WO2021153703A1 - 軟骨形成異常症の治療 - Google Patents

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WO2021153703A1
WO2021153703A1 PCT/JP2021/003133 JP2021003133W WO2021153703A1 WO 2021153703 A1 WO2021153703 A1 WO 2021153703A1 JP 2021003133 W JP2021003133 W JP 2021003133W WO 2021153703 A1 WO2021153703 A1 WO 2021153703A1
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fgfr3
ach
mutation
pharmaceutical composition
dysplasia
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PCT/JP2021/003133
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French (fr)
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範行 妻木
由紀 飯森
三浦　晃敬
洋 平井
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国立大学法人京都大学
大鵬薬品工業株式会社
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    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders

Definitions

  • the present invention relates to the treatment of chondrogenic dysplasia (achondroplasia, chondrogenic hypoplasia, tanatophoric osteodysplasia) using FGFR inhibitors.
  • Fibroblast growth factor is one of the growth factors that is expressed in a wide range of tissues and controls the growth and differentiation of cells.
  • the physiological activity of FGF is mediated by a specific cell surface receptor, the fibroblast growth factor receptor (FGFR).
  • FGFR belongs to the receptor-type protein tyrosine kinase family and is composed of an extracellular ligand binding domain, a transmembrane domain and an intracellular tyrosine kinase domain, and four types of FGFRs have been identified so far (FGFR1). , FGFR2, FGFR3 and FGFR4).
  • FGFR forms a dimer by binding to FGF and is activated by phosphorylation. Receptor activation induces the recruitment and activation of specific downstream signaling molecules to express physiology.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Abnormal FGF / FGFR signaling has been reported to be associated with diseases associated with abnormal human chondrocyte differentiation. Abnormal activation of FGF / FGFR signals in diseases in human chondrocyte differentiation abnormalities has been attributed to FGFR gene mutations.
  • Patent Document 1 Disubstituted benzenealkynyl compounds having a FGFR inhibitory effect have been reported (Patent Document 1), these compounds are effective for cancers having a specific FGFR2 mutation (Patent Document 2), and intermittent administration is useful as an administration schedule. It has also been reported that this is possible (Patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a novel drug for treating cartilage dysplasia and a therapeutic method using the pharmaceutical composition.
  • the present invention includes the following [1] to [11].
  • achondroplasia is achondroplasia having a FGFR3 mutation in which glycine at position 380 of FGFR3 is mutated to arginine.
  • cartilage hypoplasia is a cartilage hypoplasia having a FGFR3 mutation in which asparagine at position 540 of FGFR3 is mutated to lysine.
  • Tanatophoric osteodysplasia is a tanatophoric osteodysplasia having a FGFR3 mutation in which arginine at position 248 of FGFR3 is mutated to cysteine or a mutation in FGFR3 in which lysine at position 650 is mutated to glutamic acid.
  • the present invention also relates to the following aspects.
  • a therapeutic agent for cartilage dysplasia which comprises pyrrolidinyl] -2-propen-1-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a method for treating cartilage dysplasia which comprises the step of administering to a patient with cartilage dysplasia an effective amount of pyrrolidinyl] -2-propen-1-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the measurement result of the femur length is shown.
  • the vertical axis indicates the bone length (mm).
  • the horizontal axis is as follows.
  • WT Wild-type mouse
  • ACH texture ACH mouse vapor administration group
  • ACH 0.1 mg / kg ACH mouse 0.1 mg / kg administration group
  • ACH 1 mg / kg ACH mouse 1 mg / kg administration group
  • ACH 3 mg / kg ACH mouse 3 mg / kg administration group.
  • the measurement result of the tibial length is shown.
  • the vertical axis indicates the bone length (mm).
  • the horizontal axis is as follows.
  • WT Wild-type mouse, ACH texture: ACH mouse vapor administration group, ACH 0.1 mg / kg: ACH mouse 0.1 mg / kg administration group, ACH 1 mg / kg: ACH mouse 1 mg / kg administration group, ACH 3 mg / kg: ACH mouse 3 mg / kg administration group.
  • the measurement result of the ulnar length is shown.
  • the vertical axis indicates the bone length (mm).
  • the horizontal axis is as follows.
  • WT Wild-type mouse, ACH texture: ACH mouse vapor administration group, ACH 0.1 mg / kg: ACH mouse 0.1 mg / kg administration group, ACH 1 mg / kg: ACH mouse 1 mg / kg administration group, ACH 3 mg / kg: ACH mouse 3 mg / kg administration group.
  • the measurement result of the growth cartilage plate thickness of the femur is shown.
  • the vertical axis shows the growth cartilage plate thickness ( ⁇ m).
  • the horizontal axis is as follows.
  • WT Wild-type mouse, ACH texture: ACH mouse vapor administration group, ACH 0.1 mg / kg: ACH mouse 0.1 mg / kg administration group, ACH 1 mg / kg: ACH mouse 1 mg / kg administration group, ACH 3 mg / kg: ACH mouse 3 mg / kg administration group.
  • the measurement result of the growth cartilage plate thickness of the tibia is shown.
  • the vertical axis shows the growth cartilage plate thickness ( ⁇ m).
  • the horizontal axis is as follows.
  • WT Wild-type mouse, ACH texture: ACH mouse vapor administration group, ACH 0.1 mg / kg: ACH mouse 0.1 mg / kg administration group, ACH 1 mg / kg: ACH mouse 1 mg / kg administration group, ACH 3 mg / kg: ACH mouse 3 mg / kg administration group.
  • the measurement result of the femur length is shown.
  • the vertical axis indicates the bone length (mm).
  • the horizontal axis is as follows.
  • WT Wild-type mouse, ACH texture: ACH mouse texture administration group, ACH 1 mg / kg: ACH mouse 1 mg / kg administration group, ACH 3 mg / kg: ACH mouse 3 mg / kg administration group, ACH 10 mg / kg: ACH mouse 10 mg / kg administration group.
  • the measurement result of the tibial length is shown.
  • the vertical axis indicates the bone length (mm).
  • the horizontal axis is as follows.
  • WT Wild-type mouse
  • ACH texture ACH mouse texture administration group
  • ACH 1 mg / kg ACH mouse 1 mg / kg administration group
  • ACH 3 mg / kg ACH mouse 3 mg / kg administration group
  • ACH 10 mg / kg ACH mouse 10 mg / kg administration group.
  • the measurement result of the ulnar length is shown.
  • the vertical axis indicates the bone length (mm).
  • the horizontal axis is as follows.
  • WT Wild-type mouse, ACH texture: ACH mouse texture administration group, ACH 1 mg / kg: ACH mouse 1 mg / kg administration group, ACH 3 mg / kg: ACH mouse 3 mg / kg administration group, ACH 10 mg / kg: ACH mouse 10 mg / kg kg administration group.
  • the measurement result of the femur length is shown.
  • the vertical axis indicates the bone length (mm).
  • the horizontal axis is as follows.
  • WT Wild-type mouse, ACH texture: ACH mouse texture administration group, ACH 1 mg / kg: ACH mouse 1 mg / kg administration group, ACH 3 mg / kg: ACH mouse 3 mg / kg administration group, ACH 6 mg / kg: ACH mouse 6 mg / kg administration group.
  • the measurement result of the tibial length is shown.
  • the vertical axis indicates the bone length (mm).
  • the horizontal axis is as follows.
  • WT Wild-type mouse
  • ACH texture ACH mouse texture administration group
  • ACH 1 mg / kg ACH mouse 1 mg / kg administration group
  • ACH 3 mg / kg ACH mouse 3 mg / kg administration group
  • ACH 6 mg / kg ACH mouse 6 mg / kg administration group.
  • the measurement result of the ulnar length is shown.
  • the vertical axis indicates the bone length (mm).
  • the horizontal axis is as follows.
  • WT Wild-type mouse
  • ACH texture ACH mouse texture administration group
  • ACH 1 mg / kg ACH mouse 1 mg / kg administration group
  • ACH 3 mg / kg ACH mouse 3 mg / kg administration group
  • ACH 6 mg / kg ACH mouse 6 mg / kg administration group.
  • Compound 1 1nM 1nM Compound 1 administration group.
  • iPS cells derived from patients with tanatophoric osteodysplasia type I (TD1) and achondroplasia (ACH) the drug efficacy evaluation results using the expression of COL2A and ACAN mRNA as indicators are shown. It was measured using Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
  • the vertical axis shows the ⁇ Ct value using the GAPDH gene as an internal standard.
  • the present invention relates to 1-[(3S) -3- [4-amino-3- [2- (3,5-dimethoxyphenyl) ethynyl] -1H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-1-yl].
  • a therapeutic agent for cartilage dysplasia which contains -1-pyrrolidinyl] -2-propen-1-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof, 1-[(3S) -3- [4-amino-3- [2].
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cartilage dysplasia, which comprises the active ingredient, and a therapeutic method using the pharmaceutical composition.
  • Compound 1 is a disubstituted benzenealkynyl compound having the following structure, and is not particularly limited, but is, for example, internationally disclosed. It can be synthesized based on the production method described in WO2013 / 108809.
  • compound 1 can be used as it is or in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • the pharmaceutically acceptable salt of Compound 1 is not particularly limited, but is, for example, an addition salt with an inorganic acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid, an organic acid such as acetic acid, citric acid, tartaric acid or maleic acid, potassium, etc. Examples thereof include salts with alkali metals such as sodium, salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium, salts with organic bases such as ammonium salts, ethylamine salts and arginine salts.
  • FGFR3 includes FGFR3 of human or non-human mammal, and is preferably human FGFR3.
  • the NCBI Gene ID of human FGFR3 is 2261.
  • the FGFR3 protein contains an isoform which is a splicing variant thereof, and if it is of human origin, for example, a polypeptide consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) represented by NCBI Reference Sequence: NP_000133 can be mentioned.
  • the "FGFR3 mutation” is not particularly limited as long as it is a FGFR3 protein having an amino acid mutation that causes chondrogenic dysplasia or a FGFR3 gene encoding the amino acid, but is preferably in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 is the FGFR3 protein or wild-type amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of arginine at position 248, glycine at position 380, asparagine at position 540 and lysine at position 650 is mutated.
  • FGFR3 protein in the case of a FGFR3 protein different from the above, it is a FGFR3 protein consisting of an amino acid sequence in which at least one amino acid at a position corresponding to the above position in SEQ ID NO: 1 is mutated, or a FGFR3 gene encoding the amino acid sequence; more preferably SEQ ID NO: 1.
  • the FGFR3 protein or wild-type amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which at least one amino acid selected from the group consisting of arginine at position 248, glycine at position 380 and lysine at position 650 is mutated is SEQ ID NO:
  • the FGFR3 protein consists of an amino acid sequence in which at least one amino acid at the position corresponding to the above position in SEQ ID NO: 1 is mutated, or the FGFR3 gene encoding the amino acid sequence; more preferably the SEQ ID NO:
  • a protein it is a FGFR3 protein consisting of an amino acid sequence in which at least one amino acid at a position corresponding to the above position in SEQ ID NO: 1 is mutated, or a FGFR3 gene encoding the amino acid sequence; more preferably represented by SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 a FGFR3 protein consisting of an amino acid sequence in which glycin at position 380 is mutated or FGFR3 in which the wild-type amino acid sequence is different from SEQ ID NO: 1, the amino acid in which glycine at the position corresponding to position 380 in SEQ ID NO: 1 is mutated.
  • a FGFR3 protein consisting of a sequence or a FGFR3 gene encoding the amino acid sequence.
  • a certain FGFR3 protein is simply referred to as the X-th amino acid in SEQ ID NO: 1
  • the X-th amino acid and the wild-type amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are not specified unless otherwise specified.
  • the amino acid at the position corresponding to the Xth position in SEQ ID NO: 1 is shown.
  • BLAST's Multiple Alignment should be used to confirm which position of the amino acid shown in SEQ ID NO: 1 corresponds to an amino acid having a FGFR3 protein whose wild-type amino acid sequence is different from that of SEQ ID NO: 1. Can be done.
  • FGFR3 in which the glycine at position 380 or the glycine at the position corresponding to position 380 in SEQ ID NO: 1 is mutated those mutated to arginine are preferable.
  • FGFR3 in which the glycine at position 380 or the glycine at the position corresponding to position 380 in SEQ ID NO: 1 is mutated may be referred to as G380R.
  • R248C, N540K and K650E described later As the FGFR3 in which the arginine at position 248 or the arginine at position corresponding to position 248 in SEQ ID NO: 1 is mutated, R248C mutated to cysteine is preferable.
  • N540K mutated to lysine is preferable.
  • K650E mutated to glutamic acid is preferable.
  • the FGFR3 mutation is preferably a FGFR3 protein consisting of an amino acid sequence having at least one amino acid mutation selected from the group consisting of R248C, G380R, N540K and K650E, or a FGFR3 gene encoding the amino acid sequence, and more preferably R248C,
  • FGFR3 protein consisting of an amino acid sequence having one amino acid mutation or a FGFR3 gene encoding the amino acid sequence, and more preferably a FGFR3 protein having a G380R mutation or a FGFR3 gene encoding the amino acid sequence.
  • the position of the mutation is different from that of the amino acid shown in SEQ ID NO: 1. It is understood to be similar to the mutation of the position corresponding to the position of the indicated amino acid. Therefore, for example, the 380th glycine in FGFR3 represented by SEQ ID NO: 1 corresponds to the 382nd glycine in FGFR3 consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) shown in NCBI Reference Sequence: NP_0011566685.
  • G380R not only means that the 380th glycine of FGFR3 represented by SEQ ID NO: 1 is mutated to arginine, but also NCBI Reference Sequence: It also includes a glycine at position 382 in FGFR3 consisting of the amino acid sequence shown by NP_0011566685 mutated to arginine. It should be noted that, for example, it can be confirmed by BLAST's Multiple Alignment as to which position of the amino acid shown in SEQ ID NO: 1 an amino acid of a certain FGFR3 isoform corresponds to.
  • achondroplasia means, for example, achondroplasia, achondroplasia, tanatophoric osteodysplasia and other diseases caused by functional deterioration of growing cartilage, preferably achondroplasia. It is achondroplasia, or tanatophoric osteodysplasia, more preferably achondroplasia.
  • Tanatophoric osteodysplasia having an FGFR3 mutation mutated to cysteine or a FGFR3 mutation in which the glycine at position 650 in FGFR3 represented by SEQ ID NO: 1 or the lysine corresponding to position 650 in SEQ ID NO: 1 is mutated to glutamic acid. Is mentioned; More preferably, it is represented by achondroplasia having a FGFR3 mutation in which the 380th glycine in FGFR3 represented by SEQ ID NO: 1 or the glycine corresponding to the 380th position in SEQ ID NO: 1 is mutated to arginine, or SEQ ID NO: 1.
  • the 248th arginine in FGFR3 or the arginine at the position corresponding to 248th in SEQ ID NO: 1 is mutated to cysteine, or the 650th lysine in FGFR3 represented by SEQ ID NO: 1 or the 650th in SEQ ID NO: 1.
  • tanatophoric osteodysplasia with an FGFR3 mutation in which the lysine at the site is mutated to glutamic acid; More preferably, it is represented by achondroplasia having a FGFR3 mutation in which the glycine at position 380 in FGFR3 represented by SEQ ID NO: 1 or the glycine at position corresponding to position 380 in SEQ ID NO: 1 is mutated to arginine, or SEQ ID NO: 1.
  • tanatophoric dysplasia with FGFR3 mutation in which arginine at position 248 in FGFR3 or arginine at position corresponding to position 248 in SEQ ID NO: 1 is mutated to cysteine; Even more preferably, achondroplasia having a FGFR3 mutation in which the glycine at position 380 in FGFR3 represented by SEQ ID NO: 1 or the glycine at position corresponding to position 380 in SEQ ID NO: 1 is mutated to arginine can be mentioned.
  • cartilage dysplasia having a FGFR3 mutation may be simply referred to as FGFR3 mutant cartilage dysplasia.
  • the FGFR3 mutation can be detected by a method well known to those skilled in the art.
  • a method for detecting a mutation in the FGFR3 gene a commonly used method such as a Southern blotting method, a PCR method, a DNA microarray method, or a sequence analysis method can be mentioned.
  • the method for detecting a mutation in the FGFR3 protein include a method using an antibody that specifically binds to the FGFR3 mutation (ELISA method, Western blotting method, immunostaining method, etc.), and a commonly used method such as mass spectrum analysis. Be done.
  • Antibodies that specifically bind to the FGFR3 mutation can be prepared using commercially available products or by conventional methods.
  • sample refers not only to biological samples (for example, cells, tissues, organs, body fluids (blood, lymph, etc.), digestive juices, urine), but also nucleic acid extracts (genomic DNA) obtained from these biological samples. It also includes extracts, mRNA extracts, cDNA preparations prepared from mRNA extracts, cRNA preparations, etc.) and protein extracts. Further, the sample may be subjected to formalin fixation treatment, alcohol fixation treatment, freezing treatment or paraffin embedding treatment. As the biological sample, a sample collected from a living body can be used. In addition, the method for collecting the biological sample can be appropriately selected according to the type of the biological sample.
  • a pharmaceutical composition in which Compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is combined with a pharmaceutical carrier even when Compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used as a therapeutic agent for cartilage dysplasia May be used as. Accordingly, in one embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition containing Compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof When compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is contained in the preparation as an active ingredient, it can be optionally blended with a pharmaceutical carrier and various administration forms can be adopted depending on the purpose of prevention or treatment.
  • the administration form include oral preparations, injections, suppositories, ointments, patches and the like, but oral preparations are preferable.
  • the oral preparation may be in the form of tablets, capsules, granules, powders, syrups and the like, and is not particularly limited. Each of these dosage forms can be produced by a conventional production method known to those skilled in the art. Carriers such as appropriate excipients, diluents, bulking agents, and disintegrants can be added to the formulation or pharmaceutical composition depending on the dosage form and optionally.
  • the amount of compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof to be blended in each of the above-mentioned administration unit forms is not constant depending on the patient's symptomatology to which this is applied, its dosage form, etc., but is generally administered. It is desirable that the unit form is 0.05 to 1000 mg for oral preparations, 0.01 to 500 mg for injections, and 1 to 1000 mg for suppositories.
  • the daily dose of compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof varies depending on the patient's symptoms, body weight, age, gender, etc. and cannot be unconditionally determined, but is usually per day for an adult (body weight 60 kg).
  • the amount of compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is about 1 to 1000 mg, preferably about 10 to 500 mg per day, and more preferably about 10 to 300 mg per day.
  • the dose is, for example, about 1 as compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof per day. It is ⁇ 200 mg, preferably 2-100 mg per day, more preferably 4-50 mg per day, and even more preferably 10-40 mg per day.
  • the dose is, for example, about 2 as Compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof per day. It is ⁇ 1000 mg, preferably 10 to 500 mg per day, more preferably 20 to 200 mg per day, and even more preferably 50 to 160 mg per day.
  • the administration schedule of Compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof includes daily administration or intermittent administration.
  • “daily administration” includes, for example, an administration schedule in which a schedule of continuous administration for 21 days is set as one cycle, and a drug holiday may be provided each time one cycle is completed.
  • intermittent administration is not particularly limited as long as it satisfies the condition that the administration interval (the number of days between one administration day and the next administration day) is one day or more twice a week or more.
  • compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered every 1 to 3 days per cycle (the interval between one administration day and the next administration day is 1 to 1 to 3 days).
  • Administration schedule which is administered more than once in 3 days) and the cycle is repeated once or more than once;
  • Compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered 4 to 7 times per cycle with an interval of 1 to 3 days between the dosing date and the next dosing date.
  • the administration schedule is one cycle of 14 days, and of the 14 days included in one cycle, compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used on the 1st, 4th, 8th and 8th days.
  • the administration schedule is one cycle of 14 days, and among the 14 days included in one cycle, compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used on the 1st, 3rd, and 5th days.
  • the administration schedule is one cycle of 14 days, and of the 14 days included in one cycle, compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used on the 1st, 3rd, and 5th days.
  • the administration schedule and the like to be administered on the 8th day, the 10th day and the 12th day can be mentioned.
  • the interval between the administration day and the next administration day is separated by X days means that when the administration is performed on the nth day, the next administration day is set to the n + (1 + X) day. do.
  • leaving an interval between the administration day and the next administration day by one day means that when the administration is performed on the first day, the next administration day is set as the third day.
  • the present invention also provides a method for treating cartilage dysplasia, which comprises the step of administering to a patient with cartilage dysplasia an effective amount of Compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, an administration method thereof, and the like are as described above.
  • Patients include humans, non-human mammals and the like. Examples of non-human mammals include monkeys, dogs, cats, rabbits, mice, rats, guinea pigs and the like. Further, as described above, examples of cartilage dysplasia include FGFR3 mutant cartilage dysplasia.
  • the present invention also provides a method for treating FGFR3 mutant cartilage dysplasia, which comprises the following steps (1) and (2): (1) A step of detecting a mutation in the FGFR3 protein or the FGFR3 gene in a sample derived from a patient. (2) A step of administering an effective amount of Compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a patient in which a mutation in the FGFR3 protein or the FGFR3 gene is detected in the step (1) above.
  • the invention also provides the following methods: A step of administering to a patient having a mutation in the FGFR3 protein or the FGFR3 gene an effective amount of Compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It is a treatment method for FGFR3 mutant cartilage dysplasia. Mutations in the FGFR3 protein or FGFR3 gene are detected in samples derived from the patient. Method.
  • the "therapeutic effect” can be evaluated by the bone lengthening effect or the like.
  • the therapeutic effect can be estimated from the degree of FGFR3 function-inhibiting activity (for example, inhibitory activity using FGFR3 phosphorylation as an index).
  • Example 1 Evaluation of inhibitory activity of Compound 1 against FGFR3 mutant in vitro
  • FGFR3 variant expression vector For the FGFR3 vector, FGFR3 (NM_000142) Human Tagged ORF Clone (FGFR3 wild type (WT) expression vector) purchased from ORIGENE was used, and each variant (G380R, N540K and K650E) was used. The expression vector was constructed using the vector as a template.
  • FGFR3 Human Tagged ORF Clone (FGFR3 wild type (WT) expression vector) purchased from ORIGENE was used, and each variant (G380R, N540K and K650E) was used.
  • the expression vector was constructed using the vector as a template.
  • FGFR3 inhibitory activity using FGFR3 phosphorylation as an index Human fetal kidney cell HEK293T is cultured in DMEM medium containing 10% bovine fetal serum, and the cells are collected by a conventional method and then contains 10% bovine fetal serum. Suspended in DMEM medium, the FGFR3 wild-type or variant expression vector shown above was introduced into cells using the lipotransfection method using Lipofectamine 3000 Reagent (ThermoFisher SCIENTIFIC), respectively, and 1.5 per well in 96 plates. ⁇ 10 4 seeds / 100 ⁇ L were sown.
  • Relative FGFR3 phosphorylation rate (%) (signal amount of drug-added well) / (Signal amount of control group) x 100
  • the IC50 value (50% inhibition concentration) was calculated as the concentration that achieved 50% inhibition with respect to the control group.
  • Example 2 Bone prolongation effect of Compound 1 using achondroplasia model mice
  • FGFR3ACH mice (Naski, MC et al. Development 1998, 125 (24): 4977-88; hereinafter simply referred to as ACH mice) were used.
  • a large number of F1 hybrid mice artificially inseminated into FVB strain ACH mice were produced, genomic DNA was extracted, and genotyping was performed by the PCR method.
  • Compound 1 is dissolved in 0.5% HPMC to prepare a solution of each concentration, and the dose of compound 1 is 0.1 mg / kg, 1 mg / kg, or 3 mg / kg depending on the individual body weight on the day of administration. It was administered at 10 mL / kg so as to become.
  • FIGS. 1 to 5 at the time of measurement (day age 43), a concentration-dependent bone lengthening effect was observed in the compound 1-administered group as compared with the vehicle-administered group.
  • the femur was isolated from the mice after administration, and the cartilage growth plate was stained with safranin O, and the length thereof was measured.
  • the result is shown in FIG.
  • the average width of the growth plate of the ACH mouse was 148.3, and it was 206.4 in the group in which the compound 1 was administered to the ACH mouse, which was confirmed to be longer than that in the vehicle-administered group.
  • Example 3 Bone prolongation effect of Compound 1 using achondroplasia model mice
  • Example 4 Evaluation of efficacy in a disease iPS cell model
  • iPS cell line from skin fibroblasts of patients with tanatophoric osteodysplasia type I (TD1, R248C) and achondroplasia (ACH, G380A) and skin fibroblasts of healthy subjects to become chondrocytes. Differentiation was induced. Cartilage tissue was formed from healthy iPS cells, whereas cartilage components were reduced in tissues derived from TD1-iPS cells and ACH-iPS cells (Yamashita et al., Nature, 2014,513 (7519)). : 507-11).
  • glycosaminoglycan which is a component of the extracellular matrix of cartilage, was stained by the addition of compound 1.
  • FIG. 13 the expression of COL2A1 and ACAN mRNA was increased in the cells to which Compound 1 was added as compared with the cells to which the compound 1 was not added.

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Abstract

１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ　［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩を含有する、軟骨形成異常症を治療するための医薬組成物、及び当該医薬組成物を用いた治療方法。

Description

軟骨形成異常症の治療
　［関連出願の相互参照］
　本出願は、２０２０年１月３１日に出願された、日本国特許出願第２０２０－０１４２６０号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
本発明は、ＦＧＦＲ阻害剤を用いた軟骨形成異常症（軟骨無形成症、軟骨低形成症、タナトフォリック骨異形成症）の治療に関する。
　線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）は幅広い組織で発現が見られ細胞の増殖分化を司る増殖因子の一つである。ＦＧＦの生理学的活性は、特異的な細胞表面受容体である線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ；ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によって媒介される。ＦＧＦＲは、受容体型のタンパク質チロシンキナーゼファミリーに属し、細胞外リガンド結合ドメイン、１回膜貫通ドメイン及び細胞内チロシンキナーゼドメインから構成されており、これまでに４種類のＦＧＦＲが同定されている（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４）。ＦＧＦＲは、ＦＧＦの結合によって二量体を形成し、リン酸化により活性化される。受容体の活性化は、下流の特定のシグナル伝達分子の動員及び活性化を誘導し、生理機能を発現する。
ＦＧＦ／ＦＧＦＲシグナル伝達の異常は、ヒトの軟骨細胞分化異常に関する疾患との関連性について報告がある。ヒトの軟骨細胞分化異常における疾患におけるＦＧＦ／ＦＧＦＲシグナルの異常な活性化は、ＦＧＦＲの遺伝子変異に起因するとされている（非特許文献１、２）。
　軟骨形成異常症においては、ＦＧＦＲ３のＧ３８０Ｒ、Ｎ５４０Ｋ、Ｋ６５０Ｅ等の点突然変異が報告されており、このような遺伝子変異が軟骨形成異常症の原因となっている可能性が示唆されている（非特許文献３、４、５）。また、ＦＧＦＲ阻害剤であるＮＶＰ－ＢＧＪ３９８がキナーゼドメイン外の活性化変異であるＦＧＦＲ３Ｙ３６７Ｃにおいて発症する軟骨無形成症マウスモデルにおいて、治療効果を持つことが報告されている（非特許文献６）。また、ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８がＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒ変異に対して５０ｎＭでキナーゼ阻害効果を示すことが報告されている。一方で、ＦＧＦＲ３Ｇ３８０Ｒにおいて発症する軟骨無形成症マウスモデルにおける治療効果は報告されていない。
　ＦＧＦＲ阻害効果を有する二置換ベンゼンアルキニル化合物が報告されており（特許文献１）、これらの化合物が特定のＦＧＦＲ２変異を持つ癌に有効であること（特許文献２）、投与スケジュールとして間歇投与が有用であり得ること（特許文献３）も報告されている。
国際公開ＷＯ２０１３／１０８８０９パンフレット 国際公開ＷＯ２０１５／００８８４４パンフレット 国際公開ＷＯ２０１５／００８８３９パンフレット
Ｄｅｖ　Ｄｙｎ．　２０１７　Ａｐｒ；２４６（４）：２９１－３０９． Ａｍ　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ．　２０００　Ｄｅｃ；６７（６）：１４１１－２１． Ｎａｔｕｒｅ．　１９９４　Ｓｅｐ　１５；３７１（６４９４）：２５２－４． Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．　１９９５　Ｊｕｌ；１０（３）：３５７－９． Ａｍ　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｇｅｎｅｔ．　１９９６　Ｍａｙ　３；６３（１）：１４８－５４． Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１６　１２６（５）：１８７１－１８８４
　本発明は、軟骨形成異常症を治療するための新規医薬及び当該医薬組成物を用いた治療方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン（Ｆｕｔｉｂａｔｉｎｉｂ）又はその薬学的に許容される塩が、変異を有するＦＧＦＲ３のリン酸化を阻害し、軟骨形成異常症に対して優れた骨延長効果を有することを見出した。
　すなわち本発明は、次の［１］～［１１］を包含する。
　［１］１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩を含有する、軟骨形成異常症を治療するための医薬組成物。
　［２］軟骨形成異常症が、軟骨無形成症、軟骨低形成症、又はタナトフォリック骨異形成症である、［１］記載の医薬組成物。
　［３］軟骨形成異常症が、軟骨無形成症である、［１］又は［２］記載の医薬組成物。
　［４］軟骨形成異常症が、ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨形成異常症である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
　［５］ＦＧＦＲ３変異が、ＦＧＦＲ３の２４８番目のアルギニン、３８０番目のグリシン、ＦＧＦＲ３の５４０番目のアスパラギン、又は６５０番目のリジンの変異である、［４］記載の医薬組成物。
　［６］ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨形成異常症が、ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨無形成症である、［４］記載の医薬組成物。
　［７］軟骨無形成症が、ＦＧＦＲ３の３８０番目のグリシンがアルギニンに変異したＦＧＦＲ３変異を有する軟骨無形成症である、［６］記載の医薬組成物。
　［８］ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨形成異常症が、ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨低形成症である、［４］記載の医薬組成物。
　［９］軟骨低形成症が、ＦＧＦＲ３の５４０番目のアスパラギンがリジンに変異したＦＧＦＲ３変異を有する軟骨低形成症である、［８］記載の医薬組成物。
　［１０］ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨形成異常症が、ＦＧＦＲ３変異を有するタナトフォリック骨異形成症である、［４］記載の医薬組成物。
　［１１］タナトフォリック骨異形成症が、ＦＧＦＲ３の２４８番目のアルギニンがシステインに変異したＦＧＦＲ３変異、又は６５０番目のリジンがグルタミン酸に変異したＦＧＦＲ３変異を有するタナトフォリック骨異形成症である、［１０］記載の医薬組成物。
　本発明は、以下の態様にも関する。
・１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩を含む、軟骨形成異常症の治療剤。
・軟骨形成異常症の治療における使用のための、１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩。
・軟骨形成異常症の治療のための、１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩の使用。
・軟骨形成異常症を治療するための医薬を製造するための、１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩の使用。
・１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩の有効量を、軟骨形成異常症の患者に投与する工程を含む、軟骨形成異常症の治療方法。
・活性成分としての１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩を、被験者における軟骨形成異常症を治療するためのその使用のための指示書と共に含む、コマーシャルパッケージ。
　本発明によれば、軟骨形成異常症に対し、優れた骨延長効果を奏する治療を行うことが可能である。
大腿骨長の測定結果を示す。縦軸は骨長（ｍｍ）を示す。横軸は次のとおりである。ＷＴ：野生型マウス、ＡＣＨ　ｖｅｈｉｃｌｅ：ＡＣＨマウス　ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＡＣＨ　０．１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　０．１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　３ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　３ｍｇ／ｋｇ投与群。 脛骨長の測定結果を示す。縦軸は骨長（ｍｍ）を示す。横軸は次のとおりである。ＷＴ：野生型マウス、ＡＣＨ　ｖｅｈｉｃｌｅ：ＡＣＨマウス　ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＡＣＨ　０．１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　０．１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　３ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　３ｍｇ／ｋｇ投与群。 尺骨長の測定結果を示す。縦軸は骨長（ｍｍ）を示す。横軸は次のとおりである。ＷＴ：野生型マウス、ＡＣＨ　ｖｅｈｉｃｌｅ：ＡＣＨマウス　ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＡＣＨ　０．１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　０．１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　３ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　３ｍｇ／ｋｇ投与群。 大腿骨の成長軟骨板厚の測定結果を示す。縦軸は成長軟骨板厚（μｍ）を示す。横軸は次のとおりである。ＷＴ：野生型マウス、ＡＣＨ　ｖｅｈｉｃｌｅ：ＡＣＨマウス　ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＡＣＨ　０．１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　０．１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　３ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　３ｍｇ／ｋｇ投与群。 脛骨の成長軟骨板厚の測定結果を示す。縦軸は成長軟骨板厚（μｍ）を示す。横軸は次のとおりである。ＷＴ：野生型マウス、ＡＣＨ　ｖｅｈｉｃｌｅ：ＡＣＨマウス　ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＡＣＨ　０．１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　０．１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　３ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　３ｍｇ／ｋｇ投与群。 大腿骨長の測定結果を示す。縦軸は骨長（ｍｍ）を示す。横軸は次のとおりである。ＷＴ：野生型マウス、ＡＣＨ　ｖｅｈｉｃｌｅ：ＡＣＨマウス　ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＡＣＨ　１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　３ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　３ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　１０ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１０ｍｇ／ｋｇ投与群。 脛骨長の測定結果を示す。縦軸は骨長（ｍｍ）を示す。横軸は次のとおりである。ＷＴ：野生型マウス、ＡＣＨ　ｖｅｈｉｃｌｅ：ＡＣＨマウス　ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＡＣＨ　１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　３ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　３ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　１０ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１０ｍｇ／ｋｇ投与群。 尺骨長の測定結果を示す。縦軸は骨長（ｍｍ）を示す。横軸は次のとおりである。ＷＴ：野生型マウス、ＡＣＨ　ｖｅｈｉｃｌｅ：ＡＣＨマウス　ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＡＣＨ　１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　３ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　３ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　１０ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１０ｍｇ／ｋｇ投与群。 大腿骨長の測定結果を示す。縦軸は骨長（ｍｍ）を示す。横軸は次のとおりである。ＷＴ：野生型マウス、ＡＣＨ　ｖｅｈｉｃｌｅ：ＡＣＨマウス　ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＡＣＨ　１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　３ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　３ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　６ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　６ｍｇ／ｋｇ投与群。 脛骨長の測定結果を示す。縦軸は骨長（ｍｍ）を示す。横軸は次のとおりである。ＷＴ：野生型マウス、ＡＣＨ　ｖｅｈｉｃｌｅ：ＡＣＨマウス　ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＡＣＨ　１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　３ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　３ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　６ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　６ｍｇ／ｋｇ投与群。 尺骨長の測定結果を示す。縦軸は骨長（ｍｍ）を示す。横軸は次のとおりである。ＷＴ：野生型マウス、ＡＣＨ　ｖｅｈｉｃｌｅ：ＡＣＨマウス　ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ＡＣＨ　１ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　１ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　３ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　３ｍｇ／ｋｇ投与群、ＡＣＨ　６ｍｇ／ｋｇ：ＡＣＨマウス　６ｍｇ／ｋｇ投与群。 タナトフォリック骨異形成症Ｉ型（ＴＤ１）及び軟骨無形性症（ＡＣＨ）患者由来のｉＰＳ細胞を用いて、グルコサミノグリカンを指標とした薬効評価結果（サフラニン染色図）を示す。ｖｅｈｉｃｌｅ：ｖｅｈｉｃｌｅ（＝０．１％ＤＭＳＯ）投与群、化合物１　１ｎＭ：１ｎＭ　化合物１投与群。 タナトフォリック骨異形成症Ｉ型（ＴＤ１）及び軟骨無形性症（ＡＣＨ）患者由来のｉＰＳ細胞を用いて、ＣＯＬ２Ａ及びＡＣＡＮ　ｍＲＮＡの発現を指標とした薬効評価結果を示す。Ｓｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準として用いたΔＣｔ値を示す。横軸は次のとおりである。Ｖｅｈｉｃｌｅ：ｖｅｈｉｃｌｅ（＝０．１％ＤＭＳＯ）投与群、化合物１：１ｎＭ　化合物１投与群。
　本発明は、１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩を含む軟骨形成異常症の治療剤、１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、軟骨形成異常症を治療するための医薬組成物、及び当該医薬組成物を用いた治療方法に関する。
　１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン（本明細書において「化合物１」と示すことがある）は、下記の構造を有する二置換ベンゼンアルキニル化合物であり、特に限定するものではないが、例えば国際公開ＷＯ２０１３／１０８８０９号に記載の製造方法に基づき合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明において、化合物１はそのまま、又は薬学的に許容される塩の形態で使用することができる。化合物１の薬学的に許容される塩としては、特に限定するものではないが、例えば塩酸、硫酸等の無機酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸等の有機酸との付加塩、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩、エチルアミン塩、アルギニン塩等の有機塩基との塩等が挙げられる。
　本発明において「ＦＧＦＲ３」とは、ヒト又は非ヒト哺乳動物のＦＧＦＲ３を含み、好ましくはヒトＦＧＦＲ３である。ヒトＦＧＦＲ３のＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤは２２６１である。また、ＦＧＦＲ３タンパク質は、そのスプライシングバリアントであるアイソフォームを含み、ヒト由来のものであれば、例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００１３３で示されるアミノ酸配列（配列番号１）からなるポリペプチドが挙げられる。
　本発明において「ＦＧＦＲ３変異」は、軟骨形成異常症の原因となるアミノ酸変異を有するＦＧＦＲ３タンパク質若しくは当該アミノ酸をコードするＦＧＦＲ３遺伝子であれば特に限定されないが、好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２４８番目のアルギニン、３８０番目のグリシン、５４０番目のアスパラギン及び６５０番目のリジンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３タンパク質若しくは野生型のアミノ酸配列が配列番号１と異なるＦＧＦＲ３タンパク質の場合において、配列番号１における上記位置に相当する位置の少なくとも１つのアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３タンパク質又は当該アミノ酸配列をコードするＦＧＦＲ３遺伝子であり；より好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２４８番目のアルギニン、３８０番目のグリシン及び６５０番目のリジンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３タンパク質若しくは野生型のアミノ酸配列が配列番号１と異なるＦＧＦＲ３タンパク質の場合において、配列番号１における上記位置に相当する位置の少なくとも１つのアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３タンパク質又は当該アミノ酸配列をコードするＦＧＦＲ３遺伝子であり；より好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２４８番目のアルギニン及び３８０番目のグリシンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３タンパク質若しくは野生型のアミノ酸配列が配列番号１と異なるＦＧＦＲ３タンパク質の場合において、配列番号１における上記位置に相当する位置の少なくとも１つのアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３タンパク質又は当該アミノ酸配列をコードするＦＧＦＲ３遺伝子であり；より好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸配列において、３８０番目のグリシンが変異したアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３タンパク質若しくは野生型のアミノ酸配列が配列番号１と異なるＦＧＦＲ３の場合において、配列番号１における３８０番目に相当する位置のグリシンが変異したアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３タンパク質又は当該アミノ酸配列をコードするＦＧＦＲ３遺伝子である。本明細書において、あるＦＧＦＲ３タンパク質について、単に配列番号１におけるＸ番目のアミノ酸と示した場合、そうでないことが明記されない限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸及び野生型のアミノ酸配列が配列番号１と異なるＦＧＦＲ３タンパク質の場合において配列番号１におけるＸ番目に相当する位置のアミノ酸を示す。なお、野生型のアミノ酸配列が配列番号１と異なるＦＧＦＲ３タンパク質のあるアミノ酸が、配列番号１で示されるアミノ酸のどの位置に相当するアミノ酸であるかどうかは、例えば、ＢＬＡＳＴのＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔにより確認することができる。
　３８０番目のグリシン又は配列番号１における３８０番目に相当する位置のグリシンが変異したＦＧＦＲ３としては、アルギニンに変異したものが好ましい。本明細書おいて、３８０番目のグリシン又は配列番号１における３８０番目に相当する位置のグリシンが変異したＦＧＦＲ３をＧ３８０Ｒと示すことがある。後述するＲ２４８Ｃ、Ｎ５４０Ｋ及びＫ６５０Ｅも同様である。２４８番目のアルギニン又は配列番号１における２４８番目に相当する位置のアルギニンが変異したＦＧＦＲ３としては、システインに変異したＲ２４８Ｃが好ましい。５４０番目のアスパラギン又は配列番号１における５４０番目に相当する位置のアスパラギンが変異したＦＧＦＲ３としては、リジンに変異したＮ５４０Ｋが好ましい。６５０番目のリジン又は配列番号１における６５０番目に相当する位置のリジンが変異したＦＧＦＲ３としては、グルタミン酸に変異したＫ６５０Ｅが好ましい。
　ＦＧＦＲ３変異として、好ましくはＲ２４８Ｃ、Ｇ３８０Ｒ、Ｎ５４０Ｋ及びＫ６５０Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３タンパク質若しくは当該アミノ酸配列をコードするＦＧＦＲ３遺伝子であり、より好ましくはＲ２４８Ｃ、Ｇ３８０Ｒ及びＫ６５０Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３タンパク質若しくは当該アミノ酸配列をコードするＦＧＦＲ３遺伝子であり、より好ましくはＲ２４８Ｃ及びＧ３８０Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３タンパク質若しくは当該アミノ酸配列をコードするＦＧＦＲ３遺伝子であり、より好ましくはＧ３８０Ｒ変異を有するＦＧＦＲ３タンパク質若しくは当該アミノ酸配列をコードするＦＧＦＲ３遺伝子である。
　また、前述のように、あるＦＧＦＲ３アイソフォームにおける変異において、アミノ酸の欠失、挿入等によって、変異の位置が配列番号１で示されるアミノ酸の位置とは異なる場合であっても、配列番号１で示されるアミノ酸の位置に相当する位置の変異と同様であると解される。そのため、例えば、配列番号１で表されるＦＧＦＲ３における３８０番目のグリシンは、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１１５６６８５で示されるアミノ酸配列（配列番号２）からなるＦＧＦＲ３においては、３８２番目のグリシンに相当する。そのため、本発明において、そうでないことが明示されない限り、例えば、「Ｇ３８０Ｒ」は、配列番号１で表されるＦＧＦＲ３の３８０番目のグリシンがアルギニンに変異していることだけでなく、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１１５６６８５で示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ３における３８２番目のグリシンがアルギニンに変異したものも包含する。なお、あるＦＧＦＲ３アイソフォームのあるアミノ酸が、配列番号１で示されるアミノ酸のどの位置に相当するアミノ酸であるかどうかは、例えば、ＢＬＡＳＴのＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔにより確認することができる。
　本発明において「軟骨形成異常症」は、例えば、軟骨無形成症、軟骨低形成症、タナトフォリック骨異形成症等の成長軟骨の機能低下による疾患を意味し、好ましくは軟骨無形成症、軟骨低形成症、又はタナトフォリック骨異形成症であり、より好ましくは軟骨無形成症である。
　また、本発明において、「ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨形成異常症」としては、配列番号１における３８０番目のグリシン又は配列番号１における３８０番目に相当する位置のグリシン、５４０番目のアスパラギン又は配列番号１における５４０番目に相当する位置のアスパラギン、又は２４８番目のアルギニン若しくは配列番号１における２４８番目に相当する位置のアルギニン又は６５０番目のリジン若しくは配列番号１における６５０番目に相当する位置のリジンの変異による成長軟骨の機能低下による疾患等が挙げられ；
好ましくは、配列番号１における３８０番目のグリシン又は配列番号１における３８０番目に相当する位置のグリシンがアルギニンに変異したＦＧＦＲ３変異を有する軟骨無形成症、配列番号１における５４０番目のアスパラギン又は配列番号１における５４０番目に相当する位置のアスパラギンがリジンに変異したＦＧＦＲ３変異を有する軟骨低形成症、又は配列番号１で表されるＦＧＦＲ３における２４８番目のアルギニン若しくは配列番号１における２４８番目に相当する位置のアルギニンがシステインに変異したＦＧＦＲ３変異又は配列番号１で表されるＦＧＦＲ３における６５０番目のリジン若しくは配列番号１における６５０番目に相当する位置のリジンがグルタミン酸に変異したＦＧＦＲ３変異を有するタナトフォリック骨異形成症が挙げられ；
より好ましくは配列番号１で表されるＦＧＦＲ３における３８０番目のグリシン又は配列番号１における３８０番目に相当する位置のグリシンがアルギニンに変異したＦＧＦＲ３変異を有する軟骨無形成症、又は配列番号１で表されるＦＧＦＲ３における２４８番目のアルギニン若しくは配列番号１における２４８番目に相当する位置のアルギニンがシステインに変異したＦＧＦＲ３変異又は配列番号１で表されるＦＧＦＲ３における６５０番目のリジン若しくは配列番号１における６５０番目に相当する位置のリジンがグルタミン酸に変異したＦＧＦＲ３変異を有するタナトフォリック骨異形成症が挙げられ；
さらに好ましくは配列番号１で表されるＦＧＦＲ３における３８０番目のグリシン又は配列番号１における３８０番目に相当する位置のグリシンがアルギニンに変異したＦＧＦＲ３変異を有する軟骨無形成症、又は配列番号１で表されるＦＧＦＲ３における２４８番目のアルギニン若しくは配列番号１における２４８番目に相当する位置のアルギニンがシステインに変異したＦＧＦＲ３変異を有するタナトフォリック骨異形成症が挙げられ；
なおさらに好ましくは配列番号１で表されるＦＧＦＲ３における３８０番目のグリシン又は配列番号１における３８０番目に相当する位置のグリシンがアルギニンに変異したＦＧＦＲ３変異を有する軟骨無形成症が挙げられる。本明細書においてＦＧＦＲ３変異を有する軟骨形成異常症を単にＦＧＦＲ３変異軟骨形成異常症と示すこともある。
　本発明において、ＦＧＦＲ３変異は、当業者に周知の方法で検出することが可能である。例えば、ＦＧＦＲ３遺伝子の変異の検出方法としては、サザンブロッティング法、ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、シークエンス解析法等の通常慣用の方法が挙げられる。また、ＦＧＦＲ３タンパク質の変異の検出方法としては、ＦＧＦＲ３変異に特異的に結合する抗体を用いた手法（ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、免疫染色法等）、マススペクトル分析等の通常慣用の方法が挙げられる。ＦＧＦＲ３変異に特異的に結合する抗体は、市販品を使用すること、又は通常慣用の方法で作製することが可能である。
　本発明において用語「試料」は、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器、体液（血液、リンパ液等）、消化液、尿）のみならず、これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムＤＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物、ｃＲＮＡ調製物等）及びタンパク質抽出物も包含する。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。前記生体試料としては、生体から採取したものを使用することができる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類に応じて適宜選択することができる。
　本発明において、化合物１又はその薬学的に許容される塩そのものを軟骨形成異常症の治療剤として用いても、化合物１又はその薬学的に許容される塩を薬学的担体と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。従って、一実施形態において、本発明は、化合物１又はその薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物を提供する。
　化合物１又はその薬学的に許容される塩を有効成分として製剤中に含有せしめる場合、任意選択で薬学的担体と配合し、予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能である。投与形態として、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられるが、経口剤が好ましい。経口剤としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉剤、シロップ剤等の形態とすることができ、特に限定するものではない。これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製造方法により製造できる。製剤又は医薬組成物には、投与形態によって、また任意選択で適切な賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤等の担体を添加することができる。
　上記の各投与単位形態中に配合されるべき化合物１又はその薬学的に許容される塩の量は、これを適用すべき患者の症状により、或いはその剤形等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり、経口剤では０．０５～１０００ｍｇ、注射剤では０．０１～５００ｍｇ、坐剤では１～１０００ｍｇとするのが望ましい。
　また、化合物１又はその薬学的に許容される塩の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人（体重６０ｋｇ）１日あたり化合物１又はその薬学的に許容される塩として約１～１０００ｍｇであり、好ましくは１日あたり約１０～５００ｍｇであり、より好ましくは１日あたり約１０～３００ｍｇである。
　なお、化合物１又はその薬学的に許容される塩の１日あたりの投与量を連日投与する場合、その投与量は、例えば、１日あたり化合物１又はその薬学的に許容される塩として約１～２００ｍｇであり、好ましくは１日あたり２～１００ｍｇであり、より好ましくは１日あたり４～５０ｍｇであり、さらに好ましくは１日あたり１０～４０ｍｇである。
　なお、化合物１又はその薬学的に許容される塩の１日あたりの投与量を間歇投与する場合、その投与量は、例えば、１日あたり化合物１又はその薬学的に許容される塩として約２～１０００ｍｇであり、好ましくは１日あたり１０～５００ｍｇであり、より好ましくは１日あたり２０～２００ｍｇであり、さらに好ましくは１日あたり５０～１６０ｍｇである。
　また、化合物１又はその薬学的に許容される塩の投与スケジュールは、連日投与、又は間歇投与が挙げられる。
　本明細書において、「連日投与」とは、例えば、２１日間連続して投与するスケジュールを１サイクルとした投与スケジュールが挙げられ、１サイクルが終了する毎に休薬期間を設けてもよい。
　本明細書において「間歇投与」とは、１週間に２回以上かつ投与間隔（ある投与日と次の投与日との間隔の日数）を１日以上空ける条件を満たす限り、特に限定されない。
　例えば、１週間で１サイクルの投与スケジュールであって、化合物１又はその薬学的に許容される塩が、１サイクル当り１～３日おき（ある投与日と次の投与日との間隔が１～３日）に２回以上投与され、当該サイクルが１回又は２回以上繰り返して実施される、投与スケジュール；
　１４日間で１サイクルの投与スケジュールであって、化合物１又はその薬学的に許容される塩が、投与日と次の投与日との間隔が１～３日空けて１サイクル当りに４～７回投与され、当該サイクルが１回又は２回以上繰り返して実施される、投与スケジュール；
　１４日間で１サイクルの投与スケジュールであって、１サイクルに含まれる１４日間のうち、化合物１又はその薬学的に許容される塩が、第１日目、第４日目、第８日目及び第１１日目に投与される、投与スケジュール；
　１４日間で１サイクルの投与スケジュールであって、１サイクルに含まれる１４日間のうち、化合物１又はその薬学的に許容される塩が、第１日目、第３日目、第５日目、第７日目、第９日目、第１１日目及び第１３日目に投与される、投与スケジュール；
　１４日間で１サイクルの投与スケジュールであって、１サイクルに含まれる１４日間のうち、化合物１又はその薬学的に許容される塩が、第１日目、第３日目、第５日目、第８日目、第１０日目及び第１２日目に投与される、投与スケジュール等が挙げられる。本発明において、「投与日と次の投与日との間隔をＸ日空ける」とは、第ｎ日目に投与をした場合、次の投与日を第ｎ＋（１＋Ｘ）日目とすることを意味する。例えば、投与日と次の投与日との間隔を１日空けるとは、第１日目に投与をした場合、次の投与日を第３日目とすることを意味する。
　本発明は、また、化合物１又はその薬学的に許容される塩の有効量を、軟骨形成異常症の患者に投与する工程を含む、軟骨形成異常症の治療方法を提供する。化合物１又はその薬学的に許容される塩、その投与方法等については前述の通りである。患者としては、ヒト、非ヒトの哺乳動物等が挙げられる。非ヒトの哺乳動物としては、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット等が挙げられる。また、前述したように、軟骨形成異常症としては、ＦＧＦＲ３変異軟骨形成異常症等が挙げられる。
　従って、一実施形態において、本発明は、また、以下の（１）及び（２）の工程を含む、ＦＧＦＲ３変異軟骨形成異常症の治療方法を提供する：
（１）患者由来の試料中から、ＦＧＦＲ３タンパク質又はＦＧＦＲ３遺伝子の変異を検出する工程、
（２）上記（１）の工程において、ＦＧＦＲ３タンパク質又はＦＧＦＲ３遺伝子の変異が検出された患者に、化合物１又はその薬学的に許容される塩の有効量を投与する工程。
　一実施形態において、本発明は、また、以下の方法も提供する：
ＦＧＦＲ３タンパク質又はＦＧＦＲ３遺伝子の変異を有する患者に、化合物１又はその薬学的に許容される塩の有効量を投与する工程を含む、
ＦＧＦＲ３変異軟骨形成異常症の治療方法であって、
該患者由来の試料中から、ＦＧＦＲ３タンパク質又はＦＧＦＲ３遺伝子の変異が検出される、
方法。
　上記の治療方法において、ＦＧＦＲ３タンパク質又はＦＧＦＲ３遺伝子の変異が検出された患者は、化合物１又はその薬学的に許容される塩の有効量を投与する化学療法が十分な治療効果を示すと予測される。ここで、「治療効果」は、骨延長効果等により評価することができる。また、ＦＧＦＲ３の機能阻害の活性（例えば、ＦＧＦＲ３リン酸化を指標とした阻害活性）の程度により治療効果を推定することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。本発明は実施例により十分に説明されているが、当業者により種々の変更及び修飾が可能であろうことは理解される。したがって、そのような変更及び修飾が本発明の範囲を逸脱するものでない限り、それらは本発明に包含される。
実施例１：インビトロにおける化合物１によるＦＧＦＲ３変異体に対する阻害活性の評価
１－１　ＦＧＦＲ３変異体発現ベクターの構築
　ＦＧＦＲ３ベクターはＯＲＩＧＥＮＥ社より購入したＦＧＦＲ３（ＮＭ＿０００１４２）Ｈｕｍａｎ　Ｔａｇｇｅｄ　ＯＲＦ　Ｃｌｏｎｅ（ＦＧＦＲ３野生型（ＷＴ）発現ベクター）を用い、各変異体（Ｇ３８０Ｒ、Ｎ５４０Ｋ及びＫ６５０Ｅ）の発現用ベクターは、前記ベクターをテンプレートとして、構築した。
１－２　ＦＧＦＲ３リン酸化を指標としたＦＧＦＲ３阻害活性測定
　ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔを、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地にて培養し、細胞を常法により回収後、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いたリポトランスフェクション法を用いて、上記で示したＦＧＦＲ３野生型又は変異体発現ベクターをそれぞれ細胞に導入し、９６プレートに１ウェルあたり１．５×１０4個／１００μＬで播種した。
　薬液として、Ｖｅｈｉｃｌｅ（ＤＭＳＯ）群、各希釈系列（３０００ｎＭを最大終濃度とし、１０００、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３ｎＭまでの９濃度の希釈系列）の化合物１を準備した。播種した細胞を３７℃、５％　ＣＯ2で２４時間インキュベートしたのち、薬液を含む培地を１１μＬ添加し、さらに１時間インキュベートした。
　ＦＧＦＲ３の自己リン酸化能に対する機能阻害は、Ｈｕｍａｎ　Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＦＧＦ　Ｒ３　ＤｕｏＳｅｔ　ＩＣ　ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて測定及び評価した。具体的には、キットに付属の細胞溶解液にＰｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）及びＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、それを用いて細胞を溶解し、キットのプロトコルに従い実験を実施し、各ウェルに対してプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ３８４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）で比色定量を行った。薬剤添加ウェルの相対的なＦＧＦＲ３のリン酸化率は、次式に従い、コントロール群を１００％とした場合の比率として算出した。なお、実験は２連（１処理群につき２ウェル）で行い、２ウェルの各データの平均値を解析に用いた。
　相対的なＦＧＦＲ３リン酸化率（％）＝（薬剤添加ウェルのシグナル量）
　　　　　　　　　　　　／（コントロール群のシグナル量）×１００
　ＩＣ５０値（５０％阻害濃度）は、コントロール群に対して５０％阻害を達成する濃度として算出した。
　ＦＧＦＲ３野生型（ＷＴ）、又は変異体（Ｇ３８０Ｒ、Ｎ５４０Ｋ又はＫ６５０Ｅ）を発現させた２９３Ｔ細胞株において、化合物１は下記のような阻害活性を示した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２：軟骨無形成症モデルマウスを用いた化合物１の骨延長効果
　ＦＧＦＲ３ＡＣＨマウス（Ｎａｓｋｉ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１９９８，１２５（２４）：４９７７－８８。以下、単にＡＣＨマウスと示す）を用いた。ＦＶＢ系統のＡＣＨマウスに人工授精したＦ１　ｈｙｂｒｉｄマウスを大量作出し、ゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲ法で遺伝子型決定を行った。化合物１は０．５％ＨＰＭＣに溶解して各濃度の溶液を作成し、投与日の個々体重に応じて、化合物１の投与用量が０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇとなるように１０ｍＬ／ｋｇで投与した。化合物１投与群と対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ＝０．５％ＨＰＭＣ投与）に群分け（ＷＴ及びｖｅｈｉｃｌｅ投与群：ｎ＝５、化合物１投与群：ｎ＝６）して日齢２１から４２まで１日１回腹腔内注射にて週５日投薬（５投２休）を行った。日齢４３に安楽死処置を施し、体重測定ならびにＸ線撮影による骨長測定（大腿骨、脛骨、尺骨）を行った。Ｘ線撮影はｆａｘｉｔｒｏｎ　Ｘ－ｒａｙ　ＤＸ－５０（アクロバイオ株式会社）を用いて行い、計測はＩｍａｇｅＪで行った。Ｄｕｎｎｅｔｔ'ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｔｅｓｔを用いて、有意差検定を行い、図１～図５中の＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
　図１～図５に示すように測定時（日齢４３）において、ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して化合物１の投与群は濃度依存的な骨延長効果が見られた。
次に投薬後のマウスから大腿骨を単離し、軟骨成長板をサフラニンＯ染色して、その長さを計測した。その結果を図４に示した。ＡＣＨマウスの成長板平均幅は１４８．３であって、ＡＣＨマウスに化合物１を投薬した群では、２０６．４であり、ｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比べて伸長があることが確認出来た。
実施例３：軟骨無形成症モデルマウスを用いた化合物１の骨延長効果
　実施例２と同様の方法により、化合物１の投与用量（雄マウス：１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ、雌マウス：１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は６ｍｇ／ｋｇ）を変更し、雄及び雌の両方のマウス（ｎ＝１０）を用いて骨延長効果の評価を行った。Ｄｕｎｎｅｔｔ'ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｔｅｓｔを用いて、有意差検定を行い、図６～図１１中の＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。
　図６～図１１に示すように、測定時（日齢４３）において、ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して化合物１の投与群は濃度依存的な骨延長効果が見られた。
実施例４：疾患ｉＰＳ細胞モデルでの薬効評価
　タナトフォリック骨異形成症Ｉ型（ＴＤ１，Ｒ２４８Ｃ）と軟骨無形性症（ＡＣＨ，Ｇ３８０Ａ）患者の皮膚線維芽細胞と健常者の皮膚線維芽細胞からｉＰＳ細胞株を樹立し、軟骨細胞へと分化誘導した。健常ｉＰＳ細胞からは軟骨組織が形成されたのに対し、ＴＤ１－ｉＰＳ細胞とＡＣＨ－ｉＰＳ細胞から誘導した組織では軟骨成分が減少していた（Ｙａｍａｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４，５１３（７５１９）：５０７－１１）。
　この分化誘導系において、分化誘導開始後３日目より１ｎＭの化合物１を培地交換の度（培地交換は２－７日に１回）に添加し、分化誘導１０週目に解析を行った。陽性コントロールとしてＲｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎを用いた。評価項目は組織切片染色（Ｓａｆｒａｎｉｎ染色）、ＣＯＬ２Ａ１及びＡｇｇｒｅｃａｎ（ＡＣＡＮ）のｍＲＮＡ発現を指標とした。Ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔｅｓｔを用いて、有意差検定を行い、図１３中の＊はｐ＜０．０５を示す。
　図１２に示すように、化合物１の添加によって、軟骨細胞外マトリックスの構成成分であるグリコサミノグリカンを染色するサフラニン染色陽性の染色像が認められた。
また、図１３に示すように、化合物１を添加した細胞において、ＣＯＬ２Ａ１及びＡＣＡＮのｍＲＮＡの発現は添加していない細胞と比べ発現が増加した。

Claims (17)

  1. 　１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩を含有する、軟骨形成異常症を治療するための医薬組成物。
  2. 　軟骨形成異常症が、軟骨無形成症、軟骨低形成症、又はタナトフォリック骨異形成症である、請求項１記載の医薬組成物。
  3. 　軟骨形成異常症が、軟骨無形成症である、請求項１又は２記載の医薬組成物。
  4. 　軟骨形成異常症が、ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨形成異常症である、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 　ＦＧＦＲ３変異が、ＦＧＦＲ３の２４８番目のアルギニン、３８０番目のグリシン、ＦＧＦＲ３の５４０番目のアスパラギン、又は６５０番目のリジンの変異である、請求項４記載の医薬組成物。
  6. 　ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨形成異常症が、ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨無形成症である、請求項４記載の医薬組成物。
  7. 　軟骨無形成症が、ＦＧＦＲ３の３８０番目のグリシンがアルギニンに変異したＦＧＦＲ３変異を有する軟骨無形成症である、請求項６記載の医薬組成物。
  8. 　ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨形成異常症が、ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨低形成症である、請求項４記載の医薬組成物。
  9. 　軟骨低形成症が、ＦＧＦＲ３の５４０番目のアスパラギンがリジンに変異したＦＧＦＲ３変異を有する軟骨低形成症である、請求項８記載の医薬組成物。
  10. 　ＦＧＦＲ３変異を有する軟骨形成異常症が、ＦＧＦＲ３変異を有するタナトフォリック骨異形成症である、請求項４記載の医薬組成物。
  11. 　タナトフォリック骨異形成症が、ＦＧＦＲ３の２４８番目のアルギニンがシステインに変異したＦＧＦＲ３変異、又は６５０番目のリジンがグルタミン酸に変異したＦＧＦＲ３変異を有するタナトフォリック骨異形成症である、請求項１０記載の医薬組成物。
  12. 　１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩を含む、軟骨形成異常症の治療剤。
  13. 　軟骨形成異常症の治療における使用のための、１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩。
  14. 　軟骨形成異常症の治療のための、１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩の使用。
  15. 　軟骨形成異常症を治療するための医薬を製造するための、１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩の使用。
  16. 　１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩の有効量を、軟骨形成異常症の患者に投与する工程を含む、軟骨形成異常症の治療方法。
  17. 　活性成分としての１－［（３Ｓ）－３－［４－アミノ－３－［２－（３，５－ジメトキシフェニル）エチニル］－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル］－１－ピロリジニル］－２－プロペン－１－オン又はその薬学的に許容される塩を、被験者における軟骨形成異常症を治療するためのその使用のための指示書と共に含む、コマーシャルパッケージ。
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