WO2020149712A1 - 암 치료용 조성물 - Google Patents

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WO2020149712A1
WO2020149712A1 PCT/KR2020/000898 KR2020000898W WO2020149712A1 WO 2020149712 A1 WO2020149712 A1 WO 2020149712A1 KR 2020000898 W KR2020000898 W KR 2020000898W WO 2020149712 A1 WO2020149712 A1 WO 2020149712A1
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cancer
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immune checkpoint
checkpoint inhibitor
anticancer
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김태훈
박전의
김지혜
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오토텔릭바이오 주식회사
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for anticancer. More specifically, the present invention is TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (Targeting Anti-Sense Oligonucleotide) 5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3' (hereinafter TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide having this sequence "TASO” It refers to a pharmaceutical composition for anticancer, especially a solid cancer therapeutic composition comprising an immune checkpoint inhibitor (immune checkpoint inhibitor).
  • the targeted treatment anti-cancer drugs have become the mainstay of the development of anti-cancer drugs to improve these problems. It is known that the targeted treatment anticancer agent selectively attacks only specific target factors during the carcinogenic process and does not attack normal cells, so the pain to the patient is less than that of the existing cytotoxic anticancer agent.
  • the present invention is to improve the drug response rate of the immune checkpoint inhibitor to provide an anti-cancer agent composition that enhances the anti-cancer effect.
  • the present invention is to improve the anticancer effect by improving the drug response rate of the immune checkpoint inhibitor, a TGF- ⁇ 2 inhibitor TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') (TASO) and an immune checkpoint inhibitor It is for treating cancer by a combination administration of.
  • the present invention provides a combination composition for anticancer comprising a TGF- ⁇ inhibitor and an immune checkpoint inhibitor.
  • the present invention provides a combination composition for anti-cancer comprising a TGF- ⁇ inhibitor TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') and an immune checkpoint inhibitor.
  • TGF- ⁇ The expression of TGF- ⁇ in the tumor performs a comprehensive immune suppression function.
  • Immune checkpoints such as PD-1 and PD-L1 are responsible for some of the comprehensive immunosuppressions, and thus, to the immune checkpoints of PD-1 and PD-L1 without removing TGF- ⁇ . Attempts to restore immune function by using an anti-cancer drug as an anti-cancer agent work only partially, but do not fully restore the cell death function of the immune system.
  • TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide 5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3' (SEQ ID NO: 1) is a known synthetic 18-mer phosphorothioate antisense oligonucleotide specially designed for targeting human TGF- ⁇ 2, TGF - ⁇ inhibitor.
  • the anti-cancer effect is significantly enhanced by the combination administration of a TGF- ⁇ inhibitor and an immune checkpoint inhibitor.
  • the anticancer agent composition according to the present invention significantly enhances the anticancer effect.
  • FIG. 2 shows the results of quantitative analysis of TGF- ⁇ 2 protein secreted from various cancer cell lines.
  • 3 to 7 show the results of the growth inhibition analysis of various cancer cell lines according to TASO alone treatment.
  • 8 to 17 are graphs showing amounts of PD-L1 protein and antibody control IgG expressed on the surface of various solid cancer cell lines.
  • kitruda and TASO show cell killing effects by combination administration of kitruda and TASO in breast cancer cell lines, skin cancer cell lines, lung cancer cell lines, and colon cancer cell lines, respectively.
  • 22 and 23 show the cell death effect by the combination administration of honey and TASO in breast cancer cell line and skin cancer cell line, respectively.
  • 24 and 25 show the results of measuring the tumor size of skin cancer and the tumor size of breast cancer in humanized NSG mice, respectively.
  • the present invention relates to a combination composition for anticancer comprising a TGF- ⁇ inhibitor and an immune checkpoint inhibitor.
  • the present invention relates to a combination composition for anti-cancer comprising a TGF- ⁇ inhibitor TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') and an immune checkpoint inhibitor.
  • Inhibitors that can be used in the present invention include PD-L1 antibody Tecentriq (common name Atezolizumab), Impinze (common name Duvalumab), PD-1 antibody Keytruda (common name pembrolizumab), Opdivo (common name nivolumab), CTLA-4 antibody Yervoy (common name ipilimumab) and the like can be used Can.
  • PD-L1 antibody Tecentriq common name Atezolizumab
  • Impinze common name Duvalumab
  • PD-1 antibody Keytruda common name pembrolizumab
  • Opdivo common name nivolumab
  • CTLA-4 antibody Yervoy common name ipilimumab
  • TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') and immune checkpoint inhibitor of the anticancer composition of the present invention may be administered simultaneously, sequentially, or separately.
  • the present invention relates to a composition for anti-cancer containing TASO and co-administered with an immune checkpoint inhibitor.
  • the present invention relates to an anti-cancer composition for use in combination with TASO, containing an immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 antibody or a PD-L1 antibody (e.g., pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab or duvalumab, etc.), or a CTLA-4 antibody (e.g. , Ipilimumab, etc.).
  • a PD-1 antibody or a PD-L1 antibody e.g., pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab or duvalumab, etc.
  • CTLA-4 antibody e.g. , Ipilimumab, etc.
  • composition of the present invention can be used to treat solid cancer such as breast cancer (especially triple negative breast cancer (estrogen, progesterone, breast cancer negative for HER2)), colorectal cancer, pancreatic cancer, lung cancer or melanoma.
  • solid cancer such as breast cancer (especially triple negative breast cancer (estrogen, progesterone, breast cancer negative for HER2)
  • colorectal cancer pancreatic cancer
  • lung cancer or melanoma.
  • TGF- ⁇ mRNA expression was confirmed in various solid cancer cell lines, protein secretion was confirmed, and TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') treatment was performed in various solid cancer cell lines.
  • TGF- ⁇ 2 secretion by apoptosis and apoptosis effect Inhibition of TGF- ⁇ 2 secretion by apoptosis and apoptosis effect, PD-L1 expression in various solid cancer cell lines, and TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide in solid cancer cell lines with high TGF- ⁇ expression (5' -CGGCATGTCTATTTTGTA-3') alone and in combination treatment with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) co-cultured with Keytruda (PD-1 antibody) or Yervoy (CTLA-4 antibody) The cancer cell death effect was confirmed.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') and the immune checkpoint inhibitor may be administered sequentially or simultaneously, or may be administered in combination by individually administered methods. Therefore, when administering the composition of the present invention, each component is simultaneously present in a therapeutically effective amount in vivo, thereby synergistic with each other.
  • composition of the present invention may be administered to the human body by oral administration or parenteral administration (for example, injection).
  • RPMI 1640 (10% FBS, Antibiotic-Antimycotic, HEPES), DMEM (10% FBS, Antibiotic-Antimycotic), Alpha-MEM (10% FBS, Antibiotic-Antimycotic) or McCoy's 5A ( A medium such as 10% FBS, Antibiotic-Antimycotic) was used, and the cells were cultured in a 37°C, CO 2 5.0% environment.
  • RNA was purified using RNA prep kit (Qiagen) in each of the cell lines 1x10 7 of Table 1 above, and then 1 ⁇ g of purified RNA was used as a template, and TGF- ⁇ 2 (GCGAAGGCAGCAATTATGCTG) specific primer (specific primer) ) Using the RT-premix (Bioneer) cDNA synthesis kit, cDNA was synthesized at 37° C. for 1 hour.
  • PCR was performed on 10 ⁇ l of cDNA using only F-primer of TGF- ⁇ 2 F (ATCGATGGCACCTCCACATATG), R (GCGAAGGCAGCAATTATGCTG) (Denaturation 95° C. 1 min, Annealing 57° C. 1 min, Extension 72° C. 1 min, 35 cycles and Final Extension 72°C 5 min). Thereafter, mRNA expression for TGF- ⁇ 2 on the cells was confirmed using the band intensity of TGF- ⁇ 2 compared to the PCR results for GAPDH.
  • F-primer of TGF- ⁇ 2 F ATCGATGGCACCTCCACATATG
  • R GCGAAGGCAGCAATTATGCTG
  • each cell line 2 ⁇ 10 6 is prepared in a 6-well plate (SPL Lifesciences, Pocheon).
  • TASO was adjusted to an amount such that the final concentrations were 0, 20nM, 40nM, 80nM, and 160nM and placed in a medium without FBS.
  • a transfection reagent Lipofectamine 2000 (Invitrogen, California, USA) was added and stabilized at room temperature for 5 minutes.
  • the medium mixture containing TASO and the medium containing the transfection reagent were mixed so that the final concentrations of TASO were 0, 20 nM, 40 nM, 80 nM, and 160 nM, and reacted at room temperature for 20 minutes. Subsequently, the cells were dispensed into cell lines prepared the previous day, and cultured for 2 days at 37°C and 5% CO 2 conditions. After 2 days, only the culture supernatant was recovered and quantified TGF- ⁇ 2 using Quantikine TGF- ⁇ 2 ELISA (R&D Systems) kit.
  • FIG. 2 shows the results of quantitative analysis of TGF- ⁇ 2 protein secreted extracellularly for various cancer cell lines by ELISA.
  • TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') transfection
  • Each cell line was seeded as shown in Table 2 below, followed by incubation at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours:
  • TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') is diluted in serum free media to a predetermined concentration (culture A).
  • Lipofectamine 2000 is added to the serum-free culture medium in a predetermined amount under the experimental conditions shown in Table 2 above (culture B). After reacting the culture medium A and the culture medium B at room temperature for 5 minutes, the culture medium A and B are mixed and reacted again at room temperature for 20 minutes. After replacing the cell culture medium with 10% FBS culture medium, a mixture of the culture mediums A and B after the reaction is added to the cell culture medium.
  • the activity of the cells was measured with an O.D 450nm value using EZCYTOX (purchased from Daeil Lab Service), and the cytotoxicity analysis was performed based on the results.
  • 3 to 7 is a result of analyzing the growth inhibition in cancer cell lines according to TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') alone treatment with EZCYTOX. It can be confirmed that there is a difference in sensitivity to TASO for each cell line.
  • 8 to 17 are graphs showing the amount of PD-L1 protein expressed on the surface of various solid cancer cell lines.
  • Experimental Example 4 Cell killing effect test by combination of Kitruda and human PBMC with TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') in solid cancer cell lines of lung cancer, breast cancer, skin cancer and colon cancer
  • TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') transfection
  • the target cell lines are seeded as shown in the table below, and then cultured for 24 hours.
  • A TASO is diluted to serum-free media at a desired concentration to prepare culture A.
  • B Lipofectamine 2000 is added to a serum-free medium in an amount determined according to the experimental conditions shown in the table below to prepare culture B. After the cultures (A) and (B) were reacted at room temperature for 5 minutes each, (A) and (B) were mixed and reacted again at room temperature for 20 minutes. After replacing the cell culture medium with 10% FBS media, the reaction (A) and (B) are added to the culture medium.
  • Kitruda is prepared at 100 ⁇ l at a concentration of 20 ⁇ g/ml.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • T cancer cells
  • E 100: 1 to prepare a ratio of 1: 10, mixed with kitruda and reacted for 20 minutes at room temperature. Subsequently, 200 ⁇ l of the medium is removed from the cancer cell well.
  • the medium of each well is carefully pipetted three times to resuspend the PBMC, and then the medium and the PBMC are removed as much as possible using a pipette.
  • the medium: EZCYTOX solution is mixed at a ratio of 100:1, added to the wells, and incubated at 37°C for 1 hour.
  • the activity of the cells was measured with a value of 450 nm of O.D. (Activity here is the rate at which metabolism of cancer cells alone is considered as 1, and based on this, the rate at which metabolism decreases due to cell death after drug treatment) was measured.
  • Experimental Example 5 Cell death effect test by using honey and human PBMC and TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') in breast cancer cell line and melanoma cell line
  • NSG humanized mouse model NSG (NSC immuno-deficiency mice, NOD SCID gamma mouse)
  • TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide 5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3'
  • kitruda PD- 1 antibody
  • the experimental method is as follows: On the first day of the experiment, PBMC (1 ⁇ 10 7 ) of a human blood donor is intravenously administered to a humanized mouse NSG (NSG). A2058 melanoma (2x10 6 ) cell line is inoculated 7 days after the start of the experiment. When cancer cells are 50-100 mm 3 in size, TASO is administered intraperitoneally at 16 mg/kg or 8 mg/kg every other day until the end of the experiment. Kitruda is administered intraperitoneally until the end of the experiment at a frequency of 100 ug/maritime twice a week. As a control group, a negative control group (NC), no PBMC, no PBMC, only PBMC, only Kitruda, and only TASO were used (each experimental group and control group are mice. 6).
  • NC negative control group
  • TNBC triple negative breast cancer cell line
  • NSG humanized mouse model NSG (NSC immuno-deficiency mice, NOD SCID gamma mouse)
  • TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide 5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3'
  • honey CLA-4 antibody
  • the experimental method is as follows: On the first day of the experiment, MDA-MB-231 triple negative breast cancer (TNBC) is prepared and inoculated into a humanized mouse NSG. TASO (32 mg/kg each time) is administered intraperitoneally on the 2nd, 4th, 6th, 8th and 10th days after the start of the experiment. PBMC (1 ⁇ 10 7 ) of human blood donor is administered intravenously on Day 11, and honey is administered intraperitoneally on Days 11, 16, and 21 (10 mg/kg administered on Day 11, 5 mg each on Days 16 and 21) /kg dose).
  • TNBC triple negative breast cancer
  • NC negative control group
  • tumor volumes were measured on the 8th, 10th, 13th, 15th, 17th, 20th, and 22nd days, respectively.
  • tumor volumes were measured at 11, 15, 19, and 24 days after inoculation, respectively. Tumor volume was measured using a caliper.
  • TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-) compared to TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') alone or immunosuppressant inhibitor alone. It can be seen that when the combination of 3') and the immune checkpoint inhibitor is administered, the cell apoptosis effect or cancer cell suppression effect of cancer cells is significantly exhibited.
  • the anticancer effect may be low due to the drug response rate.
  • the immune checkpoint inhibitor is used in combination with TGF- ⁇ 2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3'), the anticancer effect is significantly increased. Can be improved.
  • composition of the present invention can be used for anticancer treatment.

Abstract

TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 및 면역관문 억제제를 포함하는 항암용 배합 조성물을 개시한다.

Description

암 치료용 조성물
본 발명은 항암용 의약 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드(Targeting Anti-Sense Oligonucleotide) 5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3' (이하에서는 이러한 서열을 갖는 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드를 "TASO"라고 칭한다)과 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 포함하는 항암용 의약 조성물, 특히 고형암 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
기존의 세포독성 항암제는 암세포뿐만 아니라 정상세포까지 공격하는 문제가 있기 때문에, 이러한 문제를 개선하기 위하여 표적치료 항암제가 항암치료제 개발의 주를 이루게 되었다. 표적치료 항암제는 발암 과정 중 특정 표적 인자만 선택적으로 공격하고, 정상세포는 공격하지 않기 때문에, 환자에게 가해지는 고통은 기존 세포독성 항암제보다 적은 것으로 알려져 있다.
그러나, 이러한 표적치료 항암제 또한 투여 후에 내성이 생기는 단점이 발견되었다. 이러한 표적치료 항암제의 단점을 극복하면서 항암치료를 통한 생존기간을 연장시키기 위하여, 면역항암제가 항암치료제 개발의 핵심으로 부상하고 있다.
하지만, 최근 급격히 성장하고 있는 면역관문 억제제 시장에 있어서 반응률이 문제로 떠오르고 있다. 예를 들어, 로슈-제넨테크 사의 PD-L1 계열 면역항암제인 테센트릭(tecentriq: 일반명은 아테졸리주맙 (Atezolizumab))은 임상에서 약물 반응률이 20%에 그치고 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 면역관문 억제제의 약물 반응률을 개선하여 항암 효과를 증진시킨 항암제 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 면역관문 억제제의 약물 반응률을 개선하여 항암 효과를 증진시키기 위한 것으로서, TGF-β2 억제제인 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3')(TASO)과 면역관문 억제제의 병용 투여에 의하여 암을 치료하기 위한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 TGF-β 억제제 및 면역관문 억제제를 포함하는 항암용 배합 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 TGF-β 억제제인 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 및 면역관문 억제제를 포함하는 항암용 배합 조성물을 제공한다.
종양에서 TGF-β의 발현은 포괄적 면역 억제 기능을 수행한다.
PD-1, PD-L1 등의 면역관문 (immune checkpoint)들은 포괄적 면역 억제 중 일부의 역할을 담당하고 있으며, 따라서 TGF-β를 제거하지 않은 상태에서 PD-1 및 PD-L1 등의 면역관문에 대한 억제제를 면역항암제로 사용하여 면역 기능을 회복하고자 하는 시도는 부분적으로만 작동할 뿐, 면역 체계의 세포 사멸 기능을 완전히 복구하지 못한다.
TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3' (서열번호 1)는 인간 TGF-β2를 표적으로 특별히 고안된 공지의 합성 18-mer 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 안티센스 올리고 뉴클레오타이드로서, TGF-β 억제제이다.
본 발명에서는 TGF-β 억제제 및 면역관문 억제제를 병용 투여함으로써 항암 효과를 현저하게 증진시킨다.
본 발명에 따른 항암제 조성물은 항암 효과를 현저하게 증진시킨다.
도 1은 TGF-β2 mRNA의 정량 분석 및 상대적 정성 분석 결과를 도시한 것이다.
도 2는 다양한 암 세포주에서 분비되는 TGF-β2 단백질의 정량 분석 결과를 도시한 것이다.
도 3 내지 도 7은 TASO 단독 처리에 따른 다양한 암세포주의 성장 억제 분석 결과를 도시한 것이다.
도 8 내지 도 17은 다양한 고형암 세포주 표면에서 발현된 PD-L1 단백질 및 항체 대조군인 IgG의 양을 도시한 그래프이다.
도 18 내지 도 21은 각각 유방암 세포주, 피부암 세포주, 폐암 세포주, 대장암 세포주에서의 키트루다 및 TASO 병용 투여에 의한 세포 사멸 효과를 도시한 것이다.
도 22 및 도 23은 각각 유방암 세포주 및 피부암 세포주에서의 여보이 및 TASO 병용 투여에 의한 세포 사멸 효과를 도시한 것이다.
도 24 및 도 25는 각각 인간화 NSG 마우스에서의 피부암의 종양 크기 및 유방암의 종양 크기를 측정한 결과를 도시한 것이다.
본 발명은 TGF-β 억제제 및 면역관문 억제제를 포함하는 항암용 배합 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 TGF-β 억제제인 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 및 면역관문 억제제를 포함하는 항암용 배합 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 사용될 수 있는 면역관문 억제제로는 PD-L1 항체인 테센트릭 (Tecentriq; 일반명 아테졸리주맙(Atezolizumab)), 임핀지 (Imfinze; 일반명 두발루맙(Durvalumab)), PD-1 항체인 키트루다 (Keytruda; 일반명 펨브롤리주맙(pembrolizumab)), 옵디보 (Opdivo; 일반명 니볼루맙(nivolumab)), CTLA-4 항체인 여보이 (Yervoy; 일반명 이필리무맙(ipilimumab)) 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 항암 조성물의 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 및 면역관문 억제제는 동시에 투여되거나, 순차적으로 투여되거나, 개별적으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 TASO를 함유하며, 면역관문 억제제와 병용투여하기 위한 항암용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 면역관문 억제제를 함유하며, TASO와 병용투여하기 위한 항암용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물에서, 면역관문 억제제로는 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체 (예를 들어, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙 또는 두발루맙 등)이거나, CTLA-4 항체(예를 들어, 이필리무맙 등)가 사용된다.
본 발명의 조성물은, 유방암 (특히, 삼중 음성 유방암(에스트로겐, 프로게스테론, HER2에 대하여 음성인 유방암)), 대장암, 췌장암, 폐암 또는 흑색종 등과 같은 고형암을 치료하는데 사용될 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 사상이나 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물의 고형암에 대한 항암효과를 확인하기 위하여, 마우스 고형암 모델에서 TGF-β 억제제인 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3')와 면역관문 억제제의 병용에 의한 인비트로(in-vitro) 및 인비보(in-vivo) 항암효과를 확인하기 위한 실험을 실시하였다.
이를 위하여, 다양한 고형암 세포주들에서 TGF-β mRNA 발현양을 확인하고, 단백질 분비량을 확인하였으며, 다양한 고형암 세포주들에서 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 단독 처리에 의한 TGF-β2 분비량 억제 및 세포사멸 효과를 확인하고, 다양한 고형암 세포주들에서 PD-L1의 발현을 확인하고, TGF-β 발현이 높은 고형암 세포주들에서 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 단독 처리 및 키트루다 (Keytruda)(PD-1 항체) 또는 여보이 (Yervoy)(CTLA-4 항체)와 동시 배양한 PBMC(말초혈액 단핵구: peripheral blood mononuclear cell)와의 병용 처리에서의 암세포의 사멸 효과를 확인하였다.
본 발명의 조성물 투여시 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 및 면역관문억제제는 순차적으로 또는 동시에 투여되거나 개별적으로 투여되는 방법으로 병용 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물 투여시 각 성분은 생체 내에서 치료학적 유효량으로 동시에 존재하여 서로 상승 효과를 나타내게 된다.
본 발명의 조성물은 인체에 경구적 투여 또는 비경구적 투여 (예를 들어 주사제)로 투여될 수 있다.
실험예 1: 다양한 암종을 대상으로 TGF-β2 mRNA level 정량 및 상대적 정성 분석
1) 세포배양
하기 표 1과 같이 세포 타입에 따라 RPMI 1640 (10% FBS, Antibiotic-Antimycotic, HEPES), DMEM (10% FBS, Antibiotic-Antimycotic), Alpha-MEM (10% FBS, Antibiotic-Antimycotic) 또는 McCoy’s 5A (10% FBS, Antibiotic-Antimycotic) 등의 배지를 사용하였으며, 세포는 37℃, CO2 5.0% 환경에서 배양하였다.
종양세포 조직 진단명 사용 배지 구입처
MDA-MB-231 유방(Breast) 선암 (Adenocarcinoma) RPMI 1640 (10% FBS, 1% Antibiotics, HEPES) ATCC
Hs578T 암종 (carcinoma) DMEM (10% FBS, 1% Antibiotics)
BT 549 상피내 암종(durctal carcinoma)
SK-BR3 선암 (Adenocarcinoma) RPMI 1640 (10% FBS, 1% Antibiotics, HEPES)
AsPC-1 췌장(Pancreas) 선암 (adenocarcinoma) RPMI 1640 (10% FBS, 1% Antibiotics, HEPES)
Capan-2
SK-MEL-28 피부(Skin) 악성 흑색종(malignant melanoma) DMEM (10% FBS, 1% Antibiotics)
Hs294T 흑색종 (Melanoma)
A2058
A549 폐(Lung) 암종 (carcinoma) RPMI 1640 (10% FBS, 1% Antibiotics, HEPES)
H460
HT29 결장(Colon) 선암 (adenocarcinoma) RPMI 1640 (10% FBS, 1% Antibiotics, HEPES)
DLD-1
LS174T DMEM (10% FBS, 1% Antibiotics)
HCT116 결직장암 (Colorectal carcinoma McCoy's 5A (10% FBS, 1% Antibiotics)
2) TGF-β2 mRNA 발현분석
위 표 1의 각 세포주 1x107개에서 RNA prep kit (Qiagen)를 사용하여 RNA를 정제(preparation)하고, 이후 정제된 RNA 1㎍을 주형으로 하여, TGF-β2 (GCGAAGGCAGCAATTATGCTG) 특이적 프라이머 (specific primer)를 이용하여 RT-premix(Bioneer) cDNA 합성키트를 사용하여, 37℃에서 1시간 동안 cDNA를 합성하였다.
TGF-β2 F (ATCGATGGCACCTCCACATATG), R (GCGAAGGCAGCAATTATGCTG) 중 F-primer 만을 이용하여 cDNA 10㎕에 대한 PCR을 수행하였다 (Denaturation 95℃ 1 min, Annealing 57℃ 1 min, Extension 72℃ 1 min, 35 cycle 및 Final Extension 72℃ 5 min). 그 후에 GAPDH 에 대한 PCR 결과 대비 TGF-β2의 밴드 강도(band intensity)를 이용하여 세포 상에서의 TGF-β2에 대한 mRNA 발현을 확인하였다.
도 1은 TGF-β2 mRNA의 정량 분석 및 상대적 정석 분석 결과를 도시한 것이다.
3) TGF-β2 ELISA 정량분석
실험 전날 각 세포주 2×106을 6-well plate (SPL Lifesciences, Pocheon)에 준비한다. 실험 당일 TASO를 최종농도가 0, 20nM, 40nM, 80nM, 160nM이 되게 하는 양으로 맞추어 FBS가 들어있지 않은 배지에 넣었다. FBS가 들어있지 않은 또다른 배지에 형질주입 시약인 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, California, USA)을 넣고 상온에서 5분간 안정화시켰다.
TASO가 들어간 배지 혼합물과 형질주입 시약이 들어간 배지를 혼합하여 TASO의 최종 농도가 0, 20nM, 40nM, 80nM, 160nM이 되도록 하고, 상온에서 20분간 반응시켰다. 이후, 전날 준비해 두었던 세포주에 분주하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 2일 배양하였다. 2일 후 배양 상층액만을 회수하여 Quantikine TGF-β2 ELISA (R&D Systems) kit를 사용하여 TGF-β2를 정량하였다.
도 2는 다양한 암 세포주에 대하여 세포외로 분비된 TGF-β2 단백질을 ELISA로 정량 분석한 결과를 도시한 것이다.
실험예 2: 다양한 고형암 세포주들에서 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 단독 처리에 의한 세포 사멸 효과
다양한 고형암 세포주들에서 TASO 단독 처리에 의한 세포 사멸 효과를 확인하였다.
1) TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 형질주입(transfection)
각 세포주를 하기 표 2와 같이 시딩(seeding)한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다:
PLATE Seeding density Lipofectamine 2000 Total volume
6well 100,000~200,000 4 μl 2 ml
12well 50,000 2 μl 1 ml
24well 10,000~30,000 1 μl 500 μl
96well 5,000~10,000 0.5 μl 100 μl
TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3')을 소정 농도로 무혈청 배양액 (Serum free media)에 희석한다 (배양액 A). 리포펙타민 (lipofectamine) 2000을 상기 표 2와 같은 실험 조건으로 소정의 양을 무혈청 배양액에 첨가한다 (배양액 B). 배양액 A 및 배양액 B를 각 5분간 상온에서 반응시킨 후, 배양액 A와 B를 혼합하고, 다시 상온에서 20분간 반응시킨다. 세포 배양액을 10% FBS 배양액으로 교체한 후 반응이 끝난 배양액 A 및 B의 혼합물을 세포 배양액에 가한다.
2) 세포독성 분석(Cytotoxicity Assay)
세포독성 분석을 위하여 EZCYTOX (㈜대일랩서비스로부터 구입)를 이용하여 O.D 450nm 값으로 세포의 활성도를 측정하였고, 이 결과를 바탕으로 세포독성 분석을 진행하였다.
도 3 내지 도 7은 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 단독 처리에 따른 암세포주에서의 성장 억제를 EZCYTOX로 분석한 결과이다. 세포주 별로 TASO에 대한 감수성의 차이가 있다는 점을 확인할 수 있다.
실험예 3: 다양한 고형암 세포주들에서 유세포 분석기 (flow cytometer)로 세포 표면의 PD-L1의 발현을 확인하는 실험
실험에 사용될 10종의 세포주를 테스트 당 105개/100㎕ PBS로 준비한 후, FITC Mouse Anti-Human CD274(PD-L1) Clone.MIH1 항체를 테스트당 20μl씩 첨가하여 4℃에서 20분간 반응시킨다. 반응이 끝나면 cold PBS 3ml을 넣어준 후, 2100RPM에서 3분간 원심분리하는 washing과정을 진행한다. 상층액을 모두 버린 후 PBS 200μl로 재현탁시킨 후 FACS기기를 이용하여 PD-L1의 발현을 분석한다.
도 8 내지 도 17은 다양한 고형암 세포주 표면에서 발현된 PD-L1 단백질의 양을 도시한 그래프이다.
실험예 4: 폐암, 유방암, 피부암 및 대장암의 고형암 세포주에서 키트루다 및 인간 PBMC와 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 병용에 의한 세포 사멸 효과 시험
1) TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 형질주입
타겟 세포주를 하기 표와 같이 시딩(seeding)한 후 24시간 배양한다. (A) TASO를 원하는 농도로 무혈청 배지(Serum free media)에 희석하여 배양액 A를 제조한다. (B) Lipofectamine 2000을 하기 표와 같은 실험조건에 따라 정해진 양을 무혈청 배지에 첨가하여 배양액 B를 제조한다. 배양액 (A)와 (B)를 각 5분간 상온에서 반응시킨 후 (A)와 (B)를 혼합하고 다시 상온에서 20분간 반응시킨다. 세포의 배양액을 10% FBS media로 교체해준 후, 반응이 끝난 (A)와 (B)를 배양액에 가한다.
PLATE Seeding density Lipofectamine2000 Total volume
6well 100,000~200,000 4 μl 2 ml
12well 50,000 2 μl 1 ml
24well 10,000~30,000 1 μl 500 μl
96well 3,000~5,000 0.5 μl 100 μl
37℃, 5% CO2 조건에서 1일 배양한다.
2) 키트루다 처리
키트루다를 20㎍/㎖ 농도로 100㎕ 준비한다. PBMC(말초혈액 단핵구)는 부유세포만 회수하여 T(암세포) : E(PBMC) = 1:10 비율이 되도록 100㎕ 준비하고, 키트루다와 혼합한 후 상온에서 20분간 반응시킨다. 그 후, 배지가 모두 제거된 암세포 웰에 200μl 를 모두 넣는다.
3) 분석
24시간 함께 배양한 후 각 well의 배지를 조심스럽게 3번 피펫팅(pipetting)하여 PBMC를 재현탁시킨 후, 피펫(pipette)으로 배지와 PBMC를 최대한 제거한다. 세포활성 및 세포독성 분석 키트인 EZCYTOX ((주) 대일랩서비스로부터 구입)를 사용하여 배지 : EZCYTOX용액을 100:1 비율로 혼합하여 웰에 첨가한 후 37℃에서 1시간 배양한다.
반응이 끝나면 O.D 450nm 값으로 세포의 활성도(여기에서의 활성도는 암세포 단독의 대사능력을 1로 보고, 이를 기준으로 하여, 약물 처리 후의 세포 사멸로 인하여 대사가 감소되는 비율이다)를 측정하였다.
도 18 내지 도 21은 각각 유방암, 흑색종, 폐암 및 대장암 세포주에서의 키트루다 및 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 병용 투여에 의한 세포 사멸 효과를 도시한 것이다. 이 결과로부터, 병용 투여에 의하여 암세포의 활성이 현저하게 감소하였음을 알 수 있다.
실험예 5: 유방암 세포주 및 흑색종 세포주에서 여보이 및 인간 PBMC와 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 병용에 의한 세포 사멸 효과 시험
실험예 4와 동일한 방법으로 유방암 세포주 및 흑색종 세포주에 대하여 실험하되, 키트루다 대신에 여보이를 사용한다는 점만 상이하다.
도 22 및 도 23은 각각 유방암 세포주 및 흑색종 세포주에서의 여보이 및 TASO 병용 투여에 의한 세포 사멸 효과를 도시한 것이다. 이 결과로부터, 병용 투여에 의하여 암세포의 활성이 현저하게 감소하였음을 알 수 있다.
실험예 6: 인간화 마우스 모델 (NSG Humanized mouse)에 인간 PBMC를 사용하여 흑색종 또는 삼중 음성 유방암에 대한 키트루다 또는 여보이 및 TGF-β2 타겟팅 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 병용에 의한 세포 사멸 효과 시험 (in vivo)
(1) 흑색종에 대한 효과 확인 실험
인간화 마우스 모델 NSG (NSC immuno-deficiency mice, NOD SCID gamma mouse)에서 A2058 흑색종 암세포를 접종한 후, TGF-β2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 처리 및 키트루다 (PD-1 항체)를 처리하여 효과를 확인하였다.
실험방법은 다음과 같다: 실험 첫날, 인간 혈액공여자의 PBMC(1×107)를 NSG(Humanized mouse NSG)에 정맥 투여한다. 실험 시작 후 7일째 A2058 흑색종 (2x106) 세포주를 접종한다. 암세포가 50-100mm3 크기가 되었을 때 TASO를 매회 16mg/kg 또는 8mg/kg으로 이틀에 한 번씩 실험 종료시까지 복강 투여한다. 키트루다는 100ug/마리의 용량으로 주 2회의 빈도로 실험 종료시까지 복강 투여한다. 대조군으로는 어떠한 약물도 투여하지 아니하고, PBMC도 투여하지 아니한 음성대조군(NC), PBMC만을 투여한 군, 키트루다만을 투여한 군, 및 TASO만을 투여한 군을 사용한다(각 실험군 및 대조군은 마우스 6마리를 사용한다).
(2) 유방암에 대한 효과 확인 실험
또한, 인간화 마우스 모델 NSG(NSC immuno-deficiency mice, NOD SCID gamma mouse)에서 MDA-MB-231 삼중음성 유방암 세포주 (Triple negative breast cancer, TNBC)를 접종한 후, TGF-β2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 처리 및 여보이(CTLA-4 항체)를 처리하여 효과를 확인하였다.
실험방법은 다음과 같다: 실험 첫날, MDA-MB-231 삼중음성 유방암 세포주 (Triple negative breast cancer, TNBC)를 준비하여, 인간화 마우스 NSG(Humanized mouse NSG)에 접종한다. 실험 시작 후 2일째, 4일째, 6일째, 8일째 및 10일째에 TASO(매회 32mg/kg)을 복강 투여한다. 11일째에 인간 혈액공여자의 PBMC(1×107)를 정맥 투여하고, 여보이를 11일째, 16일째 및 21일째에 복강 투여한다(11일째에 10mg/kg 투여, 16일째 및 21일째에 각각 5mg/kg 투여). 대조군으로는 어떠한 약물도 투여하지 아니하고, PBMC도 투여하지 아니한 음성대조군(NC), PBMC만을 투여한 군, 여보이만을 투여한 군, 및 TASO만을 투여한 군을 사용한다(각 실험군 및 대조군은 마우스 6마리를 사용한다)
(3) 효과 확인
피부암 세포주를 접종한 마우스에 대해서는 8일, 10일, 13일, 15일, 17일, 20일, 22일 째에 종양의 부피를 각각 측정하였다. 유방암 세포주를 접종한 마우스에 대해서는 접종 후 11일, 15일, 19일, 24일 째에 종양의 부피를 각각 측정하였다. 종양의 부피는 캘리퍼(caliper)를 사용하여 측정하였다.
도 24 및 도 25는 종양 크기를 측정한 결과를 도시한 것이다. 실험 결과, TGF-β2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3')과 키트루다 또는 여보이를 병용 투여한 경우에 종양 크기가 가장 작다는 것을 알 수 있었다.
따라서, TGF-β2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3')만을 단독으로 투여하거나, 면역관문 억제제만을 단독으로 투여하는 것에 비하여, TGF-β2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3') 및 면역관문 억제제의 병용 투여시 암세포의 세포 사멸 효과 또는 암세포 억제 효과가 현저히 발휘되는 것을 알 수 있다.
특히, 면역관문 억제제만을 투여하는 경우 약물 반응률로 인하여 항암 효과가 낮을 수 있으나, 면역관문 억제제를 TGF-β2 targeting anti-sense oligonucleotide (5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3')와 병용 투여하는 경우 항암 효과를 크게 향상시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 항암 치료에 사용될 수 있다.
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TGF-beta2 Targeting Anti-Sense Oligonucleotide
<400> 1
cggcatgtct attttgta 18

Claims (23)

  1. 서열번호 1의 올리고뉴클레오타이드 및 면역관문 억제제를 포함하는 항암용 배합 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 올리고뉴클레오타이드 및 면역관문 억제제는 동시에 투여되거나, 순차적으로 투여되거나, 개별적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 항암용 배합 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 PD-1 항체, PD-L1 항체 또는 CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 항암용 배합 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체인 것을 특징으로 하는 항암용 배합 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙 또는 두발루맙인 것을 특징으로 하는 항암용 배합 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 고형암을 치료하기 위한 항암용 배합 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 고형암은 유방암, 대장암, 피부암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 항암용 배합 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 항암용 배합 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 이필리무맙인 것을 특징으로 하는 항암용 배합 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 고형암을 치료하기 위한 항암용 배합 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 고형암은 유방암, 대장암, 피부암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 항암용 배합 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  14. 서열번호 1의 올리고뉴클레오타이드를 함유하며, 면역관문 억제제와 병용투여하기 위한 항암용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 고형암을 치료하기 위한 항암용 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 고형암을 치료하기 위한 항암용 조성물.
  19. 면역관문 억제제를 함유하며, 서열번호 1의 올리고뉴클레오타이드와 병용투여하기 위한 항암용 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 고형암을 치료하기 위한 항암용 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 CTLA-4 항체인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 고형암을 치료하기 위한 항암용 조성물.
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