WO2019126894A1 - Uso combinado de bumetanida con ácido valproico o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en el tratamiento de epilepsia refractaria - Google Patents

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Enrique Antonio LORCA PONCE
Patricia Alejandra GONZALEZ LINCONIR
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    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
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Definitions

  • Epilepsy is defined conceptually as a chronic disorder of the nervous system characterized by the existence of groups of neurons firing at high frequency and in high synchrony (Engelborghs et al., 2000, Pathophyslology of Epilepsy, Acta Neurolog ⁇ a Bélgica, 100 (4), 201 -203). It is recognized that epilepsy corresponds to one of the most prevalent neurological disorders in humans, affecting approximately 1% of the world population (Elger CE (2002) Epilepsy: Disease and Model to Human Braln Functional Study Braln Pathology 12 (2) 1993-1998, and Fisher RS et al. (2005) Epileptlc selzures and epilepsy.
  • This syndrome is characterized by a hyperexcitability of mesial limbic structures (Engel (2001) Mesial temporal lobe epilepsy: what have we learned? The Neuroscientist, 7 (4), 340-352) such as the hippocampus, the entorhinal cortex and amygdala (Bartolomei F et al., 2005).
  • Epileptic seizures are the clinical manifestation of a transient cerebral functional disorder characterized by a high frequency and synchronous discharge of a group of neurons.
  • epileptogenesis is the phenomenon by which a normal neuronal network becomes hyperexcitable and is capable of generating epileptic seizures spontaneously (Garc ⁇ a and cois (2010) Experimental models in epilepsy.) Neurolog ⁇ a 25 (3) 181 - 188).
  • antiepileptic drugs affect the generation of seizures, making them worse in some cases, which is why a better approach is needed in the future to develop more specific anti-epileptogenic drugs (Clark & Wilson (1999) Mechanisms of epileptogenesis Advances in Neurology 79, 607).
  • hippocampus is the main focus where crises begin (Mirsky and cois (1960) A comparison of the psychological test performance of patients with focal and nonfocal epilepsy Experimental Neurology 2819 75-89).
  • This structure is one of several related brain regions that together comprise a functional system called hippocampal formation.
  • the hippocampus has three subdivisions: CA3, CA2 and CA1.
  • the other regions of the hippocampal formation include the dentate gyrus, subiculum, presubiculum, parasubiculum and entorhinal cortex (Anderson P (2007) The hippocampus bock, Oxford University Press).
  • the hippocampus plays a unique role in human learning and memory that is particularly essential for the consolidation of new information in long-term processing. Due to the specific role of the hippocampus, memory and learning disorders are very common among people whose epileptic foci are located within the temporal lobe (Mirsky and cois (1960). A comparison of the psychological test performance of patients with focal and nonfocal epilepsy. Experimental Neurology 2 (1) 75-89) as in adults (Glowinski (1973) Cognitive deficits in temporal lobe epilepsy: An investigation of memory functioning The Journal of nervous and mental Disease 157 (2) 129-137) have shown that patients complex partial seizures that originate in the temporal lobe present major memory deficit.
  • Dentate granule cell GABA A receptors in epileptic hippocampus enhanced synaptic efficacy and altered pharmacology European Journal of Neuroscience 17 (8) 1607-1616; Heinemann and cois (1991) The dentate gyrus as a regulated gateway for the propagation of epileptiform activeness Epilepsy research Supplement, 7, 273-280; Sloviter (1994) The functional organization of the hippocampal dentate gyrus and its relevance to the pathogenesis of temporal lobe epilepsy Annals of neurology 35 (6) 640-654).
  • GABAergic neurons contain specialized vesicles that possess a GABA transporter that is capable of producing an intravesicular concentration of GABA between 10 and 20 times greater than that which exists in the cytoplasm of the neuron.
  • GABA transporter that is capable of producing an intravesicular concentration of GABA between 10 and 20 times greater than that which exists in the cytoplasm of the neuron.
  • these vesicles fuse with the cell membrane in a process that involves the participation of different specific proteins that are activated by an increase in intracellular Ca 2+ concentration due to the opening of different types of Ca channels. 2+ that are voltage dependent.
  • Bumetanide a conventional diuretic, is a selective inhibitor of NKCC1 (Eftekhari and cois 2013 Bumetanide reduces seizure frequency in patients with temporal lobe epilepsy, Epilepsy 54 (1) e9-e12), so it could have a potential anti-epileptic effect in pathologies such as neonatal and refractory epilepsy (Ben-Ari Y.
  • US92061 1 1 teaches compounds which include a salt of valproic acid, compositions comprising them, and which can be formulated for oral, buccal, rectal, topical, transdermal, parenteral, syrup or injection administration their use for the treatment or prevention of neurological diseases such as epilepsy, migraine, schizophrenia, bipolar illness, among others.
  • WO2016067297 teaches compounds which include a salt of valproic acid and its polymorphs, compositions comprising them, and which can be formulated for oral, buccal, rectal, topical, transdermal, parenteral, syrup or injection administration its use for the treatment or prevention of diseases neurological disorders such as epilepsy, migraine, schizophrenia, bipolar illness, among others.
  • WO201 1 126733 teaches the co-administration of NKCC1 inhibitors such as bumetanide, furesomide, trosemide and ethacrynic acid and GABA transaminase inhibitors such as vigabatrin, aminooxyacetic acid, valproate and analogous structures that attenuate retinal toxicity and intramyelinic edema; useful for treating infantile spasms or refractory seizures in adults.
  • Bumetanide-vigabatrin being the preferred co-administration. It also teaches the unit dose form or a pack comprising said combination of compounds. It is mentioned as a combination of effective formulation in co-formulation of valproate and bumetanide, see example 4. It does not refer in particular to refractory temporal lobe epilepsy.
  • the objective of the present invention is the combined use of Bumetanide with valproic acid or one of its pharmaceutically acceptable salts, to restore the homeostasis of IC, and with it, the inhibitory effect of antiepileptic drugs, in a model of chronic epilepsy. .
  • the present invention proposes an alternative form to the already known forms for the treatment of epilepsy, and especially, of refractory epilepsy.
  • the anatomical and physiological characteristics of human pathology such as neuronal degeneration of the hippocampus, reorganization of neuronal networks in hippocampal and parahippocampal regions and recurrent spontaneous crises (Lévesque et al. (2016 ) Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration, Journal of Neuroscience Methods 260, 45-52).
  • the polycarpine model was used because according to the literature it is the model that best meets these requirements, see Curis and cois (2008) The polycarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal if Neuroscience Methods 172 (2).
  • the granular layer of the dentate gyrus was chosen because this zone corresponds to the entry gate of information to the hippocampal circuit, therefore, if the information transmitted to the granular layer increases, the activity of the whole hippocampal circuit increases (Haley & Somogyi (1993) Subdivision in the multiple GABAergic innervation of granule cells in the dentate gyrus of the mouse hyppocampus European Journal of Neuroscience 5 (59 41 1 -412)
  • the granular cells of the dentate gyrus under normal conditions have a low excitability, however, it has been seen that under epileptic conditions they become highly excitable (Cohen and cois (2003) Dentate granule cell GABA A receptors in epileptic hippocampus enhanced synaptic efficacy and altered pharmacology European Journal of Neuroscience 17 (8) 1607-1616; Heinemann and cois (1991) The dentate gyrus as a regulated gate for the propagation of epil
  • the murine model of pilocarpine allowed to demonstrate that 100% of the injected animals reached the SE within the first 40 minutes after injection of the drug.
  • FIG. 5A and 4B correspond to representative traces.
  • Figure 5A belongs to a control animal slice and Figure 5B belongs to an animal under epilepsy conditions, before and after the application of Bumetanide (BTDA) + phenobarbital (PFIB).
  • Figure 5E shows the decrease in the firing frequency for both conditions. Standard sample error (SEM), test t.
  • SEM Standard sample error
  • Figure 8C shows histograms with percentage quantification during the first and last 10 minutes of administration of VPA and BTDA + VPA.
  • Figure 8D shows the average representative traces of the field response in a control slice and an epileptic slice, before (1) and after (2) the administration of VPA (2 upper traces) and BTDA + VPA (2 lower traces). The stimulus was given every 10 seconds for 40 minutes with an average current intensity at the saturation current.
  • 1 Base line
  • 2 BTDA.
  • Figure 8E Sample standard error (SEM), test t, p ⁇ 0.05 O; p ⁇ 0.005 ( ** ); p ⁇ 0.001 ( *** )
  • Figure 10A shows the average survival percentage for each pre-treatment. 100% corresponds to all live animals and 0% to all dead animals. The time zero corresponds to the injection of pilocarpine and the graph is marked with an arrow.
  • anticonvulsant drugs is the standard treatment to prevent the onset of epileptic attacks of short or long duration (ES) in patients with chronic epilepsy 3 ⁇ 4h ⁇ , C., Nozadze, M., Heuchert, N., Rattka, M., and Loscher, W. (2010). Disease Modifying Effects of Phenobarbital and the NKCC1 Bumetanide Inhibitor in the Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy. Journal of Neuroscience. 30, 8602-8612).
  • BTDA is able to potentiate the antiepileptic effects of both Lidocaine and VPA in vitro.
  • the measurement is given by the decrease in the amplitude of the field potentials.
  • the main characteristic of these combinations is that it decreases the epileptiform activity of the slices of epileptic animals, in this case refractory epilepsy in vitro.
  • Extracellular recordings were made in hippocampal slices of control and epileptic animals in the presence of bumetanide (BTDA) in order to determine the possible anti-epileptic effects of said drug.
  • BTDA bumetanide
  • the change in the excitability of the excitation circuit of the Granular Cells of the Teeth Twist (CGGD) in the presence of BTDA was determined, the main result to demonstrate its effectiveness as an antiepileptic potential.
  • extracellular field potentials were recorded in the granular layer of the hippocampus (where the CGGD are located) and the amplitude of the population potential (PopSpike) that represents the sum of the action potentials was quantified.
  • BTDA managed significantly decrease the amplitude of the PopSpike in slices of epileptic animals compared to the control where the effects of BTDA are insignificant (Fig. 6A).
  • BTDA progressively decreases the amplitude of the saturating response in approximately 25 minutes decreasing the amplitude by 58.27%. This decrease in the amplitude of the PopSpike means that there is a smaller number of action potentials in the circuit, indicative of a lower neuronal excitability.
  • mice Male musculus mice, strain C57BL / 6 of between 17-22 grams were used, which were kept in controlled conditions of temperature, humidity and ad libitum of water and food (consumption of free demand), with a day / night cycle of 12 hours. In these mice, a temporal lobe epilepsy model was generated by the acute injection of intraperitoneal pilocarpine (i.p.). The mice had an average age of 5-6 weeks.
  • ACSF solution (Artificial Brain Spinal Fluid) was used at room temperature with the following salt composition, in Mm: 124 NaCl, 2.8 KCI, 1.25 NaH 2 PO 4 , 26.0 NaHCO 3 0.4 ascorbic acid, glucose 10.0, 2.0 MgS0 4, CaCl 2 2. The slices were submerged in this solution before and during the extracellular recording.
  • the dissection procedure was performed, using the following surgical material: tweezers, scissors, spatulas and Gillette blades, which was set at -20 e C, as well as the Leica Vibratomo camera model VT12008, the plates of Petri and a beaker of 20 ml_.
  • 200 ml_ of dissecting buffer was set at -20 e C for a period of 15 minutes and then kept on ice.
  • 400 ml_ of ACSF solution was placed at room temperature. Both solutions were oxygenated and the corresponding salts (3mM MgSO 4, lmM CaCl 2) were added to each solution.
  • the vibratory was calibrated and the chamber was assembled to obtain slices.
  • the brain was placed in another Petri dish and, using a gill, the cerebellum was cut and discarded, removing the corpus callosum. Then, we proceeded to obtain the slices by mounting the brain on the surface of the cutting block of the Vibratome.
  • This cutting block was mounted on the Vibratome chamber and the dissection damper was added, oxygenating it continuously throughout the procedure.
  • This cutting block was mounted on the Vibratome chamber and the dissection damper was added, oxygenating it continuously throughout the procedure. Under the dissecting cushion the Brain was cut in half (sagittal cut) to separate both hemispheres. Then, the cutting blade was lowered until completely covered by the solution.
  • CSF artificial CSF
  • the recording system consists of a one channel oscilloscope Model 3502C (Hung Chang), one AM Model 1800 channel amplifier; Systems, a 10X magnifying glass Model SZ 51 Olympus brand and a PC with a PCI acquisition card 62251 National Instruments. Data acquisition was performed with W in WCP software.
  • the data were analyzed using the Igor and Grasphpad programs.
  • the amplitude of the PopSpike was determined, which was obtained by calculating the average between the two positive maxima and the PopSpike (negative maximum).
  • the animals were divided into 6 experimental groups (of 10 each), which were pre-treated during a daily injection for 3 days with the corresponding drug combination: controls, Bumetanide (BTDA) (0.5 mg / kg), Valproic acid (VPA) (150 mg / kg), lidocaine (LDCNA) (10 mg / kg), BTDA + VPA (150 mg / kg) and BTDA + LDCNA (10 mg / kg). Later, for the study of arrival to the SE, the animals were injected with pilocarpine, at a high dose of 420 mg / kg, a dose that ensures severe seizures The control animals were injected only with the vehicle (physiological serum 0.9%).
  • BTDA Bumetanide
  • VPA Valproic acid
  • LDCNA lidocaine
  • BTDA + VPA 150 mg / kg
  • LDCNA BTDA + LDCNA
  • Example 7 Generation of a chronic epilepsy model in C57BL / 6 mice by acute or high dose administration of pilocarpine
  • Example 8 Determination of excitability changes of CGGD and presence of Bumetanide in combination with traditional antiepileptics Effect of Phenobarbital on epileptiform activity induced by pilocarpine
  • Bumetanide in this model of epilepsy does not show clear effects. It is necessary to test the combination of this drug in conjunction with conventional antiepileptics in order to assess whether the NKCC1 blocker is capable of potentiating the effect of antiepileptic drugs.
  • Example 8 Bumetanide decreases hippocampal excitability in slices of animals subjected to a chronic epilepsy model
  • Example 10 Bumetanide potentiates the antiepileptic effect of valproic acid in a murine model of chronic TLE
  • BTDA enhances the antiepileptic effect of VPA, showing greater capacity when administering the combination of drugs in slices of epileptic animals. Therefore, BTDA decreases the excitatory response in the CGGD at the hippocampal circuit level, represented by the population field potentials.
  • Example 11 Generation of Status Epilepticus in mice treated with bumetanide in combination with traditional antiepileptics

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Abstract

La presente invención se refiere al área de la salud humana o animal, en especial, al área cuyo objetivo es la preparación de medicamentos y el desarrollo de tratamientos para enfermedades humanas o animales, de diversos orígenes. Aún más especialmente, la presente invención se relaciona con el área abocada a la preparación de medicamentos y generación de tratamientos para enfermedades neurológicas, preferentemente, la epilepsia, aún más preferentemente, epilepsia refractaria. En particular, la invención se refiere al uso combinado de bumetanida con ácido valproico o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para restablecer la homeostasis de Cl- y con ello, permitir la preparación de un fármaco efectivo en el tratamiento de la epilepsia, y especialmente, en el tratamiento de la epilepsia refractaria.

Description

i
USO COMBINADO DE BUMETANIDA CON ÁCIDO VALPROICO O UNA DE SUS SALES FARMACÉUTICAMENTE ACEPTABLES, EN EL TRATAMIENTO DE EPILEPSIA
REFRACTARIA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al área de la salud humana o animal, en especial, al área cuyo objetivo es la preparación de medicamentos y el desarrollo de tratamientos para enfermedades humanas o animales, de diversos orígenes. Aún más especialmente, la presente invención se relaciona con el área abocada a la preparación de medicamentos y generación de tratamientos para enfermedades neurologías, preferentemente, la epilepsia, aún más preferentemente, epilepsia refractaria. En particular, la invención se refiere al uso combinado de bumetanida con ácido valprolco o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para restablecer la homeostasls de CI y con ello, permitir la preparación de un fármaco efectivo en el tratamiento de la epilepsia, y especialmente, en el tratamiento de la epilepsia refractaria. ARTE PREVIO
La epilepsia se define conceptualmente como un trastorno crónico del sistema nervioso caracterizado por la existencia de grupos de neuronas disparando a alta frecuencia y en alta sincronía (Engelborghs y cois., 2000, Pathophyslology of Epilepsy. Acta Neurología Bélgica, 100(4), 201 -203). Es reconocido que la epilepsia corresponde a unos de los trastornos neuroíglcos de mayor prevalencla en humanos, afectando aproximadamente al 1 % de la población mundial (Elger C E (2002) Epilepsy: Disease and Model to Study Human Braln Functín. Braln Pathology 12(2) 1993-1998; y Fisher R S y cois. (2005) Epileptlc selzures and epilepsy. Definition proposed by the
HOJAS DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) international league against epilepsy (ILAE) and the International bureau for epilepsy (IBE) Epilepsia 46(4) 470-472)). Esta condición que se caracteriza por una hiperexcitabilidad e hipersincronicidad neuronal, genera descargas eléctricas de alta frecuencia, lo que se evidencia a través de crisis espontáneas y recurrentes que pueden cursar con signos y síntomas motores, sensoriales, cognitivos, psíquicos e incluso autonómicos (Engelborghs y cois., 2000, Pathophysiology of epilepsy. Acta neurológica bélgica, 100(4), 201 -203); Fisher y cois. (2005) Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the international lengue against epilepsy (ILAE) and the international bureau for epilepsy (IBE). Epilepsia, 46(4), 470-472; McCornick & Contreras (2001 ) On the Cellular and network bases of epileptic seizures. Annual review of physiology, 63(1 ), 815-846). En la mayoría de los casos estos episodios tienen consecuencias neurobiológicas, cognitivas, psicológicas y sociales (Fisher y cois. (2005) Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the international lengue against epilepsy (ILAE) and the international bureau for epilepsy (IBE). Epilepsia, 46(4), 470-472).
De acuerdo con la Liga Internacional Contra la Epilepsia - ILAE (1981 ) - las epilepsias pueden clasificarse por una etiología en: idiopáticas o sin causa subyacente, criptogénicas o de etiología desconocida, y sintomáticas o secundarias a malformaciones, tumores, infecciones, etc. Por otro lado, dependiendo de su origen , se clasifican en parciales o focales, cuando su origen se encuentra en una región acotada de la corteza cerebral, denominada foco, o generalizadas, cuando su origen se localiza en toda o gran parte de la corteza cerebral y, por tanto, el lugar específico de inicio puede ser identificado. En la actualidad, se han reconocido más de 40 tipos de trastornos epilépticos (ILAE, 1989). Esta diversidad surge tanto de los numerosos mecanismos celulares y moleculares subyacentes así como de las características espaciales y temporales de las crisis (McCornich & Contreras (2001 ) On the Cellular and network bases of epileptic seizures. Annual review of physiology, 63(1 ), 815-846). Existen variados factores que pueden estar involucrados en el desarrollo de esta afección, algunos de ellos son: daño cerebral por lesiones prenatales o perinatales (asfixia o traumatismo durante el parto), desordenes cerebrovascu lares, desordenes cromosómicos, infecciones cerebrales como meningitis y encefalitis, síndromes neurocutáneos, traumatismo craneoencefálicos graves, tumores cerebrales, predisposición genética, entre otros (Shorvon y cois. (201 1 ) The causes of epilepsy: common and uncommon causes in adults and children. Cambridge University Press). Las características de los ataques son variables y dependen de la zona del cerebro en donde se genere el foco epiléptico, así como de su propagación. Además, los pacientes tienden a padecer mayores tasas de trastornos psicosociales, como ansiedad y depresión (OMS, 2016).
Este síndrome, según se mencionó antes, se caracteriza por una hiperexcitabilidad de estructuras límbico mesiales (Engel (2001 ) Mesial temporal lobe epilepsy: what have we learned? The Neuroscientist, 7(4), 340-352) tales como el hipocampo, la corteza entorrinal y la amígdala (Bartolomei F y cois., 2005). Las crisis epilépticas son la manifestación clínica de una alteración funcional cerebral transitoria caracterizada por una descarga de alta frecuencia y sincrónica de un grupo de neuronas. Por otro lado, la epileptogénesis es el fenómeno por el que una red neuronal normal, se transforma en hiperexcitable y es capaz de generar crisis epilépticas de forma espontánea (García y cois (2010) Modelos experimentales en epilepsia. Neurología 25(3) 181 -188). En la actualidad, gran parte de los fármacos antiepilépticos afectan la generación de las crisis, empeorándolas en algunos casos, es por esto que se requiere un mejor enfoque en el futuro para desarrollar fármacos anti-epileptogénicos más específicos (Clark & Wilson (1999) Mechanisms of epileptogenesis Advances in Neurology 79, 607).
Para el paciente epiléptico, la extensión de la enfermedad, no se limita simplemente a los riesgos físicos de las convulsiones y los riesgos del tratamiento, tiene un impacto mucho más amplio tal como el estigma social al que está unido esta condición, que con frecuencia desencadena exclusión social y aislamiento así como dificultades para acceder a servicios educativos y obtener empleo (De Boer y cois (2008) The global burden and stigma of epilepsy. Epilepsy & behavoir 12(4), 540-546. Junto con el trastorno neurológico subyacente a la enfermedad, la epilepsia presenta comorbilidad con otros trastornos cognitivos y psiquiátricos que a menudo limitan aún más la capacidad funcional del paciente, las perspectivas educativas, laborales y la participación social (Kesser y cois (2012) Accounting for comorbidity in assesing the bruden of epilepsy among us adults: results from the national comorbidity survey replication (nes-r). Molecular psychiatry 17(7), 748-758).
Entre las diversas formas de epilepsia, las crisis parciales que son definidas como aquellas en que las primeras manifestaciones clínicas y electrográficas indican la activación inicial de un sistema de neuronas limitado a una parte del hemisferio cerebral (Bancaud y cois (1981 ) Commission on classification and terminology of the internationa league against epilepsy proposal for revised clinical and electroencephalographic classification of epileptic seizures. Epilepsia, 2284), 489-501 ), constituyen aproximadamente el 50% de los casos (Thom y cois (2008) Neuropathology of epilepsy. Greenfield’s Neuropathology, Arnold London, pp. 833- 887), y su génesis está directamente relacionada con malformaciones del desarrollo cortical cerebral y con diversos tumores genéricamente denominados glioneuronales que actúan como foco epileptogénico, insensible muchas veces al tratamiento farmacológico adecuado (López & Pomposo-Gaztelu (2010) Patología quirúrgica de la epilepsia Rev Neurol, 50(10), 61 6-22).
La epilepsia de lóbulo temporal (ELT), constituye el síndrome epiléptico más común en adultos: es el responsable del 40% de los casos de epilepsia en general y del 60% de los casos de epilepsia de inicio focal (Engel, (1996) Introduction to temporal lobe epilepsy. Epilepsy research, 26(1 ), 141 -150). Este tipo de epilepsia es multifactorial y se asocia con lesiones como la esclerosis hipocampal, tumores, traumatismos, malformaciones vasculares (Vallamudi y cois 2003 Genetics of temporal lobe epilepsy Journal of Neurology Neurosurgery & Psychiatry 74(10) 1359-1361 ), plasticidad neuronal o excitabilidad celular anómala (Pastor & Sola (2008) Utility of foramen ovale electrodes in temporal lobe epilepsy surgery Res Adv Epilepsy 1 , 1 -9). De estas alteraciones fisiopatológicas, la más frecuente corresponde a la esclerosis del hipocampo que se distingue por pérdida neuronal, gliosis y disminución del volumen del hipocampo y áreas vecinas como la amígdala, el giro parahipocámpico y la corteza entorrinal (De Lanerolle y cois (1989) Hippocampal interneuron loss and plasticity in human temporal lobe epilepsy. Brian Research 49582), 387-395; y During y cois (1995) Hippocampal GABA transporter function in temporal-lobe epilepsy). Además, se establece cierta reorganización de las vías neuronales que favorecen la neoespinogénesis, morfogénesis, neosinaptogénesis y neurogénesis, con desarrollo aberrante de células y fibras, que contribuyen a la formación de un foco cuyo componente neuronal muestra un significativo aumento en la excitabilidad, es por ello que se considera que el hipocampo juega un papel importante en la epileptogénesis o mecanismo que desencadena las crisis (López-Hernándeza & Solisa (2012) Epilepsia del lóbulo temporal y las neuronas hipocampales de las áreas CA1 y CA3. Revista de la Facultad de Medicina de la UNAM 55(5), 16-25).
Recientemente, se ha publicado evidencia de la existencia de componentes genéticos como origen de algunos tipos de ELT (Cavalleri y cois (2005) Failure to replícate previously reported genetic association with sporadic temporal lobe epilepsy: where to from here? Brain 128(8), 1832-1840; Engel (2001 ) Mesial temporal lobe epilepsy: what have we learned? The Neuroscientist, 7(4), 340-352). Los tipos de ELT pueden clasificarse según el área afectada en: ELT mesial con esclerosis del hipocampo (ELT- HS*) que se caracteriza por la pérdida de neuronas del hipocampo en las zonas de CA1 , giro dentado e hilus (Lee y cois. (2007) Gene expression in temporal lobe epilepsy is consistent with increased release of glutamate by astrocytes. Molecular medicine 13(1 -2), 1 ); ELT mesial sin esclerosis del hipocampo (ELT HS**): ELT focal lateral caracterizada por trastornos del lenguaje, alucinaciones auditivas complejas y ELT familiar autosómica dominante, que está caracterizada por auras auditivas y crisis tonicoclónicas (Chabrol y cois (2007) Absence pfmutation in the Lgi1 receptor adam22 gene in autosomal dominant lateral temporal epilepsy Epilepsy research 76(1 ), 41 -48).
El ELT es el tipo de epilepsia que con mayor probabilidad se asocia a refractariedad (Blumcke, I., Thom, M., Aronica, E., Armstrong, D. D., Bartolomei, F., Bernasconi, A., Bernasconi, N., Bien, C. G., Cendes, F., Coras, R., et al. (2013). International consensus classification of hippocampal sclerosis in temporal lobe epilepsy: a task forcé report from the ilae commission on diagnostic methods. Epilepsia, 54 (7), 1315- 1329.). Esta condición se define como la ausencia de control de las crisis tras el tratamiento con dos fármacos antiepilépticos tolerados en el período de un año (ILAE, 1989). En pacientes refractarios, la resección quirúrgica del foco epiléptico cuando es posible representa una opción terapéutica aconsejable (Pastor y cois. (2005) Impacto de la experiencia sobre los resultados quirúrgicos en la epilepsia del lóbulo temporal. Rev. Neurol., 41 (12), 709-16); y Sola R y cois (2005) Epilepsia farmacoresistente del lóbulo temporal exploración con electrodo del foramen oval y resultados quirúrgicos).
La ELT también es el tipo de epilepsia que con mayor probabilidad se asocia al desarrollo de farmacoresistencia (Lóscher & Schmidt (2004) New horizons in the development of antiepileptic drugs: the search for new targets. Epilepsy research 60(2- 3) 77-159). Esta se define como la ausencia de control de las crisis tras el uso de dos fármacos antiepilépticos adecuados y bien tolerados en un período de un año (ILAE, 1989) y se considera un fenómeno multifactorial que se ha intentado explicar a través de distintas alteraciones tales como, alteraciones en los transportadores de multifármacos dependientes del adenin trifosfato, en concreto alteraciones en el transportador ABCB1 (Mosyagin y cois (2008) Association of ABCB1 genetic variants 3435c ¡t and 2677?t to ABCB1 MRNA and protein expression in brain tissue from refractory epilepsy patientes. Epilepsia 49(9) 1555-1561 ); alteraciones en los transportadores de glutamato (Avoli y cois (2005) y alteración en la neurotransmisión inhibitoria (Ge & Tian (2016) CLC-2 knockout attenuated experimental temporal lobe epilepsy in mice by tonic inhibition by GABA a receptors. Brain Research Bulletin, 121 , 209-214). Esta última es una de las teorías más ampliamente aceptadas para explicar el desarrollo de resistencia a fármacos. De este modo, la generación y propagación de las crisis pueden estar asociadas a alteraciones en la función de los receptores ionotrópicos de ácido gamma-aminobutirico (GABA) que corresponde al principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso central (Treiman (2001 ) GABAergic mechanisms in epilepsy Epilepsia 42(63) 8-12). Algunos estudios han indicado que los receptores GABAA son los que mayormente se encuentran vinculados al desarrollo de ELT refractaria (González (2015) Seizure-related regulation of GABA receptors in spontaneously epileptic rate. Neurobiology of Disease 77, 246-256).
Una de las principales estructuras vinculadas a la generación de crisis en ELT es el hipocampo, el cual es el principal foco donde se inician las crisis (Mirsky y cois (1960) A comparison of the psychological test performance of patientes with focal and nonfocal epilepsy Experimental Neurology 2819 75-89). Este corresponde a una estructura de forma bulbosa que se localiza en el interior de la parte medial o interna del lóbulo temporal bajo la superficie cortical, y se relaciona con la memoria, aprendizaje y distribución espacial. Esta estructura es una de varias regiones cerebrales relacionadas que en conjunto comprenden un sistema funcional llamado formación hipocampal. El hipocampo posee tres subdivisiones: CA3, CA2 y CA1. Las otras regiones de la formación hipocampal incluyen el giro dentado, subiculum, presubiculum, parasubiculum y corteza entorrinal (Anderson P (2007) The hipocampus bock. Oxford University Press).
Las células de las capas superficiales de la corteza entorrinal dan lugar a axones que se proyectan entre otros destinos hacia el giro dentado. Las proyecciones desde la corteza entorrinal hasta el giro dentado forman parte de la vía principal de entrada del hipocampo llamada vía perforante (Andersen P (2007) The Hippocampius Book. Oxford University Press). Las células granulares dan lugar a axones llamados fibras musgosas que se conectan con neuronas piramidales la región CA3 del hipocampo. Éstas a su vez, son la fuente de la entrada principal a la región CA3 del hipocampo (los axones colaterales de Schaffer). La región CA1 del hipocampo se proyecta unilateralmente al subículo, proporcionando su entrada excitatoria principal. Una vez que se llega a CA1 y el subículo, el patrón de conexiones intrínsecas comienza a ser algo más elaborado. CA1 , por ejemplo, se proyecta no sólo al subículo sino también a la corteza entorrinal. A través de estas conexiones en las capas superficiales de la corteza entorrinal y termina en sus capas profundas (Anderson (2007) The Hippocampus Book. Oxford University Press).
El hipocampo desempeña un papel único en el aprendizaje humano y en la memoria que es particularmente esencial para la consolidación de la nueva información en el procesamiento a largo plazo. Debido al papel especifico del hipocampo, trastornos en la memoria y aprendizaje son muy comunes entre las personas cuyos focos epilépticos se encuentran dentro del lóbulo temporal (Mirsky y cois (1960) A comparison of the psychological test performance of patients with focal and nonfocal epilepsy. Experimental Neurology 2(1 ) 75-89) como en adultos (Glowinski (1973) Cognitive déficits in temporal lobe epilepsy: An investigation of memory functioning The Journal of nervous and mental Disease 157(2) 129-137) han mostrado que los pacientes co- crisis parciales complejas que se originan en el lóbulo temporal presentan mayores déficit de memoria. Estudios anteriores han planteado que los pacientes epilépticos presentan una escasa codificación inicial de la información en el proceso de memorización de corto a largo plazo, lo que conduce al déficit observado en la memoria (Milner B (1975) Psychological aspects of focal epilepsy and its neurisurgical management Advances in neurology, 8, 299). Además, se ha establecido que la escasa eficacia memorística destaca tanto en el aprendizaje como en las fases de recuerdo (Jambaqué y cois (1993) Verbal and visual memory impairment in children with epilepsy. Neuropsychologia 31812) 1321 -1337). La pérdida de células en el hipocampo se ha observado con frecuencia en los pacientes epilépticos (Cascino y cois (1991 ) Magnetic resonance imaging-based volumen studies in temporal lobe epilepsy. Pathological correlations. Annals of neurology 30(1 ) 31 -36). Específicamente, la perdida de volumen del hipocampo se ha mostrado mediante resonancia magnética y se ha relacionado con la grave pérdida de neuronas en el mismo (Cavazos y cois (1991 ) Mossy fiber synaptic reorganization induced by kindling: time course of development, progression and permanence. The Journal of Neuroscience 1 1 (9) 2795-2803) pérdida particularmente notable en la banda de células piramidales - básicamente en el endfolium, en las células granulares y en la zona caudal de la estructura del hipocampo (Dam (1980) epilepsy and neuron loss in the hipocampus Epilepsy 21 (6) 617-629; Sass y cois (1990) Verbal memory impairment correlates with hippocampal piramidal cell density. Neurology 40(1 1 ) 1694- 1694); Saukkomen y cois (1994) Do seizures cause neuronal damage? A mri study in newly diagnosed and chronic epileps. Neuroreport 6(1 ) 219). No solo el hipocampo sino también la amígdala y el giro dentado son estructuras conocidas que sufren daños por la epilepsia del lóbulo temporal (Saukkonen y cois (1994) Do seizures cause neuronal damage? A mri study innewly diagnosed and chronic epileps. Neuroreport 6(1 ) 219). El daño del hipocampo es muy grave en pacientes con un historial de crisis recurrentes como se refleja al medir el volumen del hipocampo. Se ha observado pérdida de neuronas en el giro dentado y de neuronas piramidales en las regiones CA3 y CA1 del hipocampo (Saukkonen y cois (1994) Do seizures cause neuronal damage? A mri study innewly diagnosed and chronic epileps. Neuroreport 6(1 ) 219). Los estudios realizados con muchos animales también han demostrado que los ataques causan daño en el lóbulo temporal (Cavazos y cois (1991 ) Mossy fiber synaptic reorganization induced by kindling: time course of development, progression and permanence. The Journal of Neuroscience 1 1 (9) 2795- 2803).
La asociación de la formación hipocampal con la actividad epiléptica es fuerte y de larga data. Se remonta, tal vez, al comienzo de los estudios modernos sobre estructura y función del hipocampo (Schartzkroin (1994) role of the hippocampus in epilepsy Hippocampus 4(3) 239-242). Esta relación se puede establecer por tres razones principales. En primer lugar, se puede registrar a actividad convulsiva a partir del hipocampo (Bertram (1997) Functional anatomy of spontaneous seizures in a rat model of limbic epilepsy. Epilepsia 38(1 ) 95-105; Engel (1996) Introduction to temporal lobe epilepsy Epilepsy reserach 2681 ) 141 -150; Spencer & Spencer (1994) Entorhinal- hippocampal interactions inmedial temporal lobe epilepsy Epilepsia 35(4) 721 -727). En segundo lugar, la resección del hipocampo en pacientes con ELT que presentan esclerosis unilateral del lóbulo temporal mesial, elimina las crisis epilépticas en un 80- 90% (Falconer y cois (1964) etiology and pathogenesis of temporal lobe epilepsy Archives of neurology 10(3) 233-248; Ojemann (1987) Surgical therapy for medically intratable epilepsy Journal of Neurosurgery 66(4) 489-499). En tercer lugar, la neuropatología esterotípica de la ELT denominada esclerosis hipocámpica se encuentra en el hipocampo de los pacientes afectados que se replica en modelos animales de ELT (Buckmaster & Dudek (1997) Neuron loss, grande cell axón reorganizatrion, and functional chages in the dentate gyrus of epileptic kainate-treated rats. Journal of Comparative Neuorlogy 384(3) 385-404; French y cois (1993) Characteristics of medial temporal lobe epilepsy: I results of history and physical examination. Annals of Neurology 34(6) 774-780; Houser y cois (1990) Altered patterns of dynorphin immunoreactivity suggest mossy fiber reorganization in human hippocampal epilepsy The Journal of Neuroscience 10(1 ) 267-282).
En estudios anteriores, se ha planteado que el giro dentado es la principal estructura del hipocampo que contribuye a la generación de crisis en ELT (Heinemann y cois (1991 ) The dentate gyrus as a regulated gate for the propagation of epileptiform activity. Epilepsy research Supplement, 7, 273-280; Mello L y cois (1993) Circuit mechanism of seizures in the pilocarpine model of chronic epilepsy: cell loss and mossy fiber sprouting Epilepsia 34(6) 985-995; Lothman y cois (1991 ) the dentate gyrus as a control point for seizures in the hippocampus and beyond Epilepsy research Supplement, 7, 301 -313; Sutula y cois (1988) Sinaptic reorganization in the hippocampus induced by abnormal functional activity, Science 239(4844); 1 147-1 150). Una de las características de esta estructura es que muchas de sus conexiones son unidireccionales De este modo, la corteza entorrinal a través de un grupo de fibras denominadas vía perforante, es la principal vía de aferencia al giro dentado (Anderson (2007) The hippocampus Book. Oxford University Press).
Las células más numerosas del giro dentado son las células granulares que inervan a las neuronas musgosas y a las células piramidales de la región CA3. La transmisión neuronal a través de estos circuitos excitatorios simples y uniformes es controlada por un complejo sistema de interneuronas del giro dentado (Amaral (1978) A Golgi study of cell types in the hilar región of the hippocampus in the rat. Journal o comparative neurology 182(5), 851 -914). Estas interneuronas GABAérgicas inervan los diferentes dominios somadendriticos de las células principales (Han y cois (1993) A high degree of spatial selectivity in the axonal and dendritic domains of physiologically identified local-circuit neurons in the dentate gyms of the rat hippocampus. European Journal of Neuroscience 5(5) 395-410, Scharfman (1995) electrophysiological diversity of pyramoidal-shaped neurons at the granule cell layer/hilus border of the rat dentate gyrus recorded in vitro. Hippocampus 5(4) 287-305) y están influenciadas por diversos aferentes intrahipocampales, comisurales, entorinales y subcorticales (Sik y cois (1997) Interneurons in the hippocampal dentate gyrus. An in vivo intracelular study: European Journal of Neuroscience 9(3) 573-588).
En algunos trabajos se ha establecido que bajo condiciones normales la inhibición sináptica GABAérgica robusta en el giro dentado brinda a esta subregión hipocampal, la capacidad de funcionar como un filtro que disminuye la cantidad de información que llega al hipocampo, impidiendo que la actividad excitatoria excesiva se propague hacia el resto del circuito hipocampal por lo que en condiciones normales, las células granulares del giro dentado presentan baja excitabilidad (Cohén y cois (2003) Dentate granule cell GABAA receptors in epileptic hippocampus enhanced synaptic efficacy and altered pharmacology European Journal of Neuroscience 17(8) 1607-1616; Heinemann y cois (1991 ) The dentate gyrus as a regulated gate for the propagation of epileptiform activoity Epilepsy research Supplement, 7, 273-280; Sloviter (1994) The functional organization of the hippocampal dentate gyrus and its relevance to the pathogenesis of temporal lobe epilepsy Annals of neurology 35(6) 640-654). Además este tipo de células presentan un alto umbral para generar potenciales de acción y una pequeña amplitud de los potenciales postsinapticos excitatorios ((Halasy & Somogyi (1993) Subdivisions in the múltiple GABAergic innervation of granule cells in the dentate gyrus of the rat hippocampus European Journal of Neuroscience 5(5) 41 1 -429. Sin embargo, en otras investigaciones se ha visto que bajo condiciones epilépticas, se establecen sinapsis inhibitorias no funcionales mediadas por GABA, por lo que las células granulares quedan crónicamente excitables (Uscátegui & Izquierdo (2003) esclerosis mesial temporal Acta Neurol Colomb 19(4)). Por otro lado, también se ha visto la condición de ELT, en tejido de pacientes que padecen el trastorno, y que consisten en hipocampos adelgazados, atróficos, con su estructura macroscópica característica apenas reconocible. Además se aprecia una marcada perdida de neuronas piramidales de las zonas CA1 , CA3 y en la capa granular y muerte de interneuronas GABAérgicos en CA1 y el giro dentado. Además de perdida neuronal marcada, la esclerosis del hipocampo muestra dispersión de la capa de células granulares con desdoblamiento e irregularidades en su arquitectura (López & Pomposo-Gaztelu (2010) Patología quirúrgica de la epilepsia Rev Neurol, 50(10), 616-22).
El conocimiento de los mecanismo celulares y moleculares subyacentes a los distintos tipos de epilepsia aún es limitado. Actualmente, se desconocen los factores que transforman una parte del cerebro normal en epiléptico, es por ello que el estudio de este trastorno neurológico en modelos de animales resulta muy útil para el conocimiento de la fisiopatología de la epilepsia (De Cabo- de la vega y cois (2005) The neurochemistry of epilepsy, inhibitory neurotransmission and experimental models: new perspective. Revista de Neurología 42(39 159-168). En el sistema nervioso existe comunicación mediada por sinapsis químicas y eléctricas que controlan el balance de excitación inhibición del circuito por lo que una alteración en dicho balance podría tener consecuencias patológicas (Ben-Ari Y. (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience, 3(9), 728-739). En base a estudios anteriores, se ha observado que un desequilibrio en este balance ya sea por un exceso de excitación o bien por una disminución en la inhibición, puede generar una hiperexcitabilidad neuronal que conduzca a la aparición de crisis epilépticas generada en estructuras como el tálamo e hipocampo principalmente (García y cois (2010) Modelos experimentales en epilepsia. Neurología 25(3) 181 -188).
Como se mencionó antes, en el sistema nervioso es necesario mantener un complejo de equilibrio entre la excitación y la inhibición mediadas principalmente por la acción de dos neurotransmisores. Glutamato y GABA (ácido g-aminobutirico), respectivamente. Leves perturbaciones en este equilibrio, pueden conducir a alteraciones en el funcionamiento normal del circuito neuronal, generando patologías como la epilepsia (Ben-Ari Y. (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience, 3(9), 728-739). GABA es el principal neurotransmisor inhibitorio en el sistema nervioso central. Este ejerce una acción rápida al unirse a su receptor ionotropico (GABAa) provocando que el flujo de iones cloruro (CI ) ingrese hacia el interior de la célula, lo que genera una hiperpolarización del potencial de membrana. Uno de los mecanismos propuestos para explicar la refractariedad es la reducción de la inhibición GABAérgica (Sivakumaran S. & Maguire J (2016) Bumetanide reduces seizure progression and the development of pharmacoresistant status epilepticus. Epilepsia, 5782), 222-232). Esta reducción en la inhibición puede darse por diferentes motivos, tales como: disminución en la expresión de subunidades GABAA y muerte de interneuronas en el hipocampo. Además, tanto en tejido de pacientes como en modelos animales, se ha observado un aumento de la concentración intracelular de cloruro ([Cl-]i) que es responsable del efecto excitatorio de GABA (Goodkin & Kapur (2009) The impact of diazepam’s discovery on the treatment and understanding of status epilepticus. Epilepsia 50(9) 201 1 -2018). Dependiendo de la fuerza electromotriz de CI , su entrada o salida a través de los receptores (GABAa) generará una hiperpolarización o despolarización. La mantención de la [Cl-]i está regulada por el nivel de expresión de dos co -transportado res con efectos antagónicos: KCC2 (K+ CI Co Transporter 2) y NKCC1 (Na+ K+ CI Co transporter 1 ). El primero promueve la extrusión de iones desde la célula y el segundo el ingreso de éstos hacia la célula (Ben-Ari (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience, 389), 728-739; Yamada y cois (2004) CI update promoting depolarizing GABA action in inmature rat neocortical neutrones is mediated by NKCC1. The Journal of Physiology 557(3), 829- 841 ). Por otro lado, se ha visto que en modelos de epilepsia neonatal, la administración del bloqueador de NKCC1 , Bumetanida, aumenta el potencial de antiepilépticos como fenobarbital (Clearly y cois (2013) Bumetanide enhances phenobarbital efficacy in a rat model of hypoxic neonatal seizures. PloS one, 8(3), e57148). Sin embargo, no se ha enseñado ni sugerido el uso de Bumetanida en combinación con antiepilépticos convencionales para el tratamiento de epilepsia. La presente invención demuestra mediante un modelo de epilepsia crónica inducido a través de la administración de pilocarpina, que tal combinación es útil en el tratamiento de epilepsia resistente a fármacos. En el cerebro adulto, el equilibrio entre la excitación e inhibición está mediado principalmente por dos neurotransmisores, GABA, principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso central (SNC) y glutamato, principal neurotransmisor excitatorio, los que operan a través de receptores ionotrópicos, responsables de efectos rápidos y metabotrópicos, responsables de efectos lentos y mantenidos (Ben-Ari Y. (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature
Reviews Neuroscience, 3(9), 728-739). Así, una pérdida o disminución de la actividad GABAérgica produce una hiperexcitación de la neurotransmisión cerebral que puede dar lugar a la aparición de crisis epilépticas. Por otro lado, una mayor actividad GABAérgica produciría una depresión generalizada de la actividad cerebral que generaría somnolencia e incluso coma. De este modo, los fármacos que estimulan la neurotransmisión GABAérgica presentan efectos hipnóticos, ansiolíticos, anestésicos, antiespásticos y antiepilépticos (MacDonald & Kelly (1995) Antiepileptic drug mechanism of action. Epilepsia 36(s2), S2-S12). La biosíntesis de GABA procede de la descarboxilación de ácido L-glutámico en un proceso catalizado por la encima glutamato descarboxilasa (GAD). Las neuronas GABAérgicas contienen vesículas especializadas que poseen un transportador de GABA que es capaz de producir una concentración intravesicular de GABA entre 10 y 20 veces mayor que la que existe en el citoplasma de la neurona. Cuando la neurona se despolariza, estas vesículas se fusionan con la membrana celular en un proceso que implica la participación de diferentes proteínas específicas que se activan por un aumento de la concentración intracelular de Ca2+ debido a la apertura de diferentes tipos de canales de Ca2+ que son dependientes del voltaje. Este proceso genera la liberación del GABA vesicular al espacio sináptico permitiendo la activación receptores GABAérgicos tanto pre-sinápticos como post-sinápticos. Tras su liberación de los terminales sinápticos, GABA realiza su función inhibidora mediante la activación de receptores específicos. Hasta el momento se han descrito dos subtipos diferentes de receptores GABAérgicos denominados GABAA y GABAb. LOS receptores GABAA son de tipo ionotrópico, y por tanto, están asociados a un canal iónico mientras que los receptores GABAB son de tipo metabotrópico y están acoplados a proteínas G. Ambos tipos de receptores se encuentran ampliamente distribuidos en el SNC principalmente en la corteza cerebelosa, tálamo, hipocampo y corteza cerebral aunque el subtipo predominante es el receptor GABAA (Bradford (1995) Glutamate, GABA and epilepsy Progess in neurobiology 47(6) 477-511 ; Treiman (2001 ) GABAergic mechanisms in epilepsy Epilepsia 42(63) 8-12; Watanabe y cois (2002) GABA y GABA receptors in the control nervous system and other organs. International review of cytology 213, 1 - 47).
El receptor GABAA es un proteína heteropentamerica transmebranal que forma en su interior un canal para el paso de cloruro. Su activación por parte de GABA produce una apertura del canal a través de cual este ion negativo penetrará al interior de la célula, generando una hiperpolarización. Así, la activación del receptor GABAA media una rápida inhibición fásica de la transmisión sinóptica así como también una inhibición tónica mediante canales localizados en regiones extra-sinópticas (Watanabe y cois (2002) GABA y GABA receptors in the control nervous system and other organs. International review of cytology 213, 1 -47).
Los receptores GABAA están compuestos por cinco subunidades codificadas por 19 genes (a1 -6, b1 -3, g1 -3, d, e, p g w) (Bateson & Langer (1998) International Union of Pharmacology xv subtypes of-aminobutyricreceptors: classification on the basis of subunit structure and receptor function Pharmacological Reviews 50(2); Simón y cois (2004) Analysis of the set of the GABAs receptor genes in the human genome Journal of Biological Chemistry 279 (40), 41422-41435). El ensamblaje de las subunidades que forma un pentámero que produce una compleja heterogeneidad en la estructura de cada subtipo de receptor que le confiere un perfil farmacológico específico. Así, por ejemplo, el sitio de unión a GABA se encuentra entre las subunidades a y y. Además de las benzodiacepinas, en estos receptores existen sitios para otra serie de compuestos que se comportan como moduladores alostéricos del receptor. Entre estas sustancias se encuentran diversos anestésicos generales, barbitúricos, esteroides neuroactivos, etomidato, propofol y etanol. Los moduladores alostéricos positivos son capaces de potenciar la eficacia del GABA para abrir el canal de cloruro mientras que los negativos la disminuyen (MacDonald & Kelly (1995) Antiepileptic drug mechanism of action. Epilepsia 36(s2), S2-S12; Treiman (2001 ) GABAergic mechanisms in epilepsy Epilepsia 42(63) 8-12, Watanabe y cois (2002) GABA y GABA receptors in the control nervous system and other organs. International review of cytology 213, 1 -47).
Los compuestos que potencian la actividad de los receptores GABAA han demostrado inducir diversos efectos farmacológicos con indudables aplicaciones terapéuticas entre los que se incluyen efectos ansiolíticos, hipnóticos, sedantes, antiepilépticos, anestésicos, relajantes musculares y analgésicos. Es por ello que este receptor se ha convertido en un importante blanco farmacológicos para tratar trastornos relacionados con la neurotransmisión inhibitoria (Atack y cois (2006) Rat pharmacokinectics and pharmacodynamic of a sustained release formulation of the GABAA a5-selective compound 1-655, 708 Drug metabolism and dispossition 34(5) 887-893).
La inhibición mediada por el receptor GABAA depende del mantenimiento de una baja [Cl-]i. En tejido inmaduro, la [Cl-]i es elevada, EGABA es más positivo que el potencial de reposo y en consecuencia GABA es excitatorio (Ben-Ari Y. (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience, 3(9), 728-739; Dzhala & Staley (2008) Bumetanide enhances Phenobarbital Efficacy in a Neonatal Seizure Model. Annals of Neurology 63(2) 222-235); Hollrigel y cois (1998) Temporal patterns and depolarizing actions of spontaneous GABAA receptor activation in granule cells of the early postnatal dentate gyrus. Journal of Neurophysiology, 80(5) 2340-2351 ; Owens y cois (1996) Excitatory GABA responses in embryonic and neonatal cortical slices demonstrated by gramicidin perforated-patch recordings and calcium imaging The Journal of Neuroscience 16(20) 6414-6423). Las altas [Cl-]i en estadios tempranos de desarrollo hacen al cerebro particularmente vulnerable a crisis epilépticas (Fukuda (2005) Diuretic soothes seizures in newborn Nature Medicine 1 1 (1 1 ) 1 153-1 153). Sin embargo, en tejido maduro GABA se vuelve inhibitorio debido a la baja [Cl-]i lo que conduce a un EGABA más negativo que el potencial de reposo (Ben-Ari Y. (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience, 3(9), 728-739).
En general, los anti-epilépticos ejercen su efecto sobre los receptores GABAa, actuando como inhibidores de la recaptura o degradación de GABA, potenciando el efecto inhibitorio de este neurotransmisor (Lóscher y cois 2013 New avenues for antiepileptic drug discovery and development of new atiepileptic drugs. Seizure 20(5) 359-368). Uno de los mecanismos propuestos para explicar el desarrollo de farmacoresistencia son los cambios patológicos en la homoestasis del Cl , lo que produce a una disfunción en la respuesta GABAérgica, al disminuir el efecto inhibitorio de este neurotransmisor. Estos aumentos en [Cl-]i incluso pueden llegar a hacer que GABA tenga un efecto excitatorio, en donde al liberar pulsos de GABA en tejido epiléptico aumenta la probabilidad de generar potenciales de acción (Pathak y cois (2007) Disrupted dentate granule cell chloride regulation enhances synpatic excitability during development of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience 27(51 ) 14012- 14022). Este cambio en la polaridad de GABA está asociado a la progresión de crisis y desarrollo de farmacoresistencia de adultos (Sivakumaran & Maguire (2016) Bumetanide reduces seizure progression and the development of pharmacoresistant status epilepticus Epilepsia 57(2) 222-232). La homeostasis neuronal de cloruro es crítica para una amplia gama de procesos neurofisiológicos desde asegurar la respuesta eléctrica adecuada a la señalización GABAérgica hasta la regulación del volumen celular en respuesta a los cambios osmolares extracelulares (Kable & Staley (2008) The bumetanide-sensitive Na-K-2CI cotransporter NKCC1 as a potential target of a novel mechanism-based treatment strategy for neonatal seizures). El control estricto de la [Cl-]i está modulado por la familia de genes SLC12 y co-transportadores del catión cloruro (CCC8) incluyendo los co-transportadores NKCC y KCC que dirigen el flujo de cloruro hacia adentro y hacia afuera, respectivamente. Estos CCC8 son proteínas intrínsecas de membrana que transportan cloruro a través de las membranas plasmáticas usando los gradientes de transmembrana de Na+ y K+ que son enérgicamente favorables NKCC1 y NKCC2 cargan el cloruro en las células, usando la fuerza electromotriz de Na+ para elevar la [Cl-]i mientras que KCC1 , KCC2, KCC3 y KCC4 usan la fuerza electromotiriz de K+. NKCC1 se expresa en todos los tipos celulares mientras NKCC2 se encuentra principalmente en el riñón. KCC2 se expresa principalmente en neuronas maduras (Maa y cois (201 1 ) Diuretics and epilepsy: Wil the past and present meet) Epilepsia 52(9) 1559-1569). En neuronas, la [Cl-]i es mantenida principalmente por la actividad de los co-transportadores: KCC2 (K+ Cl+ Co.transporter 2) y NKCC1 (Na+ K+ Cl+ Co- transporter 1 ). En neuronas maduras la [Cl-]i es baja como resultado de un reducido nivel de expresión del co -transportador KCC2 cuya función es extrudir el CI hacia el exterior de la célula a favor del gradiente electroquímico de K+ manteniendo el potencial de equilibrio de cloruro en valores negativos respecto al potencial de membrana. Este bajo nivel de [Cl-]i es responsable de que el flujo de cloruro a través de los receptores GABAA generen un hiperpolarización (Ben-Ari Y. (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience, 3(9), 728-739; Fukuda (2005) Diuretic soothes seizures in newborn Nature Medicine 1 1 (1 1 ) 1 153-1 153; y Yamada y cois (2004) Cl+ uptake promoting depolarizing GABA action in immature rat neocortical neutrons is mediated by NKCC1. The Journal of Physiology 557(3) 829-841 ).
Debido a que NKCC1 es una molécula clave en la determinación de la función excitatoria de GABA (Ben-Ari Y. (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience, 3(9), 728-739; Payne y cois (2003) Cation-chloride co-transporters in neuronal communication development and trauma Trends in neurosciences 26(4) 199-206; Yamada y cois (2004) Cl+ uptake promoting depolarizing GABA action in immature rat neocortical neutrons is mediated by NKCC1 . The Journal of Physiology 557(3) 829-841 ), la inhibición de la actividad de este co-transportador reduciría la [Cl-]i lo que a su vez podría disminuir la excitación mediada por el receptor GABAA o restablecer la respuesta inhibitoria GABAergica (Fukuda (2005) Diuretic soothes seizures in newborn Nature Medicine 1 1 (1 1 ) 1 153-1 153). A pesar de la introducción de fármacos antiepilépticos de tercera generación alrededor de un 30% de los pacientes continua siendo refractario al tratamiento médico (Mohanraj & Brodie (2006) Diagnosing refractory epilpesy: response to sequential treatment schedules European Journal of Neurology 13(3) 277-282; Lóscher y cois 2013 New avenues for antiepileptic drug discovery and development of new atiepileptic drugs. Seizure 20(5) 359-368; Kwan & Brodie (2000) Early Identification of refractory epilepsy New England Journal of Medicine 342(5) 314-319), lo que puede ser atribuido a la anomalía que existe en la respuesta GABAérgica a causa de la cual los antiepilépticos convencionales no tienen el efecto deseado en estos casos, pues la mayoría de ellos actúan potenciando la actividad del receptor GABAA en respuesta al neurotransmisor (Sivakumaran & Maguire (2016) Bumetanide reduces seizure progression and the development of pharmacoresistant status epilepticus Epilepsia 57(2) 222-232). Por otro lado, el control de las crisis epilépticas a través de una resección quirúrgica es efectiva sólo en un 50% de los casos de esclerosis temporal mesial y solo puede efectuarse en una población de pacientes con un foco epiléptico muy acotado. (Téllez-Zenteno y cois (2005) Long Term seizure outcomes following epilepsy surgery: a systematic review and meta-analysis Brain 128(5) 1 188-1 198; y Schmidt & Stavern (2009) Long-term seizure outcome of surgery versus no surgery for drug-resistant partical epilepsy: A review of controlled studies. Epilepsia 50(6) 1301 - 1309). Además, se ha visto que estas cirugías son de gran riesgo, generando en los pacientes una serie de efectos secundarios. Estos datos revelan una imperante necesidad del desarrollo de nuevos fármacos antiepilépticos junto con una mejor comprensión de los mecanismos fisiopatológicos de esta enfermedad (Maa y cois Diuretics and epilepsy Will the past and present meet? Epilepsy 52(9) 1559-1569).
Como se mencionó anteriormente, tanto en estadios tempranos de desarrollo como en algunas situaciones de epilepsia resistente a fármacos existe una alteración en la homeostasis de Cl , vinculada a una sobreexpresión del co -transportador NKCC1 por lo que el bloqueo de éste puede restablecer las concentraciones normales de [Cl-]i (Fukuda (2005) Diuretic soothes seizures in newborn Nature Medicine 1 1 (1 1 ) 1 153- 1 153). Bumetanida, un diurético convencional, es un inhibidor selectivo de NKCC1 (Eftekhari y cois 2013 Bumetanide reduces seizure frequency in patients with temporal lobe epilepsy. Epilepsia 54(1 ) e9-e12), por ello podría tener un potencial efecto anti epiléptico en patologías como epilepsia neonatal y refractaria (Ben-Ari Y. (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience, 3(9), 728-739; Tóller y cois (2015) Bumetanide is not capable of terminating status epilepticus but enhances phenobarbital efficacy in different rat model European Journal of Pharmacology, 746, 78-88); y Yamada y cois (2004) Cl+ uptake promoting depolarizing GABA action in immature rat neocortical neutrons is mediated by NKCC1. The Journal of Physiology 557(3) 829-841 ).
Asimismo, el descubrimiento y desarrollo de una droga antiepiléptica (AED) alternativa depende del uso preclínico de modelos animales para establecer su eficacia y seguridad antes de los primeros ensayos en humanos (White y cois (2006) Therapeutic assays for the identification and characterization of antiepileptic and antiepileptpgenic drugs In Elsevier Inc) en el descubrimiento y desarrollo de drogas antiepilépticas (AEDs) alternativas, los modelos animales de epilepsia sirven a una variedad de propósitos: (i) identificar la eficacia anti -epiléptica de un nuevo compuesto; (ii) evaluar los posibles efectos específicos del compuestos frente a diferentes tipos de crisis epilépticas; (iii) caracterizar la eficacia preclínica de nuevos compuestos durante su administración crónica; (iv) estimar las concentraciones plasmáticas efectivas en los primeros ensayos clínicos (v) desarrollo de AEDs que pueden prevenir o modificar el desarrollo de epilepsia (Lóscher & Schmidt (2004) New horizons in the development of antiepileptic drugs: the search for new targets. Epilepsy research 60(2-3) 77-159). Hoy en día se considera que un modelo animal válido es aquel que es capaz de reproducir total o parcialmente una serie de características clínicas que luego se puedan trasladar al humano o a otras especies animales. Así, existen modelos de epilepsia aguda y crónica. Los de epilepsia aguda se inducen por la administración de fármacos convulsivos o por estimulación eléctrica. Por otro lado, los modelos de epilepsia crónica requieren de mayor cuidado, trabajo y coste económico pero se ha comprobado que replican mejor la fisiopatología de la epilepsia en humanos. Ambos tipos de modelos reproducen crisis parciales y generalizadas, sin embargo, dado que la epilepsia se caracteriza por la aparición de crisis espontaneas a lo largo del tiempo solo los modelos que replican dicha condición, se consideran modelos de epilepsia validos (García y cois (2010) Modelos experimentales en epilepsia Neurología 25(3) 181 -188)
Dentro de los modelos que mejor reproducen el estado de ELT crónica, se encuentran los agentes químicos (administración de ácido kainico o pilocarpina) que corresponden a modelos en los que se genera Status Epilepticus (SE) y posteriores crisis espontaneas (Curia y cois (2008). El SE es definido clínicamente como una crisis epiléptica única o repetida que se repite por más de 5 minutos que puede producir daño neurológico con una tasa de mortalidad asociada del 20% aproximadamente (Lowenstein (199) Status epilepticus: an overview of the clinical problema. Epilepsia 40(s1 ), s3-s8)). En la presente invención se emplea un modelo de ELT crónica en ratones C547BL/6 inducido por policarpina debido a que se ha visto que emula de mejor forma el trastorno en humanos. Algunas características importantes del modelo de policarpina son: (I) inducir rápidamente el SE; (ii) la presencia de un periodo latente, seguido por la aparición de crisis espontaneas recurrentes (fase crónica) (Cavalheiro y cois (1991 ) Long-term effects of policarpine in rats: Stuctural damage of the brain triggers kindling and spontaneois i recurrent seizures Epilepsia 32(6) 778-782; Leite y cois (1990) Spontaneous recurrent aeixures in ratea n exprimental model of partial epilepsy Neuroscience & Biobehavioral Reviews 14(4) 51 1 -517); (iii) ocurrencia de lesiones generalizas en las mismas áreas cerebrales afectadas en los pacientes con ELT crónica, las cuales están asociadas a una reorganización de las redes neuronales en regiones hipocampales y parahicocampales (por ejemplo brotes de fibras musgosas, perdida de interneuronas y proliferación de células granulares del grio dentado) (Weiser (2004) ILAE commisision report. Mesial temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis Epilepsia 45(6) 695-714); (iv) el hecho de que las crisis epilépticas no sean controladas por drogas antiepilépticas (AEDs) en pacientes así como en roedores sometidos al modelo de pilocarpina (Chakir y cois (2006) Drug resistance and hippocampal damage after delayed treatment of pilocarpine-induced epilepsy in the rat. Brain Research Bulletioin 71 (1 ) 127-138; Gien y cois (2002) Effects of the novel antiepileptic drug levetiractem on spontaneous recurrent seizures in the rat pilocarpine model of temporal lobe epilepsy Epilepsia 43(4) 350-357). La capacidad de la pilocarpina para inducir SE, se debe a la activación del subtipo de receptor muscarínico M1 ya que se ha visto que los ratones knockout de este receptor no desarrollan crisis epilépticas en respuesta a pilocarpina (Hamilton y cois (1997) Disruption of the M1 receptorgene ablates muscarinic recpetor-dependent m recurrent regulation and seizure activity in mice. Proceedings of the National Academy of Science 94(24) 1331 1 -13316). La evidencia sustancial apoya la sugerencia de que después de la iniciación por los receptores M1 , las convulsiones son mantenidas por la activación del receptor NMDA (Nagao y cois (1996) Epileptiform activity induced by pilocaprine in the rat hippocampal-entorhinal slice preparation; neuroscience 72(2) 399-408; Smolders y cois (1997) NMDA receptor-mediated pilocarpine-induced seizure characterization in freely moving rats by mrodialysis. British Journal of Pahrmacology 121 (6) 1 171 -1 179).
Por otra parte y retomando lo revelado en el arte previo respecto a tratamientos para la epilepsia, y específicamente en relación a documentos de patente, es posible mencionar a US2015239832 que enseña análogos y profármacos de diuréticos seleccionados de bumetanida, furosemida y piretanida, composiciones farmacéuticas que los comprenden, y que son útiles en el tratamiento y/o profilaxis de condiciones que involucran la familia de co-transportadores NKCC1 y NKCC2 o KCC1 , KCC2, KCC3 y KCC4 o receptores GABAA tales como ansiedad, epilepsia, migraña, desordenes del sueño, obesidad, desórdenes alimenticios, autismo, entre otros.
TW201444788 enseña un fármaco que se convierte a bumetanida en el cerebro, en el lugar primario de la epilepsia, es un derivado de sulfamoilbenceno de formula general (1 ) o una sal farmacéutica del mismo.
US2015080350 enseña bumetanida y análogo, composiciones que los comprende, y su uso en el tratamiento y/o profilaxis de condiciones que involucran el co- transportador Na+K+CI o al receptor GABAA tales como desordenes adictivos, enfermedad de Alzheimer, desordenes de ansiedad, autismo, epilepsia, entre otros.
CA2806664 enseña acilsulfonamidas que incluyen derivados de bumetanida, composiciones que las comprenden, y su uso en el tratamiento y/o profilaxis de condiciones que involucran el co-transportador Na+K+CI o al receptor GABAA desordenes adictivos, enfermedad de Alzheimer, desordenes de ansiedad, autismo, epilepsia, entre otros.
US92061 1 1 enseña compuestos que incluyen una sal de ácido valproico, composiciones que los comprenden, y que pueden ser formuladas para administración oral, bucal, rectal, tópica, transdérmica, parenteral, jarabe o inyección su uso para el tratamiento o prevención de enfermedades neurológicas tales como epilepsia, migraña, esquizofrenia, enfermedad bipolar, entre otras. WO2016067297 enseña compuestos que incluyen una sal de ácido valproico y sus polimorfos, composiciones que los comprenden, y que pueden ser formuladas para administración oral, bucal, rectal, tópica, transdérmica, parenteral, jarabe o inyección su uso para el tratamiento o prevención de enfermedades neurológicas tales como epilepsia, migraña, esquizofrenia, enfermedad bipolar, entre otras.
WO201 1 126733 enseña la co-administración de inhibidores de NKCC1 tales como bumetanida, furesomida, trosemida y ácido etacrinico e inhibidores GABA transaminasa tales como vigabatrin, ácido aminooxiacético, valproato y estructuras análogas que atenúan la toxicidad retinal y el edema intramielinico; útil para tratar espasmos infantiles o convulsiones refractarias en adultos. Siendo la co administración preferida bumetanida - vigabatrin. También enseña la forma de dosis unitaria o un pack que comprende dicha combinación de compuestos. Se menciona como una combinación de formulación efectiva en co-formulacion de valproato y bumetanida, ver ejemplo 4. No se refiere en particular a epilepsia refractaria de lóbulo temporal.
Entonces la creación de un nuevo fármaco anti-epiléptico que apunte a pacientes refractarios significa un gran aporte al estado actual del tratamiento de la enfermedad. Por ello, el objetivo del presente invento es el uso combinado de Bumetanida con ácido valproico o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para restablecer la homeostasis de CI , y con ello, el efecto inhibitorio de los fármacos antiepilépticos, en un modelo de epilepsia crónica. De esta forma, la presente invención propone una forma alternativa a las formas ya conocidas para el tratamiento de la epilepsia, y especialmente, de la epilepsia refractaria. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención se refiere al área de la salud humana o animal, en especial, al área cuyo objetivo es la preparación de medicamentos y el desarrollo de tratamientos para enfermedades humanas o animales, de diversos orígenes. Aún más especialmente, la presente invención se relaciona con el área abocada a la preparación de medicamentos y generación de tratamientos de enfermedades neurológicas, preferentemente, la epilepsia, aun preferentemente, epilepsia refractaria. En particular, la invención se refiere al uso combinado de bumetanida con ácido valproico o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para restablecer la homeostasis de CI y con ello, permitir la preparación de un fármaco efectivo en el tratamiento de la epilepsia, y especialmente, en el tratamiento de la epilepsia refractaria.
La epilepsia corresponde a un trastorno neurológico caracterizado por una hiperexcitabilidad e hipersincronicidad neuronal que genera descargas eléctricas de alta frecuencia, evidenciadas a través de crisis espontaneas (Engelborghs y cois., 2000, Pathophysiology of Epilepsy. Acta Neurológica Bélgica, 100(4), 201 -203). A pesar de la introducción de fármacos antiepilépticos de tercera generación, alrededor de un 30% de los pacientes continua siendo refractario al tratamiento médico (Mohanraj & Brodie (2006) Diagnosing refractory epilpesy: response to sequential treatment schedules European Journal of Neurology 13(3) 277-282; Lóscher y cois 2013 New avenues for antiepileptic drug discovery and development of new atiepileptic drugs. Seizure 20(5) 359-368; Kwan & Brodie (2000) Early Identification of refractory epilepsy New England Journal of Medicine 342(5) 314-319). La mayoría de los fármacos antiepilépticos actúan aumentando el efecto inhibitorio de GABA por diferentes mecanismos como por ejemplo, disminución en la degradación de GABA y aumento en la síntesis de este neurotransmisor (Fukuda (2005) Diuretic soothes seizures in newborn Nature Medicine 1 1 (1 1 ) 1 153-1 153). Uno de los mecanismos propuestos para explicar el desarrollo de epilepsia del lóbulo temporal resistente a fármacos está relacionado con cambios patológicos en la homeostasis de CI debido a una alteración en la expresión de los co-transportadores de este ión (Ben-Ari Y. (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience, 3(9), 728-739; Yamada y cois (2004) CI update promoting depolarizing GABA action in inmature rat neocortical neutrones is mediated by NKCC1 . The Journal of Physiology 557(3), 829-841 ), generando una respuesta GABAérgica despolarizante, lo que esta posiblemente asociado a la progresión de crisis y desarrollo de farmacoresistencia en adultos (Sivakumaran S. & Maguire J (2016) Bumetanide reduces seizure progression and the development of pharmacoresistant status epilepticus. Epilepsia, 5782), 222-232).
En la presente invención se logró reproducir de la mejor manera, las características anatómicas y fisiológicas de la patología humana, tales como la degeneración neuronal del hipocampo, reorganización de las redes neuronales en regiones hipocampales y parahipocampales y crisis espontaneas recurrentes (Lévesque y cois (2016) Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration, Journal of Neuroscience Methods 260, 45-52). Para ello, se usó el modelo de policarpina ya que según la literatura es el modelo que mejor cumple estos requerimientos, ver Curis y cois (2008) The policarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal if Neuroscience Methods 172 (2). 143-157; Lóscher y cois (201 1 ) Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure 20(5) 359-368. El modelo mostró ser funcional bajo las condiciones experimentales. Los resultados mostraron que 100% de los animales inyectados con este agente epileptogenico alcanzaron el SE dentro de los 40 minutos post-inyección con una sobrevivencia del 60% de la población a los 14 días post inyección. En resumen, bajo las condiciones experimentales el modelo de pilocarpina se comporta similar a lo reportado en la literatura (Epps, S., and Weinshenker, D. (2013). Rhythm and blues: Animal models of epilepsy and depression comorbidity. Biochemical Pharmacology. 85, 135-146; Hamilton, S., Loose, M., Qi, M., Levey, A., Hille, B., McKnight, S., Idzerda, R., and Nathanson, M. (1997). Disruption of the m1 receptor gene ablates muscarinic receptor-dependent M current regulation and seizure activity in mice. Neurobiology. 94, 1331 1 -13316; Loscher, W. (201 1 ). Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, 359-368) ya que el 100% de los animales alcanza el SE y el 60% de ellos generaron crisis espontaneas que son características de la condición de epilepsia crónica.
Una vez que el modelo de pilocarpina fue privado, se procedió a realizar registros ex vivo de potenciales de campo, con el fin de evaluar la variación en la actividad neuronal espontanea a través de la comparación de rebanadas provenientes de ratones control y epilépticos, sometidos a la administración de diferentes drogas. Para ello, se registró en el hipocampo, específicamente en la capa granular del giro dentado. Cabe notar que la mayoría de los trabajos relacionados con ELT (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 24686305,
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26621 124, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/23991095, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24270080) se han estudiado en las regiones CA1 y CA3 del hipocampo dado que como lo señalan algunos autores, estas zonas son particularmente sensibles a la degeneración neuronal provocada por los diferentes modelos murinos de ELT (Sater & Nadler (1988) On the relation between seizures and brain lesions after intracerebroventricular kainic acid Neuroscience letters 84(1 ) 73-78). Además, este tipo de lesiones son particularmente similares a lo encontrado en humanos con epilepsia del lóbulo temporal (Turski y cois (1983) Limbic seizures produced by pilocarpina in rats: behaviooural electroencephalographic and neuropathological study. Behavioural Brain Research 9(3) 315-335). Sin embargo, se escogió la capa granular del giro dentado debido a que esta zona corresponde a la puerta de entrada de información al circuito hipocampal, por lo que, si aumenta la información transmitida a la capa granular, aumenta la actividad de todo el circuito hipocampal (Haley & Somogyi (1993) Subdivisión in the múltiple GABAergic innervation of granule cells in the dentate gyrus of the rat hyppocampus European Journal of Neuroscience 5(59 41 1 -412). Por otro lado, las células granulares del giro dentado bajo condiciones normales presentan una baja excitabilidad, sin embargo, se ha visto que bajo condiciones epilépticas se vuelven altamente excitables (Cohén y cois (2003) Dentate granule cell GABAA receptors in epileptic hippocampus enhanced synaptic efficacy and altered pharmacology European Journal of Neuroscience 17(8) 1607-1616; Heinemann y cois (1991 ) The dentate gyrus as a regulated gate for the propagation of epileptiform activity. Epilepsy Research Supplement, 7, 273-280; y Sloviter y cois (1994) The functional organization of the hippocampal dentate gyrus and its relevance to the pathogenesis of temporal lobe epilepsy. Annals of Neurology 35(6) 640-654) lo que las convierte en un importante blanco de estudio para investigar nuevas estrategias farmacológicas relacionadas con el trastorno epiléptico. Primero, se evaluó el efecto de un antiepiléptico convencional, Fenobarbital, sobre la excitabilidad hipocampal, observando que en la mayoría de los experimentos individuales tratados con el barbitúrico (Figura 4D) existe una tendencia a la mantención o aumento en la frecuencia de disparo. Por ello, se podría especular que este modelo, bajo las condiciones experimentales, es resistente al antiepiléptico. Esto último ha sido reportado en trabajos anteriores en donde se muestra que Fenobarbital presenta un bajo o nulo efecto antiepiléptico en modelos de ELT crónica, lo que sugiere que algunos modelos animales de epilepsia son resistentes a la acción del barbitúrico (Klein y cois (2015) Inter-individual variation in the effect of antiepileptic drugs in the intrahippocampal kainate model of mesial temporal lobe epilepsy in mice Neuropharmacology 90, 53-62; y Dzhala y cois (2003) Excitatory actions of endogenously released GABA contribute to initiation of ictal epileptiform activity in the developing hippocampus. The Journal of Neuroscience 23(5), 1840-1846) Al evaluar el efecto de bumetanida sobre la actividad neuronal espontánea, se observó una disminución en la frecuencia de disparo levemente mayor en condiciones de epilepsia, sin embargo, no hay diferencias significativas entre ambas condiciones. Además, al contrario de lo esperado, hubo efecto de la droga en los animales control no obstante su baja expresión NKCC1 . Cabe mencionar que existen estudios que han demostrado que GABA puede actuar de forma despolarizante en el procesamiento de señal de las células granulares del giro dentado, facilitando la generación de potenciales de acción (Chiang y cois, (2012) GABA is depolarizing in hippocampal dentate granule cells of the adolescent and adult rats Journal of Neuroscience 32(1 ) 62-67, Fukuda, A. (2005). Diuretic soothes seizures in newborns. Nature medicine. 1 1 , 1 153-154, Pathak, H., Weissinger, F., Terunuma, M., Carlson, G., Hsu, F.C., Moss, S., and Coulter, D. (2007). Disrupted Dentate Granule Cell Chloride Regulation Enhances Synaptic Excitability during Development of Temporal Lobe Epilepsy. The Journal of Neuroscience. 51 , 14012-14022, Szabadics, J., Varga, C.,Molná, C., Oláh, S., Barzo, P., and Tamas, G. (2006). Excitatory Effect of GABAergic Axo-Axonic Cells in Cortical Microcircuits. Science.31 1-233).
Al comparar los efectos de la combinación de drogas con su aplicación por separado, se observó que en el grupo con ELT, existen más células que muestran un mayor efecto en la disminución de la frecuencia (Figura 5D). Estos resultados son consistentes con estudios (Ben-Ari (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience, 389), 728-739; Yamada y cois (2004) Cl update promoting depolarizing GABA action in inmature rat neocortical neutrones is mediated by NKCC1. The Journal of Physiology 557(3), 829- 841 ) que han señalado la importancia de restablecer la homeostasis intracelular de Cl para lograr el efecto antiepiléptico de drogas que actúan como agonistas GABAérgicos, en casos de epilepsia resistente a fármacos. En este grupo de animales (Figura 5D) se detectaron dos poblaciones, una población en la que existía una baja disminución en la frecuencia de disparo y otra en la que se observó una notoria reducción en el mismo parámetro. Estos resultados muestran la gran variabilidad que puede existir dentro de un modelo experimental, al observar una población sensible y otra resistente a un mismo fármaco (Klein y cois (2015) Inter-individual variation in the effect of antiepileptic drugs in the intrahippocamapal kainate model of mesial temporal lobe epilepsy in mice. Neuropharmacology 90, 53-62).
Debido a que el efecto de Bumetanida no fue claro, se realizaron registros de potenciales de campo evocado, en donde se puede evaluar la respuesta de un mayor número de células. En estos registros se observó que Bumetanida por sí sola redujo considerablemente los efectos excitatorios en rebanadas provenientes de animales tratados, ascendiendo a un 58,27% de disminución en la respuesta de campo, hecho que no fue observado en los controles, los que mantuvieron un curso temporal promedio de la respuesta constante (Figuras 6A-6E). Posteriormente, se procedió a determinar el efecto de dos antiepilépticos convencionales tanto de forma individual como en combinación con bumetanida. Al analizar el efecto de lidocaína se observó que, si bien reduce la excitabilidad en condiciones control y epilépticos, su efecto es mucho mayor en epilepsia cuando se encuentra en presencia del diurético, arrojando un 81 ,82% de reducción en la respuesta de campo, lo que también fue observado al determinar el efecto de Valproato que arrojó un 76.51% de disminución. Estos resultados muestran que Bumetanida efectivamente permite una potenciación del efecto antiepiléptico para este modelo de epilepsia crónica. Ahora bien, tal como pasó en los registros de respuesta espontánea, en este tipo de registros también se puede observar que los antiepilépticos por si solos muestran disminución en la excitabilidad, que no es lo esperado en epilepsia resistente a fármacos. Sin embargo, como se mencionó anteriormente. Se ha visto que en los CGGD, la respuesta GABAérgica puede ser despolarizante (Chiang y cois (2012) GABA is depolarizing in hipocampal dentate granule cells of the adolescent and adult rats. Journal of Neuroscience 32(1 ) 62-67).
El análisis de los registros electrofisiológicos muestra que existe una gran diferencia en el efecto de Bumetanida entre los registros de actividad espontánea y los de respuesta de evocado. Esto puede ser atribuido a que el empleo de ACSF alto en K+ podría conducir a una saturación en la respuesta, generando el mismo patrón de descarga en rebanadas control y epilépticos. Por lo que no permitió observar diferencias entre ambas condiciones. Por otro lado, este tipo de registros permitió evaluar la respuesta de un número limitado de células por lo que su resultado no necesariamente es representativo de la población, a diferencia de los registros de campo evocado, que permitieron evaluar la respuesta de una población de células.
De esta forma se mostró que ocurría en animales sometidos a un modelo de epilepsia a nivel de circuito, y para establecer conclusiones decidoras, adicionalmente se realizaron pruebas in vivo, con el objetivo de evaluar el efecto de las drogas a nivel sistémico. De esta forma, se observó que Bumetanida fue capaz de retardar la llegada al SE, y aumentar el tiempo de vida de los animales. Por otro lado, la combinación de fármacos que mostró mejores resultados a nivel sistémico fue BTA + VPA ya que los animales pre-tratados con esta combinación de drogas no alcanzó el SE, mostrando supervivencia de 100%. Finalmente, el pre-tratamiento de BTDA + LDCNA resultó negativo para los estudios in vivo ya que los animales alcanzaron el SE e un corto período de tiempo (10 minutos aproximadamente) con un 0% de animales vivos. Estudios anteriores han señalo que en modelos de epilepsia, como el modelo de kaninato, que produce cambios neurológicos muy similares al modelo de policarpina, existe la tendencia a la resistencia a fármacos antiepilépticos que actúan sobre la modulación de canales de sodio dependientes de voltaje (Klein y cois (2015) Inter- individual variation in the effect of antiepileptic drugs in the intrahippocampal kainate model of mesial temporal lobe epilepsy in mice Neuropharmacology 90, 53-62; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubrned/24184743:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20868357;
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 25769270) lo que podría explicar la baja eficiencia de lidocaína en las pruebas in vivo.
De esta forma, el modelo murino de pilocarpina permitió demostrar que el 100% de los animales inyectados alcanzaron el SE dentro de los primeros 40 minutos post inyección de la droga. Además, todos los animales que sobrevivieron a la administración del agente epileptogénico, generaron crisis espontaneas, obteniendo una sobrevivencia del 60%.
Los registros de campo permitieron demostrar que Bumetanida es capaz de reducir la respuesta de campo en un 58,27% en condiciones epilépticas, mientras que en los controles este parámetro se mantuvo prácticamente constante. Además, se determinó que la combinación de BTDA + LDCNA y BTDA + VPA presentan un comportamiento similar, disminuyendo la respuesta de campo en un 80% aproximadamente.
Los ensayos in vivo mostraron que Bumetanida fue capaz de retardar la llegada al SE y aumentar la expectativa de vida de los animales. Además, se determinó que el mejor pre-tratamiento para el estudio sistémico fue el de BTDA + VPA debido a que los animales no alcanzaron la etapa V de la escala de Racine, con un 100% de sobrevivencia. Sin embargo, los estudios in vivo para lidocaína resultaron negativos ya que los animales alcanzaron el SE en un periodo de tiempo corto y la sobrevivencia fue del 0%. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1 Muestra un registro de campo en una rebanada de hipocampo. A la izquierda se observa una imagen obtenida con una cámara convencional de una vista a través de una lupa 10X de una rebanada de hipocampo con sus respectivos electrodos. A la derecha se muestra el esquema típico del hipocampo con sus respectivos electrodos según la imagen de la izquierda. R1 y R2 indican los electrodos de registro y E indica el electrodo de estimulación. En la imagen se observan los electrodos de registro en las dendritas (R1 ) y axones (R2). El electrodo de estimulación se encuentra en la vía perforante.
Figura 2 Sobrevivencia de ratones inyectados con pilocarpina 1 y 14 días post SE. El porcentaje de sobrevivencia para los dos grupos experimentales, representados por promedios con su error estándar Se realizó 4 experimentos, cada uno con 10 animales para el grupo con ELT y 3 experimentos, cada uno con 3 animales para el grupo control. El grupo control no tiene error estándar pues corresponde al 100% de los animales vivos. Prueba t, p < 0,05(*); p < 0,005(*).
Figuras 3A-3E Efecto de fenobarbital sobre el disparo espontaneo. Las Figuras 3A y
3B corresponden a trazos representativos de registros extracelulares en solución de ACSF alto en K+. La Figura 3A pertenece a una rebanada de animal control y la figura 3B a una animal bajo condiciones de epilepsia, antes y después de la aplicación de fenobarbital. En las Figuras 3C y 3D se muestra la cuantificación de los registros obtenidos para la condición control (n=7) y epiléptica (n=7), respectivamente, donde cada punto corresponde a una rebanada en particular antes (negro) y después (gris) de las administración de fenobarbital (PHB). Finalmente, en la Figura 3E se observa la cuantificación de los datos que representa un promedio de todos los experimentos, por condición, expresada en porcentaje. Error estándar de la muestra (SEM), prueba t.
Figuras 4A-4E Bumetanida disminuye la actividad epileptiforme inducida por ACSF alto en K+. Las Figuras 4A y 4B corresponden a trazos representativos de registros extracelulares en solución de ACSF alto en K+. La Figura 4A pertenece a una rebanada de animal control y la figura 4B a un animal inyectado con policarpina antes y después de la aplicación de Bumetanida.
En las Figuras 4C y 4D se muestra la cuantificación de los registros obtenidos para la condición control (n=15) y epiléptica (n=14), respectivamente, donde cada punto corresponde a una rebanada en particular antes (negro) y después (gris) de las administración de Bumetanida (BTDA). La Figura 4E muestra la disminución de la frecuencia de disparo para ambas condiciones. Error estándar de la muestra (SEM), prueba t.
Figuras 5A-5E La combinación de Bumetanida con fenobarbital no muestra un efecto aditivo sobre la actividad epileptiforme inducida por policarpina. Las Figuras
5A y 4B corresponden a trazos representativos. La Figura 5A pertenece a una rebanada de animal control y la Figura 5B a un animal bajo condiciones de epilepsia, antes y después de la aplicación de Bumetanida (BTDA) + fenobarbital (PFIB). En las Figuras 5C y 5D se muestra la cuantificación de los registros obtenidos para la condición control (n=8) y epiléptica (n=8), respectivamente, donde cada punto corresponde a una rebanada en particular antes (negro) y después (gris) de las administración de Bumetanida (BTDA) + Phenobarbital (PFIB). La figura 5E muestra la disminución de la frecuencia de disparo para ambas condiciones. Error estándar de la muestra (SEM), prueba t.
Figuras 6A-6C Efecto de Bumetanida sobre la respuesta de potencial de campo de las CGGD en un modelo de epilepsia crónica. La Figura 6A corresponden a trazos representativos promedio de la respuesta de campo provenientes de una rebanada control y una rebanada epiléptica, antes (1 ) y después (2) de la aplicación de Bumetanida (BTDA). La Figura 6B muestra el curso temporal promedio de la respuesta de campo para la condición control (n=8) y epiléptica (n=8). El estímulo fue dado cada 10 segundos durante 40 minutos, con una intensidad de corriente media a la de saturación. 1 = Línea Base, 2 = BTDA. Figura 6C = histograma que muestra la cuantificación en porcentaje durante los primeros 10 minutos y últimos 10 minutos de BTDA. Error estándar de la muestra (SEM), prueba t, p < 0.001 (***).
Figuras 7A-7E Efecto de Bumetanida en combinación con lidocaína sobre la respuesta de potencial de campo de las CGGD en un modelo de epilepsia crónica. La Figura 7A muestra curso temporal promedio de la respuesta de campo obtenida de animales control (n=1 1 ) y epilépticos (n=12) en respuesta a LDCNA. La Figura 7B muestra el curso temporal promedio de la respuesta de campo obtenida de animales control (n=1 1 ) y epilépticos (n=13) en respuesta a BTDA en combinación con LDCNA. La Figura 7C muestra un gráfica con la cuantificación en porcentaje durante los primeros y últimos 10 minutos de administración de LDCNA y BTDA + LDCNA. La Figura 7D muestra trazos representativos promedio de la respuesta de campo en una rebanada control y una rebanada epiléptica, antes (1 ) y después (2) de la administración de LDCNA (2 trazos superiores) y BTDA + LDCNA (2 trazos inferiores). El estímulo fue dado cada 10 segundos durante 40 minutos con una intensidad de corriente media a la corriente de saturación. 1 = línea Base, 2 = BTDA. La Figura 7E error estándar de la muestra (SEM), prueba t, p < 0.05 (*); p < 0.005 (**); p < 0.001 (***). Figuras 8A-8E Efecto de Bumetanida en combinación con ácido valproico sobre la respuesta de potencial de campo de las CGGD en un modelo de epilepsia crónica. La Figura 8A muestra curso temporal promedio de la respuesta de campo obtenida de animales control (n=10) y epilépticos (n=9) en respuesta a VPA. La Figura 8B muestra el curso temporal promedio de la respuesta de campo obtenida de animales control (n=10) y epilépticos (n=12) en respuesta a BTDA en combinación con VPA. La figura 8C muestra histogramas con la cuantificación en porcentaje durante los primeros y últimos 10 minutos de administración de VPA y BTDA + VPA. Figura 8D muestras los trazos representativos promedio de la respuesta de campo en una rebanada control y una rebanada epiléptica, antes (1 ) y después (2) de la administración de VPA (2 trazos superiores) y BTDA + VPA (2 trazos inferiores). El estímulo fue dado cada 10 segundos durante 40 minutos con una intensidad de corriente media a la corriente de saturación. 1 = línea Base, 2 = BTDA. La Figura 8E Error estándar de la muestra (SEM), prueba t, p < 0.05 O; p < 0.005 (**); p < 0.001 (***)
Figuras 9A-9D Evaluación de llegada al Status Epilepticus (SE) tras la administración de diferentes pre-tratamientos. Figura 9A muestra el tiempo promedio en minutos de llegada a cada una de las etapas de la escala de Racine para cada pre-tratamiento. La Figura 9B muestra el tiempo promedio de llegada al
SE, etapa V de la escala de Racine, para cada condición. La Figura 9C muestra la cuantificación del número de eventos tras la inyección i.p. de pilocarpina para la etapa V de la escala de Racine. Control (CTRL, n=25), BTDA (n=17), VPA (N=21 ), BTDA + LDCNA (N=10) y BTDA + VPA (N=10).
Figuras 10A y 10B Tasas de supervivencia y mortalidad para cada pre-tratamiento.
Figura 10A muestra el porcentaje promedio de supervivencia para cada pre tratamiento. 100% corresponde a todos los animales vivos y 0% a todos lo animales muertos. El tiempo cero corresponde a la inyección de pilocarpina y en el gráfico se señala con una flecha. La Figura 10B muestra el tiempo promedio de muerte para cada condición. Control (CTRL, n=25), BTDA (n=17), VPA (N=21 ), BTDA + LDCNA (n=10) y BTDA + VPA (n=10). Error estándar de la muestra (SEM), prueba t, p < 0.05 (*); p < 0.005 (**); p < 0.001 (***).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La administración de fármacos anticonvulsivos es el tratamiento estándar para prevenir la aparición de ataques epilépticos de corta o larga duración (SE) en pacientes con epilepsia crónica ¾hόί, C., Nozadze, M., Heuchert, N., Rattka, M., and Loscher, W. (2010). Disease Modifying Effects of Phenobarbital and the NKCC1 Inhibitor Bumetanide in the Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy. Journal of Neuroscience. 30, 8602-8612). La mayoría de los fármacos actúan aumentando la acción del neurotransmisor GABA por diversos mecanismos: aumento de la entrada de Cl a la célula, disminución de la degradación de GABA, aumento de la síntesis de GABA, entre otras Kwan, P., Schachter, S., and Brodie, M. (201 1 ). Drug-Resistant Epilepsy. The new England journal of medicine. 365, 919-26, Fukuda (2005) Diuretic soothes seizures in newborn Nature Medicine 1 1 (1 1 ) 1 153-1 153). Sin embargo, un número cercano al 30% de pacientes con ELT no responde al tratamiento con estos anticonvulsivos clásicos (estos son llamados pacientes refractarios o ELTr) (Kwan, P., Schachter, S., and Brodie, M. (201 1 ). Drug-Resistant Epilepsy. The new England journal of medicine. 365, 919-26, Reid, A., Riazi, K., Teskey, C., and Pittman, Q. (2013). Increased excitability and molecular changes in adult rats after a febrile seizure. Epilepsia. (*), 1-4). Estudios recientes apuntan a una nueva causa de la elevada excitabilidad neuronal en tejidos epilépticos, relacionada principalmente con el aumento de Cl- como consecuencia del aumento de expresión del NKCC1 . Si bien se sabe que en estadios tempranos del desarrollo la [Cl]¡ es elevada debido a un aumento en la expresión del mRNA de NKCC1 (Yamada y cois (2004) Cl+ uptake promoting depolarizing GABA action in immature rat neocortical neutrons is mediated by NKCC1. The Journal of Physiology 557(3) 829-841 , Ben-Ari Y. (2002) Excitatory actions of GABA during development: the nature of the nurture. Nature Reviews Neuroscience, 3(9), 728-739J, también se ha visto que en neuronas provenientes de tejidos con ELT existe un aumento en la expresión de NKCC1 a nivel del mRNA (Reid, A., Riazi, K., Teskey, C., and Pittman, Q. (2013). Increased excitability and molecular changes in adult rats after a febrile seizure. Epilepsia), provocando a su vez un aumento en [Cl]¡. En ambos casos GABA es depolarizante y podría llegar a comportarse como neurotransmisor excitatorio. Esto explica por qué en algunos pacientes con ELTr el tratamiento convencional con agonistas GABAérgicos no es efectivo (Duncan et al., 2006, Campos, 2009). Es por esto que se postula BTDA como posible fármaco restituyendo la [Cl]¡. y generando que GABA se comporte nuevamente como inhibitorio.
Hasta la fecha, no se han realizado estudios de excitabilidad hipocampal que involucren la combinación de fármacos antiepilépticos tales como ácido valproico, con bumetanida en modelos animales de epilepsia crónica. Estas combinaciones tienen la potencialidad de requerir menores dosis de antiepilépticos, lo cual disminuiría los efectos secundarios. Los resultados obtenidos son sumamente relevantes ya que demuestran que a nivel de circuito hipocampal, específicamente en el giro dentado, existe una disminución significativa de la respuesta excitatoria representada por las potenciales poblaciones. Se encontró que dos combinaciones de antiepiléptico con Bumetanida son capaces de generar disminución de la actividad epileptiforme observada en rebanadas de cerebro de animales epilépticos. Donde BTDA por si sola disminuye los efectos excitatorios en rebanadas de animales epilépticos. Además, BTDA es capaz de potenciar los efectos antiepilépticos tanto de Lidocaína como de VPA de manera in vitro. En este caso, la medición está dada por la disminución de la amplitud de los potenciales de campo. La principal característica de estas combinaciones es que disminuye la actividad epileptiforme de las rebanadas de animales epilépticos, en este caso epilepsia refractaria de manera in vitro.
La combinación de Bumetanida más VPA tiene efectos antiepilépticos tanto ex vivo como in vivo. Además, en los experimentos in vivo, BTDA por si sola fue capaz de retardar la llegada al SE y aumentar el tiempo de vida de los animales. BTDA en conjunto con VPA fue capaz de evitar la llegada al nivel V de Racine (ver tabla 1 ) y evitó en un 100% la muerte de los animales. Sin embargo, BTDA en conjunto con Lidocaína no resultó positivo para los estudios in vivo ya que se comportó de igual forma a los animales no tratados. Es importante destacar que ni Lidocaína ni VPA corresponden a benzodiacepinas y barbitúricos, principales compuestos psicotrópicos para el tratamiento de la epilepsia. Por lo tanto, su uso disminuiría ciertos efectos secundarios relacionados con la percepción, estado de ánimo y comportamiento como lo hacen los psicotrópicos convencionales. Los principales competidores que existen para la presente invención corresponden a antiepilépticos de uso común, como por ejemplo, lamotrigina, fenobarbital y diazepam. Sin embargo, ninguno de ellos por si solo trata la epilepsia refractaria de manera eficiente. La principal diferencia y beneficio es que el uso combinado propuesto en esta solicitud tratará una condición epiléptica específica, en donde los tratamientos de uso común, no tienen efectos positivos, y además tal combinación es de fácil administración.
Tabla 1 : Clasificación de las convulsiones o“clinical score” según Racine, 1972.
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*Clonus: serie de contracciones involuntarias rítmicas dadas en un grupo muscular.
La presente invención corresponde al uso combinado de Bumetanida y ácido valprocio, la que tiene un mayor efecto en el tratamiento de epilepsia refractaria. Mediante experimentos electrofisiológicos in vitro, en rebanadas de cerebro de ratones modelo de epilepsia del lóbulo temporal (ELT) y controles se probó los efectos del uso combinado de bumetanida con lidocaína y bumetanida con ácido valproico. Se estudiaron los cambios en la excitabilidad neuronal medida en el giro dentado, la entrada del circuito sináptico del hipocampo, la región del cerebro donde empiezan las crisis epilépticas en ELT. Se realizaron registros extracelulares en rebanadas de hipocampo de animales controles y epilépticos en presencia de bumetanida (BTDA) con el fin de determinar los posibles efectos antiepilépticos de dicha droga. Se determinó el cambio en la excitabilidad del circuito excitatorio de las Células Granulares del Giro Dentado (CGGD) en presencia de BTDA, resultado principal para demostrar su efectividad como un potencial antiepiléptico. Para esto, se hicieron registros de potenciales de campo extracelulares en la capa granular del hipocampo (donde se encuentran las CGGD) y se cuantificó la amplitud del potencial poblacional (PopSpike) que representa la sumatoria de los potenciales de acción. BTDA logró disminuir significativamente la amplitud del PopSpike en rebanadas de animales epilépticos en comparación al control en donde los efectos de BTDA son insignificantes (Fig. 6A). La adición de 10mM de BTDA en rebanas de animales controles cambia la amplitud de la respuesta en un 3,51%. Por el contrario, en rebanadas de animales epilépticos BTDA disminuye progresivamente la amplitud de la respuesta saturando en aproximadamente los 25 minutos disminuyendo la amplitud en un 58,27%. Esta disminución de la amplitud del PopSpike significa que se produce un menor número de potenciales de acción en el circuito, indicativo de una menor excitabilidad neuronal.
Mediante estudios de la expresión de NKCC1 en ambas condiciones, mostrando que existe un aumento de la expresión de este co-transportador en animales epilépticos en comparación con los controles. Es por esto que los efectos de BTDA se ven aumentados en el modelo de epilepsia. Estos resultados son alentadores ya que demuestran que BTDA disminuye de forma significativa la excitabilidad que se encuentra alterada en un modelo animal ELT. Lo cual es sustentado por Nardou, R., Ben-Ari, Y., and Khalilov, I. (2009). Bumetanide, an NKCC1 Antagonist, Does Not Prevent Formation of Epileptogenic Focus but Blocks Epileptic Focus Seizures in Immature Rat Hippocampus. J Neurophysiol. 101 , 2878-2888., Marés, P. (2009). Age and Dose-Specific Anticonvulsant Action of Bumetanide in Immature Rats. Physiol. 58, 927-930) quienes demuestran que en rebanadas de hipocampo de ratas neonatos que artificialmente generan descargas epileptiformes, BTDA es capaz de disminuir los efectos excitatorios.
Ácido Valproico (VPA) es uno de los antiepilépticos más utilizados en la actualidad para el tratamiento de la epilepsia según la“International Ligue Against Epilepsy (ILAE)”. Se estudió el efecto de VPA por si solo en la generación de los potenciales de campo en rebanadas de animales controles y epilépticos. Al igual que Lidocaína, valproato mostró una disminución de la amplitud del PopSpike tanto en rebanadas controles como en rebanadas de animales epilépticos 61 ,40% (Fig. 8A y Fig. 8D, primeros 2 trazos). Comparado a los controles (50,84%) (Fig. 8C). La aplicación de bumetanida más valproato produjo una disminución en la amplitud del PopSpike del 88,3% para los controles, comparado al 56% en los controles. Por lo tanto, hasta este punto podemos decir que la mezcla de BTDA con VPA aumenta los efectos antiepilépticos a nivel de circuito hipocampal en un 5,18% para el control (diferencia no significativa) y un 37,99% en rebanas de animales epilépticos en comparación a VPA, por sí solo. El mecanismo de acción de VPA se encuentra en discusión, sin embargo, VPA ha sido uno de los antiepilépticos de primera generación más utilizados a lo largo del mundo según la ILAE.
Mediante experimentos conductuales in vivo en animales epilépticos y controles se probaron los efectos de las combinaciones de bumetadina y antiepiléptico. A partir de esto se verificó la llegada a estatus epiléptico (SE) en cada uno de los grupos experimentales de animales. Se realizaron estudios in vivo en presencia de las mismas combinaciones de fármacos utilizados anteriormente, en los registros extracelulares. En estos estudios, los ratones sanos fueron sometidos a un pre-tratamiento de 3 días el cual consiste en una sola inyección de la droga (Vehículo, BTDA, Lidocaína, VPA, BTDA+ Lidocaína y BTDA+VPA) previo a la generación del SE con pilocarpina. El primer parámetro a analizar fue tiempo de llegada a cada etapa según la escala de Racine (ver tabla 1 ). Se observó que animales tratados con Lidocaína y VPA por si solos muestran un aumento en el tiempo de entrada a SE comparados al con animales control siendo (Fig 8A). Animales pre-tratados con BTDA mostraron un retardo en la llegada a cada uno de los niveles de la escala (Fig. 9A). Más interesante aun, la combinación de BTDA con VPA retardo significativamente los niveles III, IV y V de la escala de Racine (ver tabla 1 ) e incluso para este caso no hubo animales en nivel de convulsión V (Fig. 9A). La cuantificación de los datos para el último nivel de la escala de Racine mostró que los animales tratados con BTDA se demoran en promedio 15 minutos, los animales tratados con BTDA + Lidocaína demoran 9 minutos y los animales tratados con BTDA+VPA nunca generan convulsión a escala 5, en comparación al control que demora apenas 9 minutos post-inyección de pilocarpina (Fig. 9B). Es decir, BTDA y BTDA+VPA son capaces de retardar la llegada al SE, sin embargo, BTDA + Lidocaína no es capaz de retardar esta condición y se comporta de igual manera a los animales controles.
Como segundo parámetro de análisis se cuantificó el número de crisis en niéveles IV y V de escala de Racine para cada uno de los tratamientos (Fig. 9C y 9D). Tanto para el nivel IV como V los tratamientos aumentan en promedio el número de crisis exceptuando la combinación de BTDA+VPA en el nivel V donde ningún animal llego a tal estado. El hecho de que exista un aumento de las crisis parece paradójico, sin embargo, este es explicado debido a que los animales tienen una menor tasa de mortalidad, es decir, se evita que los animales mueran, generando mayor tiempo de sobrevida en donde los animales convulsionan más veces.
Finalmente, se determinó si los diferentes tratamientos mejoran la tasa de supervivencia de los animales en el transcurso del tiempo (durante 40 minutos post- pilocarpina). BTDA por si sola mostró una disminución de la mortalidad a un 33,3% en comparación al control donde el 84,6% de los animales muere (Fig. 10A). De igual manera, animales pre-tratados con BTDA + Lidocaína presentan un 0% de supervivencia. Sin embargo, el pre-tratamiento con BTDA+VPA mostró resultados sorprendentes en donde la tasa de mortalidad es del 0% (Fig. 10A). Si bien Lidocaína y VPA son capaces de retardar el tiempo de llegada en los distintos niveles de la escala de Racine, ninguno por si solo es capaz de evitar en 100% la mortalidad de los animales (Fig. 10C y 10D). Posteriormente, se determinó el tiempo promedio de fallecimiento de los animales y se observó que animales pre-tratados con BTDA demoran 29,77 minutos en morir, a diferencia de lo que se observó en animales controles y pre-tratados con BTDA + Lidocaína donde la latencia fue de 1 1 ,16 y 12,34 minutos. Debido a que ningún animal pre-tratado con BTDA+VPA muere, este valor quedó en 0.
Ejemplos:
Ejemplo 1 : Generación del modelo epiléptico animal
Se utilizaron ratones mus musculus macho, cepa C57BL/6 de entre 17-22 gramos, los que fueron mantenidos en condiciones controladas de temperatura, humedad y ad libitum de agua y comida (consumo de libre demanda), con un ciclo día/noche de 12 horas. En estos ratones se generó un modelo de epilepsia de lóbulo temporal mediante la inyección aguda de pilocarpina intraperitoneal (i.p.). Los ratones tenían una edad promedio de 5-6 semanas.
En primer lugar, se inyectó i.p. escopolamina, un sedante que actúa como depresor de la respuesta colinérgica, en una dosis de 1 mg/kg. Luego de 15 minutos, se inyectó i.p. pilocarpina en una dosis de 360 mg/kg para generar el SE. Finalmente, 45 minutos después de la inyección de pilocarpina se inyectó i.p. diazepam, en una dosis de 15 mg/kg con el objetivo de terminar las convulsiones. Los animales control fueron inyectados i.p. con un vehículo (suero fisiológico al 0,9%). Las ratones fueron observados continuamente con durante 45 minutos tras la administración de policarpina para monitorear la ocurrencia de convulsiones generación del Status Epilepticus (SE) que corresponde a convulsiones clase V (pérdida de la postura general, convulsiones severas) y VI (muerte) según era esperado (Racine, R. (1971 ). Modification of seizure activity by electrical stimulation: motor seizure. Electroenceph. clin. Neurophysiol. 32, 281-294). Se esperó 2 semanas para la generación de la condición de epilepsia crónica en donde se observó la iniciación de ataques espontáneos, como era esperado (Hamilton, S., Loose, M., Qi, M., Levey, A., Hille, B., McKnight, S., Idzerda, R., and Nathanson, M. (1997). Disruption of the m1 receptor gene ablates muscarinic receptor-dependent M current regulation and seizure activity in mice. Neurobiology. 94, 1331 1-13316, Oliveira, A., Nogueira, C., Nascimento, V., Aguiar, L, Freitas, R., Sousa, F., Viana, G., and Fonteles, M. (2005). Evaluation of levetiracetam effects on pilocarpine-induced seizures: Cholinergic muscarinic system involvement. Neuroscience Letters. 385, 184-188).
Ejemplo 2: Preparación de soluciones
Solución para extracción de cerebro y obtención de rebanadas
Se empleó un amortiguador de disección frió con las siguientes concentraciones de sales (mM): 212,7 de Sacarosa, 5 de KCI, 1 ,25 de NaFi2P04, 1 ,0 de MgCI2, 26,0 de NaHC03, 10,9 de Glucosa.
Solución para estabilización de rebanadas
Se empleó solución de ACSF (Fluido Espinal de Cerebro Artificial) a temperatura ambiente con la siguiente composición de sales, en Mm: 124 de NaCI, 2,8 de KCI, 1 ,25 de NaH2P04, 26,0 de NaHC03, 0,4 de ácido ascórbico, 10,0 de glucosa, 2,0 de MgS04, 2 de CaCI2. Las rebanadas fueron sumergidas en esta solución antes y durante el registro extracelular.
Solución para llenado de electrodos de registro
Para los registros de frecuencia de disparo, los electrodos de vidrio fueron llenados con una solución de ACSF alta en potasio, con la siguiente composición de sales, en nM: 124 de NaCI, 8,0 de KCI, 1 ,25 de NaH2P04, 1 ,0 de MgCI2, 26,0 de NaHC03, 10 de Glucosa, 0,25 de CaCI2. Por otro lado, para los registros de potenciales de campo evocados, los electrodos fueron llenados con la misma solución de ACSF con la que se estabilizaron las rebanadas.
Todas las soluciones fueron oxigenadas con 02 al 95% (5% C02) se almacenaron frías. Ejemplo 3: Obtención de rebanadas de hipocampo
En primer lugar, se realizó el procedimiento de disección, empleando el siguiente material quirúrgico: pinzas, tijeras, espátulas y hojas de Gillette, el cual fue puesto a - 20eC, así como también la cámara del Vibratomo Leica modelo VT12008, las placas de Petri y un vaso de precipitado de 20 ml_. Por otro lado, 200 ml_ de amortiguador de disección fueron puestos a -20eC por un período de 15 minutos y luego se conservó en hielo. Además, 400 ml_ de solución de ACSF fueron puestos a temperatura ambiente. Ambas soluciones fueron oxigenadas y se le agregó las sales correspondientes (3mM MgS04, lmM CaCl2), a cada solución. Finalmente, se calibró el vibratorio y se montó la cámara para la obtención de rebanadas. Una vez listo todo el material de disección, los animales fueron anestesiados con isofluorano y decapitados haciendo uso de una guillotina. La cabeza fue puesta en un vaso precipitado con 20 mL de amortiguador de disección con el propósito de retirar restos de sangre. Luego, fue puesta en una placa Petri cortando la piel desde la base hasta la parte anterior del cráneo. Se introdujo la tijera desde la base del cráneo y se cortó hasta cada uno de los oídos, luego se realizó un corte de ojo a ojo. Posteriormente, se introdujo la tijera desde la base del cráneo, cortando de forma muy cuidadosa por la línea media hasta llegar, de forma perpendicular, a la altura de los ojos. Se introdujo una espátula por debajo del bulbo olfatorio, separando el cerebro del cráneo. El cerebro fue puesto en otra placa de Petri y empleando una Gillete se cortó y desechó el cerebelo extrayendo el cuerpo calloso. Luego, se procedió a obtener las rebanadas montando el cerebro sobre la superficie del bloque del corte del Vibrátomo. Este bloque de corte fue montado sobre la cámara del Vibratomo y se agregó el amortiguador de disección, oxigenándolo de forma continua durante todo el procedimiento. Este bloque de corte fue montado sobre la cámara del Vibratomo y se agregó el amortiguador de disección, oxigenándolo de forma continua durante todo el procedimiento. Bajo el amortiguador de disección el cerebro fue cortado por la mitad (corte sagital) para separar ambos hemisferios. Luego, se bajó la hoja de corte hasta quedar completamente cubierta por la solución. Se procedió a la obtención de rebanadas de 300 mm de grosor, a una velocidad de 0,09 mm/s. Finalmente, estas fueron sumergidas en solución de Liquido Cefalorraquídeo Artificial (ACSF) a temperatura ambiente, por un periodo de 40 minutos. Ver Figura 1 .
Ejemplo 4: Disparo Espontaneo
Para analizar la frecuencia de disparo de las CGGD del hipocampo, se realizaron registros extracelulares mediante la estimulación con solución ACSF de alto contenido en K+. (5 mM) El sistema de registro está compuesto por un osciloscopio de un canal Modelo 3502C (Hung Chang), un amplificador de un canal Modelo 1800 Marca AM; Systems, una lupa 10X Modelo SZ 51 Marca Olympus y un PC con una tarjeta de adquisición PCI 62251 National Instruments. La adquisición de datos se realizó con el software W i n W C P .
Previamente, se prepararon micropipetas en un Puller Sutter Instruments Modelo P-87. Una de ellas fue llenada con solución de ACSF con alto contenido en K+ (5 mM) y ubicada en el manipulador. Se reguló para que no hubiera rebalse del flujo de solución que fue oxigenada en todo momento, y se depositó una rebanada en la cámara de registro en la que se ubicó la micropipeta en los somas de las CGGD, lo que permitió ver respuestas en el osciloscopio. Los protocolos consistieron en 10 minutos de línea base, solución ACSF, 15 minutos de perfusión de droga (bumetanida 10 mhi, Fenobarbital 100 mhi, la combinación de ambos), y 5 minutos de lavado.
Una vez obtenidos los registros, los datos fueron analizados en MATLAB. Para este análisis se determinaron los máximos que el umbral de 4 desviaciones estándar de línea base y se calculó la frecuencia de disparo. Ejemplo 5: Potenciales de Campo Evocados
Para analizar los potenciales de campo de las CGGD, se incorporó al sistema, un estimulador marca WPI, el que fue conectado a un electrodo de estimulación. Se reguló para que no ocurriera rebalse del flujo de solución, que fue oxigenado continuamente, y se depositó una rebanada en la cámara de registro. Posteriormente, se ubicó el electrodo de estimulación en la vía perforante. Por otro lado, se llenó una micropipeta con solución de ACSF y se ubicó en el manipulador. Luego se puso la micropipeta en la capa granular del giro dentado donde se encuentran los somas de CGGD y se aplicó una intensidad de estímulo de 200 mA cada 10 segundos, lo que permitió ver la respuesta característica, la cual consiste en una onda representada por un peak positivo (respuesta sináptica) y un peak negativo (sumatoria de potenciales de acción). Para ambos tipos de análisis, se aplicó en el baño de la rebanada 10 mM de BTDA en combinación con Lidocaina y ácido valproico, ambos antiepilépticos diferentes de uso común en los sistemas de perfusión.
Una vez obtenidos los registros, los datos fueron analizados empleando los programas Igor y Grasphpad. En los registros de campo evocado se determinó la amplitud del PopSpike, la que fue obtenida calculando el promedio entre los dos máximos positivos y el PopSpike (máximo negativo).
Ejemplo 6: Pre-Tratamientos
Los animales fueron divididos en 6 grupos experimentales (de 10 cada uno), los que fueron pre-tratados durante una inyección diaria durante 3 días con la combinación de drogas correspondiente: controles, Bumetanida (BTDA) (0,5 mg/kg), ácido valproico (VPA) (150 mg/kg), lidocaina (LDCNA) (10 mg/kg), BTDA + VPA (150 mg/kg) y BTDA + LDCNA (10 mg/kg). Posteriormente, para el estudio de llegada al SE, los animales fueron inyectados con pilocarpina, a una dosis alta de 420 mg/kg, dosis que asegura convulsiones severas. Los animales controles fueron inyectados solo con el vehículo (suero fisiológico 0,9%). Todos los animales fueron tratados posteriormente con 1 mg/kg de escopolamina y luego de 40 minutos post SE, se les inyectó 15,0 mg/kg i.p. de diazepam para frenar las convulsiones. Para cada caso, se midió el tiempo que demoran en llegar los animales a cada etapa de la escala de Racine (ver tabla 1 ) en el miembro anterior o parálisis; etapa IV movimientos bilaterales y clonus en la extremidad anterior; etapa V, perdida de la postura general, convulsiones severas; etapa VI, muerte), numero de crisis en cada animal y porcentaje de mortalidad. Los datos obtenidos fueron graficados y analizados usando el programa de análisis estadístico Graphpad Prism., evaluando el ± error estándar de la muestra (SEM). Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando la prueba t. La significancia estadística considerada fue a valores p < 0,05(*), p < 0,005(**), p < 0,001 (***). Ejemplo 7: Generación de un modelo de epilepsia crónica en ratones C57BL/6 mediante la administración aguda o de alta dosis de pilocarpina
Para verificar si el modelo de pilocarpina es eficiente para la inducción de ELT crónica, bajo las condiciones experimentales, se evaluó la sobrevivencia de los animales, tanto control como los sometidos a SE, 1 hora y 14 días post inyección. El 100% de los animales sometidos a este protocolo (aprox. 80) alcanzaron el SE dentro de los primeros 40 minutos post inyección de pilocarpina (380 mg/Kg). Al transcurrir una hora post inyección, la sobrevivencia fue del 67,5% y 14 días post inyección disminuyó a un 60% del total (Figura 2). Estos resultados muestran que la inducción de ELT crónica empleando el modelo propuesto es eficiente ya que presenta una alta tasa de sobrevivencia similar a la reportada en la literatura (50%) Doodipala, R., and Ramkumar, K. (2013). Experimental Models of Status Epilepticus and Neuronal Injury for Evaluation of Therapeutic Interventions. Molecular Sciences. 14, 18284-18318. . Además, el 60% de los animales que sobrevivieron generaron crisis espontaneas que son características del trastorno epiléptico.
Ejemplo 8: Determinación de los cambios de excitabilidad de las CGGD e presencia de Bumetanida en combinación con antiepilépticos tradicionales Efecto de Fenobarbital en la actividad epileptiforme inducida por pilocarpina
Para evaluar el efecto de fenobarbital sobre la excitabilidad hipocampal, se realizaron registros extracelulares de potenciales de campo espontáneo en animales control (8) y epilépticos (8). Para evocar el disparo, se prefundió la cámara de registro con ACSF con alto contenido en K+ (5 mM) para generar disparos espontáneos. Posteriormente, se cuantificó la frecuencia de disparo antes y después de la aplicación de fenobarbital. Los trazos representativos para ambas condiciones (Figuras 3A y 3B) muestran que esta droga produce una disminución de la frecuencia de disparo. El análisis de disminución en la frecuencia de disparo para cada una de las rebanadas muestran que existe una disminución de este parámetro, mayoritariamente en las rebanadas de animales control (Figura 3C) a diferencia de las rebanadas que provienen de animales ELT que tienden a la mantención o aumento en la frecuencia de disparo (Figura 3D). Por otro lado, la cuantificación del promedio de disminución en la frecuencia de disparo muestra que existe una mayor disminución en condiciones control. Sin embargo, estas diferencias no son estadísticamente significativas (Figura 3E).
Estos resultados muestran que la administración de fenobarbital en este modelo de epilepsia no es capaz de disminuir la excitabilidad del circuito. Efecto de Bumetanida en la actividad epileptiforme inducida por pilocarpina
Para evaluar el efecto de bumetanida sobre la excitabilidad hipocampal, se realizaron registros extracelulares de potenciales de campo espontáneo en animales control (1 1 ) y epilépticos (12). Para evocar el disparo, se prefundió la cámara de registro con ACSF alto contenido en K+ (5 mM) para generar disparos espontáneos. Posteriormente, se cuantificó la frecuencia de disparo antes y después de la aplicación de Bumetanida. Los trazos representativos para las condiciones control y epiléptica muestran características similares, es decir, una alta frecuencia de disparo durante la línea base (Figuras 4A y 4B). La aplicación de 10 mM de bumetanida produjo una disminución en la frecuencia de disparo mayoritariamente en las rebanadas que provienen de animales sometidos al modelo de epilepsia, hecho que es concordante con trabajos anteriores de los mismos inventores (Tesis para optar al título profesional de Biotecnólogo con mención en investigación biotecnológica, Escuela de Biotecnología, Universidad Santo Tomás, titulada“Participación del co-transportador de Cloruro NKCC1 en neuronas hipocampales en condiciones epilépticas”, Marzo 2014, Marcelo Andrés Lara Suzarte), que establece que, Bumetanida al inhibir de forma específica al co-transportador NKCC1 es capaz de restablecer la homeostasis de [Cl-]i (Figura 4B y 4C). El análisis de disminución en la frecuencia de disparo para cada una de las rebanadas (cada punto de las gráficas corresponde a una rebanada), luego de administrar Bumetanida, muestra un comportamiento similar para ambas condiciones que tiende a la disminución en la frecuencia de disparo (Figura 4C y 4D). Por otro lado, la cuantificación del promedio de disminución en la frecuencia de disparo muestra que existe una mayor disminución en condiciones control. Sin embargo, estas diferencias no son estadísticamente significativas (Figura 4E).
La administración de Bumetanida en este modelo de epilepsia no muestra efectos claros. Es necesario probar la combinación de esta droga en conjunto con antiepilépticos convencionales con el fin de evaluar si el bloqueador de NKCC1 es capaz de potenciar el efecto de fármacos antiepilépticos.
Efecto de Bumetanida en combinación con Fenobarbital sobre la actividad epileptiforme inducida por pilocarpina En modelos agudos de epilepsia neonatal se ha visto que la efectividad de Bumetanida ocurre principalmente en presencia de agonistas GABAérgicos sugiriendo que para generar el efecto antiepiléptico es necesario un restablecimiento del“driving forcé” de Cl en conjunto con la potenciación del receptor GABAA (Tóllner y cois (2015) Bumetanide is not capable of terminating status epilepticus but enhances phenobarbital efficacy in different rat models. European Journal of Pharmacology, 746, 78-88). Por lo anterior, se evaluó el efecto combinado de fenobarbital y bumetanida. Los trazos representativos para de los registros muestran que la aplicación de estas drogas (10mM de BTDA y 100mM de fenobarbital) produjo una disminución en la frecuencia de disparo (Figuras 5A y 5B). Por otro lado, al analizar la disminución en la frecuencia de disparo en cada una de las rebanadas (Figura 5C y 5D), la tendencia es a la disminución para ambas condiciones. Finalmente, al realizar la cuantificación de los datos (Figura 5E) se puede observar que existe un mayor número de células con una mayor disminución de frecuencia de disparo en animales epilépticos, sin embargo, no se observan diferencias significativas entre ambas condiciones al analizar los valores promedio.
Ninguna de las drogas o combinaciones de las mismas produce una mayor diminución de la frecuencia de disparo en lo animales epilépticos comparados a los animales control, por lo que se decisión estudiar la Bumetanida sobre la respuesta evocada en el circuito del gripo dentado.
Ejemplo 8: Bumetanida disminuye la excitabilidad hipocampal en rebanadas de animales sometidos a un modelo de epilepsia crónica
Se determinó la acción de BTDA (10 mM) sobre la excitabilidad hipocampal y, con ello, su potencial efecto antiepiléptico, se realizaron registros extracelulares de potencial de campo evocado en rebanadas de hipocampo de animales controles (1 1 ) y animales epilépticos (9), en presencia y ausencia de BTDA. Para este fin, se ubicó un electrodo de estimulación en la vía perforante y se registró en la capa granular del giro dentado. Posteriormente, se cuantificó la amplitud del PopSpike que corresponde a la generación de potenciales de acción de las neuronas circundantes al electro de registro. Los trazos representativos promedio de la respuesta de campo (Figura 6A) muestra que BTDA disminuyó significativamente la amplitud del PopSpike en rebanadas provenientes de ratones epilépticos mientras que en rebanadas provenientes de ratones control, la disminución es casi imperceptible. Por otro lado, al analizar el curso temporal de la amplitud PopSpike (Figura 6B) se puede observar que para la condición control se mantiene constante mientras que para la condición epiléptica el curso temporal de la respuesta disminuye, saturando la respuesta aproximadamente a los 13 minutos post aplicación de la droga (10 mM). La cuantificación de la respuesta de campo (Figura 6C) arrojo un 2,8% de disminución en rebanadas de animales control, post administración de BTDA, comparado al 58,27% en animales epilépticos. Esto es consistente con la administración de Bumetanida puede restablecer homoestasis de Cl , y con ello, disminuir la excitabilidad alterada en un modelo de ELT crónica.
Ejemplo 9: Bumetanida potencia el efecto antiepiléptico de lidocaína en un modelo murino de ELT crónica
Se determinó el efecto de bumetanida (10mM) en combinación con lidocaína (LDCNA, 100mM), un bloqueador de los canales de sodio que depende del voltaje, usado como antiepiléptico (Chiu y cois (2016) Neuroprotective and anti-inflammatory effects of lidocaine in kainic acid-injected rats. Neuro Report 27(7) 501 -507). El curso temporal de la respuesta de campo (Figuras 6A y 6B) mostró que LDCNA fue capaz de disminuir la amplitud del PopSpike tanto en rebanadas de animales control (10) como en animales epilépticos (9) , saturando la respuesta aproximadamente a los 15 minutos post aplicación de la droga, en ambos casos. Por otro lado, los trazos representativos promedio de la respuesta de campo muestran que existe una gran disminución de la amplitud del PopSpike, principalmente post administración de la combinación de drogas (BTDA 10mM + LDCNA 100mM). Finalmente, la cuantificación de la respuesta (Figura 7C) mostró que tanto LDCNA por si sola como la combinación con BTDA disminuyó significativamente la amplitud de los potenciales de campo, tanto en animales control, con un 57,1 % de disminución, como en los animales epilépticos con un 81 ,82% de disminución. Mientras que para aquellos tratados sólo con LDCNA el porcentaje de disminución fue de un 40.96% y 58,1 % para animales control y animales epilépticos, respectivamente. Por lo tanto, BTDA potencia el efecto antiepiléptico de LDCNA, mostrando mayor capacidad al administrar la combinación de drogas en rebanadas de animales epilépticos.
Ejemplo 10: Bumetanida potencia el efecto antiepiléptico de ácido valpróico en un modelo murino de ELT crónica
Se determinó el efecto de bumetanida en combinación con ácido valproico (VPA a 2mM), un antiepiléptico de primera generación cuyo mecanismo de acción exacto es desconocido en la actualidad, sin embargo algunos trabajos señalan que aumenta los niveles de GABA en el cerebro inhibiendo a la enzima GABA transaminasa y la recaptación de este neurotransmisor en las neuronas (Katzung y cois (201 1 ) Basic & Clinical Pharmacology. McGraw-Hill Medical New York).
Los trazos promedio de la respuesta de campo muestran que existe una notable disminución de la amplitud del PopSpike, Principalmente, luego de la administración de la combinación de drogas (BTDA 10mM + VPA 2mM) (Figura 8B). Al analizar el curso temporal de la respuesta de campo, es posible otra que la mayor disminución de la amplitud del PopSpike se produce en ambos grupos a los 25 minutos aproximadamente. Por último, la cuantificación de la respuesta de campo mostró que tanto VPA por si solo como en combinación con BTDA disminuyó significativamente la amplitud de los potenciales de campo, tanto en rebanadas de animales control (9) con un 47,99% de disminución como en rebanadas de animales epilépticos (12) con un 76,51% de disminución. Mientras que en rebanadas de animales control la disminución de la respuesta de campo fue de un 40,08% y un 53,21 % en rebanadas de animales control y animales epilépticos, respectivamente. Análogamente a lo ocurrido con LDCNA, BTDA potencia el efecto antiepiléptico de VPA mostrando mayor capacidad al administrar la combinación de drogas en rebanadas de animales epilépticos. Por tanto, BTDA disminuye la respuesta excitatoria en las CGGD a nivel de circuito hipocampal, representada por los potenciales de campo poblacionales. Ejemplo 11 : Generación de Status Epilepticus en ratones tratados con bumetanida en combinación con antiepilépticos tradicionales
Efecto de pre-tratamiento de BTDA en combinación con antiepilépticos convencionales sobre la generación de Status Epilepticus (SE).
Con el objetivo de evaluar la generación del SE tras la administración de los diferentes fármacos y combinaciones de fármacos empleadas en los registros extracelulares de potenciales de campo evocado, se realizó un pre-tratamiento de 3 días en animales control a los que se les inyectó i.p., una dosis diaria de las diferentes drogas (Vehículo, BTDA (1 OmM), BTDA (10mM) + LDCNA (100mM) y BTDA (10mM) + VPA (2mM)), induciendo al tercer día el SE a través del modelo de pilocarpina, agente epileptogénico. Para este fin en primer lugar se midió el tiempo de llegada a cada uno de los niveles de la escala de Racine (figura 9A y 9B) y en segundo lugar, se registró el número de crisis independientes que se produjo en cada animal al llegar a la etapa IV (Figura 9C) y etapa V (Figura 9D) de Racine para cada uno de los pre-tratamientos. Tras realizar estos experimentos se observó que los animales pre-tratados con BTDA mostraron un mayor tiempo (10 minutos más que el control aproximadamente) de llegada a cada uno de los estadios de la escala de Racine. Por otro lado, aquellos animales que fueron pre-tratados con la combinación de BTDA + VPA y ningún animal pre-tratado con la combinación de estas drogas alcanzó la etapa V. Para cuantificar el tiempo promedio de llegada a la etapa V, se determinó la droga que presentó un mayor tiempo de llegada a este nivel fue VPA por sí solo, con un promedio de 24,13 minutos. Sin embargo, los animales pre-tratados con la combinación de BTDA + VPA no experimentaron la llegada a la etapa V y por tanto no generaron la condición de SE. Respecto del número de eventos que se produjeron en las etapas IV y V, se determinó que todos los animales tratados con las diferentes drogas llegaron a la etapa IV, siendo la combinación de BTDA + VPA, el pre-tratamiento a que se le asoció mayor número de eventos para este nivel, con un promedio de 3,75. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, ningún animal pre-tratado con la combinación de estas drogas llegó a la etapa V.
Efecto de Pre-tratamientos sobre la sobrevivencia post-SE.
Se evaluó el porcentaje de sobrevivencia (Figura 10A) y la mortalidad promedio (Figura 10B) para cada droga o combinación de drogas. Este análisis se realizó durante 40 minutos post inyección i.p. de pilocarpina (380 mg / Kg). El fármaco que presentó menor tasa de supervivencia fue la combinación de BTDA + LDCNA con un 0% de animales vivos, a diferencia de lo observado al administrar BTDA + VPA que presentó un 100% de animales vivos (Figura 10A). Por otro lado, el tiempo promedio de muerte fue significativamente mayor al administrar el pre-tratamiento de BTDA, cuyo promedio fue 24,03 minutos (Figura 10B). Respecto de aquellos animales a los que se les administró un pre-tratamiento de LDCNA y BTDA + LDCNA, estos fueron los que mostraron un menor tiempo de fallecimiento, con 21 ,15 y 12,34 minutos, respectivamente (Figura 10B). Cabe notar que, como ningún animal sometido al pre- tratamiento de BTDA + VPA muere, para este caso el valor asignado es cero (Figura 1 0B).

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Uso combinado de bumetanlda con ácido valprolco o una de sus sales farmacéuticamente aceptables caracterizado porque sirve preparar un medicamento destinado al tratamiento de epilepsia refractarla.
2. Un método para restablecer la homeostasls de CI caracterizado porque comprende administrar bumetanlda en conjunto con ácido valprolco.
3. Un método para tratar epilepsia refractarla caracterizado porque comprende administrar bumetanlda en conjunto con ácido valprolco.
PCT/CL2018/050147 2017-12-28 2018-12-26 Uso combinado de bumetanida con ácido valproico o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en el tratamiento de epilepsia refractaria WO2019126894A1 (es)

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