WO2020248967A1 - Eta抗体与bnp的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 - Google Patents

Eta抗体与bnp的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 Download PDF

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张�成
章华
汪笑峰
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Definitions

  • pulmonary hypertension pulmonary hypertension or heart failure
  • methods for treating, preventing or ameliorating two or more diseases of pulmonary hypertension, pulmonary hypertension or heart failure which include administering to a subject a therapeutically effective amount of a fusion protein of an ETA antibody and BNP described herein.
  • Figure 2 Shows that the fusion protein h15F3-(G 4 S) 2 -BNP, h15F3-BNP(3-29) and h15F3-BNP(9-32) of ETA antibody and BNP reduced the normal size 15 minutes after administration The effect of rat arterial pressure.
  • Figure 7 shows the pharmacokinetic results of the fusion protein h15F3-BNP (9-32) of ETA antibody and BNP in healthy monkeys.
  • antibody refers to an intact immunoglobulin or an antigen-binding portion thereof that can compete with an intact antibody for specific binding.
  • the antigen binding portion can be produced by recombinant DNA technology or by enzymatic or chemical cleavage of the intact antibody.
  • the antigen-binding portion includes, in particular, Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv, domain antibodies (dAbs), fragments including complementarity determining regions (CDRs), single chain antibodies (scFv), chimeric antibodies, Diabodies, triabodies, tetrabodies, and polypeptides containing at least a portion of immunoglobulin sufficient to confer specific antigen binding to the polypeptide.
  • murine antibody includes all antibodies that have one or more variable and constant regions derived from mouse immunoglobulin sequences.
  • regulatory sequence affects the expression of the nucleotide sequence (eg, expression level, time, or location)
  • the nucleotide sequence is "operably linked" to the regulatory sequence.
  • a “regulatory sequence” is a nucleic acid that can affect the expression (eg, expression level, time, or site) of a nucleic acid to which it is operably linked. Regulatory genes, for example, act directly on the regulated nucleic acid or through the action of one or more other molecules (for example, polynucleotides that bind to regulatory sequences and/or nucleic acids). Examples of regulatory sequences include promoters, enhancers, and other expression control elements (e.g., polyadenylation signals).
  • Cynomolgus monkey polynucleotide (SEQ ID NO: 3); accession number: JV635771.
  • Heavy chain CDR2 amino acid sequence SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, and SEQ ID NO: 114.
  • the ETA-3 antibody further comprises one or two amino acid sequences, wherein each amino acid sequence is independently selected from the following amino acid sequences:
  • the ETA antibody described herein comprises a heavy chain CDR3 amino acid sequence independently selected from the following: SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, and SEQ ID NO: 136.
  • Light chain CDR3 amino acid sequence SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 220;
  • Amino acid sequence of heavy chain CDR3 SEQ ID NO: 118;
  • Heavy chain CDR1 amino acid sequence SEQ ID NO: 78;
  • Light chain CDR3 amino acid sequence SEQ ID NO: 62;
  • Light chain CDR3 amino acid sequence SEQ ID NO: 66;
  • Heavy chain CDR2 amino acid sequence SEQ ID NO: 112;
  • Heavy chain CDR3 amino acid sequence SEQ ID NO: 134; or
  • the ETA antibody described herein comprises one or two amino acid sequences, wherein each amino acid sequence is independently selected from the following amino acid sequences:
  • Light chain variable domain amino acid sequence SEQ ID NO: 138 (L1), SEQ ID NO: 140 (L2), SEQ ID NO: 142 (L3), SEQ ID NO: 144 (L4), SEQ ID NO :146(L5), SEQ ID NO: 148(L6), SEQ ID NO: 150(L7), SEQ ID NO: 152(L8), SEQ ID NO: 154(L9), SEQ ID NO: 156(L10) , SEQ ID NO: 158 (L11), SEQ ID NO: 160 (L12), SEQ ID NO: 162 (L13), and SEQ ID NO: 164 (L14), and at least 80%, at least 85%, and at least 90%, or at least 95% identical amino acid sequence; and
  • Polynucleotide coding sequence of the light chain variable domain SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, and SEQ ID NO: 163, and a polynucleotide sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 95% identical to it; and
  • Polynucleotide coding sequence of the heavy chain variable domain SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO :175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, and SEQ ID NO: 191, and a polynucleotide sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 95% identical thereto.
  • a heavy chain variable domain amino acid sequence independently selected from the following: SEQ ID NO: 166 (H1), SEQ ID NO: 168 (H2), SEQ ID NO: 170 (H3), SEQ ID NO: 172 (H4), SEQ ID NO: 174 (H5), SEQ ID NO: 176 (H6), SEQ ID NO: 178 (H7), SEQ ID NO: 180 (H8), SEQ ID NO: 182 (H9 ), SEQ ID NO: 184 (H10), SEQ ID NO: 186 (H11), SEQ ID NO: 188 (H12), SEQ ID NO: 190 (H13), and SEQ ID NO: 192 (H14), and its Have at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 95% identical amino acid sequence.
  • L2H1 refers to an antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 140 (L2) and a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 166 (H1).
  • the ETA antibody described herein comprises a light chain variable region selected from L1-L14 or a heavy chain variable region selected from H1-H14 and fragments, derivatives, muteins, or variants thereof Of antibodies.
  • the ETA antibody described herein comprises a combination of light chain and heavy chain CDR3 amino acid sequences independently selected from the following: SEQ ID NO: 138 and SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO : 150 and SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 152 and SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 154 and SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 156 and SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 158 And SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 160 and SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 162 and SEQ ID NO: 190, and SEQ ID NO: 164 and SEQ ID NO: 192.
  • the antibodies described herein comprise the amino acid sequences of the light chain and heavy chain CDRs and FRs (framework) listed herein.
  • the antibody comprises the light chain CDR1 sequence listed herein.
  • the antibody comprises the light chain CDR2 sequence listed herein.
  • the antibody comprises the light chain CDR3 sequence listed herein.
  • the antibody comprises the heavy chain CDR1 sequence listed herein.
  • the antibody comprises the heavy chain CDR2 sequence listed herein.
  • the antibody comprises the heavy chain CDR3 sequence listed herein.
  • the antibody comprises the light chain FR1 sequence listed herein.
  • the antibody comprises the light chain FR2 sequence listed herein.
  • the heavy chain variable domain polynucleotide coding sequence comprises a polynucleotide that hybridizes to the complementary sequence of the polynucleotide coding sequence of the heavy chain variable domain of H1 under stringent conditions Acid sequence.
  • the antibodies described herein are complete antibodies (including polyclonal, monoclonal, chimeric, humanized, or human antibodies with full-length heavy and/or light chains).
  • the antibodies described herein are antibody fragments, such as F(ab') 2 , Fab, Fab', Fv, Fc, or Fd fragments, and can be integrated into single domain antibodies, single chain antibodies , Maxibodies, minibodies, intrabodies, two-chain antibodies, three-chain antibodies, four-chain antibodies, v-NAR and bis-scFv (see, for example, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23:1126-1136).
  • the antibodies described herein also include antibody polypeptides such as those disclosed in US Patent No. 6,703,199, including fibronectin polypeptide single antibodies.
  • the antibodies described herein also include other antibody polypeptides disclosed in U.S. Patent Application Publication No. US2005/0238646, which are single-chain polypeptides.
  • nucleotide primers are used to amplify variable regions of genes expressing related monoclonal antibodies in hybridomas.
  • These primers can be synthesized by those of ordinary skill in the art or purchased from commercial sources (see, for example, Stratagene, La Jolla, California). These manufacturers sell murine and human variable region primers including V Ha , V Hb , V Hc , V Hd , C H1, primer C L and V L regions.
  • These primers can be used to amplify the variable region of the heavy chain or the light chain, and then insert them into a vector such as IMMUNOZAPTMH or ILLLFFLUNOZAPTML (Stratagene), respectively. These vectors are then introduced into E. coli, yeast or mammal-based expression systems. These methods may be used to produce large amounts comprising V H and V L, domain fused single-chain protein (see Bird et al., 1988, Science242: 423-426).
  • nucleotide sequence L1 and H1 encoding the amino acid sequence A-1 can be changed by random mutagenesis or by site-directed mutagenesis (e.g., oligonucleotide-induced site-directed mutagenesis) to produce a non-mutated polynucleoside.
  • An acid phase is an altered polynucleotide that includes one or more specific nucleotide substitutions, deletions, or insertions.
  • a recombinant fusion protein containing an anti-endothelin receptor antibody fragment or derivative fused to a leucine zipper peptide is expressed in an appropriate host cell, and the soluble oligomeric anti-endothelial is collected from the culture supernatant Receptor antibody fragments or derivatives thereof.
  • the antibody derivative may comprise at least one of the CDRs disclosed herein.
  • one or more CDRs can be integrated into known antibody framework regions (IgG1, IgG2, etc.) or combined with an appropriate carrier to enhance its half-life.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, Fc, albumin, transferrin and similar substances. These and other suitable vectors are known in the art.
  • the binding CDR peptide can be monomer, dimer, tetramer or other forms.
  • one or more water-soluble polymers are bound at one or more specific sites of the binding agent, for example at the amino terminus.
  • antibody variants include glycosylation variants in which the amino acid sequence of the parent polypeptide changes the sugar The number and/or type of sylation sites.
  • the variant has a greater or lesser number of N-linked glycosylation sites than the native protein.
  • substitutions that remove the sequence can remove Existing N-linked sugar chains.
  • Rearrangements of N-linked sugar chains are also provided, in which one or more N-linked sugar chain sites (usually those that occur naturally) are removed and one or more new N-linked sugar chains are created. Linkage site.
  • Other preferred antibody variants include cysteine variants in which one or more cysteine residues are deleted or replaced by another amino acid (such as serine) compared to the parent amino acid sequence. When the antibody must be folded Cysteine variants can be used in a biologically active conformation (for example, after isolation of soluble inclusion bodies). Cysteine variants usually have fewer cysteine residues than natural proteins, and usually have an even number of halves. Cystine to minimize the interaction caused by unpaired cysteine.
  • amino acid substitutions can be used to identify important residues of human endothelin receptor antibodies or to increase or decrease the affinity of the human endothelin receptor antibodies described herein.
  • the preferred amino acid substitutions are as follows: (1) reduce proteolytic sensitivity, (2) reduce oxidation sensitivity, (3) change the binding affinity for forming protein complexes, (4) change the binding affinity and/or (4) Endow or modify other physicochemical or functional properties on this type of polypeptide.
  • These scaffolds can be derived from polypeptides of any species (or more than one species), for example, humans, other mammals, other vertebrates, invertebrates, bacteria, or viruses.
  • the biosoluble backbone structure is usually based on a protein scaffold or backbone rather than an immunoglobulin domain.
  • a protein scaffold or backbone rather than an immunoglobulin domain.
  • nucleic acids that hybridize to other nucleic acids (e.g., nucleic acids comprising any nucleotide sequence of A-1/A-2) under specific hybridization conditions.
  • Methods of hybridizing nucleic acids are well known in the art. See, for example, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Son (1989), 6.3.1-6.3.6.
  • those skilled in the art can manipulate hybridization and/or washing conditions to increase or decrease the stringency of hybridization such that they include nucleosides that are at least 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, or 99% homologous to each other.
  • the nucleic acids of the acid sequence can usually still hybridize to each other.
  • one or more mutations can be introduced into the nucleic acid to selectively change the biological activity of the encoded polypeptide (for example, binding to ETA).
  • the mutation can alter biological activity quantitatively or qualitatively. Examples of quantitative changes include increasing, decreasing or eliminating the activity. Examples of qualitative changes include changing the antigen specificity of antibodies.
  • Regulatory sequences include guiding nucleotide sequences for constitutive expression in multiple types of host cells (for example, SV40 early gene enhancer, Rous's sarcoma virus promoter and cytomegalovirus promoter), guiding only in certain hosts Expression of nucleotide sequences in cells (for example, tissue-specific regulatory sequences, see Voss et al., 1986, Trends Biochem.Sci.
  • suitable mammalian host cell lines include Chinese Hamster Ovary (CHO) cells or their derivatives such as Veggie CHO and related cell lines grown in serum-free media (see Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) or CHO The strain DXB-11 lacks DHFR (see Urlaub et al., 1980, PNAS USA 77:4216-20).
  • CHO Chinese Hamster Ovary
  • Veggie CHO and related cell lines grown in serum-free media see Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31
  • CHO The strain DXB-11 lacks DHFR (see Urlaub et al., 1980, PNAS USA 77:4216-20).
  • human embryonic kidney cells such as 293 , 293EBNA or MSR293, human epithelial A431 cells, human C010205 cells, other transformed primate cell lines, normal diploid cells, cell lines derived from in vitro culture of primary tissues, primary transplants, HL-60, U937, HaK or Jurkat cells.
  • Suitable cloning and expression vectors for bacteria, fungi, yeast and mammalian cell hosts are described in Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, 1985).
  • the transformed cells can be cultured under conditions that increase the expression of the polypeptide, and the polypeptide can be recovered by conventional protein purification methods.
  • One such purification method is described in the Examples below.
  • Polypeptides intended for use herein include substantially homologous recombinant mammalian anti-endothelin receptor antibody polypeptides, which are substantially free of contaminating endogenous materials.
  • the antibodies described herein specifically bind to endothelin receptors, inhibit signal transduction, and exhibit therapeutic biological effects, such as reducing pulmonary hypertension in animal models.
  • the antibodies described herein are murine antibodies or humanized antibodies that can specifically bind to human endothelin receptors. Such antibodies include antagonistic or neutralizing antibodies that can reduce or neutralize endothelin signaling.
  • the K d of the antibody described herein when binding to human endothelin receptor ETA is approximately 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, Or 100nM.
  • antibodies described herein in reducing the IC 50 values of human endothelin signaling about 0.01nM to 500nM, 0.1nM to 200nM, 0.5nM to 200nM, 1nM to 200 nM, or 10nM to 100nM. In another embodiment, antibodies described herein in reducing the IC 50 values of human endothelin signaling about 1nM to 200nM. In another embodiment, antibodies described herein in reducing the IC 50 values of human endothelin signaling 10nM to about 100nM.
  • the ETA antibodies described herein have one or more of the properties listed below:
  • the ETA antibody cross-competes binding with the reference antibody on the human endothelin receptor ETA.
  • the ETA antibody described herein is an antibody having one or more of the following properties:
  • the ETA antibody cross-competes binding with a reference ETA antibody on the human endothelin receptor ETA.
  • the reference antibody comprises a combination of the light chain variable domain amino acid sequence of SEQ ID NO: 138 and the heavy chain variable domain amino acid sequence of SEQ ID NO: 166.
  • the reference antibody is monoclonal antibody A-1, A-2, A-7, A-9, or A-12.
  • the term "substantially similar" means that the IC 50 or K d of the reference antibody is comparable to or approximately 200%, 180%, 160%, 150%, 140% of the IC 50 or K d value of the reference antibody. , 120%, 110%, 100%, 99%, 98%, 97%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, or 50%.
  • the BNP described herein is a peptide that can activate the function of NPRA. In another embodiment, the BNP described herein is ten to one thousand times weaker than natural BNP (SEQ ID NO: 205) in activating the function of NPRA.
  • amino acid sequence of the peptide linker described herein is: SEQ ID NO: 217. In another embodiment, the amino acid sequence of the peptide linker described herein is: SEQ ID NO:218. In another embodiment, the amino acid sequence of the peptide linker described herein is: SEQ ID NO: 219.
  • the fusion protein of ETA antibody and BNP provided herein includes one ETA antibody and one, two, three, four, five, six, seven, or eight BNP; the fusion The protein connects the amino terminal of a BNP to the carboxy terminal of the light chain or heavy chain of the ETA antibody described herein, or the fusion protein connects the carboxy terminal of a BNP to the amino terminal of the light chain or heavy chain of the ETA antibody described herein. ⁇ End connection.
  • the fusion protein of ETA antibody and BNP provided herein includes one ETA antibody and two BNPs; the fusion protein combines the amino terminus of a BNP with the light chain or heavy chain of the ETA antibody described herein. Or the fusion protein connects the carboxy terminal of a BNP with the amino terminal of the light chain or heavy chain of the ETA antibody described herein.
  • the fusion protein of ETA antibody and BNP provided herein comprises an ETA antibody, and one or two BNPs which have passed the same number of peptide linkers (Linker); the fusion protein combines a peptide linker sequence
  • the amino terminus of a BNP is connected to the carboxy terminus of the light chain or heavy chain of the ETA antibody described herein, or the fusion protein connects the carboxy terminus of a BNP with the light chain or heavy chain of the ETA antibody described herein through a peptide linker sequence. The amino end of the chain is connected.
  • the fusion protein of ETA antibody and BNP provided herein connects the amino terminus of a BNP to the carboxy terminus of the light chain or heavy chain of the ETA antibody through a peptide linker sequence. In another embodiment, the fusion protein of ETA antibody and BNP provided herein connects the amino terminus of a BNP to the carboxy terminus of the light chain of the ETA antibody through a peptide linker sequence. In another embodiment, the fusion protein of ETA antibody and BNP provided herein connects the amino terminus of a BNP to the carboxy terminus of the heavy chain of the ETA antibody through a peptide linker sequence.
  • N' represents the amino terminal of the polypeptide chain
  • C' represents the carboxyl terminal of the polypeptide chain
  • BNP represents a BNP
  • R is the amino acid sequence of the light chain or heavy chain of the ETA antibody
  • Linker represents a peptide linker.
  • a pharmaceutical composition which includes a fusion protein of an ETA antibody and BNP provided herein, and one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the pharmaceutical composition described herein is for intravenous or subcutaneous injection.
  • One embodiment herein relates to a method comprising administering an ETA antibody and a BNP fusion protein to a patient in an amount and time sufficient to induce continuous improvement of an indicator of the severity of a specific disorder above the baseline level.
  • the fusion protein of ETA antibody and BNP provided herein in the form of a composition comprising one or more other components, such as a physiologically acceptable carrier, adjuvant or diluent.
  • the composition may optionally additionally contain one or more physiologically active agents as described below.
  • the composition comprises one, two, three, four, five fusion proteins other than one or more of the antibodies provided herein (eg, murine antibodies or humanized antibodies) and BNP fusion proteins.
  • One or six physiologically active agents are physiologically active agents.
  • the pharmaceutical composition comprises the murine antibody or the fusion protein of humanized antibody and BNP provided herein and one or more substances selected from the group consisting of: a buffer with a pH suitable for the fusion protein of the antibody and BNP, Antioxidants such as ascorbic acid, low molecular weight polypeptides (such as polypeptides containing less than 10 amino acids), proteins, amino acids, sugars such as dextrin, complexes such as EDTA, glutathione, stabilizers and excipients. According to appropriate industry standards, preservatives may also be added.
  • the composition can be formulated into a freeze-dried powder using a suitable excipient solution as a diluent.
  • An example of the treatment regimen provided herein includes subcutaneous injection of a fusion protein of antibody and BNP at an appropriate dose once a week or longer to treat symptoms of pulmonary hypertension, pulmonary hypertension, and heart failure.
  • the fusion protein of antibody and BNP can be administered weekly or monthly until the desired result is achieved, such as the patient's symptoms disappear.
  • the treatment can be renewed as needed, or, optionally, a maintenance dose can be given.
  • the cGMP experiment detects the biological activity of the fusion protein of ETA antibody and BNP to activate NPRA in vitro
  • the experiment was commissioned by Prime Biotechnology Co., Ltd., and the study was carried out by a single intravenous injection of 2 mg/kg with h15F3-(G 4 S) 2 -BNP, h15F3-BNP(3-29) and h15F3-BNP( 9-32) Effect on blood pressure of healthy rhesus monkeys.
  • the monkeys were randomly grouped by body weight, fasted for 14-16 hours before anesthesia, and anesthetized the animals with 10 mg/kg ketamine hydrochloride intramuscular injection. Observed the size of the animal's arm and selected the correct cuff. The cuff was tied to the left upper arm of the animal for blood pressure testing.

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Abstract

本文提供了ETA抗体与BNP的融合蛋白质。本文还提供了ETA抗体与BNP融合蛋白质的药物组合物。本文进一步提供了ETA抗体与BNP融合蛋白质用于治疗、预防或改善肺动脉高压、肺高压、或心力衰竭的一种或多种症状方法。

Description

ETA抗体与BNP的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 技术领域
本文提供了ETA抗体与BNP的融合蛋白质。本文还提供了ETA抗体与BNP融合蛋白质的药物组合物。本文进一步提供了ETA抗体与BNP融合蛋白质用于治疗、预防或改善肺动脉高压、肺高压、或心力衰竭的一种或多种症状方法。
背景技术
肺动脉高压(Pulmonary Arterial Hypertension，PAH)是一种以肺动脉血压明显升高为特征的罕见的、渐进性的疾病。肺动脉高压已成为威胁人类健康的一个重要疾病，资料显示在全球范围内每年各类肺动脉高压发病率约为2.4～7.6/100万，患病率约为每百万人口15～26人，已成为仅次于缺血性心脏病和高血压的第3位常见的心血管疾病。肺动脉高压的致病原因人们尚不完全清楚，因其起病隐匿，患者就诊时多已处于肺动脉高压心功能的Ⅲ～Ⅳ级。肺动脉高压的伴随症状通常包括呼吸短促(特别是在运动时)、胸部疼痛、间断性的昏厥等，另外，随着病情的延续，肺动脉持续的高压会使得右心室向肺部供血的持续不畅，最终会导致右心室衰竭。心脏衰竭是肺动脉高压患者最常见的死亡原因。
目前尚未有根治肺动脉高压的方法，而药物治疗是肺动脉高压维持治疗的首选。经获FDA已批准用于肺动脉高压的治疗的药物均为血管舒张药物，按机理可分为钙离子通道阻滞剂、前列环素受体激动剂、5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂、内皮素受体抑制剂等。
肺动脉高压由肺内或者与肺关联血管的不断束紧(vasoconstriction)引起心脏对肺供血量不足后，心脏对肺供血压力补偿性增加而引起，其微观表现有肺小动脉内膜增厚，血管紧缩，重构，僵硬或者血栓造成的局部闭塞，进而血管对肺血液循环的阻力上升(Simonneau等，2004，J.Am.Coll.Cardiol.43:5S–12S；Barst等，2004，J.Am.Coll.Cardiol.43:40S–47S)。
内皮素受体(Endthelin Receptor A,ETA,或ET AR)抑制剂能够有效的阻断由内皮素引起的血管压力增加来达到缓解肺动脉高压的症状，改善病人的运动能力和血液动力学(Serasli等，2010，Recent Pat.Cardiovasc.Drug Discov.5:184-95)。
脑利钠肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)，主要在心室表达，是由心肌细胞合成的天然激素，同时也存在于脑组织中。血液BNP在心室功能障碍时升高，并通过维持肾功能和钠平衡来保护机体免受容量超负荷的影响。对肺高压患者的研究表明右心功能障碍时血液BNP相应升高。除了作为心血管疾病的生物标记外，BNP还是急性心衰(ADHF)的治疗选择。“奈西立肽”是人B型利钠肽的重组体，已在2001年被FDA批准治疗急性心衰。BNP与血管平滑肌和内皮细胞上的鸟苷酸环化酶受体结合，引起细胞内第二信使(second messager)环单磷酸鸟苷(cGMP)的水平升高，从而引发一系列生理效应：(1)具有内皮非依赖性的血管舒张活性，扩张动静脉，降低全身血管阻力、充盈压以及肺毛细血管嵌楔压，降低心脏前后负荷；(2)提高肾小球滤过率，产生排钠利尿作用，降低体液负荷，提高心排血量，综合性改善心脏功能；(3)在体内抑制肾素-血管紧张素-醛固酮***(RAAS)的激活，抑制由于扩血管效应引起的反射性心率增加，避免心律失常的发生；(4)抑制血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞的生长，对心肌肥厚有抑制作用。
本文提供了ETA抗体与BNP的融合蛋白质。一方面，ETA抗体与BNP的融合蛋白质可以抑制ETA信号通路和BNP信号通路在降低肺循环血管阻力和外周血管阻力的联合作用，降低体液负荷，缓解肺动脉高压和心脏衰竭的心脏重构，综合性的改善心脏功能。另一方面，ETA抗体与BNP的融合蛋白质可以延长BNP的半衰期，从而达到延长药物有效时间、减少药物副作用的目的。
发明内容
本文提供了ETA抗体与BNP的融合蛋白质。本文还提供了其用于治疗、预防或改善肺动脉高压、肺高压以及心力衰竭的一种或多种症状方法。
本文提供了一种ETA抗体与BNP的融合蛋白质，其结构特征在于：所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体和一或多个BNP。
本文提供了一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质，其结构特征在于：所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个，或八个BNP；该融合蛋白质将一BNP的氨基端与所述的ETA抗体轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质将一BNP的羧基端与所述的ETA抗体轻链或重链的氨基端连接。
本文提供了一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质，其结构特征在于：所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个或四个BNP；该融合蛋白质将一BNP的氨基端与所述的ETA抗体轻链或重链的 羧基端连接，或者该融合蛋白质将一BNP的羧基端与所述的ETA抗体轻链或重链的氨基端连接。
本文提供了一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质，其结构特征在于：所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体和二个BNP；该融合蛋白质将一BNP的氨基端与所述的ETA抗体轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质将一BNP的羧基端与所述的ETA抗体轻链或重链的氨基端连接。
本文提供了一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质，其结构特征在于：所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体和一个BNP；该融合蛋白质将所述的BNP的氨基端与所述的ETA抗体轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质将所述的BNP的羧基端与所述的ETA抗体轻链或重链的氨基端连接。
本文提供了一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质，其结构特征在于：所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个，或八个BNP和肽接头(Linker)；该融合蛋白质通过一肽接头序列(Linker)将一BNP的氨基端与所述的ETA抗体轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质通过一肽接头序列(Linker)将一BNP的羧基端与所述的ETA抗体轻链或重链的氨基端连接。
本文提供了一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质，其结构特征在于：所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个或四个BNP和肽接头(Linker)；该融合蛋白质通过一肽接头序列(Linker)将一BNP的氨基端与所述的ETA抗体轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质通过一肽接头序列(Linker)将一BNP的羧基端与所述的ETA抗体轻链或重链的氨基端连接。
本文提供了一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质，其结构特征在于：所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体和二个BNP和二个肽接头(Linker)；该融合蛋白质通过一肽接头序列(Linker)将一BNP的氨基端与所述的ETA抗体轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质通过一肽接头序列(Linker)将一BNP的羧基端与所述的ETA抗体轻链或重链的氨基端连接。
本文提供了一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质，其结构特征在于：所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体和一个BNP和一个肽接头(Linker)；该融合蛋白质通过所述的肽接头序列(Linker)将所述的BNP的氨基端与所述的ETA抗体轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质通过所述的肽接头序列(Linker)将所述的BNP的羧基端与所述的ETA抗体轻链或重链的氨基端连接。
本文提供了一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质，其结构特征在于：所述的ETA抗体、BNP和肽接头序列通过以下所述中一方式融合形成所述的融合蛋白质：
(1)通过一个肽接头序列(Linker)将一BNP的氨基端和一ETA抗体重链/轻链的羧基端连接：N'-R-Linker-BNP-C'；及
(2)通过一肽接头序列(Linker)将一BNP的羧基端与一ETA抗体轻链或重链的氨基端连接：N'-BNP-Linker-R-C'；
其中:N'代表多肽链的氨基端,C'代表多肽链的羧基端,BNP代表一BNP，R为一ETA抗体的轻链或者重链的氨基酸序列,及Linker代表一肽接头。
本文提供了一个多核苷酸，其编码本文中所述的一个ETA抗体和BNP的融合蛋白质。
本文提供了一个载体，其包含编码本文中所述的一个ETA抗体和BNP的融合蛋白质的多核苷酸。
本文提供了一个宿主细胞，其包含本文中所述的一个载体。
本文提供了一个药用组合物，其包含本文所述的一个ETA抗体和BNP的融合蛋白质，和一个药用可接受载体。
本文提供了本文所述的一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质在制备用于治疗、预防或改善肺动脉高压以及肺动脉高压相关病症的药物中的用途。
本文提供了本文所述的一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质在制备用于治疗、预防或改善肺高压以及肺高压相关病症的药物中的用途。
本文提供了本文所述的一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质在制备用于减肥或者治疗、预防或改善心力衰竭以及心力衰竭相关病症的药物中的用途。
本文提供了本文所述的一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质在制备用于同时治疗、预防或改善肺动脉高压、肺高压或者心力衰竭二种及二种以上病症的药物中的用途。
本文提供了治疗、预防或改善肺动脉高压以及肺动脉高压相关病症的一种或多种症状方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质。
本文提供了治疗、预防或改善肺高压以及肺高压相关病症的一种或多种症状方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个ETA抗体与 BNP的融合蛋白质。
本文提供了治疗、预防或改善心力衰竭以及心力衰竭相关病症的一种或多种症状方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质。
本文提供了治疗、预防或改善肺动脉高压、肺高压或者心力衰竭的二种及二种以上病症方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质。
附图说明：
[根据细则26改正07.07.2020]　
图1：显示了ETA抗体与BNP的融合蛋白质h15F3-(G 4S) 2-BNP(其包含SEQ ID NO:162，SEQ ID NO:190，SEQ ID NO:218，及SEQ ID NO:205)、h15F3-BNP(3-29)(其包含SEQ ID NO:162，SEQ ID NO:190，及SEQ ID NO:210)和h15F3-BNP(9-32)(其包含SEQ ID NO:162，SEQ ID NO:190，及SEQ ID NO:209)抑制人ETA介导的Ca 2+变化的结果。
[根据细则26改正07.07.2020]　
图2：显示了ETA抗体与BNP的融合蛋白质h15F3-(G 4S) 2-BNP、h15F3-BNP(3-29)和h15F3-BNP(9-32)在给药后15分钟后降低正常小鼠动脉压的效果。
[根据细则26改正07.07.2020]　
图3：显示了ETA抗体与BNP的融合蛋白质h15F3-(G 4S) 2-BNP不同剂量在MCT大鼠上降低右心室压力的效果。
[根据细则26改正07.07.2020]　
图4：显示了ETA抗体与BNP的融合蛋白质h15F3-(G 4S) 2-BNP、h15F3-BNP(3-29)和h15F3-BNP(9-32)在给药后10分钟降低健康猴子动脉压的效果。
[根据细则26改正07.07.2020]　
图5：显示了ETA抗体与BNP的融合蛋白质h15F3-(G 4S) 2-BNP、h15F3-BNP(3-29)和h15F3-BNP(9-32)在给药后60分钟降低健康猴子动脉压的效果。
[根据细则26改正07.07.2020]　
图6：显示了ETA抗体与BNP的融合蛋白质h15F3-(G 4S) 2-BNP在健康猴子上的药代动力学结果。
[根据细则26改正07.07.2020]　
图7：显示了ETA抗体与BNP的融合蛋白质h15F3-BNP(9-32)在健康猴子上的药代动力学结果。
具体实施方式定义
除非本文另外定义，与本文相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。通常，与本文所述药物学、生物学、生物化学、细胞和组织培养学、生物学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质核酸化学以及杂交相关的命名法和技术为本领域熟知和经常使用的。
本文使用标准的单字母或三字母缩写表明多聚核苷酸和多肽序列。除非另外指明，多肽序列的氨基端在左而它们的羧基端在右，单链核酸序列和 双链核酸序列的上游链的5’端在左而它们的3’端在右。多肽的具体部分可由氨基酸残基编号表示，例如氨基酸80至130，或由该位点的实际残基表示例如Lys80至Lys130。也可通过解释其与参比序列的差异描述具体的多肽或多聚核苷酸序列。
术语“肽”、“多肽”、和“蛋白”均指包含两个或多个通过肽健相互连接的氨基酸的分子。这些术语涵盖例如天然和人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物(例如突变蛋白、变异体和融合蛋白)以及转录后或否则为共价或非共价修饰的蛋白。肽、多肽或蛋白可为单体或多聚体。
术语“多肽片段”指与对应的全长蛋白相比具有氨基端和/或羧基端缺失的多肽。片段长度可为例如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150或200个氨基酸。片段长度可为例如最多1000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或10个氨基酸。片段可在其一端或两端进一步包含一个或多个附加氨基酸，例如，来自不同天然蛋白质的氨基酸序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如，人工接头序列)。
本文的多肽包括以任何原因和经任何方法修饰的多肽，例如，以：(1)降低蛋白水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的亲和性，(4)改变结合亲和性以及(4)赋予或修饰其它物理化学或功能性质。类似物包含多肽的突变蛋白。例如，可在天然序列(例如在形成分子内接触的结构域之外的多肽部分)中进行单个或多个氨基酸替换(例如，保守氨基酸替换)。“保守氨基酸替换”为不显著改变母体序列结构特性者(例如，替换氨基酸不应破坏母体序列中出现的螺旋或干扰其它赋予母体序列特性或对其功能是必须的二级结构类型)。
多肽的“变异体”包含相对于另一多肽序列在氨基酸序列中***、缺失和/或替换了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。本文的变异体包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”为经化学修饰的多肽，例如通过与其它化学部分例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)结合、磷酸化和糖基化。
除非另外说明，术语“抗体”包括除包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体外的其衍生物，变异体、片段和突变蛋白，其实例见下文。
术语“抗体”为包含与抗原结合部分并任选为允许抗原结合部分采取促进该抗体与该抗原结合的构象的支架或框架部分的蛋白。抗体的实例包括完整抗体、抗体片段(例如抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物、和抗体类似物。该抗体可包含例如可选择的蛋白支架或具有移植CDRs或CDRs衍 生物的人工支架。该支架包括但不限于包含被引入的例如以稳定化该抗体的三维结构的抗体衍生支架以及包含例如生物相容性多聚体的全合成支架。参见，例如，Korndorfer等，2003，Proteins:Structure，Function and Bioinformatics 53:121-129；Roque等，2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可使用模拟肽抗体(“PAMs”)以及基于模拟抗体的支架，其如支架一样利用纤维蛋白连接素。
抗体可具有例如天然免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”为四聚体分子。在天然的免疫球蛋白中，各四聚体由两个相同的多肽链对组成，各对具有一个“轻”(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基端包括约100至110或更多氨基酸的可变结构域，主要与抗原识别相关。各链的羧基端部分确定了主要与效应器作用相关的恒定区。人的轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ、δ、α或ε，并确定了抗原的同种型，例如分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变和恒定区由约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链也包括约10多个氨基酸的“D”区。参见，Fundamental Immunology Ch.7(Paul编辑，第2版，Raven Press，1989)(其完整内容以参考形式并于本文用于任何目的)。各轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，这样一个完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
天然免疫球蛋白链显示出由三个高度可变区连接的相对保守骨架区(FR)的相同基本结构，也被称作互补决定区或CDRs。从N端到C端，轻和重链均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各结构域氨基酸的分配与Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS，NIH，NIH Publication No.91-3242，1991中的定义一致。
除非另外指明，“抗体”指完整的免疫球蛋白或其可与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。可由重组DNA技术或通过酶或化学裂解完整抗体生产抗原结合部分。抗原结合部分包括，尤其是，Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv、结构域抗体(dAbs)，包括互补决定区(CDRs)的片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双链抗体(diabodies)、三链抗体(triabodies)、四链抗体(tetrabodies)和至少包含足以赋予多肽特异抗原结合的免疫球蛋白的一部分的多肽。
Fab片段为具有V L、V H、C L和C H1结构域的单价片段；F(ab’) 2片段为具有两个在铰链区由二硫键连接的Fab片段的二价片段；Fd片段具有V H或V L结构域；dAb片段具有V H结构域、V L结构域，或V H或V L结构域的抗原结合片段(美国专利号US6,846,634、US6,696,245，美国专利申请公开号US2005/0202512、US2004/0202995、US2004/0038291、US2004/0009507、US2003/0039958,Ward等，1989，Nature 341:544-546.)。
单链抗体(scFv)为其中的V L扣V H区由接头(例如，合成的氨基酸残基序列)连接以形成连续蛋白质的抗体，其中该接头足够长以允许该蛋白链折叠回自身并形成单价抗原结合位点(参见，例如，Bird等，1988，Science 242:423-26 and Huston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)。
双链抗体为包含两个多肽链的二价抗体，其中各多肽链包含由接头连接的V H和V L结构域，该接头很短以致于不允许两个结构域在相同链上的配对，因此允许各结构域与另一多肽链上的互补结构域配对(参见，例如，Holliger等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48，和Poljak等，1994，Structure 2:1121-23)。如果双链抗体的两个多肽链是相同的，那么由它们配对得到的双链抗体将具有相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可用于制备具有不同抗原结合位点的双链抗体。相似地，三链抗体和四链抗体分别为包含三个和四个多肽链的抗体并分别形成三个和四个抗原结合位点，其可相同或不同。
可使用Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版,US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication No.91-3242，1991中描述的方法鉴定给定抗体的互补决定区(CDRs)和框架区(FR)。可向分子中共价或非共价并入一个或多个CDRs使其成为抗体。抗体可以较大多肽链并入CDR(s)。可将CDR(s)共价连接至另一乡肽链，或非共价并入CDR(s)。CDRs允许抗体与具体的相关抗原特异性结合。
抗体可有一个或多个结合位点。如果多于一个结合位点，该结合位点可与另一个相同或不同。例如，天然人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。
术语“鼠源抗体”包括具有一个或多个来源于小鼠免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。
术语“人源化抗体”是将小鼠抗体分子的互补决定区序列移植到人抗体可变区框架中而制成的抗体。
术语“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”为包含与抗原相互作用的氨基酸残基(或其它部分)并有助于抗体对抗原的特异性和亲和力的抗体的部分。对与其抗原特异性结合的抗体而言，这将包括至少部分的至少一个其CDR结构域。
术语“表位”为与抗体(例如，通过抗体)结合的分子部分。表位可包含分子的非连续部分(例如，在多肽中，在多肽的一级序列中不连续的氨基酸残基在该多肽的三级和四级结构中相互足够接近以致于被一个抗体结合)。
两个多聚核苷酸或两个多肽序列的“相同百分比”由使用GAP计算机程序(GCG Wisconsin Package；version 10.3(Accelrys，San Diego，CA)的一部分)使用其默认参数比较序列测定。
术语“多聚核苷酸”、“寡聚核苷酸”和“核酸”可在全文中交替使用并包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天然核苷酸类似物)生成的DNA或RNA类似物及其杂交体。核酸分子可为单链或双链。在一个实施方案中，本文的核酸分子包含编码本文提供抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变异体连续的开放阅读框。
如果它们的序列可反向平行排列则两个单链多聚核苷酸是相互“互补的”，这样一个多聚核苷酸中的各核苷酸与另一多聚核苷酸中的互补核苷酸相反，不会引入空隙并且各序列的5’或3’端没有未配对的核苷酸。如果两个多聚核苷酸可在中等严格条件下相互杂交那么一个多聚核苷酸与另一多聚核苷酸“互补”。因此，一个多聚核苷酸可与另一多聚核苷酸互补，但并不是它的互补序列。
术语“载体”为可用于将与其相连的另一核酸引入细胞的核酸。载体的一种类型为“质粒”，其指可连接附加核酸区段的线性或环状双链DNA分子。载体的另一类型为病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺病毒伴随病毒)，其中可将附加DNA区段引入病毒基因组。某些载体可在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体以及游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组中并因此与宿主基因组一起复制。
“表达载体”为可引导所选多聚核苷酸表达的载体类型。
如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达水平、时间或位点)那么核苷酸序列与调控序列“可操作地相连”。“调控序列”为可影响与其可操作相连的核酸的表达(例如，表达水平、时间或位点)的核酸。调控基因，例如，直接对受调控核酸发挥作用或通过一个或多个其它分子(例如，与调控序列和/或核酸结合的多聚核苷酸)的作用。调控序列的实例包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调控序列的进一步实例描述于例如Goeddel，1990,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Volume 185,Academic Press,San Diego,CA and Baron等,1995,Nucleic Acids Res.23:3605-06。
术语“宿主细胞”为用于表达核酸例如本文提供核酸的细胞。宿主细胞可为原核生物，例如大肠杆菌，或者其可为真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其它真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、动物 细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。通常，宿主细胞为可用多肽编码核酸转化或转染的培养细胞，其可接着在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可用于表述用预期表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可为包含该核酸但是不以期望水平表达的细胞，除非向该宿主细胞引入了调控序列这样其与核酸可操作地相连。应理解的是术语宿主细胞不仅指具体的受试者细胞也指该细胞的子代或可能的子代。由于例如突变或环境影响后续世代会出现某些修饰，该子代事实上可能与母体细胞不同但是仍然属于本文使用的术语范围。
内皮素受体
内皮素受体(ETA)属于7-跨膜受体家族的A亚家族，其通过异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)与一个或多个胞内信号传导途径偶联(Jelinek等，1993,Science 259:1614-1616,Segre等,1993,Trends Endocrinol.Metab.4:309-314)。如本文所使用“内皮素受体”和“ETA”或“ET AR”可交替使用。
在一个实施方案中，可选择本文所述的抗体结合表达于细胞上的膜结合内皮素受体并通过内皮素受体抑制或阻断内皮素信号传导。在一个实施方案中，本文所述的抗体与人内皮素受体特异性结合。在进一步的实施方案中，与人内皮素受体结合的抗体也可与其它物种的内皮素受体结合，例如大鼠。下文中的实施例提供生成与人膜结合内皮素受体结合的鼠源抗体，在进一步的实施方案中与其它物种的内皮素受体结合。
已知数个物种的内皮素受体的多聚核苷酸和多肽序列。SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:6显示了人、猴子和大鼠的序列。序列数据来源于美国国立生物技术信息中心的GeneBank数据库。
内皮素受体A(ETA)如下：
人(Homo sapiens)多聚核苷酸(SEQ ID NO:1)；登录号：S63938。
人(Homo sapiens)氨基酸(SEQ ID NO:2)；登录号：AAB20278。
猴子(Cynomolgus monkey)多聚核苷酸(SEQ ID NO:3)；登录号：JV635771。
猴子(Cynomolgus monkey)氨基酸(SEQ ID NO:4)；登录号：AFJ71111。
大鼠(Rattus norvegicus)多聚核苷酸(SEQ ID NO:5)；登录号：M60786。
大鼠(Rattus norvegicus)氨基酸(SEQ ID NO:6)；登录号：AAA41114。
内皮素受体A(ETA)抗体
在一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含一个、两个、三个、四个、五个、或六个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：
a.轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、及SEQ ID NO:30；
b.轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、及SEQ ID NO:48；
c.轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68，及SEQ ID NO:220；
d.重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、及SEQ ID NO:90；
e.重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、及SEQ ID NO:114；及
f.重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、及SEQ ID NO:136。
表一列出本文所述的ETA抗体的轻链CDRs的氨基酸序列，以及其相应的多聚核苷酸编码序列。表二列出本文所述的ETA抗体的重链CDRs的氨基酸序列，以及其相应的多聚核苷酸编码序列。
表一：轻链CDRs的氨基酸序列及其多聚核苷酸编码序列
Figure PCTCN2020095062-appb-000001
Figure PCTCN2020095062-appb-000002
Figure PCTCN2020095062-appb-000003
表二：重链CDRs的氨基酸序列及其多聚核苷酸编码序列
Figure PCTCN2020095062-appb-000004
Figure PCTCN2020095062-appb-000005
Figure PCTCN2020095062-appb-000006
在一个实施方案中，本文所述的抗体包含与表1和表2中的CDR氨基酸序列各相差5、4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。在另一个实施方案中，本文所述的抗体包含与表1和表2中的CDR氨基酸序列各相差4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。在另一个实施方案中，本文所述的抗体包含与表1和表2中的CDR氨基酸序列各相差3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。在另一个实施方案中，本文所述的抗体包含与表1和表2中的CDR氨基酸序列各相差2或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。在另一个实施方案中，本文所述的抗体包含与表1和表2中的CDR氨基酸序列各相差1个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体(ETA-1抗体)，其包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：
a.轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、及SEQ ID NO:30；和
b.重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、及SEQ ID NO:90。
一方面，ETA-1抗体还包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：
a.轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、及SEQ ID NO:48；和
b.重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、及SEQ ID NO:114。
另一方面，ETA-1抗体还包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：
a.轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68，及SEQ ID NO:220；和
b.重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、及SEQ ID NO:136。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体(ETA-2抗体)，其包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：
a.轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、及SEQ ID NO:48；和
b.重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、及SEQ ID NO:114。
一方面，ETA-2抗体还包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：
a.轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、及SEQ ID NO:30；和
b.重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、及SEQ ID NO:90。
另一方面，ETA-2抗体还包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：
a.轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68，及SEQ ID NO:220；和
b.重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、及SEQ ID NO:136。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体(ETA-3抗体)，其包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：
a.轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68，及SEQ ID NO:220；和
b.重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、及SEQ ID NO:136。
一方面，ETA-3抗体还包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：
a.轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、及SEQ ID NO:30；和
b.重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、及SEQ ID NO:90。
另一方面，ETA-3抗体还包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：
a.轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、及SEQ ID NO:48；和
b.重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、及SEQ ID NO:114。
在一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含：a.一个独立地选自于以下所列的轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、及SEQ ID NO:30；
b.一个独立地选自于以下所列的轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、及SEQ ID NO:48；
c.一个独立地选自于以下所列的轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、及SEQ ID NO:68；
d.一个独立地选自于以下所列的重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、及SEQ ID NO:90；
e.一个独立地选自于以下所列的重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、及SEQ ID NO:114；及
f.一个独立地选自于以下所列的重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、及SEQ ID NO:136。
在一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含一个独立地选自于以下所列的轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68，及SEQ ID NO:220。在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含一个独立地选自于以下所列的重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQID NO:132、SEQ ID NO:134、及SEQ ID NO:136。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含一个独立地选自于以下所列的轻链与重链CDR3氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:50与SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:50与SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:62与SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:62与SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:64与SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:134、及SEQ ID NO:68与SEQ ID NO:136。
在一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含:
(a)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:8；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:32；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:220；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:70；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:92；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:116；
(b)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:10；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:34；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:52；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:72；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:94；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:118；
(c)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:12；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:36；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:54；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:74；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:96；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:120；
(d)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:14；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:38；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:56；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:76；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:98；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:122；
(e)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:16；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:40；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:58；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:78；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:100；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:124；
(f)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:18；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:42；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:60；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:80；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:102；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:126；
(g)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:20或22；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:44；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:62；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:82；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:104或106；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:128；
(h)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:24；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:44；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:62；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:84；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:108；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:130；
(i)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:26；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:46；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:64；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:86；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:110；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:132；
(j)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:28；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:46；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:66；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:88；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:112；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:134；或
(k)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:30；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:48；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:68；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:90；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:114；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:136。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含:
轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:28；
轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:46；
轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:66；
重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:88；
重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:112；及
重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:134。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体，其包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：
a.轻链可变结构域氨基酸序列：SEQ ID NO:138(L1)、SEQ ID NO:140(L2)、SEQ ID NO:142(L3)、SEQ ID NO:144(L4)、SEQ ID NO:146(L5)、SEQ ID NO:148(L6)、SEQ ID NO:150(L7)、SEQ ID NO:152(L8)、SEQ ID NO:154(L9)、SEQ ID NO:156(L10)、SEQ ID NO:158(L11)、SEQ ID NO:160(L12)、SEQ ID NO:162(L13)、及SEQ ID NO:164(L14)、及与其有至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同的氨基酸序列；及
b.重链可变结构域氨基酸序列：SEQ ID NO:166(H1)、SEQ ID NO:168(H2)、SEQ ID NO:170(H3)、SEQ ID NO:172(H4)、SEQ ID NO:174(H5)、SEQ ID NO:176(H6)、SEQ ID NO:178(H7)、SEQ ID NO:180 (H8)、SEQ ID NO:182(H9)、SEQ ID NO:184(H10)、SEQ ID NO:186(H11)、SEQ ID NO:188(H12)、SEQ ID NO:190(H13)、及SEQ ID NO:192(H14)、及与其有至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体的多聚核苷酸编码序列包含一个或两个多聚核苷酸序列，其中每个多聚核苷酸列独立地选自于以下所列多聚核苷酸序列：
a.轻链可变结构域的多聚核苷酸编码序列：SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、及SEQ ID NO:163、及与其有至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同的多聚核苷酸序列；及
b.重链可变结构域的多聚核苷酸编码序列：SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、及SEQ ID NO:191、及与其有至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同的多聚核苷酸序列。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体，其包含:
a.一个独立地选自于以下所列的轻链可变结构域氨基酸序列：SEQ ID NO:138(L1)、SEQ ID NO:140(L2)、SEQ ID NO:142(L3)、SEQ ID NO:144(L4)、SEQ ID NO:146(L5)、SEQ ID NO:148(L6)、SEQ ID NO:150(L7)、SEQ ID NO:152(L8)、SEQ ID NO:154(L9)、SEQ ID NO:156(L10)、SEQ ID NO:158(L11)、SEQ ID NO:160(L12)、SEQ ID NO:162(L13)、及SEQ ID NO:164(L14)及与其有至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同的氨基酸序列；及
b.一个独立地选自于以下所列的重链可变结构域氨基酸序列：SEQ ID NO:166(H1)、SEQ ID NO:168(H2)、SEQ ID NO:170(H3)、SEQ ID NO:172(H4)、SEQ ID NO:174(H5)、SEQ ID NO:176(H6)、SEQ ID NO:178(H7)、SEQ ID NO:180(H8)、SEQ ID NO:182(H9)、SEQ ID NO:184(H10)、SEQ ID NO:186(H11)、SEQ ID NO:188(H12)、SEQ ID NO:190(H13)、及SEQ ID NO:192(H14)、及与其有至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体，其包含:
a.一个独立地选自于以下所列的轻链可变结构域氨基酸序列：SEQ ID NO:138(L1)、SEQ ID NO:140(L2)、SEQ ID NO:142(L3)、SEQ ID NO:144(L4)、SEQ ID NO:146(L5)、SEQ ID NO:148(L6)、SEQ ID NO:150(L7)、SEQ ID NO:152(L8)、SEQ ID NO:154(L9)、SEQ ID NO:156(L10)、SEQ ID NO:158(L11)、SEQ ID NO:160(L12)、SEQ ID NO:162(L13)、及SEQ ID NO:164(L14)；及
b.一个独立地选自于以下所列的重链可变结构域氨基酸序列：SEQ ID NO:166(H1)、SEQ ID NO:168(H2)、SEQ ID NO:170(H3)、SEQ ID NO:172(H4)、SEQ ID NO:174(H5)、SEQ ID NO:176(H6)、SEQ ID NO:178(H7)、SEQ ID NO:180(H8)、SEQ ID NO:182(H9)、SEQ ID NO:184(H10)、SEQ ID NO:186(H11)、SEQ ID NO:188(H12)、SEQ ID NO:190(H13)、及SEQ ID NO:192(H14)。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含一个独立地选自于以下所列的轻链与重链可变结构域氨基酸序列的组合:SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:166(L1H1)、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:168(L2H2)、SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:170(L3H3)、SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:172(L4H4)、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:174(L5H5)、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:176(L6H6)、SEQ ID NO:150和SEQ ID NO:178(L7H7)、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:180(L8H8)、SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:182(L9H9)、SEQ ID NO:156和SEQ ID NO:184(L10H10)、SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:186(L11H11)、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:188(L12H12)、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:190(L13H13)、及SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:192(L14H14)。在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含一轻链与重链可变结构域氨基酸序列的组合:SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:190(L13H13)。
本文也可用“LxHy”符号来表示本文所述的ETA抗体，其中“x”对应于轻链可变区并且“y”对应于重链可变区。例如，L2H1指具有包含SEQ ID NO:140(L2)氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:166(H1)氨基酸序列的重链可变区的抗体。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含选自L1-L14的轻链可变区或选自H1-H14的重链可变区及其片段、衍生物、突变蛋白、或变异体的抗体。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含一个独立地选自于以下所列的轻链与重链CDR3氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:138与SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:150与SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:152与SEQ  ID NO:180、SEQ ID NO:154与SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:156与SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:158与SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:160与SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:162与SEQ ID NO:190、及SEQ ID NO:164与SEQ ID NO:192。
在一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含SEQ ID NO:138轻链可变结构域氨基酸序列或SEQ ID NO:166重链可变结构域氨基酸序列。在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体包含SEQ ID NO:138轻链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO:166的重链可变结构域氨基酸序列的组合。在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体还包含恒定氨基酸序列，其中每个恒定氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列：a.轻链恒定氨基酸序列:SEQ ID NO:194及SEQ ID NO:196；及b.重链恒定氨基酸序列:SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:221。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体还包含恒定氨基酸序列，其中每个恒定氨基酸序列独立地选自于以下所列的轻链和重链恒定氨基酸序列的组合：
a.轻链恒定氨基酸序列SEQ ID NO:194和重链恒定氨基酸序列SEQ ID NO:198的组合；
b.轻链恒定氨基酸序列SEQ ID NO:194和重链恒定氨基酸序列SEQ ID NO:221的组合；
c.轻链恒定氨基酸序列SEQ ID NO:196和重链恒定氨基酸序列SEQ ID NO:198的组合；
d.轻链恒定氨基酸序列SEQ ID NO:196和重链恒定氨基酸序列SEQ ID NO:221的组合。
在另一个实施方式中，本文所述ETA抗体的轻链和重链的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:222和SEQ ID NO:236。
在一个实施方案中，本文所述的抗体包含本文所列轻链及重链CDRs和FRs(框架)的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体包含本文所列的轻链CDR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列的轻链CDR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列的轻链CDR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列的重链CDR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列的重链CDR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列的轻链FR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列的轻链FR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列轻链的FR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列的轻链FR4 序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列的重链FR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列重链的FR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列的重链FR3厚列。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列的重链FR4序列。
在一个实施方案中，该抗体的CDR3序列与本文所列轻重链CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:50与SEQ ID NO:116的组合相差最多不超过6、5、4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失。在另一个实施方案中，该抗体的轻链CDR3序列与本文所列轻链CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:50相差不得超过6、5、4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失。在另一个实施方案中，该抗体的轻链CDR3序列与本文所列轻链CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:50相差不得超过6、5、4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失，并且该抗体的重链CDR3序列与本文所列重链CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:118相差最多不超过6、5、4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失。在另一个实施方案中，该抗体进一步包含1、2、3、4、5、或6个本文所列轻重链CDR轻重链序列组合。在另一个实施方案中，该抗体进一步包含1、2、3、4、5、或6个CDR轻重链序列组合，各序列独自与本文所列轻重链轻重链CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:50与SEQ ID NO:116的组合相差最多不超过6、5、4、3、2、或1个单氨基酸。在另一个实施方案中，该抗体包含本文所列轻链可变区的CDRs和重链可变区的CDRs。在另一实施方案中，该抗体包含本文所列的1、2、3、4、5、和/或6个CDR轻重链序列组合。
在一个实施方案中，该抗体(例如抗体或抗体片段)包含本文所列L1轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，该轻链可变结构域包含与L1的轻链可变结构域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中各该序列的差异独立为一个氨基酸残基的缺失、***或替换。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域包含与L1的轻链可变结构域序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域多聚核苷酸编码序列包含与L1多聚核苷酸编码序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％相同的核苷酸编码序列。在另一个实施方案中，该轻链可变结构域多聚核苷酸编码序列包含在中等条件下与L1的轻链可变结构域的多聚核苷酸编码序列互补序列杂交的多聚核苷酸序列。在另一个实施方棠中，该轻链可变结构域多聚核苷酸编码序 列包含在严格条件下与L1的轻链可变结构域的多聚核苷酸编码序列互补序列杂交的多聚核苷酸序列。
在一个实施方案中，该抗体(例如抗体或抗体片段)包含本文所列H1重链可变结构域序列。在另一个实施方案中，该可变结构域包含选与H1的重链可变结构域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中各该序列的差异独立为一个氨基酸残基的缺失、***或替换。在另一个实施方案中，该重链可变结构域包含与H1的重链可变结构域序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该重链可变结构域多聚核苷酸编码序列包含与H1多聚核苷酸编码序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％相同的核苷酸编码序列。在另一个实施方案中，该重链可变结构域多聚核苷酸编码序列包含在中等严格条件下与H1的重链可变结构域的多聚核苷酸编码序列互补序列杂交的多聚核苷酸序列。在一个实施方案中，该重链可变结构域多聚核苷酸编码序列包含在严格条件下与H1的重链可变结构域的多聚核苷酸编码序列互补序列杂交的多聚核苷酸序列。
在一个实施方案中，本文所述的抗体包括包含组合L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、或L14H14的抗体，或其期望表型(例如，IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE和IgD)，或其Fab或F(ab') 2片段。
在一个实施方案中，本文所述的抗体包括包含组合L1H1的抗体，或其类转换的抗体(例如，IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE和IgD)，或其Fab或F(ab') 2片段。
本文所述的抗体(例如，抗体、抗体片段、和抗体衍生物)可包含本领域已知的恒定区中任何一个。轻链恒定区可为例如κ或λ型轻链恒定区，例如小鼠κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α、δ、ε、γ、或μ型重链恒定区，例如小鼠α、δ、ε、γ、或μ型重链恒定区。在一个实施方案中，该轻链或重链恒定区为天然恒定区的片段、衍生物、变异体、或突变蛋白。
在一个实施方案中，本文所述的抗体进一步包含恒定轻链κ或λ结构域或这些的片段。轻链恒定区序列和它们的多聚核苷酸提编码序列供如下：多聚核苷酸(κ)，(SEQ ID NO:193)；氨基酸(κ)，(SEQ ID NO:194)；多聚核苷酸(λ)，(SEQ ID NO:195)；氨基酸(λ)，(SEQ ID NO:196)。
在另一个实施方案中，本文所述的抗体进一步包含重链恒定结构域或其片段。重链恒定区序列和它的多聚核苷酸编码序列提供如下：多聚核苷酸(IgG4)，(SEQ ID NO:197)；氨基酸(IgG4)，(SEQ ID NO:198)。
在一个实施方式中，本文所述的ETA抗体选自鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(ab’) x片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、和IgG4抗体。在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体为ETA单克隆抗体。在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体为自鼠源ETA抗体。本文所述的ETA抗体为人源化ETA抗体。
在一个实施方式中，本文所述的ETA抗体为单克隆抗体A-1(其包含SEQ ID NO:138与SEQ ID NO:166)、A-7(其包含SEQ ID NO:150与SEQ ID NO:178)、A-8(其包含SEQ ID NO:152与SEQ ID NO:180)、A-9(其包含SEQ ID NO:154与SEQ ID NO:182)、A-10(其包含SEQ ID NO:156与SEQ ID NO:184)、A-11(其包含SEQ ID NO:158与SEQ ID NO:186)、A-12(其包含SEQ ID NO:160与SEQ ID NO:188)、A-13(其包含SEQ ID NO:162与SEQ ID NO:190)、或A-14(其包含SEQ ID NO:164与SEQ ID NO:192)。
抗体和抗体片段
在一个实施方案中，本文所述的抗体为完整抗体(包括具有全长重和/或轻链的多克隆、单克隆、嵌合、人源化或人类抗体)。在另一个实施方案中，本文所述的抗体为抗体片段，列如F(ab’) 2、Fab、Fab’、Fv、Fc、或Fd片段，并可整合入单结构域抗体、单链抗体、最大抗体(maxibodies)、微抗体(minibodies)、内抗体(intrabodies)、二链抗体、三链抗体、四链抗体、v-NAR和bis-scFv(参见，例如Hollinger and Hudson，2005，Nature Biotechnology 23:1126-1136)。在另一个实施方案中，本文所述的抗体也包括抗体多肽例如美国专利号US6,703,199中所公开的那些，包括纤维结合素多肽单抗体。在另一个实施方案中，本文所述的抗体也包括其它抗体多肽公开于美国专利申请公开号US2005/0238646，其为单链多肽。
在一个实施方案中，使用核苷酸引物扩增在杂交瘤中表达相关单克隆抗体的基因的可变区。这些引物可由本领域普通技术人员合成或从商业来源购买(参见，例如Stratagene，La Jolla，California)，这些厂商销售鼠和人可变区引物包括V Ha、V Hb、V Hc、V Hd、C H1、V L和C L区的引物。这些引物可用于扩增重链或轻链可变区，然后将其分别***载体例如IMMUNOZAPTMH或ILLLFFLUNOZAPTML(Stratagene)中。然后将这 些载体引入大肠杆菌、酵母或哺乳动物为基础的表达***。可使用这些方法生产大量包含V H和V L结构域融合的单链蛋白(参见Bird等，1988，Science242:423-426)。
一旦使用上述任何免疫和其它技术获得了根据本文生产抗体的细胞，可根据本文所述标准方法通过分离并从其扩增DNA或mRNA将特异抗体基因克隆。测序从其生产的抗体并鉴定CDRs，可如之前所述对编码CDRs的DNA进行操作以生成根据本文所述的其它抗体。
本文所述的抗体优选在本文描述的基于细胞的测定法中和/或本文描述的体内测定法中调节内皮素信号传导和/或交叉阻断本申请所述抗体之一的结合和/或经本申请所述抗体之一被结合ETA交叉阻断。因此可使用本文所述测定法鉴定该类结合剂。
在一些实施方案中，通过首先鉴定在本文描述的基于细胞的和/或体内测定法中与过表达ETA的细胞结合和/或中和和/或交叉阻断本申请描述的抗体和/或经本申请描述的抗体之一被结合ETA交叉阻断的抗体以生成抗体。
本领域技术人员应理解的是一些蛋白质，例如抗体，可能进行可多种转录后修饰。这些修饰的类型和程度取决于用于表达该蛋白的宿主细胞系以及培养条件。该类修饰包括糖基化作用、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺作用的变化。由于羧肽酶的作用频繁修饰导致羧端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)的丢失(如Harris，1995，Journal of Chromatography 705:129-134中所述)。
生产鼠单克隆抗体的可选择方法为将杂交瘤细胞注入同系基因小鼠的腹膜腔，例如经处理(例如姥鲛烷初次免疫)促进形成包含单克隆抗体的腹水的小鼠。可通过多种已确立的技术分离和纯化单克隆抗体。该类分离技术包括使用蛋白A-琼脂糖的亲和色谱法、分子排阻色谱法和离子交换色谱法，参见，例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页；Baines等，“Purification of Immunoglobulin G(IgG),”Methods in Molecular Biology，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.，1992)。可使用基于抗体的特殊性质(例如，重链或轻链同种型、结合特异性等)筛选的适当配基通过亲和色谱法纯化单克隆抗体。固定化于固体载体的适当配基的实例包括蛋白A、蛋白G、抗恒定区(轻链或重链)抗体、抗独特型抗体以及TGF-p结合蛋白或其片段或变异体。
可使用抗体结合位点中央的互补决定区(CDRs)的分子进化分离亲和性增加的抗体，例如对c-erbB-2亲和性增加的抗体，如Schier等，1996，J.Mol.Biol.263:551-567所述。因此，该类技术可用于制备人内皮素受体 的抗体。例如可在检测是否存在内皮素受体的体外或体内测定法中使用针对人内皮素受体的抗体。
也可通过任何传统技术制备抗体。例如，可从天然表达这些抗体的细胞将其纯化(例如，可从生产抗体的杂交瘤将其纯化)或使用本领域任何已知的技术在重组表达***中生产。参见，例如，Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimensionin Biological Analyses,Kennet等编辑，Plenum Press(1980)；和Antibodies:A Laboratory Manual,Harlowand Land编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)。这在下文的核酸部分讨论。
可通过任何已知技术制备抗体并筛选期望性质。一些技术涉及分离编码相关抗体(例如，抗内皮素受体抗体)的多肽链(或其部分)的核酸，并通过重组DNA技术操作核酸。该核酸可与另一相关核酸融合或经修饰(例如通过诱变或其它传统技术)以添加、缺失或替换一个或多个氨基酸残基。
当需要提高根据本文包含一个或多个上述CDRs的抗体的亲和性时，可通过多种亲和成熟方案包括维持CDRs(Yang等，1995，J.Mol.Biol.254:392-403)、链替换(Marks等，1992，Bio/Technology 10:779-783)、使用大肠杆菌的突变株(Low等，1996，J.Mol.Biol.250:350-368)DNA重排(Patten等，1997，Curr.Opin.Biotechnol.8:724-733)、噬菌体展示(Thompson等，1996，J.Mol.Biol.256:7-88)以及其它PCR技术(Crameri等，1998，Nature 391：28 8-291)。所有这些亲和力成熟方法讨论于Vaughan等，1998，Nature Biotechnology 16:535-539中。
在一个实施方案中，本文所述的抗体为抗内皮素受体片段。该片段可完全由抗体衍生序列组成或可包含附加序列。抗原结合片段的实例包括Fab、F(ab’) 2、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体和结构域抗体，其它实例提供于Lunde等，2002，Biochem.Soc.Trans.30:500-06。
可经氨基酸桥(短肽接头)连接重链和轻链可变结构域(Fv区)形成单链抗体，从而得到单多肽链。已通过将编码肽接头的DNA融合在编码两个可变结构域多肽(V L和V H)的DNAs之间制备该单链Fvs(scFvs)。所得多肽可折叠回自身形成抗原结合单体，或它们可形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)，取决于两个可变结构域之间的柔性接头的长度(Kortt等，1997，Prot.Eng.10:423；Kortt等2001，Biomol.Eng.18:95-108)。通过组合包含多肽的不同V L和V H，可形成与不同表型结合的多体scFvs(Kriangkum等，2001，Biomol.Eng.18:31-40)。已研发的用于生产单链抗体的技术包括美国专利号US4,946,778；Bird，1988，Science 242:423；Huston等，1988,PNAS USA 85:5879-5883；Ward等，1989，Nature 334:544-546；deGraaf等，2002，Methods Mol.Biol.178:379-87申描述的那些。来源于本 文所述的抗体的单链抗体包括但不限于包含可变结构域组合L1H1的scFvs，均涵盖于本文。
也可通过抗体的蛋白水解作用例如根据传统方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗体获得来源于抗体的抗原结合片段。举例而言，可用胃蛋白酶酶裂解抗体提供称作F(ab’) 2的SS片段生产抗体片段。可使用巯基还原剂进一步裂解这一片段产生3.5S Fab’单价片段。可选择的方案有，使用巯基保护基团进行该裂解反应得到二硫键的裂解；另外还可以使用木瓜蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法描述于例如Goldenberg，美国专利号US4,331,647，Nisonoff等，1960，Arch.Biochem.Biophys.89:230；Porter，1959，Biochem.J.73:119；Edelman等，Methods in Enzymology l:422(Academic Press，1967)；以及Andrews和Titus,J.A.Current Protocols in Immunology(Coligan等编辑，John Wiley&Sons,2003)，第2.8,1-2.8.10页和第2.10A.1-2.10A.5页。其它裂解抗体的方法，例如制备重链以形成单价重、轻链片段(Fd)，进一步裂解片段或也可使用其它酶、化学或基因技术，只要片段与可被该完整抗体识别的抗原结合。
另一种形式的抗体片段为包含一个或多个抗体互补决定区(CDRs)的肽。可通过构建编码相关CDR的多肽获得CDRs。例如可通过使用聚合酶链式反应用抗体生成细胞的mRNA作为模板合成可变区制备该类多肽，参见，例如，Larrick等，1991，Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106；Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,”Monoclonal Antibodies:Production,Engineering and Clinical Application，Ritter等编辑，166页(Cambridge University Press，1995)；和Ward等，“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,”Monoclonal Antibodies:Principles and Applications，Birch等编辑，137页(Wiley-Liss，Inc.，1995)。该抗体片段可进一步包含本文所述抗体的至少一个可变结构域。因此，例如，V区结构域可为单体并且是V H或V L结构域，其可以如下文所述的至少等于1x10 -7M或更低的亲和度独立与内皮素受体结合。
该可变区结构域可为任何天然可变结构域或其基因工程形式。基因工程形式指使用重组DNA工程技术生产的可变区结构域。该基因工程形式包括例如通过向特异抗体的氨基酸序列***、缺失或改变从特异抗体可变区产生的。具体实例包括包含只含一个CDR以及任选来自一个抗体的一个或多个框架氨基酸和来自另一抗体的可变区结构域剩余部分，并由基因工程组装成的可变区结构域。
可变区结构域可与至少一个其它抗体结构域或其片段在C端氨基酸共价连接。因此，举例而言，存在于可变区结构域的V H结构域可与免疫球蛋 白C H1结构域或其片段相连。相似地，V L结构域可与C K结构域或其片段相连。以这种方式，例如，该抗体可为Fab片段，其中抗原结合结构域包含它们的C端分别与C H1和C K结构域共价连接的联合V H和V L结构域。可用其它氨基酸延长C H1结构域，例如以提供铰链区或如Fab’片段中的部分铰链结构域或提供其它结构域，例如抗体C H2和C H3结构域。
抗体的衍生物和变异体
例如可通过随机诱变或通过定点诱变(例如寡聚核苷酸诱导的定点诱变)改变编码对应于氨基酸序列A-1的核苷酸序列L1和H1以产生与未突变多聚核苷酸相比包含一个或多个具体核苷酸替换、缺失或***的经改变的多聚核苷酸。用于产生该类改变的技术实例描述于Walder等，1986，Gene 42:133；Bauer等，1985，Gene 37:73；Craik,1985，BioTechniques,3:12-19；Smith等，1981,Genetic Engineering:Principles and Methods，Plenum Press；以及美国专利号US4,518,584和US4,737,462。这些和其它方法可用于产生例如与未衍生化抗体相比具有期望性质例如亲和性、亲和力或对内皮素受体的特异性增强、体内或体外活性或稳定性增强或体内副作用降低的抗内皮素受体抗体的衍生物。
本文领域的其它抗内皮素受体抗体衍生物包括抗内皮素受体抗体或其片段与它蛋白或多肽的共价或聚集结合物，例如通过表达包含与抗内皮素受体抗体多肽的N端或C端融合的异源多肽的重组融合蛋白。例如，该结合肽可为异源信号(或引导)多肽，例如酵母α因子前导肽或例如表位标签的肽。包含融合蛋白的抗体可包含被添加以辅助抗体的纯化或鉴定的肽(例如多聚组氨酸)。抗体也可与FLAG肽连接，如Hopp等，1988,Bio/Technology6:1204和美国专利号US5,011,912所述。FLAG肽具有高抗原性并提供被特异单克隆抗体(mAb)可逆结合的表位，允许已表达重组蛋白的快速检测和方便纯化。可商业购买(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)用于制备其中FLAG肽与给定多肽融合的融合蛋白的试剂，在另一个实施方案中，包含一个或多个抗体的寡聚体可用作内皮素受体拮抗剂或用更高级的寡聚体。寡聚体可以是共价连接的或非共价连接的二聚体、三聚体或更高的寡聚体形式。可使用包含两个或更多个抗体的寡具体，其中一个实例为同型二聚体。其它寡聚体包括异二聚体、同型三聚体、异三聚体、同型四聚体、杂四聚体等。
一个实施方案是针对包含多个抗体的寡聚体，它们通过与抗体融合的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接。该类肽可为肽接头(spacers)或具有促进寡聚化作用性质的肽。亮氨酸拉链和某些来源于抗体的多肽为可促进抗体寡聚化的肽，如下文详细描述。
在具体的实施方案中，寡聚体包含两个至四个抗体。寡聚体的抗体可为任何形式，如上文所述任何形式，例如变异体或片段。优选地，该寡聚体包含具有内皮素受体结合活性的抗体。
在一个实施方案中，使用来源于免疫球蛋白的多肽制备寡聚体。制备包含一些与抗体衍生多肽(包括Fc结构域)的不同部位融合的异源多肽已描述于例如Ashkenazi等，1991，PNAS USA 88:10535；Byrn等，1990，Nature 344:677；和Hollenbaugh等，Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins,Current Protocols in Immunology，Suppl.4，第10.19.1-10.19.11页。本文的一个实施方案是针对包含两个由融合抗内皮素受体抗体的内皮素结合片段与抗体的Fc区产生的融合蛋白的二聚体。可通过以下方式制备二聚体：例如在适当的表达载体中***编码融合蛋白的基因融合，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达该融合基因并允许已表达融合蛋白像抗体分子一样组装，其中Fc部分之间的链间二硫键形成二聚体。
如本文所使用术语“Fc多肽”包括来源于抗体Fc区的天然和突变蛋白形式的多肽。也包括包含促进二聚体化的铰链区的该类多肽的截短形式。包含Fc部分(以及由其形成的寡聚体)的融合蛋白提供了在蛋白A或蛋白G柱子上进行亲和层析法方便纯化的优势。
PCT申请W093/10151(以参考形式并于本文)中一种适当的Fc多肽为从N端铰链区延伸至人IgG1抗体的Fc区的天然C端的单链多肽。另一种可用的Fc多肽为美国专利号US5,457,035和Baum等，1994,EMBO J.13:3992-4001中描述的Fc突变蛋白。该突变蛋白的氨基酸序列与W093/10151中所示天然Fc序列的氨基酸序列相同，除了氨基酸19从亮氨酸变为丙氨酸，氨基酸20从亮氨酸变为谷氨酰胺以及氨基酸22从甘氨酸变为丙氨酸。该突变蛋白表现出对Fc受体的亲和力降低。在其它实施方案中，抗内皮素受体抗体的重链和/或轻链可被取代为抗体重链和/或轻链的可变部分。
或者，该寡聚体为包含多个抗体的融合蛋白，包含或不包含接头肽(spacer peptides)。这些适当的接头肽描述于美国专利号US4,751,180和US4,935,233。
制备寡聚抗体的另一种方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域为促进它们所存在的蛋白寡聚化作用的肽。最初发现亮氨酸拉链存在于数种DNA结合蛋白中(Landschulz等，1988，Science 240:1759)，此后发现存在于各种不同蛋白中。在已知的亮氨酸拉链中为可二聚体化或三聚体化的天然肽或其衍生物。适用于生产可溶寡聚蛋白的亮氨酸拉链结构域的实例描述于PCT申请W094/10308，来源于肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸 拉链描述于Hoppe筝，1994，FEBS Letters 344:191，以参考形式并于本文。允许与其融合的异源蛋白稳定三聚体化的经修饰的亮氨酸拉链的使用描述于Fanslow等，1994，Semin.Immunol.6:267-78。在一种方法中，在适当的宿主细胞中表达包含与亮氨酸拉链肽融合的抗内皮素受体抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，从培养物上清中收集可溶寡聚抗内皮素受体抗体片段或其衍生物。
在另一个实施方案中，该抗体衍生物可包含至少本文公开的CDRs之一。举例而言，可将一个或多个CDR整合入已知的抗体骨架区(IgG1，IgG2等)或与适当的载体结合以增强其半衰期。适当载体包括但不限于Fc、白蛋白、转铁蛋及类似物质。这些和其它适当的载体为本领域已知。该结合CDR肽可为单体、二聚体、四聚体或其它形式。在一个实施方案中，一个或多个水溶性多聚体在结合剂的一个或多个特异位点结合，例如在氨基端。在一个实例中，抗体衍生物包含一个或多个水溶性多聚体附着物包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇。参见，例如，美国专利号US4,640,835、US4,496,689、US4,301,144、US4,670,417、US4,791,192和US4,179,337，在一些实施方案中，衍生物包含一个或多个一甲氧基.聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其它基于碳水化合物的聚合物，聚(N-乙烯基吡咯酮)。聚乙二醇、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇，以及该类聚合物的混合物。在一些实施方案中，一个或多个水溶性聚合物与一个或多个侧链随机结合。在一些实施方案中。PEG可提高结合剂例如抗体的治疗作用。一些该类方法描述于例如美国专利号US6,133,426，其以参考形式以任何目的并于本文。
应当理解的是本文所述的抗体可具有至少一个氨基酸替换，只要该抗体保留了结合特异性。因此，抗体结构的修饰包含于本文范畴。这些可包括不破坏抗体内皮素受体结合能力的氨基酸替换，其可为保守或非保守的。保守氨基酸替换可包括非天然氨基酸残基，其通常经化学肽合成整合而不是生物***合成。这些包括拟肽和其它反向或倒转形式的氨基酸部分。保守氨基酸替换也可涉及用非天然残基替换天然氨基酸残基这样对该位点氨基酸残基的极性或电荷作用很小或没有作用。非保守替换可涉及一类氨基酸或氨基酸类似物的一个成员与具有不同物理性质(例如，体积、极性、疏水性、电荷)的另一类氨基酸的成员交换。
而且，本领域技术人员可生成在各期望氨基酸残基上包含氨基酸替换的待测变异体。可使用本领域技术人员已知的活性测定法筛选该类变异体。该类变异体可用于收集关于适当变异体的信息。举例而言，如果发现某一氨基酸残基可引起活性破坏、非期望的降低或不当的活性，可避免具有该类变 化的变异体。换言之，基于从这些常规试验收集的信息，本领域技术人员可轻松确定应避免进一步替换(单独或与其它突变组合)的氨基酸。
技术人员可使用已知技术确定如本文所列的多肽的适当变异体。在一些实施方案中，本领域技术人员可通过靶向对于活性不重要的区域鉴定经改变后不会破坏活性的分子适当区域。在一些实施方案中，可鉴定在相似多肽中保守的残基或分子部分。在一些实施方案中，甚至可保守替换对于生物活性或结构重要的区域而不破坏生物活性或不会有不利作用于多肽结构。此外，本领域技术人员可考察结构.功能研究鉴定对活性或结构重要的相似多肽中的残基。鉴于这一对比，可预测对应于在相似蛋白中对活性或结构重要的氨基酸残基的蛋白质中氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可为这些经预测重要的氨基酸残基选择化学相似氨基酸替换。
本领域技术人员也可分析与相似多肽的结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于该类信息，本领域技术人员可预测就三维结构而言抗体的氨基酸残基比对。在一些实施方案中，本领域技术人员可选择不对经预测在蛋白质表面的氨基酸残基进行显著改变，因为该类残基可能参与与其它分子的重要相互作用。许多科学出版物致力于二级结构的预测。参见，Moult，1996，Curr.Op.Biotech.7:422-427，Chou等，1974，Biochemistry 13:222-245；Chou等，1974，Biochemistry 113:211-222；Chou等，1978，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47:45-148；Chou等，1979，Ann.Rev.Biochem.47:251-276和Chou等，Biophys.J.26:367-384。此外，目前可使用计算机程序辅助预测二级结构。举例而言，序列同一性大于30％或相似性大于40％的两个多肽或蛋白质通常具有相似的高级结构。近期蛋白结构数据库(PDB)的增长增强了二级结构的可预测性，包括多肽或蛋白结构中潜在的折叠数量。参见，Holm等，1999，Nucl.Acid.Res.27:244-247。已表明(Brenner等，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7:369-376)在给定多肽或蛋白质中存在有限数量的折叠并且一旦确定了临界数量的结构，结构预测将变得显著更加精确。预测二级结构的其它方法包括“穿接(threading)”(Jones，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.,7:377-87；Sippl等，1996，Structure 4:15-19；“图谱分析(profile analysis)”(Bowie等，1991，Science 253:164-170；Gribskov等，1990，Meth.Enzym.183:146-159；Gribskov等，1987，PNAS USA 84:4355-4358和“进化联系(evolutionary linkage)”(参见Holm，supra(1999)，and Brenner，supra(1997))。在一些实施方案中，抗体变异体包括糖基化变异体，其中与母体多肽的氨基酸序列相比改变了糖基化位点的数量和/或类型。在一些实施方案中，变异体与天然蛋白质相比具有更多或更少数量的N连接糖基化位点。或者，去除该序列的替换可移除现有的N连接糖链。也提供了N连接 糖链的重排，其中去除了一个或多个N连接糖链位点(通常为天然存在的那些)并创造了一个或多个新的N连接位点。其它优选抗体变异体包括半胱氨酸变异体，与母体氨基酸序列相比其中缺失或由另一氨基酸(例如丝氨酸)替换一个或多个半胱氨酸残基。当抗体必须折叠成生物活性构象时(例如在分离可溶包涵体之后)可用半胱氨酸变异体。半胱氨酸变异体通常比天然蛋白质具有较少的半胱氨酸残基，并通常具有偶数个半胱氨酸以最小化未配对半胱氨酸引起的相互作用。
本领域技术人员可在需要该类替换时确定期望的氨基酸替换(保守或非保守)。在一些实施方案中，氨基酸替换可用于鉴定人内皮素受体抗体的重要残基或者增加或降低本文所述人内皮素受体抗体的亲和力。根据一些实施方案，优选的氨基酸替换为以下：(1)降低蛋白质水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力和/或(4)赋予或修饰该类多肽上的其它物理化学或功能性质。根据一些实施方案，可在天然存在序列中(在一些实施方案中，在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分)进行单个或多个氨基酸替换(在一些实施方案中为保守氨基酸替换)。在一些实施方案中，保守氨基酸替换通常不会本质上改变母体序列的结构特性(例如，替换氨基酸不应破解存在于母体序列中的螺旋或干扰特征化母体序列的其它类型二级结构)。本领域认可的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles，Creighton编辑，W.H.Freeman and Company(1984)；Introduction to Protein Structure，Branden and Tooze编辑，Garl and Publishing(1991)；以及Thornton等，1991，Nature 354:105，其以参考形式并于本文。
在一些实施方案中，本文所述的抗体可与多聚体、脂类或其它部分(moieties)化学键合。抗原结合试剂可包含至少一个本文描述的CDRs，其掺入生物相容性骨架结构中。在一个实例中，该生物相容性骨架结构包含足以形成构象稳定结构支持或骨架或支架的多肽或其部分，其可在局限的表面区域展示可与抗原结合的一个或多个氨基酸序列(例如，CDRs、可变区等)。该类结构可为天然存在多肽或多肽“折叠”(结构基序)，或相对与天然多肽或折叠可具有一个或多个修饰，例如氨基酸添加、缺失或替换。这些支架可来源于任何物种(或多于一个物种)的多肽，例如，人类、其它哺乳动物、其它脊椎动物、无脊椎动物、细菌或病毒。生物可溶性骨架结构通常是基于蛋白质支架或骨架而不是免疫球蛋白结构域。举例而言，可使用基于纤维结合素、锚蛋白、脂质运载蛋白(lipocalin)、新抑癌蛋白、细胞色素b、CP1锌指蛋白、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z结构域和淀粉酶抑肽结构域(参 见，例如，Nygren和Uhlen,1997，Current Opinionin Structural Biology 7:463-469)。
此外，本领域技术人员可认识到适当的结合剂包括这些抗体的部分，例如一个或多个重链CDR1、CDR2、CDR3，轻链CDR1、CDR2和CDR3，如本文所具体公开。至少一个重链CDR1、CDR2、CDR3、CDR1，CDR2和CDR3区具有至少一个氨基酸替换，只要该抗体保留了非替换CDR的结合特异性。该抗体的非CDR部分可为非蛋白分子，其中该结合剂交叉阻断本文公开的抗体与人ETA的结合和/或抑制经该受体的内皮素信号传导。该抗体的非CDR部分可为非蛋白质分子，其中该抗体在竞争结合测定法中显示出与至少抗体A-1/A-2之一所显示相似的与人ETA肽的结合类型，和/或中和内皮素的活性。抗体的非CDR部分可由氨基酸组成，其中该抗体为重组结合蛋白或合成肽，并且该重组结合蛋白交叉阻断本文公开的抗体与人ETA的结合和/或中和体内或体外内皮素活性。抗体的非CDR部分可由氨基酸组成，其中该抗体为重组抗体，并且该重组抗体在竞争结合测定法中显示出与至少抗体A-1/A-2之一所显示相似的与人ETA肽的结合类型，和/或中和内皮素信号传导。
核酸
一方面，本文提供分离的核酸分子。该核酸分子包含例如编码全部或部分抗体的多聚核苷酸，例如本文抗体的一条链或两条链，或其片段、衍生物、突变蛋白或变异体；足以用作杂交探针的多聚核苷酸；PCR引物或用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多聚核苷酸的测序引物；用于抑制多聚核苷酸表达的反义核酸以及其互补序列。该核酸可为任何长度。例如它们的长度可为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000或更多个核苷酸，和/或包含一个或多个附加序列，例如调控序列，和/或是较大核酸例如载体的一部分。该核酸可为单链或双链并包含RNA和/或DNA核苷酸以及其人工变异体(例如，肽核酸)。
可从经ETA抗原免疫的小鼠B细胞中分离编码抗体多肽(例如，重链或轻链、仅可变结构域或全长)的核酸。可通过常规方法例如聚合酶链式反应(PCR)分离该核酸。
编码重链和轻链可变区的核酸序列如上文所示。熟练的技术人员可理解由于遗传密码的简并性，本文公开的各多肽序列可由更多数量的其他核酸序列编码。本文提供编码本文所述的抗体的各简并核苷酸序列。
本文进一步提供在具体杂交条件下与其他核酸(例如，包含任何A-1/A-2的核苷酸序列的核酸)杂交的核酸。杂交核酸的方法为本领域熟知。参见， 例如，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Son(1989)，6.3.1-6.3.6。如本文定义，例如，中等严格条件使用包含5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)的预洗溶液、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)、约50％甲酰胺的杂交缓冲液、6xSSC和55℃的杂交温度(或其他相似的杂交溶液，例如包含绚50％甲酰胺的，以42℃杂交)，并且洗脱条件为60℃，使用0.5xSSC、0.1％SDS。严格杂交条件在6xSSC中于45℃杂交，然后于68℃在0.1xSSC、0.2％SDS中洗涤一次或多次。此外，本领域技术人员可操作杂交和/或洗涤条件以增加或降低杂交严格度这样包含相互之间至少65、70、75、80、85、90、95、98或99％同源的核苷酸序列的核酸通常仍可以相互杂交。影响杂交条件选择的基本参数和设计适当条件的指导列于例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，第9和11章；Current Protocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.，第2.10和6.3-6.4节)并可由具有本领域普通技术的人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成轻松确定。可通过突变在核酸中引入变化，藉此导致其编码的多肽(例如，抗原结合蛋白)氨基酸序列的变化。可使用本领域已知的任何技术引入突变。在一个实施方案中，使用例如定点诱变方案改变一个或多个具体氨基酸残基。在另一个实施方案中，使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。无论其如何生成，可表达突变多肽并筛选期望性质。
可将突变引入核酸而不显著改变其编码多肽的生物学活性。例如，可进行引起非必需氨基酸残基处氨基酸替换的核苷酸替换。在一个实施方案中，突变本文为L-1至L-2和H-1至H-2提供的核苷酸序列或其片段、变异体或衍生物这样其编码包含本文所示L-1至L-2和H-1至H-2的氨基酸残基的一个或多个缺失或替换，成为两个或多个序列相异的残基。在另一个实施方案中，诱变作用在本文所示L-1至L-2和H-1至H-2的一个或多个氨基酸残基附近***一个氨基酸成为两个或多个序列相异的残基。或者，可将一个或多个突变引入核酸以选择性改变其编码多肽的生物学活性(例如，与ETA结合)。例如，该突变可在数量上或性质上改变生物学活性。量变的实例包括增加、降低或消除该活性。质变的实例包括改变抗体的抗原特异性。
在另一方面，本文提供适于用做引物或检测本文核酸序列的杂交探针的核酸分子。本文的核酸分子可仅包含编码本文全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物或编码本文多肽活性部分的片段(例如，ETA结合部分)的片段。基于本文核酸序列的探针可用于检测该核酸或相似核酸，例如编码本文多肽的转录物。该探针可包含标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。该类探针可用于鉴定表达该多肽的细胞。
在另一方面本文提供包含编码本文多肽或其部分的核酸的载体。载体的实例包括但是不限于质粒、病毒载体、非游离基因哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。本文的重组表达载体可包含适于该核酸在宿主细胞中表达的形式的本文核酸。该重组表达载体包括一个或多个调控序列，基于用于表达的宿主细胞进行筛选，其与该预表达的核酸序列可操作性相连。调控序列包括引导核苷酸序列在多个种类宿主细胞中组成型表达的(例如，SV40早期基因增强剂、劳斯氏肉瘤病毒启动子和细胞巨化病毒启动子)，引导仅在某些宿主细胞中核苷酸序列的表达的(例如，组织特异调控序列，参见Voss等，1986，Trends Biochem.Sci.11:287，Maniatis等，1987，Science 236:1237，其完整内容以参考形式并于本文)以及引导核苷酸序列响应具体处理或条件的诱导型表达的(例如，哺乳动物细胞中的金属硫堇启动子和原核和真核***二者中的四环霉素反应(tet-sesponsive)启动子和/或链霉素反应启动子(同前))。本领域技术人员应理解表达载体的设计取决于例如用于转化的宿主细胞的选择、所需蛋白表达水平等因素。本文的表达载体可引入宿主细胞，藉此生产由本文所述核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。
另一方面，本文提供可引入本文表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。原核宿主细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。更高级的真核细胞包括昆虫细胞、酵母细胞以及哺乳动物源的确立细胞系。适当哺乳动物宿主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或它们的衍生物例如Veggie CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28:31)或CHO株DXB-11，其缺失DHFR(参见Urlaub等，1980，PNAS USA77:4216-20)。其它CHO细胞系包括CHO-K1(ATCC#CCL-61)、EM9(ATCC#CRL-1861)，和UV20(ATCC#CRL-1862)，其它宿主细胞包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC#CRL-1651)(参见Gluzman等，1981，Cell23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL-163)，AM-1/D细胞(描述于美国专利号US6,210,924)、HeLa细胞、BHK(ATCCCRL-10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCCCCL-70)(参见McMahan等，1991，EMBO J.10:2821)、人胚肾细胞例如293，293EBNA或MSR293、人上皮A431细胞、人C010205细胞、其它经转化灵长动物细胞系、正常二倍体细胞、来源于初生组织体外培养物的细胞株、初移植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。用于细菌、真菌、酵母和哺乳细胞宿主的适当克隆和表达载体描述于Pouwels等(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,1985)。
可通过传统转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。对于稳定的哺乳动物转染而言，取决于使用的表达载体和转染技术，已知只有一小部分细胞可将外源DNA鏊合入它们的基因组中。为了鉴定和筛选这些整合子，通常将编码筛选标记(例如抗生素抗性)的基因与所关注基因一起引入宿主细胞。优选的筛选标记包括可赋予药物(如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的那些。在其它方法中可通过药物筛选鉴别包含被引入核酸的稳定转染细胞(例如，整合了筛选基因的细胞可存活，而其它细胞则死亡)。
可在提高多肽表达的条件下培养已转化细胞，可通过常规蛋白纯化方法回收多肽。一种该纯化方法描述于下文实施例。预用于本文的多肽包括基本同源的重组哺乳动物抗内皮素受体抗体多肽，其基本不含污染性内源材料。
抗体的活性
在一个实施方案中，本文所述的抗体与内皮素受体特异性结合，抑制信号传导并显示出治疗性生物作用，例如降低动物模型的肺动脉高压。在另一个实施方案中，本文所述的抗体是能与人内皮素受体特异性结合的鼠源抗体或人源化抗体。该类抗体包括可减少或中和内皮素信号传导的拮抗或中和抗体。
在一个实施方案中，本文所述的抗体与人内皮素受体ETA结合时的K d大约为0.01nM至1000nM、0.1nM至500nM、0.5nM至200nM、1nM至200nM、或10nM至100nM。在另一个实施方案中，本文所述的抗体与人内皮素受体ETA结合时的K d大约为1nM至200nM。在另一个实施方案中，本文所述的抗体与人内皮素受体ETA结合时的K d大约为10nM至100nM。在另一个实施方案中，本文所述的抗体与人内皮素受体ETA结合时的K d大约为1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、或100nM。
在一个实施方案中，本文所述的抗体在降低人内皮素信号传导的IC 50值大约为0.01nM至500nM、0.1nM至200nM、0.5nM至200nM、1nM至200nM、或10nM至100nM。在另一个实施方案中，本文所述的抗体在降低人内皮素信号传导的IC 50值大约为1nM至200nM。在另一个实施方案中，本文所述的抗体在降低人内皮素信号传导的IC 50值大约为10nM至100nM。在另一个实施方案中，本文所述的抗体在降低人内皮素信号传导的IC 50值大约为1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、或100nM。
在一个实施方式中，本文所述的ETA抗体具有一个或多个以下所列的性质：
a.当与人内皮素受体ETA结合时，其K d与所述参比抗体相同或更优；
b.当抑制人内皮素受体ETA的内皮素激活时，其IC 50与所述参比抗体相同或更优；和
c.该ETA抗体在人内皮素受体ETA上与所述参比抗体交叉竞争结合。
在另一个实施方式中，本文所述的ETA抗体是一抗体具有一个或多个以下所列的性质：
a.当与人内皮素受体ETA结合时，其K d与一参比ETA抗体相同或更优；
b.当抑制人内皮素受体ETA的内皮素激活时，其IC 50与一参比ETA抗体相同或更优；和
c.该ETA抗体在人内皮素受体ETA上，与一参比ETA抗体交叉竞争结合。
在一方面,所述参比抗体包含轻链可变结构域氨基酸序列SEQ ID NO:138和重链可变结构域氨基酸序列SEQ ID NO:166的组合。在另一方面,所述参比抗体为单克隆抗体A-1、A-2、A-7、A-9、或A-12。在本文中，术语“基本相似”意为与参比抗体的IC 50或K d可比或大约是参比抗体的IC 50或K d值的200％、180％、160％、150％、140％、120％、110％、100％、99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、或50％。在一个实施方案中，参比抗体包括，例如，具有重链和轻链组合L1H1或L2H2的抗体。在另一个实施方案中，参比抗体包括ETA抗体A-1。在一个实施方案中，本文所述的ETA抗体可与人内皮素受体特异性结合，并能降低动物模型的肺动脉高压。在一个实施方案中，与未处理动物相比肺动脉高压降低2％。在另一个实施方案中，与未处理动物相比肺动脉高压降低约5％。在另一个实施方案中，与未处理动物相比肺动脉高压降低约10％。在另一个实施方案中，与未处理动物相比肺动脉高压降低约15％。在另一个实施方案中，与未处理动物相比肺动脉高压降低约20％，在另一个实施方案中，与未处理动物相比肺动脉高压降低约25％。肺动脉高压降低量由剂量控制，对于动物或人类患者而言，治疗有效剂量是为将肺动脉高压降低至正常范围的剂量。
BNP
在一个实施方案中，本文所述的BNP是一可以激活NPRA的功能的肽。在另一个实施方案中，本文所述的BNP在激活NPRA的功能上比自然的BNP(SEQ ID NO:205)要弱上十到一千倍。
在一个实施方案中，本文所述的BNP包含各独立地选自于以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、 SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、及SEQ ID NO:216。
在一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:205。在另一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:206。在另一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:207。在另一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:208。在另一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:209。在另一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:210。在另一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:211。在另一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:212。在另一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:213。在另一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:214。在另一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:215。在另一个实施方案中，本文所述的BNP的氨基酸序列为：SEQ ID NO:216。
肽接头(Linker)
在一个实施方案中，本文所述的肽接头(Linker)包含各独立地选自于以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、及SEQ ID NO:219。
在一个实施方案中，本文所述的肽接头的氨基酸序列为：SEQ ID NO:217。在另一个实施方案中，本文所述的肽接头的氨基酸序列为：SEQ ID NO:218。在另一个实施方案中，本文所述的肽接头的氨基酸序列为：SEQ ID NO:219。
ETA抗体与BNP的融合蛋白质
在一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个本文所述的ETA抗体和一或多个BNP。
在一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个本文所述的ETA抗体和一、两、三、四、五、六，七，或八个BNP。在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个本文所述的ETA抗体和一个BNP。另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个本文所述的ETA抗体和两个BNP。另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个本文所述的ETA抗体和三个BNP。另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个本文所述的ETA抗体和四个BNP。另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合 蛋白质包含一个本文所述的ETA抗体和五个BNP。另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个本文所述的ETA抗体和六个BNP。另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个本文所述的ETA抗体和七个BNP。另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个本文所述的ETA抗体和八个BNP。
在一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个，或八个BNP；该融合蛋白质将一BNP的氨基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质将一BNP的羧基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接。
在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个，或四个BNP；该融合蛋白质将一BNP的氨基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质将一BNP的羧基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接。
在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个或二个BNP；该融合蛋白质将一BNP的氨基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质将一BNP的羧基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接。
在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和二个BNP；该融合蛋白质将一BNP的氨基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质将一BNP的羧基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接。
在一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质将一BNP的氨基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接。在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质将一BNP的氨基端与本文所述的ETA抗体的轻链的羧基端连接。在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质将一BNP的氨基端与本文所述的ETA抗体的重链的羧基端连接。
在一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含氨基酸序列：SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:190，以及SEQ ID NO:209或SEQ ID NO:210。在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含氨基酸序列：SEQ ID NO:162，SEQ ID NO:190， 及SEQ ID NO:209。在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含氨基酸序列：SEQ ID NO:162，SEQ ID NO:190，及SEQ ID NO:210。
在一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个，或八个BNP已及同样数量的肽接头(Linker)；该融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的氨基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的羧基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接。
在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个，或四个BNP已及同样数量的肽接头(Linker)；该融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的氨基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的羧基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接。
在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个或二个BNP已及经同样数量的肽接头(Linker)；该融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的氨基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的羧基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接。
在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和二个BNP及二个肽接头(Linker)；该融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的氨基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的羧基端与本文所述的ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接。
在一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的氨基端与所述ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接。在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的氨基端与所述ETA抗体的轻链的羧基端连接。在另一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的氨基端与所述ETA抗体的重链的羧基端连接。
在一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质包含氨基酸序列：SEQ ID NO:162，SEQ ID NO:190，SEQ ID NO:205，和SEQ ID NO:218。
在一个实施方案中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质,其中所述的ETA抗体、BNP和肽接头序列通过以下所述中一方式融合形成所述的融合蛋白质：
(3)通过一个肽接头序列将一BNP的氨基端和所述ETA抗体的重链/轻链的羧基端连接：N'-R-Linker-BNP-C'；及
(4)通过一肽接头序列将一BNP的羧基端与所述ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接：N'-BNP-Linker-R-C'；
其中:N'代表多肽链的氨基端,C'代表多肽链的羧基端,BNP代表一BNP，R为所述的ETA抗体的轻链或者重链的氨基酸序列,及Linker代表一肽接头。
在一个实施方式中，本文所提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质含有两个相同的轻链，其氨基酸序列为SEQ ID NO:222；及两个相同的重链，其氨基酸序列为以下所列的序列之一：SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、及SEQ ID NO:235，其中一BNP的氨基端与一ETA抗体重链(SEQ ID NO:235)的羧基端连接或者通过一肽接头序列与一ETA抗体重链的羧基端连接。
ETA抗体与BNP的融合蛋白质的生物学活性
ETA抗体与BNP的融合蛋白质的生物学活性包含BNP的生物学活性和ETA抗体活性。ETA的抗体抑制剂能够有效地阻断由内皮素引起的血管压力增加来达到缓解肺动脉高压的症状，改善病人的运动能力和血液动力学。“BNP生物学活性”指ETA抗体与BNP的融合蛋白质在体内结合并激活NPRA受体并引起细胞应激反应，并显示出治疗作用的生物学活性，例如肺动脉高压、肺高压和心力衰竭的其它相关症状。前述细胞应激反应包括但是不限于降低肺动脉压、降低主动脉压，以及相关的心脏和肺血管重构变化。综合了BNP和ETA抗体的生物学活性，本文所述的BNP融合蛋白质可以用于治疗多种与NPRA和ETA相关联的疾病和病症。该融合蛋白质通过作用于NPRA和/或ETA发挥其生物学作用，因此可以用本文所述的BNP融合蛋白质治疗对“增加NPRA刺激”或对“降低ETA刺激”做出有利应答的疾病和病症的受试者。这些受试者称为“需要NPRA刺激治疗” 或“需要降低ETA刺激”的受试者。包括肺动脉高压、肺高压和心脏和肺血管重构的其它相关症状。
在一个实施方案中，ETA抗体或BNP融合蛋白质的生物学活性变化是用钙流实验和直接cGMP检测方法来检测的，量化ETA抗体或BNP融合蛋白质在体外抑制ETA和激活NPRA的功能。
药物组合物
在一个实施方案中，本文提供了一药物组合物，其包括本文提供的一个ETA抗体与BNP的融合蛋白质，与一种或多种可药用载体。
在一个实施方案中，本文所述的药用组合物是用于静脉或皮下注射。
本文所使用的术语“载体”包括载体、药用辅料或者在使用的剂量和浓度下将细胞或哺乳动物暴露于其中无害的稳定剂。
治疗方法
在一个实施方案中，本文提供了本文所述的ETA抗体与BNP的融合蛋白质在制备用于治疗、预防或改善肺动脉高压以及肺动脉高压相关病症的药物中的用途。
在另一个实施方案中，本文提供了本文所述的ETA抗体与BNP的融合蛋白质在制备用于治疗、预防或改善肺高压以及肺高压相关病症的药物中的用途。
在另一个实施方案中，本文提供了本文所述的ETA抗体与BNP的融合蛋白质在制备用于治疗、预防或改善心力衰竭以及心力衰竭相关病症的药物中的用途。
在进一步的实施方案中，本文提供了本文所述的ETA抗体与BNP的融合蛋白质在制备用于同时治疗、预防或改善肺动脉高压、肺高压或者心力衰竭二种及二种以上病症的药物中的用途。
本文中，术语“受试者”指哺乳动物，包括人类，可与术语“患者”交替使用。
术语“治疗”包括减轻至少一种症状或病症的其它方面，或者减轻疾病严重性。本文提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质不需要产生完全治愈的效果，或根除疾病的所有症状或表现，即可构成有效治疗剂。如相关领域所公认，作为治疗剂的药物可减少给定疾病状态的严重程度，但不需消除疾病的所有表现即可被认为是有效的治疗剂。相似地，预防给药治疗不需在预防症状出现上完全有效即可构成有效预防剂。只减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重度，或通过提高另一治疗效果，或通过产生另一有效作用)，或者减少受试者中疾病发生或加重的可能性就已经足够。本文 的一个实施方案涉及包含以足以诱导反应具体病症严重性的指示剂高于基线水平的持续改善的量和时间给予患者ETA抗体与BNP融合蛋白质的方法。
ETA抗体与BNP的融合蛋白质药物组合物可采用任意适当技术包括但不限于肠道外、局部或吸入给药。如果是注射，可通过例如关节内、静脉内、肌肉内、损伤区内、腹膜内或皮下途径，以快速注射或连续输注给予药用组合物。可考虑例如在疾病或损伤部位局部给药，如透皮给药和埋植剂持续释放给药。吸入给药包括例如鼻腔或口腔吸入、采用喷雾剂、以气雾剂形式吸入抗体等等。其它选择包括口腔制剂包括片剂、糖浆剂或锭剂。
以包含一个或更多其它组分例如生理学可接受载体、辅料或稀释剂的组合物形式给予本文提供的ETA抗体与BNP的融合蛋白质是有利的。组合物可任选额外包含一个或更多如下所述的生理学活性剂。在多个具体实施方案中，组合物包含除一个或更多本文提供的抗体(例如鼠源抗体或人源化抗体)与BNP融合蛋白质之外的一个、两个、三个、四个、五个或六个生理学活性剂。
在一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的鼠源抗体或人源化抗体与BNP的融合蛋白质以及一个或更多选自以下的物质：pH适合于抗体与BNP的融合蛋白质的缓冲液、抗氧化剂例如抗坏血酸、低分子量多肽(例如含少于10个氨基酸的多肽)、蛋白质、氨基酸、糖例如糊精、络合物例如EDTA、谷胱甘肽、稳定剂和辅料。根据适当工业标准，也可加入防腐剂。可使用适当辅料溶液作为稀释剂将组合物配制成冻干粉末。适当组分在所用剂量和浓度下对受者无毒。可用于药物处方组分的进一步实例见Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)和20版(2000)，Mack Publishing Company提供医学从业者使用的试剂盒，其包括一种或更多本文提供的抗体与BNP的融合蛋白质以及治疗本文讨论任何病症的标签或其它说明。在一个实施方案中，试剂盒包括以上述组合物形式装在一个或多个管型瓶中的一种或多种抗体与BNP的融合蛋白质的无菌制剂。
给药剂量和频率可根据以下因素而改变：给药途径、所用具体抗体与BNP的融合蛋白质、所治疾病的性质和严重度、症状为急性还是慢性以及患者的体积和总体症状。可通过本领域熟知的方法确定适当剂量，例如在临床试验中包括剂量放大研究。
本文提供的抗体与BNP的融合蛋白质可在例如一段时间内按规律间隔给药一次或多次。在具体实施方案中，在至少一个月或更长时间给药一次给予鼠源抗体或人源化抗体与BNP的融合蛋白质，例如一个、两个或三个月或者甚至不确定。对于治疗慢性症状，长期治疗通常最有效。但是，对于治 疗急性症状，短期给药例如从一周至六周就已足够。通常，给予人类抗体直至患者表现出所选体征或指示剂高于基线水平的医学相关改善度为止。
本文提供的治疗方案的一个实例包括以适当剂量一周一次或者更长的皮下注射抗体与BNP的融合蛋白质治疗肺动脉高压、肺高压和心力衰竭的症状。可持续每周或每月给予抗体与BNP的融合蛋白质直到达到所需结果例如病人症状消退。可按需要重新治疗，或者，可选择地，给予维持剂量。
可在使用抗体与BNP的融合蛋白质治疗之前、进行中和/或之后监测病人肺动脉压，以检测其压力的任何变化。对于某些病症，肺动脉压的变化可随例如疾病进程等因素而变化。可用已知技术测定肺动脉压。
本文提供的方法和组合物的具体实施方案涉及使用例如抗体与BNP的融合蛋白质和一个或多个内皮素拮抗剂、两个或更多本文提供的抗体与BNP的融合蛋白质，或者本文提供的抗体与BNP的融合蛋白质和一个或更多其它内皮素拮抗剂。在进一步的实施方案中，单独或与其它用于治疗使患者痛苦的症状的药剂组合给予本文提供的抗体与BNP的融合蛋白质。这些药剂的实例包括蛋白质以及非蛋白质药物。当联合给予多种药物时，如本领域所熟知其剂量应相应调整。“联合给药”组合疗法不限于同时给药，也包括在涉及给予患者至少一种其它治疗剂的疗程中至少给予一次抗原和蛋白的治疗方案。
另一方面，本文提供制备治疗肺动脉高压、肺高压和心力衰竭症状的方法，其包含本文提供的抗体与BNP的融合蛋白质与药学可接受辅料中的混合物，用于治疗上述疾病的相关病症。药剂制备方法如上所述。
本文进一步提供可特异性结合与人ETA的抗体与BNP的融合蛋白质相关的组合物、试剂盒和方法。也提供了核酸分子及其衍生物和片段，其包含编码与ETA结合的多肽与BNP的融合蛋白质的全部或部分的多聚核苷酸，例如编码全部或部分抗ETA抗体、抗体片段、抗体衍生物与BNP的融合蛋白质的核酸。本文进一步提供包含该类核酸的载体和质粒以及包含该类核酸和/或载体和质粒的细胞和细胞系。所提供方法包括，例如，制备、鉴定或分离与人ETA结合的抗体与BNP的融合蛋白质例如抗ETA抗体与BNP的融合蛋白质的方法，测定该抗体与BNP的融合蛋白质是否与ETA结合的方法、以及将与ETA结合的抗体与BNP的融合蛋白质给予动物模型的方法。
下面通过具体实例，对本文的技术方案作进一步的说明。
本文中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
1.抗体基因的克隆及亚克隆
收集分泌抗体的杂交瘤细胞，按照QIAGEN的mRNA抽提试剂盒操作规程，提取杂交瘤细胞的mRNA。然后将提取后的mRNA反转录成cDNA，逆转录引物为小鼠轻、重链恒定区的特异性引物，重链逆转录引物为(5’-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3’)(SEQ ID NO:199)，轻链逆转录引物为(5’-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’)(SEQ ID NO:200)和(5’-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’)(SEQ ID NO:201)。RT-PCR的反应条件为：25℃ 5min(minutes)；50℃ 60min；70℃ 15min。将反转录的cDNA用0.1mM的TE稀释至500μL，加入到超滤离心管(Amicon Ultra-0.5)中，2000g离心10min；弃滤液，再加500μL的0.1mM的TE，2000g离心10min；弃滤液，将制备管倒置到新的离心管中，2000g离心10min，得到纯化后的cDNA；取10μL的纯化后的cDNA作为模板，加入4μL的5xtailing buffer(Promega，市售)，4μL的dATP(1mM)和10U的末端转移酶(Promega，市售)后混匀，37℃孵育5min后65℃ 5min；然后以加上PolyA尾的cDNA为模板，PCR扩增抗体的轻、重链可变区基因。上游引物均为OligodT，重链下游引物为(5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’)(SEQ ID NO:202)和(5’-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’)(SEQ ID NO:203)，轻链下游引物为(5’-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3’)(SEQ ID NO:204)。PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s(seconds)，56℃ 30s，72℃ 1min 40 cycles；72℃ 7min；PCR产物连接到PMD 18-T载体(Takara Bio，市售)后进行测序。克隆的抗体的CDR序列见表一和表二。
基于已测序得到的抗体的DNA序列设计PCR引物，从而将完整轻链、重链信号肽和可变域以及小鼠IgG1恒定区与表达载体pTM5相连。
2.抗体融合蛋白基因表达质粒的制备
人BNP(hBNP)基因序列与抗ETA抗体通过overlapping PCR的方法，将hBNP基因融合于重链抗体C端。通过PCR引物将融合蛋白重链可变区5’端带入Nhe1酶切位点，融合蛋白3’端带入Not1酶切位点，从而将完整的重链与hBNP融合蛋白基因装入表达载体pTM5；同样，将轻链可变区5’端带入Nhe1酶切位点，3’端带入Bsiw1酶切位点，从而将完整的轻链可变区序列与已装入轻链恒定区的表达载体pTM5相连。
3.抗体融合蛋白的瞬时表达
接种5×10 5/mL的悬浮HEK293或者CHO表达细胞系至转瓶中，经过24h(hours)37℃，5％CO 2旋转培养后，密度达到1×10 6/mL后被用于转染。转染过程中使用polyethylenimine(PEI)作为转染介质，将其与的DNA(DNA用量为每1×10 6个细胞0.5μg，其中抗体轻链和重链的比重为3:2) 混合，PEI和DNA的质量混合优选配比为3:1。两者混合物在静置孵育15分钟后被加入到细胞培养中。细胞在接受PEI与DNA混合物后继续37℃，5％CO 2旋转培养24h后，向细胞培养液中加入0.5％的胰蛋白胨作为表达需要的添加物，最后在表达完成后(96h以上)收集细胞上清用于抗体的纯化分离。
4.抗体融合蛋白的纯化分离
收集的细胞上清经过高速(8000rpm，15min)离心去除细胞以及细胞碎片后，再用0.45μm滤膜过滤澄清，澄清后的上清被用于纯化。纯化过程由层析仪完成。上清首先流过蛋白G亲和层析柱，上清中包含的抗体在此期间与蛋白G亲和层析柱的配基相结合后被滞留于柱内，然后低pH值(小于等于3.0)的洗脱缓冲液灌洗层析柱解离与层析柱结合的抗体，收集到的抗体洗脱液的低pH值用1M的Tris-HCl迅速中和以保护抗体不变性失活。得到的抗体融合蛋白洗脱液经过16h的透析后置换成PBS缓冲体系。
5.钙流实验检测抗ETA抗体与BNP的融合蛋白在体外阻断ETA的生物学活性
以每孔25000个接种共表达hETA-Aequorin的CHO-DHFR细胞至黑色96孔细胞培养板，37℃培养过夜。第二天除去细胞上清，加入50μL底物coelenterazine h(Promega，市售)避光孵育2h，再加入50μl杂交瘤细胞上清或纯化后的抗体继续孵育30分钟。在Molecular Devices的SpectraMax L酶标仪上采用自动进样器灌注endothelin 1，在40s内检测瞬间钙流变化，记录出峰时间和峰值。如图一所示，不同构建的ETA抗体与BNP的融合蛋白显示出不同的抑制细胞内人ETA介导的Ca 2+变化的结果。
6.cGMP实验检测ETA抗体与BNP的融合蛋白在体外激活NPRA的生物学活性
以每孔5.5×10 4接种表达人/鼠NPRA的HEK 293细胞至96孔细胞培养板，置于37℃，5％CO 2培养箱中过夜。第二天除去细胞上清，加入梯度稀释的ETA抗体与BNP融合蛋白或突变体90μL/孔，置于37℃，5％CO 2培养箱中孵育30min，再加10μL/孔的10％Triton X-100，室温裂解，用排枪混合均匀。采用cGMP试剂盒(CisBio)检测实验中产生的cGMP。取上述10μL/孔细胞裂解液于白色384孔板中，加入5μL/孔1:20稀释的cGMP-d2，最后加5μL/孔1:20稀释的Anti-cGMP-Eu3-cryptate，室温孵育1h。在Envision 2103酶标仪上读取时间分辨荧光665nm/620nm信号比值，然后采用Prism5.0计算EC 50值。表三显示了直接cGMP实验检测ETA抗体与BNP的融合蛋白激活人/鼠NPRA信号通路的EC 50，其中h15F3代表一人源化ETA抗体包含SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:190；其中BNP(如 BNP，BNP(1-28)，BNP(1-29NSF)，BNP(3-28)，BNP(3-29NSF)，BNP(3-32)，BNP(7-29)，BNP(7-32)，BNP(9-29)，及BNP(9-32))的氨基端直接或通过一肽接头(Linker)(如G 4S及(G 4S) 2)与h15F3抗体重链的羧基端相连。
表三.cGMP实验检测ETA抗体与BNP的融合蛋白的生物学活性
Figure PCTCN2020095062-appb-000007
Figure PCTCN2020095062-appb-000008
7.单次尾静脉给药对正常C57小鼠降主动脉压的体内活性
动物根据体重随机进行分组，用鼠网将小鼠固定在鼠袋中，然后放于保温筒内，将加压传感器置于尾根处，传感器标志的尖端与尾巴尖端的方向保持一致，鼠尾***传感器后，通过Softron智能无创血压计鼠仪(BP-2010)检测小鼠血压。连续记录5次，取平均值，作为基础值；按照动物体重尾静脉注射生理盐水或者药物，注射后15分钟开始测量血压，连续记录5次取平均值。通过Softron智能无创血压计鼠仪检测h15F3-BNP(3-29)、h15F3-(G 4S) 2-BNP和h15F3-BNP(9-32)在静脉注射给药前后对正常C57BL/6小鼠的动脉压的影响。h15F3-(G 4S) 2-BNP、h15F3-BNP(3-29)和h15F3-BNP(9-32)这3个受试物均按照10mg/kg的剂量给药。如图二所示，结果显示h15F3-(G 4S) 2-BNP和h15F3-BNP(9-32)组在给药后15min能降低小鼠的血压。
8.连续多次尾静脉给药对野百合碱诱发SD大鼠肺动脉高压的体内活性
动物按照体重进行随机分组，造模大鼠颈背部皮下按照50mg/kg的剂量一次性注射MCT溶液，正常对照组大鼠注射等体积的生理盐水，造模后一天根据体重以10mg/kg的剂量给药开始尾静脉给药。给药结束后，大鼠用25％乌拉坦(4mL/kg)腹腔注射麻醉，固定于操作台，用预先连接生理记录仪的脐血管导管***颈外静脉，经上腔静脉、右心房，进入右心室。动物放置3～5min，待血压稳定后，记录心率、右心室收缩压和舒张压。如图三所示，正常组、模型组、h15F3-(G 4S) 2-BNP低、高剂量组，各组的右心室收缩压分别为38.46±2.56、55.20±8.59、47.95±2.52和45.79±7.36mmHg，与模型组相比，统计学P值分别为0.000、0.038、和0.034，给药组相对模型组的右心室收缩压抑制率分别为43.27％和56.19％。
9.单次静脉注射给药对健康恒河猴血压的体内活性
此次实验委托普莱美生物科技有限公司开展，研究分别按2mg/kg的剂量单次静脉注射给予h15F3-(G 4S) 2-BNP、h15F3-BNP(3-29)和h15F3-BNP(9-32)对健康恒河猴血压的影响。猴子按体重进行随机分组，麻醉前禁食14-16h，使用10mg/kg盐酸***肌肉注射麻醉动物，观察动物手臂的大小选取正确袖带，将袖带绑于动物左上臂，进行血压检测。共检测4次，分别为给药前2次，在给药前48-72h进行，麻醉后10min和麻醉后1h测定；给药后10min和给药后1h测定；给药前后血压测量尽量保证在当天同一时间 段进行。其中，麻醉后开始每隔1min进行1次血压测量，当有3次结果(不需要连续)的SBP/DBP/MBP差距均小于10mmHg时，检测结束。考察动物给药后血压的抑制情况(△P＝给药后平均血压－给药前平均血压)。如图四和图五所示，实验结果显示，h15F3-(G 4S) 2-BNP和h15F3-BNP(9-32)组在给药后10min均能降低猴子的血压，且h15F3-(G 4S) 2-BNP在给药后60min还能降压。
10.ETA抗体与BNP的融合蛋白在健康食蟹猴上的药代动力学实验
给予雌雄各半共6只食蟹猴皮下单次人ETA抗体与BNP的融合蛋白注射，剂量为2mg/kg，并在给药前0h，给药后立即(2min之内)，给药后0.5h、2h、8h、24h、2d(days)、3d、4d、7d各1次进行给药侧肢静脉取全血0.6mL置于离心管中在冰上待其自然凝固后离心提取血清，超低温保存(-80℃)至检测为止。血清样品中的人ETA抗体与BNP的融合蛋白的BNP部分是用ELISA方法对其进行定量，并通过软件分析确定其在食蟹猴体内的半衰期。
PK研究显示，上述二个BNP的融合蛋白质的BNP部分半衰期T 1/2分别为44.0和29.5小时左右。各组猴子的PK曲线及参数见图六和图七和表四。
表四：ETA抗体与BNP融合蛋白质的药代动力学结果
Figure PCTCN2020095062-appb-000009
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (56)

  1. 一种ETA抗体与BNP的融合蛋白质，其结构特征在于：所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体和一或多个BNP。
  2. 权利要求1所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一、两、三、四、五、或六个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自以下所列的氨基酸序列：
    a.轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、及SEQ ID NO:30；
    b.轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、及SEQ ID NO:48；
    c.轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68，及SEQ ID NO:220；
    d.重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、及SEQ ID NO:90；
    e.重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、及SEQ ID NO:114；及
    f.重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、及SEQ ID NO:136。
  3. 权利要求1或2所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自以下所列的氨基酸序列：
    a.轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID  NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、及SEQ ID NO:30；及
    b.重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、及SEQ ID NO:90。
  4. 权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列：
    a.轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、及SEQ ID NO:48；及
    b.重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、及SEQ ID NO:114。
  5. 权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列：
    a.轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68，及SEQ ID NO:220；及
    b.重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、及SEQ ID NO:136。
  6. 权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68，及SEQ ID NO:220。
  7. 权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨 基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、及SEQ ID NO:136。
  8. 权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一个独立地选自于以下所列的轻链与重链CDR3氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:50与SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:50与SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:62与SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:62与SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:64与SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:134、及SEQ ID NO:68与SEQ ID NO:136。
  9. 权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含
    (a)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:8；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:32；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:220；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:70；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:92；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:116；
    (b)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:10；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:34；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:52；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:72；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:94；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:118；
    (c)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:12；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:36；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:54；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:74；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:96；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:120；
    (d)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:14；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:38；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:56；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:76；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:98；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:122；
    (e)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:16；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:40；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:58；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:78；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:100；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:124；
    (f)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:18；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:42；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:60；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:80；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:102；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:126；
    (g)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:20或22；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:44；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:62；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:82；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:104或106；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:128；
    (h)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:24；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:44；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:62；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:84；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:108；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:130；
    (i)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:26；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:46；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:64；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:86；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:110；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:132；
    (j)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:28；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:46；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:66；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:88；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:112；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:134；或
    (k)轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:30；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:48；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:68；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:90；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:114；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:136。
  10. 权利要求9所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含
    轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:28；
    轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:46；
    轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:66；
    重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:88；
    重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:112；及
    重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:134。
  11. 权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列：
    a.轻链可变结构域氨基酸序列：SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、及SEQ ID NO:164；及
    b.重链可变结构域氨基酸序列：SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、及SEQ ID NO:192。
  12. 权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体的多聚核苷酸编码序列包含一或两个多聚核苷酸序列，其中每个多聚核苷酸列独立地选自于以下所列多聚核苷酸序列：
    a.轻链可变结构域多聚核苷酸编码序列：SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ  ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、及SEQ ID NO:163；
    b.重链可变结构域多聚核苷酸编码序列：SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、及SEQ ID NO:191。
  13. 权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一个独立地选自于以下所列的氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:150和SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:156和SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:190、及SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:192。
  14. 权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一个独立地选自于以下所列的氨基酸序列：SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、及SEQ ID NO:164。
  15. 权利要求1至14中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一个独立地选自于以下所列的氨基酸序列：SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、及SEQ ID NO:192。
  16. 权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一个独立地选自于以下所列的轻链与重链可变区氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:138与SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:150与SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:152与SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:154与SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:156与SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:158与SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:160与SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:162与SEQ ID NO:190、及SEQ ID NO:164与SEQ ID NO:192。
  17. 权利要求16所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:166。
  18. 权利要求16所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含的SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:166氨基酸序列的组合。
  19. 权利要求16所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:162或SEQ ID NO:190。
  20. 权利要求16所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含的SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:190氨基酸序列的组合。
  21. 权利要求1至20中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含一或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列：
    a.轻链恒定氨基酸序列：SEQ ID NO:194及SEQ ID NO:196；
    b.重链恒定氨基酸序列：SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:221。
  22. 权利要求1所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体具有一个或多个以下所列的性质：
    a.当与人内皮素受体ETA结合时，其K d与一参比ETA抗体相同或更优；
    b.当抑制人内皮素受体ETA的内皮素激活时，其IC 50与一参比ETA抗体相同或更优；和
    c.该ETA抗体在人内皮素受体ETA上与一参比ETA抗体交叉竞争结合。
  23. 权利要求22所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体在人内皮素受体ETA上与所述的参比ETA抗体交叉竞争结合。
  24. 权利要求22或23所述的融合蛋白质，其中所述的参比ETA抗体包含权利要求1至21中任一项所述的抗体。
  25. 权利要求24所述的融合蛋白质，其中所述的参比ETA抗体包含轻链可变结构域氨基酸序列SEQ ID NO:138和重链可变结构域氨基酸序列SEQ ID NO:166的组合或轻链可变结构域氨基酸序列SEQ ID NO:162和重链可变结构域氨基酸序列SEQ ID NO:190的组合。
  26. 权利要求1至25中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含鼠源ETA抗体或人源化ETA抗体。
  27. 权利要求1至26中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体包含ETA单克隆抗体。
  28. 权利要求1至27中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体的降低人内皮素信号传导的IC 50值大约为1nM至200nM或10nM至100nM。
  29. 权利要求1至28中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个，或八个BNP；该融合蛋白质将一BNP的氨基端与所述ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质将一BNP的羧基端与所述ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接。
  30. 权利要求29所述的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个，或四个BNP。
  31. 权利要求29所述的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个或二个BNP。
  32. 权利要求29所述的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体和二个BNP。
  33. 权利要求29至32中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质将一BNP的氨基端与所述ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接。
  34. 权利要求29至33中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质将一BNP的氨基端与所述ETA抗体的重链的羧基端连接。
  35. 权利要求1至34中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质包含氨基酸序列：SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:190，以及SEQ ID NO:209或SEQ ID NO:210。
  36. 权利要求1至28中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个，或八个BNP和肽接头(Linker)；该融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的氨基端与所述ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接，或者该融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的羧基端与所述ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接。
  37. 权利要求36的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体、和一个，二个，三个，或四个BNP和肽接头(Linker)。
  38. 权利要求36的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体和二个BNP和二个肽接头(Linker)。
  39. 权利要求36的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质包含一个ETA抗体，一个BNP和一个肽接头(Linker)。
  40. 权利要求36至39中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的氨基端与所述ETA抗体的轻链或重链的羧基端连接。
  41. 权利要求36至40中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质通过一肽接头序列将一BNP的氨基端与所述ETA抗体的重链的羧基端连接。
  42. 权利要求36至41中任一项所述的融合蛋白质，其中所述的融合蛋白质包含氨基酸序列：SEQ ID NO:162，SEQ ID NO:190，SEQ ID NO:205，和SEQ ID NO:218。
  43. 权利要求36至42中任一项的融合蛋白质，其中所述的ETA抗体、BNP和肽接头序列通过以下所述中一方式融合形成所述的融合蛋白质：
    (1)通过一个肽接头序列将一BNP的氨基端和所述ETA抗体的重链/轻链的羧基端连接：N'-R-Linker-BNP-C'；及
    (2)通过一肽接头序列将一BNP的羧基端与所述ETA抗体的轻链或重链的氨基端连接：N'-BNP-Linker-R-C'；
    其中:N'代表多肽链的氨基端,C'代表多肽链的羧基端,BNP代表一BNP，R为所述的ETA抗体的轻链或者重链的氨基酸序列,及Linker代表一肽接头。
  44. 权利要求1至43中任一项的融合蛋白质，其中所述的BNP各独立地包含选自于以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、及SEQ ID NO:216。
  45. 权利要求44的融合蛋白质，其中所述的BNP各独立地选自于以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:209、及SEQ ID NO:210。
  46. 权利要求36至45中任一项的融合蛋白质，其中所述的肽接头(Linker)的序列各自独立地包含以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、及SEQ ID NO:219。
  47. 权利要求46的融合蛋白质，其中所述的肽接头(Linker)的序列为SEQ ID NO:218。
  48. 一种多核苷酸，其编码权利要求1至47中任一项所述的融合蛋白质。
  49. 一种载体，其包含权利要求48中所述的一多核苷酸。
  50. 一种宿主细胞，其包含权利要求49中所述的一载体。
  51. 一种药用组合物，其包含权利要求1至47中任一项所述的融合蛋白质和一药用可接受的载体。
  52. 一种包含权利要求1至47中任一项所述的融合蛋白质在制备用于预防、改善、或治疗肺动脉高压的药物中的用途。
  53. 一种包含权利要求1至47中任一项所述的融合蛋白质在制备用于预防、改善、或治疗肺高压的药物中的用途。
  54. 一种包含权利要求1至47中任一项所述的融合蛋白质在制备用于预防、改善、或治疗心力衰竭的药物中的用途。
  55. 一种包含权利要求1至47中任一项所述的融合蛋白质在制备用于预防、改善、或治疗肺动脉高压，肺高压或者心力衰竭二种及二种以上病症的药物中的用途。
  56. 根据权利要求52至55中任一项所述的用途，其所述的药物是用于静脉或皮下注射。
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