WO2021095776A1 - 細胞培養容器、細胞培養方法、および細胞培養容器の製造方法 - Google Patents

細胞培養容器、細胞培養方法、および細胞培養容器の製造方法 Download PDF

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WO2021095776A1
WO2021095776A1 PCT/JP2020/042106 JP2020042106W WO2021095776A1 WO 2021095776 A1 WO2021095776 A1 WO 2021095776A1 JP 2020042106 W JP2020042106 W JP 2020042106W WO 2021095776 A1 WO2021095776 A1 WO 2021095776A1
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cell
well
cell culture
culture
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英幸 三須
杉山　陽子
彰紀 木村
麻子 本村
菅沼　寛
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住友電気工業株式会社
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    • B29C45/0053—Injection moulding, i.e. forcing the required volume of moulding material through a nozzle into a closed mould; Apparatus therefor combined with a final operation, e.g. shaping
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Definitions

  • the present disclosure relates to a cell culture vessel, a cell culture method, and a method for producing a cell culture vessel.
  • This application claims priority based on Japanese Application No. 2019-206248 filed on November 14, 2019, and incorporates all the contents described in the Japanese application.
  • Patent Document 1 describes a cell culture container for culturing a cell mass or the like in a culture solution. This cell culture vessel has a plurality of wells in which a cell mass or the like to be cultured is held.
  • the cell observation container is a first container configured to contain a culture solution and a state in which one or both of cells and cell clusters cultured by the culture solution are held.
  • a second container having at least one well that can be taken in and out of one container is provided.
  • Each at least one well has a bottom capable of holding the culture medium and a side wall extending from the periphery of the bottom. The side wall is provided with a liquid passing portion through which the culture liquid contained in the first container can pass.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view schematically showing a cell culture container according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view schematically showing a cell culture container according to an embodiment.
  • FIG. 3A is a plan view of the cell container shown in FIG.
  • FIG. 3B is a cross-sectional view of the well of the cell container shown in FIG. 1 along the line IIIB-IIIB.
  • FIG. 4A is a cross-sectional view showing a mold used in the method for producing a cell culture container according to an embodiment.
  • FIG. 4B is a view of the upper mold and the core shown in FIG. 4A as viewed from below.
  • FIG. 5A is a diagram showing one step of the method for producing a cell culture container according to an embodiment.
  • FIG. 5B is a diagram showing a state after one step of the method for producing a cell culture vessel shown in FIG. 5A.
  • the parts (a) to (d) of FIG. 6 are schematic cross-sectional views showing changes in the culture state of cells and cell clusters.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view schematically showing a culture step of the cell culture method according to the embodiment.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view schematically showing a culture step of the cell culture method according to the embodiment.
  • FIG. 9 is a cross-sectional view schematically showing an observation step of the cell culture method according to the embodiment.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view schematically showing an observation step of the cell culture method according to the embodiment.
  • FIG. 12A is a cross-sectional view schematically showing a cell culture vessel according to a modified example.
  • FIG. 12B is a cross-sectional view schematically showing a cell culture vessel according to the modified example shown in FIG. 12A.
  • FIG. 13A is a plan view schematically showing the cell container according to the modified example.
  • FIG. 13B is a plan view schematically showing the cell container according to the modified example.
  • FIG. 13C is a plan view schematically showing the cell container according to the modified example.
  • FIG. 13D is a plan view schematically showing the cell container according to the modified example.
  • FIG. 12A is a cross-sectional view schematically showing a cell culture vessel according to a modified example.
  • FIG. 12B is a cross-sectional view schematically showing a cell culture vessel according to the modified example shown in FIG. 12A.
  • FIG. 13A is a plan view schematically showing the cell container according to the modified example.
  • FIG. 13B is a plan view schematically showing the
  • FIG. 14A is a cross-sectional view schematically showing a well according to a modified example.
  • FIG. 14B is a cross-sectional view schematically showing a well according to a modified example.
  • FIG. 15A is a perspective view schematically showing a liquid passing portion according to a modified example.
  • FIG. 15B is a perspective view schematically showing a liquid passing portion according to a modified example.
  • FIG. 15C is a perspective view schematically showing a liquid passing portion according to a modified example.
  • FIG. 16 is a cross-sectional view schematically showing a liquid passing portion according to a modified example.
  • FIG. 17A is a cross-sectional view showing a mold used in the method for producing a cell culture container according to a modified example.
  • FIG. 17A is a cross-sectional view showing a mold used in the method for producing a cell culture container according to a modified example.
  • FIG. 17A is a cross-sectional view showing a mold used in the method for producing
  • FIG. 17B is a cross-sectional view taken along the line XVIIB-XVIIB of the mold shown in FIG. 17A.
  • FIG. 18 is a diagram showing a part of wells after molding by the method for producing a cell culture container according to a modified example.
  • FIG. 19A is a diagram showing one step of a method for producing a cell culture container according to a modified example.
  • FIG. 19B is a diagram showing a state after one step of the method for producing a cell culture vessel shown in FIG. 19A.
  • FIG. 20A is a diagram showing one step of a method for manufacturing a cell culture container according to a modified example.
  • FIG. 20B is a diagram showing a state after one step of the method for producing a cell culture container shown in FIG. 20A.
  • FIG. 21 is a diagram schematically showing a well according to a further modification.
  • FIG. 22 is a diagram schematically showing a well according to a further modification.
  • FIG. 23 is a diagram schematically showing a well according to a further modification.
  • FIG. 24 is a diagram schematically showing a well according to a further modification.
  • FIG. 25 is a diagram schematically showing a well according to a further modification.
  • FIG. 26 is a diagram schematically showing a well according to a further modification.
  • FIG. 27 is a diagram schematically showing a well according to a further modification.
  • FIG. 28 is a diagram schematically showing a well according to a further modification.
  • FIG. 29 is a diagram schematically showing a cell culture vessel according to a further modified example.
  • the cell culture container according to one embodiment is placed in the first container in a state of holding either or both of the first container configured to contain the culture solution and the cells and cell clusters cultured by the culture solution.
  • a second container having at least one well that can be taken in and out of the cell is provided.
  • Each at least one well has a bottom capable of holding the culture medium and a side wall extending from the periphery of the bottom. The side wall is provided with a liquid passing portion through which the culture liquid contained in the first container can pass.
  • the culture solution is taken in and out of the well through the liquid passage portion provided on the side wall. Therefore, the wells can be filled with the culture solution only by inserting the wells into the first container containing the culture solution.
  • the liquid passage portion may be at least one hole penetrating the side wall.
  • the holes penetrating the side wall can realize a structure that allows the culture solution to pass through.
  • the material constituting at least one well may be polystyrene. Since polystyrene has a property of being difficult to adhere to a cell mass or the like, it is suitable for culturing a cell mass or the like. By forming the well from polystyrene, for example, a cultured cell mass or the like can be easily removed from the well. Can be taken out.
  • the liquid passage portion is at least a part of the side wall, and this region may be composed of a porous polymer material through which the culture liquid passes.
  • the region of the side wall made of the porous polymer material can realize a structure that allows the culture solution to pass through.
  • At least one well may be a plurality of wells connected to each other.
  • the height from the lower end of each bottom of each of the plurality of wells to the lower end of each liquid passing portion may be constant.
  • the amount of the culture solution remaining in the well is kept constant. Is difficult.
  • the height is constant from the first container.
  • the first container has a plurality of storage spaces into which a part of the plurality of wells can be taken in and out, and at least one partition wall separating the plurality of storage spaces from each other. You may be.
  • the plurality of accommodation spaces are watertightly partitioned, the culture solution does not enter the wells accommodated in each accommodation space from other accommodation spaces. Therefore, contamination caused by the culture medium contained in another storage space can be avoided.
  • the height from the lower end of the bottom to the lower end of the liquid passage portion may be 1.0 mm or more and 5.0 mm or less.
  • each of at least one well may further have an inducing member that guides the flow of the culture solution discharged from the liquid passage portion.
  • the discharged culture solution causes dripping to adhere to the lower part of the well, which hinders the observation of the cultured cell mass. there's a possibility that.
  • the cell culture vessel is provided with an inducing member that prevents dripping, it becomes possible to efficiently observe the cell mass.
  • the guiding member When the guiding member is provided, the guiding member is provided on the outer peripheral surface of each of at least one well in a region on the lower end side of the bottom portion of the liquid passing portion, and extends to the opposite side of the liquid passing portion. You may. In this case, the guiding member can be realized with a simple configuration.
  • the cell culture method includes the step of preparing any of the above cell culture containers and immersing the cells held in at least one well in the culture solution contained in the first container to obtain cells and cells. It is provided with a step of culturing the cell mass obtained by agglomeration of cells and a step of observing the cell mass.
  • the step of observing the cell mass involves removing the second container from the first container, and the cells in at least one well with a part of the culture solution discharged from at least one well through the liquid passage portion. You may observe the mass. In this case, a part of the culture solution can be easily discharged from the well in the observation step.
  • the cell mass in the well is observed in a state where a part of the culture solution is discharged, it is possible to suppress the inhibition of the observation of the cell mass by the culture solution. Therefore, it is possible to efficiently observe the culture state of the cell mass in the process of culturing the cell mass.
  • the step of observing the cell mass may include removing the liquid adhering to the outer periphery of the bottom of the second container after removing the second container from the first container. .. In this case, it is possible to prevent the observation of the cell mass from being hindered by the culture solution adhering to the outer periphery of the second container. Therefore, it is possible to more efficiently observe the culture state of the cell mass in the process of culturing the cell mass.
  • the method for manufacturing a cell culture container is the above-mentioned method for manufacturing a cell culture container, and includes a step of manufacturing a second container by molding.
  • an upper mold having a convex portion having a shape corresponding to the outer shape of at least one well and a shape corresponding to the outer shape of at least one well are arranged so as to face the convex portion.
  • It has a step of forming a second container, and a hole as a liquid passage portion may be formed by a core.
  • a hole as a liquid passage portion is formed in the well of the second container manufactured by molding, so that a cell culture container having the above structure can be easily formed. Therefore, by using the manufactured cell culture vessel, it is possible to efficiently observe the culture state of the cell mass in the process of culturing the cell mass.
  • the method for manufacturing a cell culture container is the above-mentioned method for manufacturing a cell culture container, and includes a step of manufacturing a second container by molding.
  • an upper mold having a convex portion having a shape corresponding to the outer shape of at least one well and a shape corresponding to the outer shape of at least one well are arranged so as to face the convex portion. It has a step of preparing a lower mold having a concave portion of the above, a step of preparing a mold including the mold, and a step of curing a resin material poured into the mold to form a second container containing at least one well.
  • the upper mold may have protrusions extending in the vertical direction, protruding from the convex portion and in contact with the concave portion, and the protrusions may form a slit as a liquid passage portion.
  • a slit as a liquid passage portion is formed in the well of the second container manufactured by molding, so that a cell culture container having the above structure can be easily formed. Therefore, by using the manufactured cell culture vessel, it is possible to efficiently observe the culture state of the cell mass in the process of culturing the cell mass.
  • the method for producing a cell culture vessel is the above-mentioned method for producing a cell culture vessel, which comprises a step of molding a molded product having an outer shape of at least one well by molding, and laser irradiation. It may be provided with a step of forming a hole as a liquid passage portion in the molded product. According to this method, a hole as a liquid passage portion is formed in the produced well by laser irradiation, so that a cell culture container having the above structure can be easily formed. Therefore, by using the manufactured cell culture vessel, it is possible to efficiently observe the culture state of the cell mass in the process of culturing the cell mass.
  • FIG. 1 and 2 are cross-sectional views schematically showing a cell culture vessel 1 according to an embodiment.
  • the cell culture vessel 1 is used when culturing cells C and cell mass M (see FIG. 8) using the culture medium S.
  • cell C is shown by a virtual line.
  • the cell culture vessel 1 is a vessel for agglutinating cells C in the culture medium S to obtain a cell mass M in a desired state.
  • the cell culture container 1 includes a culture solution container 2 (first container) and a cell container 3 (second container).
  • the culture solution container 2 is a container (dish) for accommodating the culture solution S.
  • the culture solution container 2 is made of, for example, resin.
  • the resin material constituting the culture solution container 2 is preferably polystyrene, for example, but may be another resin, or may be glass or metal.
  • the inner surface of the culture solution container 2 may be surface-treated by coating it with fluorine or the like, or may be subjected to a surface treatment having chemical resistance according to the properties of the culture solution S.
  • the culture solution container 2 does not have to be a transparent material.
  • the shape of the culture solution container 2 is substantially rectangular in a plan view.
  • the culture solution container 2 has a rectangular flat bottom plate 21 and four side walls 22.
  • the bottom plate 21 extends so as to spread along the horizontal plane in a state in which the culture solution S is contained (the state shown in FIG. 1).
  • the thickness of the bottom plate 21 is, for example, 1 mm.
  • the length of the bottom plate 21 in the longitudinal direction is, for example, 120 mm or more and 132 mm or less.
  • the length of the bottom plate 21 in the lateral direction is, for example, 80 mm or more and 90 mm or less.
  • the four side walls 22 are erected along the four edges of the bottom plate 21. Each side wall 22 extends upward from each edge of the bottom plate 21.
  • the thickness of the side wall 22 is, for example, 1 mm.
  • the height H1 of the side wall 22 is, for example, 14.5 mm.
  • the bottom plate 21 and the four side walls 22 define a storage space V for storing the culture solution S.
  • the culture solution container 2 has only one storage space V.
  • the culture solution container 2 has an opening 23 that opens the storage space V on the opposite side to the bottom plate 21. With the bottom plate 21 placed along the horizontal plane, the opening 23 opens the accommodation space V upward.
  • the cell container 3 is, for example, a resin well plate.
  • the cell container 3 is made of a material that can transmit a light source for observation (for example, a light source L described later), and may be made transparent to visible light.
  • the material constituting the cell container 3 is preferably polystyrene, for example, but may be polycarbonate or glass.
  • the cell container 3 has a plate-shaped plate 31 and a plurality of (for example, 96 in this embodiment) wells 32 provided on the plate 31.
  • the well 32 includes a bottom portion 32a and a side wall 32b, as will be described later.
  • the bottom 32a of the well 32 may be made of a material that can transmit the light source for observation, and other parts (for example, the side wall 32b) may be made of a material that cannot transmit the light source. Good.
  • the inner surface of the well 32 of the cell container 3 may be subjected to a surface treatment in which cells C are less likely to adhere or a chemical resistant surface treatment.
  • the region (plate 31 or side wall 32b) other than the bottom 32a of the cell container 3 does not have to be a material different from the material of the bottom 32a, that is, a material that can transmit a light source, for example, an acrylic resin or a fluororesin (for example, PTFE). ) Or metal, or fibers such as non-woven fabric.
  • a surface treatment that makes it difficult for cells to adhere to a region other than the inner surface of the bottom 32a of the well 32 may be performed, or a chemical-resistant surface treatment may be performed.
  • the cell container 3 may be formed by appropriately combining the above-mentioned plurality of materials.
  • FIG. 3A is a plan view of the cell container 3 shown in FIG.
  • FIG. 3B is a cross-sectional view of the well 32 of the cell container 3 shown in FIG. 1 along the line IIIB-IIIB.
  • the outer shape of the plate 31 is a substantially rectangular shape that is one size larger than the bottom plate 21.
  • the thickness of the plate 31 is, for example, 1 mm.
  • the plate 31 is arranged with a plurality of connection holes 31a (the same number as the wells 32, for example, 96 in the present embodiment) for connecting the wells 32 through the plate 31 in the thickness direction. ..
  • the inner diameter ⁇ 1 of the connection hole 31a is, for example, 6.0 mm.
  • the plate 31 connects a plurality of wells 32 to each other.
  • the plate 31 has an outer shape larger than the opening 23 of the culture solution container 2, and when the cell container 3 is installed in the culture solution container 2, the plate 31 is the edge of the opening 23 of the culture solution container 2.
  • Each well 32 is positioned in the culture solution container 2 by being in contact with the culture solution container 2.
  • Well 32 is a container for holding cells C and cell mass M cultured in the culture medium S.
  • the thickness of the well 32 is, for example, 1 mm.
  • the plurality of wells 32 are configured so that they can be taken in and out of the storage space V of the culture solution container 2. In this embodiment, all wells 32 can be moved in and out of one accommodation space V.
  • Each of the plurality of wells 32 is connected to the connection hole 31a.
  • the plurality of wells 32 are arranged on one main surface 31b of the plate 31.
  • the cell container 3 has wells 32 arranged in 12 rows in the longitudinal direction of the plate 31 and 8 rows of wells 32 in the lateral direction of the plate 31.
  • the pitch P of the two adjacent wells 32 is constant (eg, 9.0 mm).
  • the plurality of wells 32 are collectively arranged in the accommodating space V by moving the plate 31 close to the culture solution container 2, and collectively arranged from the accommodating space V by separating the plate 31 from the culture solution container 2. And leave.
  • the well 32 has a bottom portion 32a and a side wall 32b that connects the bottom portion 32a and the plate 31.
  • the bottom portion 32a has a concave shape that is recessed in a direction away from the plate 31, and can hold the culture solution S.
  • the outer shape of the bottom portion 32a is, for example, hemispherical.
  • the inner diameter ⁇ 2 of the bottom portion 32a is, for example, 5.2 mm.
  • the side wall 32b is a tubular portion extending from the peripheral edge of the bottom 32a to the connection hole 31a of the plate 31.
  • the bottom 32a and the side wall 32b define a culture space W for holding the cells C and the cell mass M to be cultured.
  • the height H2 of the culture space W is smaller than the height H1 of the side wall 22.
  • the height H2 is, for example, 10.5 mm.
  • the end of the side wall 32b opposite to the bottom plate 21 communicates with the connection hole 31a of the plate 31, and the culture space W is
  • the side wall 32b is provided with a liquid passing portion 4 through which the culture liquid S can pass.
  • the liquid passage portion 4 is configured so as not to pass at least the cell mass M.
  • the liquid passage portion 4 may be configured so as not to allow cells C to pass through.
  • the liquid passage portion 4 is one or a plurality of holes 41.
  • the number of holes 41 may be set arbitrarily. In this embodiment, an example in which a plurality of holes 41 are provided will be described.
  • the hole 41 penetrates the side wall 32b along the thickness direction of the side wall 32b.
  • the hole 41 may penetrate the side wall 32b along a direction inclined with respect to the thickness direction of the side wall 32b.
  • the hole 41 communicates with the culture space W and the external space.
  • the hole 41 allows the culture solution S to pass through.
  • the shape of the hole 41 is circular when viewed from, for example, the penetrating direction (that is, the thickness direction of the side wall 32b).
  • the size in the plane intersecting the penetrating direction of the hole 41 is a size that does not allow the cell mass M to pass through, for example, a diameter of 0.01 mm or more and a diameter of 6.0 mm or less.
  • the in-plane size of the holes 41 intersecting in the penetrating direction may be 3.0 mm or less in diameter or 1.0 mm or less in diameter.
  • the in-plane size (diameter) of the holes 41 intersecting in the penetrating direction is 1.0 mm as an example.
  • the liquid passage portion 4 is provided at a position separated from the tip end (lower end) of the bottom portion 32a by a predetermined height H3 or more.
  • the height H3 from the lower end of the bottom portion 32a to the lower end of the liquid passage portion 4 may be 1.0 mm or more when the diameter of the cell mass M to be cultured is 1 mm or less, and the height H3 is 5.0 mm. It may be as follows.
  • the height H3 When the diameter of the cell mass M to be cultured is 0.1 mm or more and 2 mm or less, the height H3 may be 1.0 mm or more, and the height H3 may be 4.0 mm or less. Further, as a pattern of the relationship between the diameter of the cell mass M and the height H3 of the water surface of the culture solution, for example, when the diameter of the cell mass M is 1 mm or less, the height H3 may be 2 mm, and the cell mass M may be used. The height H3 may be 3 mm or more and 4 mm or less when the diameter of the cell is 1 mm or more and 2 mm or less.
  • the height H3 is preferably set as low as possible so that the cell mass M is not exposed from the water surface of the culture solution and the culture solution does not hinder the observation in order to prevent drying, and the height H3 is not limited to the above range. Good. If the upper surface of the cell mass M and the water surface of the culture solution are too close to each other, the water surface directly above the cell mass M becomes convex due to the influence of surface tension, and the observation light does not become straight with respect to the microscope, which hinders observation. Therefore, for example, it is preferable to secure a distance of at least 1 mm or more or 2 mm or more as the distance from the upper part of the cell mass M to the water surface of the culture solution.
  • the liquid passing portion 4 may be provided over a predetermined range R extending from a position separated by a height H3 from the lower end of the bottom portion 32a toward the plate 31.
  • the range R is the entire region of the side wall 32b.
  • the range R may be a part of the side wall 32b.
  • a plurality of holes 41 are dispersedly provided in the range R.
  • the height H3 is constant among the plurality of wells 32. In other words, among the plurality of wells 32, the heights H3 of the holes 41 located at the lowermost ends are equal to each other.
  • the term "constant” used here means not only when each height H3 from the lower end of each bottom portion 32a to the lower end of each liquid passing portion 4 coincides, but also ⁇ 10% with respect to the average height of each height H3. Including the height within the range of.
  • the plurality of holes 41 other than the hole 41 located at the lowermost end may be provided at an arbitrary position within the range R.
  • FIG. 4A is a cross-sectional view showing a mold 5 used in the method for producing the cell culture vessel 1.
  • a mold 5 for molding is prepared.
  • FIG. 4B is a view of the upper mold 51 and the core 53 shown in FIG. 4A as viewed from below.
  • 5A and 5B are diagrams showing each step of the method for producing the cell culture vessel 1.
  • the mold 5 includes an upper mold 51, a lower mold 52, and a plurality of cores 53.
  • the upper mold 51 and the lower mold 52 are molds for forming the outer shapes of the plate 31 and the well 32.
  • the upper mold 51 has a plurality of convex portions 51a having a shape corresponding to the outer shape of each of the plurality of wells 32.
  • the lower mold 52 has a plurality of concave portions 52a having a shape corresponding to the outer shape of each of the plurality of wells 32.
  • Each of the convex portion 51a and the concave portion 52a is formed with a through hole through which a plurality of cores 53 pass.
  • the plurality of cores 53 are molds for forming the liquid passage portion 4.
  • FIG. 5A shows some wells 32 during molding and FIG. 5B shows some wells 32 after molding.
  • Each core 53 forms a hole 41.
  • the core 53 is a rod-shaped member having an outer peripheral surface having the same shape as the hole 41.
  • the core 53 is used in a state of penetrating the upper mold 51 and the lower mold 52.
  • the plurality of cores 53 may be arranged in parallel, for example, or the extending directions may intersect, depending on the position where the hole 41 is formed in the well 32.
  • the plurality of cores 53 are arranged in the number of wells 32 according to the number of holes 41 formed.
  • the hole 41 may be formed by one core 53 per well 32, or the hole 41 may be formed by a plurality of cores 53 per well 32.
  • the pellet-shaped resin material is melted, the melted resin material is poured into the mold 5, and the cell container 3 is cured in that state. As a result, the cell container 3 in which the liquid passing portion 4 is provided in the well 32 is manufactured. As described above, the production of the cell culture container 1 is completed.
  • the cell container 3 may be manufactured before the culture solution container 2 is manufactured, or the culture solution container 2 and the cell container 3 may be manufactured in parallel.
  • cell culture method a method for culturing cells C and cell mass M will be described.
  • culture of cell C and cell mass M means that cell C is immersed in culture medium S to aggregate, cell mass M is immersed in culture medium S to change its state, and differentiation. It means to let.
  • Parts (a) to (d) of FIG. 6 are schematic cross-sectional views showing changes in the state of culture of cells C and cell mass M.
  • Cell C immersed in the culture medium S (see part (a) of FIG. 6) aggregates over several hours to several days to form a cell mass M (see part (b) of FIG. 6). By continuing the culture, the cell mass M becomes more aggregated (see part (c) of FIG.
  • This period varies depending on the type of cell C and the content of differentiation, and may be several days to several weeks. During this time, the cell mass M is optically observed as appropriate. Hereinafter, a specific description will be given.
  • the cell culture vessel 1 is prepared (preparation step).
  • a culture solution container 2 containing the culture solution S and a cell container 3 before allowing a plurality of wells 32 to enter the storage space V of the culture solution container 2 are prepared.
  • the cell C is immersed in the culture solution S, and the cell C and the cell mass M obtained by agglutination of the cell C are cultured (culture step).
  • the culture liquid S is also introduced into the culture space W of the well 32 via the liquid passage portion 4. Let it enter.
  • the culture space W is filled with the culture solution S.
  • Culture is started by seeding cells C in this culture space W.
  • the cell C is in a state of being held in the well 32. In that state, it waits until a predetermined time elapses.
  • the predetermined time is, for example, the time until the cell mass M is obtained by the aggregation of cells C.
  • the predetermined time is appropriately set according to the cells C to be cultured, and is, for example, several hours to several days.
  • FIG. 9 and 10 are cross-sectional views schematically showing a culture step of the cell culture method according to the embodiment.
  • a part of the culture solution S is discharged from the culture space W of the well 32.
  • the cell container 3 is taken out from the culture solution container 2.
  • a part of the culture solution S is discharged from the well 32 via the liquid passing portion 4.
  • the part of the culture solution S discharged here is a part of the culture solution S that was present above the lower end (the lowermost hole 41) of the liquid passage portion 4 in the culture space W of the well 32. is there.
  • the part of the culture solution S in the plurality of wells 32 is discharged at once. Further, by this operation, the culture solution S remains only in the portion including the bottom portion 32a of the well 32 (the portion of the culture space W below the liquid passage portion 4). Therefore, the state in which the cell mass M is immersed in the culture solution S is maintained.
  • observation is performed from below the well 32 (bottom 32a) by an observation device D (for example, a microscope). This operation is performed for each one or a plurality of wells 32.
  • observation device D for example, a microscope
  • the above-mentioned observation step may be executed only once or repeatedly at intervals. By repeatedly executing the observation step, the state of change in the cell mass M may be observed as appropriate (for example, periodically).
  • the parts (a) to (c) of FIG. 11 are cross-sectional views schematically showing each observation step for observing the state of change in the cell mass M. Examples of changes in the cell mass M include an initial state of the cell mass M (see part (a) of FIG. 11) and a state of increased aggregation of the cell mass M (see part (b) of FIG. 11). ), The aggregation of the cell mass M is weakened (that is, the aggregation of the cell mass M is loosened), or the cell mass M is differentiated (see part (c) of FIG.
  • the liquid passes by re-entering the plurality of wells 32 into the storage space V of the culture liquid container 2 containing the culture liquid S.
  • the culture solution S is allowed to enter the culture space W of the well 32 via the part 4.
  • the culture spaces W of the plurality of wells 32 are collectively filled with the culture solution S.
  • the cell mass M is further cultured.
  • the cell mass M is continuously cultured and observed again, so that the cell mass M is aggregated as shown in the part (b) of FIG.
  • the state of strengthening and the state of differentiation of the cell mass M may be observed as shown in part (c) of FIG.
  • the observation of the cell mass M is completed.
  • the desired cell mass M is generated.
  • the observation period varies depending on the type of cell and the content of differentiation, and may be several days to several weeks.
  • the cell culture container 1, the method for producing the cell culture container 1, and the action and effect of the cell culture method described above will be described.
  • the culture solution S is taken in and out of the well 32 via the liquid passing portion 4 provided on the side wall 32b. Therefore, the well 32 can be filled with the culture solution S only by inserting the well 32 into the culture solution container 2 containing the culture solution S. Further, when observing the culture state of the cell mass M, only a part of the culture solution S in the well 32 is held in the bottom 32a by simply ejecting the well 32 from the culture solution container 2. Only can be easily discharged. Therefore, it is possible to efficiently observe the cultured state of the cell mass M in the process of culturing the cell C and the cell mass M.
  • the liquid passage portion 4 is a hole 41 penetrating the side wall 32b. According to the hole 41 penetrating the side wall 32b, a configuration capable of passing the culture solution S can be realized.
  • the material constituting the well 32 is polystyrene.
  • Polystyrene has a property of being difficult to adhere to cell C and cell mass M, and is therefore suitable for culturing cell C and cell mass M.
  • well 32 By constructing well 32 from polystyrene, for example, cultured cells The lump or the like can be easily taken out from the well 32.
  • the cell vessel 3 has a plurality of wells 32 connected to each other, and the height from the lower end of the bottom portion 32a to the lower end of the liquid passage portion 4 between the plurality of wells 32.
  • H3 is constant.
  • the culture solution S inside the well 32 is manually removed with a dropper or the like, the culture solution S remaining in the well 32 It is difficult to keep the amount constant. Further, as the number of wells 32 increases, the labor increases.
  • the plurality of wells are simply ejected from the culture solution container 2. With a certain amount of the culture solution S held in the bottom 32a of the 32, only a part of the culture solution S in the well 32 can be easily discharged.
  • the liquid passage portion 4 has a side wall 32b so that the height from the lower end of the bottom portion 32a to the lower end of the liquid passage portion 4 is 1.0 mm or more and 5.0 mm or less. It may be provided in.
  • the height to the lower end of the liquid passing portion 4 is 1.0 mm or more, the cell mass or the like held on the bottom 32a can be more reliably observed even when observing the cell mass or the like. It can be immersed in the culture solution. Further, since the height to the lower end of the liquid passing portion 4 is 5.0 mm or less, when observing a cell mass or the like, it is easier to obtain an appropriate amount of the culture solution that inhibits the observation. It becomes possible to discharge.
  • the step of preparing the cell culture container 1 and the cell C held in the well 32 are immersed in the culture solution S contained in the culture solution container 2, and the cells C and the cells C are immersed. It is provided with a step of culturing the cell mass M obtained by agglomeration of cells and a step of observing the cell mass M.
  • the observing step the cell mass M in the well 32 is observed in a state where a part of the culture solution S is discharged from the well 32 through the liquid passage portion 4 by taking out the cell container 3 from the culture solution container 2. Thereby, in the step of observing, a part of the culture solution S can be easily discharged from the well 32.
  • the cell culture method according to the present embodiment is particularly advantageous when the culture state of the cell mass M is repeatedly observed as appropriate.
  • the method for manufacturing the cell culture vessel 1 includes a step of manufacturing the cell vessel 3 by molding, and the step is an upper mold having a convex portion 51a having a shape corresponding to the outer shape of the well 32. 51, a lower mold 52 arranged to face the convex portion 51a and having a concave portion 52a having a shape corresponding to the outer shape of the well 32, and a core 53 penetrating the convex portion 51a and the concave portion 52a. It has a step of preparing a mold 5 provided with a mold 5 and a step of curing a resin material poured into the mold 5 to form a well 32, and a hole 41 as a liquid passing portion 4 is formed by a core 53. You may.
  • the cell culture container 1 can be easily formed. Therefore, by using the manufactured cell culture vessel 1, it is possible to efficiently observe the culture state of the cell mass M in the process of culturing the cell C and the cell mass M. Further, when the cell mass M is continuously cultured and the state of change in the cell mass M is appropriately observed, the manufactured cell culture vessel 1 is used to efficiently observe the desired culture state of the cell mass M. It will be possible to do well.
  • the above-described embodiment describes an embodiment of a cell culture vessel, a method for producing a cell culture vessel, and a method for culturing a cell mass according to the present disclosure.
  • the cell culture container, the method for producing the cell culture container, and the cell culture method according to the present disclosure may be obtained by arbitrarily modifying each of the above-described embodiments.
  • the culture solution container 2 has one continuous storage space V, but may have a plurality of storage spaces V.
  • 12A and 12B are cross-sectional views schematically showing the cell culture vessel 1A according to the modified example, respectively.
  • the cell culture container 1A is different from the cell culture container 1 in that it has the culture solution container 2A instead of the culture solution container 2, and has the same configuration as the cell culture container 1 in other respects.
  • the culture solution container 2A has a plurality of storage spaces V. Specifically, the culture solution container 2A further has a plurality of partition walls 24 arranged in the space defined by the bottom plate 21 and the four side walls 22. The partition wall 24 watertightly partitions the adjacent accommodation spaces V. In other words, the plurality of accommodation spaces V are separated from each other by the plurality of partition walls 24. A part of a plurality of wells 32 can be taken in and out of each accommodation space V. As an example, the culture solution container 2A has 12 storage spaces V, and the size of one storage space V is a size capable of accommodating one row (8 out of 96) wells 32. ..
  • the partition wall 24 is erected on the upper surface of the bottom plate 21. Each partition wall 24 is provided at a position corresponding to each accommodation space V on the upper surface of the bottom plate 21.
  • the thickness of the partition wall 24 is, for example, 1 mm.
  • the height H4 of the partition wall 24 is, for example, 14.5 mm.
  • the material constituting the partition wall 24 may be the same as the material constituting the bottom plate 21.
  • the number of accommodation spaces V may be set arbitrarily.
  • the culture solution container 2A may have the same number (96) of storage spaces V as the wells 32, or may have only two storage spaces V. When the culture solution container 2A has only two storage spaces V, it may have only one partition wall 24.
  • the culture solution S since the culture solution S is taken in and out of the well 32 via the liquid passage portion 4 provided on the side wall 32b, the same action and effect as the cell culture container 1 can be obtained. Further, according to the culture solution container 2A, since the plurality of storage spaces V are watertightly partitioned, the culture solution S does not enter the wells 32 housed in each storage space V from the other storage spaces V. Therefore, contamination caused by the culture solution S contained in the other storage space V can be avoided.
  • the number of wells 32 in the cell container 3 is an example, and may be set as appropriate.
  • 13A to 13D are plan views schematically showing the cell containers 3B to 3E according to the modified example, respectively.
  • the cell containers 3B to 3E differ from the cell container 3 in the number of wells 32, and have the same configuration as the cell container 3 in other respects.
  • the cell culture vessel 1 may include a cell vessel 3B having only one well 32 instead of the cell vessel 3.
  • the cell culture containers 1 and 1A may include a cell container 3C having two wells 32 instead of the cell container 3.
  • the cell culture containers 1 and 1A may include a cell container 3C having 6 wells 32 instead of the cell container 3.
  • the cell culture containers 1 and 1A may include a cell container 3C having eight wells 32 instead of the cell container 3.
  • the cell container in the cell culture containers 1 and 1A may have a number of wells 32 other than the above, and may have, for example, 384 wells 32.
  • the shape of the bottom 32a of the well 32 is an example, and may be changed as appropriate.
  • 14A and 14B are cross-sectional views schematically showing wells 32F and 32G according to the modified example, respectively.
  • the well 32F shown in FIG. 14A differs from the well 32 in that it has a bottom 33a instead of the bottom 32a, and has the same configuration as the well 32 in other respects.
  • the bottom portion 33a has a peripheral wall 33b and a circular bottom wall 33c that closes below the peripheral wall 33b.
  • the peripheral wall 33b has a cylindrical shape having the same diameter as the inner diameter of the side wall 32b. In this case, the entire shape of the culture space W defined by the bottom portion 33a and the side wall 32b is a cylindrical shape.
  • the liquid passage portion 4 (hole 41) is provided in a range RF separated from the tip end (lower end) of the bottom portion 33a by the above-mentioned predetermined height H3.
  • the well 32G shown in FIG. 14B differs from the well 32 in that it has a bottom 34a instead of the bottom 32a, and has the same configuration as the well 32 in other respects.
  • the bottom portion 34a has a peripheral wall 34b and a circular bottom wall 34c that closes below the peripheral wall 34b.
  • the peripheral wall 34b has a shape tapered in a conical shape from the lower end of the side wall 32b.
  • the liquid passage portion 4 (hole 41) is provided in the range RG separated from the tip end (lower end) of the bottom portion 34a by the above-mentioned predetermined height H3.
  • the culture solution S is taken in and out of the wells 32F and 32G via the liquid passing portion 4 provided on the side wall 32b. Therefore, it is possible to efficiently observe the cultured state of the cell mass M in the process of culturing the cell C and the cell mass M. Further, when the cell mass M is subsequently cultured and the state of change in the cell mass M is appropriately observed, it becomes possible to efficiently observe the desired culture state of the cell mass M.
  • the configuration of the liquid passage portion 4 is an example, and may be changed as appropriate.
  • the shape of the hole 41 of the liquid passage portion 4 may be changed as appropriate.
  • the shape of the hole 41 may be, for example, an elliptical shape or a semicircular shape.
  • the liquid passage portion 4 may be a combination of a plurality of holes 41 having different shapes.
  • the liquid passage portion 4H shown in FIG. 15A is provided in a partial region (range RH) of the side wall 32b.
  • the lower end of the range RH is a position separated by a height H3 from the tip (lower end) of the bottom portion 32a.
  • the height of the range RH is, for example, 7.0 mm.
  • the liquid passage portion 4H is one or more elongated holes 41H (slits).
  • the elongated hole 41H penetrates the side wall 32b.
  • the elongated hole 41H extends along the extending direction (vertical direction) of the side wall 32b.
  • the shape of the elongated hole 41H is, for example, a rectangular shape.
  • the height of the elongated hole 41H (in the present modification, the size in the longitudinal direction) is 0.01 mm or more and 7.0 mm or less, which is the same as the range RH (7.0 mm) as an example.
  • the width of the elongated hole 41H (in this modified example, the size in the lateral direction) is, for example, 0.01 mm or more and 6.0 mm or less. Alternatively, the width of the elongated hole 41H may be 3.0 mm or less, or 1.0 mm or less.
  • the liquid passage portion 4J shown in FIG. 15B is provided in a partial region (range RJ) of the side wall 32b.
  • the range RJ is similar to, for example, the range RH.
  • the liquid passage portion 4J is a plurality of holes 41 densely provided in the range RJ.
  • the liquid passage portion 4K shown in FIG. 15C is provided in a partial region (range RK) of the side wall 32b.
  • the range RK is the same as, for example, the ranges RH and RJ.
  • the liquid passage portion 4K is a plurality of holes 41K densely provided in the range RK.
  • the hole 41K differs from the hole 41 in that it exhibits a rhombus when viewed from the penetrating direction, and has the same configuration as the hole 41 in other respects.
  • the height of the hole 41K is, for example, 0.01 mm or more and 7.0 mm or less.
  • the width of the hole 41K is, for example, 0.01 mm or more and 6.0 mm or less. Alternatively, the width of the hole 41K may be 3.0 mm or less, or 1.0 mm or less.
  • FIG. 16 is a cross-sectional view schematically showing the liquid passing portion 4L according to the modified example.
  • the liquid passage portion 4L may be configured by forming at least a part of the side wall 32b (range R) with a material different from that of the bottom 32a.
  • the range R is the entire region of the side wall 32b.
  • examples of the material constituting the liquid passing portion 4L include a porous polymer material through which the culture liquid S passes. As a result, it is possible to realize a structure in which the culture solution S can pass through the region of the side wall 32b made of the porous polymer material.
  • FIG. 17A is a cross-sectional view showing a mold 5A used in the method for producing a cell culture container according to a modified example.
  • FIG. 17B is a cross-sectional view taken along the line XVIIB-XVIIB of FIG. 17A.
  • FIG. 18 is a diagram showing a part of wells 32M after molding by the method for producing a cell culture container according to a modified example.
  • the mold 5A has an upper mold 51A and a lower mold 52A.
  • the upper mold 51A has a plurality of wells 32 and a plurality of convex portions 51a having the same shape as each of the wells 32.
  • the lower mold 52A has a plurality of wells 32 and a plurality of concave portions 52a having the same shape as each of the wells 32.
  • the upper mold 51A has one or more (four in the example of FIG. 17B) protrusions 51b that further project from the surface of the convex portion 51a.
  • the protrusion 51b extends in the vertical direction (that is, the direction in which the upper mold 51A and the lower mold 52A face each other) over the range in which the liquid passing portion (the liquid passing portion 4M described later) is provided. ..
  • the well 32M differs from the well 32 in that it has a liquid passing portion 4M instead of the liquid passing portion 4, and has the same configuration as the well 32 in other respects.
  • the protrusion 51b forms a slit 41M as a liquid passage portion 4M.
  • One protrusion 51b may form one slit 41M per well 32M, or a plurality of slits 41M may be formed by a plurality of protrusions 51b per well 32.
  • the slit 41M as the liquid passage portion 4M is formed in the well 32M of the cell container 3 manufactured by molding, so that the cell culture container 1 can be easily formed. Therefore, by using the manufactured cell culture vessel 1, it is possible to efficiently observe the cell mass M in the process of culturing the cell C and the cell mass M. Further, when the cell mass M is subsequently cultured and the state of change in the cell mass M is appropriately observed, it becomes possible to efficiently observe the desired culture state of the cell mass M.
  • FIGS. 20A and 20B are diagrams showing each step of the method for producing a cell culture vessel according to a modified example.
  • FIG. 19A shows some wells 32 in the step of irradiating the laser
  • FIG. 19B shows some wells 32 after molding by the step shown in FIG. 19A.
  • the molded body 30 is molded by mold molding (step of molding the mold).
  • the molded body 30 exhibits the outer shape of the plate 31 and the plurality of wells 32.
  • the holes 41 are formed in the molded body 30 by laser irradiation (step of irradiating the laser).
  • the laser device 6 is used in the step of irradiating the laser.
  • the laser device 6 has a plurality of laser heads 61 arranged corresponding to the plurality of wells 32.
  • Each laser head 61 outputs a laser beam in a direction diagonally intersecting the side wall 32b.
  • a hole 41 that obliquely penetrates the side wall 32b may be formed.
  • the step of irradiating the laser may be performed as follows.
  • FIG. 20A shows some wells 32 in the step of irradiating another laser
  • FIG. 20B shows some wells 32 after molding according to FIG. 20A.
  • the laser device 7 may be used instead of the laser device 6.
  • the laser device 7 has a plurality of laser heads 71 arranged corresponding to the plurality of wells 32. Each laser head 71 outputs a laser beam in a direction orthogonal to the side wall 32b.
  • a shielding plate 72 may be arranged between two adjacent molded bodies 30.
  • the laser beam may be irradiated over the plurality of molded bodies 30 by not arranging the shielding plate 72.
  • a hole 41 may be formed through the side wall 32b in the thickness direction of the side wall 32b.
  • the cell container 3 provided with the liquid passing portion 4 in the well 32 is manufactured.
  • the manufactured well 32 is formed with a hole 41 as a liquid passage portion 4 by laser irradiation, so that the cell culture vessel 1 can be easily formed. Therefore, by using the manufactured cell culture vessel 1, it is possible to efficiently observe the cell mass M in the process of culturing the cell C and the cell mass M. Further, when the cell mass M is subsequently cultured and the state of change in the cell mass M is appropriately observed, it becomes possible to efficiently observe the desired culture state of the cell mass M.
  • 21 to 28 are diagrams schematically showing wells according to a further modification.
  • the well 32 is taken out from the culture solution container 2 when observing the cell mass M by the light emitted from the light source L.
  • the culture solution S discharged from the liquid passing portion 4 drips (see FIG. 29) and adheres to the outside of the bottom portion 32a of the well 32.
  • the droplet of the culture solution S may be located on the line connecting the light source L, the cell mass M, and the observation device D, and may hinder the observation of the cell mass M. Therefore, for example, as shown in FIGS.
  • the guiding members 80, 81 that guide the flow of the culture solution S discharged from the liquid passing portion 4 on the outer peripheral surfaces of the bottom portions 32a, 33a, 34a. , 82 may be provided respectively.
  • Each of the guiding members 80 to 82 is, for example, a tubular member extending in a circumferential shape.
  • Each of the guiding members 80 to 82 is provided on the outer peripheral surface of each well 32, 32F, 32G in a region on the bottom 32a, 33a, 34a side of the liquid passing portion 4, and is provided on the opposite side of the liquid passing portion 4. (That is, it extends to the lower side of the figure).
  • the guide members 80 to 82 need only have a length that does not transmit the culture solution S to the bottoms 32a, 33a, 34a, and have a length equal to the lower ends of the bottoms 32a, 33a, 34a. It may be longer, or it may be longer.
  • the length of the guide members 80 to 82 can be, for example, 0.5 mm or more and 10 mm or less. This prevents the observation of the cell mass M due to the dripping of the culture solution S discharged from the liquid passage portion 4 when the cell container 3 having the wells 32, 32F or 32G is taken out from the culture solution container 2. Can be done.
  • the guide member 83 may be provided so as to incline toward the outside of the well 32. In this case, the guide member 83 may be inclined outward at an inclination angle of 90 degrees or less with respect to the vertical direction.
  • the guiding member 84 may be provided so as to incline toward the inside of the well 32. In this case, it may be inclined inward with an inclination angle of 45 degrees or less with respect to the vertical direction. At this angle, the installation of the observation device D is not hindered.
  • the guiding member 80 may be configured to extend linearly downward from the side wall 32b, but as shown in FIG.
  • the guiding member 85 is radially downward with respect to the side wall 32b. It may be configured to be located inside the bottom portion 32a and extend downward from the middle portion of the bottom portion 32a. However, in the configuration shown in FIG. 26, the facing distance of the guiding member 85 can be made larger than the diameter of the cell mass M to be observed. For example, when the diameter of the cell mass M is 1 mm or less, the installation location of the guide member 85 can be a region having a diameter of 1 mm or more from the center of the bottom portion 32a. As a result, it is possible to prevent the observation of the cell mass M by the observation device D from being hindered.
  • the guiding member is configured to prevent dripping, it is not necessary to be arranged on the entire circumference of the bottom portion 32a.
  • the liquid passing portion 4 is one of the side walls 32b.
  • the guiding member 86 may be provided only on the side where the liquid passing portion 4 is provided.
  • the guiding member 86 may be a member having a semi-cylindrical shape or an arc-shaped cross section.
  • the liquid passing portion 4 A hole 87a may be provided in a part of the guide member 87 on the side where the guide member 87 is not provided.
  • the cell culture vessel 1 may be further provided with the dripping removing device 90.
  • the dripping remover 90 is made of, for example, resin or metal.
  • a gauze 91 for absorbing water droplets S1 of the culture solution S may be installed on the dripping remover 90.
  • the base itself of the dripping remover 90 is made of an absorbent material (sponge material), and the droplet S1 of the culture solution S adhering to the outer periphery of the bottom 32a of the well 32 of the cell culture container 1 is formed. It may be absorbed and removed before observation.
  • the surface of the dripping removing device 90 may have an uneven shape so as to avoid the guiding member 80 or the like, or may have a flat surface when the guiding member 80 or the like is absent.
  • the base of the dripping remover 90 or the gauze 91 arranged on the base may be made of a material that can be sterilized in order to prevent contamination.

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Abstract

細胞観察容器は、培養液を収容するように構成された第１容器と、培養液によって培養される細胞および細胞塊のいずれか一方または両方を保持した状態で第１容器に対して出し入れ可能な少なくとも一つのウェルを有する第２容器と、を備える。少なくとも一つのウェル各々は、培養液を保持可能な底部と、底部の周縁部から延在する側壁と、を有する。側壁には、第１容器に収容された培養液が通過可能な液通過部が設けられている。

Description

細胞培養容器、細胞培養方法、および細胞培養容器の製造方法
　本開示は、細胞培養容器、細胞培養方法、および細胞培養容器の製造方法に関する。
　本出願は、２０１９年１１月１４日出願の日本出願第２０１９－２０６２４８号に基づく優先権を主張し、前記日本出願に記載された全ての記載内容を援用する。
　細胞および細胞塊（以下、「細胞塊等」ともいう。）を培養するための容器として、複数のウェルが配列されたもの（所謂、ウェルプレート）が知られている。特許文献１には、培養液の中で細胞塊等を培養するための細胞用培養容器が記載されている。この細胞用培養容器は、培養する細胞塊等が保持される複数のウェルを有する。
国際公開第２０１３－１８３７７号公報
　本開示の一実施形態に係る細胞観察容器は、培養液を収容するように構成された第１容器と、培養液によって培養される細胞および細胞塊のいずれか一方または両方を保持した状態で第１容器に対して出し入れ可能な少なくとも一つのウェルを有する第２容器と、を備える。少なくとも一つのウェル各々は、培養液を保持可能な底部と、底部の周縁部から延在する側壁と、を有する。側壁には、第１容器に収容された培養液が通過可能な液通過部が設けられている。
図１は、一実施形態に係る細胞培養容器を模式的に示す断面図である。 図２は、一実施形態に係る細胞培養容器を模式的に示す断面図である。 図３Ａは、図１に示す細胞容器の平面図である。 図３Ｂは、図１に示す細胞容器のウェルのＩＩＩＢ－ＩＩＩＢ線に沿った断面図である。 図４Ａは、一実施形態に係る細胞培養容器の製造方法において用いられる金型を示す断面図である。 図４Ｂは、図４Ａに示す上部金型および中子を下方から見た図である。 図５Ａは、一実施形態に係る細胞培養容器の製造方法の一工程を示す図である。 図５Ｂは、図５Ａに示す細胞培養容器の製造方法の一工程の後の状態を示す図である。 図６の（ａ）部～（ｄ）部は、細胞および細胞塊の培養状態の変化を示す模式的な断面図である。 図７は、一実施形態に係る細胞培養方法の培養工程を模式的に示す断面図である。 図８は、一実施形態に係る細胞培養方法の培養工程を模式的に示す断面図である。 図９は、一実施形態に係る細胞培養方法の観察工程を模式的に示す断面図である。 図１０は、一実施形態に係る細胞培養方法の観察工程を模式的に示す断面図である。 図１１の（ａ）部～（ｃ）部は、細胞塊の変化の様子を観察する各観察工程を模式的に示す断面図である。 図１２Ａは、変形例に係る細胞培養容器を模式的に示す断面図である。 図１２Ｂ は、図１２Ａに示す変形例に係る細胞培養容器を模式的に示す断面図である。 図１３Ａは、変形例に係る細胞容器を模式的に示す平面図である。 図１３Ｂは、変形例に係る細胞容器を模式的に示す平面図である。 図１３Ｃは、変形例に係る細胞容器を模式的に示す平面図である。 図１３Ｄは、変形例に係る細胞容器を模式的に示す平面図である。 図１４Ａは、変形例に係るウェルを模式的に示す断面図である。 図１４Ｂは、変形例に係るウェルを模式的に示す断面図である。 図１５Ａは、変形例に係る液通過部を模式的に示す斜視図である。 図１５Ｂは、変形例に係る液通過部を模式的に示す斜視図である。 図１５Ｃは、変形例に係る液通過部を模式的に示す斜視図である。 図１６は、変形例に係る液通過部を模式的に示す断面図である。 図１７Ａは、変形例に係る細胞培養容器の製造方法において用いられる金型を示す断面図である。 図１７Ｂは、図１７Ａに示す金型のＸＶＩＩＢ－ＸＶＩＩＢ線に沿った断面図である。 図１８は、変形例に係る細胞培養容器の製造方法による成形後の一部のウェルを示す図である。 図１９Ａは、変形例に係る細胞培養容器の製造方法の一工程を示す図である。 図１９Ｂは、図１９Ａに示す細胞培養容器の製造方法の一工程の後の状態を示す図である。 図２０Ａは、変形例に係る細胞培養容器の製造方法の一工程を示す図である。 図２０Ｂは、図２０Ａに示す細胞培養容器の製造方法の一工程の後の状態を示す図である。 図２１は、更なる変形例に係るウェルを模式的に示す図である。 図２２は、更なる変形例に係るウェルを模式的に示す図である。 図２３は、更なる変形例に係るウェルを模式的に示す図である。 図２４は、更なる変形例に係るウェルを模式的に示す図である。 図２５は、更なる変形例に係るウェルを模式的に示す図である。 図２６は、更なる変形例に係るウェルを模式的に示す図である。 図２７は、更なる変形例に係るウェルを模式的に示す図である。 図２８は、更なる変形例に係るウェルを模式的に示す図である。 図２９は、更なる変形例に係る細胞培養容器を模式的に示す図である。
［本開示が解決しようとする課題］
　細胞培養容器を用いて細胞塊等の培養が行われる際、ウェルの内部は、細胞塊等の培養のために培養液によって満たされる。細胞塊等の培養の際には、培養液の蒸発によって細胞塊等が乾燥してしまうことを避ける観点から、所定量以上の培養液がウェルの内部に存在していることが求められる。しかしながら、培養の過程で細胞塊を光学的に観察しようとすると、この培養液の光吸収によってウェルを観察するための透過光量を十分に得られない場合がある。そのような場合、ウェルの内部の培養液を減らす必要が生じる。培養液を減らすためには、例えば、ウェルの内部の培養液をスポイト等によって手作業で抜くことが考えられ、手間がかかる。
［本開示の効果］
　本開示によれば、細胞塊を培養する過程において細胞塊の培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
［本開示の実施形態の説明］
　最初に、本開示の実施形態の内容を列記して説明する。一実施形態に係る細胞培養容器は、培養液を収容するように構成された第１容器と、培養液によって培養される細胞および細胞塊のいずれか一方または両方を保持した状態で第１容器に対して出し入れ可能な少なくとも一つのウェルを有する第２容器と、を備える。少なくとも一つのウェル各々は、培養液を保持可能な底部と、底部の周縁部から延在する側壁と、を有する。側壁には、第１容器に収容された培養液が通過可能な液通過部が設けられている。
　この細胞培養容器においては、側壁に設けられた液通過部を介して培養液がウェルに出し入れされる。このため、培養液が収容された第１容器にウェルを進入させるだけで、ウェルを培養液で満たすことができる。一方、細胞塊の培養状態を観察する際には、第１容器からウェルを退出させるだけで、底部に培養液を保持した状態で、ウェル内の培養液の一部のみを簡易に排出することができる。したがって、細胞および細胞塊を培養する過程において細胞塊の培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
　一実施形態に係る細胞培養容器において、液通過部は、側壁を貫通する少なくとも一つの孔であってもよい。側壁を貫通する孔によって、培養液を通過可能な構成を実現できる。
　一実施形態に係る細胞培養容器において、少なくとも一つのウェルを構成する材料は、ポリスチレンであってもよい。ポリスチレンは、細胞塊等に接着しにくい性質を有しているため、細胞塊等の培養に適しており、ウェルをポリスチレンから構成することにより、例えば、培養された細胞塊等をウェルから容易に取り出すことができる。
　一実施形態に係る細胞培養容器において、液通過部は、側壁の少なくとも一部の領域であって、この領域は、培養液を通過させる多孔質な高分子材料によって構成されていてもよい。この場合、側壁のうち多孔質な高分子材料によって構成された領域によって、培養液を通過可能な構成を実現できる。
　一実施形態に係る細胞培養容器において、少なくとも一つのウェルは、互いに連結された複数のウェルであってもよい。この場合において、複数のウェル各々の各底部の下端から各液通過部の下端までの高さは一定であってもよい。例えば、複数のウェルを有する構成において、細胞塊の培養状態を観察する際に、ウェルの内部の培養液をスポイト等によって手作業で抜くと、ウェルに残存させる培養液の量を一定とすることが困難である。また、ウェルの個数が多いほど手間も増大する。これに対し、本開示の一実施形態に係る細胞培養容器において、複数のウェル各々の各底部の下端から各液通過部の下端までの高さを一定とする構成によれば、第１容器からウェルを退出させるだけで、複数のウェル各々の各底部に一定量の培養液を保持した状態で、ウェル内の培養液の一部のみを簡易に排出することができる。これにより、各ウェルに収容される細胞塊等の培養状態の観察を同じ条件で効率よく行うことが可能となる。なお、ここで用いる「一定」とは、各底部の下端から各液通過部の下端までの各高さが一致する場合だけでなく、各高さの平均高さに対して±１０％の範囲内の高さも含む。
　一実施形態に係る細胞培養容器において、第１容器は、複数のウェルのうちの一部をそれぞれ出し入れ可能な複数の収容空間と、複数の収容空間を互いに隔てる少なくとも一つの隔壁と、を有していてもよい。この場合、複数の収容空間の間が水密に仕切られるので、各収容空間に収容されたウェルには、他の収容空間から培養液が進入しない。したがって、他の収容空間に収容された培養液に起因するコンタミネーションを回避することができる。
　一実施形態に係る細胞培養容器において、底部の下端から液通過部の下端までの高さが１．０ｍｍ以上で且つ５．０ｍｍ以下であってもよい。培養液を保持可能な底部に対して液通過部をこのような範囲に位置させることにより、細胞塊等の観察の際に培養液を液通過部を介して排出させても、細胞塊等を乾燥させないようにすることができ、観察作業を容易に行うことができる。より具体的には、液通過部の下端までの高さが１．０ｍｍ以上であることにより、細胞塊等を観察する場合であっても底部に保持される細胞塊等をより確実に培養液中に浸漬させておくことが可能となる。また、液通過部の下端までの高さが５．０ｍｍ以下であることにより、細胞塊等を観察する場合に、観察を阻害する培養液をより適切な量となるように、より容易に排出することが可能となる。
　一実施形態に係る細胞培養容器において、少なくとも一つのウェル各々は、液通過部から排出される培養液の流れを誘導する誘導部材を更に有してもよい。細胞塊の培養状態を観察する際にウェルを持ち上げて不要な培養液をウェルから排出すると、排出された培養液がウェルの下方に付着する液だれが生じ、培養された細胞塊の観察を阻害する可能性がある。しかしながら、細胞培養容器が液だれを防止する誘導部材を備えることにより、細胞塊を効率よく観察することが可能となる。なお、誘導部材を設ける場合において、誘導部材は、少なくとも一つのウェル各々の外周面上であって液通過部よりも底部の下端側の領域に設けられ、液通過部とは逆側に延在してもよい。この場合、誘導部材を簡易な構成で実現できる。
　一実施形態に係る細胞培養方法は、上記のいずれかの細胞培養容器を準備する工程と、少なくとも一つのウェルに保持された細胞を第１容器に収容された培養液に浸して、細胞と細胞が凝集して得られた細胞塊とを培養する工程と、細胞塊を観察する工程と、を備える。細胞塊を観察する工程は、第２容器を第１容器から取り出すことを含み、液通過部を介して少なくとも一つのウェルから培養液の一部を排出した状態で、少なくとも一つのウェル内の細胞塊を観察してもよい。この場合、観察する工程において、ウェルから培養液の一部を簡易に排出することができる。また、培養液の一部が排出された状態でウェル内の細胞塊を観察するので、培養液によって細胞塊の観察が阻害されることを抑制できる。したがって、細胞塊を培養する過程において細胞塊の培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
　一実施形態に係る細胞培養方法において、細胞塊を観察する工程は、第２容器を第１容器から取り出した後に第２容器の底部の外周に付着している液を除去することを含んでもよい。この場合、第２容器の外周に付着している培養液によって細胞塊の観察が阻害されることを抑制できる。したがって、細胞塊を培養する過程において細胞塊の培養状態の観察をより一層効率よく行うことが可能となる。
　一実施形態に係る細胞培養容器の製造方法は、上記の細胞培養容器を製造する方法であって、モールド成形によって第２容器を製造する工程を備える。この製造する工程は、少なくとも一つのウェル各々の外形状に対応する形状の凸状部を有する上部金型と、凸状部と向かい合って配置され、少なくとも一つのウェル各々の外形状に対応する形状の凹状部を有する下部金型と、凸状部および凹状部を貫通する中子と、を備える金型を準備する工程と、金型に流し込んだ樹脂材を硬化させて少なくとも一つのウェルを含む第２容器を成形する工程と、を有し、中子によって液通過部としての孔を形成してもよい。この方法によれば、モールド成形によって製造された第２容器のウェルには、液通過部としての孔が形成されるので、上記の構成を有する細胞培養容器を簡易に形成することができる。したがって、製造された細胞培養容器を用いることにより、細胞塊を培養する過程において細胞塊の培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
　別の実施形態に係る細胞培養容器の製造方法は、上記の細胞培養容器を製造する方法であって、モールド成形によって第２容器を製造する工程を備える。この製造する工程は、少なくとも一つのウェル各々の外形状に対応する形状の凸状部を有する上部金型と、凸状部と向かい合って配置され、少なくとも一つのウェル各々の外形状に対応する形状の凹状部を有する下部金型と、を備える金型を準備する工程と、金型に流し込んだ樹脂材を硬化させて少なくとも一つのウェルを含む第２容器を成形する工程と、を有する。上部金型は、上下方向に沿って延び、凸状部から突出して凹状部に接する突起を有し、突起によって液通過部としてのスリットを形成してもよい。この方法によれば、モールド成形によって製造された第２容器のウェルには、液通過部としてのスリットが形成されるので、上記の構成を有する細胞培養容器を簡易に形成することができる。したがって、製造された細胞培養容器を用いることにより、細胞塊を培養する過程において細胞塊の培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
　更に別の実施形態に係る細胞培養容器の製造方法は、上記の細胞培養容器を製造する方法であって、モールド成形によって少なくとも一つのウェルの外形状を呈する成形体を成形する工程と、レーザー照射によって成形体に液通過部としての孔を形成する工程と、を備えていてもよい。この方法によれば、製造されたウェルには、レーザー照射によって液通過部としての孔が形成されるので、上記の構成を有する細胞培養容器を簡易に形成することができる。したがって、製造された細胞培養容器を用いることにより、細胞塊を培養する過程において細胞塊の培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
［本開示の実施形態の詳細］
　本開示に係る細胞培養容器、細胞培養方法、および細胞培養容器の製造方法の具体例を、以下に図面を参照しつつ説明する。なお、本発明はこれらの例示に限定されるものではなく、請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。以下の説明においては、同一要素または同一機能を有する要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する場合がある。
（細胞培養容器の構成）
　図１および図２は、一実施形態に係る細胞培養容器１を模式的に示す断面図である。細胞培養容器１は、培養液Ｓを用いて細胞Ｃおよび細胞塊Ｍ（図８を参照）を培養する際に用いられる。図１では、細胞Ｃが仮想線にて示されている。具体的には、細胞培養容器１は、培養液Ｓ中において、細胞Ｃを凝集させて所望の状態の細胞塊Ｍを得るための容器である。細胞培養容器１は、培養液容器２（第１容器）と、細胞容器３（第２容器）と、を備える。
　培養液容器２は、培養液Ｓを収容するための容器（皿）である。培養液容器２は、例えば樹脂製である。培養液容器２を構成する樹脂材料は、例えばポリスチレンであることが好ましいが他の樹脂であってもよく、ガラスまたは金属であってもよい。培養液容器２は、その内側表面に、フッ素などをコートする表面処理を行ってもよく、培養液Ｓの性質に合わせて耐薬剤性を有する表面処理を行っていてもよい。なお、培養液容器２は、透明体の素材でなくてもよい。培養液容器２の形状は、平面視において略長方形状である。培養液容器２は、長方形状の平坦な底板２１と、４つの側壁２２と、を有する。底板２１は、培養液Ｓを収容した状態（図１に示す状態）において水平面に沿って広がるように延在している。底板２１の厚さは、例えば１ｍｍである。底板２１の長手方向における長さは、例えば１２０ｍｍ以上であり、また、１３２ｍｍ以下である。底板２１の短手方向における長さは、例えば８０ｍｍ以上であり、また、９０ｍｍ以下である。
　４つの側壁２２は、底板２１の４つの縁部に沿ってそれぞれ立設している。各側壁２２は、底板２１の各縁部から上方に延在している。側壁２２の厚さは、例えば１ｍｍである。側壁２２の高さＨ１は、例えば１４．５ｍｍである。底板２１および４つの側壁２２は、培養液Ｓを収容するための収容空間Ｖを画成している。本実施形態において、培養液容器２は、収容空間Ｖを１つのみ有する。また、培養液容器２は、収容空間Ｖを底板２１と反対側に開放する開口部２３を有する。底板２１が水平面に沿うように置かれた状態において、開口部２３は、収容空間Ｖを上方に開放する。
　細胞容器３は、例えば樹脂製のウェルプレートである。本実施形態において、細胞容器３は、観察用の光源（例えば、後述する光源Ｌ）を透過可能な材料によって構成されており、可視光に対して透明に構成されていてもよい。細胞容器３を構成する材料は、例えば、ポリスチレンであることが好ましいが、ポリカーボネートまたはガラスであってもよい。細胞容器３は、板状のプレート３１と、プレート３１に設けられた複数（本実施形態においては例えば９６個）のウェル３２と、を有する。ウェル３２は、後述するように、底部３２ａと側壁３２ｂとを含んで構成される。細胞容器３は、ウェル３２の底部３２ａが観察用の光源を透過可能な材料によって構成されていればよく、その他の部分（例えば側壁３２ｂ）は当該光源を透過可能でない材料によって構成されていてもよい。細胞容器３のウェル３２の内部表面には、細胞Ｃが付着しにくい表面処理または耐薬品性の表面処理を行ってもよい。細胞容器３の底部３２ａ以外の領域（プレート３１または側壁３２ｂ）は、底部３２ａの材料と異なる材料、即ち、光源を透過可能な材料でなくてもよく、例えば、アクリル樹脂、フッ素樹脂（例えばＰＴＦＥ）または金属から構成されてもよく、不織布等の繊維から構成されてもよい。ウェル３２の底部３２ａの内部表面以外の領域に、細胞が付着しづらい表面処理を行ってもよく、耐薬品性の表面処理を行っていてもよい。なお、細胞容器３は、上述した複数の材料を適宜組み合わせて構成してもよい。
　このような構成の細胞容器３は、培養液容器２とは分離している。図３Ａは、図１に示す細胞容器３の平面図である。図３Ｂは、図１に示す細胞容器３のウェル３２のＩＩＩＢ－ＩＩＩＢ線に沿った断面図である。図１から図３Ａに示されるように、平面視において、プレート３１の外形状は、底板２１よりも一回り大きい略長方形状である。プレート３１の厚さは、例えば１ｍｍである。プレート３１には、プレート３１の厚さ方向に貫通し、ウェル３２が接続されるための複数（ウェル３２と同数であって、本実施形態では例えば９６個）の接続孔３１ａが配列されている。接続孔３１ａの内径φ１は、例えば６．０ｍｍである。プレート３１は、複数のウェル３２を互いに連結している。なお、プレート３１は、培養液容器２の開口部２３よりも大きい外形を有しており、細胞容器３を培養液容器２に設置した際、プレート３１が培養液容器２の開口部２３の縁に接することにより、各ウェル３２の培養液容器２内での位置決めが為される。
　ウェル３２は、培養液Ｓによって培養される細胞Ｃおよび細胞塊Ｍを保持するための容器である。ウェル３２の厚さは、例えば１ｍｍである。複数のウェル３２は、培養液容器２の収容空間Ｖに出し入れ可能に構成されている。本実施形態においては、すべてのウェル３２が１つの収容空間Ｖに対して出し入れ可能である。複数のウェル３２は、接続孔３１ａにそれぞれ接続されている。複数のウェル３２は、プレート３１の一方の主面３１ｂ上に配列されている。本実施形態において、細胞容器３は、プレート３１の長手方向に１２列、プレート３１の短手方向に８行のウェル３２にて並ぶウェル３２を有している。隣り合う２つのウェル３２のピッチＰは一定（例えば、９．０ｍｍ）である。複数のウェル３２は、プレート３１を培養液容器２に対して近接させることによって収容空間Ｖに一括して配置され、プレート３１を培養液容器２に対して離間させることによって収容空間Ｖから一括して退出する。
　ウェル３２は、底部３２ａと、底部３２ａとプレート３１とを連結する側壁３２ｂと、を有する。底部３２ａは、プレート３１から離れる向きに窪む凹状を呈し、培養液Ｓを保持可能である。底部３２ａの外形状は、例えば半球状である。底部３２ａの内径φ２は、例えば５．２ｍｍである。側壁３２ｂは、底部３２ａの周縁部からプレート３１の接続孔３１ａまで延在する筒状の部分である。底部３２ａおよび側壁３２ｂは、培養される細胞Ｃおよび細胞塊Ｍを保持するための培養空間Ｗを画成している。培養空間Ｗの高さＨ２は、側壁２２の高さＨ１よりも小さい。高さＨ２は、例えば１０．５ｍｍである。側壁３２ｂにおける底板２１と反対側の端部は、プレート３１の接続孔３１ａに連通しており、培養空間Ｗは、接続孔３１ａを介して外部空間に開放されている。
　側壁３２ｂには、培養液Ｓが通過可能な液通過部４が設けられている。液通過部４は、少なくとも細胞塊Ｍを通過させないように構成されている。なお、液通過部４は、細胞Ｃを通過させないように構成されていてもよい。本実施形態において、液通過部４は、一又は複数の孔４１である。孔４１の個数は任意に設定してよい。本実施形態においては、複数の孔４１が設けられている例について説明する。孔４１は、側壁３２ｂの厚さ方向に沿って側壁３２ｂを貫通している。なお、孔４１は、側壁３２ｂの厚さ方向に対して傾斜した方向に沿って側壁３２ｂを貫通していてもよい。孔４１は、培養空間Ｗと外部空間とに連通している。これにより、孔４１は、培養液Ｓを通過させる。孔４１の形状は、例えば貫通方向（すなわち、側壁３２ｂの厚さ方向）から見て円形状である。孔４１の貫通方向に交差する面内の大きさは、細胞塊Ｍを通過させない大きさであって、例えば直径０．０１ｍｍ以上であり、また、直径６．０ｍｍ以下である。あるいは、孔４１の貫通方向に交差する面内の大きさは、直径３．０ｍｍ以下であってもよいし、直径１．０ｍｍ以下であってもよい。本実施形態において、孔４１の貫通方向に交差する面内の大きさ（直径）は、一例として、１．０ｍｍである。
　液通過部４は、底部３２ａの先端（下端）から所定の高さＨ３以上離れた位置に設けられている。このように底部３２ａから離れた位置に液通過部４を設けることにより、観察中の細胞塊Ｍが乾燥することが防止される。底部３２ａの下端から液通過部４の下端までの高さＨ３は、例えば、培養する細胞塊Ｍの直径が１ｍｍ以下の場合、１．０ｍｍ以上であってもよく、高さＨ３は５．０ｍｍ以下であってもよい。また、培養する細胞塊Ｍの直径が０．１ｍｍ以上２ｍｍ以下の場合、高さＨ３は１．０ｍｍ以上であってもよく、高さＨ３は４．０ｍｍ以下であってもよい。更に、細胞塊Ｍの直径と培養液の水面の高さＨ３との関係のパターンとして、例えば、細胞塊Ｍの直径が１ｍｍ以下の場合に高さＨ３が２ｍｍであってもよく、細胞塊Ｍの直径が１ｍｍ以上２ｍｍ以下の場合に高さＨ３が３ｍｍ以上４ｍｍ以下であってもよい。また、高さＨ３は、乾燥を防止するために細胞塊Ｍが培養液の水面から露出せず且つ培養液が観察を阻害しないように、できるだけ低くすることが好ましく、上記の範囲でなくてもよい。なお、細胞塊Ｍの上面と培養液の水面とが近すぎると表面張力の影響で細胞塊Ｍの直上の水面が凸面になり、観察用の光が顕微鏡に対して真っ直ぐにならず観察を阻害する場合もあるため、例えば、細胞塊Ｍ上部から培養液の水面までの距離として、少なくとも１ｍｍ以上又は２ｍｍ以上の距離を確保することが好ましい。液通過部４は、底部３２ａの下端から高さＨ３だけ離れた位置からプレート３１に向かって延びる所定の範囲Ｒに亘って設けられていてもよい。本実施形態において、範囲Ｒは、側壁３２ｂの全領域である。なお、範囲Ｒは、側壁３２ｂの一部の領域であってもよい。本実施形態においては、範囲Ｒ内に複数の孔４１が分散して設けられている。複数のウェル３２の間において、高さＨ３は一定である。換言すると、複数のウェル３２間において、最下端に位置する孔４１の高さＨ３は互いに等しい。ここで用いる「一定」とは、各底部３２ａの下端から各液通過部４の下端までの各高さＨ３が一致する場合だけでなく、各高さＨ３の平均高さに対して±１０％の範囲内の高さも含む。なお、最下端に位置する孔４１を除く複数の孔４１は、範囲Ｒ内において任意の位置に設けられていてよい。
（細胞培養容器の製造方法）
　以上説明した細胞培養容器１を製造する製造方法の一例について説明する。はじめに、培養液容器２をモールド成形によって製造する（第１容器を製造する工程）。例えば、ペレット状の樹脂材を溶融させ、溶融した樹脂材を金型に流し込み、その状態で硬化させる。これにより、培養液容器２が製造される。次に、細胞容器３をモールド成形によって製造する（第２容器を製造する工程）。図４Ａは、細胞培養容器１の製造方法において用いられる金型５を示す断面図である。第２容器を製造する工程では、まず、モールド成形のための金型５を準備する。図４Ｂは、図４Ａに示す上部金型５１および中子５３を下方から見た図である。図５Ａおよび図５Ｂは、細胞培養容器１の製造方法の各工程を示す図である。
　図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、金型５は、上部金型５１と、下部金型５２と、複数の中子５３と、を備える。上部金型５１および下部金型５２は、プレート３１およびウェル３２の外形を形成するための型である。具体的には、上部金型５１は、複数のウェル３２のそれぞれの外形状に対応する形状の複数の凸状部５１ａを有する。下部金型５２は、複数のウェル３２のそれぞれの外形状に対応する形状の複数の凹状部５２ａを有する。凸状部５１ａおよび凹状部５２ａのそれぞれには、複数の中子５３を貫通させる貫通孔が形成されている。
　複数の中子５３は、液通過部４を形成するための型である。図５Ａは、成形中の一部のウェル３２を示し、図５Ｂは成形後の一部のウェル３２を示している。各中子５３は、孔４１を形成する。中子５３は、孔４１と同形状の外周面を有する棒状部材である。中子５３は、上部金型５１および下部金型５２を貫通した状態で使用される。複数の中子５３は、ウェル３２に孔４１を形成する位置に応じて、例えば平行に並んでいてもよいし、延在方向が交差していてもよい。複数の中子５３は、ウェル３２ごとに、形成される孔４１の個数に応じた数だけ配置される。１つのウェル３２あたり１本の中子５３によって孔４１が形成されてもよいし、１つのウェル３２あたり複数本の中子５３によって孔４１が形成されてもよい。
　細胞容器３を製造する際には、ペレット状の樹脂材を溶融させ、溶融した樹脂材をこの金型５に流し込み、その状態で硬化させる。これにより、ウェル３２に液通過部４が設けられた細胞容器３が製造される。以上により、細胞培養容器１の製造が完了する。なお、培養液容器２を製造する前に細胞容器３を製造してもよく、培養液容器２の製造と細胞容器３の製造とを並行して行ってもよい。
（細胞培養方法）
　次に、細胞培養方法として、細胞Ｃおよび細胞塊Ｍの培養方法について説明する。本明細書において、「細胞Ｃおよび細胞塊Ｍの培養」とは、細胞Ｃを培養液Ｓに浸して凝集させること、細胞塊Ｍを培養液Ｓに浸して状態を変化させること、および、分化させることをいう。図６の（ａ）部～（ｄ）部は、細胞Ｃおよび細胞塊Ｍの培養の状態の変化を示す模式的な断面図である。培養液Ｓに浸された細胞Ｃ（図６の（ａ）部を参照）は、数時間から数日かけて凝集して細胞塊Ｍとなる（図６の（ｂ）部を参照）。細胞塊Ｍは、更に培養を継続することにより、凝集が強まったり（図６の（ｃ）部を参照）、分化したりする（図６の（ｄ）部を参照）。この期間は細胞Ｃの種類や分化の内容によって異なり、数日から数週間になることもある。この間、適宜、細胞塊Ｍを光学的に観察する。以下、具体的に説明する。
　図７および図８は、一実施形態に係る細胞培養方法の培養工程を模式的に示す断面図である。まず、細胞培養容器１を準備する（準備する工程）。例えば、培養液Ｓを収容した培養液容器２と、培養液容器２の収容空間Ｖに複数のウェル３２を進入させる前の細胞容器３を準備する。次に、図７および図８に示されるように、細胞Ｃを培養液Ｓに浸して、細胞Ｃと細胞Ｃが凝集して得られた細胞塊Ｍとを培養する（培養する工程）。本工程においては、培養液Ｓが収容された培養液容器２の収容空間Ｖに複数のウェル３２を進入させることにより、液通過部４を介してウェル３２の培養空間Ｗにも培養液Ｓを進入させる。これにより、培養空間Ｗが培養液Ｓによって満たされた状態となる。この培養空間Ｗに細胞Ｃが播種されることで培養が開始される。このとき、細胞Ｃは、ウェル３２に保持された状態である。その状態で、所定時間が経過するまで待機する。所定時間は、例えば、細胞Ｃの凝集によって細胞塊Ｍが得られるまでの時間である。所定時間は、培養対象の細胞Ｃに応じて適宜設定され、例えば数時間から数日である。
　所定時間の経過後、図８に示されるように細胞塊Ｍが得られる。このとき、細胞塊Ｍは、ウェル３２に保持された状態である。次に、この細胞塊Ｍを観察する（観察する工程）。図９および図１０は、一実施形態に係る細胞培養方法の培養工程を模式的に示す断面図である。本工程では、まず、図９に示されるように、ウェル３２の培養空間Ｗから、培養液Ｓの一部を排出する。具体的には、細胞容器３を培養液容器２から取り出す。この操作によって液通過部４を介してウェル３２から培養液Ｓの一部が排出される。ここで排出される培養液Ｓの一部とは、ウェル３２の培養空間Ｗにおいて、液通過部４の下端（最下端の孔４１）よりも上方に存在していた一部の培養液Ｓである。この操作により、複数のウェル３２における当該一部の培養液Ｓが一度に排出される。また、この操作により、ウェル３２の底部３２ａを含む部分（培養空間Ｗのうち液通過部４よりも下方の部分）にのみ培養液Ｓが残存する。したがって、細胞塊Ｍが培養液Ｓに浸った状態が維持される。
　次に、図１０に示されるように、細胞塊Ｍに光を透過させて観察する。例えば、ウェル３２の上方（接続孔３１ａ）から光源Ｌによって細胞塊Ｍに光を照射した状態で、ウェル３２の下方（底部３２ａ）から観察装置Ｄ（例えば、顕微鏡）によって観察する。この操作を一又は複数のウェル３２ごとに行う。全数のウェル３２に対する細胞塊Ｍの観察が完了したら、１回の観察工程が終了する。
　上述した観察する工程は、１回のみ実行されてもよいし、間隔をおいて繰り返し実行されてもよい。観察する工程を繰り返し実行することにより、細胞塊Ｍの変化の様子を適宜（例えば、定期的に）観察してもよい。図１１の（ａ）部から（ｃ）部は、細胞塊Ｍの変化の様子を観察する各観察工程を模式的に示す断面図である。細胞塊Ｍの変化の様子としては、例えば、細胞塊Ｍの初期の状態（図１１の（ａ）部を参照）、細胞塊Ｍの凝集が強まった様子（図１１の（ｂ）部を参照）、細胞塊Ｍの凝集が弱まった様子（すなわち、細胞塊Ｍの凝集が緩んだ様子）、または細胞塊Ｍが分化した様子（図１１の（ｃ）部を参照）等が挙げられる。観察する工程が繰り返し実行される場合には、各観察する工程の終了後、培養液Ｓが収容された培養液容器２の収容空間Ｖに、再び複数のウェル３２を進入させることにより、液通過部４を介してウェル３２の培養空間Ｗに培養液Ｓを進入させる。この操作によって複数のウェル３２の培養空間Ｗを一括して培養液Ｓで満たされた状態とする。これにより、更に細胞塊Ｍの培養が行われる。そして、例えば、細胞塊Ｍが形成された後、細胞塊Ｍの培養を継続し、再び観察する工程を行うことにより、図１１の（ｂ）部に示されるように、細胞塊Ｍの凝集が強まった様子や、図１１の（ｃ）部に示されるように、細胞塊Ｍが分化した様子を観察してもよい。すべての観察する工程が終了したら、細胞塊Ｍの観察が完了する。そして、所望の細胞塊Ｍが生成される。なお、観察の期間は細胞の種類や分化の内容よって異なり、数日から数週間になることもある。
（作用効果）
　以上説明した細胞培養容器１、細胞培養容器１の製造方法、および細胞培養方法の作用効果について説明する。細胞培養容器１においては、側壁３２ｂに設けられた液通過部４を介して培養液Ｓがウェル３２に出し入れされる。このため、培養液Ｓが収容された培養液容器２にウェル３２を進入させるだけで、ウェル３２を培養液Ｓで満たすことができる。また、細胞塊Ｍの培養状態を観察する際には、培養液容器２からウェル３２を退出させるだけで、底部３２ａに培養液Ｓを保持した状態で、ウェル３２内の培養液Ｓの一部のみを簡易に排出することができる。したがって、細胞Ｃおよび細胞塊Ｍの培養の過程において細胞塊Ｍの培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
　本実施形態に係る細胞培養容器１において、液通過部４は、側壁３２ｂを貫通する孔４１である。側壁３２ｂを貫通する孔４１によれば、培養液Ｓを通過可能な構成を実現できる。
　本実施形態に係る細胞培養容器１において、ウェル３２を構成する材料は、ポリスチレンである。ポリスチレンは、細胞Ｃおよび細胞塊Ｍに接着しにくい性質を有しているため、細胞Ｃおよび細胞塊Ｍの培養に適しており、ウェル３２をポリスチレンから構成することにより、例えば、培養された細胞塊等をウェル３２から容易に取り出すことができる。
　本実施形態に係る細胞培養容器１において、細胞容器３は、互いに連結された複数のウェル３２を有し、複数のウェル３２間において、底部３２ａの下端から液通過部４の下端までの高さＨ３は一定である。例えば、複数のウェル３２を有する構成において、細胞塊Ｍの培養状態を観察する際に、ウェル３２の内部の培養液Ｓをスポイト等によって手作業で抜くと、ウェル３２に残存させる培養液Ｓの量を一定とすることが困難である。また、ウェル３２の個数が多いほど手間も増大する。これに対し、本実施形態に係る細胞培養容器１において、複数のウェル３２の間で高さＨ３を一定とする構成によれば、培養液容器２からウェル３２を退出させるだけで、複数のウェル３２の底部３２ａに一定量の培養液Ｓを保持した状態で、ウェル３２内の培養液Ｓの一部のみを簡易に排出することができる。
　本実施形態に係る細胞培養容器１において、液通過部４は、底部３２ａの下端から液通過部４の下端までの高さが１．０ｍｍ以上で且つ５．０ｍｍ以下となるように、側壁３２ｂに設けられていてもよい。培養液Ｓを保持可能な底部３２ａに対して液通過部４をこのような範囲に位置させることにより、細胞塊等の観察の際に培養液Ｓを液通過部４を介して排出させても、細胞塊等を乾燥させないようにすることができ、観察作業を容易に行うことができる。より具体的には、液通過部４の下端までの高さが１．０ｍｍ以上であることにより、細胞塊等を観察する場合であっても底部３２ａに保持される細胞塊等をより確実に培養液中に浸漬させておくことが可能となる。また、液通過部４の下端までの高さが５．０ｍｍ以下であることにより、細胞塊等を観察する場合に、観察を阻害する培養液をより適切な量となるように、より容易に排出することが可能となる。
　本実施形態に係る細胞培養方法は、細胞培養容器１を準備する工程と、ウェル３２に保持された細胞Ｃを、培養液容器２に収容された培養液Ｓに浸して、細胞Ｃと細胞Ｃが凝集して得られた細胞塊Ｍとを培養する工程と、細胞塊Ｍを観察する工程と、を備える。観察する工程では、細胞容器３を培養液容器２から取り出すことによって液通過部４を介してウェル３２から培養液Ｓの一部を排出した状態で、ウェル３２内の細胞塊Ｍを観察する。これにより、観察する工程において、ウェル３２から培養液Ｓの一部を簡易に排出することができる。また、培養液Ｓの一部が排出された状態でウェル３２内の細胞塊Ｍを観察するので、培養液Ｓによって細胞塊Ｍの観察が阻害されることを抑制できる。したがって、細胞Ｃおよび細胞塊Ｍを培養する過程において細胞塊Ｍの観察を効率よく行うことが可能となる。また、細胞塊Ｍが得られた後、更に細胞塊Ｍを培養して観察する工程を適宜繰り返して行う場合には、各観察する工程において、複数のウェル３２から培養液Ｓの一部を簡易に排出することができるので、各観察する工程を効率よく行うことが可能となる。したがって、細胞塊Ｍの所望の培養状態の観察を効率よく行うことができる。以上により、本実施形態に係る細胞培養方法は、細胞塊Ｍの培養状態を適宜繰り返して観察する場合において、特に有利である。
　本実施形態に係る細胞培養容器１の製造方法は、モールド成形によって細胞容器３を製造する工程を備え、当該工程は、ウェル３２の外形状に対応する形状の凸状部５１ａを有する上部金型５１と、凸状部５１ａと向かい合って配置され、ウェル３２の外形状に対応する形状の凹状部５２ａを有する下部金型５２と、凸状部５１ａおよび凹状部５２ａを貫通する中子５３と、を備える金型５を準備する工程と、金型５に流し込んだ樹脂材を硬化させてウェル３２を成形する工程と、を有し、中子５３によって液通過部４としての孔４１を形成してもよい。この構成によれば、モールド成形によって製造された細胞容器３のウェル３２には、液通過部４としての孔４１が形成されるので、細胞培養容器１を簡易に形成することができる。したがって、製造された細胞培養容器１を用いることにより、細胞Ｃおよび細胞塊Ｍを培養する過程において細胞塊Ｍの培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。また、続けて細胞塊Ｍを培養して細胞塊Ｍの変化の状態を適宜観察する場合には、製造された細胞培養容器１を用いることにより、細胞塊Ｍの所望の培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
（変形例）
　以上の実施形態は、本開示に係る細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、および細胞塊の培養方法の一実施形態について説明したものである。本開示に係る細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、および細胞培養方法は、上述した各実施形態を任意に変更したものとすることができる。
　例えば、上記実施形態においては、培養液容器２は、連続する１つの収容空間Ｖを有していたが、複数の収容空間Ｖを有していてもよい。図１２Ａおよび図１２Ｂは、それぞれ、変形例に係る細胞培養容器１Ａを模式的に示す断面図である。細胞培養容器１Ａは、培養液容器２に代えて培養液容器２Ａを有している点において細胞培養容器１と相違し、その他の点において細胞培養容器１と同様の構成を有している。
　培養液容器２Ａは、複数の収容空間Ｖを有している。具体的に、培養液容器２Ａは、上記の底板２１および４つの側壁２２によって画成される空間内に配置された複数の隔壁２４を更に有する。隔壁２４は、隣り合う収容空間Ｖを水密に仕切っている。換言すると、複数の収容空間Ｖは、複数の隔壁２４によって互いに隔てられている。各収容空間Ｖには、複数のウェル３２の一部を出し入れ可能である。一例として、培養液容器２Ａは、１２個の収容空間Ｖを有し、１つの収容空間Ｖの大きさは、一列分（９６個中の８個）のウェル３２を収容可能な大きさである。
　隔壁２４は、底板２１の上面に立設している。各隔壁２４は、底板２１の上面において、各収容空間Ｖに応じた位置に設けられる。隔壁２４の厚さは、例えば１ｍｍである。隔壁２４の高さＨ４は、例えば１４．５ｍｍである。隔壁２４を構成する材料は、底板２１を構成する材料と同様であってもよい。なお、収容空間Ｖの個数は任意に設定してよい。培養液容器２Ａは、ウェル３２と同数（９６個）の収容空間Ｖを有していてもよいし、収容空間Ｖを２つのみ有していてもよい。培養液容器２Ａが、収容空間Ｖを２つのみ有している場合には、隔壁２４を１つのみ有していてよい。
　細胞培養容器１Ａにおいても、側壁３２ｂに設けられた液通過部４を介して培養液Ｓがウェル３２に出し入れされるので、上記細胞培養容器１と同様の作用効果が得られる。また、培養液容器２Ａによれば、複数の収容空間Ｖの間が水密に仕切られるので、各収容空間Ｖに収容されたウェル３２には、他の収容空間Ｖから培養液Ｓが進入しない。したがって、他の収容空間Ｖに収容された培養液Ｓに起因するコンタミネーションを回避することができる。
　また、細胞容器３のウェル３２の個数は一例であって、適宜設定してよい。図１３Ａから図１３Ｄは、それぞれ、変形例に係る細胞容器３Ｂ～３Ｅを模式的に示す平面図である。細胞容器３Ｂ～３Ｅは、ウェル３２の個数において細胞容器３と相違し、その他の点において細胞容器３と同様の構成を有している。上記の細胞培養容器１は、図１３Ａに示されるように、細胞容器３に代えてウェル３２を１個のみ有する細胞容器３Ｂを備えていてもよい。また、細胞培養容器１，１Ａは、図１３Ｂに示されるように、細胞容器３に代えて２個のウェル３２を有する細胞容器３Ｃを備えていてもよい。細胞培養容器１，１Ａは、図１３Ｃに示されるように、細胞容器３に代えて６個のウェル３２を有する細胞容器３Ｃを備えていてもよい。細胞培養容器１，１Ａは、図１３Ｄに示されるように、細胞容器３に代えて８個のウェル３２を有する細胞容器３Ｃを備えていてもよい。細胞培養容器１，１Ａにおける細胞容器は、上記以外の個数のウェル３２を有していてもよく、例えば、３８４個のウェル３２を有していてもよい。
　また、ウェル３２の底部３２ａの形状は一例であって、適宜変更してよい。図１４Ａおよび図１４Ｂは、それぞれ、変形例に係るウェル３２Ｆ，３２Ｇを模式的に示す断面図である。図１４Ａに示されるウェル３２Ｆは、底部３２ａに代えて底部３３ａを有する点においてウェル３２と相違し、その他の点においてウェル３２と同様の構成を有している。底部３３ａは、周壁３３ｂと、周壁３３ｂの下方を塞ぐ円形状の底壁３３ｃと、を有する。周壁３３ｂは、側壁３２ｂの内径と同じ直径を有する円筒状を呈している。この場合、底部３３ａおよび側壁３２ｂによって画成される培養空間Ｗの全体の形状が円柱形状となる。液通過部４（孔４１）は、底部３３ａの先端（下端）から上記の所定の高さＨ３だけ離れた範囲ＲＦ内に設けられている。
　図１４Ｂに示されるウェル３２Ｇは、底部３２ａに代えて底部３４ａを有する点においてウェル３２と相違し、その他の点においてウェル３２と同様の構成を有している。底部３４ａは、周壁３４ｂと、周壁３４ｂの下方を塞ぐ円形状の底壁３４ｃと、を有する。周壁３４ｂは、側壁３２ｂの下端から円錐状に先細りした形状を呈している。液通過部４（孔４１）は、底部３４ａの先端（下端）から上記の所定の高さＨ３だけ離れた範囲ＲＧ内に設けられている。
　ウェル３２Ｆ，３２Ｇにおいても、側壁３２ｂに設けられた液通過部４を介して培養液Ｓがウェル３２Ｆ，３２Ｇに出し入れされる。このため、細胞Ｃおよび細胞塊Ｍを培養する過程において細胞塊Ｍの培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。また、続けて細胞塊Ｍを培養して細胞塊Ｍの変化の状態を適宜観察する場合には、細胞塊Ｍの所望の培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
　また、液通過部４の構成は一例であって、適宜変更してよい。液通過部４の孔４１の形状は適宜変更してよい。孔４１の形状は、例えば楕円形状であってもよいし半円形状であってもよい。あるいは、液通過部４は、異なる形状の複数の孔４１の組み合わせであってもよい。
　図１５Ａから図１５Ｃは、それぞれ、変形例に係る液通過部４Ｈ，４Ｊ，４Ｋを模式的に示す斜視図である。図１５Ａに示される液通過部４Ｈは、側壁３２ｂの一部の領域（範囲ＲＨ）に設けられている。範囲ＲＨの下端は、底部３２ａの先端（下端）から高さＨ３だけ離れた位置である。範囲ＲＨの高さは、例えば、７．０ｍｍである。液通過部４Ｈは、一又は複数の長孔４１Ｈ（スリット）である。長孔４１Ｈは、側壁３２ｂを貫通している。長孔４１Ｈは、側壁３２ｂの延在方向（上下方向）に沿って延在している。長孔４１Ｈの形状は、例えば長方形状である。長孔４１Ｈの高さ（本変形例では、長手方向の大きさ）は、０．０１ｍｍ以上７．０ｍｍ以下であって、一例として範囲ＲＨと同じ（７．０ｍｍ）である。長孔４１Ｈの幅（本変形例では、短手方向の大きさ）は、例えば０．０１ｍｍ以上であり、また、６．０ｍｍ以下である。あるいは、長孔４１Ｈの幅は、３．０ｍｍ以下であってもよいし、１．０ｍｍ以下であってもよい。
　図１５Ｂに示される液通過部４Ｊは、側壁３２ｂの一部の領域（範囲ＲＪ）に設けられている。範囲ＲＪは、例えば範囲ＲＨと同様である。液通過部４Ｊは、当該範囲ＲＪ内に密に設けられた複数の孔４１である。図１５Ｃに示される液通過部４Ｋは、側壁３２ｂの一部の領域（範囲ＲＫ）に設けられている。範囲ＲＫは、例えば範囲ＲＨ，ＲＪと同様である。液通過部４Ｋは、当該範囲ＲＫ内に密に設けられた複数の孔４１Ｋである。孔４１Ｋは、貫通方向から見て菱形を呈する点で孔４１と相違し、その他の点において孔４１と同様の構成を有している。孔４１Ｋの高さは、例えば０．０１ｍｍ以上であり、また、７．０ｍｍ以下である。孔４１Ｋの幅は、例えば０．０１ｍｍ以上であり、また、６．０ｍｍ以下である。あるいは、孔４１Ｋの幅は、３．０ｍｍ以下であってもよいし、１．０ｍｍ以下であってもよい。
　また、液通過部は孔である場合に限定されない。図１６は、変形例に係る液通過部４Ｌを模式的に示す断面図である。図１６に示されるように、側壁３２ｂの少なくとも一部の領域（範囲Ｒ）を底部３２ａとは異なる材料によって構成することにより液通過部４Ｌが構成されていてもよい。図１６に示される例では、範囲Ｒは側壁３２ｂの全領域である。この場合、液通過部４Ｌを構成する材料としては、培養液Ｓを通過させる多孔質な高分子材料が挙げられる。これにより、側壁３２ｂのうち多孔質な高分子材料によって構成された領域によって、培養液Ｓを通過可能な構成を実現できる。したがって、この構成においても、液通過部４Ｌを介して培養液Ｓがウェル３２に出し入れされるので、細胞Ｃを培養する過程において細胞塊Ｍの培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。同様に、この構成においても、続けて細胞塊Ｍを培養して細胞塊Ｍの変化の状態を適宜観察する場合には、細胞塊Ｍの所望の培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
　また、上記実施形態に係る細胞培養容器の製造方法は一例であって、適宜変更してよい。金型５に代えて次のような金型５Ａを用いて第２容器製造工程を行ってもよい。図１７Ａは、変形例に係る細胞培養容器の製造方法において用いられる金型５Ａを示す断面図である。図１７Ｂは、図１７ＡのＸＶＩＩＢ－ＸＶＩＩＢ線に沿った断面図である。図１８は、変形例に係る細胞培養容器の製造方法による成形後の一部のウェル３２Ｍを示す図である。
　図１７Ａおよび図１７Ｂに示されるように、金型５Ａは、上部金型５１Ａと、下部金型５２Ａと、を有する。上部金型５１Ａは、上部金型５１と同様に、複数のウェル３２とそれぞれ同形状の複数の凸状部５１ａを有する。下部金型５２Ａは、下部金型５２と同様に、複数のウェル３２とそれぞれ同形状の複数の凹状部５２ａを有する。また、上部金型５１Ａは、凸状部５１ａの表面から更に突出する一又は複数（図１７Ｂの例では、４つ）の突起５１ｂを有する。突起５１ｂは、液通過部（後述する液通過部４Ｍ）が設けられる範囲に亘って、上下方向（すなわち、上部金型５１Ａと下部金型５２Ａとが向かい合う方向）に沿って延在している。
　図１８に示されるように、ウェル３２Ｍは、液通過部４に代えて液通過部４Ｍを有する点においてウェル３２と相違し、その他の点においてウェル３２と同様の構成を有している。突起５１ｂは、液通過部４Ｍとしてのスリット４１Ｍを形成する。１つのウェル３２Ｍあたり１本の突起５１ｂによって１つのスリット４１Ｍが形成されてもよいし、１つのウェル３２あたり複数本の突起５１ｂによって複数のスリット４１Ｍが形成されてもよい。細胞容器３を製造する際には、ペレット状の樹脂材を溶融させ、溶融した樹脂材をこの金型５Ａに流し込み、その状態で硬化させる。これにより、ウェル３２Ｍに液通過部４Ｍが設けられた細胞容器３が製造される。
　この構成によれば、モールド成形によって製造された細胞容器３のウェル３２Ｍには、液通過部４Ｍとしてのスリット４１Ｍが形成されるので、細胞培養容器１を簡易に形成することができる。したがって、製造された細胞培養容器１を用いることにより、細胞Ｃおよび細胞塊Ｍを培養する過程において細胞塊Ｍの観察を効率よく行うことが可能となる。また、続けて細胞塊Ｍを培養して細胞塊Ｍの変化の状態を適宜観察する場合には、細胞塊Ｍの所望の培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
　また、液通過部４をレーザー照射によって形成してもよい。図１９Ａおよび図１９Ｂと図２０Ａおよび図２０Ｂとは、変形例に係る細胞培養容器の製造方法の各工程を示す図である。図１９Ａは、レーザーを照射する工程における一部のウェル３２を示し、図１９Ｂは図１９Ａに示す工程による成形後の一部のウェル３２を示している。細胞容器３を製造する際、まず、モールド成形によって成形体３０を成形する（モールドを成形する工程）。成形体３０は、プレート３１および複数のウェル３２の外形状を呈する。次に、レーザー照射によって成形体３０に孔４１を形成する（レーザーを照射する工程）。
　図１９Ａに示されるように、レーザーを照射する工程においては、レーザー装置６が用いられる。レーザー装置６は、複数のウェル３２に対応して配列された複数のレーザーヘッド６１を有する。各レーザーヘッド６１は、側壁３２ｂと斜めに交差する向きのレーザー光を出力する。これにより、図１９Ｂに拡大して示されるように、側壁３２ｂを斜めに貫通する孔４１が形成されてもよい。
　あるいは、次のようにレーザーを照射する工程を行ってもよい。図２０Ａは、別のレーザーを照射する工程における一部のウェル３２を示し、図２０Ｂは図２０Ａによる成形後の一部のウェル３２を示している。図２０Ａに示されるように、レーザーを照射する工程においては、レーザー装置６に代えてレーザー装置７が用いられてもよい。レーザー装置７は、複数のウェル３２に対応して配列された複数のレーザーヘッド７１を有する。各レーザーヘッド７１は、側壁３２ｂと直交する向きのレーザー光を出力する。隣り合う２つの成形体３０の間には、遮蔽板７２が配置されてもよい。あるいは、遮蔽板７２を配置しないことによって複数の成形体３０に亘ってレーザー光が照射されてもよい。これにより、図２０Ｂに示されるように、側壁３２ｂを当該側壁３２ｂの厚さ方向に貫通する孔４１が形成されてもよい。
　上記のいずれかのレーザーを照射する工程によって、液通過部４としてのすべての孔４１の形成が完了したら、ウェル３２に液通過部４が設けられた細胞容器３が製造される。これらの構成によれば、製造されたウェル３２には、レーザー照射によって液通過部４としての孔４１が形成されるので、細胞培養容器１を簡易に形成することができる。したがって、製造された細胞培養容器１を用いることにより、細胞Ｃおよび細胞塊Ｍを培養する過程において細胞塊Ｍの観察を効率よく行うことが可能となる。また、続けて細胞塊Ｍを培養して細胞塊Ｍの変化の状態を適宜観察する場合には、細胞塊Ｍの所望の培養状態の観察を効率よく行うことが可能となる。
　図２１から図２８は、更なる変形例に係るウェルを模式的に示す図である。ウェル３２は、光源Ｌから照射された光によって細胞塊Ｍを観察する際、培養液容器２から取り出される。この際、液通過部４から排出される培養液Ｓが液だれし（図２９を参照）、ウェル３２の底部３２ａの外側に付着してしまうことが考えられる。この場合、培養液Ｓの液滴が光源Ｌと細胞塊Ｍと観察装置Ｄとを繋ぐ線上に位置し、細胞塊Ｍの観察を阻害する可能性がある。そこで、例えば、図２１、図２２および図２３に示すように、底部３２ａ，３３ａ，３４ａの外周面上に、液通過部４から排出される培養液Ｓの流れを誘導する誘導部材８０，８１，８２をそれぞれ設けてもよい。各誘導部材８０から８２は、例えば円周状に延びる筒状部材である。各誘導部材８０から８２は、各ウェル３２，３２Ｆ，３２Ｇの外周面上であって液通過部４よりも底部３２ａ，３３ａ，３４ａ側の領域に設けられ、液通過部４とは逆側に（即ち、図示の下側）に延在する。なお、各誘導部材８０から８２は、底部３２ａ，３３ａ，３４ａに培養液Ｓを伝えない長さを有していればよく、底部３２ａ，３３ａ，３４ａの下端と同等になる長さであってもよく、また、それより長くてもよい。誘導部材８０から８２の長さは、例えば、０．５ｍｍ以上で且つ１０ｍｍ以下とすることができる。これにより、ウェル３２，３２Ｆまたは３２Ｇを有する細胞容器３を培養液容器２から取り出した際に液通過部４から排出される培養液Ｓの液だれによる細胞塊Ｍの観察の阻害を防止することができる。
　また、図２４に示すように、誘導部材８３は、ウェル３２の外側に向けて傾斜するように設けられてもよい。この場合、誘導部材８３は、上下方向に対して９０度以内の傾斜角で外側に向けて傾斜していてもよい。逆に、図２５に示すように、誘導部材８４がウェル３２の内側に向けて傾斜するように設けられてもよい。この場合、上下方向に対して４５度以内の傾斜角で内側に傾斜していてもよい。この角度であれば、観察装置Ｄの設置を阻害しない。また、図２１等に示すように、誘導部材８０が側壁３２ｂから直線状に下方に延在する構成であってもよいが、図２６に示すように、誘導部材８５が側壁３２ｂよりも径方向の内側に位置し、底部３２ａの途中部分から下方に延在する構成であってもよい。但し、図２６に示す構成においては、誘導部材８５の対向する距離は、観察する細胞塊Ｍの直径より大きくすることができる。例えば、細胞塊Ｍの直径が１ｍｍ以下の場合、誘導部材８５の設置箇所は、底部３２ａの中心から直径１ｍｍ以上の範囲の領域とすることができる。これにより、細胞塊Ｍの観察装置Ｄによる観察が阻害されることを防止できる。
　また、誘導部材は液だれを防止するための構成であるため、底部３２ａの円周全体に配置されている必要はなく、例えば、図２７に示すように、液通過部４が側壁３２ｂの一方に設けられているウェル３２Ｌの場合には、液通過部４が設けられている側にのみ誘導部材８６を設けるようにしてもよい。この場合、誘導部材８６は、半筒形状または断面円弧状の部材であってもよい。また、誘導部材を周方向に延びるように設ける場合であっても、図２８に示すように、液通過部４が側壁３２ｂの一方に設けられているウェル３２Ｌの場合には、液通過部４が設けられていない側に誘導部材８７の一部に孔８７ａを設けるようにしてもよい。
　また、誘導部材８０等を設けることに加えて又はこれに代えて、図２９に示すように、細胞培養容器１は、液だれ除去装置９０を更に備える構成としてもよい。液だれ除去装置９０は、例えば樹脂または金属から構成される。液だれ除去装置９０の上には、例えば、培養液Ｓの液滴Ｓ１を吸水するためのガーゼ９１を設置してもよい。また、液だれ除去装置９０の土台自体が吸収性の材料（スポンジ材料）から構成されるようにして、細胞培養容器１のウェル３２の底部３２ａの外周に付着した培養液Ｓの液滴Ｓ１を観察前に吸収して除去するようにしてもよい。液だれ除去装置９０は、誘導部材８０等を避けられるように表面が凹凸形状であってもよいし、誘導部材８０等がない場合には表面が平坦状であってもよい。なお、液だれ除去装置９０の土台又はその上に配置されるガーゼ９１は、コンタミネーションを防止するために減菌可能な材料から構成されてもよい。
　また、上記実施形態および各変形例は、相互に組み合わされてもよい。
１，１Ａ…細胞培養容器
２，２Ａ…培養液容器（第１容器）
３，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄ，３Ｅ，…細胞容器（第２容器）
４，４Ｈ，４Ｊ，４Ｋ，４Ｌ，４Ｍ…液通過部
５，５Ａ…金型
６，７…レーザー装置
２１…底板
２２…側壁
２３…開口部
２４…隔壁
３０…成形体
３１…プレート
３１ａ…接続孔
３２，３２Ｆ，３２Ｇ，３２Ｍ，３２Ｌ…ウェル
３２ａ，３３ａ，３４ａ…底部
３２ｂ…側壁
３３ｂ，３４ｂ…周壁
３３ｃ，３４ｃ…底壁
４１，４１Ｋ…孔
４１Ｈ…長孔
４１Ｍ…スリット
５１，５１Ａ…上部金型
５１ａ…凸状部
５１ｂ…突起
５２，５２Ａ…下部金型
５２ａ…凹状部
５３…中子
６１，７１…レーザーヘッド
７２…遮蔽板
８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７…誘導部材
８７ａ…孔
９０…液だれ除去装置
９１…ガーゼ
Ｃ…細胞
Ｄ…観察装置
Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３，Ｈ４…高さ
Ｌ…光源
Ｍ…細胞塊
Ｐ…ピッチ
Ｒ，ＲＦ，ＲＧ，ＲＨ，ＲＪ，ＲＫ…範囲
Ｓ…培養液
Ｓ１…液滴
Ｖ…収容空間
Ｗ…培養空間
φ１，φ２…内径

Claims (15)

  1. 　培養液を収容するように構成された第１容器と、
    　前記培養液によって培養される細胞および細胞塊のいずれか一方または両方を保持した状態で前記第１容器に対して出し入れ可能な少なくとも一つのウェルを有する第２容器と、
    を備え、
    　前記少なくとも一つのウェル各々は、
    　前記培養液を保持可能な底部と、
    　前記底部の周縁部から延在する側壁と、を有し、
    　前記側壁には、前記第１容器に収容された前記培養液が通過可能な液通過部が設けられている、
    　細胞培養容器。
  2. 　前記液通過部は、前記側壁を貫通する少なくとも一つの孔である、
    　請求項１に記載の細胞培養容器。
  3. 　前記少なくとも一つのウェルを構成する材料は、ポリスチレンである、
    　請求項１または請求項２に記載の細胞培養容器。
  4. 　前記液通過部は、前記側壁の少なくとも一部の領域であって、
    　前記領域は、前記培養液を通過させる多孔質な高分子材料によって構成されている、
    　請求項１に記載の細胞培養容器。
  5. 　前記少なくとも一つのウェルは、互いに連結された複数のウェルである、
    　請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  6. 　前記複数のウェル各々の前記各底部の下端から前記各液通過部の下端までの高さは一定である、
    　請求項５に記載の細胞培養容器。
  7. 　前記第１容器は、
    　前記複数のウェルのうちの一部をそれぞれ出し入れ可能な複数の収容空間と、
    　前記複数の収容空間を互いに隔てる少なくとも一つの隔壁と、を有する、
    　請求項５又は請求項６に記載の細胞培養容器。
  8. 　前記底部の下端から前記液通過部の下端までの高さが１．０ｍｍ以上で且つ５．０ｍｍ以下である、
    請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
  9. 　前記少なくとも一つのウェル各々は、前記液通過部から排出される前記培養液の流れを誘導する誘導部材を更に有する、
    請求項１から請求項８の何れか一項に記載の細胞培養容器。
  10. 　前記誘導部材は、前記少なくとも一つのウェル各々の外周面上であって前記液通過部よりも前記底部の下端側の領域に設けられ、前記液通過部とは逆側に延在する、
    請求項９に記載の細胞培養容器。
  11. 　請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の細胞培養容器を準備する工程と、
    　前記少なくとも一つのウェルに保持された前記細胞を前記第１容器に収容された前記培養液に浸して、前記細胞と前記細胞が凝集して得られた細胞塊とを培養する工程と、
    　前記細胞塊を観察する工程と、を備え、
    　前記細胞塊を観察する工程は、前記第２容器を前記第１容器から取り出すことを含み、前記液通過部を介して前記少なくとも一つのウェルから前記培養液の一部を排出した状態で、前記少なくとも一つのウェル内の前記細胞塊を観察する、
    　細胞培養方法。
  12. 　前記細胞塊を観察する工程は、前記第２容器を前記第１容器から取り出した後に前記第２容器の前記底部の外周に付着している液を除去することを含む、
    請求項１１に記載の細胞培養方法。
  13. 　請求項１に記載の細胞培養容器を製造する方法であって、
    　モールド成形によって前記第２容器を製造する工程を備え、
    　前記工程は、
    　前記少なくとも一つのウェル各々の外形状に対応する形状の凸状部を有する上部金型と、前記凸状部と向かい合って配置され、前記少なくとも一つのウェル各々の外形状に対応する形状の凹状部を有する下部金型と、前記凸状部および前記凹状部を貫通する中子と、を備える金型を準備する工程と、
    　前記金型に流し込んだ樹脂材を硬化させて前記少なくとも一つのウェルを含む前記第２容器を成形する工程と、
    を有し、
    　前記中子によって前記液通過部としての孔を形成する、
    　細胞培養容器の製造方法。
  14. 　請求項１に記載の細胞培養容器を製造する方法であって、
    　モールド成形によって前記第２容器を製造する工程を備え、
    　前記工程は、
    　前記少なくとも一つのウェル各々の外形状に対応する形状の凸状部を有する上部金型と、前記凸状部と向かい合って配置され、前記少なくとも一つのウェル各々の外形状に対応する形状の凹状部を有する下部金型と、を備える金型を準備する工程と、
    　前記金型に流し込んだ樹脂材を硬化させて前記少なくとも一つのウェルを含む前記第２容器を成形する工程と、
    を有し、
    　前記上部金型は、上下方向に沿って延び、前記凸状部から突出して前記凹状部に接する突起を有し、
    　前記突起によって前記液通過部としてのスリットを形成する、
    　細胞培養容器の製造方法。
  15. 　請求項１に記載の細胞培養容器を製造する方法であって、
    　モールド成形によって前記少なくとも一つのウェルの外形状を呈する成形体を成形する工程と、
    　レーザー照射によって前記成形体に前記液通過部としての孔を形成する工程と、を備える、細胞培養容器の製造方法。
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