WO2021100396A1 - 試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法 - Google Patents

試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法 Download PDF

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WO2021100396A1
WO2021100396A1 PCT/JP2020/039620 JP2020039620W WO2021100396A1 WO 2021100396 A1 WO2021100396 A1 WO 2021100396A1 JP 2020039620 W JP2020039620 W JP 2020039620W WO 2021100396 A1 WO2021100396 A1 WO 2021100396A1
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WO
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sample preparation
accommodating
observed
fixing
opening
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PCT/JP2020/039620
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昭夫 清水
大史 佐谷
Original Assignee
学校法人創価大学
株式会社ニチレイ
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
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    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation

Definitions

  • the present invention relates to a sample preparation method, a freeze pressurizer, and an observation method.
  • Non-Patent Document 1 and Patent Document 2 disclose a freezing technique for suppressing the formation of ice crystals.
  • a method for preparing a sample for observation with a scanning electron microscope (SEM) disclosed in Non-Patent Document 1 will be described with reference to FIGS. 11A to 11E.
  • 11A to 11E are diagrams showing an outline of preparation of an observation sample in the prior art.
  • a freeze-cut sample is prepared by using a flat plate type sample preparation device 50 as shown in FIG. 11A.
  • the flat plate type sample preparation device 50 in the prior art is configured to be divisible into two flat plate type accommodating members 51a and 51b.
  • the flat plate type accommodating members 51a and 51b have a recess with an open upper portion, and by connecting the two flat plate type accommodating members 51a and 51b, a sample preparation region as shown in FIG. 11A is formed.
  • FIGS. 11C to 11E show each step of the freeze-cut sample preparation method.
  • the object to be observed and water are put into the recessed portion of the flat plate type sample preparation device 50, and the recessed portion is filled with the object to be observed and water.
  • the object to be observed is arranged so that the portion to be observed is arranged at the boundary between the flat plate type accommodating members 51a and 51b.
  • the flat plate type sample preparation device 50 is cooled to freeze the object to be observed and water.
  • the method for cooling the flat plate type sample preparation device 50 include a method in which the cooled metal block is brought into contact with the flat plate type sample preparation device 50. At this time, the water in the flat plate type sample preparation device 50 is frozen from the outer portion, and further cooling proceeds while containing the unfrozen water and the object to be observed. Therefore, when water or the water content of the observed object freezes, the volume expansion is suppressed and the formation of ice crystals is suppressed.
  • the flat plate type accommodating members 51a and 51b are divided as shown in FIG. 11E. Since the portion of the recessed portion of the flat plate type accommodating member 51a and 51b that is connected to the other flat plate type accommodating member 51 is thin, the object to be observed is easily cut when the flat plate type accommodating member 51 is divided. It has a structure. The object to be observed cut in this way is vacuum-dried and then coated with osmium to become a sample for microscopic observation.
  • the present invention has been made in view of the above problems in the prior art, and an object of the present invention is to provide a sample preparation method, a freeze pressurization device, and an observation method for suppressing the formation of ice crystals.
  • An object to be observed and water are put into the space inside the sample preparation apparatus including the first member and the second member, each of which has a cavity and an opening in which one surface of the cavity is open.
  • the step of filling the space with the object to be observed and the water A step of fixing the first member and the second member while aligning the opening of the first member with the opening of the second member.
  • the step of cooling the sample preparation device and Provided is a sample preparation method including a step of separating the first member and the second member and cutting the frozen object to be observed by a step of cooling the sample preparation device.
  • the present invention it is possible to provide a sample preparation method, a freeze pressurization device, and an observation method for suppressing the formation of ice crystals.
  • FIG. 1 is a perspective view showing the structure of the sample preparation device of one embodiment.
  • FIG. 2A is a diagram showing a structure of a housing member constituting the sample preparation device of one embodiment.
  • FIG. 2B is a diagram showing a structure of a housing member constituting the sample preparation device of one embodiment.
  • FIG. 3A is a diagram showing the structure of a fixing member constituting the sample preparation apparatus of one embodiment.
  • FIG. 3B is a diagram showing the structure of a fixing member constituting the sample preparation apparatus of one embodiment.
  • FIG. 4A is a diagram illustrating the preparation of an observation sample in one embodiment.
  • FIG. 4B is a diagram illustrating the preparation of an observation sample in one embodiment.
  • FIG. 4C is a diagram illustrating the preparation of an observation sample in one embodiment.
  • FIG. 4A is a diagram illustrating the preparation of an observation sample in one embodiment.
  • FIG. 4B is a diagram illustrating the preparation of an observation sample in one embodiment.
  • FIG. 4C is a diagram
  • FIG. 5A shows an SEM image of the sample prepared in one embodiment.
  • FIG. 5B shows an SEM image of the sample prepared in one embodiment.
  • FIG. 5C shows an SEM image of a comparative example.
  • FIG. 6A is a diagram showing a first modification of the accommodating member constituting the sample preparation apparatus of one embodiment.
  • FIG. 6B is a diagram showing a first modification of the accommodating member constituting the sample preparation apparatus of one embodiment.
  • FIG. 7A is a diagram showing a second modification of the accommodating member constituting the sample preparation apparatus of one embodiment.
  • FIG. 7B is a diagram showing a second modification of the accommodating member constituting the sample preparation apparatus of one embodiment.
  • FIG. 8A is a diagram showing a third modification of the accommodating member and a modification of the fixing member constituting the sample preparation apparatus of one embodiment.
  • FIG. 8B is a diagram showing a third modification of the accommodating member and a modification of the fixing member constituting the sample preparation apparatus of one embodiment.
  • FIG. 8C is a diagram showing a third modification of the accommodating member and a modification of the fixing member constituting the sample preparation apparatus of one embodiment.
  • FIG. 9A is a diagram showing a third modification of the accommodating member and a modification of the fixing member constituting the sample preparation apparatus of one embodiment.
  • FIG. 9B is a diagram showing a third modification of the accommodating member and a modification of the fixing member constituting the sample preparation apparatus of one embodiment.
  • FIG. 10A is a cross-sectional view of a first accommodating member, a second accommodating member, and a gasket (first example).
  • FIG. 10B is a cross-sectional view of a first accommodating member, a second accommodating member, and a gasket (second example).
  • FIG. 10C is a cross-sectional view of a first accommodating member, a second accommodating member, and a gasket (third example).
  • FIG. 10D is a cross-sectional view of a first accommodating member, a second accommodating member, and a gasket (fourth example).
  • FIG. 11A is a diagram showing an outline of preparation of an observation sample in the prior art.
  • FIG. 11B is a diagram showing an outline of preparation of an observation sample in the prior art.
  • FIG. 11C is a diagram showing an outline of preparation of an observation sample in the prior art.
  • FIG. 11D is a diagram showing an outline of preparation of an observation sample in the prior art.
  • FIG. 11E is a diagram showing an outline of preparation of an observation sample in the prior art.
  • a sample for observing with a scanning electron microscope (SEM) is prepared by using a microscopic organism as an object to be observed is illustrated. It is not limited. Therefore, in addition to micro-organisms, foods, plants, cells, gel-like substances, and the like may be used as objects to be observed, and as their applications, the techniques described below may be applied in fields such as chemistry and pharmaceuticals. .. Further, the observation device may be a device other than the SEM.
  • FIG. 1 is a perspective view showing the structure of the sample preparation device 10 of the present embodiment.
  • the sample preparation device 10 of the present embodiment is composed of an accommodating portion and a fixing portion, and as shown in FIG. 1, a first accommodating member 11a and a second accommodating member 11b for accommodating an object to be observed and water, and a second accommodating member 11b It includes a fixing member 12 and a screw 13 for fixing the accommodating member 11a of 1 and the accommodating member 11b of 2.
  • the fixing screw 13 is illustrated as a hexagon socket head cap screw as an example, but the embodiment is not particularly limited.
  • the observed object and water contained in the sample preparation device 10 may be collectively referred to as “contents”.
  • FIGS. 2A to 3B are views showing the structure of the accommodating member 11 constituting the sample preparation device 10 of the present embodiment
  • FIGS. 3A and 3B are fixing members 12 constituting the sample preparation device 10 of the present embodiment. It is a figure which shows the structure of.
  • FIG. 2A shows a projection drawing of the accommodating member 11.
  • the upper part of FIG. 2A shows a top view of the accommodating member 11, and the lower part of FIG. 2A shows a cross-sectional view of the accommodating member 11 cut along the line IIA-IIA of the upper part of FIG. 2A.
  • the left view of FIG. 2B shows a perspective view of the accommodating member 11, and the right view of FIG. 2B shows a perspective view of a cross section of the accommodating member 11.
  • the accommodating member 11 has a structure including a cavity for accommodating an object to be observed and the like, and an opening formed so that one surface of the cavity is open.
  • the hollow portion of the accommodating member 11 may be provided with a recess for facilitating fixing the position of the accommodating object to be observed.
  • the sample preparation device 10 of the present embodiment by aligning the openings of the two accommodating members 11a and 11b and fixing the two accommodating members 11a and 11b, the cavities of the accommodating members 11a and 11b are connected to each other.
  • One closed space (hereinafter simply referred to as "space") for accommodating the object to be observed and water is formed. Since the inside of this space is filled with the contents and sealed, the expansion of the contents at the time of freezing is suppressed by the inner wall of the accommodating member 11, and the contents can be pressurized. Thereby, the formation of ice crystals of the observed object can be suppressed.
  • the shapes of the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b constituting the sample preparation device 10 of the present embodiment do not necessarily have to be the same, and may be configured in different shapes.
  • the size of the cavity of the accommodating member 11 is not particularly limited as long as the contents can be sufficiently frozen, but as an example, the diameter of the opening is about 8 mm and the depth is about 4 mm. Compared with the prior art disclosed in Document 2 and Non-Patent Document 1, a sample can be prepared even when a significantly larger object to be observed is used.
  • FIG. 3A shows a projection drawing of the fixing member 12. Further, FIG. 3B shows a perspective view of the fixing member 12.
  • the fixing member 12 of the present embodiment is a frame-shaped member, and is provided with a screw hole penetrating through the upper portion.
  • the sample preparation device 10 of the present embodiment accommodates two accommodating members 11a and 11b in a state where the openings are aligned in the frame of the fixing member 12, and tightens the screws using the screws 13 to accommodate each accommodating member.
  • 11a and 11b can be hermetically sealed and fixed (see FIG. 1).
  • the shape of the fixing member 12 is not limited to the frame shape as shown in FIGS. 3A and 3B. That is, the fixing member 12 may have a structure in which the two accommodating members 11a and 11b with the openings aligned are pressed from above and below by tightening the screws using the screws 13, for example, ".
  • the fixing member 12 may have a structure based on a combination of three side members such as a U-shaped structure.
  • each member constituting the sample preparation apparatus 10 according to the embodiment to be described has a simple structure, it is easy to process at the time of manufacturing and is excellent in terms of manufacturing cost.
  • the sample preparation device 10 having the structure shown in FIGS. 1 to 3B can prepare a sample in which the formation of ice crystals is suppressed.
  • the contents are pressurized by utilizing the expansion action of the contents at the time of freezing. Therefore, the damage applied to the contents (particularly the observed object) at the time of freezing can be remarkably reduced as compared with the case where the contents are positively pressured by the external member.
  • FIGS. 4A to 4C are views for explaining the preparation of the observation sample in the present embodiment. Preparation of the sample in this embodiment is performed in the order of FIGS. 4A, 4B and 4C.
  • a charging step and a fixing step are performed. That is, in the charging step, the object to be observed and water are put into the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b, and the cavities of the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b are filled with the contents. To do.
  • the water to be filled is pure water or ultrapure water (the term "water” in the embodiment to be described refers to pure water and ultrapure water. Also included).
  • the opening of the first accommodating member 11a and the opening of the second accommodating member 11b are combined to fix the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b.
  • the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b are fixed by housing the inside of the 12 and tightening the screws using the screws 13.
  • the sample preparation device 10 having the form shown in FIG. 1 is configured.
  • the charging step and the fixing step shown in FIG. 4A may be performed in water. That is, the charging step and the fixing step may be performed in a state where the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b are submerged in water.
  • the charging step and the fixing step may be performed in a state where the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b are submerged in water.
  • a gasket may be inserted between the accommodating members 11. .
  • the material of the gasket is not particularly limited, but for example, pressure sensitive paper, fluororesin (for example, polytetrafluoroethylene (PTFE)) and copper can be used as the material of the gasket, and the gasket may be partially or wholly used. May contain one or more of these materials.
  • the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11a and the second accommodating member 11a are used in the fixing process. It is possible to visually grasp that the accommodating member 11b is fixed with an appropriate pressure. Further, by inserting a copper gasket, heat conduction in a cooling step described later can be improved, and efficient cooling can be performed. In particular, it was confirmed that when a copper gasket was inserted, the formation of ice crystals was more effectively suppressed as compared with the case where pressure-sensitive paper was used.
  • a pressure-sensitive paper for example, "Prescale (registered trademark)” manufactured by FUJIFILM Corporation
  • FIG. 10A is a cross-sectional view of the first accommodating member 11a, the second accommodating member 11b, and the gasket 31 (first example).
  • the gasket 31 shown in FIG. 10A has an annular shape with a flat upper surface and a lower surface.
  • the outer peripheral diameter of the gasket 31 is the same as the outer peripheral diameter of each of the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b.
  • the inner peripheral diameter of the gasket 31 is the same as the inner peripheral diameter of each of the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b (particularly the inner peripheral diameter at the open end).
  • the gasket 31 accommodates the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11a so that the flat lower surface and the upper surface of the gasket 31 come into contact with the opening surface of the first accommodating member 11a and the opening surface of the second accommodating member 11b, respectively. It is sandwiched by the member 11b.
  • the gasket 31 thus arranged between the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b is a sealing member that fills the gap between the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b.
  • the enclosed space filled with the contents includes the first cavity portion 21a (including the first recessed portion 22a) of the first accommodating member 11a and the second cavity portion 21b (including the first recessed portion 22a) of the second accommodating member 11b. It includes a second recess 22b) and a cavity inside the gasket 31 (ie, the gasket cavity 23).
  • FIG. 10B is a cross-sectional view of the first accommodating member 11a, the second accommodating member 11b, and the gaskets 31a, 31b (second example).
  • the first gasket 31a and the second gasket 31b are stacked and arranged between the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b.
  • Each of the first gasket 31a and the second gasket 31b can be configured in the same manner as the gasket 31 shown in FIG. 10A described above.
  • FIG. 10C is a cross-sectional view of the first accommodating member 11a, the second accommodating member 11b, and the gasket 31 (third example).
  • the first accommodating member 11a has a circular first accommodating groove 35a on the opening surface
  • the second accommodating member 11b has a circular second accommodating groove on the opening surface. It has 35b.
  • the first accommodating groove 35a surrounds the first cavity 21a
  • the second accommodating groove 35b surrounds the second cavity 21b.
  • the first accommodating groove 35a and the second accommodating groove 35b face each other to form an integrated space.
  • the gasket 31 shown in FIG. 10C is thus arranged in the space composed of the first accommodating groove 35a and the second accommodating groove 35b.
  • the gasket 31 shown in FIG. 10C has a rectangular cross section, but the cross-sectional shape of the gasket 31 is not limited.
  • the gasket 31 may have a circular cross section.
  • FIGS. 10C and 10D by using a gasket 31 that is fitted into the grooves of the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b (the first accommodating groove 35a and the second accommodating groove 35b). While improving the airtightness of the sealed space, it facilitates the alignment between the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b, and the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b. It is possible to effectively prevent the misalignment between the and.
  • FIG. 4B is an enlarged cross-sectional view of the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b of the sample preparation apparatus 10.
  • the closed space of the sample preparation device 10 is filled with the contents, and the inside is filled with the contents. Therefore, when the sample preparation device 10 is cooled and the contents are frozen, the inside is pressurized by the expansion of the contents due to the freezing. Thereby, the formation of ice crystals can be suppressed.
  • the method for cooling the sample preparation device 10 in the cooling step is not particularly limited, and various methods can be adopted.
  • a method of immersing the sample preparation device 10 in liquid nitrogen can be mentioned, but a cooling material other than liquid nitrogen may be used.
  • the cutting step shown in FIG. 4C is performed.
  • the sample preparation device 10 is unfixed, and the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b are separated. Further, since the ice expanded by freezing is pressed by the inner wall of the accommodating portion, in the cutting step, the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b are gripped and the connecting portion is folded so that the first accommodating portion is broken. By separating the accommodating member 11a and the second accommodating member 11b, the frozen object to be observed can be cut and the fractured surface can be exposed.
  • a blade may be inserted in the connecting portion, a cut may be made in the ice, and then the object to be observed may be cut.
  • the fractured surface exposed by the cutting step becomes an observation surface in microscopic observation.
  • the object to be measured that is, the divided object to be observed
  • the object to be measured is vacuum-dried and osmium-coated on the object to be measured to complete the preparation of the sample for SEM observation, and the observation by SEM can be performed.
  • FIGS. 5A to 5C are SEM images of the samples prepared in the present embodiment and comparative examples thereof.
  • the samples in FIGS. 5A to 5C are obtained by freezing and cutting a 2% agar gel as an object to be observed.
  • the 2% agar gel was frozen by the method of the present embodiment (a pressure-sensitive paper (prescale) gasket was inserted between the accommodating members 11a and 11b).
  • a pressure-sensitive paper (prescale) gasket was inserted between the accommodating members 11a and 11b.
  • FIG. 5B ((b-0) to (b-3)
  • the 2% agar gel was frozen by the method of the present embodiment (a copper gasket (copper ring) was inserted between the accommodating members 11a and 11b).
  • FIG. 5C ((c-0) to (c-3)) is a comparative example, and is an image obtained by immersing a 2% agar gel in liquid nitrogen and observing it with SEM.
  • FIG. 5A ((a-0) to (a-3)) will be described.
  • FIG. 5A (a-0) is an SEM image of the entire sample prepared by the method of the present embodiment (with the use of a gasket (pressure sensitive paper)).
  • (a-1) to (a-3) in FIG. 5A are SEM images in which the positions indicated by "1" to "3" in (a-0) are enlarged.
  • (A-1) is an SEM image near the outside of the sample, and it was observed that the network structure of the agar was slightly damaged.
  • A-2) is an SEM image of a portion about 1 mm inside from the sample surface, and a good network structure peculiar to agar was observed.
  • (a-3) is an SEM image near the center of the sample, and a good network structure peculiar to agar was observed. That is, a network structure peculiar to agar was observed in any part of the sample prepared by the method of the present embodiment, and in particular, a good network structure was observed in (a-2) and (a-3). Therefore, it was confirmed that the method of the present embodiment suppressed the formation of ice crystals during freezing.
  • (B-0) in FIG. 5B is an SEM image of the entire sample prepared by the method of this embodiment (with the use of a gasket (copper ring)).
  • (B-1) to (b-3) in FIG. 5B are SEM images in which the positions indicated by "1" to "3" in (b-0) are enlarged.
  • (B-1) is an SEM image near the outside of the sample
  • (b-2) is an SEM image of a portion about 1 mm inside from the sample surface
  • (b-3) is an SEM image near the center of the sample. is there.
  • a better agar network structure was observed than the agar network structure shown in (a-1) to (a-3) described above. .. Therefore, it was confirmed that the formation of ice crystals during freezing was more effectively suppressed by inserting the gasket between the accommodating members 11a and 11b.
  • FIG. 5C ((c-0) to (c-3)) will be described.
  • FIG. 5C (c-0) is an SEM image of a sample prepared by immersing a 2% agar gel in liquid nitrogen.
  • (c-1) to (c-3) are SEM images in which the positions indicated by "1" to "3" in (c-0) are enlarged, and (c-1) is a sample.
  • (C-2) indicates the portion inside about 1 mm from the sample surface, and (c-3) indicates the vicinity of the center of the sample.
  • damage to the observed object due to the formation of ice crystals was confirmed in the part near the outer circumference of the sample prepared by immersing the 2% agar gel in liquid nitrogen.
  • (c-3) a network structure of agar can be seen near the center of the sample, but since the network is relatively large, ice crystals are observed to cause damage to the observed object. confirmed.
  • the housing member 11 having the shapes illustrated in FIGS. 2A and 2B has been described.
  • the shape of the accommodating member 11 is not limited to that shown in FIGS. 2A and 2B, and may be, for example, a shape as shown in each modification shown below.
  • FIGS. 6A and 6B are views showing a first modification of the accommodating member 11 constituting the sample preparation device 10 of the present embodiment.
  • FIG. 6A is a top projection drawing and a side sectional view of the first modification of the accommodating member 11, and FIG. 6B is a perspective view and a sectional perspective view.
  • the upper part of FIG. 6A shows a top projection drawing of the first modification of the accommodating member 11, and the lower part of FIG. 6A is cut along the VIA-VIA line of the upper part of FIG. 6A of the first modification of the accommodating member 11.
  • a cross-sectional view is shown.
  • the accommodating member 11 in the first modification has a shape in which the cavity portion narrows toward the opening portion. With such a shape, the area in which the opening of the first accommodating member 11a and the opening of the second accommodating member 11b are connected becomes small, so that each accommodating member 11 can be easily separated. The cutting process can be easily performed.
  • FIGS. 7A and 7B are views showing a second modification of the accommodating member 11 constituting the sample preparation device 10 of the present embodiment.
  • FIG. 7A is a top projection drawing and a side sectional view of a second modification of the housing member 11
  • FIG. 7B is a perspective view of the sample preparation device 10 composed of the housing member 11 according to the second modification. It is a figure.
  • the upper part of FIG. 7A shows a top projection drawing of the second modification of the accommodating member 11, and the lower part of FIG. 7A is cut along the VIIA-VIIA line of the upper part of FIG. 7A of the second modification of the accommodating member 11.
  • a cross-sectional view is shown.
  • the accommodating member 11 according to the second modification shown in FIGS. 7A and 7B has a shape in which the accommodating portion and the fixing portion of the present embodiment are integrally formed.
  • the accommodating member 11 of the second modification includes the cavity and the opening described in FIGS. 2A and 2B, and is further provided so as to be adjacent to the opening of the accommodating member 11. It is provided with a flange portion that forms a part of the opening surface.
  • the flange portion is provided with holes arranged at equal intervals (equal angle intervals) on the same circumference, and screws used for screwing can be inserted into the holes.
  • the flange portion has a function corresponding to the fixing member 12, and by screwing the flange portions of the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b to each other in the fixing step, the first accommodating member 11a and the first accommodating member 11a and the flange portion are screwed together.
  • the second accommodating member 11b can be fixed.
  • the position and number of holes in the flange portion are not limited to those shown in FIGS. 7A and 7B, and may be arbitrary. Further, the hole of the flange portion may be a tapped screw hole.
  • the accommodating member 11 according to the second modification is combined as shown in the left figure of FIG. 7B to form the sample preparation device 10. That is, the accommodating member 11 with the flange portion (that is, the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b) is fixed with the screw 13 and the nut 13a while aligning the opening and the hole of the flange portion. As a result, the sample preparation device 10 having the form shown on the right of FIG. 7B can be manufactured. By using the accommodating member 11 according to the second modification, the sample preparation device 10 that does not require the fixing member 12 can be obtained.
  • 8A to 9B are views showing a third modification of the accommodating member 11 and a modification of the fixing member 12 constituting the sample preparation device 10 of the present embodiment.
  • FIG. 8A shows a projection drawing of the first accommodating member 11a.
  • the upper part of FIG. 8A shows a top view of the first accommodating member 11a, and the lower part of FIG. 8A shows a cross-sectional view of the first accommodating member 11a cut along the line VIIIA-VIIIA of the upper part of FIG. 8A.
  • FIG. 8B shows a projection drawing of the second accommodating member 11b.
  • the upper part of FIG. 8B shows a top view of the second accommodating member 11b, and the lower part of FIG. 8B shows a cross-sectional view of the second accommodating member 11b cut along the line VIIIB-VIIIB of the upper part of FIG. 8B.
  • the first accommodating member 11a and the second accommodating member 11b have different shapes. That is, the first accommodating member 11a has the same shape as the accommodating member 11 shown in FIGS. 2A and 2B. As shown in FIG. 8A, it is preferable that the first accommodating member 11a is provided with a hole for inserting the pin 14 as will be described later. Further, as shown in FIG. 8B, the second accommodating member 11b has a tapered hole (tapered portion) provided in the accommodating member 11 shown in FIGS. 2A and 2B, and has a tapered portion from the opening. It has a shape that penetrates to. As shown in FIG. 8C, the fixing member 12 has the same shape as the fixing member 12 shown in FIGS. 3A and 3B, but corresponds to the pin insertion hole of the accommodating member 11a shown in FIG. 8A. It may have a hole provided.
  • FIG. 9A shows a charging step and a fixing step in the sample preparation apparatus 10 using each member shown in FIGS. 8A to 8C.
  • a screw for fixing the accommodating member 11 and the fixing member 12 as shown in FIG. 9A, a screw 13'(hereinafter referred to as "tapered screw 13'") having a tapered shape at the tip is used. ..
  • the tapered screw 13' has a shape in which the tapered shape of the tip portion corresponds to the tapered portion of the second accommodating member 11b, and in the fixing step, the tapered portion of the tapered screw 13'and the second accommodating member 11b It comes into close contact with the tapered part of.
  • FIG. 9B is a cross-sectional view of the sample preparation device 10. It should be noted that in FIG. 9B, the object to be observed, water, and the like are omitted. As shown in FIG. 9B, by using the tapered screw 13', the accommodating member 11a and the accommodating member 11b can be fixed, the space can be sealed, and pressurization in the cooling step is possible. Further, by inserting the pin 14 into the first accommodating member 11a and the fixing member 12, it is possible to prevent the members from being displaced.
  • the present embodiment it is possible to provide a sample preparation method, a freeze pressurization device, and an observation method that suppress the formation of ice crystals. Further, since the present embodiment can suppress the formation of ice crystals with a simple configuration, it can also contribute to cost reduction. Further, it is possible to prepare a sample much larger than the conventional technique.
  • the present invention has been described above with embodiments, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and embodiments that can be conceived by those skilled in the art are as long as they exhibit the actions and / or effects of the present invention. It is included in the scope of the present invention.
  • the sample preparation device according to the described embodiment is not limited to the device used for preparing an observation sample, and may be applied to a device for pressurizing the contents by freezing water. Good.
  • the present disclosure also relates to, for example, the following configurations.
  • Structure 1 A step of filling the first cavity of the first member and the second cavity of the second member with an object to be observed and water.
  • the first cavity and the second cavity are liquid-tightened with the first member and the second member fixed to each other and the first cavity and the second cavity connected to each other.
  • the process of sealing The step of freezing the observed object and water filled in the first cavity and the second cavity while the first member and the second member are fixed to each other is included.
  • Sample preparation method. The step of breaking the observed object by separating the first member and the second member in a state where the observed object and the water filled in the first cavity and the second cavity are frozen.
  • (Structure 3) The sample preparation method according to the configuration 2, wherein the observed object is divided by separating the first member and the second member by folding the frozen observed object and water.
  • (Structure 4) Before breaking the frozen observation object, the frozen observation object and water filled in the first cavity and the second cavity from between the first member and the second member.
  • Structure 5 The sample preparation according to any one of the configurations 1 to 4, wherein the observed object and water are filled in the first cavity portion and the second cavity portion in a state where the first member and the second member are in water.
  • (Structure 6) A first member having a first cavity, A second member having a second cavity, The first member and the second member are tightly sealed with each other so that the first cavity and the second cavity are liquid-tightly sealed with the first cavity and the second cavity connected to each other.
  • a freezing and pressurizing device including a fixing portion for fixing to.
  • the first cavity opens in the first surface of the first member and When the first member and the second member are fixed to each other by the fixing portion, the opening in the first surface of the first cavity portion faces the second cavity portion.
  • the member and the second member are arranged and The freeze-pressurizing device according to configuration 6, wherein the cross-sectional area of the first cavity gradually decreases toward the first surface.
  • the second cavity opens in the second surface of the second member and When the first member and the second member are fixed to each other by the fixing portion, the opening in the second surface of the second cavity portion faces the first cavity portion.
  • the member and the second member are arranged and The freeze-pressurizing device according to the configuration 6 or 7, wherein the cross-sectional area of the second cavity gradually decreases toward the second surface.
  • the fixing portion is described in any one of configurations 6 to 8 having a first fixing portion provided integrally with the first member and a second fixing portion provided integrally with the second member. Freezing and pressurizing device.
  • the second member has a second fixing recess and The fixing portion has a second fixing tool, and in a state where the second fixing tool is inserted into the second fixing recess, the second fixing tool presses the second member toward the first member.
  • the second fixing recess has a tapered fixing surface and The second fixture has an end face shaped to correspond to the fixing surface of the second fixing recess.
  • the first cavity and the second cavity are liquid-tightened with the first member and the second member fixed to each other and the first cavity and the second cavity connected to each other.
  • the process of sealing A step of freezing the observed object and water filled in the first cavity and the second cavity while the first member and the second member are fixed to each other.
  • a step of breaking the observed object by separating the first member and the second member in a state where the observed object and the water filled in the first cavity and the second cavity are frozen.
  • An observation method including a step of observing a broken object to be observed. (Structure 19) An object to be observed and water are put into the space inside the sample preparation apparatus including the first member and the second member, each of which has a cavity and an opening in which one surface of the cavity is open.
  • the step of filling the space with the object to be observed and the water A step of fixing the first member and the second member while aligning the opening of the first member with the opening of the second member.
  • the step of cooling the sample preparation device and A sample preparation method including a step of separating the first member and the second member and cutting the frozen object to be observed by a step of cooling the sample preparation device.
  • Structure 20 The sample preparation method according to the configuration 19, wherein the step of filling the space with the object to be observed and the water is performed in a state where the first member and the second member are in water.
  • the step of cutting the observed object is characterized in that the first member and the second member are separated by folding a portion in which the first member and the second member are connected.
  • the sample preparation method according to the configuration 19 or 20 The sample preparation method according to the configuration 19 or 20.
  • (Structure 22) A first accommodating portion and a second accommodating portion, each of which has a cavity and an opening in which one surface of the cavity is open.
  • a fixing portion for fixing the first accommodating portion and the second accommodating portion is provided.
  • Structure 23 22.
  • (Structure 24) The freeze-pressurizing device according to the configuration 22 or 23, wherein the first accommodating portion and the second accommodating portion are respectively configured integrally with the fixing portion.
  • the second accommodating portion has a tapered portion that opens on the opposite side of the opening.
  • Structure 26 With the gasket inserted between the opening of the first accommodating portion and the opening of the second accommodating portion, the first accommodating portion and the second accommodating portion are fixed.
  • Structure 27 The freeze-pressurizing device according to configuration 26, wherein the gasket contains copper.

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Abstract

本開示は、氷晶の生成を抑制する試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法を提供する。試料作製方法は、各々が空洞部と、空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の部材（１１ａ）および第２の部材（１１ｂ）を備える試料作製装置の内部の空間に、被観察物および水を入れて、空間に被観察物および水を充填する工程と、第１の部材（１１ａ）の開口部と、第２の部材（１１ｂ）の開口部とを合わせつつ第１の部材（１１ａ）および第２の部材（１１ｂ）を固定する工程と、試料作製装置を冷却する工程と、第１の部材（１１ａ）および第２の部材（１１ｂ）を分離して、試料作製装置を冷却する工程によって凍結した被観察物を割断する工程とを含む。

Description

試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法
　本発明は、試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法に関する。
　食品、植物、微小生物、および細胞などといった水分含有量の多い物質を被観察物として顕微鏡で観察する場合において、当該被観察物を凍結させて、切断することで、観察用の試料を作製する、凍結割断試料作製技術が知られている（例えば、特許文献１など参照）。
　しかしながら、被観察物に含まれる水分が凍結する際に氷晶が生成され、被観察物が破壊されるため、適切な観察ができないという問題があった。このような被観察物の破壊を抑制するため、有機溶媒などによって氷晶の生成を抑制する方法なども提案されているが、有機溶媒が被観察物に影響を及ぼすことがあり、そのような方法もやはり適切な観察には向かなかった。
　この点につき、非特許文献１や特許文献２などには、氷晶の生成を抑制する凍結技術が開示されている。ここで、非特許文献１に開示されている走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）での観察用の試料を作製する方法について、図１１Ａ～図１１Ｅを以て説明する。図１１Ａ～図１１Ｅは、従来技術における観察用試料の作製の概略を示す図である。
　非特許文献１に記載されている従来技術では、図１１Ａに示すような平板型試料作製装置５０を用いて、凍結割断試料を作製する。従来技術における平板型試料作製装置５０は、図１１Ｂに示すように、２つの平板型収容部材５１ａ，５１ｂに分割可能に構成される。平板型収容部材５１ａ，５１ｂは、上部が開放された窪みを有し、２つの平板型収容部材５１ａ，５１ｂを連結することで、図１１Ａのような試料作製領域が形成される。
　図１１Ｃ～図１１Ｅは、凍結割断試料作製方法の各工程を示している。まず、図１１Ｃのように、平板型試料作製装置５０の窪み部分に被観察物と水を入れて、窪み部分を被観察物と水で満たす。このとき、観察対象となる部位が、平板型収容部材５１ａ，５１ｂの境界に配置されるように、被観察物を配置する。
　その後、図１１Ｄに示すように、平板型試料作製装置５０を冷却し、被観察物や水を凍結させる。平板型試料作製装置５０を冷却する方法としては、冷却した金属ブロックを平板型試料作製装置５０に当接させる方法が挙げられる。このとき、平板型試料作製装置５０内の水は、外側の部分から凍結し、未凍結の水と被観察物とを内包しながらさらに冷却が進む。したがって、水や被観察物の水分が凍結する際に、体積の膨張が押さえ付けられ、氷晶の生成が抑制される。
　平板型試料作製装置５０の内容物を凍結させたあと、図１１Ｅに示すように、平板型収容部材５１ａ，５１ｂを分割する。平板型収容部材５１ａ，５１ｂは、窪み部分のうち、他方の平板型収容部材５１と連結する箇所が細くなっていることから、平板型収容部材５１を分割する際に被観察物が割断しやすい構造となっている。このようにして割断された被観察物は、真空乾燥後、オスミウムでコーティングされ、顕微鏡観察用の試料となる。
　図１１Ａ～図１１Ｅを以て説明した従来技術のように、凍結時に加圧することで氷晶の生成を抑制した試料を作製することができる。しかしながら、非特許文献１などの従来技術においては、冷却速度が１０Ｋ／ｓの急速な冷却が必要であり、また、１ｍｍ以下（０．０６ミリリットル程度以下）の小さな被観察物でしか、試料を作製することができなかった。
　そのため、氷晶の生成を抑制する凍結割断試料作製技術において、さらなる利便性の向上が求められていた。
特開２０１３－２５３９５７号公報 特開２０１４－２５７３２号公報
太田裕彦 et al. (2011)：冷却水を使用した新しいSEM試料作製用凍結乾燥法．医学生物学電子顕微鏡技術学会誌，25(1):9-13.
　本発明は、上記従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、氷晶の生成を抑制する試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法を提供することを目的とする。
　すなわち、本発明の一態様によれば、
　各々が空洞部と、前記空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の部材および第２の部材を備える試料作製装置の内部の空間に、被観察物および水を入れて、前記空間に前記被観察物および前記水を充填する工程と、
　前記第１の部材の開口部と、前記第２の部材の開口部とを合わせつつ、前記第１の部材および前記第２の部材を固定する工程と、
　前記試料作製装置を冷却する工程と、
　前記第１の部材および前記第２の部材を分離して、前記試料作製装置を冷却する工程によって凍結した前記被観察物を割断する工程と
　を含む、試料作製方法が提供される。
　本発明によれば、氷晶の生成を抑制する試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法が提供できる。
図１は、一実施形態の試料作製装置の構造を示す斜視図である。 図２Ａは、一実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の構造を示す図である。 図２Ｂは、一実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の構造を示す図である。 図３Ａは、一実施形態の試料作製装置を構成する固定部材の構造を示す図である。 図３Ｂは、一実施形態の試料作製装置を構成する固定部材の構造を示す図である。 図４Ａは、一実施形態における観察用試料の作製を説明する図である。 図４Ｂは、一実施形態における観察用試料の作製を説明する図である。 図４Ｃは、一実施形態における観察用試料の作製を説明する図である。 図５Ａは、一実施形態において作製された試料のＳＥＭ画像を示す。 図５Ｂは、一実施形態において作製された試料のＳＥＭ画像を示す。 図５Ｃは、一比較例のＳＥＭ画像を示す。 図６Ａは、一実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第１の変形例を示す図である。 図６Ｂは、一実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第１の変形例を示す図である。 図７Ａは、一実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第２の変形例を示す図である。 図７Ｂは、一実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第２の変形例を示す図である。 図８Ａは、一実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第３の変形例および固定部材の変形例を示す図である。 図８Ｂは、一実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第３の変形例および固定部材の変形例を示す図である。 図８Ｃは、一実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第３の変形例および固定部材の変形例を示す図である。 図９Ａは、一実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第３の変形例および固定部材の変形例を示す図である。 図９Ｂは、一実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第３の変形例および固定部材の変形例を示す図である。 図１０Ａは、第１の収容部材、第２の収容部材およびガスケット（第１の例）の断面図である。 図１０Ｂは、第１の収容部材、第２の収容部材およびガスケット（第２の例）の断面図である。 図１０Ｃは、第１の収容部材、第２の収容部材およびガスケット（第３の例）の断面図である。 図１０Ｄは、第１の収容部材、第２の収容部材およびガスケット（第４の例）の断面図である。 図１１Ａは、従来技術における観察用試料の作製の概略を示す図である。 図１１Ｂは、従来技術における観察用試料の作製の概略を示す図である。 図１１Ｃは、従来技術における観察用試料の作製の概略を示す図である。 図１１Ｄは、従来技術における観察用試料の作製の概略を示す図である。 図１１Ｅは、従来技術における観察用試料の作製の概略を示す図である。
　以下、本発明を、実施形態をもって説明するが、本発明は後述する実施形態に限定されるものではない。なお、以下に参照する各図においては、共通する要素について同じ符号を用い、適宜その説明を省略するものとする。
　また、以下に説明する実施形態では、微小生物を被観察物として、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察するための試料を作製する場合を例示しているが、以下の例示は特に実施形態を限定するものではない。したがって、微小生物以外にも、食品、植物、細胞、およびゲル状物などを被観察物としてもよく、さらにその応用として、化学および製薬などの分野において以下に説明する技術を適用してもよい。また、観察装置についても、ＳＥＭ以外の装置であってもよい。
　図１は、本実施形態の試料作製装置１０の構造を示す斜視図である。本実施形態の試料作製装置１０は、収容部と固定部から構成され、図１に示すように、被観察物および水を収容する第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂと、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを固定する固定部材１２およびネジ１３とを具備する。なお、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを組み合わせることで、密閉された空間を形成することができる。また、図１では、固定のためのネジ１３は、六角穴付きボルトが例として図示されているが、特に実施形態を限定するものではない。以下に説明する実施形態では、試料作製装置１０に収容された被観察物および水をまとめて「内容物」として参照する場合がある。
　図１に示した試料作製装置１０を冷却し、収容した内容物を凍結させ、割断することで、氷晶の生成を抑制した顕微鏡観察用の試料を作製することができる。以下に、図１に示した本実施形態の試料作製装置１０を構成する各部について、図２Ａ～図３Ｂを以て説明する。図２Ａおよび図２Ｂは、本実施形態の試料作製装置１０を構成する収容部材１１の構造を示す図であり、図３Ａおよび図３Ｂは、本実施形態の試料作製装置１０を構成する固定部材１２の構造を示す図である。
　まず、図２Ａおよび図２Ｂの収容部材１１について説明する。図２Ａは、収容部材１１の投影図を示している。図２Ａの上段は、収容部材１１の上面図を示し、図２Ａの下段は、収容部材１１を図２Ａの上段のＩＩＡ－ＩＩＡ線で切断した断面図を示している。また、図２Ｂの左図は、収容部材１１の斜視図を示し、図２Ｂの右図は、収容部材１１を切断した断面の斜視図を示している。
　図２Ａおよび図２Ｂの各図に示すように、収容部材１１は、被観察物などを収容する空洞部と、空洞部の１面が開口するように構成される開口部とを具備した構造を有する。また、収容部材１１の空洞部には、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、収容した被観察物の位置を固定しやすくするための窪みを設けてもよい。
　本実施形態の試料作製装置１０は、２つの収容部材１１ａ，１１ｂの開口部を合わせて２つの収容部材１１ａ，１１ｂを固定することで、各収容部材１１ａ，１１ｂの空洞部同士が連結し、被観察物および水を収容するための１つの閉じた空間（以下、単に「空間」として参照する）が形成される。この空間は、内容物で内部が充填され、密閉されているため、凍結時における内容物の膨張が収容部材１１の内壁によって押さえ付けられ、内容物を加圧することができる。これによって、被観察物の氷晶の生成を抑制することができる。
　なお、本実施形態の試料作製装置１０を構成する第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂの形状は、必ずしも同一でなくてもよく、それぞれ異なる形状で構成されてもよい。
　また、収容部材１１の空洞部の大きさは、内容物を充分に凍結できる程度であれば特に限定されないが、一例として開口部の直径を８ｍｍ程度、深さを４ｍｍ程度とすることで、特許文献２や非特許文献１などが開示する従来技術に比べて、格段に大きな被観察物を用いる場合であっても試料を作製することができる。
　次に、図３Ａおよび図３Ｂの固定部材１２について説明する。図３Ａは、固定部材１２の投影図を示している。また、図３Ｂは、固定部材１２の斜視図を示している。
　図３Ａおよび図３Ｂの各図に示すように、本実施形態の固定部材１２は、枠型形状の部材であり、上部に貫通したネジ穴が設けられている。本実施形態の試料作製装置１０は、固定部材１２の枠内に、開口部を合わせた状態の２つの収容部材１１ａ，１１ｂを収め、ネジ１３を使ってネジ締めを行うことで、各収容部材１１ａ，１１ｂを密閉して固定することができる（図１参照）。
　なお、固定部材１２の形状は、図３Ａおよび図３Ｂに示すような枠型形状に限定されない。すなわち、固定部材１２は、開口部を合わせた状態の２つの収容部材１１ａ，１１ｂを、ネジ１３を使ってネジ締めを行うことによって上方および下方から押さえ付けられる構造であればよく、例えば、「コの字」形状の構造のような３つの辺部材の組み合わせに基づく構造の固定部材１２であってもよい。
　また、説明する実施形態に係る試料作製装置１０を構成する各部材は、構造がシンプルであるため、製造時における加工が容易であり、製造コストの面でも優れる。
　以上、図１～図３Ｂに示した構造の試料作製装置１０によって、氷晶の生成を抑制した試料を作製することができる。特に、凍結時における内容物の膨張作用を利用することで内容物が加圧される。そのため、外部部材によって内容物に積極的な圧力が加えられる場合に比べて、凍結時の内容物（特に被観察物）に加えられるダメージを著しく低減することができる。次に、本実施形態の試料作製装置１０による凍結割断試料の作製について、図４Ａ～図４Ｃを以て説明する。図４Ａ～図４Ｃは、本実施形態における観察用試料の作製を説明する図である。本実施形態における試料の作製は、図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃの順序で行われる。
　まず、図４Ａに示すように、投入工程および固定工程を行う。すなわち、投入工程では、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂに、被観察物および水を入れ、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂの空洞部を内容物で充填する。なお、試料に不純物が混入するのを防ぐため、充填される水は、純水または超純水とすることが好ましい（説明する実施形態における「水」の用語は、純水および超純水をも含むものとする）。
　投入工程の後、固定工程では、第１の収容部材１１ａの開口部と、第２の収容部材１１ｂの開口部とを合わせて、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを固定部材１２の内部に収め、ネジ１３を使ったネジ締めを行うことで、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを固定する。これによって、図１に示したような形態の試料作製装置１０が構成される。
　なお、好ましい実施形態では、図４Ａに示す投入工程および固定工程は、水中で行われることとしてもよい。すなわち第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂが水中に沈められた状態で、投入工程および固定工程が行われてもよい。このように第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂが水中にある状態で投入工程および固定工程が行われることによって、試料作製装置１０の密閉された空間に空気が入らず、空間内部が水で充填されるため、膨張による加圧を効果的に行うことができる。
　また、密閉された空間の気密性を向上させるために、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを固定する際に、各収容部材１１の間には、ガスケットを挿入してもよい。ガスケットの材料には、特に制限はないが、例えば感圧紙、フッ素樹脂（例えばポリテトラフロオロエチレン（ＰＴＦＥ））および銅などをガスケットの材料とすることができ、ガスケットは部分的にまたは全体的にこれらの材料のうちの１以上を含んでいてもよい。印加された圧力に応じて着色される感圧紙（例えば、富士フイルム株式会社製「プレスケール（登録商標）」など）をガスケットに用いることで、固定工程において第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂが適当な圧力で固定されていることを視覚的に把握することができる。また、銅製のガスケットを挿入することで、後述する冷却工程における熱伝導を向上でき、効率的な冷却を行うことができる。特に銅製のガスケットを挿入した場合には、感圧紙を用いた場合に比べて、氷晶の生成がより効果的に抑制されていることが確認された。
　このようにして第１の収容部材１１ａと第２の収容部材１１ｂとの間に配置されるガスケットの組成や形状は限定されない。図１０Ａは、第１の収容部材１１ａ、第２の収容部材１１ｂおよびガスケット３１（第１の例）の断面図である。図１０Ａに示すガスケット３１は、平坦な上面及び下面を持つ円環形状を有する。ガスケット３１の外周径は、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂの各々の外周径と同じである。ガスケット３１の内周径は、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂの各々の内周径（特に開口端部における内周径）と同じである。ガスケット３１の平坦な下面および上面のそれぞれが第１の収容部材１１ａの開口面および第２の収容部材１１ｂの開口面と接触するように、ガスケット３１は第１の収容部材１１ａと第２の収容部材１１ｂとによって挟まれる。このようにして第１の収容部材１１ａと第２の収容部材１１ｂとの間に配置されるガスケット３１は、第１の収容部材１１ａと第２の収容部材１１ｂとの間の隙間を埋めるシール部材として働く。したがって内容物が充填される密閉空間は、第１の収容部材１１ａの第１の空洞部２１ａ（第１の窪み部２２ａを含む）と、第２の収容部材１１ｂの第２の空洞部２１ｂ（第２の窪み部２２ｂを含む）と、ガスケット３１の内側の空洞部（すなわちガスケット空洞部２３）とを含む。
　第１の収容部材１１ａと第２の収容部材１１ｂとの間に配置されるガスケットの数は限定されない。図１０Ｂは、第１の収容部材１１ａ、第２の収容部材１１ｂおよびガスケット３１ａ、３１ｂ（第２の例）の断面図である。図１０Ｂに示す例では、第１の収容部材１１ａと第２の収容部材１１ｂとの間に、第１のガスケット３１ａおよび第２のガスケット３１ｂが積み重ねられて配置される。第１のガスケット３１ａおよび第２のガスケット３１ｂの各々は、上述の図１０Ａに示すガスケット３１と同じように構成可能である。
　ガスケット３１は、各収容部材１１の開口面が有する溝に嵌め込まれてもよい。図１０Ｃは、第１の収容部材１１ａ、第２の収容部材１１ｂおよびガスケット３１（第３の例）の断面図である。図１０Ｃに示す例において、第１の収容部材１１ａは、開口面において円形状の第１の収容溝３５ａを有し、第２の収容部材１１ｂは、開口面において円形状の第２の収容溝３５ｂを有する。第１の収容溝３５ａは第１の空洞部２１ａを取り囲み、第２の収容溝３５ｂは第２の空洞部２１ｂを取り囲む。第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを、お互いの開口面を向かい合わせつつ重ねた場合、第１の収容溝３５ａおよび第２の収容溝３５ｂはお互いに向かい合って一体的な空間を構成する。図１０Ｃに示すガスケット３１は、このようにして第１の収容溝３５ａおよび第２の収容溝３５ｂにより構成される空間に配置される。
　図１０Ｃに示すガスケット３１は矩形状の断面を有するが、ガスケット３１の断面形状は限定されない。例えば、図１０Ｄに示すように、ガスケット３１は円形状の断面を有していてもよい。図１０Ｃおよび図１０Ｄに示すように、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂの溝（第１の収容溝３５ａおよび第２の収容溝３５ｂ）に嵌め込まれるガスケット３１を用いることによって、密閉された空間の気密性を向上させつつ、第１の収容部材１１ａと第２の収容部材１１ｂとの間の位置合わせを容易にするとともに、第１の収容部材１１ａと第２の収容部材１１ｂとの間の位置ずれを効果的に防ぐことができる。
　投入工程および固定工程のあと、図４Ｂに示すように冷却工程を行い、試料作製装置１０の内容物を凍結させる。図４Ｂは、試料作製装置１０の第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを拡大した断面図である。図４Ｂに示すように、試料作製装置１０の密閉された空間は、内容物で充填され、内部が内容物で満たされている。したがって、試料作製装置１０が冷却されて、内容物が凍結されると、凍結に伴う内容物の膨張によって、内部が加圧される。これによって、氷晶の生成を抑制することができる。
　なお、冷却工程において試料作製装置１０を冷却する方法は、特に限定されず、種々の方法を採用することができる。冷却方法の一例として、試料作製装置１０を液体窒素に浸漬する方法が挙げられるが、液体窒素以外の冷却材料を用いてもよい。
　冷却工程によって内容物を凍結させたあと、図４Ｃに示す割断工程を行う。割断工程では、試料作製装置１０の固定を外し、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを分離する。また、凍結によって膨張した氷は、収容部の内壁に押さえられているため、割断工程では、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを把持し、連結部分を折るようにして第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを分離させることで、凍結した被観察物が割断され、割断面を露出させることができる。なお、各収容部材１１を分離しやすくするために、連結部分に刃を入れ、氷に切れ目を入れてから被観察物を割断してもよい。割断工程によって露出した割断面は、顕微鏡観察における観察面となる。その後、被測定物（すなわち割断された被観察物）を真空乾燥させ、当該被測定物のオスミウムコーティングを行うことで、ＳＥＭ観察用試料の作製が完成し、ＳＥＭによる観察を行うことができる。
　図４Ａ～図４Ｃにおいて説明した各工程によって、水分を含む被観察物であっても、氷晶の生成によるダメージを抑制して観察用試料を作製することができる。また、図１１Ａ～図１１Ｅに示した従来技術などでは、１ｍｍ以下（０．０６ミリリットル程度以下）の小さな被観察物の試料しか作製できなかったが、本実施形態の試料作製では、０．４ミリリットル以上の比較的大きな被観察物であっても観察用試料を作製することができる。さらに、本実施形態における試料作製の冷却工程では、図１１Ａ～図１１Ｅに示した従来技術などよりも遅い冷却速度であっても、氷晶の生成を抑制することができる。
　図５Ａ～図５Ｃは、本実施形態において作製された試料のＳＥＭ画像およびその比較例である。図５Ａ～図５Ｃにおける試料は、２％寒天ゲルを被観察物として凍結し割断したものである。図５Ａ（（ａ－０）～（ａ－３））は、２％寒天ゲルを本実施形態の方法（収容部材１１ａ、１１ｂ間に感圧紙（プレスケール）のガスケットを挿入した）で凍結し、割断して作製された試料を、ＳＥＭで観察して得られた画像である。図５Ｂ（（ｂ－０）～（ｂ－３））は、２％寒天ゲルを本実施形態の方法（収容部材１１ａ、１１ｂ間に銅製のガスケット（銅リング）を挿入した）で凍結し、割断して作製された試料を、ＳＥＭで観察して得られた画像である。また、図５Ｃ（（ｃ－０）～（ｃ－３））は、比較例であり、２％寒天ゲルを液体窒素に浸漬させ、ＳＥＭで観察して得られた画像である。
　まず、図５Ａ（（ａ－０）～（ａ－３））について説明する。図５Ａの（ａ－０）は、本実施形態の方法（ガスケット（感圧紙）の使用有り）によって作製された試料全体のＳＥＭ画像である。また、図５Ａの（ａ－１）～（ａ－３）は、それぞれ（ａ－０）中の「１」～「３」で示される位置を拡大したＳＥＭ画像である。（ａ－１）は、試料の外側近傍のＳＥＭ画像であり、わずかに寒天の網目構造がダメージを受けていることが観察された。（ａ－２）は、試料表面から１ｍｍ程度内側の部分のＳＥＭ画像であり、寒天特有の良好な網目構造が観察された。また、（ａ－３）は、試料の中央付近のＳＥＭ画像であり、寒天特有の良好な網目構造が観察された。すなわち、本実施形態の方法によって作製された試料のいずれの部位においても、寒天に特有の網目構造が観察され、特に、（ａ－２）および（ａ－３）では、良好な網目構造が観察されたことから、本実施形態の方法によって、凍結時における氷晶の生成が抑制されていることが確認された。
　図５Ｂの（ｂ－０）は、本実施形態の方法（ガスケット（銅リング）の使用有り）によって作製された試料全体のＳＥＭ画像である。図５Ｂの（ｂ－１）～（ｂ－３）は、それぞれ（ｂ－０）中の「１」～「３」で示される位置を拡大したＳＥＭ画像である。（ｂ－１）は試料の外側近傍のＳＥＭ画像であり、（ｂ－２）は試料表面から１ｍｍ程度内側の部分のＳＥＭ画像であり、（ｂ－３）は試料の中央付近のＳＥＭ画像である。（ｂ－１）～（ｂ－３）のいずれにおいても、上述の（ａ－１）～（ａ－３）で示される寒天の網目構造よりも、さらに良好な寒天の網目構造が観察された。したがって、収容部材１１ａ、１１ｂ間にガスケットを挿入することで、凍結時における氷晶の生成がより効果的に抑制されていることが確認された。
　次に、図５Ｃ（（ｃ－０）～（ｃ－３））について説明する。図５Ｃの（ｃ－０）は、２％寒天ゲルを液体窒素に浸漬させることで作製された試料のＳＥＭ画像である。また、（ｃ－１）～（ｃ－３）は、それぞれ（ｃ－０）中の「１」～「３」で示される位置を拡大したＳＥＭ画像であり、（ｃ－１）は、試料の外側近傍を、（ｃ－２）は、試料表面から１ｍｍ程度内側の部分を、（ｃ－３）は、試料の中央付近を、それぞれ示している。（ｃ－１）および（ｃ－２）に示すように、２％寒天ゲルを液体窒素に浸漬させて作製した試料の外周に近い部位は、氷晶の生成による被観察物へのダメージが確認された。また、（ｃ－３）に示すように、試料の中央付近では、寒天の網目構造がみられるが、網目が比較的大きいことから、氷晶の生成が認められ、被観察物へのダメージが確認された。
　図５Ａ～図５Ｃに示したように、本実施形態の方法で作製した試料では、寒天特有の網目構造が確認され、氷晶の生成が抑制されていることを確認した。したがって、本実施形態の方法によって、水分の含有量が多い被観察物であっても、氷晶の生成を抑制して試料を作製できたことが確認できた。
　ここまでに説明した実施形態では、図２Ａおよび図２Ｂに例示した形状の収容部材１１で以て説明した。しかしながら、収容部材１１の形状は、図２Ａおよび図２Ｂに示したものに限定されず、例えば、以下に示す各変形例のような形状であってもよい。
　まず、第１の変形例について説明する。図６Ａおよび図６Ｂは、本実施形態の試料作製装置１０を構成する収容部材１１の第１の変形例を示す図である。図６Ａは、収容部材１１の第１の変形例の上面投影図および側面断面の投影図であり、図６Ｂは、斜視図および断面斜視図である。図６Ａの上段は、収容部材１１の第１の変形例の上面投影図を示し、図６Ａの下段は、収容部材１１の第１の変形例を図６Ａの上段のＶＩＡ－ＶＩＡ線で切断した断面図を示している。図６Ａおよび図６Ｂに示すように、第１の変形例における収容部材１１は、空洞部が開口部に向かって狭くなる形状である。このような形状とすることで、第１の収容部材１１ａの開口部と、第２の収容部材１１ｂの開口部とが連結する面積が小さくなることから、各収容部材１１を分離しやすくでき、割断工程を容易に行うことができる。
　次に、第２の変形例について説明する。図７Ａおよび図７Ｂは、本実施形態の試料作製装置１０を構成する収容部材１１の第２の変形例を示す図である。図７Ａは、収容部材１１の第２の変形例の上面投影図および側面断面の投影図であり、図７Ｂは、第２の変形例に係る収容部材１１によって構成される試料作製装置１０の斜視図である。図７Ａの上段は、収容部材１１の第２の変形例の上面投影図を示し、図７Ａの下段は、収容部材１１の第２の変形例を図７Ａの上段のＶＩＩＡ－ＶＩＩＡ線で切断した断面図を示している。図７Ａおよび図７Ｂに示す第２の変形例に係る収容部材１１は、本実施形態の収容部と固定部とを一体として構成された形状を有する。
　図７Ａに示すように、第２の変形例の収容部材１１は、図２Ａおよび図２Ｂなどで説明した空洞部および開口部を備え、さらに、開口部に隣り合うように設けられ収容部材１１の開口面の一部を形成するフランジ部を具備する。フランジ部には、同一円周上に等間隔（等角度間隔）に配置された穴が設けられており、当該穴にはネジ留めに用いられるネジが挿入可能である。フランジ部は、固定部材１２に相当する機能を有し、固定工程において第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂのフランジ部同士のネジ留めを行うことで、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを固定することができる。なお、フランジ部の穴の位置や数は、図７Ａおよび図７Ｂに示したものに限定されず、任意とすることができる。また、フランジ部の穴は、タッピング処理されたネジ穴であってもよい。
　第２の変形例に係る収容部材１１は、図７Ｂの左図のように組み合わせられることで、試料作製装置１０を構成する。すなわち、フランジ部付きの収容部材１１（すなわち第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂ）を、開口部およびフランジ部の穴を合わせつつ、ネジ１３およびナット１３ａで固定する。これによって、図７Ｂの右図のような形態の試料作製装置１０を作製することができる。第２の変形例に係る収容部材１１を用いることで、固定部材１２が不要な試料作製装置１０とすることができる。
　次に第３の変形例について説明する。図８Ａ～図９Ｂは、本実施形態の試料作製装置１０を構成する収容部材１１の第３の変形例および固定部材１２の変形例を示す図である。
　図８Ａは、第１の収容部材１１ａの投影図を示している。図８Ａの上段は、第１の収容部材１１ａの上面図を示し、図８Ａの下段は、第１の収容部材１１ａを図８Ａの上段のＶＩＩＩＡ－ＶＩＩＩＡ線で切断した断面図を示している。図８Ｂは、第２の収容部材１１ｂの投影図を示している。図８Ｂの上段は、第２の収容部材１１ｂの上面図を示し、図８Ｂの下段は、第２の収容部材１１ｂを図８Ｂの上段のＶＩＩＩＢ－ＶＩＩＩＢ線で切断した断面図を示している。収容部材１１の第３の変形例は、図８Ａおよび図８Ｂに示すように、第１の収容部材１１ａと第２の収容部材１１ｂとで異なる形状を有する。すなわち、第１の収容部材１１ａは、図２Ａおよび図２Ｂに示した収容部材１１と同様の形状を有する。なお、第１の収容部材１１ａには、図８Ａに示すように、後述するようにピン１４を挿入するための穴を設けることが好ましい。また、第２の収容部材１１ｂは、図８Ｂに示すように、図２Ａおよび図２Ｂに示した収容部材１１に設けられているテーパ状の穴（テーパ部）を有し、開口部からテーパ部まで貫通した形状を有する。なお、固定部材１２は、図８Ｃに示すように、図３Ａおよび図３Ｂに示した固定部材１２と同様の形状を有するが、図８Ａに示した収容部材１１ａのピン挿入穴に対応するように設けられた穴を有していてもよい。
　上述した各収容部材１１および固定部材１２を用いた試料作製装置１０は、図９Ａに示すように構成される。図９Ａは、図８Ａ～図８Ｃに示した各部材を用いた試料作製装置１０における、投入工程および固定工程を示している。ここで、収容部材１１および固定部材１２を固定するためのネジとして、図９Ａに示すように、先端にテーパ形状を有するネジ１３’（以下、「テーパ付きネジ１３’」として参照する）を用いる。テーパ付きネジ１３’は、先端部のテーパ形状が第２の収容部材１１ｂのテーパ部に対応する形状を有し、固定工程において、テーパ付きネジ１３’のテーパ部と、第２の収容部材１１ｂのテーパ部とが密着する。
　図９Ｂは、試料作製装置１０の断面図である。なお、図９Ｂでは、被観察物や水などが省略して図示されている点に留意されたい。図９Ｂに示すように、テーパ付きネジ１３’を用いることによって、収容部材１１ａおよび収容部材１１ｂを固定するとともに、空間を密閉することができ、冷却工程における加圧を可能とする。また、第１の収容部材１１ａと、固定部材１２とにピン１４を挿入することで、各部材のズレを防止することができる。
　図８Ａ～図９Ｂに示した形態の試料作製装置１０を用いることによって、各工程の作業性を向上することができる。
　以上に説明した本発明の実施形態によれば、氷晶の生成を抑制する試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法を提供することができる。また、本実施形態は、簡易な構成で以て氷晶の生成を抑制できることから、コスト低減にも寄与し得る。さらに、従来技術よりも格段に大きな試料を作製することができる。
　以上、本発明について実施形態をもって説明してきたが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、当業者が推考しうる実施態様は、本発明の作用および／または効果を奏する限り、本発明の範囲に含まれるものである。また、説明した実施形態に係る試料作製装置は、観察用試料を作製するための用途に供されるものに限定されず、水の凍結によって内容物を加圧するための装置などに応用されてもよい。
［付記］
　本開示は、例えば下記の構成にも関する。
（構成１）
　第１の部材の第１の空洞部および第２の部材の第２の空洞部に被観察物および水を充填する工程と、
　第１の部材および第２の部材をお互いに対して固定し、第１の空洞部および第２の空洞部をお互いに接続させた状態で第１の空洞部および第２の空洞部を液密に密閉する工程と、
　第１の部材および第２の部材をお互いに対して固定している状態で、第１の空洞部および第２の空洞部に充填されている被観察物および水を凍結する工程と、を含む試料作製方法。
（構成２）
　第１の空洞部および第２の空洞部に充填されている被観察物および水が凍結している状態で第１の部材および第２の部材を分離することによって、被観察物を割る工程を更に含む構成１に記載の試料作製方法。
（構成３）
　被観察物は、凍結している被観察物および水を折るようにして第１の部材および第２の部材を分離することによって、割られる構成２に記載の試料作製方法。
（構成４）
　凍結している被観察物を割る前に、第１の部材と第２の部材との間から、第１の空洞部および第２の空洞部に充填されている凍結状態の被観察物および水の少なくともいずれか一方に切れ目を入れる構成２または３に記載の試料作製方法。
（構成５）
　被観察物および水は、第１の部材および第２の部材が水中にある状態で、第１の空洞部および第２の空洞部に充填される構成１～４のいずれかに記載の試料作製方法。
（構成６）
　第１の空洞部を有する第１の部材と、
　第２の空洞部を有する第２の部材と、
　第１の空洞部および第２の空洞部をお互いに接続させた状態で第１の空洞部および第２の空洞部を液密に密閉するように、第１の部材および第２の部材をお互いに対して固定する固定部と、を備える凍結加圧装置。
（構成７）
　第１の空洞部は、第１の部材の第１の面において開口し、
　固定部により第１の部材および第２の部材をお互いに対して固定する際、第１の空洞部の第１の面における開口部が、第２の空洞部に面するように、第１の部材および第２の部材は配置され、
　第１の空洞部の断面積は、第１の面に向かって徐々に小さくなる構成６に記載の凍結加圧装置。
（構成８）
　第２の空洞部は、第２の部材の第２の面において開口し、
　固定部により第１の部材および第２の部材をお互いに対して固定する際、第２の空洞部の第２の面における開口部が、第１の空洞部に面するように、第１の部材および第２の部材は配置され、
　第２の空洞部の断面積は、第２の面に向かって徐々に小さくなる構成６または７に記載の凍結加圧装置。
（構成９）
　固定部は、第１の部材と一体的に設けられた第１の固定部と、第２の部材と一体的に設けられた第２の固定部とを有する構成６～８のいずれかに記載の凍結加圧装置。
（構成１０）
　固定部は、第１の固定部および第２の固定部をお互いに対して固定する固定部材を有する構成９に記載の凍結加圧装置。
（構成１１）
　第１の固定部および第２の固定部の少なくともいずれか一方はフランジである構成９または１０に記載の凍結加圧装置。
（構成１２）
　第１の部材は、第１の固定凹部を有し、
　固定部は、第１の固定具を有し、第１の固定凹部に第１の固定具が挿入された状態で、第１の部材および第２の部材をお互いに対して固定する構成６～１１に記載の凍結加圧装置。
（構成１３）
　第２の部材は、第２の固定凹部を有し、
　固定部は、第２の固定具を有し、第２の固定凹部に第２の固定具が挿入された状態で当該第２の固定具により第２の部材を第１の部材に向けて押しつけつつ、第１の部材および第２の部材をお互いに対して固定する構成６～１２に記載の凍結加圧装置。
（構成１４）
　第２の固定凹部はテーパ状の固定面を有し、
　第２の固定具は、第２の固定凹部の固定面に対応する形状の端面を有し、
　固定部により第１の部材および第２の部材がお互いに対して固定される際、第２の固定具の端面が第２の固定凹部の固定面に接触する構成１３に記載の凍結加圧装置。
（構成１５）
　固定部は、第１の部材と第２の部材との間にガスケットを介在させつつ、第１の部材および第２の部材をお互いに対して固定する構成６～１４に記載の凍結加圧装置。
（構成１６）
　ガスケットは銅を含む構成１５に記載の凍結加圧装置。
（構成１７）
　ガスケットは、印加された圧力に応じて着色される材料を含む構成１５または１６に記載の凍結加圧装置。
（構成１８）
　第１の部材の第１の空洞部および第２の部材の第２の空洞部に被観察物および水を充填する工程と、
　第１の部材および第２の部材をお互いに対して固定し、第１の空洞部および第２の空洞部をお互いに接続させた状態で第１の空洞部および第２の空洞部を液密に密閉する工程と、
　第１の部材および第２の部材をお互いに対して固定している状態で、第１の空洞部および第２の空洞部に充填されている被観察物および水を凍結する工程と、
　第１の空洞部および第２の空洞部に充填されている被観察物および水が凍結している状態で第１の部材および第２の部材を分離することによって、被観察物を割る工程と、
　割られた被観察物を観察する工程と、を含む観察方法。
（構成１９）
　各々が空洞部と、前記空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の部材および第２の部材を備える試料作製装置の内部の空間に、被観察物および水を入れて、前記空間に前記被観察物および前記水を充填する工程と、
　前記第１の部材の開口部と、前記第２の部材の開口部とを合わせつつ、前記第１の部材および前記第２の部材を固定する工程と、
　前記試料作製装置を冷却する工程と、
　前記第１の部材および前記第２の部材を分離して、前記試料作製装置を冷却する工程によって凍結した前記被観察物を割断する工程と
　を含む、試料作製方法。
（構成２０）
　前記空間に前記被観察物および前記水を充填する工程は、前記第１の部材および前記第２の部材が水中にある状態で行われることを特徴とする、構成１９に記載の試料作製方法。
（構成２１）
　前記被観察物を割断する工程は、前記第１の部材と前記第２の部材とが連結した部分を折ることで、前記第１の部材および前記第２の部材を分離することを特徴とする、構成１９または２０に記載の試料作製方法。
（構成２２）
　各々が空洞部と、前記空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の収容部および第２の収容部と、
　前記第１の収容部と前記第２の収容部とを固定する固定部と
　を具備し、
　前記第１の収容部の開口部と、前記第２の収容部の開口部とを合わせつつ前記第１の収容部および前記第２の収容部を前記固定部によって固定して形成される空間を有する、
　凍結加圧装置。
（構成２３）
　前記空洞部は、前記開口部に向かって狭くなることを特徴とする、構成２２に記載の凍結加圧装置。
（構成２４）
　前記第１の収容部および前記第２の収容部は、それぞれが前記固定部と一体として構成されることを特徴とする、構成２２または２３に記載の凍結加圧装置。
（構成２５）
　前記第２の収容部は、前記開口部の反対側に開いたテーパ部を有し、
　前記テーパ部に対応する形状を具備するネジによって、前記第１の収容部と前記第２の収容部とが固定されていることを特徴とする、構成２２または２３に記載の凍結加圧装置。
（構成２６）
　前記第１の収容部の開口部と、前記第２の収容部の開口部との間にガスケットが挿入された状態で、前記第１の収容部および前記第２の収容部は、前記固定部によって固定されていることを特徴とする、構成２２～２５のいずれか１項に記載の凍結加圧装置。
（構成２７）
　前記ガスケットは銅を含むことを特徴とする、構成２６に記載の凍結加圧装置。
（構成２８）
　前記ガスケットは、印加された圧力に応じて着色されることを特徴とする、構成２６に記載の凍結加圧装置。
（構成２９）
　各々が空洞部と、前記空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の部材および第２の部材を備える試料作製装置の内部の空間に、被観察物および水を入れて、前記空間に前記被観察物および前記水を充填する工程と、
　前記第１の部材の開口部と、前記第２の部材の開口部とを合わせつつ、前記第１の部材および前記第２の部材を固定する工程と、
　前記試料作製装置を冷却する工程と、
　前記第１の部材および前記第２の部材を分離して、前記試料作製装置を冷却する工程によって凍結した前記被観察物を割断する工程と、
　前記被観察物を割断する工程によって割断された前記被観察物の割断面を観察する工程と
　を含む、観察方法。
１０…試料作製装置、
１１…収容部材、
１２…固定部材、
１３…ネジ、
１３’…テーパ付きネジ、
１３ａ…ナット、
１４…ピン、
５０…平板型試料作製装置、
５１…平板型収容部材

Claims (11)

  1. 　各々が空洞部と、前記空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の部材および第２の部材を備える試料作製装置の内部の空間に、被観察物および水を入れて、前記空間に前記被観察物および前記水を充填する工程と、
    　前記第１の部材の開口部と、前記第２の部材の開口部とを合わせつつ、前記第１の部材および前記第２の部材を固定する工程と、
    　前記試料作製装置を冷却する工程と、
    　前記第１の部材および前記第２の部材を分離して、前記試料作製装置を冷却する工程によって凍結した前記被観察物を割断する工程と
    　を含む、試料作製方法。
  2. 　前記空間に前記被観察物および前記水を充填する工程は、前記第１の部材および前記第２の部材が水中にある状態で行われることを特徴とする、請求項１に記載の試料作製方法。
  3. 　前記被観察物を割断する工程は、前記第１の部材と前記第２の部材とが連結した部分を折ることで、前記第１の部材および前記第２の部材を分離することを特徴とする、請求項１または２に記載の試料作製方法。
  4. 　各々が空洞部と、前記空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の収容部および第２の収容部と、
    　前記第１の収容部と前記第２の収容部とを固定する固定部と
    　を具備し、
    　前記第１の収容部の開口部と、前記第２の収容部の開口部とを合わせつつ前記第１の収容部および前記第２の収容部を前記固定部によって固定して形成される空間を有する、
    　凍結加圧装置。
  5. 　前記空洞部は、前記開口部に向かって狭くなることを特徴とする、請求項４に記載の凍結加圧装置。
  6. 　前記第１の収容部および前記第２の収容部は、それぞれが前記固定部と一体として構成されることを特徴とする、請求項４または５に記載の凍結加圧装置。
  7. 　前記第２の収容部は、前記開口部の反対側に開いたテーパ部を有し、
    　前記テーパ部に対応する形状を具備するネジによって、前記第１の収容部と前記第２の収容部とが固定されていることを特徴とする、請求項４または５に記載の凍結加圧装置。
  8. 　前記第１の収容部の開口部と、前記第２の収容部の開口部との間にガスケットが挿入された状態で、前記第１の収容部および前記第２の収容部は、前記固定部によって固定されていることを特徴とする、請求項４～７のいずれか１項に記載の凍結加圧装置。
  9. 　前記ガスケットは銅を含むことを特徴とする、請求項８に記載の凍結加圧装置。
  10. 　前記ガスケットは、印加された圧力に応じて着色されることを特徴とする、請求項８に記載の凍結加圧装置。
  11. 　各々が空洞部と、前記空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の部材および第２の部材を備える試料作製装置の内部の空間に、被観察物および水を入れて、前記空間に前記被観察物および前記水を充填する工程と、
    　前記第１の部材の開口部と、前記第２の部材の開口部とを合わせつつ、前記第１の部材および前記第２の部材を固定する工程と、
    　前記試料作製装置を冷却する工程と、
    　前記第１の部材および前記第２の部材を分離して、前記試料作製装置を冷却する工程によって凍結した前記被観察物を割断する工程と、
    　前記被観察物を割断する工程によって割断された前記被観察物の割断面を観察する工程と
    　を含む、観察方法。
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