WO2021054789A1 - 신규 키메라 항원 수용체 암호화 유전자가 형질도입된 유전자 변형 nk 세포주 및 그의 용도 - Google Patents

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WO2021054789A1
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김세원
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Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified immune cell line transformed with a chimeric antigen receptor-encoding gene and its use, and in more detail, a novel chimeric antigen receptor-encoding gene with improved anti-cancer activity, particularly against acute myelogenous leukemia, is transduced. It relates to genetically modified NK cell lines and uses thereof.
  • Cancer immune cell therapy is a treatment technology that suppresses and removes the proliferation of cancer cells by extracting and proliferating the cancer patient's own immune cells and then administering them to the patient again.
  • various types of immune cells dendritic cells (DCs), natural killer cells (NKs), and cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are mainly used for cancer immune cell therapy.
  • DCs dendritic cells
  • NKs natural killer cells
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • CTLs have the advantage of having an immunological memory function, antigen specificity, and excellent in vivo proliferation ability, and thus relatively many studies are being conducted compared to dendritic cells and natural killer cells.
  • T cell therapy drugs are being developed up to the 3rd generation until now, but the first generation T cell therapy is effective because all T cells (bulk T cells) present in blood or cancer tissues are proliferated and administered to patients. It was not expected, and the second generation T cell therapy showed enhanced therapeutic effect by separating/mass culturing only tumor antigen-specific T cells and administering them to cancer patients.
  • the problem of the complexity of the process has been raised, and the third-generation T-cell therapy is either 1) directly introducing a TCR gene that recognizes a specific cancer antigen into T cells, or 2) the antigen recognition site of a monoclonal antibody that recognizes a specific antigen (scFv).
  • the T cell activation domain By binding the T cell activation domain to the T cell and introducing it into T cells, not only the antigen specificity was increased and the manufacturing period was shortened, but the therapeutic efficacy was also very excellent, and the therapeutic effect of close to 100% in some leukemias and lymphomas was achieved. Induced.
  • the third generation T cell therapy as described above is characterized by genetically engineered to express the so-called chimeric antigen receptor (hereinafter, abbreviated as'CAR'). Does not exist.
  • CAR' chimeric antigen receptor
  • CAR-introduced T cell technology Based on the above CAR-introduced T cell technology, the leading companies of Novartis, Juno Therapeutics, and Kite Pharma of the United States all developed CAR-introduced T cells targeting CD19, a B cell-specific antigen. It has been positioned as a leader in the field of targeted immune cell therapy by showing a high cure rate approaching 80 to 90% in constituent leukemia (ALL) and non-Hodgkin's lymphoma (NHL) (Hartmann et al ., EMBO Mol. Med. 9 (9): 1183-1197, 2017).
  • ALL constituent leukemia
  • NHS non-Hodgkin's lymphoma
  • Natural killer cell lines are based on unlimited scalability, cell uniformity, product stability (especially after freeze/thaw) and batch-to-batch consistency, and are a commercially attractive quality-controlled immunotherapy platform without any modification.
  • NK-92 is a representative NK cell line with the most intensive characterization that has been approved for clinical trials by the FDA (Klingemann et al. , Front.Immunol. 7: 91, 2016).
  • NK-92 cells can proliferate in a feeder-independent manner of xenogeneic cells (Arai et al ., Cytother. 10: 625-632, 2008).
  • NK-92 The therapeutic dose was reached within 3 weeks of up to 10 9 cells per 1 L culture bag (Arai et al ., Cytother. 10: 625-632, 2008).
  • repeated administration of NK-92 at a dose of up to 5x10 9 cells/m 2 every other day (three infusions in a cycle of up to 6 months) has been found to be safe and well tolerated (Williams et al ., Oncotarget 8: 89256-68928 , 2017), the value as a platform for adoptive cell transfer has further increased.
  • NK-92 injection only 2 out of 39 patients treated showed limited clinical efficacy as reported (Yang et al ., J. Immunother. Cancer 7: 138, 2019).
  • NK cell line-based therapy is further decreasing (Zhang et al ., Front. Immunol. 8: 533, 2017; Tang et al ., Am. J. Cancer Res . 8: 1083-1089, 2018; Qu et al ., MRS Commun. 9: 433-440, 2019).
  • numerous efforts have been made to improve the function of NK cell lines, especially through genetic engineering.
  • NK cell lines can be classified into four categories that focus on enhancing tumor recognition and killing activity: first, cytolytic activity of NK cell lines by the introduction of missing activation or co-stimulatory receptor expression. It has been shown to recover. Liu et al. induced surface expression of CD11a/CD18 ⁇ heterodimer (LFA-1) by transfecting the CD18 gene into YT-1(-), a mutant NK cell line, and as a result demonstrated an increase in cytotoxicity to Raji cells. This is probably the result achieved by promoting adhesion to LFA-1-mediated tumor cells (Liu et al ., Cell Immunol . 156: 24-35, 1994).
  • LFA-1 CD11a/CD18 ⁇ heterodimer
  • IL-15 genetic modification induced increased tumor killing activity with IFN- ⁇ secretion in both NKL and NK-92 (Jiang et al. , Immunobiol . 219: 547-553, 2014; Zhang et al. ., Haematologica 89: 338-347, 2004).
  • a bait receptor for an inhibitory molecule was inserted into the NK cell line. Yang et al.
  • NK-92 modified to express the dominant negative TGF- ⁇ type 2 receptor (DNT ⁇ RII) became resistant to the TGF- ⁇ -mediated inhibitory effect, and thus the parental NK- It was shown to exhibit superior anticancer effect than 92 cell lines (Yang et al . Int. Immunopharmacol . 17: 198-204, 2013).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • anti-CD19-CAR modifications caused NK-92 cells to restore cytotoxicity to previously resistant B cell leukemia cell lines (Boissel et al ., Leuk. Res . 33: 1255-1259, 2009; Romanski et al ., J.
  • AML acute myeloid leukemia
  • AML is a cancer in which myeloid cells develop into a malignant tumor. Abnormal white blood cells proliferate and accumulate in the bone marrow. It is a disease that leads to death.
  • Treatment of AML is divided into remission-induced chemotherapy to obtain complete remission by reducing leukemia cells to the extent that normal hematopoietic function is restored, and postremission therapy to prevent recurrence after remission.
  • the present invention is intended to solve various problems including the above problems, and is a genetically modified NK cell line transformed to simultaneously express a novel chimeric antigen receptor and apoptotic gene effective for the treatment of cancer, particularly acute myeloid leukemia, and the genetically modified NK
  • An object of the present invention is to provide a method for treating cancer using a cell line.
  • a polynucleotide encoding an FLT3-specific chimeric antigen receptor is transduced into an isolated NK cell line having the following characteristics to provide a genetically modified NK cell line expressing the FLT3-specific chimeric antigen receptor. :
  • CD2, CD7, CD11a, CD25, CD28, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L and CD56 are positive;
  • CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD23, CD34, TCR ⁇ and TCR ⁇ are negative.
  • a cell therapy agent for cancer treatment comprising a therapeutically effective amount of the genetically modified NK cell line as an active ingredient.
  • kits for cancer treatment comprising the genetically modified NK cell line and a suicide inducer.
  • a method for treating cancer in an individual comprising administering a therapeutically effective amount of the genetically modified NK cell line and optionally a suicide inducer to an individual in need of treatment for cancer.
  • a kit for cancer treatment comprising a genetically modified immune cell expressing a FLT3-specific chimeric antigen receptor protein and apoptosis gene simultaneously and the genetically modified immune cell and a suicide inducer according to an embodiment of the present invention is very effective in killing cancer cells. Since it is efficient, it can be used as a new immunocytotherapy agent for the treatment of cancer, especially acute myelogenous leukemia, which is a type of existing refractory cancer.
  • FIG. 1A is a graph showing the degree of cell proliferation according to the passage of the NK101 cell line of the present invention
  • FIG. 1B is a dot graph confirming that the NK101 cells are CD3, CD20, and CD16 negative and CD56 positive NK cells.
  • FIG. 1C is a photograph of the morphology of NK101 cells identified during cultivation of the NK101 cells using a microscope
  • FIG. 1D is a photograph of the morphology of NK101 cells using Wright-Giemsa staining
  • FIG. It is a photograph confirming the expression of Perforin (green) and Granzyme (red), which are major apoptosis factors of NK cells, through a fluorescent staining technique.
  • FIG. This is a graph showing the results confirmed through NK101 co-culture.
  • Figure 2a is a graph comparing and analyzing the IL-2 concentration-dependent cell growth rate and sensitivity of NK101 and NK-92 using MTS analysis
  • Figure 2b is a flow cytometric difference in the expression level of the IL-2 receptor subunits of NK101 and NK-92. It is a series of histograms confirmed using the analysis
  • Figure 2c is a graph showing the results of comparing the cell proliferation and survival rate under the same culture conditions from the time of thawing of NK101 and NK-92
  • Figure 2d shows the degree of proliferation and doubling time after culture adaptation. It is a graph shown in comparison.
  • FIG. 3A is a series of histograms showing the results of flow cytometry for the expression of major lineages or progenitor markers in NK101 cells
  • FIG. 3B is a flow cytometry result for the expression of activating receptors and inactivating receptors in NK101 cells.
  • Is a series of histograms
  • FIG. 3C is a series of histograms showing the results of flow cytometry for cell adhesion factor expression in NK101 cells
  • FIG. 3D is CD107a, perforin, which are involved in NK cell-dependent cytotoxicity in NK101 cells.
  • Granzyme a series of histograms showing the results of flow cytometry for expression of FasL and TRAIL
  • Figure 3e is a series of histograms showing the results of flow cytometry for expression of cytokine receptors in NK101 cells
  • Figure 3f is a variety of NK101 cells It is a series of histograms showing the results of flow cytometry for CC chemokine receptor and CXC chemokine receptor expression.
  • Figure 4a is a histogram showing the results of flow cytometry confirming the expression of CD56 in NK101, NK-92 and first cultured CD56 + peripheral blood NK cells
  • Figure 4b is a two-dimensional contour line showing the results of flow cytometry confirming the expression of CD56 and CD62L of the cells. It is a graph.
  • Figure 5a is a graph showing the result of confirming the proliferation rate of NK101 cells by MTS analysis after treatment with each labeled cytokine in a culture medium for 3 days (left) and a graph showing the result of confirming the production of NK-activated cytokine IFN- ⁇ by ELISA (Right), and Figure 5b is a graph showing the results of confirming the secreted cytokines after co-culture with K562 or THP-1 cancer cell line for 24 hours with NK101 cells by the Multiplex analysis method.
  • Figure 6a is a graph showing the result of confirming the degree of death of cancer cells by co-culturing various cancer cell lines and NK101 cells at various cell ratios for 24 hours.
  • FIG. 6C is a graph showing the treatment of neutralizing antibodies against the surface antibodies indicated on NK101 cells, respectively, and chronic myelogenous leukemia cell lines K562 and 4
  • FIG. 6D is a 4:1 ratio with acute lymphocytic leukemia cell line Jurkat treated with neutralizing antibodies to the surface antibodies respectively labeled on NK101 cells. It is a graph showing the result of measuring apoptosis after co-culture for 24 hours with NK101, and FIG. 6E is a graph showing the result of simultaneous neutralization of each marker after treating NK101 with DNAM-1, CD54 or DNAM-1 and CD54 neutralizing antibodies, respectively. This is a graph showing the results of confirming synergistic inhibition.
  • FIG. 7 shows the structures of lentiviral transfer plasmids (A: pBD-7.28.CD, B: pBD-15.TN, and C: pBD-CAR) used for preparing a lentivirus according to an embodiment of the present invention. It is a schematic series of vector maps.
  • FIG. 8A is a histogram showing the results of confirming the expression patterns of CD7 and CD28 co-stimulatory factors in NK101 and the previously constructed cell lines KHYG-1, and NK-92 through flow cytometry
  • FIG. 8B is shown in FIG. 7B.
  • It is a histogram showing the result of confirming the expression of CD7 and CD28 in NK101 cells (named NK101-7.28.CD) into which the gene construct was introduced through flow cytometry
  • FIG. 8C is a histogram showing CD expression in NK101-7.28.CD cells. It is a picture showing the results confirmed through reverse transcription PCR, and FIG.
  • FIG. 8D is a CD80 (Sk-MES-1, K562, A2780, Jeko-1, EoL-1, KG-1, IM9, Raji and HDLM-2) of various cancer cells ( Blue), CD86 (green), and SECTM1 (red) are a series of histograms showing the results of analyzing the surface expression of the surface by flow cytometry
  • FIG. 8E is a cancer cell (SK-MES-1, K562, and A2780, Jeko-1, EoL-1, KG-1, IM9, Raji and HDLM-2) were co-cultured with NK101 or NK101-7.28.CD cells at 1:1, 2:1 and 4:1 ratios for 24 hours.
  • FIG. 8F is a series of graphs showing various concentrations of 5-FC on NK101 or NK101-7.28.CD cells for 48 hours, and then the cell growth rate was analyzed by MTS. It is a graph showing the result checked through.
  • Figure 9a shows the results of confirming the expression of IL-15 on the surface of NK101-15.TN and NK111 cells in which the pBD-15.TN constructs of Figure 7 are respectively introduced into NK101 and NK101-7.28.CD through flow cytometry. It is a series of histograms shown, and FIG. 9B is a series of histograms showing the results of confirming the expression of TGF ⁇ RII ⁇ cyto in NK101-15.TN and NK111 cells through flow cytometry.
  • Figure 10a is a graph showing the cell number proliferation level (population doubling level) according to the addition of IL-2 when culturing NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN and NK111 cells
  • Figure 10b is NK101, NK101- 7.28. It is a series of histograms showing the results of confirming NKG2D expression in CD, NK101-15.TN and NK111 cells through flow cytometry
  • FIG. 10C is a NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN, and NK111 cells.
  • FIG. 10D is an HDLM-2 (left) or IM9 (right) cell line NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.
  • FIG. 10E is NK101 (black), NK101-7.28 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11a shows the expression of CAR on the cell surface (left) and the degree of binding to the FLT3-Fc protein (right) of the NK cell line (named NK111-CAR) into which the pBD-CAR construct of Figure 7 was introduced into NK111.
  • FIG. 11B is an analysis of the expression of the CAR construct in the NK101, NK111, and NK111-CAR cell lines according to an embodiment of the present invention by Western blot analysis using an anti-CD3 ⁇ antibody. This is a picture showing one result.
  • FIG. 12 is a commercialized anti-human FLT3 antibody (top) and anti-FLT3-scFv-hyFc (bottom) EoL-1, REH, Molm-13, Daudi, K562 cell lines and normal bone marrow according to an embodiment of the present invention. It is a series of histograms showing the results of confirming the reactivity to the derived peripheral blood cells through flow cytometry.
  • Figure 13 is a co-culture of EoL-1, REH, Molm-13, Daudi, K562 and normal bone marrow-derived peripheral blood cells with NK111 or NK111-CAR cells in an E:T ratio of 1:1, 2:1 and 4:1 This is a series of graphs showing the results of measuring the death frequency of each cancer cell through flow cytometry.
  • FIG. 15A is a graph showing the number of cells (left) and survival rate (right) according to the presence or absence of radiation
  • FIG. 15B is a graph showing the death frequency of EoL-1, Molm-13, and K562 cancer cells according to the presence or absence of radiation.
  • NK111 or NK111-CAR cells were co-cultured at an E:T ratio of 1:1, 2:1 and 4:1, and then the killing ability was measured through flow cytometry.
  • FIG. 16 is a result of analyzing the anticancer efficacy in vivo when irradiated NK111-CAR was administered alone and when LY2510924, a CXCR4 antagonist, was co-administered to acute myelogenous leukemia xenograft tumor model mice
  • FIG. It schematically shows the administration schedule of the genetically modified NK cell line according to the embodiment
  • Figure 16b is a distribution of cancer cells in the body after 0, 7 and 14 days of administration of the genetically modified NK cell line and/or LY2510924 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 16C is a graph showing the results of measuring the degree of bioluminescence in tumor tissues 14 days after administration of the genetically modified NK cell line and/or LY2510924 according to an embodiment of the present invention to be.
  • CAR construct as used in this document is an abbreviation of "chimeric antigen receptor construct", and is usually a single chain-based antibody analog such as scFv and sdAb as an antigen recognition site-passing through the cell membrane.
  • synthetic protein composed of domain-auxiliary stimulating factor-intracellular signaling domain, it is transduced into immune cells such as T cells to recognize cancer cell-specific antigens, thereby enhancing the anticancer activity of immune cells expressing the CAR construct against these cancer cells. It is well known for letting go.
  • scFv as used in this document is an abbreviation of "single chain variable fragment” and is not an actual antibody fragment.
  • the heavy chain variable region (V H ) and light chain variable region (V L ) of the antibody are connected to a linker having a size of about 25 aa.
  • As a kind of fusion protein prepared by linking with a peptide it is known to have antigen-binding ability even though it is not a native antibody fragment (Glockshuber et al ., Biochem . 29(6): 1362-1367, 1990).
  • the term "genetically modified" as used herein refers to a host cell, or a polynucleotide or a vector according to an embodiment of the present invention introduced into one of the predecessors/parents. Means to include in addition to its own genome.
  • the polynucleotide or vector according to an embodiment of the present invention may exist in a genetically modified host cell as an independent molecule outside the genome, preferably a replicable molecule, or stably into the genome of the host immune cell. Can be inserted.
  • cell suicide gene refers to a gene that induces cytotoxicity or triggers apoptosis mechanism to induce the death of a cell in which the gene is expressed.
  • gene expression itself does not trigger apoptosis, but when a specific prodrug is treated, the metabolite of the prodrug by the apoptosis gene triggers cytotoxicity or apoptosis mechanism, leading to cell death.
  • apoptosis genes include the herpes simplex virus thymidine phosphorylation gene (HSV TK), which uses ganciclovir as a suicide induction signal, and 6-methoxypurine arabinonucleoside, as suicide induction signals.
  • HSV TK herpes simplex virus thymidine phosphorylation gene
  • VZV TK Varicella zoster virus thymidine kinase
  • CD cytosine deaminase
  • UPRT uracil phosphoribosyl transferase
  • CPT-11 carboxyl esterase using the fusion protein (CD::UPRT) of the CD and UPRT
  • CPT-11 carboxyl esterase using the fusion protein (CD::UPRT) of the CD and UPRT
  • CPT-11 carboxyl esterase using the fusion protein
  • CPT-11 irinotecan
  • 5 asziridin-1-yl)-2,4-dinite Nitroreductase using lobenzamide (CB1954) as a suicide induction signal
  • 4-[(2-chloroethyl)(2-mesyloxyethyl)amino]benzoyl-L-glutamic acid (CMDA) as a suicide induction signal
  • CD::UPRT is a fusion protein in which cytosine deaminase (CD) and uracil phosphoribosyl transferase (UPRT) are fused as an apoptosis gene.
  • CD::UPRT induces suicide of cells during 5-FC treatment by converting 5-fluorocytosine (5-FC) into 5-fluorouracil (5-FU), which has a lethal effect on cells.
  • mbIL-15 refers to the form of IL-15 bound to the membrane, and is a concept that is distinguished from the secreted IL-15.
  • TGF ⁇ RII ⁇ cyto refers to a variant in which the cytoplasmic domain portion of TGF ⁇ RII, one of the TGF ⁇ receptors (positions 192-567aa), has been removed, and refers to a variant that binds to TGF ⁇ but cannot transmit intracellular signaling. .
  • a polynucleotide encoding an FLT3-specific chimeric antigen receptor is transduced into an isolated NK cell line having the following characteristics to provide a genetically modified NK cell line expressing the FLT3-specific chimeric antigen receptor. :
  • CD2, CD7, CD11a, CD25, CD28, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L and CD56 are positive;
  • CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD23, CD34, TCR ⁇ and TCR ⁇ are negative.
  • the genetically modified NK cell line may be an apoptosis gene transduced additionally.
  • the apoptosis gene is a uracil phosphoribosyl transferase (UPRT) gene, herpes simplex virus thymidine phosphorylation.
  • UPRT uracil phosphoribosyl transferase
  • HSV TK Varicella zoster virus thymidine kinase (VZV TK) gene, cytosine deaminase gene (CD), gene encoding the fusion protein (CD::UPRT) of the CD and UPRT, carboxyl It may be an esterase gene, a nitroreductase gene, a carboxypeptidase G2 gene, or an inducible caspase 9 (iCas9) gene, and the CD::UPRT may consist of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
  • the genetically modified NK cell line may be an additionally transduced polynucleotide encoding membrane-bound IL-15 (mbIL-15).
  • the genetically modified NK cell line may be an additionally transduced polynucleotide encoding a cytoplasmic domain deletion TGF ⁇ receptor II (TGF ⁇ RII ⁇ cyto).
  • the isolated NK cell line may be an NK111 cell line transduced with a CD7-CD28-CD::UPRT construct and a mbIL-15-TGF ⁇ RII ⁇ cyto construct into an NK101 cell line (KCTC 13305BP).
  • the FLT3-specific chimeric antigen receptor is a scFv that specifically binds to FLT3, a modified Ig Fc region, a CD28 transmembrane domain, a DAP10 intracellular activation domain, a DAP12 intracellular activation domain, and a T cell receptor.
  • CD3 ⁇ cytoplasmic domain In the genetically modified NK cell line, the FLT3-specific chimeric antigen receptor is a scFv that specifically binds to FLT3, a modified Ig Fc region, a CD28 transmembrane domain, a DAP10 intracellular activation domain, a DAP12 intracellular activation domain, and a T cell receptor.
  • CD3 ⁇ cytoplasmic domain CD3 ⁇ cytoplasmic domain.
  • the scFv specifically binding to FLT3 may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • the modified Ig Fc domain may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the CD28 transmembrane domain may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • the DAP10 intracellular activation domain may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • the DAP12 intracellular activation domain is It may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • the CD3 ⁇ cytoplasmic domain of the T cell receptor may consist of an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 9.
  • the FLT3-specific chimeric antigen receptor may be entirely composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and the polynucleotide encoding the FLT3-specific chimeric antigen receptor may be composed of a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • DAP10 refers to a transmembrane signal adapter that forms an immune receptor complex, and refers to a hematopoietic cell signal transducer encoded by a hematopoietic cell signal transducer (HCST) gene, and activation of NK cells and T cells. It is known to play an important role in the survival and proliferation of cells by reaction.
  • HCST hematopoietic cell signal transducer
  • DAP12 used in this document is a 12 kDa transmembrane protein, has high homology with DAP10, and is recognized as an important signaling receptor in NK cells.
  • the apoptosis gene is uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) gene, herpes simplex virus thymidine phosphorylation gene (HSV TK), Varicella zoster virus thymidine kinase (VZV TK) Gene, cytosine deaminase gene (CD), gene encoding the fusion protein (CD::UPRT) of the CD and UPRT, carboxyl esterase gene, nitroreductase gene, carboxypeptidase G2 gene, or inducible It may be a caspase 9 (iCas9) gene, and the CD::UPRT may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20.
  • UPRT uracil phosphoribosyltransferase
  • HSV TK herpes simplex virus thymidine phosphorylation gene
  • VZV TK Varicella zoster virus thymidine kina
  • the mbIL-15 may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23.
  • the TGF ⁇ RII ⁇ cyto may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23.
  • chimeric antigen receptor refers to a kind of fusion protein prepared by fusion of a binding portion (variable region) to an antigen of a monoclonal antibody and an intracellular signaling site derived from a lymphocyte activation receptor. .
  • CAR chimeric antigen receptor
  • MHC major histocompatibility complex
  • the FLT3-specific chimeric antigen receptor, the CD7-CD28-CD::UPRT construct and the mbIL-15-TGF ⁇ RII ⁇ cyto construct are expressed in the form of a fusion protein or cloned into a single gene construct.
  • the polynucleotide encoding the FLT3-specific chimeric antigen receptor, the CD7-CD28-CD::UPRT construct and the mbIL-15-TGF ⁇ RII ⁇ cyto construct are cloned into the single gene construct, each can be operated in a separate promoter Or all three polynucleotides are operably linked to a single promoter, the polynucleotide encoding the FLT3-specific chimeric antigen receptor, the CD7-CD28-CD::UPRT construct and the mbIL-15-TGF ⁇ RII ⁇ cyto construct Traits can be expressed polycistronic by linking each construct to an internal ribosome entry site (IRS).
  • IRS internal ribosome entry site
  • operably linked to means that a particular polynucleotide is linked to another polynucleotide such that it can exert its function. That is, the fact that the polynucleotide encoding a specific protein is operably linked to the promoter means that it is transcribed into mRNA and translated into the protein by the action of the promoter, and the polynucleotide encoding the specific protein is That the specific protein is operably linked to a polynucleotide encoding another protein can be expressed in the form of a fusion protein with another protein.
  • the gene construct may be cloned into an expression vector and transfected into a host immune cell, and such a vector may contain various regulatory factors that enable expression of the cloned gene, including a promoter.
  • modulators are well known to those skilled in the art. As mentioned above, these usually include regulators responsible for initiation of transcription and, optionally, a poly-A signal responsible for termination and stabilization of transcription of the transcript. Additional modulators may include, in addition to transcriptional modulators, translation enhancers and/or naturally-combined or heterologous promoter regions.
  • possible regulators that allow expression in mammalian host cells include the CMV-HSV thymidine kinase promoter, SV40, RSV-promoter (Rous sarcoma virus), human kidney element 1 ⁇ -promoter, glucocorticoid-inducible MMTV- A promoter (Moloni mouse tumor virus), a metallothionein-inducible or tetracycline-inducible promoter, or an amplifying agent such as a CMV amplifying agent or an SV40-amplifying agent.
  • neurofibrillation-promoter For expression in neurons, it is contemplated that neurofibrillation-promoter, PGDF-promoter, NSE-promoter, PrP-promoter or thy-1-promoter can be used.
  • Such promoters are known in the art and are described in Charron, J. Biol. Chem. 1995, 270: 25739-25745.
  • the modulators include transcription termination signals such as SV40-poly-A site or TK-poly-A site downstream of the polynucleotide according to an embodiment of the present invention. You may.
  • suitable expression vectors are known in the art, examples of which are Okayama-Berg cDNA expression vector pcDV1 (Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL). ), pX (Pagano (1992) Science 255, 1144-1147), yeast two-hybrid vectors, such as pEG202 and dpJG4-5 (Gyuris, Cell 75: 791-803, 2005).
  • a cell therapy agent for cancer treatment comprising a therapeutically effective amount of the genetically modified NK cell line as an active ingredient.
  • the cell therapy agent for cancer treatment may further include at least one or more other anticancer agents.
  • the anticancer agent may be an alkylating agent, an anti-metabolite, an anti-microtubule agent, a topoisomerase inhibitor, a cytotoxic agent, a cell proliferation/migration and survival signaling pathway inhibitor, an apoptosis inducing agent, or a histone deacetylase (HDAC) inhibitor.
  • HDAC histone deacetylase
  • the alkylating agent may be nitrogen mustard, nitrosourea, tetrazine, aziridine, or cisplatin, and the anti-metabolic agents methotrexat, pemetrexed, fluorouracil, capecitabine, cytarabine, gemcitabine, decitabine, azacitidine, fludarabine, nelara , nelarabine, cladribine, clofarabine, or pentostatin, antimicrobial agents may be vincristine, vinblastine, vinorelbine, vindesine, vinflunine, paclitaxel, or pdophyllotoxin, and the topoisomerase inhibitors may be irinoteopocan, toptecan, etubiside , mitoxantrone, novobiocin, merbarone, aclarubicin or teniposide, the cytotoxic agent may be anthracycline,
  • Cancer treatable by the cell therapy for cancer treatment of the present invention can be used for both hematologic and solid cancers as long as FLT3 is overexpressed, and the hematologic cancer may be acute and chronic leukemia, lymphoma, multiple myelosis, or myelodysplastic syndrome.
  • the solid cancer is liver cancer, lung cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, cervical cancer, gallbladder cancer, gastric cancer, biliary tract cancer, colon cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, brain tumor, malignant melanoma, prostate cancer, testicular cancer. , Tongue cancer, or bone marrow cancer.
  • the cell therapy agent is a kind of pharmaceutical composition, and may include a pharmaceutically acceptable carrier, additive, or excipient necessary for the formulation of the pharmaceutical composition.
  • the dosage of the cell therapy agent according to an embodiment of the present invention may be 10 7 to 10 11 cells, but may be adjusted according to the sex, age, disease progression degree, and treatment purpose of the patient. In general, this amount will be sufficient to obtain localization in the target cell, eg, a cancer cell overexpressing a cancer antigen, and kill the cancer cell, eg, by phagocytosis or lysis.
  • the cell therapy agent may additionally include a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or excipient in addition to the carrier.
  • the "pharmaceutically acceptable” refers to a composition that is physiologically acceptable and does not usually cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder or dizziness or a similar reaction when administered to a human.
  • the composition according to an embodiment of the present invention may be formulated in a suitable form together with a generally used pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycol, and the like, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers are antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives are benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • the cell therapy according to the present invention if necessary depending on the administration method or formulation, suspending agent, solubilizing agent, stabilizer, isotonic agent, preservative, adsorption inhibitor, surfactant, diluent, excipient, pH adjuster, painless agent, buffer agent , Antioxidants, etc. may be appropriately included.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, the latest edition.
  • the cell therapy according to an embodiment of the present invention may be formulated using a method known in the art to enable rapid release, or sustained or delayed release of the active ingredient when administered to a mammal.
  • Formulations include powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, and sterile powder forms.
  • composition according to an embodiment of the present invention may be administered by various routes, for example, oral, parenteral, such as suppositories, transdermal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intracranial, nasal, It can be administered intrathecally, and can also be administered using an implantable device for sustained release or continuous or repeated release.
  • the number of administration may be administered once a day or divided into several times a day within a desired range, and the administration period is not particularly limited.
  • the dosage of the pharmaceutical composition to a patient depends on many factors, including the patient's height, body surface area, age, the specific compound administered, sex, time and route of administration, general health, and other drugs administered simultaneously.
  • the pharmaceutically active protein substance may be present in an amount of 1 ng-10 mg/body weight (kg) per administration, but may be administered within or above the above exemplary range in consideration of the above factors, and if the administration method is continuous infusion , It can be administered in the range of 1 ⁇ g-10 mg per 1 kg of body weight per minute.
  • kits for cancer treatment comprising the genetically modified NK cell line and a suicide inducer.
  • the cancer treatment kit may further include at least one or more other anticancer agents.
  • the anticancer agent may be an alkylating agent, an anti-metabolite, an anti-microtubule agent, a topoisomerase inhibitor, a cytotoxic agent, a cell proliferation/migration and survival signaling pathway inhibitor, an apoptosis inducing agent, or a histone deacetylase (HDAC) inhibitor.
  • HDAC histone deacetylase
  • the cancer treatment kit of the present invention includes the genetically modified immune cells and a suicide inducer, but these two components are not provided in a mixed form, but are separately packaged, and these two components are provided by the same or different routes at the same time. Although it can be administered, it is distinguished from the general composition in that it is administered at regular intervals according to a doctor's prescription.
  • the kit of the present invention includes first administration of the genetically modified immune cells, and then at an appropriate time point, such as the same time as the administration of the genetically modified immune cells, or 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days from administration.
  • the first After administration may be administered in multiple doses two or more times at intervals of two days, three days, four days, five days, six days, or a week.
  • the suicide inducing agent is gancyclovir or 6-methoxypurine arabinonucleoside, respectively, when the apoptosis gene is HSV TK or VZV TK, and the apoptosis gene is cytosine dia.
  • Minase (CD), UPRT, or a gene encoding the fusion protein (CD::UPRT) of the CD and UPRT is 5-fluorocytosine (5-FC), and the apoptosis gene is carboxyl esterase Irinotecan (CPT-11), and the apoptosis gene is 5 (aziridin-1-yl)-2,4-dinitrobenzamide (CB1954) when the apoptosis gene is nitroreductase, and the apoptosis gene is carboxypepti For Days G2, it may be 4-[(2-chloroethyl)(2-mesyloxyethyl)amino]benzoyl-L-glutamic acid (CMDA), and if the apoptosis gene is iCas9, it may be an iCas9 dimerizer.
  • CMDA 4-[(2-chloroethyl)(2-mesyloxyethyl)amino
  • a method for treating cancer in an individual comprising administering a therapeutically effective amount of the genetically modified NK cell line and optionally a suicide inducer to an individual in need of treatment for cancer.
  • the cancer treatment method may further include performing at least one anticancer therapy selected from stem cell transplantation, irradiation therapy, surgical resection, chemotherapy, immunotherapy, targeted therapy, or a combination thereof.
  • the genetically modified NK cell line and the suicide inducing agent may be administered at the same time, but as described above, the administration may be divided into appropriate administration intervals for optimal effect, and the administration interval may be adjusted to maximize therapeutic activity. .
  • Cancer treatable by the cancer treatment method of the present invention can be used for both hematologic cancer or solid cancer as long as FLT3 is overexpressed, and the hematologic cancer may be acute and chronic leukemia, lymphoma, multiple myelosis, or myelodysplastic syndrome.
  • the solid cancer is liver cancer, lung cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, cervical cancer, gallbladder cancer, gastric cancer, biliary tract cancer, colon cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, brain tumor, malignant melanoma, prostate cancer, testicular cancer, It may be tongue cancer or bone marrow cancer.
  • the present inventors isolated a new NK cell line having the characteristics described in Table 1 from cancer tissues of NK lymphoma patients, and as a result of examining various characteristics thereof, as shown in Figs. 1 to 6, it exhibits IL-2 dependent proliferative ability, It was confirmed that it is a multifunctional NK cell line having both cancer cell killing ability and immunomodulatory ability.
  • KCTC Korean Collection for Type Culture
  • the IL-2 receptor CD25 is highly expressed and has a phenotype of CD56 dim CD62L + , but CD7, an NK cell activating factor that directly affects the anticancer activity of NK cells. And by confirming that CD28 is not expressed, it was expected that the anticancer activity itself would not be higher than that of the conventionally constructed NK cell line.
  • FIG. 7A is a schematic diagram schematically showing the structure of the gene construct pBD-7.28.CD used in the production of the genetically modified NK cell line NK101-7.28.CD according to an embodiment of the present invention in order to achieve the above object
  • FIG. 7B is a schematic diagram schematically showing the structure of the genetic construct pBD-15.TN used for the production of genetically modified NK cell lines NK101-15.TN and NK111 according to an embodiment of the present invention.
  • NK101 cells accession number KCTC 13305BP
  • TGF ⁇ receptor an NK111 cell line capable of enhancing the anticancer effect of the corresponding NK cells and proliferating NK cells independent of cytokine supplementation was constructed (see FIGS. 9A and 9B).
  • Figure 8a is a genetically modified NK cell line (NK101-7.28.CD) according to an embodiment of the present invention, NK101, the parent cell line of the NK101-7.28.CD, and in the conventionally constructed NK cell lines KHYG-1 and NK-92. It is a result of comparative analysis of the expression of cell surface markers, and FIG. 8B is a genetically modified cell line NK101-7.28.CD according to an embodiment of the present invention transfected with the pBD-7.28.CD construct shown in FIG. 7B. This is a histogram showing the results of confirming the expression of CD7 and CD28 in cells through flow cytometry. As shown in Figs.
  • KHYG-1 and NK-92 which are known to have high cancer cell killing ability, have the characteristic of expressing CD7 in common, and the NK-92 cell line CD7 is Of course, it was confirmed that even CD28 was simultaneously expressed, whereas NK101 did not express both co-stimulatory factors at all. Accordingly, the present inventors attempted to evaluate whether the ability to kill cancer cells is enhanced through the introduction of CD7 and CD28 into NK101 cells.
  • Figure 8d shows CD80 (blue), CD86 (green), and SECTM1 of various cancer cells (SK-MES-1, K562, A2780, Jeko-1, EoL-1, KG-1, IM9, Raji and HDLM-2). Red) is a series of histograms showing the results of analyzing the surface expression of the surface by flow cytometry, and FIG. 8E is a genetically modified NK cell line NK101.7.28.CD and a parental cell line of the NK101.7.28.CD according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8F is a graph showing the result of treatment with various concentrations of 5-FC on NK101 or NK101-7.28.CD cells for 48 hours, and then the cell growth rate is measured. This is a graph showing the results confirmed through MTS analysis.
  • the genetically modified NK cell line NK101-7.28.CD according to an embodiment of the present invention shows excellent killing ability in various cancer cell lines compared to NK101, and the killing ability of NK101 cells through the introduction of CD7 and CD28 is It could be confirmed that it was improved. In addition, it was confirmed that safety can be secured by inducing the removal of NK101-7.28.CD cells through 5-FC treatment.
  • FIG. 9 is a diagram showing the construction process of the NK111 cell line, a genetically modified NK cell line according to another embodiment of the present invention
  • FIG. 9A is a pBD-15.TN shown in FIG. 7B in NK101 and NK101-7.28.CD cells. It is a histogram showing the results of confirming the expression of IL-15 on the surface of NK101-15.TN and NK111 cells into which constructs were introduced, respectively, through flow cytometry
  • FIG. 9B is NK101, NK101-7.28.CD, and NK101-15.TN
  • a histogram showing the result of confirming the expression of TGF ⁇ RII ⁇ cyto(DNT ⁇ RII) in NK111 cells through flow cytometry.
  • NK101-7.28.CD cells As confirmed in Figure 8e, the introduction of CD7 and CD28 showed a moderate effect on enhancing the killing ability of NK101 cells. Accordingly, in order to maximize the ability of NK101-7.28.CD cells to kill cancer cells, the present inventors tried to transduce membrane bound IL-15, a representative NK cell activating factor, into NK101-7.28.CD cells, and immunosuppressive factors. TGF ⁇ RII ⁇ cyto (dominant negative TGF ⁇ RII, DNT ⁇ RII) from which the cytoplasmic domain was deleted was overexpressed to act as a decoy receptor to induce resistance to TGF- ⁇ .
  • TGF ⁇ RII ⁇ cyto dominant negative TGF ⁇ RII, DNT ⁇ RII
  • FIG. 10 is a result of comparative analysis of the anticancer activity and safety of NK111, a genetically modified NK cell line according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 10A is a cultivation of NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN, and NK111 cells.
  • FIG. 10B is a flow cytometric analysis of NKG2D expression in NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN, and NK111 cells. It is a histogram showing the confirmed result
  • FIG. 10A is a cultivation of NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN, and NK111 cells.
  • FIG. 10B is a flow cytometric analysis of NKG2D expression in NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN, and NK111 cells. It is a histogram showing the confirmed result
  • FIG. 10A is a cultivation of NK101, NK101-7.28.CD
  • FIG. 10C shows HDLM-2, Raji, IM-9, KG-1, EoL-1, JEKO-1, A2780, K562 and SK-MES-1 cancer cells and NK101, NK101-7.28.CD , NK101-15.
  • the IM-9 cell line is co-cultured with NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN, and NK111 cells, and after treatment with various concentrations of TGF ⁇ 1, it is a graph showing the effect on cancer cell killing ability. As shown in FIG.
  • NK111 through the introduction of membrane-bound IL-15, NK111 according to an embodiment of the present invention enables cell growth independently of IL-2, which increases convenience during production.
  • FIG. 10B it was confirmed that the expression of NKG2D, a representative activating receptor for NK cells, was upregulated through the introduction of IL-15, thereby enhancing the killing ability against cancer cells.
  • Fig. 10c the killing ability for 9 cancer cell lines was enhanced through the introduction of IL-15.
  • FIG. 10A through the introduction of membrane-bound IL-15, NK111 according to an embodiment of the present invention enables cell growth independently of IL-2, which increases convenience during production.
  • NKG2D a representative activating receptor for NK cells
  • TGF ⁇ RII ⁇ cyto a bait receptor for TGF ⁇ 1, an immunosuppressive factor that is oversecreted in the tumor microenvironment, it was not affected by the decrease in killing ability against TGF ⁇ 1, which in the future decreases in vivo activity. It is a characteristic that makes people expect to be able to overcome to some extent.
  • the present inventors use the genetically modified NK cell line according to an embodiment of the present invention to transduce a chimeric antigen receptor capable of antigen-specific cell therapy.
  • a chimeric antigen receptor construct targeting FLT3 known to be overexpressed in various hematologic cancers under the assumption that it could be possible (Fig. 7C)
  • it was prepared and further transduced into the NK111 cell line prepared above.
  • the chimeric antigen receptor was normally expressed while maintaining the characteristics of the parent cell (NK101) (Fig. 11), and as a result of performing a reactivity analysis using anti-FLT3-scFv-hyFc, FLT3 was overexpressed.
  • Example 1 Manufacturing process of the NK cell line of the present invention
  • NK cells In order to produce a cell line derived from NK cells, the following process was performed.
  • Cellgro TM stem cell growth medium containing 20% fetal calf serum (GE Healthcare, USA) and 1% antibiotics (Gibco, USA) on a 40 ⁇ m strainer with extranodal NK lymph carcinoma derived from the patient.
  • SCGM CellGenix, Germany, hereinafter referred to as'NK media'
  • 10 mL was added, and then detached into single cells using the shear force of the piston of a 5 mL syringe, and then suspended.
  • NK cells in the single cell suspension were isolated using an NK isolation kit (Milltenyi Biotec, Germany) and then 1,000 U/mL of recombinant human IL-2 (recombinant human IL-2; rhIL-2; Prometheus Laboratories Inc., USA). Incubated for 3 weeks in NK media to which was added. NK media containing IL-2 was added twice a week, and it was confirmed that a stable cell line was formed by continuously culturing the dividing cell line up to passage 30 (FIG. 1A). Since the cell line expresses CD56 without expressing CD3, CD20, and CD16, it was confirmed that the origin of the corresponding cell is an NK cell (Fig. 1b).
  • NK101 expresses Perforin and Granzyme B through fluorescence staining of the cell death factors Perforin (green) and Granzyme B (red), which are characteristics of NK cells (FIG. 1E).
  • Co-culture was performed with K562, an MHCI negative cell sensitive to NK cells.
  • CFDA carboxyfluorescein diacetate
  • the cell pellet formed by centrifugation again was suspended in 100 ⁇ L of FACS buffer containing 1 ⁇ L LIVE/DEAD ⁇ Fixable Near-IR Dead Stain Kit (Invitrogen, USA), and reacted at 4° C. for 20 minutes. After washing twice with FACS buffer, the cell pellet was suspended in a solution obtained by diluting 5 ⁇ L of Annexin V APC (Biolegend, USA) in 100 ⁇ L of 1X Annexin V binding buffer and reacted at room temperature for 20 minutes.
  • NK101 is an immortalized cell capable of continuous passage, forms a cluster during culture, and has characteristics consistent with previously known NK cells in phenotype and function.
  • the cell line was named'NK101' by confirming the cell lineage of the cell and the characteristics of the NK cell, and this is the Korean Collection for Type Culture, located at 181 Ipsin-gil, Jeongeup-si, Jeollabuk-do, Korea.
  • KCTC Korean Collection for Type Culture
  • the depository body is an international depository body under the Budapest Treaty.
  • NK101 expresses a high affinity IL-2 receptor, CD25, higher than that of NK-92.
  • NK101 recovered cell growth after 2 days (passion 1) after thawing, but NK-92 recovered 10 days (passage 5) after thawing.
  • FIG. 2C After that, it was confirmed that a certain cell growth was reached (FIG. 2C). After the cell growth of the two cells was stabilized, when comparing the cell proliferation of the two cells, it was confirmed that the total cell line of NK101 cells obtained after passage on the 16th day was about 100 times the expected number of cells obtained from NK-92 cells (Fig. 2d). This suggests that the productivity of the NK101 cells of the present invention is superior to that of the conventional NK-92 cells, and the NK101 cells of the present invention are very advantageous in terms of economy.
  • NK101 cells of the present invention Item NK101 cells Clinical data Age/Gender 56 years old male race Asian Diagnosis Extranodal NK/T lymphoma Cell culture Growth aspect Multicellular Aggregates in Suspension Doubling time 18-32 hours Maximum cell concentration 1.2x10 6 cells/ml Minimum cell concentration 0.5x10 5 cells/ml Cytokine dependence IL-2 dependence (500 IU/ml) Optimal cleavage Every 2-3 days Immunological properties T/NK marker CD2 +, CD3 -, CD4 - , CD7 -, CD8 -, CD16 -, CD56 + B cell marker CD10 -, CD19 -, CD20 - Myelomonocytic marker CD13 -, CD14 -, CD33 + NK cell activating receptor NKp46 + , NKp30 + , NKG2D + NK cell inhibitory receptor KIR2DL1 -, KIR2DL2 -, ILT2 - Offspring/activ
  • Example 3 Analysis of surface markers
  • the NK101 cell line of the present invention prepared in Example 1 has the characteristics of floating cells, and the expression level of the surface antigen of the cells was confirmed by flow cytometry.
  • the antibodies used are as follows:
  • PE-conjugated anti-CD1 antibody (clone HI149), PE-conjugated anti-CD2 antibody (clone RPA-2.10), PE-conjugated anti-CD3 antibody (clone UCHT1), PE-conjugated anti-CD4 Antibody (clone SK3), PE-conjugated anti-CD5 antibody (clone UCHT2), PE-conjugated anti-CD7 antibody (clone CD7-6B7), PE-conjugated anti-CD8 antibody (clone RPA-T8), PE-conjugated anti -CD16 antibody (clone B73.1), PE-conjugated anti-CD25 antibody (clone BC96), PE-conjugated anti-CD28 antibody (clone CD28.2), PE-conjugated anti-CD56 antibody (clone HCD56), PE- Conjugated anti-CD57 antibody (clone HNK-1), PE-conjugated anti
  • NK-cell activating/inhibiting receptors or inhibitory immune checkpoints/PD-L1 were subjected to PE-conjugated anti-NKp44 antibody (clone P44-8), PE-conjugated anti-NKp46.
  • Antibody (clone 9E2), PE-conjugated anti-NKp80 antibody (clone 5D12), PE-conjugated anti-DNAM1 antibody (clone 11A8), PE-conjugated anti-NKG2D antibody (clone 1D11), PE-conjugated anti-2B4 antibody ( Clone C1.7), PE-conjugated anti-ILT2 antibody (clone GHI/75), PE-conjugated anti-KIR2DL1/S1/S3/S5 antibody (clone HP-MA4), PE-conjugated anti-KIR2DL2/DL3 antibody ( Clone DX27), PE-conjugated anti-PD-1 antibody (clone NAT105), PE-conjugated anti-CTLA4 antibody (clone L3D10), PE-conjugated anti-LAG-3 antibody (clone 11C3C65), PE-conjugated anti-TIM -3 antibody (clone F38-2E2), PE-conjugated anti-TI
  • the NK101 cell line of the present invention expresses CD2 and CD56, which are the surface antigens of NK cells, but does not express CD16, and the surface antigens of T cells, CD3, CD4, CD8, and TCR ⁇ . And NK cells not expressing TCR ⁇ and CD20, a B cell surface antigen, and CD14, a monocyte-expressing antigen (Fig. 3A).
  • the NK101 cell line of the present invention expresses NK cell activation receptors NKG2D, NKp30, NKp46, DNAM-1, 2B4, and NKp44 is not expressed, and inactivation receptors CD94 and NKG2A are expressed, and KIR2DL1/S1/S3/ S5, KIR2DL2/DL3, and CD85j were not expressed (Fig. 3B).
  • cell adhesion molecules CD2, CD11a, CD19, and ICAM-1 were expressed, and CD7 was not expressed (FIG. 3C).
  • the NK101 cell line of the present invention expresses CD107a, Perforin, Granzyme B, and low levels of TRAIL, which are involved in cytotoxicity and immune activation of NK cells, but not FASL (Fig. 3D), and cytokine receptors of NK cells.
  • IL-2 high affinity receptor CD25, IL-2 receptor (CD122, CD132) and IL-15 receptor IL-15Ra Among the chemokine receptors related to the mobility of NK cell lines, CCR4, CCR6, CCR7, CXCR3, and CXCR4 were expressed, but other CCR and CXCR were not expressed (Fig. 3f).
  • the NK101 cell line of the present invention exhibits a phenotype of activated NK cells, and is distinguished from other NK cell lines in that CD25 is highly expressed.
  • CD25 is an indicator of activated NK cells and is a marker of NK cells with high dividing ability.
  • NK101 cells of the present invention antigen Whether it is manifested or not antigen Whether it is manifested or not System marker Functional marker CD1a - CD95 (FAS) +++ CD2 +++ CD178 (FAS-L) + CD3 - CD107a +++ CD4 - TRAIL (CD253) + CD5 - Perforin +++ CD8 - Granzyme B +++ CD10 - IFN ⁇ +++ CD11a +++ Chemokine receptor CD11c - CCR1 + CD13 + CCR2 - CD14 + CCR3 - CD16 - CCR4 +++ CD18 +++ CCR5 + CD19 - CCR6 +++ CD23 - CCR7 +++ CD33 +++ CCR8 ++ CD45 +++ CCR9 + CD56 +++ CXCR1 - CD57 - CXCR2 - CD161 ++ CXCR3 +++ Activating receptor CXCR4 +++ 2B4 +++ CXCR5 - NKp
  • Example 4 Confirmation of the expression patterns of CD56 and CD62L of NK101
  • the expression patterns of CD56 and CD62L which are markers of NK cells
  • NK101 cells were identified as CD56 dim NK cells with a lower level of CD56 expression compared to NK-92 cells.
  • NK101 cells highly express the CD62L marker, which is not expressed in NK-92 cells, and is a marker that is limitedly expressed in some first cultured NK cells.
  • NK cells In general first cultured NK cells, it can be classified into CD56 dim and CD56 bright depending on the expression of CD56, which is thought to be composed of two clusters with more dominant properties, respectively, for cytotoxicity or cytokine production.
  • CD56 bright NK cells have high cell proliferation ability, secretion of IFN- ⁇ when activated by cytokines, and low cancer cell killing ability.
  • CD56 dim NK cells have low cell proliferation ability, as opposed to CD56 bright NK cells, and It secretes IFN- ⁇ and has high cytotoxicity.
  • Recently proven CD62L + CD56 dim NK cells Juelke, K et al,, Blood, 116 (8):...
  • NK101 has the phenotype and characteristics of CD56 dim CD62L + NK cells, and NK101 , although first-cultured NK cells expressing CD56 dim CD62L + characteristic markers or first-cultured NK cells ex vivo expanded have been reported. Is an immortalized NK cell line, which is differentiated from these, and it can be said to be a unique characteristic that cannot be found among existing known NK cell lines.
  • Example 5 Investigation of NK101's ability to kill cancer cells in vitro and mechanism of cytotoxicity
  • CFDA-labeled human-derived cancer cell lines THP-1, KG-1, HL-60 (acute myelogenous leukemia), HCT116 (colorectal cancer), U373 (brain cancer), A2780 (ovarian cancer), A549 (lung adenocarcinoma) ), and SK-BR3 (breast cancer) cells were seeded at a concentration of 3 ⁇ 10 5 cells/mL in each 24-well plate at 1 mL each.
  • the cell pellet was suspended in a solution obtained by diluting 5 ⁇ L of Annexin V APC (Biolegend, USA) in 100 ⁇ L of 1X Annexin V binding buffer and reacted at room temperature for 20 minutes.
  • Apoptosis of cells was determined by flow cytometry using viable cells (annexin V-negative/LIVE/DEAD-negative), early apoptotic cells (annexin V-positive/LIVE/DEAD-negative), late apoptotic cells (annexin V-positive/negative). LIVE/DEAD-positive) and necrotic cells (annexin V-negative/LIVE/DEAD-positive).
  • NK101 cell administration group showed cell killing ability against various human cancer cell lines.
  • THP-1 Fig. 6b
  • IAM-1 CD25, CD62L, DNAM-1, and CD54
  • Apoptosis was analyzed after co-culture with K562 (Fig. 6c) and Jurkat (Fig. 6d) at a ratio of 4:1 effector cells to target cells.
  • NK101 As a result, it was confirmed that the apoptosis ability of NK101 was reduced by treatment with neutralizing antibodies such as DNAM-1 and CD54 in THP-1, CD54 in K562, and CD25, CD62L, and CD54 in Jurkat.
  • neutralizing antibodies such as DNAM-1 and CD54 in THP-1, CD54 in K562, and CD25, CD62L, and CD54 in Jurkat.
  • FIG. 6e when THP-1 and NK101 are co-cultured, when the neutralizing antibodies of DNAM-1 and CD54 are simultaneously treated, the apoptosis ability is synergetic. Based on the results, it can be seen that markers such as DNAM-1 and CD54 are mainly involved in the cell killing ability by NK101.
  • KHYG-1 and NK-92 are known to have high cancer cell killing ability among previously constructed NK cell lines, and they commonly express CD7 and/or CD28, whereas NK101 does not express both co-stimulatory factors at all. Focusing on (Fig. 8a), the present inventors tried to evaluate whether or not cancer cell killing ability is enhanced when transduced NK101 with genes encoding CD7 and CD28.
  • the present inventors used a nucleic acid molecule encoding CD7 (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 15) and a CD28 immune cell co-stimulatory factor (SEQ ID NO: 16) in the NK101 cells prepared in Example 1 in order to produce a function-enhancing NK cell line.
  • the encoding nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 17) is linked to a nucleic acid molecule encoding 2A peptide (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19), and additionally, a nucleic acid molecule encoding CD::UPRT (SEQ ID NO: 20) (SEQ ID NO: 21) )
  • pBD transfer vector
  • the filtered lentivirus-containing supernatant was concentrated using a Lenti-X concentrator (Takara Bio, USA), and the concentrate was stored at 4°C overnight.
  • the concentrate containing lentivirus was centrifuged at 4000 rpm for 60 minutes, the supernatant was removed, and the lentivirus recovered in the form of a pellet was diluted with 1-2 mL of culture solution and stored at -80°C until use.
  • the cell culture plate was centrifuged at 1,800 rpm at room temperature and then incubated at 37°C for 4 hours. Then, the same infection process was repeated once again and cultured overnight, and then the cells were centrifuged and resuspended in fresh culture medium, followed by incubation for 3 days before evaluation of transgene expression.
  • NK101 cells infected with lentivirus expressing pBD-7.28.CD were treated with PE-conjugated anti-CD7 (clone CD7-6B7) antibody and allophycocyanin (APC)-conjugated anti-CD28 (clone CD28.2) antibody.
  • PE-conjugated anti-CD7 clone CD7-6B7
  • APC allophycocyanin
  • the intracellular expression protein CD::UPRT was isolated from RNA, and its expression was confirmed using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) (FIG. 8C).
  • Total RNA was isolated using an RNA extraction kit (iNtRON, South Korea).
  • cDNA was synthesized using the QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN, Germany), and then the synthesized cDNA was mixed with Taq polymerase and primers, and then polymerase chain reaction (PCR) was performed.
  • the amplified PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm the presence of the CD::UPRT gene. As a result, as shown in Fig. 8c, it was confirmed that the transduced CD::UPRT gene was normally expressed.
  • Example 7 Confirmation of increase in NK cell activation by NK cell co-activation factor and apoptosis gene
  • Cytotoxic activity of NK cells is regulated by several cell surface receptors that transmit activating or inhibitory signals (Wang and Matosevic, Cell Oncol. 43: 577-600, 2020). Because the inhibitory receptor is not expressed in NK101 (Yang et al ., J. Immunother. Cancer 7(1): 138, 2019, the present inventors found that the cytolytic potential of NK101 by recovery of the missing activation receptor expression. Therefore, the present inventors first investigated the expression level of surface markers functionally utilized to define NK cell lines in NK101 compared to KHYG-1 and NK-92, which have strong cancer cell killing activity (Klingemann et al ., Front.Immunol.
  • NK101-7.28.CD is SK. -MES-1, K562 and B7 including A2780 -.. exhibited almost the same cytotoxicity against tumor cells, on the other hand NK101-7.28.CD exhibited a significantly stronger cell-killing ability against B7 + tumor cells, CD7 / CD28 insert cytotoxicity increased extent according to the (i) CD80 - CD86 + CD80 + CD86 + NK101 and NK101-7.2 for the cancer cell lines than for the cancer cell lines 8.
  • the present inventors could not observe a clear correlation between the degree of lysis of the target cell and the surface SECTM1 expression of the target tumor (Figs. 8D and 8E).
  • the present inventors have a nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 24) encoding membrane-bound IL-15 (mbIL-15, SEQ ID NO: 23) and A gene construct linked to a nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 26) encoding TGF ⁇ RII ⁇ cyto (SEQ ID NO: 25) from which the cytoplasmic domain of TGF ⁇ RII has been removed (SEQ ID NO: 19) encoding a 2A peptide (SEQ ID NO: 18)
  • SEQ ID NO: 24 nucleic acid molecule
  • mbIL-15 membrane-bound IL-15
  • SEQ ID NO: 26 A gene construct linked to a nucleic acid molecule molecule encoding TGF ⁇ RII ⁇ cyto
  • SEQ ID NO: 19 encoding a 2A peptide (SEQ ID NO: 18)
  • Transfer plasmid pBD-15. TN 12 ⁇ g prepared in Example 6-1, 12 ⁇ g of packaging plasmid psPAX2 (Addgene plasmid, #12260) and 12 ⁇ g of Lenti-X cells cultured for 48 hours or 72 hours for lentivirus production, and lenti 2.4 ⁇ g of virus helper plasmid pMD2.G (Addgene plasmid, #12259) was mixed with Lipofectamine (Thermo Fisher Scientific, USA) and transduced into 8.5x10 6 Lenti-X 293T cells (Takara Bio, USA). After incubation at 37° C. for 6 hours, the medium was removed and fresh growth medium was added.
  • the filtered lentivirus-containing supernatant was concentrated using a Lenti-X concentrator (Takara Bio, USA), and the concentrate was stored at 4°C overnight.
  • the concentrate containing lentivirus was centrifuged at 4000 rpm for 60 minutes, the supernatant was removed, and the lentivirus recovered in the form of a pellet was diluted with 1-2 mL of culture solution and stored at -80°C until use.
  • IL-15 is a pleiotropic cytokine that increases NK cell proliferation and effector function (Carson et al ., Braz. J. Med. Biol. Res . 31: 1-9, 1998).
  • Membrane-bound IL-15 (mbIL-15) a major physiological form of cytokine, is known to transmit a stronger activation signal than soluble IL-15 (van Belle et al ., Arch. Immunol. Ther. Exp . (Warsz) 53: 115-126, 2005; Cho et al ., Kor. J. Lab. Med . 29: 89-96, 2009).
  • the present inventors used the pBD.15.TN prepared in Example 8-2 above to use the prepared lentivirus to NK101 and NK101-7.28.CD cells. Infected.
  • /ml IL-2 was infected by mixing with a final volume of 1.5 mL of 2x10 6 NK101 cells.
  • the cell culture plate was centrifuged at 1,800 rpm at room temperature and then incubated at 37°C for 4 hours. Then, the same infection process was repeated once again and cultured overnight, and then the cells were centrifuged and resuspended in fresh culture medium, followed by incubation for 3 days before evaluation of transgene expression. 72 hours after infection, the expression of mbIL-15 and TGF ⁇ RII ⁇ cyto was confirmed by flow cytometry, and one week later, detection and isolation of infected cells were performed using a FACSAria cell sorter and Cell Quest software (BD Biosciences, USA). The selected clones were named'NK101-15.TN'or'NK111', respectively. Surface expression of mbIL-15 and TGF ⁇ RII ⁇ cyto was first confirmed by flow cytometry (FIGS. 9A and 9B ).
  • 2 Cell proliferation patterns were investigated according to no addition.
  • NK101-15.TN or NK111 cells were stable without exogenous IL-2.
  • the maternal NK101 cell line or the NK101-7.28.CD cell line did not proliferate in the absence of IL-2 (FIG.
  • NK101-15.TN or NK111 cells were maintained in IL-2 deficient conditions. Then, parallel co-culture of NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN or NK111 cells with the tumor cell line used in Example 7-1 was performed, and the degree of apoptosis of cancer cells was measured through flow cytometry. In all co-cultures performed, tumors enhanced by mbIL-15 introduction, as indicated by a higher rate of specific lysis in the NK101-15.TN or NK111 co-culture groups than in each control (NK101 or NK101-7.28.CD). Showed removal activity.
  • the present inventors also confirmed that the degree of increase in cytotoxicity from NK101 to NK101-15.TN is similar to the degree of increase from NK101-7.28.CD to NK111 in most co-cultures (Fig. 10c). Since previous studies have suggested that IL-15 mediated cytotoxicity improvement involves upregulation of NKG2D in stimulated NK cells, we have shown surface NKG2D expression in NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN and NK111 cells. It was compared by flow cytometry (FIG. 10B). The proportions of NKG2D + cells in NK101 and NK101-7.28.CD were found to be 36% and 51%, respectively.
  • mbIL-15 introduction increased NKG2D expression, as indicated by 69% and 98% of NKG2D + populations in NK101-15.TN and NK111 cells, respectively (FIG. 10B).
  • the introduction of mbIL-15 not only conferred the ability to grow and survive autonomously, but also increased the cytolytic activity of NK101 through upregulation of surface NKG2D expression.
  • the present inventors investigated the presence of TGF ⁇ (3, 10 and 30 ng) to determine whether the immunosuppressive effect of TGF ⁇ I, which is well known as an immunosuppressive factor present in a large amount in the patient's body, is inhibited by TGF ⁇ RII ⁇ cyto introduced into NK111 cells. /mL) or in the absence of E:T in a 24-well plate with target cells HDLM-2 and Raji tumor cell lines and effector cells 3x10 5 cells/ml of NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN or NK111 in a 24-well plate.
  • the NK101-7.28.CD cells have significantly increased cancer cell killing ability compared to the parental cell line NK101 while maintaining the main characteristics of the parental cell line NK101, and the NK101-7.28.CD.
  • NK111 cells with enhanced performance not only significantly increased their cancer cell killing ability compared to NK101-7.28.CD cells, but also avoided the inhibition of cell killing ability caused by TGF ⁇ , so they can be used as a very effective cancer treatment when administered in the body. It is expected to be.
  • Example 9 Preparation of FLT3 target chimeric antigen receptor-introduced NK cell line
  • the present inventors investigated whether the antigen-specific cancer cell killing ability was enhanced when the NK111 cell line prepared in Example 8 was transduced with a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (hereinafter, abbreviated as'CAR'). Specifically, for this, the present inventors prepared an FLT3 targeting chimeric antigen receptor gene construct and then transduced it into NK111 to prepare NK111-CAR cells and evaluated their function.
  • a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor
  • scFv targeting FLT3 to NK111 cells prepared in Example 8 (SEQ ID NO: 13), modified human immunoglobulin (modified human Ig) Fc region (SEQ ID NO: 1), and CD28.
  • Anti-FLT3 scFv-CAR protein consisting of a transmembrane domain (SEQ ID NO: 3), DAP10 intracellular activation domain (SEQ ID NO: 5), DAP12 intracellular activation domain (SEQ ID NO: 7), and CD3 ⁇ cytoplasmic domain (SEQ ID NO: 9)
  • SEQ ID NO: 3 A gene construct containing a polynucleotide encoding SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) was prepared and cloned into a transfer vector pBD for preparing a lentivirus to prepare pBD-CAR (FIG. 7C).
  • packaging plasmid psPAX2 Additional plasmid
  • lentiviral helper to Lenti-X cells cultured for 48 hours or 72 hours for the production of lentivirus.
  • 2.4 ⁇ g of plasmid pMD2.G (Addgene plasmid, #12259) was mixed with Lipofectamine (Thermo Fisher Scientific, USA) and transduced into 8.5x10 6 Lenti-X 293T cells (Takara Bio, USA). After incubation at 37° C. for 6 hours, the medium was removed and fresh growth medium was added.
  • the filtered lentivirus-containing supernatant was concentrated using a Lenti-X concentrator (Takara Bio, USA), and the concentrate was stored at 4°C overnight.
  • the concentrate containing lentivirus was centrifuged at 4000 rpm for 60 minutes, the supernatant was removed, and the lentivirus recovered in the form of a pellet was diluted with 1-2 mL of culture solution and stored at -80°C until use.
  • Chimeric antigen receptor modification is an effective method of conferring tumor antigen specificity to NK cells lacking an intrinsically rearranged antigen receptor (Li et al ., Cancer Gene Ther . 17: 147-154, 2010; Wu and Wang, Cell. . Mol Immunol 15:. 1095-1097, 2018).
  • the lentivirus prepared using the pBD-CAR prepared in Example 9-2 was infected with NK111 cells.
  • the cell culture plate was centrifuged at 1,800 rpm at room temperature and then incubated at 37°C for 4 hours. Then, the same infection process was repeated once again and cultured overnight, and then the cells were centrifuged and resuspended in fresh culture medium, followed by incubation for 3 days before evaluation of transgene expression.
  • anti-FLT3 scFv-CAR 72 hours after infection, the expression of anti-FLT3 scFv-CAR was confirmed by flow cytometry, and one week later, detection and isolation of infected cells were performed using a FACSAria cell sorter and Cell Quest software (BD Biosciences, USA). The selected clone was named'NK111-CAR'. The surface expression of anti-FLT3 scFv-CAR was confirmed by flow cytometry using an anti-IgG Fc antibody that recognizes the spacer region (left of Fig. 11A).
  • the NK111 cells expressing the anti-FLT3 scFv-CAR according to the present invention are anti-recognizing the modified Fc region (SEQ ID NO: 1) encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 It was confirmed that it reacts specifically to human Fc protein. This indicates that the introduced CAR is expressed on the cell surface.
  • Recombinant human FLT3-Fc Chimera protein (cat# 368-ST/CF, R&D, USA) was added to the FACS tube after the reaction was completed, and reacted at 4° C. for 20 minutes.
  • 3 ⁇ l of anti-human IgG-PE (cat#: 409304, Biolegend, USA) secondary antibody was diluted in 100 ⁇ l of FACS buffer and bound to add 20 minutes at 4°C. The reaction was carried out. Finally, the unbound antibody was washed twice with FACS buffer, and then FACS analysis was performed (right side of FIG. 11A).
  • NK111 cells expressing the Anti-FLT3 scFv-CAR according to the present invention bind to the human FLT3-Fc protein.
  • CAR is mainly expressed exclusively by NK111-CAR cells in a dimer configuration (FIG. 11B).
  • the present inventors recombined anti- An scFv-modified Fc fusion protein was prepared and the binding to various cancer cells was analyzed through flow cytometry using an anti-FLT3 antibody.
  • the production of the recombinant fusion protein was carried out as follows:
  • HEK293-F cells were seeded in a 1 L shake flask (Corning) at a density of 1.0 ⁇ 10 6 cells/mL in 200 mL, and cultured at 120 rpm and 8% CO 2. One day later, cells were added to 10 mL containing 400 ⁇ g (2 ⁇ g/mL) total of plasmid DNA encoding the anti-FLT3-scFv-Fc protein at the same molar ratio at a cell density of about 2.0 ⁇ 10 6 cells/mL.
  • the anti-FLT3-scFv-Fc construct is composed of an anti-FLT3 scFv composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 in the Anti-FLT3 scFv-CAR prepared in Example 10 and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It was constructed to include a polynucleotide encoding a fusion protein to which the modified Fc region is linked.
  • Proteins were purified from the cell culture supernatant collected with reference to standard protocols.
  • the antibody was applied to a Protein A Sepharose column (GE healthcare) and washed with PBS (pH 7.4). After eluting the antibody at pH 3.0 with 0.1 M glycine buffer, the sample was immediately neutralized with 1 M Tris buffer.
  • the eluted antibody fraction was exchanged with PBS (pH 7.4) using a Pierce Dextran Desalting Column (5K MWCO), and then concentrated using a MILLIPORE Amicon Ultra (10 MWCO) centrifugal concentrator, and the purified protein was subjected to BCA technique. It was quantified through.
  • Acute myelogenous leukemia cell lines EOL-1, MOLM-13, and REH cell lines known to express FLT3 protein on the cell surface, and FLT3-negative cell lines K562, Daudi, and normal human bone marrow cells ( using 2.5x0 5 cells) were twice as FACS buffer. After washing, 4 ⁇ l of Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) (cat# 422302, Biolegend, USA) was diluted in 100 ⁇ l of FACS buffer, and then reacted for 10 minutes at room temperature. To the FACS tube after the reaction was completed, 1 ⁇ g of the anti-FLT3-scFv-Fc protein prepared above was added and reacted at 4° C. for 20 minutes.
  • anti-FLT3 scFv-hyFc fusion protein showed strong binding to FLT3 + EOL-1, MOLM-13, and REH cell lines, but against FLT3 - K562, Daudi, and normal human bone marrow cells. Did not bind (FIG. 12 ).
  • the present inventors investigated antigen-specific tumor cell killing activity by NK cell lines when co-cultured with these cell lines and NK111 or NK111-CAR cells.
  • NK111-CAR cells showed stronger cytotoxicity to the FLT3 + EOL-1, MOLM-13, and REH cell lines, compared to the parental NK111 cells, and FLT3- K562, Daudi and normal human bone marrow cells. It showed a similar degree of cytotoxicity to (Fig. 13).
  • Example 10 In vitro of NK111-CAR cells ( in vitro ) Anti-cancer activity assay
  • EOL-1 acute myelogenous leukemia
  • MOLM-13 acute myelogenous leukemia
  • REH acute lymphocytic leukemia
  • K562 Chronic myelogenous leukemia
  • normal human bone marrow cells normal BM
  • NK111-CAR cells showed significantly higher apoptosis than NK111, a control group, in FLT3-expressing cells EoL-1, MOLM-13, and REH cells, whereas in FLT3-negative normal bone marrow cells.
  • NK111 it was confirmed that it did not show cell killing ability similar to NK111. This means that NK111-CAR cells specifically recognize FLT3-expressing cancer cells.
  • Example 11 Analysis of changes in NK111-CAR cell characteristics according to irradiation
  • NK111-CAR cell line of the present invention was transgenic using a lentivirus to NK101, a cell line derived from NK lymphoma, in order to be used as a therapeutic agent, cell growth was suppressed through irradiation to remove tumorigenicity and at the same time It must maintain anti-cancer activity.
  • the present inventors evaluated whether or not to inhibit cell growth and kill cancer cells after irradiating NK111-CAR cell line with 0 Gy or 10 Gy of gamma radiation (FIG. 15).
  • NK111-CAR cells not irradiated with radiation showed a continuous proliferation pattern until day 4, whereas NK111-CAR cells irradiated with 10 Gy radiation inhibited cell growth and died after 72 hours. Confirmed that.
  • the NK111-CAR cell line irradiated with 10 Gy of radiation showed remarkably higher cell killing ability than the control NK111 in FLT3 overexpressing cells EOL-1 and Molm-13, and even after irradiation with radiation It was confirmed that it was maintained.
  • K562 cells which are FLT3 non-expressing cells, showed similar levels of killing ability as the control NK111 both before and after irradiation. Therefore, it can be seen that the NK111-CAR cell line exhibits equivalent activity without proliferation in the body even after irradiation, so it can be used for removing cancer cells.
  • Example 12 In vivo of NK111-CAR cells ( in vivo ) Anti-leukemia activity analysis and improvement of anti-cancer efficacy by co-administration
  • the present inventors analyzed the anticancer activity of the NK111-CAR cell line using an AML xenograft tumor model mouse to analyze the in vivo anticancer activity of NK111-CAR.
  • EoL-1-luc-EGFP 1x10 6 cells a human acute myelogenous leukemia cell line expressing FLT3 and luciferase, were intravenously administered to 6-8 weeks old mice (NOD/SCID IL2R ⁇ null , NSG) for removing magnetic immunity, and 4 days elapsed. Then, the control (growth medium) and 10 Gy irradiated NK111-CAR cells 5 ⁇ 10 6 cells were administered intravenously 5 times a week, a total of 10 times at 24 hour intervals.
  • the degree of bioluminescence due to luciferase emitted from cancer cells was administered subcutaneously with 150 mg/kg luciferin, and then tumor growth was periodically monitored by bioluminescence imaging (BLI) using Lago (Spectral Imaging Instruments, Arlington, AZ) ( 14a).
  • BLI bioluminescence imaging
  • Lago Spectral Imaging Instruments, Arlington, AZ
  • the experimental animals were sacrificed, and the bone marrow, spleen, lungs and liver were excised and treated as previously reported (Kim et al ., Clin. Cancer Res. 19: 415 -427, 2013).
  • Single cell suspensions derived from various organs were subjected to flow cytometry by staining with an APC-conjugated anti-CD56 antibody (clone HCD56, Biolegend) and LIVE/DEAD Fixable Near-IR dye.
  • Live cells were gated and the proportions of residual tumor cells (GFP-positive) and NK111-CAR cells (PE-positive) were measured using the BD LSRFortessa system.
  • GFP-positive residual tumor cells
  • PE-positive NK111-CAR cells
  • EOL-1 tumor-bearing mice were injected with irradiated 5X10 6 NK111-CAR cells 3 times at 1 week intervals for 2 weeks. All animal experiments were conducted in accordance with the guidelines of the Laboratory Animal Care and Use Committee.
  • NK111-CAR cells irradiated with 10 Gy radiation exhibited a significant level of anti-leukemia inhibitory effect compared to the control.
  • the anticancer efficacy of NK111-CAR was observed by co-administration with LY2510924, a CXCR4 peptide antagonist.
  • intraperitoneal administration was performed 5 times a week from the time of administration of NK111-CAR cells, and a total of 10 times at 24 hour intervals.
  • the efficacy was further enhanced when administered in combination with NK111-CAR alone.
  • NK111-CAR cells 1X10 8 to 5X10 12 cells
  • the genetically modified immune cell line according to an embodiment of the present invention may be usefully used in the manufacture of an anticancer cell therapy agent.

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Abstract

본 발명은 보다 효율적인 급성 골수성 백혈병의 면역치료를 위해, FLT3 특이적 단일클론 항체 또는 그의 기능적 단편, 세포막 통과 도메인, 및 T 세포 수용체의 CD3ζ 도메인을 포함하는 암항원 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 단백질을 발현하도록 숙주 면역세포를 형질전환시킨, 유전자 변형 NK 세포주 및 그의 용도를 제공한다.

Description

신규 키메라 항원 수용체 암호화 유전자가 형질도입된 유전자 변형 NK 세포주 및 그의 용도
본 발명은 키메라 항원 수용체 암호화 유전자로 형질전환된 유전자 변형 면역세포주 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항암 활성, 특히 급성 골수성 백혈병에 대한 항암활성이 향상된 신규 키메라 항원 수용체 암호화 유전자가 형질도입된 유전자 변형 NK 세포주 및 그의 용도에 관한 것이다.
암 면역세포치료는 암환자 자신의 면역세포를 추출하여 증식시킨 뒤, 환자에게 다시 투여하여 암세포의 증식을 억제 제거하는 치료기술이다. 암 면역세포치료에는 다양한 종류의 면역세포 중 수지상세포(dendritic cells, 이하 DCs), 자연살해세포(natural killer cells, 이하 NKs) 및 세포 독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, 이하 CTLs)가 주로 사용되고 있다. 특히, CTLs의 경우, 면역기억(immunological memory) 기능, 항원 특이성 및 뛰어난 생체 내 증식능을 가지고 있다는 장점이 있어, 수지상 세포와 자연살해 세포에 비하여 상대적으로 많은 연구가 이루어지고 있는 실정이다.
T 세포치료제는 현재까지 3세대까지 개발되고 있는데 제1세대 T 세포치료제는 혈액 또는 암 조직 내 존재하는 모든 T 세포(bulk T cells)를 증식시켜 환자에게 투여하였기 때문에 암세포에 대한 특이성이 낮아 효력을 기대할 수 없었고, 제2세대 T 세포치료제는 종양 항원 특이적 T 세포만(Ag-specific T cells)을 분리/대량 배양하여 암 환자에게 투여하는 방법으로 증진된 치료 효과를 보였으나, 배양기간이 길고 공정이 복잡하다는 문제가 대두되었으며, 제3세대 T 세포치료제는 1) 특정 암항원을 인식하는 TCR 유전자를 T 세포에 직접 도입하거나, 2) 특정 항원을 인식하는 단클론항체의 항원인식부위(scFv)에 T세포 활성화 도메인(T cell activation domain)을 결합시켜 T 세포에 도입함으로써, 항원 특이성을 높이고 제조기간을 단축하였을 뿐 아니라, 그 치료 효능 또한 매우 뛰어나 일부 백혈병 및 림프종에서 100%에 가까운 치료 효과를 유도하였다.
상기와 같은 제3세대 T 세포치료제는 이른바 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, 이하, 'CAR'라고 약칭함)를 발현하도록 유전자 조작된 것을 특징으로 하고 있는데, 아직까지 임상시험을 통해 승인을 받은 치료제는 존재하지 않는다.
상기 CAR 도입 T 세포 기술을 기반으로 가장 앞서가고 있는 기업은 미국의 Novartis, Juno Therapeutics사 그리고 Kite Pharma사로 모두 B 세포 특이 항원인 CD19를 표적화하는 CAR 도입 T 세포를 개발하였으며, 저항성/재발성 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 비호지킨 림프종(NHL)에서 80 내지 90%에 육박하는 높은 치료율을 보여 표적지향성 면역세포치료제 분야의 선두주자로 자리매김하고 있다(Hartmann et al., EMBO Mol. Med. 9(9): 1183-1197, 2017).
그러나 상기 CD19 표적 CAR 도입 T 세포의 경우 ALL 및 NHL만을 적응증으로 하고 있어, 범용성이 떨어지고 B 세포 특이 항원을 표적으로 하고 있고, 최근 급성 골수성 백혈병(AML)을 대상으로 한 임상 시험에서는 CAR-T 치료제의 항암 효능이 미비한 반면 cytokine release syndrome 등의 심각한 부작용을 동반하여 이에 대한 극복 방안(차세대 CAR 플랫폼 개발)이 절실히 요구되고 있다.
자연 살해(natural killer) 세포주는 무제한 확장성, 세포 균일성, 제품 안정성(특히 동결/해동 후) 및 배치간 일관성을 기반으로, 별다른 개조 없이도 상업적으로 매력적인 품질-관리(quality-controlled) 면역요법 플랫폼으로 간주되고 있다(Yang et al., J. Immunother. Cancer 7: 138, 2019). 그 중에서도 NK-92는 FDA의 임상시험 승인을 받은 가장 집중적으로 특성이 연구된 대표적인 NK 세포주이다(Klingemann et al., Front. Immunol. 7: 91, 2016). GMP 준수 조건에서 NK-92 세포는 무-이종세포의 피더-비의존적인 방식으로 증식될 수 있다(Arai et al., Cytother. 10: 625-632, 2008). 3주 이내에 최대 1 L 배양백 당 109 세포까지 치료 투여량에 도달하였다(Arai et al., Cytother. 10: 625-632, 2008). 암 환자의 경우 NK-92를 최대 5x109 세포/m2의 격일 용량으로 반복 투여(최대 6 개월 주기로 세 번 주입)는 안전하고 잘 견디는 것으로 확인되어(Williams et al., Oncotarget 8: 89256-68928, 2017), 외래 면역세포 전달(adoptive cell transfer)을 위한 플랫폼으로서의 가치가 더욱 높아졌다. 그러나, NK-92 주입시 다량의 투여에서도 치료받은 39 명의 환자 중 단 2건의 완전관해가 보고된 것처럼 제한적인 임상효능을 보여주었다(Yang et al., J. Immunother. Cancer 7: 138, 2019). 또한 환자에게 주입 전 방사선 조사가 필요하고 투여 후 생체 내 지속성 손실이 보고된 바 있어, NK 세포주 기반 치료법의 임상적 매력도는 더욱 감소되고 있다(Zhang et al., Front. Immunol. 8: 533, 2017; Tang et al., Am. J. Cancer Res. 8: 1083-1089, 2018; Qu et al., MRS Commun. 9: 433-440, 2019). 이러한 단점에 대응하여 특히 유전 공학을 통해 NK 세포주의 기능을 개선하기 위한 수많은 노력이 수행되고 있다.
NK 세포주의 유전자 변형 전략은 종양 인식 및 사멸 활성을 향상시키는 데 초점을 맞추고 있는 하기 네 가지 카테고리로 분류될 수 있다: 첫째, 누락된 활성화 또는 공동 자극 수용체 발현의 도입에 의해 NK 세포주의 세포용해 활성이 회복되는 것으로 나타났다. Liu 등은 CD18 유전자를 돌연변이 NK 세포주인 YT-1(-)에 형질감염시켜 CD11a/CD18αβ 이종 이량체(LFA-1)의 표면 발현을 유도였고, 그 결과 Raji 세포에 대한 세포독성의 증가를 입증하였는데, 이는 아마도 LFA-1-매개 종양세포로의 부착을 촉진함으로써 달성된 결과로 보인다(Liu et al., Cell Immunol. 156: 24-35, 1994). 둘째, 자가 분비 자극을 위한 NK 세포주에서 사이토카인의 이소성 발현에 의해 효과기 기능의 향상이 야기됐다. 예를 들어, IL-15 유전자 변형은 NKL과 NK-92 모두에서 IFN-γ 분비와 함께 증가된 종양 살해활성을 유도하였다(Jiang et al., Immunobiol. 219: 547-553, 2014; Zhang et al., Haematologica 89: 338-347, 2004). 셋째, 종양 미세환경을 극복하기 위한 조치로 억제 분자에 대한 미끼 수용체를 NK 세포주에 삽입하였다. Yang 등은 우성 음성 TGF-β 제2형 수용체(DNTβRII)를 발현하도록 변형된 NK-92가 TGF-β-매개 억제성 효과에 대하여 저항성을 갖게 되고 그에 따라 Calu-6 이종이식 모델에서 모 NK-92 세포주보다 더 뛰어난 항암 효과를 나타냄을 보여줬다(Yang et al. Int. Immunopharmacol. 17: 198-204, 2013). 넷째, 특정 항원을 인식하기 위해 NK 세포주를 재지향하기 위한 키메라 항원 수용체(CAR)의 도입이 활발히 연구되고 있다. 대표적으로, 항-CD19-CAR 변형은 NK-92 세포가 이전에 내성이 있는 B 세포 백혈병 세포주에 대한 세포독성을 회복하도록 하였다(Boissel et al., Leuk. Res. 33: 1255-1259, 2009; Romanski et al., J. Cell Mol. Med. 20: 1287-1294, 2016). 이러한 전략 외에도 자살 유전자를 NK 세포주에 도입하는 것이 방사선 조사를 대체하는 동시에 주입된 NK 세포의 생체 내 지속성을 확장할 수 있는 "사멸 스위치"를 제공하기 위해 제안되었다. Qu 등은 최근에 유도성 카스페이즈 9(iCasp9) 자살 유전자를 CAR-NK92 세포에 전달하고 AP20187 투여시 생체 내에서 형질도입된 NK 세포의 제거를 입증하였다(Qu et al., MRS Commun. 9: 433-440, 2019). 다중 유전자 조작 전략은 현상태의 NK 세포주의 미충족 요구에 맞추어 개발중이며, 이러한 접근방법들의 통합에 의해 차세대 NK 세포주 기반 면역 요법을 위한 길이 열릴 수 있다.
한편, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, 이하 AML)은 백혈병 중 가장 발생빈도가 높은 질환으로 급성백혈병의 약 70%를 차지하며, 미국에서는 10만명당 4명의 발생빈도를 보이고 (Dㆆhner, H. et al., Blood, 115(3): 453-474, 2010), 매년 약 13,000명 이상의 새로운 환자가 발생하고 9,000명 정도가 사망하는 것으로 보고되고 있다(SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005). 더욱이, AML은 연령의 증가와 함께 발생빈도가 증가하여, 75세 이상에서는 10만 명당 15명으로 연간 발생율이 급격히 증가하며, 발생연령의 평균이 67세이고, 새로 진단되는 환자의 35%가 75세 이상인 것으로 보고되고 있다(SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005).
AML은 골수성(myeloid) 계열의 세포가 악성 종양으로 발전하는 암으로써, 비정상적인 백혈구가 증식하여 골수에 축적되고 궁극적으로 정상적인 혈액세포를 만들지 못하고 적절한 치료를 받지 못하면 발명 후 수 주 혹은 수 달 내에 환자를 사망에 이르게 하는 질환이다. AML의 치료는 정상적인 조혈기능이 회복될 정도로 백혈병세포를 줄여 완전관해를 얻기 위한 관해유도 항암화학요법(induction therapy)과 관해 후 재발을 막기 위한 관해 후 치료(postremission therapy)로 나누어지는데, 관해 후 치료에는 공고 항암화학요법(consolidation chemotherapy), 자가 및 동종 조혈모 세포 이식이 있다. 초기의 표준 관해유도 항암화학요법으로 젊은 환자(60세 미만)의 대부분(70 - 80%)은 완전관해상태(complete remission)에 도달할 수 있으나, 이중 약 절반의 환자가 결국 재발하게 되어 5년 생존율은 40-45%에 그치는 것으로 알려져 있고, 60세 이상의 환자는 예후가 더욱 불량하여, 완전관해율은 40-50%에 불과하고 평균생존 기간은 1년 미만이며, 완치율은 10% 미만에 머물러 있는 실정이다.
본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 암, 특히 급성 골수성 백혈병의 치료에 효과적인 신규 키메라 항원 수용체 및 세포 세포자살 유전자를 동시에 발현하도록 형질전환된 유전자 변형 NK 세포주, 상기 유전자 변형 NK 세포주를 이용한 암 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기의 특성을 갖는 분리된 NK 세포주에 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어 상기FLT3 특이적 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전자 변형 NK 세포주가 제공된다:
CD2, CD7, CD11a, CD25, CD28, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L 및 CD56은 양성; 및
CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD23, CD34, TCRαβ 및 TCRγδ는 음성.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 세포치료제가 제공된다.
아울러 본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 유전자 변형 NK 세포주 및 자살유도제를 포함하는 암 치료용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 유전자 변형 NK 세포주 및 선택적으로 자살유도제를 암의 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 FLT3 특이적인 키메라 항원 수용체 단백질 및 세포자살 유전자를 동시에 발현하는 유전자 변형 면역세포 및 상기 유전자 변형 면역세포 및 자살유도제를 포함하는 암 치료용 키트는 암 세포의 사멸에 매우 효율적이기 때문에, 새로운 면역세포치료제로 암, 특히 기존의 난치성 암의 일종인 급성 골수성 백혈병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 NK101 세포주의 계대에 따른 세포증식 정도를 나타내는 그래프이고, 도 1b는 NK101 세포가 CD3, CD20, 및 CD16 음성이며 CD56 양성인 NK세포임을 확인한 도트 그래프이다. 도 1c는 상기 NK101 세포의 배양시 확인되는 세포형태를 현미경을 이용하여 촬영한 사진이며, 도 1d는 Wright-Giemsa 염색법을 이용하여 NK101 세포의 형태를 촬영한 사진이고, 도 1e는 상기 NK101 세포가 NK세포의 주요 세포 사멸인자인 Perforin(녹색) 및 Granzyme(적색)을 발현함을 형광염색 기법을 통해 확인한 사진이며, 도 1f는 NK101이 MHC class I 음성 세포인 K562에 대한 세포사멸능을 암세포와 NK101 공배양을 통해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 NK101와 NK-92의 IL-2 농도 의존적 세포 성장률 및 민감도를 MTS 분석을 이용하여 비교 분석한 그래프이고, 도 2b는 NK101 및 NK-92의 IL-2 수용체 소단위의 발현도의 차이를 유세포 분석을 이용해 확인한 일련의 히스토그램이며, 도 2c는 NK101 및 NK-92의 해동 시점부터 세포증식 및 생존율을 동일 배양조건에서 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2d는 배양적응 후 증식정도 및 배가시간을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3a는 NK101 세포에서의 주요 계통(lineage) 또는 조상 표지자 (progenitor marker) 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이고, 도 3b는 NK101 세포에서의 활성화 수용체 및 비활성화 수용체 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이며, 도 3c는 NK101 세포에서의 세포부착 인자 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이고, 도 3d는 NK101 세포에서의 NK 세포 의존적 세포독성에 관여하는 CD107a, 퍼포린, 그랜자임, FasL 및 TRAIL 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이며, 도 3e는 NK101 세포에서의 사이토카인 수용체 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이고, 도 3f는 NK101 세포에서의 다양한 C-C 케모카인 수용체 및 C-X-C 케모카인 수용체 발현에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이다.
도 4a는 NK101, NK-92 및 초도배양 CD56+ 말초혈액 NK 세포의 CD56 발현을 확인한 유세포 분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 4b는 상기 세포들의 CD56 및 CD62L 발현을 확인한 유세포 분석 결과를 나타내는 2차원 등고선 그래프이다.
도 5a는 각각 표기된 사이토카인을 3일간 배양액에 처리한 후 NK101 세포의 증식률을 MTS 분석법으로 확인한 결과를 나타내는 그래프(좌측) 및 NK 활성화 사이토카인인 IFN-γ의 생성을 ELISA로 확인한 결과를 나타내는 그래프(우측)이고, 도 5b는 NK101 세포를 K562 또는 THP-1 암세포주와 24시간 공배양한 후 분비되는 사이토카인을 Multiplex 분석법으로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 다양한 암세포주와 NK101 세포를 다양한 세포비율로 24시간 공배양하여 암세포의 사멸도를 확인한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6b는 NK101 세포에 각각 표기된 표면항체에 대한 중화항체를 처리하고 급성골수성백혈병 세포주 THP-1과 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 세포사멸도를 측정한 그래프이며, 도 6c는 NK101 세포에 각각 표기된 표면항체에 대한 중화항체를 처리하고 만성골수성백혈병 세포주 K562와 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 세포사멸도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6d는 NK101 세포에 각각 표기된 표면항체에 대한 중화항체를 처리하고 급성림프구성백혈병 세포주 Jurkat과 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 세포사멸도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 6e는 NK101에 각각 DNAM-1, CD54 혹은 DNAM-1 및 CD54 중화항체를 처리한 후, 각 표지자의 동시 중화에 의한 상승적 저해작용(synergistic inhibition)을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 렌티바이러스 제조를 위해 사용된 렌티바이러스 트랜스퍼 플라스미드들(A: pBD-7.28.CD, B: pBD-15.TN, 및 C: pBD-CAR)의 구조를 개략적으로 나타낸 일련의 벡터맵이다.
도 8a는 NK101 및 기존에 구축된 세포주 KHYG-1, 및 NK-92에서의 CD7, CD28 보조자극인자의 발현 양상을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 8b는 상기 도 7b에 도시된 유전자 컨스트럭트가 도입된 NK101 세포(NK101-7.28.CD로 명명)에서의 CD7, CD28 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 8c는 NK101-7.28.CD 세포에서의 CD 발현을 역전사 PCR을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이며, 도 8d는 다양한 암세포(SK-MES-1, K562, A2780, Jeko-1, EoL-1, KG-1, IM9, Raji 및 HDLM-2)의 CD80(청색), CD86(녹색), 및 SECTM1(적색)의 표면발현 여부를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이고, 도 8e는 상기 도 8d에서 사용된 암세포(SK-MES-1, K562, A2780, Jeko-1, EoL-1, KG-1, IM9, Raji 및 HDLM-2)를 NK101 또는 NK101-7.28.CD 세포와 1:1, 2:1 및 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 암세포 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 일련의 그래프이며, 도 8f는 다양한 농도의 5-FC를 NK101 또는 NK101-7.28.CD 세포에 48시간 처리한 뒤, 세포 성장률을 MTS 분석을 통하여 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 NK101 및 NK101-7.28.CD 에 상기 도 7의 pBD-15.TN 컨스트럭트가 각각 도입된 NK101-15.TN 및 NK111 세포 표면에서의 IL-15 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이며, 도 9b는 NK101-15.TN 및 NK111 세포에서의 TGFβRIIΔcyto 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이다.
도 10a는 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 및 NK111 세포의 배양 시, IL-2 무첨가에 따른 세포수 증식수준(population doubling level)을 나타낸 그래프이고, 도 10b는 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 및 및 NK111 세포에서의 NKG2D 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이며, 도 10c는 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 및 NK111 세포를 다양한 암세포( (SK-MES-1, K562, A2780, Jeko-1, EoL-1, KG-1, IM9, Raji 및 HDLM-2)와 1:1, 2:1 또는 4:1 비율로 공배양 시, 암세포의 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 일련의 그래프이고, 도 10d는 HDLM-2(좌측) 또는 IM9(우측) 세포주를 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 및 NK111 세포와 공배양시, 다양한 농도의 TGFβ1을 처리한 후, 암세포 사멸능에 미치는 영향을 나타낸 일련의 그래프이며, 도 10e는 본 발명의 일 실시예에 따른 NK101(흑색), NK101-7.28.CD(청색), NK101-15.TN(녹색) 및 NK111(적색) 세포주의 DNAM-1, NKp46, NKp44, NKp80, ILT2, KIR2DL/S1/S3/S5 및 KIR2DL2/L3의 발현 양상을 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이다.
도 11a는 NK111에 상기 도 7의 pBD-CAR 컨스트럭트가 도입된 NK 세포주(NK111-CAR로 명명)의 세포 표면에서의 CAR 발현(좌측) 및 FLT3-Fc 단백질과 결합하는 정도(우측)를 유세포 분석법을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 NK101, NK111 및 NK111-CAR 세포주에서 CAR 컨스트럭트의 발현여부를 항-CD3ζ항체를 사용한 웨스턴 블랏 분석으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 상용화된 항-인간 FLT3 항체(상단) 및 anti-FLT3-scFv-hyFc(하단)의 EoL-1, REH, Molm-13, Daudi, K562 세포주 및 정상 골수 유래 말초혈액세포에 대한 반응성을 유세포 분석법을 통해 확인한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이다.
도 13은 EoL-1, REH, Molm-13, Daudi, K562 및 정상 골수 유래 말초혈액세포를 NK111 또는 NK111-CAR 세포와 1:1, 2:1 및 4:1의 E:T 비율로 공배양 시 각 암세포 사멸 빈도를 유세포 분석법을 통해 측정한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 14는 방사선 조사에 따른 NK111-CAR 세포의 면역표현형 변화를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이다.
도 15a는 방사선 유무에 따른 세포수(좌측)와 생존율(우측)을 나타낸 그래프고, 도 15b는 방사선 조사 유무에 따른 EoL-1, Molm-13 및 K562 암세포의 사멸 빈도를 분석하고자 상기 세포들 각각과 NK111 또는 NK111-CAR 세포를 1:1, 2:1 및 4:1의 E:T 비율로 공배양한 후, 유세포 분석법을 통해 살상능을 측정한 그래프이다.
도 16은 급성골수성백혈병 이종이식 종양 모델 마우스에 방사선 조사한 NK111-CAR 를 단독투여하였을 때와 CXCR4 antagonist인 LY2510924를 병용투여하였을 때의 생체 내 항암효능을 분석한 결과로서, 도 16a는 본 발명의 일실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주의 투여스케쥴을 개략적으로 나타낸 것이고, 도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 및/또는 LY2510924 투여 0일, 7일 및 14일 경과 후 체내 암세포 분포를 확인한 전신 이미징 결과를 나타내는 일련의 사진이고, 도 16c는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 및/또는 LY2510924 투여 14일 경과 후 종양조직에서의 생물발광 정도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "CAR 컨스트럭트"는 "키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor) 컨스트럭트"의 약어로, 통상적으로 항원 인식부위로 scFv, sdAb와 같은 단일쇄 기반의 항체 유사체-세포막 통과 도메인-보조자극인자-세포내 신호전달 도메인으로 구성된 합성 단백질로서 T 세포 등 면역세포에 형질도입되어 암세포 특이적인 항원을 인식하여 CAR 컨스트럭트를 발현하는 면역세포의 이들 암세포에 대한 항암 활성을 향상시키는 것으로 잘 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "scFv"는 "single chain variable fragment"의 약어로서 실제 항체의 단편은 아니며, 항체의 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 약 25 a.a. 크기의 링커 펩타이드로 연결하여 제조한 일종의 융합단백질로서 고유의 항체 단편이 아님에도 불구하고 항원 결합능을 지닌 것으로 알려지고 있다(Glockshuber et al., Biochem. 29(6): 1362-1367, 1990).
본 문서에서 사용되는 용어 "유전자 변형(genetically modified)"이라는 용어는 숙주세포, 또는 선행종(predecessors)/모종(parents) 중 하나로 도입된 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 숙주세포가 자신의 게놈 외에 포함하는 것을 의미한다. 아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 게놈 외부의 독립적 분자, 바람직하게는 복제할 수 있는 분자로서 유전적으로 변형된 숙주세포 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주 면역세포의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "세포자살 유전자(cell suicide gene)"는 세포독성을 유발하거나 또는 세포사멸 기전을 촉발시킴으로써 해당 유전자가 발현되는 세포가 사멸하도록 유도하는 유전자를 의미한다. 특히 유전자 발현 자체로는 세포사멸이 촉발되지 않으나 특정 프로드러그(prodrug)를 처리시 세포자살 유전자에 의한 프로드러그의 대사산물이 세포독성 또는 세포사멸 기전을 촉발함으로써 세포를 사멸에 이르게 할 수 있다. 이러한 세포자살 유전자들에는 간시클로비르를 자살 유도신호로 사용하는 헤르페스 단순포진 바이러스 티미딘 인산화 유전자(HSV TK), 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-mehoxypurine arabinonucleoside)를 자살 유도 신호로 사용하는 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 인산화효소(VZV TK), 5-플루오로시토신(5-FC)를 자살 유도신호로 사용하는 시토신 디아미네이즈(CD), 우라실 포스포리보실전이효소(UPRT) 및 상기 CD 및 UPRT의 융합단백질(CD::UPRT), 이리노테칸(CPT-11)을 자살 유도신호로 사용하는 카르복실 에스터라제, 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954)를 자살 유도신호로 사용하는 니트로리덕테이즈, 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA)을 자살 유도신호로 사용하는 카르복시펩티데이즈 G2, 분자간 이량화 유도제(dimerizer)를 자살 유도신호로 사용하는 유도성 카스페이즈 9(iCas9)이 보고된 바 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "CD::UPRT"는 세포자살 유전자로서 cytosine deaminase(CD)와 uracil phosphoribosyl transferase(UPRT)가 융합된 형태의 융합단백질이다. 상기 CD::UPRT는 5-fluorocytosine(5-FC)를 세포에 치명적인 작용을 하는 5-fluorouracil(5-FU)로 전환시키는 역할을 수행함으로써 5-FC 처리시 세포의 자살을 유도한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "mbIL-15"는 막에 결합된 형태의 IL-15를 의미하는 것으로, 분비형 IL-15와 구분이 되는 개념이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "TGFβRⅡΔcyto"는 TGFβ 수용체중 하나인 TGFβRII의 세포질 도메인 부분(192-567 a.a. 위치)이 제거된 변이체로서 TGFβ와 결합은 하나, 세포내 신호전달을 할 수 없는 변이체를 의미한다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기의 특성을 갖는 분리된 NK 세포주에 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어 상기FLT3 특이적 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전자 변형 NK 세포주가 제공된다:
CD2, CD7, CD11a, CD25, CD28, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L 및 CD56은 양성; 및
CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD23, CD34, TCRαβ 및 TCRγδ는 음성.
상기 유전자 변형 NK 세포주는 세포자살 유전자가 추가로 형질도입된 것일 수 있다.상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 세포자살 유전자는 우라실 포스포리보실전이효소(UPRT) 유전자, 헤르페스 단순포진 바이러스 티미딘 인산화 유전자(HSV TK), 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 인산화효소(VZV TK) 유전자, 시토신 디아미네이즈 유전자(CD), 상기 CD 및 UPRT의 융합단백질(CD::UPRT)을 암호화하는 유전자, 카르복실 에스터레이즈 유전자, 니트로리덕테이즈 유전자, 카르복시펩티데이즈 G2 유전자, 또는 유도성 카스페이즈 9(iCas9) 유전자일 수 있고, 상기 CD::UPRT는 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주는 막결합 IL-15(mbIL-15)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 추가로 형질도입된 것일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주는 세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체II(TGFβRIIΔcyto)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 추가로 형질도입된 것일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 분리된 NK 세포주는 NK101 세포주(KCTC 13305BP)에 CD7-CD28-CD::UPRT 컨스트럭트 및 mbIL-15-TGFβRⅡΔcyto 컨스트럭트가 형질도입된 NK111 세포주일 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체는 FLT3에 특이적으로 결합하는 scFv, 변형 Ig Fc 영역, CD28 막통과 도메인, DAP10 세포내 활성화 도메인, DAP12 세포내 활성화 도메인 및 T 세포 수용체의 CD3ζ 세포질 도메인으로 구성될 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 FLT3에 특이적으로 결합하는 scFv는 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 변형 Ig Fc 도메인은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 상기 CD28 막통과 도메인은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 DAP10 세포내 활성화 도메인은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 상기 DAP12 세포내 활성화 도메인은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 T 세포 수용체의 CD3ζ 세포질 도메인은 서열번호 9로 구성되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체는 전체적으로 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12로 기재되는 핵산서열로 구성될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "DAP10"은 면역 수용체 복합체를 형성하는 막통과 신호 어댑터로서, HCST(hematopoietic cell signal transducer) 유전자에 의해 암호화되는 조혈성 세포 신호 전달자를 의미하며, NK 세포의 활성화 및 T 세포 반응에 의한 세포의 생존 및 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "DAP12"는 12 kDa 크기의 막통과 단백질로서 상기 DAP10과 높은 상동성을 가지고 있으며, NK 세포에서 중요한 신호전달 수용체로 인식되고 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 세포자살 유전자는 우라실 포스포리보실전이효소(UPRT) 유전자, 헤르페스 단순포진 바이러스 티미딘 인산화 유전자(HSV TK), 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 인산화효소(VZV TK) 유전자, 시토신 디아미네이즈 유전자(CD), 상기 CD 및 UPRT의 융합단백질(CD::UPRT)을 암호화하는 유전자, 카르복실 에스터레이즈 유전자, 니트로리덕테이즈 유전자, 카르복시펩티데이즈 G2 유전자, 또는 유도성 카스페이즈 9(iCas9) 유전자일 수 있고, 상기 CD::UPRT는 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 mbIL-15는 서열번호 23으로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주에 있어서, 상기 TGFβRIIΔcyto는 서열번호 23으로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다
본 문서에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 단일클론항체의 항원에 결합 부분(가변 영역)을 림프구 활성화 수용체로부터 유래된 세포 내 신호전달 부위를 융합하여 제조된 일종의 융합단백질을 지칭한다. 이들 키메라 항원 수용체가 인간 T 세포들에서 발현되었을 때 MHC(major histocompatibility complex) 제한의 한계성 없이 강력한 세포 작용 기작들을 유도할 수 있다. 이러한 접근법의 잠재성은 CAR를 발현하는 T 세포들이 췌장암 환자들에게 주사된 임상적 연구에서 보고되었다. 지속적인 효능과 현저한 객관적인 반응(objective responses)이 저항성을 보이는 환자들에서 관찰되었고, CAR 기술의 활용이 좀 더 광범위하게 암 치료에서 사용될 것으로 전망되고 있으며, 현재 1세대, 2세대를 거쳐 3세대 CAR 분자가 보고되고 있다.
보다 구체적으로, 상기 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체, CD7-CD28-CD::UPRT 컨스트럭트 및 mbIL-15-TGFβRⅡΔcyto 컨스트럭트는 융합단백질의 형태로 발현이 되거나, 단일 유전자 컨스트럭트 내에 클로닝된 후, 숙주 면역세포를 형질감염하여 공발현되거나, 별도의 유전자 컨스트럭트 내에 각각 클로닝된 후, 숙주 면역세포를 공형질감염함으로써 공발현될 수 있다. 상기 단일 유전자 컨스트럭트 내로 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, CD7-CD28-CD::UPRT 컨스트럭트 및 mbIL-15-TGFβRⅡΔcyto 컨스트럭트가 클로닝되는 경우 별도의 프로모터에 각각 작동 가능하게 연결되어 발현되거나, 세 폴리뉴클레오티드 모두 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되되, 상기 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, CD7-CD28-CD::UPRT 컨스트럭트 및 mbIL-15-TGFβRⅡΔcyto 컨스트럭트는 각 컨스트럭트가 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site, IRES)로 연결됨으로써 폴리시스트로닉하게(polycistronic) 발현되도록 할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "작동가능하게 연결된(operably linked to)"은 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미하고, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 다른 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 당해 특정 단백질이 다른 단백질과 융합단백질의 형태로 발현될 수 있다.
상기 유전자 컨스트럭트는 발현벡터에 클로닝되어 숙주 면역세포를 형질감염시킬 수 있는데, 이러한 벡터에는 프로모터를 포함한 내부에 클로닝된 유전자의 발현을 가능케하는 다양한 조절인자들을 포함할 수 있다. 상기 조절인자들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절인자들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절인자들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절인자들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 1995, 270: 25739-25745)에 기술되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절인자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오티드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(In-vitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pX(Pagano (1992) Science 255, 1144-1147), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris, Cell 75: 791-803, 2005)가 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 세포치료제가 제공된다.
상기 암 치료용 세포치료제는 적어도 하나 이상의 다른 항암제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항암제는 알킬화제, 항대사제, 항미세소관제, 토포아이소머레이즈 저해제, 세포독성 제제, 세포증식/이동 및 생존 신호전달 경로 억제제, 세포자살 유도제, 또는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 저해제일 수 있다.
상기 암 치료용 세포치료제에 있어서, 상기 알킬화제는 nitrogen mustard, nitrosourea, tetrazine, aziridine, 또는 cisplatin일 수 있고, 상기 항대사제는 methotrexat, pemetrexed, fluorouracil, capecitabine, cytarabine, gemcitabine, decitabine, azacitidine, fludarabine, nelarabin, nelarabine, cladribine, clofarabine, 또는 pentostatin일 수 있으며, 항미세소관제는 vincristine, vinblastine, vinorelbine, vindesine, vinflunine, paclitaxel, 또는 pdophyllotoxin일 수 있고, 상기 토포아이소머레이즈 저해제는 irinotecan, toptecan, etoposide, doxorubicin, mitoxantrone, novobiocin, merbarone, aclarubicin 또는 teniposide일 수 있으며, 상기 세포독성 제제는 anthracycline, bleomycin, mitomycin C, mitoxantrone 또는 actinomycin일 수 있고, 상기 세포증식/이동 및 생존 신호전달 경로 저해제는 PI3K/AKT/mTOR 저해제, 또는 CXCR4 펩타이드 길항제일 수 있고, 상기 CXCR4 펩타이드 길항제는 Plerixafor, BL-8040 또는 LY2510924일 수 있다.
본 발명의 암 치료용 세포치료제에 의해 치료 가능한 암은 FLT3가 과발현되는 암이라면 혈액암이나 고형암 모두 사용될 수 있는데, 상기 혈액암은 급성 및 만성 백혈병, 림프종, 다발성 골수증 또는 골수형성이상 증후군일 수 있고, 상기 고형암은 간암, 폐암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 담낭암, 위암, 담도암, 대장암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 뇌종양, 악성 흑색종, 전립선암, 고환암, 설암, 또는 골수암일 수 있다.
상기 세포치료제는 일종의 약학적 조성물로서, 약학적 조성물의 제형에 필요한 약학적으로 허용 가능한 담체, 첨가제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포치료제의 투여량은 세포의 수는 107 내지 1011개일 수 있지만, 환자의 성별, 나이, 질병의 진행정도, 치료 목적에 따라 조절될 수 있다. 일반적으로, 이러한 양은 표적 세포, 예를 들어, 암항원 과발현 암 세포에서의 국소화를 수득하고, 상기 암세포를, 예를 들어, 포식작용 또는 용해에 의해 죽이는데 충분할 것이다.
상기 세포치료제는 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다.
아울러 상기 "약학적으로 허용 가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 본 발명에 일 실시예에 따른 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료제는 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 치료제는 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 두 개강내, 비강, 척추관내로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
상기 약학적 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다. 약학적으로 활성인 단백질 물질은 투여마다 1 ng - 10 ㎎/체중(㎏)의 양으로 존재할 수 있지만, 상기 요소들을 고려하여 상기 예시 범위 이하 또는 이상에서 투여할 수 있으며, 투여법이 연속 주입이면, 1분당 체중 1 ㎏ 당 1 ㎍ - 10 ㎎ 단위의 범위 내로 투여할 수 있다.
아울러 본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 유전자 변형 NK 세포주 및 자살유도제를 포함하는 암 치료용 키트가 제공된다.
상기 암 치료용 키트는 적어도 하나 이상의 다른 항암제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항암제는 알킬화제, 항대사제, 항미세소관제, 토포아이소머레이즈 저해제, 세포독성 제제, 세포증식/이동 및 생존 신호전달 경로 억제제, 세포자살 유도제, 또는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 저해제일 수 있다. 상기 항암제의 세부 항목에 속하는 구체적인 항암제는 상술한 바와 같다.
본 발명의 암 치료용 키트는 상기 유전자 변형 면역세포와 자살유도제를 포함하되 이들 두 구성성분이 혼합된 형태로 제공되지 않고 별도로 포장되어 제공되며, 이들 두 구성성분은 같은 시점에 같거나 다른 경로로 투여될 수 있으나, 의사의 처방에 따라 일정한 간격을 두고 투여된다는 점에서 일반적인 조성물과 구분된다. 본 발명의 키트는 먼저 상기 유전자 변형 면역세포를 투여한 후, 적절한 시점, 예컨대 유전자 변형 면역세포 투여와 같은 시점, 또는 투여로부터 1일 후, 2일 후, 3일 후, 4일 후, 5일 후, 6일 후, 또는 1주일 후, 10일 후, 2주 후, 15일 후, 20일 후, 3주 후, 25일 후, 4주 후, 또는 30일 후에 투여될 수 있고, 첫 번째 투여 이후 이틀, 사흘, 나흘, 닷새, 엿새, 일주일간의 간격으로 두 차례 이상 복수로 투여될 수도 있다.
상기 자살유도제는 상기 세포자살 유전자가 HSV TK 또는 VZV TK일 경우에는 각각 간시클로비르(gancyclovir) 또는 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-mehoxypurine arabinonucleoside)이고, 상기 세포자살 유전자가 시토신 디아미네이즈(CD), UPRT 또는 상기 CD 및 UPRT의 융합단백질(CD::UPRT)을 암호화하는 유전자인 경우 5-플루오로시토신(5-FC)이며, 상기 세포자살 유전자가 카르복실 에스터라제인 경우 이리노테칸(CPT-11)이고, 상기 세포자살 유전자가 니트로리덕테이즈인 경우 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954)이며, 상기 세포자살 유전자가 카르복시펩티데이즈 G2인 경우 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA)이고, 상기 세포자살 유전자가 iCas9인 경우 iCas9 이량화제(dimerizer)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 유전자 변형 NK 세포주 및 선택적으로 자살유도제를 암의 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료 방법이 제공된다.
상기 암 치료 방법은 추가적으로 줄기 세포 이식, 방사선 조사 요법, 수술에 의한 절제, 화학 요법제, 면역 요법제, 표적 치료제 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 항암 요법을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 유전자 변형 NK 세포주와 상기 자살유도제는 동시에 투여될 수 있으나, 상술한 바와 같이, 최적의 효과를 위하여 적절한 투여간격으로 나누어 투여될 수 있으며, 상기 투여간격은 치료활성의 극대화를 위해 조절될 수 있다.
본 발명의 암 치료방법에 의해 치료가 가능한 암은 FLT3가 과발현되는 암이라면 혈액암이나 고형암 모두 사용될 수 있는데, 상기 혈액암은 급성 및 만성 백혈병, 림프종, 다발성 골수증 또는 골수형성이상 증후군일 수 있고, 상기 고형암은 간암, 폐암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 담낭암, 위암, 담도암, 대장암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 뇌종양, 악성 흑색종, 전립선암, 고환암, 설암, 또는 골수암일 수 있다.
이하, 본 발명을 첨부되는 도면을 이용하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 NK 림프암종 환자의 암조직으로부터 표 1에 기재된 특성을 갖는 새로운 NK 세포주를 분리하였으며, 이에 대한 다양한 특성을 조사한 결과, 도 1 내지 6에 나타난 바와 같이, IL-2 의존적 증식능을 나타내며, 암세포 사멸능과 면역조절능을 모두 갖는 다기능성 NK 세포주임을 확인할 수 있었다. 특히, 현재 임상시험이 진행중인 유일한 NK 세포주인 NK-92에 비해 증식능이 현저하게 높아서 경제적으로 생산가능한 세포임을 확인하여, 이를 'NK101' 세포주로 명명하고 이를 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 181번지에 소재하고 있는 한국생명공학연구원 내 한국유전자은행(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2017년 8월 7일자로 기탁하여, 2017년 8월 24일자로 KCTC 13305BP의 수탁번호를 부여받았다. 그러나, 상기 NK101 세포주는 유전자 발현 분석 결과, IL-2 수용체인 CD25는 고발현이고, CD56dimCD62L+의 표현형을 갖는 것으로 확인되었으나, NK 세포의 항암 활성에 직접적인 영향을 주는 NK 세포 활성화 인자인 CD7 및 CD28은 발현하지 않음을 확인함으로써, 항암 활성 자체는 종래에 구축된 NK 세포주 보다 높지 않을 것으로 예상하게 되었다.
이에, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 NK101 세포의 항암활성을 강화하기 위해, NK101 세포에 기반한 유전자 변형 NK 세포주를 제조하고자 하였다. 도 7a는 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 NK101-7.28.CD의 제조에 사용된 유전자 컨스트럭트 pBD-7.28.CD의 구조를 개략적으로 나타낸 개요도이고, 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 NK101-15.TN 및 NK111의 제조를 위해 사용된 유전자 컨스트럭트 pBD-15.TN의 구조를 개략적으로 나타낸 개요도이다.
본 발명에서는 앞서 언급한 요소를 보완하기 위하여, 본 발명자들에 의해 기확립된 NK101 세포(수탁번호 KCTC 13305BP)에 NK 세포의 보조활성화 수용체, 세포자살유전자, 세포막 고정(membrane bound) 사이토카인, 돌연변이 TGFβ 수용체를 도입하여 해당 NK 세포의 항암효과 증진, 및 사이토카인 보충제(cytokine supplement) 비의존적으로 NK 세포의 증식이 가능한 NK111 세포주를 구축하였다(도 9a 및 9b 참조).
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주(NK101-7.28.CD) 및 상기 NK101-7.28.CD의 모세포주인 NK101, 그리고 종래구축된 NK 세포주인 KHYG-1 및 NK-92에서의 세포표면 표지자의 발현여부를 비교분석한 결과이고, 도 8b는 상기 도 7b에 도시된 pBD-7.28.CD 컨스트럭트를 형질도입한 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 세포주 NK101-7.28.CD 세포에서의 CD7 및 CD28 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이다. 상기 도 8a 및 8b에서 확인되는 바와 같이, 기존에 구축된 NK 세포주들 중 암세포 사멸능이 높다고 알려져 있는 KHYG-1 및 NK-92는 공통적으로 CD7을 발현하는 특징을 갖고, NK-92 세포주는 CD7은 물론 CD28 까지도 동시에 발현하는 특성을 가지고 있는 반면, NK101은 두 보조자극 인자가 전혀 발현되지 않음을 확인할 수 있었다. 이에, 본 발명자들은 NK101 세포에 CD7 및 CD28 도입을 통해 암세포 사멸능이 증진되는지의 여부를 평가하고자 하였다.
도 8d는 다양한 암세포(SK-MES-1, K562, A2780, Jeko-1, EoL-1, KG-1, IM9, Raji 및 HDLM-2)의 CD80(청색), CD86(녹색), 및 SECTM1(적색)의 표면발현 여부를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이고, 도 8e는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 NK101.7.28.CD 및 상기 NK101.7.28.CD의 모세포주인 NK101의 다양한 암세포 SK-MES-1, K562, A2780, Jeko-1, EoL-1, KG-1, IM9, Raji 및 HDLM-2)에 대한 세포사멸능을 분석한 결과로서, HDLM-2, Raji,IM-9, KG-1, EoL-1, JEKO-1, A2780, K562 및 SK-MES-1 암세포를 NK101 또는 NK101-7.28.CD 세포와 1:1, 2:1 및 4:1 비율로 24시간 공배양한 후 암세포 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 8f는 다양한 농도의 5-FC를 NK101 또는 NK101-7.28.CD 세포에 48시간 처리한 뒤, 세포 성장률을 MTS 분석을 통하여 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8e 내지 8f에서 확인되듯이, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주 NK101-7.28.CD은 NK101 대비 다양한 암세포주에서 우수한 살상능을 보여, CD7 및 CD28 도입을 통해 NK101 세포의 살상능이 증진되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 5-FC 처리를 통해 NK101-7.28.CD 세포의 제거를 유도함으로써 안전성을 확보할 수 있음을 확인하였다.
도 9는 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주인 NK111 세포주의 구축과정을 나타내는 것으로서, 도 9a는 NK101 및 NK101-7.28.CD 세포에 상기 도 7B에 도시된 pBD-15.TN 컨스트럭트가 각각 도입된 NK101-15.TN 및 NK111 세포 표면에서의 IL-15 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 9b는 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 및 NK111 세포에서의 TGFβRIIΔcyto(DNTβRII) 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이다. 도 8e에서 확인된 바와 같이, CD7 및 CD28 도입은 NK101 세포의 살상능 증진에 중간 정도의 효과를 나타냈다. 이에 본 발명자들은 NK101-7.28.CD 세포의 암세포 사멸능을 극대화하기 위해, 대표적 NK 세포 활성화 인자인 막결합(membrane bound) IL-15을 NK101-7.28.CD 세포에 형질도입하고자 하였고, 면역억제인자 TGF-β에 대한 저항성 유도을 위해 세포질 도메인(cytoplasmic domain)이 결실된 TGFβRIIΔcyto(dominant negative TGFβRII, DNTβRII)을 과발현시켜 미끼 수용체(decoy receptor)로 작용하도록 하였다. 그 결과, 도 9a 및 9b에서 확인되는 바와 같이, 모세포주인 NK101-7.28.CD 에서는 발현이 되지 않던 IL-15 및 dominant negative TGFβRII가 본 발명의 일 실시예에 따른 NK111 세포주에서는 발현됨이 확인되었다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주인 NK111의 항암활성 및 안전성을 비교분석한 결과로서, 도 10a는 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 및 NK111 세포의 배양 시, IL-2 무첨가에 따른 세포수 증식수준(population doubling level)을 나타낸 그래프이고, 도 10b는 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 및 NK111 세포에서의 NKG2D 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 10c는 HDLM-2, Raji, IM-9, KG-1, EoL-1, JEKO-1, A2780, K562 및 SK-MES-1 암세포와 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 및 NK111 세포를 1:1, 2:1 또는 4:1 비율로 공배양 시, 암세포의 사멸빈도를 유세포 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 10d는 HDLM-2 또는 IM-9 세포주를 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 및 NK111 세포와 공배양시, 다양한 농도의 TGFβ1을 처리한 후, 암세포 사멸능에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 도 10a에서 확인되듯이, 막결합 IL-15의 도입을 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 NK111는 IL-2 독립적으로 세포성장이 가능하게 되었으며, 이는 생산시 편의성을 높여준다. 또한, 도 10b에서 확인되는 바와 같이, IL-15 도입을 통해 NK 세포의 대표적 활성화 수용체인 NKG2D 발현이 상향조절됨으로써 암세포에 대한 살상능을 증진시킴을 확인할 수 있었다. 실제로, 도 10c에서 확인되는 바와 같이, IL-15 도입을 통해 9개의 암세포주에 대한 살상능이 증진되었다. 또한, 도 10d에서 확인되는 바와 같이, 종양미세환경에서 과다분비되는 면역억제인자인 TGFβ1에 대한 미끼 수용체인 TGFβRIIΔcyto 도입을 통해 TGFβ1에 대한 살상능 저하에도 영향을 받지 않게 되었는데, 이는 추후 생체내 활성 감소를 어느 정도 극복할 수 있음을 기대하게 하는 특성이다.
더 나아가, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 NK 세포주를 이용하여 항원 특이적 세포치료가 가능한 키메라 항원 수용체를 형질도입할 경우 해당 암항원을 고발현하는 암에 대하여 보다 효과적인 항암 치료가 가능할 수 있을 것이라는 가정하에 다양한 혈액암에서 과발현되는 것으로 알려진 FLT3를 표적으로 한 키메라 항원 수용체 컨스트럭트를 고안한 후(도 7C), 이를 제작하여 상기에서 제조한 NK111 세포주에 추가로 형질도입시킨 결과, 장기계대시에도 모세포(NK101)의 특성은 그대로 유지하면서도 키메라 항원 수용체를 정상적으로 발현시킬 뿐만 아니라(도 11), anti-FLT3-scFv-hyFc를 이용하여 반응성 분석을 수행한 결과, FLT3를 과발현 하는 암세포에 대하여 특이적인 결합반응이 일어남을 확인할 수 있었고(도 12), FLT3를 과발현하는 암세포에 대하여 시험관내 조건은 물론 생체내 조건에서 매우 효과적인 항암활성을 나타냄을 실험적으로 입증함으로써(도 13 내지 16) 본 발명을 완성하였다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 본 발명의 NK 세포주의 제조 과정
NK 세포 유래 세포주를 제작하기 위하여 다음과 같은 과정을 거쳤다. 환자에서 유래한 림프절외(extranodal) NK 림프암종을 40 μm 스트레이너에 올려두고, 20% 우태아혈청(GE Healthcare, USA)과 1% 항생제(Gibco, USA)가 포함된 CellgroTM 줄기세포 성장배지(SCGM; CellGenix, Germany, 이하 'NK media'라 함) 10 mL를 첨가한 후 5 mL 주사기의 피스톤의 전단력을 이용하여 단일세포로 떼어낸 후 현탁하였다. 단일세포 현탁액 중 NK 세포를 NK 분리키트(Milltenyi Biotec, Germany)를 이용하여 분리한 후 1,000 U/mL의 인간 재조합 IL-2(recombinant human IL-2; rhIL-2; Prometheus Laboratories Inc., USA)가 첨가된 NK media에서 3주간 배양하였다. IL-2가 포함된 NK media를 주 2회 첨가하였으며, 분열 세포주를 30계대까지 지속 배양하여 안정적인 세포주가 형성되었음을 확인하였다(도 1a). 상기 세포주는 CD3, CD20, CD16는 발현하지 않으면서 CD56을 발현하므로, 해당 세포의 기원이 NK 세포임을 확인하였다(도 1b). 해당 세포주는 배양 시 군집(spheroid)을 형성하는 특징이 있다는 것을 현미경 상에서 확인할 수 있었으며(도 1c), Wright-Giemsa 염색법을 이용한 형태학적 분석에서 NK101 세포가 큰 과립성 림프구(large granular lymphocyte)의 특성을 가짐을 확인하였다(도 1d). NK 세포 특성인 세포 사멸인자 퍼포린(Perforin, green) 및 그랜자임 B(Granzyme B, red)의 형광염색을 통해 NK101이 퍼포린과 그랜자임 B를 발현함을 확인하였다(도 1e). NK 세포에 민감하게 반응하는 MHCⅠ 음성 세포인 K562와 공배양을 수행하였다. 카르복시플루오레세인 디아세테이트(CFDA; Invitrogen, USA)로 표지한 K562 세포를 3x105 cells/mL 농도로 24-웰 플레이트(well-plate; Corning, USA)에 파종한 뒤 NK101 세포를 다양한 효과기 세포 대 표적 비율(E:T 비율 = 1:1, 2:1, 4:1, 10:1)로 1 mL 배지에 부유한 후 상기 암세포와 24시간 동안 함께 배양하였다(도 1f). 배양 이후 모든 세포를 각 웰로부터 회수하여 원심 분리한 후, 세포 펠렛을 FACS 완충액으로 현탁시켰다. 다시 원심분리하여 형성된 세포 펠렛을 1 μL LIVE/DEADㄾ Fixable Near-IR Dead Stain Kit(Invitrogen, USA)를 넣은 FACS 완충액 100 μL에 현탁시켜, 4℃에서 20분간 반응하였다. FACS 완충액으로 2번 세척한 뒤, 1X Annexin V binding buffer 100 μL에 Annexin V APC 5 μL(Biolegend, USA)를 희석한 용액에 세포 펠렛을 현탁시켜, 실온에서 20분간 반응하였다. 세포의 사멸 여부는 유세포 분석법을 이용하여 생존 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-음성), 초기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-음성), 후기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-양성), 괴사(necrotic) 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-양성)으로 구분하였다. 도 1a 내지 1f의 결과로부터, NK101은 지속적인 계대가 가능한 불멸화 세포이고, 배양 시 군집을 형성하며, 표현형 및 기능이 기존에 알려진 NK 세포와 일치하는 특성을 가짐을 알 수 있었다. 해당 세포의 세포주화 및 NK 세포의 특성을 확인함으로써 해당 세포주를 'NK101'으로 명명하였으며, 이를 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 181번지에 소재하고 있는 한국생명공학연구원 내 한국유전자은행(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2017년 8월 7일자로 기탁하여, 2017년 8월 24일자로 KCTC 13305BP의 수탁번호를 부여받았다. 상기 기탁기관은 부다페스트 조약상 국제기탁기관이다.
실시예 2 : NK101의 세포 분열능 분석
상기 실시예 1에서 제조된 NK101 세포주에 대한 배양 조건 확립 및 분열능 비교를 위하여, NK101 세포와 대조군 세포인 NK-92 세포에 20% 우태아 혈청이 포함된 SCGM 배양배지에 다양한 농도의 IL-2를 처리한 후 MTS 분석법을 통해 두 세포주의 세포생장을 비교하였다. 도 2a와 같이 NK101은 약 8 pM의 IL-2 농도에서 생장이 시작되어 500 pM에서 생장이 saturation 되었으며(EC50=23.3 pM), NK-92는 30 pM 농도의 IL-2 존재 시 세포생장이 확인되며 2000 pM 농도에서 생장이 정체되어(EC50=128.3 pM) 세포생장에 있어 NK101이 NK-92 대비 낮은 농도의 IL-2를 필요로 함을 알 수 있었다. 도 2b에서 확인한 IL-2 수용체 소단위체 발현을 유세포 분석으로 확인한 결과, NK101이 고친화 IL-2 수용체인 CD25를 NK-92 대비 높게 발현함을 확인하였다. 또한 NK101 및 NK-92의 동결 후 세포 생장률 및 생존율을 동일 배양조건에서 분석한 결과 NK101은 해동 후 2일(1 계대) 이후 세포생장이 회복되나, NK-92는 해동 후 10일(5 계대) 이후 일정한 세포생장에 도달함을 확인할 수 있었다(도 2c). 두 세포의 세포생장이 안정화된 후, 두 세포의 세포증식을 비교하였을 때 16일 계대 후 수득되는 NK101 세포의 총 세포주가 NK-92 세포의 수득 예상 세포수의 약 100배임을 확인할 수 있었다(도 2d). 이는, 본 발명의 NK101 세포의 생산성이 종래의 NK-92 세포에 비해 월등하여, 경제성의 측면에서 본 발명의 NK101 세포가 매우 유리함을 시사하는 것이다.
본 발명의 NK101 세포의 종합적인 특성은 하기 [표 1]로 정리하였다.
본 발명의 NK101 세포의 주요 특징
항목 NK101 세포
임상 데이터
연령/성별 56세 남성
인종 아시안
진단 절외 NK/T 림프종(extranodal NK/T lymphoma)
세포배양
성장 양상 현탁상태에서 다중세포 응집체
배가시간 18-32시간
최대 세포농도 1.2x106 cells/㎖
최소 세포농도 0.5x105 cells/㎖
사이토카인 의존성 IL-2 의존성(500 IU/㎖)
최적 분열 매 2-3일
면역학적 특성
T/NK 마커 CD2+, CD3-, CD4-, CD7-, CD8-, CD16-, CD56+
B 세포 마커 CD10-, CD19-, CD20-
골수단핵구성 마커 CD13-, CD14-, CD33+
NK 세포 활성화 수용체 NKp46+, NKp30+, NKG2D+
NK 세포 저해성 수용체 KIR2DL1-, KIR2DL2-, ILT2-
자손/활성화 마커 CD34-, FAS+
부착 마커 CD11a+, CD18+, CD54+
기능적 특성
NK 활성 호-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 분비능(면역활성능) 및 증식능
사이토카인 생산 IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-2 등 호-염증성 사이토카인 및 IL-1 수용체 길항제 및 IL-10 등 항-염증성 사이토카인 미분비
사이토카인 수용체 CD25+, CD122+, CD132+, CD127-
케모카인 수용체 CCR4+, CCR6+, CCR7+, CCR8+, CXCR3+, CXCR4+
실시예 3 : 표면 마커 분석 상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 NK101 세포주는 부유세포의 특성을 가지며, 해당 세포의 표면항원의 발현도를 유세포 분석으로 확인하였다. 사용된 항체는 하기와 같다:
파이코에리트린(PE)-접합 항-CD1 항체(클론 HI149), PE-접합 항-CD2 항체(클론 RPA-2.10), PE-접합 항-CD3 항체(클론 UCHT1), PE-접합 항-CD4 항체(클론 SK3), PE-접합 항-CD5 항체(클론 UCHT2), PE-접합 항-CD7 항체(클론 CD7-6B7), PE-접합 항-CD8 항체(클론 RPA-T8), PE-접합 항-CD16 항체(클론 B73.1), PE-접합 항-CD25 항체(클론 BC96), PE-접합 항-CD28 항체(클론 CD28.2), PE-접합 항-CD56 항체(클론 HCD56), PE-접합 항-CD57 항체(클론 HNK-1), PE-접합 항-CD94 항체(클론 DX22), PE-접합 항-CD122 항체(클론 TU27), PE-접합 항-CD132 항체(클론 TUGh4), PE-접합 항-CD158a 항체(클론 HP-DM1), PE-접합 항-CD158b 항체(클론 DX27) 및 PE-접합 항-CD161 항체(클론 HP-3G10)는 모두 Biolegend(San Diego, CA)로부터 구매하였고, 이들은 모두 LIVE/DEAD Fixable Near-IR dye(Molecular Probe, Eugene, OR)와 조합하여 사용하였다.
유전자 조작된 NK101 세포주 상의 NK-세포 활성화/억제 수용체 또는 억제성 면역관문/PD-L1의 발현 분석을 위해, 세포를 PE-접합 항-NKp44 항체(클론 P44-8), PE-접합 항-NKp46 항체(클론 9E2), PE-접합 항-NKp80 항체(클론 5D12), PE-접합 항-DNAM1 항체(클론 11A8), PE-접합 항-NKG2D 항체(클론 1D11), PE-접합 항-2B4 항체(클론 C1.7), PE-접합 항-ILT2 항체(클론 GHI/75), PE-접합 항-KIR2DL1/S1/S3/S5 항체(클론 HP-MA4), PE-접합 항-KIR2DL2/DL3 항체(클론 DX27), PE-접합 항-PD-1 항체(클론 NAT105), PE-접합 항-CTLA4 항체(클론 L3D10), PE-접합 항-LAG-3 항체(클론 11C3C65), PE-접합 항-TIM-3 항체(클론 F38-2E2), PE-접합 항-TIGIT 항체(클론 A15153G) 또는 PE-접합 항-PD-L1 항체(클론 29E.2A3)로 염색하였는데, 이들 항체들 역시 모두 Biolegend 사(San Diego, CA)로부터 구매하였고, LIVE/DEAD Fixable Near-IR dye(Molecular Probe, Eugene, OR)와 함께 사용하였다.
상기 유세포 분석 결과, T/NK 세포 마커의 경우, 본 발명의 NK101 세포주는 NK 세포의 표면항원인 CD2, CD56을 발현하나 CD16은 발현하지 않으며, T 세포의 표면항원인 CD3, CD4, CD8, TCRαβ 및 TCRγδ과 B세포 표면항원인 CD20, 단핵구 표현항원 CD14를 발현하지 않는 NK 세포의 표현형을 가지고 있었다(도 3a). 또한, 본 발명의 NK101 세포주는 NK 세포의 활성화 수용체인 NKG2D, NKp30, NKp46, DNAM-1, 2B4를 발현하며 NKp44는 미발현하였고, 비활성화 수용체인 CD94, NKG2A는 발현하고, KIR2DL1/S1/S3/S5, KIR2DL2/DL3, 및 CD85j 등은 발현하지 않았다(도 3b). 또한 세포부착 분자인 CD2, CD11a, CD19, ICAM-1을 발현하며, CD7은 미발현하였다(도 3c). 추가적으로 본 발명의 NK101 세포주는 NK 세포의 세포독성 및 면역활성화에 관여하는 CD107a, 퍼포린, 그랜자임 B, 낮은 수준의 TRAIL이 발현되나 FASL은 발현되지 않고(도 3d), NK 세포의 사이토카인 수용체 중에서는 IL-2 고친화 수용체인 CD25, IL-2 수용체(CD122, CD132) 및 IL-15 수용체인 IL-15Ra를 발현함을 확인하였다(도 3e). NK 세포주의 이동성에 관련된 케모카인 수용체 중에서는 CCR4, CCR6, CCR7, CXCR3, 및 CXCR4를 발현하였으나, 그 외의 CCR 및 CXCR은 발현되지 않았다(도 3f). 결론적으로, 본 발명의 NK101 세포주는 활성화된 NK 세포의 표현형을 보이며, 특히 CD25가 고발현된다는 점에서 다른 NK 세포주와 구분되는데, CD25는 활성화된 NK 세포의 지표로 특히 분열능이 높은 NK 세포의 표지자로 알려져 있어(Clausen, J. et al., Immunobiology, 207(2): 85-93, 2003), 본 발명의 NK101 세포주는 세포치료제의 대량생산에 매우 적합한 세포주임을 알 수 있다.
본 발명의 NK101 세포의 다양한 세포표지자의 발현여부는 하기 [표 2]로 정리하였다.
본 발명의 NK101 세포의 마커 특성
항원 발현여부 항원 발현여부
계통 마커 기능성 마커
CD1a - CD95 (FAS) +++
CD2 +++ CD178 (FAS-L) +
CD3 - CD107a +++
CD4 - TRAIL (CD253) +
CD5 - 퍼포린 +++
CD8 - 그랜자임 B +++
CD10 - IFNγ +++
CD11a +++ 케모카인 수용체
CD11c - CCR1 +
CD13 + CCR2 -
CD14 + CCR3 -
CD16 - CCR4 +++
CD18 +++ CCR5 +
CD19 - CCR6 +++
CD23 - CCR7 +++
CD33 +++ CCR8 ++
CD45 +++ CCR9 +
CD56 +++ CXCR1 -
CD57 - CXCR2 -
CD161 ++ CXCR3 +++
활성화 수용체 CXCR4 +++
2B4 +++ CXCR5 -
NKp30 ++ CXCR6 -
NKp46 +++ CXCR7 -
NKG2D ++ 사이토카인 수용체
저해 수용체 CD25(IL-2Ra) +++
CD85j(ILT2) - CD122(IL-2Rb) ++
CD94 +++ CD132(공통 γ 사슬) +++
CD158(KIR2DL1/S1/S3/S5) - CD127(IL-7Ra) -
CD158b(KIR2DL2/DL3) - 기타 마커
CD159a +++ TCRαβ -
부착분자 TCRγδ -
DNAM-1(CD226) +++
ICAM-1(CD54) +++
CD62L ++
-, 음성; +, < 10% 양성; ++, 10-69% 양성; +++, 70-100% 양성(%는 세포 집단 내 양성 세포의 비율을 나타냄)
실시예 4 : NK101의 CD56 및 CD62L 발현양상 확인 NK101 세포의 특성을 분석하기 위하여 NK 세포의 표지마커인 CD56 및 CD62L의 발현양상을 NK-92와 초도배양 NK 세포와 비교하여 유세포 분석을 이용하여 확인하였다. 도 4a에서와 같이 NK101 세포는 NK-92 세포 대비 CD56 발현 정도가 낮은 CD56dim NK 세포로 확인되었다. 또한 도 4b의 등고선 그래프와 같이 NK101 세포는 CD62L 마커를 고발현하는데, 이는 NK-92 세포에서는 미발현되고, 일부 초도배양 NK 세포에서 한정적으로 발현되는 마커이다. 일반적인 초도배양 NK 세포에서는 CD56의 발현에 따라 CD56dim, CD56bright으로 구분할 수 있고 이는 각각 세포독성 또는 사이토카인 생산이 더 우세한 특성을 가진 2개의 군집으로 구성된다고 여겨진다. CD56bright NK 세포는 높은 세포 증식능, 사이토카인에 의한 활성화 시 IFN-γ를 분비, 낮은 암세포 사멸능을 보이며, CD56dim NK 세포는 CD56bright NK 세포와는 반대로 세포 증식능은 낮고, 표적세포의 인지에 의해서 IFN-γ를 분비하며, 높은 세포독성을 가지는 특성이 있다. 최근 검증된 CD56dimCD62L+ NK 세포는(Juelke, K et al,, Blood, 116(8): 1299-1307, 2010; Luetke-Eversolh, M et al., Front. Immunol., 4: 499, 2013) CD56bright, CD56dim NK 세포의 특성을 모두 가지고 있는 다기능성의 NK 세포로 보고되고 있다. NK101은 사이토카인 자극에 의해 증식 및 IFN-γ를 분비할 수 있고(도 5a), 표적세포 인지 시에도 다양한 종류의 사이토카인을 분비함이 확인되었다(도 5b). 결론적으로 NK101은 CD56dimCD62L+ NK 세포의 표현형과 특성을 가지고 있으며, CD56dimCD62L+ 특성 마커를 발현하는 초도배양 NK 세포 혹은 체외 증식(ex vivo expanded) 초도배양 NK 세포가 보고된 바가 있다 하더라도 NK101은 불멸화된 NK 세포주로서 이들과는 차별되며, 이는 기존 알려진 NK 세포주 중에서도 찾아볼 수 없는 고유 특성이라고 할 수 있다.
실시예 5 : NK101의 시험관내 암세포 사멸능 및 세포독성 메커니즘 규명
상기 실시예 1에서 제조되어 표현형이 확인된 NK101 세포주의 암세포 사멸능을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, CFDA로 표지한 인간-유래 암세포주인 THP-1, KG-1, HL-60(급성골수성백혈병), HCT116(대장암), U373(뇌암), A2780(난소암), A549(폐 선암종), 및 SK-BR3(유방암) 세포를 각각 24-웰 플레이트에 3X105 cells/mL 농도로 1 mL 씩 파종하였다. 이후 NK101 세포 및 대조군을 다양한 효과기 세포 대 표적 세표 비율(E:T 비율=1:1, 2:1, 및 4:1)로 1 mL 배지에 부유한 후 상기 암세포와 24시간 동안 함께 배양하였다. 배양 이후 모든 세포를 수집한 뒤 각 웰로부터 세포를 회수하여 원심분리한 후, 세포 펠렛을 FACS 완충액으로 현탁시켰다. 다시 원심분리하여 형성된 세포 펠렛을 1 μL LIVE/DEADㄾ Fixable Near-IR Dead Stain Kit를 희석한 100 μL의 FACS 완충액에 현탁시켜, 4℃에서 20분간 반응하였다. FACS 완충액으로 2번 세척한 뒤, 1X Annexin V binding buffer 100 μL에 Annexin V APC 5 μL (Biolegend, USA)를 희석한 용액에 세포 펠렛을 현탁시켜, 실온에서 20분간 반응하였다. 세포의 사멸 여부는 유세포 분석법을 이용하여 생존 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-음성), 초기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-음성), 후기 아폽토시스 세포(annexin V-양성/LIVE/DEAD-양성), 괴사(necrotic) 세포(annexin V-음성/LIVE/DEAD-양성)으로 구분하였다. 도 6a에서 확인되는 바와 같이 NK101 세포 투여군의 경우 다양한 인간 암세포주에 대하여 세포 살상능을 보임을 확인할 수 있었다. NK101 세포의 세포 살상능의 주요 표지 인자를 확인하기 위하여 NK 세포에 고발현되는 CD25, CD62L, DNAM-1, CD54(ICAM-1)에 대한 중화항체를 처리한 후 THP-1(도 6b), K562(도 6c), Jurkat(도 6d)와 4:1의 효과기 세포 대 표적세포 비율로 공배양한 뒤 세포사멸을 분석하였다. 그 결과 THP-1에서는 DNAM-1 및 CD54, K562에서는 CD54, Jurkat에서는 CD25, CD62L, CD54 등의 중화항체 처리에 의해 NK101의 세포 사멸능이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 도 6e에서 THP-1과 NK101의 공배양 시 DNAM-1 및 CD54의 중화항체를 동시 처리할 경우 상승성으로(synergestic) 세포사멸능이 감소함을 확인할 수 있었다. 해당 결과를 토대로 NK101에 의한 세포살상능에 DNAM-1 및 CD54 등의 표지인자가 주로 관여함을 알 수 있다.
실시예 6: 기능강화 NK 세포주 제조
KHYG-1 및 NK-92는 기존에 구축된 NK세포주들 중, 암세포 사멸능이 높다고 알려져있고 이들은 공통적으로 CD7 및/또는 CD28을 발현하는 특징을 갖는 반면, NK101은 두 보조자극인자의 발현이 전혀 되지 않음에 착안하여(도 8a), 본 발명자들은 상기 NK101에 CD7 및 CD28를 암호화하는 유전자를 형질도입할 경우 암세포 사멸능이 증진되는지의 여부를 평가하고자 하였다.
6-1: NK 세포 활성화 인자 및 세포자살 유전자 도입 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 기능강화 NK 세포주를 제작하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조된 NK101 세포에 CD7(서열번호 14)을 암호화하는 핵산분자(서열번호 15) 및 CD28 면역세포 보조자극인자(서열번호 16)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 17)가 2A 펩타이드(서열번호 18)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 19)로 연결되고, 추가적으로 CD::UPRT(서열번호 20)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 21)가 IRES(서열번호 22)로 연결된 유전자 컨스트럭트를 제조하여 렌티바이러스 제조용 트랜스퍼 벡터 pBD(SL-Bigen, Seongnam, Korea)에 클로닝하여 pBD-7.28.CD를 제조하였다(도 7A).
6-2: 렌티바이러스 제조
렌티바이러스 생산을 위하여 48시간 또는 72시간 배양한 Lenti-X 세포에 상기 실시예 6-1에서 제조된 트랜스퍼 플라스미드 pBD-7.28.CD 12 μg와 패키징 플라스미드 psPAX2(Addgene plasmid, #12260) 12 μg 및 렌티바이러스 헬퍼 플라스미드 pMD2.G(Addgene plasmid, #12259) 2.4 μg을 리포펙타민(Lipofectamine; Thermo Fisher Scientific, USA)과 혼합하여 8.5x106 Lenti-X 293T 세포(Takara Bio, USA)에 형질도입하였다. 37℃에서 6시간 배양 후, 배지를 제거하고 신선한 성장배지를 첨가하였다. 세포를 추가로 48시간 배양 후, 세포배양액을 5분간 원심분리(4℃, 4000 rpm)하고 상층액을 취한 후 0.45 μm 필터(Millipore, USA)를 이용하여 세포 찌꺼기들을 제거함으로써 바이러스 포함 상등액을 회수하였다. 렌티바이러스를 농축하기 위하여 여과된 렌티바이러스 포함 상등액를 Lenti-X concentrator(Takara Bio, USA)를 이용하여 농축한 후 농축액을 4℃에서 밤새 보관하였다. 최종단계로, 렌티바이러스 포함 농축액을 4000 rpm에서 60분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 펠렛 형태로 회수된 렌티바이러스를 1~2 mL의 배양액으로 희석하고 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
6-3: NK 세포 활성화 인자 및 세포자살 유전자 도입 세포주 제조
상기 실시예 6-2에서 제조된 CD7-CD28-CD::UPRT 렌티바이러스(MOI = 10)를 8 mg/ml 프로타민 설페이트(Sigma, USA), 6 μM BX795(Invitrogen, USA) 및 250 IL/ml IL-2를 존재하에 최종 부피 1.5 mL의 2x106 NK101 세포와 혼합하여 감염시켰다. 세포배양 플레이트를 상온에서 1,800 rpm으로 원심분리한 후 37℃에서 4시간 배양하였다. 그런 다음 다시 한 번 동일한 감염과정을 반복하고 밤새 배양한 후, 세포를 원심분리하고 신선한 배양배지에서 재현탁한 후, 형질도입 유전자 발현 평가전까지 3일간 배양하였다. 감염 72시간 후 면역세포 공동자극인자인 CD7과 CD28의 발현을 유세포 분석으로 확인하고, 1주일 뒤 FACSAria 세포정렬기 및 Cell Quest 소프트웨어(BD Biosciences, USA)를 이용하여 감염된 세포의 검출 및 분리를 수행하였다. 안정적인 성장 양상을 나타내고 계대가 거듭됨에 따라 높은 형질도입 유전자 발현을 보이는 클론들을 향후 분석을 위해 선별하였다. pBD-7.28.CD를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 NK101 세포는 PE-접합 항-CD7(클론 CD7-6B7) 항체 및 알로파이코사이아닌(APC)-접합 항-CD28(클론 CD28.2) 항체를 이용하여 염색하였고, 이중-양성 군집에 대하여 정렬하였다(도 8b). 본 발명자들은 상기 클론들 중 가장 적합한 CD7-CD28-CD::UPRT를 발현하는 유전자 변형 NK101 세포주를 선별하였으며, 이를 'NK101-7.28.CD'으로 명명하였다.
6-4: 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)
세포 내 발현 단백질인 CD::UPRT는 RNA를 분리하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 발현을 확인하였다(도 8c). 전체 RNA는 RNA 추출 키트(iNtRON, South Korea)를 이용하여 분리하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응은 QuantiTect Reverse Transcription Kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 합성된 cDNA를 Taq 폴리머라제와 프라이머 등과 혼합한 후 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 CD::UPRT 유전자 존재여부를 확인하였다. 그 결과 도 8c에서 확인되는 바와 같이, 형질도입된 CD::UPRT 유전자는 정상적으로 발현이 됨을 확인할 수 있었다.
실시예 7: NK 세포 공동활성 인자 및 세포자살 유전자에 의한 NK 세포 활성화 증가 확인
7-1: CD7 및 CD28 도입에 의한 NK 세포 살상능 검증
NK 세포의 세포독성 활성은 활성화 또는 억제성 신호를 전달하는 여러 세포표면 수용체에 의해 조절된다(Wang and Matosevic, Cell Oncol. 43: 577-600, 2020). NK101에는 억제성 수용체가 발현이 되지 않기 때문에(Yang et al., J. Immunother. Cancer 7(1): 138, 2019, 본 발명자들은 우리는 누락된 활성화 수용체 발현의 회복에 의해 NK101의 세포용해 잠재력이 향상되는지 여부를 조사하였다. 이에 본 발명자들은 먼저 강력한 암세포살상 활성을 보유한 KHYG-1 및 NK-92와 비교하여 NK101에서 NK 세포주를 정의하는데 기능적으로 활용되는 표면 마커의 발현 수준을 조사하였다(Klingemann et al., Front. Immunol. 7: 91, 2016). 18 개의 서로 다른 유세포 분석 비교 분석을 통해 마커, 우리는 대조 세포주 중 하나 또는 둘 모두에서 발현되지만 NK101에는 완전히 존재하지 않는 CD7 및 CD28의 두 항원을 확인하였다(도 8a). CD7과 CD28이 각각 초도배양 NK 세포와 NK 세포주에서 자극 신호를 제공하는 것으로 제안되었기 때문에, 본 발명자들은 NK101에서 CD7과 CD28의 강제 발현이 세포독성 기능을 향상시킬 수 있는지 여부를 평가하였다. NK101 세포독성에 대한 CD7 및 CD28 발현의 영향을 결정하기 위해, 변형되지 않은 NK101 및 NK101-7.28.CD를 다양한 정도의 B7 분자(CD80/CD86) 및 SECTM1(각각, CD28 및 CD7 리간드)의 표면 발현을 가진 인간 종양 세포주(도 8d)와 공배양하고, 종양세포의 세포사멸을 유세포 분석으로 측정하였다(도 8f). 모세포주인 NK101과 비교하여 NK101-7.28.CD 는 SK-MES-1, K562 및 A2780을 포함한 B7- 종양 세포에 대해 거의 동일한 세포독성을 나타냈다. 반면에 NK101-7.28.CD는 B7+ 종양 세포에 대해 현저히 더 강한 세포살상능을 나타냈다. CD7/CD28 삽입에 따른 세포독성 증가 정도는 (i) CD80-CD86+ 암세포주에 대한 것보다 CD80+CD86+ 암세포주에 대한 NK101 및 NK101-7.28.CD의 특이적 용행율 사이에 더 큰 차이가 나타난데서 나타나듯, 종양세포 표면에 CD80과 CD86이 동시에 존재하는 것과 상관관계가 있었고, (ii) NK101-7.28.CD가 Raji 세포(MFI=9,265) 또는 IM-9 세포(MFI=8,937) 보다 HDLM-2 세포(MFI=17,463)에서 더 큰 세포독성 효과를 나타낸 것에서 알 수 있듯이, 종양세포 상의 표면 CD86의 강도와 상관관계가 있었다. 본 발명자들은 표적세포의 용해 정도와 표적 종양의 표면 SECTM1 발현 사이에는 분명한 상관관계를 관찰할 수 없었다(도 8d 및 8e). 종합적으로, 이러한 결과는 NK101-7.28.CD의 강화된 종양살해 활성이 주로 CD28과 표적 세포에서 발현되는 리간드 사이의 세포 간 상호 작용에 의해 매개됨을 시사한다.
실시예 8: mbIL-15과 TGFβRIIΔcyto 도입
8-1: mbIL-15 및 TGFβRIIΔcyto 동시 발현 유전자 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 6에서 제조된 NK101-7.28.CD 세포의 세포 살상능을 더욱 증진시키기 위하여 막 결합 IL-15(mbIL-15, 서열번호 23)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 24)와 TGFβRII의 세포질 도메인을 제거한 TGFβRIIΔcyto(서열번호 25)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 26)가 2A 펩타이드(서열번호 18)를 암호화하는 핵산분자(서열번호 19)로 연결된 유전자 컨스트럭트를 제조하여 렌티바이러스 제조용 트랜스퍼 벡터 pBD에 클로닝하여 pBD.15.TN을 제조하였다(도 7B).
8-2: 렌티바이러스 제조
렌티바이러스 생산을 위하여 48시간 또는 72시간 배양한 Lenti-X 세포에 상기 실시예 6-1에서 제조된 트랜스퍼 플라스미드 pBD-15.TN 12 μg와 패키징 플라스미드 psPAX2(Addgene plasmid, #12260) 12 μg 및 렌티바이러스 헬퍼 플라스미드 pMD2.G(Addgene plasmid, #12259) 2.4 μg을 리포펙타민(Lipofectamine; Thermo Fisher Scientific, USA)과 혼합하여 8.5x106 Lenti-X 293T 세포(Takara Bio, USA)에 형질도입하였다. 37℃에서 6시간 배양 후, 배지를 제거하고 신선한 성장배지를 첨가하였다. 세포를 추가로 48시간 배양 후, 세포배양액을 5분간 원심분리(4℃, 4000 rpm)하고 상층액을 취한 후 0.45 μm 필터(Millipore, USA)를 이용하여 세포 찌꺼기들을 제거함으로써 바이러스 포함 상등액을 회수하였다. 렌티바이러스를 농축하기 위하여 여과된 렌티바이러스 포함 상등액를 Lenti-X concentrator(Takara Bio, USA)를 이용하여 농축한 후 농축액을 4℃에서 밤새 보관하였다. 최종단계로, 렌티바이러스 포함 농축액을 4000 rpm에서 60분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 펠렛 형태로 회수된 렌티바이러스를 1~2 mL의 배양액으로 희석하고 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
8-3: mbIL-15 및 TGFβRIIΔcyto 유전자 도입 세포주 제조
IL-15는 NK 세포의 증식과 효과기 기능을 증가시키는 다면 발현성(pleiotropic) 사이토카인이다(Carson et al., Braz. J. Med. Biol. Res. 31: 1-9, 1998). 사이토카인의 주요 생리학적 형태인 막-결합 IL-15(mbIL-15)는 용해성 IL-15보다 더 강한 활성화 신호를 전달하는 것으로 알려져 있다(van Belle et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz) 53: 115-126, 2005; Cho et al., Kor. J. Lab. Med. 29: 89-96, 2009). NK101의 세포독성에 대한 mbIL-15 발현의 효과를 평가하기 위해 본 발명자들은 상기 실시예 8-2에서 제조된 pBD.15.TN을 이용하여 제조된 렌티바이러스를 NK101 및 NK101-7.28.CD 세포에 감염시켰다. 구체적으로 상기 실시예 8-2에서 pBD.15.TN을 이용하여 제조된 렌티바이러스(MOI = 10)를 8 mg/ml 프로타민 설페이트(Sigma, USA), 6 μM BX795(Invitrogen, USA) 및 250 IL/ml IL-2를 존재하에 최종 부피 1.5 mL의 2x106 NK101 세포와 혼합하여 감염시켰다. 세포배양 플레이트를 상온에서 1,800 rpm으로 원심분리한 후 37℃에서 4시간 배양하였다. 그런 다음 다시 한 번 동일한 감염과정을 반복하고 밤새 배양한 후, 세포를 원심분리하고 신선한 배양배지에서 재현탁한 후, 형질도입 유전자 발현 평가전까지 3일간 배양하였다. 감염 72시간 후 mbIL-15 및 TGFβRIIΔcyto의 발현을 유세포 분석으로 확인하고, 1주일 뒤 FACSAria 세포정렬기 및 Cell Quest 소프트웨어(BD Biosciences, USA)를 이용하여 감염된 세포의 검출 및 분리를 수행하였다. 선택된 클론은 각각 'NK101-15.TN' 또는 'NK111'로 명명하였다. mbIL-15 및 TGFβRIIΔcyto의 표면 발현은 먼저 유세포 분석에 의해 확인하였다(도 9a 및 9b).
8-4: mbIL-15 도입에 의한 암세포 살상능 분석
본 발명자들은 mbIL-15의 도입에 따른 효과를 조사하기 위하여, 모세포주인 NK101, NK101-7.28.CD 세포주와 이들 세포주에 mbIL-15 유전자를 도입한 NK101.15.TN 및 NK111 세포를 대상으로 IL-2 무첨가에 따른 세포증식 양상을 조사하였다. 그 결과 mbIL-15가 도입된 초도배양 NK 세포에 대한 이전 연구결과와 유사하게(Imamura et al. Blood 124: 1081-1088, 2014), NK101-15.TN 또는 NK111 세포는 외인성 IL-2 없이 안정적으로 성장할 수 있는 반면, 모계 NK101 세포주 또는 NK101-7.28.CD 세포주는 IL-2 부재시 증식하지 못하였다(도 10a). 다음 실험을 위해 NK101-15.TN 또는 NK111 세포를 IL-2 결핍 조건에서 유지시켰다. 그런 다음 실시예 7-1에서 사용된 종양 세포주와 함께 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 또는 NK111 세포의 병행 공동배양을 수행하고 유세포 분석을 통해 암세포의 세포사멸 정도를 측정하였다. 수행된 모든 공동배양에서, 각각의 대조군(NK101 또는 NK101-7.28.CD)보다 NK101-15.TN 또는 NK111 공동배양 그룹에서 더 높은 비율의 특이적 용해로 나타난 바와 같이, mbIL-15 도입에 의해 향상된 종양제거 활성을 나타냈다. 본 발명자들은 또한 NK101에서 NK101-15.TN으로의 세포독성 증가 정도가 대부분의 공동배양에서 NK101-7.28.CD에서 NK111로의 증가 정도와 비슷하다는 점을 확인하였다(그림 10c). 이전 연구에서 IL-15 매개 세포독성 개선이 자극된 NK 세포에서 NKG2D의 상향 조절을 포함한다고 제안했기 때문에, 우리는 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 및 NK111 세포에서 표면 NKG2D 발현을 유세포 분석법으로 비교하였다(도 10b). NK101과 NK101-7.28.CD에서 NKG2D+ 세포의 비율은 각각 36%와 51%로 확인되었다. 특히, mbIL-15 도입은 NK101-15.TN 및 NK111 세포에서 각각 69% 및 98%의 NKG2D+ 집단으로 나타난 바와 같이, NKG2D 발현을 증가시켰다(도 10b). 다른 활성화 수용체(DNAM-1, NKp46, NKp44, NKp80) 및 억제성 수용체(ILT2, KIR2DL1/S1/S3/S5, KIR2DL2/L3)의 발현 수준이, 분석된 4개 세포주 모두에서 동일하게 유지되었다는 점도 주목할 필요가 있다(도 10e). 전반적으로, mbIL-15의 도입은 자율적으로 성장하고 생존할 수 있는 능력을 부여했을 뿐만 아니라 표면 NKG2D 발현의 상향 조절을 통해 NK101의 세포 용해활성을 증가시켰다.
8-5: TGFβRIIΔcyto 도입에 따른 내인성 TGFβ에 의한 면역저항성 억제 확인
아울러, 본 발명자들은 환자의 체내에 다량 존재하는 면역억제 인자로 잘 알려진 TGFβⅠ의 면역억제 효과가 NK111 세포에 도입된 TGFβRIIΔcyto에 의하여 저해되는지의 여부를 확인하기 위하여 TGFβ의 존재(3, 10 및 30 ng/mL) 또는 부재 하에 24-웰 플레이트에 표적세포인 HDLM-2 및 Raji 종양 세포주와 효과기 세포인 3x105 cells/ml의 NK101, NK101-7.28.CD, NK101-15.TN 또는 NK111를 E:T=1:1의 비율로 분주한 후, 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양한 후 유세포 분석을 통해 암세포 사멸능을 조사하였다(도 10d). 그 결과, 도 10d에서 확인되는 바와 같이, 테스트 한 모든 용량에서 TGFβ 처리시 NK101 및 NK101-7.28.CD의 세포독성 활성이 감소되었고 NK101-15.TN 또는 NK111의 기능은 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 TGFβ 신호전달이 DNTβRII 전달에 의해 효과적으로 차단되고 형질전환된 NK101 세포가 TGFβ의 면역억제 효과를 반전시킬 수 있음을 시사한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 NK101-7.28.CD 세포는 모세포주인 NK101의 주된 특징은 그대로 유지하면서도 모세포주인 NK101과 비교하여 암세포사멸능이 현저히 증가하였고, 상기 NK101-7.28.CD의 성능을 더 강화시킨 NK111 세포는 암세포 살상능이 NK101-7.28.CD 세포에 비해 현저하게 증가하였을 뿐만 아니라, TGFβ로 인한 세포 살상능의 저해를 회피할 수 있어서 체내 투여시 매우 효율적인 암 치료제로 사용이 가능할 것으로 기대가 된다.
실시예 9: FLT3 표적 키메라 항원 수용체 도입 NK 세포주의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 8에서 제조된 NK111 세포주에 키메라 항원 수용체(이하, 'CAR'라 약칭함)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 형질도입할 경우, 항원 특이적인 암세포 사멸능이 증진되는지를 조사하였다. 이를 위해 구체적으로, 본 발명자들은 FLT3 표적화 키메라 항원 수용체 유전자 컨스트럭트를 제조한 후 이를 NK111에 형질도입하여 NK111-CAR 세포를 제조하고 그 기능을 평가하였다.
9-1: anti-FLT3 scFv-CAR 유전자 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 종양표적 NK 세포주를 제작하기 위하여 상기 실시예 8에서 제조된 NK111 세포에 FLT3을 표적화하는 scFv(서열번호 13)와 변형 인간 면역글로불린(modified human Ig) Fc 영역(서열번호 1), CD28 막통과 도메인(서열번호 3), DAP10 세포내 활성화 도메인(서열번호 5), DAP12 세포내 활성화 도메인(서열번호 7), 및 CD3ζ 세포질 도메인(서열번호 9)로 구성된 anti-FLT3 scFv-CAR 단백질(서열번호 11)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 12)를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제조하여 렌티바이러스 제조용 트랜스퍼 벡터 pBD에 클로닝함으로써 pBD-CAR를 제조하였다(도 7C).
9-2: anti-FLT3 scFv-CAR 발현 렌티바이러스의 제조
렌티바이러스 생산을 위하여 48시간 또는 72시간 배양한 Lenti-X 세포에 상기 실시예 9-1에서 제조된 트랜스퍼 플라스미드 pBD-CAR 12 μg와 패키징 플라스미드 psPAX2(Addgene plasmid, #12260) 12 μg 및 렌티바이러스 헬퍼 플라스미드 pMD2.G(Addgene plasmid, #12259) 2.4 μg을 리포펙타민(Lipofectamine; Thermo Fisher Scientific, USA)과 혼합하여 8.5x106 Lenti-X 293T 세포(Takara Bio, USA)에 형질도입하였다. 37℃에서 6시간 배양 후, 배지를 제거하고 신선한 성장배지를 첨가하였다. 세포를 추가로 48시간 배양 후, 세포배양액을 5분간 원심분리(4℃, 4000 rpm)하고 상층액을 취한 후 0.45 μm 필터(Millipore, USA)를 이용하여 세포 찌꺼기들을 제거함으로써 바이러스 포함 상등액을 회수하였다. 렌티바이러스를 농축하기 위하여 여과된 렌티바이러스 포함 상등액를 Lenti-X concentrator(Takara Bio, USA)를 이용하여 농축한 후 농축액을 4℃에서 밤새 보관하였다. 최종단계로, 렌티바이러스 포함 농축액을 4000 rpm에서 60분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 펠렛 형태로 회수된 렌티바이러스를 1~2 mL의 배양액으로 희석하고 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
9-3: anti-FLT3 scFv-CAR 도입 NK111 세포주의 제조
키메라 항원 수용체 변형은 내재적으로 재배열된 항원 수용체가 부족한 NK 세포에 종양 항원 특이성을 부여하는 효과적인 방법이다(Li et al., Cancer Gene Ther. 17: 147-154, 2010; Wu and Wang, Cell. Mol. Immunol. 15: 1095-1097, 2018). 상기 실시예 9-2에서 제조된 pBD-CAR를 이용하여 제조된 렌티바이러스를 NK111 세포에 감염시켰다. 구체적으로 상기 실시예 9-2에서 pBD-CAR를 이용하여 제조된 렌티바이러스(MOI = 10)를 8 mg/ml 프로타민 설페이트(Sigma, USA), 6 μM BX795(Invitrogen, USA) 및 250 IL/ml IL-2를 존재하에 최종 부피 1.5 mL의 2x106 NK111 세포와 혼합하여 감염시켰다. 세포배양 플레이트를 상온에서 1,800 rpm으로 원심분리한 후 37℃에서 4시간 배양하였다. 그런 다음 다시 한 번 동일한 감염과정을 반복하고 밤새 배양한 후, 세포를 원심분리하고 신선한 배양배지에서 재현탁한 후, 형질도입 유전자 발현 평가전까지 3일간 배양하였다. 감염 72시간 후 anti-FLT3 scFv-CAR의 발현을 유세포 분석으로 확인하고, 1주일 뒤 FACSAria 세포정렬기 및 Cell Quest 소프트웨어(BD Biosciences, USA)를 이용하여 감염된 세포의 검출 및 분리를 수행하였다. 선택된 클론은 'NK111-CAR' 로 명명하였다. anti-FLT3 scFv-CAR의 표면 발현은 스페이서 영역을 인식하는 항-IgG Fc 항체를 사용하여 유세포분석으로 확인하였다(도 11a의 좌측).
유세포분석 결과 도 11a에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 anti-FLT3 scFv-CAR를 발현시킨 NK111 세포는 서열번호 2에 기재된 염기 서열에 의해 암호화되는 변형 Fc 영역(서열번호 1)을 인식하는 항-인간 Fc 단백질에 특이적으로 반응함을 확인하였다. 이는 도입한 CAR가 세포 표면에서 발현되고 있음을 나타낸다.
아울러, 세포표면에서 발현되는 anti-FLT3 scFv-CAR의 인간 FLT3 단백질 결합능을 분석하기 위하여, FACS 분석법을 통해 하기와 같은 실험을 수행하였다. Anti-FLT3 scFv-CAR를 발현시킨 NK111 세포주(2.5X105 cell사용)을 FACS 완충액으로 2번 씻어낸 후, Human TruStain FcX(Fc Receptor Blocking Solution) (cat# 422302, Biolegend, USA) 4 ㎕을 100 ㎕의 FACS 완충액에 희석한 후, 실온에서 10 분간 반응시켰다. 반응이 끝난 FACS 튜브에, Recombinant human FLT3-Fc Chimera protein(cat# 368-ST/CF, R&D, USA) 15 ㎕를 첨가하여 4℃에서 20분간 반응시켰다. 결합하지 않은 항체를 FACS 완충액으로 씻어낸 후, 항-인간 IgG-PE(cat#: 409304, Biolegend, USA) 이차 항체 3 ㎕을 100 ㎕의 FACS 완충액에 희석한 후 결합시켜 4℃에서 20분간 추가 반응시켰다, 마지막으로 결합하지 않은 항체를 FACS 완충액으로 2번 씻어낸 후, FACS 분석을 수행하였다(도 11a의 우측).
그 결과, 도 11a에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 Anti-FLT3 scFv-CAR를 발현시킨 NK111 세포는 인간 FLT3-Fc 단백질에 결합함을 확인하였다. 아울러, 항-CD3ζ항체를 사용한 NK101, NK111 및 NK111-CAR 용해물에 대한 웨스턴블롯 분석을 통해 CAR가 주로 이량체 구성에서 NK111-CAR 세포에 의해 배타적으로 발현됨을 확인할 수 있었다(도 11b).
9-4: 항원-특이적 암세포 살상능의 변화 분석
NK111 세포 상에 발현된 CAR가 암세포 상의 FLT3를 인식하는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 본 발명의 CAR 컨스트럭트에서 세포막 통과 도메인 및 세포내 신호전달 도메인 부분을 제외한 나머지 부분이 동일한 재조합 항-scFv-변형 Fc 융합단백질을 제조하여 다양한 암세포와의 결합여부를 항-FLT3 항체를 이용한 유세포분석을 통해 분석하였다. 상기 재조합 융합단백질의 생산은 하기와 같이 수행하였다:
1 L 진탕 플라스크(Corning)에 HEK293-F 세포를 200 mL 중 1.0x106 세포/mL의 밀도로 파종하고, 120 rpm, 8% CO2 조건에서 배양하였다. 하루 후, 세포를 약 2.0x 106 세포/mL의 세포 밀도에서 같은 몰 비율로, anti-FLT3-scFv-Fc 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA를 총 400 μg(2 μg/mL)을 함유하는 10 mL FreeSytle 293 발현 배지(Invitrogen) 및 10 mL FreeSytle 293 발현 배지 + 800 μg PEI(4 μg/mL)의 약 21 mL 혼합물로 형질감염시킨 후 상층액을 5일 후에 채취하였다. 상기 anti-FLT3-scFv-Fc 컨스트럭트는 실시예 10에서 제조된 Anti-FLT3 scFv-CAR 중 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 anti-FLT3 scFv와 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 변형 Fc 영역이 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 제작되었다.
표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상청액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼(Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글리신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1 M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉각적으로 중화하였다. 용리한 항체 분획은 Pierce Dextran Desalting Column(5K MWCO)를 이용하여 PBS(pH 7.4)로 완충액을 교환한 후, MILLIPORE Amicon Ultra(10 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하고, 정제된 단백질은 BCA 기법을 통해 정량하였다.
FLT3 단백질을 세포 표면에 발현한다고 알려진 급성골수성백혈병 세포주 EOL-1, MOLM-13, 및 REH 세포주와 FLT3 음성 세포주인 K562, Daudi 및 정상 인간 골수세포(2.5x05 cell 사용)를 FACS 완충액으로 2번 씻어낸 후, Human TruStain FcX(Fc Receptor Blocking Solution)(cat# 422302, Biolegend, USA) 4 ㎕을 100 ㎕의 FACS 완충액에 희석한 후, 실온에서 10 분간 반응시켰다. 반응이 끝난 FACS 튜브에, 상기 제조한 anti-FLT3-scFv-Fc 단백질 1 ㎍를 첨가하여 4℃에서 20분간 반응시켰다. 결합하지 않은 항체를 FACS 완충액으로 씻어낸 후, 항-인간 IgG-PE(cat#: 409304, Biolegend, USA) 이차 항체 3 ㎕을 100 ㎕의 FACS 완충액에 희석한 후 결합시켜 4℃에서 20분간 추가 반응시켰다, 마지막으로 결합하지 않은 항체를 FACS 완충액으로 2번 씻어낸 후, FACS 분석을 수행하였다. 상용화된 항-인간 FLT3(CD135)-PE 항체(cat #313308, Biolegend, USA)의 경우는 Fc receptor blocking solution 처리 뒤, 3㎕를 처리하고 4℃에서 20분간 반응시킨 후 마지막으로 세척한 후 FACS 분석을 수행하였다.
상기 유세포분석 결과 상용 항체와 마찬가지로 anti-FLT3 scFv-hyFc 융합 단백질은 FLT3+ EOL-1, MOLM-13, REH 세포주에 대해 강한 결합을 나타냈으나, FLT3- K562, Daudi, 정상 인간 골수세포에 대하여는 결합하지 않았다(도 12). 이어 본 발명자들은 이들 세포주와 NK111 또는 NK111-CAR 세포와의 공동배양시 NK 세포주에 의한 항원-특이적 종양세포 사멸활성을 조사하였다. 그 결과 예상한 바와 같이 모세포주인 NK111 세포와 비교하여 NK111-CAR 세포는 FLT3+ EOL-1, MOLM-13, REH 세포주에 대해 더 강한 세포독성을 나타냈고, FLT3- K562, Daudi 및 정상 인간 골수세포에 대해 비슷한 정도의 세포독성을 나타냈다(도 13). 종합적으로, 이러한 결과는 CAR 변형 NK111에 의한 FLT3+ 종양세포에 대한 특이적 인식 및 세포사멸에 대한 직접적인 증거이다.
실시예 10: NK111-CAR 세포의 시험관 내( in vitro ) 항암 활성 분석
상기 실시예 9-3에서 제조된 NK111-CAR 세포의 세포 살상능을 분석하기 위하여 EOL-1(급성골수성백혈병), MOLM-13(급성골수성백혈병), REH(급성림프구성백혈병), 및 K562(만성골수성백혈병), 정상 인간 골수세포(normal BM)와 공동ㅋ배양을 수행하였다. Celltracker violet dye(CTV; Invitrogen, USA)로 표지한 타깃 종양 세포주를 3x105 세포/mL의 농도로 준비한 후, 24-웰 플레이트에 1mL씩 분주하였다. 이후 NK111 및 NK111-CAR 세포주를 다양한 효과기 세포 대 표적 세포 비율(E:T 비율=1:1, 2:1, 4:1)로 현탁한 후 상기 타깃 종양 세포주와 공배양하였다. 배양 이후 각 웰로부터 모든 세포를 회수하여 원심분리한 후, 세포 펠렛을 확보하였다. 세포 펠렛을 1㎕ LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Stain Kit(Life Technologies)를 희석한 100㎕의 FACS 완충액에 현탁시켜, 4에서 20분간 반응하였다. FACS 완충액으로 2번 세척한 뒤, 1X Annexin V binding buffer 100㎕에 Annexin V APC 5㎕ (BioLegend, USA)를 희석한 용액으로 실온에서 20분간 염색하였다. 세포의 사멸 여부는 유세포 분석법을 이용하여 생존 세포, 초기 아폽토시스 세포, 후기 아폽토시스 세포, 괴사 세포로 구분하였다(도 12).
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, NK111-CAR 세포는 FLT3 발현 세포인 EoL-1, MOLM-13, REH 세포에서 대조군인 NK111에 비해 현저히 높은 세포살상능을 보이는 반면, FLT3 음성 정상 골수세포에 대해서는 NK111과 유사하게 세포 살상능을 보이지 않음을 확인하였다. 이는 NK111-CAR 세포가 FLT3 발현 암세포를 특이적으로 인식함을 의미한다.
실시예 11: 방사선 조사에 따른 NK111-CAR 세포 특성 변화 여부 분석
본 발명의 NK111-CAR 세포주는 NK 림프종 유래 세포주인 NK101에 렌티바이러스를 이용한 유전자도입을 수행한 세포이므로, 치료제로 이용하기 위해서는 방사선 조사를 통하여 세포 성장을 억제하여 종양원성을 제거함과 동시에 동등한 정도의 항암 활성을 유지하여야 한다. 이를 검증하기 위하여, 본 발명자들은 NK111-CAR 세포주에 0 Gy 또는 10 Gy의 감마 방사선을 조사한 후 세포성장 억제 여부 및 암세포 살상능을 평가하였다(도 15).
그 결과, 도 15a에 나타난 바와 같이, 방사선을 조사하지 않은 NK111-CAR 세포는 4일차까지 지속적인 증식 패턴을 보인 반면, 10 Gy 방사선 조사한 NK111-CAR 세포는 세포 성장이 저해되어 72시간 이후에 모두 사멸함을 확인하였다. 또한, 도 13b에 나타난 바와 같이, 10 Gy의 방사선을 조사한 NK111-CAR 세포주는 FLT3 과발현 세포인 EOL-1 및 Molm-13 에서 대조군 NK111에 비해 현저히 높은 세포 살상능 보였으며, 방사선 조사 후에도 동등한 살상능을 유지함을 확인할 수 있었다. 반면, FLT3 미발현 세포인 K562 세포에 대해서는 방사선 조사 전과 후 모두 대조군 NK111과 유사한 수준의 살상능을 보임을 확인하였다. 따라서, NK111-CAR 세포주는 방사선 조사 후에도 체내 증식 없이 동등한 활성을 나타내므로 암세포를 제거하는 용도로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 12: NK111-CAR 세포의 생체 내( in vivo ) 항-백혈병 활성 분석 및 병용 투여에 의한 항암 효능 증진
본 발명자들은 NK111-CAR의 생체 내(in vivo) 항암 활성을 분석하고자 AML 이종이식(xenograft) 종양 모델 마우스를 이용하여 NK111-CAR 세포주의 항암 활성을 분석하였다. FLT3 및 루시퍼레이즈를 발현하는 인간 급성골수성백혈병 세포주인 EoL-1-luc-EGFP 1x106 세포를 6-8주령의 자성 면역력 제거 실험쥐(NOD/SCID IL2Rγnull, NSG)에 정맥투여하고 4일 경과 후, 대조군(성장 배지) 및 10 Gy 방사선 조사한 NK111-CAR 세포 5x106 세포를 1주일에 5회, 24시간 간격으로 총 10회 정맥내 투여하였다. 암세포에서 방사되는 루시퍼레이즈에 의한 생물발광정도를 150 mg/kg 루시페린을 피하 투여한 후 Lago(Spectral Imaging Instruments, Tucson, AZ)를 이용하여 생물발광 촬영(BLI)으로 종양 성장을 주기적으로 모니터링하였다(도 14a). 아울러, NK111-CAR 투여일로부터 2주 경과 후 실험동물을 희생시킨 후 골수, 비장, 폐 및 간을 적출하였고 종래에 보고된 바와 같이 처리하였다(Kim et al., Clin. Cancer Res. 19: 415-427, 2013). 다양한 기관 유래의 단일세포 현탁액을 APC-접합 항-CD56 항체(클론 HCD56, Biolegend)와 LIVE/DEAD Fixable Near-IR dye를 이용하여 염색함으로써 유세포분석을 수행하였다. 살아 있는 세포를 게이팅하고 잔존 종양세포(GFP-양성) 및 NK111-CAR 세포(PE-양성)의 비율을 BD LSRFortessa 시스템을 이용하여 측정하였다. 반복 투여 연구를 위해, EOL-1 종양-보유 마우스에 방사선 조사된 5X106 NK111-CAR 세포를 2주간 1주일 간격으로 3회 꼬리정맥 주사하였다. 모든 동물실험은 실험실 동물 보호 및 사용 위원회의 가이드라인을 준수하여 수행되었다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 10 Gy 방사선 조사한 NK111-CAR 세포는 대조군(control) 대비 유의미한 수준의 항-백혈병 억제 효과를 나타냄을 확인하였다. 아울러, 임상에서 사용 중인 약제와의 병용 투여에 따른 항암 활성능 증진 여부를 확인하기 위해, CXCR4 펩타이드 길항제인 LY2510924와 병용 투여하여 NK111-CAR 의 항암효능을 관찰하였다. LY2510924 병용투여 군의 경우, NK111-CAR 세포 투여시점부터 1주일에 5회, 24시간 간격으로 총 10회 복강투여 하였다. 그 결과, 병용투여 시 NK111-CAR 단독투여 시보다 효력이 더욱 증진됨을 확인할 수 있었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1: 주사제의 제조
유전자 재조합 NK111-CAR 세포 1X108 내지 5X1012 cells
pH 조절제 적량
안정화제 적량
주사용 멸균 증류수 100% 까지
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 변형 면역세포주는 항암 세포치료제의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (35)

  1. 하기의 특성을 갖는 분리된 NK 세포주에 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 형질도입되어 상기 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전자 변형 NK 세포주:
    CD2, CD7, CD11a, CD25, CD28, CD45, CD54, DNAM-1, CD62L 및 CD56은 양성; 및
    CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD23, CD34, TCRαβ 및 TCRγδ는 음성.
  2. 제1항에 있어서,
    세포자살 유전자가 추가로 형질도입된, 유전자 변형 NK 세포주.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 세포자살 유전자는 우라실 포스포리보실전이효소(UPRT) 유전자, 헤르페스 단순포진 바이러스 티미딘 인산화 유전자(HSV TK), 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 인산화효소(VZV TK) 유전자, 시토신 디아미네이즈 유전자(CD), 상기 CD 및 UPRT의 융합단백질(CD::UPRT)을 암호화하는 유전자, 카르복실 에스터레이즈 유전자, 니트로리덕테이즈 유전자, 카르복시펩티데이즈 G2 유전자, 또는 유도성 카스페이즈 9(iCas9) 유전자인, 유전자 변형 NK 세포주.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 CD::UPRT는 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  5. 제1항에 있어서,
    막결합 IL-15(mbIL-15)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 추가로 형질도입된, 유전자 변형 NK 세포주.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 mbIL-15는 서열번호 23으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  7. 제1항에 있어서,
    세포질 도메인 결실 TGFβ 수용체II(TGFβRIIΔcyto)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입된, 유전자 변형 NK 세포주.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 TGFβRIIΔcyto는 서열번호 25로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  9. 제1항에 있어서,
    세포자살 유전자, 막결합 IL-15를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 세포질도메인 결실 TGFβRII를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 형질도입된, 유전자 변형 NK 세포주.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체는 FLT3에 특이적으로 결합하는 scFv, 변형 Ig Fc 도메인, CD28 막통과 도메인, DAP10 세포내 활성화 도메인, DAP12 세포내 활성화 도메인 및 T 세포 수용체의 CD3ζ 도메인으로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 scFv는 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 변형 Ig Fc 도메인은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 CD28 막통과 도메인은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 DAP10 세포내 활성화 도메인은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 DAP12 세포내 활성화 도메인은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체의 CD3ζ 세포질 도메인은 서열번호 9로 구성되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체는 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자 변형 NK 세포주.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 치료적으로 유효한 양의 상기 유전자 변형 NK 세포주를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 세포치료제.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 암은 FLT3를 과발현하는 혈액암 또는 고형암인, 암치료용 세포치료제.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 FLT3를 과발현하는 혈액암은 급성 및 만성 백혈병, 림프종, 다발성 골수증 또는 골수형성이상 증후군인, 암 치료용 세포치료제.
  21. 제18항에 있어서,
    하나 이상의 항암제를 추가로 포함하는, 암 치료용 세포치료제.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 항암제는 알킬화제, 항대사제, 항미세소관제, 토포아이소머레이즈 저해제, 세포독성 제제, 세포증식/이동 및 생존 신호전달 경로 억제제, 세포자살 유도제, 또는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 저해제인, 암 치료용 세포치료제.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 세포증식/이동 및 생존 신호전달 경로 억제제는 CXCR4 펩타이드 길항제인, 암 치료용 세포치료제.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 CXCR4 펩타이드 길항제는 Plerixafor, BL-8040 또는 LY2510924인, 암 치료용 세포치료제.
  25. 제2항 내지 제4항 및 제9항 중 어느 한 항의 유전자 변형 NK 세포주 및 자살유도제를 포함하는 암 치료용 키트.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 자살유도제는 상기 세포자살 유전자가 HSV TK 또는 VZV TK일 경우에는 각각 간시클로비르(gancyclovir) 또는 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-mehoxypurine arabinonucleoside)이고, 상기 세포자살 유전자가 시토신 디아미네이즈(CD), UPRT 또는 상기 CD 및 UPRT의 융합단백질(CD::UPRT)을 암호화하는 유전자인 경우 5-플루오로시토신(5-FC)이며, 상기 세포자살 유전자가 카르복실 에스터라제인 경우 이리노테칸(CPT-11)이고, 상기 세포자살 유전자가 니트로리덕테이즈인 경우 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954)이며, 상기 세포자살 유전자가 카르복시펩티데이즈 G2인 경우 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA)이고, 상기 세포자살 유전자가 iCas9인 경우 iCas9 이량화제(dimerizer)인, 암 치료용 키트.
  27. 제25항에 있어서,
    하나 이상의 항암제를 추가로 포함하는, 암 치료용 키트.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 항암제는 알킬화제, 항대사제, 항미세소관제, 토포아이소머레이즈 저해제, 세포독성 제제, 세포증식/이동 및 생존 신호전달 경로 억제제, 세포자살 유도제, 또는 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 저해제인, 암 치료용 세포치료제.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 세포증식/이동 및 생존 신호전달 경로 억제제는 CXCR4 펩타이드 길항제인, 암 치료용 세포치료제.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 CXCR4 펩타이드 길항제는 Plerixafor, BL-8040 또는 LY2510924인, 암 치료용 세포치료제.
  31. 치료적으로 유효한 양의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 유전자 변형 NK 세포주 및 선택적으로 자살유도제를 암의 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    추가적으로 줄기 세포 이식, 방사선 조사 요법, 수술에 의한 절제, 화학 요법제, 면역 요법제, 표적 치료제 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 항암 요법을 수행하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  33. 제31항에 있어서,
    상기 자살유도제는 상기 세포자살 유전자가 HSV TK 또는 VZV TK일 경우에는 각각 간시클로비르(gancyclovir) 또는 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레오사이드(6-mehoxypurine arabinonucleoside)이고, 상기 세포자살 유전자가 시토신 디아미네이즈(CD), UPRT 또는 상기 CD 및 UPRT의 융합단백질(CD::UPRT)을 암호화하는 유전자인 경우 5-플루오로시토신(5-FC)이며, 상기 세포자살 유전자가 카르복실 에스터라제인 경우 이리노테칸(CPT-11)이고, 상기 세포자살 유전자가 니트로리덕테이즈인 경우 5(아지리딘-1-일)-2,4-디니트로벤자마이드(CB1954)이며, 상기 세포자살 유전자가 카르복시펩티데이즈 G2인 경우 4-[(2-클로로에틸)(2-메실록시에틸)아미노]벤조일-엘-글루탐산(CMDA)이고, 상기 세포자살 유전자가 iCas9인 경우 iCas9 이량화제(dimerizer)인, 암 치료 방법.
  34. 제31항에 있어서,
    상기 암은 FLT3이 과발현되는 혈액암 또는 고형암인, 암 치료 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 FLT3를 과발현하는 혈액암은 급성 및 만성 백혈병, 림프종, 다발성 골수증 또는 골수형성이상 증후군인, 암 치료 방법.
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