WO2021080021A1 - Method for producing oligonucleotide - Google Patents

Abstract

The purpose of the present invention is to provide a method for producing an oligonucleotide and to provide an activating agent for producing the oligonucleotide. The aforementioned problem is solved by a method for producing an oligonucleotide, wherein said method comprises a step in which a nucleoside phosphoramidite having a protective group linked to a hydroxyl group at position 5' and a nucleoside having an unprotected hydroxyl group at the 3' position and the 5' position are reacted in the presence of an activating agent represented by formula (I).

Description

オリゴヌクレオチドを製造する方法How to make oligonucleotides

　本発明は、オリゴヌクレオチドを製造する方法およびオリゴヌクレオチドを製造するための活性化剤に関する。 The present invention relates to a method for producing an oligonucleotide and an activator for producing an oligonucleotide.

　ＤＮＡオリゴヌクレオチドやＲＮＡオリゴヌクレオチド等の核酸の化学合成において、ホスホロアミダイト法が広く用いられている。この方法において、所望の配列を有するオリゴヌクレオチドは、典型的には、適切に保護されたヌクレオシドを１つずつ、順次付加していくことにより得られ、各ヌクレオシドの付加は、少なくとも３つの工程、すなわち、カップリング工程、酸化または硫化工程、および脱保護工程を必要とする。例えば、特許文献１および２には、活性化剤としてテトラゾールを用い、３’位または５’位の水酸基が保護されたヌクレオシドとヌクレオシドホスホロアミダイトとを反応させることによりオリゴヌクレオチドを得る方法が記載されている。
　ここで、当該方法において、３’位および５’位の水酸基が無保護であるヌクレオシドを使用することができれば、脱保護の工程は不要となり、それに伴って、使用する試薬の減少、時間および労力の削減等、ひいてはコストの大幅な削減が期待される。
　しかしながら、従来の方法において、５’位と３’位の水酸基がともに無保護であるヌクレオシドを用いた場合には、５’位と３’位の水酸基が非選択的にホスホロアミダイトと反応する結果、不純物の割合が大幅に増加することとなり、所望のオリゴヌクレオチドを効率的に得ることはできなかった。

  The phosphoramidite method is widely used in the chemical synthesis of nucleic acids such as DNA oligonucleotides and RNA oligonucleotides. In this method, oligonucleotides with the desired sequence are typically obtained by sequentially adding appropriately protected nucleosides one by one, with each nucleoside being added in at least three steps. That is, it requires a coupling step, an oxidation or sulfurization step, and a deprotection step. For example, Patent Documents 1 and 2 describe a method for obtaining an oligonucleotide by reacting a nucleoside in which a hydroxyl group at the 3'- or 5'-position is protected with a nucleoside phosphoramidite using tetrazole as an activator. Has been done.
Here, if a nucleoside in which the hydroxyl groups at the 3'- and 5'-positions are unprotected can be used in the method, the deprotection step becomes unnecessary, and the amount of reagents used is reduced, time and labor. It is expected that the cost will be significantly reduced.
However, in the conventional method, when a nucleoside in which both the 5'- and 3'-hydroxyl groups are unprotected is used, the 5'- and 3'-hydroxyl groups react non-selectively with phosphoramidite. As a result, the proportion of impurities was significantly increased, and the desired oligonucleotide could not be obtained efficiently.

米国特許出願第２００３／０２２９２１８号U.S. Patent Application No. 2003/02229218 米国特許第９４８６９８号U.S. Pat. No. 948698

　本発明は、オリゴヌクレオチドを製造する方法およびオリゴヌクレオチドを製造するための活性化剤の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing an oligonucleotide and an activator for producing the oligonucleotide.

　本発明者らは、所望のオリゴヌクレオチドを効率的に製造することができる方法について鋭意研究に取り組む中で、３’水酸基と５’水酸基がともに無保護であるヌクレオシドを使用した場合においても、ヌクレオシドの５’水酸基を選択的にホスホロアミダイトと反応させることができる活性化剤を見出した。そしてかかる知見に基づいてさらに研究を続けた結果、本発明を完成させた。 The present inventors are working diligently on a method capable of efficiently producing a desired oligonucleotide, and even when using a nucleoside in which both the 3'hydroxyl group and the 5'hydroxyl group are unprotected, the nucleoside is used. We have found an activator capable of selectively reacting the 5'hydroxyl group of nucleoside with phosphoramidite. Then, as a result of further research based on such findings, the present invention was completed.

　すなわち、本発明は以下に関する。
[１]オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
５’位の水酸基に保護基が結合したヌクレオシドホスホロアミダイトと、３’位および５’位の水酸基が無保護であるヌクレオシドとを、式（Ｉ）：

式中、
Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２、メトキシ、シクロブタジエン、アダマンタン、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和のＣ_１～２２アルキル基、および任意に置換されていてもよい芳香族環からなる群から選択される、またはＲ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成している、
で表される活性化剤の存在下で反応させる工程を含む、前記方法。 That is, the present invention relates to the following.
[1] A method for producing an oligonucleotide.
A nucleoside phosphoramidite in which a protecting group is bonded to a hydroxyl group at the 5'position and a nucleoside in which the hydroxyl groups at the 3'and 5'positions are unprotected are expressed in the formula (I) :.

During the ceremony
R ¹ , R ² and R ³ are independently H, F, Cl, Br, CN, NO ₂ , methoxy, cyclobutadiene, adamantan, linear or branched saturated or unsaturated C _1-22. Selected from the group consisting of alkyl groups and optionally substituted aromatic rings, or R ² and R ³ together, phenyl with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached. Forming a ring,
The method comprising reacting in the presence of an activator represented by.

[２]Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２、メトキシ、メチル、ｉ－プロピル、ｔ－ブチル、シクロブタジエン、アダマンタン、ならびに任意に置換されていてもよいフェニル、ナフチル、およびアントラセニルからなる群から選択される、またはＲ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成している、[１]に記載の方法。
[３]Ｒ^１が、式（ＩＩ）：

式中、
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２、メチル、ｔ－ブチル、メトキシ、ｉ－プロピルおよびアダマンタンからなる群から選択される、
である、[１]または[２]に記載の方法。 [2] R ¹ , R ² and R ³ are independently H, F, Cl, Br, CN, NO ₂ , methoxy, methyl, i-propyl, t-butyl, cyclobutadiene, adamantane, and optionally. Selected from the group consisting of phenyl, naphthyl, and anthracenyl which may be substituted with, or R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached. The method according to [1], which is formed.
[3] R ¹ is the formula (II):

During the ceremony
R ⁴ and R ⁵ are independently selected from the group consisting of H, F, Cl, Br, CN, NO ₂ , methyl, t-butyl, methoxy, i-propyl and adamantane, respectively.
The method according to [1] or [2].

[４]（ａ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｂ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｃ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
（ｄ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
（ｅ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
（ｆ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
（ｇ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
（ｈ）Ｒ^１が、１－ナフチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｉ）Ｒ^１が、９－アントラセニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｊ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｋ）Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｌ）Ｒ^１が、２，６－ジクロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｍ）Ｒ^１が、ペンタフルオロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｎ）Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３がフェニルである、
（ｏ）Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｂｒである、
（ｐ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２がＮＯ_２であり、Ｒ^３が、Ｈである、
（ｑ）Ｒ^１が、１－アダマンチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、および
（ｒ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
からなる群から選択される、[１]または[２]に記載の方法。
[５]前記活性化剤は、酸と塩を形成している、[１]～[４]のいずれか１つに記載の方法
[６]酸が、トリフルオロメタンスルホン酸である、[５]に記載の方法。 [4] (a) R ¹ is phenyl and R ² and R ³ are H.
(B) R ¹ is t-butyl and R ² and R ³ are H.
(C) R ¹ is phenyl, and R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached.
(D) R ¹ is t-butyl, and R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached.
(E) R ¹ is phenyl and R ² and R ³ are CN.
(F) R ¹ is t-butyl and R ² and R ³ are CN.
(G) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are CN.
(H) R ¹ is 1-naphthyl and R ² and R ³ are H.
(I) R ¹ is 9-anthrasenyl and R ² and R ³ are H.
(J) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are H.
(K) R ¹ is 2-chlorophenyl and R ² and R ³ are H.
(L) R ¹ is 2,6-dichlorophenyl and R ² and R ³ are H.
(M) R ¹ is pentafluorophenyl and R ² and R ³ are H.
(N) R ¹ is 2-chlorophenyl and R ² and R ³ are phenyl.
(O) R ¹ , R ² and R ³ are Br.
(P) R ¹ is Br, R ² is NO ₂ , and R ³ is H.
(Q) R ¹ is 1-adamantyl, R ² and R ³ are H, and (r) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are together and they are Forming a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to be bonded,
The method according to [1] or [2], which is selected from the group consisting of.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the activator forms a salt with an acid.
[6] The method according to [5], wherein the acid is trifluoromethanesulfonic acid.

[７]オリゴヌクレオチドが、式（ＩＩＩ）：

で表される構造を有し、
５’位の水酸基に保護基が結合したヌクレオシドホスホロアミダイトが、式（ＩＶ）：

で表される構造を有し、
３’位および５’位の水酸基が無保護であるヌクレオシドが、式（Ｖ）：

で表される構造を有する、
式中、
Ｂは、各々独立して、保護基で保護された、または無保護のヌクレオシド塩基であり；
Ｒ_６は、保護基であり；
Ｒ_７およびＲ_８は、各々独立して、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、またはＯＣＨ_３のいずれか一つであり；
Ｒ_９は、各々独立して、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；
Ｘは、各々独立して、共有電子対、ＯまたはＳのいずれか一つであり；
Ｙは、各々独立して、Ｈ、ＮＨＲ_１０、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、またはアシル系保護基、エーテル系保護基もしくはシリル系保護基で保護された水酸基のいずれか一つであり；
Ｒ_１０は、各々独立して、－Ｈ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアラルキル基、または保護基のいずれか一つであり；
Ｚは、各々独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲン、または前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；および
ｎは、０以上２３以下の整数である；
[１]～[６]のいずれか１つに記載の方法。 [7] The oligonucleotide is of formula (III):

Has a structure represented by
The nucleoside phosphoramidite in which a protecting group is bonded to the hydroxyl group at the 5'position has the formula (IV):

Has a structure represented by
The nucleosides in which the hydroxyl groups at the 3'and 5'positions are unprotected have the formula (V) :.

Has a structure represented by
During the ceremony
B is each independently protected or unprotected nucleoside base;
R ₆ is a protecting group;
R ₇ and R ₈ are independently one of OCH ₂ CH ₂ CN, SCH ₂ CH ₂ CN, OCH ₂ CH = CH ₂ , or OCH ₃ ;
R ₉ is an independently substituted or unsubstituted aliphatic group, substituted or unsubstituted aromatic group;
Each X is independently one of a shared electron pair, O or S;
Y is each independently one of H, NHR ₁₀ , halogen, CN, CF ₃ , or hydroxyl group protected by an acyl protecting group, an ether protecting group or a silyl protecting group;
Each of R ₁₀ is independently any of -H, a substituted or unsubstituted aliphatic group, a substituted or unsubstituted aromatic group, a substituted or unsubstituted aralkyl group, or a protecting group. One;
Z independently forms a ZZ bond with H, alkyl, O-alkyl, N-alkyl, halogen, or said Y; and n is an integer greater than or equal to 0 and less than or equal to 23;
The method according to any one of [1] to [6].

[８]ヌクレオシドホスホロアミダイトを製造する方法であって、
ヌクレオシドホスホロアミダイトが、式（ＶＩ）：

で表される構造を有し、
[７]に記載の方法によりオリゴヌクレオチドを製造する工程を含む、
前記方法。 [8] A method for producing nucleoside phosphoramidite.
Nucleoside phosphoramidite has the formula (VI):

Has a structure represented by
A step of producing an oligonucleotide by the method according to [7].
The method.

[９]オリゴヌクレオチドを製造するための、式（Ｉ）：

式中、
Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２、メトキシ、シクロブタジエン、アダマンタン、－ＸＲ^Ａ、ヘテロ原子を含む基で任意に置換されていてもよい直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和のＣ_１～２２アルキル基、および任意に置換されていてもよい芳香族環からなる群から選択され、ここで、Ｘはヘテロ原子であり、Ｒ^Ａは直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和のＣ_１～２２アルキル基である、またはＲ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成している、
で表される、活性化剤。
[１０]Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２、メトキシ、メチル、ｉ－プロピル、ｔ－ブチル、シクロブタジエン、アダマンタン、ならびに任意に置換されていてもよいフェニル、ナフチル、およびアントラセニルからなる群から選択される、またはＲ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成している、[９]に記載の活性化剤。 [9] Formula (I) for producing oligonucleotides:

During the ceremony
R ^{1, R 2} and ^{R 3} are each independently, H, F, Cl, Br , CN, NO 2, methoxy, cyclobutadiene, adamantane, -XR ^A, optionally substituted with a group containing a hetero atom _{Selected from the group consisting of saturated or unsaturated C 1-22} alkyl groups, which may be linear or branched, and aromatic rings, which may be optionally substituted, where X is a heteroatom. ^RA is a linear or branched saturated or unsaturated C _1-22 alkyl group, or R ² and R ³ are phenyl together with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached. Forming a ring,
An activator represented by.
[10] R ¹ , R ² and R ³ are independently H, F, Cl, Br, CN, NO ₂ , methoxy, methyl, i-propyl, t-butyl, cyclobutadiene, adamantane, and optionally. Selected from the group consisting of phenyl, naphthyl, and anthracenyl which may be substituted with, or R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached. The activator according to [9], which is formed.

[１１]Ｒ^１が、式（ＩＩ）：

式中、
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、メチル、ｔ－ブチル、メトキシ、ｉ－プロピルおよびアダマンタンからなる群から選択される、
である、[９]または[１０]に記載の活性化剤。
[１２]（ａ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｂ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｃ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
（ｄ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
（ｅ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
（ｆ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
（ｇ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
（ｈ）Ｒ^１が、１－ナフチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｉ）Ｒ^１が、９－アントラセニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｊ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｋ）Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｌ）Ｒ^１が、２，６－ジクロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｍ）Ｒ^１が、ペンタフルオロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
（ｎ）Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３がフェニルである、
（ｏ）Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｂｒである、
（ｐ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２がＮＯ_２であり、Ｒ^３が、Ｈである、
（ｑ）Ｒ^１が、１－アダマンチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、および
（ｒ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
からなる群から選択される、[９]または[１０]に記載の活性化剤。
[１３]酸と塩を形成している、[９]～[１２]のいずれか１つに記載の活性化剤
[１４]酸が、トリフルオロメタンスルホン酸である、[１３]に記載の活性化剤。 [11] R ¹ is the equation (II):

During the ceremony
R ⁴ and R ⁵ are independently selected from the group consisting of H, F, Cl, Br, CN, methyl, t-butyl, methoxy, i-propyl and adamantane, respectively.
The activator according to [9] or [10].
[12] (a) R ¹ is phenyl and R ² and R ³ are H.
(B) R ¹ is t-butyl and R ² and R ³ are H.
(C) R ¹ is phenyl, and R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached.
(D) R ¹ is t-butyl, and R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached.
(E) R ¹ is phenyl and R ² and R ³ are CN.
(F) R ¹ is t-butyl and R ² and R ³ are CN.
(G) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are CN.
(H) R ¹ is 1-naphthyl and R ² and R ³ are H.
(I) R ¹ is 9-anthrasenyl and R ² and R ³ are H.
(J) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are H.
(K) R ¹ is 2-chlorophenyl and R ² and R ³ are H.
(L) R ¹ is 2,6-dichlorophenyl and R ² and R ³ are H.
(M) R ¹ is pentafluorophenyl and R ² and R ³ are H.
(N) R ¹ is 2-chlorophenyl and R ² and R ³ are phenyl.
(O) R ¹ , R ² and R ³ are Br.
(P) R ¹ is Br, R ² is NO ₂ , and R ³ is H.
(Q) R ¹ is 1-adamantyl, R ² and R ³ are H, and (r) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are together and they are Forming a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to be bonded,
The activator according to [9] or [10], which is selected from the group consisting of.
[13] The activator according to any one of [9] to [12], which forms a salt with an acid.
[14] The activator according to [13], wherein the acid is trifluoromethanesulfonic acid.

　本発明の活性化剤を用いることにより、３’位および５’位の水酸基が無保護であるヌクレオシドを使用した場合においても、ヌクレオシドの５’水酸基を選択的に反応させることができるため、所望のオリゴヌクレオチドを効率的に製造することができる。したがって、本発明の活性化剤を用いることにより、３’位および５’位の水酸基が無保護であるヌクレオシドを反応に用いることが可能となり、脱保護の工程が不要となる。
　特定の理論に拘束されることは望まないが、活性化剤の反応点であるイミダゾールの窒素周辺を嵩高くすることにより、活性化剤は第２級アルコールである３’水酸基には近づきにくくなり、結果として、第１級アルコールである５’水酸基と選択的に反応することになり、５’水酸基に対する反応選択性が実現されているものと考えられる。 By using the activator of the present invention, even when a nucleoside in which the hydroxyl groups at the 3'- and 5'positions are unprotected can be used, the 5'hydroxyl group of the nucleoside can be selectively reacted, which is desired. Oligonucleotides can be efficiently produced. Therefore, by using the activator of the present invention, it becomes possible to use a nucleoside in which the hydroxyl groups at the 3'- and 5'positions are unprotected, and the deprotection step becomes unnecessary.
Although it is not desirable to be bound by a specific theory, by making the area around nitrogen of imidazole, which is the reaction point of the activator, bulky, the activator becomes less accessible to the 3'hydroxyl group, which is a secondary alcohol. As a result, it is considered that the reaction selectively with the 5'hydroxyl group, which is a primary alcohol, is realized, and the reaction selectivity with respect to the 5'hydroxyl group is realized.

　以下、本発明を詳細に説明する。
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Unless defined otherwise herein, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as those commonly understood by one of ordinary skill in the art. All patents, applications and other publications and information referenced herein are hereby incorporated by reference in their entirety. In the event of a conflict between the publications referred to herein and the description herein, the description herein shall prevail.

　本発明は、一側面において、オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、５’位の水酸基に保護基が結合したヌクレオシドホスホロアミダイトと、３’位および５’位の水酸基が無保護であるヌクレオシドとを、活性化剤の存在下で反応させる工程を含む、前記方法に関する。 In one aspect, the present invention is a method for producing an oligonucleotide, in which a nucleoside phosphoramidite in which a protecting group is bonded to a hydroxyl group at the 5'position and a nucleoside in which the hydroxyl groups at the 3'and 5'positions are unprotected. The present invention relates to the above method, which comprises a step of reacting with and in the presence of an activator.

　本発明において、オリゴヌクレオチドの製造は、溶液中または固体支持体上で、好適な活性化剤の存在下で、ヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドとの縮合反応によってヌクレオチドの付加が行われる、いわゆるホスホロアミダイト法を用いて行われる。 In the present invention, the production of an oligonucleotide is a so-called phosphorotide in which nucleotides are added by a condensation reaction between a nucleoside phosphoramidite and a nucleoside in solution or on a solid support in the presence of a suitable activator. It is performed using the amidite method.

　本発明において、オリゴヌクレオチドとは、ヌクレオシド塩基、糖、リン酸がホスホジエステル結合で連なった構造を有する化合物を指し、天然に存在するオリゴヌクレオチド、例えば２’－デオキシリボ核酸（以下、「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（以下、「ＲＮＡ」）と、修飾糖部分、修飾リン酸部分、または修飾ヌクレオ塩基を含有する核酸とが含まれる。糖部分への修飾には、リボース環をヘキソース、シクロペンチル、またはシクロヘキシル環に置き換えることが含まれる。あるいは、天然に存在する核酸のＤ－リボース環をＬ－リボース環に置き換えてよく、または、天然に存在する核酸のβ－アノマーをα－アノマーに置き換えてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、１以上の非塩基性部分を含んでいてもよい。修飾リン酸部分には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸メチルが含まれる。こうした核酸類似体は当業者に知られている。上記の２以上の混合物を含んでなるオリゴヌクレオチドは、例えば、デオキシリボおよびリボヌクレオシドの混合物、特にデオキシリボヌクレオシドと２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－メトキシエチルリボヌクレオシドのような２’－Ｏ－置換リボヌクレオシドの混合物を含んでなるオリゴヌクレオチドから製造可能である。ヌクレオシドの混合物を含んでなるオリゴヌクレオチドの例には、リボザイムが含まれる。 In the present invention, the oligonucleotide refers to a compound having a structure in which a nucleoside base, a sugar, and a phosphoric acid are linked by a phosphodiester bond, and a naturally occurring oligonucleotide, for example, 2'-deoxyribonucleic acid (hereinafter, "DNA"). And ribonucleic acid (hereinafter, "RNA") and a nucleic acid containing a modified sugar moiety, a modified phosphate moiety, or a modified nucleobase. Modifications to the sugar moiety include replacing the ribose ring with a hexose, cyclopentyl, or cyclohexyl ring. Alternatively, the D-ribose ring of a naturally occurring nucleic acid may be replaced with an L-ribose ring, or the β-anomer of a naturally occurring nucleic acid may be replaced with an α-anomer. Oligonucleotides may also contain one or more non-basic moieties. Modified phosphate moieties include phosphorothioate, phosphorodithioate, methylphosphonate, and methyl phosphate. Such nucleic acid analogs are known to those of skill in the art. Oligonucleotides comprising the above two or more mixtures include, for example, mixtures of deoxyribo and ribonucleosides, particularly 2'-O such as deoxyribonucleoside and 2'-O-methyl or 2'-O-methoxyethylribonucleoside. -Can be prepared from oligonucleotides comprising a mixture of substituted ribonucleosides. Examples of oligonucleotides comprising a mixture of nucleosides include ribozymes.

　本発明の一態様において、オリゴヌクレオチドは、式（ＩＩＩ）：

で表される構造を有する。 In one aspect of the invention, the oligonucleotides are of formula (III) :.

It has a structure represented by.

　本発明において、ヌクレオシドホスホロアミダイトとは、アミダイトで誘導体化されたヌクレオシドを指す。本発明においては、ヌクレオシドの３’水酸基がホスホロアミダイト化されており、５’水酸基には保護基が結合している。
　アミダイト化は、例えば、１Ｈ－テトラゾールを活性化剤に用い、適切に保護されたヌクレオシドに対し、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイトを反応させることによって行うことができる。
　ヌクレオシドホスホロアミダイトは、モノマーであっても、２ｍｅｒ～２４ｍｅｒのようなオリゴマーであってもよい。 In the present invention, the nucleoside phosphoramidite refers to a nucleoside derivatized with amidite. In the present invention, the 3'hydroxyl group of the nucleoside is phosphoramidite-ized, and a protecting group is bonded to the 5'hydroxyl group.
Amiditeization is carried out, for example, by reacting a properly protected nucleoside with 2-cyanoethyl-N, N, N', N'-tetraisopropylphosphorodiamidite using 1H-tetrazole as an activator. be able to.
The nucleoside phosphoramidite may be a monomer or an oligomer such as 2 mer to 24 mer.

　本発明の一態様において、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、式（ＩＶ）：

で表される構造を有する。 In one aspect of the invention, the nucleoside phosphoramidite is of formula (IV):

It has a structure represented by.

　本発明において、ヌクレオチドとは、ヌクレオシド塩基と糖とリン酸とが結合した化合物を指し、アデノシン三リン酸、チミジン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸、ウリジン三リン酸のような天然に存在するヌクレオチド、または修飾ヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドのヌクレオシド塩基部分は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルのような天然に存在する塩基、または修飾ヌクレオシド塩基であってもよい。ヌクレオシドの糖部分は、天然に存在するデオキシリボースやリボースであってもよく、Ｄ配置もしくはＬ配置をとってもよい。リン酸部分は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸メチルであってもよい。 In the present invention, the nucleotide refers to a compound in which a nucleoside base, a sugar, and phosphoric acid are bound, and such as adenosine triphosphate, thymidin triphosphate, guanosine triphosphate, citidine triphosphate, and uridine triphosphate. It may be a naturally occurring nucleotide or a modified nucleotide. The nucleoside base portion of the nucleotide may be a naturally occurring base such as adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil, or a modified nucleoside base. The sugar moiety of the nucleoside may be naturally occurring deoxyribose or ribose, and may be in the D or L configuration. The phosphoric acid moiety may be, for example, phosphorothioate, phosphorodithioate, methylphosphonate, and methyl phosphate.

　本発明において、ヌクレオシドとは、ヌクレオシド塩基と糖が結合した化合物を指し、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジンのような天然に存在するヌクレオシド、または修飾ヌクレオシドであってもよい。ヌクレオシド塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルのような天然に存在する塩基、または修飾ヌクレオシド塩基であってもよい。ヌクレオシドの糖部分は、天然に存在するデオキシリボースやリボースであってもよく、Ｄ配置もしくはＬ配置をとってもよい。
　本発明において、３’位および５’位の水酸基が無保護であるヌクレオシドとは、３’位および５’位の水酸基が、いずれの保護基によっても保護されていないヌクレオシドを指す。 In the present invention, the nucleoside refers to a compound in which a nucleoside base and a sugar are bound, and may be a naturally occurring nucleoside such as adenosine, thymidine, guanosine, cytidine, or uridine, or a modified nucleoside. The nucleoside base may be a naturally occurring base such as adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil, or a modified nucleoside base. The sugar moiety of the nucleoside may be naturally occurring deoxyribose or ribose, and may be in the D or L configuration.
In the present invention, the nucleoside in which the hydroxyl groups at the 3'-position and the 5'-position are unprotected refers to a nucleoside in which the hydroxyl groups at the 3'-position and the 5'-position are not protected by any protecting group.

　本発明の一態様において、３’位および５’位の水酸基が無保護であるヌクレオシドヌクレオシドは、式（Ｖ）：

で表される構造を有する。 In one aspect of the invention, the nucleosides in which the hydroxyl groups at the 3'and 5'positions are unprotected are of formula (V):

It has a structure represented by.

　式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）および式（Ｖ）において、Ｂは、各々独立して、保護基で保護された、または無保護のヌクレオシド塩基である。
　ヌクレオシド塩基は、これらに限定されないが、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルのような天然に存在する塩基や、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、７－デアザ－６－オキソプリン、６－オキソプリン、３－デアザアデノシン、２－オキソ－５－メチルピリミジン、２－オキソ－４－メチルチオ－５－メチルピリミジン、２－チオカルボニル－４－オキソ－５－メチルピリミジン、４－オキソ－５－メチルピリミジン、２－アミノプリン、５－フルオロウラシル、２，６－ジアミノプリン、８－アミノプリン、４－トリアゾロ－５－メチルチミン、および４－トリアゾロ－５－メチルウラシルのような修飾塩基が挙げられる。 In formulas (III), (IV) and formula (V), B is an independently protected or unprotected nucleoside base.
Nucleoside bases include, but are not limited to, naturally occurring bases such as, for example, adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil, 7-deazaguanine, 7-deaza-8-azaguanine, 5-propynylcytocin, 5 -Propinyl uracil, 7-deazaadenine, 7-deaza-8-azaadenine, 7-daza-6-oxopurine, 6-oxopurine, 3-deazaadenosin, 2-oxo-5-methylpyrimidine, 2-oxo-4-methylthio -5-Methylpyrimidine, 2-thiocarbonyl-4-oxo-5-methylpyrimidine, 4-oxo-5-methylpyrimidine, 2-aminopurine, 5-fluorouracil, 2,6-diaminopurine, 8-aminopurine, Modified bases such as 4-triazolo-5-methylthymine and 4-triazolo-5-methyluracil can be mentioned.

　保護基で保護されたヌクレオシド塩基は、該塩基の反応性官能基が保護されているヌクレオシド塩基である。典型的には、ヌクレオシド塩基は、アミドまたはカルバメートのように、アミン保護基で保護し得るアミン基を有する。例えば、アデニンおよびシトシンのアミン基は、典型的には、ベンゾイル保護基で保護され、グアニンのアミン基は、典型的には、イソブチリル基、アセチル基、またはｔ－ブチルフェノキシアセチル基で保護される。しかしながら、他の保護スキームを使用してもよい。例えば、迅速な脱保護のためには、アデニンおよびグアニンのアミン基をフェノキシアセチル基で保護し、シトシンのアミノ基をイソブチリル基またはアセチル基で保護する。保護基の除去の条件は、使用する保護基に依存する。アミド保護基を使用する場合、それは、濃水酸化アンモニウム溶液、ｎ－メチルアミン溶液、またはｔ－ブチルアミンの水酸化アンモニウム溶液のような塩基溶液でオリゴヌクレオチドを処理することによって除去することができる。 The nucleoside base protected by a protecting group is a nucleoside base in which the reactive functional group of the base is protected. Typically, the nucleoside base has an amine group that can be protected with an amine protecting group, such as an amide or carbamate. For example, the amine groups of adenin and cytosine are typically protected with a benzoyl protecting group, and the amine groups of guanine are typically protected with an isobutyryl group, an acetyl group, or a t-butylphenoxyacetyl group. .. However, other protection schemes may be used. For example, for rapid deprotection, the amine groups of adenine and guanine are protected with phenoxyacetyl groups and the amino groups of cytosine are protected with isobutyryl or acetyl groups. The conditions for removing the protecting group depend on the protecting group used. If an amide protecting group is used, it can be removed by treating the oligonucleotide with a base solution such as concentrated ammonium hydroxide solution, n-methylamine solution, or ammonium hydroxide solution of t-butylamine.

　式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）において、Ｒ_６は、保護基であり、好ましくは、酸に不安定な保護基、またはｔ－ブチルジメチルシリルまたはトリイソプロピルシリルのようなトリアルキルシリル基である。酸に不安定な保護基とは、プロトン酸またはルイス酸と該基を接触させることによって除去可能である保護基である。酸に不安定な保護基は、当業者に知られている。酸に不安定保護基の例としては、置換または非置換トリチル基、置換または非置換テトラヒドロピラニル基、置換または非置換テトラヒドロフラニル基、またはピキシル基などが挙げられる。トリチル基は、通常、アルコキシ基のような電子供与基により置換される。より好ましい態様において、Ｒ^１は、置換されたもしくは未置換のトリチル、９－（フェニル）キサンテニル（以下、「ピキシル」）またはテトラヒドロピラニル（以下、「ＴＨＰ」）である。なお一層好ましい態様において、Ｒ_６は、未置換のトリチル、モノアルコキシトリチル、ジアルコキシトリチル、トリアルコキシトリチル、ＴＨＰまたはピキシルである。最も好ましくは、Ｒ^１は４，４’－ジメトキシトリチルである。
　式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）において、Ｒ_７およびＲ_８は、各々独立して、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、またはＯＣＨ_３のいずれか一つである。
　式（ＩＶ）において、Ｒ_９は、各々独立して、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基である。置換されたもしくは未置換の脂肪族基としては、これらに限定されないが、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ピロリジノ、モルホリノが挙げられ、好ましくはエチル、イソプロピル、モルホリノである。置換されたもしくは未置換の芳香族基としては、これらに限定されないが、例えば、フェニル、ベンジル、トルイル、アニリルが挙げられ、好ましくはフェニル、ベンジルである。好ましい態様において、Ｒ_９は、イソプロピルである。
　式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）において、Ｘは、各々独立して、共有電子対、ＯまたはＳのいずれか一つである。
　式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）および式（Ｖ）において、Ｙは、各々独立して、Ｈ、ＮＨＲ_１０、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、またはアシル系保護基、エーテル系保護基もしくはシリル系保護基で保護された水酸基のいずれか一つである。ハロゲンは、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩである。アシル系保護基としては、例えば、アセチル、ベンゾイル、ピバロイルなどが挙げられる。エーテル系保護基としては、例えば、ベンジル、ｐ－メトキシベンジル（ＰＭＢ）、アリルなどが挙げられる。シリル系保護基としては、例えば、t－ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）、t－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、t－トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）などが挙げられる。Ｒ_１０は、各々独立して、－Ｈ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアラルキル基、またはアシル基をはじめとする保護基のいずれか一つである。置換されたもしくは未置換の脂肪族基としては、これらに限定されないが、例えば、メチル、エチル、アリル、１－ペンテニル、２－メトキシエチルが挙げられ、好ましくはメチル、アリル、２－メトキシエチルである。置換されたもしくは未置換の芳香族基としては、これらに限定されないが、例えば、フェニル、ベンジル、ナフチル、２－ピレニルメチルが挙げられ、好ましくはフェニル、ベンジルである。保護基は、例えば、ｔ－ブチルジメチルシリルである。好ましい態様において、Ｙは、Ｈである。
　式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）および式（Ｖ）において、Ｚは、各々独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲン、または前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成する。ハロゲンは、例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩである。
　式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）において、ｎは、０以上２３以下の整数であり、例えば、０以上２１以下、０以上２０以下、０以上１９以下、０以上１８以下、０以上１７以下、０以上１６以下、０以上１５以下、０以上１４以下、０以上１３以下、０以上１２以下、０以上１１以下、０以上１０以下、０以上９以下、０以上８以下、０以上７以下、０以上６以下、０以上５以下、０以上４以下、０以上３以下、０以上２以下、０以上１以下、または０である。 In formulas (III) and (IV), R ₆ is a protecting group, is preferably an acid labile protecting group or t- butyldimethylsilyl or a trialkylsilyl group such as triisopropylsilyl, .. Acid-labile protecting groups are protecting groups that can be removed by contacting the group with a protonic acid or Lewis acid. Acid-labile protecting groups are known to those of skill in the art. Examples of acid-unstable protecting groups include substituted or unsubstituted trityl groups, substituted or unsubstituted tetrahydropyranyl groups, substituted or unsubstituted tetrahydrofuranyl groups, pixyl groups and the like. The trityl group is usually replaced by an electron donating group such as an alkoxy group. In a more preferred embodiment, R ¹ is a substituted or unsubstituted trityl, 9- (phenyl) xanthenyl (hereinafter “Pixyl”) or tetrahydropyranyl (hereinafter “THP”). In still more preferred embodiment, R ₆ is unsubstituted trityl, monoalkoxy trityl, dialkoxy trityl, trialkoxy trityl, a THP or pixyl. Most preferably, R ¹ is 4,4'-dimethoxytrityl.
In formulas (III) and (IV), R ₇ and R ₈ are independently one of OCH ₂ CH ₂ CN, SCH ₂ CH ₂ CN, OCH ₂ CH = CH ₂ , or OCH _3. Is.
In formula (IV), R ₉ is a substituted or unsubstituted aliphatic group and a substituted or unsubstituted aromatic group, respectively. Substituted or unsubstituted aliphatic groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, isopropyl, pyrrolidino and morpholino, with preference given to ethyl, isopropyl and morpholino. Substituted or unsubstituted aromatic groups include, but are not limited to, phenyl, benzyl, toluyl, and aniryl, preferably phenyl and benzyl. In a preferred embodiment, R ₉ is isopropyl.
In formulas (III) and (IV), X is independently one of a shared electron pair, O or S, respectively.
In formulas (III), (IV) and (V), Y is independently H, NHR ₁₀ , halogen, CN, CF ₃ , or acyl-protecting group, ether-protecting group or silyl-protecting group. It is one of the hydroxyl groups protected by a group. Halogen is, for example, F, Cl, Br, and I. Examples of the acyl-based protecting group include acetyl, benzoyl, pivaloyl and the like. Examples of the ether-based protecting group include benzyl, p-methoxybenzyl (PMB), allyl and the like. Examples of the silyl protecting group include t-butyldimethylsilyl (TBS), t-butyldiphenylsilyl (TBDPS), t-triisopropylsilyl (TIPS), triethylsilyl (TES), trimethylsilyl (TMS) and the like. .. Each of R ₁₀ is independently composed of —H, a substituted or unsubstituted aliphatic group, a substituted or unsubstituted aromatic group, a substituted or unsubstituted aralkyl group, or an acyl group. It is one of the protective groups to be used. Substituted or unsubstituted aliphatic groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, allyl, 1-pentenyl, and 2-methoxyethyl, preferably methyl, allyl, and 2-methoxyethyl. is there. Substituted or unsubstituted aromatic groups include, but are not limited to, phenyl, benzyl, naphthyl, 2-pyrenylmethyl, and are preferably phenyl and benzyl. The protecting group is, for example, t-butyldimethylsilyl. In a preferred embodiment, Y is H.
In formulas (III), (IV) and (V), Z independently forms a ZZ bond with H, alkyl, O-alkyl, N-alkyl, halogen, or Y. Form. Halogen is, for example, F, Cl, Br, and I.
In formulas (III) and (IV), n is an integer of 0 or more and 23 or less, for example, 0 or more and 21 or less, 0 or more and 20 or less, 0 or more and 19 or less, 0 or more and 18 or less, 0 or more and 17 or less, 0 or more and 16 or less, 0 or more and 15 or less, 0 or more and 14 or less, 0 or more and 13 or less, 0 or more and 12 or less, 0 or more and 11 or less, 0 or more and 10 or less, 0 or more and 9 or less, 0 or more and 8 or less, 0 or more and 7 or less, 0 or more and 6 or less, 0 or more and 5 or less, 0 or more and 4 or less, 0 or more and 3 or less, 0 or more and 2 or less, 0 or more and 1 or less, or 0.

　本発明において、活性化剤は、ヌクレオシドホスホロアミダイトとヌクレオシドとを反応させるために用いられ、アクチベーターまたはカップリング剤とも称される。
　本発明において、活性化剤は、式（Ｉ）：

の構造を有する。
　本発明の一態様において、式（Ｉ）において、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２、メトキシ、シクロブタジエン、アダマンタン、－ＸＲ^Ａ、ヘテロ原子を含む基で任意に置換されていてもよい直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和のＣ_１～２２アルキル基、および任意に置換されていてもよい芳香族環からなる群から選択され、ここで、Ｘはヘテロ原子であり、Ｒ^Ａは直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和のＣ_１～２２アルキル基である、またはＲ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する。Ｘは、好ましくは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｎ、ＳｅおよびＳｉからなる群から選択されるヘテロ原子であり、好ましくはＳである。ヘテロ原子を含む基は、好ましくはＣＮ基である。直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和のＣ_１～２２アルキル基としては、これらに限定されることなく、例えば、メチル、エチル、ｉ－プロピル、およびt－ブチルが挙げられ、好ましくは、メチル、ｉ－プロピル、ｔ－ブチルである。
　本発明の一態様において、式（Ｉ）において、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２、メトキシ、メチル、ｉ－プロピル、ｔ－ブチル、シクロブタジエン、アダマンタン、ならびに任意に置換されていてもよいフェニル、ナフチル、およびアントラセニルからなる群から選択される、またはＲ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する。任意に置換されていてもよいフェニルとしては、これらに限定されることなく、例えば、フェニル、ベンジル、ナフチル、２－ピレニルメチルが挙げられ、好ましくはフェニル、ベンジルある。
　本発明の好ましい態様において、Ｒ^１は、Ｂｒ、フェニル、クロロフェニル、またはナフチルであり、Ｒ^２は、Ｈ、Ｂｒ、またはＮＯ_２であり、Ｒ^３は、ＨまたはＢｒであるか、またはＲ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する。
　本発明の一態様において、式（Ｉ）において、Ｒ^１は、式（ＩＩ）：

である。
　本発明の一態様において、式（ＩＩ）において、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、メチル、ｔ－ブチル、メトキシ、ｉ－プロピルおよびアダマンタンからなる群から選択される。 In the present invention, the activator is used for reacting a nucleoside phosphoramidite with a nucleoside, and is also referred to as an activator or a coupling agent.
In the present invention, the activator is of formula (I) :.

Has the structure of.
In one aspect of the invention, in formula (I), R ¹ , R ² and R ³ are independently H, F, Cl, Br, CN, NO ₂ , methoxy, cyclobutadiene, adamantan, -XR. ^{From the} group consisting of A, a linear or branched saturated or unsaturated C _1-22 alkyl group optionally substituted with a heteroatom-containing group, and an optionally substituted aromatic ring. Selected, where X is a heteroatom, ^RA is a linear or branched saturated or unsaturated C _1-22 alkyl group, or R ² and R ³ are together, they. Form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which the is bonded. X is preferably a heteroatom selected from the group consisting of O, N, S, N, Se and Si, preferably S. The group containing a heteroatom is preferably a CN group. Saturated or unsaturated C _1-22 alkyl groups of linear or branched chains include, but are not limited to, methyl, ethyl, i-propyl, and t-butyl, with preference given to methyl. , I-propyl, t-butyl.
In one embodiment of the present invention, in formula (I), R ¹ , R ² and R ³ are independently H, F, Cl, Br, CN, NO ₂ , methoxy, methyl, i-propyl, t. -Selected from the group consisting of butyl, cyclobutadiene, adamantane, and optionally substituted phenyl, naphthyl, and anthracenyl, or R ² and R ³ together, the imidazole ring to which they are attached. It forms a phenyl ring with the above two carbon atoms. Examples of the phenyl that may be optionally substituted include, but are not limited to, phenyl, benzyl, naphthyl, and 2-pyrenylmethyl, and preferably phenyl and benzyl.
In a preferred embodiment of the invention, R ¹ is Br, phenyl, chlorophenyl, or naphthyl, R ² is H, Br, or NO ₂ , and R ³ is H or Br, or R ^2. and R ^3, taken together, along with the two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached form a phenyl ring.
In one aspect of the present invention, in formula (I), ^{R 1} is the formula (II):

Is.
In one aspect of the invention, in formula (II), R ⁴ and R ⁵ each independently consist of H, F, Cl, Br, CN, methyl, t-butyl, methoxy, i-propyl and adamantane. Selected from the group.

　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、式（Ｉ）において、Ｒ^１は、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、Ｈである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、式（Ｉ）において、Ｒ^１は、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、Ｈである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、式（Ｉ）において、Ｒ^１は、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともに、フェニル環を形成する。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１は、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともに、フェニル環を形成する。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１は、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、ＣＮである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１は、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、ＣＮである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１は、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３は、ＣＮである。 In one aspect of the present invention, the activator is represented by structure of formula (I), in formula (I), ^{R 1} is phenyl, ^{R 2} and ^{R 3} is H.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by structure of formula (I), in formula (I), ^{R 1} is a t- butyl, ^{R 2} and ^{R 3} is H.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where in formula (I) R ¹ is phenyl and R ² and R ³ are combined and they are bound together. Form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), R ¹ is t-butyl, and R ² and R ³ are together on the imidazole ring to which they are attached. Form a phenyl ring with the two carbon atoms of.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), ^{R 1} is phenyl, ^{R 2} and ^{R 3} is CN.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is t-butyl and R ² and R ³ are CN.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is Br and R ² and R ³ are CN.

　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、１－ナフチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、９－アントラセニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、２，６－ジクロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、ペンタフルオロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３がフェニルである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｂｒである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２がＮＯ_２であり、Ｒ^３が、Ｈである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、１－アダマンチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する。
　本発明の好ましい態様において、活性化剤は、２－フェニルイミダゾール、２－ナフチルイミダゾール、２－ブロモイミダゾール、２－（２－クロロフェニル）－４，５－ジフェニルイミダゾール、２，４，５－トリブロモイミダゾール、２－ブロモ－４－ニトロイミダゾール、または２－ブロモベンゾイミダゾールである。
　本発明の最も好ましい態様において、活性化剤は、２－フェニルイミダゾール、２－ナフチルイミダゾール、２，４，５－トリブロモイミダゾール、２－ブロモ－４－ニトロイミダゾール、または２－ブロモベンゾイミダゾールである。 In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), ^{R 1} is a 1-naphthyl, ^{R 2} and ^{R 3} is H.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), ^{R 1} is a 9-anthracenyl, ^{R 2} and ^{R 3} is H.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), ^{R 1} is a Br, ^{R 2} and ^{R 3} is H.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), ^{R 1} is a 2-chlorophenyl, ^{R 2} and ^{R 3} is H.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), ^{R 1} is a 2,6-dichlorophenyl, ^{R 2} and ^{R 3} is H.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), R ¹ is a pentafluorophenyl, R ² and R ³ is H.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is 2-chlorophenyl and R ² and R ³ are phenyl.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula ^{(I), R 1, R} 2 and ^{R 3} is Br.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is Br, R ² is NO ₂ and R ³ is H.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), ^{R 1} is a 1-adamantyl, ^{R 2} and ^{R 3} is H.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is Br and R ² and R ³ are together and 2 on the imidazole ring to which they are attached. It forms a phenyl ring with one carbon atom.
In a preferred embodiment of the invention, the activator is 2-phenylimidazole, 2-naphthylimidazole, 2-bromoimidazole, 2- (2-chlorophenyl) -4,5-diphenylimidazole, 2,4,5-tribromo. It is imidazole, 2-bromo-4-nitroimidazole, or 2-bromobenzimidazole.
In the most preferred embodiment of the invention, the activator is 2-phenylimidazole, 2-naphthylimidazole, 2,4,5-tribromoimidazole, 2-bromo-4-nitroimidazole, or 2-bromobenzimidazole. ..

　本発明の一態様において、前記活性化剤は、酸と塩を形成している。酸と塩を形成させることにより、活性化剤の酸性度をあげることができる。
　本発明の一態様において、酸は、各種プロトン酸またはルイス酸であればよく、これらに限定されないが、例えば、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、六フッ化リン酸、四フッ化ホウ素酸、三フッ化ホウ素、であってもよく、好ましくは、トリフルオロメタンスルホン酸である。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、式（Ｉ）において、Ｒ^１は、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、Ｈであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、式（Ｉ）において、Ｒ^１は、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、Ｈであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、式（Ｉ）において、Ｒ^１は、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成しており、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１は、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成しており、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１は、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、ＣＮであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１は、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３は、ＣＮであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１は、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３は、ＣＮであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。 In one aspect of the invention, the activator forms a salt with an acid. By forming a salt with an acid, the acidity of the activator can be increased.
In one embodiment of the present invention, the acid may be any proton acid or Lewis acid, and is not limited to, for example, methanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, hexafluorophosphate, tetrafluoride. It may be boron acid or boron trifluoride, preferably trifluoromethanesulfonic acid.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by structure of formula (I), in formula (I), R ¹ is phenyl, R ² and R ³ are H, trifluoromethanesulfonic acid And forming salt.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by structure of formula (I), in formula (I), ^{R 1} is a t- butyl, ^{R 2} and ^{R 3} are H, trifluoromethane It forms a salt with sulfonic acid.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by structure of formula (I), in formula (I), R ¹ is phenyl, R ² and R ³ together, they are bound It forms a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring, and forms a salt with trifluoromethanesulfonic acid.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is t-butyl and R ² and R ³ are together on the imidazole ring to which they are attached. It forms a phenyl ring with the two carbon atoms of, and forms a salt with trifluoromethanesulfonic acid.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is phenyl and R ² and R ³ are CN, forming a salt with trifluoromethanesulfonic acid. There is.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is t-butyl and R ² and R ³ are CN, forming a salt with trifluoromethanesulfonic acid. doing.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is Br and R ² and R ³ are CN, forming a salt with trifluoromethanesulfonic acid. There is.

　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、１－ナフチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、９－アントラセニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、２，６－ジクロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、ペンタフルオロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３がフェニルであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｂｒであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２がＮＯ_２であり、Ｒ^３が、Ｈであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、１－アダマンチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈであり、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の一態様において、活性化剤は式（Ｉ）の構造で表され、Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成しており、トリフルオロメタンスルホン酸と塩を形成している。
　本発明の好ましい態様において、活性化剤は、２－フェニルイミダゾリウムトリフラート、２－ナフチルイミダゾリウムトリフラート、２－ブロモイミダゾリウムトリフラート、２－（２－クロロフェニル）－４，５－ジフェニルイミダゾリウムトリフラート、２，４，５－トリブロモイミダゾリウムトリフラート、２－ブロモ－４－ニトロイミダゾリウムトリフラート、または２－ブロモベンゾイミダゾリウムトリフラートである。
　本発明の最も好ましい態様において、活性化剤は、２－フェニルイミダゾリウムトリフラート、２－ナフチルイミダゾリウムトリフラート、２，４，５－トリブロモイミダゾリウムトリフラート、２－ブロモ－４－ニトロイミダゾリウムトリフラート、または２－ブロモベンゾイミダゾリウムトリフラートである。 In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), R ¹ is a 1-naphthyl, R ² and R ³ is H, forming a trifluoromethanesulfonic acid salt doing.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is 9-anthrasenyl and R ² and R ³ are H, forming a salt with trifluoromethanesulfonic acid. doing.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is Br, R ² and R ³ are H, forming a salt with trifluoromethanesulfonic acid. There is.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), R ¹ is a 2-chlorophenyl, R ² and R ³ is H, forming a trifluoromethanesulfonic acid salt doing.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), R ¹ is a 2,6-dichlorophenyl, R ² and R ³ are H, trifluoromethanesulfonic acid and salts Is forming.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), R ¹ is a pentafluorophenyl, R ² and R ³ is H, forming a trifluoromethanesulfonic acid salt doing.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is 2-chlorophenyl and R ² and R ³ are phenyl, forming a salt with trifluoromethanesulfonic acid. ing.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula ^{(I), R 1, R} 2 and R ³ are Br, to form a trifluoromethanesulfonic acid salt.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is Br, R ² is NO ₂ , R ³ is H, and trifluoromethanesulfonic acid. Forming salt.
In one aspect of the present invention, the activator is represented by the structure of formula (I), R ¹ is a 1-adamantyl, R ² and R ³ is H, forming a trifluoromethanesulfonic acid salt doing.
In one aspect of the invention, the activator is represented by the structure of formula (I), where R ¹ is Br and R ² and R ³ are together and 2 on the imidazole ring to which they are attached. It forms a phenyl ring with one carbon atom and forms a salt with trifluoromethanesulfonic acid.
In a preferred embodiment of the invention, the activator is 2-phenylimidazolium triflate, 2-naphthylimidazolium triflate, 2-bromoimidazolium triflate, 2- (2-chlorophenyl) -4,5-diphenylimidazolium triflate, 2,4,5-Tribromoimidazolium triflate, 2-bromo-4-nitroimidazolium triflate, or 2-bromobenzoimidazolium triflate.
In the most preferred embodiment of the invention, the activator is 2-phenylimidazolium triflate, 2-naphthylimidazolium triflate, 2,4,5-tribromoimidazolium triflate, 2-bromo-4-nitroimidazolium triflate, Or 2-bromobenzoimidazolium triflate.

　本発明は、一側面において、ヌクレオシドホスホロアミダイトを製造する方法であって、オリゴヌクレオチドを製造する工程を含む、前記方法に関する。
　本発明の一態様において、ヌクレオシドホスホロアミダイトは、式（ＶＩ）：

で表される構造を有する。
　式（ＶＩ）において、Ｂ、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｘ、Ｙ、Ｒ_１０、Ｚ、ｎは、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）および式（Ｖ）において定義したとおりである。 The present invention relates to, in one aspect, a method for producing a nucleoside phosphoramidite, which comprises a step of producing an oligonucleotide.
In one aspect of the invention, the nucleoside phosphoramidite is of formula (VI):

It has a structure represented by.
In formula (VI), B, R ₆ , R ₇ , R ₈ , R ₉ , X, Y, R ₁₀ , Z, n are as defined in formula (III), formula (IV) and formula (V). Is.

　本発明は、一側面において、本発明は、オリゴヌクレオチドを製造するための、活性化剤に関する。
　本発明の一態様において、活性化剤は、式（Ｉ）：

で表される構造を有する。
　Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、上記で定義したとおりである。 The present invention, in one aspect, relates to an activator for producing oligonucleotides.
In one aspect of the invention, the activator is of formula (I) :.

It has a structure represented by.
R ¹ , R ² and R ³ are as defined above.

　本発明において、ホスホロアミダイトとヌクレオシドの反応は、適切な溶媒の存在下で行われる。 In the present invention, the reaction between phosphoramidite and nucleoside is carried out in the presence of a suitable solvent.

例１．活性化剤の合成
例１．１　２－フェニルイミダゾリウムトリフラートの調製

　２－フェニルイミダゾール（２４．０ｇ、１６７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３３３ｍＬ）を氷冷し、トリフルオロメタンスルホン酸（４２．８ｍＬ、１６７ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で３０分撹拌した後、生成した白色結晶を吸引下ろ別し、ＭＴＢＥ（１５０ｍＬ）で洗浄した。得られた結晶を減圧下１５時間乾燥し、２－フェニルイミダゾリウムトリフラートを白色結晶として得た（４８．５ｇ、収率９８．９％）。 Example 1. Synthesis example of activator 1.1 Preparation of 2-phenylimidazolium triflate

A dichloromethane solution (333 mL) of 2-phenylimidazole (24.0 g, 167 mmol) was ice-cooled, and trifluoromethanesulfonic acid (42.8 mL, 167 mmol) was added dropwise. After stirring at room temperature for 30 minutes, the formed white crystals were separated by suction and washed with MTBE (150 mL). The obtained crystals were dried under reduced pressure for 15 hours to obtain 2-phenylimidazolium triflate as white crystals (48.5 g, yield 98.9%).

例１．２　２－フェニルベンゾイミダゾリウムトリフラートの調製

　２－フェニルベンゾイミダゾール（３．８８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４０ｍＬ）を氷冷し、トリフルオロメタンスルホン酸（１．７５ｍＬ、２０．０ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で３０分撹拌した後、反応溶液を濃縮し、オイル状となった粗生成物にＭＴＢＥ－ヘキサン１：１溶液（５０ｍＬ）を撹拌しながら加え、生成した白色結晶を吸引下ろ別し、ＭＴＢＥ－ヘキサン１：１溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。得られた結晶を減圧下１５時間乾燥し、２－フェニルベンゾイミダゾリウムトリフラートを白色結晶として得た（６．８０ｇ、収率９７．４％）。 Example 1.2 Preparation of 2-phenylbenzoimidazolium triflate

A dichloromethane solution (40 mL) of 2-phenylbenzimidazole (3.88 g, 20.0 mmol) was ice-cooled, and trifluoromethanesulfonic acid (1.75 mL, 20.0 mmol) was added dropwise. After stirring at room temperature for 30 minutes, the reaction solution is concentrated, MTBE-hexane 1: 1 solution (50 mL) is added to the crude product in oil form with stirring, and the white crystals produced are separated by suction and MTBE. It was washed with a 1: 1 solution of -hexane (50 mL). The obtained crystals were dried under reduced pressure for 15 hours to obtain 2-phenylbenzoimidazolium triflate as white crystals (6.80 g, yield 97.4%).

例２．活性化剤の検討
　活性化剤として、イミダゾール誘導体および１Ｈ－テトラゾールを用いて、ＤＭＴｒ－Ａ_{（ＯＣＨ３）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_（ＯＨ）（Ａ（ＯＭｅ）Ｔ）（スキーム１）およびＤＭＴｒ－Ａ_{（ＯＨ）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ａ_（ＯＨ）（ＡＡ）（（スキーム２）を合成し、反応率および選択性を算出した。
 
スキーム１：

スキーム２：

  Example 2. _{Examination of activator DMTr-A (OCH3) p (OCH2CH2CN)} T _(OH) (A (OMe) T) (Scheme 1) and DMTr-A ₍ scheme 1) using an imidazole derivative and 1H-tetrazole as activators. _{OH) p (OCH2CH2CN)} A _(OH) (AA) ((Scheme 2) was synthesized and the reaction rate and selectivity were calculated.

Scheme 1:

Scheme 2:

 

例２．１　活性化剤として２－フェニルイミダゾリウムトリフラートを用いた、オリゴヌクレオチドの合成
　例１．１で調製した２－フェニルイミダゾリウムトリフラートの１．０Ｍジクロロメタン－ＤＭＦ溶液（１００μＬ）、デオキシヌクレオシドの２．０Ｍ　ＤＭＦ溶液（１００μＬ）を混合し、本溶液を２－シアノエチル５’－Ｏ－デオキシヌクレオシド－（Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの０．５Ｍジクロロメタン溶液（１００μＬ）に滴下し、室温で３０分撹拌することにより反応させた。反応液を５００倍に希釈し、ＨＰＬＣ（装置：Ｗａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣＢｉｏ、カラム：ＢＨＥ　Ｃ１８　５０ｍｍ、溶離液：０．１Ｍ　ＴＥＡＡ緩衝液のアセトニトリル溶液を５分かけて５０→１００％リニアグラジエント）を行った。反応率は、（目的物＋不純物＋加水分解体）のＨＰＬＣピーク面積÷（目的物＋不純物＋加水分解体＋残存した原料）のＨＰＬＣピーク面積から算出し、選択性は、目的物のＨＰＬＣピーク面積：不純物のＨＰＬＣピーク面積から算出した（目的物とは、ヌクレオシドの５’位の水酸基がホスホロアミダイトに結合した化合物を指し、不純物とは、ヌクレオシドの３’位の水酸基がホスホロアミダイトに結合した化合物を指す。以下同じ。）。 Example 2.1 Synthesis of oligonucleotides using 2-phenylimidazolium triflate as an activator 1.0 M dichloromethane-DMF solution (100 μL) of 2-phenylimidazolium triflate prepared in Example 1.1, of deoxynucleoside A 2.0 M DMF solution (100 μL) was mixed, and this solution was added dropwise to a 0.5 M dichloromethane solution (100 μL) of 2-cyanoethyl 5'-O-deoxynucleoside- (N, N'-diisopropyl) phosphoramidite. The reaction was carried out by stirring at room temperature for 30 minutes. The reaction mixture was diluted 500-fold and subjected to HPLC (equipment: UPLCBio manufactured by Waters, column: BHE C18 50 mm, eluent: acetonitrile solution of 0.1 M TEAA buffer over 5 minutes 50 → 100% linear gradient). It was. The reaction rate is calculated from the HPLC peak area of (target product + impurities + hydrolyzate) ÷ (target product + impurities + hydrolyzate + remaining raw material) HPLC peak area, and the selectivity is the HPLC peak of the target product. Area: Calculated from the HPLC peak area of the impurity (the target substance refers to a compound in which the 5'-position hydroxyl group of the nucleoside is bonded to phosphoramidite, and the impurity is the 3'-position hydroxyl group of the nucleoside to phosphoramidite. Refers to bound compounds; the same shall apply hereinafter).

例２．２　活性化剤としてイミダゾール誘導体を用いた、オリゴヌクレオチドの合成
　イミダゾール誘導体（２－ナフチルイミダゾール、２－ブロモイミダゾール、２－（２－クロロフェニル）－４，５－ジフェニルイミダゾール、２，４，５－トリブロモイミダゾール、２－ブロモ－４－ニトロイミダゾール、または２－ブロモベンゾイミダゾール）の１．０Ｍジクロロメタン－ＤＭＦ溶液（１００μＬ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）の０．５Ｍジクロロメタン溶液（０、３０、あるいは９０μＬ）、およびデオキシヌクレオシドの２．０Ｍ　ＤＭＦ溶液（１００μＬ）を混合して得られた溶液を２－シアノエチル５’－Ｏ－デオキシヌクレオシド－（Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの０．５Ｍジクロロメタン溶液（１００μＬ）に滴下し、室温で３０分撹拌することにより反応させた。反応液を５００倍に希釈し、ＨＰＬＣ（装置：Ｗａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣＢｉｏ、カラム：ＢＨＥ　Ｃ１８　５０ｍｍ、溶離液：０．１Ｍ　ＴＥＡＡ緩衝液のアセトニトリル溶液を５分かけて５０→１００％リニアグラジエント）を行った。反応率は、（目的物＋不純物＋加水分解体）のＨＰＬＣピーク面積÷（目的物＋不純物＋加水分解体＋残存した原料）のＨＰＬＣピーク面積から算出し、選択性は、目的物のＨＰＬＣピーク面積：不純物のＨＰＬＣピーク面積から算出した。 Example 2.2 Synthesis of oligonucleotides using imidazole derivatives as activators Imidazole derivatives (2-naphthylimidazole, 2-bromoimidazole, 2- (2-chlorophenyl) -4,5-diphenylimidazole, 2,4 A 1.0 M dichloromethane-DMF solution (100 μL) of 5-tribromoimidazole, 2-bromo-4-nitroimidazole, or 2-bromobenzimidazole, a 0.5 M dichloromethane solution of trifluoromethanesulfonic acid (TfOH) (0, 30 or 90 μL) and a 2.0 M DMF solution of deoxynucleoside (100 μL) were mixed to obtain a solution of 2-cyanoethyl 5'-O-deoxynucleoside- (N, N'-diisopropyl) phosphoramidite. The reaction was carried out by dropping into a 0.5 M dichloromethane solution (100 μL) and stirring at room temperature for 30 minutes. The reaction mixture was diluted 500-fold and subjected to HPLC (equipment: UPLCBio manufactured by Waters, column: BHE C18 50 mm, eluent: acetonitrile solution of 0.1 M TEAA buffer over 5 minutes 50 → 100% linear gradient). It was. The reaction rate is calculated from the HPLC peak area of (target product + impurities + hydrolyzate) ÷ (target product + impurities + hydrolyzate + remaining raw material) HPLC peak area, and the selectivity is the HPLC peak of the target product. Area: Calculated from the HPLC peak area of impurities.

例２．３　活性化剤として１Ｈ－テトラゾール（比較例）を用いた、オリゴヌクレオチドの合成
　１Ｈ－テトラゾールの２．５Ｍジクロロメタン－ＤＭＦ溶液（１００μＬ）と、デオキシヌクレオシドの２．０Ｍ　ＤＭＦ溶液（１００μＬ）とを混合してられた溶液を２－シアノエチル５’－Ｏ－デオキシヌクレオシド－（Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの０．５Ｍジクロロメタン溶液（１００μＬ）に滴下し、室温で３０分撹拌することにより反応させた。反応液を５００倍に希釈し、ＨＰＬＣ（装置：Ｗａｔｅｒｓ社製ＵＰＬＣＢｉｏ、カラム：ＢＨＥ　Ｃ１８　５０ｍｍ、溶離液：０．１Ｍ　ＴＥＡＡ緩衝液のアセトニトリル溶液を５分かけて５０→１００％リニアグラジエント）を行った。反応率は、（目的物＋不純物＋加水分解体）のＨＰＬＣピーク面積÷（目的物＋不純物＋加水分解体＋残存した原料）のＨＰＬＣピーク面積から算出し、選択性は、目的物のＨＰＬＣピーク面積：不純物のＨＰＬＣピーク面積から算出した。 Example 2.3 Synthesis of oligonucleotides using 1H-tetrazole (Comparative Example) as an activator 2.5M dichloromethane-DMF solution (100 μL) of 1H-tetrazole and 2.0M DMF solution (100 μL) of deoxynucleoside Is added dropwise to a 0.5 M dichloromethane solution (100 μL) of 2-cyanoethyl 5'-O-deoxynucleoside- (N, N'-diisopropyl) phosphoramidite, and the mixture is stirred at room temperature for 30 minutes. It was reacted by. The reaction mixture was diluted 500-fold and subjected to HPLC (equipment: UPLCBio manufactured by Waters, column: BHE C18 50 mm, eluent: acetonitrile solution of 0.1 M TEAA buffer over 5 minutes 50 → 100% linear gradient). It was. The reaction rate is calculated from the HPLC peak area of (target product + impurities + hydrolyzate) ÷ (target product + impurities + hydrolyzate + remaining raw material) HPLC peak area, and the selectivity is the HPLC peak of the target product. Area: Calculated from the HPLC peak area of impurities.

例２．４　評価
　結果を表１に示す。ＤＭＴｒ－Ａ_{（ＯＣＨ３）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_（ＯＨ）（Ａ（ＯＭｅ）Ｔ）の合成において、Ｎｏ．１～８に記載の活性化剤を用いた場合、１Ｈ－テトラゾールを活性化剤として用いた場合よりも反応性が高かった。また、ＤＭＴｒ－Ａ_{（ＯＨ）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ａ_（ＯＨ）（ＡＡ）の合成において、Ｎｏ．１～４および６～８に記載の活性化剤を用いた場合、１Ｈ－テトラゾールを活性化剤として用いた場合よりも、反応性が高く、選択性にも優れていた。これらの活性化剤は、テトラゾールよりも立体障害が大きいため、選択性に優れていたと考えられる。

 
  Example 2.4 The evaluation results are shown in Table 1. In the synthesis of DMTr-A _{(OCH3) p (OCH2CH2CN)} T _(OH) (A (OMe) T), No. When the activators described in 1 to 8 were used, the reactivity was higher than when 1H-tetrazole was used as the activator. Further, in _{the synthesis of DMTr-A (OH) p (OCH2CH2CN)} A _(OH) (AA), No. When the activators described in 1 to 4 and 6 to 8 were used, the reactivity was higher and the selectivity was also excellent than when 1H-tetrazole was used as the activator. Since these activators have greater steric hindrance than tetrazole, it is considered that they were excellent in selectivity.

例３　オリゴヌクレオチドおよびホスホロアミダイトの合成ならびに精製
例３．１　ＤＭＴｒ－Ａ_{（ＯＣＨ３）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_（ＯＨ）（化合物１）の合成および精製

Example 3 Synthesis and purification of oligonucleotide and phosphoramidite Example 3.1 Synthesis and purification of DMTr-A _{(OCH3) p (OCH2CH2CN)} T _(OH) (Compound 1)

（１）
　２－シアノエチル５’－Ｏ－ｄＤＭＴｒ－Ｎ６－ベンゾイル－２’－Ｏ－メトキシアデノシン３’－（Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト（１９．０ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１１０ｍＬ）をチミジン（７．８ｇ、３２．１ｍｍｏｌ）と２－フェニルイミダゾリウムトリフラート（１２．６ｇ、４２．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１１０ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液を純水（１．２Ｌ）に滴下し、得られた有機相を飽和重曹溶液（１００ｍＬｘ２回）で洗浄し、有機相を３００ｍＬマイヤーに移した後、芒硝で３０分乾燥した。有機相を減圧下濃縮し、粗生成物を得た（２５．７ｇ）。得られた粗生成物をジクロロメタン（２６０ｍＬ）に溶解した後、ジクロロメタン－メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の２量体（化合物１）を得た（１５．９ｇ、収率７２．３％）。 (1)
2-Cyanoethyl 5'-ODDMTr-N6-benzoyl-2'-O-methoxyadenosine 3'-(N, N'-diisopropyl) phosphoramidite (19.0 g, 21.4 mmol) in dichloromethane (110 mL) Was added to a DMF solution (110 mL) of thymidine (7.8 g, 32.1 mmol) and 2-phenylimidazolium trifurate (12.6 g, 42.8 mmol), and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was added dropwise to pure water (1.2 L), the obtained organic phase was washed with a saturated sodium bicarbonate solution (100 mL x 2 times), the organic phase was transferred to 300 mL Meyer, and then dried over Glauber's salt for 30 minutes. The organic phase was concentrated under reduced pressure to give a crude product (25.7 g). The obtained crude product was dissolved in dichloromethane (260 mL) and then purified by silica gel column chromatography using dichloromethane-methanol as an elution solvent to obtain the desired dimer (Compound 1) (15.9 g, yield). Rate 72.3%).

（２）
　２－シアノエチル５’－Ｏ－ｄＤＭＴｒ－Ｎ６－ベンゾイル－２’－Ｏ－メトキシアデノシン３’－（Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト（２０．０ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１１３ｍＬ）をチミジン（８．２ｇ、３３．８ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（６．３０ｇ、９０．１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１１３ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液を純水（１．６Ｌ）に滴下し、得られた有機相を飽和重曹溶液（１００ｍＬｘ２回）で洗浄し、有機相を３００ｍＬマイヤーに移した後、芒硝で３０分乾燥した。有機相を減圧下濃縮し、粗生成物を得た（２５．７ｇ）。得られた粗生成物をジクロロメタン（２６０ｍＬ）に溶解した後、ジクロロメタン－メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の２量体（化合物１）を得た（１２．０ｇ、収率５１．８％）。 (2)
2-Cyanoethyl 5'-ODDMTr-N6-benzoyl-2'-O-methoxyadenosine 3'-(N, N'-diisopropyl) phosphoramidite (20.0 g, 22.5 mmol) in dichloromethane (113 mL) Was added to a DMF solution (113 mL) of thymidine (8.2 g, 33.8 mmol) and 1H-tetrazole (6.30 g, 90.1 mmol), and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was added dropwise to pure water (1.6 L), the obtained organic phase was washed with a saturated sodium bicarbonate solution (100 mL x 2 times), the organic phase was transferred to 300 mL Meyer, and then dried over Glauber's salt for 30 minutes. The organic phase was concentrated under reduced pressure to give a crude product (25.7 g). The obtained crude product was dissolved in dichloromethane (260 mL) and then purified by silica gel column chromatography using dichloromethane-methanol as an elution solvent to obtain the desired dimer (Compound 1) (12.0 g, yield). Rate 51.8%).

例３．２　ＤＭＴｒ－Ａ_{（ＯＣＨ３）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_{（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２）}（化合物２）の合成および精製

Example 3.2 Synthesis and purification of DMTr-A _{(OCH3) p (OCH2CH2CN)} T _{(OCH2CH2CN) (N (i-C3H7) 2) (Compound 2)}

　ｄＡＴ（化合物１）（９．９０ｇ、９．６０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）に溶解し、アミダイト化試薬ＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（４．００ｍＬ、１２．５ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（４７０ｍｇ、６．７０ｍｍｏｌ）を２回に分けて加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液にジクロロメタン（５０ｍＬ）を加えた後、ｎ－ヘキサン－ジクロロメタンを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的のホスホロアミダイト（化合物２）を得た（９．０２ｇ、収率７６．４％）。 Dissolve dAT (Compound 1) (9.90 g, 9.60 mmol) in dichloromethane solution (50 mL) and amidite reagent NCCH ₂ CH ₂ OP [N (i-C ₃ H ₇ ) ₂ ] ₂ (4.00 mL, 12.5 mmol) and 1H-tetrazole (470 mg, 6.70 mmol) were added in two portions and stirred at room temperature for 1 hour. Dichloromethane (50 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was purified by silica gel column chromatography using n-hexane-dichloromethane as an elution solvent to obtain the desired phosphoromidite (Compound 2) (9.02 g, yield 76). .4%).

例３．３　ＤＭＴｒ－Ａ_{（ＯＣＨ３）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_{（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}ｄＣ_（ＯＨ）（化合物３）の合成および精製

Example 3.3 Synthesis and purification of DMTr-A _{(OCH3) p (OCH2CH2CN)} T _(OCH2CH2CN) dC _{(OH) (Compound 3)}

（１）
　ホスホロアミダイト（化合物２）（７．４０ｇ、６．００ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）をＮ４－ベンゾイル－２’－デオキシシチジン（３．２０ｇ、９．００ｍｍｏｌ）と２－フェニルイミダゾリウムトリフラート（３．５０ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３０ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応溶液を純水（５００ｍＬ）に滴下し、得られた有機相を飽和重曹溶液（１００ｍＬｘ２回）で洗浄し、有機相を３００ｍＬマイヤーに移した後、芒硝で３０分乾燥した。有機相を減圧下濃縮し、粗生成物を得た（９．８０ｇ）。得られた粗生成物をジクロロメタン（２６０ｍＬ）に溶解した後、ジクロロメタン－ＩＰＡを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の３量体（化合物３）を得た（５．１０ｇ、収率５７．１％）。 (1)
Dichloromethane solution (30 mL) of phosphoramidite (Compound 2) (7.40 g, 6.00 mmol) with N4-benzoyl-2'-deoxycytidine (3.20 g, 9.00 mmol) and 2-phenylimidazolium trifurate (3) .50 g, 12.0 mmol) of DMF solution (30 mL) was added and stirred at room temperature for 2 hours. The reaction solution was added dropwise to pure water (500 mL), the obtained organic phase was washed with a saturated sodium bicarbonate solution (100 mL x 2 times), the organic phase was transferred to 300 mL Meyer, and then dried over Glauber's salt for 30 minutes. The organic phase was concentrated under reduced pressure to give a crude product (9.80 g). The obtained crude product was dissolved in dichloromethane (260 mL) and then purified by silica gel column chromatography using dichloromethane-IPA as an elution solvent to obtain the desired trimer (Compound 3) (5.10 g, yield). Rate 57.1%).

（２）
　ホスホロアミダイト（化合物２）（１２．７ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５２ｍＬ）をＮ４－ベンゾイル－２’－デオキシシチジン（５．６０ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（２．９ｇ、４１．３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５２ｍＬ）を加え、室温で１．５時間撹拌した。反応溶液を純水（７００ｍＬ）に滴下し、得られた有機相を飽和重曹溶液（１００ｍＬｘ２回）で洗浄し、有機相を３００ｍＬマイヤーに移した後、芒硝で３０分乾燥した。有機相を減圧下濃縮し、粗生成物を得た（１６．７ｇ）。得られた粗生成物をジクロロメタン（２６０ｍＬ）に溶解した後、反応溶液にジクロロメタン（１６０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン－ＩＰＡを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の３量体（化合物３）を得た（６．２０ｇ、収率４０．３％）。 (2)
A dichloromethane solution (52 mL) of phosphoramidite (Compound 2) (12.7 g, 10.3 mmol) was mixed with N4-benzoyl-2'-deoxycytidine (5.60 g, 15.5 mmol) and 1H-tetrazole (2.9 g, 41.3 mmol) of DMF solution (52 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours. The reaction solution was added dropwise to pure water (700 mL), the obtained organic phase was washed with a saturated sodium bicarbonate solution (100 mL x 2 times), the organic phase was transferred to 300 mL Meyer, and then dried over Glauber's salt for 30 minutes. The organic phase was concentrated under reduced pressure to give a crude product (16.7 g). The obtained crude product is dissolved in dichloromethane (260 mL), dichloromethane (160 mL) is added to the reaction solution, and the product is purified by silica gel column chromatography using dichloromethane-IPA as an elution solvent to obtain the desired trimer (Compound 3). ) Was obtained (6.20 g, yield 40.3%).

例３．４　ＤＭＴｒ－ｄＧ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｃ_（ＯＨ）（化合物４）の合成および精製

Example 3.4 Synthesis and purification of DMTr-dG _{p (OCH2CH2CN)} C _{(OH) (Compound 4)}

　２－シアノエチル５’－Ｏ－ＤＭＴｒ－Ｎ２－イソブチリル－２’－デオキシグアノシン３’－（Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル）ホスホロアミダイト（２０．０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１２０ｍＬ）をＮ４－ベンゾイル－２’－デオキシシチジン（１１．８ｇ、３５．７ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（６．６０ｇ、９５．３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１２０ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。反応溶液を純水（１．５Ｌ）に滴下し、得られた有機相を飽和重曹溶液（１００ｍＬｘ２回）で洗浄し、有機相を３００ｍＬマイヤーに移した後、芒硝で３０分乾燥した。有機相を減圧下濃縮し、粗生成物を得た（２９．３ｇ）。得られた粗生成物をジクロロメタン（２９０ｍＬ）に溶解した後、ジクロロメタン－メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の２量体（化合物４）を得た（１３．６ｇ、収率５３．５％）。 2-Cyanoethyl 5'-O-DMTr-N2-isobutyryl-2'-deoxyguanosine 3'-(N, N'-diisopropyl) phosphoramidite (20.0 g, 23.8 mmol) in dichloromethane (120 mL) N4 A DMF solution (120 mL) of -benzoyl-2'-deoxycytidine (11.8 g, 35.7 mmol) and 1H-tetrazole (6.60 g, 95.3 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The reaction solution was added dropwise to pure water (1.5 L), the obtained organic phase was washed with a saturated sodium bicarbonate solution (100 mL x 2 times), the organic phase was transferred to 300 mL Meyer, and then dried over Glauber's salt for 30 minutes. The organic phase was concentrated under reduced pressure to give a crude product (29.3 g). The obtained crude product was dissolved in dichloromethane (290 mL) and then purified by silica gel column chromatography using dichloromethane-methanol as an elution solvent to obtain the desired dimer (Compound 4) (13.6 g, yield). Rate 53.5%).

例３．５　ＤＭＴｒ－ｄＧ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｃ_{（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（Ｎ（ｉ－Ｃ３Ｈ７）２）}（化合物５）の合成および精製

Example 3.5 Synthesis and purification of _{DMTr-dGP (OCH2CH2CN)} C _{(OCH2CH2CN) (N (i-C3H7) 2) (Compound 5)}

　ｄＧＣ（化合物４）（１３．８ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（６５ｍＬ）に溶解し、アミダイト化試薬ＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＯＰ［Ｎ（ｉ－Ｃ_３Ｈ_７）_２］_２（６．１０ｍＬ、１９．３ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（６３３ｍｇ、９．００ｍｍｏｌ）を２回に分けて加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液にジクロロメタン（６５ｍＬ）を加えた後、ｎ－ヘキサン－ジクロロメタンを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的のｄＧＣホスホロアミダイト（化合物５）を得た（１４．４ｇ、収率８７．８％）。 Dissolve dGC (Compound 4) (13.8 g, 12.9 mmol) in dichloromethane solution (65 mL) and amidite reagent NCCH ₂ CH ₂ OP [N (i-C ₃ H ₇ ) ₂ ] ₂ (6.10 mL, 19.3 mmol) and 1H-tetrazole (633 mg, 9.00 mmol) were added in two portions, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Dichloromethane (65 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was purified by silica gel column chromatography using n-hexane-dichloromethane as an elution solvent to obtain the desired dGC phosphoramidite (Compound 5) (14.4 g, yield). 87.8%).

例３．６　ＤＭＴｒ－ｄＧ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｃ_{（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｃ_（ＯＨ）（化合物６）の合成および精製

Example 3.6 Synthesis and purification of DMTr-dG _{p (OCH2CH2CN)} C _(OCH2CH2CN) C _{(OH) (Compound 6)}

（１）
　ｄＧＣホスホロアミダイト（化合物５）（２．８０ｇ、２．２０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１１ｍＬ）をＮ４－ベンゾイル－２’－デオキシシチジン（１．１０ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）と２－フェニルイミダゾリウムトリフラート（０．９８０ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１１ｍＬ）を加え、室温で１４時間撹拌した。反応溶液にジクロロメタン（２０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン－メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の３量体（化合物６）を得た（１．４７ｇ、収率４４．５％）。 (1)
Dichloromethane solution (11 mL) of dGC phosphoramidite (Compound 5) (2.80 g, 2.20 mmol) was mixed with N4-benzoyl-2'-deoxycytidine (1.10 g, 3.30 mmol) and 2-phenylimidazolium trifurate (2.phenylimidazolium trifurate). 0.980 g (3.30 mmol) of DMF solution (11 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 14 hours. Dichloromethane (20 mL) was added to the reaction solution, and purification was performed by silica gel column chromatography using dichloromethane-methanol as an elution solvent to obtain the desired trimer (Compound 6) (1.47 g, yield 44.5%). ..

（２）
　ｄＧＣホスホロアミダイト（化合物５）（２．７０ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）をＮ４－ベンゾイル－２’－デオキシシチジン（１．００ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（０．５９０ｇ、８．３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応溶液にジクロロメタン（２０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン－メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的の３量体（化合物６）を得た（０．６２ｇ、収率１９．７％）。 (2)
Dichloromethane solution (10 mL) of dGC phosphoramidite (Compound 5) (2.70 g, 2.10 mmol) was mixed with N4-benzoyl-2'-deoxycytidine (1.00 g, 3.10 mmol) and 1H-tetrazole (0.590 g). , 8.30 mmol) of DMF solution (10 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 16 hours. Dichloromethane (20 mL) was added to the reaction solution, and purification was performed by silica gel column chromatography using dichloromethane-methanol as an elution solvent to obtain the desired trimer (Compound 6) (0.62 g, yield 19.7%). ..

例３．７　収率の比較
　活性化剤として２－フェニルイミダゾリウムトリフラートおよび１Ｈ－テトラゾールを用いた場合における、ＤＭＴｒ－Ａ_{（ＯＣＨ３）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_（ＯＨ）（化合物１）、ＤＭＴｒ－Ａ_{（ＯＣＨ３）ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｔ_{（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}ｄＣ_（ＯＨ）（化合物３）およびＤＭＴｒ－ｄＧ_{ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｃ_{（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）}Ｃ_（ＯＨ）（化合物６）の収率を表２に示す。

 
 　例２．４の評価にて効果の認められた活性化剤のうち、２－フェニルイミダゾリウムトリフラートを用いて合成を行ったところ、１Ｈ－テトラゾールを用いた場合と比較して、非常に高い収率で目的の化合物が得られた。 _{Example 3.7 Comparison of Yield DMTr-A (OCH3) p (OCH2CH2CN)} T _(OH) (Compound 1), DMTr-A when 2-phenylimidazolium triflate and 1H-tetrazole are used as activators. Table 2 shows the yields of _{(OCH3) p (OCH2CH2CN)} T _(OCH2CH2CN) dC _(OH) (Compound 3) and DMTr-dG _{p (OCH2CH2CN)} C _(OCH2CH2CN) C _{(OH) (Compound 6).}

Among the activators whose effects were confirmed in the evaluation of Example 2.4, when synthesis was performed using 2-phenylimidazolium triflate, the yield was very high as compared with the case of using 1H-tetrazole. The desired compound was obtained at a rate.

Claims (14)

1. 　オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
   ５’位の水酸基に保護基が結合したヌクレオシドホスホロアミダイトと、３’位および５’位の水酸基が無保護であるヌクレオシドとを、式（Ｉ）：
   

   

   
   式中、
   Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２、メトキシ、シクロブタジエン、アダマンタン、直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和のＣ_１～２２アルキル基、および任意に置換されていてもよい芳香族環からなる群から選択される、またはＲ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成している、
   で表される活性化剤の存在下で反応させる工程を含む、前記方法。 A method of producing oligonucleotides
   A nucleoside phosphoramidite in which a protecting group is bonded to a hydroxyl group at the 5'position and a nucleoside in which the hydroxyl groups at the 3'and 5'positions are unprotected are expressed in the formula (I) :.
   

   

   
   During the ceremony
   R ¹ , R ² and R ³ are independently H, F, Cl, Br, CN, NO ₂ , methoxy, cyclobutadiene, adamantan, linear or branched saturated or unsaturated C _1-22. Selected from the group consisting of alkyl groups and optionally substituted aromatic rings, or R ² and R ³ together, phenyl with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached. Forming a ring,
   The method comprising reacting in the presence of an activator represented by.
2. 　Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２、メトキシ、メチル、ｉ－プロピル、ｔ－ブチル、シクロブタジエン、アダマンタン、ならびに任意に置換されていてもよいフェニル、ナフチル、およびアントラセニルからなる群から選択される、またはＲ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成している、請求項１に記載の方法。 R ¹ , R ² and R ³ are independently substituted with H, F, Cl, Br, CN, NO ₂ , methoxy, methyl, i-propyl, t-butyl, cyclobutadiene, adamantane, and optionally. Selected from the group consisting of phenyl, naphthyl, and anthracenyl, which may be, or R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached. The method according to claim 1.
3. 　Ｒ^１が、式（ＩＩ）：
   

   

   式中、
   Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、メチル、ｔ－ブチル、メトキシ、ｉ－プロピルおよびアダマンタンからなる群から選択される、
   である、請求項１または２に記載の方法。 R ¹ is the formula (II):
   

   

   During the ceremony
   R ⁴ and R ⁵ are independently selected from the group consisting of H, F, Cl, Br, CN, methyl, t-butyl, methoxy, i-propyl and adamantane, respectively.
   The method according to claim 1 or 2.
4. （ａ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
   （ｂ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
   （ｃ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
   （ｄ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
   （ｅ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
   （ｆ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
   （ｇ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
   （ｈ）Ｒ^１が、１－ナフチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
   （ｉ）Ｒ^１が、９－アントラセニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
   （ｊ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
   （ｋ）Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
   （ｌ）Ｒ^１が、２，６－ジクロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
   （ｍ）Ｒ^１が、ペンタフルオロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
   （ｎ）Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３がフェニルである、
   （ｏ）Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｂｒである、
   （ｐ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２がＮＯ_２であり、Ｒ^３が、Ｈである、
   （ｑ）Ｒ^１が、１－アダマンチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、および
   （ｒ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
   からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。 (A) R ¹ is phenyl and R ² and R ³ are H.
   (B) R ¹ is t-butyl and R ² and R ³ are H.
   (C) R ¹ is phenyl, and R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached.
   (D) R ¹ is t-butyl, and R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached.
   (E) R ¹ is phenyl and R ² and R ³ are CN.
   (F) R ¹ is t-butyl and R ² and R ³ are CN.
   (G) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are CN.
   (H) R ¹ is 1-naphthyl and R ² and R ³ are H.
   (I) R ¹ is 9-anthrasenyl and R ² and R ³ are H.
   (J) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are H.
   (K) R ¹ is 2-chlorophenyl and R ² and R ³ are H.
   (L) R ¹ is 2,6-dichlorophenyl and R ² and R ³ are H.
   (M) R ¹ is pentafluorophenyl and R ² and R ³ are H.
   (N) R ¹ is 2-chlorophenyl and R ² and R ³ are phenyl.
   (O) R ¹ , R ² and R ³ are Br.
   (P) R ¹ is Br, R ² is NO ₂ , and R ³ is H.
   (Q) R ¹ is 1-adamantyl, R ² and R ³ are H, and (r) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are together and they are Forming a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to be bonded,
   The method according to claim 1 or 2, which is selected from the group consisting of.
5. 　前記活性化剤は、酸と塩を形成している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法 The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the activator forms a salt with an acid.
6. 　酸が、トリフルオロメタンスルホン酸である、請求項５に記載の方法。 The method according to claim 5, wherein the acid is trifluoromethanesulfonic acid.
7. 　オリゴヌクレオチドが、式（ＩＩＩ）：
   

   

   で表される構造を有し、
   ５’位の水酸基に保護基が結合したヌクレオシドホスホロアミダイトが、式（ＩＶ）：
   

   

   で表される構造を有し、
   ３’位および５’位の水酸基が無保護であるヌクレオシドが、式（Ｖ）：
   

   

   で表される構造を有する、
   式中、
   Ｂは、各々独立して、保護基で保護された、または無保護のヌクレオシド塩基であり；
   Ｒ_６は、保護基であり；
   Ｒ_７およびＲ_８は、各々独立して、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＳＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、またはＯＣＨ_３のいずれか一つであり；
   Ｒ_９は、各々独立して、置換または未置換の脂肪族基、置換または未置換の芳香族基であり；
   Ｘは、各々独立して、共有電子対、ＯまたはＳのいずれか一つであり；
   Ｙは、各々独立して、Ｈ、ＮＨＲ_１０、ハロゲン、ＣＮ、ＣＦ_３、またはアシル系保護基、エーテル系保護基もしくはシリル系保護基で保護された水酸基のいずれか一つであり；
   Ｒ_１０は、各々独立して、－Ｈ、置換されたもしくは未置換の脂肪族基、置換されたもしくは未置換の芳香族基、置換されたもしくは未置換のアラルキル基、または保護基のいずれか一つであり；
   Ｚは、各々独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ－アルキル、Ｎ－アルキル、ハロゲン、または前記Ｙとの間でＺ－Ｙ結合を形成し；および
   ｎは、０以上２３以下の整数である；
   請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。 The oligonucleotide is of formula (III):
   

   

   Has a structure represented by
   The nucleoside phosphoramidite in which a protecting group is bonded to the hydroxyl group at the 5'position has the formula (IV):
   

   

   Has a structure represented by
   The nucleosides in which the hydroxyl groups at the 3'and 5'positions are unprotected have the formula (V) :.
   

   

   Has a structure represented by
   During the ceremony
   B is each independently protected or unprotected nucleoside base;
   R ₆ is a protecting group;
   R ₇ and R ₈ are independently one of OCH ₂ CH ₂ CN, SCH ₂ CH ₂ CN, OCH ₂ CH = CH ₂ , or OCH ₃ ;
   R ₉ is an independently substituted or unsubstituted aliphatic group, substituted or unsubstituted aromatic group;
   Each X is independently one of a shared electron pair, O or S;
   Y is each independently one of H, NHR ₁₀ , halogen, CN, CF ₃ , or hydroxyl group protected by an acyl protecting group, an ether protecting group or a silyl protecting group;
   Each of R ₁₀ is independently any of -H, a substituted or unsubstituted aliphatic group, a substituted or unsubstituted aromatic group, a substituted or unsubstituted aralkyl group, or a protecting group. One;
   Z independently forms a ZZ bond with H, alkyl, O-alkyl, N-alkyl, halogen, or said Y; and n is an integer greater than or equal to 0 and less than or equal to 23;
   The method according to any one of claims 1 to 6.
8. 　ヌクレオシドホスホロアミダイトを製造する方法であって、
   ヌクレオシドホスホロアミダイトが、式（ＶＩ）：
   

   

   で表される構造を有し、
   請求項７に記載の方法によりオリゴヌクレオチドを製造する工程を含む、
   前記方法。 A method for producing nucleoside phosphoramidite,
   Nucleoside phosphoramidite has the formula (VI):
   

   

   Has a structure represented by
   7. The step of producing an oligonucleotide by the method according to claim 7.
   The method.
9. 　オリゴヌクレオチドを製造するための、式（Ｉ）：
   

   

   式中、
   Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２、メトキシ、シクロブタジエン、アダマンタン、－ＸＲ^Ａ、ヘテロ原子を含む基で任意に置換されていてもよい直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和のＣ_１～２２アルキル基、および任意に置換されていてもよい芳香族環からなる群から選択され、ここで、Ｘはヘテロ原子であり、Ｒ^Ａは直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和のＣ_１～２２アルキル基である、またはＲ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成している、
   で表される、活性化剤。 Formula (I) for producing oligonucleotides:
   

   

   During the ceremony
   R ^{1, R 2} and ^{R 3} are each independently, H, F, Cl, Br , CN, NO 2, methoxy, cyclobutadiene, adamantane, -XR ^A, optionally substituted with a group containing a hetero atom _{Selected from the group consisting of saturated or unsaturated C 1-22} alkyl groups, which may be linear or branched, and aromatic rings, which may be optionally substituted, where X is a heteroatom. ^RA is a linear or branched saturated or unsaturated C _1-22 alkyl group, or R ² and R ³ are phenyl together with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached. Forming a ring,
   An activator represented by.
10. 　Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２、メトキシ、メチル、ｉ－プロピル、ｔ－ブチル、シクロブタジエン、アダマンタン、ならびに任意に置換されていてもよいフェニル、ナフチル、およびアントラセニルからなる群から選択される、またはＲ^２およびＲ^３は、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成している、請求項９に記載の活性化剤。 R ¹ , R ² and R ³ are independently substituted with H, F, Cl, Br, CN, NO ₂ , methoxy, methyl, i-propyl, t-butyl, cyclobutadiene, adamantane, and optionally. Selected from the group consisting of phenyl, naphthyl, and anthracenyl, which may be, or R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached. The activator according to claim 9.
11. 　Ｒ^１が、式（ＩＩ）：
    

    

    式中、
    Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、メチル、ｔ－ブチル、メトキシ、ｉ－プロピルおよびアダマンタンからなる群から選択される、
    である、請求項９または１０に記載の活性化剤。 R ¹ is the formula (II):
    

    

    During the ceremony
    R ⁴ and R ⁵ are independently selected from the group consisting of H, F, Cl, Br, CN, methyl, t-butyl, methoxy, i-propyl and adamantane, respectively.
    The activator according to claim 9 or 10.
12. （ａ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
    （ｂ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
    （ｃ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
    （ｄ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
    （ｅ）Ｒ^１が、フェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
    （ｆ）Ｒ^１が、ｔ－ブチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
    （ｇ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、ＣＮである、
    （ｈ）Ｒ^１が、１－ナフチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
    （ｉ）Ｒ^１が、９－アントラセニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
    （ｊ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
    （ｋ）Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
    （ｌ）Ｒ^１が、２，６－ジクロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
    （ｍ）Ｒ^１が、ペンタフルオロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、
    （ｎ）Ｒ^１が、２－クロロフェニルであり、Ｒ^２およびＲ^３がフェニルである、
    （ｏ）Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｂｒである、
    （ｐ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２がＮＯ_２であり、Ｒ^３が、Ｈである、
    （ｑ）Ｒ^１が、１－アダマンチルであり、Ｒ^２およびＲ^３が、Ｈである、および
    （ｒ）Ｒ^１が、Ｂｒであり、Ｒ^２およびＲ^３が、一緒になって、それらが結合するイミダゾール環上の２つの炭素原子とともにフェニル環を形成する、
    からなる群から選択される請求項９または１０に記載の活性化剤。 (A) R ¹ is phenyl and R ² and R ³ are H.
    (B) R ¹ is t-butyl and R ² and R ³ are H.
    (C) R ¹ is phenyl, and R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached.
    (D) R ¹ is t-butyl, and R ² and R ³ together form a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to which they are attached.
    (E) R ¹ is phenyl and R ² and R ³ are CN.
    (F) R ¹ is t-butyl and R ² and R ³ are CN.
    (G) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are CN.
    (H) R ¹ is 1-naphthyl and R ² and R ³ are H.
    (I) R ¹ is 9-anthrasenyl and R ² and R ³ are H.
    (J) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are H.
    (K) R ¹ is 2-chlorophenyl and R ² and R ³ are H.
    (L) R ¹ is 2,6-dichlorophenyl and R ² and R ³ are H.
    (M) R ¹ is pentafluorophenyl and R ² and R ³ are H.
    (N) R ¹ is 2-chlorophenyl and R ² and R ³ are phenyl.
    (O) R ¹ , R ² and R ³ are Br.
    (P) R ¹ is Br, R ² is NO ₂ , and R ³ is H.
    (Q) R ¹ is 1-adamantyl, R ² and R ³ are H, and (r) R ¹ is Br, and R ² and R ³ are together and they are Forming a phenyl ring with two carbon atoms on the imidazole ring to be bonded,
    The activator according to claim 9 or 10, which is selected from the group consisting of.
13. 　酸と塩を形成している、請求項９～１２のいずれか一項に記載の活性化剤 The activator according to any one of claims 9 to 12, which forms a salt with an acid.
14. 　酸が、トリフルオロメタンスルホン酸である、請求項１３に記載の活性化剤。 The activator according to claim 13, wherein the acid is trifluoromethanesulfonic acid.