WO2021159198A1

WO2021159198A1 - Método de produção de biomaterial descelularizado, biomaterial descelularizado e uso do mesmo

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Publication number: WO2021159198A1
Application number: PCT/BR2021/050069
Authority: WO
Inventors: Luiz RICARDO GOULART FILHO; Letícia DE SOUZA CASTRO FILICE; Jessica PEIXOTO RODRIGUES; Jéssica REGINA DA COSTA SILVA; Paula BATISTA FERNANDES GASPARI; Natássia CAROLINE RESENDE CORRÊA; Roberta REZENDE ROSA; Cláudia MENDONÇA RODRIGUES; Matheus CARVALHO BARBOSA; Leticia SANTOS PIMENTEL; Ludmilla SOUSA QUIRINO
Original assignee: Kheiros Pater Inovação S.A; Universidade Federal de Uberlândia
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2021-02-12
Publication date: 2021-08-19
Also published as: AU2021220753A1; MX2022009961A; CA3171328A1; EP4104863A1; BR112022016166A2; KR20220161290A; IL295582A; EP4104863A4; JP2023517179A

Abstract

O presente pedido de patente refere-se ao campo da engenharia de tecidos. Em particular a um método de produção de biomaterial descelularizado a partir de tecido biológico, bem como o biomaterial descelularizado produzido pelo referido método compreendendo matriz extracelular de origem biológica. Particularmente o referido tecido biológico deriva de tecido conjuntivo ocular de origem animal ou humana. Mais particularmente refere-se a um método de produção de biomaterial descelularizado a partir de esclera animal para produção de scaffold biológico, prótese e/ou carreador de substâncias ativas (ou combinado com substâncias ativas), bem como o biomaterial em si e seus usos como scaffolds, próteses ou carreadores de substâncias para liberação sistêmica ou localizada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção: "MÉTODO DE PRODUÇÃO DE BIOMATERIAL DESCELULARIZADO, BIOMATERIAL DESCELULARIZADO E USO DO MESMO".

Campo da Invenção

[001] O presente pedido de patente refere-se ao campo da engenharia de tecidos. Em particular a um método de produção de biomaterial descelularizado a partir de tecido biológico, bem como o biomaterial descelularizado produzido pelo referido método compreendendo matriz extracelular de origem biológica. Particularmente o referido tecido biológico deriva de tecido conjuntivo ocular de origem animal ou humana. Mais particularmente refere-se a um método de produção de biomaterial descelularizado a partir de esclera animal para produção de scaffold biológico, próteses, e/ou como carreadores de substâncias ativas para liberação sistémica ou localizada, bem como o biomaterial descelularizado em si e seu uso.

Fundamentos da Invenção

[002] Na engenharia de tecidos, o desenvolvimento de novos biomateriais é fundamental para melhorar cada vez mais as caracteristicas necessárias para aumentar a efetividade desses materiais quando usados como scaffold ou para produção de próteses, reduzindo a possibilidade de rejeição desses biomateriais em sistemas biológicos. Sendo assim, um biomaterial pode ser definido como um material destinado a fazer a interface com os sistemas biológicos, com intuito de avaliar, tratar, aumentar ou substituir um órgão, tecido ou função do organismo.

[003] O desenvolvimento da medicina regenerativa é baseado no uso de uma matriz ou scaffold que funcionará como um arcabouço de sustentação para células de interesse, a fim de auxiliar na regeneração ou construção de um novo tecido, bem como permite o transporte de nutrientes, metabólitos, fatores de crescimento, moléculas de sinalização, outras moléculas regulatórias, medicamentos, dentre outros.

[004] Os scaffolds podem ser de origem sintética ou biológica. O uso de scaffolds sintéticos é vantajoso, pois suas propriedades químicas e físicas podem ser facilmente manipuladas de acordo com o objetivo que se propõe e de acordo com o tipo celular a ser utilizado. No entanto, os scaffolds biológicos, diferentemente dos sintéticos, são compostos de matriz extracelular natural derivados de tecidos, como tendões, ligamentos, submucosa do intestino delgado, bexiga e fígado (BADYLAK, 2008; MENG et al., 2014). Sendo assim, os scaffolds biológicos, por apresentarem matriz extracelular natural, podem manter fatores de crescimento e elementos estruturais, como elastina, fibronectina e colágeno, fornecendo ambiente propício para adesão, diferenciação e proliferação celular (PARENTEAU-

BAREIL et al 2010). [005] Os scaffolds oferecem propriedades estruturais, bioquímicas e biomecânicas capazes de direcionar e regular o comportamento celular e o desenvolvimento tecidual (GILPIN & YANG, 2017). As células que são utilizadas na engenharia de tecidos podem provir do próprio paciente (autólogas), de outro indivíduo (alogênicas), ou ainda de indivíduos de espécies diferentes (xenogênicas) (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012).

[006] Para reduzir as chances de reação imunogênica e rejeição de scaffolds biológicos, a descelularização é uma técnica muito utilizada, pois elimina a presença de possíveis partículas antigênicas (BADYLAK et ai., 2002). A descelularização pode ser realizada a partir de procedimentos químicos e enzimáticos, físicos e combinativos . Essa estratégia busca fazer a remoção das células do tecido em questão, bem como eliminar o material genético ali presente, com o propósito de prevenir possível reação imunológica, assim como manter os elementos da matriz extracelular preservando as propriedades mecânicas necessárias à manutenção da funcionalidade do scaffold (GILPIN & YANG, 2017). Embora a descelularização seja um processo utilizado, existem métodos distintos para realizá- la. Cada método guardando as suas particularidades, vantagens e desvantagens, bem como sendo aplicados em materiais biológicos distintos e de origens distintas. [007] A patente CN107007886 descreve a descontaminação de submucosa intestinal, bovina ou suina, utilizando ácido periacético e etanol e, após inativação virai, uso de tripsina, PBS, EDTA e ultrasonicação da submucosa para descelularização . Essa patente não utiliza detergentes, não utiliza nuclease e utiliza um equipamento oneroso, que é o ultrasonicador e não cita nenhum tecido ocular.

[008] A patente CN105944142 descreve três métodos de descelularização de tendão ou ligamento, utilizando uma solução de proteção (meio de cultura de células, condroitina, dextrano, antibiótico e ácido hialurônico, sob pressão) antes e após o tratamento com detergente e enzimas. Apresenta temperatura de incubação de nuclease de 25 ou 30°C. No entanto, não apresenta uso de quelante (EDTA), ou uso de tampão hipotônico, nem utiliza RNase para o processo de descelularização, não utiliza a temperatura padrão da DNase que é de 37°C e não cita a possibilidade de uso em um tecido ocular.

[009] A patente CN105833353 apresenta processo de descelularização da pele de origem suina, que utiliza solução protetora (condroitin sulfato, ácido hialurônico, glicerol e neomicina), adiciona ainda condição de alta pressão estática, seguido de incubação com nucleases que pode ser realizada simultaneamente ou separada da incubação com detergente. Não cita utilização de quelante (EDTA) ou uso de tampão hipotônico e não cita nenhum tecido ocular.

[010] A patente CN101947144 descreve um scaffold de córnea descelularizado. Para o processo de descelularização realiza ciclos de congelamento e descongelamento, seguidos de incubação em solução hipotônica, digestão com nuclease, eletroforese seguida de reidratação do scaffold. A patente não utiliza esclera, e prevê o uso apenas para substituição de outras córneas (transplantes).

[011] A patente EP3412322 descreve métodos de preparo e uso de membranas constituídas de colágeno, submetidas à desidratação e descelularização, advindas de placenta humana (membranas amniótica e coriônica). O processo de descelularização é baseado no uso de detergentes como Triton X-100 ou SDS, lavagens de preferência a vácuo e utiliza tratamento com fatores de adesão celular e soro humano/fetal bovino que facilitam o cultivo celular no biomaterial. Não cita o uso de nucleases ou uso de EDTA e não cita nenhum tecido ocular.

[012] A patente RU2016135703 apresenta processo de descelularização para obtenção de matriz de rim de ratos e coelhos. A descelularização é detergente-enzimática utilizando um sistema de perfusão de alto desempenho e biorreator, bem como administração de soluções (hipotônica, contendo EDTA, para choque osmótico e detergentes - SDS,

SDC, Triton X-100). O processo envolve a descelularização do órgão inteiro e não cita nenhum tecido ocular.

[013] O pedido de patente CN106730005 propõe um método para preparar um estroma de córnea para descelularização de forma que a estrutura de colágeno não sofra danos. Apesar do referido documento citar sobre esclera, a invenção tem como produto a obtenção de estroma da córnea que compreende uma córnea e uma esclerótica ligadas à periferia da córnea, sendo o tecido escleral com uma largura de apenas 2-3 mm. A descelularização em si e o uso da esclera não estão em foco na invenção.

[014] O pedido de patente US2018256784 apresenta vários métodos de descelularização de disco intervertebral de bovino, que utiliza ultrasonicação com soluções de descelularização (surfactante não-iônico e inibidor de protease), lavagens com água e soluição de álcool 70% e digestão por nucleases por 48 horas. Demonstra também os métodos de avaliar a eficiência da descelularização como quantificação de DNA residual e de glicosaminoglicanos. Relata incubação com nucleases por tempo mais prolongado, necessita de ultrasonicador e não apresenta menção a tecidos de origem ocular.

[015] O pedido de patente KR20180133172 apresenta um método de produção de um adesivo injetável para fixar enxertos ósseos, a partir de uma matriz extracelular descelularizada . O tecido de exemplo foi a tibia, incubada para desmineralização prévia, seguida de descelularização com tripsina, e desgaseifiçado por agitação. Não apresenta detalhes das soluções e não cita nenhum tecido de origem ocular.

[016] O pedido de patente US201816121969 descreve a descelularização e deslipidação de tecido adiposo e vários outros tipos de tecidos moles. O documento sugere vários formatos que o tecido descelularizado pode assumir, vários tipos de preparo e pré-processamento do material, etapas de deslipidação, descelularização e desinfecção. Porém, não cita especificamente escleras e muito menos o uso de endonucleases .

[017] O pedido de patente KR20180003879 descreve processo de descelularização por desgaseificação com uso de biorreator. Apesar do titulo referenciar o uso em diversos órgãos, os resultados apresentados referem-se apenas a rins. O método descrito no referido pedido difere do método proposto pelo presente pedido de patente.

[018] O estudo de Saldin et ai. (2017) faz uma revisão sobre 31 tipos de tecidos de diferentes origens, comparando o protocolo de descelularização dos tecidos. Apresenta o processamento de vários tecidos de origem suina, incluindo a córnea, porém não cita o uso de escleras. O processo de descelularização que utiliza EDTA e SDS é citado apenas para tendão humano e não utiliza nucleases. Os demais protocolos geralmente utilizam tripsina, SDC (sodium deoxycholate),

Triton X-100, algumas vezes em combinação com tampão de nuclease.

[019] O estudo de Singelyn et al. (2011) cita que a descelularização de tecido miocárdico foi realizada com SDS 1%, até a matriz se tornar branca. O estudo não cita uso de nuclease ou de EDTA para descelularização e não cita tecidos oculares.

[020] O estudo de Seif-Naraghi et al. (2012) relata descelularização de pericárdio suíno realizada com SDS, detergente iônico e lavagens com água. Após a descelularização o pericárdio foi liofilizado e moldo em pó. O estudo não detalha o processo de descelularização e não cita tecidos oculares.

[021] O estudo de Liu et al. (2009) tem como objetivo fabricar um scaffold poroso tridimensional de submucosa de bexiga e posterior recelularização do scaffold. As bexigas suínas eram lavadas e para descelularização eram oxidadas por imersão em ácido paracético (em diferentes concentrações) por 4 horas. Depois foram tratadas com Triton X-100 por 2 dias e depois lavadas em água destilada por outros 2 dias. O processo de descelularização não cita o uso de detergentes ou nucleases e é feito com o órgão inteiro, sem menção a tecidos oculares.

[022] O estudo de Dahl et al. (2003) descreve três métodos de descelularização de artéria carótida suina para uso como scaffolds. O primeiro método utiliza tampão com 1% de Triton X-100, 0,02% EDTA e 0,2 mg/mL de DNase por 24 horas. O segundo método descreve incubação de 11 horas com tampão hipotônico com TRIS HC1, EDTA, PMSF (fluoreto de fenilmetil sulfonil) e BHA (Hidroxianisole butilado) seguida de incubação de 11 horas de tampão hipertônico com TRIS HC1, NaCl, EDTA, PMSF e BHA. O terceiro tratamento era incubação por 11 horas com solução de detergente zwitterionico (CHAPS) com NaCl, EDTA em PBS e seguia por incubação com solução de detergente aniônico (SDS) com NaCl e EDTA em PBS. Todos os tratamentos ficaram sob 10% de C02 e 37°C em constante agitação e lavados em PBS por 5 minutos após a descelularização. Os processos não menciona o uso de nucleases e não cita tecidos oculares.

[023] O estudo de Tedder et ai. (2009) relata sobre scaffolds de colágeno com cross-link (reticulado) moderado para engenharia de válvulas cardíacas. Os scaffolds eram preparados a partir de pericárdio descelularizados, tratados com PGG (penta-galloyl glucose), um polifenol de ligação ao colágeno. Para descelularização o pericárdio era lavado em solução salina estéril, armazenados em água 4°C overnight. Depois era tratado com SDC e Triton X-100, EDTA e NaN3 em tampão de TRIS HC1 (pH 7,8) com agitação moderada por 6 dias a 22°C e trocando a solução após 3 dias. Após lavar com água e etanol 70% (para remover resíduos de detergentes), era incubado em DNase e RNase 37°C por 24 horas. Após lavagens era incubado com elastase por 6 dias e depois novamente lavados até não detectar níveis de proteínas solúveis no ensaio BCA. O processo de descularização é mais demorado, não utiliza SDS e não cita tecidos oculares.

[024] O estudo de Visser et al. (2015) relata que o processo de descelularização de cartilagem, menisco e tecido de tendão foi realizado com Tris 1% por 24 horas, sonicação por 2 horas e digestão com nuclease (DNase e RNase) por 72 horas a 37°C. Deste modo, o processo descrito apresenta-se mais longo que o proposto pelo nosso trabalho, além de não utilizar SDS e necessitar de ultrasonicação, o estudo não cita tecidos oculares.

[025] O estudo de Paduano et al. (2016) descreve que a descelularização de matrix extracelular de osso foi realizada com tripsina e EDTA por 24 horas e posterior incubação com estreptomicina e penicilina por 24 horas para remoção de material celular residual. Deste modo, o processo de descelularização em questão não dispõe do uso de nucleases e SDS e não envolve tecidos oculares.

[026] O estudo de Wang et al. (2010), objetiva utilizar miocárdio suíno descelularizado como scaffold para engenharia tecidual cardíaca. Para descelularização, o trabalho utilizou biorreator, SDS, tripsina, inibidores de protease, nucleases e sonicação. O protocolo apresenta duração de duas semanas e meia, sendo bastante longo quando comparado ao proposto neste trabalho e não cita tecidos oculares.

[027] O estudo de Wang et ai. (2015), avalia o uso de fígado e rim descelularizados para obtenção de matriz com características estáveis e aplicáveis clinicamente. Os órgãos foram submetidos a perfusão para retirada de sangue e também para realizar a descelularização com soluções contendo água destilada (1 a 3h), SDS, Triton X-100, PAA (ácido peracético) e Na-DOC (desoxicolato de sódio) (2- 18 a 24h). O protocolo não utilizou nucleases e, diferente do proposto, requer equipamento para realização da perfusão, pois é feita com órgão inteiro. O estudo não cita tecidos oculares.

[028] O estudo de Sawkins et al. (2013), buscou utilizar matriz de osso desmineralizada e descelularizada e comparar com as caracteristicas de diferentes matrizes extracelulares . Para desmineralização, utilizaram agitação com solução de HC1, por 24h. Posteriormente, as amostras foram liofilizadas. O processo de descelularização baseou- se no uso de tripsina e EDTA, 24 horas e incubação com estreptomicina e penicilina por 24h. Esta descelularização não apresenta uso de nucleases, SDS e inclui o uso de tripsina. Não cita nenhum tecido de origem ocular. [029] O estudo de Wolf et ai. (2012) apresenta a descelularização de matriz extracelular de derme e bexiga de suínos. Para descelularização, os tecidos foram submetidos a soluções de tripsina, etanol, peróxido de hidrogénio, TRIS- EDTA/Triton X-100 e ácido peracético por aproximadamente 46 horas. O processo de descelularização é mais longo que o proposto pelo presente pedido, além de não utilizar nucleases e SDS e não utiliza tecidos oculares.

[030] O estudo de Wu et ai. (2015) apresenta descelularização de menisco suíno com SDS 1%/PBS (72 horas, trocas a cada 24 horas), EDTA 0,1%/PBS (24h), água deionizada (overnight), liofilização. O processo de descelularização não utiliza nucleases e o estudo não menciona tecidos de origem ocular.

[031] O estudo de Ungerleider et ai. (2015) descreve descelularização de matriz extracelular de músculo cardíaco e esquelético com SDS 1% e estreptomicina/penicilina durante 5 dias. O processo de descelularização não cita o uso de EDTA ou de nucleases. O estudo não menciona nenhum tecido ocular.

[032] O estudo de Fu et ai. (2016), descreve uma matriz extracelular de músculo esquelético de suínos. A descelularização foi realizada com SDS, pepsina, EDTA,

Triton X-100, desoxicolato de sódio em 5 diferentes métodos, com distintas misturas desses reagentes. A descelularização não cita tecidos de origem ocular.

[033] O estudo de Martinello et ai. (2012) apresenta scaffold rescelularizado de tecido cadavérico em lesões no tendão. O protocolo de descelularização utiliza TRIS-EDTA e inibidores de protease durante 2 horas, seguida de 0,1% SDS por 5 horas e incubação com DNase por 2 horas. Não menciona o uso de tecido ocular.

[034] O estudo de Mohammadie et ai. (2018) descreve um protocolo de descelularização de cartilagem articular bovina. O protocolo baseia-se no uso de processos físicos (congelamento em nitrogénio líquido e descongelamento) e processos químicos (tratamento com SDS a 2,5%, lavagens com tampão fosfato). Para eliminar o SDS residual os autores colocam as amostras em filtro estéril de Buchner e realizam a lavagens com etanol 75%, água destilada e tampão fosfato. Os scaffolds descelularizados foram então funcionalizados com nanotubos de carbono de parede simples carboxilados para aplicação em engenharia de cartilagem. Não utiliza EDTA e necessita de um aparato específico para as lavagens. O estudo não menciona tecidos de origem ocular.

[035] O estudo de Xu et ai. (2017) descreve a padronização de um protocolo de descelularização para tendão de Aquiles suíno. Nos métodos químicos avaliados os autores testam diferentes combinações de concentrações de SDS e

Triton X-100 por 48 e 72 horas de incubação. Em seguida, foram testados os métodos físicos (congelamento e descongelamento, ultrassom, perfusão, lavagem hidrostática) combinados com a concentração ideal de reagentes químicos identificados no primeiro estudo e o tempo de tratamento químico foi limitado a 48 h. Por fim as amostras foram lavadas, digeridas com DNase e armazenadas a -20°C. Este estudo estabeleceu como protocolo ótimo uma combinação de dois detergentes químicos (0,5% SDS e 1% Triton X-100) com um método físico (lavagem sob pressão hidrostática de 200 mmHg) para descelularizar os tendões de Aquiles. O processo não cita o uso de EDTA, necessita de equipamentos especiais e não menciona tecidos oculares.

[036] No estudo de Sackett et ai. (2018) tecido pancreático foi inicialmente descelularizado utilizando duas incubações de 48 horas com troca de desoxicolato de sódio/PBS 2,5 mM. Após essa incubação, o tecido foi enxaguado com água e lavado em PBS IX suplementado com antibióticos por 72 horas, com enxagúe em água a cada 24 horas e reposição dos antibióticos frescos realizada a cada dia. A matriz pancreática descelularizada resultante foi liofilizada e armazenada a -80 ° C para uso futuro. A descelularização não menciona o uso de SDS ou EDTA e não há menção aos tecidos oculares.

[037] Muito embora se conheçam as vantagens que um biomaterial como uma matriz extracelular descelularizada possa trazer em comparação com outros biomateriais ou materiais sintéticos na medicina, particularmente na medicina regenerativa, ainda existe uma preocupação grande com o uso desse tipo de material. O potencial antigênico, a possibilidade de carregar agentes infecciosos, a variabilidade em relação ao material preparado e a falta de capacidade de especificar e/ou caracterizar componentes bioativos indesejáveis nos ditos materiais são questões importantes que necessitam cada vez mais de soluções técnicas efetivas. São conhecidos atualmente vários métodos de tratamento de tecidos, alguns desses métodos incluem a descelularização destes tecidos e estão descritos nos documentos mencionados no presente pedido, uma vez que definem o estado geral da técnica.

[038] Os métodos conhecidos para obtenção de biomateriais para uso como scaffolds biológicos compreendem tratamentos que consomem muito tempo, não apresentam grau de descelularização adequado e/ou não apresentam reprodutibilidade quando aplicados em larga escala. Portanto, a área de engenharia de tecidos busca o desenvolvimento de biomateriais melhorados para uso como scaffold ou próteses bem como o desenvolvimento de um método para produção destes materiais que possa garantir uma maior eficiência e menor variabilidade do produto final.

Objetivo da invenção [039] Tendo em vista os problemas que apresentam o estado da técnica, o presente pedido de patente teve como objetivo desenvolver um método de produção de biomaterial descelularizado compreendendo matriz extracelular de origem biológica, em que o referido método é capaz de produzir a referida matriz extracelular descelularizada em maior escala, menor tempo e com menor grau de variabilidade e maior reprodutibilidade do produto final.

[040] Um outro objetivo do presente pedido é prover um biomaterial compreendendo a matriz extracelular descelularizada de origem biológica com propriedades melhoradas para ser usado como scaffold, na produção de próteses ou como carreadores de substâncias ativas.

[041] Um outro objetivo do presente pedido é prover um biomaterial compreendendo além da matriz extracelular descelularizada de origem biológica com propriedades melhoradas, ao menos uma substância adicional para liberação sistémica ou localizada.

[042] Um outro objetivo do presente pedido é prover o uso deste biomaterial na produção de um produto como um scaffold, na produção de próteses ou de um carreador de substâncias ativas para liberação sistémica ou localizada em um indivíduo que necessite do mesmo, preferencialmente em que é para uso em processos de reparação e/ou regeneração tecidual, como por exemplo de tecido ósseo, de tecido cartilaginoso, de articulações, de tendão, de pele, para fins protéticos em implantodontia e/ou traumatologia buco- maxilo-facial, para procedimentos cirúrgicos de preenchimento e/ou correção anatômica, dentre outros.

[043] Um outro objetivo do presente pedido é prover o uso deste biomaterial na produção de um produto carreador de substâncias solúveis em água ou álcool, nutrientes, metabólitos, fatores de crescimento, moléculas de sinalização, moléculas regulatórias, hormônios e medicamentos ou compostos farmaceuticamente ativos, dentre outros, em um indivíduo ou animal em necessidade do mesmo.

Breve descrição da invenção

[044] O presente pedido de patente descreve um método de produção de biomaterial descelularizado compreendendo matriz extracelular descelularizada de origem biológica, particularmente em que o tecido biológico é derivado de tecido conjuntivo ocular, mais particularmente escleras de origem suína, bovina, de coelhos ou humana. O referido método apresenta uma melhor relação de custo-benefício, permitindo reduzir o tempo de processamento, com eficiência no processo de descelularização, redução da variabilidade entre os produtos finais e uma maior reprodutibilidade do método aqui proposto.

[045] Outra modalidade do presente pedido são os biomateriais compreendendo matriz extracelular descelularizada de origem biológica com propriedades melhoradas, tal como produzido pelo método proposto, para ser usado como scaffold, na produção de próteses ou como carreadores de substâncias para liberação sistémica ou localizada .

[046] Outra modalidade do presente pedido são os biomateriais tais como produzido pelo método proposto, compreendendo além da matriz extracelular descelularizada de origem biológica com propriedades melhoradas, ao menos uma substância ativa adicional para liberação sistémica ou localizada. A referida substância podendo ser selecionada dentre o grupo que consiste de: substâncias solúveis em água ou álcool, nutrientes, metabólitos, fatores de crescimento, moléculas de sinalização, moléculas regulatórias, hormônios e medicamentos ou compostos farmaceuticamente ativos.

[047] Outra modalidade do presente pedido é o uso deste biomaterial na produção de um scaffold, na produção de próteses e/ou na produção de um carreador de substâncias ativas para liberação sistémica ou localizada em um indivíduo que necessite do mesmo, preferencialmente em que é para uso em processos de reparação e/ou regeneração tecidual, como por exemplo de tecido ósseo, de tecido cartilaginoso, de articulações, de tendão, de pele, para fins proféticos em implantodontia e/ou traumatologia buco-maxilo-facial, para procedimentos cirúrgicos de preenchimento e/ou correção anatômica, dentre outros.

Breve descrição das figuras

[048] A presente invenção será melhor compreendida com base na descrição, a seguir, tomada em conjunto com as figuras anexas, nas quais:

[049] A FIGURA IA mostra uma imagem do olho suino in natura, conforme recebido, ainda com os tecidos naturalmente pertencentes a este.

[050] A FIGURA 1B mostra uma imagem representativa do corte dos tecidos, com a finalidade de limpar o material deixando somente o tecido escleral.

[051] A FIGURA 2A mostra uma imagem representativa da esclera limpa, logo antes do processo de descelularização - Vista externa.

[052] A FIGURA 2B mostra uma imagem representativa da esclera limpa, logo antes do processo de descelularização - Vista interna.

[053] A FIGURA 3 mostra uma imagem representativa de um biorreator utilizado no protocolo F de descelularização. [054] A FIGURA 4 mostra a análise histológica de esclera suina controle (in natura) e do biomaterial produzido após os protocolos de descelularização de A a F. (Setas sinalizam núcleos ou resíduos de núcleos).

[055] A FIGURA 5 mostra uma placa de ensaio representativa demonstrando a coloração obtida através do procedimento de quantificação de hidroxiprolina.

[056] A FIGURA 6A mostra o layout utilizado para deposição das soluções analisadas na membrana de nitrocelulose para análise do conteúdo de colágeno do tipo I, colágeno do tipo II e elastina por dot blot.

[057] As FIGURAS 6B, 6C e 6D mostram o dot blot realizado para o colágeno do tipo I, colágeno do tipo III e elastina, respectivamente .

[058] As FIGURAS 7A e 7B mostram imagens de microscopia eletrónica de varredura de amostras de esclera in natura. A seta indica presença de célula.

[059] As FIGURAS 8A e 8B mostram imagens de microscopia eletrónica de varredura de amostras de esclera desidratada. A seta indica presença de célula.

[060] As FIGURAS 9A e 9B mostram imagens de microscopia eletrónica de varredura de amostras de esclera desidratada e reidratada. A seta indica presença de célula.

[061] As FIGURAS 10A e 10B mostram imagens de microscopia eletrónica de varredura de amostras do biomaterial descelularizado produzido.

[062] A FIGURA 11A mostra um Scatter dot plot do módulo de elasticidade de Young (GPa) para amostras de esclera in natura, amostras do biomaterial descelularizado, amostras do biomaterial descelularizado e desidratado e amostras do biomaterial descelularizado desidratado e reidratado. [063] A FIGURA 11B mostra um Scatter dot plot de Tensão máxima (MPa) para amostras de esclera in natura, amostras do biomaterial descelularizado, amostras do biomaterial descelularizado e desidratado e amostras do biomaterial descelularizado desidratado e reidratado.

[064] As FIGURAS 12 A-D mostram as etapas do procedimento de implantação, no tecido subcutâneo de um animal, do biomaterial descelularizado.

[065] As FIGURAS 13-17 apresentam imagens representativas de cortes histológicos dos implantes do biomaterial em um animal.

[066] As FIGURAS 18 A-D mostram análises estatísticas dos parâmetros avaliados. A) inflamação aguda; B) presença de fibroblastos; C) presença de vasos e D) presença de células gigantes.

[067] As FIGURAS 19 A e B apresentam imagens representativas de cortes histológicos dos implantes do biomaterial descelularizado em lesão de tendão com 49 e 114 dias respectivamente.

[068] A FIGURA 20 A apresenta imagem representativa de corte histológico da região do implante do biomaterial descelularizado em lesão de tendão.

[069] A FIGURA 20 B apresenta imagem representativa de corte histológico de tecido adjacente ao tendão nativo lesionado. [070] As FIGURAS 20 C e D apresentam imagems representativas de cortes histológicos de tendão nativo saudável que foi retirado para substituição pelo implante com o biomaterial descelularizado.

[071] A FIGURA 21 apresenta imagem representativa de corte histológico da região do implante do biomaterial descelularizado em lesão de tendão mostrando a presença de vasos sanguíneos e hiperemia em região de interação com implante no primeiro tempo experimental (49 dias).

[072] A FIGURA 22 apresenta imagem representativa de corte histológico mostrando o tecido conjuntivo frouxo que recobre a região de tendão lesionado.

[073] As FIGURAS 23 A e B apresentam imagens representativas de corte histológico do implante do biomaterial descelularizado em interação com o tendão nativo no segundo tempo experimental (114 dias).

[074] As FIGURAS 24 A e B apresentam imagens representativas de corte histológico mostrando o perfil de células predominantes de tendão nativo que infiltram o implante de biomaterial no primeiro tempo experimental (49 dias) (A) e no segundo tempo experimental (114 dias) (B). [075] As FIGURAS 25 A-D apresentam imagens representativas de cortes histológicos mostrando o implante em tecido ósseo de um produto disponível no mercado (grânulos de enxerto ósseo comercializado como Bio-Oss®)), após 49 dias - grupo controle.

[076] As FIGURAS 26 A-D apresentam imagens representativas de cortes histológicos mostrando o implante em tecido ósseo de um produto disponível no mercado (grânulos de enxerto ósseo comercializado como Bio-Oss®), após 130 dias - grupo controle.

[077] As FIGURAS 27 A e B apresentam imagens representativas de corte histológico mostrando a interação do implante de biomaterial descelularizado com tecido ósseo nativo, após 49 dias.

[078] As FIGURAS 28 A-D apresentam imagens representativas de corte histológico mostrando o implante do biomaterial descelularizado em tecido ósseo mostrando a integração do biomaterial com o tecido ósseo nativo, após 130 dias.

[079] A FIGURA 29 apresenta imagens representativas de corte histológico mostrando o implante do biomaterial descelularizado associado à sinvastatina em tecido ósseo, após 49 dias.

[080] As FIGURAS 30 A e B apresentam imagens representativas de corte histológico mostrando a integração do implante do biomaterial descelularizado associado à sinvastatina em tecido ósseo após 49 dias.

[081] AS FIGURA 31 A e B apresentam imagens representativas de corte histológico mostrando a infiltração celular no implante de biomaterial descelularizado associado à sinvastatina em tecido ósseo, após 130 dias.

[082] A FIGURA 32 apresenta imagem representativa de corte histológico mostrando a lesão em cartilagem que recebeu o implante, após 30 dias.

[083] As FIGURAS 33 A-C apresentam imagens representativas de corte histológico mostrando boa integração entre o implante de biomaterial, a cartilagem articular e o tecido conjuntivo neoformado.

[084] AS FIGURAS 34 A-F apresentam imagens de correção cirúrgica de preenchimento e correção anatômica de retenção de pálpebra com uso do biometarial.

Descrição detalhada da invenção [085] O presente pedido descreve um método de produção de um biomaterial descelularizado a partir de tecido biológico, em que compreende as etapas de:

[086] - coletar, processar e higienizar o tecido biológico;

[087] - submeter o tecido biológico a um processo de descelularização; e

[088] - submeter o tecido biológico descelularizado a um processo de descontaminação e/ou esterilização.

[089] O referido método compreende ainda uma etapa de desidratação que pode ocorrer preferencialmente após uma etapa de descontaminação e antes da etapa esterilização, e uma etapa de reidratação do biomaterial descelularizado. [090] O tecido biológico utilizado no referido método é derivado de tecido conjuntivo ocular, ainda mais particularmente escleras de origem suina, bovina, de coelho ou humana.

[091] O presente pedido também descreve o biomaterial descelularizado produzido pelo dito método de produção. O dito biomaterial compreendendo matriz extracelular descelularizada de origem biológica com propriedades melhoradas, em que a dita matriz compreende fibras de colágeno tipo I, III e elastina.

[092] Ademais, o presente pedido descreve o uso do dito biomaterial descelularizado produzido como scaffold, prótese ou carreador de substâncias ativas em um indivíduo que necessite do mesmo.

Exemplo 1- Coleta e processamento das amostras de origem animal .

[093] As amostras de globo ocular animal foram coletadas em frigoríficos. No exemplo aqui demonstrado, foram amostras de globo ocular suínas coletadas em frigoríficos que processam exclusivamente suínos (FIGURA IA). Imediatamente após a coleta, as amostras foram imersas em solução salina (NaCl a 0,9%) e mantidas refrigeradas em recipiente térmico, até o recebimento pelo laboratório.O tempo de transporte até o laboratório deve ser o mais breve possível, sempre inferior a 1Oh.

[094] As amostras foram imediatamente processadas a fim de retirar os componentes oculares que não correspondiam à esclera, com auxilio de instrumentos cirúrgicos (pinças, bisturi, etc.) (FIGURA 1B).

[095] As escleras extraídas foram intensamente higienizadas em solução de TBS (solução salina TRIS tamponada) e água corrente (FIGURA 2A e 2B), para posterior submissão ao protocolo de descelularização

Exemplo 2- Protocolo de descelularização do material biológico .

[096] A descelularização é uma estratégia que busca reduzir ou anular as chances de reação imunogênica adversa frente à utilização de scaffolds biológicos. Esta técnica atua na remoção das células do tecido em questão, bem como na eliminação do material genético ali presente, porém buscando manter os elementos da matriz extracelular e preservar as propriedades mecânicas necessárias à manutenção da funcionalidade do scaffold.

[097] Sendo assim, após a etapa de processamento das amostras e obtenção das escleras higienizadas, as escleras foram inicialmente lavadas de 1-5 vezes em solução de TBS entre 1 a 20 minutos, à temperatura entre 0 a 25 °C, sob agitação entre 80 a 200 rpm. Após a lavagem, foi realizada incubação utilizando tampão hipotônico (5 a 20 mM TRIS, de 0,05 a 1% m/v de EDTA, pH entre 6 a 8) por 1 a 18h, sob agitação entre 80 a 200 rpm, à temperatura entre 4 a 37 °C. Após essa etapa, as amostras foram tratadas com tampão detergente (5 a 20 mM TRIS, de 0,05 a 1% m/v de EDTA e 0,05 a 2% SDS) sob agitação entre 80 a 200 rpm por 5 a 24h, à temperatura entre 4 a 37 °C. Em seguida, lavou-se as amostras em água deionizada, por 30 minutos a 4 horas, à temperatura de entre 4 a 37 °C sob agitação de entre 80 a 200 rpm e realizou-se as lavagens com tampão isotônico (solução TBS) por 5 a 15 minutos, à temperatura entre 4 a 37 °C, sob agitação entre 80 a 200 rpm. Seguiu-se o protocolo com incubação das amostras biológicas com tampão de nucleases (10-50 mM TRIS, 2-10 mM MgC12, 1 a 80 U/mL de DNAse e 0,05 a 80 U/mL de RNAse), entre 30 minutos a 3h, sob agitação entre 100-200 rpm, e à temperatura entre 30 a 40 °C. Após esta etapa, as amostras foram submetidas a lavagens finais em tampão salino-fosfato (PBS) compreendendo de 0,05 a 1% m/v de EDTA, por até 5 minutos à temperatura entre 25 a 37 °C, sob agitação entre 80 a 200 rpm.

[098] O protocolo padronizado e descrito acima baseou- se em estudos prévios de descelularização, com modificações que visavam atender o material em questão, bem como assegurar a reprodutibilidade do método, redução do tempo e melhora do custo-beneficio . O trabalho de Kasbekar e colaboradores

(2018) indica um processo de descelularização quimico- enzimático para tecidos envolvendo uso de detergente hipotônico e tampão com nucleases, que foi utilizado como protocolo inicial para padronização da descelularização das escleras (Tabela 1).

[099] Tabela 1: Descrição do protocolo de descelularização inicial e protocolos testes com as devidas modificações realizadas.

[0100] Conforme a Tabela 1, o protocolo A seguiu fielmente o que foi descrito pelo estudo de Kasbekar e colaboradores (2018). O protocolo B proposto apresenta como diferença a concentração de benzonase utilizada no tampão de nuclease, sendo elevada de 1 U/mL para 5 U/mL. Já o protocolo C, eleva esta concentração para 10 U/mL. O protocolo D, por sua vez, substitui a benzonase por DNase e RNase (80 U/mL), enquanto o protocolo E utiliza 8 U/mL de DNase e RNase, bem como reduz todas as rotações durante o processo, preferencialmente de entre 80 rpm a 200 rpm, mais preferenciamente de entre 90 a 180 rpm, ainda mais preferencialmente 100 rpm e adiciona-se uma etapa de lavagens com água deionizada após incubação com tampão detergente, preferencialmente por 4 horas, à temperatura de 25°C e rotação de 100 rpm, com duas trocas neste intervalo. Por fim, para o protocolo F foram realizados ajustes nas rotações, preferencialmente entre 80 rpm a 200 rpm, mais preferenciamente de entre 90 a 190 rpm, ainda mais preferencialmente 180 rpm, temperaturas, tempos de incubações e concentrações das nucleases de modo a se adequar ao volume e às condições possíveis para se realizar de modo semi-automático no biorreator Biostat B (B. Braun, Biotech International) (Figura 3).

[0101] Segundo Crapo e colaboradores (2011) os critérios de eficiência da descelularização abrange quantidade inferior a 50 ng de DNA/mg de matriz extracelular (peso seco), bem como ausência de DNA íntegro e material nuclear visível na análise histológica.

[0102] De acordo com os resultados obtidos e descritos na Tabela 2, os protocolos A, B e C não alcançaram o limite de DNA/mg de tecido exigido para uma descelularização eficiente. Estes protocolos utilizaram a benzonase (nuclease de Serratia marcescens), uma endonuclease promíscua que ataca e degrada todas as formas de DNA e RNA (Nestle and

Roberts, 1969). A partir de então, foi proposto o uso de nucleases (DNase/RNase) em combinação e em alta concentração substituindo a benzonase (Protocolo D). Este protocolo foi o primeiro a atender os critérios de eficiência da descelularização . Sendo assim, após o resultado satisfatório do protocolo D, com apenas uma esclera, e frente à necessidade da reprodutibilidade do ensaio, foi testado um novo protocolo (E) utilizando escleras inteiras e em maior quantidade (20 escleras). Para isso foi ajustada a concentração ideal de DNase/RNase para uma maior economia no processo, bem como redução da rotação para melhorar a exposição do material às soluções de incubação e adição de lavagens com água deionizada para retirada de SDS residual. Este protocolo também atendeu os critérios de quantidade de DNA reduzida. A partir de então, para mimetizar um processo em larga escala, semi-automatizado e de menor tempo e custo- benefício, foram realizados novos ajustes para a aplicação da descelularização em 100 escleras utilizando um biorreator (Protocolo F). Este protocolo também se mostrou eficiente (Tabela 2)

[0103] Tabela 2. Quantificação de DNA genômico (ng/pL), e concentração de DNA por miligrama de escleras, das amostras controle (in natura) e descelularizadas pelos protocolos testes A-F.

[0104] Por meio da análise histológica (coloração de HE) evidenciou-se que as amostras controles (in natura) possuem núcleos intactos (pontos roxos - as setas sinalizam os núcleos) . Na avaliação das imagens referentes aos protocolos A, B e C nota-se resquícios de núcleos em determinados pontos, demonstrando que estes protocolos não foram eficientes. Por outro lado, na aplicação dos protocolos D, E e F não foi possível observar a presença de núcleos, demonstrando a eficiência na descelularização do material a partir destes ensaios (Figura 4).

[0105] Segundo Gilbert et al. (2006), a eficácia dos protocolos de descelularização não depende somente de métodos químicos, enzimáticos e físicos competentes, mas também da origem do tecido e sua composição. O protocolo de descelularização descrito por Kasbekar (2018) foi padronizado para tecido conjuntivo bulbar humano, enquanto o aqui proposto se trata de tecido escleral animal ou humano, o que em parte pode justificar a descelularização ineficiente utilizando o protocolo A. Além disso, o processo descrito por Kasbekar (2018) atinge um n amostrai de 20 olhos, o presente estudo, por meio das modificações realizadas, alcançou uma descelularização eficiente de 100 escleras, demonstrando adaptação, redução de tempo e economia de recursos para produção em larga escala. Ainda, de acordo com os protocolos de verificação, nota-se a reprodutibilidade da técnica, visto que respeita os limites estipulados de detecção de DNA e ausência de núcleos nas análises histológicas.

[0106] Deste modo, o processo de descelularização final padronizado neste estudo (Protocolo F) foi mais eficiente (100 escleras), com melhor relação custo-beneficio (concentração de DNase e RNase), permitindo reduzir o tempo de processamento por número de escleras (semi-automatizado em biorreator), atendendo aos critérios de avaliação e reprodutibilidade .

Exemplo 3a- Protocolo de descontaminação do biomaterial descelularizado .

[0107] Para a realização de ensaios ín vitro/in vivo o biomaterial descelularizado foi descontaminado realizando uma lavagem inicial em PBS estéril e em seguida embebidos em PBS lx estéril (aproximadamente 30 mL) contendo solução concentrada de antibiótico e/ou antimicótico. Preferencialmente a solução concentrada de antibiótico e/ou antimicótico compreende ao menos um composto com ação antibiótica e ao menos um composto com ação antimicótica,mas particularmente em que compreende: penicilina, estreptomicina e anfotericina B. As amostras foram armazenadas nesta solução por cerca de 36h a 60h, preferencialmente cerca de 48h, a uma temperatura de cerca de 2°C a 8°C, preferencialmente 4°C. Após o período de armazenamento, retirou-se fragmentos de cada amostra do biomaterial, e realizou-se rápida lavagem em PBS lx estéril. Estes fragmentos foram submetidos ao teste de descontaminação a partir da sua inoculação em meio de cultura de microorganismos Luria Bertani (LB), sem antibióticos e antifúngico. Estas amostras foram incubadas à 37°C sob agitação por 72h. Para a avaliação da presença de algum tipo de contaminação por microorganismos, após as 72h foi realizada a leitura da densidade óptica (OD) (por espectrofotometria, comprimento de onda de 600nm) do meio de cultura onde esteve embebido os fragmentos em questão e demais controles (PBS lx da lavagem, meio LB estéril sem nenhum tipo de inoculo) . Abaixo seguem detalhes do experimento realizado:

[0108] Materiais embebidos em meio LB para teste de descontaminação :

A) Fragmento de biomaterial descelularizado

B) Fragmento de esclera in natura

C) Fragmento de esclera desidratada

D) PBS lx da lavagem prévia E) Meio LB apenas

[0109] Os resultados do teste de descontaminação (leitura da OD) demonstraram:

A) -0,022

B) -0,018

C) -0,021

D) -0,025

E) 0

[0110] As leituras demonstram ausência de crescimento de microorganismos e consequentemente que o protocolo utilizado foi capaz de descontaminar os biomateriais descelularizados. [0111] O referido método se mostrou eficaz tanto para ser usado como uma etapa inicial e preliminar de descontaminação do biomaterial descelularizado, podendo o mesmo passar posteriormente por uma etapa adicional de esterilização (usando óxido de etileno ou qualquer outro método conhecido por um técnico no assunto, como por exemplo, usando radiação gama).

Exemplo 3b - Protocolo de esterilização do biomaterial descelularizado .

[0112] Em outra modalidade do presente pedido, a etapa de esterilização se deu usando óxido de etileno. Após as etapas de descelularização e desidratação como descritas no presente pedido, as amostras do biomaterial foram então cortadas em dimensões especificas para realização dos testes, e secas a temperatura ambiente por cerca de 30 minutos a 1 hora. Após a secagem foram embaladas e seladas em papel grau cirúrgico, garantindo a identificação e vedação para verificar a esterilização por óxido de etileno posteriormente .

[0113] As amostras foram então submetidas a um processo de esterilização por óxido de etileno e aeradas por 1 dia. Depois disso foram feitas análises para investigar o crescimento microbiológico durante 14 dias em meio de cultura caldo tioglicolato (30 °C à 35 °C) e caldo triptico de soja - TSB (20 °C à 25 °C).

[0114] Não houve nenhuma alteração macroscópica nas amostras do biomaterial quando comparada à antes do processo de esterilização. Foi verificada a esterilidade do material após esterilização, em meio de cultura após 14 dias. Tanto para o caldo tioglicolato, quanto para o caldo TSB não houve o crescimento microbiológico, apresentando resultado negativo, sendo considerada a amostra satisfatória quanto a sua esterilidade.

[0115] O referido método se mostrou eficaz para ser usado como um método de esterilização do biomaterial.

[0116]

Exemplo 4- Quantificação de colágeno.

[0117] A quantificação de hidroxiprolina (HP) visa à determinação indireta do conteúdo de colágeno do biomaterial produzido. Desta forma, de 5 a 50 mg das amostras foram homogeneizadas em 100 a 400 pL de água deionizada. Posteriormente, conforme protocolo, foi realizada uma curva de diluição do aminoácido (HP).

[0118] Na Figura 5, mostra no lado esquerdo, em triplicata, a curva padrão de hidroxiprolina como controle, com diluições decrescentes dessa substância na vertical. Quanto mais escuro, maior concentração de hidroxiprolina, que é um dos principais componentes do colágeno. No lado direito, três amostras do biomaterial descelularizado individuais tiveram a quantificação de hidroxiprolina realizada em 3 diluições decrescentes na vertical.

[0119] A cada 100 a 400 pL da amostra homogeneizada adicionava-se o valor correspondente (1:1) de HC1 puro. Após esta etapa a solução foi incubada por 3 a 8 horas a 100 a 120 °C. Em seguida, a amostra foi vortexada e centrifugada de 2 a 7 min para remover o precipitado.

[0120] A reação foi preparada em placas de 96 poços em que 5-50 pL das amostras foram adicionados aos poços, assim como 5-50 pL de cada solução da curva de diluição da hidroxiprolina, sendo que o ensaio foi realizado em triplicata. As placas foram secas para remoção do ácido clorídrico. Após a secagem foi adicionado 50-500 pL do reagente Cloramina T (Tampão citrato-acetato, n-propanol 50% e Cloramina T, pH 6,5). As placas foram incubadas a temperatura ambiente de 2 a 10 minutos.

[0121] Por fim, foram adicionados 100 a 500 pL de Reagente de Ehrlich (ácido perclórico, n-propanol e p- Dimetilaminobenzaldeído - DMAB), que interage com a hidroxiprolina da amostra e, consequentemente, causa uma reação colorimétrica em que a intensidade da coloração é proporcional a quantidade do aminoácido (HP) no material. Quanto mais a coloração for escura, maior quantidade de hidroxiprolina na amostra. Desta forma, a amostra foi incubada a 50 a 80 °C por 60 a 120 minutos e realizada a leitura da absorbância a 560 nm. Na Figura 5 é possível visualizar a reação ao final do protocolo, antes da leitura por espectrofotometria.

[0122] De acordo com a quantificação em fragmentos de três amostras do biomaterial descelularizado distintas, a concentração média foi 103,76 pg de hidroxiprolina por miligrama de biomaterial, o que corresponde aproximadamente a 769 pg de colágeno por miligrama de biomaterial.

Considerando que uma esclera liofilizada apresenta em média 370 mg de peso, o conteúdo de colágeno do biomaterial descelularizado produzido corresponde a 76,9% do seu peso. [0123] O resultado mostra que o biomaterial descelularizado apresenta uma alta concentração de hidroxiprolina e, portanto, grande quantidade de colágeno.

Exemplo 5- Teste de desidratação e reidratação do biomaterial descelularizado.

[0124] Este experimento teve como objetivo conhecer e mensurar a capacidade de reabsorção de soluções aquosas ou alcóolicas a partir do biomaterial desidratado. Para isso, fragmentos de diferentes tamanhos do biomaterial descelularizado (por exemplo: 0,6 x 0,6cm; 1,0 x l,0cm; 1,5 x l,5cm) foram inicialmente pesados e em seguida desidratados em etanol em concentrações crescentes (45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% e 100% volume/volume), incubando-os por no mínimo 3 horas em cada concentração. Em seguida, após a desidratação total, os fragmentos foram novamente pesados e submetidos à reidratação e incubados por cerca de 20 minutos a 40 minutos, com ao menos uma substância selecionada do grupo que consite de: água, álcool, substâncias solúveis em água ou álcool, nutrientes, metabólitos, fatores de crescimento, moléculas de sinalização, moléculas regulatórias, hormônio, medicamentos e/ou compostos farmaceuticamente ativos.

[0125] No exemplo aqui descrito, o biomaterial foi submetido à reidratação adicionando volumes fixos de água e incubados por até 30 minutos à temperatura ambiente (com quantificação do volume absorvido a cada 15 minutos). Após a reidratação, os fragmentos foram novamente pesados e o volume reabsorvido foi mensurado (Tabelas 3 e 4).

[0126] Tabela 3: Volume absorvido pelo biomaterial descelularizado :

[0127] Tabela 4: Mensuração do peso após reabsorção:

[0128] De acordo com os resultados o biomaterial descelularizado desidratado e reidratado reabsorve cerca de 1/4 do volume aplicado ou aproximadamente 65,4 pL/cm2.

[0129] Em uma modalidade da invenção, a etapa de desidratação ocorre após as etapas de descelularização e descontaminação do biometarial. Sendo o processo de descontaminação realizado com uma solução que compreende ao menos um antibiótico e/ou antimicótico.

[0130] Em outra modalidade da invenção, a etapa de desidratação pode ser realizada após a descelularização do biomaterial, pondedo ocorrer uma etapa inicial de descontaminação ou não, mas antes de submetê-lo à etapa de esterilização. Sendo o processo de esterilização realizado com óxido de etileno ou por qualquer outro método conhecido por um técnico no assunto, como por exemplo, utilizando radiação gama.

[0131] O produto então obtido pelo referido processo compreende um biomaterial descelularizado, desidratado e descontaminado e/ou esterilizado, que pode ser armazenado, podendo passar então por uma etapa de reidratação e/ou associação com ao menos um composto ativo somente quando for usado.

Exemplo 6- Análise do conteúdo de Colágeno tipo I, Colágeno tipo III e Elastina.

[0132] O objetivo foi identificar qualitativamente a presença de colágeno do tipo I, colágeno do tipo III e elastina no biomaterial descelularizado produzido. De forma resumida, três membranas de nitrocelulose foram sensibilizadas com diminutos fragmentos de escleras in natura, escleras desidratadas e reidratadas e do biomaterial descelularizado produzido. Anticorpos primários contra cada proteína foram utilizadas como controles positivos das reações. Os sítios livres de ligação de proteínas presentes na membrana de nitrocelulose foram bloqueados pela adição do tampão PBS-leite 1-3%, até cobrir as membranas por inteiro, sob agitação, a 20-40°C, por l-5h. Em seguida, as membranas foram lavadas de 1-7 vezes com tampão PBS lx e incubou-se cada membrana com anticorpo primário especifico, diluído em PBS lx, sob agitação a 20-40 °C, por l-5h. Após lavar de 1- 7 vezes com tampão PBS lx-Tween (PBS-T) a 0,05%-l%, incubou- se com os respectivos anticorpos secundários IgG- específicos, marcados com peroxidase, diluídos em PBS, sob agitação a 20-40 °C, por l-5h. Por fim as membranas foram novamente lavadas de 1-7 vezes com tampão PBS-T 0,05% e a reação foi revelada com solução de DAB (3,3'- Diaminobenzidine ).

[0133] A Figura 6 mostra o dot blot das proteínas avaliadas, revelando a presença de cada tipo de proteína, sendo que a Figura 6A mostra o layout do experimento. As Figuras 6B, 6C e 6D são as imagens representativas do dot blot para colágeno do tipo I, colágeno do tipo III e elastina, respectivamente.

[0134] De acordo com os resultados de dot blot a esclera in natura, a esclera desidratada e reidratada e o biomaterial descelularizado produzido, apresentam as três proteínas testadas: colágeno I, colágeno III e elastina.

Exemplo 7- Análise morfológica do biomaterial ao microscópio eletrónico de varredura.

[0135] A análise morfológica do biomaterial descelularizado produzido teve como objetivo avaliar sua estrutura tridimensional, a presença e qualidade das fibras colágenas e a verificação de presença/ausência de células nos diferentes materiais avaliados.

[0136] Amostras da esclera in natura, da esclera desidratada, da esclera desidratada e reidratada e do biomaterial descelularizado produzido foram lavadas em tampão e fixadas em solução fixadora própria para a microscopia eletrónica. Em seguida, o fixador foi removido e as amostras foram submetidas à desidratação progressiva em soluções com concentrações crescentes de álcool etílico. Após a desidratação, as amostras foram secas e armazenadas. As amostras receberam 3 ciclos de cobertura de ouro-paládio no metalizador e visualizadas no microscópio Zeiss EVO MAIO. Todas as análises foram realizadas em triplicata, em várias magnificações, utilizando exposições de 5 a 15kV.

[0137] As Figuras 7A e 7B mostram a microscopia eletrónica de varredura de amostras de esclera in natura, com aumento de 833 vezes e 2900 vezes, respectivamente. A presença de células pode ser claramente visualizada como indicado pela seta na figura 7B.

[0138] As Figuras 8A e 8B mostram a microscopia eletrónica de varredura de amostras de esclera desidratada, nos aumentos de 833 vezes e 7100 vezes, respectivamente. A presença de células pode ser claramente visualizada como indicado pela seta na figura 7B.

[0139] As Figuras 9A e 9B mostram a microscopia eletrónica de varredura de amostras de esclera desidratada e reidratadas, com aumento de 1250 vezes e 2640 vezes, respectivamente . A presença de células pode ser claramente visualizada como indicado pelas setas na figura 7B.

[0140] As Figuras 10A e 10B mostram a microscopia eletrónica de varredura de amostras do biomaterial descelularizado produzido, com aumento de 923 vezes e 5520 vezes, respectivamente. Não foi identificada a presença de células, bem como as fibras de colágeno e elastina permanecem sem alteração aparente ou relevante.

[0141] As análises por microscopia eletrónica demonstraram que o método de descelularização empregado levou a remoção das células do biomaterial, enquanto nos outros grupos em que o materal biológico não passou por processo de descelularização, se observa claramente a presença de células. Além disso, as fibras foram mantidas higidas no biomaterial descelularizado, mostrando que o biomaterial compreende uma matriz fibrosa descelularizada que manteve as caracteristicas de uma matriz biológica sem que a remoção das células apresentasse alterações relevantes quanto a formação e qualidade da matriz fibrosa, quando comparada a esclera in natura, desidratada ou desidratada/reidratadoa . Exemplo 8- Ensaio de biomecânica (módulo de elasticidade e tensão máxima).

[0142] Um ensaio de biomecânica foi realizado para avaliar a resistência das escleras e dos biomateriais produzidos em diferentes condições, de modo a avaliar as propriedades físicas deste biomaterial, possibilitando indicar possíveis aplicações no âmbito da medicina regenerativa. Para este ensaio foram utilizados aproximadamente 12 fragmentos de amostras de escleras (advindas de 12 indivíduos diferentes) nas seguintes condições: esclera in natura, biomaterial descelularizado produzido, biomaterial descelularizado desidratado (em concentrações crescentes de etanol) e biomaterial descelularizado desidratado e reidratado (desidratadas em concentrações crescentes de etanol e reidratadas em água por 30-50 min). Todos os fragmentos foram obtidos da região central de cada esclera in natura, com medidas aproximadas de 5 x 20 x 1 mm (largura x comprimento x espessura). Os corpos de prova (fragmentos) foram submetidos ao ensaio de tração utilizando uma Máquina Universal de Ensaios modelo WDW 38/56 - 1000E da marca TIME Group Inc. Para a obtenção das forças exercidas, foi utilizada uma célula de carga com capacidade máxima de 50 kgf e as deformações foram captadas pelos sensores internos de deslocamento da máquina. O corpo de prova foi fixado em duas garras distanciadas de 5 mm. A velocidade de aplicação da força foi de 2 mm/min.

[0143] A FIGURA 11A mostra um Scatter dot plot do módulo de elasticidade de Young (GPa) para amostras de esclera in natura (In natura), amostras do biomaterial descelularizado (Descelularizado), amostras do biomaterial descelularizado desidratado (Desidratado) e amostras do biomaterial descelularizado desidratado e reidratado (Reidratado). O módulo elasticidade de Young utilizado neste estudo descreve a razão entre a tensão e a deformação na direção da carga aplicada, sendo a máxima tensão que um material suporta sem sofrer deformação permanente. Deste modo, foi possível perceber por meio do parâmetro de elasticidade (E) que as amostras do biomaterial descelularizado desidratado e do biomaterial descelularizado apresentaram significativamente maior rigidez quando comparadas à amostra da esclera in natura. Além disso, a amostra do biomaterial descelularizado desidratado também apresentou rigidez significativamente maior em comparação à amostra do biomaterial descelularizado desidratado e reidratado.

[0144] A FIGURA 11B mostra um Scatter dot plot de Tensão máxima (MPa) para amostras de esclera in natura (In natura), amostras do biomaterial descelularizado (Descelularizado), amostras do biomaterial descelularizado desidratado

(Desidratado) e amostras do biomaterial descelularizado desidratado e reidratado (Reidratado). De modo esperado, o mesmo comportamento foi observado para o parâmetro de tensão máxima (MPa), a qual descreve a tensão máxima que o material suporta ainda no regime elástico de deformação. Sendo assim, as amostras do biomaterial descelularizado desidratado e do biomaterial descelularizado, devido à sua maior rigidez, suportaram um tensão significativamente maior quando comparadas à esclera in natura. O biomaterial descelularizado desidratado, por sua vez, ainda suportou uma tensão significativamente maior em comparação ao biomaterial descelularizado desidratado e reidratado.

[0145] É importante ressaltar que as amostras do biomaterial produzido, independente do tipo de tratamento analisado (Descelularizado, Desidratado ou Reidratado), apresentaram maior resistência (Mpa maior) em relação às amostras in natura. Apesar de suportarem uma maior força aplicada em sua área, também apresentaram uma pequena deformação relativa, que foi próxima ao valor apresentado pela amostra in natura. Tais caracteristicas confirmam o potencial de aplicações variadas para o biomaterial produzido como por exemplo: em processos de reparação e/ou regeneração tecidual, preferencialmente de tecido ósseo, de tecido cartilaginoso, de articulações, de tendão, de pele, para fins proféticos em implantodontia e/ou traumatologia buco-maxilo-facial, para procedimentos cirúrgicos de preenchimento e/ou correção anatômica, ou na produção de próteses.

Exemplo 9- Implante subcutâneo do biomaterial descelularizado para verificação de inflamação local.

[0146] Para avaliação da resposta inflamatória da presença do biomaterial em animal experimental, implantou- se o biomaterial de forma subcutânea na região dorsal de ratos.

[0147] Os animais foram anestesiados com isofluorano, foi realizada tricotomia e antissepsia da região e, logo após, foram realizadas incisões longitudinais com lâmina de bisturi. A região subcutânea foi divulsionada com auxilio de uma tesoura de ponta romba e, em seguida, introduzido um fragmento do biomaterial descelularizado de 0,5 cm x 0,5 cm x 0,2 cm em uma das incisões e, em outra incisão, foi feita somente a divulsão dos tecidos sem introdução de nenhum biomaterial, para ser utilizada como controle. As incisões foram suturadas e os animais foram mantidos em observação até o fim da anestesia. A eutanásia dos animais foi realizada após 5 e 15 dias (inflamação aguda e crónica, respectivamente) da implantação do biomaterial. A região do implante foi retirada, fixada em formol a 10% para análise histológica e coloração em HE (imagens representativas desse procedimento na Figura 12). O exame histológico teve por finalidade avaliar a intensidade de reação inflamatória do tecido circunvizinho, presença de vasos, fibroblastos, células gigantes multinucleadas e integração do tecido. [0148] As Figuras 12 A-D ilustram o procedimento de implantação, no tecido subcutâneo de ratos, do biomaterial descelularizado .A Figura 12A mostra os animais sob anestesia com máscara com isofluorano. A Figura 12B mostra a implantação do biomaterial. A Figura 12C mostra a sutura das incisões. A Figura 12D mostra a retirada da região dos implantes após 5 ou 15 dias de cirurgia.

[0149] Para a análise das imagens seis campos dos cortes histológicos foram selecionados e classificados com scores de acordo com a presença e intensidade de inflamação aguda e/ou crónica, fibroblastos, vasos e células gigantes multinucleadas, conforma tabela abaixo.

[0150] Tabela 5: Score dos parâmetros de análise

[0151] As análises foram feitas por 4 avaliadores independentes, em todos os campos selecionados. Foi calculada a média dos scores de cada animal, atribuído por cada avaliador e feita comparação entre os resultados de 5 e 15 dias.

[0152] A Figura 13 mostra uma imagem representativa de um corte histológico corado por HE do grupo controle, mostrando inflamação aguda após 5 dias. Já a Figura 14 mostra imagens representativas do corte histológico do implante subcutâneo de bimaterial após 5 dias de implantado. O inserto evidencia um campo determinado, mostrando a área de contato do infiltrado inflamatório com o biomaterial.

[0153] A Figura 15 mostra uma imagem representativa do campo histológico do implante subcutâneo de biomaterial após 5 dias de implantado. As setas indicam fibroblastos infiltrados no biomaterial (material evidenciado ao lado direito) e o circulo pontilhado é um exemplo de vaso sanguíneo.

[0154] A Figura 16 mostra imagens representativas do corte histológico do implante subcutâneo de biomaterial após 15 dias de implantado. O inserto evidencia um campo determinado, mostrando a área de contato do infiltrado inflamatório com o biomaterial implantado.

[0155] A Figura 17 mostra imagem representativa do campo histológico do implante subcutâneo de biomaterial após 15 dias de implantado. As setas indicam fibroblastos infiltrados no biomaterial (material evidenciado ao lado esquerdo). Círculos pontilhados indicam vasos sanguíneos.

Retângulos pontilhados indicam células gigantes multinucleadas .

[0156] Utilizando o score visual pré-determinado pelo grupo de pesquisa, a análise histológica sugere interação do biomaterial descelularizado implantado com o tecido adjacente, sem apresentar sinais de rejeição grave. As Figuras 18 A-D mostram uma análise estatística dos parâmetros avaliados (***: p = 0,0006; **: p = 0,0015; *: p = 0,038). [0157] Verifica-se diferença significativa na comparação da intensidade de inflamação aguda, sendo maior no grupo de 5 dias pós-implante, quando comparado ao respectivo controle (Figura 18A). Já em relação a presença de fibroblastos, nota- se aumento significativo na quantidade destas células no grupo de 15 dias pós-implante, tanto comparado com o grupo 5 dias pós-implante quanto ao grupo controle 5 dias (Figura 18B). A vascularização, por sua vez, apresentou aumento significativo no grupo de 5 dias pós-implante quando comparado ao seu respectivo controle (Figura 18C), enquanto a presença de células gigantes apresentou aumento significativo no grupo de 15 dias pós-implante em relação ao grupo controle 5 dias (Figura 18D). Apesar de não haver diferença estatística na análise referente à presença de vasos, visualmente foi possível perceber uma neovascularização no interior do biomaterial, após 15 dias do implante; sugerindo integração pelo organismo. Além disso, a presença de maior número de fibroblastos migrando para o interior do biomaterial com 15 dias de implantação sugere que há remodelamento e ou degradação tecidual na região periférica ao biomaterial.

[0158] De acordo com os resultados referentes ao implante subcutâneo de biomaterial não observou-se indução de resposta inflamatória exacerbada, sendo que o processo inflamatório detectado faz-se importante para o remodelamento tecidual gradual, visto que a presença de fibroblastos aumenta quando comparados os grupos de 15 e 5 dias, possibilitando migração mais profunda e possivelmente caracterizando a integração do implante de biomaterial ao tecido local. No tempo de execução do experimento não foram detectados sinais de rejeição grave de acordo com as análises histológicas e macroscópicas ao retirar o material após o tempo experimental, sugerindo que o biomaterial apresenta caracteristicas promissoras para aplicações em engenharia de tecidos e medicina regenerativa.

Exemplo 10- Implante do biomaterial em lesão de tendão [0159] Para demonstrar o potencial de uso do biomaterial descelularizado no reparo e/ou regeneração de tecidos, foram realizados experimentos de implantação do referido biomaterial ín vivo.

[0160] O experimento buscou analisar o efeito da implantação do biomaterial descelularizado desidratado na lesão do tendão de carneiros. [0161] Para o estudo foram utilizados carneiros machos, de idade entre 2 e 4 anos. Todos os animais foram submetidos à anestesia geral e foram usados todos os cuidados de assepsia, éticos e técnicas requeridas para um procedimento cirúrgico. Após retirada de um fragmento do tendão foi realizada a colocação do implante feito do biomaterial produzido pelo método descrito no presente pedido e fixado ao osso com um parafuso de titânio e sutura na extremidade do tendão.

[0162] O pós operatório foi acompanhado e os animais receberam antibióticos, anti-inflamatórios e analgésicos. Durante o acompanhamento, foram realizados vídeos para a avaliação de claudicação (avaliação do comprometimento da marcha), 48 horas após a cirurgia e periodicamente até o momento da eutanásia.

[0163] Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos com cinco animais cada, para serem eutanasiados no primeiro tempo experimental de 49 dias (D49) e segundo tempo experimental de 114 dias (D114) de pós-operatório. Nos dias das eutanásias, os animais foram avaliados clinicamente apresentando mucosa, sinais vitais e comportamento normais. [0164] Após a incisão, na mesma região da cirurgia anterior, a peça cirúrgica foi coletada e armazenada em solução contendo formol a 10% e encaminhada para realização de lâminas histológicas coradas com hematoxilina e eosina. [0165] Foi realizada a avaliação da claudicação e análise histológica em ambos os tempos experimentais (D49 E D114). Baseada nas avaliações de todos os animais, apenas um animal do grupo de 49 dias apresentou piora na claudicação, os demais apresentaram desempenho favorável e positivo na caminhada. Além disso, foi feita a análise histológica do tecido e implante de ambos os tempos experimentais, que mostrou uma interação das células do hospedeiro com a região periférica do implante.

AVALIAÇÃO DA CLAUDICAÇÃO DOS ANIMAIS .

[0166] Para avaliação da claudicação foram considerados os seguintes parâmetros: ausente, quando o animal trota sem claudicação; leve, quando o animal caminha com leve desequilíbrio; moderado, quando a claudicação é intercalada com caminhada; severo, quando o animal não consegue firmar a pata durante a caminhada.

[0167] Considerando os animais de ambos tempos experimentais (D49 e D114) foi realizada a primeira avaliação de claudicação logo após 48 horas do procedimento cirúrgico. Nessa análise, apenas um animal não apresentou claudicação severa. Após 15 dias do procedimento cirúrgico, todos os animais apresentaram boa evolução da marcha. Na avaliação após 30 dias, dois animais apresentaram piora na claudicação, apresentando tropeços, sendo um do D49 e outro do D114. Os demais tiveram claudicação leve ou mantiveram o padrão anterior. Após 45 dias, todos os animais apresentaram melhora relativa comparada a última análise, exceto um animal do grupo D114 que voltou a ter dificuldade em firmar a pata. [0168] No dia da eutanásia do primeiro grupo (D49), apenas um animal teve evolução com piora da claudicação. Os demais animais conseguiam caminhar sem claudicação ou trotar sem desequilíbrio severo. As avaliações prosseguiram com os animais do segundo tempo experimental e até o dia da eutanásia (D114), mantiveram o parâmetro de claudicação leve/ausente ao trotar.

[0169] Com base nas avaliações realizadas nos dois tempos experimentais, ao comparar a evolução integral das análises (dia da cirurgia até o dia da eutanásia), observou- se piora da marcha em apenas um animal do grupo D49. Todos os demais animais tiveram um bom desfecho final com a função de marcha recuperada.

AVALIAÇÃO HISTOIÓGICA

[0170] Após a avaliação histológica qualitativa do grupo D49, foi possível observar a presença de processo inflamatório intenso e difuso ao redor do implante. Houve, aparentemente, uma interação entre o implante do biomaterial descelularizado e as células do hospedeiro, que migravam entre as fibras colágenas, na periferia do tecido implantado

(Fig. 19A).

[0171] A Figura 19 (A) mostra o infiltrado inflamatório difuso e o biomaterial descelularizado implantado no grupo experimental D49 e a Figura 19 (B) mostra o infiltrado inflamatório (indicado por { }) menos difuso e mais definido ao redor do biomaterial descelularizado implantado (indicado por *) no segundo grupo experimental D114.

[0172] A região entre o tendão lesionado e o implante apresentou-se com fibras desorganizadas, hipercelularizadas, diferente do que é observado em um tendão nativo saudável (Fig. 20).

[0173] A Figura 20 (A) mostra a região do biomaterial implantado (indicado por *); tendão nativo lesionado (indicado por bb) e região intermediária ao tendão nativo e ao implante (em destaque. A Figura 20 (B) mostra o tecido adjacente ao tendão nativo lesionado, com fibras desorganizadas e hipercelularizadas. Já a Figura (C) mostra o tendão nativo saudável que foi retirado para substituição pelo implante. A Figura (D) mostra em maior aumento de uma região do tendão nativo saudável.

[0174] Foi possível perceber na maioria das análises a presença de neovascularização e também o aumento da quantidade de células no interior dos vasos sanguíneos, em regiões próximas ao tecido implantado (Fig. 21). Visualizou- se ainda algumas regiões de tecido neoformado, com características semelhantes a um tecido conjuntivo frouxo, próximo ao defeito do tendão. [0175] A Figura 21 mostra a presença de vasos sanguíneos e hiperemia na região de interação do tecido nativo com o implante de biomaterial no primeiro tempo experimental D49 (indicado peloas setas).

[0176] Em algumas amostras, na região externa ao implante e ao tendão lesionado, também foi possível observar macroscopicamente um tecido neoformado, recobrindo toda a extensão da lesão, e microscopicamente este tecido apresentou características de um tecido conjuntivo frouxo (Fig. 22).

[0177] A Figura 22 mostra uma imagem microscópica do tecido conjuntivo frouxo (indicado por ]), que recobre a região de tendão lesionado (indicado por #).

[0178] No segundo tempo experimental D114, foi possível observar a presença do infiltrado inflamatório, porém menos difuso e mais definido ao redor do implante, com menor quantidade de células (Fig. 19B). Além disso, em algumas lâminas encontrou-se a presença de algumas regiões de tecido neoformado e/ou remodelado juntamente ao implante, mostrando uma aparente deposição de matriz extracelular e um aumento do número de fibras, mais compactas e paralelas na região do defeito em continuidade tanto com o implante, quanto com o tecido nativo, o que sugere uma remodelação tecidual gradativa com discreta intenção de organização de suas fibras na mesma direção das fibras do tendão nativo (Fig. 23 A e B).

[0179] As Figuras 23 (A) e (B) mostram o implante de biomaterial descelularizado em interação com o tendão nativo no segundo tempo experimental. Observa-se o implante (indicado por *) sendo infiltrado pelas células do hospedeiro; com predomínio daquelas com características de fibroblastos (indicado pelas setas grossas). As fibras na região de interação implante-tendão (indicado pelas setas pretas) apresentam tendência de se organizarem com o aumento da compactação e do arranjo paralelo entre elas; tornando- se, nesta região do implante, com aspecto histológico de organização tecidual semelhante ao do tendão nativo (indicado por #).

[0180] De modo geral, neste segundo tempo experimental foi possível observar o predomínio de células semelhantes à fibroblastos infiltrando o tecido do implante, diferente das células que foram observadas no primeiro tempo experimental (Fig. 24 A e B). Sugere-se a ocorrência de inflamação aguda intensa no tempo inicial, com redução da inflamação no segundo tempo, mostrando diminuição e alteração dos tipos celulares e tendência de reparo da lesão.

[0181] As Figuras 24 (A) e (B) mostram o perfil de células predominantes que infiltraram o implante: primeiro tempo experimental D49 (A) e segundo tempo experimental

Dl14 (B). [0182] Com base nos achados histológicos e avaliação comparativa entre os dois tempos experimentais, pode-se inferir que o implante do biomaterial descelularizado produzido pelo método descrito no presente pedido atuou de forma eficiente para permitir a infiltração celular e ainda propiciou um ambiente favorável para que estas células utilizassem este scaffold na tentativa de indução de reparo e/ou remodelamento da lesão, embora o tempo experimental não tenha sido suficiente para visualização da completa integração do implante ou reparo completo da lesão. Além disso, os aspectos clínicos, macroscópicos e histológicos não apresentaram sinais de infecção e/ou rejeição do biomaterial, sugerindo boa interação deste implante durante os tempos experimentais avaliados.

[0183] O implante do biomaterial descelularizado mostrou potencial de remodelação tecidual, possibilitando a rescelularização principalmente em sua periferia e permitiu a vascularização da região e favoreceu a deposição de matriz extracelular, que são fatores essenciais para a remodelação do tecido lesionado.

Exemplo 11- Implante do biomaterial em osso.

[0184] Para verificar o potencial do uso do biomaterial como um enxerto em um processo de reparação e regeneração tecidual e também como um carreador de substâncias ativas foi realizado um experimento de implante ósseo in vivo, mais especificamente, um implante na face vestibular do osso alveolar da maxila de cães.

[0185] Foram utilizados cães machos e fêmeas, de idade entre 2 a 8 anos. Todos os animais foram submetidos à anestesia geral e foram usados todos os cuidados de assepsia, éticos e técnicas requeridas por um procedimento cirúrgico. [0186] O ensaio foi composto por três grupos experimentais. No grupo primeiro grupo chamado CONTROLE, foi utilizado o material comercializado padrão para regeneração óssea, o Geistlich Bio-Oss® de 0.25 g; no segundo grupo foi utilizada o biomaterial descelularizado desidratado, chamado grupo BIOMATERIAL; e no terceiro, o biomaterial descelularizado desidratado, carreando sinvastatina a 2,5%, chamado de grupo BIOMATERIAL COM COMPOSTO ATIVO.

[0187] Foram realizadas incisões longitudinais com lâmina de bisturi n° 15 na gengiva inserida e posteriormente o periósteo foi incisado e descolado ao longo da área óssea a ser exposta, permitindo, assim, acesso direto ao osso alveolar. Com broca cirúrgica Carbide n° 701, tronco-cónica foram feitas ranhuras na superfície óssea receptora com tamanho médio de 0,5 x 0,75 cm, sempre com irrigação externa com soro fisiológico concomitante e ininterrupta para prevenção do superaquecimento da porção óssea. Após o posicionamento do biomaterial sobre as ranhuras, o periósteo e a gengiva foram reposicionados para a síntese cirúrgica, por meio de pontos isolados, com fio monofilamentar de nylon

(4-0), montado em agulha atraumática semicircular de 1,5 cm de comprimento. Após o procedimento cirúrgico, os animais receberam doses de antibiótico, anti-inflamatório e analgésico durante três dias consecutivos.

[0188] Fragmentos do local da cirurgia foram removidos após 49 (D49) e 130 (D130) dias. As amostras foram fixadas em solução contendo formol a 10%, desidratadas em concentrações crescentes de etanol, diafanizadas em xilol, infiltradas, incluídas em parafina e coradas com hematoxilina e eosina para posterior análise histológica ao microscópio de luz.

AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA

[0189] De acordo com a avaliação histológica qualitativa, nas lâminas representativas do grupo CONTROLE D49 foram observadas formação de blasfemas ósseos na lâmina própria da gengiva inserida, circundantes aos fragmentos do biomaterial. A área do blasfema é compatível com o início do processo de formação do tecido ósseo, com presença de células típicas, como osteócitos, osteoblastos e osteoclastos. É possível constatar a prematuridade do processo, a partir da análise da distribuição desorganizada das fibras de colágeno e presença de osteócitos e osteoblastos e vasos sanguíneos inseridos na matriz, achados comuns ao tecido ósseo imaturo

(Figura 25). [0190] As Figuras 25 mostram lâmina própria da mucosa oral com presença dos grânulos do enxerto ósseo comercial implantado (indicado por *). Em (A) é possível observar o tecido conjuntivo denso onde o enxerto está implantado (indicado por #) e tecido conjuntivo frouxo na parte superior (inciado por colchete). Em (B), observa-se em destaque o grânulo do enxerto comercial (indicado por *) com a formação do blastema ósseo adjacente, sendo este processo ampliado e detalhado em (C) e (D), do grupo controle D49.

[0191] Notou-se, também, aumento discreto na quantidade de vasos sanguíneos próximo aos grânulos do enxerto ósseo comercial e hiperemia leve, condição que poderia favorecer a nutrição tecidual e, consequentemente, contribuir para o desenvolvimento do tecido em questão. Deste modo, infere-se que a presença dos grânulos induziu a formação óssea, com matriz extracelular irregular, típico de osso imaturo.

[0192] No tempo experimental D130 do grupo CONTROLE observou-se resposta semelhante ao primeiro tempo experimental, com osso primário contendo grande quantidade de osteócitos no interior da matriz neoformada e regiões mais organizadas, com arranjo lembrando a formação de Sistemas de Havers próximas aos grânulos do enxerto comercial (Figura 26).

[0193] As Figuras 26 mostram o grupo controle D130. Em

(A) observa-se a presença dos grânulos de enxerto ósseo comercial (indicado por *) na lâmina própria, externas ao periósteo do osso alveolar (indicado por [), além da presença do grânulo em destaque incluída no osso neoformado (indicado por #). A área destacada em (B) foi ampliada em (C) para análise, onde visualizam-se linhas de crescimento (indicado por setas) próximas a região do biomaterial e de formação de Sistemas de Havers (indicado por **). Em maior aumento, percebe-se deposição de fibras colágenas mais organizadas e orientadas ao redor das partículas, assim como células osteogênicas ao redor do biomaterial (D).

[0194] No grupo BIOMATERIAL D49 foi possível observar o contato íntimo do biomaterial descelularizado com o osso alveolar do animal, com um número elevado de células entremeando a região da esclera e angiogênese dentro do biomaterial, características essas marcantes neste tempo experimental. Não foram visualizadas áreas com infiltrado inflamatório significativo (Figura 27).

[0195] As Figuras 27 mostram o grupo BIOMATERIAL D49. Em

(A), nota-se a região da lâmina própria da gengiva inserida e tecido ósseo do animal experimental (indicado por [), implante de biomaterial descelularizado (indicado por *) adjacente ao osso alveolar do animal (indicado por [). Em

(B) observa-se por ampliação de (A), detalhes do implante e do tecido ósseo em formação (indicado por #), onde é possível verificar a interação do biomaterial com o osso e prováveis células osteoprogenitoras invadindo o biomaterial e presença de células no biomaterial descelularizado assim como vasos sanguíneos (indicado por setas).

[0196] No grupo BIOMATERIAL D130 é notória a presença de numerosos vasos sanguíneos, propondo moderada angiogênese no interior do implante de biomaterial desceliuarizado e contato íntimo do referido implante com uma região que sugere discreta formação óssea. A formação óssea apresentou um padrão desorganizado ou ligeiramente organizado, não diferindo do tempo inicial, D49. No biomaterial também foram observadas células entremeadas no seu interior e na região adjacente ao osso do animal experimental (Figura 28).

[0197] As Figuras 28 mostram o grupo BIOMATERIAL D130. Em (A) observam-se áreas de íntima integração entre o implante de biomaterial e o osso do animal (indicado por [) e implante e tecido conjuntivo frouxo (indicado por {). O implante de biomaterial descelularizado (indicado por #) apresenta agora possíveis células osteoprogenitoras em seu interior e presença de pequeno infiltrado celular entremeando suas fibras. Em (B), destaca-se a presença de possíveis adipócitos, com provável origem a partir da medula óssea (indicado por setas). Em (C) e (D) nota-se a deposição do osso recém formado (indicado por *) sobre o biomaterial implantado.

[0198] Sabendo-se que a angiogênese e a migração celular são importantes no processo de reparo do tecido ósseo e que biomateriais osteocondutores são utilizados para direcionar as células de forma mais rápida e apropriada no reparo do osso, sugere-se um papel osteocondutor do biomaterial descelularizado como produzido pelo método descrito pelo presente pedido de patente.

[0199] No grupo BIOMATERIAL COM COMPOSTO ATIVO, onde se avaliou a capacidade do biomaterial ser usado em combinação com substâncias ativas, servindo também como um carreado, nesse caso usando a sinvastatina, a avaliação histológica demonstrou a presença de maior volume ósseo em comparação aos demais grupos (Figura 29), onde é possível observar o osso alveolar e áreas de neoformação óssea adjacentes.

[0200] A Figura 29 mostra o grupo BIOMATERIAL COM COMPOSTO ATIVO D49 . Onde o A imagem é uma fotomicrografia demonstrando a presença do epitélio da mucosa gengival (indicado por seta), lâmina própria (indicado por [) da mucosa e a região onde foi posicionada o biomaterial com sinvastatina (indicado por {) adjacente ao osso alveolar do animal (indicado por*). Observa-se destacada no retângulo região de neoformação óssea (#).

[0201] A área de formação óssea no grupo BIOMATERIAL COM COMPOSTO ATIVO D49 apresentou as trabéculas ósseas integradas, caracteristicas do processo de maturação do osso. Além disso, nota-se em região de osso imaturo, com grande quantidade de osteócitos e a presença de pequenas cavidades medulares contendo vasos sanguíneos (Figura 30). [0202] As Figuras 30 mostram o grupo BIOMATERIAL COM COMPOSTO ATIVO D49. Região de interação entre o biomaterial com sinvastatina e osso alveolar (A) e tecido conjuntivo (inciado por [). Observa-se um maior volume ósseo neoformado (indicado por *) adjacente e integrado ao osso alveolar (indicado por #), infiltrado celular e vasos sanguíneos no interior das trabéculas ósseas recém formadas (indicado por *). O osso recém formado possui fibras de colágeno desorganizadas conforme apresentado na imagem (B) e linhas de crescimento (indicado por setas em A e B) que o distingue do osso alveolar.

[0203] No segundo tempo experimental do grupo BIOMATERIAL COM COMPOSTO ATIVO (D130) foi observado um comportamento similar em relação ao tempo D49, e presença de um maior volume ósseo neoproduzido, adjacente e delimitado pela linha de crescimento do osso alveolar (Figura 31). Além disso, observa-se também a presença de mastócitos na região próxima ao biomaterial, comprovadamente relacionados com o processo de remodelação tecidual, assim como a maior presença de vasos sanguíneos e de células interagindo com o implante de biomaterial.

[0204] As Figuras 31 mostram o grupo BIOMATERIAL COM

COMPOSTO ATIVO D130. Em (A) e (B) nota-se a presença de mastócitos (indicado por e outros tipos celulares no interior do biomaterial com sinvastatina. Linhas de crescimento (indicado por setas) separam o osso alveolar maduro (indicado por [) do recém formado (indicado por *). Tecido conjuntivo do próprio animal (indicado por {).

[0205] O biomaterial descelularizado produzido pelo método descrito no presente pedido de patente aparentemente apresentou um papel osteocondutor e osteoindutor, além de favorecer a migração celular. Além disso demonstrou a possibilidade de ser usado em combinação com compostos ativos, carreando por exemplo compostos diretamente ao local do implante. A sinvastatina é um fármaco utilizado no tratamento da hiperlipidemia e possui efeitos pleiotrópicos osteogênicos e antirreabsortivos já estudados ín vitro (mostrando alteração na dinâmica celular resultante dos efeitos da sinvastatina no tecido ósseo, que estão associados com o aumento da expressão de proteína óssea morfogenética- 2 (BMP-2), estimulando a proliferação e diferenciação dos osteoblastos) . Deste modo, o implante do biomaterial descelularizado favoreceu a formação óssea e quando associado a sinvastatina apresentou melhor desempenho comparado aos outros grupos experimentais.

Exemplo 12- Implante do biomaterial em lesão de cartilagem.

[0206] Para verificar o potencial do uso do biomaterial como um enxerto, scaffold biológico, em um processo de reparação e regeneração tecidual, foi realizado um implante do biomaterial descelularizado produzido pelo método descrito pelo presente pedido de patente em lesão causada em tecido cartilaginaoso ín vivo, mais especificamente um implante do biomaterial em lesão causada em joelhos de ovinos.

[0207] Foram utilizados carneiros machos com idade aproximada de 18 meses e peso corpóreo entre 48-56kg. Os animais foram submetidos ao protocolo anestésico, todos os cuidados de assepsia, éticos e técnicas requeridas por um procedimento cirúrgico, bem como ao protocolo de artrotomia femurotibiopatelar medial, com a patela rebatida lateralmente e articulação femurotibial flexionada. Foi utilizada fresa óssea para o desgaste articular de 6mm de diâmetro e aproximadamente 3 mm de profundidade, até a exposição do osso subcondral. Um fragmento da membrana de 7mm de diâmetro foi adaptada e inserida no local da lesão. Após a ráfia e recuperação pós-anestésica, os animais foram encaminhados para as baias, acompanhados diariamente com exames clínicos e imobilizados com bandagem por 5 dias. [0208] Após 30 dias da realização do procedimento cirúrgico, os animais foram eutanasiados por medicação pré- anestésica e o local da cirurgia foi removido. A peça cirúrgica foi fixada em formol a 4% e desmineralizada com solução de ácido fórmico. Seguiu-se os procedimentos para realização das lâminas histológicas, coradas por Hematoxilina e Eosina.

[0209] Na análise histológica foi possível observar (Figura 32) boa interação do biomaterial implantado, mais particularmente das fibras colágenas do implante de biomaterial com o tecido ósseo nativo.

[0210] A Figura 32 mostra um corte histológico do grupo que sofreu a lesão em cartilagem e recebeu o implante, em um tempo experimental de 30 dias pós-cirurgia.A linha tracejada indica a delimitação aproximada do implante no local da lesão. O colchete (]) indica a região de cartilagem articular nativa e as setas ilustram a interação com o tecido ósseo (região subcondral).

[0211] Nas extremidades do implante de biomaterial observou-se intensa infiltração de fibroblastos do animal, acompanhada de deposição de nova matriz extracelular, o que conduziu a ausência de delimitação exata das bordas, demonstrando importante integração do implante de biomaterial aos tecidos adjacentes (Figura 33C).

[0212] As Figuras 33 mostram um corte histológico do grupo que sofreu a lesão em cartilagem e recebeu o implante, em um tempo experimental de 30 dias pós-cirurgia. A figura

(A) é uma imagem representativa do corte histológico com as regiões demarcadas que foram ampliadas para uma melhor análise em (B) e (C). Na figura (B), as setas indicam a região de integração entre a cartilagem articular e o tecido conjuntivo neoformado, indicando impostante integração com o implante. Os círculos indicam as figuras de mitose dos condrócitos. A figura (C) mostra a região do implante de biomaterial com infiltrado de fibroblastos, deposição de nova matriz extracelular, que conduz para a perda da delimitação das bordas, devido a boa integração entre os tecidos (inferior esquerdo).

[0213] Nas adjacências do implante de biomaterial foram encontradas também células inflamatórias, com predomínio de mononucleares, como linfócitos, macrófagos e plasmócitos, que corresponde a uma etapa do processo de reparação. Não houve sinais de rejeição do biomaterial, como a presença de células gigantes multinucleadas (células gigantes de Langerhans) ou processo de encapsulamento, em nenhum dos animais analisados.

[0214] Na superfície superior do implante foi observado um tecido conjuntivo neoformado, com importante integração com o tecido cartilaginoso. Nesta região percebeu-se a presença de figuras de mitose de condrócitos na borda da lesão, evidenciando proliferação cartilaginosa, o que demonstra o potencial de reparo tecidual do implante de biomaterial produzido pelo método descrito pelo presente pedido de patente (Figura 33B). Exemplo 13- Implante do biomaterial para preenchimento e correção anatômica.

[0215] Para verificar o potencial do uso do biomaterial em um processo de preenchimento e correção anatômica, foi realizado um implante do biomaterial em um ser humano que apresentava retenção da pálpebra em um dos olhos (indicado por seta na Figura 34 A).

[0216] 0 implante de biomaterial foi então preparado no tamanho adequado para ser impantado cirurgicamente na pálpebra desejada (Figura 34 B-D).

[0217] A Figura 34 (E) mostra o resultado da cirugia logo após a realização do procedimento. Já a Figura 34 (F) mostra o resultado da cirurgia de preenchimento e correção anatômica usando o biomaterial descelularizado do presente pedido de patente, após cerca de 10 meses do referido procedimento cirúrgico. O paciente não apresentou rejeição ao biomaterial implantado, bem como o preenchimento e correção anatômica foi um sucesso, recuperando esteticamente a simetria dos olhos do paciente.

[0218] Desta forma o presente pedido descreve um método de produção de biomaterial descelularizado que compreende as etapas de:

- coletar, processar e higienizar o tecido biológico, preferencialmente em que o tecido biológico é derivado de tecido conjuntivo ocular, preferencialmente escleras de origem suína, bovina, de coelho ou humana;

- submeter o biomaterial descelularizado obtido a um processo de descelularização compreendendo: a- lavar o tecido biológico de 1 a 5 vezes utilizando tampão isotônico entre 1 a 20 minutos, à temperatura de entre 0 a 25 °C, sob agitação de entre 80 a 200rpm; b- incubar o tecido biológico utilizando tampão hipotônico, por 1 a 18 horas, à temperatura de entre 4 a 37 °C sob agitação de entre 80 a 200 rpm; c- tratar o tecido biológico com tampão detergente, por 5 a 24 horas, à temperatura de entre 4 a 37 °C sob agitação entre de 80 a 200 rpm; d- lavar o tecido biológico com água deionizada por 30 minutos a 4 horas, à temperatura de entre 4 a 37 °C sob agitação de entre 80 a 200 rpm; e- lavar o tecido biológico de 1 a 5 vezes com tampão isotônico, por 5 a 15 minutos, à temperatura de entre 4 a 37 °C sob agitação de entre 80 a 200 rpm; f- incubar o tecido biológico com tampão de Nucleases, entre 30 minutos e 3 horas, à temperatura de 30 a 40 °C, sob agitação de entre 80 a 200 rpm; e g- lavar o tecido biológico com tampão salino- fosfato (PBS) compreendendo de 0,05 a 1% m/v de EDTA, de 1 a 2 vezes, por até 5 minutos, à temperatura de 25 a 37°C, sob agitação de entre 80 a 200 rpm; e

- submeter o biomaterial descelularizado obtido a um processo de descontaminação e/ou esterilização.

[0219] Ademais, a agitação nas etapas (a) a (g) varia de entre 90 a 190 rpm. O referido tampão isotônico das etapas (a) e (e) é uma solução salina TRIS tamponada (TBS) compreendendo de 10 - 100 mM TRIS e 100 - 200 mM NaCl. O tampão hipotônico da etapa (b)compreende de 5 a 20mM de TRIS; de 0,05 a 1% m/v de EDTA e pH de entre 6 a 8. O tampão detergente da etapa (c) compreende de 5 a 20mM de TRIS; de 0,05 a 1% m/v de EDTA; e de 0,05 a 2% m/v de SDS. O tampão de nucleases da etapa (f) compreende de 10 a 50 mM de TRIS; de 2 a 10 mM de MgC12; de 1 a 80 U/mL de DNAse; e/ou de 0,05 a 80 U/mL de RNAse. A etapa (d) compreende ao menos uma troca da água de lavagem na metade do tempo total. O referido método pode ser realizado de forma semi-automatizada para produção em larga escala, preferencialmente as etapas (a) a (g) podem ser realizadas em biorreator.

[0220] A etapa de descontaminação do biomaterial descelularizado compreende o uso de ao menos um antibiótico e/ou antimicótico.

[0221] A etapa de descontaminação do biomaterial descelularizado usando antibiótico e/ou antimicótico compreende : i- lavar o biomaterial descelularizado ao menos uma vez com tampão salino-fosfato (PBS) estéril; ii- embeber o biomaterial descelularizado em tampão salino-fosfato (PBS) estéril contendo solução concentrada de antibiótico e/ou antimicótico; iii- manter o biomaterial descelularizado embebido na referida solução por cerca de 36 a 60 horas, a uma temperatura de 2 a 8°C; e iv- lavar o biomaterial descelularizado e esterilizado ao menos uma vez com tampão salino-fosfato (PBS) estéril.

[0222] A solução concentrada de antibiótico e/ou antimicótico compreende ao menos um composto com ação antibiótica e ao menos um composto com ação antimicótica. [0223] Preferencialmente a solução concentrada de antibiótico e/ou antimicótico compreende: penicilina, estreptomicina e anfotericina B.

[0224] A etapa de esterilização do biomaterial descelularizado compreende o uso de óxido de etileno ou de qualquer outro método conhecido por um técnico no assunto, como por exemplo o uso de radiação gama

[0225] O referido método de produção do biomaterial descelularizado compreende ainda uma etapa de desidratação que pode ocorrer preferencialmente após uma possível etapa de descontaminação e antes da etapa esterilização.

[0226] A etapa de desidratação compreende submeter o biomaterial descelularizado ou o biomaterial descelularizado e descontaminado a um processo de desidratação em que o referido biomaterial é incubado com concentrações crescentes de um álcool, preferencialmente em que a concentração álcool cresce de 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% até 100% volume/volume, e em que o referido biomaterial é incubado por ao menos 3 horas em cada uma das ditas concentrações de álcool.

[0227] O método ainda pode compreender uma etapa de reidratação do biomaterial desidratado, que pode ocorrer preferencialmente após a etapa de esterilização, em que compreende a incubação do referido biomaterial desidratado, por cerca de 20 a 40 minutos, com ao menos uma substância selecionada do grupo que consite de: água, álcool, substâncias solúveis em água ou álcool, nutrientes, metabólitos, fatores de crescimento, moléculas de sinalização, moléculas regulatórias, hormônio, medicamentos e/ou compostos farmaceuticamente ativos (por exemplo sinvastatina) .

[0228] O pedido também descreve o biomaterial descelularizado produzido pelo referido método, em que compreende uma matriz extracelular descelularizada de origem biológica, em que a dita matriz compreende predominantemente fibras de colágeno tipo I, III e elastina. O biomaterial pode ser usado em combinação com ao menos uma sustância ativa ou pode compreender ao menos uma substância ativa selecionada do grupo que consiste de: substâncias solúveis em água ou álcool, nutrientes, metabólitos, fatores de crescimento, moléculas de sinalização, moléculas regulatórias, hormônio, medicamentos e/ou compostos farmaceuticamente ativos (por exemplo sinvastatina).

[0229] O biomaterial sendo para uso na produção de um produto scaffold, prótese e/ou carreador de substâncias ativas para liberação sistémica ou localizada em um indivíduo que necessite do mesmo. Por exemplo, mas não limitado há, para uso em processos de reparação e/ou regeneração tecidual, preferencialmente de tecido ósseo, de tecido cartilaginoso, de articulações, de tendão, de pele, para fins proféticos em implantodontia e/ou traumatologia buco-maxilo-facial, para procedimentos cirúrgicos de preenchimento e/ou correção anatômica, ou na produção de próteses.

[0230] Embora o presente pedido de patente tenha descrito a matéria objeto da presente invenção com um certo grau de detalhamento a titulo de ilustração e exemplificação para fins de clareza e compreensão, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas no escopo das reivindicações em anexo.

[0231] Os exemplos descritos neste relatório não são limitativos, permitindo que um técnico no assunto altere alguns aspectos ou componentes da presente invenção, sem se distanciar do escopo da presente invenção.

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O presente pedido de patente refere-se ao campo da engenharia de tecidos. Em particular a um método de produção de biomaterial descelularizado a partir de tecido biológico, bem como o biomaterial descelularizado produzido pelo referido método compreendendo matriz extracelular de origem biológica. Particularmente o referido tecido biológico deriva de tecido conjuntivo ocular de origem animal ou humana. Mais particularmente refere-se a um método de produção de biomaterial descelularizado a partir de esclera animal para produção de scaffold biológico, prótese e/ou carreador de substâncias ativas (ou combinado com substâncias ativas), bem como o biomaterial em si e seus usos como scaffolds, próteses ou carreadores de substâncias para liberação sistémica ou localizada.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1- Método de produção de biomaterial descelularizado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

- coletar, processar e higienizar o tecido biológico; submeter o tecido biológico a um processo de descelularização compreendendo: a- lavar o tecido biológico de 1 a 5 vezes utilizando tampão isotônico entre 1 a 20 minutos, à temperatura de entre 0 a 25 °C, sob agitação de entre 80 a 200rpm; b- incubar o tecido biológico utilizando tampão hipotônico, por 1 a 18 horas, à temperatura de entre 4 a 37 °C sob agitação de entre 80 a 200 rpm; c- tratar o tecido biológico com tampão detergente, por 5 a 24 horas, à temperatura de entre 4 a 37 °C sob agitação entre de 80 a 200 rpm; d- lavar o tecido biológico com água deionizada por 30 minutos a 4 horas, à temperatura de entre 4 a 37 °C sob agitação de entre 80 a 200 rpm; e- lavar o tecido biológico de 1 a 5 vezes com tampão isotônico, por 5 a 15 minutos, à temperatura de entre 4 a 37 °C sob agitação de entre 80 a 200 rpm; f- incubar o tecido biológico com tampão de Nucleases, entre 30 minutos e 3 horas, à temperatura de 30 a 40 °C, sob agitação de entre 80 a 200 rpm; e g- lavar o tecido biológico com tampão salino- fosfato (PBS) com agente quelante, de 1 a 2 vezes, por até 5 minutos, à temperatura de 25 a 37°C, sob agitação de entre 80 a 200 rpm; e

2- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito tecido biológico é derivado de tecido conjuntivo ocular, preferencialmente escleras de origem suina, bovina, de coelho ou humana.

3- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a agitação nas etapas (a) a (g) varia de entre 90 a 190 rpm.

4- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido tampão isotônico das etapas (a) e (e) é uma solução salina TRIS tamponada (TBS) compreendendo de 10 - 100 mM TRIS e 100 - 200 mM NaCl.

5- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão hipotônico da etapa

(b)compreende de 5 a 20mM de TRIS; de 0,05 a 1% m/v de EDTA e pH de entre 6 a 8.

6- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão detergente da etapa

(c) compreende de 5 a 20mM de TRIS; de 0,05 a 1% m/v de EDTA; e de 0,05 a 2% m/v de SDS

7- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão de Nucleases da etapa

(f) compreende de 10 a 50 mM de TRIS; de 2 a 10 mM de MgCl2; de 1 a 80 U/mL de DNAse; e/ou de 0,05 a 80 U/mL de RNAse.

8- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) compreende ao menos uma troca da água de lavagem na metade do tempo total.

9- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido método pode ser realizado de forma semi- automatizada para produção em larga escala, preferencialmente as etapas (a) a (g) podem ser realizadas em biorreator.

10- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a etapa de descontaminação do biomaterial descelularizado compreende o uso de ao menos um antibiótico e/ou antimicótico.

11- Método de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de que a etapa de descontaminação do biomaterial descelularizado usando antibiótico e/ou antimicótico compreende: i- lavar o biomaterial descelularizado ao menos uma vez com tampão salino-fosfato (PBS) estéril; ii- embeber o biomaterial descelularizado em tampão salino-fosfato (PBS) estéril contendo solução concentrada de antibiótico e/ou antimicótico; iii- manter o biomaterial descelularizado embebido na referida solução por cerca de 36 a 60 horas, a uma temperatura de 2 a 8°C; e iv- lavar o biomaterial descelularizado e esterilizado ao menos uma vez com tampão salino-fosfato (PBS) estéril.

12- Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a solução concentrada de antibiótico e/ou antimicótico compreende ao menos um composto com ação antibiótica e ao menos um composto com ação antimicótica.

13- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a etapa de esterilização do biomaterial descelularizado compreende o uso de óxido de etileno ou de radiação gama.

14- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende ainda uma etapa de desidratação que pode ocorrer preferencialmente após uma etapa de descontaminação e antes da etapa esterilização.

15- Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a etapa de desidratação compreende submeter o biomaterial descelularizado ou o biomaterial descelularizado e descontaminado a um processo de desidratação em que o referido biomaterial é incubado com concentrações crescentes de um álcool, preferencialmente em que a concentração do álcool cresce de 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% até 100% volume/volume, e em que o referido biomaterial é incubado por ao menos 3 horas em cada uma das ditas concentrações de álcool.

16- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o método ainda pode compreender uma etapa de reidratação do biomaterial desidratado, que pode ocorrer preferencialmente após a etapa de esterilização, em que compreende a incubação do referido biomaterial desidratado, por cerca de 20 a 40 minutos, com ao menos uma substância selecionada do grupo que consiste de: água, álcool, substâncias solúveis em água ou álcool, nutrientes, metabólitos, fatores de crescimento, moléculas de sinalização, moléculas regulatórias, hormônio, medicamentos e/ou compostos farmaceuticamente ativos.

17- Biomaterial descelularizado caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método tal como definido em qualquer uma das reivindações 1 a 16 em que compreende uma matriz extracelular descelularizada de origem biológica, em que a dita matriz compreende predominantemente fibras de colágeno tipo I, III e elastina.

18- Biomaterial de acordo com a reivindicação 17 caracterizado pelo fato de que compreender ainda substâncias ativas selecionadas do grupo que consiste de: substâncias solúveis em água ou álcool, nutrientes, metabólitos, fatores de crescimento, moléculas de sinalização, moléculas regulatórias, hormônio, medicamentos e/ou compostos farmaceuticamente ativos.

19- Biomaterial de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que é para uso como scaffold, prótese ou carreador de substâncias ativas em um indivíduo que necessite do mesmo.

20- Biomaterial para uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato que é para uso em processos de reparação e/ou regeneração tecidual, preferencialmente de tecido ósseo, de tecido cartilaginoso, de articulações, de tendão, de pele, para fins proféticos em implantodontia e/ou traumatologia buco-maxilo-facial, para procedimentos cirúrgicos de preenchimento e/ou correção anatômica, ou na produção de próteses.

21- Uso do biomaterial descelularizado tal como produzido pelo método definido em qualquer uma das reivindições 1 a 16, caracterizado pelo fato de que é na produção de um scaffold, na produção de próteses e/ou na produção de um carreador de substâncias para liberação sistémica ou localizada em um indivíduo que necessite do mesmo.

22- Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que é para uso em processos de reparação e/ou regeneração tecidual, preferencialmente de tecido ósseo, de tecido cartilaginoso, de articulações, de tendão, de pele, para fins proféticos em implantodontia e/ou traumatologia buco-maxilo-facial, para procedimentos cirúrgicos de preenchimento e/ou correção anatômica, ou na produção de próteses.