WO2019235270A1 - 標的物質検出方法及び標的物質検出キット - Google Patents

標的物質検出方法及び標的物質検出キット Download PDF

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WO2019235270A1
WO2019235270A1 PCT/JP2019/020765 JP2019020765W WO2019235270A1 WO 2019235270 A1 WO2019235270 A1 WO 2019235270A1 JP 2019020765 W JP2019020765 W JP 2019020765W WO 2019235270 A1 WO2019235270 A1 WO 2019235270A1
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liquid sample
substance
target substance
light
sample introduction
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PCT/JP2019/020765
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雅人 安浦
藤巻　真
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a target substance detection method for detecting a target substance by using a change in an optical signal when a target substance existing in a liquid sample is moved using a magnetic field, and the implementation of the target substance detection method.
  • the present invention relates to a target substance detection kit suitably used.
  • An external force assisted sensor for example, an external force assisted near-field illumination biosensor (External-Force-Assisted) that detects the target substance by comparatively observing a conjugate obtained by binding magnetic particles to the target substance before and after applying a magnetic field.
  • Near Field Illumination Biosensor (see Non-Patent Documents 1 and 2) is one of them, and an optical signal based on the target substance bound to the magnetic particles moves before and after application of the magnetic field, while detection is used for detection.
  • a conjugated conjugate is prepared. Specifically, first, an analyte liquid of the target substance, a first liquid containing a first binding substance that binds the magnetic particles and the magnetic particles to the target substance, the photoresponsive substance, and the light A second liquid containing a second binding substance that binds a responsive substance to the target substance is prepared.
  • the first binding substance and the second binding substance are selected from substances that can bind to the target substance.
  • the first binding substance and the second binding substance must also bind to the magnetic particles and the photoresponsive substance. Therefore, the first binding substance that binds to the magnetic particles and the second binding substance that binds to the photoresponsive substance are selected from different substances.
  • the first liquid is added to the analyte liquid and allowed to react for a predetermined time, and the magnetic particles are bound to the target substance via the first binding substance.
  • the second liquid is added to the analyte liquid and reacted for a predetermined time, the photoresponsive substance is bound to the target substance via the second binding substance, and the first binding to the target substance is performed.
  • the combined body in which the magnetic particles and the photoresponsive substance are bonded through the substance and the second binding substance is obtained.
  • the order of adding the first liquid and the second liquid is changed, the second liquid is added first, and the first liquid is added later, so that the first binding substance and the second liquid are added to the target substance.
  • the combined body in which the magnetic particles and the photoresponsive substance are bonded via the binding substance is obtained.
  • the order of adding the first liquid and the second liquid to the analyte liquid is such that the affinity (binding) with the target substance is between the selected first binding substance and the second binding substance.
  • the first liquid is added first when the affinity of the first binding substance is low, and when the affinity of the second binding substance is low, the first binding substance is low.
  • Add 2 liquids first that is, when a binding substance having a higher affinity with the target substance is added first, the binding site of the target substance is filled with the binding substance, and the affinity with the target substance added later is lower. Therefore, any one of the magnetic particles and the photoresponsive substance does not form a conjugate with the target substance and is excluded from the detection target. Such a procedure is cumbersome for the user and hinders efficient detection testing.
  • the detection target is removed from the detection target due to the difference in the procedure described above or the passage of time, the accuracy of the detection result is lowered and the detection result becomes unstable.
  • the present invention provides a target substance detection method and a target substance detection kit that can solve the above-mentioned problems in the prior art and can detect a target substance efficiently, highly accurately and stably using the external force support type sensor.
  • the purpose is to do.
  • Means for solving the above problems are as follows. That is, ⁇ 1> A liquid sample is introduced onto the front surface and transmitted through the light irradiated from the rear surface side or the front surface side as propagating light so that it can propagate to the surface side opposite to the side irradiated with the light.
  • a detection plate capable of generating near-field light on the surface by light that is introduced onto the surface and irradiated with total reflection conditions on the surface.
  • the liquid sample introduction plate is arranged and the liquid sample is held on the surface of the liquid sample introduction plate with respect to the liquid sample holding portion that can hold the liquid sample on the surface of the liquid sample introduction plate.
  • a first combined body moving step of moving in a direction having a vector component in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the introduction plate and a direction moving away from the liquid sample introduction plate; and the liquid sample introduction plate The combined body in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate is drawn onto the surface of the liquid sample introduction plate by applying a magnetic field from a magnetic field application unit disposed on the back side. In the state where the magnetic field is applied, the magnetic field application unit is moved in a direction having a vector component in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate, and the coupling is performed by following the movement of the magnetic field application unit.
  • a combined body moving step which is one of the second combined body moving steps for moving the body, and the movement of the combined body in accordance with the combined body moving step of the optical signal based on the propagating light or the near-field light.
  • An optical signal detection step for detecting by a change in signal, wherein the liquid sample has a magnetic particle and a photoresponsive substance each forming a conjugate with a target substance, and a first that binds the magnetic particle to the target substance.
  • a binding substance and a second binding substance that binds the photoresponsive substance to the target substance, wherein the same binding substance is used for the first binding substance and the second binding substance.
  • a target substance detection method for detecting by a change in signal, wherein the liquid sample has a magnetic particle and a photoresponsive substance each forming a conjugate with a target substance, and a first that binds the magnetic particle to the target substance.
  • a binding substance and a second binding substance that binds the photoresponsive substance to the target substance, wherein the same binding substance is used for
  • the target substance detection method according to ⁇ 1>, wherein the target substance is a substance having a plurality of binding sites of the same type, and the binding substance is a substance that can specifically bind to the binding site.
  • the liquid sample is prepared by mixing one liquid detection liquid containing a magnetic particle and a photoresponsive substance each in a state of being bound to a binding substance with respect to an analyte liquid of a target substance. > To ⁇ 2>.
  • ⁇ 4> The target substance detection method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the photoresponsive substance is irradiated with propagating light or near-field light to generate scattered light.
  • the target substance detection method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the photoresponsive substance generates fluorescence upon irradiation with propagating light or near-field light.
  • the optical signal detection step is a step of detecting a signal change of an optical signal based on propagating light
  • the photoresponsive substance includes a light absorbing substance that generates light absorption when irradiated with the propagating light.
  • ⁇ 7> The target substance detection method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the magnetic particles are spherical particles having a diameter of 5 nm to 6,500 nm.
  • the target substance detection method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the photoresponsive substance is a spherical particle having a diameter of 50 nm to 6,500 nm.
  • the combined body moving step is the first combined body moving step, after the liquid sample introduction and holding step and before the combined body moving step, all or all of the combined bodies in the liquid sample are applied by applying an attracting magnetic field.
  • Feature target substance detection kit Magnetic particles that form a conjugate with a target substance, a photoresponsive substance that forms the conjugate with the target substance, a first binding substance that binds the magnetic particles to the target substance, and the photoresponse And a second binding substance that binds the target substance to the target substance, and the first binding substance and the second binding substance have a single liquid detection solution composed of the same binding substance.
  • a target substance detection method and a target substance detection kit that can solve the above-described problems in the prior art and can detect a target substance efficiently, highly accurately, and stably using the external force support type sensor. Can be provided.
  • Via binding substance B 1, B 2 to the target substance T magnetic particles M and photoresponsive material O is an explanatory diagram showing a conjugate bound a total of three. It is explanatory drawing of the target substance detection apparatus.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
  • FIG. 9 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. It is explanatory drawing of 1 A of target substance detection apparatuses. It is explanatory drawing of the target substance detection apparatus 1B.
  • FIG. (2) which shows typically a mode on the surface of a liquid sample introduction board in an observation field of view observed with an imaging device after a combined body movement process.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. 1 is an explanatory diagram of a target substance detection device 10.
  • FIG. It is a figure (3) which shows typically the mode on the surface of the liquid sample introduction board in the observation visual field observed with an imaging device after a combined body movement process.
  • FIG. 16 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. It is explanatory drawing of the target substance detection apparatus 20.
  • FIG. It is explanatory drawing of 20 A of target substance detection apparatuses. It is explanatory drawing of the target substance detection apparatus 30.
  • FIG. It is explanatory drawing of the target substance detection apparatus.
  • FIG. 1 shows the mode on the said surface of a liquid sample introduction plate after a conjugate
  • FIG. It is a figure (2) which shows the mode on the said surface of a liquid sample introduction plate before a coupling body movement process. It is a figure (2) which shows the mode on the said surface of a liquid sample introduction plate after a conjugate
  • FIG. It is a figure which shows the image after 7 second passage from the said one time point in the said moving image of the 1st detection by the target substance detection method based on Example 1.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the image in one time in the moving image of the 2nd detection by the target substance detection method which concerns on Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the image after 5.3 second progress from the said one time point in the said moving image of the 2nd detection by the target substance detection method which concerns on Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the image in the one time point in the moving image of the 1st detection by the target substance detection method which concerns on the comparative example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the image after 6.3 second progress from the said one time point in the said moving image of the 1st detection by the target substance detection method which concerns on the comparative example 1.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the image in the one time point in the moving image of the 2nd detection by the target substance detection method which concerns on the comparative example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the image after 2.7 second progress from the said one time point in the said moving image of the 2nd detection by the target substance detection method which concerns on the comparative example 1.
  • the target substance detection method according to the present invention is an external force assisted sensor that detects a target substance by comparatively observing a conjugate obtained by binding magnetic particles to the target substance before and after applying a magnetic field, for example, external force assisted near field illumination. It can be carried out using a biosensor (External-Force-Assisted Near Field Illumination Biosensor).
  • a biosensor External-Force-Assisted Near Field Illumination Biosensor
  • the external force support type sensor will be described in detail.
  • the external force support type sensor will be described as a “target substance detection device”.
  • the target substance detection device includes a liquid sample holding unit, a light irradiation unit, a magnetic field application unit, and an optical signal detection unit, and includes other units as necessary.
  • the liquid sample holding part is a part in which a liquid sample introduction plate is arranged and a liquid sample is held on the surface of the liquid sample introduction plate.
  • the liquid sample introduction plate propagates to the surface side opposite to the side irradiated with the light using the transmitted light of the light irradiated from the back side or the surface side as the propagation light while the liquid sample is introduced onto the surface.
  • a translucent plate that is made possible, a reflective plate that is capable of propagating the reflected light of the light irradiated from the surface side as the propagating light as the propagating light, and the liquid sample.
  • the propagation light is generally light that does not include near-field light that exhibits abrupt attenuation at a position that is separated from the generation source by a distance of several hundred nm to several ⁇ m. It means that near-field light is not included, and means light that does not show abrupt attenuation at a position separated from the surface of the liquid sample introduction plate by a distance of several hundred nm to several ⁇ m.
  • the near-field light means light that shows abrupt attenuation at a position separated from the surface of the liquid sample introduction plate by a distance of several hundred nm to several ⁇ m.
  • the light-transmitting plate is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • a known translucent plate can be used.
  • the reflecting plate is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • a known plate such as a glass plate, a plastic plate, or a metal plate used for an observation stage of a known episcopic microscope is used.
  • a reflector can be used.
  • the introduction plate is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • the introduction plate includes the light transmission plate and the reflection plate, and is a known plate for introducing other liquid samples.
  • a shaped member can be used.
  • the detection plate is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • a known detection plate such as a known surface plasmon resonance sensor or a known waveguide mode sensor is used. be able to.
  • the said surface is surface-treated with the adsorption inhibitor which suppresses adsorption
  • the adsorption inhibitor which suppresses adsorption
  • the target substance is the protein
  • a known blocking method that suppresses adsorption of the protein can be selected as the surface treatment method.
  • the blocking method is not particularly limited, and examples thereof include a method using polyethylene glycol, a method using ethanolamine, a method using skim milk, and a method using a silane coupling agent.
  • maintenance part there is no restriction
  • the plate-like translucent member and the liquid sample introduction plate may be sandwiched, and the liquid layer of the liquid sample may be held on the surface of the liquid sample introduction plate.
  • maintenance part it can also comprise with the bowl-shaped liquid cell in which a bottom face is comprised with the said liquid sample introduction plate.
  • the liquid sample holding unit may be divided into a plurality of regions by dividing a plurality of regions on the surface of one liquid sample introduction plate.
  • a flow path capable of feeding liquid is formed between the outside and the space on the surface of the liquid sample introduction plate as the liquid sample holding portion. That is, according to the target substance detection device, since the target substance can be detected ignoring the presence of impurities adsorbed on the liquid sample introduction plate, the cleaning process of the liquid sample introduction plate is sequentially performed. Therefore, when the flow path is formed in the liquid sample holder, the liquid sample is simply replaced through introduction and discharge of the liquid sample through the flow path. Detection can be advanced, and the detection operation can be made more efficient.
  • the “cleaning process” means a process of removing the contaminants adsorbed on the surface of the liquid sample introduction plate by a physical polishing process, a peeling process using chemicals, or a dissolving process. , It does not include a process of rinsing with water when changing the liquid sample.
  • the light irradiation unit is formed of any one of a back surface side light irradiation unit, a front surface side light irradiation unit, a side surface side light irradiation unit, and a total reflection light irradiation unit.
  • the back surface side light irradiating unit can irradiate the light from the back surface of the liquid sample introducing plate when the liquid sample introducing plate is formed of the light transmitting plate.
  • the back surface side light irradiating unit can irradiate the light from the back surface of the liquid sample introducing plate when the liquid sample introducing plate is formed of the light transmitting plate.
  • the said back surface side light irradiation part there is no restriction
  • the surface-side light irradiating unit can irradiate the light from the surface side of the liquid sample introducing plate when the liquid sample introducing plate is formed of either the light transmitting plate or the reflecting plate.
  • the said surface side light irradiation part there is no restriction
  • the side-side light irradiating unit is configured so that the liquid sample is introduced from the side surface side of the liquid sample introduction plate with respect to the liquid sample held on the liquid sample introduction plate when the liquid sample introduction plate is formed by the introduction plate.
  • the light can be irradiated in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the sample introduction plate.
  • the total reflection light irradiating unit can irradiate the light on the surface under total reflection conditions when the liquid sample introduction plate is formed by the detection plate.
  • the total reflection on the surface is not particularly limited in the incident direction of the light as long as the total reflection condition can be satisfied on the surface of the detection plate.
  • the light can be introduced into the waveguide structure from the surface side through the prism, and the total reflection condition on the surface of the detection plate can be satisfied by utilizing the total reflection in the waveguide structure.
  • the prism may be formed as a partial structure of the detection plate.
  • the light irradiation unit can be configured in the same manner.
  • the back side light irradiation part the surface side light irradiation part, the side surface side light irradiation part, and the total reflection light irradiation part
  • a known light emitting device such as a lamp, an LED device, or a laser light irradiation device can be used.
  • the back side light irradiation unit, the front side light irradiation unit, and the total reflection light irradiation unit are not particularly limited with respect to optical elements other than the light source, and a known optical microscope, a known surface plasmon resonance sensor, A known optical element used in a known waveguide mode sensor can be appropriately adopted depending on the purpose.
  • the magnetic field application unit is formed by one of a first magnetic field application unit and a second magnetic field application unit. Any one of the first magnetic field application unit and the second magnetic field application unit has a role of moving the conjugate introduced on the surface of the liquid sample introduction unit, and the target substance. In the detection apparatus, the movement of the conjugate is used for detection of the target substance.
  • the first magnetic field application unit is disposed on the surface side or the side surface side of the liquid sample introduction plate and magnetically applies the combination in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate. Is a member that is moved in either a direction having a vector component parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate or a direction away from the liquid sample introduction plate.
  • the first magnetic field application unit is not particularly limited as long as it is such a member, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the first magnetic field application unit can be configured using a known electromagnet and permanent magnet.
  • the permanent magnet In the case of using the permanent magnet, for example, the permanent magnet is held on a moving member, and the magnetic field by the permanent magnet is in the proximity state where the magnetic field by the permanent magnet extends on the surface of the liquid sample introduction plate. It is possible to control the movement between the liquid sample introduction plate and the separated state that does not reach the surface, and to turn on and off the application state of the magnetic field on the surface of the liquid sample introduction plate. Further, for example, a known magnetic shield member is controlled to be opened and closed in an open state in which the magnetic field is applied to the surface of the liquid sample introduction plate and a shield state in which the magnetic field is not applied to the surface of the liquid sample introduction plate. The application state of the magnetic field to the surface of the liquid sample introduction plate can be turned on and off.
  • the first magnetic field application unit is not particularly limited, but has a through-hole, an incomplete ring shape such as a U shape, or a plurality of members arranged in an annular or incomplete ring shape. It is preferable that it is the structure comprised.
  • the first magnetic field application unit is formed in this way, the surface side of the liquid sample introduction plate through the through hole or the inside of the ring or the incomplete ring when the surface side light irradiation unit is used.
  • the surface of the liquid sample introduction plate in any case of the front side light irradiation unit, the back side light irradiation unit, the side surface side light irradiation unit, and the total reflection light irradiation unit can be detected by the optical signal detection unit through the inside of the through hole or the annular member.
  • the members arranged in an annular shape are not particularly limited as long as they do not obstruct the light irradiation or the optical path of the optical signal, and may be those that can individually control the application state of the magnetic field.
  • the second magnetic field application unit is arranged on the back side of the liquid sample introduction plate and applies the combined body in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate by applying a magnetic field.
  • the liquid sample introduction plate can be drawn toward the surface side and can be moved in a direction having a vector component in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate with the magnetic field applied. It is a member.
  • the second magnetic field application unit is not particularly limited as long as it is such a member, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the second magnetic field application unit can be configured using a known electromagnet and permanent magnet.
  • the electromagnet or the permanent magnet is held on a slide member, and the surface side light irradiation unit, the back side light irradiation unit, the side surface side light irradiation unit, or the total reflection light irradiation unit of the liquid sample introduction plate is used.
  • An initial state in which the electromagnet or the permanent magnet is positioned in the vicinity of a region (detection region) irradiated with the light from the light irradiation unit, and a vector component in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate It can comprise by carrying out movement control between the states which moved the said electromagnet or the said permanent magnet toward the direction which has.
  • the second magnetic field application unit is not particularly limited, but has a through-hole formed therein, an incomplete ring shape such as a U shape, or a plurality of members arranged in a ring shape or an incomplete ring shape. It is preferable that it is the structure comprised.
  • the members arranged in an annular shape are not particularly limited as long as they do not obstruct the light irradiation or the optical path of the optical signal, and may be those that can individually control the application state of the magnetic field.
  • the optical signal detection unit is arranged on the front surface side, the back surface side, or the side surface side of the liquid sample introduction plate and applies the magnetic field by the first magnetic field application unit and the second magnetic field application unit.
  • the movement of the combined body accompanying the movement can be detected by a signal change of an optical signal based on the propagating light or the near-field light.
  • the optical signal detector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • a known optical element such as a photodiode or a photomultiplier tube or a known optical element such as an objective lens may be used. Can be configured.
  • the optical signal detection unit is not particularly limited, but it is preferable that the state of the detection region on the surface of the liquid sample introduction plate can be acquired as a two-dimensional image. If the two-dimensional image can be acquired, position information and size information of the optical signal in the two-dimensional image appearing as a light spot or a dark spot can be easily acquired, and the two-dimensional image before and after the combined body is moved.
  • the optical signal is information related to the combined body, or the combined body such as scratches on the surface of the liquid sample introduction plate, the foreign matter, fluctuation of the light source output, etc. It is possible to clearly distinguish whether the information is not involved.
  • an imaging device may be selected as the optical signal detection unit. Furthermore, when the two-dimensional image is continuously captured and observed as a moving image, it is possible to more clearly identify the movement of the optical signal in the two-dimensional image that appears as a light spot or a dark spot. .
  • the imaging device there is no restriction
  • the optical signal detection unit is out of the imageable range and the near-field light generation region (several hundred nm from the surface of the liquid sample introduction plate).
  • a method of performing detection after arranging the conjugate once on the surface of the liquid sample introduction plate or in the vicinity of the surface. preferable.
  • Examples of detecting the target substance include detection of the presence or absence of the target substance, detection of the amount of the target substance (quantitative measurement), real-time observation of the presence state of the target substance, and the like.
  • the detection in the optical signal detection unit accompanying the movement of the combined body by the magnetic field application unit will be described.
  • the optical signal based on the propagating light detected by the optical signal detection unit includes an upper part of the surface of the liquid sample introduction plate in the same manner as the optical signal acquired by the known transmission microscope or the epi-illumination microscope.
  • An optical signal 2 an optical signal 3 that can be distinguished from the optical signal 1, and generated on the surface of the liquid sample introduction plate.
  • the optical signal also includes a noise signal caused by fluctuations in the light source output. If the optical signals 2 to 4 and the noise signal cannot be distinguished except for the optical signal 1 processed as a background signal, the detection accuracy is lowered. However, in the target substance detection device, the combined body is moved based on the magnetic field applying section formed by the first magnetic field applying section and the second magnetic field applying section of the combined body, Since it is detected as a signal change of the optical signal based on the propagating light, the optical signal 2, the optical signals 3 and 4, and the noise signal can be clearly distinguished. That is, the optical signals 3 and 4 and the noise signal are optical signals that do not change before and after the application of the magnetic field by the first magnetic field application unit and before and after the movement of the second magnetic field application unit.
  • the optical signal 2 includes scattered light, reflected light, phase difference, transmitted light based on differential interference, fluorescence of the photoresponsive substance, phosphorescence, etc. emitted when the conjugate is irradiated with the propagating light.
  • each of the liquid sample holding unit, the light irradiation unit, and the optical signal detection unit may be a known phase contrast microscope
  • the optical system in the differential interference microscope is configured.
  • Examples of the change of the optical signal 2 include intensity increase / decrease, phase change, position shift, defocus, and appearance / disappearance.
  • the optical signal based on the near-field light detected by the optical signal detection unit includes, in the liquid sample, the same as the optical signal acquired by a known surface plasmon resonance sensor or a known waveguide mode sensor.
  • the optical signal also includes a noise signal caused by fluctuations in the light source output.
  • the target substance detection device when the near-field light is used, similarly to the case where the propagation light is used, if the optical signals 5 to 7 and the noise signal cannot be distinguished, the detection sensitivity is lowered.
  • the combined body is moved based on the magnetic field applying section formed by the first magnetic field applying section and the second magnetic field applying section of the combined body, and the change is moved to the Since it is detected as a signal change of the optical signal based on near-field light, the optical signal 5, the optical signals 6 and 7, and the noise signal can be clearly distinguished.
  • the optical signals 6 and 7 and the noise signal are optical signals that do not change before and after the application of the magnetic field by the first magnetic field application unit and before and after the movement of the second magnetic field application unit
  • the optical signal 5 Is an optical signal that changes before and after the application of the magnetic field by the first magnetic field application unit and before and after the movement of the second magnetic field application unit because it is caused by the combined body including the magnetic particles.
  • optical signal 5 which is focused as the changing optical signal
  • various aspects can be taken according to the type of the photoresponsive substance and the type of the optical system of the target substance detection device. That is, examples of the optical signal 5 include scattered light emitted when the conjugate is irradiated with the near-field light, light emission such as fluorescence, and an optical signal based on light absorption of the conjugate.
  • increase / decrease in intensity, position movement, and appearance / disappearance can be mentioned.
  • the other part is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • a third magnetic field application part a known transmission microscope, a known episcopic microscope, a known total reflection microscope, An arbitrary portion used for a known surface plasmon resonance sensor, a known waveguide mode sensor, or the like can be given.
  • the third magnetic field application unit is further disposed on the back side of the liquid sample introduction plate and the liquid sample introduction plate when the magnetic field application unit is formed by the first magnetic field application unit. It is a portion that can draw the combined body in the introduced liquid sample onto the surface of the liquid sample introduction plate by applying a magnetic field.
  • the magnetic field application unit When the magnetic field application unit is formed by the second magnetic field application unit, the combined body in the liquid sample is attracted onto the surface of the liquid sample introduction plate by the application of the magnetic field. Therefore, the detection of the optical signal by the optical signal detection unit is performed by focusing on the surface of the liquid sample introduction plate or in the vicinity thereof, thereby detecting the movement state of the combined body drawn on the surface. be able to.
  • the optical signal detection unit performs the detection of the optical signal by focusing on the surface of the liquid sample introduction plate or the vicinity thereof. For example, immediately after the liquid sample is introduced into the liquid sample introduction plate, the conjugate does not necessarily attract the surface of the liquid sample introduction plate. It is in a state of floating in the liquid layer.
  • the combined body in the floating state exists outside the imageable range where the optical signal can be detected by the optical signal detection unit or outside the near-field light generation region, the combined body is not detected. Become. Therefore, when the optical signal is detected by the optical signal detection unit while focusing on the surface of the liquid sample introduction plate or the vicinity thereof, the liquid sample is introduced into the liquid sample introduction plate, and then the coupling is performed. It is necessary to wait for the body to gravity settle on the surface of the liquid sample introduction plate, and it takes time to prepare for detection. In particular, when the specific gravity of the conjugate is small, a longer time is required. Therefore, by applying the magnetic field by the third magnetic field applying unit, the conjugate floating in the liquid layer of the liquid sample is drawn to the surface side of the liquid sample introduction plate, thereby shortening the detection preparation time. And more efficient detection can be performed.
  • said 3rd magnetic field application part can select suitably, For example, it can comprise using a well-known electromagnet and a permanent magnet.
  • the third magnetic field application unit is configured to prevent the combination from being moved by the first magnetic field application unit after the combination is attracted to the surface side of the liquid sample introduction plate. Therefore, it is necessary to adjust the strength to weaken the application state of the magnetic field that attracts and to turn on / off control.
  • the permanent magnet when the permanent magnet is used, for example, the permanent magnet is held on a moving member, and the magnetic field generated by the permanent magnet extends into the liquid layer of the liquid sample and the magnetic field generated by the permanent magnet is the liquid.
  • the intensity adjustment or the on-off control of the magnetic field application state can be performed through excitation and demagnetization of the electromagnet.
  • the application state of the magnetic field can be turned on and off.
  • the third magnetic field application unit is not particularly limited, but has a through-hole formed therein, an incomplete ring shape such as a U shape, or a plurality of members arranged in a ring shape or an incomplete ring shape. It is preferable that it is the structure comprised.
  • an incomplete ring shape such as a U shape
  • a plurality of members arranged in a ring shape or an incomplete ring shape It is preferable that it is the structure comprised.
  • the members arranged in an annular shape are not particularly limited as long as they do not obstruct the light irradiation or the optical path of the optical signal, and may be those that can individually control the application state of the magnetic field.
  • the conjugate can be concentrated in the detection region on the surface of the liquid sample introduction plate, and the target substance can be detected with higher accuracy. It can be carried out.
  • the target substance detection method of the present invention includes a liquid sample introduction and holding step, a light irradiation step, a conjugate transfer step, and an optical signal detection step, and includes other steps as necessary.
  • liquid sample introduction and holding process In the liquid sample introduction and holding step, the liquid sample is introduced onto the front surface and transmitted light of light irradiated from the rear surface side or the front surface side is used as propagation light on the surface opposite to the side irradiated with the light.
  • a translucent plate capable of propagating, a reflective plate capable of propagating reflected light of light irradiated from the surface side as the propagating light as the propagating light, and the liquid sample. Can introduce near-field light on the surface by the introduction plate introduced on the surface, and the liquid sample introduced on the surface and light irradiated on the surface under total reflection conditions.
  • the liquid sample introduction plate is arranged with respect to a liquid sample holding portion in which a liquid sample introduction plate formed by any of the detection plates is arranged and the liquid sample can be held on the surface of the liquid sample introduction plate The liquid on the surface of A step of the introduced retaining fee.
  • the liquid sample includes a magnetic particle and a photoresponsive substance that form a conjugate with a target substance, a first binding substance that binds the magnetic particle to the target substance, and the photoresponsive substance as the target substance. And a second binding substance to be bound.
  • Examples of the target substance include various proteins including virus-like particles such as DNA, RNA, virus, capsid protein, extracellular vesicles such as exosomes, microvesicles, and large oncosomes, fungi, and contaminants.
  • Examples of the target substance test liquid for verifying the presence of the target substance include, for example, blood, saliva, urine, liquid chemicals, environmental water, water and sewage, beverages, food homogenizing solutions, wipes, powders, etc. And a solution obtained by dissolving the solid sample in a solvent such as water, and a gas phase concentrated liquid obtained by collecting gas and fine particles in the gas phase.
  • the role of the magnetic particles is to cause movement associated with application of the magnetic field in a state where a conjugate with the target substance is formed.
  • the magnetic particle is not particularly limited as long as it plays the above role, and can be appropriately selected according to the purpose, and known magnetic beads or the like can be used.
  • the role of the photoresponsive substance is to generate the optical signal based on the propagating light or the near-field light in a state where a conjugate with the target substance is formed.
  • the photoresponsive substance is not particularly limited as long as it plays the above role and can be appropriately selected according to the purpose, and generates scattered light upon irradiation with the propagating light or the near-field light.
  • a light scattering material, a fluorescent material that generates fluorescence, or a light absorbing material that generates light absorption can be used.
  • resin particles such as polystyrene beads prepared so as to have the respective properties, metal nanoparticles such as gold nanoparticles, silver nanoparticles, gold nanorods, and gold nanostars are known.
  • the particles can be used.
  • known fluorescent materials such as fluorescent dyes, quantum dots, fluorescent beads, beads with quantum dots, and fluorescent dyes can be used.
  • light responsiveness refers to the property of generating an optical signal that can be detected in the optical signal detection step in response to irradiation with the propagating light or the near-field light.
  • the first binding substance and the second binding substance have a role of binding the magnetic particles and the photoresponsive substance to the target substance, and are in a state of being combined with the magnetic particles and the photoresponsive substance And binding to the target substance to form a conjugate in which the magnetic particles and the photoresponsive substance are bound to the target substance via the first binding substance and the second binding substance.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram for explaining the situation when the first binding substance B 1 and the second binding substance B 2 having a lower affinity than the first binding substance B 1 are used. These are explanatory drawings explaining the situation in the case of using the first binding substance B 1 and the second binding substance B 2 having a higher affinity than the first binding substance B 1 , and FIG. If the binding substance B 1 and the second coupling between the substance B 2 are identical binding agent used is an explanatory diagram for explaining the status of.
  • the magnetic particles M in a state where the first binding substance B 1 is bound to the analyte liquid of the target substance T and the photoresponsive substance O in a state where the second binding substance B 2 is bound Think about the situation when you add it. Different binding substances are used for the first binding substance B 1 and the second binding substance B 2, and the second binding substance B 2 has a lower affinity for the target substance T than the first binding substance B 1. Then, as shown in FIG. 1, the first binding substance B 1 having high affinity preferentially binds to the target substance T, and the target substance T and the magnetic particles M via the first binding substance B 1 However, there is a situation in which the binding between the target substance T and the photoresponsive substance O via the second binding substance B2 cannot be obtained. In this case, since the optical signal based on the photoresponsive substance O cannot be detected, the target substance T is excluded from the detection target.
  • the second binding substance B 2 has more affinity for the target substance T than the first binding substance B 1.
  • the second binding substance B 2 having a high affinity preferentially binds to the target substance T, and the target substance T and the light via the second binding substance B 2 are assumed.
  • a bond with the responsive substance O is obtained, a situation occurs in which a bond between the target substance T and the magnetic particles M via the first binding substance B1 cannot be obtained.
  • the conjugate of the target substance T and the photoresponsive substance O cannot be moved before and after the application of the magnetic field, and the optical signal based on the photoresponsive substance O cannot be distinguished from the noise signal. It is out of detection.
  • the binding substance is not particularly limited and can be appropriately selected according to the type of the target substance and the detection material.
  • Various substances that give a bond by a known antigen-antibody reaction, binding by an aptamer, DNA hybridization, biotin-avidin bond, chelate bond, amino bond and the like can be used.
  • Specific examples include monoclonal antibodies, aptamers, DNA probes, RNA probes, peptides, protein A, protein G, avidin and derivatives thereof (streptavidin, neutravidin, etc.), biotin and the like.
  • polyclonal antibodies which are aggregates of different types of antibodies that can bind to a certain antigen, cannot guarantee to give the same binding substance to each of the magnetic particles and the photoresponsive substance, It is not preferable as the binding substance.
  • the target substance detection method since the same binding substance is used for the first binding substance and the second binding substance, the target of the type having a plurality of binding sites of the same type It is particularly suitable for the detection of substances (for example, virus-like particles such as viruses and capsid proteins, and extracellular vesicles such as exosomes, microvesicles, and large oncosomes). It is preferable that the substance be capable of binding to.
  • substances for example, virus-like particles such as viruses and capsid proteins, and extracellular vesicles such as exosomes, microvesicles, and large oncosomes.
  • the magnetic particles and the photoresponsive substance will be further described.
  • the conjugate can be a detection target.
  • the size of the magnetic particles and the photoresponsive substance is excessive with respect to the size of the target substance, and only two of the magnetic particles and the photoresponsive substance can bind to the target substance. In the situation, both of the two particles that bind to the target substance become the magnetic particles or the photoresponsive substance, increasing the risk of being removed from the detection target.
  • the upper limit of the size of the magnetic particles and the photoresponsive substance is set so that three or more of the magnetic particles and the photoresponsive substance can be bonded to one target substance, It is preferable to give an opportunity for any one of the three or more magnetic particles and the photoresponsive substance to be bonded to a different type from the remaining particles (see FIG. 4).
  • FIG. 4 is an explanatory diagram showing a combined body in which a total of three magnetic particles M and photoresponsive substances O are bonded to the target substance T via the binding substances B 1 and B 2 .
  • the size of the target substance that is required to be detected using the target substance detection device (the external force assisting sensor) is generally about 1 nm to 1,000 nm.
  • the upper limit of the diameter is 6,500 nm. And is more preferably 1,000 nm.
  • the lower limit of the diameter of the magnetic particle if the magnetic particle is too small, the magnetization value of the magnetic particle becomes small, and it may be difficult to receive a sufficient force to move the optical signal. For this reason, the lower limit of the diameter of the magnetic particles is preferably 5 nm. When the diameter of the magnetic particles is 5 nm or more, detection can be performed using a magnetic field generated by a general permanent magnet.
  • the magnetic particles are preferably spherical particles having a diameter of 5 nm to 6,500 nm, and more preferably spherical particles having a diameter of 5 nm to 1,000 nm.
  • the lower limit of the diameter of the photoresponsive substance when the optical signal is generated using the scattered light, if the photoresponsive substance is too small, it cannot be detected beyond the detection limit of the optical system that performs the detection. There is a fear. Therefore, the lower limit of the diameter of the photoresponsive substance is preferably 50 nm. When the diameter of the photoresponsive substance is 50 nm or more, detection can be performed using a general light source in the visible light wavelength region (400 nm to 700 nm).
  • the photoresponsive substance is preferably a spherical particle having a diameter of 50 nm to 6,500 nm, and a spherical particle having a diameter of 50 nm to 1,000 nm when the optical signal is generated using the scattered light. It is more preferable.
  • the spherical particles include not only true spheres but also irregular spherical particles such as elliptical spheres, and the diameter of the irregular spherical particles corresponds to the maximum diameter of the particles.
  • the magnetic particles and the light with respect to the content of the target substance In the scene of preparing the liquid sample, from the viewpoint of binding three or more of the magnetic particles and the photoresponsive substance to one target substance, the magnetic particles and the light with respect to the content of the target substance. It is preferable to carry out the preparation so that the total content of responsive substances is 3 times or more. In particular, the greater the total content of the magnetic particles and the photoresponsive substance, the greater the number of bindings to the target substance, so that the target substance can be detected with high accuracy. Therefore, the magnetic particles and the photoresponsive substance may be contained in a content greater than or equal to the content that causes saturation in the binding with the target material relative to the content of the target material. In this case, the number of the target substances present in the liquid sample is unknown at the stage before detection, but an excessive amount may be introduced in view of the number of target substances assumed from a rule of thumb.
  • the method for preparing the liquid sample is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. For example, (1) after holding the analyte liquid of the target substance in the liquid sample holder, A method in which the magnetic particles bound to the first binding substance and the photoresponsive substance bound to the second binding substance are added to the sample liquid and mixed; (2) to the liquid sample holder Prior to introduction, the analyte liquid of the target substance is held in the liquid sample holder, and then the magnetic particles combined with the first binding substance and the light combined with the second binding substance Examples thereof include a method in which a responsive substance is added to the sample liquid and mixed, and a (pre-mixing method) method.
  • the magnetic particles in the mixing container and the combined body containing the magnetic particles are collected by the magnet through the mixing container, so that they do not flow down by the magnet.
  • the magnetic particles in the mixing container and the combined body containing the magnetic particles are collected by the magnet through the mixing container, so that they do not flow down by the magnet.
  • the magnetic particles in the mixing container and the combined body containing the magnetic particles are collected by the magnet through the mixing container, so that they do not flow down by the magnet.
  • contamination of the liquid sample introduced into the liquid sample holding unit can be suppressed and the introduced into the liquid sample holding unit In a liquid sample, the conjugate can be concentrated. As a result, it is possible to carry out detection with higher accuracy than when the method (1) is applied.
  • the method of adding the magnetic particles bound to the first binding substance and the photoresponsive substance bound to the second binding substance to the analyte liquid there is no particular limitation on the method of adding the magnetic particles bound to the first binding substance and the photoresponsive substance bound to the second binding substance to the analyte liquid, depending on the purpose.
  • (3) the liquid containing the magnetic particles combined with the first binding substance and the second binding substance combined with the analyte liquid A method of adding two liquids with a liquid containing a photoresponsive substance (two liquid method), and (4) the magnetic particles bound to the first binding substance and the second binding to the analyte liquid.
  • a method of adding one liquid detection solution containing the photoresponsive substance bound to the substance can be mentioned.
  • each of the target substance in the state of being bound to the binding substance with respect to the analyte liquid by preparing and storing the detection liquid in advance, each of the target substance in the state of being bound to the binding substance with respect to the analyte liquid.
  • the liquid sample can be prepared simply by mixing one detection liquid containing the magnetic particles and the photoresponsive substance, and pretreatment before detection can be efficiently performed.
  • the conjugate may be prepared to include a weight substance that promotes gravity sedimentation. That is, in the conjugate containing the weight substance, it is easy to settle on the surface of the liquid sample introduction plate, and the time until the detection operation is started can be shortened. It can be used when the specific gravity of the conjugate is small.
  • the weight substance is not particularly limited as long as it is a substance having such properties, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include known gold nanoparticles.
  • the weight substance is preferably bound to the target substance to form the conjugate. Examples of the binding method include physical adsorption, antigen-antibody reaction, binding with an aptamer, DNA hybridization, biotin-avidin binding. In addition, a known binding method such as a chelate bond or an amino bond can be used.
  • the light irradiation step includes a back side light irradiation step of irradiating the light from the back side of the liquid sample introduction plate when the liquid sample introduction plate is formed of the translucent plate, and the liquid sample introduction plate is A surface-side light irradiating step of irradiating the light from the surface side of the liquid sample introduction plate when formed by either a light-transmitting plate or the reflection plate; and the liquid sample introduction plate is formed by the introduction plate A side surface that irradiates the liquid sample held on the liquid sample introduction plate from the side surface side of the liquid sample introduction plate in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate.
  • the said back surface side light irradiation process it can implement by the said back surface side light irradiation part demonstrated in the said target substance detection apparatus.
  • the surface side light irradiation step can be performed by the surface side light irradiation unit described in the target substance detection device.
  • the side surface side light irradiation step can be performed by the side surface side light irradiation unit described in the target substance detection device.
  • the total reflected light irradiation step can be performed by the total reflected light illumination unit described in the target substance detection device.
  • the combined body in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate is moved in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate by applying a magnetic field.
  • the first combined body moving step of moving in either the direction having the vector component or the direction moving away from the liquid sample introduction plate, and the magnetic field from the magnetic field application unit arranged on the back side of the liquid sample introduction plate.
  • the combined body in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate by application is drawn onto the surface of the liquid sample introduction plate, and the magnetic field application unit is moved to the liquid while the magnetic field is applied.
  • a second coupled body moving step in which the coupled body is moved in a direction having a vector component in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the sample introduction plate, and is moved following the movement of the magnetic field application unit; Is any of the steps.
  • the first combined body moving step can be performed by the first magnetic field application unit described in the target substance detection device.
  • the second combined body moving step can be performed by the second magnetic field application unit described in the target substance detection device.
  • the first combined body moving step and the second combined body moving step can be performed repeatedly while sandwiching the optical signal detecting step, respectively, thereby increasing detection accuracy.
  • the relative position of the first magnetic field application unit with respect to the liquid sample introduction plate is changed, and the combined body is moved.
  • the combined body may be moved in a different direction.
  • the movement of the coupled body in different directions can be performed by installing a plurality of the first magnetic field application units and sequentially applying magnetic fields from different directions.
  • the second combined body moving step is repeatedly performed in the second magnetic field applying unit, the magnetic field applying unit is attached to the liquid sample introduction plate in each second combined body moving step.
  • the combined body may be moved by moving in a different direction having a vector component in a direction parallel to the in-plane direction of the surface and changing the direction in which the combined body is moved.
  • the first combined body moving step and the second combined body moving step are interwoven. Can be implemented.
  • the same effect can be obtained by moving the liquid sample introduction plate in a direction having a vector component parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate when a magnetic field is applied. May be.
  • the optical signal detection step is a step of detecting the movement of the combined body accompanying the combined body moving step by a signal change of an optical signal based on the propagating light or the near-field light.
  • the optical signal detection step is generated from the photoresponsive substance when the combined body receives the propagating light or the near-field light out of the propagating light or the optical signal based on the near-field light.
  • This is a step of detecting only an optical signal based on the conjugate in which the magnetic particles and the photoresponsive substance are bound to one target substance as a signal change target.
  • the optical signal detection step can be performed by the optical signal detection unit described in the target substance detection device.
  • the combined body attracting step is further performed by applying an attracting magnetic field after the liquid sample introduction and holding step and before the combined body moving step. This is a step of drawing all or part of the combined body in the liquid sample once onto the surface of the liquid sample introduction plate.
  • the optical signal is detected in the optical signal detecting step by focusing on the surface of the liquid sample introduction plate or in the vicinity thereof. For example, immediately after the liquid sample is introduced into the liquid sample introduction plate, the conjugate is not drawn to the surface of the liquid sample introduction plate. It is in a floating state in the liquid layer. When the floating coupled body exists outside the imageable range where the optical signal can be detected in the optical signal detection step or outside the near-field light generation region, the coupled body is not detected. Become. Therefore, when the optical signal is detected by the optical signal detection step with focusing on the surface of the liquid sample introduction plate or the vicinity thereof, the liquid sample is introduced into the liquid sample introduction plate, and then the coupling is performed.
  • the combined body moving step is the first combined body moving step
  • the combined body pulling step is further performed to shorten detection preparation time and perform more efficient detection. Is preferred.
  • the combined body drawing step can be performed by the third magnetic field application unit described in the target substance detection device.
  • the conjugate drawing step and in the case of carrying out the first conjugate moving step by moving the conjugate in a direction away from the liquid sample introduction plate, there is no particular limitation, After the liquid sample introduction and holding step, it is preferable to repeat the conjugate drawing step, the conjugate moving step, and the optical signal detection step in this order (multiple magnetic field application).
  • the alternating magnetic field By applying the alternating magnetic field, the optical signals originating from the same combined body are repeatedly detected, so that the detection accuracy can be improved.
  • it is also possible to amplify the optical signal by periodically applying the alternating magnetic field and applying a known lock-in amplifier to the frequency of the optical signal caused by the same combination. Thus, the detection sensitivity can be improved.
  • the target substance detection kit includes a magnetic particle that forms a conjugate with a target substance, a photoresponsive substance that forms the conjugate with the target substance, and a first binding substance that binds the magnetic particle to the target substance. And a second binding substance that binds the photoresponsive substance to the target substance, and the first binding substance and the second binding substance are composed of the same binding substance.
  • the detection liquid is divided into two liquids according to the difference in affinity. There is no need to determine the order of addition. Further, if the detection liquid is prepared and stored as a single liquid, the liquid sample can be prepared simply by adding the detection liquid to the analyte liquid of the target substance, and pretreatment before detection is efficient. Can be done automatically. In particular, since there is no difference in affinity between the first binding substance and the second binding substance, reactions in which these binding substances bind to the target substance occur in parallel, and the target substance and the binding substance are combined. The combined body of the magnetic particles and the photoresponsive substance via a substance can be obtained in a short time, and the time required for the pretreatment before detection can be shortened to further increase the efficiency. it can.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of the target substance detection device 1.
  • the target substance detection apparatus 1 is configured according to a known transmission microscope, and includes a liquid sample introduction plate 2, a light irradiation unit 3, a first magnetic field application unit 4, an imaging device 5a, and It is comprised with the optical signal detection part 5 comprised with the objective lens 5b.
  • the imaging device 5a is configured by, for example, a known CCD image sensor or the like, and can acquire a two-dimensional image.
  • Liquid sample introduction plate 2 the transmitted light T L of the light L liquid sample containing the magnetic particles forming the coupling member and the target substance and the target substance is irradiated from the back side while being introduced onto the surface It is formed of a translucent plate that can propagate as propagating light above the surface.
  • the liquid sample introduction plate 2 itself constitutes a liquid sample holding unit, and after the liquid sample is introduced onto the surface, a cover glass or the like is disposed so as to cover the liquid sample, whereby the liquid sample is disposed. Hold.
  • the light irradiation unit 3 is configured as a back surface side light irradiation unit that can irradiate the light L from the back surface side of the liquid sample introduction plate 2.
  • the first magnetic field application unit 4 is arranged on the surface side of the liquid sample introduction plate 2 and applies a magnetic field to the combination in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 2. Is configured to move in a direction away from the liquid sample introduction plate 2.
  • the first magnetic field applying unit 4 is formed by an annular electromagnet which through-holes are formed in the center, the optical signal is the through hole based on the transmitted light T L of the light L irradiated from the light irradiation section 3 Through the optical signal detection unit 5, the detection is possible.
  • the optical signal detection unit 5 is arranged on the surface side of the liquid sample introduction plate 2 and can detect a signal change of the optical signal based on the propagation light before and after application of the magnetic field by the first magnetic field application unit 4.
  • the target substance detection method is performed using the target substance detection apparatus 1.
  • the liquid sample is introduced and held on the surface of the liquid sample introduction plate 2 (liquid sample introduction and holding step).
  • the liquid sample includes the magnetic particles and the photoresponsive substance that form a conjugate with the target substance, the first binding substance that binds the magnetic particles to the target substance, and the light. It is important that the same binding substance is used for the first binding substance and the second binding substance, including the second binding substance that binds the responsive substance to the target substance (see FIG. 1 to 3).
  • the imageable range refers to a range in which an optical signal at the focal depth and in the vicinity thereof can be acquired.
  • FIG. 6 schematically shows a state on the surface of the liquid sample introduction plate 2 in the observation field observed by the imaging device 5a at this time.
  • the light transmitted through the liquid sample that propagates above the surface of the liquid sample introduction plate 2 is transmitted.
  • Four optical signals a to d that can be distinguished from the background signal are observed based on a contrast difference with the signal (background signal).
  • the optical signals a and d are observed as light spots, and the optical signals b and c are observed as dark spots.
  • FIG. 7 shows a state in which the substance a ′ for generating the optical signal a and the substance b ′ for generating the optical signal b at this time are viewed from the side surface of the liquid sample introduction plate 2.
  • 7 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
  • an arrow B in FIG. 7 indicates an imageable range where an optical signal can be acquired.
  • the substance a ′ and the substance b ′ are in a state of being gravity settled on the surface of the liquid sample introduction plate 2.
  • the electromagnet of the first magnetic field application unit 4 is excited to apply the magnetic field to the combined body in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 2 by applying a magnetic field. And then the combined body is moved in a direction away from the liquid sample introduction plate 2 (a combined body moving step). Next, an optical signal on the surface of the liquid sample introduction plate 2 after the combined body is moved away from the liquid sample introduction plate 2 while maintaining the imageable range and the observation field is acquired by the imaging device 5a. (Optical signal detection step).
  • FIG. 8 schematically shows the state on the surface of the liquid sample introduction plate 2 in the observation field observed by the imaging device 5a after the combined body moving step.
  • the optical signals a and b are before and after the combined body moving step.
  • the optical signal changes, and the optical signals c and d do not change before and after the combined body moving step. From this, it is understood that the substances a ′ and b ′ that generate the optical signals a and b are the combined body including the magnetic particles attracted to the first magnetic field application unit 4 and include the target substance. .
  • the optical signals c and d which are not confirmed before and after the combined body moving step, are scratches on the surface of the liquid sample introduction plate 2, adsorbed on the surface, or impurities present on the surface, light source It can be seen that this is a noise signal such as output fluctuation.
  • FIG. 9 shows a state in which the substance a ′ for generating the optical signal a and the substance b ′ for generating the optical signal b after the combined body moving step are viewed from the side surface of the liquid sample introduction plate 2.
  • 9 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. Further, an arrow B in FIG. 9 indicates an imageable range where an optical signal can be acquired.
  • the substance a ′ and the substance b ′ are moved in a direction away from the liquid sample introduction plate 2 by the application of the magnetic field by the first magnetic field application unit 4.
  • the size of the light spot is observed large before and after the combined body moving step (see FIG. 8). This is based on the depth of focus in a state where the surface of the liquid sample introduction plate 2 is in focus before the combined body moving step, although the substance a ′ is present within the imageable range of the optical signal detection unit 5. Since it is off, the size of the light spot is observed large (see FIG. 9). On the other hand, it is confirmed that the optical signal b disappears after the combined body moving step (see FIG. 8). This is because the substance b ′ has moved out of the imageable range of the optical signal detector 5 (see FIG. 9).
  • the optical signal based on the target substance is adsorbed on the surface of the liquid sample introduction plate 2 or is present on the surface.
  • the target substance can be detected with high accuracy because it can be clearly distinguished and detected from noise signals such as impurities and fluctuations in light source output. Further, even when the contaminants are adsorbed on the surface of the liquid sample introduction plate 2, since the detection can be performed while ignoring its presence, the cleaning process for the liquid sample introduction plate 2 is not necessarily performed for each detection. Efficient detection can be performed without the need to do so.
  • the target substance can be detected efficiently, accurately, and stably.
  • FIG. 10 is an explanatory diagram of the target substance detection apparatus 1A.
  • the target substance detection device 1 ⁇ / b> A is configured by further arranging a third magnetic field application unit 6 with respect to the target substance detection device 1.
  • description is abbreviate
  • the third magnetic field application unit 6 is arranged on the back side of the liquid sample introduction plate 2 and the combined body in the liquid sample introduced into the liquid sample introduction plate 2 is applied to the liquid sample introduction plate 2 by applying a magnetic field. It can be drawn onto the surface, and here is formed of an annular electromagnet having a through hole, and the light irradiation unit 3 can irradiate light from the back side of the liquid sample introduction plate 2 through the through hole.
  • the conjugate that floats in the liquid layer of the liquid sample after the liquid sample introduction / holding step becomes the Without waiting for gravity sedimentation on the surface, after the liquid sample introduction and holding step and before the combined body moving step, the binding in the liquid sample is performed by applying a pulling magnetic field in the third magnetic field application unit 6. All or a part of the body can be once drawn on the surface of the liquid sample introduction plate 2 (a combined body drawing step). Therefore, according to the first modification of the first embodiment, in addition to the advantages of the first embodiment, the time required for detection is shortened and the target substance is detected more efficiently. be able to.
  • FIG. 11 is explanatory drawing of the target substance detection apparatus 1B.
  • the target substance detection device 1 ⁇ / b> B is configured by arranging a first magnetic field application unit 7 instead of the first magnetic field application unit 4 in the target substance detection device 1.
  • description is abbreviate
  • the first magnetic field application unit 7 is configured by an electromagnet, and is detected on the surface of the liquid sample introduction plate 2 (received by the light irradiation unit 3 on the back surface side, and propagates above the surface).
  • the region in the liquid sample introduction plate 2 is disposed obliquely above the surface of the liquid sample introduction plate 2 and is applied to the surface of the liquid sample introduction plate 2 by applying a magnetic field. Move in a direction having a vector component in a direction parallel to the in-plane direction (first combined body moving step).
  • FIG. 12 schematically shows the state on the surface of the liquid sample introduction plate 2 in the observation field of view observed by the imaging device 5a after the first combined body moving step performed using the first magnetic field application unit 7. Shown in The state before the first combined body moving step is the same as in FIG.
  • the optical signals a and b are The optical signal changes before and after the first combined body moving process, and the optical signals of the optical signals c and d do not change before and after the first combined body moving process. Therefore, according to the second modification of the first embodiment, as in the first embodiment, the substances a ′ and b ′ that generate the optical signals a and b include the target substance, and the optical signal c , D can be determined as noise signals such as scratches on the surface of the liquid sample introduction plate 2, adsorption on the surface or impurities existing on the surface, fluctuations in light source output, and the like.
  • FIG. 13 shows the state when viewed from above.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. Further, an arrow B in FIG. 13 indicates an imageable range where an optical signal can be acquired.
  • the substance a ′ and the substance b ′ are each parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 2 by the magnetic field attracted from the oblique upper side by the first magnetic field application unit 7.
  • the first embodiment in which the substance a ′ and the substance b ′ are moved only in the direction away from the liquid sample introduction plate 2 and the first combined body moving step. The situation after is different.
  • the optical signal b is the result of the disappearance of the optical signal in both figures.
  • the optical signal a in the case shown in FIG. 8, only the target substance is detected based on the size change, and the target substance cannot be detected based on the movement, whereas in the case shown in FIG.
  • the case shown in FIG. 12 is easier to detect the target substance in that the target substance can be detected based on movement in addition to the detection of the target substance based on the change. Therefore, in the second modification of the first embodiment, the target substance can be detected with higher accuracy.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram of the target substance detection device 10.
  • the target substance detection apparatus 10 is configured according to a known transmission microscope, and includes a liquid sample introduction plate 12, a light irradiation unit 13, a second magnetic field application unit 18, and an imaging device 15a. And the optical signal detection unit 15 including the objective lens 15b.
  • the liquid sample introduction plate 12, the light irradiation unit 13, and the optical signal detection unit 15 are configured in the same manner as the liquid sample introduction plate 2, the light irradiation unit 3, and the optical signal detection unit 5 in the target substance detection device 1 of the first embodiment.
  • the target substance detection apparatus 10 is different from the target substance detection apparatus 1 in that a second magnetic field application unit 18 is provided instead of the first magnetic field application unit 4.
  • a second magnetic field application unit 18 is provided instead of the first magnetic field application unit 4.
  • the second magnetic field application unit 18 is disposed on the back surface side of the liquid sample introduction plate 12, and the combined body in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 12 is liquidated by applying a magnetic field. It can be drawn onto the surface of the sample introduction plate 12 and can be moved in a direction having a vector component in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 12 with the magnetic field applied.
  • the second magnetic field applying unit 18 is formed out with sliding member for sliding said permanent magnet and the permanent magnet of annular through holes are formed in the direction of the X 1 or X 2 (not shown),
  • the light irradiation unit 13 can irradiate light from the back side of the liquid sample introduction plate 12 through the through hole.
  • the combined sample is moved by using the second magnetic field application unit 18 as a magnetic field application unit, and the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 12 by application of the magnetic field from the second magnetic field application unit 18.
  • the combined body in the liquid sample introduction plate 12 is attracted to the surface of the liquid sample introduction plate 12 and the second magnetic field application unit 18 is applied in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 12 with the magnetic field applied.
  • the movement is performed in a direction having a vector component, and the combined body is moved following the movement of the second magnetic field applying unit 18 (second combined body moving step).
  • the 2nd magnetic field application part 18 is comprised by the some member arrange
  • the second magnetic field application unit 18 in the second combined body moving step, all or a part of the combined body in the liquid sample is applied on the surface of the liquid sample introduction plate 12 by applying the magnetic field. Therefore, after the liquid sample introduction and holding step, there is no need to wait for the conjugate floating in the liquid layer of the liquid sample to gravity settle on the surface of the liquid sample introduction plate 12.
  • FIG. 15 schematically shows a state on the surface of the liquid sample introduction plate 12 in the observation field of view observed by the imaging device 15a after the second combined body moving step.
  • the state before the second combined body moving step is the same as in FIG.
  • the optical signals a and b are obtained before and after the second combined body moving step.
  • the optical signals c and d do not change before and after the second combined body moving step.
  • the substances a ′ and b ′ that generate the optical signals a and b include the target substance, and the optical signals c and d are scratches on the surface of the liquid sample introduction plate 12, It can be determined that the signal is a noise signal such as a foreign matter adsorbed on the surface or a contaminant present on the surface, or a fluctuation in light source output.
  • FIG. 16 shows a state when the substance a ′ that generates the optical signal a and the substance b ′ that generates the optical signal b are viewed from the side surface of the liquid sample introduction plate 12 after the second combined body moving step.
  • FIG. 16 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. Note that an arrow B in FIG. 16 indicates an imageable range where an optical signal can be acquired.
  • the substance a ′ and the substance b ′ are attracted onto the surface of the liquid sample introduction plate 12 by application of the magnetic field from the second magnetic field application unit 18, and then applied with the second magnetic field. Based on the movement (direction X 1 or X 2 in FIG.
  • the second magnetic field application section 18 Is moved in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 12.
  • 15 and 16 show an example in which the substance a ′ and the substance b ′ move within the observation field of view, but the second magnetic field application unit 18 is arranged in the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 12.
  • the optical system is irradiated with light from the back side of the liquid sample introduction plates 2 and 12 according to the configuration of a known upright microscope, and the front side
  • the optical signal based on the propagating light transmitted to the optical signal is detected by the optical signal detectors 5 and 15, and light is irradiated from the surface side of the liquid sample introduction plate according to the configuration of a known inverted microscope.
  • the optical signal based on the propagating light transmitted to the back side may be detected by the optical signal detection unit arranged on the back side.
  • FIG. 17 is an explanatory diagram of the target substance detection device 20.
  • the target substance detection device 20 is configured according to a known epi-illumination microscope, and includes a liquid sample introduction plate 22, a light irradiation unit 23, a first magnetic field application unit 24, an imaging device 25a,
  • the optical signal detector 25 includes an objective lens 25b and a half mirror (such as a dichroic mirror) 25c.
  • the imaging device 25a is configured with, for example, a known CCD image sensor or the like, and can acquire a two-dimensional image.
  • the half mirror 25c is also used as an optical element of the light irradiation unit 23 for introducing irradiation light onto the surface of the liquid sample introduction plate 22 by reflection.
  • the liquid sample introduction plate 22 is formed by the propagation possible reflector to said surface upward reflected light R L as the propagation of the light L emitted from the front surface side while being introduced onto the surface
  • the liquid sample introduction plate 22 itself constitutes the liquid sample holding unit, and after the liquid sample is introduced onto the surface, a cover glass or the like is disposed so as to cover the liquid sample, whereby the liquid is introduced. Hold the sample.
  • the light irradiation unit 23 is configured as a surface-side irradiation unit that can irradiate the light L from the surface side of the liquid sample introduction plate 22 by the reflected light from the half mirror 25c.
  • the first magnetic field application unit 24 is arranged on the surface side of the liquid sample introduction plate 22 and applies a magnetic field to the conjugate in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 22. Is configured to move away from the liquid sample introduction plate 22.
  • the first magnetic field application unit 24 is formed of an annular electromagnet having a through hole formed in the center, and the light L emitted from the light irradiation unit 23 is applied to the liquid sample introduction plate 22 through the through hole. optical signal based on the reflected light R L of the light L while being capable radiation is detectable by the optical signal detection unit 25 through the through hole.
  • the optical signal detection unit 25 is arranged on the surface side of the liquid sample introduction plate 22 and can detect a signal change of the optical signal based on the propagation light before and after application of the magnetic field by the first magnetic field application unit 24.
  • the Note that the liquid sample introduction plate 22, the light irradiation unit 23, and the optical signal detection unit 25 (the imaging device 25a, the objective lens 25b, and the half mirror 25c) can be configured according to a known episcopic microscope.
  • the target substance detection method according to the third embodiment is performed using the target substance detection device 20.
  • the liquid sample is introduced and held on the surface of the liquid sample introduction plate 22 (liquid sample introduction and holding step).
  • the liquid sample includes the magnetic particles and the photoresponsive substance that form a conjugate with the target substance, the first binding substance that binds the magnetic particles to the target substance, and the light. It is important that the same binding substance is used for the first binding substance and the second binding substance, including the second binding substance that binds the responsive substance to the target substance (see FIG. 1 to 3).
  • the light L irradiated from the light irradiation unit 23 is liquidated via the half mirror 25c.
  • the surface of the sample introduction plate 22 is irradiated (light irradiation step)
  • the irradiation objective lens 25b is adjusted to place the surface or the vicinity thereof within the imageable range
  • the imaging device 25a emits the light L on the surface.
  • An optical signal based on the reflected light RL is acquired (optical signal detection step).
  • the electromagnet of the first magnetic field application unit 24 is excited to apply the combined body in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 22 by applying a magnetic field. And the combined body is moved in a direction away from the liquid sample introduction plate 22 (first combined body moving step).
  • an optical signal on the surface of the liquid sample introduction plate 22 after the combined body is moved in a direction away from the liquid sample introduction plate 22 while maintaining the imageable range and the observation field of view is acquired by the imaging device 25a. (Optical signal detection step).
  • optical signals before and after the first combined body moving step in the optical signal detecting step are obtained as shown in FIGS. 6 and 8, and light based on the target substance is obtained.
  • the signal can be detected by clearly distinguishing it from noise signals such as scratches on the surface of the liquid sample introduction plate 22, adsorption on the surface or contaminants existing on the surface, fluctuations in the light source output, and the like. Therefore, according to the third embodiment, the target substance can be detected with high accuracy. Further, even when the contaminants are adsorbed on the surface of the liquid sample introduction plate 22, since the detection can be performed while ignoring its presence, the cleaning process for the liquid sample introduction plate 22 is not necessarily performed for each detection. Efficient detection can be performed without the need to do so.
  • an optical signal generated based on various phenomena such as the scattered light, the reflected light, the fluorescence, and the light absorption can be handled as an identification signal, and can be expected to be used in a wide range of fields.
  • a phenomenon of disappearing in addition to the defocus can be used, so that the change of the optical signal can be clearly captured.
  • the target substance since the same binding substance is used for the first binding substance and the second binding substance, the target substance can be detected efficiently, accurately, and stably.
  • FIG. 18 is an explanatory diagram of the target substance detection device 20A.
  • a third magnetic field application unit 26 is further arranged with respect to the target substance detection device 20, and the first magnetic field application unit 24 is replaced with the first magnetic field.
  • the application unit 27 is arranged.
  • description is abbreviate
  • the third magnetic field application unit 26 is formed of an electromagnet, and is disposed on the back side of the liquid sample introduction plate 22, and the combination in the liquid sample introduced into the liquid sample introduction plate 22 is liquidated by applying a magnetic field. It can be drawn onto the surface of the sample introduction plate 22.
  • the third magnetic field application unit 26 as in the case of using the target substance detection device 20, after the liquid sample introduction and holding step, the combined body floating in the liquid layer of the liquid sample is a liquid sample introduction plate. Without waiting for gravity sedimentation on the surface of 22, after the liquid sample introduction and holding step, and before the combined body moving step, by applying a drawing magnetic field in the third magnetic field application unit 26, All or a part of the combined body can be once drawn on the surface of the liquid sample introduction plate 22 (a combined body drawing step). Therefore, according to the modification of the third embodiment, in addition to the advantages of the third embodiment, the time required for detection can be shortened and the target substance can be detected more efficiently. .
  • the first magnetic field application unit 27 is composed of an electromagnet, and is arranged on the side of the liquid sample introduction plate 22, and the coupling in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 22.
  • the body is moved in a direction having a vector component parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 2 by applying a magnetic field (first combined body moving step).
  • first magnetic field application unit 27 is used instead of the first magnetic field application unit 24
  • optical signals before and after the first combined body movement step in the optical signal detection step are obtained as shown in FIGS.
  • the optical signal based on the target substance is clearly distinguished from noise signals such as scratches on the surface of the liquid sample introduction plate 22, adsorption on the surface or impurities existing on the surface, fluctuations in light source output, etc. Can be detected.
  • FIG. 19 is an explanatory diagram of the target substance detection device 30.
  • the target substance detection device 30 is configured according to a known epi-illumination microscope, and includes a liquid sample introduction plate 32, a light irradiation unit 33, a second magnetic field application unit 38, and an imaging device 35a. And an optical signal detection unit 35 including an objective lens 35b and a half mirror 35c.
  • the liquid sample introduction plate 32, the light irradiation unit 33, and the optical signal detection unit 35 are configured in the same manner as the liquid sample introduction plate 22, the light irradiation unit 23, and the optical signal detection unit 25 in the target substance detection device 20 of the third embodiment.
  • the target substance detection device 30 is different from the target substance detection device 20 in that a second magnetic field application unit 38 is provided instead of the first magnetic field application unit 24.
  • a second magnetic field application unit 38 is provided instead of the first magnetic field application unit 24.
  • the second magnetic field application unit 38 is arranged on the back surface side of the liquid sample introduction plate 32 and applies the liquid to the combined body in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 32 by applying a magnetic field. It can be drawn onto the surface of the sample introduction plate 32 and can be moved in a direction having a vector component in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 32 with the magnetic field applied.
  • the second magnetic field applying unit 38 is formed out with sliding member for sliding said permanent magnet and the permanent magnet in the direction of the X 1 or X 2 (not shown).
  • the combined body in the liquid sample introduction plate 32 is attracted to the surface of the liquid sample introduction plate 32 and the second magnetic field application unit 38 is applied in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 32 with the magnetic field applied.
  • the movement is performed in a direction having a vector component, and the combined body is moved following the movement of the second magnetic field applying unit 38 (second combined body moving step).
  • the 2nd magnetic field application part 38 is comprised by the some member arrange
  • the second magnetic field application unit 38 in the second combined body moving step, all or part of the combined body in the liquid sample is applied on the surface of the liquid sample introduction plate 32 by applying the magnetic field. Therefore, it is not necessary to wait for the combined substance floating in the liquid layer of the liquid sample to gravity settle on the surface of the liquid sample introduction plate 2 after the liquid sample introduction and holding step.
  • optical signals before and after the second combined body moving step in the optical signal detecting step are obtained as shown in FIGS. 6 and 15, and light based on the target substance is obtained.
  • the signal can be detected by clearly distinguishing it from noise signals such as scratches on the surface of the liquid sample introduction plate 32, adsorption on the surface or impurities existing on the surface, and fluctuations in the light source output.
  • FIG. 15 shows an example in which the substance a ′ and the substance b ′ move within the observation field.
  • the second magnetic field application unit 38 is parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 32.
  • the distance a is longer than the length of the one side.
  • the substance b ′ can be moved out of the observation field, and highly accurate detection based on the disappearance of the optical signals a and b can be performed.
  • optical signal based on the conjugate examples are shown in FIGS. 6, 8, 12, and 15, and it has been described that the optical signal is caused by the scattered light, the reflected light, the fluorescence, This is for convenience of drawing display, and the optical signal may be an optical signal resulting from the transmitted light due to the phase difference, the differential interference, or the like.
  • the optical signal may be an optical signal resulting from the transmitted light due to the phase difference, the differential interference, or the like.
  • the position movement, the defocus, and the disappearance examples are shown in FIGS. 8, 12, and 15, and the position movement, the defocus, and the disappearance have been described.
  • FIG. 20 is an explanatory diagram of the target substance detection device 40.
  • the target substance detection device 40 is configured according to a known waveguide mode sensor, and includes a liquid sample introduction plate 42, a light irradiation unit including a light source 43a and an optical prism 43b, and a third A magnetic field application unit 46, a first magnetic field application unit 47, and an optical signal detection unit 45 (imaging device) are included.
  • the imaging device is constituted by, for example, a known CCD image sensor or the like, and can acquire a two-dimensional image.
  • the third magnetic field applying unit 46 controls the on / off of the magnetic field application by moving the permanent magnet and the permanent magnet away from or close to the optical prism 43b (see directions Y 1 and Y 2 in FIG. 20).
  • the liquid sample introduction plate 42 is formed by a moving member (not shown), arranged on the back side of the liquid sample introduction plate 42 and the combined body in the liquid sample introduced into the liquid sample introduction plate 42 by applying a magnetic field. It is possible to draw on the surface.
  • the liquid sample introduction plate 42 is capable of generating near-field light above the surface when the liquid sample E is introduced onto the surface and irradiated with the light L irradiated on the surface under total reflection conditions. It is formed with a detection plate. Further, the liquid sample introduction plate 42 itself constitutes the liquid sample holding unit, and after the liquid sample E is introduced onto the surface, the cover glass G is disposed so as to cover the liquid sample. A liquid sample E is held.
  • the light irradiation unit is configured as a total reflection light irradiation unit that can irradiate the surface of the liquid sample introduction plate 42 with the light L from the light source 43a through the optical prism 43b under total reflection conditions. .
  • the total reflection light irradiation unit introduces the light L emitted from the light source 43a under the total reflection condition to the surface of the liquid sample introduction plate 42 via a grating, for example, instead of the optical prism 43b. It can also be configured.
  • the first magnetic field application unit 47 controls on / off of the magnetic field application by moving the permanent magnet and the permanent magnet away from or close to the optical prism 43b (see directions X 1 and X 2 in FIG. 20). Formed by a slide moving member (not shown), disposed on the side of the liquid sample introduction plate 42, and the combined body in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 42 by applying a magnetic field.
  • the liquid sample introduction plate 42 is configured to move in a direction having a vector component in a direction parallel to the in-plane direction of the surface.
  • the target substance detection method according to the fifth embodiment is performed.
  • the liquid sample is introduced and held on the surface of the liquid sample introduction plate 42 (liquid sample introduction and holding step).
  • the liquid sample includes the magnetic particles and the photoresponsive substance that form a conjugate with the target substance, the first binding substance that binds the magnetic particles to the target substance, and the light. It is important that the same binding substance is used for the first binding substance and the second binding substance, including the second binding substance that binds the responsive substance to the target substance (see FIG. 1 to 3).
  • the combined body floating in the liquid layer of the liquid sample is attracted onto the surface of the liquid sample introduction plate 42.
  • the light L emitted from the light source 43a is applied to the surface of the liquid sample introduction plate 42 through the optical prism 43b under a total reflection condition (light irradiation process), and the optical signal detector 45 applies the light on the surface.
  • An optical signal S based on near-field light is acquired (optical signal detection step).
  • the slide moving member in the third magnetic field applying unit 46 is operated to turn off the magnetic field from the third magnetic field applying unit 46
  • the slide moving member in the first magnetic field applying unit 47 is operated to operate the first magnetic field applying unit 47.
  • the magnetic field from the magnetic field application unit 47 is turned on, and the combined body in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 42 is drawn toward the first magnetic field application unit 47 by applying a magnetic field, and The coupled body is moved in a direction having a vector component parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 42 by applying a magnetic field (first coupled body moving step).
  • the optical signal on the surface of the liquid sample introduction plate 42 after the combined body is moved while maintaining the observation visual field is acquired by the optical signal detection unit 45 (optical signal detection step).
  • the optical signals before and after the first combined body moving step in the optical signal detecting step are obtained as shown in FIGS. 21 and 22, and the optical signal based on the target substance is obtained.
  • e and g can be detected by clearly distinguishing them from noise signals f such as scratches on the surface of the liquid sample introduction plate 42, adsorption on the surface or impurities existing on the surface, fluctuations in the light source output, and the like.
  • FIG. 21 is a diagram showing a state on the surface of the liquid sample introduction plate 42 before the conjugate moving step
  • FIG. 22 is a diagram on the surface of the liquid sample introduction plate 42 after the conjugate moving step.
  • the optical signal obtained by using the near-field light has a dark field as a background due to the attenuation of the near-field light. Based on this, the target substance is detected.
  • the appearance of an optical signal based on movement from outside the observation field of view can also be a detection target.
  • the detection can be performed while ignoring the presence of the impurities, and therefore the cleaning process for the liquid sample introduction plate 42 is not necessarily performed for each detection. Efficient detection can be performed without the need to do so.
  • an optical signal generated based on the phenomenon such as the scattered light and the fluorescence can be handled as an identification signal.
  • the appearance / disappearance phenomenon can also be used as the mode of change of the optical signal, so that the change of the optical signal can be clearly captured.
  • the target substance can be detected efficiently, accurately, and stably.
  • FIG. 23 is an explanatory diagram of the target substance detection device 50.
  • the target substance detection device 50 is configured according to a known waveguide mode sensor, and includes a liquid sample introduction plate 52, a light irradiation unit including a light source 53a and an optical prism 53b, a second The magnetic field applying unit 58 and the optical signal detecting unit 55 are configured.
  • the liquid sample introduction plate 52, the light irradiation unit, and the optical signal detection unit 55 are configured in the same manner as the liquid sample introduction plate 42, the light irradiation unit, and the optical signal detection unit 45 in the target substance detection device 40 of the fifth embodiment.
  • the target substance detection device 50 is different from the target substance detection device 40 in that a second magnetic field application unit 58 is provided in place of the first magnetic field application unit 47 and the third magnetic field application unit 46. .
  • a second magnetic field application unit 58 is provided in place of the first magnetic field application unit 47 and the third magnetic field application unit 46.
  • the second magnetic field application unit 58 is arranged on the back surface side of the liquid sample introduction plate 52 and applies the liquid to the combination in the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 52 by applying a magnetic field. It can be drawn onto the surface of the sample introduction plate 52 and can be moved in a direction having a vector component in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 52 with the magnetic field applied.
  • the second magnetic field applying unit 58 is formed out with sliding member for sliding said permanent magnet and the permanent magnet in the direction of the X 1 or X 2 (not shown).
  • the combined sample is moved by using the second magnetic field application unit 58 as a magnetic field application unit, and the liquid sample introduced onto the surface of the liquid sample introduction plate 52 by application of the magnetic field from the second magnetic field application unit 58.
  • the combined body in the liquid sample introduction plate 52 is attracted to the surface of the liquid sample introduction plate 52 and the second magnetic field application unit 58 is applied in a direction parallel to the in-plane direction of the surface of the liquid sample introduction plate 52 with the magnetic field applied.
  • the movement is performed in the direction having the vector component, and the combined body is moved following the movement of the second magnetic field applying unit 58 (second combined body moving step).
  • the 2nd magnetic field application part 58 is comprised by the some member arrange
  • the second magnetic field application unit 58 in the second combined body moving step, all or a part of the combined body in the liquid sample is placed on the surface of the liquid sample introduction plate 52 by applying the magnetic field. Therefore, it is not necessary to wait for the combined substance floating in the liquid layer of the liquid sample to gravity settle on the surface of the liquid sample introduction plate 52 after the liquid sample introduction and holding step.
  • FIGS. 24 and 25 optical signals before and after the second conjugate moving step in the optical signal detecting step are obtained as shown in FIGS. 24 and 25, and the optical signal based on the target substance is obtained. h can be detected by clearly distinguishing it from a noise signal i such as a scratch on the surface of the liquid sample introduction plate 52, adsorption on the surface or impurities existing on the surface, and fluctuations in the light source output.
  • FIG. 24 is a diagram showing a state on the surface of the liquid sample introduction plate 52 before the conjugate moving step
  • FIG. 25 is a diagram on the surface of the liquid sample introducing plate 52 after the conjugate moving step.
  • the target substance detection devices of the fifth and sixth embodiments are configured according to the configuration of the waveguide mode sensor, as a modification of these embodiments, liquid sample introduction plates 42 and 52 are provided.
  • the detection plate used in the surface plasmon resonance sensor and the optical system as an optical system used in the surface plasmon resonance sensor the detection of the target substance based on the movement of the conjugate is performed similarly to these embodiments. It can be performed.
  • an optical system that uses near-field light generated by total reflection for illumination such as an optical system of a known total reflection microscope, can also be used.
  • the liquid sample introduction plate is configured using the translucent plate, the reflection plate, and the detection plate, but may be configured using the introduction plate. Good.
  • the side light irradiation unit is employed as the light irradiation unit, and in the optical signal detection unit disposed on the front surface side or the back surface side of the liquid sample introduction plate, scattered light from the combined body, It can be set as the structure which detects reflected light etc.
  • the optical signal detection unit arranged on the side of the liquid sample introduction plate (the side opposite to the side on which the side light irradiation unit of the liquid sample introduction plate is arranged), It can be set as the structure which detects light absorption, transmitted light, etc.
  • Example 1 As Example 1, the target substance detection test using the target substance detection apparatus (external force support type sensor) was performed as follows.
  • Example 1 a target substance detection apparatus manufactured according to the configuration of the target substance detection apparatus 40 of the fifth embodiment shown in FIG. 20 is used.
  • the liquid sample introduction plate 42 a planar waveguide chip in which a 25 nm thick Si layer and a 343 nm thick SiO 2 layer are laminated in this order on a 0.725 mm thick SiO 2 substrate is used. It was.
  • a light source 43a is connected to a green LED light source (Thorlabs, model number M530F2) by connecting an optical fiber having a core diameter of 600 ⁇ m with a collimating lens attached to the exit end, and an air slit having a width of 500 ⁇ m disposed at the end of the exit end.
  • a prism 43b made of SiO 2 glass having a base angle of 35 degrees is disposed on the back surface of the liquid sample introduction plate 42 in an optically close contact with the incident surface of the prism 43b at an angle parallel to the surface of the liquid sample introduction plate 42. In this case, the light from the light source 43a is made incident.
  • virus-like particles of Norovirus were used.
  • magnetic particles magnetic beads having a diameter of 25 nm (NANOCS, Magnetic Nanoparticles, Protein G Labeled, model number MP25-PG) were used.
  • photoresponsive substance 60 nm diameter gold nanoparticles (Cytodiagnostics, 60 nm NHS-Activated Gold Nanoparticle Conjugation Kit, model number CGN10K-60) were used.
  • binding substance an anti-Norovirus monoclonal antibody was used.
  • the detection liquid one liquid
  • the detection liquid one liquid
  • this detection liquid is used as an analyte liquid of the target substance. Prepared by mixing.
  • the usage-amount of the said detection liquid is 100 microliters, and the density
  • the amount of the analyte liquid used is 100 ⁇ L, and the concentration of the target substance in the analyte liquid is 1 fg / L.
  • a specific method for detecting the target substance is as follows. First, 30 ⁇ L of the liquid sample was introduced into the liquid sample holder formed by installing a 1 mm thick silicon rubber sheet having a 6 mm diameter through hole on the liquid sample introduction plate 42. After introducing the liquid sample, a cover glass G is disposed to cover the liquid sample holding unit, and the third magnetic field applying unit 46 disposed on the bottom surface side of the prism 43b is turned on, whereby the magnetic particles are liquidated. The sample was drawn on the surface of the sample introduction plate 42. The third magnetic field application unit 46 was a neodymium magnet fixed to a slide member.
  • a near field is formed on the surface of the liquid sample introduction plate 42 by irradiation of the incident light, and a neodymium magnet fixed to the slide member disposed on the side surface of the prism 43b is used.
  • the first magnetic field application unit 47 was turned on, and the state on the surface of the liquid sample introduction plate 42 was observed with a moving image by the optical signal detection unit 45 to detect the optical signal.
  • an optical microscope equipped with a 4 ⁇ objective lens and an uncooled CMOS camera manufactured by Basler, model number acA2440-35uc
  • the optical signal detection unit 45 imaging device
  • a CMOS camera provided with a 4 ⁇ objective lens is used. Since the gold nanoparticles used as the photoresponsive substance cause localized plasmon resonance due to light irradiation by the light source 43a, the imaging device uses the photoresponsive substance enhanced by the localized plasmon resonance. Scattered light is observed.
  • the detection of the target substance by the target substance detection method according to the first embodiment includes the first detection performed within 5 minutes after mixing the detection liquid with the analyte liquid of the target substance, and the prepared liquid sample. Was stored twice in the refrigerator for the second detection.
  • an anti-norovirus polyclonal antibody is used, except that the anti-norovirus polyclonal antibody is bound to the magnetic particles, and the anti-norovirus monoclonal antibody is bound to the photoresponsive substance.
  • the optical signal is detected by the same method as the target substance detection method according to Example 1, and the magnetic material obtained by binding the anti-norovirus polyclonal antibody to the analyte liquid of the target substance first.
  • the liquid sample is prepared by adding the photoresponsive substance bound with the anti-norovirus monoclonal antibody, and the first detection and preparation performed after 15 minutes as the reaction time, The liquid sample was stored twice in the refrigerator for the second detection.
  • the amount of the first liquid containing the anti-norovirus polyclonal antibody bound to the magnetic particles is 50 ⁇ L, and the concentration of the anti-norovirus polyclonal antibody in the first liquid is 0.1 pg / L. .
  • the amount of the second solution containing the anti-norovirus monoclonal antibody bound to the photoresponsive substance is 50 ⁇ L, and the concentration of the anti-norovirus monoclonal antibody in the second solution is 2.5 pg / L. It is.
  • the amount of the analyte liquid used and the concentration of the target substance in the analyte liquid are the same as in Example 1.
  • FIG. 26A shows an image at one time point in the moving image of the first detection by the target substance detection method according to the first embodiment
  • FIG. 26B shows the first time by the target substance detection method according to the first embodiment.
  • An image after 7 seconds from the one time point in the moving image of detection is shown.
  • FIG. 27A shows an image at one time point in the moving image of the second detection by the target substance detection method according to the first embodiment
  • FIG. 27B shows the target substance detection method according to the first embodiment.
  • FIG. 28A shows an image at one time point in the moving image of the first detection by the target substance detection method according to Comparative Example 1
  • FIG. 28B shows the target substance detection method according to Comparative Example 1.
  • An image after 6.3 seconds from the one time point in the moving image detected for the first time is shown.
  • FIG. 29A shows an image at one point in the moving image of the second detection by the target substance detection method according to Comparative Example 1
  • FIG. 29B shows the target substance detection method according to Comparative Example 1.
  • An image after 2.7 seconds from the one time point in the moving image detected for the second time is shown.
  • 26 (a) to 29 (b) the background is white and the optical signal detection position is black.
  • the field of view in each of FIGS. 26A to 29B is approximately 1.9 mm ⁇ 1.6 mm.
  • the circled portions indicate the light spots that have moved before and after the movement of the magnet. It is confirmed that the light spot is moving in the direction (direction in which the magnetic particles are attracted by the first magnetic field application unit 47).
  • the timing for acquiring the image shown in each figure (b) is random, but this moves among a plurality of images acquired for each elapsed time. This is because a light spot that can be clearly confirmed is selected.
  • the target substance detection methods according to Example 1 and Comparative Example 1 were performed twice each for a total of four times.
  • measurement results obtained by a three-point measurement method for observing the state before and after the movement of the magnet at arbitrary three locations having different fields of view will be described.
  • the three-point measurement method the number of light spots moved during 40 seconds of camera observation is measured, and the measurement result is evaluated by the average value of the number of light spots moved at three locations.
  • a measurement result with the average value being 2.7 was obtained in the first detection by the target substance detection method according to Example 1.
  • a measurement result having the average value of 2.7 was obtained in the second detection by the target substance detection method according to Example 1, as in the first detection.
  • a measurement result with the average value being 3.0 was obtained in the first detection by the target substance detection method according to Comparative Example 1.
  • a measurement result was obtained in which the average value was significantly lower than the average value of the first detection and the average value was 0.3.
  • a control test was performed using a control liquid sample in which a phosphate buffer solution containing no target substance was used instead of the sample liquid of the target substance. Since no moving light spot is confirmed, it is concluded that the moved light spot is a light spot based on a conjugate in which the magnetic substance and the photoresponsive substance are bound to the target substance via the binding substance. Can do.
  • the average value is used in the target substance detection method according to Example 1 using the liquid sample in which the same binding substance (anti-norovirus monoclonal antibody) is bound to the magnetic particle and the photoresponsive substance. Is the same in the first detection and the second detection (both are 2.7), there is no fluctuation with the passage of time, and a stable detection result can be obtained.
  • the target substance detection method according to Comparative Example 1 using the liquid sample in which the binding substances (anti-Noro monoclonal antibody and anti-Norovirus polyclonal antibody) that are different between the magnetic particles and the photoresponsive substance are bound Since the average value (0.3) of the first detection is substantially lower than the average value (3.0) of the first detection and becomes almost zero, the detection result is unstable due to fluctuations with time. It turns out that it is. Further, the average value (2.7) of the first detection by the target substance detection method according to Example 1 is compared with the average value (3.0) of the first detection by the target substance detection method according to Comparative Example 1.
  • the target substance detection method according to Example 1 Since the average value (2.7) of the second detection by the target substance detection method according to Example 1 is not inferior at the same time, the target substance detection method according to Example 1 has a high-precision detection result. It can be seen that can be obtained stably. In addition, in the target substance detection method according to Example 1, since the liquid sample in which the same binding substance (anti-Norovirus monoclonal antibody) is bound to the magnetic particles and the photoresponsive substance is used, the binding substance is used.

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Abstract

【課題】外力支援型センサを用いて、効率的で、高精度かつ安定的に標的物質を検出可能な標的物質検出方法及び標的物質検出キットを提供すること。 【解決手段】外力支援型センサに用いられる液体試料が、それぞれ標的物質Ｔと結合体を形成する磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏと、磁性粒子Ｍを標的物質Ｔに結合させる第１の結合物質Ｂ１と、光応答性物質Ｏを標的物質Ｔに結合させる第２の結合物質Ｂ２とを含み、第１の結合物質Ｂ１と第２の結合物質Ｂ２とで同一の結合物質を用いることとする。

Description

標的物質検出方法及び標的物質検出キット
　本発明は、液体試料中に存在する標的物質を磁場を利用して移動させたときの光信号の変化を利用して前記標的物質を検出する標的物質検出方法及び前記標的物質検出方法の実施に好適に用いられる標的物質検出キットに関する。
　近年、溶液中に存在する微小物質、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、細菌等の生体関連物質を標的物質として、これらを検出・定量する方法の開発が進められている。
　前記標的物質に磁性粒子を結合させた結合体を磁場の印加前後で比較観察することで前記標的物質の検出を行う外力支援型センサ｛例えば、外力支援近接場照明バイオセンサ（External-Force-Assisted Near Field Illumination Biosensor）、非特許文献１，２参照｝は、その一つであり、前記磁性粒子と結合した前記標的物質に基づく光信号が前記磁場の印加前後で移動する一方、検出に用いる検出チップ表面のキズ等に由来するノイズ信号が前記磁場の印加前後で移動しないことを利用して、前記ノイズ信号を排除した前記標的物質の高精度検出を可能とする。
　前記外力支援型センサを用いた前記標的物質の検出場面では、前記標的物質に対し、前記磁場の印加前後で移動可能な前記磁性粒子と、前記光信号を発生可能な光応答性物質とをそれぞれ結合させた結合体を調製することが行われる。
　具体的には、先ず、前記標的物質の被検体液と、前記磁性粒子及び前記磁性粒子を前記標的物質に結合させる第１の結合物質を含む第１液と、前記光応答性物質及び前記光応答性物質を前記標的物質に結合させる第２の結合物質を含む第２液とを用意する。
　ここで、前記第１の結合物質及び前記第２の結合物質は、前記標的物質と結合可能な物質から選択されるが、これに加えて、前記磁性粒子及び前記光応答性物質とも結合する必要があるため、前記磁性粒子と結合する前記第１の結合物質と前記光応答性物質と結合する前記第２の結合物質とは、別の物質から選択されている。
　次に、前記被検体液に前記第１液を加えて所定時間反応させ、前記標的物質に前記第１の結合物質を介して前記磁性粒子を結合させる。その後、前記被検体液に前記第２液を加えて所定時間反応させ、前記標的物質に前記第２の結合物質を介して前記光応答性物質を結合させ、前記標的物質に前記第１の結合物質及び前記第２の結合物質を介して前記磁性粒子及び前記光応答性物質が結合した前記結合体を得る。
　または、前記第１液及び前記第２液を加える順番を変え、先に前記第２液を加え、後に前記第１液を加えることで、前記標的物質に前記第１の結合物質及び前記第２の結合物質を介して前記磁性粒子及び前記光応答性物質が結合した前記結合体を得る。
　前記被検体液に前記第１液と前記第２液とを加える順番は、選択された前記第１の結合物質と前記第２の結合物質との間で、前記標的物質との親和性（結合し易さ）の高低で決まり、前記第１の結合物質の親和性が低い場合には、前記第１液を先に加え、前記第２の結合物質の親和性が低い場合には、前記第２液を先に加える。
　即ち、前記標的物質との親和性が高い方の結合物質を先に加えると、前記標的物質の結合部位がこの結合物質との結合で埋まり、後に加えられる前記標的物質との親和性が低い方の結合物質が結合せず、延いては、前記磁性粒子及び前記光応答性物質のいずれかが前記標的物質との結合体を形成せず、検出対象から外れることとなる。
　こうした手順は、ユーザにとって煩雑であり、効率的な検出試験の実施を妨げる。
　加えて、前記手順に従う場合でも、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質との間で、前記標的物質に対する親和性に差があると、時間の経過に伴い、親和性の高い方の結合が支配的となり、親和性の低い方の結合物質が親和性の高い方の結合物質に置換され、延いては、前記磁性粒子及び前記光応答性物質のいずれかが前記標的物質との結合体を形成せず、検出対象から外れることとなる。
　したがって、前記磁性粒子及び前記光応答性物質を前記第１の結合物質及び前記第２の結合物質を介して過不足なく前記標的物質に結合させるためには、前記第１液を加えてから前記第２液を加えるまでの時間管理が必要となり、効率的な検出試験の実施をより一層妨げることとなっている。
　また、以上に説明した手順の相違や時間の経過により、検出対象であるものが検出対象から外れることは、検出結果の精度を低下させるとともに検出結果の不安定化を招く。
安浦 雅人、藤巻 真「微量検出のための導波モードイメージセンサの開発」電気学会研究会資料　センサ・マイクロマシン部門総合研究会（２０１６年６月２９日，３０日）、ｐｐ．４５～５２、一般社団法人電気学会（２０１６年） M. Yasuura and M. Fujimaki, Sci. Rep. Vol. 6, pp. 39241-1-39241-7 (2016)
　本発明は、従来技術における前記諸問題を解決し、前記外力支援型センサを用いて、効率的で、高精度かつ安定的に標的物質を検出可能な標的物質検出方法及び標的物質検出キットを提供することを目的とする。
　前記課題を解決するための手段としては、次の通りである。即ち、
　＜１＞　液体試料が表面上に導入されるとともに裏面側又は前記表面側から照射される光の透過光を伝搬光として前記光が照射される側と反対の面側に伝搬可能とされる透光板、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面側から照射される光の反射光を前記伝搬光として前記表面上方に伝搬可能な反射板、前記液体試料が前記表面上に導入される導入板及び前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光により前記表面上に近接場光を発生可能な検出板のいずれかで形成される液体試料導入板が配され、かつ、前記液体試料が前記液体試料導入板の前記表面上に保持可能とされる液体試料保持部に対し、前記液体試料導入板の表面上に前記液体試料を導入し保持する液体試料導入保持工程と、前記液体試料導入板が前記透光板で形成されるときに前記液体試料導入板の前記裏面側から前記光を照射する裏面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記透光板及び前記反射板のいずれかで形成されるときに前記液体試料導入板の前記表面側から前記光を照射する表面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記導入板で形成されるときに前記液体試料導入板上に保持される前記液体試料に対して前記液体試料導入板の側面側から前記光を照射する側面側光照射工程及び前記液体試料導入板が前記検出板で形成されるときに前記表面に対して全反射条件で前記光を照射する全反射光照射工程のいずれかである光照射工程と、前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向及び前記液体試料導入板から遠ざかる方向のいずれかの方向に移動させる第１の結合体移動工程並びに前記液体試料導入板の前記裏面側に配される磁場印加部からの磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で前記磁場印加部を前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、前記磁場印加部の移動に追従させて前記結合体を移動させる第２の結合体移動工程のいずれかである結合体移動工程と、前記結合体移動工程に伴う前記結合体の移動を前記伝搬光又は前記近接場光に基づく光信号の信号変化により検出する光信号検出工程と、を含み、前記液体試料が、それぞれ標的物質と結合体を形成する磁性粒子及び光応答性物質と、前記磁性粒子を前記標的物質に結合させる第１の結合物質と、前記光応答性物質を前記標的物質に結合させる第２の結合物質とを含み、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで同一の結合物質が用いられることを特徴とする標的物質検出方法。
　＜２＞　標的物質が同一型の被結合部位を複数有する物質であり、結合物質が前記被結合部位と特異的に結合可能な物質である前記＜１＞に記載の標的物質検出方法。
　＜３＞　液体試料が、標的物質の被検体液に対し、それぞれが結合物質と結合された状態の磁性粒子及び光応答性物質を含む一液の検出液を混合させて調製される前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の標的物質検出方法。
　＜４＞　光応答性物質が、伝搬光又は近接場光の照射を受けて散乱光を発生させる前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の標的物質検出方法。
　＜５＞　光応答性物質が、伝搬光又は近接場光の照射を受けて蛍光を発生させる前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の標的物質検出方法。
　＜６＞　光信号検出工程が伝搬光に基づく光信号の信号変化を検出する工程であるときに、光応答性物質が前記伝搬光の照射を受けて光吸収を生じる光吸収物質を含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の標的物質検出方法。
　＜７＞　磁性粒子が、直径５ｎｍ～６，５００ｎｍの球状粒子である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の標的物質検出方法。
　＜８＞　光応答性物質が、直径５０ｎｍ～６，５００ｎｍの球状粒子である前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の標的物質検出方法。
　＜９＞　結合体移動工程が第１の結合体移動工程であるときに、更に、液体試料導入保持工程後、結合体移動工程前に、引き寄せ磁場の印加により液体試料中の結合体の全部又は一部を一旦液体試料導入板の表面上に引き寄せる結合体引き寄せ工程を実施する前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の標的物質検出方法。
　＜１０＞　標的物質と結合体を形成する磁性粒子及び前記標的物質と前記結合体を形成する光応答性物質と、前記磁性粒子を前記標的物質に結合させる第１の結合物質と、前記光応答性物質を前記標的物質に結合させる第２の結合物質とを含み、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とが同一の結合物質で構成される一液の検出液を有することを特徴とする標的物質検出キット。
　本発明によれば、従来技術における前記諸問題を解決でき、前記外力支援型センサを用いて、効率的で、高精度かつ安定的に標的物質を検出可能な標的物質検出方法及び標的物質検出キットを提供することができる。
第１の結合物質Ｂ１と第１の結合物質Ｂ１よりも親和性の低い第２の結合物質Ｂ２とを用いる場合の状況を説明する説明図である。 第１の結合物質Ｂ１と第１の結合物質Ｂ１よりも親和性の高い第２の結合物質Ｂ２とを用いる場合の状況を説明する説明図である。 第１の結合物質Ｂ１と第２の結合物質Ｂ２とで同一の結合物質が用いられる場合の状況を説明する説明図である。 標的物質Ｔに結合物質Ｂ１，Ｂ２を介して磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏが合計で３つ結合した結合体を示す説明図である。 標的物質検出装置１の説明図である。 撮像デバイスで観察される観察視野内の液体試料導入板の表面上の様子を模式的に示す図である。 図６におけるＡ－Ａ線断面図である。 結合体移動工程後、撮像デバイスで観察される観察視野内の液体試料導入板の表面上の様子を模式的に示す図（１）である。 図８におけるＡ－Ａ線断面図である。 標的物質検出装置１Ａの説明図である。 標的物質検出装置１Ｂの説明図である。 結合体移動工程後、撮像デバイスで観察される観察視野内の液体試料導入板の表面上の様子を模式的に示す図（２）である。 図１２におけるＡ－Ａ線断面図である。 標的物質検出装置１０の説明図である。 結合体移動工程後、撮像デバイスで観察される観察視野内の液体試料導入板の表面上の様子を模式的に示す図（３）である。 図１５におけるＡ－Ａ線断面図である。 標的物質検出装置２０の説明図である。 標的物質検出装置２０Ａの説明図である。 標的物質検出装置３０の説明図である。 標的物質検出装置４０の説明図である。 結合体移動工程前における、液体試料導入板の前記表面上の様子を示す図（１）である。 結合体移動工程後における、液体試料導入板の前記表面上の様子を示す図（１）である。 標的物質検出装置５０の説明図である。 結合体移動工程前における、液体試料導入板の前記表面上の様子を示す図（２）である。 結合体移動工程後における、液体試料導入板の前記表面上の様子を示す図（２）である。 実施例１に係る標的物質検出方法による１回目検出の動画中の一の時点での画像を示す図である。 実施例１に係る標的物質検出方法による１回目検出の前記動画中の前記一の時点から７秒経過後の画像を示す図である。 実施例１に係る標的物質検出方法による２回目検出の動画中の一の時点での画像を示す図である。 実施例１に係る標的物質検出方法による２回目検出の前記動画中の前記一の時点から５．３秒経過後の画像を示す図である。 比較例１に係る標的物質検出方法による１回目検出の動画中の一の時点での画像を示す図である。 比較例１に係る標的物質検出方法による１回目検出の前記動画中の前記一の時点から６．３秒経過後の画像を示す図である。 比較例１に係る標的物質検出方法による２回目検出の動画中の一の時点での画像を示す図である。 比較例１に係る標的物質検出方法による２回目検出の前記動画中の前記一の時点から２．７秒経過後の画像を示す図である。
　本発明に係る標的物質検出方法は、標的物質に磁性粒子を結合させた結合体を磁場の印加前後で比較観察することで前記標的物質の検出を行う外力支援型センサ、例えば外力支援近接場照明バイオセンサ（External-Force-Assisted Near Field Illumination Biosensor）を用いて実施することができる。
　本発明に係る前記標的物質検出方法の説明に先立って、前記外力支援型センサを詳細に説明する。なお、以下では、前記外力支援型センサを「標的物質検出装置」と称して説明を行う。
（標的物質検出装置）
　前記標的物質検出装置は、液体試料保持部と、光照射部と、磁場印加部と、光信号検出部とを有し、必要に応じて、その他の部を有する。
＜液体試料保持部＞
　前記液体試料保持部は、液体試料導入板が配され、かつ、液体試料が前記液体試料導入板の表面上に保持される部である。
－液体試料導入板－
　前記液体試料導入板は、前記液体試料が表面上に導入されるとともに裏面側又は前記表面側から照射される光の透過光を伝搬光として前記光が照射される側と反対の面側に伝搬可能とされる透光板、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面側から照射される光の反射光を前記伝搬光として前記表面上方に伝搬可能な反射板、前記液体試料が前記表面上に導入される導入板、及び、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光により前記表面上に近接場光を発生可能な検出板のいずれかで形成される。
　なお、前記伝搬光とは、一般に発生源から数百ｎｍ～数μｍ以内の距離だけ離れた位置で急激な減衰を示す近接場光を含まない光とされるが、本明細書においても、前記近接場光を含まないことを意味し、前記液体試料導入板の前記表面から数百ｎｍ～数μｍ以内の距離だけ離れた位置で急激な減衰を示すことのない光を意味する。また、前記近接場光とは、前記液体試料導入板の前記表面から数百ｎｍ～数μｍ以内の距離だけ離れた位置で急激な減衰を示す光を意味する。
　前記透光板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の透過型顕微鏡や公知の落射型顕微鏡の観察用ステージに用いられるガラス板、プラスチック板などの公知の透光板を用いることができる。
　また、前記反射板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の落射型顕微鏡の観察用ステージに用いられるガラス板、プラスチック板、金属板などの公知の反射板を用いることができる。
　また、前記導入板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記透光板、前記反射板を含み、この他の液体試料を導入するための公知の板状部材を用いることができる。
　また、前記検出板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の表面プラズモン共鳴センサや公知の導波モードセンサに用いられる検出板などの公知の検出板を用いることができる。
　前記液体試料導入板としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記表面が前記結合体の吸着を抑制する吸着抑制剤で表面処理されていることが好ましい。このような表面処理が施されていると、前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面に吸着されることが抑制され、前記磁場印加部による移動を補助することができる。
　前記吸着抑制剤としては、特に制限はなく、前記結合体を構成する物質の種類に応じて、公知の吸着抑制剤から適宜選択することができる。
　例えば、前記表面処理の手法として、前記標的物質が前記タンパク質である場合には、前記タンパク質の吸着を抑制する公知のブロッキング法を選択することができる。前記ブロッキング法としては、特に制限はなく、例えば、ポリエチレングリコールを用いる手法、エタノールアミンを用いる方法、スキムミルクを用いる方法、シランカップリング剤を用いる方法などが挙げられる。
　前記液体試料保持部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記液体試料導入板そのもので構成されてもよく、また、前記液体試料をカバーガラス等の板状透光部材と前記液体試料導入板とで挟み、前記液体試料の液層を前記液体試料導入板の前記表面上に保持する構成でもよい。
　また、前記液体試料保持部の構成としては、底面が前記液体試料導入板で構成される枡状の液体セルで構成することもできる。
　なお、前記液体試料保持部としては、１つの前記液体試料導入板の前記表面上の領域を複数に分画してマルチチャンネル化させてもよい。
　また、前記液体試料保持部としては、外部と前記液体試料導入板の表面上の空間との間で送液可能な流路が形成されることが好ましい。
　即ち、前記標的物質検出装置によれば、前記液体試料導入板に吸着した夾雑物の存在を無視した前記標的物質の検出を行うことができることから、前記液体試料導入板の洗浄処理を逐次行うことなく次の検出を行うことができるため、前記液体試料保持部に前記流路が形成される場合、前記流路を介した前記液体試料の導入と排出とを通じて前記液体試料を交換するだけで次の検出を進めることができ、より一層、検出操作を効率化させることができる。
　なお、本明細書において「洗浄処理」とは、前記液体試料導入板の前記表面に吸着した前記夾雑物を物理的な磨き処理や化学薬品を用いた剥離処理、溶解処理によって取り除く処理を意味し、前記液体試料の交換時に水で濯ぐ処理を含まない。
＜光照射部＞
　前記光照射部は、裏面側光照射部、表面側光照射部、側面側光照射部及び全反射光照射部のいずれかで形成される。
　前記裏面側光照射部は、前記液体試料導入板が前記透光板で形成されるときに前記液体試料導入板の前記裏面から前記光を照射可能とされる。
　前記裏面側光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の透過型顕微鏡に用いられる公知の光照射部と同様に構成することができる。
　前記表面側光照射部は、前記液体試料導入板が前記透光板及び前記反射板のいずれかで形成されるときに前記液体試料導入板の前記表面側から前記光を照射可能とされる。
　前記表面側光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の落射型顕微鏡や実体顕微鏡に用いられる公知の光照射部と同様に構成することができる。
　前記側面側光照射部は、前記液体試料導入板が前記導入板で形成されるときに前記液体試料導入板上に保持される前記液体試料に対して前記液体試料導入板の側面側から前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向で前記光を照射可能とされる。
　前記側面側光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の光照射部と同様に構成することができる。
　前記全反射光照射部は、前記液体試料導入板が前記検出板で形成されるときに前記表面に対して全反射条件で前記光を照射可能とされる。前記表面における全反射は、前記検出板の前記表面において全反射条件を満たすことが可能であれば、前記光の入射方向に特に制限はない。例えば、前記検出板表面を導波路構造にすることで、前記検出板の前記表面側、前記裏面側又は前記側面側に形成したグレーティング、若しくは、前記表面側、前記裏面側又は前記側面側に配したプリズムを介して前記導波路構造に前記光を前記表面側から導入し、前記導波路構造内での全反射を利用して前記検出板表面での全反射条件を満たすことができる。また、前記プリズムは前記検出板の一部構造として形成されてもよい。
　前記全反射光照射部の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の全反射顕微鏡や公知の表面プラズモン共鳴センサや公知の導波モードセンサに用いられる公知の光照射部と同様に構成することができる。
　なお、前記裏面側光照射部、前記表面側光照射部、前記側面側光照射部及び前記全反射光照射部における光源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知のランプ、ＬＥＤ装置、レーザ光照射装置などの発光装置を用いることができる。
　また、前記裏面側光照射部、前記表面側光照射部及び前記全反射光照射部としては、前記光源以外の光学要素についても特に制限はなく、公知の光学顕微鏡、公知の表面プラズモン共鳴センサや公知の導波モードセンサに用いられる公知の光学要素を目的に応じて適宜採用して構成することができる。
＜磁場印加部＞
　前記磁場印加部は、第１の磁場印加部及び第２の磁場印加部のいずれかで形成される。前記第１の磁場印加部及び前記第２の磁場印加部のいずれの磁場印加部も、前記液体試料導入部の前記表面上に導入された前記結合体を移動させる役割を有し、前記標的物質検出装置では、前記結合体の移動を前記標的物質の検出に利用する。
－第１の磁場印加部－
　前記第１の磁場印加部は、前記液体試料導入板の前記表面側又は前記側面側に配されるとともに前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向及び前記液体試料導入板から遠ざかる方向のいずれかの方向に移動させる部材である。
　前記第１の磁場印加部としては、このような部材であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の電磁石及び永久磁石を用いて構成することができる。なお、前記永久磁石を用いる場合、例えば、移動部材に前記永久磁石を保持し、前記永久磁石による前記磁場が前記液体試料導入板の前記表面上に及ぶ近接状態と前記永久磁石による前記磁場が前記液体試料導入板の前記表面上に及ばない離間状態との間で移動制御し、前記液体試料導入板の前記表面上に対する前記磁場の印加状態をオン－オフさせる構成とすることができる。また、例えば、公知の磁気シールド部材を、前記液体試料導入板の前記表面上に前記磁場を印加させる開放状態と前記液体試料導入板の前記表面上に前記磁場を印加させない遮蔽状態とで開閉制御し、前記液体試料導入板の前記表面上に対する前記磁場の印加状態をオン－オフさせる構成とすることができる。また、前記電磁石を用いる場合には、前記電磁石の励磁と消磁とを通じて前記液体試料導入板の前記表面上に対する前記磁場の印加状態のオン－オフ制御を行うことができる。
　また、前記第１の磁場印加部としては、特に制限はないが、貫通孔が形成されている、或いはＵ字型などの不完全な環状、或いは複数の部材が環状乃至不完全な環状に配置された構成であることが好ましい。このように前記第１の磁場印加部を形成すると、前記表面側光照射部を用いた場合に前記貫通孔或いは前記環状乃至前記不完全な環状の内側を通じた前記液体試料導入板の前記表面側からの光照射が可能となるとともに、前記表面側光照射部、前記裏面側光照射部、前記側面側光照射部及び前記全反射光照射部のいずれの場合も前記液体試料導入板の前記表面上方に伝搬される前記伝搬光に基づく光信号を前記貫通孔或いは前記環状に配置された部材の内側を通じて前記光信号検出部で検出することが可能となる。なお、前記環状に配置された部材は、前記光照射や光信号の光路を妨げない配置であれば特に制限はなく、磁場の印加状態の制御が個別に行えるものでもよい。
－第２の磁場印加部－
　前記第２の磁場印加部は、前記液体試料導入板の前記裏面側に配されるとともに前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面側に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動可能とされる部材である。
　前記第２の磁場印加部としては、このような部材であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の電磁石及び永久磁石を用いて構成することができる。例えば、スライド部材上に前記電磁石又は前記永久磁石を保持し、前記液体試料導入板の前記表面側光照射部、前記裏面側光照射部、前記側面側光照射部又は前記全反射光照射部における前記光照射部から前記光を照射する領域（検出領域）の近傍に前記電磁石又は前記永久磁石を位置させる初期状態と、前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に向けて前記電磁石又は前記永久磁石を移動させた状態との間で移動制御させることで構成することができる。なお、前記電磁石を用いる場合、前記移動制御中、連続的或いは断続的に励磁させた状態とする。また、前記移動制御中に励磁の強度を変化させてもよい。
　また、複数の前記電磁石又は永久磁石を配置し、各部材における前記磁場の印可状態を制御することによっても、前記スライド部材上に前記電磁石又は前記永久磁石を保持して前記移動制御を行う構成と同等の効果を得ることができる。
　また、前記第２の磁場印加部としては、特に制限はないが、貫通孔が形成されている、或いはＵ字型などの不完全な環状、或いは複数の部材が環状乃至不完全な環状に配置された構成であることが好ましい。このように前記第２の磁場印加部を形成すると、前記裏面側光照射部において前記貫通孔或いは前記環状乃至前記不完全な環状の内側を通じた前記液体試料導入板の裏面側からの光照射が可能となる。なお、前記環状に配置された部材は、前記光照射や光信号の光路を妨げない配置であれば特に制限はなく、磁場の印加状態の制御が個別に行えるものでもよい。
＜光信号検出部＞
　前記光信号検出部は、前記液体試料導入板の前記表面側、前記裏面側又は前記側面側に配されるとともに前記第１の磁場印加部による前記磁場の印加及び前記第２の磁場印加部の移動に伴う前記結合体の移動を前記伝搬光又は前記近接場光に基づく光信号の信号変化により検出可能とされる。
　前記光信号検出部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、フォトダイオード、光電子増倍管などの公知の光検出器や対物レンズ等の公知の光学要素を用いて構成することができる。
　また、前記光信号検出部としては、特に制限はないが、前記液体試料導入板の前記表面上の検出領域の様子を２次元画像として取得可能とされることが好ましい。前記２次元画像を取得できると、光点や暗点として現れる前記２次元画像中の前記光信号の位置情報やサイズ情報を容易に取得することができ、前記結合体の移動前後の前記２次元画像同士を比較して、前記光信号が前記結合体に関与する情報であるのか、或いは、前記液体試料導入板の前記表面上のキズ、前記夾雑物、光源出力の揺らぎ等の前記結合体に関与しない情報であるのかを明確に区別することが可能となる。このような２次元画像の取得を可能とするには、前記光信号検出部として撮像デバイスを選択すればよい。さらには、前記２次元画像を連続的に撮像し、動画として観察を行うと、光点や暗点として現れる前記２次元画像中の前記光信号が移動する様子をより明確に識別することができる。
　前記撮像デバイスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサなどの公知のイメージセンサを用いることができる。
　なお、前記光信号検出部により前記光信号を検出する方法としては、前記光信号検出部の結像可能範囲外及び前記近接場光の発生領域（前記液体試料導入板の前記表面から数百ｎｍ～数μｍ上方の領域）外に存在する前記結合体の検出漏れを防ぐため、一旦、前記液体試料導入板の前記表面上ないし前記表面近傍に前記結合体を配した後に検出を実施する方法が好ましい。
　また、前記標的物質を検出することとしては、前記標的物質の有無の検出、前記標的物質の存在量の検出（定量測定）、前記標的物質の存在状況のリアルタイム観察等が挙げられる。
　前記磁場印加部による前記結合体の移動に伴う前記光信号検出部における検出について説明する。
　前記光信号検出部で検出される前記伝搬光に基づく前記光信号には、公知の前記透過型顕微鏡や前記落射型顕微鏡で取得される光信号と同様に、前記液体試料導入板の前記表面上方に伝搬される前記伝搬光の前記液体試料に対する透過光や反射光の光信号１と、前記液体試料中の前記結合体に前記伝搬光が照射されたときに発生し、光信号１と識別可能な光信号２と、前記液体試料中の前記夾雑物に前記伝搬光が照射されたときに発生し、光信号１と識別可能な光信号３と、前記液体試料導入板の前記表面に存在するキズや前記表面に吸着した前記夾雑物に前記伝搬光が照射されたときに発生する光信号４などが存在する。また、前記光信号には、光源出力の揺らぎなどを原因とするノイズ信号も含まれる。
　バックグラウンド信号として処理される光信号１を除き、光信号２～４や前記ノイズ信号を区別することができない場合、検出精度の低下を招くこととなる。
　しかしながら、前記標的物質検出装置では、前記結合体の前記第１の磁場印加部及び前記第２の磁場印加部で形成される前記磁場印加部に基づいて前記結合体を移動させ、その移動を前記伝搬光に基づく前記光信号の信号変化として検出するため、光信号２と光信号３，４及び前記ノイズ信号とを明確に区別することができる。
　即ち、光信号３，４や前記ノイズ信号は、前記第１の磁場印加部による磁場の印加前後及び前記第２の磁場印加部の移動前後において変化しない光信号であるのに対し、光信号２は、前記磁性粒子を含む前記結合体に起因するため、前記第１の磁場印加部による磁場の印加前後及び前記第２の磁場印加部の移動前後において変化する光信号であることから、前記伝搬光に基づく前記光信号の信号変化を検出することで、前記結合体、延いては前記結合体を構成する前記標的物質の検出を高精度に行うことができる。
　ここで、変化する前記光信号として着目される光信号２の態様としては、前記標的物質の検出に用いる検出材の種類や前記標的物質検出装置の光学系の種類に応じて様々な態様を取り得る。即ち、光信号２としては、前記結合体が前記伝搬光の照射を受けたときに発する、散乱光、反射光、位相差、微分干渉に基づく透過光、前記光応答性物質の蛍光、燐光等の発光、及び前記結合体の光吸収に基づく光信号等が挙げられる。なお、前記位相差、前記微分干渉に基づく透過光を光信号２として検出する場合、前記液体試料保持部、前記光照射部及び前記光信号検出部のそれぞれを、公知の位相差顕微鏡、公知の微分干渉顕微鏡における光学系にしたがって構成する。
　また、光信号２の変化の態様としては、強度の増減、位相変化、位置移動、焦点ずれ、及び出現・消失が挙げられる。
　また、前記光信号検出部で検出される前記近接場光に基づく前記光信号には、公知の表面プラズモン共鳴センサや公知の導波モードセンサで取得される光信号と同様に、前記液体試料中の前記結合体に前記近接場光が照射されたときに発生する光信号５と、前記液体試料中の前記夾雑物に前記近接場光が照射されたときに発生する光信号６と、前記液体試料導入板の前記表面に存在するキズや前記表面に吸着した前記夾雑物に前記近接場光が照射されたときに発生する光信号７などが存在する。また、前記光信号には、光源出力の揺らぎなどを原因とするノイズ信号も含まれる。
　即ち、前記近接場光を利用する場合も、前記伝搬光を利用する場合と同様、光信号５～７や前記ノイズ信号を区別することができない場合、検出感度の低下を招くこととなる。
　しかしながら、前記標的物質検出装置では、前記結合体の前記第１の磁場印加部及び前記第２の磁場印加部で形成される前記磁場印加部に基づいて前記結合体を移動させ、その変化を前記近接場光に基づく前記光信号の信号変化として検出するため、光信号５と光信号６，７及び前記ノイズ信号とを明確に区別することができる。
　即ち、光信号６，７や前記ノイズ信号は、前記第１の磁場印加部による磁場の印加前後及び前記第２の磁場印加部の移動前後において変化しない光信号であるのに対し、光信号５は、前記磁性粒子を含む前記結合体に起因するため、前記第１の磁場印加部による磁場の印加前後及び前記第２の磁場印加部の移動前後において変化する光信号であることから、前記近接場光に基づく前記光信号の信号変化を検出することで、前記結合体、延いては前記結合体を構成する前記標的物質の検出を高精度に行うことができる。
　ここで、変化する前記光信号として着目される光信号５の態様としては、前記光応答性物質の種類や前記標的物質検出装置の光学系の種類に応じて様々な態様を取り得る。即ち、光信号５としては、前記結合体が前記近接場光の照射を受けたときに発する散乱光、蛍光等の発光、及び前記結合体の光吸収に基づく光信号等が挙げられる。
　また、光信号５の変化の態様としては、強度の増減、位置移動、及び出現・消失が挙げられる。
＜その他の部＞
　前記その他の部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、第３の磁場印加部、公知の透過型顕微鏡、公知の落射型顕微鏡、公知の全反射顕微鏡、公知の表面プラズモン共鳴センサ、公知の導波モードセンサ等に用いられる任意の部が挙げられる。
－第３の磁場印加部－
　前記第３の磁場印加部は、前記磁場印加部が前記第１の磁場印加部で形成されるときに、更に、前記液体試料導入板の前記裏面側に配されるとともに前記液体試料導入板に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せ可能とされる部である。
　前記磁場印加部が前記第２の磁場印加部で形成される場合、前記液体試料中の前記結合体が前記磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せられる。そのため、前記光信号検出部による前記光信号の検出を前記液体試料導入板の前記表面ないしその近傍に焦点を当てて行うことで、前記表面上に引き寄せられた前記結合体の移動状況を検出することができる。
　しかしながら、前記磁場印加部が前記第１の磁場印加部で形成される場合、前記光信号検出部による前記光信号の検出を前記液体試料導入板の前記表面ないしその近傍に焦点を当てて行う際、必ずしも前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せられた状態ではなく、例えば、前記液体試料を前記液体試料導入板に導入させた直後においては、前記結合体が前記液体試料の液層中に浮遊した状態とされる。浮遊状態の前記結合体が前記光信号検出部で前記光信号を検出可能な結像可能範囲の外方や前記近接場光の発生領域の外方に存在すると、前記結合体が検出されないこととなる。
　したがって、前記光信号検出部による前記光信号の検出を前記液体試料導入板の前記表面ないしその近傍に焦点を当てて行う際、前記液体試料を前記液体試料導入板に導入させた後、前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面上に重力沈降することを待つ必要があり、検出の準備に時間を要することとなる。特に、前記結合体の比重が小さい場合、より長い時間を要することとなる。
　そこで、前記第３の磁場印加部による前記磁場の印加により、前記液体試料の液層中に浮遊する前記結合体を前記液体試料導入板の前記表面側に引き寄せることで、検出の準備時間を短縮化させ、より効率的な検出を行うことができる。
　前記第３の磁場印加部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の電磁石及び永久磁石を用いて構成することができる。
　なお、前記第３の磁場印加部は、前記結合体を前記液体試料導入板の前記表面側に引き寄せた後、前記第１の磁場印加部による前記結合体の移動を妨げないよう、前記結合体を引き寄せる前記磁場の印加状態を弱める強度調整や停止するオン－オフ制御が求められる。この点、前記永久磁石を用いる場合、例えば、移動部材に前記永久磁石を保持し、前記永久磁石による前記磁場が前記液体試料の液層中に及ぶ近接状態と前記永久磁石による前記磁場が前記液体試料導入板の前記液体試料の液層中に及ばない離間状態との間で移動制御し、前記磁場の印加状態の前記強度調整又は前記オン－オフ制御を実施する構成とすることができる。また、前記電磁石を用いる場合には、前記電磁石の励磁と消磁とを通じて前記磁場の印加状態の前記強度調整又は前記オン－オフ制御を行うことができる。また例えば、公知の磁気シールド部材を用いて、前記結合体に対して前記表面上に引き寄せる前記磁場を印加させた開放状態と前記結合体に対して前記表面上に引き寄せる前記磁場を印加させない遮蔽状態とで制御し、前記磁場の印加状態をオン－オフさせる構成とすることができる。
　また、前記第３の磁場印加部としては、特に制限はないが、貫通孔が形成されている、或いはＵ字型などの不完全な環状、或いは複数の部材が環状乃至不完全な環状に配置された構成であることが好ましい。このように前記第３の磁場印加部を形成すると、前記裏面側光照射部において前記貫通孔或いは前記環状乃至前記不完全な環状の内側を通じた前記液体試料導入板の前記裏面側からの光照射が可能となる。なお、前記環状に配置された部材は、前記光照射や光信号の光路を妨げない配置であれば特に制限はなく、磁場の印加状態の制御が個別に行えるものでもよい。
　また、前記第３の磁場印加部を有すると、前記液体試料導入板の前記表面上の前記検出領域に前記結合体を寄せ集めて濃縮することができ、より高精度に前記標的物質の検出を行うことができる。
（標的物質検出方法）
　本発明の標的物質検出方法は、液体試料導入保持工程と、光照射工程と、結合体移動工程と、光信号検出工程とを含み、必要に応じて、その他の工程を含む。
＜液体試料導入保持工程＞
　前記液体試料導入保持工程は、前記液体試料が表面上に導入されるとともに裏面側又は前記表面側から照射される光の透過光を伝搬光として前記光が照射される側と反対の面側に伝搬可能とされる透光板、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面側から照射される光の反射光を前記伝搬光として前記表面上方に伝搬可能な反射板、前記液体試料が前記表面上に導入される導入板、及び、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光により前記表面上に近接場光を発生可能な検出板のいずれかで形成される液体試料導入板が配され、かつ、前記液体試料が前記液体試料導入板の前記表面上に保持可能とされる液体試料保持部に対し、前記液体試料導入板の前記表面上に前記液体試料を導入し保持する工程である。
－液体試料－
　前記液体試料は、それぞれ標的物質と結合体を形成する磁性粒子及び光応答性物質と、前記磁性粒子を前記標的物質に結合させる第１の結合物質と、前記光応答性物質を前記標的物質に結合させる第２の結合物質とを含む。
　前記標的物質としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、カプシドタンパク質等のウイルス様粒子を含む各種タンパク質、エクソソームやマイクロベシクルやラージオンコソーム等の細胞外小胞、菌、汚染物質などが挙げられる。
　また、前記標的物質の存在等を検証する前記標的物質の被検体液としては、例えば、血液、唾液、尿、液体薬品、環境水、上下水、飲料、食品のホモジナイズ溶液、ぬぐい液、粉末等の固体試料を水等の溶媒に溶解させた溶液、気相中のガスや微粒子などを捕集した気相濃縮液などが挙げられる。
　前記磁性粒子の役割は、前記標的物質と結合体を形成した状態で、前記磁場の印加に伴う移動を生じさせることにある。
　前記磁性粒子としては、前記役割を奏するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の磁気ビーズ等を用いることができる。
　前記光応答性物質の役割は、前記標的物質と結合体を形成した状態で、前記伝搬光又は前記近接場光に基づく前記光信号を生じさせることにある。
　前記光応答性物質としては、前記役割を奏するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記伝搬光又は前記近接場光の照射を受けて散乱光を発生させる光散乱物質や、蛍光を発生させる蛍光物質や、光吸収を生じる光吸収物質を用いることができる。
　前記光散乱物質及び前記光吸収物質としては、それぞれの性質を備えるように調製されたポリスチレンビーズ等の樹脂粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、金ナノロッド、金ナノスター等の金属ナノ粒子などの公知の粒子を用いることができる。また、前記蛍光物質としては、蛍光色素、量子ドット、蛍光ビーズ、量子ドット入りビーズ、蛍光染色剤などの公知の蛍光材料を用いることができる。
　なお、本明細書において、「光応答性」とは、前記伝搬光又は前記近接場光の照射を受けて前記光信号検出工程で信号変化を検出可能な光信号を生じる性質を指す。
　前記第１の結合物質及び前記第２の結合物質は、前記標的物質に対し前記磁性粒子及び前記光応答性物質を結合させる役割を有し、前記磁性粒子及び前記光応答性物質と結合した状態で前記標的物質と結合し、前記標的物質に前記第１の結合物質及び前記第２の結合物質を介して前記磁性粒子及び前記光応答性物質が結合された結合体を形成させる。
　ここで、前記標的物質検出方法では、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで同一の結合物質を用いることが肝要とされる。その理由を図１～３を用いて具体的に説明する。なお、図１は、第１の結合物質Ｂ１と第１の結合物質Ｂ１よりも親和性の低い第２の結合物質Ｂ２とを用いる場合の状況を説明する説明図であり、図２は、第１の結合物質Ｂ１と第１の結合物質Ｂ１よりも親和性の高い第２の結合物質Ｂ２とを用いる場合の状況を説明する説明図であり、図３は、第１の結合物質Ｂ１と第２の結合物質Ｂ２とで同一の結合物質が用いられる場合の状況を説明する説明図である。
　今、標的物質Ｔの前記被検体液に、第１の結合物質Ｂ１が結合された状態の磁性粒子Ｍと、第２の結合物質Ｂ２が結合された状態の光応答性物質Ｏとを加えたときの状況について考えてみる。
　第１の結合物質Ｂ１と第２の結合物質Ｂ２とで異なる結合物質を用い、第１の結合物質Ｂ１よりも第２の結合物質Ｂ２の方が標的物質Ｔに対する親和性が低いとすると、図１に示すように、親和性の高い第１の結合物質Ｂ１が標的物質Ｔに優先的に結合し、第１の結合物質Ｂ１を介した標的物質Ｔと磁性粒子Ｍとの結合が得られるものの、第２の結合物質Ｂ２を介した標的物質Ｔと光応答性物質Ｏとの結合が得られない状況が発生する。この場合、光応答性物質Ｏに基づく光信号を検出できないため、標的物質Ｔが検出対象外となる。
　また、第１の結合物質Ｂ１と第２の結合物質Ｂ２とで異なる前記結合物質を用い、第１の結合物質Ｂ１よりも第２の結合物質Ｂ２の方が標的物質Ｔに対する親和性が高いとすると、図２に示すように、親和性の高い第２の結合物質Ｂ２が標的物質Ｔに優先的に結合し、第２の結合物質Ｂ２を介した標的物質Ｔと光応答性物質Ｏとの結合が得られるものの、第１の結合物質Ｂ１を介した標的物質Ｔと磁性粒子Ｍとの結合が得られない状況が発生する。この場合、磁場の印加前後で標的物質Ｔと光応答性物質Ｏとの結合体を移動させることができず、光応答性物質Ｏに基づく光信号をノイズ信号と区別できないため、標的物質Ｔが検出対象外となる。
　こうした状況を避けるため、標的物質Ｔの前記被検体液に対し、親和性の低い方の前記結合物質を先に加え、標的物質Ｔに対する親和性の高い方の前記結合物質を後に加える手法が採られている。
　しかしながら、こうした手法によっても、時間の経過に伴い、親和性の高い方の結合が支配的となり、親和性の低い方の前記結合物質が親和性の高い方の前記結合物質に置換され、図１，２に示す状況と同様になる。
　そのため、この手法では、標的物質Ｔと磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏとの結合体が形成されるタイミングを時間管理して実施する必要がある。
　こうした手法は、ユーザにとって煩雑で、効率的な検出試験の実施の妨げとなるばかりか、手順の相違や時間の経過により、検出対象であるものが検出対象から外れることとなって、検出結果の精度を低下させるともに検出結果の不安定化を招く。
　一方、第１の結合物質Ｂ１と第２の結合物質Ｂ２とで同一の前記結合物質を用いると、標的物質Ｔに対する双方の親和性が等しいことから、標的物質Ｔに対する結合機会が競争的となり、その結果、図３に示すように、標的物質Ｔと磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏとの結合体が得られ易い。
　したがって、第１の結合物質Ｂ１と第２の結合物質Ｂ２とで同一の前記結合物質を用いることで、効率的で、高精度かつ安定的に標的物質Ｔを検出することが可能となる。
　前記結合物質としては、特に制限はなく、前記標的物質及び前記検出材の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、前記標的物質と前記磁性粒子及び前記光応答性物質との間で、公知の抗原－抗体反応、アプタマーによる結合、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ビオチン－アビジン結合、キレート結合、アミノ結合などによる結合を与える諸物質を用いることができる。具体的には、モノクローナル抗体、アプタマー、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン及びその誘導体（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、ビオチンなどが挙げられる。
　なお、ある抗原に対して結合可能な異なる多種類の抗体の集合体であるポリクロナール抗体は、前記磁性粒子と前記光応答性物質とのそれぞれに同一の結合物質を付与することを担保できないため、前記結合物質として好ましくない。
　以上の通り、前記標的物質検出方法では、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで、同一の前記結合物質が用いられるため、同一型の被結合部位を複数有するタイプの前記標的物質（例えば、ウイルス、カプシドタンパク質等のウイルス様粒子、エクソソームやマイクロベシクルやラージオンコソーム等の細胞外小胞）の検出に特に適しており、前記結合物質としては、前記被結合部位と特異的に結合可能な物質であることが好ましい。
　前記磁性粒子及び前記光応答性物質について、更に説明を加える。
　前記磁性粒子及び前記光応答性物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記磁性粒子及び前記光応答性物質は、前記標的物質に対し１つずつ、最少２つ結合されていれば、その結合体を検出対象とすることができる。
　しかしながら、前記標的物質の大きさに対し、前記磁性粒子及び前記光応答性物質の大きさが過大であり、前記標的物質に対して前記磁性粒子及び前記光応答性物質が２つだけ結合可能な状況であると、前記標的物質に結合する２つの粒子が２つとも前記磁性粒子となるか前記光応答性物質となって、検出対象から外れる危険性が増大する。
　そのため、１つの前記標的物質に対し、前記磁性粒子及び前記光応答性物質が３つ以上結合可能であるように前記磁性粒子及び前記光応答性物質の大きさの上限を設定し、前記標的物質に結合する３つ以上の前記磁性粒子及び前記光応答性物質のうち、いずれか１つが残りの粒子と異なる種類となる機会を付与することが好ましい（図４参照）。なお、図４は、標的物質Ｔに結合物質Ｂ１，Ｂ２を介して磁性粒子Ｍ及び光応答性物質Ｏが合計で３つ結合した結合体を示す説明図である。
　前記標的物質検出装置（前記外力支援型センサ）を用いて検出が求められる前記標的物質の大きさとしては、一般に１ｎｍ～１，０００ｎｍ程度であり、１つの前記標的物質に対し、前記磁性粒子及び前記光応答性物質を合計で３つ結合させるためには、これらの直径が前記標的物質の直径の約６．５倍以内である必要があり、よって、前記直径の上限としては、６，５００ｎｍであることが好適であり、１，０００ｎｍであることがより好適である。
　また、前記磁性粒子の直径の下限に関し、前記磁性粒子が小さすぎると、前記磁性粒子の磁化の値が小さくなり、前記光信号の移動に十分な力を受けることが難しくなるおそれがある。そのため、前記磁性粒子の直径の下限としては、５ｎｍであることが好適である。前記磁性粒子の直径が５ｎｍ以上であると、一般的な永久磁石による磁界を用いて検出を行うことができる。
　よって、前記磁性粒子としては、直径５ｎｍ～６，５００ｎｍの球状粒子であることが好ましく、直径５ｎｍ～１，０００ｎｍの球状粒子であることがより好ましい。
　また、前記光応答性物質の直径の下限に関し、前記散乱光を用いて前記光信号を発生させる場合、前記光応答性物質が小さすぎると、検出を行う光学系の検出限界を超えて検出できないおそれがある。そのため、前記光応答性物質の直径の下限としては、５０ｎｍであることが好適である。前記光応答性物質の直径が５０ｎｍ以上であると、可視光波長域（４００ｎｍ～７００ｎｍ）の一般的な光源を用いて検出を行うことができる。
　よって、前記光応答性物質としては、前記散乱光を用いて前記光信号を発生させる場合、直径５０ｎｍ～６，５００ｎｍの球状粒子であることが好ましく、直径５０ｎｍ～１，０００ｎｍの球状粒子であることがより好ましい。
　なお、前記球状粒子としては、真球状に加え、楕円球状等のいびつな球状粒子も含み、前記いびつな球状粒子における前記直径としては、その粒子の最大径が該当する。
　前記液体試料の調製の場面では、１つの前記標的物質に対して前記磁性粒子及び前記光応答性物質を３つ以上結合させる観点から、前記標的物質の含有数に対し、前記磁性粒子及び前記光応答性物質の合計の含有数が３倍以上となるように調製を行うことが好ましい。
　特に、前記磁性粒子及び前記光応答性物質の合計の含有数が多ければ多い程、前記標的物質に対する結合数が増え、引いては、前記標的物質を高精度に検出することができる。したがって、前記標的物質の含有数に対し、前記標的物質との結合に飽和をもたらす含有数以上で前記磁性粒子及び前記光応答性物質を含有させてもよい。なお、この場合、前記液体試料中に存在する前記標的物質の数は、検出前の段階では未知であるが、経験則から想定される前記標的物質の数からみて、過剰量導入すればよい。
　前記液体試料の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（１）前記標的物質の被検体液を前記液体試料保持部に保持させた後、前記第１の結合物質と結合させた前記磁性粒子及び前記第２の結合物質と結合させた前記光応答性物質を前記被検体液に添加して混合する方法、（２）前記液体試料保持部に対する導入前に、前記標的物質の前記被検体液を前記液体試料保持部に保持させた後、前記第１の結合物質と結合させた前記磁性粒子及び前記第２の結合物質と結合させた前記光応答性物質を前記被検体液に添加して混合する方法、（事前混合法）などの方法を挙げることができる。
　中でも、前記（２）の事前混合法によれば、混合容器内の前記磁性粒子及び前記磁性粒子を含む前記結合体を前記混合容器越しに磁石で集め、これらが前記磁石により流れ落ちないようにしつつ、混合液の一部を分離することで、前記液体試料保持部に導入される前記液体試料に対して夾雑物等の混入を抑制することができるとともに、前記液体試料保持部に導入される前記液体試料において、前記結合体の濃縮を行うことができる。その結果、前記（１）の方法を適用する場合よりも、より高精度な検出を実施することができる。
　また、前記被検体液に前記第１の結合物質と結合させた前記磁性粒子及び前記第２の結合物質と結合させた前記光応答性物質を加える方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、（３）前記被検体液に対し、前記第１の結合物質と結合させた前記磁性粒子を含む液体と、前記第２の結合物質と結合させた前記光応答性物質を含む液体との二液を加える方法（二液法）、（４）前記被検体液に対し、前記第１の結合物質と結合させた前記磁性粒子と、前記第２の結合物質と結合させた前記光応答性物質とを含む一液の検出液を加える方法（一液法）が挙げられる。
　中でも、前記（４）の一液法によれば、前記検出液を予め調製し保存しておくことで、前記標的物質の前記被検体液に対し、それぞれが前記結合物質と結合された状態の前記磁性粒子及び前記光応答性物質を含む一液の前記検出液を混合させるだけで前記液体試料を調製することができ、検出前の前処理を効率的に行うことができる。
　前記結合体としては、重力沈降を促進させる重り物質を含むように調製してもよい。即ち、前記重り物質を含む前記結合体では、前記液体試料導入板の表面上に沈降させ易く、検出操作を開始するまでの時間を短縮化させることができ、特に、前記重り物質を含まない前記結合体の比重が小さい場合に用いることができる。
　前記重り物質としては、このような性質を有する物質であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の金ナノ粒子などを挙げることができる。
　前記重り物質としては、前記標的物質と結合させて前記結合体を形成することが好ましく、結合方法としては、例えば、物理吸着、抗原－抗体反応、アプタマーによる結合、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ビオチン－アビジン結合、キレート結合、アミノ結合などの公知の結合方法を用いることができる。
＜光照射工程＞
　前記光照射工程は、前記液体試料導入板が前記透光板で形成されるときに前記液体試料導入板の前記裏面側から前記光を照射する裏面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記透光板及び前記反射板のいずれかで形成されるときに前記液体試料導入板の前記表面側から前記光を照射する表面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記導入板で形成されるときに前記液体試料導入板上に保持される前記液体試料に対して前記液体試料導入板の側面側から前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向で前記光を照射する側面側光照射工程、並びに、前記液体試料導入板が前記検出板で形成されるときに前記表面に対して全反射条件で前記光を照射する全反射光照射工程のいずれかの工程である。
　なお、前記裏面側光照射工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記裏面側光照射部により実施することができる。
　また、前記表面側光照射工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記表面側光照射部により実施することができる。
　また、前記側面側光照射工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記側面側光照射部により実施することができる。
　また、前記全反射光照射工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記全反射光照明部により実施することができる。
＜結合体移動工程＞
　前記結合体移動工程は、前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向及び前記液体試料導入板から遠ざかる方向のいずれかの方向に移動させる第１の結合体移動工程並びに前記液体試料導入板の前記裏面側に配される磁場印加部からの磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で前記磁場印加部を前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、前記磁場印加部の移動に追従させて前記結合体を移動させる第２の結合体移動工程のいずれかの工程である。
　なお、前記第１の結合体移動工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記第１の磁場印加部により実施することができる。
　また、前記第２の結合体移動工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記第２の磁場印加部により実施することができる。
　また、前記第１の結合体移動工程及び前記第２の結合体移動工程としては、それぞれ前記光信号検出工程を挟みながら繰り返し行うことで、検出精度を高めることができる。このように前記第１の結合体移動工程を繰り返し行う際、それぞれの結合体移動工程において、前記第１の磁場印加部を前記液体試料導入板に対する相対な位置を変更し、前記結合体を移動させる方向を変えて、前記結合体を移動させてもよい。同様の、異なる方向への結合体の移動は、前記第１の磁場印加部を複数個設置して、順番に異なる方向から磁場を印加することよっても実施可能である。また、同様に、前記第２の磁場印加部において、繰り返し前記第２の結合体移動工程を行う際、それぞれの前記第２の結合体移動工程において、前記磁場印加部を前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ異なる方向に移動させ、前記結合体を移動させる方向を変えて、前記結合体を移動させてもよい。さらには、前記第１の磁場印可部と前記第２の磁場印可部双方を有する前記標的物質検出装置においては、前記第１の結合体移動工程と前記第２の結合体移動工程を織り交ぜて実施することができる。
　また、前記結合体移動工程において、磁場印加時に前記液体試料導入板を前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に動かすことによって、同様の効果を得てもよい。
＜光信号検出工程＞
　前記光信号検出工程は、前記結合体移動工程に伴う前記結合体の移動を前記伝搬光又は前記近接場光に基づく光信号の信号変化により検出する工程である。
　また、前記光信号検出工程は、前記伝搬光又は前記近接場光に基づく光信号のうち、前記結合体が前記伝搬光又は前記近接場光を受けたときに前記光応答性物質から生じ、１つの前記標的物質に対し前記磁性粒子と前記光応答性物質が結合した前記結合体に基づく光信号のみを信号変化の対象として検出する工程である。
　なお、前記光信号検出工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記光信号検出部により実施することができる。
＜その他の工程＞
　前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合体引き寄せ工程を挙げることができる。
－結合体引き寄せ工程－
　前記結合体引き寄せ工程は、前記結合体移動工程が前記第１の結合体移動工程であるときに、更に、前記液体試料導入保持工程後、前記結合体移動工程前に、引き寄せ磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を一旦前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せる工程である。
　前記結合体移動工程が前記第１の結合体移動工程により実施される場合、前記光信号検出工程で前記光信号の検出を前記液体試料導入板の前記表面ないしその近傍に焦点を当てて行う際、必ずしも前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せられた状態ではなく、例えば、前記液体試料を前記液体試料導入板に導入させた直後においては、前記結合体が前記液体試料の液層中に浮遊した状態とされる。浮遊状態の前記結合体が前記光信号検出工程で前記光信号を検出可能な結像可能範囲の外方や前記近接場光の発生領域の外方に存在すると、前記結合体が検出されないこととなる。
　したがって、前記光信号検出工程による前記光信号の検出を前記液体試料導入板の前記表面ないしその近傍に焦点を当てて行う際、前記液体試料を前記液体試料導入板に導入させた後、前記結合体が前記液体試料導入板の前記表面上に重力沈降することを待つ必要があり、検出の準備に時間を要することとなる。特に、前記結合体の比重が小さい場合、より長い時間を要することとなる。
　そのため、前記結合体移動工程が前記第１の結合体移動工程であるときに、更に、前記結合体引き寄せ工程を実施して、検出の準備時間を短縮化させ、より効率的な検出を行うことが好ましい。
　なお、前記結合体引き寄せ工程としては、前記標的物質検出装置において説明した前記第３の磁場印加部により実施することができる。
　前記結合体引き寄せ工程を実施する場合で、かつ、前記第１の結合体移動工程を前記結合体を前記液体試料導入板から遠ざかる方向に移動させて実施する場合では、特に制限はないが、前記液体試料導入保持工程後、前記結合体引き寄せ工程、前記結合体移動工程及び前記光信号検出工程をこの順で複数回繰返して実施すること（交互磁場印加）が好ましい。
　前記交互磁場印加によって、同一の前記結合体に起因する前記光信号が繰返し検出されることとなるため、検出の精度を向上させることができる。更には、前記交互磁場印加を周期的に実施し、同一の前記結合体に起因する前記光信号の周波数に対して公知のロックイン増幅器を適用することによって、この光信号を増幅することも可能であり、検出の感度を向上させることができる。
（標的物質検出キット）
　続いて、本発明の標的物質検出キットについて説明する。
　前記標的物質検出キットは、標的物質と結合体を形成する磁性粒子及び前記標的物質と前記結合体を形成する光応答性物質と、前記磁性粒子を前記標的物質に結合させる第１の結合物質と、前記光応答性物質を前記標的物質に結合させる第２の結合物質とを含み、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とが同一の結合物質で構成される一液の検出液を有する。
　なお、前記標的物質、前記磁性粒子、前記光応答性物質及び前記結合物質等としては、前記標的物質検出方法について説明した事項を適用することができる。
　前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで同一の前記結合物質を用いる場合、前記標的物質に対する親和性が等しいことから、前記検出液を親和性の差に応じて２液に分け、添加する順番を決定する必要がない。
　また、前記検出液を一液として調製し保存しておくと、前記標的物質の前記被検体液に前記検出液を加えるだけで前記液体試料を調製することができ、検出前の前処理を効率的に行うことができる。
　特に、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで親和性に差がないことから、これら結合物質が前記標的物質に結合する反応が同時並行的に生じ、前記標的物質と前記結合物質を介した前記磁性粒子及び前記光応答性物質との前記結合体を短時間に得ることができ、検出前の前処理に要する時間を短縮化させて、より一層の効率化を図ることができる。
　以下では、図面を参照しつつ、本発明の実施形態をより具体的に説明する。
〔第１の実施形態〕
　第１の実施形態について図５等を参照しつつ説明する。第１の実施形態では、標的物質検出装置１を用いる。なお、図５は、標的物質検出装置１の説明図である。
　図５に示すように標的物質検出装置１は、公知の透過型顕微鏡に準じて構成され、液体試料導入板２と、光照射部３と、第１の磁場印加部４と、撮像デバイス５ａ及び対物レンズ５ｂで構成される光信号検出部５とで構成される。なお、撮像デバイス５ａは、例えば、公知のＣＣＤイメージセンサ等で構成され、２次元画像の取得が可能とされる。
　液体試料導入板２は、前記標的物質及び前記標的物質と前記結合体を形成する前記磁性粒子を含む液体試料が表面上に導入されるとともに裏面側から照射される光Ｌの透過光ＴＬを伝搬光として前記表面上方に伝搬可能とされる透光板で形成される。また、液体試料導入板２は、自身で液体試料保持部を構成し、前記表面上に前記液体試料が導入された後、前記液体試料を覆うようにカバーガラス等を配することで前記液体試料を保持する。
　光照射部３は、液体試料導入板２の前記裏面側から光Ｌを照射可能とされる裏面側光照射部として構成される。
　また、第１の磁場印加部４は、液体試料導入板２の前記表面側に配されるとともに液体試料導入板２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２から遠ざかる方向に移動させるように構成される。ここで、第１の磁場印加部４は、中央に貫通孔が形成された環状の電磁石で形成され、光照射部３から照射される光Ｌの透過光ＴＬに基づく光信号が前記貫通孔を通じて光信号検出部５で検出可能とされる。
　光信号検出部５は、液体試料導入板２の前記表面側に配されるとともに第１の磁場印加部４による前記磁場の印加前後における前記伝搬光に基づく光信号の信号変化を検出可能とされる。
　標的物質検出装置１を用いて、第１の実施形態に係る標的物質検出方法を実施する。
　先ず、液体試料導入板２の前記表面上に前記液体試料を導入し、保持させる（液体試料導入保持工程）。
　ここで、前記液体試料としては、それぞれ前記標的物質と結合体を形成する前記磁性粒子及び前記光応答性物質と、前記磁性粒子を前記標的物質に結合させる前記第１の結合物質と、前記光応答性物質を前記標的物質に結合させる前記第２の結合物質とを含み、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで同一の前記結合物質が用いられることが肝要である（図１～図３参照）。
　次に、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２の前記表面上に重力沈降した後、液体試料導入板２の裏面側から光Ｌを照射し（光照射工程）、対物レンズ５ｂを調整して前記表面ないしその近傍を結像可能範囲内に入れ、撮像デバイス５ａで前記表面上の光信号を取得する（光信号検出工程）。ここで、結像可能範囲とは、焦点深度及びその近傍における光信号を取得可能な範囲を指す。
　このときの撮像デバイス５ａで観察される観察視野内の液体試料導入板２の前記表面上の様子を模式的に図６に示す。
　図６に示すように、観察視野内の液体試料導入板２の前記表面上には、例えば、液体試料導入板２の前記表面上方に伝搬される前記伝搬光の前記液体試料に対する透過光の光信号（バックグラウンド信号）とのコントラスト差により前記バックグラウンド信号と識別可能な４つの光信号ａ～ｄが観察される。図６では、光信号ａ，ｄが光点として観察されることを示しており、光信号ｂ，ｃが暗点として観察されることを示している。
　また、このときの光信号ａを発生させる物質ａ’と光信号ｂを発生させる物質ｂ’とを液体試料導入板２の側面から見たときの様子を図７に示す。なお、図７は、図６におけるＡ－Ａ線断面図である。また、図７中の矢印Ｂは、光信号を取得可能な結像可能範囲を示している。
　図７に示すように、物質ａ’及び物質ｂ’は、液体試料導入板２の前記表面上に重力沈降された状態とされる。
　次に、第１の磁場印加部４の前記電磁石を励磁して液体試料導入板２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により第１の磁場印加部４に向けて引き寄せ、前記結合体を液体試料導入板２から遠ざかる方向に移動させる（結合体移動工程）。
　次に、結像可能範囲及び観察視野を維持したまま前記結合体を液体試料導入板２から遠ざかる方向に移動させた後の液体試料導入板２の前記表面上の光信号を撮像デバイス５ａで取得する（光信号検出工程）。
　前記結合体移動工程後、撮像デバイス５ａで観察される観察視野内の液体試料導入板２の前記表面上の様子を模式的に図８に示す。
　前記結合体移動工程前の様子を示す図６と、前記結合体移動工程後の様子を示す図８との比較を通じて理解されるように、光信号ａ，ｂは、前記結合体移動工程前後で光信号が変化し、光信号ｃ，ｄは、前記結合体移動工程前後で光信号が変化しない。
　このことから、光信号ａ，ｂを発生させる物質ａ’，ｂ’は、第１の磁場印加部４に引き寄せられる前記磁性粒子を含む前記結合体であり、前記標的物質を含むものであることが分かる。
　これに対し、前記結合体移動工程前後で変化が確認されない、光信号ｃ，ｄは、液体試料導入板２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号であることが分かる。
　前記結合体移動工程後の光信号ａを発生させる物質ａ’と光信号ｂを発生させる物質ｂ’とを液体試料導入板２の側面から見たときの様子を図９に示す。図９は、図８におけるＡ－Ａ線断面図である。また、図９中の矢印Ｂは、光信号を取得可能な結像可能範囲を示している。
　図９に示すように、物質ａ’及び物質ｂ’は、第１の磁場印加部４での前記磁場の印加により、液体試料導入板２から遠ざかる方向に移動された状態とされる。
　光信号ａは、前記結合体移動工程前後で光点のサイズが大きく観察される（図８参照）。これは、物質ａ’が光信号検出部５の結像可能範囲内に存在するものの、前記結合体移動工程前における液体試料導入板２の前記表面にピントを合せた状態での焦点深度からは外れるため、光点のサイズが大きく観察されるものである（図９参照）。
　これに対し、光信号ｂは、前記結合体移動工程後、消失することが確認される（図８参照）。これは、物質ｂ’が光信号検出部５の結像可能範囲外に移動したためである（図９参照）。
　以上のように、第１の実施形態に係る標的物質検出方法では、前記標的物質に基づく光信号を、液体試料導入板２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号と明確に区別して検出することができるため、前記標的物質を高精度に検出することができる。また、液体試料導入板２の前記表面上に前記夾雑物が吸着している場合でも、その存在を無視した検出を行うことができるため、必ずしも検出ごとに液体試料導入板２に対する前記洗浄処理を行う必要がなく、効率的な検出を行うことができる。
　加えて、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで同一の前記結合物質が用いられることから、効率的で、高精度かつ安定的に標的物質を検出することができる。
　次に、第１の実施形態の第１の変形例について図１０を用いて説明する。第１の変形例では、標的物質検出装置１Ａを用いる。なお、図１０は、標的物質検出装置１Ａの説明図である。
　図１０に示すように、標的物質検出装置１Ａでは、標的物質検出装置１に対し、更に、第３の磁場印加部６を配して構成される。なお、この他は、標的物質検出装置１と同様であるため、説明を省略する。
　第３の磁場印加部６は、液体試料導入板２の裏面側に配されるとともに液体試料導入板２に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２の表面上に引き寄せ可能とされ、ここでは、貫通孔が形成された環状の電磁石で形成され、光照射部３が前記貫通孔を通じて液体試料導入板２の裏面側から光を照射可能とされる。
　標的物質検出装置１Ａを用いる場合、標的物質検出装置１を用いた検出のように、前記液体試料導入保持工程後、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２の前記表面上に重力沈降することを待つことなく、前記液体試料導入保持工程後、前記結合体移動工程前に、第３の磁場印加部６での引き寄せ磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を一旦液体試料導入板２の表面上に引き寄せることができる（結合体引き寄せ工程）。
　したがって、第１の実施形態の第１の変形例によれば、第１の実施形態が有する利点に加えて、検出に要する時間を短時間化させ、より効率的な前記標的物質の検出を行うことができる。
　次に、第１の実施形態の第２の変形例について図１１を用いて説明する。第２の変形例では、標的物質検出装置１Ｂを用いる。なお、図１１は、標的物質検出装置１Ｂの説明図である。
　図１１に示すように、標的物質検出装置１Ｂでは、標的物質検出装置１における第１の磁場印加部４に代えて、第１の磁場印加部７を配して構成される。なお、この他は、標的物質検出装置１と同様であるため、説明を省略する。
　第１の磁場印加部７は、電磁石により構成されるとともに、液体試料導入板２の前記表面上の検出領域（前記裏面側において光照射部３による光の照射を受け、前記表面上方に前記伝搬光を生じさせる領域）に対して斜め上方に配され、液体試料導入板２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させる（第１の結合体移動工程）。
　第１の磁場印加部７を用いて実施した前記第１の結合体移動工程後に、撮像デバイス５ａで観察される観察視野内の液体試料導入板２の前記表面上の様子を模式的に図１２に示す。なお、前記第１の結合体移動工程前における様子は、図６と同様である。
　前記第１の結合体移動工程前の様子を示す図６と、前記第１の結合体移動工程後の様子を示す図１２との比較を通じて理解されるように、光信号ａ，ｂは、前記第１の結合体移動工程前後で光信号が変化し、光信号ｃ，ｄは、前記第１の結合体移動工程前後で光信号が変化しない。
　したがって、第１の実施形態の第２の変形例によれば、第１の実施形態と同様に、光信号ａ，ｂを発生させる物質ａ’，ｂ’が前記標的物質を含み、光信号ｃ，ｄが液体試料導入板２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号であると判断することができる。
　第１の磁場印加部７を用いて実施した前記第１の結合体移動工程後に、光信号ａを発生させる物質ａ’と光信号ｂを発生させる物質ｂ’とを液体試料導入板２の側面から見たときの様子を図１３に示す。なお、図１３は、図１２におけるＡ－Ａ線断面図である。また、図１３中の矢印Ｂは、光信号を取得可能な結像可能範囲を示している。
　図１３に示すように、物質ａ’及び物質ｂ’は、第１の磁場印加部７による斜め上方からの引き寄せ磁場により、それぞれ、液体試料導入板２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分ｘ１，ｘ２と、液体試料導入板２から遠ざかる方向のベクトル成分ｙ１，ｙ２とを持つ方向に移動する。
　したがって、第１の実施形態の第２の変形例では、物質ａ’及び物質ｂ’を液体試料導入板２から遠ざかる方向にのみ移動させる第１の実施形態と、前記第１の結合体移動工程後の様子が相違する。
　この相違点は、前記標的物質の検出負担を軽減することにつながる。
　即ち、図８及び図１２を比較しつつ、光信号ａ，ｂに基づく前記標的物質の検出を試みた場合について検討すると、光信号ｂについては、両図とも光信号の消失する結果であり変わりがないが、光信号ａについては、図８で示すケースではサイズ変化に基づく前記標的物質の検出のみとなり、移動に基づく前記標的物質の検出が行えないのに対し、図１２で示すケースではサイズ変化に基づく前記標的物質の検出に加え、移動に基づく前記標的物質の検出を行うことができる点で、図１２で示すケースの方が前記標的物質の検出を行い易い。
　したがって、第１の実施形態の第２の変形例では、より一層、高精度に前記標的物質の検出を行うことができる。
〔第２の実施形態〕
　次に、本発明の第２の実施形態を図１４等を参照しつつ説明する。第２の実施形態では、標的物質検出装置１０を用いる。なお、図１４は、標的物質検出装置１０の説明図である。
　図１４に示すように、標的物質検出装置１０は、公知の透過型顕微鏡に準じて構成され、液体試料導入板１２と、光照射部１３と、第２の磁場印加部１８と、撮像デバイス１５ａ及び対物レンズ１５ｂで構成される光信号検出部１５とで構成される。
　液体試料導入板１２、光照射部１３及び光信号検出部１５は、第１の実施形態の標的物質検出装置１における液体試料導入板２、光照射部３及び光信号検出部５と同様に構成することができ、標的物質検出装置１０は、第１の磁場印加部４に代えて第２の磁場印加部１８を配する点で標的物質検出装置１と相違する。以下、相違点について説明する。
　第２の磁場印加部１８は、液体試料導入板１２の前記裏面側に配されるとともに液体試料導入板１２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板１２の前記表面上に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で液体試料導入板１２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動可能とされる。ここで、第２の磁場印加部１８は、貫通孔が形成された環状の永久磁石と前記永久磁石をＸ１又はＸ２の方向にスライド移動させるスライド移動部材（不図示）とで形成され、光照射部１３が前記貫通孔を通じて液体試料導入板１２の裏面側から光を照射可能とされる。
　前記結合体の移動は、第２の磁場印加部１８を磁場印加部として、第２の磁場印加部１８からの前記磁場の印加により液体試料導入板１２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を液体試料導入板１２の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で第２の磁場印加部１８を液体試料導入板１２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、第２の磁場印加部１８の移動に追従させて前記結合体を移動させることにより行う（第２の結合体移動工程）。また、第２の磁場印加部１８を、環状に配置された複数の部材により構成した場合、各部材毎に磁場印加状態を制御することでスライド移動部材を用いずに第２の結合体移動工程を行うことも可能である。
　この第２の磁場印加部１８を用いる場合、前記第２の結合体移動工程において、前記磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を液体試料導入板１２の表面上に引き寄せるため、前記液体試料導入保持工程後、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板１２の前記表面上に重力沈降することを待つ必要がない。
　前記第２の結合体移動工程後に、撮像デバイス１５ａで観察される観察視野内の液体試料導入板１２の前記表面上の様子を模式的に図１５に示す。なお、前記第２の結合体移動工程前における様子は、図６と同様である。
　前掲図６と、前記第２の結合体移動工程後の様子を示す図１５との比較を通じて理解されるように、光信号ａ，ｂは、前記第２の結合体移動工程前後で光信号が変化し、光信号ｃ，ｄは、前記第２の結合体移動工程前後で光信号が変化しない。
　したがって、第２の実施形態によれば、光信号ａ，ｂを発生させる物質ａ’，ｂ’が前記標的物質を含み、光信号ｃ，ｄが液体試料導入板１２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号であると判断することができる。
　前記第２の結合体移動工程後に、光信号ａを発生させる物質ａ’と光信号ｂを発生させる物質ｂ’とを液体試料導入板１２の側面から見たときの様子を図１６に示す。なお、図１６は、図１５におけるＡ－Ａ線断面図である。なお、図１６中の矢印Ｂは、光信号を取得可能な結像可能範囲を示している。
　図１６に示すように、物質ａ’及び物質ｂ’は、第２の磁場印加部１８からの前記磁場の印加により液体試料導入板１２の前記表面上に引き寄せられた後、第２の磁場印加部１８の液体試料導入板１２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向への移動（図１４中の方向Ｘ１又はＸ２）に基づき、第２の磁場印加部１８の移動に追従して液体試料導入板１２の前記表面の面内方向と平行な方向に移動する。
　なお、図１５，１６では、物質ａ’及び物質ｂ’が観察視野内で移動する例を示しているが、第２の磁場印加部１８を液体試料導入板１２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向で、かつ、矩形状の観察視野を律するいずれかの一辺の方向と平行な方向に、前記一辺の長さよりも長い距離で移動させると、前記観察視野内の物質ａ’及び物質ｂ’を観察視野外まで移動させることができ、光信号ａ，ｂの消失に基づく高精度の検出を行うことができる。
　また、第１及び第２の実施形態における標的物質検出装置では、光学系を公知の正立顕微鏡の構成にしたがって、液体試料導入板２，１２の前記裏面側から光を照射し、前記表面側に透過する前記伝搬光に基づく前記光信号を光信号検出部５，１５で検出することとしているが、公知の倒立顕微鏡の構成にしたがって、前記液体試料導入板の前記表面側から光を照射し、前記裏面側に透過する前記伝搬光に基づく前記光信号を、前記裏面側に配された前記光信号検出部で検出することとしてもよい。
〔第３の実施形態〕
　次に、本発明の第３の実施形態を図１７等を参照しつつ説明する。第３の実施形態では、標的物質検出装置２０を用いる。なお、図１７は、標的物質検出装置２０の説明図である。
　図１７に示すように標的物質検出装置２０は、公知の落射型顕微鏡に準じて構成され、液体試料導入板２２と、光照射部２３と、第１の磁場印加部２４と、撮像デバイス２５ａ、対物レンズ２５ｂ及びハーフミラー（ダイクロイックミラー等）２５ｃで構成される光信号検出部２５とで構成される。なお、撮像デバイス２５ａは、例えば、公知のＣＣＤイメージセンサ等で構成され、２次元画像の取得が可能とされる。また、ハーフミラー２５ｃは、反射によって液体試料導入板２２の前記表面上に照射光を導入するための光照射部２３の光学要素としても用いられる。
　液体試料導入板２２は、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面側から照射される光Ｌの反射光ＲＬを前記伝搬光として前記表面上方に伝搬可能な反射板で形成される。また、液体試料導入板２２は、自身で前記液体試料保持部を構成し、前記表面上に前記液体試料が導入された後、前記液体試料を覆うようにカバーガラス等を配することで前記液体試料を保持する。
　光照射部２３は、ハーフミラー２５ｃによる反射光により液体試料導入板２２の前記表面側から光Ｌを照射可能とされる表面側照射部として構成される。
　また、第１の磁場印加部２４は、液体試料導入板２２の前記表面側に配されるとともに液体試料導入板２２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２２から遠ざかる方向に移動させるように構成される。ここで、第１の磁場印加部２４は、中央に貫通孔が形成された環状の電磁石で形成されており、光照射部２３から照射される光Ｌが前記貫通孔を通じて液体試料導入板２２に照射可能とされるとともに光Ｌの反射光ＲＬに基づく光信号が前記貫通孔を通じて光信号検出部２５で検出可能とされる。
　光信号検出部２５は、液体試料導入板２２の前記表面側に配されるとともに第１の磁場印加部２４による前記磁場の印加前後における前記伝搬光に基づく光信号の信号変化を検出可能とされる。
　なお、液体試料導入板２２、光照射部２３及び光信号検出部２５（撮像デバイス２５ａ、対物レンズ２５ｂ、ハーフミラー２５ｃ）は、公知の落射型顕微鏡にしたがって構成することができる。
　標的物質検出装置２０を用いて、第３の実施形態に係る標的物質検出方法を実施する。
　先ず、液体試料導入板２２の前記表面上に前記液体試料を導入し、保持させる（液体試料導入保持工程）。
　ここで、前記液体試料としては、それぞれ前記標的物質と結合体を形成する前記磁性粒子及び前記光応答性物質と、前記磁性粒子を前記標的物質に結合させる前記第１の結合物質と、前記光応答性物質を前記標的物質に結合させる前記第２の結合物質とを含み、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで同一の前記結合物質が用いられることが肝要である（図１～図３参照）。
　次に、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２２の前記表面上に重力沈降した後、光照射部２３から照射される光Ｌをハーフミラー２５ｃを介して液体試料導入板２２の前記表面側に照射し（光照射工程）、照射対物レンズ２５ｂを調整して前記表面ないしその近傍を結像可能範囲内に入れ、撮像デバイス２５ａで前記表面上の光Ｌの反射光ＲＬに基づく光信号を取得する（光信号検出工程）。
　次に、第１の磁場印加部２４の前記電磁石を励磁して液体試料導入板２２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により第１の磁場印加部２４に向けて引き寄せ、前記結合体を液体試料導入板２２から遠ざかる方向に移動させる（第１の結合体移動工程）。
　次に、結像可能範囲及び観察視野を維持したまま前記結合体を液体試料導入板２２から遠ざかる方向に移動させた後の液体試料導入板２２の前記表面上の光信号を撮像デバイス２５ａで取得する（光信号検出工程）。
　このように実施される第３の実施形態では、前記光信号検出工程における前記第１の結合体移動工程前後における光信号が、前掲図６，８のように得られ、前記標的物質に基づく光信号を、液体試料導入板２２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号と明確に区別して検出することができる。
　したがって、第３の実施形態によれば、前記標的物質を高精度に検出することができる。また、液体試料導入板２２の前記表面上に前記夾雑物が吸着している場合でも、その存在を無視した検出を行うことができるため、必ずしも検出ごとに液体試料導入板２２に対する前記洗浄処理を行う必要がなく、効率的な検出を行うことができる。また、前記散乱光、前記反射光、前記蛍光、前記光吸収等の様々な現象に基づいて発生する光信号を識別信号として取り扱うことができ、幅広い分野での利用を期待することができる。また、光信号の変化の態様として、焦点ずれに加えて消失する現象を利用することもできるため、明確に光信号の変化を捉えることができる。
　加えて、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで同一の前記結合物質が用いられることから、効率的で、高精度かつ安定的に標的物質を検出することができる。
　次に、第３の実施形態の変形例を図１８を用いて説明する。第３の実施形態では、標的物質検出装置２０Ａを用いる。なお、図１８は、標的物質検出装置２０Ａの説明図である。
　図１８に示すように、標的物質検出装置２０Ａでは、標的物質検出装置２０に対し、更に、第３の磁場印加部２６が配されるとともに第１の磁場印加部２４に代えて第１の磁場印加部２７が配された構成とされる。なお、この他は、標的物質検出装置２０と同様であるため、説明を省略する。
　第３の磁場印加部２６は、電磁石で形成され、液体試料導入板２２の裏面側に配されるとともに液体試料導入板２２に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２２の前記表面上に引き寄せ可能とされる。
　第３の磁場印加部２６によれば、標的物質検出装置２０を用いた場合のように、前記液体試料導入保持工程後、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２２の前記表面上に重力沈降することを待つことなく、前記液体試料導入保持工程後、前記結合体移動工程前に、第３の磁場印加部２６での引き寄せ磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を一旦液体試料導入板２２の表面上に引き寄せることができる（結合体引き寄せ工程）。
　したがって、第３の実施形態の変形例によれば、第３の実施形態が有する利点に加えて、検出に要する時間を短時間化させ、より効率的な前記標的物質の検出を行うことができる。
　また、第１の磁場印加部２７は、電磁石により構成されるとともに、液体試料導入板２２の側方に配され、液体試料導入板２２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させる（第１の結合体移動工程）。
　第１の磁場印加部２４に代えて第１の磁場印加部２７を用いる場合、前記光信号検出工程における前記第１の結合体移動工程前後における光信号が、前掲図６，１２のように得られ、前記標的物質に基づく光信号を、液体試料導入板２２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号と明確に区別して検出することができる。
〔第４の実施形態〕
　次に、本発明の第４の実施形態を図１９等を参照しつつ説明する。第４の実施形態では、標的物質検出装置３０を用いる。なお、図１９は、標的物質検出装置３０の説明図である。
　図１９に示すように、標的物質検出装置３０は、公知の落射型顕微鏡に準じて構成され、液体試料導入板３２と、光照射部３３と、第２の磁場印加部３８と、撮像デバイス３５ａ、対物レンズ３５ｂ及びハーフミラー３５ｃで構成される光信号検出部３５とで構成される。
　液体試料導入板３２、光照射部３３及び光信号検出部３５は、第３の実施形態の標的物質検出装置２０における液体試料導入板２２、光照射部２３及び光信号検出部２５と同様に構成することができ、標的物質検出装置３０は、第１の磁場印加部２４に代えて第２の磁場印加部３８を配する点で標的物質検出装置２０と相違する。以下、相違点について説明する。
　第２の磁場印加部３８は、液体試料導入板３２の前記裏面側に配されるとともに液体試料導入板３２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板３２の前記表面上に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で液体試料導入板３２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動可能とされる。ここで、第２の磁場印加部３８は、永久磁石と前記永久磁石をＸ１又はＸ２の方向にスライド移動させるスライド移動部材（不図示）とで形成される。
　前記結合体の移動は、第２の磁場印加部３８を磁場印加部として、第２の磁場印加部３８からの前記磁場の印加により液体試料導入板３２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を液体試料導入板３２の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で第２の磁場印加部３８を液体試料導入板３２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、第２の磁場印加部３８の移動に追従させて前記結合体を移動させることにより行う（第２の結合体移動工程）。また、第２の磁場印加部３８を、環状に配置された複数の部材により構成した場合、各部材毎に磁場印加状態を制御することでスライド移動部材を用いずに第２の結合体移動工程を行うことも可能である。
　この第２の磁場印加部３８を用いる場合、前記第２の結合体移動工程において、前記磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を液体試料導入板３２の表面上に引き寄せるため、前記液体試料導入保持工程後、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板２の前記表面上に重力沈降することを待つ必要がない。
　このように実施される第４の実施形態では、前記光信号検出工程における前記第２の結合体移動工程前後における光信号が、前掲図６，１５のように得られ、前記標的物質に基づく光信号を、液体試料導入板３２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号と明確に区別して検出することができる。
　なお、図１５では、物質ａ’及び物質ｂ’が観察視野内で移動する例を示しているが、第２の磁場印加部３８を液体試料導入板３２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向で、かつ、矩形状の観察視野を律するいずれかの一辺の方向と平行な方向に、前記一辺の長さよりも長い距離で移動させると、前記観察視野の物質ａ’及び物質ｂ’を観察視野外まで移動させることができ、光信号ａ，ｂの消失に基づく高精度の検出を行うことができる。
　なお、前記結合体に基づく光信号の態様として、図６，８，１２，１５に例を挙げ、前記散乱光、前記反射光、蛍光等に起因する光信号であることの説明をしたが、これは、図面表示の便宜ためであり、前記光信号の態様としては、前記位相差、前記微分干渉などによる前記透過光に起因する光信号であってもよい。
　また、前記結合体に基づく光信号の変化の態様として、図８，１２，１５に例を挙げ、前記位置移動、前記焦点ずれ、前記消失として説明をしたが、前記光信号の変化の態様としては、強度の増減（前記焦点ずれに基づく強度低下等）、位相変化（位置移動後の位相変化）、出現（観察視野外からの位置移動）も挙げることができる。
〔第５の実施形態〕
　次に、本発明の第５の実施形態を図２０等を参照しつつ説明する。第５の実施形態では、標的物質検出装置４０を用いる。なお、図２０は、標的物質検出装置４０の説明図である。
　図２０に示すように標的物質検出装置４０は、公知の導波モードセンサに準じて構成され、液体試料導入板４２と、光源４３ａ及び光学プリズム４３ｂで構成される光照射部と、第３の磁場印加部４６と第１の磁場印加部４７と、光信号検出部４５（撮像デバイス）とで構成される。なお、前記撮像デバイスは、例えば、公知のＣＣＤイメージセンサ等で構成され、２次元画像の取得が可能とされる。
　第３の磁場印加部４６は、永久磁石と、永久磁石を光学プリズム４３ｂから遠ざけたり近づけたりする（図２０中の方向Ｙ１，Ｙ２参照）ことによって磁場印加のオン－オフを制御するスライド移動部材（不図示）で形成され、液体試料導入板４２の裏面側に配されるとともに液体試料導入板４２に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板４２の前記表面上に引き寄せ可能とされる。
　液体試料導入板４２は、前記液体試料Ｅが前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光Ｌの照射を受け、前記表面上方に近接場光を発生可能な検出板で形成される。また、液体試料導入板４２は、自身で前記液体試料保持部を構成し、前記表面上に前記液体試料Ｅが導入された後、前記液体試料を覆うようにカバーガラスＧを配することで前記液体試料Ｅを保持する。
　前記光照射部は、光源４３ａから照射される光Ｌを光学プリズム４３ｂを介して液体試料導入板４２の前記表面に対して全反射条件で照射可能とされる全反射光照射部として構成される。なお、前記全反射光照射部は、例えば前記光学プリズム４３ｂに代わり、グレーティングを介して前記液体試料導入板４２の前記表面に対して全反射条件で前記光源４３ａから照射される光Ｌを導入する構成とすることもできる。
　また、第１の磁場印加部４７は、永久磁石と、永久磁石を光学プリズム４３ｂから遠ざけたり近づけたりする（図２０中の方向Ｘ１，Ｘ２参照）ことによって磁場印加のオン－オフを制御するスライド移動部材（不図示）で形成され、液体試料導入板４２の側方に配され、液体試料導入板４２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板４２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させるように構成される。
　標的物質検出装置４０を用いて、第５の実施形態に係る標的物質検出方法を実施する。
　先ず、液体試料導入板４２の前記表面上に前記液体試料を導入し、保持させる（液体試料導入保持工程）。
　ここで、前記液体試料としては、それぞれ前記標的物質と結合体を形成する前記磁性粒子及び前記光応答性物質と、前記磁性粒子を前記標的物質に結合させる前記第１の結合物質と、前記光応答性物質を前記標的物質に結合させる前記第２の結合物質とを含み、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで同一の前記結合物質が用いられることが肝要である（図１～図３参照）。
　次に、第３の磁場印加部４６におけるスライド移動部材を操作して磁場を印加し、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板４２の前記表面上に引き寄せた後、光源４３ａから照射される光Ｌを光学プリズム４３ｂを介して液体試料導入板４２の前記表面に対して全反射条件で照射し（光照射工程）、光信号検出部４５で前記表面上の前記近接場光に基づく光信号Ｓを取得する（光信号検出工程）。
　次に、第３の磁場印加部４６におけるスライド移動部材を操作して第３の磁場印加部４６からの磁場をオフし、第１の磁場印加部４７におけるスライド移動部材を操作して第１の磁場印加部４７からの磁場をオンにして液体試料導入板４２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により第１の磁場印加部４７に向けて引き寄せ、前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板４２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させる（第１の結合体移動工程）。
　次に、観察視野を維持したまま前記結合体を移動させた後の液体試料導入板４２の前記表面上の光信号を光信号検出部４５で取得する（光信号検出工程）。
　このように実施される第５の実施形態では、前記光信号検出工程における前記第１の結合体移動工程前後における光信号が、図２１，２２のように得られ、前記標的物質に基づく光信号ｅ，ｇを、液体試料導入板４２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号ｆと明確に区別して検出することができる。なお、図２１が結合体移動工程前における、液体試料導入板４２の前記表面上の様子を示す図であり、図２２が結合体移動工程後における、液体試料導入板４２の前記表面上の様子を示す図である。
　図２１，２２に示すように前記近接場光を利用して得られる光信号は、前記近接場光の減衰によりバックグランドが暗視野とされ、第５の実施形態では、光点の光信号に基づき、前記標的物質を検出する。また、図示しないが、観察視野外からの移動に基づく、光信号の出現も検出対象とすることができる。
　また、液体試料導入板４２の前記表面上に前記夾雑物が吸着している場合でも、その存在を無視した検出を行うことができるため、必ずしも検出ごとに液体試料導入板４２に対する前記洗浄処理を行う必要がなく、効率的な検出を行うことができる。また、前記散乱光、前記蛍光等の現象に基づいて発生する光信号を識別信号として取り扱うことができる。また、光信号の変化の態様として、位置移動に加え、出現・消失の現象を利用することもできるため、明確に光信号の変化を捉えることができる。
　加えて、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで同一の前記結合物質が用いられることから、効率的で、高精度かつ安定的に標的物質を検出することができる。
〔第６の実施形態〕
　次に、本発明の第６の実施形態を図２３等を参照しつつ説明する。第６の実施形態では、標的物質検出装置５０を用いる。なお、図２３は、標的物質検出装置５０の説明図である。
　図２３に示すように、標的物質検出装置５０は、公知の導波モードセンサに準じて構成され、液体試料導入板５２と、光源５３ａ及び光学プリズム５３ｂで構成される光照射部と、第２の磁場印加部５８と、光信号検出部５５とで構成される。
　液体試料導入板５２、前記光照射部及び光信号検出部５５は、第５の実施形態の標的物質検出装置４０における液体試料導入板４２、前記光照射部及び光信号検出部４５と同様に構成することができ、標的物質検出装置５０は、第１の磁場印加部４７及び第３の磁場印加部４６に代えて第２の磁場印加部５８を配する点で標的物質検出装置４０と相違する。以下、相違点について説明する。
　第２の磁場印加部５８は、液体試料導入板５２の前記裏面側に配されるとともに液体試料導入板５２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により液体試料導入板５２の前記表面上に引き寄せ可能とされるとともに前記磁場を印加した状態で液体試料導入板５２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動可能とされる。ここで、第２の磁場印加部５８は、永久磁石と前記永久磁石をＸ１又はＸ２の方向にスライド移動させるスライド移動部材（不図示）とで形成される。
　前記結合体の移動は、第２の磁場印加部５８を磁場印加部として、第２の磁場印加部５８からの前記磁場の印加により液体試料導入板５２の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を液体試料導入板５２の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で第２の磁場印加部５８を液体試料導入板５２の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、第２の磁場印加部５８の移動に追従させて前記結合体を移動させることにより行う（第２の結合体移動工程）。また、第２の磁場印加部５８を、環状に配置された複数の部材により構成した場合、各部材毎に磁場印加状態を制御することでスライド移動部材を用いずに第２の結合体移動工程を行うことも可能である。
　この第２の磁場印加部５８を用いる場合、前記第２の結合体移動工程において、前記磁場の印加により前記液体試料中の前記結合体の全部又は一部を液体試料導入板５２の表面上に引き寄せるため、前記液体試料導入保持工程後、前記液体試料の液層中を浮遊する前記結合体が液体試料導入板５２の前記表面上に重力沈降することを待つ必要がない。
　このように実施される第６の実施形態では、前記光信号検出工程における前記第２の結合体移動工程前後における光信号が、図２４，２５のように得られ、前記標的物質に基づく光信号ｈを、液体試料導入板５２の前記表面上のキズ、前記表面に吸着ないし前記表面上に存在する夾雑物、光源出力の揺らぎなどのノイズ信号ｉと明確に区別して検出することができる。なお、図２４が結合体移動工程前における、液体試料導入板５２の前記表面上の様子を示す図であり、図２５が結合体移動工程後における、液体試料導入板５２の前記表面上の様子を示す図である。
　なお、第５及び第６の実施形態の標的物質検出装置では、前記導波モードセンサの構成にしたがって構成されることとしたが、これら実施形態の変形例として、液体試料導入板４２，５２を前記表面プラズモン共鳴センサで用いられる前記検出板とし、光学系を前記表面プラズモン共鳴センサで用いられる光学系とすることで、これら実施形態と同様に、前記結合体の移動に基づく前記標的物質の検出を行うことができる。また、公知の全反射顕微鏡の光学系をはじめとする、全反射により生じる近接場光を照明に利用する光学系を用いることもできる。
　なお、上記実施の形態等で示した例は、発明を理解しやすくするために記載したもので
あり、この形態に限定されるものではない。
　また、前掲の各標的物質検出装置においては、前記液体試料導入板として、前記透光板、前記反射板、前記検出板を用いた構成とされるが、前記導入板を用いて構成してもよい。この場合、前記光照射部として前記側面側光照射部を採用し、前記液体試料導入板の前記表面側又は前記裏面側に配された前記光信号検出部において、前記結合体からの散乱光、反射光等を検出する構成とすることができる。或いは、前記液体試料導入板の前記側面（前記液体試料導入板の前記側面側光照射部が配される側と反対側の側面）側に配された前記光信号検出部において、前記結合体の光吸収、透過光等を検出する構成とすることができる。
（実施例１）
　実施例１として前記標的物質検出装置（外力支援型センサ）を用いた前記標的物質の検出試験を次のように行った。
　実施例１では、図２０に示す第５の実施形態の標的物質検出装置４０の構成に準じて作製した標的物質検出装置を用いる。以下では、説明の便宜上、標的物質検出装置４０の説明に用いた符号と同一の符号で実施例１に用いた標的物質検出装置の各構成部を説明する。
　具体的に、液体試料導入板４２としては、厚さ０．７２５ｍｍのＳｉＯ２基板上に厚さ２５ｎｍのＳｉ層と厚さ３４３ｎｍのＳｉＯ２層とをこの順番で積層した平面導波路チップを用いた。光源４３ａには緑色ＬＥＤ光源（Ｔｈｏｒｌａｂｓ社、型番Ｍ５３０Ｆ２）に対して、出射端にコリメートレンズを装着した６００μｍコア径の光ファイバを接続し、出射端の先に５００μｍ幅のエアスリットを配置したものを用いた。液体試料導入板４２の裏面には底角３５度のＳｉＯ２ガラス製のプリズム４３ｂを光学的に密着させて配し、液体試料導入板４２の表面に対して平行な角度でプリズム４３ｂの入射面に光源４３ａからの光を入射させることとした。
　前記標的物質としては、ノロウイルスのウイルス様粒子を用いた。
　前記磁性粒子としては、２５ｎｍ径の磁性ビーズ（NANOCS社製，Magnetic Nanoparticles,Protein G Labeled，型番MP25-PG）を用いた。
　前記光応答性物質としては、６０ｎｍ径の金ナノ粒子（Cytodiagnostics社製，60nm NHS-Activated Gold Nanoparticle Conjugation Kit，型番CGN10K-60）を用いた。
　前記結合物質としては、抗ノロウイルスモノクローナル抗体を用いた。
　前記液体試料としては、それぞれに前記結合物質を結合させた前記磁性粒子及び前記光応答性物質を含む前記検出液（一液）を予め調製し、この検出液を前記標的物質の被検体液に混合して調製した。
　なお、前記検出液の使用量は、１００μＬであり、前記検出液中の前記結合物質の濃度は、１．３ｐｇ／Ｌである。また、前記被検体液の使用量は、１００μＬであり、前記被検体液中の前記標的物質の濃度は、１ｆｇ／Ｌである。
　前記標的物質の具体的な検出方法は、次の通りである。
　先ず、前記液体試料３０μＬを液体試料導入板４２上に直径６ｍｍの貫通穴を持つ厚さ１ｍｍのシリコンゴムシートを設置することで形成した前記液体試料保持部に導入した。
　前記液体試料を導入後、カバーガラスＧを配して前記液体試料保持部に蓋をし、プリズム４３ｂの底面側に配した第３の磁場印加部４６をオンすることによって、前記磁性粒子を液体試料導入板４２の表面上に引き寄せた。第３の磁場印加部４６にはスライド部材に固定したネオジウム磁石を用いた。
　第３の磁場印加部４６による引き寄せ後、前記入射光の照射によって液体試料導入板４２の表面に近接場を形成させるとともに、プリズム４３ｂの側面に配した、スライド部材に固定したネオジウム磁石を用いて、第１の磁場印加部４７をオンにして、光信号検出部４５により液体試料導入板４２の表面上の様子を動画で観測し、光信号の検出を行った。
　光信号検出部４５による前記光信号の観測には、４倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡と、非冷却ＣＭＯＳカメラ（Basler社製、型番acA2440-35uc）とを用いた。つまり、光信号検出部４５（撮像デバイス）として、４倍の対物レンズを備えたＣＭＯＳカメラを用いたこととなる。
　前記光応答性物質として用いた金ナノ粒子は、光源４３ａによる光照射に起因して局在プラズモン共鳴を起こすため、前記撮像デバイスでは、前記局在プラズモン共鳴により増強された前記光応答性物質からの散乱光が観測される。
　以上の実施例１に係る標的物質検出方法による前記標的物質の検出は、前記検出液を前記標的物質の被検体液に混合してから５分以内に行う１回目検出と、調製した前記液体試料を冷蔵庫で一晩保存して行う２回目検出とで２回行った。
（比較例１）
　前記結合物質として、前記抗ノロウイルスモノクローナル抗体に加え、抗ノロウイルスポリクローナル抗体を用い、前記抗ノロウイルスポリクローナル抗体を前記磁性粒子に結合させ、前記抗ノロウイルスモノクローナル抗体を前記光応答性物質に結合させたこと以外は、実施例１に係る標的物質検出方法と同様の物質構成で前記液体試料を調製した。
　また、前記光信号の検出は、実施例１に係る標的物質検出方法と同様の方法で行うこととし、前記標的物質の被検体液に対し、先に前記抗ノロウイルスポリクローナル抗体を結合させた前記磁性粒子を加え、反応時間として１５分間経過後、前記抗ノロウイルスモノクローナル抗体を結合させた前記光応答性物質を加えて前記液体試料を調製し、反応時間として１５分経過後に行う１回目検出と、調製した前記液体試料を冷蔵庫で一晩保存して行う２回目検出とで２回行った。
　なお、前記磁性粒子と結合させた前記抗ノロウイルスポリクローナル抗体を含む第１液の使用量は、５０μＬであり、前記第１液中の前記抗ノロウイルスポリクローナル抗体の濃度は、０．１ｐｇ／Ｌである。また、前記光応答性物質と結合させた前記抗ノロウイルスモノクローナル抗体を含む第２液の使用量は、５０μＬであり、前記第２液中の前記抗ノロウイルスモノクローナル抗体の濃度は、２．５ｐｇ／Ｌである。また、前記被検体液の使用量及び前記被検体液中の前記標的物質の濃度は、実施例１と同じである。
　実施例１及び比較例１に係る各標的物質検出方法により、それぞれ２回ずつ行った検出の結果として、前記磁石の移動前後の様子を露光時間０．３秒で撮像した画像を図２６（ａ）～図２９（ｂ）に示す。
　図２６（ａ）が実施例１に係る標的物質検出方法による１回目検出の動画中の一の時点での画像を示し、図２６（ｂ）が実施例１に係る標的物質検出方法による１回目検出の前記動画中の前記一の時点から７秒経過後の画像を示している。
　また、図２７（ａ）が実施例１に係る標的物質検出方法による２回目検出の動画中の一の時点での画像を示し、図２７（ｂ）が実施例１に係る標的物質検出方法による２回目検出の前記動画中の前記一の時点から５．３秒経過後の画像を示している。
　また、図２８（ａ）が比較例１に係る標的物質検出方法による１回目検出の動画中の一の時点での画像を示し、図２８（ｂ）が比較例１に係る標的物質検出方法による１回目検出の前記動画中の前記一の時点から６．３秒経過後の画像を示している。
　また、図２９（ａ）が比較例１に係る標的物質検出方法による２回目検出の動画中の一の時点での画像を示し、図２９（ｂ）が比較例１に係る標的物質検出方法による２回目検出の前記動画中の前記一の時点から２．７秒経過後の画像を示している。
　なお、説明の簡単化のため、図２６（ａ）～図２９（ｂ）の各図は、バックグラウンドを白、光信号検出位置を黒としている。
　また、図２６（ａ）～図２９（ｂ）の各図における視野は、大凡１．９ｍｍ×１．６ｍｍである。
　また、図２６（ａ）～図２９（ｂ）の各図における円で囲んだ部分は、前記磁石の移動前後で移動があった光点を示しており、いずれの図においても、図の左方向（第１の磁場印加部４７により前記磁性粒子が引き寄せられる方向）に光点が移動していることが確認される。
　また、図２６（ａ）～図２９（ｂ）における、各図（ｂ）で示す画像を取得するタイミングがランダムであるが、これは、経過時間毎に取得した複数の画像のうち、移動する光点が明瞭に確認できるものを選択したためである。
　更に、これら図２６（ａ）～図２９（ｂ）に示す観察状況と同様の観察状況で、実施例１及び比較例１に係る各標的物質検出方法により、それぞれ２回ずつ行った合計４回の検出試験に関し、視野が異なる任意の３箇所に対し前記磁石の移動前後の様子を観察する３点測定法により得られた測定結果を説明する。
　なお、前記３点測定法では、４０秒間のカメラ観察の中で移動した光点数を測定することとし、測定結果は、３箇所における移動した光点数の平均値により評価する。
　先ず、実施例１に係る標的物質検出方法による１回目検出では、前記平均値を２．７とする測定結果が得られた。
　次に、実施例１に係る標的物質検出方法による２回目検出では、１回目検出と同様に、前記平均値を２．７とする測定結果が得られた。
　次に、比較例１に係る標的物質検出方法による１回目検出では、前記平均値を３．０とする測定結果が得られた。
　次に、比較例１に係る標的物質検出方法による２回目検出では、１回目検出の前記平均値を大きく下回り、前記平均値を０．３とする測定結果が得られた。
　なお、全ての検出において、前記標的物質を含まないりん酸緩衝液を前記標的物質の前記被検体液の代わりとした対照用液体試料を用いて対照試験を行ったが、いずれの対照試験においても移動する光点が確認されないことから、移動した光点は、前記標的物質に前記結合物質を介して前記磁性粒子及び前記光応答性物質が結合した結合体に基づく光点であると結論付けることができる。
　前記測定結果について、前記磁性粒子と前記光応答性物質とで、同じ前記結合物質（抗ノロウイルスモノクローナル抗体）を結合させた前記液体試料を用いる実施例１に係る標的物質検出方法では、前記平均値が１回目検出と２回目検出とで同じであることから（いずれも２．７）、時間経過に伴う変動がなく、安定的な検出結果を得ることができている。
　一方、前記磁性粒子と前記光応答性物質とで、異なる前記結合物質（抗ノロモノクローナル抗体と抗ノロウイルスポリクローナル抗体）を結合させた前記液体試料を用いる比較例１に係る標的物質検出方法では、２回目検出の前記平均値（０．３）が１回目検出の前記平均値（３．０）を大きく下回り、ほぼ０となったことから、時間経過に伴う変動を受け、不安定的な検出結果となっていることが分かる。
　また、比較例１に係る標的物質検出方法による１回目検出の前記平均値（３．０）と比べて実施例１に係る標的物質検出方法による１回目検出の前記平均値（２．７）は遜色がなく、同時に実施例１に係る標的物質検出方法による２回目検出の前記平均値（２．７）も遜色がないことから、実施例１に係る標的物質検出方法では、高精度の検出結果を安定的に得られることが分かる。
　加えて、実施例１に係る標的物質検出方法では、前記磁性粒子と前記光応答性物質とで同じ前記結合物質（抗ノロウイルスモノクローナル抗体）を結合させた前記液体試料を用いることから、前記結合物質間の親和性の相違を考慮する必要がなく、延いては、前記結合物質を結合させた状態の前記磁性粒子と前記光応答性物質とを加える際における、いずれを先に加えるかといった手順の問題や、前記液体試料の調製後、いつまでに検出を終えなければならないかといった時間管理の問題からの制約を受けず、単に、前記標的物質の被検体液に前記結合物質を結合させた状態の前記磁性粒子と前記光応答性物質とを加えるだけで検出の前処理を完了させることができることから、前記外力支援型センサを用いた前記標的物質の検出プロセスの高効率化を図ることができる。
　更に、実施例１に係る標的物質検出方法の１回目検出及び２回目検出における前記平均値が同じである結果（いずれも２．７）は、裏返せば、前記液体試料の調製を極めて短時間（前記結合物質を結合させた状態の前記磁性粒子と前記光応答性物質とを前記標的物質の被検体液に混合してから５分以内）で完了させることができることを意味しており、前記外力支援型センサを用いた前記標的物質の検出プロセスの高効率化を、より一層顕著なものとする。
　　　Ｔ　　　標的物質
　　　Ｂ１　　第１の結合物質
　　　Ｂ２　　第２の結合物質
　　　Ｍ　　　磁性粒子
　　　Ｏ　　　光応答性物質
　１，１Ａ，１Ｂ，１０，２０，２０Ａ，３０，４０，５０　　標的物質検出装置
　２，１２，２２，３２，４２，５２　　液体試料導入板
　３，１３，２３，３３　　光照射部
　４，７，２４，２７，４７　　第１の磁場印加部
　５ａ，１５ａ，２５ａ，３５ａ　　撮像デバイス
　５ｂ，１５ｂ，２５ｂ，３５ｂ　　対物レンズ
　２５ｃ，３５ｃ　　ハーフミラー
　５，１５，２５，３５，４５，５５　　光信号検出部
　　６，２６，４６　　第３の磁場印加部
　１８，３８，５８　　第２の磁場印加部
　４３ａ，５３ａ　　光源
　４３ｂ，５３ｂ　　光学プリズム
　　　Ｌ　　　光
　　　ＴＬ　　　透過光
　　　ＲＬ　　　反射光
　　ａ～ｉ　　光信号
　　ａ’，ｂ’　　物質
　Ｘ１，Ｘ２，Ｙ１，Ｙ２　　方向
　ｘ１，ｘ２，ｙ１，ｙ２　　ベクトル成分
　　　Ｇ　　　カバーガラス
　　　Ｅ　　　液体試料
　　　Ｓ　　　光信号

 

Claims (10)

  1. 　液体試料が表面上に導入されるとともに裏面側又は前記表面側から照射される光の透過光を伝搬光として前記光が照射される側と反対の面側に伝搬可能とされる透光板、前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面側から照射される光の反射光を前記伝搬光として前記表面上方に伝搬可能な反射板、前記液体試料が前記表面上に導入される導入板及び前記液体試料が前記表面上に導入されるとともに前記表面に対して全反射条件で照射される光により前記表面上に近接場光を発生可能な検出板のいずれかで形成される液体試料導入板が配され、かつ、前記液体試料が前記液体試料導入板の前記表面上に保持可能とされる液体試料保持部に対し、前記液体試料導入板の表面上に前記液体試料を導入し保持する液体試料導入保持工程と、
    　前記液体試料導入板が前記透光板で形成されるときに前記液体試料導入板の前記裏面側から前記光を照射する裏面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記透光板及び前記反射板のいずれかで形成されるときに前記液体試料導入板の前記表面側から前記光を照射する表面側光照射工程、前記液体試料導入板が前記導入板で形成されるときに前記液体試料導入板上に保持される前記液体試料に対して前記液体試料導入板の側面側から前記光を照射する側面側光照射工程及び前記液体試料導入板が前記検出板で形成されるときに前記表面に対して全反射条件で前記光を照射する全反射光照射工程のいずれかである光照射工程と、
    　前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向及び前記液体試料導入板から遠ざかる方向のいずれかの方向に移動させる第１の結合体移動工程並びに前記液体試料導入板の前記裏面側に配される磁場印加部からの磁場の印加により前記液体試料導入板の前記表面上に導入された前記液体試料中の前記結合体を前記液体試料導入板の前記表面上に引き寄せるとともに前記磁場を印加した状態で前記磁場印加部を前記液体試料導入板の前記表面の面内方向と平行な方向のベクトル成分を持つ方向に移動させ、前記磁場印加部の移動に追従させて前記結合体を移動させる第２の結合体移動工程のいずれかである結合体移動工程と、
    　前記結合体移動工程に伴う前記結合体の移動を前記伝搬光又は前記近接場光に基づく光信号の信号変化により検出する光信号検出工程と、を含み、
    　前記液体試料が、それぞれ標的物質と結合体を形成する磁性粒子及び光応答性物質と、前記磁性粒子を前記標的物質に結合させる第１の結合物質と、前記光応答性物質を前記標的物質に結合させる第２の結合物質とを含み、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とで同一の結合物質が用いられることを特徴とする標的物質検出方法。
  2. 　標的物質が同一型の被結合部位を複数有する物質であり、結合物質が前記被結合部位と特異的に結合可能な物質である請求項１に記載の標的物質検出方法。
  3. 　液体試料が、標的物質の被検体液に対し、それぞれが結合物質と結合された状態の磁性粒子及び光応答性物質を含む一液の検出液を混合させて調製される請求項１から２のいずれかに記載の標的物質検出方法。
  4. 　光応答性物質が、伝搬光又は近接場光の照射を受けて散乱光を発生させる請求項１から３のいずれかに記載の標的物質検出方法。
  5. 　光応答性物質が、伝搬光又は近接場光の照射を受けて蛍光を発生させる請求項１から３のいずれかに記載の標的物質検出方法。
  6. 　光信号検出工程が伝搬光に基づく光信号の信号変化を検出する工程であるときに、光応答性物質が前記伝搬光の照射を受けて光吸収を生じる光吸収物質を含む請求項１から３のいずれかに記載の標的物質検出方法。
  7. 　磁性粒子が、直径５ｎｍ～６，５００ｎｍの球状粒子である請求項１から６のいずれかに記載の標的物質検出方法。
  8. 　光応答性物質が、直径５０ｎｍ～６，５００ｎｍの球状粒子である請求項１から７のいずれかに記載の標的物質検出方法。
  9. 　結合体移動工程が第１の結合体移動工程であるときに、更に、液体試料導入保持工程後、結合体移動工程前に、引き寄せ磁場の印加により液体試料中の結合体の全部又は一部を一旦液体試料導入板の表面上に引き寄せる結合体引き寄せ工程を実施する請求項１から８のいずれかに記載の標的物質検出方法。
  10. 　標的物質と結合体を形成する磁性粒子及び前記標的物質と前記結合体を形成する光応答性物質と、前記磁性粒子を前記標的物質に結合させる第１の結合物質と、前記光応答性物質を前記標的物質に結合させる第２の結合物質とを含み、前記第１の結合物質と前記第２の結合物質とが同一の結合物質で構成される一液の検出液を有することを特徴とする標的物質検出キット。

     
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