:841-847,1992）。ｉＰＳ細胞は、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（必要に応じて更にｃ－Ｍｙｃ又はｎ－Ｍｙｃ）等のリプログラミング因子を導入することにより製造することができる（Ce11,126:p.663-676,2006;Nature,448:p.313-317,2007;Nat Biotechno1,26;p,101-106,2008;Cel1 131:p.861‐872,2007;Science,318:p.1917-1920,2007;Ce11 Stem Cells 1:p.55-70,2007;Nat Biotechnol,25:p.1177-1181,2007;Nature,448:p.318-324,2007;Cell Stem Cells 2:p.10-12,2008;Nature 451:p.141-146,2008;Science,318:p.1917-1920,2007）。体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞としてまた好ましい（Nature,385,810（1997）；Science,280,1256（1998）；Nature Biotechnology,17,456（1999）；Nature,394,369（1998）；Nature Genetics,22,127（1999）；Proc.Nat1. Acad.Sci.USA,96,14984（1999））、Rideout IIIら（Nature Genetics,24,109（2000））。 Examples of pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), EG cells (Embryonic germ cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like. ES cells can be produced by culturing the inner cell mass on feeder cells or in a medium containing LIF. Methods for producing ES cells are described in, for example, WO96 / 22362, WO02 / 10157, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 and the like. EG cells can be produced by culturing primordial germ cells in a medium containing mSCF, LIF and bFGF (Ce11, 70: 841-847, 1992). iPS cells are produced by introducing reprogramming factors such as Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 (and, if necessary, c-Myc or n-Myc) into somatic cells (eg, fibroblasts, skin cells, etc.). Can be (Ce11,126: p.663-676,2006; Nature, 448: p.313-317,2007; Nat Biotechno1,26; p, 101-106, 2008; Cel1 131: p.861-872, 2007; Science, 318: p.1917-1920,2007; Ce11 Stem Cells 1: p.55-70,2007; Nat Biotechnol, 25: p.1177-1181,2007; Nature, 448: p.318-324, 2007; Cell Stem Cells 2: p.10-12,2008; Nature 451: p.141-146,2008; Science, 318: p.1917-1920,2007). Stem cells established by culturing early embryos produced by somatic cell nuclear transfer are also preferred as pluripotent stem cells (Nature, 385,810 (1997); Science, 280,1256 (1998); Nature. Biotechnology, 17,456 (1999); Nature, 394,369 (1998); Nature Genetics, 22,127 (1999); Proc.Nat1. Acad.Sci.USA, 96,14984 (1999)), Rideout III et al. (Nature Genetics, 24,109 (2000)) )).

　複能性幹細胞としては、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等の細胞に分化可能な間葉系幹細胞、白血球、赤血球、血小板等の血球系細胞に分化可能な造血系幹細胞、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト等の細胞に分化可能な神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞等の体性幹細胞等を挙げることができる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞の全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞を意味する。複能性幹細胞は、自体公知の方法により、生体から単離することができる。例えば、間葉系幹細胞は、哺乳動物の骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血等から公知の一般的な方法で採取することができる。例えば、骨髄穿刺後の造血幹細胞等の培養、継代によりヒト間葉系幹細胞を単離することができる（Journal of Autoimmunity，30（2008）163-171）。複能性幹細胞は、上記多能性幹細胞を適切な誘導条件下で培養することによっても得ることができる。 The pluripotent stem cells include mesenchymal stem cells capable of differentiating into cells such as fat cells, bone cells, chondrocytes, and fat cells, hematopoietic stem cells capable of differentiating into hematogenous cells such as leukocytes, erythrocytes, and platelets, and neurons. Examples thereof include neural stem cells capable of differentiating into cells such as astrosites and oligodendrocytes, somatic stem cells such as bone marrow stem cells and germ stem cells. Multipotent stem cells are preferably mesenchymal stem cells. Mesenchymal stem cells mean stem cells capable of differentiating into all or some of osteoblasts, chondroblasts and lipoblasts. Multipotent stem cells can be isolated from living organisms by methods known per se. For example, mesenchymal stem cells can be collected from mammalian bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, cord blood and the like by a known general method. For example, human mesenchymal stem cells can be isolated by culturing and subculturing hematopoietic stem cells after bone marrow aspiration (Journal of Autoimmunity, 30 (2008) 163-171). Pluripotent stem cells can also be obtained by culturing the pluripotent stem cells under appropriate inducing conditions.

　本発明の哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を例示することができ、中でも、マウス、ブタ、ヒトを好適に例示することができる。 Mammals of the present invention include rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, rabbits such as rabbits, ungulates such as pigs, cows, goats, horses and sheep, and cats such as dogs and cats. Primates such as humans, monkeys, ungulates, unculates, marmosets, orangutans, and chimpanzees can be exemplified, and among them, mice, pigs, and humans can be preferably exemplified.

　本発明の哺乳動物細胞として、付着性（「接着性」ともいう）の細胞を例示することができる。本明細書中、「付着性」細胞とは、足場に接着することで生存、増殖、物質の生産を行なうことができる足場依存性の細胞を意味する。付着性幹細胞としては、例えば、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞等を挙げることができ、間葉系幹細胞を好適に例示することができる。 As the mammalian cell of the present invention, an adherent (also referred to as “adhesive”) cell can be exemplified. As used herein, "adhesive" cells mean scaffold-dependent cells that can survive, proliferate, and produce substances by adhering to the scaffold. Examples of the adherent stem cells include pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, bone marrow stem cells, reproductive stem cells, and the like, and mesenchymal stem cells can be preferably exemplified.

　本発明の哺乳動物細胞（集団）は、生体内から分離されたものであっても、インビトロで継代培養されたものであってもよいが、単離又は精製されていることが好ましい。本明細書中、「単離又は精製」とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製された哺乳動物細胞の純度（全細胞数に対する、哺乳動物幹細胞数等の目的とする細胞の割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば１００％）である。 The mammalian cell (population) of the present invention may be isolated from the living body or subcultured in vitro, but is preferably isolated or purified. In the present specification, "isolation or purification" means that an operation for removing a component other than the target component has been performed. The purity of isolated or purified mammalian cells (ratio of target cells such as the number of mammalian stem cells to the total number of cells) is usually 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more. More preferably, it is 90% or more (for example, 100%).

　本件哺乳動物細胞保存用液中に保存する哺乳動物細胞（集団）は、単一細胞（シングルセル）の状態であってもよい。本明細書において、「単一細胞の状態」とは、他の細胞と寄り集まって塊を形成していないこと（即ち、凝集していない状態）を意味する。単一細胞の状態の哺乳動物細胞は、インビトロで培養した哺乳動物細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ等で酵素処理することにより調製することができる。哺乳動物細胞中に含まれる単一細胞の状態の哺乳動物細胞の割合は、例えば７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上（例えば１００％）である。単一細胞の状態の細胞の割合は、哺乳動物細胞をＰＢＳ中に分散させ、これを顕微鏡下で観察し、無作為に選択された複数個（例えば、１０００個）の細胞について凝集の有無を調べることにより決定することができる。 The mammalian cells (population) stored in the mammalian cell preservation solution may be in the state of a single cell (single cell). As used herein, the term "single cell state" means that it does not gather together with other cells to form a mass (that is, a state in which it does not aggregate). Mammalian cells in the single cell state can be prepared by enzymatically treating mammalian cells cultured in vitro with trypsin / EDTA or the like. The proportion of mammalian cells in a single cell state contained in mammalian cells is, for example, 70% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 99% or more (for example, 100%). be. The percentage of cells in the single cell state is the presence or absence of aggregation of mammalian cells dispersed in PBS and observed under a microscope for a plurality of randomly selected cells (eg, 1000). It can be determined by examining.

　本件哺乳動物細胞保存用液中に保存する哺乳動物細胞（集団）は、浮遊していてもよい。本明細書において、「浮遊」とは、哺乳動物細胞が、保存用液を収容した容器の内壁に接触することなく、液中に保持されていることをいう。 The mammalian cells (population) stored in the mammalian cell preservation solution may be suspended. As used herein, the term "floating" means that mammalian cells are retained in the liquid without contacting the inner wall of the container containing the storage liquid.

　本件哺乳動物細胞保存用液中に保存した哺乳動物細胞が、凝集又は沈殿している場合、移植前にピペッティングやタッピング等の当該技術分野における周知の方法により哺乳動物細胞を懸濁することが好ましい。 When the mammalian cells stored in the Mammalian Cell Preservation Solution are aggregated or precipitated, the Mammalian cells can be suspended by a well-known method in the art such as pipetting or tapping before transplantation. preferable.

　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.

　本発明者らは、これまでに、哺乳動物細胞を含む液中にデキストランを添加すると、溶液の状態で保存したときの細胞生存率低下を抑制できることを報告している（特開２０１２－１１５２５３号公報、国際公開第２０１４／２０８０５３号パンフレット）。また、最近、本発明者らは、９３種類の糖類の中から、哺乳動物細胞を含む液を保存したときに生じる細胞生存率低下を抑制するものをスクリーニングした結果、アカルボースを同定している（ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／３７２２３）。そこで、アカルボースとデキストランとの併用による、細胞生存率低下の抑制効果を検討した。 The present inventors have previously reported that the addition of dextran in a solution containing mammalian cells can suppress a decrease in cell viability when stored in a solution state (Japanese Patent Laid-Open No. 2012-115253). Gazette, International Publication No. 2014/208053 Pamphlet). In addition, recently, the present inventors have identified acarbose as a result of screening among 93 types of saccharides that suppress the decrease in cell viability that occurs when a solution containing mammalian cells is stored (). PCT / JP2019 / 37223). Therefore, the effect of the combined use of acarbose and dextran to suppress the decrease in cell viability was investigated.

［実施例１］
１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　５（ｗ／ｖ）％のデキストランを含む等張液は、低分子デキストランＬ注（１０［ｗ／ｖ］％デキストラン含有ラクテック注）（大塚製薬工場社製）と、ラクテック注（大塚製薬工場社製）とを、１：１の割合で混合することにより調製した。また、８８ｍＭのトレハロース及び５（ｗ／ｖ）％のデキストランを含む等張液は、下記のとおり調製した。５（ｗ／ｖ）％のデキストランを含む等張液に、トレハロース（林原社製）を最終濃度が８８ｍＭとなるように添加・融解することにより調製した。また、８８ｍＭのアカルボース及び５（ｗ／ｖ）％のデキストランを含む等張液は、下記のとおり調製した。５（ｗ／ｖ）％のデキストランを含む等張液に、アカルボース（富士フイルム和光純薬社製）を最終濃度が８８ｍＭとなるように添加・融解することにより調製した。 [Example 1]
1. 1. Materials and methods [Preparation of isotonic solution for test]
Isotonic solutions containing 5 (w / v)% dextran are low-molecular-weight dextran L injection (10 [w / v]% dextran-containing lactec injection) (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory) and lactec injection (Otsuka Pharmaceutical Factory). Manufactured by) and was prepared by mixing at a ratio of 1: 1. An isotonic solution containing 88 mM trehalose and 5 (w / v)% dextran was prepared as follows. It was prepared by adding and thawing trehalose (manufactured by Hayashibara Co., Ltd.) to an isotonic solution containing 5 (w / v)% dextran so that the final concentration was 88 mM. An isotonic solution containing 88 mM acarbose and 5 (w / v)% dextran was prepared as follows. It was prepared by adding and melting acarbose (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to an isotonic solution containing 5 (w / v)% dextran so that the final concentration was 88 mM.

［哺乳動物細胞］
　哺乳動物細胞は、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）（Lonza Walkersville社製）を用いた。 [Mammalian cells]
As mammalian cells, bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (hMSC) (manufactured by Lonza Walkersville) were used.

［ｈＭＳＣを含むＰＢＳの調製］
　ｈＭＳＣを含むＰＢＳは、以下の手順〔１〕～〔８〕に従って調製した。
〔１〕４～６×１０^５個のｈＭＳＣを、７５ｃｍ^２フラスコに加え、ヒト間葉系幹細胞専用培地キット（Lonza社製）(以下、「ＭＳＣ培地」という）存在下で３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて培養を行った。顕微鏡下で細胞の状態を観察し、約８０％程度コンフルエントになるまで培養した。
〔２〕ＭＳＣ培地を除き、８ｍＬのＰＢＳ（－）でｈＭＳＣをリンスした。
〔３〕ＰＢＳ（－）を除き、４ｍＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（ＣＣ－３２３２、Lonza社製）を加え、室温で５分間静置した。
〔４〕ｈＭＳＣが９０％程度剥離するまで顕微鏡下で観察しながら、ゆっくりと揺らした。
〔５〕５ｍＬのＭＳＣ培地を加え、トリプシン反応を停止させ、ピペッティングによりｈＭＳＣを回収し、５０ｍＬ遠心チューブに移した。
〔６〕６００×ｇ、５分間、室温で遠心分離を行った。
〔７〕上清（ＭＳＣ培地）を除き、７．５ｍＬのＰＢＳ（－）を加え、沈殿（ｈＭＳＣ）を懸濁した。
〔８〕細胞数を計測し、５×１０^５cells／ｍＬとなるようにＰＢＳ（－）で調整し、ｈＭＳＣを含むＰＢＳを調製した。 [Preparation of PBS containing hMSC]
PBS containing hMSC was prepared according to the following procedures [1] to [8].
[1] 4 to 6 × 10 ⁵ hMSCs were added to a 75 cm ² flask, and the temperature was 37 ° C., 5% in the presence of a medium kit for human mesenchymal stem cells (manufactured by Lonza) (hereinafter referred to as “MSC medium”). The cells were cultured in a _{CO 2 incubator.} The state of the cells was observed under a microscope, and the cells were cultured until they became about 80% confluent.
[2] The MSC medium was removed, and hMSC was rinsed with 8 mL of PBS (−).
[3] PBS (-) was removed, 4 mL of trypsin-EDTA (CC-3232, manufactured by Lonza) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
[4] The hMSC was slowly shaken while observing under a microscope until about 90% of the hMSC was exfoliated.
[5] 5 mL of MSC medium was added to stop the trypsin reaction, hMSC was collected by pipetting, and transferred to a 50 mL centrifuge tube.
[6] Centrifugation was carried out at room temperature for 5 minutes at 600 × g.
[7] The supernatant (MSC medium) was removed, 7.5 mL of PBS (−) was added, and the precipitate (hMSC) was suspended.
[8] measures the number of cells, such that the ^{5 × 10 5 cells / mL PBS} (-) prepared in, to prepare a PBS containing hMSC.

［各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存方法］
　各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存は、以下の手順〔１〕～〔２〕に従って行った。
〔１〕調製したｈＭＳＣを含むＰＢＳを、各チューブに０．５ｍＬずつ分注し、遠心分離（６００×ｇ、５分間）を行った。
〔２〕上清（ＰＢＳ）を除き、沈殿（ｈＭＳＣ）を、０．５ｍＬの各種被験用等張液で懸濁し、５℃で３日間、７日間、及び１４日間保存した。 [How to store hMSC in isotonic solutions for various tests]
The hMSC was stored in various test isotonic solutions according to the following procedures [1] and [2].
[1] The prepared PBS containing hMSC was dispensed into each tube by 0.5 mL and centrifuged (600 × g, 5 minutes).
[2] The supernatant (PBS) was removed, and the precipitate (hMSC) was suspended in 0.5 mL of various test isotonic solutions and stored at 5 ° C. for 3, 7, and 14 days.

［トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析］
　トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析は、以下の手順〔１〕～〔２〕に従って行った。
〔１〕５℃で３日間、７日間、及び１４日間保存後のｈＭＳＣを含む各種被験用等張液のそれぞれから、２０μＬ（１×１０^４cells相当）を採取し、チューブに移した後、トリパンブルー染色液（Gibco社製）２０μＬを混合した。なお、比較対照として、各種被験用等張液に懸濁する前（５℃で保存前）のｈＭＳＣを含むＰＢＳのそれぞれから、２０μＬ（１×１０^４cells相当）を採取し、チューブに移した後、トリパンブルー染色液２０μＬを混合した。
〔２〕顕微鏡下にてワンセルカウンター（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて全細胞数とトリパンブルー陽性細胞（死細胞）数の測定を行い、全細胞数に対するトリパンブルー陰性細胞の割合、すなわち、細胞生存率（％）を、式「細胞生存率（％）＝（全細胞数－死細胞数）／全細胞数×１００」を基に算出した。 [Analysis of cell viability of hMSC by trypan blue staining method]
The analysis of the cell viability of hMSC by the trypan blue staining method was performed according to the following procedures [1] to [2].
^{[1] 20 μL (equivalent to 1 × 10 4} cells) was collected from each of various test isotonic solutions containing hMSC after storage at 5 ° C. for 3, 7, and 14 days, and then transferred to a tube. 20 μL of trypan blue stain (manufactured by Gibco) was mixed. As a comparison, the respective PBS containing hMSC before (before storage at 5 ° C.) for suspending various subjects for isotonic solution, collect 20μL (1 × 10 ⁴ cells equivalent) and transferred to tubes Then, 20 μL of trypan blue staining solution was mixed.
[2] The total number of cells and the number of tripang blue positive cells (dead cells) were measured using a one-cell counter (manufactured by Biomedical Science) under a microscope, and the ratio of tripang blue negative cells to the total number of cells, that is, , Cell viability (%) was calculated based on the formula "cell viability (%) = (total number of cells-number of dead cells) / total number of cells x 100".

２．結果
　ｈＭＳＣを、アカルボース及びデキストランを含む等張液中に３～１４日間保存すると、デキストランを含む等張液中に保存した場合と比べ、細胞生存率は有意に増加することが示された（図１及び表１における「ＬＲＤ＋Ａ」と「ＬＲＤ」の比較）。また、ｈＭＳＣを、トレハロース及びデキストランを含む等張液中に３～１４日間保存すると、デキストランを含む等張液中に保存した場合と比べ、細胞生存率は増加したものの（図１及び表１における「ＬＲＤ＋Ｔ」と「ＬＲＤ」の比較）、アカルボース及びデキストランを含む等張液中にｈＭＳＣを保存した場合の方がその割合は有意に高かった（図１及び表１における「ＬＲＤ＋Ａ」と「ＬＲＤ＋Ｔ」の比較）。 2. Results It was shown that when hMSC was stored in an isotonic solution containing acarbose and dextran for 3 to 14 days, the cell viability was significantly increased as compared with the case where it was stored in an isotonic solution containing dextran (Fig.). Comparison of "LRD + A" and "LRD" in 1 and Table 1). Further, when hMSC was stored in an isotonic solution containing trehalose and dextran for 3 to 14 days, the cell viability was increased as compared with the case where it was stored in an isotonic solution containing dextran (in FIGS. 1 and 1). Comparison of "LRD + T" and "LRD"), the proportion was significantly higher when hMSC was stored in an isotonic solution containing acarbose and dextran ("LRD + A" and "LRD + T" in FIGS. 1 and 1). comparison).

　これらの結果は、細胞保存液中に生じる細胞生存率低下は、デキストラン単独で使用した場合よりも、アカルボース及びデキストランを併用した方が、効果的に抑制されることを示すとともに、その併用効果は、トレハロース及びデキストランの併用効果よりも高いことを示している。 These results indicate that the decrease in cell viability that occurs in the cell preservation solution is more effectively suppressed by the combined use of acarbose and dextran than when dextran alone is used, and the combined effect is , Trehalose and dextran are shown to be higher than the combined effect.

［実施例２］
１．材料及び方法
［被験用等張液の調製］
　８種類の被験用等張液（アカルボース及びデキストラン不含の等張液［ＬＲ］；８８ｍＭのアカルボースを含む等張液［ＬＲ＋８８Ａ］；５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［ＬＲＤ］；５．５ｍＭのアカルボース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［ＬＲＤ＋５．５Ａ］；１１ｍＭのアカルボース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［ＬＲＤ＋１１Ａ］；２２ｍＭのアカルボース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［ＬＲＤ＋２２Ａ］；４４ｍＭのアカルボース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［ＬＲＤ＋４４Ａ］；並びに、８８ｍＭのアカルボース及び５［ｗ／ｖ］％のデキストランを含む等張液［ＬＲＤ＋８８Ａ］）を調製した。具体的には、上記ＬＲは、ラクテック注（大塚製薬工場社製）を分注することにより得た。また、上記「ＬＲ＋８８Ａ」は、ラクテック注にアカルボース（富士フイルム和光純薬社製）を最終濃度が８８ｍＭとなるように添加・融解することにより調製した。また、上記「ＬＲＤ」は、低分子デキストランＬ注（１０［ｗ／ｖ］％デキストラン含有ラクテック注）（大塚製薬工場社製）と、ラクテック注（大塚製薬工場社製）を、１：１の割合で混合することにより調製した。また、上記「ＬＲＤ＋８８Ａ」は、上記のとおり調製した「ＬＲＤ」に、アカルボース（富士フイルム和光純薬社製）を最終濃度が８８ｍＭとなるように添加・融解することにより調製した。また、上記「ＬＲＤ＋４４Ａ」は、上記のとおり調製した「ＬＲＤ＋８８Ａ」及び「ＬＲＤ」を、１：１の割合で混合することにより得た。また、上記「ＬＲＤ＋２２Ａ」は、上記のとおり調製した「ＬＲＤ＋４４Ａ」及び「ＬＲＤ」を１：１の割合で混合することにより得た。また、上記「ＬＲＤ＋１１Ａ」は、上記のとおり調製した「ＬＲＤ＋２２Ａ」及び「ＬＲＤ」を、１：１の割合で混合することにより得た。また、上記「ＬＲＤ＋５．５Ａ」は、上記のとおり調製した「ＬＲＤ＋１１Ａ」及び「ＬＲＤ」を、１：１の割合で混合することにより得た。 [Example 2]
1. 1. Materials and methods [Preparation of isotonic solution for test]
Eight test isotonic solutions (acarbose and dextran-free isotonic solution [LR]; isotonic solution containing 88 mM acarbose [LR + 88A]; isotonic solution containing 5 [w / v]% dextran [LRD] ]; Isotonic solution containing 5.5 mM acarbose and 5 [w / v]% dextran [LRD + 5.5A]; isotonic solution containing 11 mM acarbose and 5 [w / v]% dextran [LRD + 11A]; Isotonic solution containing 22 mM acarbose and 5 [w / v]% dextran [LRD + 22A]; isotonic solution containing 44 mM acarbose and 5 [w / v]% dextran [LRD + 44A]; and 88 mM acarbose and An isotonic solution [LRD + 88A]) containing 5 [w / v]% dextran was prepared. Specifically, the above LR was obtained by dispensing Lactec Injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.). The above "LR + 88A" was prepared by adding and melting acarbose (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to Lactec injection so that the final concentration was 88 mM. In addition, the above "LRD" is a 1: 1 ratio of small molecule dextran L injection (10 [w / v]% dextran-containing lactec injection) (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory) and lactec injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory). Prepared by mixing in proportion. The above "LRD + 88A" was prepared by adding and melting acarbose (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to the "LRD" prepared as described above so that the final concentration was 88 mM. Further, the above-mentioned "LRD + 44A" was obtained by mixing "LRD + 88A" and "LRD" prepared as described above at a ratio of 1: 1. Further, the above-mentioned "LRD + 22A" was obtained by mixing "LRD + 44A" and "LRD" prepared as described above at a ratio of 1: 1. Further, the above-mentioned "LRD + 11A" was obtained by mixing "LRD + 22A" and "LRD" prepared as described above at a ratio of 1: 1. The above "LRD + 5.5A" was obtained by mixing "LRD + 11A" and "LRD" prepared as described above at a ratio of 1: 1.

［ｈＭＳＣを含むＰＢＳの調製］
　ｈＭＳＣを含むＰＢＳは、上記実施例１と同様の方法により調製した。 [Preparation of PBS containing hMSC]
PBS containing hMSC was prepared by the same method as in Example 1 above.

［各種被験用等張液中でのｈＭＳＣの保存方法］
　ｈＭＳＣは、上記実施例１に記載の方法に従い、上記８種類の被験用等張液中で、５℃で７日間保存した。 [How to store hMSC in isotonic solutions for various tests]
The hMSC was stored at 5 ° C. for 7 days in the above 8 types of test isotonic solutions according to the method described in Example 1.

［トリパンブルー染色法によるｈＭＳＣの細胞生存率の解析］
　上記８種類の被験用等張液中で保存したｈＭＳＣの細胞生存率は、上記実施例１に記載の方法に従って解析した。 [Analysis of cell viability of hMSC by trypan blue staining method]
The cell viability of hMSC stored in the above eight types of test isotonic solutions was analyzed according to the method described in Example 1 above.

２．結果
　ｈＭＳＣを、アカルボースを含む等張液中に保存すると、等張液中に保存した場合と比べ、細胞生存率は増加することが示された（図２Ａ及び表２における「ＬＲ＋８８Ａ」と「ＬＲ」の比較）。また、ｈＭＳＣを、アカルボース及びデキストランを含む等張液中に保存すると、デキストランを含む等張液中に保存した場合と比べ、細胞生存率は増加した（図２Ａ及び表２における「ＬＲＤ＋８８Ａ」と「ＬＲＤ」の比較）。さらに、ｈＭＳＣを、アカルボース及びデキストランを含む等張液中に保存すると、アカルボースを含む等張液中に保存した場合と比べ、細胞生存率は有意に増加することが示された（図２Ａ及び表２における「ＬＲＤ＋８８Ａ」と「ＬＲ＋８８Ａ」の比較）。 2. Results It was shown that when hMSC was stored in an isotonic solution containing acarbose, the cell viability was increased as compared with the case where it was stored in an isotonic solution (“LR + 88A” and “LR” in FIGS. 2A and 2). "comparison). In addition, when hMSC was stored in an isotonic solution containing acarbose and dextran, the cell viability was increased as compared with the case where it was stored in an isotonic solution containing dextran (“LRD + 88A” and “LRD + 88A” in FIGS. 2A and 2). Comparison of "LRD"). Furthermore, it was shown that storage of hMSC in an isotonic solution containing acarbose and dextran significantly increased cell viability as compared to storage in an isotonic solution containing acarbose (FIGS. 2A and Table). Comparison of "LRD + 88A" and "LR + 88A" in 2).

　これらの結果は、細胞保存液中に生じる細胞生存率低下は、アカルボース単独で使用した場合よりも、アカルボース及びデキストランを併用した方が、効果的に抑制されることを示している。 These results indicate that the decrease in cell viability that occurs in the cell preservation solution is more effectively suppressed when acarbose and dextran are used in combination than when acarbose is used alone.

　また、ｈＭＳＣを、５．５～８８ｍＭのアカルボースを含むデキストラン含有等張液中に保存すると、アカルボース不含のデキストラン含有等張液中に保存した場合と比べ、細胞生存率は有意に増加することが示された（図２Ｂ及び表３における「ＬＲＤ＋５．５Ａ」、「ＬＲＤ＋１１Ａ」、「ＬＲＤ＋２２Ａ」、「ＬＲＤ＋４４Ａ」、及び「ＬＲＤ＋８８Ａ」と、「ＬＲＤ」との比較）。 In addition, when hMSC is stored in a dextran-containing isotonic solution containing 5.5 to 88 mM acarbose, the cell viability is significantly increased as compared with the case where it is stored in an acarbose-free dextran-containing isotonic solution. (Comparison of "LRD + 5.5A", "LRD + 11A", "LRD + 22A", "LRD + 44A", and "LRD + 88A" in FIGS. 2B and 3 with "LRD").

　この結果は、アカルボースとデキストランの併用による細胞生存率低下の抑制効果は、アカルボースが低濃度においても発揮されることを示している。 This result indicates that the inhibitory effect of the combined use of acarbose and dextran on the decrease in cell viability is exhibited even at low concentrations of acarbose.

　本発明によると、アカルボース類及びデキストラン類を液体中に加えることにより、哺乳動物細胞を液体中に保存したときに生じる細胞生存率低下を効果的に抑制することができる。さらに、これらアカルボース類及びデキストラン類は、哺乳動物の生体内に投与した場合に、哺乳動物の生態に悪影響を及ぼす可能性の低い糖類であることから、哺乳動物細胞を本件哺乳動物細胞保存用液中で保存した後、新しい移植用液に置換することなく、そのまま哺乳動物の生体内へ投与することができる。 According to the present invention, by adding acarboses and dextrans to a liquid, it is possible to effectively suppress the decrease in cell viability that occurs when mammalian cells are stored in the liquid. Furthermore, since these acarboses and dextrans are saccharides that are unlikely to adversely affect the ecology of mammals when administered in vivo into mammals, the mammalian cell preservation solution for the present mammal cells can be used. After being stored in, it can be directly administered into the living body of a mammal without being replaced with a new transplant solution.

Claims (14)

1. 　アカルボース又はその塩と、デキストラン又はその塩とを含む哺乳動物細胞保存用液。 A mammalian cell preservation solution containing acarbose or a salt thereof and dextran or a salt thereof.
2. 　アカルボース又はその塩と、デキストラン又はその塩とを等張液中に含む、請求項１に記載の液。 The liquid according to claim 1, which contains acarbose or a salt thereof and dextran or a salt thereof in an isotonic liquid.
3. 　等張液が、乳酸リンゲル液である、請求項２に記載の液。 The liquid according to claim 2, wherein the isotonic liquid is Ringer's lactate liquid.
4. 　哺乳動物細胞を３～１４日間保存するための、請求項１～３のいずれか１項に記載の液。 The liquid according to any one of claims 1 to 3, for storing mammalian cells for 3 to 14 days.
5. 　哺乳動物細胞の生存率低下を抑制するために用いられる、請求項１～４のいずれか１項に記載の液。 The liquid according to any one of claims 1 to 4, which is used to suppress a decrease in the survival rate of mammalian cells.
6. 　哺乳動物細胞が、哺乳動物幹細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の液。 The liquid according to any one of claims 1 to 5, wherein the mammalian cell is a mammalian stem cell.
7. 　哺乳動物幹細胞が、哺乳動物間葉系幹細胞である、請求項６に記載の液。 The liquid according to claim 6, wherein the mammalian stem cells are mammalian mesenchymal stem cells.
8. 　アカルボース又はその塩と、デキストラン又はその塩とを含む液中で、哺乳動物細胞を保存する工程を含む、哺乳動物細胞の保存方法。 A method for preserving mammalian cells, which comprises a step of preserving the mammalian cells in a liquid containing acarbose or a salt thereof and dextran or a salt thereof.
9. 　液が、等張液である、請求項８に記載の保存方法。 The storage method according to claim 8, wherein the liquid is an isotonic liquid.
10. 　等張液が、乳酸リンゲル液である、請求項９に記載の保存方法。 The storage method according to claim 9, wherein the isotonic solution is Ringer's lactate solution.
11. 　哺乳動物細胞を３～１４日間保存することを特徴とする、請求項８～１０のいずれか１項に記載の保存方法。 The storage method according to any one of claims 8 to 10, wherein the mammalian cells are stored for 3 to 14 days.
12. 　哺乳動物細胞が、哺乳動物幹細胞である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の保存方法。 The storage method according to any one of claims 8 to 11, wherein the mammalian cell is a mammalian stem cell.
13. 　哺乳動物幹細胞が、哺乳動物間葉系幹細胞である、請求項１２に記載の保存方法。 The storage method according to claim 12, wherein the mammalian stem cells are mammalian mesenchymal stem cells.
14. 　アカルボース又はその塩と、デキストラン又はその塩とを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の液を調製するための粉末製剤。 A powder preparation for preparing the liquid according to any one of claims 1 to 7, which contains acarbose or a salt thereof and dextran or a salt thereof.

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