WO2020226528A1

WO2020226528A1 - Method for determining fetal karyotype in a pregnant woman

Info

Publication number: WO2020226528A1
Application number: PCT/RU2019/000322
Authority: WO
Inventors: Дмитрий Олегович КОРОСТИН; Дарья Александровна ПЛАХИНА; Сергей Александрович ЕВФРАТОВ; Александр Сергеевич РАКИТЬКО; Валерий Владимирович ИЛЬИНСКИЙ
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "ГЕНОТЕК ИТ"
Priority date: 2019-05-08
Filing date: 2019-05-08
Publication date: 2020-11-12

Abstract

The invention describes a method for the non-invasive diagnosis of fetal aneuploidy by means of analyzing extracellular DNA from the blood of a pregnant woman by the method of massive parallel DNA sequencing. The described method is characterized by a novel method of sample preparation for extracellular DNA from blood samples. The technical result of the present invention is to improve the effectiveness of the process of determining fetal aneuploidy, said improvement being achieved by the fact that from one reading of the DNA libraries generated, information on several different chromosomes is potentially obtained, and said information is used to determine fetal aneuploidy. The present method can be used in the clinical diagnostics laboratories of medical facilities.

Description

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРИОТИПА ПЛОДА БЕРЕМЕННОЙ ЖЕНЩИНЫ METHOD FOR DETERMINING FETAL CARIOTYPE OF A PREGNANT WOMAN

Область техники Technology area

Изобретение относится к медицинской диагностике анеуплоидий и других аномалий генома молекулярно-генетическими методами, в частности высокопроизводительным секвенированием ДНК. The invention relates to the medical diagnosis of aneuploidies and other anomalies of the genome by molecular genetic methods, in particular, high-throughput DNA sequencing.

Уровень техники State of the art

Неинвазивная пренатальная диагностика анеуплоидий рекомендована беременным женщинам для получения более полной информации о здоровье будущего ребенка. Список наиболее часто встечающихся и тяжелых состояний, вызванных анеуплоидиями, включает в себя на сегодняшний день: синдром Дауна (трисомия по 21 паре хромосом), синдром Эдвардса (трисомия по 18 паре хромосом), синдром Патау (трисомия по 13 паре хромосом), а также синдромы Клайнфельтера и Шершевского-Тернера (полисомии по половым хромосомам и моносомия по хромосоме X, соответственно). На сегодняшний день выявление беременных, плод которых имеет одну из этих патологий начинается скринингом I триместра, который используется для оценки риска анеуплоидии. Согласно [Wapner R., et al. "First-trimester screening for trisomies 21 and 18", New England Journal of Medicine, 2003, T. 349. Ns. 15. стр. 1405-1413], значения чувствительности и специфичности для трисомии по 21 хромосоме составляют 85,2 и 90,6%. После скрининга I триместра формируется группа с высоким риском патологий плода, входящие в нее пациенты направляются на процедуру инвазивной диагностики (ИД). ИД представляет собой забор биоматериала плода (как правило, на таких сроках беременности это амниотическая жидкость - амниоцентез) с помощью иглы под контролем УЗИ и дальнейший цитогенетический анализ фетальных клеток для определения их кариотипа. С учетом чувствительности, 9,4% всех женщин получают ложноположительный результат по результатам скрининга и тем не менее делают ИД. До 1 % процедур ИД приводит к выкидышу, также повышаются риски развития других осложнений (повышение температуры и лихорадка, обильные кровотечения, отслойка плаценты, аллоиммунизация). Non-invasive prenatal diagnosis of aneuploidies is recommended for pregnant women to obtain more complete information about the health of the unborn child. The list of the most common and severe conditions caused by aneuploidies today includes: Down syndrome (trisomy on 21 pairs of chromosomes), Edwards syndrome (trisomy on 18 pairs of chromosomes), Patau syndrome (trisomy on 13 pairs of chromosomes), and Klinefelter and Shershevsky-Turner syndromes (sex chromosome polysomy and X chromosome monosomy, respectively). To date, the identification of pregnant women whose fetus has one of these pathologies begins with the first trimester screening, which is used to assess the risk of aneuploidy. According to [Wapner R., et al. "First-trimester screening for trisomies 21 and 18", New England Journal of Medicine, 2003, T. 349. Ns. 15. pp. 1405-1413], the values of sensitivity and specificity for trisomy on chromosome 21 are 85.2 and 90.6%. After the first trimester screening, a group with a high risk of fetal pathologies is formed, the patients included in it are sent for the invasive diagnosis (ID) procedure. ID is a collection of fetal biomaterial (as a rule, at such periods of pregnancy, it is amniotic fluid - amniocentesis) using a needle under ultrasound control and further cytogenetic analysis of fetal cells to determine their karyotype. Adjusted for sensitivity, 9.4% of all women receive a false positive on screening and still have ID. Up to 1% of ID procedures lead to miscarriage, and the risks of developing other complications (fever and fever, profuse bleeding, placental abruption, alloimmunization) also increase.

Во внеклеточной фракции крови человека присутствуют нуклеиновые кислоты. Внеклеточная ДНК (внДНК) является побочным продуктом апоптоза клеток и представляет собой короткие фрагменты геномной ДНК длиной 166 пар оснований (медианное значение). Во внДНК беременных женщин, начиная с самых ранних сроков беременности, определяется фетальная (плодная) фракция (вкфДНК, англ. - cell-free fetal DNA, cffDNA), причем с увеличением срока беременности, доля фетальной внДНК растет. У фракции вкфДНК наблюдается снижение среднего размера с 166 пар оснований (п.о.) до 143 п.о. ВнДНК выделяется из плазмы периферической крови человека и может быть использована для оценки состояния генома плода. Диагностика генетических нарушений плода по внеклеточной фетальной ДНК называется неинвазивным пренатальным тестированием (НИПТ, англ. - non-invasive prenatal testing, NIPT). The extracellular fraction of human blood contains nucleic acids. Extracellular DNA (cfDNA) is a byproduct of cell apoptosis and consists of short genomic DNA fragments of 166 base pairs (median value). In the cfDNA of pregnant women, starting from the earliest stages of pregnancy, the fetal (fetal) fraction (cfDNA, English - cell-free fetal DNA, cffDNA) is determined, and with an increase in pregnancy, the proportion of fetal cfDNA increases. The cfDNA fraction shows a decrease in the average size from 166 base pairs (bp) to 143 bp. CfDNA is isolated from human peripheral blood plasma and can be used to assess the state of the fetal genome. Diagnosis of fetal genetic disorders by extracellular fetal DNA is called non-invasive prenatal testing (NIPT).

NIPT - это статистическое исследование, проводимое для оценки доли представленности каждой из хромосом в исследуемом образце. В норме на каждую из хромосом генома небеременной женщины будет приходиться пропорциональное ее длине количество прочтений (ридов), полученных методами высокопроизводительного секвенирования. Если женщина беременна ребенком с нормальным кариотипом, картина не изменится. Но если у ребенка имеется трисомия по, например, 21 хромосоме, то ее относительное покрытие вырастет. Длина 21 хромосомы составляет примерно 1 ,5 % генома. Если доля фетальной ДНК у образца 10%, то третья фетальная 21 хромосома даст примерно 0,08% прибавку к общему покрытию 21 хромосомы. Чтобы оценить достоверность полученных данных результатов, используются различные статистические методики оценки. Наиболее распространенной является методика Z-критерия Фишера. Z- тест проверяет, не является ли увеличение покрытия хромосомы случайным, сравнивая ее значение с математическим ожиданием покрытия с учетом его стандартной ошибки. Математическое ожидание вычисляется с помощью проведенного заранее анализа выборки образцов внДНК беременных женщин с известным диагнозом у ребенка. Таким образом, чем больше выборка, тем ниже значение стандартной ошибки, а значит, больше точность теста. NIPT is a statistical study carried out to assess the proportion of each chromosome in a sample under study. Normally, each chromosome of the genome of a non-pregnant woman will have a proportional number of reads (reads) obtained by high-throughput sequencing methods. If a woman is pregnant with a child with a normal karyotype, the picture will not change. But if a child has trisomy on, for example, chromosome 21, then its relative coverage will increase. The length of chromosome 21 is approximately 1.5% of the genome. If the proportion of fetal DNA in the sample is 10%, then the third fetal 21 chromosome will give approximately 0.08% increase to the total coverage of 21 chromosomes. To assess the reliability of these results, various statistical evaluation techniques are used. The most common is the Fisher Z-test. The Z-test checks if the increase in chromosome coverage is random by comparing its value with the mathematical expectation of the coverage, taking into account its standard error. The mathematical expectation is calculated using a preliminary analysis of a sample of cfDNA samples from pregnant women with a known diagnosis in a child. Thus, the larger the sample, the lower the value of the standard error, which means the greater the test accuracy.

Важнейшим критерием, влияющим на NIPT, является доля фетальной внДНК. Чем она больше, тем большее значение Z покажет анализ в случае анеуплоидии. Существует несколько общепринятых способов оценки доли вкфДНК. Их объединяет принцип поиска значимых отличий фетальной фракции внДНК от материнской. Наиболее очевидной является оценка по доле Y-хромосомы, значение которой составляет половину значения вкфДНК. Этот подход надежен, но имеет существенный недостаток - он применим только в случае вынашивания мальчика. The most important criterion influencing NIPT is the proportion of fetal cfDNA. The larger it is, the greater the Z value will be shown by the analysis in case of aneuploidy. There are several generally accepted methods for assessing the proportion of cfDNA. They are united by the principle of searching for significant differences between the fetal fraction of cfDNA and the maternal one. The most obvious is the estimate based on the proportion of the Y chromosome, the value of which is half of the cfDNA value. This approach is reliable, but has a significant drawback - it is applicable only in the case of bearing a boy.

Универсальным и наиболее популярным в настоящее время подходом является оценка доли фетальной внДНК по однонуклеотидным полиморфизмам (single nucleotide polymorphism, SNP). В геноме можно отобрать биоинформатически те диаллельные SNP, которые имеют частоту минорного аллеля (minor allele frequency, MAF), близкую к 50%, входят в разные группы сцепления, и не подвергаются отбору. Так как половину своего генома ребенок наследует от отца, то при достаточной выборке SNP (80-150 шт) обнаружатся те точки, в которых генотип матери будет гомозиготен, а плода - гетерозиготен (за счет другого аллеля, унаследованного от отца). Доля ридов, выравненных на альтернативные материнскому генотипу аллели, подсчитывается напрямую и равна половине доли фетальной внДНК. В пределе, увеличивая количество анализируемых SNP, можно определять анеуполидию, сравнивая долю покрытия фетальных и материнских хромосом по соотношению ридов соответствующих SNP. Подобным образом поступила компания Natera, тест Panorama которой основан на анализе около 20000 SNP, распределенных по геному [Zimmermann, В., Hill, М., Gemelos, G., Demko,Currently, the universal and most popular approach is to estimate the proportion of fetal cfDNA by single nucleotide polymorphism (SNP). In the genome, it is possible to select bioinformatically those diallelic SNPs that have a minor allele frequency (MAF) close to 50%, are included in different linkage groups, and are not subject to selection. Since the child inherits half of its genome from the father, then with a sufficient sample of SNPs (80-150 pcs), those points will be found at which the mother's genotype is homozygous, and the fetus is heterozygous (due to another allele inherited from the father). The proportion of reads aligned for alleles alternative to the maternal genotype is calculated directly and equal to half the proportion of fetal cfDNA. In the extreme, by increasing the number of analyzed SNPs, it is possible to determine aneupolydy by comparing the proportion of coverage of fetal and maternal chromosomes by the ratio of reads of the corresponding SNPs. Similarly, Natera, whose Panorama test is based on the analysis of about 20,000 SNPs distributed over the genome [Zimmermann, B., Hill, M., Gemelos, G., Demko,

Z., Banjevic, M., Baner, J . & Levy, B, (2012) Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21 , X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci. Prenatal diagnosis, 32(13), 1233-1241]. Для создания таких SNP-библиотек применяется ряд дополнительных лабораторных методик, направленных на обогащение библиотеки NGS соответствующими участками генома. Z., Banjevic, M., Baner, J. & Levy, B, (2012) Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci. Prenatal diagnosis, 32 (13), 1233-1241]. To create such SNP libraries, a number of additional laboratory techniques are used to enrich the NGS library with the corresponding regions of the genome.

Недостатками существующих тестов типа NIPT является их высокая себестоимость по сравнению со стандартным биохимическим скринингом и даже инвазивной диагностикой. Таким образом, несмотря на существование ряда способов оценки наличия анеуплоидии, на сегодняшний день на рынке сохраняется потребность в более эффективном методе. The disadvantages of the existing tests of the NIPT type are their high cost compared to standard biochemical screening and even invasive diagnostics. Thus, despite the existence of a number of methods for assessing the presence of aneuploidy, there is still a need in the market for a more effective method.

Сущность изобретения The essence of the invention

Задачей настоящего изобретения является создание нового, более эффективного способа определения анеуплоидий плода по внеклеточной ДНК, циркулирующей в крови матери. Для решения этой задачи авторами предложен способ создания библиотек внеклеточной ДНК беременных женщин для проведения NIPT, путем «упаковки» в один рид нескольких различных фрагментов исходных внДНК с медианой длины 35 п.о., получая таким образом химерные линейные молекулы ДНК. Тем самым достигается снижение необходимого для анализа количества сырых данных как минимум в 4 раза, что существенно повышает эффективность идентификации анеуплоидий по внДНК для последующего определения анеуплоидий плода. Разработанный способ основан на том, что для картирования рида на геном достаточно 30-40 п.о., то есть не более четверти длины нативной внДНК длиной 166 п.о. Существующие тесты NIPT делают полное прочтение внДНК, либо два коротких (до 40 п.о.) прочтения с концов молекул внДНК. В первом случае информация оказывается избыточной. Однако реактивы для высокопроизводительных секвенаторов позволяют проводить анализ ридов большей длины, поэтому второй подход нерационально расходует реактивы для секвенирования. Таким образом, если создать химерные молекулы внДНК, состоящие из случайно соединенных фрагментов внДНК в одном риде, можно получить в несколько раз больше информации с одного прочтения, и использовать ее для определения анеуплоидий плода. The objective of the present invention is to provide a new, more effective method for determining fetal aneuploidies by extracellular DNA circulating in the mother's blood. To solve this problem, the authors proposed a method for creating libraries of extracellular DNA of pregnant women for NIPT by “packing” several different fragments of the original cfDNA with a median length of 35 bp into one read, thus obtaining chimeric linear DNA molecules. Thus, a decrease in the amount of raw data required for analysis is achieved by at least 4 times, which significantly increases the efficiency of identification of aneuploidies by cfDNA for subsequent determination of fetal aneuploidies. The developed method is based on the fact that 30-40 bp is sufficient for mapping the read onto the genome, that is, no more than a quarter of the length of native cfDNA 166 bp in length. Existing NIPT tests do a full read of cfDNA, or two short (up to 40 bp) reads from the ends of cfDNA molecules. In the first case, the information turns out to be redundant. However, reagents for high-throughput sequencers allow the analysis of longer reads, so the second approach is wasteful of reagents for sequencing. Thus, if you create chimeric cfDNA molecules, consisting of randomly connected fragments of cfDNA in one read, you can get several times more information from one reading, and use it to determine fetal aneuploidies.

Указанная задача решается путем создания способа подготовки внеклеточной ДНК из образца крови беременной женщины к секвенированию для диагностики анеуплоидии плода, включающего следующие стадии: а) получают образец материнской крови, состоящий из цельной крови, или плазмы крови, или сыворотки крови, при этом для образца, состоящего из цельной крови, отделяют плазму крови и используют ее для последующих стадий; Ь) выделяют внеклеточную ДНК, присутствующую в указанном образце крови; с) осуществляют фрагментацию очищенной внеклеточной ДНК, получая в результате размер ДНК-фрагментов от 30 до 100 пар оснований со средним размером 40 пар оснований; d) отбирают фрагменты ДНК длиной между 35 и 45 пар оснований; е) осуществляют случайное лигирование отобранных на стадии d) фрагментов ДНК друг с другом для формирования химерных линейных молекул ДНК размером более 100 п.о.; f) осуществляют лигирование адаптерных последовательностей, специфических для используемого в дальнейшем метода секвенирования, с химерными линейными молекулами ДНК для создания библиотек химерных линейных молекул ДНК; д) проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для индексирования библиотек химерных линейных молекул ДНК уникальными последовательностями баркодов. This problem is solved by creating a method for preparing extracellular DNA from a blood sample of a pregnant woman for sequencing to diagnose fetal aneuploidy, which includes the following stages: a) a sample of maternal blood is obtained, consisting of whole blood, or blood plasma, or blood serum, while for a sample consisting of whole blood, the blood plasma is separated and used for subsequent stages; B) isolate extracellular DNA present in said blood sample; c) carry out the fragmentation of the purified extracellular DNA, resulting in the size of DNA fragments from 30 to 100 base pairs with an average size of 40 base pairs; d) select DNA fragments between 35 and 45 base pairs; f) randomly ligating the DNA fragments selected at step d) with each other to form chimeric linear DNA molecules larger than 100 bp; f) ligation of adapter sequences specific for the sequencing method used in the future with chimeric linear DNA molecules to create libraries of chimeric linear DNA molecules; e) carry out polymerase chain reaction (PCR) to index libraries of chimeric linear DNA molecules with unique barcode sequences.

В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что фрагментацию очищенной внеклеточной ДНК на стадии с) осуществляют с помощью ферментов и без обработки ДНК ультразвуком. In some embodiments, the method is characterized in that the fragmentation of the purified extracellular DNA in step c) is performed using enzymes and without sonication of the DNA.

Указанная задача также решается путем создания способа определения анеуплоидии плода с помощью анализа внеклеточной ДНК из крови беременной женщины методом секвенирования, включающего следующие стадии: а) подготавливают внеклеточную ДНК из образца крови беременной женщины согласно описанному выше способу; б) осуществляют секвенирование образованных библиотек химерных линейных молекул ДНК одним из методов массового параллельного секвенирования, получая множество чтений; в) осуществляют картирование полученных чтений на референсный геном человека для определения присутствия в чтениях участков хромосом человека; г) определяют количество участков последовательностей ДНК в чтениях, соответствующих разным хромосомам человека, при этом исключают участки, которые являются неуникальными для отдельных хромосом генома человека; д) определяют наличие анеуплоидии по определенной хромосоме при обнаружении отличий в нормализованной на длину хромосомы представленности этой хромосомы от среднего значения по геному. This problem is also solved by creating a method for determining fetal aneuploidy by analyzing extracellular DNA from the blood of a pregnant woman by sequencing, including the following stages: a) prepare extracellular DNA from a blood sample of a pregnant woman according to the method described above; b) sequencing the generated libraries of chimeric linear DNA molecules by one of the methods of massive parallel sequencing, obtaining multiple readings; c) carry out the mapping of the received readings on the reference human genome to determine the presence of sections of human chromosomes in the readings; d) determine the number of sections of DNA sequences in readings corresponding to different human chromosomes, while excluding sections that are non-unique for individual chromosomes of the human genome; e) determine the presence of aneuploidy for a certain chromosome upon detection of differences in the representation of this chromosome normalized to the length of the chromosome from the average value for the genome.

В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что классификация представленности отдельных хромосом производится на основании z- статистики, вычисленной в регрессионной модели, и порогового значения z_0. Пороговое значение выбирается для каждой хромосомы отдельно в соответствии с критерием максимизации специфичности. In some embodiments of the invention, this method is characterized in that the classification of the representation of individual chromosomes is based on the z-statistic calculated in the regression model and the threshold value z_0. The threshold value is selected for each chromosome separately in accordance with the criterion for maximizing specificity.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение эффективности процесса определения анеуплоидии плода путем анализа внеклеточной ДНК из крови беременной женщины методом массового параллельного секвенирования. Технический результат достигается тем, что за одно прочтение образованных библиотек ДНК потенциально получают информацию о нескольких различных хромосомах, и используют эту информацию для определения анеуплоидии плода. The technical result of the present invention is to improve the efficiency of the process for determining fetal aneuploidy by analyzing extracellular DNA from the blood of a pregnant woman by mass parallel sequencing. The technical result is achieved by the fact that in one reading of the generated DNA libraries, information is potentially obtained about several different chromosomes, and this information is used to determine fetal aneuploidy.

Краткое описание рисунков Brief Description of Figures

Рис. 1. Схема строения рида, применяемого компаниями, занимающимися проведением NIPT (А), а также схема строения рида для проведения NIPT, разработанного авторами и состоящего из коротких фрагментов. Прямоугольники на концах - адаптерные последовательности, необходимые для закрепления библиотеки на подложке проточной ячейки высокопроизводительного секвенатора. Стрелки показывают прямые и обратные прочтения рида, проводящиеся в процессе секвенирования. Figure: 1. Diagram of the read structure used by companies involved in NIPT (A), as well as the diagram of the read structure for NIPT, developed by the authors and consisting of short fragments. The rectangles at the ends are the adapter sequences required to anchor the library to the high performance sequencer flow cell substrate. The arrows show the forward and backward reads of the read during sequencing.

Рис. 2. Схема картирования ридов для «классического» NIPT (А) и разработанного авторами (В) на геном человека. За счет химерного строения молекулы, картирование прочитанных фрагментов каждого из ридов (В) несет в себе больше информации для определения наличия анеуплоидии плода. Figure: 2. Scheme for mapping reads for the "classic" NIPT (A) and developed by the authors (B) on the human genome. Due to the chimeric structure of the molecule, the mapping of the read fragments of each of the reads (B) carries more information for determining the presence of fetal aneuploidy.

Рис. 3. (а). Хроматограмма библиотеки химерных молекул ДНК высокого качества. Показана зависимость сигнала флуоресценции (ось Y) от длины ДНК (ось X). Цифрами 35 и 10380 обозначены нижний и верхний маркеры соответствующей длины в парах оснований. Figure: 3. (a). Chromatogram of a high quality chimeric DNA molecule library. The dependence of the fluorescence signal (Y-axis) on the DNA length (X-axis) is shown. Numbers 35 and 10380 denote the lower and upper markers of the corresponding length in base pairs.

Рис. 3. (Ь). Хроматограмма библиотеки амплифицированных фрагментов ДНК высокого качества. Показана зависимость сигнала флуоресценции (ось Y) от длины ДНК (ось X). Цифрами 35 и 10380 обозначены нижний и верхний маркеры соответствующей длины в парах оснований. Figure: 3. (b). High quality chromatogram of a library of amplified DNA fragments. The dependence of the fluorescence signal (Y-axis) on the DNA length (X-axis) is shown. Numbers 35 and 10380 denote the lower and upper markers of the corresponding length in base pairs.

Рис. 4. Пример покрытия хромосомы X с нормальным женским кариотипом для одного из образцов контрольной выборки. По оси X отложены окна (бины) размером 50 кб (тысяч пар оснований), на которые разбита хромосома, по оси Y - количество прочтений внутри бина. Figure: 4. An example of the coverage of the X chromosome with a normal female karyotype for one of the samples of the control sample. The X-axis shows windows (bins) with a size of 50 kb (thousand base pairs), into which the chromosome is divided, and the Y-axis shows the number of reads within a bin.

Рис. 5. (а). Значения Z-статистики по 13-ой хромосоме для всех образцов контрольной выборки. Кругами обозначены средние значения Z для образцов с нормальным кариотипом, треугольниками - с трисомией по 13 хромосоме. «Усы» - диапазон значений Z для соответствующего образца, которые она принимала в рамках 200 симуляций. Жирная горизонтальная линия - значение Z, равное 3. Figure: 5. (a). Z-statistic values for the 13th chromosome for all samples of the control sample. The circles indicate the average Z values for samples with normal karyotype, triangles - with trisomy on chromosome 13. "Whiskers" is the range of Z values for the corresponding sample that she took over 200 simulations. The bold horizontal line is a Z-value of 3.

(Ь). Значения Z-статистики по 18-ой хромосоме для всех образцов контрольной выборки. Кругами обозначены средние значения Z для образцов с нормальным кариотипом, треугольниками - с трисомией по 18 хромосоме. «Усы» - диапазон значений Z для соответствующего образца, которые она принимала в рамках 200 симуляций. Жирная горизонтальная линия - значение Z, равное 3. (B). Z-statistic values for the 18th chromosome for all samples of the control sample. The circles indicate the average Z values for samples with a normal karyotype, triangles - with trisomy on chromosome 18. "Mustache" - Z value range for the corresponding sample, which she took over 200 simulations. The bold horizontal line is a Z-value of 3.

(с). Значения Z-статистики по 21-ой хромосоме для всех образцов контрольной выборки. Кругами обозначены средние значения Z для образцов с нормальным кариотипом, треугольниками - с трисомией по 21 хромосоме. «Усы» - диапазон значений Z для соответствующего образца, которые она принимала в рамках 200 симуляций. Жирная горизонтальная линия - значение Z, равное 3. (from). Z-statistic values for the 21st chromosome for all samples of the control sample. The circles indicate the average Z values for samples with a normal karyotype, triangles - with trisomy on chromosome 21. "Whiskers" is the range of Z values for the corresponding sample that she took over 200 simulations. The bold horizontal line is a Z-value of 3.

Рис. 6. График зависимости значений характеристик модели, подсчитывающей z- статистику, от доли оставшихся данных, рассчитанный в одной из симуляций для трисомии по 21 хромосоме. По оси Y отложены значения от 0 до 1 , по оси X отложены значения доли данных относительно исходно полученного количества прочтений, используемые для вычислений AUC, чувствительности и специфичности. Видно, что снижение количества данных в 2 раза от среднего не приводит к ухудшению показателей разработанного NIPT. Figure: 6. A graph of the dependence of the values of the characteristics of the model calculating the z-statistic, on the share of the remaining data, calculated in one of the simulations for trisomy on chromosome 21. The y-axis plots values from 0 to 1, the x-axis plots the proportion of data relative to the original number of reads used to calculate AUC, sensitivity and specificity. It can be seen that a 2-fold decrease in the amount of data from the average does not lead to a deterioration in the indicators of the developed NIPT.

Рис. 7. (a). ROC кривая для определения трисомии по 13 хромосоме. Figure: 7. (a). ROC curve for trisomy 13 chromosome.

(b). ROC кривая для определения трисомии по 18 хромосоме. (b). ROC curve to determine trisomy on chromosome 18.

(c). ROC кривая для определения трисомии по 21 хромосоме. (c). ROC curve for trisomy 21 chromosomes.

Рис. 8. Значения доли фетальной ДНК, определенные для контрольной выборки с помощью анализа результатов секвенирования библиотек амплифицированных фрагментов ДНК. По оси Y отложено количество образцов, по оси X - значение доли фетальной ДНК в %. Figure: 8. Values of the proportion of fetal DNA determined for the control sample by analyzing the results of sequencing of libraries of amplified DNA fragments. The Y-axis is the number of samples, the X-axis is the value of the proportion of fetal DNA in%.

Рис. 9. Результаты определения пола плода по отношению нормированного покрытия Y хромосомы (значения отложены по оси Y) к отношению нормированного покрытия X хромосомы к аутосомам (значения отложены по оси X). Образцы делятся на две группы: группа А - беременные с плодами мужского пола, группа В - беременные с плодами женского пола. Стрелками обозначены два образца с плодами мужского пола, определенного как женский по причине низкой доли фетальной ДНК (менее 2%). Figure: 9. The results of determining the sex of the fetus in relation to the ratio of the normalized coverage of the Y chromosome (values are plotted on the Y axis) to the ratio of the normalized coverage of the X chromosome to autosomes (the values are plotted on the X axis). Samples are divided into two groups: group A - pregnant women with male fetuses, group B - pregnant women with female fetuses. Arrows indicate two samples with male fetuses identified as female due to the low proportion of fetal DNA (less than 2%).

Подробное раскрытие изобретения Detailed disclosure of the invention

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе. In the description of this invention, the terms "includes" and "including" are interpreted to mean "includes, among other things". These terms are not intended to be construed as “consists only of”. Unless otherwise specified, technical and scientific terms in this application have the standard meanings generally accepted in the scientific and technical literature.

Методы массового параллельного секвенирования (также называемыми методами секвенирования следующего поколения, NGS) - термин, относящийся ко всем высокопроизводительным технологиям секвенирования ДНК, которые способны расшифровать большое число различных последовательностей ДНК в одной реакции (то есть параллельно). Технологии массового параллельного секвенирования, в отличие от капиллярного секвенирования, основаны как правило на параллельном выявлении присоединяемых нуклеотидов при синтезе клона ДНК в каждой из миллионов микроскопических ячеек/участках матрицы. Каждая из наиболее распространенных платформ массового параллельного секвенирования (lllumina, Ion Torrent, MGI, Oxford Nanopore и др.) использует собственную стратегию для реализации этого принципа. Эти компании используют подходы, основанные на обратимой флуоресценции, выявлении изменений в уровне pH среды, протаскивании молекулы ДНК через белковую пору и измерении в ней электрического сопротивления. Massively parallel sequencing techniques (also called next generation sequencing techniques, NGS) is a term that refers to all high-throughput DNA sequencing technologies that are capable of decoding a large number of different DNA sequences in a single reaction (i.e. in parallel). Mass parallel sequencing technologies, in contrast to capillary sequencing, are usually based on the parallel detection of the attached nucleotides during the synthesis of a DNA clone in each of the millions of microscopic wells / regions of the matrix. Each of the most common mass parallel sequencing platforms (lllumina, Ion Torrent, MGI, Oxford Nanopore, etc.) uses its own strategy to implement this principle. These companies use approaches based on reversible fluorescence, detecting changes in the pH level of the environment, pulling a DNA molecule through a protein pore and measuring electrical resistance in it.

В основе заявляемого способа определения анеуплоидии плода с помощью анализа внеклеточной ДНК из крови беременной женщины лежит разработанный авторами протокол пробоподготовки внеклеточной ДНК беременных женщин на ранних стадиях беременности (10-14 неделя), с помощью которого можно получать библиотеки ДНК, состоящие из коротких фрагментов внДНК, для высокопроизводительного секвенирования и последующего NIPT-анализа полученных данных. Ключевыми отличиями от существующих методов анализа внДНК для определения анеуплоидии являются: The proposed method for determining fetal aneuploidy using the analysis of extracellular DNA from the blood of a pregnant woman is based on the protocol developed by the authors for sample preparation of extracellular DNA of pregnant women in the early stages of pregnancy (weeks 10-14), which can be used to obtain DNA libraries consisting of short cfDNA fragments, for high-throughput sequencing and subsequent NIPT analysis of the obtained data. The key differences from existing cfDNA analysis methods for determining aneuploidy are:

1. Длительная фрагментация внДНК до сверхкоротких фрагментов; 1. Prolonged fragmentation of cfDNA to ultrashort fragments;

2. Селективный отбор (size-select) фрагментов внДНК длиной около 40 п.о.; 2. Selective selection (size-select) of cfDNA fragments about 40 bp in length;

3. Случайное лигирование коротких фрагментов внДНК (конкатемеров) друг с другом для формирования химерных линейных молекул ДНК размером более 200 пар оснований. 3. Random ligation of short cfDNA fragments (concatemers) with each other to form chimeric linear DNA molecules over 200 base pairs in size.

Комбинация перечисленных выше шагов не применяется ни в одной из описанных ранее методик пробоподготовки образцов для проведения NIPT. Основным преимуществом данного подхода является сниженное по меньшей мере вчетверо по сравнению с аналогичными подходами количество сырых данных, необходимое для проведения NIPT с такими же параметрами чувствительности и специфичности. На Рис. 1. представлена схема строения рида, применяемого на сегодняшний день компаниями, занимающимися проведением NIPT, а также схема строения рида по настоящему изобретению (упаковка в один рид нескольких различных фрагментов внДНК). Прямоугольники на концах - адаптерные последовательности, необходимые для закрепления библиотеки на подложке проточной ячейки высокопроизводительного секвенатора. Стрелки показывают прямые и обратные прочтения рида, проводящиеся в процессе секвенирования. На Рис. 2 представлена схема картирования ридов для «классического» NIPT (А) и разработанного авторами (В) на геном человека. Один рид, состоящий из коротких конкатемеров, содержит такое же количество клинически полезной информации, как и по меньшей мере 4 обычных рида. Для осуществления заявляемого способа определения анеуплоидии плода авторами был разработан набор реагентов, который позволяет модифицировать внДНК с помощью ряда ферментативных реакций (фрагментация, фосфорилирование 5’ концов, затупление 5’ и 3’ концов, ПЦР, лигирование), в результате чего из внДНК готовятся библиотеки химерных фрагментов ДНК и библиотеки амплифицированных фрагментов ДНК, необходимые для анализа одним из методов высокопроизводительного секвенирования, например, синтезом с использованием обратимых терминаторов. A combination of the above steps does not apply to any of the previously described sample preparation procedures for NIPT. The main advantage of this approach is that the amount of raw data required to perform NIPT with the same parameters of sensitivity and specificity is at least four times reduced compared with similar approaches. In Fig. 1. shows a diagram of the structure of the read used today by companies involved in NIPT, as well as a diagram of the structure of the read according to the present invention (packing several different cfDNA fragments into one read). The rectangles at the ends are the adapter sequences required to anchor the library to the high performance sequencer flow cell substrate. The arrows show the forward and backward reads of the read during sequencing. In Fig. 2 shows a diagram of the mapping of reads for the "classic" NIPT (A) and developed by the authors (B) on the human genome. One read, consisting of short concatemers, contains the same amount of clinically useful information as at least 4 conventional reads. To implement the proposed method for determining fetal aneuploidy, the authors have developed a set of reagents that allows you to modify cfDNA using a number of enzymatic reactions (fragmentation, phosphorylation of the 5 'ends, blunting of the 5' and 3 'ends, PCR, ligation), as a result of which libraries are prepared from cfDNA chimeric DNA fragments and libraries of amplified DNA fragments required for analysis by one of the high-throughput sequencing methods, for example, synthesis using reversible terminators.

Библиотеки ДНК позволяют провести молекулярное кариотипирование образца внДНК беременной женщины. Смесь экзонуклеаз обеспечивает внедрение случайных двунитевых разрывов в молекулах исходной ДНК. Смеси полинуклеотидкиназы и Т4 ДНК- полимеразы производит «полировку» концов разорванных молекул ДНК, в результате чего убираются выступающие одноцепочечные нити, а также 5’ концы фрагментов фосфорилируются. Лигаза на первом этапе проводит случайное лигирование коротких фраментов внДНК, формируя цепочки химерных ДНК; на втором этапе лигаза пришивает к подготовленным концам фрагментов олигнуклеотидные адаптеры, необходимые для их индексирования специфическими последовательностями в процессе высокопроизводительного секвенирования. ДНК-полимераза осуществляет амплификацию библиотек ДНК, фланкированных адаптерами на втором этапе лигирования. DNA libraries allow molecular karyotyping of a pregnant woman's cfDNA sample. A mixture of exonucleases ensures the introduction of random double-stranded breaks in the molecules of the original DNA. A mixture of polynucleotide kinase and T4 DNA polymerase "polishes" the ends of the broken DNA molecules, as a result of which protruding single-stranded strands are removed, and the 5 'ends of the fragments are phosphorylated. At the first stage, ligase performs random ligation of short cfDNA fragments, forming chains of chimeric DNA; at the second stage, the ligase sutures olignucleotide adapters to the prepared ends of the fragments, which are necessary for their indexing with specific sequences during high-throughput sequencing. DNA polymerase amplifies DNA libraries flanked by adapters in a second ligation step.

Библиотеки амплифицированных фрагментов ДНК позволяют проводить оценку доли фетальной ДНК у беременных женщин. Процедура пробоподготовки помимо описанных ранее этапов для подготовки химерных фрагментов ДНК содержит стадию амплификации целевых регионов генома, проводимую с помощью мультиплексной ПЦР. Libraries of amplified DNA fragments allow assessment of the proportion of fetal DNA in pregnant women. The sample preparation procedure, in addition to the previously described steps for the preparation of chimeric DNA fragments, contains the stage of amplification of the target regions of the genome, carried out using multiplex PCR.

Комплект реагентов для индексирования библиотек ДНК баркодами позволяет с помощью ПЦР-реакции присоединить к адаптерным концам фрагментов ДНК уникальные индексные нуклеотидные последовательности, благодаря которым возможно анализировать сразу несколько библиотек ДНК в одном запуске высокопроизводительного секвенатора. A set of reagents for indexing DNA libraries with barcodes allows using a PCR reaction to attach unique index nucleotide sequences to the adapter ends of DNA fragments, thanks to which it is possible to analyze several DNA libraries at once in one run of a high-performance sequencer.

Комплект реагентов для высокопроизводительного секвенирования позволяет провести анализ библиотек фрагментов ДНК и библиотек амплифицированных фрагментов ДНК по одной технологий массового параллельного секвенирования. В предпочтительных вариантах изобретения используют секвенирование синтезом с обратимыми терминаторами, разработанное компанией lllumina, США для платформы lllumina MiSeq или MiSeqDX. The high-throughput sequencing reagent kit allows you to analyze libraries of DNA fragments and libraries of amplified DNA fragments using the same mass parallel sequencing technology. Preferred embodiments of the invention use reversible terminator fusion sequencing as developed by lllumina, USA for the lllumina MiSeq or MiSeqDX platform.

Авторами также разработано программное обеспечение «НИПТ-Аналитика», которое позволяет проанализилировать данные секвенирования на lllumina MiSeq/MiSeqDX и получить результаты о наличии или отсутствии анеуплоидий у плода по интересующим хромосомам. Таким образом, разработанный авторами набор реагентов включает: смеси реагентов для конструирования библиотек химерных фрагментов ДНК, смеси реагентов для конструирования библиотек амплифицированных фрагментов ДНК, смеси реагентов для индексирования библиотек баркодами, реагенты для проведения высокопроизводительного секвенирования на платформе lllumina MiSeq, программное обеспечение для анализа данных секвенирования, контрольные образцы, содержащие ДНК с нормальным кариотипом. The authors also developed the NIPT-Analytica software, which allows analyzing sequencing data on lllumina MiSeq / MiSeqDX and obtaining results on the presence or absence of aneuploidies in the fetus for the chromosomes of interest. Thus, the set of reagents developed by the authors includes: mixtures of reagents for constructing libraries of chimeric DNA fragments, mixtures of reagents for constructing libraries of amplified DNA fragments, mixtures of reagents for indexing libraries with barcodes, reagents for high-throughput sequencing on the lllumina MiSeq platform, software for analyzing sequencing data , control samples containing DNA with normal karyotype.

Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. The following examples of the implementation of the method are given in order to disclose the characteristics of the present invention and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention.

Для осуществления способа предпочтительно использовать свежую цельную периферическую кровь беременных женщин. Также для осуществления способа пригодна свежеотобранная или замороженная плазма, или сыворотка периферической крови беременных женщин. Выделение геномной ДНК или внеклеточной ДНК можно проводить в соответствии с инструкцией производителя набора для выделения QIAamp DNA Blood mini kit, Qiagen, либо использовать аналогичные наборы. For the implementation of the method, it is preferable to use fresh whole peripheral blood of pregnant women. Freshly sampled or frozen plasma or peripheral blood serum of pregnant women is also suitable for carrying out the method. Isolation of genomic DNA or extracellular DNA can be performed according to the manufacturer's instructions for the QIAamp DNA Blood mini kit, Qiagen, or similar kits.

Пример. Забор венозной крови общим объемом 20 мл осуществлялся квалифицированным персоналом в 2 пробирки Streck ВСТ. Режим хранения и транспортировки - только комнатная температура (+15 - +25°С) не более 7 дней с момента сбора крови. Example. The collection of venous blood with a total volume of 20 ml was carried out by qualified personnel in 2 Streck BCT tubes. Storage and transportation mode - only room temperature (+15 - + 25 ° С) no more than 7 days from the moment of blood collection.

Отделение плазмы крови для выделения внеклеточной ДНК. Separation of blood plasma for extraction of extracellular DNA.

1. Центрифугировать пробирки с цельной кровью 30 мин. 1500 об/мин; 1. Centrifuge the whole blood tubes for 30 min. 1500 rpm;

2. Промаркировать для каждого образца по 4-6 пробирок объемом 2 мл; 2. Label 4-6 2 ml tubes for each sample;

3. Отобрать верхнюю фракцию, не задевая раздела фаз (лейкоцитарное кольцо) по 2000 мкл в каждую пробирку; 3. Take the upper fraction without touching the phase interface (leukocyte ring), 2000 µl in each tube;

4. Центрифугировать плазму крови 15 мин. в микроцентрифуге на максимальных оборотах; 4. Centrifuge the blood plasma for 15 minutes. in a microcentrifuge at maximum speed;

5. Промаркировать для каждого образца по 4-6 пробирок объемом 2 мл; 5. Label 4-6 2 ml tubes for each sample;

6. Отобрать в каждую пробирку по ~2000 мкл плазмы после центрифугирования, не задевая осадок; 6. Take in each tube ~ 2000 µl of plasma after centrifugation, without touching the sediment;

7. Заморозить и хранить на -20°С; Срок хранения замороженной плазмы не более 4 месяцев. 7. Freeze and store at -20 ° С; The shelf life of frozen plasma is no more than 4 months.

Приготовление раствора протеиназы К. На 10 мл раствора необходимо смешать 100 мг протеиназы К, 200 мкл 0,5М СаС12, довести водой деионизированной до 10 мл. Preparation of a solution of proteinase K. For 10 ml of solution, it is necessary to mix 100 mg of proteinase K, 200 μl of 0.5 M CaCl2, bring to 10 ml with deionized water.

Протокол выделения внДНК с помощью набора QIAamp DNA Mini от Qiagen. CfDNA isolation protocol using QIAamp DNA Mini kit from Qiagen.

1. Разморозить образцы плазмы по 4-5 мл плазмы. 1. Thaw plasma samples at 4-5 ml of plasma.

2. В чистые 15 мл фальконы (по числу образцов) внести 4-5 (в зависимости от объема образца) мл буфера AL. К нему добавить один объем плазмы и 0,1 объема (от объема плазмы) протеиназы К. Тщательно перемешать на вортексе в течение 1 минуты и затем инкубировать 40 минут при температуре 56°С на водяной бане.2. Add 4-5 ml of buffer AL (depending on the sample volume) into clean 15 ml falcones (according to the number of samples). Add one volume of plasma and 0.1 volume to it (from the plasma volume) of proteinase K. Mix thoroughly on a vortex for 1 minute and then incubate for 40 minutes at 56 ° C in a water bath.

3. Добавить в каждую пробирку по одному объему [плазмы] 95% этанола, перемешать на вортексе в течение 1 минуты, оставить на 5 минут при комнатной температуре. 3. Add one volume [plasma] of 95% ethanol to each tube, vortex for 1 minute, leave for 5 minutes at room temperature.

4. Подготовить манифолд QiaVac-24: вставить vac-переходники (по числу образцов), в них вставить подписанные (на крышке и сбоку) колонки. Открыть колонки, включить насос и проверить по манометру, что давление достигло -800-900 мбар. 4. Prepare the QiaVac-24 manifold: insert vac-adapters (according to the number of samples), insert the signed columns (on the cover and on the side) into them. Open the dispensers, turn on the pump and check on the pressure gauge that the pressure has reached -800-900 mbar.

5. Перенести 700 мкл образца на колонку. Подождать, пока жидкость пройдет через колонку. 5. Transfer 700 µL of sample to the column. Wait for the liquid to pass through the column.

6. Повторить пункт 5 необходимое количество раз (пока не закончится лизат). 6. Repeat step 5 the required number of times (until the end of the lysate).

7. После лизиса центрифугировать колонки на 7000 об/мин 3 минуты. 7. After lysis, centrifuge the columns at 7000 rpm for 3 minutes.

8. Внести на колонку 700 мкл буфера AW1 , центрифугировать на 7000 об/мин 1 минуту. Вылить жидкость из пробирки и вставить колонку в новую пробирку. 8. Pipette 700 µL of Buffer AW1 onto the column, centrifuge at 7000 rpm for 1 minute. Pour liquid from the vial and insert the column into a new vial.

9. Внести на колонку 700 мкл буфера AW2, центрифугировать на 7000 об/мин 1 минуту. Вылить жидкость из пробирки и вставить колонку в новую пробирку. 9. Pipette 700 µl of buffer AW2 onto the column, centrifuge at 7000 rpm for 1 minute. Pour liquid from the vial and insert the column into a new vial.

10. Внести на колонку 700 мкл 95% этанола, центрифугировать на 7000 об/мин 1 минуту. Вылить жидкость из пробирки и вставить колонку в новую пробирку. 10. Pipette 700 µL of 95% ethanol onto the column, centrifuge at 7000 rpm for 1 minute. Pour liquid from the vial and insert the column into a new vial.

11. Центрифугировать образцы на максимальной скорости в течение 3 минут, чтобы удалить остатки этанола. Вставить колонки в чистые 1 ,5 мл пробирки (LoBind). 11. Centrifuge samples at maximum speed for 3 minutes to remove residual ethanol. Insert columns into clean 1.5 ml tubes (LoBind).

12. Внести на колонку 41 мкл low ТЕ и инкубировать 30 минут. 12. Pipette 41 µl low TE onto the column and incubate for 30 minutes.

13. Центрифугировать на максимальной скорости в течение 1 минуты. Выбросить колонку. ДНК выделена. Выделенную ДНК следует хранить на -20°С. Для проведения пробоподготовки требуются следующие реагенты: 13. Centrifuge at maximum speed for 1 minute. Throw away the column. DNA isolated. The extracted DNA should be stored at -20 ° C. The following reagents are required for sample preparation:

10 ten

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

11 eleven

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

12 12

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

Протокол пробоподготовки рассчитан на образец внДНК общим количеством не менее 3 нг. The sample preparation protocol is designed for a sample of cfDNA with a total amount of at least 3 ng.

Протокол подготовки библиотек фрагментов ДНК DNA fragment library preparation protocol

1. Модификация длин ДНК 1. Modification of DNA lengths

Для подготовки библиотеки фрагментов ДНК из внеклеточной ДНК необходимо взять около 3-6 нг выделенной по описанному выше протоколу ДНК, пересчитав количество ДНК из значения ее концентрации и подставив его в таблицу ниже. To prepare a library of DNA fragments from extracellular DNA, it is necessary to take about 3-6 ng of DNA isolated according to the protocol described above, recalculating the amount of DNA from the value of its concentration and substituting it into the table below.

13 13

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) В микропробирку 1 ,5 мл необходимо внести следующие компоненты: SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The following components must be added to a 1.5 ml microtube:

Тщательно перемешать пипетированием. Mix thoroughly by pipetting.

Инкубировать при следующих параметрах: Incubate with the following parameters:

• После фрагментации добавить Раствор магнитных частиц (предварительно перемешав флакон с частицами на вортексе, чтобы получилась взвесь частиц равномерной концентрации) в количестве 60 мкл (х2 объема); • After fragmentation, add a Solution of magnetic particles (after mixing the bottle with particles on a vortex mixer to obtain a suspension of particles of uniform concentration) in an amount of 60 μl (x2 volume);

• Инкубировать смесь 5 минут; • Incubate the mixture for 5 minutes;

• Затем поставить на магнитный штатив пробирки со смесью на 5 минут; • Then place the test tubes with the mixture on a magnetic stand for 5 minutes;

• Супернатант (надосадочную жидкость) перенести в новые пробирки на 1 ,5 мл; • Transfer the supernatant (supernatant) to new 1.5 ml tubes;

• Добавить 10 объемов Раствора для очистки А; • Add 10 volumes of Cleaning Solution A;

• Инкубировать в течение 1 минуты; • Incubate for 1 minute;

• Перенести 600 мкл раствора на Колонку для очистки ДНК; • Transfer 600 µl solution to the DNA Purification Column;

• Инкубировать 1 минуту; • Incubate for 1 minute;

· Затем центрифугировать на 7000 об/мин в течение 1 минуты; · Then centrifuge at 7000 rpm for 1 minute;

• Поменять пробирку под колонкой на чистую Пробирку для центрифугирования; • Change the tube under the column for a clean Centrifuge tube;

• Внести на колонку оставшийся объем Раствора для очистки А с разведенным в нем образцом; • Pour the remaining volume of Purification Solution A with the diluted sample onto the column;

· Центрифугировать на 7000 об/мин в течение 1 минуты; · Centrifuge at 7000 rpm for 1 minute;

• Промыть колонку Раствора для очистки В в количестве 500 мкл еще раз; • Wash the column of Purification Solution B with 500 µL again;

• Центрифугируя на 7000 об/мин в течение 1 минуты; • Centrifuging at 7000 rpm for 1 minute;

14 fourteen

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) • Центрифугируя на 7000 об/мин в течение 1 минуты; SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) • Centrifuging at 7000 rpm for 1 minute;

• После отмывок центрифугировать колонки на 13400 об/мин в течение 1 минуты; • After washes, centrifuge the columns at 13400 rpm for 1 minute;

• Внести на колонки по 20 мкл Раствора LowT; • Pipette 20 µl of LowT solution onto the columns;

· Инкубировать 1 минуту; · Incubate for 1 minute;

• Центрифугировать на 13400 об/мин в течение 1 минуты; • Centrifuge at 13400 rpm for 1 minute;

• Перенести элюат на ту же колонку; • Transfer the eluate to the same column;

• Снова центрифугировать на 13400 об/мин в течение 1 минуты; • Centrifuge again at 13400 rpm for 1 minute;

• Полученный элюат F использовать в следующей реакции модификации концов ДНК. • Use the resulting eluate F in the next reaction for modifying the DNA ends.

2. Модификация концов ДНК 2. Modification of DNA ends

В микропробирку 1 ,5 мл необходимо внести следующие компоненты: The following components must be added to a 1.5 ml microtube:

Тщательно перемешать пипетированием Mix thoroughly by pipetting

3. Предварительное лигирование 3. Pre-ligation

15 fifteen

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Всего 38,6 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Total 38.6

4. Постлигатная модификация ДНК 4. Post-ligate DNA modification

Смешать следующие компоненты: Mix the following ingredients:

Перенести подготовленную смесь в микропробирки 0,2 мл в стрипах и запустить на амплификаторе следующую программу (режим нагрева крышки должен быть включен): Transfer the prepared mixture into 0.2 ml microtubes in strips and run the following program on the amplifier (the lid heating mode must be on):

5. Лигирование адаптера У 5. Ligation of the Y adapter

В отдельной микропробирке смешать следующие компоненты: In a separate microtube, mix the following ingredients:

16 sixteen

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

Тщательно перемешать пипетированием. Полученную смесь добавить к 47,1 мкл продукта постлигатной модификации ДНК. Тщательно перемешать пипетированием. Mix thoroughly by pipetting. Add the resulting mixture to 47.1 μl of the post-ligate DNA modification product. Mix thoroughly by pipetting.

Инкубировать в амплификаторе с нагреваемой крышкой при следующих параметрах: Incubate in a thermal cycler with a heated lid with the following parameters:

6. Отмывка продуктов лигирования адаптера Y 6. Washing of adapter Y adapter ligation products

• Перенести продукт лигирования адаптера Y в микропробирку объемом 1 ,5 мл; • Transfer the ligation product of adapter Y into a 1.5 ml microtube;

• К продукту лигирования адаптера Y (65,7 мкл) добавить такой же объем воды деионизированной; • Add the same volume of deionized water to the ligation product of adapter Y (65.7 µl);

• В полученный раствор добавить 0,4 объема раствора магнитных частиц (предварительно перемешав флакон с частицами на вортексе, чтобы получилась взвесь частиц равномерной концентрации); • Add 0.4 volume of a solution of magnetic particles to the resulting solution (having previously mixed the bottle with particles on a vortex mixer to obtain a suspension of particles of uniform concentration);

• Инкубировать при комнатной температуре 5 минут; • Incubate at room temperature for 5 minutes;

• Сбить капли мини-центрифугой/вортексом; • Knock down the drops with a mini-centrifuge / vortex;

• Перенести микропробирки на магнитный штатив; • Transfer the microtubes to a magnetic rack;

• После того как смесь станет прозрачной (на это требуется до 5 минут), нужно осторожно удалить супернатант, не задевая магнитные частицы, которые содержат фрагменты ДНК; • After the mixture becomes clear (this takes up to 5 minutes), carefully remove the supernatant without touching the magnetic particles that contain DNA fragments;

• Добавить 200 мкл 80% этилового спирта; • Add 200 µl of 80% ethyl alcohol;

• Проворачивать микропробирки в магнитном штативе на 180° таким образом, чтобы магнитные частицы пробежали через раствор спирта несколько раз; • Rotate the microtubes 180 ° in the magnetic rack so that the magnetic particles run through the alcohol solution several times;

• Собрать все магнитные частицы на одной стенке микропробирки; • Collect all magnetic particles on one side of the microtube;

• Осторожно удалить этиловый спирт, не задевая магнитные частицы; • Carefully remove ethyl alcohol without touching magnetic particles;

• Проворачивать пробирки в магнитном штативе на 180° таким образом, чтобы магнитные частицы пробежали через раствор спирта несколько раз; • Rotate the tubes 180 ° in a magnetic stand so that the magnetic particles run through the alcohol solution several times;

• Итого получилось две последовательные отмывки ДНК магнитными частицами; • A total of two successive DNA washes with magnetic particles;

• Максимально отобрать микропипеткой остатки раствора спирта; • Take away as much as possible with a micropipette the remaining alcohol solution;

17 17

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) • Оставить сушиться микропробирки с открытой крышкой прямо на магнитном штативе на 2-5 минут, следя за тем, чтобы магнитные частицы не пересушились, но при этом не осталось спирта. SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) • Leave the microtubes with the lid open to dry directly on the magnetic rack for 2-5 minutes, making sure that the magnetic particles do not dry out, but no alcohol remains.

7. ПЦР для индексирования библиотек ДНК баркодами 7. PCR for indexing DNA libraries with barcodes

Смешать в отдельной микропробирке следующие компоненты: Mix the following components in a separate microtube:

Полученную смесь добавить к иммобилизированной на магнитных частицах ДНК. Снять микропробирки с магнитного штатива, тщательно перемешать пипетированием. Add the resulting mixture to the DNA immobilized on magnetic particles. Remove microtubes from the magnetic rack, mix thoroughly by pipetting.

Перенести полученную смесь в пробирки 0,2 мл в стрипах. Transfer the resulting mixture to 0.2 ml tubes in strips.

Запустить индексную ПЦР в амплификаторе по следующей программе: Start index PCR in the thermocycler using the following program:

18 18

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

9. Отмывка продуктов ПЦР 9. Washing of PCR products

После окончания ПЦР необходимо провести очистку библиотек фрагментов ДНК After the end of PCR, it is necessary to purify the libraries of DNA fragments

• Перенести продукт ПЦР в микропробирку объемом 1 ,5 мл; • Transfer the PCR product into a 1.5 ml microtube;

• К продукту ПЦР (~25 мкл) добавить 0,5 объема (13 мкл) раствора магнитных частиц (предварительно перемешав флакон с частицами на вортексе, чтобы получилась взвесь частиц равномерной концентрации); • To the PCR product (~ 25 µl) add 0.5 volume (13 µl) of a solution of magnetic particles (after mixing the vial with particles on a vortex mixer to obtain a suspension of particles of uniform concentration);

• Оставить сушиться микропробирки с открытой крышкой прямо на магнитном штативе на 2-5 минут, следя за тем, чтобы магнитные частицы не пересушились, но при этом не осталось спирта; • Leave the microtubes with the lid open to dry directly on the magnetic stand for 2-5 minutes, making sure that the magnetic particles do not dry out, but no alcohol remains;

• Добавить к подсушенным магнитным частицам 20 мкл Раствора LowT; • Add 20 µl of LowT Solution to the dried magnetic particles;

• Перемешать смесь на вортексе; • Vortex the mixture;

• Оставить инкубироваться на столе на 3-5 минут; • Leave to incubate on the table for 3-5 minutes;

• Осторожно перенести супернатант в новую микропробирку, не задевая магнитных частиц. • Carefully transfer the supernatant to a new microtube, avoiding magnetic particles.

19 nineteen

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Контроль качества библиотек фрагментов ДНК SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Quality control of DNA fragment libraries

Необходимо провести контроль качества полученных библиотек амплифицированных фрагментов ДНК на приборе Agilent Bioanalyzer 2100 с помощью набора High Sensitivity Kit по протоколу производителя (или аналогичном флуоресцентном анализаторе ДНК). It is necessary to control the quality of the obtained libraries of amplified DNA fragments on the Agilent Bioanalyzer 2100 using the High Sensitivity Kit according to the manufacturer's protocol (or an equivalent fluorescence DNA analyzer).

Правильным результатом является пик длин библиотек фрагментов в диапазоне 580-650 п.о. Молярность библиотек в диапазоне 200-1000 п.о. должна составлять не менее 2 наноМ (см. Рис. За). В диапазоне 100-160 п.о. должны отсутствовать пики, свидетельствующие о недостаточной отмывке димеров адаптеров Y. The correct result is a peak in fragment library lengths in the 580-650 bp range. The molarity of the libraries is in the range 200-1000 bp. must be at least 2 nanoM (see Fig. 3a). In the range of 100-160 bp there should be no peaks indicating insufficient washing of Y adapter dimers.

Протокол подготовки библиотек амплифицированных фрагментов ДНК Protocol for the preparation of libraries of amplified DNA fragments

1. Постановка ПЦР Ns1 1. Staging PCR Ns1

В отдельной микропробирке 0,2 мл в стрипах смешать следующие компоненты: Mix the following components in a separate 0.2 ml microtube in strips:

Запустить ПЦР в амплификаторе по следующей программе: Start PCR in the thermocycler using the following program:

20 20

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 2. Очистка продуктов ПЦР N°1 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 2. Purification of PCR products N ° 1

• К продукту ПЦР (~35 мкл) добавить 3 объема (100 мкл) раствора магнитных частиц (предварительно перемешав флакон с частицами на вортексе, чтобы получилась взвесь частиц равномерной концентрации); • Add 3 volumes (100 µl) of a solution of magnetic particles to the PCR product (~ 35 µl) (after mixing the bottle with particles on a vortex mixer to obtain a suspension of particles of uniform concentration);

• Добавить к подсушенным магнитным частицам 21 мкл Раствора LowT; • Add 21 µl of LowT Solution to the dried magnetic particles;

4. Лигирование адаптера Y 4. Ligation of Y adapter

В отдельной микропробирке смешать следующие компоненты:

In a separate microtube, mix the following ingredients:

21 21

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

5. Отмывка продуктов лигирования адаптера Y 5. Washing of adapter Y ligation products

• В раствор добавить 1 ,5 объема (75 мкл) раствора магнитных частиц (предварительно перемешав флакон с частицами на вортексе, чтобы получилась взвесь частиц равномерной концентрации); • Add 1, 5 volume (75 µl) of the solution of magnetic particles to the solution (having previously mixed the bottle with particles on a vortex to obtain a suspension of particles of uniform concentration);

22 22

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) • Добавить 200 мкл 80% этилового спирта; SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) • Add 200 µl of 80% ethyl alcohol;

· осторожно удалить этиловый спирт, не задевая магнитные частицы; · Carefully remove ethyl alcohol, not touching magnetic particles;

· Итого получилось две последовательные отмывки ДНК магнитными частицами; · In total, we got two successive DNA washes with magnetic particles;

• Добавить к подсушенным магнитным частицам 19 мкл Раствора LowT; • Add 19 µl of LowT Solution to the dried magnetic particles;

· Перенести микропробирки на магнитный штатив; · Transfer the microtubes to a magnetic stand;

6. ПЦР для индексирования библиотек ДНК баркодами: 6. PCR for indexing DNA libraries with barcodes:

23 23

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

Отмывка продуктов индексной ПЦР с сайз-селектом Washing of index PCR products with size-select

• Добавить 4 объема (100 мкп) Буфера для промывки SB к 1 объему реакции; • Add 4 volumes (100 µl) of SB Wash Buffer to 1 reaction volume;

• Смешать пипетированием; • Mix by pipetting;

• Перенести смесь на Колонка для сайз-селекга ДНК; • Transfer the mixture to the Column for size-selection DNA;

· Центрифугировать 1 минуту на максимальной скорости; · Centrifuge for 1 minute at maximum speed;

• Перенести колонку в новую Пробирку для центрифугирования; • Transfer the column to a new Centrifuge Tube;

• Добавить 700 мкл 80% этилового спирта; • Add 700 µl of 80% ethyl alcohol;

• Центрифугировать 1 минуту; • Centrifuge for 1 minute;

· Добавить 700 мкл 80% этилового спирта; · Add 700 μl of 80% ethyl alcohol;

• Тем самым, отмывок 80% этиловым спиртом проводится две подряд; • Thus, washing with 80% ethyl alcohol is carried out two in a row;

• Отцентрифугировать колонку на максимальной скорости минуту для удаления остатков этилового спирта; • Centrifuge the column at maximum speed for a minute to remove residual ethyl alcohol;

• Переместить колонку в чистую 1 ,5 мл микропробирку; • Transfer the column to a clean 1.5 ml microtube;

• Добавить20 мкл Раствора LowT прямо на мембрану колонки; • Add 20 µl LowT Solution directly to the column membrane;

• Инкубировать бминут; • Incubate for a minute;

• Центрифугировать 1 мин на максимальной скорости; • Centrifuge for 1 min at maximum speed;

· Вынув колонку из пробирки, отобрать пипеткой весь объём элюата, поставить колонку в эту же микропробирку и вновь внести элюат на колонку; · After removing the column from the test tube, take the entire volume of the eluate with a pipette, put the column in the same microtube and add the eluate to the column again;

• Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут; • Incubate at room temperature for 5 minutes;

• Центрифугировать на максимальной скорости 1 минуту; • Centrifuge at maximum speed for 1 minute;

• Выбросить колонку; • Throw away the column;

24 24

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) • В микропробирке очищенная библиотека амплифицированных фрагментовSUBSTITUTE SHEET (RULE 26) • In a microtube, a purified library of amplified fragments

ДНК. DNA.

Контроль качества библиотек фрагментов ДНК Quality control of DNA fragment libraries

Правильным результатом является пик длин библиотек фрагментов в диапазоне 265-280 п.о. Молярность библиотек в диапазоне 200-1000 п.о. должна составлять не менее 2 наноМ (см. рис. ЗЬ). В диапазоне 100-160 п.о. должны отсутствовать пики, свидетельствующие о недостаточной отмывке димеров адаптеров Y. The correct result is a peak in fragment library lengths in the 265-280 bp range. The molarity of the libraries is in the range 200-1000 bp. should be at least 2 nanoM (see Fig. 3b). In the range of 100-160 bp there should be no peaks indicating insufficient washing of Y adapter dimers.

Секвенирование библиотек фрагментов ДНК и библиотек амплифицированных фрагментов ДНК на lllumina MiSeq. Sequencing of libraries of DNA fragments and libraries of amplified DNA fragments on lllumina MiSeq.

Пулирование образцов. На основании результатов измерения концентрации библиотек ДНК и библиотек фрагментов ДНК необходимо провести три последовательных смешивания: Pouring samples. Based on the results of measuring the concentration of DNA libraries and libraries of DNA fragments, it is necessary to carry out three consecutive mixing:

• Пулирование библиотек фрагментов ДНК. • Population of libraries of DNA fragments.

• Пулирование библиотек амплифицированных фрагментов ДНК. • Pooling libraries of amplified DNA fragments.

• Смешивание пула библиотек фрагментов ДНК и пула библиотек амплифицированных фрагментов ДНК. • Mixing of a pool of libraries of DNA fragments and a pool of libraries of amplified DNA fragments.

Для проведения первого и второго пулирования необходимо смешать все библиотеки соответствующего типа эквимолярно. Значения молярности можно определять на приборе Agilent Bioanalyzer 2100 с набором High Sensitivity DNA kit или аналогичном оборудовании и реактивах в диапазоне 200-1000 п.о. Предлагается следующая схема: To perform the first and second pooling, it is necessary to mix all libraries of the corresponding type equimolarly. Molarity values can be determined on an Agilent Bioanalyzer 2100 with a High Sensitivity DNA kit or similar equipment and reagents in the 200-1000 bp range. The following scheme is proposed:

• Определить библиотеку, имеющую наибольшее значение молярности [Х_т наноМ]; • Determine the library with the highest molarity value [X _t nanoM];

. Рассчитать, во сколько раз каждая из остальных библиотек того же типа меньше значения X. Обозначим это значение U,; ... Calculate how many times each of the other libraries of the same type is less than the value of X. Let's denote this value by U ,;

• Смешать по объемам все библиотеки одного типа в одной микропробирке. Объемная доля рассчитывается как Cp/U,. На основании этой пропорции и проводится пулирование: • Mix by volume all libraries of the same type in one microtube. The volume fraction is calculated as Cp / U ,. Based on this proportion, the pooling is carried out:

• Итоговая концентрация пула определяется по формуле Xm/£Yr, • The final concentration of the pool is determined by the formula Xm / £ Yr,

Смешивание пула библиотек фрагментов ДНК и пула библиотек амплифицированных фрагментов ДНК проводится в пропорции 100/1 (на 100 объемов пула библиотеки фрагментов ДНК берется один объем пула библиотек амплифицированных фрагментов). Mixing of the pool of libraries of DNA fragments and the pool of libraries of amplified DNA fragments is carried out in a proportion of 100/1 (for 100 volumes of the pool of the library of DNA fragments, one volume of the pool of libraries of amplified fragments is taken).

Разведение аликвот всех компонентов проводится Раствором LowT. Dilution of aliquots of all components is carried out with LowT Solution.

25 25

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Оптимальную концентрацию конечной (денатурированной, готовой к секвенированию) смеси пулов можно определять для каждого прибора lllumina MiSeq индивидуально. Практика показывает, что она лежит в диапазоне 8-13 пикоМ. SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The optimum concentration of the final (denatured, ready to sequencing) pool mix can be determined individually for each lllumina MiSeq instrument. Practice shows that it lies in the range of 8-13 picoM.

Денатурацию и разведение смеси пулов непосредственно перед запуском секвенирования рекомендуется проводить по инструкции производителя lllumina MiSeq: “MiSeq System. Denature and Dilute Libraries Guide” под номером 15039740, расположенную по ссылке https://support.illumina.com/content/dam/illumina- support/documents/documentation/system_documentation/miseq/miseq-denature-dilute- libraries-guide-15039740-06.pdf It is recommended to denaturation and dilution of the mixture of pools immediately before starting sequencing according to the manufacturer's instructions lllumina MiSeq: “MiSeq System. Denature and Dilute Libraries Guide ”under number 15039740, located at https://support.illumina.com/content/dam/illumina- support / documents / documentation / system_documentation / miseq / miseq-denature-dilute- libraries-guide-15039740 -06.pdf

Обслуживание lllumina MiSeq после и между запусками секвенирования рекомендуется проводить по инструкции производителя MiSeq System Guide for Local Run Manager под номером 15027617, расположенную по ссылке https://support.illumina.com/content/dam/illumina- support/documents/documentation/system documentation/miseq/miseq-system-guide-for-local- run-manaqer-t 5027617-04.pdf It is recommended to maintain lllumina MiSeq after and between sequencing runs according to the manufacturer's instructions MiSeq System Guide for Local Run Manager under the number 15027617 located at https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support / documents / documentation / system documentation / miseq / miseq-system-guide-for-local- run-manaqer-t 5027617-04.pdf

Учет результатов реакции. Accounting for the results of the reaction.

1. Для всех образцов в зависимости от типа библиотеки рассчитывается ряд биоинформатических метрик (количество сырых ридов, количество картированных ридов, Q20, Q30, доля фетальной фракции, количество информативных для оценки доли фетальной фракции SNP, полезная эффективность данных библиотеки фрагментов ДНК), на основании которых программа принимает решение о качестве проведенного анализа. В случае обнаружения проблемы соответствующий образец имеет маркировку «Bioinformatic QC failed» в отчете; 1. For all samples, depending on the type of library, a number of bioinformatics metrics are calculated (the number of raw reads, the number of mapped reads, Q20, Q30, the proportion of the fetal fraction, the number of SNPs informative for assessing the proportion of the fetal fraction, the useful efficiency of the DNA fragments in the library), based on which the program decides on the quality of the analysis. If a problem is found, the corresponding sample is labeled "Bioinformatic QC failed" on the report;

2. Обработка выходных файлов с секвенатора в формате fastq.gz, а также учет и интерпретация результатов секвенирования проводится с помощью программного обеспечения «НИПТ-аналитика» версии не менее 1.0; 2. Processing of the output files from the sequencer in the fastq.gz format, as well as accounting and interpretation of the sequencing results is carried out using the NIPT-analytics software version at least 1.0;

3. Для всех образцов программа рассчитывает долю фетальной ДНК во внДНК и выдает ее значение в отчете; 3. For all samples, the program calculates the proportion of fetal DNA in cfDNA and gives its value in the report;

4. Для всех образцов программа рассчитывает наличие анеуплоидий по хромосомам, входящим в данный вариант исполнения набора (21 или 13, 18, 21 или 13, 18, 21 , X, Y) и выдает ответ о наличии в отчете; 4. For all samples, the program calculates the presence of aneuploidies for chromosomes included in this version of the set (21 or 13, 18, 21 or 13, 18, 21, X, Y) and gives an answer about the presence in the report;

5. Для всех образцов, не прошедших контроль качества по доле фетальной внДНК, программа выдает отчет о непрохождении контроля качества в связи с низкой долей фетальной ДНК. 5. For all samples that did not pass quality control for the proportion of fetal cfDNA, the program issues a report on the failure of quality control due to a low proportion of fetal DNA.

26 26

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Пример осуществления предсказания хромосомных аномалий. SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) An example of the implementation of the prediction of chromosomal abnormalities.

В данном примере авторами решались следующие задачи: 1 ) предсказать трисомию по хромосомам 13, 18, 21 ; 2) определить пол ребенка; 3) предсказать долю фетальной ДНК; 4) оценить минимально необходимое количество данных. In this example, the authors solved the following problems: 1) predict trisomy by chromosomes 13, 18, 21; 2) determine the sex of the child; 3) predict the proportion of fetal DNA; 4) estimate the minimum required amount of data.

Предобработка данных: было проведено маскирование с помощью списка надёжных регионов из базы 1000 Genomes. Data preprocessing: masking was carried out using a list of reliable regions from the 1000 Genomes database.

Статистическая обработка данных: Statistical data processing:

Из контрольной выборки объемом 154 образца было взято 78 образцов с долей фетальной ДНК, превышающей 4%, а также имеющих не менее чем 2,5 млн фильтрованных фрагментов на образец (см ниже). From a control sample of 154 samples, 78 samples were taken with a proportion of fetal DNA exceeding 4%, as well as having at least 2.5 million filtered fragments per sample (see below).

Доля внеклеточной фетальной ДНК была подсчитана методом, основанным на глубоком прочтении нескольких полиморфизмов (SNP), по которым мать гомозиготна, а ребёнок гетерозиготен. Сравнение с работающим для мальчиков методом, основанным на количестве прочтений Y хромосомы, показано на Рис. 8, на котором можно увидеть хорошую корреляцию результатов. The proportion of extracellular fetal DNA was calculated by a method based on deep reading of several polymorphisms (SNPs) for which the mother is homozygous and the child is heterozygous. Comparison with the Y-chromosome read method for boys is shown in Fig. 8, where you can see a good correlation between the results.

Для обработки данных использовалась библиотека NIPTeR языка R. Количество фрагментов генома подсчитали на участках в 50 000 п.о. для каждого образца. Полученные суммы характеризуют интенсивность прочтений участков хромосом (Рис. 4). For data processing, the NIPTeR library of the R language was used. The number of genome fragments was counted in 50,000 bp regions. for each sample. The sums obtained characterize the intensity of the readings of the chromosome sections (Fig. 4).

После этого была проведена GC-коррекция, то есть внесена поправка на регионы с повышенным количеством G-С связей, с которых удаётся считывать меньшее количество фрагментов. Следующим шагом проведена поправка на выбросы. Был использован метод, основанный на отбрасывании пиков с помощью квантилей, так и процедура уменьшения вариации, основанная на критерии хи-квадрат. При каждом запуске программы подсчёта статистики контрольная выборка формировалась случайным образом из подвыборки не имеющих трисомии образцов. Алгоритм обучался на такой выборке и определял трисомию у оставшихся образцов. Многократный запуск программы позволяет судить о качестве выбранного метода. Всего было проделано 200 симуляций. After that, a GC correction was carried out, that is, an amendment was made for regions with an increased number of GC bonds, from which fewer fragments could be read. The next step is the correction for outliers. A method based on rejection of peaks using quantiles and a procedure for reducing variation based on the chi-square test were used. At each start of the program for calculating statistics, the control sample was formed randomly from a subsample of samples without trisomy. The algorithm was trained on such a sample and determined trisomy in the remaining samples. Multiple launch of the program allows you to judge the quality of the selected method. A total of 200 simulations were performed.

Результаты расчета чувствительности, специфичности и AUC для каждой анеуплоидии и всех вместе представлены в Таблице 1 (в скобках указано значение стандартного отклонения). The results of calculating the sensitivity, specificity and AUC for each aneuploidy and all together are presented in Table 1 (the standard deviation value is indicated in parentheses).

Таблица 1. Table 1.

27 27

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Результаты расчета Z статистики по 13, 18 и 21 хромосоме для контрольной выборки образцов представлены на рис. 5 (а, Ь, с) соответственно. Видно, что во всех трех вариантоах образцы с нормальным и анеуплоидным кариотипом располагаются под и над пороговым значением (Z=3). SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The results of calculating Z statistics for 13, 18, and 21 chromosomes for the control sample of samples are shown in Fig. 5 (a, b, c), respectively. It can be seen that in all three variants the samples with normal and aneuploid karyotypes are located below and above the threshold value (Z = 3).

С целью выяснить, будет ли алгоритм работать при сокращении числа прочтений генома, авторы отбрасывали часть фрагментов и повторяли эксперимент на неполных данных. Результат не претерпевает серьёзных ухудшений при уменьшении количества данных в 2 раза (Рис. 6). Таким образом, порогом по количеству прошедших все фильтры и поправки значений авторы приняли цифру в 2,5 млн фрагментов на 1 образец. In order to find out whether the algorithm would work when reducing the number of genome reads, the authors discarded some of the fragments and repeated the experiment on incomplete data. The result does not undergo serious deterioration when the amount of data is reduced by 2 times (Fig. 6). Thus, the authors took the figure of 2.5 million fragments per sample as the threshold for the number of values that passed all filters and corrections.

На рис. 7 (а, Ь, с) представлены результаты построения ROC-кривой для определения анеуплоидии 13, 18 и 21 хромосом в контрольной выборке образцов. In fig. 7 (a, b, c) shows the results of constructing an ROC-curve to determine aneuploidy of 13, 18 and 21 chromosomes in the control sample of samples.

Для определения пола ребёнка авторы подсчитали у образцов нормализованное количество прочтений на Y хромосоме и нашли соотношение количества фрагментов с X хромосомы к количеству фрагментов аутосомных хромосом (Рис. 9). Ошибка происходила на двух образцах - это мальчики, у которых нет достаточного количества прочтений на Y хромосоме. To determine the sex of the child, the authors calculated the normalized number of readings on the Y chromosome in the samples and found the ratio of the number of fragments from the X chromosome to the number of fragments of autosomal chromosomes (Fig. 9). The error occurred on two samples - these are boys who do not have enough readings on the Y chromosome.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения. Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that the specific cases described in detail are provided for purposes of illustration only and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention. It should be understood that various modifications are possible without departing from the spirit of the present invention.

28 28

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ CLAIM

1. Способ подготовки внеклеточной ДНК из образца крови беременной женщины к секвенированию для диагностики анеуплоидии плода, включающий следующие стадии: a) получают образец материнской крови, состоящий из цельной крови, или плазмы крови, или сыворотки крови, при этом для образца, состоящего из цельной крови, отделяют плазму крови и используют ее для последующих стадий; 1. A method of preparing extracellular DNA from a blood sample of a pregnant woman for sequencing for the diagnosis of fetal aneuploidy, comprising the following steps: a) obtaining a sample of maternal blood consisting of whole blood, or blood plasma, or blood serum, while for a sample consisting of whole blood, separate the blood plasma and use it for subsequent stages;

B) выделяют из указанного образца крови внеклеточную ДНК; B) extracellular DNA is isolated from the specified blood sample;

c) осуществляют фрагментацию выделенной внеклеточной ДНК, получая в результате размер ДНК-фрагментов от 30 до 100 пар оснований со средним размером около 40 пар оснований; c) performing fragmentation of the isolated extracellular DNA, resulting in the size of DNA fragments from 30 to 100 base pairs with an average size of about 40 base pairs;

d) отбирают фрагменты ДНК длиной между 35 и 45 пар оснований; d) select DNA fragments between 35 and 45 base pairs;

e) осуществляют случайное лигирование отобранных на стадии d) фрагментов ДНК друг с другом для формирования химерных линейных молекул ДНК размером более 100 пар оснований; e) randomly ligating the DNA fragments selected in step d) to each other to form chimeric linear DNA molecules of more than 100 base pairs;

f) осуществляют лигирование адаптерных последовательностей, специфических для используемого в дальнейшем метода секвенирования, к химерным линейным молекулам ДНК для создания библиотек химерных линейных молекул ДНК; д) проводят ПЦР для индексирования библиотек химерных линейных молекул ДНК уникальными последовательностями баркодов. f) ligation of adapter sequences specific for the sequencing method used hereinafter to chimeric linear DNA molecules to create libraries of chimeric linear DNA molecules; e) carry out PCR to index libraries of chimeric linear DNA molecules with unique barcode sequences.

2. Способ по п. 1 , характеризующийся тем, что фрагментацию очищенной внеклеточной ДНК на стадии с) осуществляют с помощью ферментов и без обработки ДНК ультразвуком. 2. The method according to claim 1, characterized in that the fragmentation of the purified extracellular DNA in step c) is carried out using enzymes and without sonication of the DNA.

3. Способ определения анеуплоидии плода с помощью анализа внеклеточной ДНК из крови беременной женщины методом секвенирования, включающий следующие стадии: а) подготавливают внеклеточную ДНК из образца крови беременной женщины по п.1 ; 3. A method for determining fetal aneuploidy by analyzing extracellular DNA from the blood of a pregnant woman by sequencing, including the following stages: a) prepare extracellular DNA from a blood sample of a pregnant woman according to claim 1;

б) осуществляют секвенирование образованных библиотек химерных линейных молекул ДНК одним из методов массового параллельного секвенирования, получая множество чтений; b) sequencing the generated libraries of chimeric linear DNA molecules by one of the methods of massive parallel sequencing, obtaining multiple readings;

в) осуществляют картирование полученных чтений на референсный геном человека для определения присутствия в чтениях участков хромосом человека; c) carry out the mapping of the received readings on the reference human genome to determine the presence of sections of human chromosomes in the readings;

г) определяют количество участков последовательностей ДНК в чтениях, соответствующих разным хромосомам человека, при этом исключают участки, которые являются неуникальными для отдельных хромосом генома человека; d) determine the number of sections of DNA sequences in readings corresponding to different human chromosomes, while excluding sections that are non-unique for individual chromosomes of the human genome;

д) определяют наличие анеуплоидии по определенной хромосоме при обнаружении отличий в нормализованной на длину хромосомы представленности этой хромосомы от среднего значения по геному. e) determine the presence of aneuploidy for a certain chromosome upon detection of differences in the representation of this chromosome normalized to the length of the chromosome from the average value for the genome.

4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что классификация представленности отдельных хромосом производится на основании z-статистики, вычисленной в регрессионной модели, и порогового значения z_0, равного 3. 4. The method according to claim 3, characterized in that the classification of the representation of individual chromosomes is based on the z-statistic calculated in the regression model and the threshold value z_0 equal to 3.