WO2021141138A1 - 新規細胞表現型スクリーニング方法 - Google Patents
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Definitions
- This disclosure relates to novel cell phenotypic screening.
- the cell phenotype is known as a screening for various drugs using cells.
- Phenotype screening uses cell image information represented by cell or organ phenotype (phenotype), for example, cell proliferation rate, cell death, localization of a specific protein, or cell structure as an index. This is a method for searching for drugs to be changed (for example, small molecule compounds, peptides, etc.).
- One of the important objectives of cell phenotype screening is (i) what kind of cell phenotypic change (image response) is exhibited in response to inputs (test substance, drug stimulation, etc.), and (ii) gene expression. The purpose is to examine information on whether it responds and (iii) what mechanism of action it was based on.
- the present disclosure provides a method for rapidly detecting an image response or a gene expression response of cells coexisting with a test subject such as a drug.
- a step of preparing a plurality of cells labeled with a first barcode nucleic acid associated with a test subject and treated with the test subject A step of selecting the plurality of cells based on the cell phenotype using an imaging cell sorter, A method for screening a test subject is provided, which comprises a step of identifying a test subject used for processing each cell using the first barcode nucleic acid as an index.
- each input information such as the processing performed on the cell by the test object is linked with the image response and the gene expression response in a pooled state, which is advantageous for high-speed phenotropic screening. It can be used.
- the present disclosure can be advantageously used in selecting or searching for a test subject that causes a phenotypic change in a cell of interest.
- FAM green fluorescent dye
- Cy5 red fluorescent dye Cy5
- the horizontal axis is the fluorescence intensity derived from immunostaining of NFkB protein
- the vertical axis is the fluorescence intensity derived from the correct label Fixable Far Red.
- DTSSP 1 mg or 10 mg of cells under fixed conditions NFkB protein obtained from image signal data performs machine learning on the presence or absence of nuclear translocation (positive with nuclear translocation, negative without nuclear translocation), and is a type of machine learning model. It is a matrix and a table showing the result (histogram) showing a certain SVM (support vector machine) score and the result comparing the result with the correct answer data labeled by Fixable Far Red.
- It is a schematic diagram of a part of the reagent for the gene analysis technique used in Examples 5 and 6.
- the Multi-seq Barcode first bar code sequence 10X Barcode is the second common bar code area
- UMI is the second unique bar code area sequence. It is a hybrid of a second barcode nucleic acid and a first barcode nucleic acid, or a hybrid of a second barcode nucleic acid and a genome-related nucleic acid for a cell genome or a derivative thereof.
- It is a schematic diagram of the sequence library after the PCR reaction applied in Examples 5 and 6.
- the second common barcode region sequence of each cell in the mixed sample (cells with LPS drug to cell ratio of 9: 1) and the number of reads of each first barcode sequence detected from the unique read having this. It is a table (Table 1-1) showing.
- the second common barcode region sequence of each cell in the mixed sample (cells with LPS drug to cell ratio of 9: 1) and the number of reads of each first barcode sequence detected from the unique read having this. It is a table (Table 1-2) showing.
- Distribution of the number of reads of (2 types) (mixed sample (cell ratio between cells with LPS drug and cell without drug is 9: 1))
- (1st barcode nucleic acid sequence A: without LPS drug, 1st barcode nucleic acid sequence B It is a graph (graph 1) showing (with LPS drug).
- FIG. 5 is a photomicrograph showing how a uniform droplet (compartment) (diameter about 110 ⁇ m) is generated by fusion of 1 droplet to 1 droplet in a microfluidic device.
- FIG. 8 It is a schematic diagram of the cell phenotypic screening method of Example 8 using a 96-well microplate for searching a test subject which causes a desired phenotypic change. It is a table which shows 96 kinds of test subjects (24 kinds of test substances ⁇ 4 kinds of concentrations) used in Example 8 and the function (known mechanism of action) of a test substance. It is a table which shows the sequence of the 1st barcode nucleic acid (Barcorde #: Ind_8bp_0015-Ind_8bp_036) which identifies a test subject used in Example 8.
- FIG. 8 is a graph showing the enrichment level of the first barcode nucleic acid sequence of sorted cells in Example 8. In Example 8, whether or not the cells sorted and collected by the image cell sorter certainly show a phenotype was confirmed by taking an image of the cells using an existing image flow cytometer and calculating the nuclear translocation score. is there.
- a method of screening cells is a step of preparing a plurality of cells labeled with a first barcode nucleic acid associated with the test subject and treated with the test subject.
- the step of identifying the test subject used for the treatment of each cell using the first barcode nucleic acid as an index is included.
- the term "genome-related information” refers to information related to a cell genome or its origin, and refers to information related to changes in nucleic acids and proteins associated with changes in gene expression.
- the "genome-related nucleic acid” is a nucleic acid related to genome-related information, and RNA such as cell genomic DNA and mRNA derived from the cell genome or its cDNA is a preferable example.
- RNA such as cell genomic DNA and mRNA derived from the cell genome or its cDNA is a preferable example.
- another example of the "genome-related nucleic acid” includes a nucleic acid probe that specifically interacts (for example, binds) with a molecule such as a protein expressed in a cell.
- the DNA may be a fragment cleaved with a restriction enzyme or the like, or a DNA tag may be introduced into the DNA fragment.
- the "barcode region” is a region of a base sequence containing T (thymine) or U (uracil), A (adenine), G (guanine), and C (cytosine), and is common to those described below. It is not limited as long as it is an array of barcode areas or unique barcode areas.
- the barcode nucleic acid is a nucleic acid containing a barcode region, and makes it possible to identify genome-related information of cells and imaging information derived from a test subject or beads coexisting with the cells.
- the barcode area includes two types, a common barcode area and a unique barcode area.
- the length of the barcode region is not particularly limited, but is preferably a sequence having a length of 8 to 40 bases.
- the bar code region is 12 bases in length may be nucleic acid amplification at a time bar coding sequence of 4 12 kinds of diversity.
- the "common barcode area” is a barcode area that is common to the same identification target.
- a test object for example, a bar code region different for each test object, that is, a bar code area common to one test object can be mentioned.
- the barcode area is different for each combination, that is, it is common to a specific combination of test objects. Labeled with a barcode nucleic acid having a barcode region. By labeling with such a common barcode region, the combination of test subjects can be identified.
- the object of identification is genome-related information of one cell
- a barcode region different for each cell that is, a barcode region common to one cell
- genome-related information derived from the same cell can be identified.
- the "unique barcode region” means that each barcode nucleic acid can be distinguished by labeling each barcode nucleic acid with a different barcode region. For example, by labeling the unique barcode region, beads linked to each barcode nucleic acid, organisms containing each barcode nucleic acid, and genome-related nucleic acid hybridized with each barcode nucleic acid can be identified.
- hybridizing means that the hybrid region of a barcode nucleic acid forms a double-stranded complex with a genome-related nucleic acid corresponding to the cell genome or its origin or another barcode nucleic acid. Means.
- hybridization at 37 ° C., 40 to 45% formamide, 1.0 M NaCl, 0.1% SDS and 0 at 55 ° C. to 60 ° C. Cleaning with .5X-1XSSC can be mentioned.
- Another aspect of forming the double-stranded complex is that the complex is formed under stringent conditions.
- the stringent condition means a condition in which a so-called specific complex is formed and a non-specific complex is not formed, and includes the above-mentioned exemplary conditions.
- Such stringent conditions are known to those skilled in the art and are known to those skilled in the art, for example, Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), Cold Spring Harbor Laboratory, 1987, Molecular biology, and Molecular biology. Can be referenced and set.
- Examples of the sequence in which the hybrid region of the barcode nucleic acid hybridizes include a sequence complementary to the hybrid region.
- the "hybridization region” is preferably a region that binds (hybridizes) to the genome-related nucleic acid corresponding to the cell genome or its origin or another barcode nucleic acid. Such a hybridizing region preferably exists together with the barcode region in the barcode nucleic acid.
- cells treated with a test subject and labeled with the first barcode nucleic acid are prepared.
- Such a preparatory step may include, for example, the following steps (steps 1-1 to 1-3 in FIG. 1).
- Step 1 Prepare multiple cells labeled with the first barcode nucleic acid associated with the test subject and treated with the test subject.
- Step 1-1 Creation of subcompartment (droplet) (Step of forming droplets containing the test object and the first barcode nucleic acid corresponding to the test object)
- a liquid medium containing the test subject and the first barcode nucleic acid and an organic solvent are mixed, and the test subject and its subject are mixed.
- a subcompartment (droplet) containing the first barcode nucleic acid corresponding to the test subject is formed.
- hydrogel beads can be added to a liquid medium containing the test subject and the first barcode nucleic acid to generate a first subcompartment containing the test subject and the first barcode nucleic acid.
- the hydrogel particles prepared in advance, the test subject, and the first barcode nucleic acid corresponding to the test subject are mixed, and the organic solvent and the surface activity are mixed.
- the agent and vortexing it is possible to generate a large amount of uniform system droplets containing the test subject and the first barcode nucleic acid corresponding to the test subject.
- the above step can be carried out according to the method described in Anal. Chem., 2018, 90, 16, 9813-9820.
- the hydrogel particles added as a template in this step for example, beads made of acrylamide, agarose, collagen, alginic acid, polyethylene glycol or the like can be used.
- test subject of the present disclosure is not particularly limited as long as it is a test subject for which a response in a desired cell is examined, and for example, a nucleic acid compound or enzyme having a small organic compound, a peptide compound, a nucleic acid and a derivative thereof as a basic skeleton.
- a nucleic acid compound or enzyme having a small organic compound, a peptide compound, a nucleic acid and a derivative thereof as a basic skeleton examples thereof include polypeptides such as antibodies and antibody fragments, and test substances such as proteins, cells, viruses and drugs.
- the type of target cell is not particularly limited as long as the effect of the present disclosure is not impaired, and the cell can be selected according to the purpose.
- a patient's blood cell-derived cell or iPS cell induced pluripotent stem cell
- Human-derived cells such as cells induced to differentiate from stem cells to target cells
- mammalian-derived cells such as CHO (Chinese Hamster Ovaly) cells
- Step 1-2 Creating a compartment by fusing subcompartments (Step of fusing a sub-compartment (droplet) containing a test subject and a first barcode nucleic acid corresponding to the test subject and a sub-compartment (droplet) containing cells) Further, according to one embodiment of the present disclosure, as shown in step 1-2, a droplet containing the test object and the first barcode nucleic acid and a droplet containing cells are mixed with the test object. The step of associating the first barcode nucleic acid with the cell is carried out.
- the first subcompartment containing the test subject and the first barcode nucleic acid and the second subcompartment containing the cells are fused to generate a compartment containing the test subject, the first barcode nucleic acid and the cells.
- the subject, the first barcode nucleic acid and the cell may be associated with each other.
- a droplet group containing a test subject and a first barcode nucleic acid corresponding to the test subject is flowed from one channel, and a droplet group containing cells is poured from the other channel.
- a large number of drops containing cells, the test subject, and the first barcode nucleic acid corresponding to the test subject are generated in the organic solvent phase. can do.
- a droplet containing a cell is formed in a microfluidic device, and the droplet is fused with a test subject and a droplet containing the first barcode nucleic acid corresponding to the test target to form a cell. It is also possible to generate droplets containing the test subject and the first bar code nucleic acid corresponding to the test subject.
- the test subject is allowed to act on the cells, and the cells are labeled with the first barcode nucleic acid by attaching the barcode nucleic acid corresponding to the test subject to the cell surface. can do.
- the above step is performed by Anal. Chem. It can be carried out according to the method described in 2018, 90, 2, 1273-1279.
- Each compartment or sub-compartment is a unit of compartment that can distinguish the combination of each component in the compartment or sub-compartment from other compartments.
- the type and number of test subjects included in the compartments in the present disclosure are not particularly limited as long as they do not interfere with the effects of the present disclosure, but are one type per compartment from the viewpoint of simplifying or clarifying the cell response. Is preferable. However, for example, when examining the response of cells to a test subject by combining a plurality of types, the number of types of the test subject per one compartment may be plural. In addition, the concentration of the test subject may be set to be different for each compartment, whereby the cell response at different concentrations of the test subject can be evaluated. Such aspects are also included in the present disclosure.
- the compartments of the present disclosure are not particularly limited as long as they can maintain a compartment that can be distinguished from other compartments, and include, for example, aqueous droplets generated by the above steps (for example, aqueous droplets in oil).
- aqueous droplets generated by the above steps for example, aqueous droplets in oil.
- Yet another example includes gel particles of hydrogels, water / oil structures in which a plurality of non-mixed interfaces such as emulsions overlap, and vesicles formed by a monomolecular membrane or a bimolecular membrane such as micelles or liposomes. ..
- an aqueous solution such as a cell culture solution, a physiological saline solution, or a buffer solution can be used.
- an oil such as Droplet Generator oil for EvaGreen (manufactured by BioRad) can be used as the organic solvent phase.
- the compartment of the present disclosure preferably has a physical barrier function in the peripheral portion thereof from the viewpoint of distinction from other compartments.
- a preferred method for producing a compartment having such a barrier function includes a phase separation method and the like.
- the phase separation method for example, cells and beads and an aqueous substrate can be mixed to obtain an aqueous droplet, and the aqueous liquid is suspended in a hydrophobic solvent to form a compartment.
- Compartments can also be created by mixing droplets at a bifurcation or confluence in a microfluidic device.
- the compartment of the present disclosure can also be formed by including it in a container such as a microwell, a well, or a tube.
- a container such as a microwell, a well, or a tube.
- cells can be labeled with the first barcode nucleic acid in a compartment containing the test subject, the first barcode nucleic acid and the cells.
- the first barcode nucleic acid includes an anchor (for example, a known anchor having an oligonucleotide region and a lipid region (cholesterol, chitosan-glycol-lipid, etc.)) capable of linking the first barcode nucleic acid to the cell surface. Is desirable. Particularly preferable examples include anchor DNA and the like used in Examples described later.
- the first barcode nucleic acid may be used in a form contained or bound to particles or the like. In that case, the first barcode nucleic acid is designed to be released from the appropriately contained particles or the like. Details of the composition of the first barcode nucleic acid will be described later.
- the cells and the test subject may be cultured in a coexisting state in the compartment.
- Such culturing includes, for example, holding the compartment at a desired culturing time and culturing temperature.
- the compartment In holding a compartment, the compartment may be moved and held in a reservoir that can hold multiple compartments.
- the above step can be performed by a known method. For example, J. J. Agresti et al. , Proc Natl Acad Sci US A. , 107 (9), 4004-9 (2010), A.I. Abbassourrad et al. , Scientific Rep. , 5, 12756 (2015), B.I. L. Wang et al. , Nat Biotechnology. , 32 (5), 473-8 (2014).
- the culturing time and culturing temperature can be set to such an extent that the response of the cells to the test subject can be evaluated.
- the culturing time is, for example, 0 hours or more and 14 days or less, preferably 2 hours or more and 5 days or less.
- the culture temperature is, for example, 4 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, preferably around 37 ° C.
- one embodiment of the search for a test subject of the present disclosure includes a search for a target site that causes a desired phenotypic change in cells.
- the search for the target site includes, for example, a search for a target position (target) on a gene that causes a desired phenotypic change.
- Labeling cells with a first bar code nucleic acid that identifies information that identifies the treatment to be applied to the cell in advance for example, information that identifies the position where gene editing occurs and information on nucleic acid sequences such as guide RNA used for gene editing).
- the imaging cell sorter can be used to search for the target position (target) on the gene that causes the desired phenotypic change. It can be used efficiently.
- Step 1-3 Destruction of compartment (Step of collecting cells labeled with the first barcode nucleic acid)
- One embodiment of the present disclosure comprises the step of retrieving cells from the compartment, as shown in steps 1-3 of FIG.
- cells labeled with the first barcode nucleic acid can be recovered from droplets in the organic solvent phase (including cells on which the test subject is allowed to act and labeled with the first barcode nucleic acid).
- the recovery step can be carried out, for example, by adding an organic solvent to the organic solvent phase to cause phase separation, or by applying an electric field to the organic phase solvent phase.
- the recovered cells are labeled with the first barcode nucleic acid associated with the test subject, even if a plurality of cells treated by different test subjects are mixed, the nucleic acid information described later can be read. Information about the subject to be tested can be identified in the process. Therefore, the purpose is to mix a plurality of cells labeled with the first barcode nucleic acid recovered in this step, and further separate the cells generating a predetermined phenotype by image-based cell sorting described later. For cells that cause phenotypic changes in cells, genome-related information in the specific cells and information on the processed test subject can be acquired at the same time.
- Step 2 Cell selection (Image-based cell sorting)
- a step of selecting a plurality of cells based on a cell phenotype is carried out using an imaging cell sorter.
- cells undergoing a predetermined reaction can be selected by a test subject based on the cell phenotype.
- a more specific embodiment of the imagen cell sorter will be described later, and examples of the imaging cell sorter include the devices described in WO2017 / 073737 and WO2018 / 181458.
- the imaging cell sorter described in the above-mentioned publication analyzes signals such as light and electromagnetic waves from cells to be observed without imaging, optimizes the light source system or detection system by machine learning, and analyzes the observation target. By optimizing the method of discrimination using machine learning, it is possible to perform sorting quickly and accurately.
- Step 3 Identification of the test subject that causes the desired cell change (Reading nucleic acid information)
- a step of identifying a test subject used for processing each cell is carried out using the first barcode nucleic acid as an index.
- the nucleic acid information of the first barcode nucleic acid can be read and the change in cell phenotype can be associated with the test subject, it is possible to identify the test subject that causes the change in phenotype of the target cell. Is possible.
- the present disclosure it is preferable to analyze the genome-related information of each cell selected for each phenotype using an imaging cell sorter.
- an imaging cell sorter By analyzing the genome-related information of each cell, it is possible to relate the change in cell phenotype, the genome-related information of the cell, and the relationship with the test subject. Since it is possible to obtain information on a phenomenon occurring at the gene level in a cell, it is possible to obtain information on the phenomenon in more detail.
- the nucleic acid information here includes information on the first barcode nucleic acid associated with the test subject and nucleic acid information on the genome-related nucleic acid corresponding to the cell-derived genome or its origin.
- the step of analyzing the nucleic acid information is This is a step of preparing a plurality of compartments containing cells showing a target phenotypic change sorted using an imaging cell sorter, a first barcode nucleic acid, and a second barcode nucleic acid linking bead.
- a step in which a bar coded nucleic acid linking bead contains a plurality of second bar coded nucleic acids capable of hybridizing with a genome-related nucleic acid corresponding to the cell genome or its origin or a first bar coded nucleic acid.
- a large number of droplets are produced in the microchannel, and preferably, in each droplet, a second barcode nucleic acid-linked bead that is different for each droplet and a cell showing a desired phenotypic change are probabilistically formed.
- Mix so as to contain in a ratio of 1: 1.
- the cells are then lysed in the compartment described above, with the genome-related nucleic acid corresponding to the cell genome or its origin and the first barcode nucleic acid used to label the subject, as shown in the upper left corner of FIG. Is contained in the compartment in a hybridized state with the second barcode nucleic acid linking beads.
- the first barcode nucleic acid of the present disclosure is not particularly limited as long as it contains a barcode region corresponding to each test subject, and the nucleic acid is, for example, RNA, DNA, or a combination thereof.
- the first barcode nucleic acid can hybridize with the first common barcode region corresponding to the test subject and the second barcode nucleic acid, respectively. It is preferable to include a first hybridization region.
- the first hybridization region is a sequence consisting of polyadenylation, and this portion can hybridize with the second hybridization region of the second barcode nucleic acid-linked bead (for example, a sequence consisting of polythianin).
- the sequence information of the first common barcode region the same test subject can be identified in a one-to-one correspondence. Therefore, by using the sequence information of the first common barcode region, it is possible to identify the test subject existing in the compartment.
- the first barcode nucleic acid is prepared by a solid phase synthesis method or an enzyme synthesis method for a specific nucleic acid sequence.
- the barcode nucleic acid is RNA
- the barcode nucleic acid after synthesizing a DNA template that is a complementary strand of the single-stranded barcode nucleic acid, it binds to the promoter sequence on the DNA template by a linear amplification reaction to form a single-stranded barcode region. It may be synthesized by an RNA polymerase such as T7, which synthesizes RNA containing.
- the barcode nucleic acid is DNA
- the barcode nucleic acid is not particularly limited as long as it does not interfere with the effects of the present disclosure, and may be synthesized and / or designed using, for example, a known sequence.
- the second barcode nucleic acid linking beads hybridize with the genome-related nucleic acid or the first barcode nucleic acid corresponding to the cell genome or its origin. It is linked to a second barcode nucleic acid containing a possible sequence.
- the number of the second barcode nucleic acid-linked beads per compartment is not particularly limited, but one per compartment is preferable.
- Second barcode nucleic acid Further , (1) and (2) in the lower part of FIG. 2 are enlarged views of the surface of the second barcode nucleic acid-linked bead, showing an example of the structure of the second barcode nucleic acid linked to the bead. There is.
- the second barcode nucleic acid may be directly or indirectly linked to the second bead.
- the second barcode nucleic acid is RNA, DNA or a combination thereof.
- the second barcode nucleic acid has a second common to each other among the plurality of second barcode nucleic acids linked to the beads, as shown in the lower parts (1) and (2) of FIG. It is preferable to include a common barcode region, a second unique barcode region that can be distinguished from each other, and a second hybrid region that can hybridize with a genome-related nucleic acid or a first barcode nucleic acid.
- the second barcode nucleic acid preferably further contains a PCR primer region.
- the second barcode nucleic acid has a PCR primer region, a second common barcode region, a second unique barcode region, and a second hybrid region in this order from the bead side. Including.
- the sequence information of the second common barcode region is common to each other among the plurality of second barcode nucleic acids linked to the beads as described above, and is derived from cells. Since it is associated with the genome-related nucleic acid by hybridization, it can be used as an index for identifying the cell from which the genome-related nucleic acid is derived. Furthermore, since cells are sorted by phenotype using an imaging cell sorter, the sequence information of the second common barcode region is associated with the cell phenotype (imaging information), and the cell phenotype It can also be used as an index.
- sequence information of the second unique bar code region can be distinguished from each other for each second bar code nucleic acid, while the genome-related nucleic acids that hybridize individually can be identified. It is possible to analyze reactions at the genome level, such as whether the expression level of genome-related nucleic acids is increasing.
- the second hybridizing region of the second barcode nucleic acid comprises a nucleic acid complementary to the first hybridizing region or genome-related nucleic acid.
- the second hybridization region in the second barcode nucleic acid is preferably polytimine composed of T.
- the length of polytimine may be any length that can be annealed (hybridized) with the polyadenyl (A) tail of mRNA.
- the second hybridization region in the second barcode nucleic acid contains a specific sequence of the DNA or a sequence complementary to the sequence of the DNA tag introduced into the DNA. Is preferable.
- the second barcode nucleic acid can have a different sequence as a whole of each second barcode nucleic acid.
- the plurality of second barcode nucleic acids linked to the beads are preferably a plurality of types of second barcode nucleic acids.
- Beads Beads are preferably linked to 1,000 to 100,000 second barcode nucleic acids from the perspective of being able to hybridize to a large number of genome-related nucleic acids.
- the material thereof is not particularly limited, but is cadmium selenide (CdSe), zinc sulfide (ZnS), cadmium sulfide (CdS), zinc selenium (ZnSe), zinc oxide (ZnO), silicon dioxide.
- Semiconductors such as quantum dots (semiconductor nanoparticles) made of semiconductor materials such as (SiO 2 ), inorganic substances such as heavy metals such as gold, acrylamide, agarose, collagen, alginic acid, cellulose, chitosan, hyaluronic acid, silicone hydrogel, Hydrogels such as PEG, resins such as polystyrene, polypropylene, hydrophilic vinyl polymers (for example, Toyopearl HW-65S (Toyosaw Co., Ltd.)), or chemically crosslinked materials of these hydrogels, or PEG or its Examples thereof include a hydrophilic vinyl polymer to which a derivative is bonded, preferably a hydrogel, and more preferably acrylamide or alginic acid.
- quantum dots semiconductor nanoparticles
- inorganic substances such as heavy metals such as gold, acrylamide, agarose, collagen, alginic acid, cellulose, chitosan, hyaluronic acid
- a plurality of types of second barcode nucleic acid linking beads can be produced by a known method.
- E.I. Z. Macosko et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) or Gierahn, T. et al. M et al. , Seq-Well: A Portable, Low-Cost Platform for High-Throughput Single-Cell RNA-Seq of Low-Input Samples; Nat Methods. It can be produced by the method described in 14,395-398 (2017).
- Cells or their derivatives examples include nucleic acids obtained from cell disruptions, cell contents, cell lysates and the like.
- Cell-derived products for example, crushed cells, contents, lysates, etc.
- Cell-derived products can be obtained by using a known method such as coexistence of cells with a cell lysis buffer or the like.
- cells labeled with the first barcode nucleic acid may be encapsulated together with a cell lysis buffer or the like when the compartment is prepared.
- a cell lysis buffer may be encapsulated with cells labeled with a first barcoded nucleic acid and cells linked with a second barcoded nucleic acid and generated in a compartment.
- the number of cells enclosed in the compartment is not particularly limited as long as it does not interfere with the effects of the present disclosure, but from the viewpoint of single cell analysis, it is preferably one per compartment.
- Hybridization complex acquisition step in the step of analyzing the genome-related information, the genome-related nucleic acid and the first barcode nucleic acid are each hybridized with the second barcode nucleic acid. A step of obtaining a hybridization complex is carried out.
- the above step can be performed by a known method.
- E.I. Z. Macosko et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 and 1202-1214 (2015) or Zheng GX et al. , Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. It can be carried out by the method described in 6; 8: 14049 (2017). The compartment may then be destroyed by a known method.
- the step of analyzing the genome-related information is derived from the hybridized complex obtained in the hybridized complex acquisition step.
- the step of producing the amplified product is carried out.
- the above step can be performed by a known method.
- E.I. Z. Macosko et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 and 1202-1214 (2015) or Zheng GX et al. , Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. It can be carried out by the method described in 6; 8: 14049 (2017).
- the hybrid complex obtained in the above-mentioned hybridization complex preparation step is subjected to the synthesis of complementary strand DNA and the reverse transcription reaction.
- cDNA for cell-derived mRNA is synthesized, and complementary DNA for the first barcode nucleic acid is synthesized.
- template switching template switching
- a PCR reaction By this PCR reaction, it is derived from the first amplification product derived from the hybrid complex of the first barcode nucleic acid and the second barcode nucleic acid, and from the hybrid complex of the cell-derived mRNA and the second barcode nucleic acid. Two types of amplification products of the second amplification product can be produced.
- the genome-related nucleic acid is DNA
- the extension PCR method can be performed as the above PCR reaction. Then, based on the obtained amplification product, a library of amplification products containing the first amplification product and the second amplification product, which are derived from the treatment of the test subject, can be prepared.
- the expression pattern of the amplification product obtained in the step of producing the amplification product derived from the hybridization complex is used as an index for the cell and the cell. It includes a step of identifying a coexisting test subject and detecting genome-related information of the cell.
- the expression pattern of the amplified product for example, the sequence information of the amplified product obtained by sequencing, for example, the sequence information of the first barcode nucleic acid in the sequence information (for example, the sequence of the first common barcode region).
- sequence information of the second barcode nucleic acid for example, sequence information of the second common barcode region, sequence information of the second unique barcode region
- sequence information of the genome-related nucleic acid sequence information of the genome-related nucleic acid (sequence of mRNA for each cell), etc.
- the sequence of the amplification product (first amplification product, second amplification product) obtained in the above-mentioned step of producing the amplification product derived from the hybridization complex is determined by a sequencer, and the sequence information of the amplification product is analyzed.
- the cells from which each amplification product is derived are assigned using the sequence information of the second common barcode region as an index.
- each mRNA molecule can be identified from the sequence information of the second unique barcode region, information such as the mRNA sequence for each cell and its expression level can be obtained using the sequence information as an index.
- Transcriptome information for each cell can be obtained based on the information obtained in the analysis of the second amplification product.
- the test subject coexisting with the above cells is identified.
- the first barcode nucleic acid corresponds to the test subject. Therefore, in the above identification, a test subject coexisting with a cell can be assigned to each first amplification substance based on the sequence information of the first common barcode region of the first barcode nucleic acid.
- the transcriptome information is matched with the test subject coexisting with the cells. Therefore, the test subjects coexisting with the genome-related information of the cells in each compartment can be linked one-to-one. Therefore, the response of cells to coexisting test subjects can be evaluated by detecting genome-related information such as transcriptome information of cells coexisting with one or more kinds of test subjects or their derivatives.
- nucleic acid information reading step for example, it can be carried out using a Chromium controller device manufactured by 10xGenomics, which is a one-cell analysis technique using droplet technology, and a single cell 3'reagent kit v3 manufactured by 10xGenomics.
- an imaging cell sorter is used to select a plurality of cells based on cell phenotype.
- an imaging cell sorter by using an imaging cell sorter, it is possible to analyze changes in the phenotype of cells generated in response to a test subject quickly and accurately, and select cells showing the desired phenotype.
- the imaging cell sorter is a flow cytometer that acquires and analyzes morphological information of an observation object such as a cell at high speed, and can selectively acquire a target observation object based on the analysis result.
- the imaging cell sorter is a scattered light or transmitted light from an observation object existing in a light irradiation region in which light from a light source is structured and irradiated.
- An analyzer including an analysis unit that analyzes an observation object based on a signal extracted based on the time axis of the electric signal output from a light receiving unit that receives fluorescence or electromagnetic waves and converts the electromagnetic wave into an electric signal.
- imaging cell sorter in the first embodiment uses a dynamic ghost imaging technique that utilizes the relative movement of the optical structure and the object to be measured.
- the analysis using the imaging cell sorter in the first embodiment can be performed, for example, according to the description in WO2017 / 073737.
- the imaging cell sorter in the first embodiment of the present disclosure by entrusting each key point of one-cell flow cytometry to machine learning, it is possible to measure cell information wisely and analyze and discriminate wisely, quickly and accurately. And. Cell classification method that is not bound by human intelligence bias (1), high-speed cell space information imaging / analysis method that does not capture cell "images" (2), and optical imaging method that automatically optimizes according to the target (3) It can be realized.
- FIG. 3 is a schematic view showing an embodiment of the imaging cell sorter according to the first embodiment of the present disclosure.
- the imaging cell sorter according to the first embodiment of the present disclosure is, as an example, Light source 1 and The light irradiation region 3 where the light from the light source 1 is irradiated, and A light receiving unit 7 that receives scattered light (including Raman scattering), transmitted light, fluorescence, or electromagnetic waves from an observation object 5 existing in the light irradiation region 3 and converts them into an electric signal.
- a storage unit 9 that receives and records an electric signal from the light receiving unit 7 and
- An analysis unit 11 that analyzes electrical signals related to scattered light, transmitted light, fluorescence, or electromagnetic waves recorded by the storage unit 9 and records the analysis results.
- An optical system control unit 13 that optimizes the light source 1 or the light irradiation region 3 based on the analysis result, Have.
- the light emitted in the light irradiation region 3 has a structured illumination pattern.
- the structured illumination pattern is provided, for example, by an optical modulator including a spatial light modulator, a filter, etc., which is arranged in the middle of the optical path from the light source 1 to the light irradiation region 3.
- the structured illumination here is illumination having a plurality of regions having different light characteristics, and the illumination light irradiating the observation object in the light irradiation region 3 is, for example, a plurality of regions divided in a grid pattern.
- the plurality of regions are processed into a band-shaped illumination light composed of a region having at least a first optical characteristic and a region having a second optical characteristic having different optical characteristics from each other.
- the imaging cell sorter according to the first embodiment of the present disclosure may be configured not to include the optical system control unit 13 from the configuration of FIG. 3 described above.
- the light emitted in the light irradiation region 3 is not structured, and the scattered light (including Raman scattering), transmitted light, and the transmitted light from the observation object 5 are used.
- Fluorescence or electromagnetic waves may be structured and detected by the light receiving unit 7.
- a light modulation unit such as a filter in the middle of the optical path from the light irradiation region 3 to the light receiving unit 7, the light from the observation object 5 (scattered light from the observation object 5 described above).
- Transmitted light, fluorescence, or electromagnetic waves can be structured and detected.
- the optical modulation unit used in the structured detection configuration has a plurality of regions divided in a grid pattern, and a region in which the plurality of regions transmit light and a region in which light is not transmitted are arranged. Has a pattern.
- the light from the observation object 5 is detected by the light receiving unit 7 as light having a plurality of regions having different optical characteristics via the optical modulation unit.
- the imaging cell sorter preferably optimizes the discrimination algorithm of the analysis unit 11 by machine learning.
- learning data is acquired using a learning sample containing cells showing the target phenotype, and the learning data is used to discriminate cells showing the target phenotype. It is possible to prepare a discriminant model to be used, measure a test sample based on the model, and obtain cells showing the desired phenotype from the test sample.
- the analysis unit 11 analyzes the observation target without reconstructing the image of the observation target with electrical signals related to scattered light, transmitted light, fluorescence, or electromagnetic waves. Is what you do. That is, the electric signal related to the scattered light, transmitted light, fluorescence, or electromagnetic wave is used for analysis as time-series waveform data.
- the imaging cell sorter according to the first embodiment of the present disclosure more preferably acquires waveform data (electrical signal) acquired by using a learning sample containing cells showing a target phenotype as training data, and the training data thereof.
- the optical system control unit 13 preferably optimizes the light source 1 by machine learning.
- the light from the light source 1 has a plurality of optical regions 21, and the optical system control unit 13 controls the optical structure of the plurality of optical regions.
- the imaging cell sorter according to the first embodiment of the present disclosure preferably has a plurality of optical regions, and the optical system control unit controls the optical structure of the optical regions.
- an optical modulation unit having a plurality of regions having different optical characteristics is arranged on an optical path between a light source and a light irradiation region. Being done.
- the light from the light source 1 is structured via the light modulation unit, and the observation object 5 is irradiated in the light irradiation region 3 by the structured illumination.
- the optical system control unit 13 analyzes the existing region of the observation object 3 based on the electric signal and controls so as to limit the light irradiation region 3. It is a thing.
- the optical system control unit 13 analyzes the density of the observation target 5 based on the electric signal to obtain the density information of the observation target, and obtains the density information. Based on this, the light source 1 or the light irradiation region 3 is controlled. Therefore, according to one embodiment, the analysis unit updates the discrimination algorithm based on the analysis result. Then, in the imaging cell sorter according to the first embodiment of the present disclosure, the light and the light irradiation region are preferably controlled based on the result analyzed by the analysis unit.
- the imaging cell sorter preferably includes a light receiving system control unit 27 that receives an electric signal from the light receiving unit 7 and optimizes the light receiving region 25 which is a region in which the light receiving unit 7 is irradiated with light. It also has.
- the light receiving system control unit 27 optimizes the light receiving region 25 by machine learning.
- a preferred embodiment of the imaging cell sorter in the first embodiment of the present disclosure has a flow cell including a light irradiation region 3.
- the observation object 5 moves together with the fluid flowing in the flow cell, and is irradiated with light from the light source 1 in the light irradiation region 3.
- the imaging cell sorter preferably has a sorting unit that discriminates an observation object based on the analysis result of the analysis unit 11 and separates the observation object 5.
- the imaging cell sorter is a scattered light, transmitted light, fluorescence from an observation object existing in a light irradiation region where light from a light source is irradiated.
- an analyzer equipped with an analysis unit that analyzes an observation object based on a signal extracted based on the time axis of an electric signal output from a light receiving unit that receives an electromagnetic wave and converts it into an electric signal hereinafter, "" Also referred to as an "imaging cell sorter” in the second embodiment.
- the analysis using the imaging cell sorter in the second embodiment can be performed according to the description in WO2018 / 199080.
- a three-dimensional image of the observation target can be generated at high speed, which is advantageous in quickly identifying the phenotype of the cell as the observation target.
- the imaging cell sorter in the second embodiment preferably passes through at least one flow path through which the observation object flows, a light source that irradiates the flow path with a band-shaped excitation light, and a position where the excitation light is irradiated.
- a three-dimensional image of the observation object based on an imaging unit that images a certain cross section of the observation object by imaging the fluorescence from the observation object and a plurality of captured images of the cross section imaged by the imaging unit. It is an imaging flow cytometer including a three-dimensional image generation unit that generates an image of.
- the observation object is preferably sorted based on the information indicating the morphology of the observation object indicated by the cross section imaged by the imaging unit.
- the flow paths are a plurality of flow paths arranged in parallel, and the excitation light is applied to the plurality of the flow paths, and the imaging unit is used. Takes an image of a cross section of an observation object flowing through each of the plurality of the flow paths.
- an optical modulation unit having a plurality of regions having different optical characteristics is arranged on the optical path between the light source and the image sensor that detects the fluorescence intensity.
- the image pickup unit reconstructs an image of the cross section of the observation object as an image pickup image based on the fluorescence intensity detected by the image pickup device and the optical characteristics of the light modulation section.
- an imaging flow cytometer that generates a three-dimensional image of an observation object at high speed.
- the method of the present disclosure may be carried out according to the method described in the following examples after the above preparation step.
- Japanese Patent No. 5441142 Japanese Patent No. 5540359, Japanese Patent No. 6544600, WO2017 / 073737, WO2018 / 181458, WO2018 / 199080, WO2018 / 203575
- the contents described are hereby incorporated by reference.
- the step of preparing the cells includes a step of mixing the liquid medium containing the test subject and the first barcode nucleic acid with the cells and associating the first barcode nucleic acid with the cells [1]. ] To [4].
- hydrogel beads are added to the liquid medium containing the test subject and the first barcode nucleic acid to generate the first subcompartment containing the test subject and the first barcode nucleic acid.
- the step of preparing the cells fuses the first subcompartment containing the test subject and the first barcode nucleic acid with the second subcompartment containing the cells, and the test subject, the first barcode nucleic acid and the above.
- the method according to any one of [1] to [6] which produces a compartment containing cells.
- the step of analyzing the genome-related information comprises a plurality of compartments including the genome-related nucleic acid corresponding to the cell genome or its origin, the first barcode nucleic acid, and the second barcode nucleic acid linking beads.
- the second bar code nucleic acid linking beads contain a plurality of second bar code nucleic acids capable of hybridizing with the genome-related nucleic acid corresponding to the cell genome or its origin or the first bar code nucleic acid.
- [4] to [11] include a step of producing an amplification product derived from the hybridization complex and a step of detecting genome-related information after coexistence of the test subject in cells using the expression pattern of the amplification product as an index.
- the method described in any of. [13] The method according to [12], wherein the genome-related nucleic acid is the cell genome DNA, RNA derived from the cell genome, or cDNA thereof.
- Each of the first barcode nucleic acids comprises a common first common barcode region in the same test subject and a first hybridizing region capable of hybridizing with the second barcode nucleic acid [12].
- the imaging cell sorter receives scattered light, transmitted light, fluorescence, or electromagnetic waves from an observation object existing in a light irradiation region where light from a light source is irradiated, and outputs the light from a light receiving unit that converts it into an electric signal.
- the method according to any one of [1] to [19], which is an analyzer including an analysis unit that analyzes the observation object based on the signal extracted based on the time axis of the electric signal.
- an optical modulation unit having a plurality of regions having different optical characteristics is arranged on an optical path between the light source and the light irradiation region.
- the imaging cell sorter includes a flow cell including the light irradiation region.
- the imaging cell sorter has a sorting unit that discriminates the observation target based on the analysis result of the analysis unit and separates the observation target. the method of.
- the imaging cell sorter further includes a streamline width control unit that variably controls the movable streamline width of the observation object moving in the flow path.
- the analysis unit machine-learns teacher information indicating a criterion for determining the state of the observation object based on the signal extracted based on the time axis and the streamline width when the signal is acquired.
- the teacher information generator generated by The method according to any one of [20] to [27], which estimates the state of the observation object moving in the streamline based on the signal and the teacher information generated by the teacher information generation unit.
- the streamline width control unit The streamline width is controlled to the first streamline width, which is the width corresponding to the diameter of the observation object.
- the above teacher information generation department The first teacher information based on the first observation result signal detected by the light receiving unit in the first streamline width controlled by the streamline width control unit is generated as the teacher information.
- the above analysis department The method according to [28], wherein the state of the observation object moving in the streamline is estimated based on the first teacher information generated by the teacher information generation unit and the signal.
- the streamline width control unit The streamline width is controlled to a second streamline width that is based on the diameter of the observation object and is wider than the first streamline width.
- the above teacher information generation department further Second teacher information based on the second observation result signal detected by the light receiving unit in the second streamline width controlled by the streamline width control unit is generated as the teacher information.
- the above analysis department The observation object moving in the streamline based on the first teacher information generated by the teacher information generation unit, the second teacher information generated by the teacher information generation unit, and the signal.
- the imaging cell sorter At least one channel through which the observation object flows, and A light source that irradiates the flow path with band-shaped excitation light, An imaging unit that captures a cross section of the observation object by imaging the fluorescence from the observation object that has passed the position where the excitation light is irradiated. Any of [1] to [30], comprising a three-dimensional image generation unit that generates a three-dimensional image of the observation object based on a plurality of captured images captured by the imaging unit. The method described in Crab. [32] The imaging cell sorter The method according to [31], wherein the observation object is sorted based on the information indicating the morphology of the observation object shown by the cross section taken by the imaging unit.
- the flow path is a plurality of flow paths arranged in parallel, and the flow path is a plurality of flow paths.
- the excitation light is applied to the plurality of the flow paths, and the excitation light is applied to the plurality of channels.
- An optical modulation unit having a plurality of regions having different optical characteristics is arranged on the optical path between the light source and the image pickup device that detects the fluorescence intensity.
- the image pickup unit [1] to [33] the image of the cross section of the observation object is reconstructed as an image based on the intensity of fluorescence detected by the image sensor and the optical characteristics of the light modulation unit.
- the method described in any of. [35] The method according to any one of [1] to [34], wherein the test subject contains a test substance.
- the step of analyzing the genome-related information is A step of preparing a plurality of compartments containing cells showing a target phenotypic change sorted using an imaging cell sorter, the first barcode nucleic acid, and the second barcode nucleic acid linking beads.
- a step in which a bar code nucleic acid linking bead contains a plurality of second bar code nucleic acids capable of hybridizing with a genome-related nucleic acid corresponding to the cell genome or its origin or a first bar code nucleic acid.
- the method according to any one of [1] to [36].
- JIS Japanese Industrial Standards
- Reference Example 1 Association of First Barcode Nucleic Acid with Cell Preliminary Test
- a cell similar to Example 1 described later according to the Multi-seq method (described in Nature Methods, volume16, pages 619-626 (2019)).
- the following preliminary experiments were performed using anchor CMOs, co-anchor CMOs and oligonucleotides. That is, cells and anchor CMO were incubated with Phosphate Buffered Saline (PBS) solution for 4 degrees and 5 minutes, co-anchor CMO was added, and incubation was performed for 4 times and 5 minutes.
- PBS Phosphate Buffered Saline
- the oligonucleotide to which Cy5) was added (having a sequence corresponding to the partial sequence of the first barcode nucleic acid) was mixed and incubated 4 times for 5 minutes.
- the oligonucleotide (corresponding to the partial sequence of the first barcode nucleic acid) to which the red fluorescent dye (Cy5) was added. (Has a sequence to be) was retained in the cell. However, it was confirmed that after a long period of time (3 hours or more after incubation), most of the cells may die or the barcode nucleic acid added to the cells may fall out (not shown).
- Reference Example 2 Preliminary test for associating the first barcode nucleic acid with cells
- a preliminary experiment is carried out by the same method as in Reference Example 1 except that a cell medium containing serum or Bovine Serum Albumin (BSA) is used as a solvent for incubation.
- BSA Bovine Serum Albumin
- Reference Example 3 Preliminary test for associating the first barcode nucleic acid with cells
- the solution for adding the anchor CMO or co-anchor CMO was changed to a serum-free Opti-MEM medium (manufactured by Thermo Fisher) and incubated at room temperature.
- a preliminary experiment was carried out by the same method as in Reference Example 1.
- an oligonucleotide having a sequence corresponding to a partial sequence of the first barcode nucleic acid
- a fluorescent dye can be added to the cells.
- a reaction suitable for a screening system using droplets can be performed while the addition efficiency to cells is high (100%). Therefore, it was decided to carry out the experiment of Example 1 below.
- Example 1 Linking the first barcode nucleic acid to cells in a compartment (tube)
- two types of cholesterol-modified oligonucleotide linkers namely anchor CMO (5'- Cholesterol-TEG-GTACGATGGAGCTGTCACTTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3'(SEQ ID NO: 1) and co-anchor CMO (5'-AGTGACAGCTGGATCGTTAC-TEG-Cholesterol-3' (SEQ ID NO: 2)
- anchor CMO 5'- Cholesterol-TEG-GTACGATGGAGCTGTCACTTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3'(SEQ ID NO: 1)
- co-anchor CMO 5'-AGTGACAGCTGGATCGTTAC-TEG-Cholesterol-3' (SEQ ID NO: 2)
- “Cholesterol-TEG” in the oligonucleotide linker is http: // sg. idtdna.
- the first barcode nucleic acid A was added to tube 1, mixed, and incubated.
- the oligonucleotide containing the first barcode nucleic acid A sequence (8 bases) was 5'-CCTTGGCACCGGAATTCCACCACATGA30-3' (SEQ ID NO: 3).
- the A30 added to the end of the first bar code nucleic A is a poly-adenine of 30 residues (poly (A 30)).
- the final concentration of the first barcode nucleic acid A was 250 nM. Incubation was carried out at room temperature for 5 minutes.
- Cells previously centrifuged and collected were added to tube 1 and incubated.
- Cells used in this case is THP1 cells, cell concentration was 1X10 7 cell / mL. Incubation was carried out at room temperature for 5 minutes.
- the tube 2 the same method and conditions as in the tube 1 except that the oligonucleotide containing the first barcode nucleic acid B (8 bases) is used instead of the oligonucleotide containing the first barcode nucleic acid A (8 bases).
- the cells were labeled with the first barcode nucleic acid B.
- the oligonucleotide containing the first barcode nucleic acid B (8 bases) was 5'-CCTTGGCACCGGAATTCCATGAGACCTA30-3' (SEQ ID NO: 4).
- Example 2 Binding of test substance, first barcode nucleic acid and cells in a compartment (tube)
- tube 1 and tube 2 cells are placed in RPMl-1640 medium supplemented with 10% FBS and 50 uM 2-mercaptoethanol, respectively. Resuspended.
- LPS Lipopolysaccharide
- DMSO dimethyl sulfoxide
- Cells labeled with (having a sequence corresponding to the partial sequence of the first barcode nucleic acid) were prepared separately, mixed in PBS solution and incubated for 1 hour.
- the mixed cell sample after this incubation was observed using a fluorescence microscope for each channel of green fluorescence (A in FIG. 5) and red fluorescence (B in FIG. 5), many cells were both green and red. It was shining. That is, in the long-term culture in the PBS solution, which is the above-mentioned method, the barcode nucleic acid was dropped out, and the two types of barcode nucleic acids were mixed.
- cells labeled with the oligonucleotide to which the green fluorescent dye FAM was added (having a sequence corresponding to the partial sequence of the first barcode nucleic acid) and the oligonucleotide to which the red fluorescent dye (Cy5) was added.
- Cells labeled with (having a sequence corresponding to the partial sequence of the first barcode nucleic acid) were prepared separately and mixed in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FPS and 50 uM 2-mercaptoethanol. Incubation was performed for 1 hour. When the mixed cell samples after this incubation were observed using a fluorescence microscope for each channel of green fluorescence (C in FIG. 5) and red fluorescence (D in FIG. 2), there was no omission of barcodes, and two types were observed. It was confirmed that the problem of mixing barcode nucleic acids in the above was solved.
- the barcode nucleic acid added to the cells remains attached to the cell membrane surface for about 1 hour after the addition, and then the cells to which the barcode nucleic acid is added are observed over time (1 hour, 2 hours, 3 hours, 6 hours). Later). As a result, as shown in FIG. 6, a part of the cells was taken up into the cells, but the cells still retained the barcode nucleic acid. It was also confirmed that the death of the cells to which the barcode nucleic acid was added could be prevented by culturing the cells in RPMl-1640 medium supplemented with 10% FBS and 50uM 2-mercaptoethanol.
- Example 3 Experiment of fixation, protein labeling, and staining of cells in response to the test substance
- DTSP Dithiobis sulphosuccinimidyltropionated disodium salt
- the primary antibody was diluted 100-fold and the reaction solution was treated with PBS containing 1% BSA 4 degrees for 16-20 hours. Next, it reacted with a secondary antibody with a fluorescent dye (Alexa Fluor 488). The secondary antibody was diluted 200-fold and the reaction solution was treated with PBS containing 1% BSA at room temperature for 1 hour.
- Example 4 Using an experimental image cell sorter in which the response to the test substance was selected based on the cell image phenotype by an image cell sorter, for nuclear translocation of the NFkB protein, which is a cell image phenotype observed in response to LPS drug addition. Based on this, cells were selected and collected from the mixed cell solution.
- the image cell sorter used in this experiment is Science, 15 Jun 2018: Vol. 360, Issue 6394, pp. The one described in 1246-1251 was used.
- a machine learning model that discriminates cells to which the NFkB protein, which is a cell image phenotype to be sorted and collected, has translocated to the nucleus.
- a part of the mixed cell solution A for learning in which the cells of tube 1 and the cells of tube 2 (only the cells of tube 1 are stained with Fixable Far Red) at a known ratio was used.
- a supervised machine learning model (SVM: Support Vector Machine) was generated.
- SVM Support Vector Machine
- training teacher data a part of the mixed cell solution A was introduced into the image cell sorter, and the image signal derived from Alexa Fluor 488 labeled with the acquired NFkB protein and the correct answer data based on the Fixable Far Red label were used as teacher data.
- a discriminant model for predicting nuclear translocation of NFkB protein was generated.
- the NFkB protein which is a cell image phenotype of the cells to which the LPS drug was added.
- the cells were sorted using an image cell sorter, and the cells to which the NFkB protein had translocated to the nucleus were collected. The recovery rate was 90% or more of the whole cells.
- Example 5 Experiment to confirm information association between test substance and cell phenotype of cells selected and collected by image cell sorter
- Cells selected and collected by image cell sorter possive purity: 0.995
- control mixed cells with LPS drug and drug
- solutions containing about 4800 cells were dispensed and 1-cell analysis was performed.
- a Chromium controller device manufactured by 10xGenomics which is a one-cell analysis technique using droplet technology, and a single cell 3'reagent kit v3 manufactured by 10xGenomics were used.
- FIG. 10 is a schematic diagram of the reagents included in the reagent kit.
- a large number of droplets are produced in a microchannel, and one cell is stochastically mixed with a second barcode nucleic acid-linked bead, which is different for each droplet, at a ratio of 1: 1 in each droplet.
- a plurality of second barcode nucleic acids are linked to the second beads via a linker.
- each of the plurality of second barcode nucleic acids linked to the second beads has a second common barcode region (16 bases) common to each other if the cells contained in the droplets are the same, and each individual droplet. It contains a second unique barcode region (12 bases) that can be distinguished from each other and a second hybrid region that can hybridize with a nucleic acid derived from the cell genome or a first barcode nucleic acid.
- the second hybridizing poly (dT) sequence added to the end of the second unique barcode region and the poly (A) of the first barcode nucleic acid added to the cell surface.
- the ends were combined.
- a reverse transcriptase reaction using reverse transcriptase is performed, and the primer 5'-CTTGGCACCCGAGAATTCC-3'for the first bar code (SEQ ID NO: 5) and a single cell 3'reagent kit v3 manufactured by 10xGenemics are included.
- the complementary strand DNA primer was used to generate the complementary strand DNA of the first barcode nucleic acid to which the second barcode nucleic acid sequence was added.
- the droplets were destroyed in a state where each of the generated droplets was mixed, and the complementary strand DNA group of the second unique bar code extracted from each droplet was amplified by PCR reaction, and Invitrogen's Liquid
- the image-sorted recovery cell solution was 23.4 ng / ul
- the control cell solution was 30.4 ng / ul.
- a next-generation sequence library of the first barcode nucleic acid to which a different second barcode nucleic acid sequence was added to each cell was prepared by PCR reaction.
- the primers used were Read1 side (Universal I5 primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATAGTACACTCTTTCCCTACACCGACGCTTCTCCGATTC-3' (SEQ ID NO: 6) and Read2 side (TruSeq RPI primer) image-sorted recovery cell solution. 7)
- the control cell solution is 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAATTACAAGGTGACTGGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'(SEQ ID NO: 8).
- the DNA size and concentration were measured using a D5000 screen tape manufactured by Agilent, and the quality of the library was confirmed.
- Illumina's MiSeq reagent kit v3 was used to generate P5 and P7 sequence libraries, and Illumina's MiSeq next-generation sequencer was used.
- the obtained sequence data was read out as a text-based FASTQ file on the Read1 side and the Read2 side, respectively, and analyzed using Python3, DropseqTools, and UMITools.
- the total number of reads of the second common barcode region sequence (16 bases) and the second unique barcode region (12 bases) was 19,912,682.
- the number of first barcode nucleic acid sequences that could correspond to the second common barcode region sequence (16 bases) and the second unique barcode region (12 bases) was 16,354,670.
- the number of reads of the first barcode nucleic acid A corresponding to the drug LPS is 85.1% of the total number of the first barcode nucleic acid reads
- the number of reads of the first barcode nucleic acid B corresponding to the drug LPS is 0.8. %Met.
- the total number of reads in the second common barcode region (16 bases) and the second unique barcode region (12 bases) is 10,795. It was 154, and the number of first barcode nucleic acid sequences that could correspond to the second common barcode region (16 bases) and the second unique barcode (12 bases) was 7,587,061. Among them, the number of reads of the first barcode nucleic acid A corresponding to the drug LPS was 51.3% of the total number of the first barcode nucleic acid reads, and the number of reads of the first barcode nucleic acid B corresponding to the drug LPS was 35.6. %Met.
- cells with a nucleic acid barcode attached to the test substance are selected based on the observed cell image phenotype according to the test substance, and the attached nucleic acid barcode sequence is read. This confirmed that cell phenotypic screening of the test substance could be performed.
- Example 6 Experiment to confirm the association between the test substance and cell phenotype information of the mixed cell and the gene expression information
- the cell mixed sample selected and collected by the image cell sorter prepared under the above-mentioned fixation / labeling / staining fixation conditions is imitated.
- a solution containing about 4800 cells was dispensed from the mixed sample (cell ratio of cells with LPS drug to cell without drug: 9: 1) (positive purity: 0.9), and 1-cell analysis was performed.
- a Chromium controller device manufactured by 10xGenomics and a single cell manufactured by 10xGenomics which are one-cell analysis techniques using the droplet technology as in Example 5.
- Cell 3'reagent kit v3 was used.
- the second hybridizing poly (dT) sequence added to the end of the second unique barcode region and the poly (A) end of the first barcode nucleic acid added to the cell surface were bound. .. Further, a reverse transcription reaction using reverse transcriptase or the like is performed, and the primer 5'CTTGGCACCCCGAGAATTCC-3'(SEQ ID NO: 5) for the first bar code nucleic acid and the single cell 3'reagent kit v3 manufactured by 10xGenomics are included.
- the complementary strand DNA primer was used to generate the complementary strand DNA of the first barcode nucleic acid to which the second barcode nucleic acid sequence was added.
- the second hybrid poly (dT) sequence added to the end of the second unique barcode region and the cells for the endogenous cDNA for each cell.
- the poly (A) end of the derived mRNA was attached.
- a reverse transcription reaction using reverse transcriptase and the like was carried out to generate cell-derived complementary strand DNA using the complementary strand DNA primer included in the single cell 3'reagent kit v3 manufactured by 10xGenomics.
- the droplets were destroyed in a state where each of the generated droplets was mixed, and the complementary strand DNA and cells of the first barcode nucleic acid to which the second barcode nucleic acid sequence extracted from each droplet was added.
- Each of the derived complementary strand DNA groups was amplified by PCR reaction, and the DNA concentration was measured with the Qubit Fluorometer of Invitrogen.
- the barcode complementary strand DNA of the recovered cells after image sorting was 57.8 ng / ul, and the cell-derived complementary strand was The DNA was 0.676 ng / ul.
- Barcode complementary strand DNA and cell-derived complementary strand DNA were collected from each of the negative control cells without LPS drug stimulation by the same method, and the DNA concentration was measured with Invitrogen's Qubit Fluorometer. The barcode complementary strand DNA was measured. Was 45.6 ng / ul, and the complementary strand DNA derived from the cell was 0.658 ng / ul.
- a next-generation sequence library of the first barcode nucleic acid to which a different second barcode nucleic acid sequence was added to each cell and the complementary strand DNA derived from the cell was prepared by PCR reaction.
- the primers used were Read1 side (Universal I5 primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATAGTACACTCTTTCCCTACACCGACGCTTTCCGATCGATCT-3'(SEQ ID NO: 6) and Lead2 side (TruSeq RPI primer) Negative control cells 5'-CAGACTA.
- Read2 side image-sorted recovered cells are 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAATTACAGGTGACTGGGAGTTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3'(SEQ ID NO: 8).
- the DNA size and concentration were measured using a D5000 screen tape manufactured by Azilent Co., Ltd. and a qPCR reaction, and the quality of the library was confirmed.
- Illumina's MiSeq reagent kit v3 was used to generate P5 and P7 sequence libraries, and Illumina's MiSeq next-generation sequencer was used.
- the obtained sequence data was read out as a text-based FASTQ file on the Read1 side and the Read2 side, respectively, and analyzed using Python3, DropseqTools, and UMITools.
- the total number of reads of the second common barcode region sequence (16 bases) and the second unique barcode region (12 bases) of the mixed sample cells was increased. It was 251,958.
- the number of first barcode nucleic acid sequences associated with each other by being read together with the second common barcode region sequence (16 bases) and the second unique barcode region (12 bases) was 249,793.
- the number of reads of the first barcode nucleic acid A corresponding to the drug LPS is 86.8% of the total number of the first barcode nucleic acid reads
- the number of reads of the first barcode nucleic acid B corresponding to the drug LPS is 3.1. %Met.
- the second number of reads among the number of reads of the second common barcode region sequence read corresponding to the first barcode nucleic acid sequence A or the first barcode nucleic acid sequence B is large.
- a high-ranking list in which the common barcode region sequences are arranged in order is shown together with the number of reads of the first barcode nucleic acid sequence A or the first barcode nucleic acid sequence B that are simultaneously read (Tables 1-1 in FIG. 12A and Tables in FIG. 12A). 1-2).
- the second unique barcode region sequences 594 of the complementary strand DNA the same second unique barcode region sequence was found in the first barcode sequence library in 550, and the second unique barcode region was found.
- the first barcode nucleic acid sequence of most (92.6%) of the first nucleic acid barcode sequence library in which the sequence was found was assigned to the first barcode nucleic acid A (Fig. 13, Graph 1).
- the total number of reads of the second common barcode region sequence (16 bases) and the second unique barcode region (12 bases) of the negative control cells without LPS drug was 185,858. Furthermore, the number of first barcode nucleic acid sequences that could correspond to the second common barcode region sequence (16 bases) and the second unique barcode region (12 bases) was 184,181. Among them, the number of reads of the first barcode nucleic acid A corresponding to the drug LPS was 0% of the total number of the first barcode nucleic acid reads, and the number of reads of the first barcode nucleic acid B corresponding to the drug LPS was 83.3%. there were.
- the second unique barcode region is arranged in descending order of the total number of reads of the second common barcode region sequence that matches each of the first barcode nucleic acid sequence A and the first barcode nucleic acid sequence B.
- a list of the top ranks is shown (Table 2-1 in FIG. 14A, Table 2-2 in FIG. 14B).
- the same second unique barcode region sequence was found in the first barcode sequence library in 172, which is almost all (> 99%).
- First barcode nucleic acid sequence was assigned to the first barcode nucleic acid B (FIG. 15, graph 2).
- Example 7 Cell phenotypic screening method in a compartment (droplet) A test substance by including and contacting a cell, a test substance, and a first bar code nucleic acid corresponding to the test substance in the compartment (droplet).
- the cell phenotypic screening of the above can be carried out by, for example, the following method. 7-1
- the first subcompartment containing the test substance and the first barcode nucleic acid corresponding to the test substance is described in Anal. Chem. , 2018, 90, 16, 9813-9820, and can be generated by the following procedure.
- the test substance is dissolved in the aqueous phase using Opti-MEM medium containing no FBS.
- aqueous phase in the well or tube hydrogel particles prepared in advance using a microfluidic device (for example, gel beads with a diameter of about 70 ⁇ m and a concentration of 1.1 wt% agarose), and the test substance are supported.
- the first bar code nucleic acid, the anchor CMO, and the co-anchor CMO are mixed.
- an organic solvent and a surfactant for example, Triton-100
- Triton-100 Droplets containing the above can be obtained.
- 16 is a photomicrograph of the test substance and the first subcompartment prepared without adding the first bar code nucleic acid, but may contain the test substance and the first bar code nucleic acid corresponding to the test substance. Similarly, droplets having a size of approximately 70 ⁇ m in diameter are prepared. This process associates the test substance with the first barcode nucleic acid within the first subcompartment.
- the organic solvent for example, Droplet Generator oil for EvaGreen (manufactured by BioRad) is used. Droplet Generator oil for EvaGreen has oxygen permeability and is suitable for in-droplet culture of cells. In fact, as a result of culturing the cells (THP1 cells) for 24 hours in the droplets generated in the Opti-MEM medium containing no organic solvent and FBS, the survival rate was 88%.
- cells suspended in Opti-MEM medium containing no FBS are prepared.
- the cell suspension is poured into a microfluidic device with an organic solvent to create a second subcompartment containing cells while passing through the microfluidic device.
- the flow rate of each of the cell suspension and the organic solvent is controlled, and the size of the second subcompartment containing the cells is adjusted to about 100 ⁇ m.
- the first sub-compartment and the second sub-compartment are merged by applying a voltage of 350V-500V to generate droplets (compartments) containing the test substance, cells, and first barcode nucleic acid at the same time. Generate.
- the test substance and the droplet group (first subcompartment) containing the first barcode nucleic acid corresponding to the test substance are organically solvent from one channel and the cell suspension is from the other channel.
- a droplet (compartment) containing the test substance, cells, and first barcode nucleic acid at the same time is finally generated.
- droplets for example, E.I. Z. Macosko et al. , Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell.
- a flow focusing device can be used according to the description of 161, 1202-1214 (2015).
- one channel is a group of droplets (first subcompartment) containing the test substance and the first bar code nucleic acid corresponding to the test substance according to the method described in 2018, 90, 2, 1273-1279.
- a droplet group of droplets containing the first barcode nucleic acid (first subcompartment, size of about 70 ⁇ m in diameter) and a second subcompartment containing cells (size of about 100 ⁇ m in diameter) are sequentially combined into one droplet pair.
- first subcompartment size of about 70 ⁇ m in diameter
- second subcompartment containing cells size of about 100 ⁇ m in diameter
- the test substance is allowed to act on the cells, and the first bar code nucleic acid corresponding to the test substance is attached to the cell surface to make the cells the first bar. It can be labeled with a coding nucleic acid.
- the cells can then be recovered from the compartment (droplets) by the following process.
- 100 ⁇ L of droplets are taken out using a microchip or the like, and 500 ⁇ L of a fluorine-based solvent (for example, hydrofluoroether (HFE)), Novec (for example, Hydrofluoroether (HFE)) is used as a lower layer.
- a fluorine-based solvent for example, hydrofluoroether (HFE)
- Novec for example, Hydrofluoroether (HFE)
- TM 7200 high performance liquid (3M Ltd. JAPAN)) is varied transferred entered microtube.
- the microtube was vigorously shaken for 10 seconds and then allowed to stand to disrupt the droplets and label with the first barcode nucleic acid.
- the cells can be separated into two layers, an aqueous phase containing the resulting cells and an organic solvent phase, and the cells labeled with the first barcode nucleic acid can be recovered from the aqueous phase to prepare a cell mixture solution.
- the droplet can be crushed using an antistatic gun (for example, Zerostat 3).
- 100 ⁇ L of droplets (compartment containing cells on which the test substance is allowed to act and labeled with the first barcode nucleic acid A) are taken out using a microchip or the like, and 100 ⁇ L of a fluorine-based solvent (for example, hydrofluoroether (HFE), Novec) is placed in the lower layer. It was transferred to a microtube containing 7200 high-performance liquid (manufactured by 3M JAPAN). Droplets can be crushed by pulling back the trigger of the static eliminator gun about 10 times with respect to this microtube.
- HFE hydrofluoroether
- cells labeled with the first barcode nucleic acid A are collected to prepare a cell mixture solution.
- a method of crushing droplets using an antistatic gun see, for example, Biomicrofluorics. 22 (4): It can be carried out according to the method described in 044107, 2017.
- cells are selected and recovered from the cell mixture solution based on the cell image phenotype observed in response to the addition of the test substance (for example, nuclear translocation of protein in response to stimulation or drug treatment).
- the method of selecting cells having a change in cell image phenotype in response to a test substance by an image cell sorter can be carried out by, for example, the same method as in Example 4.
- Example 6 the cell mixture solution selected and collected by the image cell sorter is subjected to 1-cell analysis, and the test substance of the cells selected and collected by the image cell sorter is associated with the cell phenotype information.
- a Chromium controller device manufactured by 10xGenomics and a single cell manufactured by 10xGenomics which are one-cell analysis techniques using the droplet technology as in Example 5.
- Cell 3'reagent kit v3 can be used. Further, the gene expression information of the collected cells can also be obtained by using the same reagent kit.
- Example 8 Cell phenotypic screening method using a 96-well microplate According to the schematic diagram shown in FIG. 18, a test subject causing a desired phenotypic change (in the example of FIG. 18, LPS-induced NF- ⁇ B). A test substance that inhibits nuclear translocation) was searched for. Specifically, in each well of the 96-well microplate, the first barcode nucleic acid was attached to cells (THP1 cells) and further contacted with a test substance according to the method described in Reference Example 1. At that time, different types and concentrations of the test substance and the first barcode nucleic acid in each well were used. As a result, 96 types of test subjects (24 types of test substances ⁇ 4 types of concentrations) were associated with 96 types of first barcode nucleic acids attached to cells (THP1 cells).
- the 96 types of test subjects 24 types of test substances x 4 types of concentrations
- the functions of the test substances known mechanism of action
- the sequence of the first barcode nucleic acid (Barcorde #) used in this experiment was as shown in FIGS. 20A to 20C.
- the sequence of the first barcode nucleic acid used is different for each test subject, and the first barcode nucleic acid is associated with the test subject.
- test was carried out in each well of the 96-well microplate by contacting each test substance, the first barcode nucleic acid corresponding to the test substance, and cells.
- cells were selected and recovered from the cell mixture solution based on the cell image phenotype observed in response to the addition of the test substance (presence or absence of nuclear translocation of NF- ⁇ B protein in response to LPS stimulation). ..
- one cell analysis was performed on the cell mixture solution selected and collected by the image cell sorter.
- a Chromium controller manufactured by 10xGenomics which is a one-cell analysis technique using the droplet technology as in Examples 5 and 6.
- the device and a single cell 3'reagent kit v3 from 10xGenemics were used.
- the enrichment level of the first barcode nucleic acid sequence of the sorted cells was as shown in FIG.
- the numerical value on the vertical axis exceeds 1, it means that the sample is more concentrated than the sample before sorting.
- FIG. 22 shows whether or not the cells sorted and collected by the image cell sorter certainly show a phenotype.
- the image of the cell was taken by image flow cytometry, and the nuclear translocation score is also calculated by image flow cytometry.
- the nuclear transfer score the larger the value, the higher the degree of nuclear transfer.
- A is a cell corresponding to a positive control (LPS (-): NF- ⁇ B has not translocated to the nucleus)
- B is a cell treated with LPS as a test substance and a known NF- ⁇ B nuclear translocation inhibitor (TAK242: 30 ⁇ M)
- C is a cell treated with LPS and the test substance Costunlide, which was selected as a candidate by cell phenotype screening
- D is a cell corresponding to negative control (LPS (+): NF- ⁇ B is nuclear translocated).
- the cells corresponding to the positive control (LPS (-): NF- ⁇ B has not translocated to the nucleus) are 1.58, LPS as the test substance and the known NF- ⁇ B nuclear translocation inhibitor (TAK242: 30 ⁇ M). ) was 0.92, cells treated with LPS and the test substance Costunlide, which was selected as a candidate by cell phenotype screening, were 0.23, and D was negative control (LPS (+): NF- ⁇ B). The number of cells corresponding to (nuclear translocation) was 0.30.
- cells to which a nucleic acid barcode corresponding to a test subject is attached are selected based on the cell image phenotype observed according to the test subject using an image cell sorter, and the attached barcode is used.
- image cell sorter By reading the nucleic acid sequence and further reading the genes of each cell, cell phenotypic screening of the test subject can be performed.
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Abstract
本開示は、被験対象と関連付けされている第一バーコード核酸で標識しかつ前記被験対象で処理した複数の細胞を準備する工程、イメージングセルソーターを用いて、前記複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する工程、第一バーコード核酸を指標として各細胞の処理に用いられた被験対象を同定する工程を含む、細胞をスクリーニングする方法を提供する。
Description
本特許出願は、2020年1月10日に出願された米国特許出願番号62/959,420号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
本開示は、新規細胞表現型スクリーニングに関する。
細胞を用いた多種薬剤スクリーニングとして細胞表現型(フェノタイプスクリーニング)が知られている。フェノタイプスクリーニングとは、細胞や臓器の表現型(フェノタイプ)、例えば、細胞増殖率や細胞死、特定のタンパク質の局在や細胞の構造で表される細胞イメージ情報を指標にして、それを変化させる薬剤(例えば、低分子化合物、ペプチド等)を探索する手法である。細胞フェノタイプスクリーニングの重要な目的の一つは、インプット(被験物質、薬剤刺激など)に対して、(i)どのような細胞表現型の変化(イメージ応答)を示すのか、(ii)遺伝子発現応答を示すのか、(iii)どのような作用機序に基づいていたのか、という情報を調べることにある。
しかしながら、従来のウェルを用いた大スケールの一般的なフェノタイプスクリーニングアッセー系においては、それぞれのウェルで培養した細胞に対してそれぞれの薬剤を与え、イメージ応答を調べた上で、目的表現型と思しき応答を生じた対象を取り出し、その個体に対して遺伝子解析を行い遺伝子発現応答や作用機序を見出す(例えば、非特許文献1等)必要があった。したがって、低速・高コストであるのに加えて、個別細胞に対して遺伝子発現応答や作用機序のような多角解析を迅速に行うことは困難であった。
Nature Methods, volume16, pages 619-626 (2019)
本開示は、薬剤等の被験対象と共存した細胞のイメージ応答や遺伝子発現応答を迅速に検出する方法を提供する。
本開示の一実施態様によれば、被験対象と関連付けされている第一バーコード核酸で標識しかつ上記被験対象で処理した複数の細胞を準備する工程、
イメージングセルソーターを用いて、上記複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する工程、
第一バーコード核酸を指標として各細胞の処理に用いられた被験対象を同定する工程を含む、被験対象をスクリーニングする方法が提供される。
イメージングセルソーターを用いて、上記複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する工程、
第一バーコード核酸を指標として各細胞の処理に用いられた被験対象を同定する工程を含む、被験対象をスクリーニングする方法が提供される。
本開示によれば、被験対象と共存した細胞のイメージ応答や遺伝子発現応答を迅速に検出することができる。本開示によれば、細胞に対して行った試験対象による処理などの各インプット情報と、イメージ応答と遺伝子発現応答を、プールした状態で結び付けて、フェノティピックスクリーニングを高速に行う上で有利に利用することができる。本開示は、目的とする細胞の表現型変化を生じる被験対象を選択ないし探索するうえで有利に利用することができる。
本開示の一実施態様によれば、細胞をスクリーニングする方法は、被験対象と関連付けされている第一バーコード核酸で標識しかつ前記被験対象で処理した複数の細胞を準備する工程、
イメージングセルソーターを用いて、前記複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する工程、
第一バーコード核酸を指標として各細胞の処理に用いられた被験対象を同定する工程を含む。
イメージングセルソーターを用いて、前記複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する工程、
第一バーコード核酸を指標として各細胞の処理に用いられた被験対象を同定する工程を含む。
定義
本明細書において「ゲノム関連情報」とは、細胞ゲノムまたはその由来物に関連する情報で、遺伝子発現の変化に伴う核酸、たんぱく質の変化に関する情報をいう。またここで、「ゲノム関連核酸」とはゲノム関連情報と関連する核酸であり、細胞のゲノムDNA、細胞ゲノムに由来するmRNA等のRNAもしくはそのcDNAが好適な例である。また「ゲノム関連核酸」別の一例として、細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的に相互作用(例えば、結合)する核酸プローブが含まれる。また、核酸がゲノムDNAである場合には、当該DNAは制限酵素等で切断された断片でもよいし、当該DNA断片にDNAタグが導入されていてもよい。
本明細書において「ゲノム関連情報」とは、細胞ゲノムまたはその由来物に関連する情報で、遺伝子発現の変化に伴う核酸、たんぱく質の変化に関する情報をいう。またここで、「ゲノム関連核酸」とはゲノム関連情報と関連する核酸であり、細胞のゲノムDNA、細胞ゲノムに由来するmRNA等のRNAもしくはそのcDNAが好適な例である。また「ゲノム関連核酸」別の一例として、細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的に相互作用(例えば、結合)する核酸プローブが含まれる。また、核酸がゲノムDNAである場合には、当該DNAは制限酵素等で切断された断片でもよいし、当該DNA断片にDNAタグが導入されていてもよい。
本明細書において「バーコード領域」とは、T(チミン)またはU(ウラシル)、A(アデニン)、G(グアニン)、およびC(シトシン)を含む塩基配列の領域であって、後述の共通バーコード領域または固有バーコード領域の配列であれば限定されない。また、バーコード核酸はバーコード領域を含む核酸であり、細胞のゲノム関連情報、前記細胞と共存した被験対象やビーズ由来のイメージング情報を識別可能とするものである。
バーコード領域には、共通バーコード領域、固有バーコード領域の二種類が含まれる。
バーコード領域には、共通バーコード領域、固有バーコード領域の二種類が含まれる。
バーコード領域の長さは、特に限定されるものでないが、好ましくは8~40塩基長の配列である。例えばバーコード領域が12塩基長である場合は、412種類の多様性のあるバーコード配列を一度に核酸増幅することができる。
「共通バーコード領域」とは、同一の識別の対象において共通するバーコード領域である。識別の対象が被験対象である場合には、例えば、被験対象毎に異なるバーコード領域、すなわち、一つの被験対象において共通するバーコード領域が挙げられる。共通バーコード領域で標識することにより、各被験対象が識別可能とされる。また、1つのコンパートメント中に被験対象の組み合わせが含まれる等、識別の対象が被験対象の組み合わせである場合には、該組み合わせ毎に異なるバーコード領域、すなわち、特定の被験対象の組み合わせにおいて共通するバーコード領域を有するバーコード核酸で標識される。かかる共通バーコード領域で標識することにより、被験対象の組み合わせが識別可能とされる。識別の対象が一細胞のゲノム関連情報である場合には、細胞毎に異なるバーコード領域、すなわち、一つの細胞において共通するバーコード領域が挙げられる。共通バーコード領域で標識することにより、同―細胞由来のゲノム関連情報が識別可能とされる。
また、「固有バーコード領域」とは、バーコード核酸毎に異なるバーコード領域で標識することにより、各バーコード核酸を各々峻別可能とするものである。例えば、固有バーコード領域に標識されることにより、各バーコード核酸に連結したビーズ、各バーコード核酸を含む生物、各バーコード核酸とハイブリダイズしたゲノム関連核酸が識別可能とされる。
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、バーコード核酸のハイブリダイズ領域が、細胞ゲノムもしくはその由来物に対応するゲノム関連核酸または別のバーコード核酸と二本鎖の複合体を形成することを意味する。ここで、かかる二本鎖の複合体を形成する例示的条件としては、37℃、40~45%ホルムアミド、1.0M NaCl、0.1% SDSでのハイブリダイゼーションおよび55℃~60℃の0.5X~1XSSCでの洗浄が挙げられる。上記二本鎖の複合体を形成する際の別の態様として、複合体の形成がストリンジェントな条件下で行われることが挙げられる。ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的な複合体が形成され、非特異的な複合体が形成されない条件をいい、上記例示的条件を含む。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning(ThirdEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)やCurrent protocols in molecular biology(edited by Frederick M. Ausubel et al.,1987)を参照して設定することができる。バーコード核酸のハイブリダイズ領域がハイブリダイズする配列としては、かかるハイブリダイズ領域に相補的な配列が挙げられる。
したがって、「ハイブリダイズ領域」は、細胞ゲノムもしくはその由来物に対応するゲノム関連核酸または別のバーコード核酸に結合する(ハイブリダイズする)領域が好ましい。かかるハイブリダイズ領域は、バーコード核酸においてバーコード領域と共に存在することが好ましい。
本開示のスクリーニング方法の一実施態様を、以下、図1に従い説明する。
本開示の方法では、被験対象で処理しかつ第一バーコード核酸で標識した細胞を準備する。かかる準備工程は、例えば、以下の工程(図1の工程1-1~工程1-3)を含んでいてもよい。
本開示の方法では、被験対象で処理しかつ第一バーコード核酸で標識した細胞を準備する。かかる準備工程は、例えば、以下の工程(図1の工程1-1~工程1-3)を含んでいてもよい。
工程1:被験対象と関連付けされている第一バーコード核酸で標識しかつ被験対象で処理した複数の細胞を準備する工程
工程1-1:サブコンパートメント(液滴)の作成
(被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸とを含む液滴の形成する工程)
本開示の一実施態様によれば、図1の工程1-1の上段に示される通り、被験対象および第一バーコード核酸を含む液媒体と、有機溶剤とを混合して、被験対象とその被験対象に対応する第一バーコード核酸を含むサブコンパートメント(液滴)を形成する。具体的には、例えば、被験対象および第一バーコード核酸を含む液媒体にハイドロゲルビーズを添加して、被験対象および第一バーコード核酸を含む第一サブコンパートメントを生成することができる。より具体的な手法においては、各容器(例えば各ウェル)内で、予め用意したハイドロゲル粒子と、被験対象と、被験対象に対応する第一バーコード核酸とを混合し、有機溶媒と界面活性剤を追加してボルテックスをかけることにより、被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸を含む均一系液滴を大量生成することができる。また、同様の手法により、上記工程は、Anal. Chem., 2018, 90, 16, 9813-9820に記載の方法に準じて実施することができる。本工程でテンプレートとして添加されているハイドロゲル粒子としては、例えば、アクリルアミド、アガロース、コラーゲン、アルギン酸、ポリエチレングリコール等を素材とするビーズを用いることができる。
工程1-1:サブコンパートメント(液滴)の作成
(被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸とを含む液滴の形成する工程)
本開示の一実施態様によれば、図1の工程1-1の上段に示される通り、被験対象および第一バーコード核酸を含む液媒体と、有機溶剤とを混合して、被験対象とその被験対象に対応する第一バーコード核酸を含むサブコンパートメント(液滴)を形成する。具体的には、例えば、被験対象および第一バーコード核酸を含む液媒体にハイドロゲルビーズを添加して、被験対象および第一バーコード核酸を含む第一サブコンパートメントを生成することができる。より具体的な手法においては、各容器(例えば各ウェル)内で、予め用意したハイドロゲル粒子と、被験対象と、被験対象に対応する第一バーコード核酸とを混合し、有機溶媒と界面活性剤を追加してボルテックスをかけることにより、被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸を含む均一系液滴を大量生成することができる。また、同様の手法により、上記工程は、Anal. Chem., 2018, 90, 16, 9813-9820に記載の方法に準じて実施することができる。本工程でテンプレートとして添加されているハイドロゲル粒子としては、例えば、アクリルアミド、アガロース、コラーゲン、アルギン酸、ポリエチレングリコール等を素材とするビーズを用いることができる。
本開示の被験対象は、所望の細胞での応答を検討する被験対象であれば特に限定されないが、例えば、低分子有機化合物、ペプチド化合物、核酸およびその誘導体を基本骨格とする核酸化合物、酵素、抗体、抗体フラグメントなどのポリペプチドやたんぱく質、細胞、ウイルス、薬剤などの被験物質が挙げられる。
対象となる細胞の種類は、本開示の効果を妨げない限り特に限定されず、目的に応じて細胞を選択することができ、例えば、患者の血球由来の細胞やiPS細胞(induced pluripotent stem cell)などの幹細胞から目的細胞に分化誘導された細胞などのヒト由来の細胞、CHO(Chinese Hamster Ovary)細胞などの哺乳動物由来の細胞が使用できる。
工程1-2:サブコンパートメントの融合によるコンパートメントの作成
(被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸とを含むサブコンパートメント(液滴)と、細胞を含むサブコンパートメント(液滴)とを融合する工程)
また、本開示の一実施態様によれば、工程1-2に示されるように、被験対象および第一バーコード核酸を含む液滴と、細胞を含む液滴を混合して、前記被験対象と前記第一バーコード核酸と細胞とを関連付けする工程を実施する。具体的には、被験対象および第一バーコード核酸を含む第一サブコンパートメントと、細胞を含む第二サブコンパートメントとを融合し、被験対象、第一バーコード核酸および細胞を含むコンパートメントを生成することにより、被験対象、第一バーコード核酸および細胞の関連付けを実施してもよい。より具体的な手法においては、マイクロ流体デバイスにおいて、被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸を含む液滴群を片方のチャネルから、細胞を含む液滴群を他方のチャネルから流し込み、逐次、1液滴対1液滴の融合をマイクロ流体デバイス中で実施することにより、細胞と被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸を含む液滴を有機溶媒相中に大量に生成することができる。この際、後述の例のように、マイクロ流体デバイス中で細胞を含む液滴を形成させ、その液滴を被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸を含む液滴と融合させて細胞と被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸を含む液滴を生成することもできる。上記有機溶媒相中の液滴の中では、細胞に対して被験対象を作用させる一方で、細胞表面に被験対象に対応するバーコード核酸を付着させることにより、細胞を第一バーコード核酸で標識することができる。上記工程は、Anal. Chem. 2018, 90, 2, 1273-1279に記載の方法に準じて実施することができる。
(被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸とを含むサブコンパートメント(液滴)と、細胞を含むサブコンパートメント(液滴)とを融合する工程)
また、本開示の一実施態様によれば、工程1-2に示されるように、被験対象および第一バーコード核酸を含む液滴と、細胞を含む液滴を混合して、前記被験対象と前記第一バーコード核酸と細胞とを関連付けする工程を実施する。具体的には、被験対象および第一バーコード核酸を含む第一サブコンパートメントと、細胞を含む第二サブコンパートメントとを融合し、被験対象、第一バーコード核酸および細胞を含むコンパートメントを生成することにより、被験対象、第一バーコード核酸および細胞の関連付けを実施してもよい。より具体的な手法においては、マイクロ流体デバイスにおいて、被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸を含む液滴群を片方のチャネルから、細胞を含む液滴群を他方のチャネルから流し込み、逐次、1液滴対1液滴の融合をマイクロ流体デバイス中で実施することにより、細胞と被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸を含む液滴を有機溶媒相中に大量に生成することができる。この際、後述の例のように、マイクロ流体デバイス中で細胞を含む液滴を形成させ、その液滴を被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸を含む液滴と融合させて細胞と被験対象と被験対象に対応する第一バーコード核酸を含む液滴を生成することもできる。上記有機溶媒相中の液滴の中では、細胞に対して被験対象を作用させる一方で、細胞表面に被験対象に対応するバーコード核酸を付着させることにより、細胞を第一バーコード核酸で標識することができる。上記工程は、Anal. Chem. 2018, 90, 2, 1273-1279に記載の方法に準じて実施することができる。
コンパートメントまたはサブコンパートメントはそれぞれ、コンパートメントまたはサブコンパートメント中の各成分の組み合わせを、他のコンパートメントと区別しうる区画の単位である。
本開示においてコンパートメントに含まれる被験対象の種類、数は、本開示の効果を妨げない限り、特に限定されないが、細胞応答の簡素化または明確化の観点からは、1つのコンパートメント当たり1種類であることが好ましい。しかしながら、例えば、複数種を組み合わせて被験対象に対しての細胞の応答を調べる場合には、1つのコンパートメント当たりの被験対象の種類を複数としてもよい。また、コンパートメント毎に被験対象の濃度もそれぞれ異なるように設定してもよく、それにより被験対象の異なる濃度における細胞応答を評価できる。本開示にはかかる態様も包含される。
本開示のコンパートメントは、他のコンパートメントと区別しうる区画を維持できれば特に限定されず、例えば、前記工程により生成される水性液滴(例えば、油中の水性液滴)が含まれる。さらに別の例として、ハイドロゲルのゲル粒子、エマルション等の複数の非混合界面の重なった水・油の構造体、ミセルまたはリポソーム等の単分子膜または二重分子膜による小胞等が挙げられる。その際、液滴に含まれる水相には、例えば、細胞培養液、生理食塩水、緩衝液等の水溶液を用いる事ができる。また有機溶媒相には、例えば、Droplet Generator oil for EvaGreen (BioRad社製)などの油を用いることができる。
本開示のコンパートメントは、他のコンパートメントとの峻別の観点から、その周縁部に物理的なバリア機能を有していることが好ましい。かかるバリア機能を有するコンパートメントの好適な製造方法としては、相分離法等が挙げられる。相分離法においては、例えば、細胞およびビーズと水性基材を混合して水性液滴を得、該水性液的を疎水性溶媒中に懸濁させることにより、コンパートメントを生成することができる。また、マイクロ流体デバイス中の分岐部あるいは合流部において液滴同士を混合することによりコンパートメントを生成することもできる。
また本開示のコンパートメントは、マイクロウェル、ウェル、チューブ等の容器に包含させることにより形成することもできる。この場合、被験対象および被験対象に対応する第一バーコードと細胞の関連付け、即ち接触は、ウェル等の中にそれらを共存させることで行われる。
また、本開示の一実施態様によれば、被験対象、第一バーコード核酸および細胞を含むコンパートメント中において、第一バーコード核酸により細胞を標識することができる。
第一バーコード核酸は、細胞表面に第一バーコード核酸を連結しうるアンカー(例えば、オリゴヌクレオチド領域と脂質領域(コレステロール、キトサン-グリコール-脂質等)とを備えた公知のアンカー等)含む構成であることが望ましい。特に好ましい例としては、後述する実施例にて使用されるアンカーDNA等が挙げられる。また第一バーコード核酸は、粒子等に包含あるいは結合された形態で使用されてもよい。その場合、第一バーコード核酸が、適宜包含された粒子等から遊離するように設計される。
第一バーコード核酸の構成の詳細については、後述する。
第一バーコード核酸は、細胞表面に第一バーコード核酸を連結しうるアンカー(例えば、オリゴヌクレオチド領域と脂質領域(コレステロール、キトサン-グリコール-脂質等)とを備えた公知のアンカー等)含む構成であることが望ましい。特に好ましい例としては、後述する実施例にて使用されるアンカーDNA等が挙げられる。また第一バーコード核酸は、粒子等に包含あるいは結合された形態で使用されてもよい。その場合、第一バーコード核酸が、適宜包含された粒子等から遊離するように設計される。
第一バーコード核酸の構成の詳細については、後述する。
また、本開示の一実施態様によれば、コンパートメント中において、被験対象による細胞の処理を実施することができる。
必要に応じ、コンパートメント内において細胞と被験対象の共存した状態で培養してもよい。かかる培養とは、例えば、コンパートメントを所望の培養時間、培養温度で保持することが挙げられる。コンパートメントの保持において、複数のコンパートメントを保持できるリザーバに、コンパートメントを移動し保持してもよい。上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、J.J. Agresti et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.,107(9), 4004-9(2010)、A.Abbaspourrad et al.,Sci Rep.,5,12756(2015)、B.L. Wang et al.,Nat Biotechnol.,32(5),473-8(2014)に記載の方法により行うことができる。
ここで、培養時間、培養温度としては、被験対象に対しての細胞の応答評価が可能な程度の培養時間、培養温度を設定することができる。かかる培養時間は、例えば、0時間以上14日以下が挙げられ、好ましくは2時間以上5日以下である。培養温度は、例えば、4℃以上40℃以下が挙げられ、好ましくは37℃付近の温度である。
なお本開示の被験対象の探索の一実施態様には、上記の細胞に表現型変化を引き起こす被験対象の探索に加え、細胞に目的とする表現型変化を生じる標的部位の探索が含まれる。上記標的部位の探索には、例えば、目的とする表現型変化を生じる遺伝子上の標的位置(ターゲット)の探索が含まれる。予め細胞に施す処置を特定する情報(例えば、遺伝子編集が生じる位置を特定する情報や遺伝子編集に用いるガイドRNAなどの核酸配列の情報など)を特定する第一バーコード核酸により細胞を標識することで、イメージングセルソーターで判別取得される細胞に、その細胞が施された処理を特定する情報を付加できるため、目的とする表現型変化を生じる遺伝子上の標的位置(ターゲット)の探索をイメージングセルソーターを用いて効率的に行なうことができる。
工程1-3:コンパートメントの破壊
(第一バーコード核酸を標識した細胞を回収する工程)
本開示の一実施態様は、図1の工程1-3に示されるように、上記コンパートメントから細胞を回収する工程を含む。具体的な手法においては、有機溶媒相中の液滴(被験対象を作用させかつ第一バーコード核酸で標識した細胞を含む)から第一バーコード核酸で標識した細胞を回収することができる。上記回収工程においては、例えば有機溶媒相中に有機溶媒を追加して相分離を起こしたり、有機相溶媒相に電場をかけることにより実施することができる。
(第一バーコード核酸を標識した細胞を回収する工程)
本開示の一実施態様は、図1の工程1-3に示されるように、上記コンパートメントから細胞を回収する工程を含む。具体的な手法においては、有機溶媒相中の液滴(被験対象を作用させかつ第一バーコード核酸で標識した細胞を含む)から第一バーコード核酸で標識した細胞を回収することができる。上記回収工程においては、例えば有機溶媒相中に有機溶媒を追加して相分離を起こしたり、有機相溶媒相に電場をかけることにより実施することができる。
回収された細胞は、被験対象と関連付けされた第一バーコード核酸に標識されていることから、異なった被験対象により処理を行われた細胞を複数個混合しても、後述する核酸情報の読み取り工程において被験対象に関する情報を同定することができる。したがって、本工程により回収した第一バーコード核酸で標識された複数の細胞を混合し、さらに所定の表現型を発生させている細胞を後述するイメージベースセルソーティングにより分離することで、目的とする細胞の表現型変化を生じさせる細胞について、その特定の細胞におけるゲノム関連情報と処理をした被験対象の情報を同時に取得することができる。
工程2:細胞の選別
(イメージベースセルソーティング)
本開示の一実施態様によれば、図1の工程2に示されるように、イメージングセルソーターを用いて、複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する工程を実施する。本開示の好ましい実施態様によれば、細胞表現型に基づいて、被験対象により所定の反応が起こっている細胞を選別することができる。イメージンセルソーターのより具体的な態様は後述するが、イメージングセルソーターとしては、例えば、WO2017/073737号公報、WO2018/181458号公報に記載の装置が挙げられる。前記公報記載のイメージングセルソーターでは、観測対象の細胞からの光・電磁波等の信号に基づいて画像化を行わずに分析し、光源系または検出系を機械学習により最適化するほか,観測対象の分析や判別する手法についても機械学習を用いて最適化することで,迅速かつ精度よく選別を実施することができる。
(イメージベースセルソーティング)
本開示の一実施態様によれば、図1の工程2に示されるように、イメージングセルソーターを用いて、複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する工程を実施する。本開示の好ましい実施態様によれば、細胞表現型に基づいて、被験対象により所定の反応が起こっている細胞を選別することができる。イメージンセルソーターのより具体的な態様は後述するが、イメージングセルソーターとしては、例えば、WO2017/073737号公報、WO2018/181458号公報に記載の装置が挙げられる。前記公報記載のイメージングセルソーターでは、観測対象の細胞からの光・電磁波等の信号に基づいて画像化を行わずに分析し、光源系または検出系を機械学習により最適化するほか,観測対象の分析や判別する手法についても機械学習を用いて最適化することで,迅速かつ精度よく選別を実施することができる。
工程3:目的とする細胞変化を生じる被験対象の同定
(核酸情報の読み取り)
本開示の一実施態様によれば、図1の工程3に示されるように、第一バーコード核酸を指標として各細胞の処理に用いられた被験対象を同定する工程を実施する。本工程においては、第一バーコード核酸の核酸情報を読み取り、細胞の表現型の変化と被験対象とを関連付けすることができることから、目的とする細胞の表現型変化を生じる被験対象を同定することが可能となる。
(核酸情報の読み取り)
本開示の一実施態様によれば、図1の工程3に示されるように、第一バーコード核酸を指標として各細胞の処理に用いられた被験対象を同定する工程を実施する。本工程においては、第一バーコード核酸の核酸情報を読み取り、細胞の表現型の変化と被験対象とを関連付けすることができることから、目的とする細胞の表現型変化を生じる被験対象を同定することが可能となる。
さらに、本開示においては、イメージングセルソーターを用いて表現型毎に選別された各細胞のゲノム関連情報を解析することが好ましい。各細胞のゲノム関連情報を解析することにより、細胞の表現型の変化、細胞のゲノム関連情報、および被験対象との関係を関連付けることができることから、被験対象により目的とする表現型変化を生じた細胞において遺伝子レベルで起こっている現象に関する情報を合わせて得ることができることから、より詳細に現象に関する情報を得ることが可能となる。
以下、一例として、本開示の好ましい核酸情報を解析する工程について説明する。ここでの核酸情報には、被験対象と関連付けられる第一バーコード核酸の情報と細胞由来のゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸の核酸情報が含まれる。
本開示の一実施態様によれば、上記核酸情報を解析する工程は、
イメージングセルソーターを用いて分取された目的の表現型変化を示す細胞と、第一バーコード核酸と、第二バーコード核酸連結ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する工程であって、上記第二バーコード核酸連結ビーズが、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸を含んでいる工程、
上記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程、
上記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する工程、および
上記増幅物の発現パターンを指標として、第一バーコード核酸と細胞における被験対象の共存後のゲノム関連情報を検出する工程
を含む。
本開示の一実施態様によれば、上記核酸情報を解析する工程は、
イメージングセルソーターを用いて分取された目的の表現型変化を示す細胞と、第一バーコード核酸と、第二バーコード核酸連結ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する工程であって、上記第二バーコード核酸連結ビーズが、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸を含んでいる工程、
上記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程、
上記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する工程、および
上記増幅物の発現パターンを指標として、第一バーコード核酸と細胞における被験対象の共存後のゲノム関連情報を検出する工程
を含む。
以下、核酸情報を解析する工程の一実施態様を、図2に基づき説明する。
マイクロ流路中に大量の液滴(コンパートメント)を作製し、好ましくは、それぞれの液滴中に、液滴ごとに異なる第二バーコード核酸連結ビーズと目的の表現型変化を示す細胞を確率的に1:1の割合で含むように混合する。その後、細胞は上述のコンパートメント内で溶解され、図2の左上段に示されるように、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸と被験対象の標識に使用された第一バーコード核酸とが、第二バーコード核酸連結ビーズにハイブリダイズされた状態でコンパートメント内に包含される。
マイクロ流路中に大量の液滴(コンパートメント)を作製し、好ましくは、それぞれの液滴中に、液滴ごとに異なる第二バーコード核酸連結ビーズと目的の表現型変化を示す細胞を確率的に1:1の割合で含むように混合する。その後、細胞は上述のコンパートメント内で溶解され、図2の左上段に示されるように、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸と被験対象の標識に使用された第一バーコード核酸とが、第二バーコード核酸連結ビーズにハイブリダイズされた状態でコンパートメント内に包含される。
第一バーコード核酸
本開示の第一バーコード核酸は、各被験対象に対応するバーコード領域を含んでいれば、特に限定されず、例えば、該核酸はRNA、DNAまたはそれら組み合わせである。
本開示の第一バーコード核酸は、各被験対象に対応するバーコード領域を含んでいれば、特に限定されず、例えば、該核酸はRNA、DNAまたはそれら組み合わせである。
図2(1)に示される通り、本開示の一実施態様によれば、第一バーコード核酸は、各々被験対象に対応する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域を含むことが好ましい。例えば、第一ハイブリダイズ領域はポリアデニンからなる配列であり、この部分が第二バーコード核酸連結ビーズの第二ハイブリダイズ領域(例えばポリチアニンからなる配列)とハイブリダイズすることができる。ここで、第一共通バーコード領域の配列情報を用いることにより、同一の被験対象を一対一に対応し識別できる。したがって、第一共通バーコード領域の配列情報を用いることにより、コンパートメント中に存在する被験対象を同定することができる。
第一バーコード核酸は特定の核酸配列を固相合成法または酵素合成法により調製される。バーコード核酸がRNAである場合は、一本鎖バーコード核酸の相補鎖となるDNA鋳型を合成した後、線形増幅反応にて、DNA鋳型上のプロモーター配列に結合して一本鎖バーコード領域を含むRNAを合成する、T7等のRNAポリメラーゼにより合成してもよい。バーコード核酸がDNAである場合は、該バーコード核酸は本開示の効果を妨げない限り特に限定されず、例えば、既知配列を用いて合成されおよび/または設計されてもよい。
第二バーコード核酸連結ビーズ
図2(1)(2)に示されるとおり、第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な配列を含む第二バーコード核酸と連結している。
上記第二バーコード核酸連結ビーズの1コンパートメント当たりの数は、特に限定されないが、1コンパートメント当たり1つが好ましい。
図2(1)(2)に示されるとおり、第二バーコード核酸連結ビーズは、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な配列を含む第二バーコード核酸と連結している。
上記第二バーコード核酸連結ビーズの1コンパートメント当たりの数は、特に限定されないが、1コンパートメント当たり1つが好ましい。
第二バーコード核酸
また、図2の下段の(1)(2)は第二バーコード核酸連結ビーズの表面の拡大図であり、ビーズに連結した第二バーコード核酸の構造の一例を示している。
また、図2の下段の(1)(2)は第二バーコード核酸連結ビーズの表面の拡大図であり、ビーズに連結した第二バーコード核酸の構造の一例を示している。
第二バーコード核酸は第二ビーズに直接的または間接的に連結していてもよい。
本開示の一実施態様によれば、第二バーコード核酸は、RNA、DNAまたはそれら組み合わせである。
本開示の一実施態様によれば、第二バーコード核酸は、RNA、DNAまたはそれら組み合わせである。
本開示の一実施態様によれば、第二バーコード核酸は、図2の下段(1)(2)にも示される通り、ビーズに連結する複数の第二バーコード核酸同士で互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、ゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含むことが好ましい。また、第二バーコード核酸は、PCRプライマー領域をさらに含むことが好ましい。図2の下段(1)(2)の一例において、第二バーコード核酸は、ビーズ側から順に、PCRプライマー領域、第二共通バーコード領域、第二固有バーコード領域および第二ハイブリダイズ領域を含む。
図2の(2)に示されるように、上記第二共通バーコード領域の配列情報は、上述の通り、ビーズに連結する複数の第二バーコード核酸同士で互いに共通しており、細胞由来のゲノム関連核酸とハイブリダイズにより関連づけされるため、ゲノム関連核酸の由来する細胞を特定する指標として用いることができる。さらに、細胞はイメージングセルソーターを用いて表現型毎に選別されていることから、第二共通バーコード領域の配列情報は、細胞の表現型(イメージング情報)に関連づけられており、細胞の表現型の指標としても利用することができる。
また、上記第二固有バーコード領域の配列情報は、第二バーコード核酸毎に互いに峻別しうる一方で個々にハイブリダイズされるゲノム関連核酸を特定できるため、表現型変化を生じた細胞においてどのゲノム関連核酸の発現量が増加しているのかなどのゲノムレベルでの反応を分析することができる。
図2の(1)に示されるように、第二バーコード核酸の第二ハイブリダイズ領域は、第一バーコード核酸ともハイブリダイズすることができることから、被験対象と関連づけされた第一バーコード核酸の第一共通バーコード領域等の配列情報も上記第二バーコード核酸の配列情報に関連づけられることとなる。好ましい実施態様によれば、第二バーコード核酸の第二ハイブリダイズ領域は、第一ハイブリダイズ領域またはゲノム関連核酸と相補的な核酸を含む。
例えば、ゲノム関連核酸がmRNAである場合は、第二バーコード核酸における第二ハイブリダイズ領域はTにより構成されるポリチミンであることが好ましい。ポリチミンの長さはmRNAのポリアデニン(A)テールとアニーリングし得る(ハイブリダイズし得る)長さであればよい。
ゲノム関連核酸がゲノムDNA等のDNAである場合、第二バーコード核酸における第二ハイブリダイズ領域は当該DNAの特定の配列または当該DNAに導入されたDNAタグの配列と相補的な配列を含むことが好ましい。
第二バーコード核酸は、各第二バーコード核酸全体としてはそれぞれ異なる配列を有することができる。ビーズに連結する複数の第二バーコード核酸は複数種の第二バーコード核酸となることが好ましい。
ビーズ
ビーズは、多数のゲノム関連核酸とハイブリダイズできる観点から、1,000~100,000の第二バーコード核酸と連結していることが好ましい。
ビーズは、多数のゲノム関連核酸とハイブリダイズできる観点から、1,000~100,000の第二バーコード核酸と連結していることが好ましい。
ビーズが粒子である場合、その材質は、特に限定されないが、セレン化カドミウム(CdSe)、硫化亜鉛(ZnS)、硫化カドミウム(CdS)、セレン化亜鉛(ZnSe)、酸化亜鉛(ZnO)、二酸化ケイ素(SiO2)等の半導体材料でできた量子ドット(半導体ナノ粒子)等の半導体、金等の重金属等の無機物質、アクリルアミド、アガロース、コラーゲン、アルギン酸、セルロース、キトサン、ヒアルロン酸、シリコーンハイドロゲル、PEG系等のハイドロゲル、ポリスチレン、ポリプロピレン、親水性ビニルポリマー(例えば、Toyopearl HW-65S(東ソー株式会社))等の樹脂、またはこれらのハイドロゲル素材を化学的に架橋したもの、またはPEGまたはその誘導体が結合した親水性ビニルポリマー等が挙げられ、好ましくは、ハイドロゲルであり、より好ましくは、アクリルアミド、アルギン酸である。
第二バーコード核酸連結ビーズの製造方法
複数種の第二バーコード核酸連結ビーズは、公知の手法により製造することができる。例えば、E. Z.Macosko et al.,Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161,1202-1214(2015)またはGierahn, T. M et al., Seq-Well: A Portable,Low-CostPlatform for High-Throughput Single-Cell RNA-Seq of Low-Input Samples;Nat Methods.14,395-398(2017)に記載の方法により製造することができる。
複数種の第二バーコード核酸連結ビーズは、公知の手法により製造することができる。例えば、E. Z.Macosko et al.,Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161,1202-1214(2015)またはGierahn, T. M et al., Seq-Well: A Portable,Low-CostPlatform for High-Throughput Single-Cell RNA-Seq of Low-Input Samples;Nat Methods.14,395-398(2017)に記載の方法により製造することができる。
細胞またはその由来物
上記コンパートメントに封入する細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸は、細胞の破砕物、細胞の内容物、細胞の溶解物等から得られる核酸が挙げられる。細胞の由来物(例えば、細胞の破砕物、内容物、溶解物等)は、細胞と細胞溶解バッファー等とを共存させる等の公知手法を用いることにより取得することができる。
上記コンパートメントに封入する細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸は、細胞の破砕物、細胞の内容物、細胞の溶解物等から得られる核酸が挙げられる。細胞の由来物(例えば、細胞の破砕物、内容物、溶解物等)は、細胞と細胞溶解バッファー等とを共存させる等の公知手法を用いることにより取得することができる。
細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸を取得する工程としては、コンパートメントを作成する際に第一バーコード核酸で標識された細胞を細胞溶解バッファー等を共に封入して行ってもよく、第一バーコード核酸で標識された細胞および第二バーコード核酸連結ビーズと共に細胞溶解バッファーを封入してコンパートメント中で生成させてもよい。この際、コンパートメント内に封入する細胞の数は、本開示の効果を妨げない限り、特に限定されないが、シングルセル解析の観点からは、1つのコンパートメント当たり1つであることが好ましい。
ハイブリダイズ複合体取得工程
また、本開示の一実施態様によれば、上記ゲノム関連情報を解析する工程において、ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程を実施する。
また、本開示の一実施態様によれば、上記ゲノム関連情報を解析する工程において、ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程を実施する。
上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)またはZheng GX et al., Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 6;8:14049 (2017)に記載の方法により行うことができる。その後に、公知方法によりコンパートメントを破壊してもよい。
ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の作製工程
また、本開示の一実施態様によれば、上記ゲノム関連情報を解析する工程において、上記ハイブリダイズ複合体取得工程で得られたハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を作製する工程を実施する。
また、本開示の一実施態様によれば、上記ゲノム関連情報を解析する工程において、上記ハイブリダイズ複合体取得工程で得られたハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を作製する工程を実施する。
上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)またはZheng GX et al., Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 6;8:14049 (2017)に記載の方法により行うことができる。
具体的な一実施態様によれば、上述のハイブリダイズ複合体作製工程で得られたハイブリダイズ複合体に対して、相補鎖DNAの合成および逆転写反応を行う。この合成反応および逆転写反応により、細胞由来mRNAに対するcDNAが合成され、第一バーコード核酸に対する相補鎖DNAが合成される。その後、鋳型切り替え(テンプレートスイッチング)を行ってもよい。
その後、PCR反応を行うことが好ましい。このPCR反応により、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物、および、細胞由来mRNAと第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の2種類の増幅物を作製させることができる。なお、ゲノム関連核酸がDNAである場合には、上記PCR反応としてエクステンションPCR法を行うことができる。その後、得られた増幅物に基づいて、被験対象の処理に由来する、第一増幅物および第二増幅物を含む増幅物のライブラリを調製することができる。
細胞における被験対象共存後の核酸情報の読み取り工程
また、本開示の一実施態様によれば、上記ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の作製工程で得られた増幅物の発現パターンを指標として細胞と共存した被験対象を同定し該細胞のゲノム関連情報を検出する工程を含む。上記増幅物の発現パターンとしては、例えば、シークエンシングにより得られた、増幅物の配列情報、例えば、該配列情報中の第一バーコード核酸の配列情報(例えば、第一共通バーコード領域の配列情報)、第二バーコード核酸の配列情報(例えば、第二共通バーコード領域の配列情報、第二固有バーコード領域の配列情報)、ゲノム関連核酸の配列情報(細胞毎のmRNAの配列)等が挙げられる。
また、本開示の一実施態様によれば、上記ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の作製工程で得られた増幅物の発現パターンを指標として細胞と共存した被験対象を同定し該細胞のゲノム関連情報を検出する工程を含む。上記増幅物の発現パターンとしては、例えば、シークエンシングにより得られた、増幅物の配列情報、例えば、該配列情報中の第一バーコード核酸の配列情報(例えば、第一共通バーコード領域の配列情報)、第二バーコード核酸の配列情報(例えば、第二共通バーコード領域の配列情報、第二固有バーコード領域の配列情報)、ゲノム関連核酸の配列情報(細胞毎のmRNAの配列)等が挙げられる。
以下、特に限定するものではないが、細胞における被験対象共存後の核酸情報の読み取り工程の一態様を説明する。
上述のハイブリダイズ複合体由来の増幅物の作製工程で得られた増幅物(第一増幅物、第二増幅物)の配列をシーケンサーにより決定し、増幅物の配列情報の解析を行う。第二増幅物の解析では、第二共通バーコード領域の配列情報を指標として、各増幅物の由来する細胞を割り当てる。また、第二固有バーコード領域の配列情報により、各mRNA分子を識別できることから、該配列情報を指標として、細胞毎のmRNAの配列およびその発現量等の情報を得ることができる。上記第二増幅物の解析で得られた情報に基づき、細胞毎のトランスクリプトーム情報を得ることができる。
上述のハイブリダイズ複合体由来の増幅物の作製工程で得られた増幅物(第一増幅物、第二増幅物)の配列をシーケンサーにより決定し、増幅物の配列情報の解析を行う。第二増幅物の解析では、第二共通バーコード領域の配列情報を指標として、各増幅物の由来する細胞を割り当てる。また、第二固有バーコード領域の配列情報により、各mRNA分子を識別できることから、該配列情報を指標として、細胞毎のmRNAの配列およびその発現量等の情報を得ることができる。上記第二増幅物の解析で得られた情報に基づき、細胞毎のトランスクリプトーム情報を得ることができる。
次に、上記細胞と共存した被験対象の同定を行う。ここで、上述のように、第一バーコード核酸は被験対象に対応している。したがって、上記同定では、第一バーコード核酸の第一共通バーコード領域の配列情報に基づいて、各第一増幅物に対し、細胞と共存した被験対象を割り当てることができる。
次に、細胞と共存した被験対象と、トランスクリプトーム情報のマッチングを行う。したがって、各コンパートメント中の細胞のゲノム関連情報と共存した被験対象を、1対1で結びつけることができる。
したがって、1種以上の被験対象と共存した細胞またはその由来物のトランスクリプトーム情報等のゲノム関連情報の検出により、共存した被験対象に対しての細胞の応答を評価することができる。
したがって、1種以上の被験対象と共存した細胞またはその由来物のトランスクリプトーム情報等のゲノム関連情報の検出により、共存した被験対象に対しての細胞の応答を評価することができる。
上記核酸情報の読み取り工程において、例えば、液滴技術を用いた1細胞解析技術である10xGenomics社製 Chromium コントローラー装置と10xGenomics社製の単一細胞3’試薬キットv3を用いて実施することができる。
イメージングセルソーター
本開示においては、上述の通り、イメージングセルソーターを用いて、複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する。本開示においては、イメージングセルソーターを利用することにより、迅速かつ精度よく被験対象に応答して生じた細胞の表現型の変化を分析し、目的とする表現型を示す細胞を選別することができる。イメージングセルソーターは、細胞等の観測対象物の形態情報を高速に取得して分析するフローサイトメータであり、その分析結果に基づいて目的とする観測対象物を選択的に取得することができる。
本開示においては、上述の通り、イメージングセルソーターを用いて、複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する。本開示においては、イメージングセルソーターを利用することにより、迅速かつ精度よく被験対象に応答して生じた細胞の表現型の変化を分析し、目的とする表現型を示す細胞を選別することができる。イメージングセルソーターは、細胞等の観測対象物の形態情報を高速に取得して分析するフローサイトメータであり、その分析結果に基づいて目的とする観測対象物を選択的に取得することができる。
第一の実施態様のイメージングセルソーター
本開示の一実施態様によれば、イメージングセルソーターは、光源からの光が構造化されて照射される光照射領域に存在する観測対象物からの散乱光、透過光、蛍光、または電磁波を受け取り、電気信号に変換する受光部から出力される前記電気信号の時間軸に基づいて抽出される信号に基づいて前記観測対象物を分析する分析部を備える分析装置である(以下、「第一の実施態様におけるイメージングセルソーター」ともいう)。第一の実施形態におけるイメージングセルソーターでは、光構造と測定対象の相対的な動きを利用する動的ゴーストイメージング(Ghost Motion Imaging)技術が用いられている。第一の実施態様におけるイメージングセルソーターを用いた分析は、例えば、WO2017/073737号公報の記載に準じて実施することができる。
本開示の一実施態様によれば、イメージングセルソーターは、光源からの光が構造化されて照射される光照射領域に存在する観測対象物からの散乱光、透過光、蛍光、または電磁波を受け取り、電気信号に変換する受光部から出力される前記電気信号の時間軸に基づいて抽出される信号に基づいて前記観測対象物を分析する分析部を備える分析装置である(以下、「第一の実施態様におけるイメージングセルソーター」ともいう)。第一の実施形態におけるイメージングセルソーターでは、光構造と測定対象の相対的な動きを利用する動的ゴーストイメージング(Ghost Motion Imaging)技術が用いられている。第一の実施態様におけるイメージングセルソーターを用いた分析は、例えば、WO2017/073737号公報の記載に準じて実施することができる。
本開示の第一の実施態様におけるイメージングセルソーターによれば、機械学習に1細胞フローサイトメトリーの各要所を委ねることにより、細胞情報を賢く計測し、賢く速く正確に分析・判別することを可能とする。人知バイアスに縛られない細胞分類法(1)、細胞「画像」を撮らない高速の細胞空間情報撮影・分析法(2)、対象に応じて自動的に最適化する光撮影法(3)を実現することができる。
図3は、本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターの一実施態様を示す模式図である。本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、一例として、
光源1と、
光源1からの光が照射される光照射領域3と、
光照射領域3に存在する観測対象物5からの散乱光(ラマン散乱を含む),透過光,蛍光,または電磁波を受け取り,電気信号に変換する受光部7と、
受光部7から電気信号を受け取って記録する記憶部9と、
記憶部9が記録した、散乱光、透過光、蛍光、または電磁波に関する電気信号を分析して、分析結果を記録する分析部11と、
分析結果に基づいて、光源1または光照射領域3を最適化する光学系制御部13と、
を有する。
光源1と、
光源1からの光が照射される光照射領域3と、
光照射領域3に存在する観測対象物5からの散乱光(ラマン散乱を含む),透過光,蛍光,または電磁波を受け取り,電気信号に変換する受光部7と、
受光部7から電気信号を受け取って記録する記憶部9と、
記憶部9が記録した、散乱光、透過光、蛍光、または電磁波に関する電気信号を分析して、分析結果を記録する分析部11と、
分析結果に基づいて、光源1または光照射領域3を最適化する光学系制御部13と、
を有する。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターでは、光照射領域3において照射される光が、構造化された照明パターンを有している。構造化された照明パターンは、一例として、光源1から光照射領域3の光路の途中に配置される空間光変調器、フィルタ等を含む光変調部により付与される。ここで構造化された照明とは、光特性が異なる複数の領域を有する照明であり、光照射領域3において観測対象物に照射される照明光は、例えば、格子状に区分された複数の領域を有し、その複数の領域が互いに光特性が異なる少なくとも第1の光特性を有する領域と第2の光特性を有する領域により構成される帯状の照明光に加工される。本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、上記の図3の構成から、光学系制御部13を含まない構成とすることもできる。
また、第1の実施態様におけるイメージングセルソーターの別の実施態様として、光照射領域3において照射される光を構造化せず、観測対象物5からの散乱光(ラマン散乱を含む)、透過光、蛍光または電磁波を、構造化して受光部7において検出する構成とすることもできる。この構成では、一例として、光照射領域3から受光部7の光路の途中にフィルタ等の光変調部を配置することで、観測対象物5からの光(上記の観測対象物5からの散乱光、透過光、蛍光、または電磁波)を構造化して検出することができる。構造化して検出する構成において用いられる光変調部は、一例として、格子状に区分された複数の領域を有し、その複数の領域が光を透過させる領域と光を透過させない領域が配置されたパターンを有している。観測対象物5からの光は、上記光変調部を介することにより、光特性が異なる複数の領域を有する光として受光部7により検出される。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、好ましくは、分析部11の判別アルゴリズムを機械学習により最適化するものである。本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターでは、目的とする表現型を示す細胞を含む学習サンプルを用いて学習データを取得し、その学習データを用いて目的とする表現型を示す細胞を判別する判別モデルを作製し、そのモデルに基づいてテストサンプルを測定し、テストサンプルから目的とする表現型を示す細胞を取得することができる。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、好ましくは、分析部11が、散乱光、透過光、蛍光、または電磁波に関する電気信号を観測対象の像を再構築することなく、観測対象を分析するものである。即ち、前記散乱光、透過光、蛍光、または電磁波に関する電気信号は時系列の波形データとして分析に用いられる。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、より好ましくは、目的とする表現型を示す細胞を含む学習サンプルを用いて取得した波形データ(電気信号)を学習データとして取得し、その学習データを用いて目的とする表現型を示す細胞を判別する判別モデルを作製し、そのモデルに基づいてテストサンプルを測定した際に取得される波形データ(電気信号)に基づいてテストサンプルから目的とする表現型を示す細胞が取得される。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、より好ましくは、目的とする表現型を示す細胞を含む学習サンプルを用いて取得した波形データ(電気信号)を学習データとして取得し、その学習データを用いて目的とする表現型を示す細胞を判別する判別モデルを作製し、そのモデルに基づいてテストサンプルを測定した際に取得される波形データ(電気信号)に基づいてテストサンプルから目的とする表現型を示す細胞が取得される。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、好ましくは、光学系制御部13が、機械学習により光源1を最適化するものである。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、好ましくは、光源1からの光は、複数の光領域21を有し、光学系制御部13は、複数の光領域の光構造を制御するものである。したがって、本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、好ましくは、複数の光領域を有し、光学系制御部は、光領域の光構造を制御する。また、一実施態様によれば、本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、光源と光照射領域との間の光路上に、光特性が互いに異なる複数の領域を有する光変調部が配置されてなる。光源1からの光は、光変調部を介して構造化され、構造化された照明により観測対象物5は光照射領域3において照射を受ける。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、好ましくは、光学系制御部13が、電気信号に基づいて観測対象物3の存在領域を分析し、光照射領域3を限定するように制御するものである。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、好ましくは、光学系制御部13が、電気信号に基づいて観測対象物5の粗密を分析して観測対象の粗密情報を得て、粗密情報に基づいて、光源1または光照射領域3を制御するものである。したがって、一実施態様によれば、分析部が、分析した結果に基づいて判別アルゴリズムが更新される。そして、本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターでは、好ましくは、光および光照射領域が、分析部が分析した結果に基づいて制御される。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、好ましくは、受光部7から電気信号を受け取り、受光部7へ光が照射される領域である受光領域25を最適化する受光系制御部27を更に有するものである。本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、好ましくは、受光系制御部27は、機械学習により受光領域25を最適化する。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターの好ましい利用態様は、光照射領域3を含むフローセルを有する。観測対象物5はフローセル中を流れる流体と共に移動し、光照射領域3において光源1からの光の照射を受ける。
本開示の第1の実施態様におけるイメージングセルソーターは、好ましくは、分析部11の分析結果に基づいて、観測対象物を判別し、観測対象物5を分別する分別部を有する。
第二の実施態様のイメージングセルソーター
また、本開示の好ましい実施態様によれば、イメージングセルソーターは、光源からの光が照射される光照射領域に存在する観測対象物からの散乱光、透過光、蛍光、または電磁波を受け取り、電気信号に変換する受光部から出力される電気信号の時間軸に基づいて抽出される信号に基づいて観測対象物を分析する分析部
を備える分析装置である(以下、「第二の実施態様におけるイメージングセルソーター」ともいう)。第二の実施態様におけるイメージングセルソーターを用いた分析は、WO2018/199080号公報の記載に準じて実施することができる。
また、本開示の好ましい実施態様によれば、イメージングセルソーターは、光源からの光が照射される光照射領域に存在する観測対象物からの散乱光、透過光、蛍光、または電磁波を受け取り、電気信号に変換する受光部から出力される電気信号の時間軸に基づいて抽出される信号に基づいて観測対象物を分析する分析部
を備える分析装置である(以下、「第二の実施態様におけるイメージングセルソーター」ともいう)。第二の実施態様におけるイメージングセルソーターを用いた分析は、WO2018/199080号公報の記載に準じて実施することができる。
第二の実施態様におけるイメージングセルソーターによれば、観測対象物の3次元画像を高速に生成することができ、観測対象物である細胞の表現型を迅速に特定するうえで有利である。
第二の実施態様におけるイメージングセルソーターは、好ましくは、観測対象物が流される少なくとも1つの流路と、流路に対して帯状の励起光を照射する光源と、励起光が照射される位置を通過した観測対象物からの蛍光を撮像することにより、観測対象物のある断面を撮像する撮像部と、撮像部が撮像した断面が撮像された複数の撮像画像に基づいて、観測対象物の3次元の画像を生成する3次元画像生成部とを備えるイメージングフローサイトメーターである。
また、第二の実施態様におけるイメージングセルソーターにおいて、好ましくは、撮像部が撮像した断面が示す観測対象物の形態を示す情報に基づいて、観測対象物を分取する。
また、第二の実施態様におけるイメージングセルソーターにおいて、好ましくは、流路は、並列に並べられた複数の流路であって、励起光は、複数の前記流路に対して照射され、前記撮像部は、複数の前記流路をそれぞれ流される観測対象物の断面を撮像する。
また、第二の実施態様におけるイメージングセルソーターにおいて、好ましくは、光源と蛍光の強さを検出する撮像素子との間の光路上に、光特性が互いに異なる複数の領域を有する光変調部が配置され、撮像部は、撮像素子が検出する前記蛍光の強さと、光変調部の光特性とに基づいて、観測対象物の前記断面の像を、撮像画像として再構成する。
本開示によれば、観測対象物の3次元画像を高速に生成するイメージングフローサイトメーターを提供ことができる。
一つの態様によれば、本開示の方法は、上記準備工程後、以下の実施例に記載の手法に準じて実施してもよい。
また、日本国特許第5441142号公報、日本国特許第5540359号公報、日本国特許第6544600号公報、WO2017/073737号公報、WO2018/181458号公報、WO2018/199080号公報、WO2018/203575号公報に記載する内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
本開示の一実施態様によれば、以下が提供される。
[1]被験対象と関連付けされている第一バーコード核酸で標識しかつ上記被験対象で処理した複数の細胞を準備する工程、
イメージングセルソーターを用いて、上記複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する工程、
第一バーコード核酸を指標として各細胞の処理に用いられた被験対象を同定する工程を含む、被験対象をスクリーニングする方法。
[2]各細胞の処理に用いられた被験対象と、各細胞の表現型とを関連付けする、[1]に記載の方法。
[3]上記同定工程が、さらに被験対象により目的とする細胞の表現型変化を生じさせる標的部位を同定する工程を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4]各細胞のゲノム関連情報を解析する工程をさらに含む、[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[5]上記細胞を準備する工程が、被験対象および第一バーコード核酸を含む液媒体と、細胞とを混合して、上記第一バーコード核酸と細胞とを関連付けする工程を含む、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6]上記細胞を準備する工程が、被験対象および第一バーコード核酸を含む液媒体にハイドロゲルビーズを添加して、被験対象および第一バーコード核酸を含む第一サブコンパートメントを生成して、被験対象と第一バーコード核酸とを関連付けする工程を含む、[1]~[5]のいずれかに記載の方法。
[7]上記細胞を準備する工程が、上記被験対象および第一バーコード核酸を含む第一サブコンパートメントと、細胞を含む第二サブコンパートメントとを融合し、上記被験対象、第一バーコード核酸および細胞を含むコンパートメントを生成する、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8]上記細胞を準備する工程が、上記コンパートメント中において被験対象で細胞を処理する、[7]に記載の方法。
[9]上記コンパートメントまたはサブコンパートメントが液滴である、[6]~[8]のいずれかに記載の方法。
[10]上記細胞を準備する工程が、上記コンパートメントから細胞を回収する工程を含む、[7]~[9]のいずれかに記載の方法。
[11]上記選別工程が、細胞表現型に基づいて、被験対象により所定の反応が起こっている細胞を選別する工程を含む、[1]~[10]のいずれかに記載の方法。
[12]上記ゲノム関連情報を解析する工程が、上記細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸と、上記第一バーコード核酸と、第二バーコード核酸連結ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する工程であって、上記第二バーコード核酸連結ビーズが、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは上記第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸を含んでいる工程、
上記ゲノム関連核酸および上記第一バーコード核酸をそれぞれ、上記第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程、
上記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する工程、および
上記増幅物の発現パターンを指標として細胞における上記被験対象の共存後のゲノム関連情報を検出する工程
を含む、[4]~[11]のいずれかに記載の方法。
[13]上記ゲノム関連核酸が、上記細胞ゲノムDNA、または上記細胞ゲノムに由来するRNAもしくはそのcDNAである、[12]に記載の方法。
[14]第一バーコード核酸が各々、同一の被験対象において共通する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域とを含んでいる、[12]または[13]のいずれかに記載の方法。
[15]第一共通バーコード領域の配列情報が、被験対象を特定する指標となる、[12]~[14]のいずれかに記載の方法。
[16]上記第二バーコード核酸連結ビーズに連結した複数の第二バーコード核酸が各々、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、ゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含む、[12]~[15]のいずれかに記載の方法。
[17]上記第二固有バーコード領域の配列情報が、ゲノム関連核酸を特定する指標となる、[12]~[16]のいずれかに記載の方法。
[18]第二バーコード核酸が、PCRプライマー領域をさらに含む、[11[~[16]のいずれかに記載の方法。
[19]第二ハイブリダイズ領域が、上記第一ハイブリダイズ領域または上記ゲノム関連核酸と相補的な核酸を含む、[12]~[17]のいずれかに記載の方法。
[20]上記イメージングセルソーターが、光源からの光が照射される光照射領域に存在する観測対象物からの散乱光、透過光、蛍光、または電磁波を受け取り、電気信号に変換する受光部から出力される上記電気信号の時間軸に基づいて抽出される信号に基づいて上記観測対象物を分析する分析部
を備える分析装置である、[1]~[19]のいずれかに記載の方法。
[21]上記光源と上記光照射領域との間の光路上に、光特性が互いに異なる複数の領域を有する光変調部が配置された、[20]に記載の方法。
[22]上記分析部が分析した分析結果に基づいて,上記光源を制御する光学系制御部を更に備える、[20]または[21]に記載の方法。
[23]上記光源からの光が、複数の光領域を有し、上記光学系制御部は、上記光領域の光構造を制御する、[22]に記載の方法。
[24]上記分析部が、分析した結果に基づいて判別アルゴリズムが更新される、[20]~[23]のいずれかに記載の方法。
[25]上記光および上記光照射領域が、上記分析部が分析した結果に基づいて制御される、[20]~[24]のいずれかに記載の方法。
[26]上記イメージングセルソーターが、上記光照射領域を含むフローセルを含む、[20]~[25]のいずれかに記載の方法。
[27]上記イメージングセルソーターが、上記分析部の分析結果に基づいて,上記観測対象物を判別し,上記観測対象物を分別する分別部を有する、[20]~[26]のいずれかに記載の方法。
[28]上記イメージングセルソーターが、流路を移動する上記観測対象物の移動可能な流線幅を可変に制御する流線幅制御部を更に備え、
上記分析部が,上記時間軸に基づいて抽出される信号と、当該信号が取得された際の流線幅とに基づいて,上記観測対象物の状態を判別する基準を示す教師情報を機械学習によって生成する教師情報生成部と、
上記信号と上記教師情報生成部が生成する教師情報とに基づいて、上記流線を移動する上記観測対象物の状態を推定する、[20]~[27]のいずれかに記載の方法。
[29]上記流線幅制御部が、
上記観測対象物の径に応じた幅である第1の流線幅に上記流線幅を制御し、
上記教師情報生成部が、
上記流線幅制御部が制御した上記第1の流線幅において上記受光部が検出する第1の観察結果信号に基づく第1の教師情報を上記教師情報として生成し、
上記分析部が、
上記教師情報生成部が生成する上記第1の教師情報と,上記信号とに基づいて,上記流線を移動する上記観測対象物の状態を推定する、[28]に記載の方法。
[30]上記流線幅制御部が、
上記観測対象物の径に基づく幅であり,かつ,上記第1の流線幅よりも幅が広い第2の流線幅に上記流線幅を制御し、
上記教師情報生成部は更に、
上記流線幅制御部が制御した上記第2の流線幅において上記受光部が検出する第2の観察結果信号に基づく第2の教師情報を上記教師情報として生成し、
上記分析部が、
上記教師情報生成部が生成する上記第1の教師情報と、上記教師情報生成部が生成する上記第2の教師情報と,上記信号とに基づいて,上記流線を移動する上記観測対象物の状態を推定する、[28]または[29]に記載の方法。
[31]上記イメージングセルソーターが、
観測対象物が流される少なくとも1つの流路と、
上記流路に対して帯状の励起光を照射する光源と、
上記励起光が照射される位置を通過した上記観測対象物からの蛍光を撮像することにより、上記観測対象物のある断面を撮像する撮像部と、
上記撮像部が撮像した上記断面が撮像された複数の撮像画像に基づいて、上記観測対象物の3次元の画像を生成する3次元画像生成部と
を備える、[1]~[30]のいずれかに記載の方法。
[32]上記イメージングセルソーターが、
上記撮像部が撮像した上記断面が示す上記観測対象物の形態を示す情報に基づいて、観測対象物を分取する、[31]に記載の方法。
[33]上記流路が、並列に並べられた複数の流路であって、
上記励起光が、複数の上記流路に対して照射され、
上記撮像部が、複数の上記流路をそれぞれ流される上記観測対象物の上記断面を撮像する、[31]または[32]に記載の方法。
[34]上記光源と上記蛍光の強さを検出する撮像素子との間の光路上に、光特性が互いに異なる複数の領域を有する光変調部が配置され、
上記撮像部が、
上記撮像素子が検出する上記蛍光の強さと、上記光変調部の上記光特性とに基づいて、上記観測対象物の上記断面の像を、撮像画像として再構成する、[1]~[33]のいずれかに記載の方法。
[35]上記被験対象が被験物質を含む、[1]~[34]のいずれかに記載の方法。
[36]上記被験対象が被験物質である、[1]~[35]のいずれかに記載の方法。
[37]上記ゲノム関連情報を解析する工程が、
イメージングセルソーターを用いて分取された目的の表現型変化を示す細胞と、上記第一バーコード核酸と、第二バーコード核酸連結ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する工程であって、上記第二バーコード核酸連結ビーズが、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸を含んでいる工程、
上記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程、
上記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する工程、および
上記増幅物の発現パターンを指標として、第一バーコード核酸と細胞における被験対象の共存後のゲノム関連情報を検出する工程
を含む、[1]~[36]のいずれかに記載の方法。
[1]被験対象と関連付けされている第一バーコード核酸で標識しかつ上記被験対象で処理した複数の細胞を準備する工程、
イメージングセルソーターを用いて、上記複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する工程、
第一バーコード核酸を指標として各細胞の処理に用いられた被験対象を同定する工程を含む、被験対象をスクリーニングする方法。
[2]各細胞の処理に用いられた被験対象と、各細胞の表現型とを関連付けする、[1]に記載の方法。
[3]上記同定工程が、さらに被験対象により目的とする細胞の表現型変化を生じさせる標的部位を同定する工程を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4]各細胞のゲノム関連情報を解析する工程をさらに含む、[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[5]上記細胞を準備する工程が、被験対象および第一バーコード核酸を含む液媒体と、細胞とを混合して、上記第一バーコード核酸と細胞とを関連付けする工程を含む、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6]上記細胞を準備する工程が、被験対象および第一バーコード核酸を含む液媒体にハイドロゲルビーズを添加して、被験対象および第一バーコード核酸を含む第一サブコンパートメントを生成して、被験対象と第一バーコード核酸とを関連付けする工程を含む、[1]~[5]のいずれかに記載の方法。
[7]上記細胞を準備する工程が、上記被験対象および第一バーコード核酸を含む第一サブコンパートメントと、細胞を含む第二サブコンパートメントとを融合し、上記被験対象、第一バーコード核酸および細胞を含むコンパートメントを生成する、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8]上記細胞を準備する工程が、上記コンパートメント中において被験対象で細胞を処理する、[7]に記載の方法。
[9]上記コンパートメントまたはサブコンパートメントが液滴である、[6]~[8]のいずれかに記載の方法。
[10]上記細胞を準備する工程が、上記コンパートメントから細胞を回収する工程を含む、[7]~[9]のいずれかに記載の方法。
[11]上記選別工程が、細胞表現型に基づいて、被験対象により所定の反応が起こっている細胞を選別する工程を含む、[1]~[10]のいずれかに記載の方法。
[12]上記ゲノム関連情報を解析する工程が、上記細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸と、上記第一バーコード核酸と、第二バーコード核酸連結ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する工程であって、上記第二バーコード核酸連結ビーズが、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは上記第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸を含んでいる工程、
上記ゲノム関連核酸および上記第一バーコード核酸をそれぞれ、上記第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程、
上記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する工程、および
上記増幅物の発現パターンを指標として細胞における上記被験対象の共存後のゲノム関連情報を検出する工程
を含む、[4]~[11]のいずれかに記載の方法。
[13]上記ゲノム関連核酸が、上記細胞ゲノムDNA、または上記細胞ゲノムに由来するRNAもしくはそのcDNAである、[12]に記載の方法。
[14]第一バーコード核酸が各々、同一の被験対象において共通する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域とを含んでいる、[12]または[13]のいずれかに記載の方法。
[15]第一共通バーコード領域の配列情報が、被験対象を特定する指標となる、[12]~[14]のいずれかに記載の方法。
[16]上記第二バーコード核酸連結ビーズに連結した複数の第二バーコード核酸が各々、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、ゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含む、[12]~[15]のいずれかに記載の方法。
[17]上記第二固有バーコード領域の配列情報が、ゲノム関連核酸を特定する指標となる、[12]~[16]のいずれかに記載の方法。
[18]第二バーコード核酸が、PCRプライマー領域をさらに含む、[11[~[16]のいずれかに記載の方法。
[19]第二ハイブリダイズ領域が、上記第一ハイブリダイズ領域または上記ゲノム関連核酸と相補的な核酸を含む、[12]~[17]のいずれかに記載の方法。
[20]上記イメージングセルソーターが、光源からの光が照射される光照射領域に存在する観測対象物からの散乱光、透過光、蛍光、または電磁波を受け取り、電気信号に変換する受光部から出力される上記電気信号の時間軸に基づいて抽出される信号に基づいて上記観測対象物を分析する分析部
を備える分析装置である、[1]~[19]のいずれかに記載の方法。
[21]上記光源と上記光照射領域との間の光路上に、光特性が互いに異なる複数の領域を有する光変調部が配置された、[20]に記載の方法。
[22]上記分析部が分析した分析結果に基づいて,上記光源を制御する光学系制御部を更に備える、[20]または[21]に記載の方法。
[23]上記光源からの光が、複数の光領域を有し、上記光学系制御部は、上記光領域の光構造を制御する、[22]に記載の方法。
[24]上記分析部が、分析した結果に基づいて判別アルゴリズムが更新される、[20]~[23]のいずれかに記載の方法。
[25]上記光および上記光照射領域が、上記分析部が分析した結果に基づいて制御される、[20]~[24]のいずれかに記載の方法。
[26]上記イメージングセルソーターが、上記光照射領域を含むフローセルを含む、[20]~[25]のいずれかに記載の方法。
[27]上記イメージングセルソーターが、上記分析部の分析結果に基づいて,上記観測対象物を判別し,上記観測対象物を分別する分別部を有する、[20]~[26]のいずれかに記載の方法。
[28]上記イメージングセルソーターが、流路を移動する上記観測対象物の移動可能な流線幅を可変に制御する流線幅制御部を更に備え、
上記分析部が,上記時間軸に基づいて抽出される信号と、当該信号が取得された際の流線幅とに基づいて,上記観測対象物の状態を判別する基準を示す教師情報を機械学習によって生成する教師情報生成部と、
上記信号と上記教師情報生成部が生成する教師情報とに基づいて、上記流線を移動する上記観測対象物の状態を推定する、[20]~[27]のいずれかに記載の方法。
[29]上記流線幅制御部が、
上記観測対象物の径に応じた幅である第1の流線幅に上記流線幅を制御し、
上記教師情報生成部が、
上記流線幅制御部が制御した上記第1の流線幅において上記受光部が検出する第1の観察結果信号に基づく第1の教師情報を上記教師情報として生成し、
上記分析部が、
上記教師情報生成部が生成する上記第1の教師情報と,上記信号とに基づいて,上記流線を移動する上記観測対象物の状態を推定する、[28]に記載の方法。
[30]上記流線幅制御部が、
上記観測対象物の径に基づく幅であり,かつ,上記第1の流線幅よりも幅が広い第2の流線幅に上記流線幅を制御し、
上記教師情報生成部は更に、
上記流線幅制御部が制御した上記第2の流線幅において上記受光部が検出する第2の観察結果信号に基づく第2の教師情報を上記教師情報として生成し、
上記分析部が、
上記教師情報生成部が生成する上記第1の教師情報と、上記教師情報生成部が生成する上記第2の教師情報と,上記信号とに基づいて,上記流線を移動する上記観測対象物の状態を推定する、[28]または[29]に記載の方法。
[31]上記イメージングセルソーターが、
観測対象物が流される少なくとも1つの流路と、
上記流路に対して帯状の励起光を照射する光源と、
上記励起光が照射される位置を通過した上記観測対象物からの蛍光を撮像することにより、上記観測対象物のある断面を撮像する撮像部と、
上記撮像部が撮像した上記断面が撮像された複数の撮像画像に基づいて、上記観測対象物の3次元の画像を生成する3次元画像生成部と
を備える、[1]~[30]のいずれかに記載の方法。
[32]上記イメージングセルソーターが、
上記撮像部が撮像した上記断面が示す上記観測対象物の形態を示す情報に基づいて、観測対象物を分取する、[31]に記載の方法。
[33]上記流路が、並列に並べられた複数の流路であって、
上記励起光が、複数の上記流路に対して照射され、
上記撮像部が、複数の上記流路をそれぞれ流される上記観測対象物の上記断面を撮像する、[31]または[32]に記載の方法。
[34]上記光源と上記蛍光の強さを検出する撮像素子との間の光路上に、光特性が互いに異なる複数の領域を有する光変調部が配置され、
上記撮像部が、
上記撮像素子が検出する上記蛍光の強さと、上記光変調部の上記光特性とに基づいて、上記観測対象物の上記断面の像を、撮像画像として再構成する、[1]~[33]のいずれかに記載の方法。
[35]上記被験対象が被験物質を含む、[1]~[34]のいずれかに記載の方法。
[36]上記被験対象が被験物質である、[1]~[35]のいずれかに記載の方法。
[37]上記ゲノム関連情報を解析する工程が、
イメージングセルソーターを用いて分取された目的の表現型変化を示す細胞と、上記第一バーコード核酸と、第二バーコード核酸連結ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する工程であって、上記第二バーコード核酸連結ビーズが、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸を含んでいる工程、
上記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程、
上記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する工程、および
上記増幅物の発現パターンを指標として、第一バーコード核酸と細胞における被験対象の共存後のゲノム関連情報を検出する工程
を含む、[1]~[36]のいずれかに記載の方法。
以下、本開示を実施例に基づき具体的に説明するが、本開示はかかる実施例に限定されない。また、特に言及しない限り、本開示の測定方法および単位は日本工業規格(JIS)の規定に従う。
参考例1:第一バーコード核酸と細胞との紐付け予備試験
Multi-seq法(Nature Methods,volume16,pages 619-626 (2019)の記載)に準じて、後述する例1と同様の細胞、アンカーCMO、共アンカーCMOおよびオリゴヌクレオチドを使用して、以下の予備実験を行った。すなわち、細胞とアンカーCMOをPhosphate Buffered Saline(PBS)溶液で4度、5分間のインキュベーションを行ったのち、共アンカーCMOを加え、さらに4度、5分間のインキュベーションを行い、最後に赤色蛍光色素(Cy5)を付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)を混合し、4度、5分間インキュベーションした。
Multi-seq法(Nature Methods,volume16,pages 619-626 (2019)の記載)に準じて、後述する例1と同様の細胞、アンカーCMO、共アンカーCMOおよびオリゴヌクレオチドを使用して、以下の予備実験を行った。すなわち、細胞とアンカーCMOをPhosphate Buffered Saline(PBS)溶液で4度、5分間のインキュベーションを行ったのち、共アンカーCMOを加え、さらに4度、5分間のインキュベーションを行い、最後に赤色蛍光色素(Cy5)を付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)を混合し、4度、5分間インキュベーションした。
その結果、図4のAおよびBに示される通り、PBS溶液中において短時間(インキュベート後30分)では、赤色蛍光色素(Cy5)を付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)は細胞に保持されていた。しかしながら、長時間(インキュベート後3時間以上)が経過すると、ほとんどの細胞が死滅したり、細胞に付加したバーコード核酸が抜け落ちたりする場合があることが確認された(図示せず)。
参考例2:第一バーコード核酸と細胞との紐付け予備試験
また、血清またはBovine SerumAlbumin(BSA)を含有する細胞培地を溶媒として用いてインキュベーションする以外、参考例1と同様の手法により予備実験を行った。その結果、図4のCおよびDの写真に示される通り、赤色蛍光色素(Cy5)を付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)の細胞への付加率が低下することが確認された。
また、血清またはBovine SerumAlbumin(BSA)を含有する細胞培地を溶媒として用いてインキュベーションする以外、参考例1と同様の手法により予備実験を行った。その結果、図4のCおよびDの写真に示される通り、赤色蛍光色素(Cy5)を付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)の細胞への付加率が低下することが確認された。
参考例3:第一バーコード核酸と細胞との紐付け予備試験
また、アンカーCMOや共アンカーCMOを付加する時の溶液を、血清なしOpti-MEM培地 (Thermo Fisher製)に変更し室温でインキュベーションする以外、参考例1と同様の手法により予備実験を行った。その結果、図4のEおよびFの写真に示される通り、十分に蛍光色素を付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)を細胞に付加できることを確認した。細胞への付加効率が高いまま (100%) 液滴を用いたスクリーニング系に適した反応を行うことができることが確認された。そこで、以下の例1の実験を行うこととした。
また、アンカーCMOや共アンカーCMOを付加する時の溶液を、血清なしOpti-MEM培地 (Thermo Fisher製)に変更し室温でインキュベーションする以外、参考例1と同様の手法により予備実験を行った。その結果、図4のEおよびFの写真に示される通り、十分に蛍光色素を付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)を細胞に付加できることを確認した。細胞への付加効率が高いまま (100%) 液滴を用いたスクリーニング系に適した反応を行うことができることが確認された。そこで、以下の例1の実験を行うこととした。
例1:コンパートメント(チューブ)内での第一バーコード核酸と細胞との紐付け
本実験では、まずチューブ1内において、コレステロール修飾された2種類のオリゴヌクレオチドリンカー、すなわち、アンカーCMO(5’-Cholesterol-TEG-GTAACGATGGAGCTGTCACTTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3’(配列番号1))と、共アンカーCMO(5’-AGTGACAGCTGGATCGTTAC-TEG-Cholesterol-3’(配列番号2))を混合した。ここで、オリゴヌクレオチドリンカー中の「Cholesterol-TEG」はhttps://sg.idtdna.com/site/Catalog/Modifications/Product/2555に記載の市販品を使用している。上記混合行程において、溶媒は血清なしのOpti-MEM培地を用い、アンカーCMO、共アンカーCMOの終濃度は共に250nMとした。チューブ1は、室温で5分間インキュベーションした。
本実験では、まずチューブ1内において、コレステロール修飾された2種類のオリゴヌクレオチドリンカー、すなわち、アンカーCMO(5’-Cholesterol-TEG-GTAACGATGGAGCTGTCACTTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3’(配列番号1))と、共アンカーCMO(5’-AGTGACAGCTGGATCGTTAC-TEG-Cholesterol-3’(配列番号2))を混合した。ここで、オリゴヌクレオチドリンカー中の「Cholesterol-TEG」はhttps://sg.idtdna.com/site/Catalog/Modifications/Product/2555に記載の市販品を使用している。上記混合行程において、溶媒は血清なしのOpti-MEM培地を用い、アンカーCMO、共アンカーCMOの終濃度は共に250nMとした。チューブ1は、室温で5分間インキュベーションした。
次に、第一バーコード核酸Aをチューブ1に加えて混合し、インキュベーションした。第一バーコード核酸A配列(8塩基)を含むオリゴヌクレオチドは、5’-CCTTGGCACCCGAGAATTCCACCACAATGA30-3’(配列番号3)であった。ここで、第一バーコード核酸Aの末端に付加されたA30は30残基からなるポリアデニン(poly(A30))である。第一バーコード核酸Aの終濃度は250nMとした。また、インキュベーションは、室温で5分間実施した。
次に、チューブ1に予め遠心して集めておいた細胞を添加し、インキュベートした。この際に用いられた細胞はTHP1細胞であり、細胞濃度は1X107cell/mLとした。インキュベーションは、室温で5分間実施した。
一方で、チューブ2内において、第一バーコード核酸A(8塩基)を含むオリゴヌクレオチドに代えて第一バーコード核酸B(8塩基)を含むオリゴヌクレオチドを用いる以外チューブ1と同様の手法および条件により、細胞を第一バーコード核酸Bで標識した。第一バーコード核酸B(8塩基)を含むオリゴヌクレオチドは、5’-CCTTGGCACCCGAGAATTCCATGAGACCTA30-3’(配列番号4)であった。
例2:コンパートメント(チューブ)内での被験物質、第一バーコード核酸および細胞の紐付け
チューブ1およびチューブ2においてそれぞれ、10%FBSと50uM 2-メルカプトエタノールを添加したRPMl-1640培地に細胞を再懸濁した。次に、チューブ1に対してのみ、ジメチルスルホキシド(DMSO)に懸濁したLipopolysaccharide(LPS)を薬剤として、最終濃度2ug/mLで添加した。チューブ2には、薬剤の溶剤であるDMSOのみを添加した。次に、チューブ1およびチューブ2をそれぞれ、37度、CO2下で、2時間のインキュベーションを行った。ここまでの実験により、薬剤LPSあり、薬剤なし、という薬剤条件を、各細胞に対して、第一バーコード核酸種類Aと第一バーコード核酸種類Bに対応させ、関連付けした。
チューブ1およびチューブ2においてそれぞれ、10%FBSと50uM 2-メルカプトエタノールを添加したRPMl-1640培地に細胞を再懸濁した。次に、チューブ1に対してのみ、ジメチルスルホキシド(DMSO)に懸濁したLipopolysaccharide(LPS)を薬剤として、最終濃度2ug/mLで添加した。チューブ2には、薬剤の溶剤であるDMSOのみを添加した。次に、チューブ1およびチューブ2をそれぞれ、37度、CO2下で、2時間のインキュベーションを行った。ここまでの実験により、薬剤LPSあり、薬剤なし、という薬剤条件を、各細胞に対して、第一バーコード核酸種類Aと第一バーコード核酸種類Bに対応させ、関連付けした。
なお、例2の方法では、10% FBSと50uM 2-メルカプトエタノールを添加したRPMl-1640 培地に再懸濁し培養することで、長時間インキュベーション時に細胞に付加したバーコード核酸が抜け落ちる問題を回避できることを併せて確認された。
具体的には、まず緑色の蛍光色素FAMを付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)で標識された細胞と赤色蛍光色素(Cy5)を付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)で標識された細胞を別々に準備し、これらをPBS溶液中で混合して1時間インキュベーションした。このインキュベーション後の混合細胞サンプルを、蛍光顕微鏡を用いて、緑色蛍光(図5のA)と赤色蛍光(図5のB)のそれぞれのチャンネルを観察したところ、多くの細胞が緑・赤の両方で光っていた。すなわち、既出の手法であるPBS溶液中での長時間培養では、バーコード核酸の抜け落ちが生じ、2種類のバーコード核酸が混じり合っていた。
具体的には、まず緑色の蛍光色素FAMを付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)で標識された細胞と赤色蛍光色素(Cy5)を付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)で標識された細胞を別々に準備し、これらをPBS溶液中で混合して1時間インキュベーションした。このインキュベーション後の混合細胞サンプルを、蛍光顕微鏡を用いて、緑色蛍光(図5のA)と赤色蛍光(図5のB)のそれぞれのチャンネルを観察したところ、多くの細胞が緑・赤の両方で光っていた。すなわち、既出の手法であるPBS溶液中での長時間培養では、バーコード核酸の抜け落ちが生じ、2種類のバーコード核酸が混じり合っていた。
次に、同様にして、緑色の蛍光色素FAMを付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)で標識された細胞と赤色蛍光色素(Cy5)を付加したオリゴヌクレオチド(第一バーコード核酸の部分配列に相当する配列を持つ)で標識された細胞を別々に準備し、これらを10%FPSと50uM 2-メルカプトエタノールを添加したRPMI-1640培地中に混合し、1時間インキュベーションを行った。このインキュベーション後の混合細胞サンプルを、蛍光顕微鏡を用いて、緑色蛍光(図5のC)と赤色蛍光(図2のD)のそれぞれのチャンネルを観察したところ、バーコードの抜け落ちはなく、2種類のバーコード核酸が混じり合う問題は解決されたことが確認された。
また、上記細胞に付加したバーコード核酸は、付加後1時間程度では細胞膜表面に付着したままで、その後、バーコード核酸を付加した細胞を経時観察(1時間、2時間、3時間、6時間後)した。その結果、図6に示される通り、一部は細胞内に取り込まれるが、細胞はバーコード核酸を保持したままであった。また細胞を10% FBSと50uM 2-メルカプトエタノールを添加したRPMl-1640培地で培養することにより、バーコード核酸を付加した細胞の死滅を防ぐことができたことを確認した。
例3:被験物質に応答した細胞の固定・タンパク質標識・染色の実験
次に、チューブ1およびチューブ2からそれぞれ一部の細胞を採取した。得られた細胞をPBSに懸濁した4%ホルマリン溶液で室温15分間または1mg/mLのDithiobis sulfosuccinimidylpropionatedisodiumsalt(DTSSP)(DOJINDO社製)で室温30分間インキュベーションして固定した後、氷冷したメタノールで5分間処理した。固定処理された細胞を、PBS溶液中に置換した。その後、NFkBタンパク質に対する1次抗体(NFkB p65(D14E12),CST社製)を用いて免疫抗体染色を行った。1次抗体は100倍希釈で用い、反応溶液は1%BSA入りのPBSで4度、16~20時間処理した。次に、蛍光色素付きの2次抗体(Alexa Fluor 488)と反応した。2次抗体は200倍希釈で用い、反応溶液は1%BSA入りのPBSを用いて室温、1時間処理した。
次に、チューブ1およびチューブ2からそれぞれ一部の細胞を採取した。得られた細胞をPBSに懸濁した4%ホルマリン溶液で室温15分間または1mg/mLのDithiobis sulfosuccinimidylpropionatedisodiumsalt(DTSSP)(DOJINDO社製)で室温30分間インキュベーションして固定した後、氷冷したメタノールで5分間処理した。固定処理された細胞を、PBS溶液中に置換した。その後、NFkBタンパク質に対する1次抗体(NFkB p65(D14E12),CST社製)を用いて免疫抗体染色を行った。1次抗体は100倍希釈で用い、反応溶液は1%BSA入りのPBSで4度、16~20時間処理した。次に、蛍光色素付きの2次抗体(Alexa Fluor 488)と反応した。2次抗体は200倍希釈で用い、反応溶液は1%BSA入りのPBSを用いて室温、1時間処理した。
蛍光顕微鏡を用いて確認したところ、図7に示される通り、薬剤の溶剤であるDMSOのみを添加したチューブ2の細胞では、NFkBタンパク質のほとんどが細胞質に局在しているのに対して、LPS薬剤を添加したチューブ1の細胞では、NFkBタンパク質のほとんどが核に局在していた。
次に、チューブ1から一部の細胞を採取しFixable Far Redで染色して染色細胞を得、この染色細胞と、Fixable Far Redでは非染色であるチューブ2の一部の細胞とを細胞濃度が1:1になるように混合して混合細胞溶液Aを得た。
また、ネガティブコントロールとして、薬剤の溶剤であるDMSOのみをチューブ2より一部の細胞を採取し、細胞溶液Bを得た。
また、イメージセルソーターの教師データ用に、混合細胞溶液Aの一部を用意した。
例4:イメージセルソーターにより、被験物質への応答を細胞イメージ表現型に基づいて選別した実験
イメージセルソーターを用いて、LPS薬剤添加に応じて観察される細胞イメージ表現型であるNFkBタンパク質の核移行に基づき、混合細胞溶液から細胞を選別し回収した。なお、本実験で用いたイメージセルソーターは、Science, 15 Jun 2018: Vol. 360, Issue 6394, pp. 1246-1251に記載されたものを使用した。
イメージセルソーターを用いて、LPS薬剤添加に応じて観察される細胞イメージ表現型であるNFkBタンパク質の核移行に基づき、混合細胞溶液から細胞を選別し回収した。なお、本実験で用いたイメージセルソーターは、Science, 15 Jun 2018: Vol. 360, Issue 6394, pp. 1246-1251に記載されたものを使用した。
まず、選別回収する細胞イメージ表現型であるNFkBタンパク質が核移行した細胞を判別する機械学習モデルを開発した。具体的には、チューブ1の細胞とチューブ2の細胞(チューブ1の細胞のみFixable Far Red で染色されている)とを既知の比率で混合した学習用の混合細胞溶液Aの一部を用いて、教師あり機械学習モデル(SVM: Support Vector Machine)を生成した。学習の教師データとして、混合細胞溶液Aの一部をイメージセルソーターに導入して、取得したNFkBタンパク質を標識したAlexa Fluor 488由来のイメージ信号をとFixable Far Redのラベルを元にした正解データを教師データとして学習させることによりNFkBタンパク質の核移行を予測する判別モデルを生成した。
次に、LPS薬剤を添加した細胞と薬剤非添加細胞が、細胞濃度1:1になるように混合されている細胞溶液Aから、LPS薬剤を添加した細胞の細胞イメージ表現型であるNFkBタンパク質の核移行に基づき、イメージセルソーターを用いて選別し、NFkBタンパク質が核移行した細胞を回収した。回収率は、細胞全体の9割以上であった。
4%ホルマリン固定後にタンパク質標識を行ったサンプルにおいては、イメージ信号データよりNFkBタンパク質の核移行を予測し、Fixable Far Red由来のラベル信号を元に正解付したところ、acc(Accuracy)で0.95,roc-auc(Area under the Receiver Operating Characteristc Curve)で0.997、の判別精度が得られた。さらに、イメージ信号データに基づくソーティング後に、フローサイトメトリーによりFixable Far Red由来のラベル信号を元にPurityを計測・定量したところ、図8に示される通りであった。ソート後回収サンプルに薬剤添加細胞が含まれる割合(positive purity)0.995が得られた。
なお、DTSSP固定後にタンパク質標識を行ったサンプルにおいては、イメージ信号データよりNFkBタンパク質の核移行を予測し、Fixable Far Red由来のラベル信号を元に正解付したところ、図9に示される通りであった。DTSSP 1mgの固定条件においては、acc(Accuracy)で0.87, roc-aucで0.91の判別精度が得られた。DTSSP 10mgの固定条件においては、acc(Accuracy)で0.90、roc-aucで0.96の判別精度が得られた。
以上の結果から、従来手法において、イメージ表現型に基づいた細胞分取には時間はコストが大きくかかっていたが、本手法においては、イメージセルソーターを用いて、イメージ表現型に基づいて細胞が迅速に分取できることが判る。
例5:イメージセルソーターで選別・回収した細胞の被験物質と細胞表現型の情報紐付け確認実験
イメージセルソーターで選別・回収した細胞(positive purity: 0.995)ならびにコントロール混合細胞(LPS薬剤ありと薬剤なしの比が1:1)より、細胞約4800個を含む溶液をそれぞれ分注し、1細胞解析を行った。細胞ごとに修飾しているDNAバーコードの読み出しには、液滴技術を用いた1細胞解析技術である10xGenomics社製 Chromium コントローラー装置と10xGenomics社製の単一細胞3’試薬キットv3を用いた。
イメージセルソーターで選別・回収した細胞(positive purity: 0.995)ならびにコントロール混合細胞(LPS薬剤ありと薬剤なしの比が1:1)より、細胞約4800個を含む溶液をそれぞれ分注し、1細胞解析を行った。細胞ごとに修飾しているDNAバーコードの読み出しには、液滴技術を用いた1細胞解析技術である10xGenomics社製 Chromium コントローラー装置と10xGenomics社製の単一細胞3’試薬キットv3を用いた。
図10は、試薬キットに含まれる試薬の模式図である。当該技術は、マイクロ流路中に大量の液滴を作製し、それぞれの液滴中に、液滴ごとに異なる第二バーコード核酸連結ビーズと1細胞を確率的に1:1で混合するものである。第二ビーズには、複数の第二バーコード核酸がリンカーを介して連結している。さらに、当該第二ビーズに連結した複数の第二バーコード核酸は各々、液滴に含まれる細胞が同じであれば互いに共通する第二共通バーコード領域(16塩基)と、個々の液滴毎に互いに峻別しうる第二固有バーコード領域(12塩基)と、細胞のゲノム由来の核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含んでいる。
具体的には、まず各液滴の中で、第二固有バーコード領域の末端に付加された第二ハイブリダイズpoly(dT)配列と、細胞表面付加した第一バーコード核酸のpoly(A)末端を結合させた。さらに、逆転写酵素を用いた逆転写反応などを行い、第一バーコード用のプライマー5’-CTTGGCACCCGAGAATTCC-3’(配列番号5)と、10xGenomics社製の単一細胞3’試薬キット v3に含まれる相補鎖DNAプライマーを用いて、第二バーコード核酸配列が付加された第一バーコード核酸の相補鎖DNAを生成した。
その後、生成した1つ1つの液滴を混合した状態で液滴を破壊し、それぞれの液滴から抽出された第二固有バーコードの相補鎖DNA群をPCRリアクションにより増幅させ、インビトロジェン社のQubit FluorometerでDNA濃度を測定したところ、イメージソート回収細胞溶液は23.4ng/ul、コントロール細胞溶液は30.4ng/ulであった。
次に、図11に示されるように、1細胞ごとに異なる第二バーコード核酸配列が付加された第一バーコード核酸の次世代シーケンスライブラリをPCRリアクションにより作成した。用いたプライマーは、Read1側(Universal I5プライマー)5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(配列番号6)と、Read2側(TruSeq RPIプライマー)イメージソート回収細胞溶液には5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’(配列番号7)、コントロール細胞溶液には、5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’(配列番号8)である。得られた次世代シーケンスライブラリは、アジレント社のD5000スクリーンテープを用いて、DNAサイズと濃度を測定し、ライブラリの品質確認を行った。
次世代シーケンシングには、イルミナ社のMiSeq試薬キットv3を用いて、P5とP7のシーケンスライブラリを生成し、イルミナ社のMiSeq次世代シーケンサーを使用した。得られたシーケンスデータは、テキストベースのFASTQファイルとしてRead1側とRead2側それぞれ読み出し、Python3 およびDropseqTools、UMIToolsを用いて解析した。
その結果、イメージソート回収細胞については、第二共通バーコード領域配列(16塩基)と第二固有バーコード領域(12塩基)のリード総数は、19,912,682であった。さらに第二共通バーコード領域配列(16塩基)と第二固有バーコード領域(12塩基)と対応できた第一バーコード核酸配列数が、16,354,670であった。そのうち、薬剤LPSありと対応する第一バーコード核酸Aのリード数が第一バーコード核酸リード数全体の85.1%、薬剤なしと対応する第一バーコード核酸Bのリード数が0.8%であった。
コントロール混合細胞(LPS薬剤ありと薬剤なしの比が1:1)については、第二共通バーコード領域(16塩基)と第二固有バーコード領域(12塩基)のリード総数は、10,795,154であり、第二共通バーコード領域(16塩基)と第二固有バーコード(12塩基)と対応できた第一バーコード核酸配列数が、7,587,061であった。そのうち、薬剤LPSありと対応する第一バーコード核酸Aのリード数が第一バーコード核酸リード数全体の51.3%、薬剤なしと対応する第一バーコード核酸Bのリード数が35.6%であった。
これら一連の実験により、イメージセルソーターを用いて、被験物質に対応する核酸バーコードの付着した細胞を被験物質に応じて観察される細胞イメージ表現型に基づき選別し、付着した核酸バーコード配列を読むことにより、被験物質の細胞表現型スクリーニングを行うことができることが確認された。
例6:混合細胞の被験物質と細胞表現型の情報と、遺伝子発現情報の紐付け確認実験
上記固定・標識・染色固定条件により用意された、イメージセルソーターで選別・回収した細胞混合サンプルを模して混合されたサンプル(LPS薬剤あり細胞と薬剤なしの細胞比が9:1)(positive purity:0.9)より、細胞約4800個を含む溶液を分注し、1細胞解析を行った。細胞ごとに修飾しているDNAバーコードおよび細胞由来の遺伝子情報の読み出しには、例5と同じく液滴技術を用いた1細胞解析技術である10xGenomics社製 Chromium コントローラー装置と10xGenomics社製の単一細胞3’試薬キットv3を用いた。
上記固定・標識・染色固定条件により用意された、イメージセルソーターで選別・回収した細胞混合サンプルを模して混合されたサンプル(LPS薬剤あり細胞と薬剤なしの細胞比が9:1)(positive purity:0.9)より、細胞約4800個を含む溶液を分注し、1細胞解析を行った。細胞ごとに修飾しているDNAバーコードおよび細胞由来の遺伝子情報の読み出しには、例5と同じく液滴技術を用いた1細胞解析技術である10xGenomics社製 Chromium コントローラー装置と10xGenomics社製の単一細胞3’試薬キットv3を用いた。
まず各液滴の中で、第二固有バーコード領域の末端に付加された第二ハイブリダイズpoly(dT)配列と、細胞表面付加した第一バーコード核酸のpoly(A)末端を結合させた。さらに、逆転写酵素を用いた逆転写反応などを行い、第一バーコード核酸用のプライマー5’CTTGGCACCCGAGAATTCC-3’(配列番号5)と、10xGenomics社製の単一細胞3’試薬キットv3に含まれる相補鎖DNAプライマーを用いて、第二バーコード核酸配列が付加された第一バーコード核酸の相補鎖DNAを生成した。
また、第二固有バーコードの相補鎖DNAを生成するのと同時に、1細胞ごとの内在cDNAについて、第二固有バーコード領域の末端に付加された第二ハイブリダイズpoly(dT)配列と、細胞由来のmRNAのpoly(A)末端を結合させた。さらに、逆転写酵素を用いた逆転写反応などを行い、10xGenomics社製の単一細胞3’試薬キットv3に含まれる相補鎖DNAプライマーを用いて、細胞由来の相補鎖DNAを生成した。
その後、生成した1つ1つの液滴を混合した状態で液滴を破壊し、それぞれの液滴から抽出された第二バーコード核酸配列が付加された第一バーコード核酸の相補鎖DNAならびに細胞由来の相補鎖DNA群をそれぞれPCRリアクションにより増幅させ、インビトロジェン社のQubit FluorometerでDNA濃度を測定したところ、イメージソート後回収細胞のバーコード相補鎖DNAは57.8ng/ul、細胞由来の相補鎖DNAは0.676ng/ulであった。
同様の手法により、LPS薬剤刺激なしのネガティブコントロール細胞についてもバーコード相補鎖DNAと細胞由来の相補鎖DNAをそれぞれ回収し、インビトロジェン社のQubit FluorometerでDNA濃度を測定したところ、バーコード相補鎖DNAは45.6ng/ul、細胞由来の相補鎖DNAは0.658ng/ulであった。
次に、1細胞ごとに異なる第二バーコード核酸配列が付加された第一バーコード核酸および細胞由来の相補鎖DNAの次世代シーケンスライブラリをPCRリアクションにより作成した。用いたプライマーは、Read1側(Universal I5プライマー)5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(配列番号6)と、Read2側(TruSeq RPIプライマー)ネガティブコントロール細胞には5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’(配列番号7)、Read2側イメージソート後回収細胞には、5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’(配列番号8)である。
得られた次世代シーケンスライブラリは、アジレント社のD5000スクリーンテープとqPCR反応を用いて、DNAサイズと濃度を測定し、ライブラリの品質確認を行った。
次世代シーケンシングには、イルミナ社のMiSeq試薬キットv3 を用いて、P5とP7のシーケンスライブラリを生成し、イルミナ社のMiSeq次世代シーケンサーを使用した。得られたシーケンスデータは、テキストベースのFASTQファイルとしてRead1側とRead2側それぞれ読み出し、Python3 およびDropseqTools、UMIToolsを用いて解析した。
その結果、混合サンプル細胞(LPS薬剤あり細胞と薬剤なしの細胞比が9:1)の第二共通バーコード領域配列(16塩基)と第二固有バーコード領域(12塩基)のリード総数は、251,958であった。さらに第二共通バーコード領域配列(16塩基)および第二固有バーコード領域(12塩基)と共にリードされることにより対応付けされた第一バーコード核酸配列数は、249,793であった。そのうち、薬剤LPSありと対応する第一バーコード核酸Aのリード数が第一バーコード核酸リード数全体の86.8%、薬剤なしと対応する第一バーコード核酸Bのリード数が3.1%であった。さらに、読み出しエラー補正したのち、第一バーコード核酸配列Aまたは第一バーコード核酸配列Bに対応してリードされた第二共通バーコード領域配列のリード数の中で、リード数が多い第二共通バーコード領域配列を順に並べた上位の一覧を同時にリードされた第一バーコード核酸配列Aまたは第一バーコード核酸配列Bのリード数と共に示す(図12Aの表1-1、図12Aの表1-2)。また、相補鎖DNAの第二固有バーコード領域配列594のうち、第一バーコード配列ライブラリに同一の第二固有バーコード領域配列が見出されたのは550であり、第二固有バーコード領域配列が見いだされた第一核酸バーコード配列ライブラリのほとんど(92.6%)の第一バーコード核酸配列が第一バーコード核酸Aに帰属した(図13、グラフ1)。
LPS薬剤なしネガティブコントロール細胞の第二共通バーコード領域配列(16塩基)と第二固有バーコード領域(12塩基)のリード総数は、185,858であった。さらに第二共通バーコード領域配列(16塩基)と第二固有バーコード領域(12塩基)と対応できた第一バーコード核酸配列数が、184,181であった。そのうち、薬剤LPSありと対応する第一バーコード核酸Aのリード数が第一バーコード核酸リード数全体の0%、薬剤なしと対応する第一バーコード核酸Bのリード数が83.3%であった。さらに、読み出しエラー補正したのち、第二固有バーコード領域を、第一バーコード核酸配列Aと第一バーコード核酸配列Bそれぞれと一致した第二共通バーコード領域配列の合計リード数の多い順に並べた上位の一覧を(図14Aの表2-1、図14Bの表2-2)に示す。また、相補鎖DNAの第二固有バーコード領域配列197のうち、第一バーコード配列ライブラリに同一の第二固有バーコード領域配列が見出されたのは172であり、ほぼ全て(>99%)の第一バーコード核酸配列が第一バーコード核酸Bに帰属された(図15、グラフ2)。
例7:コンパートメント(液滴)内での細胞表現型スクリーニング方法
コンパートメント(液滴)内に、細胞と、被験物質と、被験物質に対応する第一バーコード核酸を包含し接触させることによる被験物質の細胞表現型スクリーニングについては、例えば、以下の方法により実施できる。
7-1
被験物質と被験物質に対応する第一バーコード核酸を包含する第一サブコンパートメントはAnal.Chem.,2018,90,16,9813-9820の記載に準じて、以下の手順により生成することができる。具体的には、FBSを含まないOpti-MEM培地を用い、被験物質を水相に溶解する。次に、ウェル内あるいはチューブ内で水相と、事前にマイクロ流体デバイスなどを用いて作製したハイドロゲル粒子(例えば直径約70μmのサイズのアガロース1.1wt%濃度のゲルビーズ)と、被験物質に対応する第一バーコード核酸、アンカーCMO、共アンカーCMOとを混合する。次に、ウェルに有機溶媒および界面活性剤(例えばTriton―100)を追加してボルテックスにより振とう撹拌処理することにより、第一サブコンパートメントとして、被験物質と被験物質に対応する第一バーコード核酸を含む液滴を得ることができる。図16の顕微鏡写真は被験物質および第一バーコード核酸を添加せずに調製された第一サブコンパートメントの顕微鏡写真であるが、被験物質と被験物質に対応する第一バーコード核酸を含む場合も同様に、おおよそ直径約70μmのサイズの液滴が調製される。この処理により、第一サブコンパートメント内で被験物質と第一バーコード核酸とを関連付けられる。
なお、ここで有機溶媒としては、例えば、Droplet Generator oil for EvaGreen(BioRad社製)が用いられる。Droplet Generator oil for EvaGreenは、酸素の透過性を有し、細胞の液滴内培養に適している。実際、この有機溶媒とFBSを含まないOpti-MEM培地で生成した液滴内で、細胞(THP1細胞)を24時間培養した結果、生存率は88%であった。
コンパートメント(液滴)内に、細胞と、被験物質と、被験物質に対応する第一バーコード核酸を包含し接触させることによる被験物質の細胞表現型スクリーニングについては、例えば、以下の方法により実施できる。
7-1
被験物質と被験物質に対応する第一バーコード核酸を包含する第一サブコンパートメントはAnal.Chem.,2018,90,16,9813-9820の記載に準じて、以下の手順により生成することができる。具体的には、FBSを含まないOpti-MEM培地を用い、被験物質を水相に溶解する。次に、ウェル内あるいはチューブ内で水相と、事前にマイクロ流体デバイスなどを用いて作製したハイドロゲル粒子(例えば直径約70μmのサイズのアガロース1.1wt%濃度のゲルビーズ)と、被験物質に対応する第一バーコード核酸、アンカーCMO、共アンカーCMOとを混合する。次に、ウェルに有機溶媒および界面活性剤(例えばTriton―100)を追加してボルテックスにより振とう撹拌処理することにより、第一サブコンパートメントとして、被験物質と被験物質に対応する第一バーコード核酸を含む液滴を得ることができる。図16の顕微鏡写真は被験物質および第一バーコード核酸を添加せずに調製された第一サブコンパートメントの顕微鏡写真であるが、被験物質と被験物質に対応する第一バーコード核酸を含む場合も同様に、おおよそ直径約70μmのサイズの液滴が調製される。この処理により、第一サブコンパートメント内で被験物質と第一バーコード核酸とを関連付けられる。
なお、ここで有機溶媒としては、例えば、Droplet Generator oil for EvaGreen(BioRad社製)が用いられる。Droplet Generator oil for EvaGreenは、酸素の透過性を有し、細胞の液滴内培養に適している。実際、この有機溶媒とFBSを含まないOpti-MEM培地で生成した液滴内で、細胞(THP1細胞)を24時間培養した結果、生存率は88%であった。
7-2
次に、FBSを含まないOpti-MEM培地に懸濁した細胞(THP1細胞)を用意する。細胞懸濁液は有機溶媒と共にマイクロ流体デバイスに流し込まれ、マイクロ流体デバイス通過中に、細胞入りの第二サブコンパートメントが作製される。細胞懸濁液と有機溶媒それぞれの流速をコントロールし、細胞入りの第二サブコンパートメントのサイズを約100μmに調整する。さらにマイクロ流体デバイス中で、第一サブコンパートメントと第二サブコンパートメントを、350V―500Vの電圧をかけマージさせることにより、被験物質、細胞、第一バーコード核酸を同時に内包する液滴(コンパートメント)を生成する。即ち、マイクロ流体デバイスにおいて、被験物質と被験物質に対応する第一バーコード核酸を含む液滴群(第一サブコンパートメント)を片方のチャネルから、細胞懸濁液を他方のチャネルから、それぞれ有機溶媒と共に流し込むことで、最終的に被験物質、細胞、第一バーコード核酸を同時に内包する液滴(コンパートメント)が生成される。液滴の生成には、例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)の記載に準じて、フローフォーカシングデバイスを用いることができる。
次に、FBSを含まないOpti-MEM培地に懸濁した細胞(THP1細胞)を用意する。細胞懸濁液は有機溶媒と共にマイクロ流体デバイスに流し込まれ、マイクロ流体デバイス通過中に、細胞入りの第二サブコンパートメントが作製される。細胞懸濁液と有機溶媒それぞれの流速をコントロールし、細胞入りの第二サブコンパートメントのサイズを約100μmに調整する。さらにマイクロ流体デバイス中で、第一サブコンパートメントと第二サブコンパートメントを、350V―500Vの電圧をかけマージさせることにより、被験物質、細胞、第一バーコード核酸を同時に内包する液滴(コンパートメント)を生成する。即ち、マイクロ流体デバイスにおいて、被験物質と被験物質に対応する第一バーコード核酸を含む液滴群(第一サブコンパートメント)を片方のチャネルから、細胞懸濁液を他方のチャネルから、それぞれ有機溶媒と共に流し込むことで、最終的に被験物質、細胞、第一バーコード核酸を同時に内包する液滴(コンパートメント)が生成される。液滴の生成には、例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)の記載に準じて、フローフォーカシングデバイスを用いることができる。
一方、第一サブコンパートメントをゲルビーズとのボルテックスによる振とう撹拌処理を用いて作製せず、事前にマイクロ流体デバイスを用いて第一サブコンパートメントを作製し、細胞を含む第二サブコンパートメントとマージすることで液滴(コンパートメント)を生成することもできる。より具体的には、Anal. Chem. 2018, 90, 2, 1273-1279に記載の方法に準じて、マイクロ流体デバイスにおいて、被験物質と被験物質に対応する第一バーコード核酸を含む液滴群(第一サブコンパートメント)を片方のチャネルから、細胞懸濁液を他方のチャネルから、それぞれ有機溶媒と共に流し込むことで被験物質、細胞、第一バーコード核酸を同時に内包する液滴(コンパートメント)を生成することができる。例えば、第一バーコード核酸を含む液滴群(第一サブコンパートメント、直径約70μmのサイズ)の液滴と、細胞入りの第二サブコンパートメント(直径約100μmのサイズ)を逐次、1液滴対1液滴の融合をマイクロ流体デバイス中で実施した結果、図17の顕微鏡写真に示される通り、均一系の液滴(コンパートメント)(直径約110μm)が安定に生成することが確認された。
7-3
上記有機溶媒相中の液滴(コンパートメント)の中においては、細胞に対して被験物質を作用させる一方で、細胞表面に被験物質に対応する第一バーコード核酸を付着させ、細胞を第一バーコード核酸で標識することができる。
上記有機溶媒相中の液滴(コンパートメント)の中においては、細胞に対して被験物質を作用させる一方で、細胞表面に被験物質に対応する第一バーコード核酸を付着させ、細胞を第一バーコード核酸で標識することができる。
7-4
次に、コンパートメント(液滴)からの細胞の回収を、以下のプロセスにより行うことができる。液滴(被験物質を作用させかつ第一バーコード核酸で標識した細胞を含むコンパートメント)100μLをマイクロチップ等を用いて取り出し、下層に500μLのフッ素系溶剤(例えばハイドロフルオロエーテル(HFE)、Novec(商標)7200高機能性液体(3M JAPAN製))が入ったマイクロチューブに移し変える。この混合物に、さらに別の有機溶媒(例えばパーフルオロ-n-オクタノール)300μLを添加し、マイクロチューブを10秒激しく振ったのち静置することで液滴を破砕し、第一バーコード核酸で標識された細胞を含む水相と、有機溶媒相の二層に分離し、水相から、第一バーコード核酸で標識された細胞を回収し、細胞混合溶液を調製することができる。
次に、コンパートメント(液滴)からの細胞の回収を、以下のプロセスにより行うことができる。液滴(被験物質を作用させかつ第一バーコード核酸で標識した細胞を含むコンパートメント)100μLをマイクロチップ等を用いて取り出し、下層に500μLのフッ素系溶剤(例えばハイドロフルオロエーテル(HFE)、Novec(商標)7200高機能性液体(3M JAPAN製))が入ったマイクロチューブに移し変える。この混合物に、さらに別の有機溶媒(例えばパーフルオロ-n-オクタノール)300μLを添加し、マイクロチューブを10秒激しく振ったのち静置することで液滴を破砕し、第一バーコード核酸で標識された細胞を含む水相と、有機溶媒相の二層に分離し、水相から、第一バーコード核酸で標識された細胞を回収し、細胞混合溶液を調製することができる。
コンパートメント(液滴)からの細胞の回収には、有機溶媒用いる方法の他に、静電気除去銃(例えばZerostat3)を用いて液滴を破砕することもできる。液滴(被験物質を作用させかつ第一バーコード核酸Aで標識した細胞を含むコンパートメント)100μLをマイクロチップ等を用いて取り出し、下層に100μLのフッ素系溶剤(例えばハイドロフルオロエーテル(HFE)、Novec(商標)7200高機能性液体(3M JAPAN製))が入ったマイクロチューブに移し変えた。このマイクロチューブに対して、静電気除去銃のトリガーを10回程度引き戻しすることで液滴を破砕することができる。水相から、第一バーコード核酸Aで標識された細胞を回収し、細胞混合溶液を調製する。静電気除去銃を用いて液滴を破砕する方法については、例えば、Biomicrofluidics.22(4):044107、2017に記載の方法に準じておこなうことができる。
7-5
次に、イメージセルソーターを用いて、被験物質添加に応じて観察される細胞イメージ表現型(例えば刺激や薬剤処理に応答したタンパク質の核移行)に基づき、細胞混合溶液から細胞を選別回収する。被験物質に応答し細胞イメージ表現型に変化を生じた細胞をイメージセルソーターにより選別する方法は、具体的には、例えば例4と同様の方法により行うことができる。
次に、イメージセルソーターを用いて、被験物質添加に応じて観察される細胞イメージ表現型(例えば刺激や薬剤処理に応答したタンパク質の核移行)に基づき、細胞混合溶液から細胞を選別回収する。被験物質に応答し細胞イメージ表現型に変化を生じた細胞をイメージセルソーターにより選別する方法は、具体的には、例えば例4と同様の方法により行うことができる。
7-6
次に、例6と同様、イメージセルソーターで選別・回収した細胞混合溶液について、1細胞解析を行ない、イメージセルソーターで選別・回収した細胞の被験物質と細胞表現型の情報紐付けを行う。細胞ごとに修飾しているDNAバーコードおよび細胞由来の遺伝子情報の読み出しには、例5と同じく液滴技術を用いた1細胞解析技術である10xGenomics社製 Chromium コントローラー装置と10xGenomics社製の単一細胞3’試薬キットv3を用いることができる。また、回収した細胞の遺伝子発現情報についても、同様の試薬キットを用いて行うことができる。
次に、例6と同様、イメージセルソーターで選別・回収した細胞混合溶液について、1細胞解析を行ない、イメージセルソーターで選別・回収した細胞の被験物質と細胞表現型の情報紐付けを行う。細胞ごとに修飾しているDNAバーコードおよび細胞由来の遺伝子情報の読み出しには、例5と同じく液滴技術を用いた1細胞解析技術である10xGenomics社製 Chromium コントローラー装置と10xGenomics社製の単一細胞3’試薬キットv3を用いることができる。また、回収した細胞の遺伝子発現情報についても、同様の試薬キットを用いて行うことができる。
例8:96穴マイクロプレートを用いた細胞表現型スクリーニング方法
図18に記載の模式図に準じて、目的の表現型変化を起こす被験対象(図18の例ではLPSにより誘導されるNF-κBの核移行を阻害する被験物質)を探索した。
具体的には、96穴マイクロプレートの各ウェル内において、参考例1に記載の方法に準じて、第一バーコード核酸を細胞(THP1細胞)に付着させ、さらに被験物質と接触させた。その際、各ウェルにおける被験物質の種類および濃度と、第一バーコード核酸はそれぞれ異なる種類のものを使用した。これにより、96種類の被験対象(24種類の被験物質×4種類の濃度)と、細胞(THP1細胞)に付着した96種類の第一バーコード核酸とが関連付けされた。
図18に記載の模式図に準じて、目的の表現型変化を起こす被験対象(図18の例ではLPSにより誘導されるNF-κBの核移行を阻害する被験物質)を探索した。
具体的には、96穴マイクロプレートの各ウェル内において、参考例1に記載の方法に準じて、第一バーコード核酸を細胞(THP1細胞)に付着させ、さらに被験物質と接触させた。その際、各ウェルにおける被験物質の種類および濃度と、第一バーコード核酸はそれぞれ異なる種類のものを使用した。これにより、96種類の被験対象(24種類の被験物質×4種類の濃度)と、細胞(THP1細胞)に付着した96種類の第一バーコード核酸とが関連付けされた。
本実験に使用した96種類の被験対象(24種類の被験物質×4種類の濃度)および被験物質の機能(既知の作用メカニズム)は、図19に示される通りであった。また、本実験に使用した第一バーコード核酸(Barcorde#)の配列は、図20A~20Cに示される通りであった。使用した第一バーコード核酸の配列は被験対象ごとに個別に異なっており、第一バーコード核酸は被験対象と対応づけられている。
本試験では、96穴マイクロプレートの各ウェル内において、各被験物質とその被験物質に対応する第一バーコード核酸、さらに細胞を接触させる方法により試験が実施された。
次に、イメージセルソーターを用いて、被験物質添加に応じて観察される細胞イメージ表現型(LPS刺激に応答したNF-κBタンパク質の核移行の有無)に基づき、細胞混合溶液から細胞を選別回収した。
また次に、上述の例と同様に、イメージセルソーターで選別・回収した細胞混合溶液について、1細胞解析を行った。具体的には、細胞ごとに修飾しているDNAバーコードおよび細胞由来の遺伝子情報の読み出しには、例5、例6と同じく液滴技術を用いた1細胞解析技術である10xGenomics社製 Chromium コントローラー装置と10xGenomics社製の単一細胞3’試薬キットv3を用いた。
ソートされた細胞の第一バーコード核酸配列の濃縮レベルは、図21に示される通りであった。ここで、縦軸の数値として1を超えているものはソート前のサンプルより濃縮されていることを意味する。
ポジティブコントロール(LPS(-):NF-κBが核移行していない)は、イメージソーティングにより約20倍濃縮されていた。
被験物質として既知NF-κB核移行阻害剤(TAK242:30μM)を用いた細胞群は、イメージソーティングにより約1.5倍濃縮されていた。
また、ランダムで添加した被験物質のうち、Costunolideを用いた細胞群は顕著に濃縮されていた(Constunolide:anti-inflammatory activity)。
ネガポティブコントロール(LPS(+):NF-κBが核移行している)は、ソートサンプルにほとんど含まれていなかった。
ソートされた細胞の第一バーコード核酸配列の濃縮レベルは、図21に示される通りであった。ここで、縦軸の数値として1を超えているものはソート前のサンプルより濃縮されていることを意味する。
ポジティブコントロール(LPS(-):NF-κBが核移行していない)は、イメージソーティングにより約20倍濃縮されていた。
被験物質として既知NF-κB核移行阻害剤(TAK242:30μM)を用いた細胞群は、イメージソーティングにより約1.5倍濃縮されていた。
また、ランダムで添加した被験物質のうち、Costunolideを用いた細胞群は顕著に濃縮されていた(Constunolide:anti-inflammatory activity)。
ネガポティブコントロール(LPS(+):NF-κBが核移行している)は、ソートサンプルにほとんど含まれていなかった。
図22は、イメージセルソーターで選別・回収した細胞が確かに表現型を示すかどうか確認したものである。細胞のイメージはイメージフローサイトメトリーで撮影されたものであり、また核移行スコアについてもイメージフローサイトメトリーで計算されたものを示す。核移行スコアについては、値が大きいものほど核移行度合いが高いことを示す。Aはポジティブコントロール(LPS(-):NF-κBが核移行していない)に対応する細胞、Bは被験物質としてLPSと既知NF-κB核移行阻害剤(TAK242:30μM)で処理した細胞、CはLPSと細胞表現型スクリーニングにより候補として挙げられた被験物質Costunolideで処理した細胞、Dはネガポティブコントロール(LPS(+):NF-κBが核移行している)に対応する細胞である。核移行スコアについては、ポジティブコントロール(LPS(-):NF-κBが核移行していない)に対応する細胞が1.58、被験物質としてLPSと既知NF-κB核移行阻害剤(TAK242:30μM)で処理した細胞は0.92、LPSと細胞表現型スクリーニングにより候補として挙げられた被験物質Costunolideで処理した細胞は0.23、Dはネガポティブコントロール(LPS(+):NF-κBが核移行している)に対応する細胞は0.30であった。
以上の通り、本開示によれば、イメージセルソーターを用いて、被験対象に対応する核酸バーコードの付着した細胞を被験対象に応じて観察される細胞イメージ表現型に基づき選別し、付着したバーコード核酸配列を読み、さらに各細胞の遺伝子を読むことにより、被験対象の細胞表現型スクリーニングを行うことができる。
1 光源
3 光照射領域
5 観測対象物
7 受光部
9 記憶部
11 分析部
13 光学系制御部
25 受光領域
27 受光系制御部
3 光照射領域
5 観測対象物
7 受光部
9 記憶部
11 分析部
13 光学系制御部
25 受光領域
27 受光系制御部
Claims (36)
- 被験対象と関連付けされている第一バーコード核酸で標識しかつ前記被験対象で処理した複数の細胞を準備する工程、
イメージングセルソーターを用いて、前記複数の細胞を細胞表現型に基づいて選別する工程、
前記第一バーコード核酸を指標として各細胞の処理に用いられた被験対象を同定する工程を含む、被験対象をスクリーニングする方法。 - 各細胞の処理に用いられた被験対象と、各細胞の表現型とを関連付けする、請求項1に記載の方法。
- 前記同定工程が、さらに被験対象により目的とする細胞の表現型変化を生じさせる標的部位を同定する工程を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 各細胞のゲノム関連情報を解析する工程をさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を準備する工程が、被験対象および第一バーコード核酸を含む液媒体と、細胞とを混合して、前記第一バーコード核酸と細胞とを関連付けする工程を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を準備する工程が、被験対象および第一バーコード核酸を含む液媒体にハイドロゲルビーズを添加して、被験対象および第一バーコード核酸を含む第一サブコンパートメントを生成して、被験対象と第一バーコード核酸とを関連付けする工程を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を準備する工程が、前記被験対象および第一バーコード核酸を含む第一サブコンパートメントと、細胞を含む第二サブコンパートメントとを融合し、前記被験対象、第一バーコード核酸および細胞を含むコンパートメントを生成する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を準備する工程が、前記コンパートメント中において被験対象で細胞を処理する、請求項7に記載の方法。
- 前記コンパートメントまたはサブコンパートメントが液滴である、請求項6~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を準備する工程が、前記コンパートメントから細胞を回収する工程を含む、請求項7~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選別工程が、細胞表現型に基づいて、被験対象により所定の反応が起こっている細胞を選別する工程を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノム関連情報を解析する工程が、前記細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸と、前記第一バーコード核酸と、第二バーコード核酸連結ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する工程であって、前記第二バーコード核酸連結ビーズが、細胞ゲノムまたはその由来物に対応するゲノム関連核酸あるいは前記第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸を含んでいる工程、
前記ゲノム関連核酸および前記第一バーコード核酸をそれぞれ、前記第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程、
前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する工程、および
前記増幅物の発現パターンを指標として細胞における前記被験対象の共存後のゲノム関連情報を検出する工程
を含む、請求項4~11のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ゲノム関連核酸が、前記細胞ゲノムDNA、または前記細胞ゲノムに由来するRNAもしくはそのcDNAである、請求項12に記載の方法。
- 第一バーコード核酸が各々、同一の被験対象において共通する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域とを含んでいる、請求項12または13のいずれか一項に記載の方法。
- 第一共通バーコード領域の配列情報が、被験対象を特定する指標となる、請求項12~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二バーコード核酸連結ビーズに連結した複数の第二バーコード核酸が各々、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、ゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含む、請求項12~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二固有バーコード領域の配列情報が、ゲノム関連核酸を特定する指標となる、請求項12~16のいずれか一項に記載の方法。
- 第二バーコード核酸が、PCRプライマー領域をさらに含む、請求項11~16のいずれか一項に記載の方法。
- 第二ハイブリダイズ領域が、前記第一ハイブリダイズ領域または前記ゲノム関連核酸と相補的な核酸を含む、請求項12~17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イメージングセルソーターが、光源からの光が照射される光照射領域に存在する観測対象物からの散乱光、透過光、蛍光、または電磁波を受け取り、電気信号に変換する受光部から出力される前記電気信号の時間軸に基づいて抽出される信号に基づいて前記観測対象物を分析する分析部
を備える分析装置である、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。 - 前記光源と前記光照射領域との間の光路上に、光特性が互いに異なる複数の領域を有する光変調部が配置された、請求項20に記載の方法。
- 前記分析部が分析した分析結果に基づいて,前記光源を制御する光学系制御部を更に備える、請求項20または21に記載の方法。
- 前記光源からの光が、複数の光領域を有し、前記光学系制御部は、前記光領域の光構造を制御する、請求項22に記載の方法。
- 前記分析部が、分析した結果に基づいて判別アルゴリズムが更新される、請求項20~23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光および前記光照射領域が、前記分析部が分析した結果に基づいて制御される、請求項20~24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イメージングセルソーターが、前記光照射領域を含むフローセルを含む、請求項20~25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イメージングセルソーターが、前記分析部の分析結果に基づいて,前記観測対象物を判別し,前記観測対象物を分別する分別部を有する、請求項20~26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イメージングセルソーターが、流路を移動する前記観測対象物の移動可能な流線幅を可変に制御する流線幅制御部を更に備え、
前記分析部が,前記時間軸に基づいて抽出される信号と、当該信号が取得された際の流線幅とに基づいて,前記観測対象物の状態を判別する基準を示す教師情報を機械学習によって生成する教師情報生成部と、
前記信号と前記教師情報生成部が生成する教師情報とに基づいて、前記流線を移動する前記観測対象物の状態を推定する、請求項20~27のいずれか一項に記載の方法。 - 前記流線幅制御部が、
前記観測対象物の径に応じた幅である第1の流線幅に前記流線幅を制御し、
前記教師情報生成部が、
前記流線幅制御部が制御した前記第1の流線幅において前記受光部が検出する第1の観察結果信号に基づく第1の教師情報を前記教師情報として生成し、
前記分析部が、
前記教師情報生成部が生成する前記第1の教師情報と,前記信号とに基づいて,前記流線を移動する前記観測対象物の状態を推定する、請求項28に記載の方法。 - 前記流線幅制御部が、
前記観測対象物の径に基づく幅であり,かつ,前記第1の流線幅よりも幅が広い第2の流線幅に前記流線幅を制御し、
前記教師情報生成部は更に、
前記流線幅制御部が制御した前記第2の流線幅において前記受光部が検出する第2の観察結果信号に基づく第2の教師情報を前記教師情報として生成し、
前記分析部が、
前記教師情報生成部が生成する前記第1の教師情報と、前記教師情報生成部が生成する前記第2の教師情報と,前記信号とに基づいて,前記流線を移動する前記観測対象物の状態を推定する、請求項28または29に記載の方法。 - 前記イメージングセルソーターが、
観測対象物が流される少なくとも1つの流路と、
前記流路に対して帯状の励起光を照射する光源と、
前記励起光が照射される位置を通過した前記観測対象物からの蛍光を撮像することにより、前記観測対象物のある断面を撮像する撮像部と、
前記撮像部が撮像した前記断面が撮像された複数の撮像画像に基づいて、前記観測対象物の3次元の画像を生成する3次元画像生成部と
を備える、請求項1~30のいずれか一項に記載の方法。 - 前記イメージングセルソーターが、
前記撮像部が撮像した前記断面が示す前記観測対象物の形態を示す情報に基づいて、観測対象物を分取する、請求項31に記載の方法。 - 前記流路が、並列に並べられた複数の流路であって、
前記励起光が、複数の前記流路に対して照射され、
前記撮像部が、複数の前記流路をそれぞれ流される前記観測対象物の前記断面を撮像する、請求項31または32に記載の方法。 - 前記光源と前記蛍光の強さを検出する撮像素子との間の光路上に、光特性が互いに異なる複数の領域を有する光変調部が配置され、
前記撮像部が、
前記撮像素子が検出する前記蛍光の強さと、前記光変調部の前記光特性とに基づいて、前記観測対象物の前記断面の像を、撮像画像として再構成する、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。 - 前記被験対象が被験物質を含む、請求項1~34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験対象が被験物質である、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。
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