WO2021064191A1 - Methode de détection, localisation et quantification de protéines mdr - Google Patents

Methode de détection, localisation et quantification de protéines mdr Download PDF

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WO2021064191A1
WO2021064191A1 PCT/EP2020/077694 EP2020077694W WO2021064191A1 WO 2021064191 A1 WO2021064191 A1 WO 2021064191A1 EP 2020077694 W EP2020077694 W EP 2020077694W WO 2021064191 A1 WO2021064191 A1 WO 2021064191A1
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alkenyl
aryl
heteroaryl
heterocycle
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PCT/EP2020/077694
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Mahchid HASSEL BAMDAD
Pierre DAUMAR
Clémence DUBOIS
Jean Gauthier
Antoine GOISNARD
Emmanuelle Mounetou
Frédérique PENAULT-LLORCA
Bernard VIDALINC
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/021—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)n-C(=0)-, n being 5 or 6; for n > 6, classification in C07K5/06 - C07K5/10, according to the moiety having normal peptide bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to an in vitro method for the detection, localization and / or quantification of MDR proteins of multiresistance (“MultiDrug Resistance”, MDR) expressed by cells present in a sample.
  • MDR multiresistance
  • the invention also relates to detectable MDR tracers which can be used in this method.
  • MDR Multidrug Resistance
  • ABSC ATP binding cassette
  • the main MDR proteins include the subfamilies of ABCB (ABCB1 / MDR1 / P-glycoprotein), ABCC (ABCC1 / MRP1, ABCC2 / MRP2, ABCC10 / MRP7 and also ABCC3-6, and ABCC11), and ABCG (ABCG2 / MXR / BCRP) [1].
  • ABCB1 ABCB1
  • MDR1 MDR1 gene
  • abcb1 / mdr1 / P-glycoprotein (P-gp), which represents the reference protein, has rather been demonstrated in bacteria and parasites [2- 4], in protozoa [5-7], in aquatic invertebrates [8], in Drosophila [9,10] and in plants (arabidobsis and maize) [11, 12]
  • P-gp P-glycoprotein
  • MDR proteins are efflux pumps with a detoxifying role. They recognize a very wide variety of substrates ranging from organic molecules with very varied physicochemical properties (hydrophobic, amphipathic, etc.) up to heavy metals. Due to this property, MDR proteins play a defense role against xenobiotics at the cell level.
  • MDR proteins are naturally expressed on the membrane systems of almost all living organisms. This is the natural basal expression. In the presence of xenobiotics, the level of expression of these proteins may increase in a dose dependent manner. This basal or induced level of expression is currently quantifiable in vitro using antibodies specific for each protein by immuno-cytology or immunohistology approaches [5-10,13-15,18 ] The expression differential between the basal level and after induction (exposure to a xenobiotic) can be exploited as a biomarker of cellular defense. Indeed, by way of example, MDR proteins, in particular P-gp, represent a “biomarker of choice” for the detection of air and water pollution [5-10,13-15, 18]
  • MDR proteins are also overexpressed in all tumor cells [19,20] They are responsible for the concept of “Multidrug Resistance (MDR)” or the cross-resistance of cancer cells to anticancer agents. Indeed, some tumors show an inherent resistance profile linked to an elevated basal expression level of P-gp and / or other MDRs. In other tumors, the level of expression of P-gp and / or other MDRs increases during treatment (resistance to treatment). In both cases, the massive efflux of chemotherapeutics renders the treatment ineffective [1] The activity of xenobiotic efflux by these MDR pumps can be bypassed by the use of other target substrates and more specific of these pumps called " competitive inhibitors ”.
  • the efflux / transport activity of MDR pumps can be analyzed / demonstrated at the cellular level, preferably by the flow cytometry technique or by fluorescence imaging (Strouse JJ et al. (2013), Analytical Biochemistry, 437 (1), 77-87).
  • MDR proteins Due to the strong involvement of MDR proteins in chemoresistance mechanisms, their detection and quantification in tumor cells before and during treatment are very relevant. They make it possible to estimate the efficacy of the treatment, in preclinical stages during the screening of anti-cancer drugs by in vitro modeling and in the clinic on patient biopsies. Testing for the level of MDR protein expression has not yet been used on biopsies during treatment. The described invention will be an innovative tool applicable to this research, thus allowing the optimization of treatments.
  • the invention is based on the development of detectable and quantifiable tracers (for example fluorescent, radioactive) specifically targeting MDR proteins, in activity or not, applicable more particularly in vitro on prokaryotic and eukaryotic organisms of animal and plant type, unicellular and multicellular such as (i) fungi, (ii) parasites, (iii) animal and plant cell culture models: unicellular, two-dimensional and three-dimensional, (iv) organoids, (v) biopsies or even (vi) tissue fragments.
  • MDR proteins are very ubiquitous and expressed in the membrane systems of cells and intracellular organelles of all organisms [21]
  • the tracers developed have the capacity to penetrate / diffuse into cells and cell clusters of all these models.
  • the invention includes the use of these tracers capable of entering a cell or diffusing into cell masses and entering cells, for labeling membranes and / or localizing and quantifying the expression of MDR proteins ( P-gp protein for example).
  • P-gp protein for example
  • the fixed state corresponds to the fixation of biological samples which consists in freezing the cellular structures in a state allowing subsequent exploitation by exposing them to a chemical agent such as paraformaldehyde. This binding necessarily results in the cessation of all metabolic activity.
  • the compounds of the invention can be produced by organic synthesis and as such represent an interesting alternative to the use of the antibodies (i) from an economic point of view (comparison of the cost) and (ii) of an ethical point of view, considering the methods of antibody production. All these characteristics constitute a strong added value of the invention compared to the existing methods for localizing and quantifying MDR proteins, in particular using antibodies. They are summarized in Table 1 below.
  • the compounds of the invention allow the direct measurement of the expression of MDR proteins, unlike the existing methods intended for the measuring efflux activity of MDR proteins (eg, MDR Assay Kit, Abcam®). Indeed, although also based on the use of small molecules, these methods do not allow the direct measurement of the expression of MDR proteins. In addition, they are only suitable for use on cells in suspension or in a monolayer.
  • oligopeptides derived from reversins as inhibitors of P-gp used as medicaments in particular in the treatment of cancers. These oligopeptides do not carry groups that are specifically detectable, in particular by fluorescence or chemiluminescence, in particular in a complex medium.
  • the first subject of the invention is a method for the detection, localization and / or quantification in vitro of MDR proteins associated with cells.
  • This method is intended for the detection, localization and / or quantification of MDR proteins in a sample containing cells, in particular in suspension, in cell clusters or in the form of cell extract, of the prokaryotic or eukaryotic type, in the living or fixed state.
  • MDR proteins targeted mention may be made of P-gp, MRP1, MRP2, MRP7, ABCC3-6, ABCC11 and BCRP.
  • the MDR protein is P-gp.
  • the method includes in particular:
  • cells whole cells and elements of cellular origin, such as organelles, cell membrane (plasma membrane), endoplasmic membranes for eukaryotes; membrane, wall, capsule for prokaryotes.
  • cells in suspension is meant that the sample contains isolated cells maintained in a liquid medium.
  • cell cluster is meant that the sample is a set of cohesive and aggregated cells, which can form tissue.
  • cell extract is meant a cell sample containing elements of cellular origin, for example organelles, and maintained in a living or fixed state.
  • the method can be used independently for the detection, for the localization, for the quantification of MDR proteins expressed in cells. It can also be used by fulfilling two of these functions (detection and localization; detection and quantification, localization and quantification), or all three.
  • the method according to the invention does not allow measurement of the activity of MDR proteins but can be combined with a method capable of measuring said activity.
  • the sample can comprise, without limitation, cell extracts, cell cultures, for example cells in suspension, cells adherent to a culture support, a monolayer cell culture or multilayers, a 3D cell culture, a spheroid or a biological tissue or tissue fragment or a unicellular or multicellular organism.
  • the sample may in particular comprise cancer cells from a patient, a biopsy from a cancer from a patient, cells of a cancerous lineage, an artificial tumor.
  • the MDR tracer is added to the sample.
  • This sample is preferably in a liquid medium or comprises a liquid phase.
  • the method of the invention comprises in particular a step of bringing together the sample and the MDR tracer.
  • the sample is maintained, cultivated or stored in a liquid medium suitable for maintaining its conservation.
  • the sample is placed in a liquid medium compatible with good preservation of cells, tissues, etc., or is already in a suitable liquid medium.
  • the cells present or constituting are preferably placed or present in a storage or culture medium.
  • the MDR tracer is able to penetrate inside cells and diffuse within the cell sample and bind to the accessible part of MDR proteins.
  • the MDR tracer is further detectable or made detectable. This detection / localization / quantification can for example be based on fluorescence emission or radioactive radiation.
  • the term “detectable” is understood to mean a tracer which can be used in a specific and sensitive manner for detecting, localizing and / or quantifying the MDR proteins in a complex biological medium.
  • the invention can in particular use an MDR tracer of MDR ligand type labeled with a detectable chemical group according to formula (I) which will be explained below.
  • a ligand of formula (I) is used to detect P-gp.
  • MDR tracers are added to the sample in an amount sufficient to achieve the desired action, detection, localization and / or quantification. In particular, a known quantity of this tracer is added. Their quantity or concentration will be determined by the experimenter.
  • the detection, localization and / or quantification can advantageously be carried out using approximately 1 nM to 100 mM, in particular from 100 nM to 10 mM of tracer, for approximately 1 cell to approximately 10 9. cells.
  • the sample is incubated with MDR tracers which bind to MDR proteins present in the cells. Incubation is carried out for a certain period of time and at a temperature making it possible to maintain the cells in a good state of preservation.
  • Incubation of the sample with the MDR tracer is of sufficient duration to allow its attachment to cell extracts, its penetration into the cells, its diffusion within the cell clusters and its penetration into the cells of these clusters. This time can be measured by those skilled in the art, allowing them to optimize the incubation time depending on the type of sample. Generally, the incubation time can be between about 1 minute and about 24 hours.
  • This incubation can be carried out at a temperature making it possible to maintain cells, tissues, etc. in good state of conservation to enable the method to be carried out.
  • This temperature will advantageously be from about 0 ° C to about 39 ° C for cells of human or animal origin.
  • the tracer not bound to MDR proteins is removed.
  • This removal may include aspiration of the liquid medium, and recovery of cells (cell pellet or adherent cells) or cell cluster (tissue, biopsy, etc.).
  • This elimination can comprise centrifugation, precipitation or filtration, in particular for a suspension of cells, or filtration or flow of the liquid medium leaving the mass of cells or the adherent cells.
  • This method may include washing or rinsing the cells with a liquid medium suitable for the preservation of cells, tissues, etc.
  • the washing results in an efflux of the tracer which has entered the interior of the cells but which has not bound to an MDR protein.
  • washing is meant in particular the fact of placing the cells in a liquid compatible with the preservation of the sample, called washing, optionally the washing medium is replaced one or more times during this period. A sufficient number of washes are carried out. Those skilled in the art are able to determine the best conditions for sufficiently removing the unbound free MDR tracer.
  • the detection, localization and quantification of the MDR tracer attached to MDR proteins can then be carried out. It is also possible to combine these actions, in particular detection and quantification or localization and quantification or detection and localization.
  • MDR The presence of MDR proteins is detected in the sample.
  • MDR proteins The presence of MDR proteins is localized in the sample and within the cells, that is to say that one determines (i) the location of the cells expressing the MDR proteins detected in the sample, in particular in 3D culture, tissue, biopsy, multicellular organism, and optionally (ii) location of MDR proteins at the cellular level.
  • MDR proteins Different expression levels of MDR proteins (i) are determined in the sample, in particular in a 3D culture, a tissue, a biopsy or a multicellular organism and possibly (ii) within each cell.
  • the method comprises the treatment of as many samples of cells or tissues (biopsies) from the same patient over time (for example, during a drug treatment, for example anticancer), by the method according to the invention.
  • the method used for clinical follow-up in a patient comprises the comparison between samples taken at different dates.
  • the appearance of expression of MDR proteins or the increase, stagnation or regression of expression of these MDR proteins can be detected over the observation period.
  • the detection, localization and / or quantification can for example use a fluorescence or radioactivity measurement method.
  • the quantification or the level of expression of an MDR protein, for example P-gp is obtained in particular by the intensity of the signal measured, such as the intensity of fluorescence or radioactivity. It is then possible to compare samples with each other or with reference values.
  • a subject of the present invention is also MDR tracers which will be described below. These MDR tracers can be used in the method which has just been described, alone or in combination.
  • a subject of the present invention is also a composition containing at least one MDR tracer according to the invention, and a liquid medium, for example a solvent such as an organic solvent, in particular dimethylsulfoxide, ethanol, a saline solution, such as for example a phosphate buffer at physiological pH.
  • L represents a ligand capable of binding to MDR proteins, L is in particular a group of formula (II): in which
  • X represents a -CH2- or C (O) group
  • R 1 represents H or a group selected from -OH, O-alkyl, O-alkenyl, O-aryl, O-heteroaryl, O-cycloalkyl, O-heterocycle, -alkyl-aryl, -alkyl-heteroaryl, -alkyl-heterocycle , -alkyl-cycloalkyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteroaryl, alkenyl-cycloalkyl, alkenyl-heterocycle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-heteroaryl, NH-alkyl-heterocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alkenyl- aryl, NH-alkenyl-heteroaryl, NH-alkenyl-heteroaryl, NH-alkenyl-heterocycle, NH-alkenyl-cycloalkyl
  • R 2 represents H or a group selected from -OH, -NH2, O-Alkyl, O-alkenyl, O-heteroaryl, O-cycloalkyl, O-heterocycle, O-Aryl, O-Alkyl-Aryl, O-alkyl-heteroaryl , O-alkyl-heterocycle, O- alkyl-cycloalkyl, O-alkenyl-aryl, O-alkenyl-heteroaryl, O-alkenyl-heterocycle, O- alkenyl-cycloalkyl, -Alkyl-Aryl, -alkyl-heteroaryl, -alkyl- heterocycle, -alkyl-cycloalkyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteroaryl, alkenyl-cycloalkyl, alkenyl-heterocycle, NH-Alkyl, NH-alkenyl,
  • R 3 represents H or a group selected from alkyl, alkenyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycle, alkyl-aryl, -alkyl-heteroaryl, -alkyl-heterocycle, -alkyl-cycloalkyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteroaryl, alkenyl- cycloalkyl, alkenyl-heterocycle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-heteroaryl, NH-alkyl-heterocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alkenyl-aryl, NH-alkenyl-heteroaryl, NH-alkenyl-heterocycle, NH- alkenyl-cycloalkyl, C (0) alkyl, C (0) aryl, C (0) alkenyl, C (0) heteroaryl, C (O) hetero
  • R 4 represents H or a group selected from -SH, -OH, O-alkyl, O-aryl, O-alkenyl, O- heteroaryl, O-cycloalkyl, O-heterocycle, -O-alkyl-aryl, O-alkyl- heteroaryl, O-alkyl-heterocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alkenyl-aryl, O-alkenyl-heteroaryl, O-alkenyl-heterocycle, O-alkenyl-cycloalkyl, -alkyl-aryl, -alkyl-heteroaryl, -alkyl -heterocycle, -alkyl- cycloalkyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteraryl, alkenyl-cycloalkyl, alkenyl-heterocycle, -O- cycloalkyl, O-alkyl, O-al
  • R 5 represents H or an alkyl or aryl group; with the proviso that at least one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 or R 5 represents a bond with the group [ABC] when m represents 1 or with D when m represents 0;
  • R 9 and R 10 identical or different, represent an alkyl, alkenyl, heterocycle, heteroaryl, cycloalkyl, alkyl-aryl, alyl-heteroaryl, alkyl-heterocycle, alkyl-cycloalkyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteroaryl, alkenyl-heterocycle group , alkenyl-cycloalkyl or a group of formula (III) in which
  • R 6 represents H or a group selected from -OH, -NH 2 , O-Alkyl, O-Aryl, O-alkenyl, O- heteroaryl, O-cycloalkyl, O-heterocycle, O-alkyl-aryl, O-alkyl- heteroaryl, O-alkyl-heterocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alkenyl-aryl, O-alkenyl-heteroaryl, O-alkenyl-heterocycle, O-alkenyl-cycloalkyl, NH-Alkyl, NH-Aryl, NH-alkenyl, NH-heteroaryl, NH- heterocycle, NH-cycloalkyl, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-heteroaryl, NH-alkyl-heterocycle, NH- alkyl-cycloalkyl, NH-alkenyl-aryl
  • R 7 represents H or a group selected from -OH, O-alkyl, O-aryl, O-alkenyl, O-heteroaryl, O-cycloalkyl, O-heterocycle, O-alkyl-aryl, O-alkyl-heteroaryl, O- alkyl-heterocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alkenyl-aryl, O-alkenyl-heteroaryl, O-alkenyl-heterocycle, O-alkenyl-cycloalkyl, NH2, NH-Alkyl, NH-Aryl, NH-alkenyl, NH- heteroaryl, NH-heterocycle, NH-cycloalkyl, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-heteroaryl, NH-alkyl-heterocycle, NH-alkyl-cycloalkyl,
  • NH-alkenyl-aryl NH-alkenyl-heteroaryl, NH-alkenyl-heterocycle, NH-alkenyl-cycloalkyl, NR 9 R 10 , in particular -OH, -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe;
  • R 8 represents H or a group selected from Alkyl, Aryl, alkenyl, heteroaryl, heterocycle, cycloalkyl, alkyl-aryl, -alkyl-heteroaryl, -alkyl-heterocycle, -alkyl-cycloalkyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteraryl, alkenyl- cycloalkyl, alkenyl-heterocycle, O-Alkyl, O-Aryl, O- heteroaryl, O-alkenyl, O-cycloalkyl, O-heterocycle, C (0) Alkyl, C (0) Aryl, C (0) heteroaryl, C ( 0) alkenyl, C (0) heterocycle, C (0) cycloalkyl, C (0) 0Alkyl, C (0) 0Aryl, C (0) Oalkenyl, C (0) Oheterocycle, C (0) Oheteroaryl, C (0) O
  • D is a detectable agent such as for example small organic molecules, nanoparticles, radionuclides, fluorescent, bioluminescent, chemiluminescent, magnetic species
  • D can be a detectable agent as such or else made detectable after a chemical reaction such as biological activation e.g. enzymatic reaction, provided that D is not a group heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted, their enantiomers, diastereoisomers, pharmaceutically acceptable salts, solvates or hydrates.
  • a and C identical or different, independently represent a group chosen from a group
  • B represents - (CH2) n -,, - (0- (CH2) 2-0- (CH2) 2) n- each of the n, identical or different, is an integer between 1 and 99.
  • R 3 and R 5 do not represent a bond with the group [ABC] when m represents 1 or with D when m represents 0.
  • the set [ABC] should not alter the affinity of L (ligand) for the target MDR protein.
  • D is chosen from fluorochromes, for example BODIPY, cyanines, coumarins, sulfocyanimes, radionuclides, nanoparticles, preferably D is chosen from:
  • the Rs which are identical or different, are chosen from alkyl, alkenyl, aryl, heteroaryl, heterocycle, heteroaryl, alkenyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteroaryl, alkenyl-heterocycle, alkenyl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-heteroaryl, alkyl-heteroaryl heterocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl-COOH, alkenyl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alkenyl-aryl-O-alkyl-COOH; heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted, p is between 0 and 3.
  • Alkyl denotes a saturated, linear or branched hydrocarbon-based aliphatic group comprising, unless otherwise indicated, from 1 to 30 carbon atoms, preferably from 1 to 5 carbon atoms.
  • alkyl denotes a saturated, linear or branched hydrocarbon-based aliphatic group comprising, unless otherwise indicated, from 1 to 30 carbon atoms, preferably from 1 to 5 carbon atoms.
  • Alkenyl denotes a linear or branched hydrocarbon group comprising at least one double bond and comprising from 2 to 24 carbon atoms.
  • the alkenyl group can be chosen from vinyl, allyl, propenyl, butenyl, isobutenyl, pentenyl, isopentenyl, hexenyl, heptenyl, octenyl, nonenyl, decenyl, l 'undecenyl, dodecenyl, tetradecenyl and oleic.
  • Aryl denotes a cyclic, mono or polycyclic, aromatic group comprising from 6 to 10 carbon atoms, and mention may in particular be made of the phenyl group.
  • Cycloalkyl denotes a cyclic group, mono or polycyclic, non-aromatic, which can comprise at least one unsaturation, comprising from 3 to 10 carbon atoms, one can in particular quote the group cyclobenzyl.
  • Heteroaryl denotes a cyclic, mono or polycyclic, aromatic group comprising from 5 to 10 members including at least one heteroatom chosen from N, O or S, for example a heteroatom, two heteroatoms or three heteroatoms.
  • Heterocycle denotes a cyclic group, mono or polycyclic, non-aromatic, which can comprise at least one unsaturation, comprising from 3 to 10 members including at least one heteroatom chosen from N, O or S, for example a heteroatom, two heteroatoms or three heteroatoms.
  • Alkoxy denotes an O-alkyl group.
  • the cycles can be contiguous, of the spiro type or bridged.
  • Alkyls, aryls, heteroaryls and heterocyls can be substituted by one or more substituents in particular chosen from halogen atoms, alkyl groups, alkoxy groups, NR 9 R 10 , NHR 9 , NH 2 groups .
  • addition salts can be addition salts with bases such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, which are obtained using corresponding alkali and alkaline earth metal hydroxides such as bases.
  • bases such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, which are obtained using corresponding alkali and alkaline earth metal hydroxides such as bases.
  • addition salts with pharmaceutically acceptable bases mention may be made of salts with amines and in particular glucamine, N-methylglucamine, N, N-dimethylglucamine, ethanolamine, morpholine, N-methylmorpholine or lysine.
  • the pharmaceutically acceptable addition salts can be addition salts with inorganic or organic acids and preferably pharmaceutically acceptable acids such as hydrochloric, phosphoric acids, fumaric, citric, oxalic, sulfuric, ascorbic, tartaric, maleic, mandelic, methanesulfonic, lactobionic, gluconic, glucaric, succinic, sulfonic or hydroxypropanesulfonic.
  • pharmaceutically acceptable addition salts can be addition salts with inorganic or organic acids and preferably pharmaceutically acceptable acids such as hydrochloric, phosphoric acids, fumaric, citric, oxalic, sulfuric, ascorbic, tartaric, maleic, mandelic, methanesulfonic, lactobionic, gluconic, glucaric, succinic, sulfonic or hydroxypropanesulfonic.
  • R 1 represents -O-alkyl-aryl, -O-alkyl, preferably -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe;
  • R 2 represents NHC (0) 0-alkyl-aryl, NHC (0) Oalkyl, O-alkyl-aryl, O-alkyl, preferably NHC (0) 0Bn, NHC (0) 0tBu, -OBn, -OEt;
  • R 3 represents C (0) alkyl, alkyl-aryl, alkyl, preferably C (0) tBu, Bn, Me, Et, Pr;
  • R 4 represents OH, O-alkyl-aryl, O-alkyl, O-cycloalkyl, preferably -OH, -OBn, - OtBu, -OEt, -OMe, -OcHex, R 4 can in particular occupy position 3, 4 or 5 of the nitrogenous heterocycle, preferably position 4;
  • R 5 represents H or an Alkyl or aryl group, the heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted.
  • R3 and R5 do not represent a bond with the group [ABC] when m represents 1 or with D when m represents 0.
  • R 6 represents NHC (0) CH (alyl-aryl) 2 in particular NHC (0) CH [(CH2) 3Ph] 2;
  • R 7 represents -OH, O-alkyl, O-alkyl-aryl, in particular -OH, -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe;
  • R 8 represents H or a group chosen from O-Aryl, O-heteroaryl, in particular O-phenyl, O-quinoline, heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted.
  • R 1 represents -O-alkyl-aryl, -O-alkyl, preferably -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe;
  • R 2 represents NHC (0) 0-alkyl-aryl, NHC (0) Oalkyl, O-alkyl-aryl, O-alkyl, preferably NHC (0) OBn, NHC (0) OtBu, -OBn, -OEt;
  • R 3 represents C (0) alkyl, alkyl-aryl, alkyl, preferably C (0) tBu, Bn, Me, Et, Pr;
  • R 4 represents OH, O-alkyl-aryl, O-alkyl, O-cycloalkyl, preferably -OH, -OBn, - OtBu, -OEt, -OMe, -OcHex, R 4 can in particular occupy position 3, 4 or 5 of the nitrogenous heterocycle, preferably position 4;
  • R 5 represents H or an alkyl or aryl group; heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted, A and C, identical or different, independently represent a group chosen from a group
  • B represents - (CH 2 ) n -,, - (0- (CH2) 2-0- (CH2) 2) n-
  • a and / or C represent -NH-C (0) -NH, NHC ( 0) (CH 2 ) 2 , -NH-CO- (CH 2 ) 5-NH-CO-CH 2 OR -NH-C (O) -, then R3 and R5 do not represent a bond with the group [ABC] when m represents 1 or with D when m represents 0.
  • R 6 represents NHC (0) CH (alyl-aryl) 2 in particular NHC (0) CH [(CH2) 3Ph] 2;
  • R 7 represents -OH, O-alkyl, O-alkyl-aryl, in particular -OH, -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe;
  • R 8 represents H or a group chosen from O-Aryl, O-heteroaryl, in particular O-phenyl, O-quinoline, heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted,
  • a and C identical or different, independently represent a group chosen from a group
  • R 1 represents -O-alkyl-aryl, -O-alkyl, preferably -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe;
  • R 2 represents NHC (0) 0-alkyl-aryl, NHC (0) Oalkyl, O-alkyl-aryl, O-alkyl, preferably NHC (0) OBn, NHC (0) 0tBu, -OBn, -OEt;
  • R 3 represents C (0) alkyl, alkyl-aryl, alkyl, preferably C (0) tBu, Bn, Me, Et, Pr;
  • R 4 represents OH, O-alkyl-aryl, O-alkyl, O-cycloalkyl, preferably -OH, -OBn, - OtBu, -OEt, -OMe, -OcHex, R 4 can in particular occupy position 3, 4 or 5 of the nitrogenous heterocycle, preferably position 4;
  • R 5 represents H or an alkyl or aryl group; heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted,
  • D is chosen from fluorochromes, for example aromatic rings of the BODIPY type, cyanines, coumarins, sulfocyanines, radionuclides, nanoparticles, preferably D is chosen from:
  • the Rs which are identical or different, are chosen from alkyl, alkenyl, aryl, heteroaryl, heterocycle, heteroaryl, alkenyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteroaryl, alkenyl-heterocycle, alkenyl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-heteroaryl, alkyl-heteroaryl heterocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl-COOH, alkenyl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alkenyl-aryl-O-alkyl-COOH; heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted,
  • R3 and R5 do not represent a bond with the group [ABC] when m represents 1 or with D when m represents 0.
  • R 6 represents NHC (0) CH (alyl-aryl) 2 in particular NHC (0) CH [(CH2) 3Ph] 2;
  • R 7 represents -OH, O-alkyl, O-alkyl-aryl, in particular -OH, -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe;
  • R 8 represents H or a group chosen from O-Aryl, O-heteroaryl, in particular O-phenyl, O-quinoline, heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted,
  • D is chosen from fluorochromes, for example aromatic rings of the BODIPY type, cyanines, coumarins, sulfocyanines, radionuclides, nanoparticles, preferably D is chosen from:
  • the Rs which are identical or different, are chosen from alkyl, alkenyl, aryl, heteroaryl, heterocycle, heteroaryl, alkenyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteroaryl, alkenyl-heterocycle, alkenyl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-heteroaryl, alkyl-heteroaryl heterocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl-COOH, alkenyl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alkenyl-aryl-O-alkyl-COOH; heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted.
  • a and C identical or different, independently represent a group chosen from a group B represents - (CH2) n -,
  • D is chosen from fluorochromes, for example BODIPY, cyanines, coumarins, sulfocyanimes, radionuclides, nanoparticles, preferably D is chosen from:
  • the Rs which are identical or different, are chosen from alkyl, alkenyl, aryl, heteroaryl, heterocycle, heteroaryl, alkenyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteroaryl, alkenyl-heterocycle, alkenyl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-heteroaryl, alkyl-heteroaryl heterocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl-COOH, alkenyl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alkenyl-aryl-O-alkyl-COOH; heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted, Preferably when A and / or C represent -NH-C (0) -NH, NHC (0) (CH 2 ) 2 , -NH-CO- (CH2 ) 5-NH-CO-CH2 OR -NH-C (O)
  • R 1 represents -O-alkyl-aryl, -O-alkyl, preferably -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe;
  • R 2 represents NHC (0) 0-alkyl-aryl, NHC (0) Oalkyl, O-alkyl-aryl, O-alkyl, preferably NHC (0) OBn, NHC (0) OtBu, -OBn, -OEt;
  • R 3 represents C (0) alkyl, alkyl-aryl, alkyl, preferably C (0) tBu, Bn, Me, Et, Pr;
  • R 4 represents OH, O-alkyl-aryl, O-alkyl, O-cycloalkyl, preferably -OH, -OBn, - OtBu, -OEt, -OMe, -OcHex, R 4 can in particular occupy position 3, 4 or 5 of the nitrogenous heterocycle, preferably position 4;
  • R 5 represents H or an alkyl or aryl group; heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted,
  • a and C identical or different, independently represent a group selected from a bond, C (O), - (CH 2 ) n -, -NH-C (0) -NH, -NH-C (O) -, - 0-C (0) -NH-, -OC (O) -,
  • B represents - (CH 2 ) n -,, - (0- (CH2) 2-0- (CH2) 2) n-
  • D is chosen from fluorochromes, for example BODIPY, cyanines, coumarins, sulfocyanimes, radionuclides, nanoparticles, preferably D is chosen from:
  • the Rs which are identical or different, are chosen from alkyl, alkenyl, aryl, heteroaryl, heterocycle, heteroaryl, alkenyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteroaryl, alkenyl-heterocycle, alkenyl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-heteroaryl, alkyl-heterocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl-COOH, alkenyl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alkenyl-aryl-O-alkyl-COOH; heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted,
  • R3 and R5 do not represent a bond with the group [ABC] when m represents 1 or with D when m represents 0.
  • R 6 represents NHC (0) CH (alyl-aryl) 2 in particular NHC (0) CH [(CH2) 3Ph] 2;
  • R 7 represents -OH, O-alkyl, O-alkyl-aryl, in particular -OH, -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe;
  • R 8 represents H or a group chosen from O-Aryl, O-heteroaryl, in particular O-phenyl, O-quinolyl, heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted,
  • a and C identical or different, independently represent a group chosen from a group
  • B represents - (CH 2 ) n -,, - (0- (CH2) 2-0- (CH2) 2) n-
  • D is chosen from fluorochromes, for example aromatic rings of the BODIPY type, cyanines, coumarins, sulfocyanines, radionuclides, nanoparticles, preferably D is chosen from:
  • the Rs which are identical or different, are chosen from alkyl, alkenyl, aryl, heteroaryl, heterocycle, heteroaryl, alkenyl, alkenyl-aryl, alkenyl-heteroaryl, alkenyl-heterocycle, alkenyl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-heteroaryl, alkyl-heteroaryl heterocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl-COOH, alkenyl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alkenyl-aryl-O-alkyl-COOH; heterocycles, heteroaryl, cycloalkyl, aryl are substituted or unsubstituted.
  • D is BODIPY
  • D is BODIPY
  • it can in particular be chosen from:
  • Figure 1 shows the labeling obtained with compound (3) on DU4475 cells fixed or not fixed under the conditions of example ii1. ns corresponds to a non-significant difference.
  • Figure 2 represents the co-labeling (labeling with compound (3) and anti-Pgp immunolabeling) on different cell lines according to example N2.
  • IF compound (3) fluorescence intensity measured after labeling with the compound (3);
  • IF Immun. fluorescence intensity measured after anti-Pgp immunostaining; ns corresponds to a non-significant difference.
  • Figure 3 shows the signal correlation analysis of compound (3) and anti-Pgp immunolabeling according to Example N2.
  • FIG 4 shows the quantification of the increased expression of P-gp induced by OIaparib on SUM1315 cells using compound (3) according to Example N3. ns corresponds to a non-significant difference; **** p ⁇ 0.0001.
  • FIG. 5 represents the quantification of the increase in the expression of P-gp induced by OIaparib on SUM1315 cells using an immuno- anti-Pgp labeling according to Example N3. ns corresponds to a non-significant difference; **** p ⁇ 0.0001.
  • FIG 6 shows the quantification of P-gp with compound (3) on SUM1315 spheroids after 6 hours of exposure to OIaparib according to Example N4. *** p ⁇ 0.001.
  • Compound (1) can be obtained by a peptide coupling reaction between a commercial lysine (CAS 5978-22-3, Fluorochem Ref. 213710) and a commercial 4-hydroxyproline (CAS 54631-81-1, Fluorochem Ref. 318294) according to the protocol described by Arnaud O., et al. (J Med Chem. 2010; 53: 6720-9).
  • the compound (2) is obtained by selective deprotection of the Boc protecting group of the compound (1) (500 mg, 1 eq.). This deprotection is carried out in anhydrous dioxane (10 mL) in the presence of HCl (4N) at room temperature (in the rest of the text of the examples is meant by room temperature working temperatures between 15 and 35 ° C) with a 68% yield, according to an adaptation of the protocol described by Han G. et al. (J Pept Res Off J Am Pept Soc. 2001; 58: 338-41).
  • the compound (3) is obtained by coupling between the compound (2) (10 mg, 1 eq.) And the commercial fluorochrome BODIPY-FL-NHS TM (CAS 146616-66-2, Lumiprobe Ref. 41420) (1 eq.) Exhibiting an NHS ester function.
  • This step carried out at room temperature in DMF (1 mL) in the presence of triethylamine (2 eq.) Allows compound (3) of general structure (I) to be isolated with a yield of 44% after purification by liquid chromatography.
  • Compound (4) is obtained by coupling between compound (2) (see example 11) (5 mg, 1 eq.) And the commercial fluorochrome DiSulfocyanine3-NHS (CAS 1424150- 38-8, Lumiprobe Ref. 41320) (0.8 eq.) exhibiting an NHS ester function.
  • This step carried out at room temperature in DMF (500 ⁇ L) in the presence of triethylamine (1 eq.) makes it possible to isolate the compound (4) of general structure (I) with a yield of 94% after purification by liquid chromatography.
  • the compound (4) is characterized by high resolution mass spectrometry (HRMS-ESI, positive mode): m / z calculated for C 6O H 76 N 5 0 13 S 2 + [M + H] + 1138.4876; found 1138.4877.
  • the third step allows the formation of compound (7). It corresponds to the coupling between compound (6) (10 mg, 1 eq.) And the commercial fluorochrome BODIPY- FL-NHS TM (CAS 146616-66-2, Lumiprobe Ref. 41420) (1.1 eq.) Exhibiting an NHS ester function. As during the procedure described in Example 1, this step is carried out at room temperature in DMF (500 ⁇ L) in the presence of triethylamine (2 eq.) And makes it possible to isolate the compound (7) of general structure (I ) with a yield of 36% after purification by liquid chromatography.
  • the compound (7) corresponds to the coupling between compound (6) (10 mg, 1 eq.) And the commercial fluorochrome BODIPY- FL-NHS TM (CAS 146616-66-2, Lumiprobe Ref. 41420) (1.1 eq.) Exhibiting an NHS ester function.
  • this step is carried out at room temperature in DMF (500 ⁇ L) in
  • Compound (5) can be obtained in two steps starting from the commercial compound 6-aminohexanoic acid (CAS 60-32-2, Fisher Ref. 10578650) (2 g, 1 eq.).
  • the primary amine function is protected by an Fmoc group introduced under Schotten-Baumann conditions according to a standard procedure (J Med Chem. 2010; 53: 6720-9).
  • the carboxylic acid function of intermediate (8) (2.9 g, 1 eq.) Is activated into an NHS ester to form compound (5) with a yield of 38%, obtained at room temperature.
  • Compound (13) of general structure (I) is obtained by carrying out the reaction scheme below: First, lysine (10) with a free primary amine is obtained in two steps from a commercial protected lysine (CAS 7750- 45-0, Fluorochem Ref. 471593). During the first step, the side chain of lysine is protected by an Fmoc group introduced under Schotten-Baumann conditions according to a standard procedure described in example i3. During the second step at room temperature, the selective deprotection of the Boc group of compound (9) (1g, 1 eq.) Is carried out in the presence of HCl (2N) in dioxane
  • the peptide compound (11) is obtained by a first coupling step between lysine (10) (200 mg, 1 eq.) And a commercial protected 4-hydroxyproline (CAS 54631-81-1, Fluorochem Ref . 318294) (1 eq.) According to the adaptation of a procedure described by Arnaud O. et al. (J Biol Chem.
  • the compound (12) is obtained by selective deprotection of the Fmoc protective group of the compound (11) (90 mg, 1 eq.). This deprotection is carried out at room temperature in a solution of diethylamine (6 mL) in DMF (4 mL) with a yield of 58%.
  • the third step allows the formation of the compound (13). It corresponds to the coupling between compound (12) (8 mg, 1 eq.) And the commercial fluorochrome BODIPY-FL-NHS TM (CAS 146616-66-2, Lumiprobe Ref. 41420) (1 eq.) Exhibiting an ester function. NHS.
  • compound (14) of general structure (I) is carried out in three steps from a commercial lysine (CAS 5978-22-3, Fluorochem Ref. 213710) and a commercial proline (CAS 15761-39- 4, Fluorochem Ref. M03314) according to the reaction scheme described for compound (3) in Example II.
  • Compound (14) is characterized by high resolution mass spectrometry (HRMS-ESI, positive mode): m / z calculated for C37H49N5C> 6BF2 + [M + H] + 708.3738; found 708.3749.
  • Example i6 Synthesis of the compound (15) of formula (I)
  • the compound (15) of formula (I) is obtained from the compound (1) according to multi-step synthesis protocols similar to those described for example i3 .
  • the compound (16) can be obtained according to the protocol described by Arnaud O., et al. (J Med Chem. 2010; 53: 6720-9).
  • Example ii1 Use of compound (3) of structure (I) for the detection of P-gp on a triple negative breast cancer line in the live (unbound) or fixed state
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • the cells are either fixed in a solution of PBS 4% Paraformaldehyde for 20 minutes or kept in their suitable culture medium.
  • PBS 4% Paraformaldehyde for 20 minutes or kept in their suitable culture medium.
  • three washes are carried out with a PBS solution maintained at room temperature (close to 20 ° C.).
  • the cells are then incubated with the compound (3) at a concentration of 1 mM for 1 hour.
  • Three washes of the cells are then carried out with a PBS solution maintained at ambient temperature (close to 20 ° C.).
  • the cells resulting from the two labeling conditions are observed using the 3MV Cytation TM plate reader (Biotek®) and the fluorescence intensity is measured by the Gen5 software (Biotek®).
  • Results Comparison between the living state (not fixed) or the fixed state of the intensity of the labeling with the compound (3) on the DU4475 line (unicellular model).
  • Example ii2 Use of compound (3) of structure (I) for evaluating the level of expression of the P-gp protein on triple negative breast cancer lines by fluorescence imaging (samples in fixed monolayer).
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • Clone F4 P-glycoprotein Antibody
  • AlexaFluor TM 647 Goat anti-Mouse IgG (H + L) (Invitrogen® - Catalog No. A21236)
  • DU4475 ATCC® HTB-123 TM: RPMI1640 no glutamine medium (Gibco®) supplemented with 10% Fetal Calf Serum; 20pg / mL of gentamycin (Panpharma®) and 2mM of L-glutamine (Gibco®)
  • SW527 (ATCC® CRL-7940 TM): DMEM medium (Gibco®) supplemented with 10% Fetal Calf Serum and 20pg / mL of gentamycin (Panpharma®)
  • HCC1937 (ATCC® CRL-2336 TM): RPMI1640 no glutamine medium (Gibco®) supplemented with 10% Fetal Calf Serum; 20pg / mL of gentamycin (Panpharma®) and 2mM of L-glutamine (Gibco®) MDA-MB-231 (ATCC® HTB-26 TM): RPMI1640 no glutamine medium (Gibco®) supplemented with 10% Fetal Calf Serum; 20pg / ml_ of gentamycin (Panpharma®) and 2mM of L-glutamine (Gibco®)
  • cell lines SW527; HCC1937; DU4475 and SUM1315) After adequate preparation of the cell samples (cell lines SW527; HCC1937; DU4475 and SUM1315), they are fixed in a solution of PBS 4% Paraformaldehyde for 20 minutes. Three washes of the cells are then carried out with a PBS solution maintained at ambient temperature (close to 20 ° C.). The cell samples are then incubated with the compound (3) at a concentration of 1 mM for 1 hour at 37 ° C. Three washes of the cells are then carried out with a PBS solution maintained at ambient temperature (close to 20 ° C.).
  • the cells are incubated for 1 hour with the primary antiP-gp antibody diluted 1/75 at room temperature with slow stirring. Three washes of the cells are carried out with a PBS solution maintained at room temperature (close to 20 ° C.). The cells are then incubated for 1 hour with the secondary antibody coupled to AlexaFluor® 647 diluted 1/800 at room temperature with slow stirring. Three washes of the cells are then carried out with a PBS solution maintained at ambient temperature (close to 20 ° C.).
  • the DU4475 line exhibited fluorescence intensities of compound (3) significantly higher than the other lines tested. These results demonstrate the sensitivity of the detection method to assess differences in the level of P-gp expression between different cell lines. Thus, these results validate the use of compound (3) to demonstrate overexpression of Pgp in cell models.
  • Example ii3 Use of compound (3) of structure (I) for the quantification of an increase in expression of P-gp following an anticancer treatment from a triple negative breast cancer line, cultured in monolayer (2D) and fixed.
  • P-gp induction (increase in expression) experiments were performed following treatment of cells of the SUM1315 line (monolayer) with increasing doses of OIaparib, a Poly-ADP-ribose polymerase inhibitor. 1 (anti-PARP1).
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • Clone F4 P-glycoprotein Antibody
  • AlexaFluor TM 647 Goat anti-Mouse IgG (H + L) (Invitrogen® - Catalog No. A21236)
  • the SUM1315 cells in the exponential growth phase are treated for 3 hours in the absence or presence of 10, 50 or 100 mM OIaparib at 37 ° C in a humid incubator. A 0.1% DMSO solvent control is also carried out under the same experimental conditions.
  • the cells are incubated for 1 hour with the primary antiP-gp antibody diluted 1/75 at room temperature with slow stirring. Three washes of the cells are carried out with a PBS solution maintained at room temperature (close to 20 ° C.). The cells are then incubated for 1 hour with the secondary antibody coupled to AlexaFluor® 647 diluted 1/800 at room temperature with slow stirring. Three washes of the cells are then carried out with a PBS solution maintained at ambient temperature (close to 20 ° C.).
  • Example ii4 Use of compound (3) of structure (I) for the quantification of an increase in expression of P-gp following an anticancer treatment from a triple negative breast cancer line cultured in 3D (spheroids).
  • P-gp induction (increase in expression) experiments were performed following treatment of spheroids (3D culture) from the line SUM1315 with increasing doses of OIaparib, a Poly-ADP-ribose polymerase 1 (anti-PARP1) inhibitor.
  • Olaparib® (Carbosynth)
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • Clone F4 P-glycoprotein Antibody
  • AlexaFluor TM 647 Goat anti-Mouse IgG (H + L) (Invitrogen® - Catalog No. A21236)
  • Spheroids were formed from cells of the SUM1315 line. After 3 days of culture, the spheroids are treated for 6 hours in the presence of 10, 50 or 100 mM of OIaparib at 37 ° C in a humid incubator. A 0.1% DMSO solvent control is also carried out under the same experimental conditions.
  • SUM1315 spheroids After adequate preparation of the SUM1315 spheroids, they are fixed in a solution of PBS 4% Paraformaldehyde for 12 hours. The spheroids are then incubated with compound (3) at a concentration of 1 mM for 1 hour and 30 minutes. Three washes of the cells are then carried out with a PBS solution maintained at ambient temperature (close to 20 ° C.).
  • Example ii5 Use of compounds (4), (7), (13) and (14) of structure (I) for the detection of P-gp on two lines of Triple Negative Breast Cancer cultivated in a monolayer.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline

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Abstract

Méthode in vitro de détection, de localisation et/ou de quantification de protéines de multirésistance aux médicaments (MDR) associées à des cellules, dans un échantillon contenant des cellules procaryotes ou eucaryotes exprimant ou susceptibles d'exprimer des protéines MDR. La méthode comprend : • l'ajout à l'échantillon en milieu liquide ou comprenant une phase liquide d'un traceur MDR apte à se fixer aux protéines MDR, • l'incubation de l'échantillon avec ce traceur MDR, ce grâce à quoi le traceur MDR se fixe aux protéines MDR lorsqu'elles sont présentes, • l'élimination du traceur non fixé à des protéines MDR, • la détection, la localisation et/ou la quantification du traceur fixé à des protéines MDR. Traceurs aptes à être utilisés dans cette méthode.

Description

DESCRIPTION
Méthode de détection, localisation et quantification de protéines MDR
La présente invention concerne une méthode in vitro de détection, localisation et/ou quantification de protéines MDR de multirésistance (« MultiDrug Résistance », MDR) exprimées par des cellules présentes dans un échantillon. L’invention concerne aussi des traceurs de MDR détectables, utilisables dans cette méthode.
Arrière-plan technologique
La classe des protéines « Multidrug Résistance » (MDR) appartient à la superfamille des transporteurs de type « ATP binding cassette » (ABC). Les protéines MDR sont des transporteurs membranaires d’efflux (pompes) de xénobiotiques (polluants, médicaments, et/ou toutes autres molécules étrangères à la cellule). Très ubiquitaires et extrêmement conservées au cours de l’évolution, elles sont exprimées au niveau des systèmes membranaires des cellules de tous les organismes, des procaryotes aux eucaryotes.
Les principales protéines MDR comprennent les sous-familles du ABCB (ABCB1/MDR1/P-glycoprotéine), l'ABCC (ABCC1/MRP1, ABCC2/MRP2, ABCC10/MRP7 et également ABCC3-6, et ABCC11), et l’ABCG (ABCG2/MXR/BCRP) [1]. Chez l'Homme/mammifères, plusieurs tissus sains expriment naturellement la P-gp codée par le gène MDR1 (ou ABCB1), comme la barrière hématoencéphalique du cerveau, la glande surrénale, le pancréas, le foie et le rein, les cellules hématopoïétiques et les cellules souches, entre autres. Chez les autres organismes, eucaryotes ou procaryotes (animal ou végétal), la présence d’abcb1/mdr1/P-glycoprotéine (P-gp), qui représente la protéine de référence, a plutôt été démontrée chez les bactéries et parasites [2-4], chez les protozoaires [5-7], chez les invertébrés aquatiques [8], chez la drosophile [9,10] et chez les végétaux (arabidobsis et maïs) [11 ,12] Chez le modèle poisson, l’expression génique d’abcbl et également d’autres membres de transporteurs ABC comme abcc1-5, abcb3, abcbl 1 et abcg2 a également été mise en évidence [13-17]
Les protéines MDR sont des pompes d’efflux à rôle détoxificateur. Elles reconnaissent une très large variété de substrats allant de molécules organiques aux propriétés physico-chimiques très variées (hydrophobe, amphipathiques, ...) jusqu’aux métaux lourds. De part cette propriété, les protéines MDR jouent à l’échelle de la cellule un rôle de défense à l’encontre des xénobiotiques.
Les protéines MDR sont exprimées naturellement sur les systèmes membranaires de quasiment tous les organismes vivants. Il s’agit de l’expression basale naturelle. En présence de xénobiotiques, le niveau d’expression de ces protéines peut augmenter d’une manière dose dépendante. Ce niveau d’expression basal ou induit est quantifiable in vitro à l’heure actuelle à l’aide d’anticorps spécifiques de chaque protéine par des approches d’immuno-cytologie ou immuno- histologie [5-10,13-15,18] Le différentiel d’expression entre le niveau basal et après induction (exposition à un xénobiotique) peut être exploité comme un biomarqueur de défense cellulaire. En effet, à titre d’exemple, les protéines MDR, notamment la P-gp, représentent un « biomarqueur de choix » pour la détection de la pollution de l’air et de l’eau [5-10,13-15,18]
Les protéines MDR sont également surexprimées dans toutes les cellules tumorales [19,20] Elles sont responsables de la notion de « Multidrug Résistance (MDR) » ou la résistance croisée des cellules cancéreuses vis-à-vis des agents anticancéreux. En effet, certaines tumeurs montrent un profil de résistance inhérente lié à un niveau d’expression basal élevé de la P-gp et/ou d’autres MDR. Chez d'autres tumeurs, le niveau d’expression de la P-gp et/ou d’autres MDR augmente au cours du traitement (résistance au traitement). Dans les deux cas, l’efflux massif des chimiothérapeutiques rend le traitement inefficace [1] L’activité d’efflux de xénobiotique par ces pompes MDR peut être contournée par l’utilisation d’autres substrats cibles et plus spécifiques de ces pompes appelés « inhibiteurs compétitifs». En effet, par l’association d’un inhibiteur ayant une affinité/spécificité plus importante pour la pompe MDR que la molécule chimiothérapeutique, l’activité d’efflux de la pompe se focalise prioritairement sur l’efflux de l’inhibiteur » et non de la molécule chimiothérapeutique. De cette manière la molécule chimiothérapeutique est maintenue dans la cellule cancéreuse et va pouvoir agir. Ces inhibiteurs sont reconnus et transportés préférentiellement par les pompes MDR de l’intérieur vers l’extérieur des cellules cancéreuses. Parmi les inhibiteurs compétitifs / substrats les plus connus (fluorescents ou non fluorescents) décrits dans la littérature, on peut citer la cyclosporine (Andaleeb S. et al. (2019) Drug metabolism and disposition, 47(10), 1013-1023 ), la Calcein AM, la rhodamine 1 2 3, le bodipy-Taxol (Martin étal., (2003), British Journal of cancer, 437(1), 77-87), Reversin (WO 95/31474)
L’activité d’efflux/transport des pompes MDR peut être analysée/démontrée à l’échelle cellulaire préférentiellement par la technique de cytométrie en flux ou par imagerie de fluorescence (Strouse J. J. et al. (2013), Analytical Biochemistry, 437(1), 77-87).
Aucune de ces méthodes ne permet de localiser les protéines MDR dans une cellule et/ou une masse cellulaire, ni de les quantifier dans une cellule et/ou une masse cellulaire.
Aussi existe-t-il un besoin de mettre à disposition une méthode permettant de localiser et/ou de quantifier les protéines MDR dans une cellule et/ou une masse cellulaire.
De par la forte implication des protéines MDR dans les mécanismes de chimiorésistance, leur détection et leur quantification dans les cellules tumorales avant et en cours de traitement sont très pertinentes. Elles permettent une estimation de l’efficacité du traitement, en préclinique lors du screening des anti-cancéreux par modélisation in vitro et en clinique sur les biopsies des patients. La recherche du niveau d’expression des protéines MDR n’est pas utilisée à ce jour sur des biopsies au cours du traitement. L’invention décrite sera un outil innovant applicable à cette recherche, permettant ainsi l’optimisation des traitements.
Résumé de l’invention
L’invention est basée sur le développement de traceurs détectables et quantifiables (par exemple fluorescents, radioactifs) ciblant spécifiquement des protéines MDR, en activité ou non, applicables plus particulièrement in vitro sur des organismes procaryotes et eucaryotes de type animal et végétal, unicellulaires et pluricellulaires tels que (i) des champignons, (ii) des parasites, (iii) des modèles de culture cellulaire animale et végétale : unicellulaire, en deux dimensions et en trois dimensions, (iv) des organoïdes, (v) des biopsies ou encore (vi) des fragments de tissus. Les protéines MDR sont très ubiquitaires et exprimées au niveau des systèmes membranaires des cellules et organites intracellulaires de tous les organismes [21] Les traceurs développés ont la capacité de pénétrer / diffuser dans les cellules et amas cellulaires de tous ces modèles. Ils permettent de détecter l’expression et d’effectuer une quantification globale directe des protéines MDR dans des conditions où les cellules constituent une seule couche et également quand elles sont composées de «plusieurs couches» comme par exemple des cultures cellulaires flottantes, en monocouche (2D), en trois dimensions (3D), des fragments de tissus, ou des organismes pluricellulaires, entre autres. L’invention inclut l’utilisation de ces traceurs capables de pénétrer dans une cellule ou de diffuser dans des masses cellulaires et pénétrer dans les cellules, pour le marquage des membranes et/ou la localisation et la quantification de l’expression des protéines MDR (la protéine P-gp par exemple). Ceux-ci peuvent être utilisés sur des modèles biologiques variés, à l’état vivant, à l’état non-vivant notamment à l’état fixé, et présentent donc un champ d’application étendu par rapport aux outils actuels tels que les anticorps.
Au sens de la présente invention, l’état fixé correspond à la fixation d'échantillons biologiques qui consiste à figer les structures cellulaires dans un état permettant une exploitation ultérieure en les exposant à un agent chimique tel que le paraformaldéhyde. Cette fixation entraîne nécessairement l'arrêt de toute activité métabolique.
En outre, les composés de l’invention peuvent être produits par synthèse organique et représentent à ce titre une alternative intéressante à l’utilisation des anticorps (i) d’un point de vue économique (comparaison du coût) et (ii) d’un point de vue éthique, considérant les méthodes de production des anticorps. Toutes ces caractéristiques constituent une forte valeur ajoutée de l’invention par rapport aux procédés existants de localisation et de quantification des protéines MDR notamment à l’aide d’anticorps. Elles sont résumées dans le tableau 1 ci-dessous.
[Table 1]
Figure imgf000005_0001
Par ailleurs, les composés de l’invention permettent la mesure directe de l’expression des protéines MDR, contrairement aux procédés existants destinés à la mesure de l’activité d’efflux des protéines MDR (par exemple, MDR Assay Kit, Abcam®). En effet, bien qu’également basés sur l’utilisation de petites molécules, ces procédés ne permettent pas la mesure directe de l’expression des protéines MDR. De plus, ils ne sont adaptés que pour une utilisation sur cellules en suspension ou en monocouche.
De nombreux peptides interagissant avec les protéines MDR ont été décrits. Ainsi la demande internationale WO 2011/042654 décrit des oligopeptides dérivés des réversines comme inhibiteurs de la P-gp utilisés comme médicaments notamment dans le traitement des cancers. Ces oligopeptides ne sont pas porteurs de groupements spécifiquement détectables, notamment par fluorescence ou chimioluminescence, en particulier dans un milieu complexe.
La demande internationale WO 95/31474 décrit également des peptides dérivés des réversines utilisés pour réduire l’activité du transporteur MDR1 afin de diminuer la multi-résistance aux médicaments. Ces peptides ne sont pas porteurs de groupements spécifiquement détectables, notamment par fluorescence ou chimioluminescence, en particulier dans un milieu complexe.
La présente invention trouve notamment des applications dans les domaines suivants :
- Domaine recherche
• Alternative aux anticorps pour le ciblage des protéines MDR (détection et mesure directe de leur niveau d’expression) pour des cellules isolées ou en monocouche, et outil utilisable sur des amas cellulaires (cultures 3D, tissus, etc.)
• Complémentarité avec les méthodes existantes de mesure de l’activité de protéines MDR
• Ciblage des protéines MDR ubiquitaires dans tous les types de cellules procaryotes, eucaryotes et parasites unicellulaires ou pluricellulaires.
• Ciblage des protéines MDR dans les tumeurs artificielles
- Domaine clinique
• Ciblage des protéines MDR dans les biopsies tumorales
=> Suivi de l’efficacité d’un traitement et/ou optimisation du choix des traitements de chimiothérapie
- Domaine environnement
Biomarqueur de pollution environnementale. Description détaillée
L’invention a pour premier objet une méthode de détection, de localisation et/ou de quantification in vitro de protéines MDR associées à des cellules. Cette méthode est destinée à la détection, la localisation et/ou la quantification des protéines MDR dans un échantillon contenant des cellules, notamment en suspension, en amas cellulaires ou sous la forme d’extrait cellulaire, de type procaryotes ou eucaryotes, à l’état vivant ou fixé. Parmi les protéines MDR visées, on peut citer P-gp, MRP1, MRP2, MRP7, ABCC3-6, ABCC11 et BCRP. Dans un mode de réalisation la protéine MDR est la P-gp.
La méthode comprend notamment :
• l’ajout à l’échantillon en milieu liquide ou comprenant une phase liquide d’un traceur MDR apte à se fixer aux protéines MDR,
• l’incubation de l’échantillon avec ce traceur MDR, ce grâce à quoi le traceur MDR se fixe aux protéines MDR lorsqu’elles sont présentes,
• l’élimination du traceur non fixé à des protéines MDR,
• la détection, la localisation et/ou la quantification du traceur fixé à des protéines MDR.
Par « cellules » on entend les cellules entières et les éléments d’origine cellulaire, comme les organites, la membrane cellulaire (membrane plasmique), les membranes endoplasmiques pour des eucaryotes ; membrane, paroi, capsule pour des procaryotes . Par « cellules en suspension », on entend que l’échantillon contient des cellules isolées maintenues dans un milieu liquide. Par « amas cellulaire » on entend que l’échantillon est un ensemble de cellules cohésives et agrégées, pouvant former un tissu. Par « extrait cellulaire » on entend un échantillon cellulaire contenant des éléments d’origine cellulaire, par exemple organites, et maintenu à l’état vivant ou fixé.
Comme on le verra plus loin, la méthode peut être utilisée indépendamment pour la détection, pour la localisation, pour la quantification de protéines MDR exprimées dans les cellules. Elle peut être utilisée aussi en remplissant deux de ces fonctions (détection et localisation ; détection et quantification, localisation et quantification), ou les trois. La méthode selon l’invention ne permet pas la mesure de l’activité des protéines MDR mais peut être associée à une méthode apte à mesurer ladite activité.
L’échantillon peut comprendre, de manière non limitative, des extraits cellulaires, des cultures cellulaires par exemple des cellules en suspension, des cellules adhérentes à un support de culture, une culture cellulaire monocouche ou multicouches, une culture cellulaire en 3D, un sphéroïde ou un tissu ou fragment de tissu biologique ou un organisme unicellulaire ou pluricellulaire. L’échantillon peut notamment comprendre des cellules cancéreuses de patient, une biopsie de cancer de patient, des cellules de lignée cancéreuse, une tumeur artificielle.
Selon la méthode de l’invention, on ajoute le traceur MDR à l’échantillon. Cet échantillon est de préférence en milieu liquide ou comporte une phase liquide.
La méthode de l’invention comprend notamment une étape de mise en présence de l’échantillon et du traceur MDR. Avantageusement, l’échantillon est maintenu, cultivé ou conservé dans un milieu liquide propre à maintenir sa conservation. Ceci signifie que l’échantillon est placé en milieu liquide compatible avec une bonne conservation des cellules, tissus, etc., ou est déjà en milieu liquide approprié. Dans le cas de cellules, de tissus, de biopsies, d’organismes pluricellulaires, etc., les cellules présentes ou constitutives sont de préférence placées ou présentes dans un milieu de conservation ou de culture.
Le traceur MDR est apte à pénétrer à l’intérieur des cellules et à diffuser au sein de l’échantillon cellulaire et à se fixer à la partie accessible des protéines MDR. Le traceur MDR est en outre détectable ou rendu détectable. Cette détection / localisation / quantification peut par exemple reposer sur une émission de fluorescence ou un rayonnement radioactif.
Au sens de la présente invention on entend par détectable un traceur qui peut être utilisé de façon spécifique et sensible pour détecter, localiser et/ou quantifier les protéines MDR dans un milieu biologique complexe.
L’invention peut notamment utiliser un traceur MDR de type ligand de MDR marqué par un groupement chimique détectable selon la formule (I) qui sera explicitée plus loin. Dans un mode de réalisation, on utilise un ligand de formule (I) pour détecter la P-gp.
Les traceurs MDR sont ajoutés à l’échantillon en une quantité suffisante permettant de réaliser l’action souhaitée, détection, localisation et/ou quantification. On ajoute notamment une quantité connue de ce traceur. Leur quantité ou leur concentration sera déterminée par l’expérimentateur.
Il a notamment pu être déterminé que la détection, la localisation et/ou la quantification peut avantageusement être réalisée en utilisant d’environ 1 nM à 100 mM, notamment de 100 nM à 10 mM de traceur, pour environ 1 cellule à environ 109 cellules. L’Homme du métier pourra extrapoler aux quantités de cellules dont il dispose dans son échantillon. On incube l’échantillon avec les traceurs MDR qui se lient aux protéines MDR présentes dans les cellules. L’incubation est réalisée pour une certaine durée et à une température permettant de maintenir les cellules en bon état de conservation.
L’incubation de l’échantillon avec le traceur MDR est d’une durée suffisante pour permettre sa fixation aux extraits cellulaires, sa pénétration au sein des cellules, sa diffusion au sein des amas cellulaires et sa pénétration au sein des cellules de ces amas. Cette durée peut être mesurée par l’homme du métier, lui permettant d’optimiser la durée d’incubation en fonction du type d’échantillon. De manière générale, la durée d’incubation peut être comprise entre environ 1 minute et environ 24h.
Cette incubation peut être réalisée à une température permettant de maintenir les cellules, tissus, etc. en bon état de conservation pour permettre de réaliser la méthode. Cette température sera avantageusement d’environ 0°C à environ 39°C pour des cellules d’origine humaine ou animale.
Suivant une modalité de l’invention, après incubation, on procède à l’élimination du traceur non lié aux protéines MDR. Cette élimination peut comprendre l’aspiration du milieu liquide, et la récupération des cellules (culot de cellules ou cellules adhérentes) ou de l’amas cellulaire (tissu, biopsie, etc.). Cette élimination peut comprendre de la centrifugation, de la précipitation ou de la filtration, notamment pour une suspension de cellules, ou filtration ou écoulement du milieu liquide laissant la masse de cellules ou les cellules adhérentes.
Cette méthode peut comprendre un lavage ou rinçage des cellules avec un milieu liquide adapté à la conservation des cellules, des tissus, etc. De préférence, le lavage conduit à un efflux du traceur ayant pénétré à l’intérieur des cellules mais qui ne s’est pas fixé à une protéine MDR. Par lavage, on entend notamment le fait de placer les cellules dans un liquide compatible avec la conservation de l’échantillon, dit de lavage, éventuellement le milieu de lavage est remplacé une ou plusieurs fois pendant cette durée. On effectue un nombre de lavages suffisant. L’Homme du métier est en mesure de déterminer les meilleures conditions pour éliminer suffisamment le traceur MDR libre non fixé.
On peut ensuite procéder à la détection, la localisation, la quantification du traceur MDR fixé à des protéines MDR. On peut aussi combiner ces actions, notamment détection et quantification ou localisation et quantification ou détection et localisation.
Selon différentes modalités, qui peuvent être combinées, à l’aide du traceur
MDR : - On détecte la présence de protéines MDR dans l’échantillon.
- On détecte la liaison du traceur MDR à une protéine MDR en intracellulaire.
- On localise la présence de protéines MDR dans l’échantillon et au sein des cellules, c’est-à-dire que l’on détermine (i) l’emplacement des cellules exprimant les protéines MDR détectées dans l’échantillon, notamment dans une culture 3D, un tissu, une biopsie, un organisme pluricellulaire, et éventuellement (ii) l’emplacement des protéines MDR à l’échelle cellulaire.
- On quantifie le niveau d’expression des protéines MDR dans l’échantillon.
- On détermine des niveaux d’expression différents des protéines MDR (i) dans l’échantillon, notamment dans une culture 3D, un tissu, une biopsie ou un organisme pluricellulaire et éventuellement (ii) au sein de chaque cellule.
- On compare le niveau d’expression des protéines MDR dans des prélèvements de cellules ou de tissus (biopsies) provenant du même patient à des moments différents. On détermine la réponse du patient à un traitement, par exemple la réponse de la tumeur à un traitement anticancéreux ou l’apparition de résistance à un traitement médicamenteux, par exemple anticancéreux.
Dans ce dernier cas, la méthode comprend le traitement d’autant de prélèvements de cellules ou de tissus (biopsies) issus du même patient au cours du temps (par exemple, au cours d’un traitement médicamenteux, par exemple anticancéreux), par la méthode selon l’invention. La méthode utilisée pour un suivi clinique chez un patient, comprend la comparaison entre échantillons prélevés à des dates différentes. On peut détecter l’apparition de l’expression de protéines MDR ou encore l’augmentation, la stagnation ou la régression de l’expression de ces protéines MDR sur la période d’observation.
La détection, la localisation et/ou la quantification peut par exemple utiliser une méthode de mesure de fluorescence ou de radioactivité. La quantification ou le niveau d’expression d’une protéine MDR, par exemple la P-gp, est obtenue notamment par l’intensité du signal mesuré, comme l’intensité de fluorescence ou de radioactivité. Il est alors possible de comparer des échantillons entre eux ou avec des valeurs de référence.
La présente invention a aussi pour objet des traceurs MDR qui vont être décrits ci-après. Ces traceurs MDR peuvent être utilisés dans la méthode qui vient d’être décrite, seuls ou en combinaison. La présente invention a aussi pour objet une composition contenant au moins un traceur MDR selon l’invention, et un milieu liquide, par exemple un solvant tel qu’un solvant organique notamment diméthylsulfoxide, éthanol, une solution saline, comme par exemple un tampon phosphate à pH physiologique.
Ces traceurs MDR répondent à la formule (I)
L-[ABC]m-D (I) dans laquelle : m représente 0 ou 1
L représente un ligand susceptible de se lier aux protéines MDR, L est notamment
Figure imgf000011_0001
un groupe de formule (II) : dans laquelle
X représente un groupe -CH2- ou C(O)
R1 représente H ou un groupe choisi parmi -OH, O-alkyl, O-alcényl, O-aryl, O-hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, -alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl- cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle- aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, O-alkyl- aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl-hétérocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O- alcényle-hétéroaryl, O-alcényle-hétérocycle, O-alcényle-cycloalkyl, NH-alkyl, NH-alcényle, NH-aryl, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH-cycloalkyle, NR9R10, , notamment -OBn, - OtBu, -OEt, -OMe ;
R2 représente H ou un groupe choisi parmi -OH, -NH2, O-Alkyl, O-alcényl, O-hétéroaryl, O- cycloalkyl, O-hétérocycle, O-Aryl, O-Alkyl-Aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl-hétérocycle, O- alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle-hétérocycle, O- alcényle-cycloalkyl, -Alkyl-Aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl-cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, NH-Alkyl, NH-alcényle, NH-Aryl, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH-cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, N- alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle- hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, NR9R10, NHC(0)OAIkyl, NHC(0)OAIcényl, NHC(0)Ocycloalkyle, NHC(0)Ohétérocycle, NHC(0)Ohétéroaryl, NHC(0)0Aryl, NHC(0)0-alkyl-aryl, NHC(0)0-alkyl-hétéroaryl, NHC(0)0-alkyl- hétérocycle, NHC(0)0-alkyl-cycloalkyl, NHC(0)0-alcényl-aryl, NHC(0)0-alcényl- hétéroaryl, NHC(0)0-alcényl-hétérocycle, NHC(0)0-alcényl-cycloalkyl, NHC(0)NHAIkyl, NHC(0)NHAIcényle, NHC(0)NHAryl, NHC(0)NHhétéroaryle, NHC(0)NHcycloalkyl, NHC(0)NHhétérocycle, notamment NHC(0)0Bn, NHC(0)0tBu, -OBn, -OEt ;
R3 représente H ou un groupe choisi parmi alkyle, alcényle, aryl, hétéroaryle, cycloalkyl, hétérocycle, alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl-cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl- hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle- hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, C(0)alkyl, C(0)aryl, C(0)alcényle, C(0)hétéroaryle, C (O) hétérocycle, C(0)cycloalkyle, C(0)0alkyl, C(0)0aryl, C(0)Oalcényle, C(0)Ocycloalkyl, C(0)Ohétéroaryl, C(0)Ohétérocycle, C(0)NHalkyl, C(0)NHaryl, C(0)NHhétéroaryi, C(O) N H hétérocycle, C(0)NHcycioaikyle,
C(0)NHalcényle, notamment C(0)tBu, Bn, Me, Et, Pr ;
R4 représente H ou un groupe choisi parmi -SH, -OH, O-alkyl, O-aryl, O-alcényl, O- hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, -O-alkyl-aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl- hétérocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle- hétérocycle, O-alcényle-cycloalkyl, -alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl- cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéraryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, -O- cycloalkyl, O-alkyl, O-alcényl, O-aryl, O-hétéroaryl, O-hétérocycle, -NH2, NH-Alkyl, NH- Aryl, NH-alcényle, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH-cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl- hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle- hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, NR9R10, notamment -OH, - OBn, -OtBu, -OEt, -OMe, -OcHex, R4 peut notamment occuper la position 3, 4 ou 5 de l’hétérocycle azoté, avantageusement la position 4 ;
R5 représente H ou un groupe alkyle ou aryle ; avec la condition qu’au moins un des R1, R2, R3, R4 ou R5 représente une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0 ;
R9 et R10, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle, alcényle, hétérocycle, hétéroaryl, cycloalkyle, alkyl-aryl, alyl-hétéroaryl, alkyl-hétérocycle, alkyl-cycloalkyle, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-hétérocycle, alcényle-cycloalkyle ou un groupe de formule (III) dans laquelle
R6 représente H ou un groupe choisi parmi -OH, -NH2, O-Alkyl, O-Aryl, O-alcényl, O- hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, O-alkyl-aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl- hétérocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle- hétérocycle, O-alcényle-cycloalkyl, NH-Alkyl, NH-Aryl, NH-alcényle, NH-hétéroaryl, NH- hétérocycle, NH-cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH- alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH- alcényle-cycloalkyl, NRR\ NHC(0)OAIkyl, NHC(0)0Aryl, NHC(0)OAIcényl, NHC(0)Ocycloalkyle, NHC(0)Ohétérocycle, NHC(0)Ohétéroaryl, NHC(0)0-aikyi-aryl,
NHC(0)0-aikyi-hétéroaryl, NHC(0)0-aikyi-hétérocycle, NHC(0)0-alkyl-cycloaikyl, NHC(0)0-aicényi-hétéroaryl, NHC(0)0-alcényl-hétérocycie, NHC(0)0-alcényl-cycloaikyl, NHC(0)NHAicényie, NHC(0)NHhétéroaryie, NHC(0)NHcycioaikyl,
NHC(0)NHhétérocycie, NHC(0)NHAIkyl, NHC(0)NHAryl, NHC(0)CH(alyi-aryl)2 notamment NHC(0)CH[(CH2)3Ph]2
R7 représente H ou un groupe choisi parmi -OH, O-alkyl, O-aryl, O-alcényl, O-hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, O-alkyl-aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl-hétérocycle, O-alkyl- cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle-hétérocycle, O-alcényle- cycloalkyl, NH2, NH-Alkyl, NH-Aryl, NH-alcényle, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH- cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl,
NH-alcényle-aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle- cycloalkyl, NR9R10, notamment -OH, -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe ;
R8 représente H ou un groupe choisi parmi Alkyl, Aryl, alcényle, hétéroaryle, hétérocycle, cycloalkyle, alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl-cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéraryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, O-Alkyl, O-Aryl, O- hétéroaryl, O-alcényl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, C(0)Alkyl, C(0)Aryl, C(0)hétéroaryl, C(0)alcényle, C(0)hétérocycle, C(0)cycloalkyle, C(0)0Alkyl, C(0)0Aryl, C(0)Oalcényle, C(0)Ohétérocycle, C(0)Ohétéroaryle, C(0)Ocycloalkyle, C(0)NHAIkyl, C(0)NHAIcényle, C(0)NHAryl, C(0)NHhétérocycle, C(0)NHhétéroaryle, C(0)NHcycloalkyle, notamment O- phényl, O-quinoléile avec la condition qu’au moins un des R6, R7, R8 représente une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0 ; [ABC] représente un groupe de 1 à 500 atomes et peut être compris d’atomes ou groupes d’atomes tels que notamment hydrogène et carbone, amino, amido, alkylamido, oxygène, polyéthylène glycol (PEG), peptide, peptoïde, soufre, sulfoxyde, sulfonyl, carbonyl, imine, [ABC] peut présenter des groupements saturés, insaturés et des systèmes cycliques aromatiques, les systèmes cycliques aromatiques peuvent être polycycliques et/ou hétéroaromatiques contenant 1 à 4 hétéroatomes comme par exemple N, S, O ;
D est un agent détectable comme par exemple de petites molécules organiques, des nanoparticules, des radionucléides, des espèces fluorescentes, bioluminescentes, chimioluminescentes, magnétiques, D peut être un agent détectable en tant que tel ou bien rendu détectable après une réaction chimique telle qu’une activation biologique par exemple réaction enzymatique, à condition que D ne soit pas un groupe
Figure imgf000014_0001
les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués, leurs énantiomères, diastéréoisomères, sels pharmaceutiquement acceptables, solvatés ou hydrates.
De préférence dans les composés de formule (I) :
A et C, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupe choisi parmi une
Figure imgf000014_0002
B représente -(CH2)n-, , -(0-(CH2)2-0-(CH2)2)n- chacun des n, identiques ou différents, est un nombre entier compris entre 1 et 99.
De préférence lorsque A et/ou C représentent -NH-C(0)-NH, NHC(0)(CH2)2, -NH-CO- (CH2)5-NH-CO-CH2 OU -NH-C(O)-, alors R3 et R5 ne représentent pas une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0.
L’ensemble [ABC] ne doit pas altérer l’affinité de L (ligand) pour la protéine MDR cible.
D est choisi parmi les fluorochromes, par exemple BODIPY, cyanines, coumarines, sulfocyanimes, les radionucléides, les nanoparticules, de préférence D est choisi parmi :
Figure imgf000015_0001
Les R, identiques ou différents, sont choisis parmi alkyle, alcényle, aryle, hétéroaryle, hétérocycle, hétéroaryle, alcényle, alcényl-aryl, alcényl-hétéroaryle, alcényl-hétérocycle, alcényl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-hétéroaryle, alkyl-hétérocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl- COOH, alcényl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alcenyl-aryl-O-alkyl-COOH ; les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués, p est compris entre 0 et 3.
Dans le cadre de la présente invention : Alkyle désigne un groupe aliphatique hydrocarboné, saturé, linéaire ou ramifié comprenant, sauf mention contraire, de 1 à 30 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone. A titre d’exemples, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tertbutyle, pentyle.
Alcényle désigne un groupement hydrocarboné linéaire ou ramifié comprenant au moins une double liaison et comprenant de 2 à 24 atomes de carbone. Le groupement alcényle peut être choisi parmi le vinyle, l’allyle, le propényle, le butényle, l’isobutényle, le pentényle, l’isopentényle, l’hexényle, l’heptényle, l’octényle, le nonényle, le décényle, l’undécényle, le dodécényle, le tétradécényle et l’oléique.
Aryle désigne un groupe cyclique, mono ou polycyclique, aromatique comprenant de 6 à 10 atomes de carbone, on peut notamment citer le groupe phényle.
Cycloalkyle désigne un groupe cyclique, mono ou polycyclique, non aromatique, pouvant comprendre au moins une insaturation, comprenant de 3 à 10 atomes de carbone, on peut notamment citer le groupe cyclobenzyle.
Heteroaryle désigne un groupe cyclique, mono ou polycyclique, aromatique, comprenant de 5 à 10 membres dont au moins un hétéroatome choisi parmi N, O ou S, par exemple un hétéroatome, deux hétéroatomes ou trois hétéroatomes.
Hétérocycle désigne un groupe cyclique, mono ou polycyclique, non aromatique, pouvant comprendre au moins une insaturation, comprenant de 3 à 10 membres dont au moins un hétéroatome choisi parmi N, O ou S, par exemple un hétéroatome, deux hétéroatomes ou trois hétéroatomes.
Alkoxy désigne un groupe O-alkyl.
Dans le cas des polycycles, les cycles peuvent être accolés, de type spiro ou pontés.
Les alkyles, aryles, hétéroaryles, hétérocyles, peuvent être substitués par un ou plusieurs substituant notamment choisis parmi les atomes d’halogène, les groupes alkyle, les groupes alkoxy, les groupes NR9R10, NHR9, NH2.
Les sels d’addition pharmaceutiquement acceptables peuvent être des sels d’addition avec des bases tels que les sels de sodium, les sels de potassium, les sels de calcium, lesquels sont obtenus en utilisant des hydroxydes de métaux alcalins et alcalino-terreux correspondants comme bases. Comme autre type de sels d’addition avec des bases pharmaceutiquement acceptables, on peut citer les sels avec des amines et notamment la glucamine, le N-méthylglucamine, le N,N-diméthylglucamine, l’éthanolamine, la morpholine, la N-méthylmorpholine ou la lysine.
Les sels d’addition pharmaceutiquement acceptables peuvent être des sels d’addition avec des acides minéraux ou organiques et de préférence des acides pharmaceutiquement acceptables tels que les acides chlorhydrique, phosphorique, fumarique, citrique, oxalique, sulfurique, ascorbique, tartrique, maléique, mandélique, méthanesulfonique, lactobionique, gluconique, glucarique, succinique, sulfonique ou hydroxypropanesulfonique.
De préférence, dans les composés de formule (I) :
R1 représente -O-alkyle-aryle, -O-alkyle, de préférence -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe ;
R2 représente NHC(0)0-alkyle-aryle, NHC(0)Oalkyle, O-alkyle-aryle, O-alkyle, de préférence NHC(0)0Bn, NHC(0)0tBu, -OBn, -OEt ;
R3 représente C(0)alkyle, alkyle-aryle, alkyle, de préférence C(0)tBu, Bn, Me, Et, Pr ;
R4 représente OH, O-alkyle-aryle, O-alkyle, O-cycloalkyle, de préférence -OH, -OBn, - OtBu, -OEt, -OMe, -OcHex, R4 peut notamment occuper la position 3, 4 ou 5 de l’hétérocycle azoté, avantageusement la position 4 ;
R5 représente H ou un groupe Alkyle ou aryle, les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués.
De préférence lorsque A et/ou C représentent -NH-C(0)-NH, NHC(0)(CH2)2, -NH-CO- (CH2)5-NH-CO-CH2 OU -NH-C(O)-, alors R3 et R5 ne représentent pas une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0.
De préférence, dans les composés de formule (I)
R6 représente NHC(0)CH(alyl-aryl)2 notamment NHC(0)CH[(CH2)3Ph]2 ;
R7 représente -OH, O-alkyl, O-alkyl-aryl, notamment -OH, -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe ;
R8 représente H ou un groupe choisi parmi O-Aryl, O-hétéroaryl, notamment O-phényl, O- quinoléile, les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués.
De préférence, dans les composés de formule (I) :
R1 représente -O-alkyle-aryle, -O-alkyle, de préférence -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe ;
R2 représente NHC(0)0-alkyle-aryle, NHC(0)Oalkyle, O-alkyle-aryle, O-alkyle, de préférence NHC(0)OBn, NHC(0)OtBu, -OBn, -OEt ;
R3 représente C(0)alkyle, alkyle-aryle, alkyle, de préférence C(0)tBu, Bn, Me, Et, Pr ;
R4 représente OH, O-alkyle-aryle, O-alkyle, O-cycloalkyle, de préférence -OH, -OBn, - OtBu, -OEt, -OMe, -OcHex, R4 peut notamment occuper la position 3, 4 ou 5 de l’hétérocycle azoté, avantageusement la position 4 ;
R5 représente H ou un groupe Alkyle ou aryle ; les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués, A et C, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupe choisi parmi une
Figure imgf000018_0001
B représente -(CH2)n-, , -(0-(CH2)2-0-(CH2)2)n- De préférence lorsque A et/ou C représentent -NH-C(0)-NH, NHC(0)(CH2)2, -NH-CO- (CH2)5-NH-CO-CH2 OU -NH-C(O)-, alors R3 et R5 ne représentent pas une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0.
De préférence, dans les composés de formule (I)
R6 représente NHC(0)CH(alyl-aryl)2 notamment NHC(0)CH[(CH2)3Ph]2 ;
R7 représente -OH, O-alkyl, O-alkyl-aryl, notamment -OH, -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe ;
R8 représente H ou un groupe choisi parmi O-Aryl, O-hétéroaryl, notamment O-phényl, O- quinoléile, les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués,
A et C, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupe choisi parmi une
Figure imgf000018_0002
B représente -(CH2)n-, -(0-(CH2)2-0-(CH2)2)n- De préférence, dans les composés de formule (I)
R1 représente -O-alkyle-aryle, -O-alkyle, de préférence -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe ;
R2 représente NHC(0)0-alkyle-aryle, NHC(0)Oalkyle, O-alkyle-aryle, O-alkyle, de préférenceNHC(0)OBn, NHC(0)0tBu, -OBn, -OEt ;
R3 représente C(0)alkyle, alkyle-aryle, alkyle, de préférence C(0)tBu, Bn, Me, Et, Pr ; R4 représente OH, O-alkyle-aryle, O-alkyle, O-cycloalkyle, de préférence -OH, -OBn, - OtBu, -OEt, -OMe, -OcHex, R4 peut notamment occuper la position 3, 4 ou 5 de l’hétérocycle azoté, avantageusement la position 4 ; R5 représente H ou un groupe Alkyle ou aryle ; les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués,
D est choisi parmi les fluorochromes, par exemple des noyaux aromatiques de type BODIPY, cyanines, coumarines, sulfocyanines, les radionucléides, les nanoparticules, de préférence D est choisi parmi :
Figure imgf000019_0001
Les R, identiques ou différents, sont choisis parmi alkyle, alcényle, aryle, hétéroaryle, hétérocycle, hétéroaryle, alcényle, alcényl-aryl, alcényl-hétéroaryle, alcényl-hétérocycle, alcényl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-hétéroaryle, alkyl-hétérocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl- COOH, alcényl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alcenyl-aryl-O-alkyl-COOH ; les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués,
De préférence lorsque A et/ou C représentent -NH-C(0)-NH, NHC(0)(CH2)2,-NH-C0- (CH2)5-NH-CO-CH2 OU -NH-C(O)-, alors R3 et R5 ne représentent pas une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0.
De préférence, dans les composés de formule (I)
R6 représente NHC(0)CH(alyl-aryl)2 notamment NHC(0)CH[(CH2)3Ph]2 ;
R7 représente -OH, O-alkyl, O-alkyl-aryl, notamment -OH, -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe ; R8 représente H ou un groupe choisi parmi O-Aryl, O-hétéroaryl, notamment O-phényl, O- quinoléile, les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués,
D est choisi parmi les fluorochromes, par exemple des noyaux aromatiques de type BODIPY, cyanines, coumarines, sulfocyanines, les radionucléides, les nanoparticules, de préférence D est choisi parmi :
Figure imgf000020_0001
Les R, identiques ou différents, sont choisis parmi alkyle, alcényle, aryle, hétéroaryle, hétérocycle, hétéroaryle, alcényle, alcényl-aryl, alcényl-hétéroaryle, alcényl-hétérocycle, alcényl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-hétéroaryle, alkyl-hétérocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl- COOH, alcényl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alcenyl-aryl-O-alkyl-COOH ; les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués.
De préférence, dans les composés de formule (I) selon l’invention :
A et C, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupe choisi parmi une
Figure imgf000020_0002
B représente -(CH2)n-,
D est choisi parmi les fluorochromes, par exemple BODIPY, cyanines, coumarines, sulfocyanimes, les radionucléides, les nanoparticules, de préférence D est choisi parmi :
Figure imgf000021_0001
Les R, identiques ou différents, sont choisis parmi alkyle, alcényle, aryle, hétéroaryle, hétérocycle, hétéroaryle, alcényle, alcényl-aryl, alcényl-hétéroaryle, alcényl-hétérocycle, alcényl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-hétéroaryle, alkyl-hétérocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl- COOH, alcényl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alcenyl-aryl-O-alkyl-COOH ; les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués, De préférence lorsque A et/ou C représentent -NH-C(0)-NH, NHC(0)(CH2)2, -NH-CO- (CH2)5-NH-CO-CH2 OU -NH-C(O)-, alors R3 et R5 ne représentent pas une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0.
De préférence, dans les composés de formule (I) selon l’invention : R1 représente -O-alkyle-aryle, -O-alkyle, de préférence -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe ;
R2 représente NHC(0)0-alkyle-aryle, NHC(0)Oalkyle, O-alkyle-aryle, O-alkyle, de préférence NHC(0)OBn, NHC(0)OtBu, -OBn, -OEt ;
R3 représente C(0)alkyle, alkyle-aryle, alkyle, de préférence C(0)tBu, Bn, Me, Et, Pr ; R4 représente OH, O-alkyle-aryle, O-alkyle, O-cycloalkyle, de préférence -OH, -OBn, - OtBu, -OEt, -OMe, -OcHex, R4 peut notamment occuper la position 3, 4 ou 5 de l’hétérocycle azoté, avantageusement la position 4 ;
R5 représente H ou un groupe Alkyle ou aryle ; les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués,
A et C, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupe choisi parmi une liaison, C(O), -(CH2)n-, -NH-C(0)-NH, -NH-C(O)-, -0-C(0)-NH-, -O-C(O)-,
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0002
C(0)-0-, -C(0)-NH-, , -NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH2, NHC(0)(CH2)2,
Figure imgf000022_0003
B représente -(CH2)n-, , -(0-(CH2)2-0-(CH2)2)n-
D est choisi parmi les fluorochromes, par exemple BODIPY, cyanines, coumarines, sulfocyanimes, les radionucléides, les nanoparticules, de préférence D est choisi parmi :
Figure imgf000022_0004
Les R, identiques ou différents, sont choisis parmi alkyle, alcényle, aryle, hétéroaryle, hétérocycle, hétéroaryle, alcényle, alcényl-aryl, alcényl-hétéroaryle, alcényl-hétérocycle, alcényl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-hétéroaryle, alkyl-hétérocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl- COOH, alcényl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alcenyl-aryl-O-alkyl-COOH ; les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués,
De préférence lorsque A et/ou C représentent -NH-C(0)-NH, NHC(0)(CH2)2, -NH-CO- (CH2)5-NH-CO-CH2 OU -NH-C(O)-, alors R3 et R5 ne représentent pas une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0.
De préférence, dans les composés de formule (I)
R6 représente NHC(0)CH(alyl-aryl)2 notamment NHC(0)CH[(CH2)3Ph]2 ; R7 représente -OH, O-alkyl, O-alkyl-aryl, notamment -OH, -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe ;
R8 représente H ou un groupe choisi parmi O-Aryl, O-hétéroaryl, notamment O-phényl, O- quinoléyle, les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués,
A et C, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupe choisi parmi une
Figure imgf000023_0001
B représente -(CH2)n-, , -(0-(CH2)2-0-(CH2)2)n-
D est choisi parmi les fluorochromes, par exemple des noyaux aromatiques de type BODIPY, cyanines, coumarines, sulfocyanines, les radionucléides, les nanoparticules, de préférence D est choisi parmi :
Les R, identiques ou différents, sont choisis parmi alkyle, alcényle, aryle, hétéroaryle, hétérocycle, hétéroaryle, alcényle, alcényl-aryl, alcényl-hétéroaryle, alcényl-hétérocycle, alcényl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-hétéroaryle, alkyl-hétérocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl- COOH, alcényl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alcenyl-aryl-O-alkyl-COOH ; les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués.
Lorsque D est BODIPY il peut notamment être choisi parmi :
L’invention va maintenant être décrite plus en détail à l’aide d’exemples et de modes de réalisations pris à titre d’exemples non limitatifs et se référant aux dessins annexés.
Liste des Figures :
_[Fig 1] La figure 1 représente le marquage obtenu avec le composé (3) sur des cellules DU4475 fixées ou non fixées dans les conditions de l’exemple ii1. ns correspond à une différence non significative.
[Fig 2] La figure 2 représente le co-marquage (marquage avec le composé (3) et immuno-marquage anti-Pgp) sur différentes lignées cellulaires selon l’exemple N2.IF composé (3) = intensité de fluorescence mesurée après marquage par le composé (3) ; IF Immun. = intensité de fluorescence mesurée après immunomarquage anti- Pgp ; ns correspond à une différence non significative.
[Fig 3] La figure 3 représente l’analyse de corrélation des signaux du composé (3) et de l’immuno-marquage anti-Pgp selon l’exemple N2.
[Fig 4] La figure 4 représente la quantification de l’augmentation de l’expression de la P-gp induite par l’OIaparib sur les cellules SUM1315 à l’aide du composé (3) selon l’exemple N3. ns correspond à une différence non significative ; **** p<0,0001.
[Fig 5] La figure 5 représente la quantification de l’augmentation de l’expression de la P-gp induite par l’OIaparib sur les cellules SUM1315 à l’aide d’un immuno- marquage anti-Pgp selon l’exemple N3. ns correspond à une différence non significative ; **** p<0,0001.
[Fig 6] La figure 6 représente la quantification de la P-gp avec le composé (3) sur des sphéroïdes SUM1315 après 6 heures d’exposition à l’OIaparib selon l’exemple N4. ***p<0,001. i. EXEMPLES DE SYNTHESE/CARACTERISATION DE COMPOSES DE STRUCTURE GENERALE (I) - Exemple il : Synthèse du composé (3) de formule (I)
Le composé (3) de structure générale (I) est obtenu pas la mise en œuvre du schéma réactionnel suivant :
Figure imgf000026_0001
La synthèse du composé (3) est réalisée en deux étapes à partir du composé peptidique (1). Le composé (1) peut être obtenu par une réaction de couplage peptidique entre une lysine commerciale (CAS 5978-22-3, Fluorochem Ref. 213710) et une 4- hydroxyproline commerciale (CAS 54631-81-1 , Fluorochem Ref. 318294) selon le protocole décrit par Arnaud O., et al. (J Med Chem. 2010; 53: 6720-9).
Lors de la première étape, le composé (2) est obtenu par déprotection sélective du groupement protecteur Boc du composé (1) (500 mg, 1 éq.). Cette déprotection est réalisée dans le dioxane anhydre (10 mL) en présence d’HCI (4N) à température ambiante (dans le reste du texte des exemples on entend par température ambiante des températures de travail comprises entre 15 et 35°C) avec un rendement de 68%, selon une adaptation du protocole décrit par Han G. et al. (J Pept Res Off J Am Pept Soc. 2001; 58: 338-41). Lors de la deuxième étape, le composé (3) est obtenu par couplage entre le composé (2) (10 mg, 1 éq.) et le fluorochrome commercial BODIPY-FL-NHS ™ (CAS 146616-66-2, Lumiprobe Réf. 41420) (1 éq.) présentant une fonction ester NHS. Cette étape réalisée à température ambiante dans le DMF (1 mL) en présence de triéthylamine (2 éq.) permet d’isoler le composé (3) de structure générale (I) avec un rendement de 44% après purification par chromatographie liquide. Le composé (3) est caractérisé par spectrométrie de masse haute résolution (HRMS-ESI, mode positif) : m/z calculé pour C44H55N507BF2 + [M + H]+ 814,4163 ; trouvé 814,4177. - Exemple i2 : Synthèse du composé (4) de formule (I)
Le composé (4) de structure générale (l)est obtenu par la mise en œuvre du schéma réactionnel ci-dessous :
Figure imgf000027_0001
Le composé (4) est obtenu par couplage entre le composé (2) (voir exemple il) (5 mg, 1 éq.) et le fluorochrome commercial DiSulfocyanine3-NHS (CAS 1424150- 38-8, Lumiprobe Réf. 41320) (0.8 éq.) présentant une fonction ester NHS. Cette étape réalisée à température ambiante dans le DMF (500 pL) en présence de triéthylamine (1 éq.) permet d’isoler le composé (4) de structure générale (I) avec un rendement de 94% après purification par chromatographie liquide. Le composé (4) est caractérisé par spectrométrie de masse haute résolution (HRMS-ESI, mode positif) : m/z calculé pour C6OH76N5013S2 + [M + H]+ 1138,4876 ; trouvé 1138,4877.
Exemple i3 : Synthèse du composé (7) de formule (I)
Le composé (7) de structure générale (I) est obtenu par la mise en œuvre du schéma réactionnel ci-dessous :
Figure imgf000028_0001
Le composé (7) peut être obtenu en trois étapes au départ du composé (2) (décrit à l’exemple il).
Lors de la première étape réalisée à 60°C, le composé (2) (230 mg, 1 éq.) est couplé à l’intermédiaire (5) (1 éq.) dont une voie de synthèse est décrite plus loin dans cet exemple. La fonction ester NHS du composé (5) est réactive vis-à-vis de l’amine secondaire du composé (2). Un intermédiaire protégé par un groupement Fmoc est ainsi formé par réaction dans le DMF (25 mL) en présence de triéthylamine (1 éq.). Lors de la deuxième étape, le composé (6) est obtenu par déprotection sélective du groupement protecteur Fmoc. Cette déprotection est réalisée à température ambiante dans une solution de pipéridine (2,4 mL) dans le DMF (12 mL), selon un protocole classique de déprotection d’un groupement Fmoc (Green T. Protective Groups In Organic Synthesis, Third Edition, Wiley).
La troisième étape permet la formation du composé (7). Elle correspond au couplage entre le composé (6) (10 mg, 1 éq.) et le fluorochrome commercial BODIPY- FL-NHS ™ (CAS 146616-66-2, Lumiprobe Réf. 41420) (1,1 éq.) présentant une fonction ester NHS. Comme lors de la procédure décrite à l’exemple 1, cette étape est réalisée à température ambiante dans le DMF (500 pL) en présence de triéthylamine (2 éq.) et permet d’isoler le composé (7) de structure générale (I) avec un rendement de 36% après purification par chromatographie liquide. Le composé
(7) est caractérisé par spectrométrie de masse haute résolution (HRMS-ESI, mode positif) : m/z calculé pour C5oH66N60sBF2 + [M + H]+ 927,5007 ; trouvé 927,4998.
Schéma de synthèse du composé (5)
Une voie de synthèse du composé (5) est décrite sur le schéma ci-dessous :
FmocCl 1½0 / NaHCO
Figure imgf000029_0001
Le composé (5) peut être obtenu en deux étapes au départ du composé commercial acide 6-aminohexanoique (CAS 60-32-2, Fisher Ref. 10578650) (2 g, 1 éq.). Lors de la première étape, la fonction amine primaire est protégée par un groupement Fmoc introduit dans des conditions de Schotten-Baumann selon une procédure classique (J Med Chem. 2010; 53: 6720-9). Lors de la deuxième étape, la fonction acide carboxylique de l’intermédiaire (8) (2,9 g, 1 éq.) est activée en ester NHS pour former le composé (5) avec un rendement de 38%, obtenu à température ambiante par réaction du N-hydroxysuccinimide (1,5 éq.) en présence de diisopropyléthylamine (2 éq.) et de l’agent de couplage dicyclohexylcarbodiimide (1,5 éq.) dans le dichlorométhane (80 mL).
Exemple i4 : Synthèse du composé (13) de formule (I)
Le composé (13) de structure générale (I) est obtenu par la mise en œuvre du schéma réactionnel ci-dessous : Dans un premier temps, la lysine (10) présentant une amine primaire libre est obtenue en deux étapes au départ d’une lysine protégée commerciale (CAS 7750- 45-0, Fluorochem Ref. 471593). Lors de la première étape, la chaîne latérale de la lysine est protégée par un groupement Fmoc introduit dans des conditions de Schotten-Baumann selon une procédure classique décrite à l’exemple i3. Lors de la deuxième étape à température ambiante, la déprotection sélective du groupement Boc du composé (9) (1g, 1 éq.) est réalisée en présence d’HCI (2N) dans le dioxane
(40 mL) pour former la lysine (10) attendue avec un rendement de 56%.
Dans un deuxième temps, le composé peptidique (11) est obtenu par une première étape de couplage entre la lysine (10) (200 mg, 1 éq.) et une 4- hydroxyproline protégée commerciale (CAS 54631-81-1, Fluorochem Ref. 318294) (1 éq.) selon l’adaptation d’une procédure décrite par Arnaud O. et al. (J Biol Chem.
2013; 288: 31761-71). Lors de la deuxième étape, le composé (12) est obtenu par déprotection sélective du groupement protecteur Fmoc du composé (11) (90 mg, 1 éq.). Cette déprotection est réalisée à température ambiante dans une solution de diéthylamine (6 mL) dans le DMF (4 mL) avec un rendement de 58%. La troisième étape permet la formation du composé (13). Elle correspond au couplage entre le composé (12) (8 mg, 1 éq.) et le fluorochrome commercial BODIPY-FL-NHS ™ (CAS 146616-66-2, Lumiprobe Réf. 41420) (1 éq.) présentant une fonction ester NHS. Comme lors de la procédure décrite aux exemples 1 et 4, cette étape est réalisée dans le DMF en présence de triéthylamine et permet d’isoler le composé (13) de structure générale (I) avec un rendement de 12% après purification par chromatographie liquide. Le composé (13) est caractérisé par spectrométrie de masse haute résolution (HRMS-ESI, mode positif) : m/z calculé pour C4iH57Ns07BF2 + [M + H]+ 780,4319 ; trouvé 780,4324. - Exemple Î5 : Synthèse du composé (14) de formule (I)
La synthèse du composé (14) de structure générale (I) est réalisée en trois étapes à partir d’une lysine commerciale (CAS 5978-22-3, Fluorochem Ref. 213710) et d’une proline commerciale (CAS 15761-39-4, Fluorochem Ref. M03314) selon le schéma réactionnel décrit pour le composé (3) dans l’exemple il.
Figure imgf000031_0001
Le composé (14) est caractérisé par spectrométrie de masse haute résolution (HRMS-ESI, mode positif) : m/z calculé pour C37H49N5C>6BF2+ [M + H]+ 708,3738 ; trouvé 708,3749.
Exemple i6 : Synthèse du composé (15) de formule (I) Le composé (15) de formule (I) est obtenu à partir du composé (1) selon des protocoles de synthèse multi-étapes similaires à ceux décrits pour l’exemples i3.
Figure imgf000032_0001
Exemple i7 : Synthèse des composés (17), (18), (19) de formule (I)
Le composé (16) peut être obtenu selon le protocole décrit par Arnaud O., et al. (J Med Chem. 2010; 53: 6720-9).
Figure imgf000032_0002
Les composés (17), (18), (19) de formule (I) sont obtenus à partir du composé (16) selon des protocoles de synthèse multi-étapes similaires à ceux décrits pour les exemples il à i4.
ii. EXEMPLES D’UTILISATION DE COMPOSES DE STRUCTURE GENERALE (I) SUR DES MODELES BIOLOGIQUES
- Exemple ii1 : Utilisation du composé (3) de structure (I) pour la détection de la P-gp sur une lignée de cancer du sein triple Négatif à l’état vivant (non fixée) ou fixée
Matériel
Paraformaldéhyde (PAF) (Sigma® - N° Catalogue P6148)
Phosphate-Buffered Salin (PBS) (Sigma® - N° Catalogue P-3813-10)
Lames de microscope Superfrost Plus™ (Fisher® N° Catalogue J1800AMNZ) Lamelles couvre objet (24x24mm) (Thermo Scientific™ Menzel N° Catalogue LC02424)
Milieu de montage ProLong™ Glass Diamond Antifade (Invitrogen™ N° Catalogue P36965)
Lignées cellulaires de cancer du sein Triple Négatif cultivées dans le milieu préconisé par le fournisseur Lignée DU4475 (ATCC® HTB-123™) : milieu RPMI1640 no glutamine (Gibco®) supplémenté en 10% de Sérum de Veau Fœtal ; 20pg/mL de gentamycine (Panpharma®) et 2mM de L-glutamine (Gibco®)
Instruments de mesure Cytation™ 3MV (Biotek®)
Logiciel Gen5 3.03 (Biotek®)
Protocole de marquage avec le traceur MDR - composé (3)
Après préparation adéquate des échantillons cellulaires (lignée cellulaire DU4475), les cellules sont soit fixées dans une solution de PBS 4% Paraformaldéhyde pendant 20 minutes soit maintenues dans leur milieu de culture adapté. Dans le cas des cellules fixées, trois lavages sont réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C). Pour les deux conditions d’échantillons (non fixés et fixés), les cellules sont ensuite incubées avec le composé (3) à une concentration de 1 mM pendant 1 heure. Trois lavages des cellules sont ensuite réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C).
Protocole d’observation
Les cellules issues des deux conditions de marquage sont observées à l’aide du lecteur de plaque Cytation™3MV (Biotek®) et l’intensité de fluorescence est mesurée par le logiciel Gen5 (Biotek®).
Résultats : Comparaison entre l’état vivant (non fixé) ou fixé, de l’intensité du marquage avec le composé (3) sur la lignée DU4475 (modèle unicellulaire).
A partir des images acquises, les intensités moyennes de fluorescence des deux conditions de marquage (barre noire = cellules non fixées, barre grise = cellules fixées) ont été calculées et sont présentées dans la [Fig 1] Figure 1 (sous la forme moyenne ± écart- type).
Pour les deux conditions, les intensités du signal fluorescent du composé (3) sont similaires (différence non significative). Ces résultats valident l’utilisation du composé (3) sur des échantillons cellulaires à l’état vivant (non fixé) ou fixé. - Exemple ii2 : Utilisation du composé (3) de structure (I) pour l’évaluation du niveau d’expression de la protéine P-gp sur des lignées de cancer du sein triple Négatif par imagerie de fluorescence (échantillons en monocouche fixés).
Des expériences de co-marquage (composé (3) et immunomarquage anti-Pgp) ont été réalisées afin de quantifier et comparer le niveau d’expression de la protéine Pgp de différentes lignées cellulaires de cancer du sein (DU4475, SW527, SUM1315 et HCC1937). Cette expérience permet de confirmer la possibilité de détecter et quantifier l’expression des protéines MDR sur des échantillons de lignées tumorales.
Matériel
Paraformaldéhyde (PAF) (Sigma® - N° Catalogue P6148)
Phosphate-Buffered Salin (PBS) (Sigma® - N° Catalogue P-3813-10) P-glycoprotein Antibody (Clone F4) (Invitrogen® - N° Catalogue MA5-13854) AlexaFluor™ 647 Goat anti-Mouse IgG (H+L) (Invitrogen® - N° Catalogue A21236)
Micro-plaques 8 puits IbiTreat (Ibidi® N° Catalogue 80826)
Lames de microscope Superfrost Plus™ (Fisher® N° Catalogue J1800AMNZ) Lamelles couvre objet (24x24mm) (Thermo Scientific™ Menzel N° Catalogue LC02424)
Milieu de montage ProLong™ Glass Diamond Antifade (Invitrogen™ N° Catalogue P36965)
Lignées cellulaires de cancer du sein Triple Négatif cultivées dans le milieu préconisé par le fournisseur
DU4475 (ATCC® HTB-123™) : milieu RPMI1640 no glutamine (Gibco®) supplémenté en 10% de Sérum de Veau Fœtal ; 20pg/mL de gentamycine (Panpharma®) et 2mM de L-glutamine (Gibco®)
SW527 (ATCC® CRL-7940™) : milieu DMEM (Gibco®) supplémenté en 10% de Sérum de Veau Fœtal et 20pg/mL de gentamycine (Panpharma®)
HCC1937 (ATCC® CRL-2336™) : milieu RPMI1640 no glutamine (Gibco®) supplémenté en 10% de Sérum de Veau Fœtal ; 20pg/mL de gentamycine (Panpharma®) et 2mM de L-glutamine (Gibco®) MDA-MB-231 (ATCC® HTB-26™) : milieu RPMI1640 no glutamine (Gibco®) supplémenté en 10% de Sérum de Veau Fœtal ; 20pg/ml_ de gentamycine (Panpharma®) et 2mM de L-glutamine (Gibco®)
SUM1315M02 (BiolVT®) : milieu Ham’s F-12 medium (Gibco®) supplémenté en 5% de Sérum de Veau Fœtal 20pg/ml_ de gentamycine (Panpharma®) ; 10mM de tampon Hepes (Sigma®) ; 4pg/ml_ d’insuline (Novo Nordisk®) et 10ng/ml_ d’EGF (Sigma®)
Instruments de mesure Cytation™ 3MV (Biotek®)
Logiciel Gen5 3.03 (Biotek®)
Protocole de marquage avec le traceur MDR - composé (3)
Après préparation adéquate des échantillons cellulaires (lignées cellulaires SW527 ; HCC1937 ; DU4475 et SUM1315), ceux-ci sont fixés dans une solution de PBS 4% Paraformaldéhyde pendant 20 minutes. Trois lavages des cellules sont ensuite réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C). Les échantillons cellulaires sont ensuite incubés avec le composé (3) à une concentration de 1 mM pendant 1 heure à 37°C. Trois lavages des cellules sont ensuite réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C).
Protocole d’immunomarquage anti-Pgp par immunofluorescence
Après préparation adéquate des échantillons cellulaires (lignées cellulaires SW527 ; HCC1937 ; DU4475 et SUM1315), les cellules sont incubées pendant 1 heure avec l’anticorps primaire antiP-gp dilué au 1/75 à température ambiante sous agitation lente. Trois lavages des cellules sont réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C). Les cellules sont ensuite incubées pendant 1 heure avec l’anticorps secondaire couplé à AlexaFluor® 647 dilué au 1/800 à température ambiante sous agitation lente. Trois lavages des cellules sont ensuite réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C).
Protocole d’observation
Les deux types de marquages sont observés à l’aide du lecteur de plaque Cytation™3MV (Biotek®). Pour chaque lignée cellulaire, des conditions contrôles sans aucun marquage, avec seulement le marquage du composé (3), avec seulement l’immunomarquage, avec seulement l’anticorps secondaire ont été réalisés, traités et imagés selon le même protocole que pour les autres conditions.
Résultats : Comparaison de l’intensité du marquage du composé (3) et de celle de l’immunomarquage spécifique anti-Pgp, sur différentes lignées de cancer du sein Triple Négatif à l’état unicellulaire fixé et monocouche fixé
A partir des images acquises, les intensités moyennes de fluorescence des 2 signaux (barre noire = Traceur MDR composé 3, barre grise = immunomarquage anti-Pgp) ont été calculées et sont présentées dans la [Fig 2] Figure 2 (sous la forme moyenne ± écart-type).
Pour chaque lignée cellulaire testée, les intensités moyennes de fluorescence du composé (3) et de l’immunomarquage sont comparables (différences d’intensité non significatives, [Fig 2] Figure 2). La droite de régression linéaire entre les intensités des deux signaux présente un coefficient R2 de 0,9943 [Fig 3] (Figure 3). Ces résultats valident l’utilisation du composé (3) en lieu et place de l’immunomarquage anti-Pgp pour évaluer le niveau d’expression de la P-gp.
La lignée DU4475 a présenté des intensités de fluorescence du composé (3) significativement supérieures aux autres lignées testées. Ces résultats témoignent de la sensibilité de la méthode de détection pour évaluer des différences de niveau d’expression de la P-gp entre différentes lignées cellulaires. Ainsi, ces résultats valident l’utilisation du composé (3) pour mettre en évidence une surexpression de la Pgp sur des modèles cellulaires.
- Exemple ii3 : Utilisation du composé (3) de structure (I) pour la quantification d’une augmentation d’expression de la P-gp suite à un traitement anticancéreux à partir d’une lignée de cancer du sein Triple Négatif, cultivée en monocouche (2D) et fixée.
Des expériences d’induction (augmentation de l’expression) de la P-gp ont été réalisées suite à un traitement des cellules de la lignée SUM1315 (monocouche) avec des doses croissantes d’OIaparib, un inhibiteur de Poly-ADP-ribose polymérase 1 (anti-PARP1).
Matériel
Olaparib® (Carbosynth) Paraformaldéhyde (PAF) (Sigma® - N° Catalogue P6148)
Phosphate-Buffered Salin (PBS) (Sigma® - N° Catalogue P-3813-10) P-glycoprotein Antibody (Clone F4) (Invitrogen® - N° Catalogue MA5-13854) AlexaFluor™ 647 Goat anti-Mouse IgG (H+L) (Invitrogen® - N° Catalogue A21236)
Micro-plaques 8 puits IbiTreat (Ibidi® N° Catalogue 80826)
Lignées cellulaires de cancer du sein Triple Négatif cultivées dans le milieu préconisé par le fournisseur
SUM1315M02 (BiolVT®) : milieu Ham’s F-12 medium (Gibco®) supplémenté en 5% de Sérum de Veau Fœtal 20pg/ml_ de gentamycine (Panpharma®) ; 10mM de tampon Hepes (Sigma®) ; 4pg/ml_ d’insuline (Novo Nordisk®) et 10ng/ml_ d’EGF (Sigma®)
Instruments de mesure Cytation™ 3MV (Biotek®)
Logiciel Gen5 3.03 (Biotek®)
Protocole de traitement des cellules avec l’OIaparib
Les cellules SUM1315 en phase exponentielle de croissance sont traitées pendant 3h en absence ou en présence de 10, 50 ou 100 mM d’OIaparib à 37°C en incubateur humide. Un contrôle de solvant DMSO 0,1% est également réalisé dans les mêmes conditions expérimentales.
Protocole de marquage avec le traceur MDR - composé (3)
Après préparation adéquate des échantillons cellulaires SUM1315 traités, ceux-ci sont fixés dans une solution de PBS 4% Paraformaldéhyde pendant 20 minutes. Trois lavages des cellules sont ensuite réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C). Les échantillons cellulaires sont ensuite incubés avec le composé (3) à une concentration de 1 pM pendant 1 heure. Trois lavages des cellules sont ensuite réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C). Protocole d’immunomarquage anti-Pgp par immunofluorescence
Après préparation adéquate des échantillons cellulaires, les cellules sont incubées pendant 1 heure avec l’anticorps primaire antiP-gp dilué au 1/75 à température ambiante sous agitation lente. Trois lavages des cellules sont réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C). Les cellules sont ensuite incubées pendant 1 heure avec l’anticorps secondaire couplé à AlexaFluor® 647 dilué au 1/800 à température ambiante sous agitation lente. Trois lavages des cellules sont ensuite réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C).
Protocole d’observation
Les deux types de marquages (composé (3) et immunomarquage anti-P-gp) sont observés à l’aide du lecteur de plaque Cytation™3MV (Biotek®).
Résultats : Comparaison de l’augmentation de l’expression de la P-gp à l’aide du marquage avec le composé (3) et de l’immunomarquage anti-P-gp, suite à un traitement des cellules de la lignée SU M 1315 en monocouche par l’OIaparib.
A partir des images acquises, les intensités moyennes de fluorescence des 2 signaux ont été calculées et sont présentées pour chacune des doses d’OIaparib dans la [Fig 4] Figure 4 pour le marquage avec le composé (3) et dans la [Fig 5] Figure 5 pour l’immunomarquage anti-P-gp (sous la forme moyenne ± écart-type).
Pour les deux marquages, une augmentation significative de l’expression de la P-gp est détectée en présence de 50 et 100 mM d’OIaparib, comparée au contrôle DMSO 0,1%. Ces résultats valident l’utilisation du composé (3) pour la quantification de l’induction de la P-gp suite à un traitement anticancéreux spécifique sur un modèle cellulaire monocouche fixé.
- Exemple ii4 : Utilisation du composé (3) de structure (I) pour la quantification d’une augmentation d’expression de la P-gp suite à un traitement anticancéreux à partir d’une lignée de cancer du sein Triple Négatif cultivée en 3D (sphéroïdes).
Des expériences d’induction (augmentation de l’expression) de la P-gp ont été réalisées suite à un traitement des sphéroïdes (culture 3D) issus de la lignée SUM1315 avec des doses croissantes d’OIaparib, un inhibiteur de Poly-ADP-ribose polymérase 1 (anti-PARP1).
Matériel
Olaparib® (Carbosynth)
Paraformaldéhyde (PAF) (Sigma® - N° Catalogue P6148)
Phosphate-Buffered Salin (PBS) (Sigma® - N° Catalogue P-3813-10) P-glycoprotein Antibody (Clone F4) (Invitrogen® - N° Catalogue MA5-13854) AlexaFluor™ 647 Goat anti-Mouse IgG (H+L) (Invitrogen® - N° Catalogue A21236)
Micro-plaques 8 puits IbiTreat (Ibidi® N° Catalogue 80826)
Microplaques 96 puits Ultra Low Attachement (Corning® 4520)
Lignées cellulaires de cancer du sein Triple Négatif cultivées dans le milieu préconisé par le fournisseur
SUM1315M02 (BiolVT®) : milieu Ham’s F-12 medium (Gibco®) supplémenté en 5% de Sérum de Veau Fœtal 20pg/ml_ de gentamycine (Panpharma®) ; 10mM de tampon Hepes (Sigma®) ; 4pg/ml_ d’insuline (Novo Nordisk®) et 10ng/ml_ d’EGF (Sigma®)
Instruments de mesure Cytation™ 3MV (Biotek®)
Logiciel Gen5 3.03 (Biotek®)
Protocole de traitement des cellules avec l’OIaparib
Des sphéroïdes ont été formés à partir de cellules de la lignée SUM1315. Après 3 jours de culture, les sphéroïdes sont traitées pendant 6h en présence de 10, 50 ou 100 mM d’OIaparib à 37°C en incubateur humide. Un contrôle de solvant DMSO 0,1% est également réalisé dans les mêmes conditions expérimentales.
Protocole de marquage avec le traceur MDR - composé (3)
Après préparation adéquate des sphéroïdes SUM1315, ceux-ci sont fixés dans une solution de PBS 4% Paraformaldéhyde pendant 12 heures. Les sphéroïdes sont ensuite incubés avec le composé (3) à une concentration de 1 mM pendant 1 heure et 30 minutes. Trois lavages des cellules sont ensuite réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C).
Protocole d’observation
Les deux types de marquages (composé (3) et immunomarquage anti-P-gp) sont observés à l’aide du lecteur de plaque Cytation™3MV (Biotek®).
Résultats : Comparaison de l’augmentation d’expression de la P-gp à l’aide du marquage avec le composé (3) selon différentes doses d’OIaparib sur des sphéroïdes SUM1315.
A partir des images acquises, les intensités moyennes de fluorescence du signal ont été calculées et sont présentées pour chacune des doses d’OIaparib dans la [Fig 6] Figure 6 (sous la forme moyenne ± écart-type).
Une augmentation significative de l’expression de la P-gp est détectée en présence de 10, 50 et 100 mM d’OIaparib, comparée au contrôle DMSO 0,1%. Ces résultats valident l’utilisation du composé (3) pour la quantification de l’induction de la P-gp suite à un traitement anticancéreux spécifique sur un modèle de sphéroïde.
- Exemple ii5 : Utilisation des composés (4), (7), (13) et (14) de structure (I) pour la détection de la P-gp sur deux lignées de Cancer du Sein Triple Négatif cultivées en monocouche.
Des expériences de marquage de la P-gp ont été réalisées avec les composés (4), (7), (13) et (14) en comparaison avec le marquage du composé (3) afin de démontrer leur efficacité.
Matériel
Paraformaldéhyde (PAF) (Sigma® - N° Catalogue P6148)
Phosphate-Buffered Salin (PBS) (Sigma® - N° Catalogue P-3813-10) Micro-plaques 8 puits IbiTreat (Ibidi® N° Catalogue 80826)
Lignées cellulaires de cancer du sein Triple Négatif cultivées dans le milieu préconisé par le fournisseur SW527 (ATCC® CRL-7940™) : milieu DM EM (Gibco®) supplémenté en 10% de Sérum de Veau Fœtal et 20pg/mL de gentamycine (Panpharma®)
SUM1315M02 (BiolVT®) : milieu Ham’s F-12 medium (Gibco®) supplémenté en 5% de Sérum de Veau Fœtal 20pg/mL de gentamycine (Panpharma®) ; 10mM de tampon Hepes (Sigma®) ; 4pg/mL d’insuline (Novo Nordisk®) et 10ng/mL d’EGF (Sigma®)
Protocole de marquage avec le traceur MDR - composé (3)
Après préparation adéquate des échantillons cellulaires, ceux-ci sont fixés dans une solution de PBS 4% Paraformaldéhyde pendant 20 minutes. Les cellules sont ensuite incubées avec le composé (3), (4), (7), (13) ou (14) à une concentration de 1 mM pendant 1 heure. Trois lavages des cellules sont ensuite réalisés avec une solution de PBS maintenue à température ambiante (proche de 20°C).
Protocole d’observation
Les deux types de marquages (composé (3) et immunomarquage anti-P-gp) sont observés à l’aide du lecteur de plaque Cytation™3MV (Biotek®).
Instruments de mesure Cytation™ 3MV (Biotek®)
Logiciel Gen53.03 (Biotek®)
Résultats : Utilisation des composés (4), (7), (13) et (14) de structure (I) pour la détection de la P-gp sur deux lignées de Cancer du Sein Triple Négatif cultivées en monocouche et fixées.
A partir des images acquises, la capacité de chacun des composés testés à marquer la P-gp a été démontrée et est indiquée par un « + » pour chaque lignée dans le tableau 1 ci-dessous [Tableau 1]
Figure imgf000043_0001
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Claims

REVENDICATIONS 1. Composé de formule (I) L-[ABC]m-D (I) dans laquelle : m représente 0 ou 1
L représente un ligand susceptible de se lier aux protéines MDR, L est
Figure imgf000046_0001
- un groupe de formule (II) :
Figure imgf000046_0002
dans laquelle
X représente un groupe -CH2- ou C(O)
R1 représente H ou un groupe choisi parmi -OH, O-alkyle, O-alcényl, O-aryl, O-hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, -alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl- cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle- aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, O-alkyl- aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl-hétérocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O- alcényle-hétéroaryl, O-alcényle-hétérocycle, O-alcényle-cycloalkyl, NH-alkyl, NH-alcényle, NH-aryl, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH-cycloalkyle, NR9R10, ;
R2 représente H ou un groupe choisi parmi -OH, -IMH2, O-Alkyl, O-alcényl, O-hétéroaryl, O- cycloalkyl, O-hétérocycle, O-Aryl, O-Alkyl-Aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl-hétérocycle, O- alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle-hétérocycle, O- alcényle-cycloalkyl, -Alkyl-Aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl-cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, NH-Alkyl, NH-alcényle, NH-Aryl, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH-cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, N- alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle- hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, NR9R10, NHC(0)OAIkyl, NHC(0)OAIcényl, NHC(0)Ocycloalkyle, NHC(0)Ohétérocycle, NHC(0)Ohétéroaryl, NHC(0)0Aryl, NHC(0)0-alkyl-aryl, NHC(0)0-alkyl-hétéroaryl, NHC(0)0-alkyl- hétérocycle, NHC(0)0-alkyl-cycloalkyl, NHC(0)0-alcényl-aryl, NHC(0)0-alcényl- hétéroaryl, NHC(0)0-alcényl-hétérocycle, NHC(0)0-alcényl-cycloalkyl, NHC(0)NHAIkyl, NHC(0)NHAIcényle, NHC(0)NHAryl, NHC(0)NHhétéroaryle, NHC(0)NHcycloalkyl, NHC(0)NHhétérocycle, ;
R3 représente H ou un groupe choisi parmi alkyle, alcényle, aryl, hétéroaryle, cycloalkyl, hétérocycle, alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl-cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl- hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle- hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, C(0)alkyl, C(0)aryl, C(0)alcényle, C(0)hétéroaryle, C (O) hétérocycle, C(0)cycloalkyle, C(0)0alkyl, C(0)0aryl, C(0)Oalcényle, C(0)Ocycloalkyl, C(0)Ohétéroaryl, C(0)Ohétérocycle, C(0)NHalkyl, C(0)NHaryl, C(0)NHhétéroaryi, C(O) N H hétérocycle, C(0)NHcycioaikyle, C(0)NHalcényle;
R4 représente H ou un groupe choisi parmi -SH, -OH, O-alkyl, O-aryl, O-alcényl, O- hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, -O-alkyl-aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl- hétérocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle- hétérocycle, O-alcényle-cycloalkyl, -alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl- cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéraryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, -O- cycloalkyl, O-alkyl, O-alcényl, O-aryl, O-hétéroaryl, O-hétérocycle, -NH2, NH-Alkyl, NH- Aryl, NH-alcényle, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH-cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl- hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle- hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle-cycloalkyl, NR9R10, R4 pouvant occuper la position 3, 4 ou 5 de l’hétérocycle azoté, avantageusement la position 4 ;
R5 représente H ou un groupe alkyle ou aryle ; avec la condition qu’au moins un des R1, R2, R3, R4 ou R5 représente une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0 ;
R9 et R10, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle, alcényle, hétérocycle, hétéroaryl, cycloalkyle, alkyl-aryl, alyl-hétéroaryl, alkyl-hétérocycle, alkyl-cycloalkyle, alcényle-aryl, alcényle-hétéroaryl, alcényle-hétérocycle, alcényle-cycloalkyle,
- ou un groupe de formule (III)
Figure imgf000048_0001
dans laquelle
R6 représente H ou un groupe choisi parmi -OH, -NH2, O-Alkyl, O-Aryl, O-alcényl, O- hétéroaryl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, O-alkyl-aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl- hétérocycle, O-alkyl-cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle- hétérocycle, O-alcényle-cycloalkyl, NH-Alkyl, NH-Aryl, NH-alcényle, NH-hétéroaryl, NH- hétérocycle, NH-cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH- alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH- alcényle-cycloalkyl, NRR’, NHC(0)OAIkyl, NHC(0)0Aryl, NHC(0)OAIcényl, NHC(0)Ocycloalkyle, NHC(0)Ohétérocycle, NHC(0)Ohétéroaryl, NHC(0)0-aikyi-aryl,
NHC(0)0-aikyi-hétéroaryl, NHC(0)0-aikyi-hétérocycle, NHC(0)0-alkyl-cycloaikyl, NHC(0)0-aicényi-hétéroaryl, NHC(0)0-alcényl-hétérocycie, NHC(0)0-alcényl-cycloaikyl, NHC(0)NHAicényie, NHC(0)NHhétéroaryie, NHC(0)NHcycioaikyl,
N HC(O) N H hétérocycle, NHC(0)NHAIkyl, NHC(0)NHAryl, NHC(0)CH(alyi-aryl)2 R7 représente H ou un groupe choisi parmi -OH, O-alkyl, O-aryl, O-alcényl, O-hétéroaryl,
O-cycloalkyl, O-hétérocycle, O-alkyl-aryl, O-alkyl-hétéroaryl, O-alkyl-hétérocycle, O-alkyl- cycloalkyl, O-alcényle-aryl, O-alcényle-hétéroaryl, O-alcényle-hétérocycle, O-alcényle- cycloalkyl, NH2, NH-Alkyl, NH-Aryl, NH-alcényle, NH-hétéroaryl, NH-hétérocycle, NH- cycloalkyle, NH-alkyl-aryl, NH-alkyl-hétéroaryl, NH-alkyl-hétérocycle, NH-alkyl-cycloalkyl, NH-alcényle-aryl, NH-alcényle-hétéroaryl, NH-alcényle-hétérocycle, NH-alcényle- cycloalkyl, NR9R10, ;
R8 représente H ou un groupe choisi parmi Alkyl, Aryl, alcényle, hétéroaryle, hétérocycle, cycloalkyle, alkyl-aryl, -alkyl-hétéroaryl, -alkyl-hétérocycle, -alkyl-cycloalkyl, alcényle-aryl, alcényle-hétéraryl, alcényle-cycloalkyle, alcényle-hétérocycle, O-Alkyl, O-Aryl, O- hétéroaryl, O-alcényl, O-cycloalkyl, O-hétérocycle, C(0)Alkyl, C(0)Aryl, C(0)hétéroaryl,
C(0)alcényle, C(0)hétérocycle, C(0)cycloalkyle, C(0)0Alkyl, C(0)0Aryl, C(0)Oalcényle, C(0)Ohétérocycle, C(0)Ohétéroaryle, C(0)Ocycloalkyle, C(0)NHAIkyl, C(0)NHAIcényle, C(0)NHAryl, C(0)NHhétérocycle, C(0)NHhétéroaryle, C(0)NHcycloalkyle, notamment O- phényl, O-quinoléile avec la condition qu’au moins un des R6, R7, R8 représente une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0 ; [ABC] représente un groupe de 1 à 500 atomes et peut être compris d’atomes ou groupes d’atomes tels que hydrogène et carbone, amino, amido, alkylamido, oxygène, polyéthylène glycol (PEG), peptide, peptoïde, soufre, sulfoxyde, sulfonyl, carbonyl, imine, [ABC] peut présenter des groupements saturés, insaturés et des systèmes cycliques aromatiques, les systèmes cycliques aromatiques peuvent être polycycliques et/ou hétéroaromatiques contenant 1 à 4 hétéroatomes comme par exemple N, S, O ;
D est un agent détectable choisi parmi des petites molécules organiques, des nanoparticules, des radionucléides, des espèces fluorescentes, bioluminescentes, chimioluminescentes, magnétiques, D peut être un agent détectable en tant que tel ou bien rendu détectable après une réaction chimique telle qu’une activation biologique par exemple réaction enzymatique, à condition que D ne soit pas un groupe
Figure imgf000049_0001
les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués, lorsque A et/ou C représentent -NH-C(0)-NH, -NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH2, NHC(0)(CH2)2, ou -NH-C(O)-, alors R3 et R5 ne représentent pas une liaison avec le groupe [ABC] lorsque m représente 1 ou avec D lorsque m représente 0 leurs énantiomères, diastéréoisomères, sels pharmaceutiquement acceptables, solvatés ou hydrates.
2. Composé selon la revendication 1 dans laquelle A et C, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupe choisi parmi une liaison, C(O), - B représente -(CH2)n-, , -(0-(CH2)2-0-(CH2)2)n- chacun des n, identiques ou différents, est un nombre entier compris entre 1 et 99.
3. Composé selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle D est choisi parmi les fluorochromes, par exemple BODIPY, cyanines, coumarines, sulfocyanimes, les radionucléides, les nanoparticules, de préférence D est choisi parmi :
Figure imgf000050_0001
Les R, identiques ou différents, sont choisis parmi alkyle, alcényle, aryle, hétéroaryle, hétérocycle, hétéroaryle, alcényle, alcényl-aryl, alcényl-hétéroaryle, alcényl-hétérocycle, alcényl-cycloalkyl, alkyl-aryl, alkyl-hétéroaryle, alkyl-hétérocycle, alkyl-cycloalkyl, alkyl- COOH, alcényl-COOH, aryl-O-alkyl-COOH, alcenyl-aryl-O-alkyl-COOH ; les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués, p est compris entre 0 et 3.
4. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel R1 représente -O-alkyle-aryle, -O-alkyle, de préférence -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe ;
R2 représente NHC(0)0-alkyle-aryle, NHC(0)Oalkyle, O-alkyle-aryle, O-alkyle, de préférence NHC(0)OBn, NHC(0)OtBu, -OBn, -OEt ;
R3 représente C(0)alkyle, alkyle-aryle, alkyle, de préférence C(0)tBu, Bn, Me, Et, Pr ;
R4 représente OH, O-alkyle-aryle, O-alkyle, O-cycloalkyle, de préférence -OH, -OBn, - OtBu, -OEt, -OMe, -OcHex, R4 pouvant occuper la position 3, 4 ou 5 de l’hétérocycle azoté, avantageusement la position 4 ;
R5 représente H ou un groupe Alkyle ou aryle, les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués.
5. Composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel, dans les composés de formule (I)
R6 représente NHC(0)CH(alyl-aryl)2 notamment NHC(0)CH[(CH2)3Ph]2 ;
R7 représente -OH, O-alkyl, O-alkyl-aryl, notamment -OH, -OBn, -OtBu, -OEt, -OMe ;
R8 représente H ou un groupe choisi parmi O-Aryl, O-hétéroaryl, notamment O-phényl, O- quinoléile, les hétérocycles, hétéroaryle, cycloalkyle, aryle sont substitués ou non substitués.
6. Méthode in vitro de détection, de localisation et/ou de quantification de protéines de multirésistance aux médicaments (MDR) associées à des cellules, dans un échantillon contenant des cellules procaryotes ou eucaryotes exprimant ou susceptibles d’exprimer des protéines MDR, la méthode comprenant :
- l’ajout à l’échantillon en milieu liquide ou comprenant une phase liquide d’un traceur MDR apte à se fixer aux protéines MDR,
- l’incubation de l’échantillon avec ce traceur MDR, ce grâce à quoi le traceur MDR se fixe aux protéines MDR lorsqu’elles sont présentes,
- l’élimination du traceur non fixé à des protéines MDR,
- la détection, la localisation et/ou la quantification du traceur fixé à des protéines MDR. dans laquelle le traceur MDR est un composé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5
7. Méthode selon la revendication 6, dans laquelle la protéine MDR est la P- gp-
8. Méthode selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7, dans laquelle l’incubation de l’échantillon avec ledit traceur MDR a une durée qui est comprise entre 1 minute et 24 heures ; l’élimination du traceur MDR non fixé aux protéines MDR est réalisée par élimination du milieu liquide de l’échantillon et lavage des cellules contenues dans l’échantillon ; et/ou le traceur MDR est ajouté à l’échantillon en quantité de 1 nM à 100 mM, notamment de 100 nM à 10 mM pour de 1 cellule à 109 cellules.
9. Méthode selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, dans laquelle l’échantillon comprend un extrait cellulaire, une suspension de cellules, des cellules adhérentes à un support de culture, une culture cellulaire monocouche ou multicouches, une culture cellulaire en 3D, un sphéroïde, un tissu biologique, un organisme pluricellulaire.
10. Méthode selon l’une quelconque des revendications 6 à 9, dans laquelle l’échantillon comprend des cellules cancéreuses de patient, une biopsie de cancer de patient, des cellules de lignée cancéreuse, une tumeur artificielle.
11. Méthode selon l’une quelconque des revendications 6 à 10 , dans laquelle, à l’aide du traceur MDR :
- l'on détecte la présence de protéines MDR dans l’échantillon,
- l’on détecte la liaison du traceur MDR à une protéine MDR en intracellulaire
- l’on localise la présence de protéines MDR dans l’échantillon,
- l’on quantifie le niveau d’expression des protéines MDR dans l’échantillon,
- l’on localise des niveaux d’expression des protéines MDR dans l’échantillon, ou
- l’on compare le niveau d’expression des protéines MDR dans des prélèvements de cellules ou de tissus (biopsies) provenant du même patient à des moments différents, et l’on détermine la réponse du patient à un traitement, en particulier la réponse de la tumeur à un traitement anticancéreux ou l’apparition de résistance à un traitement médicamenteux.
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