WO2019107380A1 - 抗原結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a polypeptide comprising an antigen binding domain and a carrier moiety having a suppression domain which suppresses the antigen binding activity of the antigen binding domain, and having a longer half life than the antigen binding domain present alone, Production method and screening method, pharmaceutical composition containing the polypeptide, production method and screening method of single domain antibody whose antigen binding activity is suppressed by associating with specific VL / VH / VHH, and specific VL / VH
- the present invention relates to a library of fusion polypeptides including single domain antibodies whose antigen binding activity is suppressed by associating with / VHH.
- Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 2
- Non-patent Document 3 binds to antigens expressed in cancer cells, and exert their damaging activity on cancer cells by ADCC activity or the like. It is known that the cytotoxic activity due to the ADCC activity etc. depends on the number of antigens expressed in the target cells of the therapeutic antibody (Non-patent Document 4), so the expression amount of the target antigen is high It is preferable from the viewpoint of the effect of the therapeutic antibody.
- An antibody molecule that exerts such stronger cytotoxic activity can exert its cytotoxic activity against cancer cells that do not express much of the antigen, while it can also exert against normal tissues with low expression of the antigen. It exerts cytotoxic activity like cancer cells.
- cetuximab a naturally occurring human IgG1 for the EGFR antigen, EGFR-BiTE, a bispecific antibody for CD3 and EGFR, is a potent cell against cancer cells by recruiting T cells to the cancer cells It can exert its damaging activity and exert its antitumor effect.
- Non-patent Document 10 Since EGFR is also expressed in normal tissues, it is also recognized that serious side effects appear when EGFR-BiTE is administered to cynomolgus monkeys (Non-patent Document 10).
- bivatuzumab mertansine which is an ADC in which mertansine is conjugated to an antibody against CD44v6 highly expressed in cancer cells, causes serious skin toxicity and hepatotoxicity in the clinic because CD44v6 is also expressed in normal tissues. It is recognized (nonpatent literature 11).
- Non-patent Document 12 iprimumab, which enhances tumor immunity by inhibiting CTLA4, which contributes to immunosuppression in cancer, prolongs overall survival against metastatic melanoma.
- iprimumab inhibits CTLA4 systemically, tumor immunity is enhanced, but there is a problem that it shows serious side effects like autoimmune disease caused by immunity activation systemically.
- Non-patent Document 14 an antibody drug which exerts a therapeutic effect by inhibiting inflammatory cytokines in inflammatory and autoimmune diseases.
- Remicade or Humira that targets TNF, and Actemra that targets IL-6R exert high therapeutic effects on rheumatoid arthritis, while infection is achieved by neutralizing these cytokines systemically. It is also known that the side effect of the disease is seen (non-patent document 15).
- Non-patent Document 16 there are still few reports on techniques for enabling antibody drugs to specifically act on target tissues for solving the above-mentioned side effects.
- a masking peptide is linked to an antibody by a linker that is cleaved by a protease that is expressed at a lesion site such as cancer tissue or inflammatory tissue, thereby masking the antigen binding site of the antibody with the masking peptide.
- the inventors of the present invention conducted intensive studies and found that it comprises a carrier portion having an antigen binding domain and a suppression domain that suppresses the binding activity of the antigen binding domain, and has a longer half life than an antigen binding domain present alone. Created a polypeptide. By using the polypeptide, it is considered that the antigen binding activity of the antigen binding domain is restored in the diseased tissue, and the antigen binding activity can be exerted in the diseased tissue.
- the whole body of the antigen binding domain in an activated state Distribution can be suppressed.
- the present inventors have found that the polypeptide or a pharmaceutical composition containing the polypeptide is useful for treating a disease, and is useful for treating a disease including administering the polypeptide. And found that the polypeptide is useful in the manufacture of a medicament for treating a disease.
- the present inventors are screening methods and manufacturing methods of the polypeptide, methods of manufacturing and screening single-domain antibodies whose antigen binding activity is suppressed by associating with specific VL or VH or VHH, and specific methods.
- the present invention was completed by creating a library including single domain antibodies whose antigen binding activity is suppressed by associating with VL or VH or VHH.
- the protease cleavage sequence is a sequence shown in SEQ ID NOs: 12, 25, 34, 35, 70 to 73, 75, 76, 91, 168 to 178, 193 to 195, 833 to 852, 1062 to 1081, a table
- the antigen binding domain comprises a single domain antibody, the suppression domain of the delivery moiety is VHH, or antibody VH, or antibody VL, and the single domain antibody is the VHH, or antibody VH, or The polypeptide according to any one of (1) to (20), wherein the antigen binding activity is suppressed.
- the antigen binding domain comprises a single domain antibody, the suppression domain of the delivery moiety is VHH or antibody VH or antibody VL, and the single domain antibody is the VHH or antibody VH or antibody VL and The polypeptide according to any one of (1) to (21), wherein the antigen binding activity is suppressed by association.
- the single domain antibody is VHH or VH having a single domain and antigen binding activity, and the suppression domain of the transport moiety is an antibody VL, and the VHH or VH having an antigen binding activity in single domain is The polypeptide according to any one of (19) to (22), wherein the antigen binding activity is suppressed by associating with the antibody VL.
- the single domain antibody is VHH, and the VHH is at least one amino acid substitution selected from F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, L47W, T47W, or S47W (all Kabat numbering)
- the single domain antibody is VHH, and the VHH is 37V / 44G, 37V / 45L, 37V / 47W, 44G / 45L, 44G / 47W, 45L / 47W, 37V / 44G / 45L, 37V / 44G / 47W
- the poly according to any one of (19) to (23), comprising at least one set of amino acids selected from 37V / 45L / 47W, 44G / 45L / 47W, 37V / 44G / 45L / 47W (all Kabat numbering). peptide.
- the single domain antibody is VHH, and the VHH comprises at least one set of amino acid substitutions selected from F37V / R45L, F37V / G47W, R45L / G47W, and F37V / R45L / G47W (all Kabat numbering), 19)
- the single domain antibody is a single domain VL with antigen binding activity
- the suppression domain of the delivery part is an antibody VH
- the single domain VL with antigen binding activity is associated with the antibody VH
- the delivery moiety comprises an antibody constant region.
- the polypeptide according to (32), wherein the antibody constant region of the delivery moiety and the antigen binding domain are fused via a linker or not.
- the polypeptide is fused between the N-terminus of the antibody heavy chain constant region of the carrier and the C-terminus of the antigen binding domain via or without a linker, and further comprises a protease cleavage sequence
- the polypeptide is fused with the N-terminus of the antibody light chain constant region of the carrier moiety and the C-terminus of the antigen binding domain via or without a linker, and further has a protease cleavage sequence (35), wherein the protease cleavage sequence is located in the sequence of the antigen binding domain or on the antigen binding domain side from the amino acid 113 (EU numbering) (Kabat numbering 113) of the light chain antibody constant region, (35) The polypeptide described in 4.
- the antigen binding domain is a single domain antibody or VHH prepared from VH, and the protease cleavage sequence is the amino acid at position 109 (Kabat numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the antibody light chain constant.
- the antigen binding domain is a single domain antibody prepared from VL, and the protease cleavage sequence is amino acid number 104 (Kabat numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the antibody heavy chain constant region
- the polypeptide according to (40) which is located between amino acids 122 (EU numbering).
- the antigen binding domain is a single domain antibody prepared from VL, and the protease cleavage sequence is amino acid number 109 (Kabat numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the antibody light chain constant region
- the polypeptide according to (41) which is located between amino acids 113 (EU numbering) (Kabat numbering 113).
- the antigen binding domain is a single domain antibody
- the second antigen binding domain is a second single domain antibody
- the antigen binding domain and the second antigen binding domain can be released from the polypeptide (51), wherein the single domain antibody and the second single domain antibody form a bispecific antigen binding molecule in the free state of the antigen binding domain and the second antigen binding domain
- (51) The polypeptide described in 4.
- the polypeptide further comprises an antigen binding domain different from the antigen binding domain, and the antigen binding activity is suppressed by linking the other antigen binding domain to the carrier part of the polypeptide.
- a pharmaceutical composition comprising the polypeptide according to any one of (1) to (56).
- step (59) The following steps: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) forming a polypeptide precursor by linking the single domain antibody and the delivery moiety such that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a) is suppressed by the suppression domain of the delivery moiety ; (c) introducing a protease cleavage sequence into the polypeptide precursor;
- the manufacturing method as described in (58) including.
- step (60) The following steps: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) forming a polypeptide precursor by linking the single domain antibody and the delivery moiety such that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a) is suppressed by the suppression domain of the delivery moiety ; (c) introducing a protease cleavage sequence near the boundary between the single domain antibody and the carrier portion; The manufacturing method as described in (58) including.
- step (66) The following steps: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) (a) the single domain antibody is associated with VL as a substitute for the VH of the IgG antibody or the single domain antibody is conjugated to the IgG antibody so that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a) is suppressed Forming an IgG antibody-like molecule precursor into which said single domain antibody has been introduced by associating it with VH as a substitute for VL; (c) introducing a protease cleavage sequence near the boundary between the single domain antibody and the antibody constant region in the IgG antibody-like molecule precursor; (64) The manufacturing method as described in (64) including.
- (70) The following steps: (a) Substituting amino acid residues involved in association with antibody VH in a single domain antibody, or substituting amino acid residues involved in association with antibody VL in a single domain antibody, the single domain antibody Producing a modified single domain antibody that retains the binding activity of the target antigen to the target antigen; (b) by allowing the modified single domain antibody to associate with the antibody VH or causing the modified single domain antibody to associate with the antibody VL so as to suppress the antigen binding activity of the modified single domain antibody prepared in the step (a) Forming the IgG antibody-like molecule precursor into which the modified single domain antibody has been introduced; (c) introducing a protease cleavage sequence into the IgG antibody-like molecule precursor into which the modified single domain antibody has been introduced; (64) The manufacturing method as described in (64) including.
- (76) A vector comprising the polynucleotide according to (75).
- (77) A host cell comprising the polynucleotide of (75) or the vector of (76).
- (78) A method for producing the polypeptide according to any of (1) to (56), which comprises the step of culturing the host cell according to (77).
- (79) A method of screening a single domain antibody whose antigen binding activity is suppressed by associating with a specific VL, or associating with a specific VH, or by associating with a specific VHH.
- step (88) The following steps: (a) associating a single domain antibody with a specific VHH; (b) selecting an assembly of VHH and a single domain antibody in which the binding activity to the antigen of the single domain antibody associated with a specific VHH in the step (a) is absent or below a certain value; (c) Confirming that the binding activity of the single domain antibody in the assembly selected in step (b) to the antigen in the state of not being associated with the specific VHH is stronger than that at the time of association
- the step of The screening method as described in (86) including.
- (89) A method for producing a single domain antibody in which the antigen binding activity is suppressed by associating with a specific VL, or associating with a specific VH, or by associating with a specific VHH.
- (91) The following steps: (a) A step of substituting an amino acid residue involved in association with the antibody VL in a single domain antibody, and producing a modified single domain antibody that retains the binding activity of the single domain antibody to a target antigen; (90).
- step (98) Further following steps: (b) associating the modified single domain antibody prepared in step (a) with the VHH; (c) confirming that the antigen binding activity of the modified single domain antibody associated with the VHH is weakened or lost compared to before the association; The manufacturing method as described in (97) including.
- a library comprising a plurality of fusion polypeptides in which a single domain antibody and a first association support domain are linked, wherein the single domain antibody is suppressed in antigen binding activity by being associated with a specific VL or A single domain antibody which is lost, or a single domain antibody whose antigen binding activity is suppressed or lost by associating with a specific VH, or a single domain whose antigen binding activity is suppressed or lost by associating with a specific VHH Libraries, including antibodies.
- the single domain antibody portion of the fusion polypeptide in the library is a single domain antibody obtained from a camelid or a transgenic animal into which a gene capable of producing a single domain antibody has been introduced or a humanized antibody thereof, or a camelid
- a single domain antibody obtained by immunizing a transgenic animal into which an animal or a gene capable of producing a single domain antibody has been introduced, or a humanized antibody thereof, or a single domain artificially produced starting from a human antibody VH or VL The library according to (99), which comprises an antibody.
- a library comprising a plurality of fusion polypeptides in which a single domain antibody and a first association support domain are linked, wherein the single domain antibody is suppressed in antigen binding activity by being associated with a specific VL or The library according to (99) or (100), which comprises lost single domain antibodies.
- a library comprising a plurality of fusion polypeptides in which a single domain antibody and a first association support domain are linked, wherein the single domain antibody is suppressed in antigen binding activity by being associated with a specific VH or The library according to (99) or (100), which comprises lost single domain antibodies.
- a library comprising a plurality of fusion polypeptides in which a single domain antibody and a first association support domain are linked, wherein the single domain antibody suppresses antigen binding activity by being associated with a specific VHH or
- the library according to (99) or (100), which comprises lost single domain antibodies.
- a single domain antibody whose antigen binding activity is suppressed or lost by being associated with a specific VL, or an antigen binding activity by being associated with a specific VH
- a method of screening a fusion polypeptide comprising a single domain antibody in which the antibody is suppressed or lost, or a single domain antibody in which the antigen binding activity is suppressed or lost by association with a specific VHH.
- (113) A method of screening a fusion polypeptide containing a single domain antibody whose antigen binding activity is suppressed or lost by associating with a specific VH from the library described in (102).
- (114) The following steps: (a) displaying the fusion polypeptide of the library in vitro; (b) providing an association partner in which a specific VH and a second association support domain are fused; (c) The fusion polypeptide displayed in step (a) is associated with the association partner prepared in step (b), and the single domain antibody does not bind to the antigen in a state where the VH is associated, or the antigen binding activity is constant.
- step (d) From the fusion polypeptide selected in step (c), select a fusion polypeptide in which the single domain antibody contained therein does not associate with the above-mentioned VH and the antigen-binding activity is at least a certain value Process;
- the screening method as described in (113) including.
- the association partner prepared in step (b) further comprises a protease cleavage sequence, and in step (d), the association partner is cleaved by protease treatment to disassociate the single domain antibody and the VH. (114).
- the fusion polypeptide of the library further comprises a protease cleavage sequence, and in the step (d), the fusion polypeptide is cleaved by protease treatment to dissolve the VH association with the single domain antibody, (114) The screening method as described in.
- step (122) The following steps: (a) displaying the fusion polypeptide of the library in vitro; (b) providing an association partner in which a specific VHH and a second association support domain are fused; (c) The fusion polypeptide displayed in step (a) is associated with the association partner prepared in step (b), and the single domain antibody does not bind to the antigen in a state where the specific VHH is associated, or an antigen binding activity Selecting a fusion polypeptide having a value less than or equal to a predetermined value; (d) From the fusion polypeptides selected in step (c), select fusion polypeptides in which the single domain antibody contained and the VHH do not associate with each other, or the antigen binding activity is at least a certain value.
- the association partner prepared in the step (b) further comprises a protease cleavage sequence, and in the step (d), the association partner is cleaved by protease treatment to disassociate the single domain antibody and the VHH.
- the screening method according to (122) (124) The screening method according to (123), wherein the protease cleavage sequence of the association partner prepared in the step (b) is located near the boundary between the specific VHH and the second association support domain.
- the fusion polypeptide of the library further comprises a protease cleavage sequence, and in the step (d), the fusion polypeptide is cleaved by protease treatment to disassociate the single domain antibody and the VHH (122 The screening method as described in 4.).
- the screening method according to (125) wherein the protease cleavage sequence contained in the fusion polypeptide is located near the boundary between the single domain antibody and the first association support domain.
- step (d) the full length of the fusion polypeptide selected in the step (c) is displayed again in vitro, and the antigen is bound to the antigen only in association with the second association support domain, or antigen binding (122) the screening method according to (122), wherein a fusion polypeptide having an activity of a predetermined value or more is selected.
- the step of preparing the association partner in the step (b) is a step of simultaneously displaying the association partner and the fusion polypeptide, (106) to (112), (114) to (120), (122) The screening method according to any one of (128) to (128).
- the first association support domain comprises an IgG antibody CH1 domain
- the second association support domain comprises an antibody light chain constant region, (106) to (112), (114) to (120), (122) The screening method according to any one of (128) to (128).
- the first association support domain comprises an antibody light chain constant region
- the second association support domain comprises an IgG antibody CH1 domain, (106) to (112), (114) to (120), (122) The screening method according to any one of (128) to (128).
- step (133) The following steps: (a) displaying the fusion polypeptide of the library in vitro; (b) providing an association partner in which a specific VL and a second association support domain are fused; (c) selecting a fusion polypeptide in which the single domain antibody contained in the fusion polypeptide binds to an antigen, or the antigen binding activity is a predetermined value or more; (d) the fusion polypeptide selected in step (c) is associated with the association partner prepared in step (b), and the single domain antibody does not bind to the antigen in a state where the VL is associated, or the antigen binding activity is Selecting a fusion polypeptide that is below a certain value; (105), the screening method as described in (105).
- step (134) The screening method according to (129), wherein in step (d), the fusion polypeptide selected in step (c) is displayed again in vitro.
- step (c) the fusion polypeptide is associated with only the second association support domain, or a single fragment contained in the fusion polypeptide in the state where the fusion polypeptide is associated with only the second association support domain.
- step (136) The following steps: (a) displaying the fusion polypeptide of the library in vitro; (b) providing an association partner in which a specific VH and a second association support domain are fused; (c) selecting a fusion polypeptide in which the single domain antibody contained in the fusion polypeptide binds to an antigen, or the antigen binding activity is a predetermined value or more; (d) the fusion polypeptide selected in step (c) is associated with the association partner prepared in step (b), and the single domain antibody does not bind to the antigen in a state where the VH is associated, or the antigen binding activity is Selecting a fusion polypeptide that is below a certain value; The screening method as described in (113) including.
- step (137) The screening method according to (136), wherein in step (d), the fusion polypeptide selected in step (c) is displayed again in vitro.
- step (138) In the step (c), the fusion polypeptide is associated with only the second association support domain, or a single fragment contained in the fusion polypeptide in the state where the fusion polypeptide is associated with only the second association support domain.
- the screening method as described in (136) which confirms the antigen binding of a domain antibody.
- step (139) The following steps: (a) displaying the fusion polypeptide of the library in vitro; (b) providing an association partner in which a specific VHH and a second association support domain are fused; (c) selecting a fusion polypeptide in which the single domain antibody contained in the fusion polypeptide binds to an antigen, or the antigen binding activity is a predetermined value or more; (d) the fusion polypeptide selected in step (c) is associated with the association partner prepared in step (b), and the single domain antibody does not bind to the antigen in a state where the VHH is associated, or the antigen binding activity is Selecting a fusion polypeptide that is below a certain value; (121), the screening method as described in (121).
- step (140) The screening method according to (139), wherein in step (d), the fusion polypeptide selected in step (c) is displayed again in vitro.
- step (141) In the step (c), the fusion polypeptide is associated with only the second association support domain, or a single fragment contained in the fusion polypeptide in the state where the fusion polypeptide is associated with only the second association support domain.
- the screening method as described in (139) which confirms the antigen binding of a domain antibody.
- the step of associating the fusion polypeptide with the association partner in the step (d) is a step of simultaneously displaying the association partner and the fusion polypeptide, described in any of (133) to (141) Screening method.
- the invention can also encompass the embodiments specifically described in the following.
- a polypeptide wherein the polypeptide comprises an antigen binding domain and a carrier moiety, wherein the carrier moiety comprises a repression domain that suppresses the antigen binding activity of the antigen binding domain, the polypeptide comprises SEQ ID NO: A polypeptide having a protease cleavage sequence comprising one or more sequences selected from the sequences shown in Table 1 and the sequences shown in Table 1;
- B2 The suppression of the antigen-binding activity of the antigen-binding domain of the suppression domain in a state in which the protease cleavage sequence is cleaved by a protease is the same as that of the antigen-binding domain of the suppression domain in the uncleaved state of the protease cleavage sequence.
- the polypeptide according to (B1) which is weaker than suppression for antigen binding activity.
- B3 The polypeptide according to (B1) or (B2), wherein the antigen binding domain has a blood half life shorter than the carrier moiety.
- B4 The polypeptide according to any one of (B1) to (B3), wherein the molecular weight of the antigen binding domain is smaller than the molecular weight of the carrier moiety.
- B5 The polypeptide according to any one of (B1) to (B4), wherein the molecular weight of the antigen binding domain is 60 kDa or less.
- (B6) Any one of (B1) to (B5), wherein the delivery moiety has FcRn binding activity and the antigen binding domain has no FcRn binding activity or has weaker FcRn binding activity than the delivery moiety
- the polypeptide described in 4. (B7) The antigen binding domain is releasable from the polypeptide, and the antigen binding domain is free from the polypeptide. The antigen binding activity is not released from the polypeptide.
- (B8) The polypeptide according to any one of (B1) to (B7), wherein the antigen binding activity of the antigen binding domain is suppressed by the association of the antigen binding domain and the suppression domain of the carrier moiety. .
- (B9) The polypeptide according to (B7), wherein the protease cleavage sequence is cleaved by a protease to release the antigen binding domain from the polypeptide.
- B10 The polypeptide according to (B8), wherein the protease cleavage sequence is cleaved by a protease to disassociate the antigen binding domain and the suppression domain of the transport moiety.
- (B17) The polypeptide according to (B15) or (B16), wherein a second movable linker is further added to the other end of the protease cleavage sequence.
- (B18) The polypeptide according to (B17), wherein the second movable linker is a movable linker consisting of a glycine-serine polymer.
- (B19) Any of (B1) to (B18), wherein the antigen binding domain comprises a single domain antibody or is a single domain antibody, and the suppression domain of the delivery portion suppresses the antigen binding activity of the single domain antibody. Or the polypeptide according to one.
- the antigen binding domain comprises a single domain antibody, the suppression domain of the delivery moiety is VHH, or antibody VH, or antibody VL, and the single domain antibody is said VHH, or antibody VH, or antibody VL and The polypeptide according to any one of (B1) to (B21), wherein the antigen binding activity is suppressed by association.
- the single domain antibody is VHH, or VH having a single domain and antigen binding activity
- the suppression domain of the transport moiety is an antibody VL
- the VHH or VH having an antigen binding activity of single domain is The polypeptide according to any one of (B19) to (B22), in which antigen binding activity is suppressed by associating with the antibody VL.
- the single domain antibody is VHH, and the VHH is amino acid substituted at at least one position selected from amino acids 37, 44, 45, or 47 (all Kabat numbering) (B19) 2.) The polypeptide according to any one of (B23). (B25) Any one of (B19) to (B23), wherein the single domain antibody is VHH, and the VHH contains at least one amino acid selected from amino acids of 37V, 44G, 45L, or 47W (all Kabat numbering) The polypeptide described in one.
- the single domain antibody is VHH, and the VHH is at least one amino acid substitution selected from F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, L47W, T47W, or S47W (all Kabat numbering)
- the polypeptide according to any one of (B19) to (B23), comprising two amino acid substitutions.
- the single domain antibody is VHH, and the VHHs are 37/44, 37/45, 37/47, 44/45, 44/47, 45/47.
- the single domain antibody is VHH, and the VHH is 37V / 44G, 37V / 45L, 37V / 47W, 44G / 45L, 44G / 47W, 45L / 47W, 37V / 44G / 45L, 37V / 44G / 47W , At least one set of amino acids selected from 37V / 45L / 47W, 44G / 45L / 47W, 37V / 44G / 45L / 47W (all Kabat numbering), described in any one of (B19) to (B23) Polypeptide.
- the single domain antibody is VHH, and the VHH contains at least one set of amino acid substitutions selected from F37V / R45L, F37V / G47W, R45L / G47W, and F37V / R45L / G47W (all Kabat numbering), The polypeptide according to any one of B19) to (B23).
- the single domain antibody is a single domain VL with antigen binding activity
- the suppression domain of the delivery part is an antibody VH
- the single domain VL with antigen binding activity is associated with the antibody VH
- the polypeptide according to any one of (B19) to (B22), wherein the antigen binding activity is suppressed by (B31)
- B32 The polypeptide according to any one of (B1) to (B31), wherein the delivery moiety comprises an antibody constant region.
- the polypeptide is fused with the N-terminus of the antibody heavy chain constant region of the transport moiety and the C-terminus of the antigen binding domain via a linker or not via a linker, and the protease cleavage sequence comprises The polypeptide according to (B34), which is located closer to the antigen binding domain than the amino acid at position 122 (EU numbering) of the heavy chain antibody constant region or in the sequence of the antigen binding domain.
- the polypeptide is fused with the N-terminus of the antibody light chain constant region of the transport moiety and the C-terminus of the antigen binding domain via a linker or not via a linker, and the protease cleavage sequence comprises The polypeptide according to (B35), which is located closer to the antigen binding domain from the amino acid of the light chain antibody constant region (amino acid number 113 (EU numbering) (Kabat numbering 113)) in the sequence of the antigen binding domain.
- polypeptide is fused with the N-terminus of the antibody constant region of the carrier moiety and the C-terminus of the antigen binding domain via or without a linker, and the antigen binding domain is prepared from VH A single domain antibody or VHH, and the protease cleavage sequence is located within the sequence of the antibody constant region, or closer to the antibody constant region than the amino acid at position 109 (Kabat numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain.
- the polypeptide as described in any one of (B33) to (B36).
- the polypeptide is fused with the N-terminus of the antibody light chain constant region of the carrier moiety and the C-terminus of the antigen binding domain via a linker or without a linker, and the protease cleavage sequence comprises The polypeptide according to (B35), which is located near the boundary between the antigen binding domain and the antibody light chain constant region.
- the antigen binding domain is a single domain antibody or VHH prepared from VH, and the protease cleavage sequence is amino acid number 109 (Kabat numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the antibody heavy chain constant.
- the polypeptide according to (B40) which is located between amino acids 122 (EU numbering) of the region.
- the antigen binding domain is a single domain antibody or VHH prepared from VH, and the protease cleavage sequence is an amino acid at position 109 (Kabat numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the antibody light chain constant.
- the antigen binding domain is a single domain antibody prepared from VL, and the protease cleavage sequence is amino acid 104 (Kabat numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the antibody heavy chain constant region
- the antigen binding domain is a single domain antibody prepared from VL, and the protease cleavage sequence is amino acid number 109 (Kabat numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the antibody light chain constant region
- (B46) The polypeptide according to any one of (B32) to (B45), wherein the antibody constant region of the polypeptide is an IgG antibody constant region.
- (B47) The polypeptide according to any one of (B1) to (B46), wherein the polypeptide is an IgG antibody-like molecule.
- (B48) In the state where the antigen binding domain is not released, when measurement is performed using BLI (Bio-Layer Interferometry) method (Octet), no binding between the antigen binding domain and the antigen is observed, from (B1) to (B1) The polypeptide according to any one of B47).
- BLI Bio-Layer Interferometry
- (B49) The polypeptide according to any one of (B1) to (B48), wherein a second antigen binding domain is further linked to the antigen binding domain.
- (B50) The polypeptide according to (B49), wherein the second antigen binding domain has antigen binding specificity different from that of the antigen binding domain.
- (B51) The polypeptide according to (B49) or (B50), wherein the second antigen binding domain comprises a second single domain antibody.
- the antigen binding domain is a single domain antibody
- the second antigen binding domain is a second single domain antibody
- the antigen binding domain and the second antigen binding domain can be released from the polypeptide (B51) in which the single domain antibody and the second single domain antibody form a bispecific antigen binding molecule in the free state of the antigen binding domain and the second antigen binding domain, The polypeptide described in 4.
- the polypeptide further comprises an antigen binding domain other than the antigen binding domain, and the antigen binding activity is suppressed by linking the other antigen binding domain to the carrier part of the polypeptide.
- B55 The polypeptide according to (B54), which has different antigen binding specificity from the another antigen binding domain and the antigen binding domain.
- B56 The polypeptide according to any one of (B1) to (B55), wherein the antigen binding domain is an antigen binding domain that targets Plexin A1, IL-6R or CD3 as a target antigen.
- a pharmaceutical composition comprising the polypeptide according to any one of (B1) to (B56).
- (B58) A method for producing the polypeptide according to any one of (B1) to (B56). (B59) The following steps: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) forming a polypeptide precursor by linking the single domain antibody and the delivery moiety such that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a) is suppressed by the suppression domain of the delivery moiety ; (c) introducing a protease cleavage sequence into the polypeptide precursor; The manufacturing method as described in (B58) including.
- step (B60) The following steps: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) forming a polypeptide precursor by linking the single domain antibody and the delivery moiety such that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a) is suppressed by the suppression domain of the delivery moiety ; (c) A protease cleavage sequence comprising one or more sequences selected from the sequences shown in SEQ ID NOS: 833 to 852 and 1062 to 1081 and the sequences described in Table 1 near the boundary between the single domain antibody and the carrier portion Introducing process; The manufacturing method as described in (B58) including.
- (B61) The following steps: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) Sequences shown by SEQ ID NOS: 833 to 852, 1062 to 1081 such that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in the step (a) is suppressed by the suppression domain of the carrier moiety Linking to the transport moiety via a protease cleavage sequence comprising one or more sequences selected from the sequences set forth in Table 1 to form a polypeptide; The manufacturing method as described in (B58) including.
- (B62) The following steps: (d) confirming that the binding activity of the single domain antibody incorporated into the polypeptide or the polypeptide precursor to the target antigen is weakened or lost; And the method according to any one of (B59) to (B61). (B63) Further the following steps: (e) releasing the single domain antibody by cleaving the protease cleavage sequence with a protease, and confirming that the free single domain antibody binds to an antigen; And the method according to any one of (B59) to (B62). (B64) The method according to (B58), wherein the polypeptide is an IgG antibody-like molecule.
- step (B65) The following steps: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) (a) the single domain antibody is associated with VL as a substitute for the VH of the IgG antibody or the single domain antibody is conjugated to the IgG antibody so that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a) is suppressed Forming an IgG antibody-like molecule precursor into which said single domain antibody has been introduced by associating it with VH as a substitute for VL; (c) A protease comprising one or more sequences selected from the sequences shown in SEQ ID NOS: 833 to 852 and 1062 to 1081 and sequences listed in Table 1 in the IgG antibody-like molecule precursor into which the single domain antibody has been introduced.
- step (B66) The following steps: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) (a) the single domain antibody is associated with VL as a substitute for the VH of the IgG antibody or the single domain antibody is conjugated to the IgG antibody so that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a) is suppressed Forming an IgG antibody-like molecule precursor into which said single domain antibody has been introduced by associating it with VH as a substitute for VL; (c) The sequence shown in SEQ ID NOS: 833 to 852, 1062 to 1081, and a sequence selected from the sequences shown in Table 1 near the boundary between the single domain antibody and the antibody constant region in the IgG antibody-like molecule precursor Introducing a protease cleavage sequence comprising one or more of And the method according to (B64).
- (B68) The following steps: (d) confirming that the binding activity to the target antigen of the single domain antibody introduced into the IgG antibody-like molecule or the precursor of the IgG antibody-like molecule is weakened or lost; And the method according to any one of (B65) to (B67). (B69) Further following steps: (e) releasing the single domain antibody by cleaving the protease cleavage sequence with a protease, and confirming that the free single domain antibody binds to the target antigen; And the method according to any one of (B65) to (B68).
- a cell-free translation system (Clover Direct (Protein Express)) or the like in which a tRNA in which a nonnatural amino acid is bound to a complementary amber suppressor tRNA complementary to UAG codon (amber codon) which is one of stop codons is also preferably used.
- alterations include, but are not limited to, substitutions.
- amino acids 37, 45 and / or 47 are substituted includes variations of the following amino acid alterations; (a) 37, (b) 45, (c) 47, (d) 37 and 45, (e) 37 and 47, (f) 45 and 47, (g) 37 And 45 and 47.
- a representation representing amino acid modification a representation in which the one-letter code or the three-letter code of the amino acid before and after modification may be used appropriately before and after a number representing a specific position.
- the modification of F37V or Phe37Val used in adding amino acid substitutions contained in antibody variable regions or single domain antibodies represents substitution of Phe at position 37 with Val, which is represented by Kabat numbering. That is, the numbers indicate the position of the amino acid represented by Kabat numbering, and the one-letter code or three-letter code of the amino acid described earlier is the amino acid before substitution, the one letter code of the amino acid described thereafter or 3
- the letter code represents the amino acid after substitution.
- full-length antibody full-length antibody
- full antibody full antibody
- all antibody are used interchangeably herein and have a structure substantially similar to a naturally occurring antibody structure or as defined herein Antibody having a heavy chain containing an Fc region thereof.
- 262 732-745 (1996)); (d) HVR amino acid residues 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49 A combination of (a), (b), and / or (c), including -65 (H2), 93-102 (H3), and 94-102 (H3).
- the CDRs of the single domain antibody illustratively include: (a) Hypervariable loops occurring at amino acid residues 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2), and 91-96 (CDR3) (Chothia and Lesk, J. MoI. Biol. 196: 901-917 ( 1987)); (b) CDRs occurring at amino acid residues 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) and 89-97 (CDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.
- variable region or “constant domain” refer to portions other than the variable region of an antibody.
- an IgG antibody is an approximately 150,000 dalton heterotetrameric glycoprotein composed of two identical light chains and two identical heavy chains that are disulfide linked, from the N-terminus to the C-terminus, Each heavy chain has a variable region (VH), also referred to as a variable heavy chain domain or a heavy chain variable domain, followed by a heavy chain constant region (CH) comprising a CH1 domain, a hinge region, a CH2 domain and a CH3 domain.
- VH variable region
- CH heavy chain constant region
- each light chain has a variable region (VL), also referred to as variable light chain domain or light chain variable domain, followed by a constant light chain (CL) domain.
- VL variable region
- CL constant light chain
- the light chain of a naturally occurring antibody may be assigned to one of two types, called kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ), based on the amino acid sequence of its constant domain.
- the "antigen binding domain” is limited only by binding to the target antigen.
- domains of any structure can be used as long as they bind to the target antigen. Examples of such domains include, but are not limited to, for example, antibody heavy chain variable region (VH) and antibody light chain variable region (VL), single domain antibody (sdAb), in vivo A module called A domain of about 35 amino acids contained in the cell membrane protein Avimer (WO 2004/044011, WO 2005/040229), a 10Fn3 domain which is a domain that binds to a protein in fibronectin, a glycoprotein expressed on the cell membrane Adfectin (International Publication WO 2002/032925), Affibody (as International Publication WO 1995/001937) whose scaffold is an IgG binding domain that constitutes a bundle of three amino acids consisting of 58 amino acids of Protein A (International Publication WO 1995/001937), a turn containing 33 amino acid residues Molecular Table of Ankyr
- One suitable example of the antigen binding domain of the present invention is a single domain antibody (sdAb).
- single domain antibodies include, but are not limited to, all or part of an antigen binding molecule that inherently lacks a light chain, such as, for example, a camelid VHH, a shark V NAR , or a VH domain of an antibody Or antibody fragments that contain all or part of the VL domain.
- single domain antibodies which are antibody fragments comprising all or part of the VH / VL domain of antibodies include, but are not limited to, human antibodies VH or human antibodies as described, for example, in US Patent No. 6,248, 516 B1 etc.
- An artificially produced single domain antibody starting from VL can be mentioned.
- one single domain antibody has 3 CDRs (CDR1, CDR2 and CDR3).
- Single domain antibodies can be obtained from animals capable of producing single domain antibodies or by immunizing animals capable of producing single domain antibodies.
- animals that can produce single domain antibodies include, but are not limited to, camelids, transgenic animals into which genes capable of producing single domain antibodies have been introduced.
- the camelids include camels, llamas, alpaca, camel and guanaco and the like.
- transgenic animals into which a gene capable of producing a single domain antibody has been introduced include, but are not limited to, transgenic animals described in International Publication WO 2015/143414 and US Patent Publication US 2011/0123527 A1.
- Humanized single domain antibodies can also be obtained by using the framework sequences of single domain antibodies obtained from animals as human germline sequences or sequences similar thereto.
- Humanized single domain antibodies are also an embodiment of single domain antibodies of the invention.
- “Humanized single domain antibody” refers to a chimeric single domain antibody that comprises amino acid residues from non-human CDRs and amino acid residues from human FR.
- the humanized single domain antibody has all or substantially all of the CDRs correspond to those of non-human antibodies, and all or substantially all of the FRs correspond to those of human antibodies.
- substantially all of the FRs are considered as an example corresponding to those of human antibodies, even if some of the residues in the FRs do not correspond to those of human antibodies.
- single domain antibodies can be obtained from polypeptide libraries containing single domain antibodies by ELISA, panning and the like.
- Antigens include the following molecules: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-keto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, A1 adenosine receptor, A33, ACE, ACE-2, Activin, activin A, activin AB, activin B, activin C, activin RIA, activin RIA ALK-2, activin RIB ALK-4, activin RIIA, activin RIIB, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17 / TACE, ADAM8, ADAM9 , ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, addressin, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alpha-1-antitrypsin, alpha-V / beta-1 antagonist, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ , APP, APRIL, AR, ARC, ART, Artemin, Anti-Id, AS
- T cell receptor eg, T cell receptor alpha / beta
- TdT TECK
- TEM1 TEM5, TEM7, TEM8, TERT
- testicular PLAP-like alkaline phosphatase TfR, TGF, TGF-alpha, TGF-beta, TGF-beta Pan Specific, TGF-beta RI (ALK-5), TGF-beta RII, TGF-beta RIIb, TGF-beta RIII, TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, TGF-beta 4 TGF-beta5, thrombin, thymus Ck-1, thyroid stimulating hormone, Tie, TIMP, TIQ, tissue factor, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, alpha, TNF-alpha, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2
- receptors are also described in the above-mentioned examples of antigens, these receptors may also be used as antigens to which the antigen binding domain of the present invention binds, when they exist in soluble form in biological fluid.
- soluble receptors soluble IL-6R as described, for example, by Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968).
- SEQ ID NO: 35 a protein represented by SEQ ID NO: 35 can be exemplified.
- the soluble molecule is not limited to the solution in which the soluble molecule is present, and the soluble molecule may be present in the biological fluid, that is, in all the fluids filling the vessels or tissues / cells in the living body.
- a soluble molecule to which the antigen binding domain of the invention binds may be present in the extracellular fluid.
- Extracellular fluid refers to components in bone and cartilage such as plasma, interstitial fluid, lymph fluid, dense connective tissue, cerebrospinal fluid, spinal fluid, puncture fluid, or synovial fluid in vertebrates, alveolar fluid (bronchopulmonary fluid) Cell-permeating fluid such as alveolar lavage fluid, ascites fluid, pleural fluid, pericardial fluid, cyst fluid, or aqueous humor (aqueous humor) fluid in various glandular cavities resulting from active transport and secretory activity of cells, and digestive tract cavity Generic term for other body cavity fluid).
- alveolar fluid bronchopulmonary fluid
- Cell-permeating fluid such as alveolar lavage fluid, ascites fluid, pleural fluid, pericardial fluid, cyst fluid, or aqueous humor (aqueous humor) fluid in various glandular cavities resulting from active transport and secretory activity of cells, and digestive tract cavity Generic term for other body cavity fluid).
- an epitope meaning an antigenic determinant present in an antigen means a site on the antigen to which the antigen binding domain disclosed herein binds.
- an epitope can be defined by its structure.
- the epitope can also be defined by the binding activity to the antigen in the antigen binding domain that recognizes the epitope.
- the antigen is a peptide or a polypeptide
- the epitope is a sugar chain, it is also possible to specify the epitope by a specific sugar chain structure.
- a conformational epitope in contrast to a linear epitope, is an epitope in which the primary sequence of amino acids comprising the epitope is not a single defined component of the recognized epitope (eg, an antibody wherein the primary sequence of amino acids necessarily defines the epitope)
- An epitope not recognized by A conformational epitope may encompass an increased number of amino acids relative to a linear epitope.
- the antigen binding domain recognizes the three dimensional structure of the peptide or protein. For example, if the protein molecule folds to form a three-dimensional structure, certain amino acids and / or polypeptide backbones that form a steric epitope will be juxtaposed to allow the antibody to recognize the epitope.
- the structure of the antigen binding domain that binds to the epitope is called the paratope.
- the epitope and paratope are stably bound by the hydrogen bond, electrostatic force, van der Waals force, hydrophobic bond, etc. acting between the epitope and the paratope.
- the avidity between this epitope and the paratope is called affinity.
- the sum of avidity when a plurality of antigens and a plurality of antigen binding domains bind is called avidity.
- avidity is higher than the affinity, because the affinities work synergistically.
- Examples of the method for confirming the binding to an epitope by an antigen binding domain to IL-6R or a polypeptide containing the antigen binding domain are exemplified below, but an antigen binding domain to an antigen other than IL-6R or a poly comprising an antigen binding domain is exemplified.
- the method of confirming the binding of the peptide to the epitope can also be appropriately carried out according to the following example.
- the binding activity of the antigen binding domain to the peptide can be evaluated by ELISA using the immobilized linear peptide as an antigen.
- the binding activity to a linear peptide can be revealed based on the level of inhibition by the linear peptide in the binding of the antigen binding domain to IL-6R expressing cells. These tests can reveal the binding activity of the antigen binding domain to linear peptides.
- the antigen binding domain to IL-6R recognizes a steric epitope.
- cells expressing IL-6R are prepared.
- the antigen binding domain for IL-6R binds strongly to IL-6R-expressing cells when in contact with the cells, while the antigen binding domain consists of an amino acid sequence constituting the extracellular domain of IL-6R immobilized
- the present invention is substantially directed to a linear peptide, or to a linear peptide consisting of an amino acid sequence in which the antigen binding domain is composed of the extracellular domain of IL-6R denatured using a general denaturing agent such as guanidine or the like. And the like.
- substantially non-binding refers to a binding activity of 80% or less, usually 50% or less, preferably 30% or less, particularly preferably 15% or less, of binding activity to human IL-6R-expressing cells.
- the association rate (kon) and the dissociation rate (koff) are calculated by simultaneously fitting the sensorgrams of association and dissociation using a simple one-to-one Langmuir binding model (BIACORE® evaluation software version 3.2) Ru.
- the equilibrium dissociation constant (Kd) is calculated as the koff / kon ratio.
- the antigen binding activity of the antigen binding domain can also be measured by a known method of measuring intermolecular interaction such as electrochemiluminescence.
- a method for measuring the binding activity of the antigen binding domain to IL-6R to IL-6R-expressing cells for example, the method described in Antibodies A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420) Can be mentioned. That is, it can be evaluated by the principle of ELISA or FACS (fluorescence activated cell sorting) using IL-6R expressing cells as an antigen.
- the following method may be mentioned as an example of a preferred method of measuring the binding activity of an antigen binding domain to IL-6R to an antigen.
- the cells are stained with a FITC-labeled secondary antibody that recognizes a test antigen binding domain reacted with cells expressing IL-6R.
- the antigen binding domain is adjusted to a desired concentration and used by diluting the test antigen binding domain with an appropriate buffer. For example, it can be used at any concentration between 10 ⁇ g / ml and 10 ng / ml.
- the fluorescence intensity and the number of cells are measured by FACSCalibur (BD).
- the binding amount of the antigen binding domain to the cells is reflected in the fluorescence intensity obtained by analysis using CELL QUEST Software (BD), that is, the value of Geometric Mean. That is, by obtaining the value of the Geometric Mean, the binding activity of the test antigen binding domain represented by the binding amount of the test antigen binding domain can be measured.
- BD CELL QUEST Software
- antigen binding domain for IL-6R shares an epitope with an antigen binding domain can be confirmed by competition for the same epitope of both. Competition between antigen binding domains is detected, such as by cross-blocking assays.
- a competitive ELISA assay is a preferred cross blocking assay.
- a test antigen is tested after the IL-6R protein coated on the wells of a microtiter plate is pre-incubated in the presence or absence of a candidate competing antigen binding domain. Binding domain is added.
- the amount of test antigen binding domain bound to the IL-6R protein in the wells is indirectly correlated to the binding ability of the candidate competing antigen binding domain to compete for binding to the same epitope. That is, the greater the affinity of the competitor antigen binding domain for the same epitope, the lower the binding activity of the test antigen binding domain to the well coated with IL-6R protein.
- the amount of test antigen binding domain bound to the wells via the IL-6R protein can be easily measured by pre-labeling the antigen binding domain.
- a biotin labeled antigen binding domain is measured by using an avidin peroxidase conjugate and a suitable substrate.
- Cross-blocking assays utilizing enzyme labels such as peroxidase are particularly referred to as competitive ELISA assays.
- the antigen binding domain can be labeled with another labeled substance that can be detected or measured. Specifically, radiolabels or fluorescent labels are known.
- the competitive antigen binding domain has at least 20%, preferably at least 20%, binding of the antigen binding domain to the IL-6R as compared to the binding activity obtained in a control test performed in the absence of the candidate competitive antigen binding domain.
- the sharing of the epitope between the test antigen binding domain and the control antigen binding domain results in amino acid mutations in the peptide constituting the epitope. It can be evaluated by comparing the binding activities of both antigen binding domains to the introduced peptide or polypeptide.
- the test antigen binding domain and the control antigen binding domain share the epitope can be evaluated by the following method.
- cells expressing IL-6R and cells expressing IL-6R in which a mutation has been introduced into an epitope are prepared.
- the test antigen binding domain and the control antigen binding domain are added to a cell suspension in which these cells are suspended in a suitable buffer such as PBS.
- FITC-labeled antibody capable of recognizing the test antigen binding domain and the control antigen binding domain is added to the cell suspension, which is appropriately washed with buffer.
- the fluorescence intensity and cell number of the cells stained by the labeled antibody are measured by FACSCalibur (BD).
- the concentrations of the test antigen binding domain and the control antigen binding domain are adjusted to the desired concentration by appropriate dilution with a suitable buffer and used. For example, it is used at any concentration between 10 ⁇ g / ml and 10 ng / ml.
- the binding amount of the labeled antibody to the cells is reflected in the fluorescence intensity obtained by analysis using CELL QUEST Software (BD), that is, the value of Geometric Mean. That is, by obtaining the value of the Geometric Mean, it is possible to measure the binding activity of the test antigen binding domain represented by the binding amount of the labeled antibody and the control antigen binding domain.
- BD CELL QUEST Software
- “not substantially bound to a mutant IL-6R-expressing cell” can be determined by the following method. First, the test antigen binding domain and the control antigen binding domain bound to cells expressing mutant IL-6R are stained with a labeled antibody. The fluorescence intensity of the cells is then detected. When FACSCalibur is used as flow cytometry for fluorescence detection, the fluorescence intensity obtained can be analyzed using CELL QUEST Software. By calculating this comparison value ( ⁇ Geo-Mean) from the value of Geometric Mean in the presence and absence of the polypeptide complex based on the following equation 1, the percentage increase in fluorescence intensity due to the binding of the antigen binding domain You can ask for
- the term "carrying moiety” refers to a moiety other than an antigen binding domain in a polypeptide.
- the delivery moiety of the present invention is usually a peptide or polypeptide composed of amino acids, and in a specific embodiment, the delivery moiety in the polypeptide is linked to the antigen binding domain via a cleavage site.
- the delivery moiety of the present invention may be a series of peptides or polypeptides linked by amide bonds, and a plurality of peptides or polypeptides may be noncovalently linked such as covalent bonds such as disulfide bonds or hydrogen bonds, hydrophobic interactions, etc. It may be a complex formed by binding.
- the delivery moiety of the present invention has a repressing domain that represses the antigen binding activity of the antigen binding domain.
- the term "repression domain” is limited only by suppressing the antigen binding activity of the antigen binding domain.
- the suppression domain domains of any structure can be used as long as they can suppress the antigen binding activity of the antigen binding domain. Examples of such repression domains include, but are not limited to, for example, the heavy chain variable domain (VH) of the antibody, the light chain variable domain (VL) of the antibody, pre-B cell receptors, and single domain antibodies.
- VH heavy chain variable domain
- VL light chain variable domain
- pre-B cell receptors pre-B cell receptors
- single domain antibodies Be The suppression domain may be comprised of all of the delivery portion or may be comprised of part of the delivery portion.
- release of the antigen binding domain from the polypeptide results in higher antigen binding activity than before release.
- the antigen binding domain is not released from the polypeptide, its antigen binding activity is suppressed by the repression domain.
- FACS fluorescence activated cell sorting
- ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
- ECL electrogenerated chemiluminescence
- SPR There are methods such as (Surface Plasmon Resonance, surface plasmon resonance) method (Biacore), BLI (Bio-Layer Interferometry) method (Octet) and the like.
- the antigen binding activity in the state in which the antigen binding domain is released from the polypeptide is two-fold, three times that in the state in which the antigen binding domain is not released from the polypeptide. Double, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times,
- the value is 200 times, 300 times, 400 times, 500 times, 600 times, 700 times, 800 times, 900 times, 1000 times, 2000 times, or 3000 times or more.
- the antigen binding domain prior to release comprises an antigen binding domain and an antigen binding domain when measuring the antigen binding activity of the antigen binding domain in one of the methods selected from among the methods described above. No binding to antigen is seen.
- cleavage of the cleavage site allows the antigen binding domain to be released from the polypeptide, so comparisons of antigen binding activity in such embodiments can be made by comparing the antigens before and after cleavage of the polypeptide. It can be performed by comparing the binding activity.
- the antigen binding activity measured using the polypeptide after cleavage is twice, three times, four times, five times, six times, 7 times, as compared to the antigen binding activity measured using an uncleaved polypeptide.
- the value is 600 times, 700 times, 800 times, 900 times, 1000 times, 2000 times, or 3000 times or more.
- the uncleaved polypeptide shows no binding between the antigen binding domain and the antigen when the antigen binding activity is measured by one of the methods selected from the above methods. .
- the cleavage site is cleaved by a protease, so comparison of antigen binding activity in such embodiments may be performed by comparing the antigen binding activity before and after protease treatment of the polypeptide. it can. That is, the antigen binding activity measured using the polypeptide after protease treatment is twice, three times, four times, five times, as compared to the antigen binding activity measured using a polypeptide not treated with protease.
- the protease-untreated polypeptide is found to have a binding between the antigen binding domain and the antigen when the antigen binding activity is measured by one of the methods selected from the above methods. Absent.
- a polypeptide comprising an antigen binding domain and a carrier moiety has a longer blood half life, as compared to the antigen binding domain present alone.
- the delivery moiety is designed to have a longer blood half life.
- the molecular weight of the transport moiety is large, or the transport moiety has FcRn binding properties, or the transport moiety has albumin binding properties Or carrying moiety is PEGylated.
- the delivery moiety has a longer blood half life (in other words, the antigen binding domain has a shorter blood half life than the delivery moiety) than the antigen binding domain.
- One embodiment of increasing the blood half-life of the delivery moiety is that the delivery molecule has a high molecular weight. In one embodiment of increasing the blood half-life of the delivery moiety longer than that of the antigen binding domain, the molecular weight of the delivery moiety is greater than that of the antigen binding domain.
- One embodiment of extending the blood half-life of the delivery moiety is to allow the delivery moiety to have FcRn binding properties.
- the FcRn binding region refers to a region having binding to FcRn, and any structure can be used as long as it has binding to FcRn.
- the delivery moiety comprising the FcRn binding region is capable of being returned to plasma again after being taken up into cells by the salvage pathway of FcRn.
- the relatively long retention (slow elimination) of IgG molecules in plasma is due to the function of FcRn, which is known as a salvage receptor of IgG molecules.
- IgG molecules incorporated into endosomes by pinocytosis bind to FcRn expressed in endosomes under acidic conditions in endosomes. IgG molecules that can not bind to FcRn proceed to lysosomes and are degraded there, but IgG molecules bound to FcRn translocate to the cell surface and return to plasma by dissociating from FcRn under neutral conditions in plasma. .
- the FcRn binding region is preferably a region that directly binds to FcRn. As a preferred example of the FcRn binding region, the Fc region of an antibody can be mentioned.
- the FcRn binding region in the present invention May be a region that binds to a polypeptide capable of binding to such FcRn.
- the binding activity of the FcRn-binding region of the present invention to FcRn, particularly human FcRn can be measured by methods known to those skilled in the art as described in the aforementioned section on binding activity, and the conditions for the conditions are described by those skilled in the art. Can be determined appropriately.
- the binding activity to human FcRn may be KD (Dissociation constant: dissociation constant), apparent KD (Apparent dissociation constant: apparent dissociation constant), dissociation rate kd (Dissociation rate: dissociation rate), or apparent kd (Apparent) dissociation: apparent dissociation rate) and the like. These can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, Biacore (GE healthcare), Scatchard plots, flow cytometers, etc. may be used.
- Conditions for measuring the binding activity of the FcRn binding region to FcRn can be appropriately selected by those skilled in the art, and are not particularly limited. For example, it can be measured in MES buffer, 37 ° C. conditions as described in WO 2009/125825.
- the binding activity of the FcRn binding region of the present invention to FcRn can be measured by methods known to those skilled in the art, and can be measured, for example, using Biacore (GE Healthcare) or the like.
- Measurement of FcRn binding region and FcRn binding activity can be carried out by using an FcRn binding region or a carrier moiety containing an FcRn binding region or a chip on which FcRn is immobilized, using a carrier moiety containing an FcRn or FcRn binding region or an FcRn binding region as an analyte It can be evaluated by pouring.
- the binding affinity of the FcRn binding region to FcRn may be evaluated at any pH of pH 4.0 to pH 6.5.
- a pH of pH 5.8 to pH 6.0 close to the pH in early endosomes in vivo is used.
- the binding affinity of the FcRn binding region to FcRn may be evaluated at any temperature of 10 ° C. to 50 ° C.
- a temperature of 15 ° C. to 40 ° C. is used to determine the binding affinity of the FcRn binding region to human FcRn. More preferably, from 20 ° C. to 35 ° C.
- any temperature is used to determine the binding affinity of the FcRn binding region to FcRn.
- a temperature of 25 ° C. is a non-limiting example of an embodiment of the present invention.
- an FcRn binding region includes, but is not limited to, for example, an IgG antibody Fc region.
- the Fc region of an IgG antibody the type is not limited, and it is possible to use an Fc region such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
- an Fc region comprising one sequence selected from the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24.
- Fc regions of natural IgG antibodies can be used as long as they have FcRn binding ability.
- an amino acid substitution that substitutes Gly of EU numbering 237 in the IgG antibody Fc region to Met An amino acid substitution that replaces Pro at position 238 with Ala, An amino acid substitution that substitutes Lys for Ser at position 239, An amino acid substitution that replaces Lys at position 248 with Ile, An amino acid substitution that substitutes Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp, or Tyr for Thr at position 250, An amino acid substitution that substitutes Met at position 252 with Phe, Trp, or Tyr, An amino acid substitution that replaces Ser at position 254 with Thr, An amino acid substitution that replaces Arg at position 255 with Glu, An amino acid substitution that substitutes Asp, Glu, or Gln for Thr at position 256, Amino acid substitution which substitutes 257th Pro with Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, or Val, An amino acid substitution that replaces Glu at position 258 with His, An amino acid substitution
- Having FcRn binding to the delivery moiety does not mean that the antigen binding domain does not have FcRn binding.
- the antigen binding domain does not have FcRn binding.
- the blood half-life of the carrier moiety is longer than the blood half-life of the antigen binding domain, the antigen binding domain has FcRn binding, as well as the antigen binding domain has no FcRn binding. Also, it may have weaker FcRn binding than the delivery moiety.
- albumin does not undergo renal excretion and has FcRn binding property, its blood half-life is as long as 17 to 19 days (J Clin Invest. 1953 Aug; 32 (8): 746-768.). Therefore, it is reported that the half-life in blood increases because the protein bound to albumin becomes bulky and can indirectly bind to FcRn (Antibodies 2015, 4 (3), 141-156).
- the delivery moiety comprises an antibody Fc region.
- the delivery moiety comprises the CH2 domain and the CH3 domain of a human IgG antibody.
- the delivery moiety comprises a moiety extending from human IgG1 antibody heavy chain Cys226 or from Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain.
- lysine Lys 447) or glycine-lysine (Gly 446-Lys 447) at the C-terminus of the Fc region may or may not be present.
- the delivery moiety comprises an antibody constant region. In a more preferred embodiment, the delivery moiety comprises an IgG antibody constant region. In a more preferred embodiment, the delivery moiety comprises a human IgG antibody constant region.
- the delivery moiety comprises a region having a structure substantially similar to the antibody heavy chain constant region, and a covalent bond such as a disulfide bond or a hydrogen bond, a hydrophobic interaction, etc. And a region having a substantially similar structure to the antibody light chain.
- a "polypeptide comprising an antigen binding domain and a carrier moiety" is usually a series of polypeptides linked by an amide bond, or a protein comprising a plurality of series of polypeptides linked by an amide bond.
- the antigen binding domain is releasable from the polypeptide, and release of the antigen binding domain from the polypeptide results in high antigen binding activity.
- the term "free” refers to two parts of a polypeptide separating from one another. The liberation of the antigen binding domain from the polypeptide may be attributed to the cancellation of the interaction between the antigen binding domain and the delivery moiety. Since the antigen-binding activity of the antigen-binding domain incorporated into the polypeptide is suppressed, the confirmation that the antigen-binding domain is free from the polypeptide is determined by measuring the antigen-binding activity of the target substance and incorporating it into the polypeptide. This can be done by comparison with the antigen binding activity of the antigen binding domain of
- the polypeptide comprises a cleavage site, and cleavage of the cleavage site releases the antigen binding domain from the polypeptide.
- the cleavage site can, for example, be cleaved by an enzyme, reduced by a reducing agent, or photolyzed.
- the cleavage site may be located at any position in the polypeptide, as long as it can release the antigen binding domain and does not lose the antigen binding activity of the antigen binding domain after release.
- another cleavage site may be further contained in the polypeptide.
- the cleavage site comprises a protease cleavage sequence and can be cleaved by a protease.
- the term “cleaved” refers to cleavage of the cleavage site by protease and / or cleavage of the cysteine-cysteine disulfide bond of the cleavage site and / or cleavage of the antigen-binding domain and the delivery moiety after photoactivation. State.
- the term “uncleaved” means in the absence of cleavage of the cleavage site by the protease and / or in the absence of reduction of the cysteine-cysteine disulfide bond of the cleavage site and / or in the absence of light. , The antigen binding domain and the delivery part are linked.
- Cleavage of the cleavage site is carried out by subjecting a solution containing the cleavage site-containing polypeptide to SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) and measuring the molecular weight of the fragment or detecting the change in molecular weight before and after cleavage.
- SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
- the cleavage site may be about 0.001 to 1500 ⁇ 10 4 M ⁇ 1 S ⁇ 1 or at least 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, depending on the drug (ie, protease, reducing agent, light). 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250, Alternatively, it can be specifically modified (cleavage, reduction or photolysis) at a rate of 1500 ⁇ 10 4 M ⁇ 1 S ⁇ 1 .
- Specific cleavage by a protease involves contacting the protease with a cleavage site or a molecule containing a cleavage site. When in the presence of sufficient enzymatic activity, the cleavage site can be cleaved. Sufficient enzyme activity can refer to the ability of the enzyme to contact the cleavage site to effect cleavage.
- protease refers to an enzyme such as an endopeptidase or exopeptidase that hydrolyzes peptide bonds, usually an endopeptidase.
- the protease used in the present invention is limited only by the ability to cleave the protease cleavage sequence, and the type is not particularly limited. In some embodiments, target tissue specific proteases are used.
- Target tissue specific proteases for example, (1) a protease that is expressed at a target tissue at a higher level than normal tissue, (2) Protease having higher activity than target tissue in target tissue, (3) a protease that expresses at a higher level than normal cells in target cells, (4) protease having higher activity than target cells in target cells, It can point to either.
- a cancer tissue specific protease or an inflammatory tissue specific protease is used.
- target tissue means a tissue comprising at least one target cell.
- the target tissue is a cancerous tissue.
- the target tissue is an inflamed tissue.
- cancer tissue refers to a tissue that comprises at least one cancer cell. Thus, it refers to all cell types that contribute to the formation of a tumor mass, including cancer cells and endothelial cells, such as, for example, cancerous tissue containing cancer cells and blood vessels. As used herein, a tumor mass refers to a tumor tissue.
- tumor is generally used to mean benign or malignant neoplasia.
- the “inflamed tissue” includes, for example, the following. ⁇ Joints in rheumatoid arthritis and osteoarthritis ⁇ Lung (alveolar) in bronchial asthma and COPD Inflammatory bowel disease, digestive tract in Crohn's disease and ulcerative colitis Fibrotic tissue in fibrosis in liver, kidney, and lung Tissue with rejection in organ transplantation Blood vessels in arteriosclerosis or heart failure, heart (Myocardium) -Visceral fat in metabolic syndrome-Skin tissue in atopic dermatitis and other dermatitis-Spinal nerve in disc herniation and chronic low back pain
- proteases that are specifically expressed or activated or that are thought to be associated with disease states of target tissues are known.
- proteases specifically expressed in cancer tissues are disclosed in, for example, International Publication WO2013 / 128194, International Publication WO2010 / 081173, International Publication WO2009 / 025846 and the like.
- proteases are disclosed.
- proteases that are specifically expressed in target tissues there are also proteases that are specifically activated in target tissues.
- proteases may be expressed in an inactive form and then may be in an active form, and in many tissues there are substances that inhibit the active protease and the activity is controlled by the process of activation and the presence of the inhibitor. (Nat Rev Cancer. 2003 Jul; 3 (7): 489-501.).
- active proteases may escape from inhibition and be specifically activated.
- the method of measuring the active protease is a method of using an antibody that recognizes the activated protease (PNAS 2013 Jan 2; 110 (1): 93-98.) Or fluorescently labeling the peptide recognized by the protease, and before cleavage It can be measured using a method of quenching (quenching) but emitting light after cleavage (Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep; 9 (9): 690-701. Doi: 10.1038 / nrd 3053.).
- target tissue specific protease (i) proteases expressed at higher levels than normal tissue in the target tissue, (ii) a protease having higher activity than target tissue in target tissue, (iii) proteases expressed at higher levels in target cells than in normal cells, (iv) a protease having higher activity in target cells than in normal cells, It can point to either.
- proteases include cysteine proteases (including cathepsin family B, L, S, etc.), aspartyl proteases (cathepsin D, E, K, O, etc.), serine proteases (Including matriptase (including MT-SP1), cathepsin A and G, thrombin, plasmin, urokinase (uPA), tissue plasminogen activator (tPA), elastase, proteinase 3, thrombin, kallikrein, tryptase, chymase Metalloprotease (MMP 1-28), including both metalloproteases (membrane bound (MMP 14-17 and MMP 24-25) and secreted (MMP 1-13 and MMP 18-23 and MMP 26-28), protease A disintegration The And metalloprotease (ADAM), A disintegrin or metalloprotease with thrombospondin motif (ADAMTS),
- cysteine proteases including cathep
- the target tissue specific protease can refer to a cancer tissue specific protease or an inflammatory tissue specific protease.
- cancer tissue specific proteases include proteases that are specifically expressed in cancer tissues disclosed in International Publication WO 2013/128194, International Publication WO 2010/081173, International Publication WO 2009/025846, and the like.
- the concentration of cancer tissue specific protease is preferably 5 times or more, preferably 10 times or more, more preferably 100 times or more, and more preferably 500 times or more higher than that in normal tissue. Preferably, it is most preferably 1000 times higher.
- the cancer tissue specific protease preferably has an activity in cancer tissue preferably at least twice as high as that in normal tissue, at least three times higher, at least four times higher, at least five times higher, and at least 10 times higher. Is more preferably 100 times higher, more preferably 500 times higher, and most preferably 1000 times higher.
- the sequences shown in Table 1 can also be used as the protease cleavage sequence.
- X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 1067)
- X10 is an amino acid selected from I, T and Y
- X11 is S
- X1 is A, D, E, F, G, H, I K, M, N, P, Q, S, T, W and Y are selected amino acids
- X 2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, Amino acids selected from T, V, W and Y
- X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V W is an amino acid selected from W and Y
- X 4 is R
- X 5 is A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P
- protease cleavage sequences exemplified in Table 1 were newly found by the present inventors.
- the polypeptides containing these protease cleavage sequences are all useful as protease substrates which are hydrolyzed by the action of protease. That is, the present invention provides a protease substrate comprising a sequence selected from the sequences shown in SEQ ID NOs: 833 to 852, 1062 to 1081, and the sequences shown in Table 1.
- the protease substrate of the present invention can be utilized, for example, as a library for selecting one having properties according to the purpose when incorporated into the polypeptide of the present invention.
- mobile linkers include, but are not limited to, glycine polymers (G) n, glycine-serine polymers (eg, (GS) n, (GSGGS: SEQ ID NO: 27) n and (GGGS: SEQ ID NO: 28) and n is an integer of at least 1), glycine-alanine polymer, alanine-serine polymer, and other movable linkers known in the art.
- G glycine polymers
- GSGGS glycine-serine polymers
- association can be reworded to refer to, for example, a state in which two or more polypeptide regions interact. Generally, hydrophobic bonds, hydrogen bonds, ionic bonds and the like are formed between the polypeptide regions of interest to form aggregates. As an example of often seen association, in antibodies represented by natural antibodies, the heavy chain variable region (VH) and the light chain variable region (VL) maintain the pairing structure due to non-covalent bonding between them, etc. It is known.
- association between the suppression domain and the antigen binding domain can be resolved, for example, by cleaving the cleavage site. Disassociation can be said to mean, for example, that the interaction state of two or more polypeptide regions is eliminated. Even if the interaction between two or more polypeptide regions is completely eliminated, part of the interaction between two or more polypeptide regions may be eliminated.
- the term "interface” generally refers to an association surface upon association (interaction), and amino acid residues forming the interface are generally included in the polypeptide region to be subjected to the association. Or a plurality of amino acid residues, more preferably, amino acid residues involved in association and involved in interaction during association. Specifically, the interaction includes non-covalent bonds such as in the case where the adjacent amino acid residues at the time of association form hydrogen bonds, electrostatic interactions, salt bridges, and the like.
- amino acid residues involved in association in the antigen binding domain, or amino acid residues involved in association in the suppression domain, to facilitate association of the antigen binding domain and the repression domain can be modified.
- an amino acid residue in the antigen binding domain that forms an interface with the suppression domain, or an amino acid residue in the suppression domain that forms an interface with the antigen binding domain can be modified .
- the modification of the amino acid residue forming the interface is a method of introducing a mutation of an amino acid residue at the interface such that two or more amino acid residues forming the interface have different charges. .
- Modification of amino acid residues that result in different charges may be modification from positively charged amino acid residues to negatively charged amino acid residues or non-charged amino acid residues, negatively charged amino acid residues Included are modifications from groups to positively charged amino acid residues or non-charged amino acid residues, and non-charged amino acid residues to positively or negatively charged amino acid residues.
- Such amino acid modification is for promoting association, and the position of amino acid modification and the type of amino acid are not limited as long as the purpose of association promotion can be achieved. Modifications include, but are not limited to, substitutions.
- VHH can be used as an antigen binding domain and VH or VHH can be used as a repression domain to associate the antigen binding domain with the repression domain.
- an amino acid residue involved in the association of the suppression domain VH or VHH in the antigen binding domain VHH is used. These amino acid residues can be identified and altered.
- amino acid residues involved in association with the antigen binding domain VHH in the suppression domain VH or VHH can be specified, and those amino acid residues can be modified.
- the delivery moiety comprises an antibody constant region, and the N-terminus of the antibody constant region and the C-terminus of the antigen binding domain are fused via or without a linker.
- the protease cleavage sequence is located within the antibody constant region contained in the delivery moiety. In this case, the protease cleavage sequence may be located within the antibody constant region so as to release the antigen binding domain upon cleavage of the protease.
- the protease cleavage sequence is located within the antibody heavy chain constant region contained in the delivery moiety, and more specifically, from the 140th amino acid (EU numbering) amino acid in the antibody heavy chain constant region, an antigen binding domain It is preferably located on the antigen binding domain side from amino acid 122 (EU numbering) in the antibody heavy chain constant region.
- the protease cleavage sequence is located within the antibody light chain constant region contained in the delivery moiety, more specifically, # 130 (EU numbering) in the antibody light chain constant region (Kabat numbering) It is located on the antigen binding domain side from amino acid 130), preferably on the antigen binding domain side from amino acid 113 (EU numbering) (Kabat numbering 113) in the antibody light chain constant region.
- the antigen binding domain is a single domain antibody, and the C terminus of the single domain antibody and the N terminus of the delivery moiety are fused via or without a linker.
- the protease cleavage sequence is located within a single domain antibody.
- the single domain antibody is a single domain antibody or VHH prepared from VH, and the protease cleavage sequence is on the side of the transfer moiety, preferably, amino acid 35b (Kabat numbering) of the single domain antibody.
- the delivery moiety comprises an antibody constant region and the antigen binding domain is a single domain antibody, and the antibody constant region and the single domain antibody are fused via or without a linker. It is done.
- the N-terminus of the antibody constant region and the C-terminus of the single domain antibody are fused via or without a linker.
- the C-terminus of the antibody constant region and the N-terminus of the single domain antibody are fused via or without a linker.
- the protease cleavage sequence is located within the antibody constant region contained in the delivery moiety.
- the protease cleavage sequence is on the single domain antibody side from amino acid 140 (EU numbering) in the antibody heavy chain constant region, preferably amino acid 122 (EU numbering) in the antibody heavy chain constant region It is located closer to the single domain antibody.
- the protease cleavage sequence is closer to the antigen binding domain than amino acid 130 (EU numbering) (Kabat numbering 130) in the antibody light chain constant region, preferably 113 in the antibody light chain constant region. No. (EU numbering) (Kabat numbering 113) is located closer to the antigen binding domain than the amino acid.
- the protease cleavage sequence is located within a single domain antibody.
- the single domain antibody is a single domain antibody or VHH prepared from VH, and the protease cleavage sequence is closer to the antibody constant region, preferably, amino acid 35b (Kabat numbering) of the single domain antibody. It is located on the antibody constant region side from amino acid 95 (Kabat numbering) of the single domain antibody, more preferably on the antibody constant region side from amino acid 109 (Kabat numbering) on the single domain antibody.
- the antigen binding domain is a single domain antibody prepared from VL
- the vicinity of the boundary between the antigen binding domain and the antibody constant region is from single domain antibody No. 96 (Kabat numbering), preferably single domain antibody No. 104 (Kabat numbering) It is from.
- IgG antibody-like molecule refers to the constant domain or portion substantially similar to the structure of a constant domain such as an IgG antibody, and the structure and parenchyma of a variable domain or variable region such as an IgG antibody It is used to define a molecule having a similar moiety and having a steric structure substantially similar to that of an IgG antibody. Domains similar to antibody CH1 and domains similar to CL in an IgG antibody-like molecule can be used interchangeably with each other, ie, both domains have an interaction like CH1 of an IgG antibody and CL As long as the domain linked to the portion analogous to the antibody hinge region may be the antibody CH1 domain or the antibody CL domain.
- the “IgG antibody-like molecule” in the present specification is not limited to exerting the antigen binding activity while maintaining the similar structure to the IgG antibody.
- the antigen binding domain contained in the polypeptide may be one or more.
- the number of suppression domains that respectively suppress the antigen binding activity of a plurality of antigen binding domains may be one or more.
- Multiple antigen binding domains may each be associated with a repression domain.
- Multiple antigen binding domains may each be fused to the delivery moiety.
- Multiple antigen binding domains may each be capable of being released from the polypeptide.
- the cleavage site for releasing a plurality of antigen binding domains may be plural corresponding to each antigen binding domain.
- the polypeptide is an IgG antibody-like molecule
- the second antigen binding domain has a different antigen binding specificity than the antigen binding domain.
- the molecular weight of the linked antigen binding domain and the second antigen binding domain is 60 kDa or less.
- the antigen binding domain and the second antigen binding domain are single domain antibodies having different antigen binding specificities, and the linked antigen binding domain and the second antigen binding domain are It is releasable from the polypeptide, and the antigen binding domain after release and the second antigen binding domain form a bispecific antigen binding molecule.
- bispecific antigen binding molecules include, but are not limited to, for example, an antigen binding domain specifically binding to a target cell surface antigen and a second antigen binding domain specific to an immune cell surface antigen
- a bispecific antigen-binding molecule that binds to a bispecific antigen-binding molecule, an antigen-binding domain and a second antigen-binding domain bind to different subunits of the same antigen, an antigen-binding domain and a second antigen-binding domain
- Examples include bispecific antigen binding molecules that bind to different epitopes in the same antigen. Such dual specific antigen binding molecules are considered useful because they can recruit immune cells to the vicinity of target cells in the treatment of diseases caused by target cells.
- the antigen binding activity of the second antigen binding domain may or may not be suppressed by the delivery moiety. Also, the second antigen binding domain may or may not form an association with part of the structure of the carrier. In particular, when the antigen binding domain and the second antigen binding domain have different antigen binding specificities, for example, as shown in FIG. 8, even if the antigen binding activity of the second antigen binding domain is not suppressed, Even if the second antigen binding domain does not form an association with part of the structure of the carrier, it can not exert the antigen binding activity of the antigen binding domain without releasing the antigen binding domain. And a second antigen-binding domain are linked, can not perform the function of bispecifically binding to two kinds of antigens.
- FIG. 8 illustrates one embodiment in which the antigen binding domain is further linked to a second antigen binding domain.
- the term "specificity" refers to the property of one molecule of a specifically binding molecule to be substantially non-binding to molecules other than the one or more binding partner molecules. It is also used when the antigen binding domain has specificity for an epitope contained in a particular antigen. It is also used when the antigen binding domain has specificity for a particular epitope among multiple epitopes contained in an antigen.
- substantially non-binding is determined according to the method described in the section on binding activity, and the binding activity of a specific binding molecule to a molecule other than the partner is 80% of the binding activity to the molecule of the partner
- the present invention also relates to a pharmaceutical composition (drug) comprising the polypeptide of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
- treatment is a clinical attempt to alter the natural history of the individual being treated. It means intervention and can be implemented for the prevention as well as during the course of a clinical condition.
- the desired effects of treatment include, but are not limited to, preventing the onset or recurrence of the disease, reducing the symptoms, reducing any direct or indirect pathological effects of the disease, preventing metastasis, progression of the disease Includes speed reduction, amelioration or alleviation of the disease state, and remission or improved prognosis.
- the polypeptides of the invention are used to delay the onset of the disease or to slow the progression of the disease.
- the pharmaceutical composition usually refers to a drug for treatment or prevention of a disease, or examination / diagnosis.
- the term “pharmaceutical composition containing a polypeptide” can be reworded as "a method of treating a disease comprising administering a polypeptide to a treatment subject", and “treating a disease” It can be reworded as "the use of a polypeptide in the manufacture of a medicament for Also, the term “pharmaceutical composition comprising a polypeptide” can be rephrased as "use of polypeptide for treating a disease”.
- compositions of the invention may be formulated using methods known to those skilled in the art.
- it can be used parenterally in the form of an injection of a sterile solution or suspension with water or another pharmaceutically acceptable liquid.
- a pharmacologically acceptable carrier or vehicle specifically, sterile water or saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative
- a pharmacologically acceptable carrier or vehicle specifically, sterile water or saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative
- the amount of active ingredient in these preparations is set so as to obtain an appropriate volume in the indicated range.
- Sterile compositions for injection can be formulated according to a conventional formulation using a vehicle such as distilled water for injection.
- the aqueous solution for injection includes, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
- Suitable solubilizers may be used in combination with, for example, alcohols (ethanol etc.), polyalcohols (propylene glycol, polyethylene glycol etc.), nonionic surfactants (polysorbate 80 (TM), HCO-50 etc.).
- the oily liquid includes sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and / or benzyl alcohol may be used in combination as a solubilizer. It can also be formulated with buffers (eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (eg, procaine hydrochloride), stabilizers (eg, benzyl alcohol and phenol), antioxidants.
- buffers eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer
- soothing agents eg, procaine hydrochloride
- stabilizers eg, benzyl alcohol and phenol
- antioxidants eg, benzyl alcohol and phenol
- compositions for injection, intranasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration are administered.
- parenteral administration for example, compositions for injection, intranasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration are administered.
- it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
- the invention also relates to methods of producing a polypeptide comprising a carrier moiety having a repression domain and an antigen binding domain.
- a polypeptide comprising a carrier moiety having a repression domain and an antigen binding domain.
- an antigen binding domain having an antigen binding activity is obtained, and the antigen binding domain and the carrier moiety are controlled so that the antigen binding activity of the antigen binding domain is suppressed by the suppression domain.
- the cleavage site may be introduced into the polypeptide precursor, and the method of introducing the cleavage site may be either insertion of the cleavage site or modification of part of the polypeptide precursor. Furthermore, it will be apparent to those skilled in the art who have been referred to the present specification that it will be possible to introduce modified sites into the polypeptide precursor by combining both means, without departing from the scope of the present invention. I will.
- an antigen binding domain having an antigen binding activity is obtained, and the antigen binding domain is carried so that the antigen binding activity of the antigen binding domain is suppressed by the suppression domain.
- cleavage site there is also a method of linking portions via a cleavage site to form a polypeptide.
- the cleavage site may be sandwiched between the antigen binding domain and the carrier moiety, and part of the antigen binding domain or / and part of the carrier moiety is modified It may be used as part of a cutting site.
- “Inserting” the amino acid sequence A into the amino acid sequence B separates the amino acid sequence B into two parts without deletion, and connects the two parts with the amino acid sequence A (ie “amino acid sequence B first half— Amino acid sequence A--the latter half of amino acid sequence B).
- “Introducing” amino acid sequence A into amino acid sequence B refers to dividing amino acid sequence B into two parts and connecting the two parts with amino acid sequence A, wherein said amino acid sequence A in amino acid sequence B In addition to “insertion” in the amino acid sequence A, one or more amino acid residues including the amino acid residue of the amino acid sequence B adjacent to the amino acid sequence A are deleted and then the two parts are joined with the amino acid sequence A ( That is, it is also possible to replace part of the amino acid sequence B with the amino acid sequence A).
- polypeptide preparation method is described for an embodiment using a single domain antibody as the antigen binding domain and a protease cleavage sequence as the cleavage site.
- a method of producing a polypeptide comprising a carrier moiety having a repression domain and an antigen binding domain comprises the steps of: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) forming a polypeptide precursor by linking the single domain antibody and the delivery moiety such that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a) is suppressed by the suppression domain of the delivery moiety ; (c) introducing a protease cleavage sequence near the boundary between the single domain antibody and the carrier portion; Manufacturing method.
- a method of producing a polypeptide comprising a carrier moiety having a repression domain and an antigen binding domain comprises the steps of: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) The single domain antibody is linked to the carrier moiety via a protease cleavage sequence so that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a) is suppressed by the suppression domain of the carrier moiety. Forming a peptide; Manufacturing method.
- the method of producing a polypeptide comprising a delivery moiety having a repression domain and an antigen binding domain further comprises the steps of: (d) confirming that the binding activity of the single domain antibody incorporated into the polypeptide or the polypeptide precursor to the target antigen is weakened or lost; Manufacturing method.
- “weakening of binding activity” means that the binding activity to a target antigen is reduced as compared to that before ligation, and the degree of reduction does not matter.
- the method of producing a polypeptide comprising a delivery moiety having a repression domain and an antigen binding domain further comprises the steps of: (e) releasing the single domain antibody by cleaving the protease cleavage sequence with a protease, and confirming that the free single domain antibody binds to an antigen; Manufacturing method.
- a method for producing a polypeptide which is an IgG antibody-like molecule comprising a carrier moiety having a suppression domain and an antigen binding domain comprises the steps of: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) (a) the single domain antibody is associated with VL as a substitute for the VH of the IgG antibody or the single domain antibody is conjugated to the IgG antibody so that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a) is suppressed Forming an IgG antibody-like molecule precursor into which said single domain antibody has been introduced by associating it with VH as a substitute for VL; (c) introducing a protease cleavage sequence into the IgG antibody-like molecule precursor into which the single domain antibody has been introduced; Manufacturing method.
- a method for producing a polypeptide which is an IgG antibody-like molecule comprising a carrier moiety having a suppression domain and an antigen binding domain comprises the steps of: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) (a) the single domain antibody is associated with VL as a substitute for the VH of the IgG antibody or the single domain antibody is conjugated to the IgG antibody so that the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a) is suppressed Forming an IgG antibody-like molecule precursor into which said single domain antibody has been introduced by associating it with VH as a substitute for VL; (c) introducing a protease cleavage sequence near the boundary between the single domain antibody and the antibody constant region in the IgG antibody-like molecule precursor; Manufacturing method.
- a method for producing a polypeptide which is an IgG antibody-like molecule comprising a carrier moiety having a suppression domain and an antigen binding domain comprises the steps of: (a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; (b) In order to suppress the antigen binding activity of the single domain antibody obtained in step (a), the single domain antibody is used as a substitute for the IgG antibody VH or VL, and the heavy chain constant of the IgG antibody via a protease cleavage sequence Linking with a region or light chain constant region to form an IgG antibody-like molecule into which the single domain antibody has been introduced; Manufacturing method.
- the method for producing a polypeptide that is an IgG antibody-like molecule, comprising a delivery moiety having a repression domain and an antigen binding domain further comprises the following steps: (d) confirming that the binding activity to the target antigen of the single domain antibody introduced into the IgG antibody-like molecule or the precursor of the IgG antibody-like molecule is weakened or lost; Manufacturing method.
- “weakening of binding activity” means that the binding activity to a target antigen is reduced as compared to before association or before ligation, and the degree of reduction is not limited.
- VH / VL / VHH When VH / VL / VHH is used as a suppression domain, there is a method of allowing the single domain antibody to associate with VH / VL / VHH as a method for suppressing the antigen binding activity of the single domain antibody by the suppression domain of the carrier moiety.
- the VH / VL / VHH which suppresses the antigen binding activity of the prepared single domain antibody is made to associate a known VH / VL / VHH with the single domain antibody and compare the antigen binding activity of the single domain antibody before and after the association. It can screen.
- a method for producing an IgG antibody-like molecule polypeptide comprising a carrier moiety having a suppression domain and an antigen binding domain comprises the steps of: (a) Substituting amino acid residues involved in association with antibody VH in a single domain antibody, or substituting amino acid residues involved in association with antibody VL in a single domain antibody, the single domain antibody Producing a modified single domain antibody that retains the binding activity of the target antigen to the target antigen; (b) by allowing the modified single domain antibody to associate with the antibody VH or causing the modified single domain antibody to associate with the antibody VL so as to suppress the antigen binding activity of the modified single domain antibody prepared in the step (a) Forming an IgG antibody-like molecule precursor into which the modified single domain antibody has been introduced; (c) introducing a protease cleavage sequence into the IgG antibody-like molecule precursor into which the modified single domain antibody has been introduced; Manufacturing method.
- a method for producing a polypeptide which is an IgG antibody-like molecule comprising a carrier moiety having a suppression domain and an antigen binding domain comprises the steps of: (a) Substituting amino acid residues involved in association with antibody VH in a single domain antibody, or substituting amino acid residues involved in association with antibody VL in a single domain antibody, the single domain antibody Producing a modified single domain antibody that retains the binding activity of the target antigen to the target antigen; (b) by allowing the modified single domain antibody to associate with the antibody VH or causing the modified single domain antibody to associate with the antibody VL so as to suppress the antigen binding activity of the modified single domain antibody prepared in the step (a) Forming an IgG antibody-like molecule precursor into which the modified single domain antibody has been introduced; (c) introducing a protease cleavage sequence near the boundary between the modified single domain antibody and the constant region of the IgG antibody-like molecule precursor; Manufacturing method.
- a method for producing a polypeptide which is an IgG antibody-like molecule comprising a carrier moiety having a suppression domain and an antigen binding domain comprises the steps of: (a) Substituting amino acid residues involved in association with antibody VH in a single domain antibody, or substituting amino acid residues involved in association with antibody VL in a single domain antibody, the single domain antibody Producing a modified single domain antibody that retains the binding activity of the target antigen to the target antigen; (b) The modified single domain antibody is linked to the heavy chain constant region of the IgG antibody via a protease cleavage sequence so as to suppress the antigen binding activity of the modified single domain antibody prepared in step (a), or the modification Connecting a single domain antibody to a light chain constant region of an IgG antibody via a protease cleavage sequence to form an IgG antibody-like molecule into which the modified single domain antibody has been introduced; Manufacturing method.
- the method for producing a polypeptide that is an IgG antibody-like molecule, comprising a delivery moiety having a repression domain and an antigen binding domain further comprises the following steps: (d) confirming that the binding activity to the target antigen of the modified single domain antibody introduced into the IgG antibody-like molecule or the precursor of the IgG antibody-like molecule is weakened or lost; Manufacturing method.
- “weakening of binding activity” means that the binding activity to a target antigen is reduced as compared to before association or before ligation, and the degree of reduction is not limited.
- the method for producing a polypeptide that is an IgG antibody-like molecule, comprising a delivery moiety having a repression domain and an antigen binding domain further comprises the following steps: (e) releasing the modified single domain antibody by cleaving the protease cleavage sequence with a protease to confirm that the free modified single domain antibody binds to the target antigen; Manufacturing method.
- the invention also relates to a polynucleotide encoding a polypeptide comprising a carrier moiety having a repression domain and an antigen binding domain.
- the polynucleotide in the present invention is usually carried (inserted) into a suitable vector and introduced into a host cell.
- the vector is not particularly limited as long as it stably holds the inserted nucleic acid.
- E. coli is used as a host
- pBluescript vector manufactured by Stratagene
- a variety of vectors are available.
- an expression vector is particularly useful.
- the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a polypeptide in a test tube, in E.
- Insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed in a conventional manner, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 11.4-11.11).
- the host cell is not particularly limited, and various host cells may be used depending on the purpose.
- Examples of cells for expressing a polypeptide include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells (eg, Drosophila S2). , Spodoptera SF9), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293, Bowes melanoma cells) and plant cells can be exemplified.
- bacterial cells eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis
- fungal cells eg, yeast, Aspergillus
- insect cells eg, Drosophila S2).
- Spodoptera SF9 animal cells
- animal cells eg, COS, HeLa, C
- Vector introduction into host cells can be carried out, for example, by calcium phosphate precipitation, electroporation (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), Lipofectamine method (GIBCO). It is possible to carry out by a known method such as -BRL) and a microinjection method.
- VL / VH / VHH which suppresses the antigen binding activity of a single domain antibody
- VL / VH / VHH of known sequence for example, those whose sequences are registered in IMGT or Kabat database can be used.
- a sequence in which VL / VH / VHH is newly identified from a human antibody library or the like can also be used.
- those having human antibody germline sequences can be used as VL / VH / VHH to suppress the antigen binding activity of single domain antibodies.
- VL having a framework sequence of kappa chain, and VL having a framework sequence of lambda chain can be used. It is also possible to use a VL having a modified framework sequence, such as a framework sequence combining the framework sequence of kappa chain and the framework sequence of lamda chain.
- the following steps (a) obtaining a single domain antibody having target antigen binding activity; (b) associating the single domain antibody obtained in step (a) with a specific VL; (c) a step of confirming that the binding activity of the single domain antibody associated with a specific VL in the step (b) to the antigen is weakened or lost;
- the present invention provides a method of screening for single domain antibodies whose antigen binding activity is suppressed by associating with a specific VL.
- "weakening of the binding activity” means that the binding activity to the target antigen is reduced as compared to that before the association, and the degree of reduction does not matter.
- the present invention Produces a single domain antibody whose antigen binding activity is suppressed by promoting association with a specific VL, or by promoting association with a specific VH, or by promoting association with a specific VHH. It also relates to how to
- the following steps (a) A step of substituting an amino acid residue involved in association with the antibody VL in a single domain antibody, and producing a modified single domain antibody that retains the binding activity of the single domain antibody to a target antigen; Provides a method for producing a single domain antibody in which antigen binding activity is suppressed by associating with a specific VL.
- the following steps (a) A step of substituting an amino acid residue involved in association with the antibody VH in a single domain antibody, and producing a modified single domain antibody that retains the binding activity of the single domain antibody to a target antigen; Provides a method for producing a single domain antibody in which antigen binding activity is suppressed by associating with a specific VH.
- the following further steps: (b) associating the modified single domain antibody prepared in step (a) with a specific VH; (c) confirming that the antigen binding activity of the modified single domain antibody associated with the VH is weakened or lost; Provides a method for producing a single domain antibody in which antigen binding activity is suppressed by associating with a specific VH.
- "weakening of the binding activity” means that the binding activity to the target antigen is reduced as compared to that before the association, and the degree of reduction does not matter.
- the following steps (a) A step of substituting an amino acid residue involved in association with VHH in a single domain antibody, and producing a modified single domain antibody that retains the binding activity of the single domain antibody to a target antigen;
- the present invention provides a method for producing a single domain antibody whose antigen binding activity is suppressed by associating with a specific VHH, which comprises
- a single domain antibody whose antigen binding activity is suppressed or lost by associating with a specific VL / VH / VHH of the present invention comprises a single domain antibody and a first association support domain Can be obtained from a library containing multiple fusion polypeptides linked together.
- a library capable of efficiently obtaining single domain antibodies whose antigen binding activity is suppressed or lost can be provided by associating with a specific VL / VH / VHH. .
- a "library” refers to a plurality of fusion polypeptides each having a different sequence, or a set of nucleic acids or polynucleotides encoding these fusion polypeptides.
- the plurality of fusion polypeptides contained in the library are not single sequences, but fusion polypeptides with different sequences from one another.
- the term "different sequences from each other" in the description of fusion polypeptides different from each other means that the sequences of individual fusion polypeptides in the library are different from each other. More preferably, it means that the sequences of single domain antibody portions in individual fusion polypeptides in the library are different. That is, the number of different sequences in the library reflects the number of independent clones of different sequences in the library, and may be referred to as "library size". It is 10 6 to 10 12 in a typical phage display library, and it is possible to expand the library size to 10 14 by applying known techniques such as ribosome display method.
- sequences different from each other in the present invention means that the sequences of individual polypeptides in a library whose number of library equivalents is excluded are different from each other, more specifically, 10 6 It is meant that there are 10 14 molecules, preferably 10 7 to 10 12 molecules.
- the term "plurality" in the description of the library consisting mainly of a plurality of fusion polypeptides of the present invention refers to a set of the above types. For example, if two or more substances are different from each other with respect to a specific trait, it means that there are two or more kinds of the substances. Examples may include variant amino acids observed at particular amino acid positions in the amino acid sequence. For example, when there are two or more polypeptides of the invention which are substantially the same, preferably identical, sequences, except for certain variant amino acids at highly diverse amino acid positions exposed to the surface, the polypeptides of the invention There are a plurality of.
- polynucleotide molecules of the invention of substantially the same, preferably identical, sequence except for bases encoding specific variant amino acids at highly diverse amino acid positions exposed on the surface If present, there are a plurality of polynucleotide molecules of the invention.
- a panning method using a phage vector is also suitably used as a screening method for fusion polypeptides using binding activity as an index.
- a gene encoding a single domain antibody and a gene encoding an IgG antibody CH1 domain or a light chain constant region can be linked in an appropriate embodiment to form a fusion polypeptide.
- a phage that expresses the fusion polypeptide on its surface can be obtained.
- DNA bound to the antigen can be recovered to recover DNA encoding a fusion polypeptide having the desired binding activity.
- a fusion polypeptide having a desired binding activity can be enriched.
- phage display As a technique for obtaining a fusion polypeptide by panning using a library, a technique using a cell-free translation system, a technique for displaying a fusion polypeptide on a cell or a virus surface, a technique using an emulsion Etc. are known.
- a ribosome display method in which a complex of mRNA and a translated protein is formed through ribosomes by removal of a stop codon, gene sequencing using a compound such as puromycin and the like
- a cDNA display method in which a translated protein is covalently linked an mRNA display method, a CIS display method in which a complex of a gene and a translated protein is formed using a binding protein for nucleic acid, and the like can be used.
- a technique for displaying the fusion polypeptide on the cell or virus surface besides the phage display method, E.
- coli display method gram positive bacteria display method, yeast display method, mammalian cell display method, virus display method, etc. It can be used.
- an in vitro virus display method and the like by incorporating a gene and a translation related molecule in the emulsion can be used. These methods are already known (Nat Biotechnol. 2000 Dec; 18 (12): 1287-92, Nucleic Acids Res. 2006; 34 (19): e 127, Proc Natl Acad Sci US A. 2004 Mar 2; 101 (9): 2806-10, Proc Natl Acad Sci USA S. 2004 Jun 22; 101 (25): 9193-8, Protein Eng Des Sel.
- first association support domain and second association support domain refer to domains that can interact with each other by a bond such as a hydrophobic bond, a hydrogen bond, or an ionic bond to form an assembly.
- first association support domain and the second association support domain include, but are not limited to, for example, the light chain constant region (CL) of the antibody and the CH1 domain of the heavy chain constant region.
- the first association support domain and the second association support domain interact with each other, and regardless of the degree of association between the single domain antibody and the suppression domain, the fusion polypeptide and the association partner can form an association.
- a library comprising a plurality of fusion polypeptides in which a single domain antibody and an IgG antibody light chain constant region are linked, wherein a specific VL / VH / VHH is contained in the single domain antibody.
- a single domain antibody is expressed without simultaneously expressing a suppression domain, and a polypeptide containing a single domain antibody which binds to an antigen in the state or whose antigen binding activity is a predetermined value or more is selected, and then the single domain antibody and the suppression
- a method of selecting a polypeptide comprising a single domain antibody which expresses a domain simultaneously to form an association and which does not bind to an antigen in the relevant state or whose antigen binding activity is below a certain value also supports the first association with the single domain antibody.
- a single domain antibody is expressed without simultaneously expressing the suppression domain (only a single domain antibody is expressed, or a single domain Express a fusion polypeptide containing only the antibody and the first association support domain, or associate a fusion polypeptide containing a single domain antibody and the first association support domain only with the second association support domain), and bind to the antigen in this state
- 9D (1) from the selected fusion polypeptide It includes a single domain antibody that is simultaneously expressed to form an association and does not bind to the antigen in this state or whose antigen binding activity is below a certain value. Also by selecting a fusion polypeptide, an antigen-binding can be performed by associating with a specific suppression domain such as VH / VL / VHH from a library containing a plurality of fusion polypeptides in which a single domain antibody and a first association support domain are linked. It is possible to screen single domain antibodies whose activity is suppressed or lost.
- a specific suppression domain such as VH / VL / VHH
- the antigen binding activity is below a certain value can refer to an antigen binding activity below a certain standard, for example, when the antigen binding activity is measured by the method exemplified herein. “The antigen binding activity is above a certain value” can also refer to an antigen binding activity exceeding a certain standard, for example, when the antigen binding activity is measured by the method exemplified herein. Fusion polypeptides in which the antigen binding activity is above a certain value bind more strongly to the antigen than fusion polypeptides in which the antigen binding activity is below a certain value.
- the key to a method of screening a fusion polypeptide containing a target single domain antibody using the fusion polypeptide and the association partner is to compare the antigen binding activity in association / non-association state with the suppression domain of the single domain antibody It is. As shown in FIG.
- a library comprising a plurality of fusion polypeptides in which a single domain antibody and an IgG antibody CH1 domain are linked, and in the single domain antibody, a specific VL / VH / VHH
- a library including single domain antibodies whose antigen binding activity is suppressed or lost by association, and a single domain antibody whose antigen binding activity is suppressed or lost by association with a specific VL / VH / VHH from the library
- a single domain antibody in which antigen binding activity is suppressed or lost by association with a specific VL is obtained from a library containing a plurality of fusion polypeptides in which a single domain antibody and an IgG antibody CH1 domain are linked.
- a library containing a plurality of fusion polypeptides in which a single domain antibody and an IgG antibody CH1 domain are linked is obtained from a library containing a plurality of fusion polypeptides in which a single domain antibody and an IgG antibody CH1 domain are linked.
- step (a) displaying the fusion polypeptide of the library in the present invention in vitro; (b) providing an association partner in which a specific VL and an IgG antibody light chain constant region are fused; (c) The fusion polypeptide displayed in step (a) is associated with the association partner prepared in step (b), and the single domain antibody does not bind to the antigen in a state where the VL is associated, or the antigen binding activity is Selecting a fusion polypeptide that is below a certain value; (d) selecting a fusion polypeptide in which a single domain antibody contained in the fusion polypeptide selected in step (c) binds to an antigen in a state where said VL is not associated, or the antigen binding activity is a certain value or more ; A method of screening for single domain antibodies comprising
- the association partner prepared in the step (b) further includes a protease cleavage sequence, and in the step (d), the single domain antibody and the VL are disassociated by protease treatment, and the single domain antibody and the VL are not associated. It is possible to confirm the antigen binding activity of single domain antibodies in a state.
- the position of the protease cleavage sequence in the association partner is not limited as long as it disassociates the single domain antibody from the VL upon cleavage.
- amino acid number 96 (Kabat numbering) of VL to antibody light chain constant region 130 (EU numbering) (EU numbering) Kabat numbering 130 can be located between amino acids, more preferably between amino acid 104 (Kabat numbering) of VL to antibody light chain constant region number 113 (EU numbering) (Kabat numbering 113) amino acids .
- a protease cleavage sequence is introduced into the fusion polypeptide in the library, and the fusion polypeptide is cleaved by the protease to disassociate the single domain antibody and VL. It is also possible.
- the position of the protease cleavage sequence in the fusion polypeptide is not limited as long as the association between the single domain antibody and the VL is resolved upon cleavage, and the antigen binding activity of the single domain antibody is retained after cleavage.
- the location of the protease cleavage sequence it can be located, for example, near the border of the single domain antibody and the IgG antibody CH1 domain in the fusion polypeptide.
- step (d) the portion containing the full-length or single domain antibody of the fusion polypeptide selected in the step (c) is displayed again, and the antigen binding activity of the single domain antibody in a state where the single domain antibody and VL are not associated It is also possible to check
- the association partner prepared in the step (b) further includes a protease cleavage sequence, and in the step (d), the single domain antibody and the VH are disassociated by protease treatment, and the single domain antibody and the VH are not associated. It is possible to confirm the antigen binding activity of single domain antibodies in a state.
- the position of the protease cleavage sequence in the association partner is not limited as long as it disassociates the single domain antibody and VH upon cleavage.
- the position of the protease cleavage sequence for example, near the boundary between the association partner VH and the IgG antibody CH1 domain, preferably between amino acid 101 (Kabat numbering) of VH to antibody heavy chain constant region 140 (EU numbering) amino acids More preferably, it can be located between amino acid 109 (Kabat numbering) amino acid of VH to antibody heavy chain constant region 122 (EU numbering) amino acid.
- a protease cleavage sequence is introduced into the fusion polypeptide in the library, and the fusion polypeptide is cleaved by the protease to dissolve the association between the single domain antibody and the VH.
- the position of the protease cleavage sequence in the fusion polypeptide is not limited as long as the association between the single domain antibody and VH is resolved upon cleavage, and the antigen binding activity of the single domain antibody is retained after cleavage.
- the position of the protease cleavage sequence it can be located, for example, near the boundary between the single domain antibody and the IgG antibody light chain constant region in the fusion polypeptide.
- step (d) the portion containing the full-length or single domain antibody of the fusion polypeptide selected in the step (c) is displayed again, and the antigen binding activity of the single domain antibody in a state where the single domain antibody and VH are not associated It is also possible to check
- Example 1 Problem of Existing Protease-Activated Antibody A method of producing an antibody that exhibits antigen binding activity for the first time by cleaving with a protease expressed at a lesion site such as cancer tissue or inflammatory tissue has been reported. .
- the same antibody, which is called Probody is an antibody molecule that inhibits the antigen binding activity of the antibody by linking it to the antibody with a linker that is cleaved by a protease that expresses the antigen binding site of the antibody as shown in FIG. (Non-Patent Document 18).
- the linker that makes up the Probody is cleaved by the protease that is expressed at the target pathological site, whereby the mask peptide is dissociated to generate an antibody molecule with restored antigen binding activity, and it is possible to bind to the antigen in the target pathological tissue. It becomes. It is considered that Probody can expand the therapeutic window by selectively binding to an antigen at the target pathological site by the mechanism as described above. However, since cleavage of the antibody by protease in the Probody is irreversible, the antibody cleaved at the site of disease can return to the blood again from the site of disease, and is distributed to normal tissues by blood flow. It is considered that there is a possibility of binding to an antigen expressed in normal tissue.
- IL6 R90 H1001 (SEQ ID NO: 13), IL6 R 90 H 1002 (SEQ ID NO: 14), IL6 R 90 H 1003 (SEQ ID NO: 15), IL6 R 90 H 1004 (SEQ ID NO: 16), IL6 R 90 H 1005 (SEQ ID NO: 17), IL6 R 90 H 1006 (SEQ ID NO: 18)
- Expression vectors were constructed by methods known to those skilled in the art.
- VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3) as a light chain, an IgG antibody-like molecule, IL6R90H1001 / VK1-39-k0MT (heavy chain SEQ ID NO: 13, light chain SEQ ID NO: 3), IL6R90H1002 / VK1-39-k0MT (heavy chain SEQ ID NO: 14, light chain SEQ ID NO: 3), IL6R90H1003 / VK1-39-k0MT (heavy chain SEQ ID NO: 15, light chain SEQ ID NO: 3), IL6R90H1004 / VK1-39-k0MT (heavy chain SEQ ID NO: 16; light chain SEQ ID NO: 3), IL6R90H1005 / VK1-39-k0MT (heavy chain SEQ ID NO: 17; light chain SEQ ID NO: 3), IL6R90H1006 / VK1-39 -k0MT (heavy chain SEQ ID NO: 18, light
- Soluble human IL-6R was prepared by methods known to those skilled in the art.
- the soluble human IL-6R prepared was biotinylated by methods known to those skilled in the art.
- Downstream of the gene fragment encoding hsIL-6R for the purpose of adding biotin to the C-terminus of soluble human IL-6R also called hsIL-6R or soluble human IL-6R, SEQ ID NO: 35
- a gene fragment encoding a specific sequence (AviTag sequence, SEQ ID NO: 36) to which biotin is added by biotin ligase was linked via a linker.
- a gene fragment encoding a protein (hsIL6R-Avitag, SEQ ID NO: 37) in which hsIL-6R and AviTag sequence are linked is incorporated into an animal cell expression vector, and the constructed plasmid vector is Freestyle 293 cells using 293Fectin (Invitrogen) (Invitrogen) was introduced.
- a gene expressing EBNA1 (SEQ ID NO: 57) and a gene expressing biotin ligase (BirA, SEQ ID NO: 58) were simultaneously introduced, and biotin was added for the purpose of biotin labeling of hsIL-6R-Avitag.
- the protease cleavage sequence is near the boundary between VHH and heavy chain constant region. It was confirmed to be cleaved by the protease.
- binding evaluation of VHH released by protease treatment and IL-6R was performed using Octet HTX (ForteBio).
- hsIL-6R-BAP1 was bound to a streptavidin sensor (ForteBio, 18-5021), the cleaved IgG antibody-like molecule was allowed to act, and the binding at 30 ° C. was evaluated.
- a sensorgram representing the amount of binding over time measured by Octet HTX is shown in FIG.
- binding was confirmed in IL6R90H1002 / VK1-39-k0MT, IL6R90H1004 / VK1-39-k0MT, IL6R90H1005 / VK1-39-k0MT, and IL6R90H1006 / VK1-39-k0MT.
- IL6R90-G1m / k0 and IL6R90-G1m / lamL bind bivalently, they bind at avidity, whereas free VHH binds at affinity, and thus protease-treated IL6R90H1002 / VK1-39-k0MT, IL6R90H1004 / VK1-39-k0MT, IL6R90H1005 / VK1-39-k0MT, IL6R90H1006 / VK1-39-k0MT showed a faster dissociation rate from IL-6R compared to IL6R90-G1m / k0, IL6R90-G1m / lamL.
- VHH has a smaller molecular weight than IL6R90-G1m / k0 and IL6R90-G1m / lamL
- the binding amount is correspondingly lower. From these results, IL6R90H1002 / VK1-39-k0MT, IL6R90H1004 / VK1-39-k0MT, IL6R90H1005 / VK1-39-k0MT, and IL6R90H1006 / VK1-39-k0MT show binding activity to IL-6R as it is.
- VK1-39-k0MT SEQ ID NO: 3
- VK2-28-k0MT SEQ ID NO: 4
- VK3-20-k0MT SEQ ID NO: 5
- VL1-40-lamL In the same manner as in Example 3 using SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14-lamL (SEQ ID NO: 8), VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9) 20A11-G1m / VK1-39-k0MT, 20A11-G1m / VK2-28-k0MT, 20A11-G1m / VK3-20-k0MT, 20A11-G1m / VL1-40-lamL, 20A11-G1m / VL1 according to the method of Expression and purification of -44-lamL, 20A11-G1m / VL2-14-lamL, and 20A11-G1m / VL1 according to the method of
- Example 5 Production of Protease-Activated Polypeptide Using Immunological Alpaca-Derived VHH 5-1. Acquisition of immune alpaca-derived VHH IL-6R, CD3 and Plexin A1 were immunized with alpaca by a method known to those skilled in the art, and PBMCs were recovered 4 and 8 weeks later. From the collected PBMCs, the VHH gene was amplified with reference to the method described in J. Immunol. Methods (2007) 324, 13. The amplified VHH gene fragment was connected to the gene 3 gene and inserted into a phagemid vector. The phagemid vector into which the VHH fragment had been inserted was introduced into E.
- an Anti-FLAG M2 column was used to fractionate the CD3 ⁇ heterodimer (referred to as human CD3ed-Fc) to which the antibody constant region is fused.
- gel filtration chromatography Superdex 200, GE Healthcare
- Phage production was carried out from E. coli carrying the constructed phagemid for phage display.
- a phage library solution was obtained by diluting with TBS a population of phage precipitated by adding 2.5 M NaCl / 10% PEG to a culture solution of phage-produced E. coli.
- the phage library solution was brought into contact with the antigen for 60 minutes at room temperature by adding 100 pmol of biotin-labeled antigen to the prepared phage library solution.
- BSA-blocked magnetic beads were added and the antigen-phage complex was allowed to bind to the magnetic beads for 15 minutes at room temperature.
- the beads were washed twice with 0.5 mL TBST (TBS containing 0.1% Tween 20, TBS manufactured by TaKaRa), and then washed once more with 0.5 mL TBS. Thereafter, 0.5 mL of 1 mg / mL trypsin-added beads were suspended at room temperature for 15 minutes, and the beads were immediately separated using a magnetic stand to recover a phage solution.
- the recovered phage solution was added to 20 mL of E. coli strain ER2738 in a logarithmic growth phase (OD600 of 0.4 to 0.5).
- the phage was infected with E. coli by stirring the E. coli gently at 37 ° C. for 1 hour.
- the infected E. coli was plated on 225 mm x 225 mm plates.
- a phage library solution was prepared by recovering the phage from the culture solution of the inoculated E. coli. This cycle was called panning and was repeated twice in all. In the second round of panning, the beads were washed three times with TBST and twice with TBS.
- 4 nmol of human Fc was added at the time of binding of human CD3ed-Fc to phage.
- protease activated IgG antibody-like molecules shown in Table 3 below are expressed by transient expression using FreeStyle 293 cells (Invitrogen) by methods known to those skilled in the art, and purified by methods known to those skilled in the art using Protein A.
- FreeStyle 293 cells Invitrogen
- VHHs binding to a plurality of CD3s obtained by the same method as VHHs described in Table 2 are also IgG-like molecules containing protease cleavage sites similar to the IgG antibody-like molecules described in Table 3.
- binding to the antigen was confirmed by protease treatment.
- the protease cleavage sequence is cleaved by protease treatment to release the antigen binding domain, and the released antigen binding domain
- An IgG antibody-like molecule was shown that is capable of binding to an antigen.
- Example 6 Polypeptide in which a Protease Cleavage Sequence was Introduced into the Light Chain VK 1-39 P-2-Pk 0 MT (SEQ ID NO: 67) in which a protease cleavage sequence was incorporated at each position of the light chain as in Example 3
- VK 1-39 P- 1-Pk0MT SEQ ID NO: 68
- VK 1-39 P-Pk 0 MT SEQ ID NO: 69
- VK 1-39 P + 2-Pk 0 MT SEQ ID NO: 70
- VK 1-39 P + 3-Pk 0 MT SEQ ID NO: 71
- VK1-39P + 4-Pk0MT SEQ ID NO: 72
- VK1-39P + 5-Pk0MT SEQ ID NO: 73
- IgG antibody-like molecule using these light chains and IL6R90-G1m (SEQ ID NO: 2) as a heavy chain were carried out in the same manner as in Example 3.
- the protease concentration was 25 nM.
- IL6R90-G1m / VK1-39-k0MT (heavy chain SEQ ID NO: 2, light chain SEQ ID NO: 3) was used as an IgG antibody-like molecule to which no cleavage sequence had been introduced.
- the prepared IgG antibody-like molecule was cleaved with a protease in the same manner as in Example 3, and the degree of cleavage was evaluated by reducing SDS-PAGE. The results are shown in FIG.
- VK1-39P + 2-Pk0MT SEQ ID NO: 70
- VK1-39P + 3-Pk0MT SEQ ID NO: 71
- VK1-39P + 4-Pk0MT SEQ ID NO: 72
- VK1-39P + In 5-Pk0MT SEQ ID NO: 73
- Example 7 Preparation of a library comprising a heavy chain having an antigen binding domain and a light chain into which a protease cleavage sequence has been introduced, and a protease display polypeptide from the library by phage display method
- a protease Even when a protease cleavage sequence is introduced into the light chain of the activated polypeptide, the antigen binding domain is exposed after light chain cleavage and binds to the antigen. Therefore, a heavy chain containing an antigen binding domain such as a single domain antibody and a light chain into which a protease cleavage sequence has been introduced are incorporated into a phagemid and displayed on a phage.
- a plurality of phage display phagemids containing different types of antigen binding domains are constructed, and phage production is carried out from E. coli carrying these phagemids.
- a phage library solution is obtained by diluting with TBS a population of phages precipitated by adding 2.5 M NaCl / 10% PEG to a culture solution of phage-produced E. coli.
- BSA is added to the phage library solution to a final concentration of 4% BSA.
- a protease activation polypeptide is obtained by panning from the phage library prepared as described above.
- a panning method a panning method using an antigen immobilized on magnetic beads, which is a general method, is referred to (J. Immunol. Methods.
- NeutrAvidin coated beads Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated, FG beads NeutrAvidin
- Streptavidin coated beads Dynabeads M-280 Streptavidin
- clones may be selected which bind to the antigen by the phage ELISA described in the preceding paragraph, or the antibody gene is subcloned into a vector for animal expression and expressed using animal cells, binding before and after protease treatment The activity is compared to select bound clones.
- Example 8 Preparation of a Library Containing a Heavy Chain and a Light Chain Having an Antigen Binding Domain, and Preparation of a Heavy Chain from which the Antigen Binding Ability is Controlled by the Light Chain by Phage Display Method
- Chain association controls the antigen binding ability of heavy chains comprising the antigen binding domain. Therefore, a heavy chain that loses antigen binding ability when associated with a light chain and exhibits antigen binding ability when displaying only a heavy chain or a heavy chain and a light chain constant region is obtained by phage display method.
- a heavy chain containing an antigen binding domain such as a single domain antibody is incorporated into a phagemid and displayed on a phage.
- the panning method using the antigen immobilized on magnetic beads described in Example 5 is referred to.
- phage bound to magnetic beads on which the antigen is immobilized is recovered.
- the recovered phage is used to infect E. coli, and a helper phage that expresses a light chain is used to produce a phage that displays a heavy chain and a light chain.
- a phage displaying a heavy chain and a light chain containing an antigen binding domain is obtained by the method described above.
- phage that do not bind to the magnetic beads on which the antigen is immobilized are recovered.
- FIG. 9D in panning, recovery of phage populations displaying only heavy chain or heavy chain and light chain constant region binding to magnetic beads to which antigen is immobilized, and antigen is immobilized
- the order of recovery of phage populations displaying heavy and light chains that do not bind to magnetic beads may be reversed.
- a region encoding the light chain is incorporated into the same phagemid as in the heavy chain as usual, and a gene encoding only the light chain constant region or the entire light chain is used for each panning.
- clones may be selected which bind to the antigen by the phage ELISA described in the preceding paragraph, or the antibody gene is subcloned into a vector for animal expression and expressed using animal cells, binding before and after protease treatment The activity is compared to select bound clones.
- a promoter, a signal sequence, an antibody light chain variable region and a light chain can be identified in the helper phage genome.
- a light chain expression helper phage was constructed by incorporating a constant region gene or a light chain constant region gene. From E. coli infected with this helper phage, expression of antibody light chain variable region and light chain constant region, or only light chain constant region is possible. Specifically, genome extraction of helper phage M13KO7TC constructed by the method described in International Publication WO2015 / 046554 was performed to introduce a light chain expression unit.
- a gene encoding a light chain variable region and a light chain constant region (VK1-39-k0MTdC, SEQ ID NO: 152), or a gene encoding a light chain constant region (k0MTdC, SEQ ID NO: 153) as the light chain gene to be introduced was used.
- lac promoter-pelB signal sequence The light chain gene was inserted into M13KO7TC / SacI by the method described above, and introduced into E. coli strain ER2738 by electroporation. The obtained E. coli was cultured, and 2.5 M NaCl / 10% PEG was added to the culture supernatant to purify the helper phage by PEG precipitation.
- the titers of the obtained helper phages M13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC and M13KO7TC-k0MTdC were confirmed by a general plaque forming method.
- VHH-CH1 expressed from phagemid vector and full-length light chain expressed from helper phage Forms a Fab structure, and a phage population displaying VHH-CH1 / full-length light chain (VHH-CH1 / Vk1-39-k0MTdC) can be prepared on the surface of a phagemid containing a gene encoding VHH-CH1.
- coli cultured with a phagemid vector into which the gene encoding VHH-CH1 has been inserted is cultured, and the helper phage M13KO7TC-k0MTdC prepared in Example 9-1 is infected to express VHH- expressed from the phagemid vector.
- a light chain constant region expressed from CH1 and helper phage forms a structure in which VHH-CH1 and CL are associated, and a phage population displaying VHH-CH1 / light chain constant region (VHH-CH1 / k0MTdC) can be prepared.
- Phage can be purified by PEG precipitation by adding 2.5 M NaCl / 10% PEG to the culture supernatant.
- the titer of the obtained phage can be confirmed by a general plaque forming method.
- the biotin-labeled human Plexin A1 prepared in the reference example was used as an antigen.
- a phage population displaying VHH-CH1 / light chain constant region (VHH-CH1 / k0MTdC) is prepared by the method of Example 9-3
- the phages bound to the magnetic beads on which the antigen is immobilized are recovered from the inside (2) against the recovered phages by the method of Example 9-3 by the method of VHH-CH1 / full-length light chain (VHH-CH1 / Vk1- Producing a phage population displaying 39-k0MTdC) and recovering phages not bound to the magnetic beads on which the antigen is immobilized
- a phage population displaying VHH-CH1 / light chain constant region (VHH-CH1 / k0MTdC) was prepared by the method of Example 9-3 for the VHH-CH1 phage library prepared in Example 9-2 To recover phages bound to magnetic beads on which the antigen is immobilized;
- a phage population displaying VHH-CH1 / full-length light chain (VHH-CH1 / Vk1-39-k0MTdC) was prepared for the recovered phage by the method of Example 9-3, and the antigen was immobilized from the inside Recover phages that do not bind to the magnetic beads, and further collect phages that bind to the magnetic beads to which the anti-light chain antibody (EY Laboratories, Cat.
- Example 9-6 Activation by Protease Cleavage of Protease Activated IgG Antibody-Like Molecule
- the IgG antibody-like molecule prepared in Example 9-4 is cleaved with a protease in the same manner as in Example 3, and the degree of cleavage is reduced by SDS-PAGE.
- the results of evaluation by are shown in FIG.
- the protease concentration was 25 nM.
- it was confirmed that the protease cleavage sequence in each of the prepared IgG antibody-like molecules was cleaved by the protease.
- binding evaluation of VHH released by protease treatment and human Plexin A1 was performed in the same manner as in Example 3.
- the octet sensorgram is shown in FIG.
- the IgG antibody-like molecule before the protease treatment showed no antigen binding, whereas the antigen binding by the free VHH was confirmed after the protease treatment.
- IgG antibody-like molecule IL6R90-G1T4 / VK1-39-k0MT (heavy chain SEQ ID NO: 167, light chain SEQ ID NO: 3), was used to determine FreeStyle293 cells (Invitrogen) or Expi293 cells (Life technologies) by methods known to those skilled in the art. It was expressed by the transient expression used and purified by a method known to those skilled in the art using protein A. Various protease cleavage sequences were inserted in the vicinity of the VHH-CH1 boundary of the heavy chain of IL6R90-G1T4 / VK1-39-k0MT.
- An expression vector of the protease cleavage sequence shown in Table 5 inserted in the vicinity of the boundary between VHH and CH1 was prepared by a method known to those skilled in the art.
- the VHH-containing heavy chain sequences into which protease cleavage sequences have been inserted are shown in Table 6. These heavy and light chains are combined, and protease cleavage sequences are inserted in the vicinity of the boundary between VHH and CH1.
- the IgG1 antibody-like molecules shown in Table 7 are FreeStyle 293 cells (Invitrogen) or Expi 293 cells (Life technologies) And expression was carried out, and purification was carried out by a method known to those skilled in the art using protein A.
- IL6R75hu-G1m (SEQ ID NO: 192) was prepared in which amino acid modification was introduced into the interface between VHH and VL.
- Light chain VK1-39P + 4-Pk0MT (SEQ ID NO: 72) into which a protease cleavage sequence has been incorporated, and IL6R90-G1m (SEQ ID NO: 2), 20A11hu-G1m (SEQ ID NO: 39) as heavy chain, IL6R75hu-G1m (SEQ ID NO: 39) IgG antibody-like molecule IL6R90-G1m / VK1-39P + 4-Pk0MT (heavy chain SEQ ID NO: 2, light chain SEQ ID NO: 72) using SEQ ID NO: 192), 20A11hu-G1m / VK1-39P + 4-Pk0MT Expression and purification of (heavy chain SEQ ID NO: 39, light chain SEQ ID NO: 72), IL6R75h
- IL6R90-G1m / VK1-39P + 4-Pk0MT 20A11hu-G1m / VK1-39P + 4-Pk0MT
- IL6R75hu-G1m / VK1-39P + 4-Pk0MT was cleaved with a protease in the same manner as in Example 3 and cleaved. The result of having evaluated the degree of is shown in FIG.
- hsIL-6R-BAP1 used in Example 3 was immobilized on a streptavidin-coated 384-well plate (Greiner, 781990), and the cleaved IgG antibody-like molecule was allowed to bind at room temperature. After reaction for 30 minutes, HRP-labeled anti-human IgG antibody (Sigma, SAB 3701362-2MG) was allowed to act for 10 minutes at room temperature, and reacted with TMB Chromogen Solution (life technologies, 002023). After reacting for 30 minutes at room temperature, the reaction was quenched with sulfuric acid, and absorbance at 450 nm was measured with a Synergy HTX multimode reader (BioTek).
- the ratio of the absorbance of the well to which the antigen was immobilized and the well that was not immobilized was calculated as the S / N ratio.
- the S / N ratio (average value) of ELISA is shown on the vertical axis
- the concentration of each IgG antibody-like molecule is shown on the horizontal axis
- the results are shown in FIG. From this result, after protease treatment of the IgG antibody-like molecule 20A11hu-G1m / VK1-39P + 4-Pk0MT in which the cleavage sequence has been introduced into the light chain, it binds to IL-6R compared to the protease-untreated IgG antibody-like molecule.
- the activity was 10 times or more, and it was shown that in the case of the IgG antibody-like molecules IL6R90-G1m / VK1-39P + 4-Pk0MT, the protease treatment increased the binding activity to IL-6R by 1000 times or more.
- Example 13 Preparation and evaluation of IgG antibody-like molecules into which various protease cleavage sequences have been introduced 13-1 Preparation of Polypeptides Into which Various Protease Cleavage Sequences were Introduced An IgG antibody-like molecule was prepared in the same manner as in Example 3 using recognition sequences of proteases other than urokinase and matriptase.
- a heavy chain was designed in which these sequences were inserted near the boundary between the variable region and the constant region of IL6R90-G1m.
- the heavy chain variant 6R90 EIVH EMP 2.1-6 R90 EICH EMP 2.1 G1m (SEQ ID NO: 165), 6R90 EIVH EMP 2.2-6 R 90 EI CHEMP 2.2 G1 m (SEQ ID NO: 202), 6 R 90 EI VHI EMP 2.3-6 R 90 EI CHEMP 2.3 G1 m (Seq.
- Table 9 shows IgG antibody-like molecules in which these heavy chain variants and light chains are combined and a protease cleavage sequence is inserted in the vicinity of the boundary between the variable region and constant region of heavy chain.
- IgG antibody-like molecules are expressed by transient expression using FreeStyle 293 cells (Invitrogen) or Expi 293 cells (Life technologies) by methods known to those skilled in the art, and purification is carried out by methods known to those skilled in the art using Protein A The
- MMP-2, MMP-7, MMP-9 and MMP-13 were mixed with 1 MMP-aminophenylmercuric acetate (APMA; abcam, ab112146) and activated at 37 ° C. for 1 or 24 hours, respectively.
- FIGS. 30A and 30B After reacting for 20 hours under conditions, the results of evaluating the cleavage by the protease by reducing SDS-PAGE are shown in FIGS. 30A and 30B.
- cleavage with protease was performed using assay buffer (MMP Activity Assay Kit (Fluorometric-Green) (ab112146), Component C: Assay Buffer).
- the antibody variant prepared in 14-1 was cleaved by protease treatment or verified by SDS-PAGE.
- the recombinant human u-Plasminogen Activator / Urokinase (human uPA, huPA) (R & D Systems, 1310-SE-010) is used as a protease, and the reaction is carried out under the conditions of 40 nM protease, 100 ⁇ g / mL antibody, PBS at 37 ° C. for 1 hour After that, it was subjected to reducing SDS-PAGE.
- the peak of the uncleaved full-length light chain was detected at around 36 kDa
- the peak of the full-length heavy chain was detected at around 56 kDa. Since the light chain of Mab KL Hn is a kappa chain and is not detected by an anti-human lambda chain antibody, it is possible to evaluate the cleavage efficiency of a light chain into which a protease cleavage sequence has been introduced by using an anti-human lambda chain antibody.
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Abstract
Description
本発明は、このような考えに基づき為されたものであり、その目的の一つは、副作用を低減した疾患治療に有用な医薬組成物、およびその有効成分を提供することにある。また、その目的の一つは、当該医薬組成物および当該有効成分のスクリーニング方法ならびに製造方法を提供することにある。
(1)ポリペプチドであって、当該ポリペプチドは抗原結合ドメインと運搬部分とを含み、当該運搬部分は前記抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有し、前記抗原結合ドメインは前記運搬部分より短い血中半減期を有する、ポリペプチド。
(2)前記抗原結合ドメインの分子量は前記運搬部分の分子量より小さい、(1)に記載のポリペプチド。
(3)前記抗原結合ドメインの分子量は60kDa以下である、(1)または(2)に記載のポリペプチド。
(4)前記運搬部分はFcRn結合活性を有し、前記抗原結合ドメインはFcRn結合活性を有さないまたは前記運搬部分より弱いFcRn結合活性を有する、(1)から(3)のいずれかに記載のポリペプチド。
(5)前記抗原結合ドメインは前記ポリペプチドから遊離可能であり、前記抗原結合ドメインは前記ポリペプチドから遊離することで、抗原結合活性が遊離前より高くなる、(1)から(4)のいずれかに記載のポリペプチド。
(6)前記抗原結合ドメインと前記運搬部分の前記抑制ドメインが会合することで前記抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制される、(1)から(5)のいずれかに記載のポリペプチド。
(7)前記ポリペプチドは切断サイトを含み、当該切断サイトが切断されることにより前記抗原結合ドメインが前記ポリペプチドから遊離可能になる、(5)に記載のポリペプチド。
(8)前記ポリペプチドは切断サイトを含み、当該切断サイトが切断されることにより前記抗原結合ドメインと前記運搬部分の前記抑制ドメインの会合が解消される、(6)に記載のポリペプチド。
(9)前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、(7)または(8)に記載のポリペプチド。
(10)前記プロテアーゼは、標的組織特異的プロテアーゼである、(9)に記載のポリペプチド。
(11)前記標的組織は癌組織または炎症組織である、(10)に記載のポリペプチド。
(12)前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、メタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、(9)に記載のポリペプチド。
(13)前記プロテアーゼは、MT-SP1、uPA、MMP-2、MMP-9、ADAMTS5、MMP-7、MMP-13から選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、(12)に記載のポリペプチド。
(14)前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号:12、25、34、35、70~73、75、76、91、168~178、193~195、833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含む、(9)に記載のポリペプチド。
(15)前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、(9)から(14)のいずれかに記載のポリペプチド。
(16)前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、(15)に記載のポリペプチド。
(17)前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(15)に記載のポリペプチド。
(18)前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(16)に記載のポリペプチド。
(19)前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体を含み、もしくは単ドメイン抗体であり、前記運搬部分の前記抑制ドメインは当該単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制する、(1)から(18)のいずれかに記載のポリペプチド。
(20)前記単ドメイン抗体は、VHH、または単ドメインで抗原結合活性を有するVH、または単ドメインで抗原結合活性を有するVLである、(19)に記載のポリペプチド。
(21)前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体を含み、前記運搬部分の前記抑制ドメインはVHH、または抗体VH、または抗体VLであり、前記単ドメイン抗体は当該VHH、または抗体VH、または抗体VLにより抗原結合活性が抑制される、(1)から(20)のいずれかに記載のポリペプチド。
(22)前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体を含み、前記運搬部分の前記抑制ドメインはVHH、または抗体VH、または抗体VLであり、前記単ドメイン抗体は当該VHH、または抗体VH、または抗体VLと会合することにより抗原結合活性が抑制される、(1)から(21)のいずれかに記載のポリペプチド。
(23)前記単ドメイン抗体はVHH、または単ドメインで抗原結合活性を有するVHであり、前記運搬部分の前記抑制ドメインは抗体VLであり、前記VHHまたは単ドメインで抗原結合活性を有するVHは、前記抗体VLと会合することで抗原結合活性が抑制される、(19)から(22)のいずれかに記載のポリペプチド。
(24)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37番、44番、45番、または47番(すべてKabatナンバリング)のアミノ酸から選ばれる少なくとも一つのポジションにおいてアミノ酸置換されている、(19)から(23)のいずれかに記載のポリペプチド。
(25)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37V、44G、45L、または47W(すべてKabatナンバリング)のアミノ酸から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含む、(19)から(23)のいずれかに記載のポリペプチド。
(26)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHはF37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W、またはS47W(すべてKabatナンバリング)のアミノ酸置換から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、(19)から(23)のいずれかに記載のポリペプチド。
(27)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37番/44番、37番/45番、37番/47番、44番/45番、44番/47番、45番/47番、37番/44番/45番、37番/44番/47番、37番/45番/47番、44番/45番/47番、37番/44番/45番/47番(すべてKabatナンバリング)から選ばれる少なくとも一組のポジションにおいてアミノ酸置換されている、(19)から(23)のいずれかに記載のポリペプチド。
(28)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37V/44G、37V/45L、37V/47W、44G/45L、44G/47W、45L/47W、37V/44G/45L、37V/44G/47W、37V/45L/47W、44G/45L/47W、37V/44G/45L/47W(すべてKabatナンバリング)から選ばれる少なくとも一組のアミノ酸を含む、(19)から(23)のいずれかに記載のポリペプチド。
(29)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHはF37V/R45L、F37V/G47W、R45L/G47W、F37V/R45L/G47W(すべてKabatナンバリング)から選ばれる少なくとも一組のアミノ酸置換を含む、(19)から(23)のいずれかに記載のポリペプチド。
(30)前記単ドメイン抗体は単ドメインで抗原結合活性を有するVLであり、前記運搬部分の前記抑制ドメインは抗体VHであり、前記単ドメインで抗原結合活性を有するVLは、前記抗体VHと会合することで抗原結合活性が抑制される、(19)から(22)のいずれかに記載のポリペプチド。
(31)前記運搬部分はFcRn結合領域を有する、(1)から(30)のいずれかに記載のポリペプチド。
(32)前記運搬部分は抗体定常領域を含む、(1)から(31)のいずれかに記載のポリペプチド。
(33)前記運搬部分の抗体定常領域と前記抗原結合ドメインは、リンカーを介して、またはリンカーを介さずに融合されている、(32)に記載のポリペプチド。
(34)前記運搬部分は抗体重鎖定常領域を含み、当該抗体重鎖定常領域と前記抗原結合ドメインは、リンカーを介して、またはリンカーを介さずに融合されている、(32)に記載のポリペプチド。
(35)前記運搬部分は抗体軽鎖定常領域を含み、当該抗体軽鎖定常領域と前記抗原結合ドメインは、リンカーを介して、またはリンカーを介さずに融合されている、(32)に記載のポリペプチド。
(36)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体重鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、更にプロテアーゼ切断配列を有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの配列中、または前記重鎖抗体定常領域の122番(EUナンバリング)のアミノ酸より前記抗原結合ドメイン側に位置する、(34)に記載のポリペプチド。
(37)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体軽鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、更にプロテアーゼ切断配列を有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの配列中、または前記軽鎖抗体定常領域の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸より前記抗原結合ドメイン側に位置する、(35)に記載のポリペプチド。
(38)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記抗原結合ドメインはVHから作製された単ドメイン抗体またはVHHであり、前記ポリペプチドは更にプロテアーゼ切断配列を有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗体定常領域の配列中、または前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸より前記抗体定常領域側に位置する、(33)から(35)のいずれかに記載のポリペプチド。
(39)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、更にプロテアーゼ切断配列を有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記抗体定常領域の境界付近に位置する、(33)に記載のポリペプチド。
(40)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体重鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、更にプロテアーゼ切断配列を有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記抗体重鎖定常領域の境界付近に位置する、(34)に記載のポリペプチド。
(41)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体軽鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、更にプロテアーゼ切断配列を有し、当該プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記抗体軽鎖定常領域の境界付近に位置する、(35)に記載のポリペプチド。
(42)前記抗原結合ドメインはVHから作製された単ドメイン抗体またはVHHであり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体重鎖定常領域の122番(EUナンバリング)のアミノ酸の間に位置する、(40)に記載のポリペプチド。
(43)前記抗原結合ドメインはVHから作製された単ドメイン抗体またはVHHであり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体軽鎖定常領域の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸の間に位置する、(41)に記載のポリペプチド。
(44)前記抗原結合ドメインはVLから作製された単ドメイン抗体であり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の104番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体重鎖定常領域の122番(EUナンバリング)のアミノ酸の間に位置する、(40)に記載のポリペプチド。
(45)前記抗原結合ドメインはVLから作製された単ドメイン抗体であり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体軽鎖定常領域の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸の間に位置する、(41)に記載のポリペプチド。
(46)前記ポリペプチドの抗体定常領域はIgG抗体定常領域である、(32)から(45)のいずれかに記載のポリペプチド。
(47)前記ポリペプチドはIgG抗体様分子である、(1)から(46)のいずれかに記載のポリペプチド。
(48)前記抗原結合ドメインが未遊離の状態において、BLI(Bio-Layer Interferometry)法(Octet)を用いて測定を行うとき、抗原結合ドメインと抗原の結合が見られない、(1)から(47)のいずれかに記載のポリペプチド。
(49)前記抗原結合ドメインに更に第2の抗原結合ドメインが連結されている、(1)から(48)のいずれかに記載のポリペプチド。
(50)前記第2の抗原結合ドメインは、前記抗原結合ドメインと異なる抗原結合特異性を有する、(49)に記載のポリペプチド。
(51)前記第2の抗原結合ドメインは第2の単ドメイン抗体を含む、(49)または(50)に記載のポリペプチド。
(52)前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体であり、前記第2の抗原結合ドメインは第2の単ドメイン抗体であり、前記抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインは前記ポリペプチドから遊離可能であり、前記抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインの遊離状態において、前記単ドメイン抗体と前記第2の単ドメイン抗体とが二重特異的抗原結合分子を形成している、(51)に記載のポリペプチド。
(53)前記第2の抗原結合ドメインは、HER2またはGPC3を標的抗原とする、(49)から(52)のいずれかに記載のポリペプチド。
(54)前記ポリペプチドは、前記抗原結合ドメインと別の抗原結合ドメインを更に有し、当該別の抗原結合ドメインも前記ポリペプチドの前記運搬部分と連結することにより抗原結合活性が抑制される、(1)から(53)のいずれかに記載のポリペプチド。
(55)前記別の抗原結合ドメインと前記抗原結合ドメインと異なる抗原結合特異性を有する、(54)に記載のポリペプチド。
(56)前記抗原結合ドメインは、PlexinA1、IL-6RまたはCD3を標的抗原とする抗原結合ドメインである、(1)から(55)のいずれかに記載のポリペプチド。
(57)(1)から(56)のいずれかに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
(58)(1)から(56)のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
(59)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該単ドメイン抗体と当該運搬部分を連結させてポリペプチド前駆体を形成させる工程;
(c) 前記ポリペプチド前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(58)に記載の製造方法。
(60)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該単ドメイン抗体と当該運搬部分を連結させてポリペプチド前駆体を形成させる工程;
(c) 前記単ドメイン抗体と前記運搬部分との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(58)に記載の製造方法。
(61)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該単ドメイン抗体を、プロテアーゼ切断配列を介して当該運搬部分と連結させてポリペプチドを形成させる工程;
を含む、(58)に記載の製造方法。
(62)更に以下の工程:
(d) 前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチド前駆体中に組み込まれた前記単ドメイン抗体の前記標的抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(59)から(61)のいずれかに記載の製造方法。
(63)更に以下の工程:
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することで前記単ドメイン抗体を遊離させ、遊離の単ドメイン抗体が抗原に結合することを確認する工程;
を含む、(59)から(62)のいずれかに記載の製造方法。
(64)前記ポリペプチドはIgG抗体様分子である、(58)に記載の製造方法。
(65)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVHの代わりとしてVLと会合させ、または当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVLの代わりとしてVHと会合させることによって、前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(64)に記載の製造方法。
(66)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVHの代わりとしてVLと会合させ、または当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVLの代わりとしてVHと会合させることによって、前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記単ドメイン抗体と前記IgG抗体様分子前駆体中の抗体定常領域との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(64)に記載の製造方法。
(67)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体VHまたはVLの代わりとして、プロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の重鎖定常領域または軽鎖定常領域と連結させ、前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子を形成させる工程;
を含む、(64)に記載の製造方法。
(68)更に以下の工程:
(d) 前記IgG抗体様分子または前記IgG抗体様分子前駆体に導入された前記単ドメイン抗体の前記標的抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(65)から(67)のいずれかに記載の製造方法。
(69)更に以下の工程:
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することで前記単ドメイン抗体を遊離させ、遊離の単ドメイン抗体が前記標的抗原に結合することを確認する工程;
を含む、(65)から(68)のいずれかに記載の製造方法。
(70)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
(b) (a)工程で作製した改変単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制するように、当該改変単ドメイン抗体を抗体VHと会合させ、または当該改変単ドメイン抗体を抗体VLと会合させることによって、当該改変単ドメイン抗体が導入された当該IgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記改変単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(64)に記載の製造方法。
(71)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
(b) (a)工程で作製した改変単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制するように、当該改変単ドメイン抗体を抗体VHと会合させ、または当該改変単ドメイン抗体を抗体VLと会合させることによって、当該改変単ドメイン抗体が導入された当該IgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記改変単ドメイン抗体と前記IgG抗体様分子前駆体の定常領域との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(64)に記載の製造方法。
(72)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
(b) (a)工程で作製した改変単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制するように、当該改変単ドメイン抗体をプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の重鎖定常領域と連結させ、または当該改変単ドメイン抗体をプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の軽鎖定常領域と連結させ、当該改変単ドメイン抗体が導入された当該IgG抗体様分子を形成させる工程;
を含む、(64)に記載の製造方法。
(73)更に以下の工程:
(d) 前記IgG抗体様分子または前記IgG抗体様分子前駆体に導入された前記改変単ドメイン抗体の前記標的抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(70)から(72)のいずれかに記載の製造方法。
(74)更に以下の工程:
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することで前記改変単ドメイン抗体を遊離させ、遊離の改変単ドメイン抗体が前記標的抗原に結合することを確認する工程;
を含む、(70)から(73)のいずれかに記載の製造方法。
(75)(1)から(56)のいずれかに記載のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド。
(76)(75)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(77)(75)に記載のポリヌクレオチドまたは(76)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(78)(77)に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、(1)から(56)のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
(79)特定のVLと会合することで、もしくは特定のVHと会合することで、もしくは特定のVHHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体をスクリーニングする方法。
(80)特定のVLと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体をスクリーニングする、(79)に記載のスクリーニング方法。
(81)以下の工程:
(a) 標的抗原結合活性を有する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体を特定のVLと会合させる工程;
(c) (b)工程で特定のVLと会合させた前記単ドメイン抗体の前記抗原に対する結合活性が会合前と比較して弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(80)に記載のスクリーニング方法。
(82)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体を特定のVLと会合させる工程;
(b) (a)工程で特定のVLと会合させた前記単ドメイン抗体の前記抗原に対する結合活性がないもしくは一定値以下である、VLと単ドメイン抗体の会合体を選択する工程;
(c) (b)工程で選択した会合体中の単ドメイン抗体の、前記特定のVLと会合していない状態での前記抗原に対する結合活性が会合時と比較して強くなっていることを確認する工程;
を含む、(80)に記載のスクリーニング方法。
(83)特定のVHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体をスクリーニングする、(79)に記載のスクリーニング方法。
(84)以下の工程:
(a) 標的抗原結合活性を有する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体を特定のVHと会合させる工程;
(c) (b)工程で特定のVHと会合させた前記単ドメイン抗体の前記抗原に対する結合活性が会合前と比較して弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(83)に記載のスクリーニング方法。
(85)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体を特定のVHと会合させる工程;
(b) (a)工程で特定のVHと会合させた前記単ドメイン抗体の前記抗原に対する結合活性がないもしくは一定値以下である、VHと単ドメイン抗体の会合体を選択する工程;
(c) (b)工程で選択した会合体中の単ドメイン抗体の、前記特定のVHと会合していない状態での前記抗原に対する結合活性が会合時と比較して強くなっていることを確認する工程;
を含む、(83)に記載のスクリーニング方法。
(86)特定のVHHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体をスクリーニングする、(79)に記載のスクリーニング方法。
(87)以下の工程:
(a) 標的抗原結合活性を有する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体を特定のVHHと会合させる工程;
(c) (b)工程で特定のVHHと会合させた前記単ドメイン抗体の前記抗原に対する結合活性が会合前と比較して弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(86)に記載のスクリーニング方法。
(88)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体を特定のVHHと会合させる工程;
(b) (a)工程で特定のVHHと会合させた前記単ドメイン抗体の前記抗原に対する結合活性がないもしくは一定値以下である、VHHと単ドメイン抗体の会合体を選択する工程;
(c) (b)工程で選択した会合体中の単ドメイン抗体の、前記特定のVHHと会合していない状態での前記抗原に対する結合活性が会合時と比較して強くなっていることを確認する工程;
を含む、(86)に記載のスクリーニング方法。
(89)特定のVLと会合することで、もしくは特定のVHと会合することで、もしくは特定のVHHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を製造する方法。
(90)特定のVLと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を製造する、(89)に記載の製造方法。
(91)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
を含む、(90)に記載の製造方法。
(92)更に以下の工程:
(b) (a)工程で作製された改変単ドメイン抗体を前記VLと会合させる工程;
(c) 当該VLと会合させた前記改変単ドメイン抗体の抗原結合活性が会合前と比較して弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(91)に記載の製造方法。
(93)特定のVHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を製造する、(89)に記載の製造方法。
(94)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
を含む、(93)に記載の製造方法。
(95)更に以下の工程:
(b) (a)工程で作製された改変単ドメイン抗体を前記VHと会合させる工程;
(c) 当該VHと会合させた前記改変単ドメイン抗体の抗原結合活性が会合前と比較して弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(94)に記載の製造方法。
(96)特定のVHHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を製造する、(89)に記載の製造方法。
(97)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体中の、VHHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
を含む、(96)に記載の製造方法。
(98)更に以下の工程:
(b) (a)工程で作製された改変単ドメイン抗体を前記VHHと会合させる工程;
(c) 当該VHHと会合させた前記改変単ドメイン抗体の抗原結合活性が会合前と比較して弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(97)に記載の製造方法。
(99)単ドメイン抗体と第1会合支持ドメインとを連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記単ドメイン抗体は、特定のVLと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体、または特定のVHと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体、または特定のVHHと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体を含む、ライブラリ。
(100)前記ライブラリ中の融合ポリペプチドの単ドメイン抗体部分は、ラクダ科動物もしくは単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物から取得した単ドメイン抗体もしくはそのヒト化抗体、またはラクダ科動物もしくは単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物を免疫させることで取得した単ドメイン抗体もしくはそのヒト化抗体、またはヒト抗体VHもしくはVLから出発して人工的に作製された単ドメイン抗体を含む、(99)に記載のライブラリ。
(101)単ドメイン抗体と第1会合支持ドメインとを連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記単ドメイン抗体は、特定のVLと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体を含む、(99)または(100)に記載のライブラリ。
(102)単ドメイン抗体と第1会合支持ドメインとを連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記単ドメイン抗体は、特定のVHと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体を含む、(99)または(100)に記載のライブラリ。
(103)単ドメイン抗体と第1会合支持ドメインとを連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリであって、前記単ドメイン抗体は、特定のVHHと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体を含む、(99)または(100)に記載のライブラリ。
(104)(99)または(100)に記載のライブラリから、特定のVLと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体、または特定のVHと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体、または特定のVHHと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドをスクリーニングする方法。
(105)(101)に記載のライブラリから、特定のVLと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドをスクリーニングする方法。
(106)以下の工程:
(a) 前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVLと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) (a)工程でディスプレイされた融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、単ドメイン抗体と前記VLが会合する状態で抗原と結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程で選択された融合ポリペプチドから、含まれる単ドメイン抗体と前記VLが会合しない状態で抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(105)に記載のスクリーニング方法。
(107)前記(b)工程で用意された会合パートナーはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程では、プロテアーゼ処理により前記会合パートナーを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VL会合を解消させる、(106)に記載のスクリーニング方法。
(108)前記(b)工程で用意された会合パートナーの前記プロテアーゼ切断配列は、前記特定のVLと前記第2会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(107)に記載のスクリーニング方法。
(109)前記ライブラリの融合ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程では、プロテアーゼ処理により前記融合ポリペプチドを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VL会合を解消させる、(106)に記載のスクリーニング方法。
(110)前記融合ポリペプチドに含まれるプロテアーゼ切断配列は、前記単ドメイン抗体と前記第1会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(109)に記載のスクリーニング方法。
(111)前記(d)工程では、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長もしくは単ドメイン抗体を含む部分を再度インビトロディスプレイさせる、(106)に記載のスクリーニング方法。
(112)前記(d)工程では、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長を再度インビトロディスプレイさせ、第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する、(106)に記載のスクリーニング方法。
(113)(102)に記載のライブラリから、特定のVHと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドをスクリーニングする方法。
(114)以下の工程:
(a) 前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) (a)工程でディスプレイした融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、単ドメイン抗体と前記VHが会合する状態で抗原と結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程で選択された融合ポリペプチドから、含まれる単ドメイン抗体と前記VHが会合しない状態で抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(113)に記載のスクリーニング方法。
(115)前記(b)工程で用意された会合パートナーはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程では、プロテアーゼ処理により前記会合パートナーを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VHの会合を解消させる、(114)に記載のスクリーニング方法。
(116)前記(b)工程で用意された会合パートナーの前記プロテアーゼ切断配列は、前記特定のVHと前記第2会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(115)に記載のスクリーニング方法。
(117)前記ライブラリの融合ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程では、プロテアーゼ処理により前記融合ポリペプチドを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VH会合を解消させる、(114)に記載のスクリーニング方法。
(118)前記融合ポリペプチドに含まれるプロテアーゼ切断配列は、前記単ドメイン抗体と前記第1会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(117)に記載のスクリーニング方法。
(119)前記(d)工程では、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長もしくは単ドメイン抗体を含む部分を再度インビトロディスプレイさせる、(114)に記載のスクリーニング方法。
(120)前記(d)工程では、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長を再度インビトロディスプレイさせ、第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する、(114)に記載のスクリーニング方法。
(121)(103)に記載のライブラリから、特定のVHHと会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドをスクリーニングする方法。
(122)以下の工程:
(a) 前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVHHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) (a)工程でディスプレイした融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、単ドメイン抗体と前記特定のVHHが会合する状態で抗原と結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程で選択された融合ポリペプチドから、含まれる単ドメイン抗体と前記VHHが会合しない状態で抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(121)に記載のスクリーニング方法。
(123)前記(b)工程で用意された会合パートナーはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程では、プロテアーゼ処理により前記会合パートナーを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VHHの会合を解消させる、(122)に記載のスクリーニング方法。
(124)前記(b)工程で用意された会合パートナーの前記プロテアーゼ切断配列は、前記特定のVHHと前記第2会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(123)に記載のスクリーニング方法。
(125)前記ライブラリの融合ポリペプチドはプロテアーゼ切断配列を更に含み、前記(d)工程では、プロテアーゼ処理により前記融合ポリペプチドを切断し、前記単ドメイン抗体と前記VHHの会合を解消させる、(122)に記載のスクリーニング方法。
(126)前記融合ポリペプチドに含まれるプロテアーゼ切断配列は、前記単ドメイン抗体と前記第1会合支持ドメインとの境界付近に位置する、(125)に記載のスクリーニング方法。
(127)前記(d)工程では、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長もしくは単ドメイン抗体を含む部分を再度インビトロディスプレイさせる、(122)に記載のスクリーニング方法。
(128)前記(d)工程では、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドの全長を再度インビトロディスプレイさせ、第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する、(122)に記載のスクリーニング方法。
(129)前記(b)工程中の会合パートナーを用意する工程は、会合パートナーと融合ポリペプチドを同時にディスプレイさせる工程である、(106)から(112)、(114)から(120)、(122)から(128)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(130)前記第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインまたは抗体軽鎖定常領域を含む、(99)から(103)のいずれかに記載のライブラリ。
(131)前記第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含み、前記第2会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含む、(106)から(112)、(114)から(120)、(122)から(128)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(132)前記第1会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含み、前記第2会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含む、(106)から(112)、(114)から(120)、(122)から(128)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(133)以下の工程:
(a) 前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVLと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) 前記融合ポリペプチドに含まれる単ドメイン抗体が抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程で選択された融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、単ドメイン抗体と前記VLが会合する状態で抗原と結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(105)に記載のスクリーニング方法。
(134)前記(d)工程では、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドを再度インビトロディスプレイさせる、(129)に記載のスクリーニング方法。
(135)前記(c)工程では、前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させる、または前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で融合ポリペプチドに含まれる単ドメイン抗体の抗原結合を確認する、(133)に記載のスクリーニング方法。
(136)以下の工程:
(a) 前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) 前記融合ポリペプチドに含まれる単ドメイン抗体が抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程で選択された融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、単ドメイン抗体と前記VHが会合する状態で抗原と結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(113)に記載のスクリーニング方法。
(137)前記(d)工程では、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドを再度インビトロディスプレイさせる、(136)に記載のスクリーニング方法。
(138)前記(c)工程では、前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させる、または前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で融合ポリペプチドに含まれる単ドメイン抗体の抗原結合を確認する、(136)に記載のスクリーニング方法。
(139)以下の工程:
(a)前記ライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b)特定のVHHと第2会合支持ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) 前記融合ポリペプチドに含まれる単ドメイン抗体が抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程で選択された融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、単ドメイン抗体と前記VHHが会合する状態で抗原と結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む、(121)に記載のスクリーニング方法。
(140)前記(d)工程では、前記(c)工程で選択された融合ポリペプチドを再度インビトロディスプレイさせる、(139)に記載のスクリーニング方法。
(141)前記(c)工程では、前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させる、または前記融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させた状態で融合ポリペプチドに含まれる単ドメイン抗体の抗原結合を確認する、(139)に記載のスクリーニング方法。
(142)前記(d)工程中の融合ポリペプチドと会合パートナーとを会合させる工程は、会合パートナーと融合ポリペプチドを同時にディスプレイさせる工程である、(133)から(141)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(143)前記第1会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含み、前記第2会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含む、(133)から(142)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(144)前記第1会合支持ドメインは抗体軽鎖定常領域を含み、前記第2会合支持ドメインはIgG抗体CH1ドメインを含む、(133)から(142)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(B1)ポリペプチドであって、当該ポリペプチドは抗原結合ドメインと運搬部分とを含み、当該運搬部分は前記抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有し、当該ポリペプチドは配列番号:833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含むプロテアーゼ切断配列を有する、ポリペプチド。
(B2)前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼにより切断された状態における前記抑制ドメインの前記抗原結合ドメインの抗原結合活性に対する抑制は、前記プロテアーゼ切断配列が未切断の状態における前記抑制ドメインの前記抗原結合ドメインの抗原結合活性に対する抑制より弱い、(B1)に記載のポリペプチド。
(B3)前記抗原結合ドメインは前記運搬部分より短い血中半減期を有する、(B1)または(B2)に記載のポリペプチド。
(B4)前記抗原結合ドメインの分子量は前記運搬部分の分子量より小さい、(B1)から(B3)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B5)前記抗原結合ドメインの分子量は60kDa以下である、(B1)から(B4)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B6)前記運搬部分はFcRn結合活性を有し、前記抗原結合ドメインはFcRn結合活性を有さないまたは前記運搬部分より弱いFcRn結合活性を有する、(B1)から(B5)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B7)前記抗原結合ドメインは前記ポリペプチドから遊離可能であり、前記抗原結合ドメインは、前記ポリペプチドから遊離している状態下における抗原結合活性は、前記ポリペプチドから遊離していない状態下における抗原結合活性より高い、(B1)から(B6)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B8)前記抗原結合ドメインと前記運搬部分の前記抑制ドメインが会合することで前記抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制される、(B1)から(B7)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B9)前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼにより切断されることで前記抗原結合ドメインが前記ポリペプチドから遊離可能になる、(B7)に記載のポリペプチド。
(B10)前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼにより切断されることで前記抗原結合ドメインと前記運搬部分の前記抑制ドメインの会合が解消される、(B8)に記載のポリペプチド。
(B11)前記プロテアーゼは、標的組織特異的プロテアーゼである、(B1)から(B10)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B12)前記標的組織は癌組織または炎症組織であり、前記プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼである、(B11)に記載のポリペプチド。
(B13)前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、メタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、(B1)から(B12)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B14)前記プロテアーゼは、MT-SP1、uPA、MMP-2、MMP-9、ADAMTS5、MMP-7、MMP-13から選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、(B1)から(B12)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B15)前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、(B1)から(B14)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B16)前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(B15)に記載のポリペプチド。
(B17)前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、(B15)または(B16)に記載のポリペプチド。
(B18)前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(B17)に記載のポリペプチド。
(B19)前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体を含み、もしくは単ドメイン抗体であり、前記運搬部分の前記抑制ドメインは当該単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制する、(B1)から(B18)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B20)前記単ドメイン抗体は、VHH、または単ドメインで抗原結合活性を有するVH、または単ドメインで抗原結合活性を有するVLである、(B19)に記載のポリペプチド。
(B21)前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体を含み、前記運搬部分の前記抑制ドメインはVHH、または抗体VH、または抗体VLであり、前記単ドメイン抗体は当該VHH、または抗体VH、または抗体VLにより抗原結合活性が抑制される、(B1)から(B20)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B22)前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体を含み、前記運搬部分の前記抑制ドメインはVHH、または抗体VH、または抗体VLであり、前記単ドメイン抗体は当該VHH、または抗体VH、または抗体VLと会合することにより抗原結合活性が抑制される、(B1)から(B21)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B23)前記単ドメイン抗体はVHH、または単ドメインで抗原結合活性を有するVHであり、前記運搬部分の前記抑制ドメインは抗体VLであり、前記VHHまたは単ドメインで抗原結合活性を有するVHは、前記抗体VLと会合することで抗原結合活性が抑制される、(B19)から(B22)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B24)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37番、44番、45番、または47番(すべてKabatナンバリング)のアミノ酸から選ばれる少なくとも一つのポジションにおいてアミノ酸置換されている、(B19)から(B23)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B25)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37V、44G、45L、または47W(すべてKabatナンバリング)のアミノ酸から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含む、(B19)から(B23)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B26)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHはF37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W、またはS47W(すべてKabatナンバリング)のアミノ酸置換から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、(B19)から(B23)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B27)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37番/44番、37番/45番、37番/47番、44番/45番、44番/47番、45番/47番、37番/44番/45番、37番/44番/47番、37番/45番/47番、44番/45番/47番、37番/44番/45番/47番(すべてKabatナンバリング)から選ばれる少なくとも一組のポジションにおいてアミノ酸置換されている、(B19)から(B23)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B28)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHは37V/44G、37V/45L、37V/47W、44G/45L、44G/47W、45L/47W、37V/44G/45L、37V/44G/47W、37V/45L/47W、44G/45L/47W、37V/44G/45L/47W(すべてKabatナンバリング)から選ばれる少なくとも一組のアミノ酸を含む、(B19)から(B23)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B29)前記単ドメイン抗体はVHHであり、当該VHHはF37V/R45L、F37V/G47W、R45L/G47W、F37V/R45L/G47W(すべてKabatナンバリング)から選ばれる少なくとも一組のアミノ酸置換を含む、(B19)から(B23)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B30)前記単ドメイン抗体は単ドメインで抗原結合活性を有するVLであり、前記運搬部分の前記抑制ドメインは抗体VHであり、前記単ドメインで抗原結合活性を有するVLは、前記抗体VHと会合することで抗原結合活性が抑制される、(B19)から(B22)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B31)前記運搬部分はFcRn結合領域を有する、(B1)から(B30)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B32)前記運搬部分は抗体定常領域を含む、(B1)から(B31)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B33)前記運搬部分の抗体定常領域と前記抗原結合ドメインは、リンカーを介して、またはリンカーを介さずに融合されている、(B32)に記載のポリペプチド。
(B34)前記運搬部分は抗体重鎖定常領域を含み、当該抗体重鎖定常領域と前記抗原結合ドメインは、リンカーを介して、またはリンカーを介さずに融合されている、(B32)に記載のポリペプチド。
(B35)前記運搬部分は抗体軽鎖定常領域を含み、当該抗体軽鎖定常領域と前記抗原結合ドメインは、リンカーを介して、またはリンカーを介さずに融合されている、(B32)に記載のポリペプチド。
(B36)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体重鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの配列中、または前記重鎖抗体定常領域の122番(EUナンバリング)のアミノ酸より前記抗原結合ドメイン側に位置する、(B34)に記載のポリペプチド。
(B37)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体軽鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの配列中、または前記軽鎖抗体定常領域の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸より前記抗原結合ドメイン側に位置する、(B35)に記載のポリペプチド。
(B38)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記抗原結合ドメインはVHから作製された単ドメイン抗体またはVHHであり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗体定常領域の配列中、または前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸より前記抗体定常領域側に位置する、(B33)から(B36)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B39)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記抗体定常領域の境界付近に位置する、(B33)に記載のポリペプチド。
(B40)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体重鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記抗体重鎖定常領域の境界付近に位置する、(B34)に記載のポリペプチド。
(B41)前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体軽鎖定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記抗体軽鎖定常領域の境界付近に位置する、(B35)に記載のポリペプチド。
(B42)前記抗原結合ドメインはVHから作製された単ドメイン抗体またはVHHであり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体重鎖定常領域の122番(EUナンバリング)のアミノ酸の間に位置する、(B40)に記載のポリペプチド。
(B43)前記抗原結合ドメインはVHから作製された単ドメイン抗体またはVHHであり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体軽鎖定常領域の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸の間に位置する、(B41)に記載のポリペプチド。
(B44)前記抗原結合ドメインはVLから作製された単ドメイン抗体であり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の104番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体重鎖定常領域の122番(EUナンバリング)のアミノ酸の間に位置する、(B40)に記載のポリペプチド。
(B45)前記抗原結合ドメインはVLから作製された単ドメイン抗体であり、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインの単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸と前記抗体軽鎖定常領域の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸の間に位置する、(B41)に記載のポリペプチド。
(B46)前記ポリペプチドの抗体定常領域はIgG抗体定常領域である、(B32)から(B45)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B47)前記ポリペプチドはIgG抗体様分子である、(B1)から(B46)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B48)前記抗原結合ドメインが未遊離の状態において、BLI(Bio-Layer Interferometry)法(Octet)を用いて測定を行うとき、抗原結合ドメインと抗原の結合が見られない、(B1)から(B47)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B49)前記抗原結合ドメインに更に第2の抗原結合ドメインが連結されている、(B1)から(B48)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B50)前記第2の抗原結合ドメインは、前記抗原結合ドメインと異なる抗原結合特異性を有する、(B49)に記載のポリペプチド。
(B51)前記第2の抗原結合ドメインは第2の単ドメイン抗体を含む、(B49)または(B50)に記載のポリペプチド。
(B52)前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体であり、前記第2の抗原結合ドメインは第2の単ドメイン抗体であり、前記抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインは前記ポリペプチドから遊離可能であり、前記抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインの遊離状態において、前記単ドメイン抗体と前記第2の単ドメイン抗体とが二重特異的抗原結合分子を形成している、(B51)に記載のポリペプチド。
(B53)前記第2の抗原結合ドメインは、HER2またはGPC3を標的抗原とする、(B49)から(B52)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B54)前記ポリペプチドは、前記抗原結合ドメインと別の抗原結合ドメインを更に有し、当該別の抗原結合ドメインも前記ポリペプチドの前記運搬部分と連結することにより抗原結合活性が抑制される、(B1)から(B53)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B55)前記別の抗原結合ドメインと前記抗原結合ドメインと異なる抗原結合特異性を有する、(B54)に記載のポリペプチド。
(B56)前記抗原結合ドメインは、PlexinA1、IL-6RまたはCD3を標的抗原とする抗原結合ドメインである、(B1)から(B55)のいずれか一つに記載のポリペプチド。
(B57)(B1)から(B56)のいずれか一つに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
(B58)(B1)から(B56)のいずれか一つに記載のポリペプチドを製造する方法。
(B59)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該単ドメイン抗体と当該運搬部分を連結させてポリペプチド前駆体を形成させる工程;
(c) 前記ポリペプチド前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(B58)に記載の製造方法。
(B60)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該単ドメイン抗体と当該運搬部分を連結させてポリペプチド前駆体を形成させる工程;
(c) 前記単ドメイン抗体と前記運搬部分との境界付近に、配列番号:833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含むプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(B58)に記載の製造方法。
(B61)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインによって抑制されるように、当該単ドメイン抗体を、配列番号:833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含むプロテアーゼ切断配列を介して当該運搬部分と連結させてポリペプチドを形成させる工程;
を含む、(B58)に記載の製造方法。
(B62)更に以下の工程:
(d) 前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチド前駆体中に組み込まれた前記単ドメイン抗体の前記標的抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(B59)から(B61)のいずれか一つに記載の製造方法。
(B63)更に以下の工程:
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することで前記単ドメイン抗体を遊離させ、遊離の単ドメイン抗体が抗原に結合することを確認する工程;
を含む、(B59)から(B62)のいずれか一つに記載の製造方法。
(B64)前記ポリペプチドはIgG抗体様分子である、(B58)に記載の製造方法。
(B65)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVHの代わりとしてVLと会合させ、または当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVLの代わりとしてVHと会合させることによって、前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体に、配列番号:833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含むプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(B64)に記載の製造方法。
(B66)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVHの代わりとしてVLと会合させ、または当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVLの代わりとしてVHと会合させることによって、前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記単ドメイン抗体と前記IgG抗体様分子前駆体中の抗体定常領域との境界付近に、配列番号:833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含むプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(B64)に記載の製造方法。
(B67)以下の工程:
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体VHまたはVLの代わりとして、配列番号:833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含むプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の重鎖定常領域または軽鎖定常領域と連結させ、前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子を形成させる工程;
を含む、(B64)に記載の製造方法。
(B68)更に以下の工程:
(d) 前記IgG抗体様分子または前記IgG抗体様分子前駆体に導入された前記単ドメイン抗体の前記標的抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(B65)から(B67)のいずれか一つに記載の製造方法。
(B69)更に以下の工程:
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することで前記単ドメイン抗体を遊離させ、遊離の単ドメイン抗体が前記標的抗原に結合することを確認する工程;
を含む、(B65)から(B68)のいずれか一つに記載の製造方法。
(B70)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
(b) (a)工程で作製した改変単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制するように、当該改変単ドメイン抗体を抗体VHと会合させ、または当該改変単ドメイン抗体を抗体VLと会合させることによって、当該改変単ドメイン抗体が導入された当該IgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記改変単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体に、配列番号:833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含むプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(B64)に記載の製造方法。
(B71)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
(b) (a)工程で作製した改変単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制するように、当該改変単ドメイン抗体を抗体VHと会合させ、または当該改変単ドメイン抗体を抗体VLと会合させることによって、当該改変単ドメイン抗体が導入された当該IgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記改変単ドメイン抗体と前記IgG抗体様分子前駆体の定常領域との境界付近に、配列番号:833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含むプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む、(B64)に記載の製造方法。
(B72)以下の工程:
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
(b) (a)工程で作製した改変単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制するように、当該改変単ドメイン抗体を、配列番号:833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含むプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の重鎖定常領域と連結させ、または当該改変単ドメイン抗体を、配列番号:833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含むプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の軽鎖定常領域と連結させ、当該改変単ドメイン抗体が導入された当該IgG抗体様分子を形成させる工程;
を含む、(B64)に記載の製造方法。
(B73)更に以下の工程:
(d) 前記IgG抗体様分子または前記IgG抗体様分子前駆体に導入された前記改変単ドメイン抗体の前記標的抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、(B70)から(B72)のいずれか一つに記載の製造方法。
(B74)更に以下の工程:
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することで前記改変単ドメイン抗体を遊離させ、遊離の改変単ドメイン抗体が前記標的抗原に結合することを確認する工程;
を含む、(B70)から(B73)のいずれか一つに記載の製造方法。
(B75)(B1)から(B56)のいずれか一つに記載のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド。
(B76)(B75)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(B77)(B75)に記載のポリヌクレオチドまたは(B76)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(B78)(B77)に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、(B1)から(B56)のいずれか一つに記載のポリペプチドを製造する方法。
(a) 37番、(b)45番、(c)47番、(d) 37番および45番、(e) 37番および47番、(f) 45番および47番、(g) 37番および45番および47番。
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
(a) アミノ酸残基26-32 (CDR1)、53-55 (CDR2)、および96-101 (CDR3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) アミノ酸残基31-35b (CDR1)、50-65 (CDR2)、 および95-102 (CDR3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) アミノ酸残基30-35b (CDR1)、47-58 (CDR2)、および93-101 (CDR3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに、
(d) CDRアミノ酸残基26-35 (CDR1)、26-35b (CDR1)、49-65 (CDR2)、93-102 (CDR3)、または94-102 (CDR3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
(a) アミノ酸残基26-32 (CDR1)、50-52 (CDR2)、および91-96 (CDR3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) アミノ酸残基24-34 (CDR1)、50-56 (CDR2)、および89-97 (CDR3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) アミノ酸残基27c-36 (CDR1)、46-55 (CDR2)、および89-96 (CDR3)のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに、
(d) CDRアミノ酸残基46-56 (CDR2)、47-56 (CDR2)、48-56 (CDR2)、または49-56 (CDR2)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
a)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる11位のアミノ酸残基はL、M、S、V、Wからなる群から選択される、好ましくはLである)、及び/又は
b)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる37位のアミノ酸残基はF、Y、H、I、L、Vからなる群から選択される、好ましくはFまたはYである)、及び/又は
c)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基はG、E、A、D、Q、R、S、Lからなる群から選択される、好ましくはG、EまたはQである、より好ましくはGまたはEである)、及び/又は
d)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基はL、R、C、I、L、P、Q、Vからなる群から選択される、好ましくはLまたはRである)、及び/又は
e)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる47位のアミノ酸残基はW、L、F、A、G、I、M、R、S、V、Yからなる群から選択される、好ましくはW、L、FまたはRである)、及び/又は
f)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる83位のアミノ酸残基はR、K、N、E、G、I、M、Q、Tからなる群から選択される、好ましくはKまたはRである、より好ましくはKである)、及び/又は
g)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる84位のアミノ酸残基はP、A、L、R、S、T、D、Vからなる群から選択される、好ましくはPである)、及び/又は
h)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる103位のアミノ酸残基はW、P、R、Sからなる群から選択される、このましくはWである)、及び/又は
i)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基はGまたはDである、好ましくはGである)、及び/又は
j)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQ、L、Rからなる群から選択される、好ましくはQまたはLである)を含む、ポリペプチドと定義することができる。
k)Kabatナンバリングによる43位~46位のアミノ酸残基はKEREまたはKQREであるアミノ酸配列;
l)Kabatナンバリングによる44位~47位のアミノ酸残基はGLEWであるアミノ酸配列;
m)Kabatナンバリングによる83位~84位のアミノ酸残基はKPまたはEPであるアミノ酸配列。
別の面から見て、本発明の抗原結合ドメインの好適な例の一つとして、血中半減期が12時間以下の抗原結合ドメインが挙げられる。そのような抗原結合ドメインの例として、それだけに限定されないが、単ドメイン抗体、scFv、Fab、Fab'等が挙げられる。
単ドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科の動物のVHH、サメのVNARのような、先天的に軽鎖を欠如する抗原結合分子、または抗体のVHドメインのすべてもしくは一部分またはVLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片が挙げられる。抗体のVH/VLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である単ドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、米国特許第6,248,516号B1等に記載されているようなヒト抗体VHまたはヒト抗体VLから出発して人工的に作製された単ドメイン抗体が挙げられる。本発明のいくつかの実施態様において、1つの単ドメイン抗体は3つのCDR(CDR1、CDR2及びCDR3)を有する。
単ドメイン抗体は、単ドメイン抗体を産生できる動物から、または単ドメイン抗体を産生できる動物を免疫することにより取得し得る。単ドメイン抗体を産生できる動物の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科動物、単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物(transgenic animals)が挙げられる。ラクダ科動物はラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコ等を含む。単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物の例として、それだけに限定されないが、国際公開WO2015/143414号、米国特許公開US2011/0123527号A1に記載の遺伝子導入動物が挙げられる。動物から取得した単ドメイン抗体のフレームワーク配列をヒトジャームライン配列あるいはそれに類似した配列とすることで、ヒト化した単ドメイン抗体を取得することも出来る。ヒト化した単ドメイン抗体(例えば、ヒト化VHH)はまた、本発明の単ドメイン抗体の一実施態様である。「ヒト化単ドメイン抗体」は、非ヒトCDRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ単ドメイン抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化単ドメイン抗体は、すべてのもしくは実質的にすべてのCDRは非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体において、FR中の残基の一部がヒト抗体のものと対応しない場合も、実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する一例として考えられる。たとえば、単ドメイン抗体の一態様であるVHHをヒト化する場合、FR中の残基の一部をヒト抗体のものと対応しない残基にする必要がある(C Vinckeら、The Journal of Biological Chemistry 284, 3273-3284.)。
また、単ドメイン抗体は、単ドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリから、ELISA、パニング等により取得し得る。単ドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリの例として、それだけに限定されないが、例えば、各種動物若しくはヒトから取得したナイーブ抗体ライブラリ(例:Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)、Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764:8 (1307-1319))、各種動物を免疫することで取得した抗体ライブラリ(例:Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536))、または各種動物若しくはヒトの抗体遺伝子より作製した合成抗体ライブラリ(例:Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1 (35-43)、Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657)、AIDS 2016 30:11 (1691-1701))が挙げられる。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM (いずれもBD Biosciences社の商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(いずれもBeckman Coulter社の商品名)
ΔGeo-Mean=Geo-Mean(ポリペプチド会合体存在下)/Geo-Mean(ポリペプチド会合体非存在下)
本発明のいくつかの態様においては、切断サイトが切断されることによって抗原結合ドメインがポリペプチドから遊離可能になるので、このような態様における抗原結合活性の比較は、ポリペプチドの切断前後の抗原結合活性を比較することにより行うことができる。即ち、未切断のポリペプチドを用いて測定した抗原結合活性に比べて、切断後のポリペプチドを用いて測定した抗原結合活性は、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、または3000倍以上の値となる。より具体的ないくつかの実施態様においては、未切断のポリペプチドは、前記方法中から選ばれる一つの方法で抗原結合活性の測定を行うとき、抗原結合ドメインと抗原との結合が見られない。
本発明のいくつかの態様においては、切断サイトはプロテアーゼにより切断されるので、このような態様における抗原結合活性の比較は、ポリペプチドのプロテアーゼ処理前後の抗原結合活性を比較することにより行うことができる。即ち、プロテアーゼ処理を行っていないポリペプチドを用いて測定した抗原結合活性に比べて、プロテアーゼ処理後のポリペプチドを用いて測定した抗原結合活性は、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、または3000倍以上の値となる。より具体的ないくつかの実施態様においては、プロテアーゼ未処理のポリペプチドは、前記方法中から選ばれる一つの方法で抗原結合活性の測定を行うとき、抗原結合ドメインと抗原との結合が見られない。
FcRn結合領域を含む運搬部分は、FcRnのサルベージ経路により細胞内に取り込まれた後に再び血漿中に戻ることが可能である。例えば、IgG分子の血漿中滞留性が比較的長い(消失が遅い)のは、IgG分子のサルベージレセプターとして知られているFcRnが機能しているためである。ピノサイトーシスによってエンドソームに取り込まれたIgG分子は、エンドソーム内の酸性条件下においてエンドソーム内に発現しているFcRnに結合する。FcRnに結合できなかったIgG分子はライソソームへと進みそこで分解されるが、FcRnへ結合したIgG分子は細胞表面へ移行し血漿中の中性条件下においてFcRnから解離することで再び血漿中に戻る。
FcRn結合領域は、直接FcRnと結合する領域であることが好ましい。FcRn結合領域の好ましい例として、抗体のFc領域を挙げることができる。しかしながら、アルブミンやIgGなどのFcRnとの結合能を有するポリペプチドに結合可能な領域は、アルブミンやIgGなどを介して間接的にFcRnと結合することが可能であるので、本発明におけるFcRn結合領域はそのようなFcRnとの結合能を有するポリペプチドに結合する領域であってもよい。
例えば、IgG抗体Fc領域におけるEUナンバリング237番目、238番目、239番目、248番目、250番目、252番目、254番目、255番目、256番目、257番目、258番目、265番目、270番目、286番目、289番目、297番目、298番目、303番目、305番目、307番目、308番目、309番目、311番目、312番目、314番目、315番目、317番目、325番目、332番目、334番目、360番目、376番目、380番目、382番目、384番目、385番目、386番目、387番目、389番目、424番目、428番目、433番目、434番目および436番目から選択される少なくとも1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含む改変Fc領域を使用ことは可能である。
237番目のGlyをMetに置換するアミノ酸置換、
238番目のProをAlaに置換するアミノ酸置換、
239番目のSerをLysに置換するアミノ酸置換、
248番目のLysをIleに置換するアミノ酸置換、
250番目のThrをAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
252番目のMetをPhe、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
254番目のSerをThrに置換するアミノ酸置換、
255番目のArgをGluに置換するアミノ酸置換、
256番目のThrをAsp、Glu、またはGlnに置換するアミノ酸置換、
257番目のProをAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはValに置換するアミノ酸置換、
258番目のGluをHisに置換するアミノ酸置換、
265番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、
270番目のAspをPheに置換するアミノ酸置換、
286番目のAsnをAlaまたはGluに置換するアミノ酸置換、
289番目のThrをHisに置換するアミノ酸置換、
297番目のAsnをAlaに置換するアミノ酸置換、
298番目のSerをGlyに置換するアミノ酸置換、
303番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、
305番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、
307番目のThrをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
308番目のValをAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThrに置換するアミノ酸置換、
309番目のLeuまたはValをAla、Asp、Glu、Pro、またはArgに置換するアミノ酸置換、
311番目のGlnをAla、His、またはIleに置換するアミノ酸置換、
312番目のAspをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、
314番目のLeuをLysまたはArgに置換するアミノ酸置換、
315番目のAsnをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、
317番目のLysをAlaに置換するアミノ酸置換、
325番目のAsnをGlyに置換するアミノ酸置換、
332番目のIleをValに置換するアミノ酸置換、
334番目のLysをLeuに置換するアミノ酸置換、
360番目のLysをHisに置換するアミノ酸置換、
376番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、
380番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、
382番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、
384番目のAsnまたはSerをAlaに置換するアミノ酸置換、
385番目のGlyをAspまたはHisに置換するアミノ酸置換、
386番目のGlnをProに置換するアミノ酸置換、
387番目のProをGluに置換するアミノ酸置換、
389番目のAsnをAlaまたはSerに置換するアミノ酸置換、
424番目のSerをAlaに置換するアミノ酸置換、
428番目のMetをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
433番目のHisをLysに置換するアミノ酸置換、
434番目のAsnをAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、および
436番目のTyrまたはPheをHisに置換するアミノ酸置換
から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、改変Fc領域を使用することは可能である。
237番目のアミノ酸におけるMet、
238番目のアミノ酸におけるAla、
239番目のアミノ酸におけるLys、
248番目のアミノ酸におけるIle、
250番目のアミノ酸におけるAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyr、
252番目のアミノ酸におけるPhe、Trp、またはTyr、
254番目のアミノ酸におけるThr、
255番目のアミノ酸におけるGlu、
256番目のアミノ酸におけるAsp、Glu、またはGln、
257番目のアミノ酸におけるAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはVal、
258番目のアミノ酸におけるHis、
265番目のアミノ酸におけるAla、
270番目のアミノ酸におけるPhe、
286番目のアミノ酸におけるAlaまたはGlu、
289番目のアミノ酸におけるHis、
297番目のアミノ酸におけるAla、
298番目のアミノ酸におけるGly、
303番目のアミノ酸におけるAla、
305番目のアミノ酸におけるAla、
307番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyr、
308番目のアミノ酸におけるAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThr、
309番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Glu、Pro、またはArg、
311番目のアミノ酸におけるAla、His、またはIle、
312番目のアミノ酸におけるAlaまたはHis、
314番目のアミノ酸におけるLysまたはArg、
315番目のアミノ酸におけるAlaまたはHis、
317番目のアミノ酸におけるAla、
325番目のアミノ酸におけるGly、
332番目のアミノ酸におけるVal、
334番目のアミノ酸におけるLeu、
360番目のアミノ酸におけるHis、
376番目のアミノ酸におけるAla、
380番目のアミノ酸におけるAla、
382番目のアミノ酸におけるAla、
384番目のアミノ酸におけるAla、
385番目のアミノ酸におけるAspまたはHis、
386番目のアミノ酸におけるPro、
387番目のアミノ酸におけるGlu、
389番目のアミノ酸におけるAlaまたはSer、
424番目のアミノ酸におけるAla、
428番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyr、
433番目のアミノ酸におけるLys、
434番目のアミノ酸におけるAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyr、および
436番目のアミノ酸におけるHis
から選択される少なくとも1つのアミノ酸を含むFc領域を使用することは可能である。
(1)標的組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(2)標的組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(3)標的細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(4)標的細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。
より具体的な実施態様において、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼが使用される。
・関節リウマチや変形性関節症における関節
・気管支喘息やCOPDにおける肺(肺胞)
・炎症性腸疾患やクローン病や潰瘍性大腸炎における消化器官
・肝臓、腎臓、肺における線維化症における線維化組織
・臓器移植における拒絶反応が起こっている組織
・動脈硬化や心不全における血管、心臓(心筋)
・メタボリック症候群における内臓脂肪
・アトピー性皮膚炎その他皮膚炎における皮膚組織
・椎間板ヘルニアや慢性腰痛における脊髄神経
標的組織にて特異的に発現するプロテアーゼ以外に、標的組織で特異的に活性化されるプロテアーゼも存在する。例えば、プロテアーゼは不活性型で発現し、その後活性型となる場合があり、多くの組織では活性型プロテアーゼを阻害する物質が存在し、活性化のプロセスと阻害剤の存在によって活性がコントロールされている(Nat Rev Cancer. 2003 Jul;3(7):489-501.)。標的組織において、活性型プロテアーゼが阻害から逃れ、特異的に活性化されることがある。
活性型プロテアーゼの測定方法は、活性化型のプロテアーゼを認識する抗体を用いる方法(PNAS 2013 Jan 2; 110(1): 93-98.)やプロテアーゼが認識するペプチドを蛍光標識し、切断前は消光(クエンチ)しているが、切断後に発光する方法(Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep;9(9):690-701. doi: 10.1038/nrd3053.)を用いて測定されうる。
一つの視点から、用語「標的組織特異的プロテアーゼ」は、
(i) 標的組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(ii) 標的組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(iii) 標的細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(iv) 標的細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。
癌組織特異的プロテアーゼとしては、例えば、国際公開WO2013/128194号、国際公開WO2010/081173号、国際公開WO2009/025846号等で開示される癌組織に特異的に発現するプロテアーゼが挙げられる。
また、癌組織特異的プロテアーゼは、癌細胞の細胞膜に結合しているものでもよく、細胞膜に結合しておらず細胞外に分泌されるものでもよい。癌組織特異的プロテアーゼが癌細胞の細胞膜に結合していない場合、免疫細胞による細胞傷害が癌細胞に特異的であるためには、癌組織特異的プロテアーゼは癌組織の内部または近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書で「癌組織の近傍」とは、癌組織特異的プロテアーゼ切断配列が切断されて、抗原結合ドメインが抗原結合活性を発揮する範囲内であることを意味する。ただし、できるだけ正常細胞を傷害しない範囲であることが好ましい。
別の視点から、癌組織特異的プロテアーゼは、
(i) 癌組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(ii) 癌組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(iii) 癌細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(iv) 癌細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
癌組織特異的プロテアーゼは、1種単独でもよく、2種以上が組み合せられてもよい。癌組織特異的プロテアーゼの種類数は、治療対象の癌種を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
また、炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症細胞の細胞膜に結合しているものでもよく、細胞膜に結合しておらず細胞外に分泌されるものでもよい。炎症組織特異的プロテアーゼが炎症細胞の細胞膜に結合していない場合、免疫細胞による細胞傷害が炎症細胞に特異的であるためには、炎症組織特異的プロテアーゼは炎症組織の内部または近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書で「炎症組織の近傍」とは、炎症組織特異的プロテアーゼ切断配列が切断されて、抗原結合ドメインが抗原結合活性を発揮する範囲内であることを意味する。ただし、できるだけ正常細胞を傷害しない範囲であることが好ましい。
別の視点から、炎症組織特異的プロテアーゼは、
(i) 炎症組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(ii) 炎症組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(iii) 炎症細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(iv) 炎症細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
炎症組織特異的プロテアーゼは、1種単独でもよく、2種以上が組み合せられてもよい。炎症組織特異的プロテアーゼの種類数は、治療対象の病状を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
プロテアーゼ切断配列は、副作用低減の点から、治療対象の標的組織/細胞においてより特異的に発現している、もしくは治療対象の標的組織/細胞においてより特異的に活性化されている標的組織特異的プロテアーゼにより、高い特異性で加水分解されるアミノ酸配列であることが好ましい。
具体的なプロテアーゼ切断配列としては、例えば、国際公開WO2013/128194号、国際公開WO2010/081173号、国際公開WO2009/025846号等で開示されている上記で例示した癌組織に特異的に発現するプロテアーゼ、炎症組織特異的プロテアーゼ等によって特異的に加水分解される標的配列が挙げられる。既知のプロテアーゼによって特異的に加水分解される標的配列に、適宜なアミノ酸変異を導入する等、人工的に改変した配列も使用できる。また、プロテアーゼ切断配列は、Nature Biotechnology 19, 661 - 667 (2001)に記載のような当業者公知の方法で同定したものを用いてもよい。
更に、天然に存在するプロテアーゼ切断配列を用いても良い。例えば、TGFβがプロテアーゼの切断を受けることで潜在型に変化するように、プロテアーゼの切断を受けることで分子形が変わるタンパク質中のプロテアーゼ切断を受ける配列を使用することもできる。
プロテアーゼ切断配列は、上述のように、好適な標的組織特異的プロテアーゼより特異的に加水分解されるアミノ酸配列であることがより好ましい。標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に加水分解されるアミノ酸配列の中でも、以下のアミノ酸配列を含む配列が好ましい。
LSGRSDNH(配列番号:12、MT-SP1、uPAにより切断可能)
PLALAG(配列番号:25、MMP-2、MMP-9により切断可能)
VPLSLTMG(配列番号:26、MMP-7により切断可能)
プロテアーゼ切断配列として、以下の配列を用いることもできる。
TSTSGRSANPRG(配列番号:74、MT-SP1、uPAにより切断可能)
ISSGLLSGRSDNH(配列番号:75、MT-SP1、uPAにより切断可能)
AVGLLAPPGGLSGRSDNH(配列番号:76、MT-SP1、uPAにより切断可能)
GAGVPMSMRGGAG(配列番号:77、MMP-1により切断可能)
GAGIPVSLRSGAG(配列番号:78、MMP-2により切断可能)
GPLGIAGQ(配列番号:79、MMP-2により切断可能)
GGPLGMLSQS(配列番号:80、MMP-2により切断可能)
PLGLWA(配列番号:81、MMP-2により切断可能)
GAGRPFSMIMGAG(配列番号:82、MMP-3により切断可能)
GAGVPLSLTMGAG(配列番号:83、MMP-7により切断可能)
GAGVPLSLYSGAG(配列番号:84、MMP-9により切断可能)
AANLRN(配列番号:85、MMP-11により切断可能)
AQAYVK(配列番号:86、MMP-11により切断可能)
AANYMR(配列番号:87、MMP-11により切断可能)
AAALTR(配列番号:88、MMP-11により切断可能)
AQNLMR(配列番号:89、MMP-11により切断可能)
AANYTK(配列番号:90、MMP-11により切断可能)
GAGPQGLAGQRGIVAG(配列番号:91、MMP-13により切断可能)
PRFKIIGG(配列番号:92、pro-ウロキナーゼにより切断可能)
PRFRIIGG(配列番号:93、pro-ウロキナーゼにより切断可能)
GAGSGRSAG(配列番号:94、uPAにより切断可能)
SGRSA(配列番号:95、uPAにより切断可能)
GSGRSA(配列番号:96、uPAにより切断可能)
SGKSA(配列番号:97、uPAにより切断可能)
SGRSS(配列番号:98、uPAにより切断可能)
SGRRA(配列番号:99、uPAにより切断可能)
SGRNA(配列番号:100、uPAにより切断可能)
SGRKA(配列番号:101、uPAにより切断可能)
QRGRSA(配列番号:102、tPAにより切断可能)
GAGSLLKSRMVPNFNAG(配列番号:103、カテプシンBにより切断可能)
TQGAAA(配列番号:104、カテプシンBにより切断可能)
GAAAAA(配列番号:105、カテプシンBにより切断可能)
GAGAAG(配列番号:106、カテプシンBにより切断可能)
AAAAAG(配列番号:107、カテプシンBにより切断可能)
LCGAAI(配列番号:108、カテプシンBにより切断可能)
FAQALG(配列番号:109、カテプシンBにより切断可能)
LLQANP(配列番号:110、カテプシンBにより切断可能)
LAAANP(配列番号:111、カテプシンBにより切断可能)
LYGAQF(配列番号:112、カテプシンBにより切断可能)
LSQAQG(配列番号:113、カテプシンBにより切断可能)
ASAASG(配列番号:114、カテプシンBにより切断可能)
FLGASL(配列番号:115、カテプシンBにより切断可能)
AYGATG(配列番号:116、カテプシンBにより切断可能)
LAQATG(配列番号:117、カテプシンBにより切断可能)
GAGSGVVIATVIVITAG(配列番号:118、カテプシンLにより切断可能)
APMAEGGG(配列番号:119、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
EAQGDKII(配列番号:120、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
LAFSDAGP(配列番号:121、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
YVADAPK(配列番号:122、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
RRRRR(配列番号:123、フーリンにより切断可能)
RRRRRR(配列番号:124、フーリンにより切断可能)
GQSSRHRRAL(配列番号:125、フーリンにより切断可能)
SSRHRRALD(配列番号:126)
RKSSIIIRMRDVVL(配列番号:127、プラスミノーゲン(Plasminogen)により切断可能)
SSSFDKGKYKKGDDA(配列番号:128、Staphylokinaseにより切断可能)
SSSFDKGKYKRGDDA(配列番号:129、Staphylokinaseにより切断可能)
IEGR(配列番号:130、Factor Xaにより切断可能)
IDGR(配列番号:131、Factor Xaにより切断可能)
GGSIDGR(配列番号:132、Factor Xaにより切断可能)
GPQGIAGQ(配列番号:133、Collagenaseにより切断可能)
GPQGLLGA(配列番号:134、Collagenaseにより切断可能)
GIAGQ(配列番号:135、Collagenaseにより切断可能)
GPLGIAG(配列番号:136、Collagenaseにより切断可能)
GPEGLRVG(配列番号:137、Collagenaseにより切断可能)
YGAGLGVV(配列番号:138、Collagenaseにより切断可能)
AGLGVVER(配列番号:139、Collagenaseにより切断可能)
AGLGISST(配列番号:140、Collagenaseにより切断可能)
EPQALAMS(配列番号:141、Collagenaseにより切断可能)
QALAMSAI(配列番号:142、Collagenaseにより切断可能)
AAYHLVSQ(配列番号:143、Collagenaseにより切断可能)
MDAFLESS(配列番号:144、Collagenaseにより切断可能)
ESLPVVAV(配列番号:145、Collagenaseにより切断可能)
SAPAVESE(配列番号:146、Collagenaseにより切断可能)
DVAQFVLT(配列番号:147、Collagenaseにより切断可能)
VAQFVLTE(配列番号:148、Collagenaseにより切断可能)
AQFVLTEG(配列番号:149、Collagenaseにより切断可能)
PVQPIGPQ(配列番号:150、Collagenaseにより切断可能)
LVPRGS(配列番号:151、Thrombinにより切断可能)
TSGSGRSANARG(配列番号:168、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSQSGRSANQRG(配列番号:169、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSPSGRSAYPRG(配列番号:170、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSGSGRSATPRG(配列番号:171、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSQSGRSATPRG(配列番号:172、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSASGRSATPRG(配列番号:173、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSYSGRSAVPRG(配列番号:174、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSYSGRSANFRG(配列番号:175、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSSSGRSATPRG(配列番号:176、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSTTGRSASPRG(配列番号:177、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSTSGRSANPRG(配列番号:178、uPA及びMT-SP1により切断可能)
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:833)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRを表し、X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:834)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:835)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:836)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:837)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:838)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:839)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:840)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:841)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:842)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X7はNおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:843)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:844)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:845)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:846)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:847)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:848)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:849)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:850)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:851)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:852)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1062)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1063)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1064)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1065)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1066)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1067)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1068)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1069)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1070)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:1071)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X7はNおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1072)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1073)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸をである;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1074)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1075)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1076)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1077)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1078)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1079)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1080)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:1081)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X7はNおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
プロテアーゼ切断配列とプロテアーゼの相互作用を確認する方法として、in vitroもしくはin vivoでのプロテアーゼ切断を確認することにより行うことができる。
あるいは、プロテアーゼ切断配列を組み込まれたポリペプチドは、プロテアーゼによる酵素的な作用のみならず、pHの変化、温度、酸化還元ストレス等の様々な環境負荷を経て病巣に到達する。このような外部要因に対しても、各プロテアーゼ基質の耐性を比較した情報に基づいて、目的に応じた望ましい性状を備えたプロテアーゼ切断配列を選択することもできる。
(プロテアーゼ切断配列)
(第一可動リンカー)-(プロテアーゼ切断配列)
(プロテアーゼ切断配列)-(第二可動リンカー)
(第一可動リンカー)-(プロテアーゼ切断配列)-(第二可動リンカー)
本実施態様における可動リンカーはペプチドリンカーが好ましい。第一可動リンカーと第二可動リンカーは、それぞれ独立かつ任意的に存在し、少なくとも1つのフレキシブルアミノ酸(Glyなど)を含む同一または異なる可動リンカーである。例えば、プロテアーゼ切断配列が所望のプロテアーゼアクセス性を得られるほどの十分な数の残基(Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Alaなどから任意に選択されるアミノ酸、特にGly、Ser、Asp、Asn、Ala 、ことさらGlyおよびSer、特にGlyなど)が含まれる。
このうちグリシンおよびグリシン-セリンポリマーが注目されているが、これらのアミノ酸が比較的構造化されておらず、成分間の中性テザーとして機能しやすいことがその理由である。
グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば、
Ser
Gly・Ser(GS)
Ser・Gly(SG)
Gly・Gly・Ser(GGS)
Gly・Ser・Gly(GSG)
Ser・Gly・Gly(SGG)
Gly・Ser・Ser(GSS)
Ser・Ser・Gly(SSG)
Ser・Gly・Ser(SGS)
Gly・Gly・Gly・Ser(GGGS、配列番号:28)
Gly・Gly・Ser・Gly(GGSG、配列番号:29)
Gly・Ser・Gly・Gly(GSGG、配列番号:46)
Ser・Gly・Gly・Gly(SGGG、配列番号:47)
Gly・Ser・Ser・Gly(GSSG、配列番号:48)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、配列番号:49)
Gly・Gly・Gly・Ser・Gly(GGGSG、配列番号:33)
Gly・Gly・Ser・Gly・Gly(GGSGG、配列番号:30)
Gly・Ser・Gly・Gly・Gly(GSGGG、配列番号:32)
Gly・Ser・Gly・Gly・Ser(GSGGS、配列番号:27)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、配列番号:51)
Gly・Ser・Ser・Gly・Gly(GSSGG、配列番号:52)
Gly・Ser・Gly・Ser・Gly(GSGSG、配列番号:31)
Ser・Gly・Gly・Ser・Gly(SGGSG、配列番号:53)
Gly・Ser・Ser・Ser・Gly(GSSSG、配列番号:34)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGS、配列番号:50)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGG、配列番号:54)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGGS、配列番号:55)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGGG、配列番号:56)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、配列番号:49))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、配列番号:51))n
などが挙げられる。
より具体的な実施態様として、単ドメイン抗体である抗原結合ドメインと、VLもしくはVHもしくはVHHである抑制ドメインが、抗体VHと抗体VLのような会合を形成する。更に具体的な実施態様として、単ドメイン抗体である抗原結合ドメインとVLもしくはVHもしくはVHHである抑制ドメインが、抗体VHと抗体VLのような会合を形成し、当該会合が形成された状態においては、抑制ドメインが、抗原結合ドメインと抗原の結合を立体構造的に阻害すること、または抗原結合ドメインの抗原結合部位の立体構造を変化させることで、当該単ドメイン抗体の抗原結合活性が当該VLもしくはVHもしくはVHHにより抑制される。単ドメイン抗体としてVHHを利用する実施態様においては、VHHの主たる抗原結合部位であるCDR3またはその近傍の部位が抑制ドメインと会合する界面に存在すると、抑制ドメインによりVHHと抗原の結合が立体構造的に阻害されると考えられる。
また、抑制ドメインと抗原結合ドメインの会合は、例えば切断サイトを切断することにより解消可能である。会合の解消とは、例えば、2以上のポリペプチド領域の相互作用状態が解消されると換言することができる。2以上のポリペプチド領域の相互作用が全部解消されても、2以上のポリペプチド領域の相互作用の中の一部が解消されても良い。
界面を形成するアミノ酸残基の例として、それだけに限定されないが、例えば、会合の際に接近するアミノ酸残基が挙げられる。会合の際に接近するアミノ酸残基は、例えば、ポリペプチドの立体構造を解析し、該ポリペプチドの会合の際に界面を形成するポリペプチド領域のアミノ酸配列を調べることにより見出すことができる。
更に、VHHとVLの会合を促進する目的が達成できる限り、VHH中のアミノ酸ではなく、VL中のVHHとの会合に関与するアミノ酸残基を改変することが可能であり、更にVHHとVLの両方にアミノ酸改変を導入することも可能である。
特定の実施態様において、プロテアーゼ切断配列は運搬部分に含まれる抗体定常領域内に位置する。この場合、プロテアーゼ切断配列は、プロテアーゼの切断を受けたとき、抗原結合ドメインを遊離させられるように抗体定常領域内に位置すれば良い。具体的な実施態様において、プロテアーゼ切断配列は運搬部分に含まれる抗体重鎖定常領域内に位置し、より具体的には、抗体重鎖定常領域中の140番(EUナンバリング)アミノ酸より抗原結合ドメイン側、好ましくは、抗体重鎖定常領域中の122番(EUナンバリング)アミノ酸より抗原結合ドメイン側に位置する。別の具体的な実施態様において、プロテアーゼ切断配列は運搬部分に含まれる抗体軽鎖定常領域内に位置し、より具体的には、抗体軽鎖定常領域中の130番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング130番)アミノ酸より抗原結合ドメイン側、好ましくは、抗体軽鎖定常領域中の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)アミノ酸より抗原結合ドメイン側に位置する。
特定の実施態様において、プロテアーゼ切断配列は単ドメイン抗体内に位置する。より具体的な実施態様において、単ドメイン抗体はVHから作製された単ドメイン抗体またはVHHであり、プロテアーゼ切断配列は当該単ドメイン抗体の35b番(Kabatナンバリング)アミノ酸より運搬部分側、好ましくは、当該単ドメイン抗体の95番(Kabatナンバリング)アミノ酸より運搬部分側、より好ましくは、当該単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)アミノ酸より運搬部分側に位置する。別の具体的な実施態様において、単ドメイン抗体はVLから作製された単ドメイン抗体であり、プロテアーゼ切断配列は当該単ドメイン抗体の32番(Kabatナンバリング)アミノ酸より運搬部分側、好ましくは、当該単ドメイン抗体の91番(Kabatナンバリング)アミノ酸より運搬部分側、より好ましくは、当該単ドメイン抗体の104番(Kabatナンバリング)アミノ酸より運搬部分側に位置する。
特定の実施態様において、プロテアーゼ切断配列は運搬部分に含まれる抗体定常領域内に位置する。より具体的な実施態様において、プロテアーゼ切断配列は、抗体重鎖定常領域中の140番(EUナンバリング)アミノ酸より単ドメイン抗体側、好ましくは、抗体重鎖定常領域中の122番(EUナンバリング)アミノ酸より単ドメイン抗体側に位置する。別の具体的な実施態様において、プロテアーゼ切断配列は抗体軽鎖定常領域中の130番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング130番)アミノ酸より抗原結合ドメイン側、好ましくは、抗体軽鎖定常領域中の113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)アミノ酸より抗原結合ドメイン側に位置する。
特定の実施態様において、プロテアーゼ切断配列は単ドメイン抗体内に位置する。より具体的な実施態様において、単ドメイン抗体はVHから作製された単ドメイン抗体またはVHHであり、プロテアーゼ切断配列は当該単ドメイン抗体の35b番(Kabatナンバリング)アミノ酸より抗体定常領域側、好ましくは、当該単ドメイン抗体の95番(Kabatナンバリング)アミノ酸より抗体定常領域側、より好ましくは、当該単ドメイン抗体の109番(Kabatナンバリング)アミノ酸より抗体定常領域側に位置する。別の具体的な実施態様において、単ドメイン抗体はVLから作製された単ドメイン抗体であり、プロテアーゼ切断配列は当該単ドメイン抗体の32番(Kabatナンバリング)アミノ酸より抗体定常領域側、好ましくは、当該単ドメイン抗体の91番(Kabatナンバリング)アミノ酸より抗体定常領域側、より好ましくは、当該単ドメイン抗体の104番(Kabatナンバリング)アミノ酸より抗体定常領域側に位置する。
特定の実施態様において、プロテアーゼ切断配列は抗原結合ドメインと運搬部分の境界付近に位置する。抗原結合ドメインと運搬部分の境界付近とは、抗原結合ドメインと運搬部分が連結されている部位の前後で、抗原結合ドメインの二次構造に大きく影響しない部分を言う。
より具体的な実施態様において、抗原結合ドメインは運搬部分中に含まれている抗体定常領域と連結されており、プロテアーゼ切断配列は抗原結合ドメインと抗体定常領域の境界付近に位置する。抗原結合ドメインと抗体定常領域の境界付近は、抗原結合ドメインと抗体重鎖定常領域の境界付近、または抗原結合ドメインと抗体軽鎖定常領域の境界付近を指すことができる。抗原結合ドメインがVHから作製された単ドメイン抗体またはVHHであり、抗体重鎖定常領域と繋がれている場合、抗原結合ドメインと抗体定常領域の境界付近とは、単ドメイン抗体101番(Kabatナンバリング)のアミノ酸から抗体重鎖定常領域140番(EUナンバリング)のアミノ酸の間を指すことができ、好ましくは単ドメイン抗体109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸から抗体重鎖定常領域122番(EUナンバリング)のアミノ酸の間を指すことが出来る。抗原結合ドメインがVHから作製された単ドメイン抗体またはVHHであり、抗体軽鎖定常領域と繋がれている場合、抗原結合ドメインと抗体軽鎖定常領域の境界付近とは、単ドメイン抗体101番(Kabatナンバリング)のアミノ酸から抗体軽鎖定常領域130番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング130番)のアミノ酸の間を指すことができ、好ましくは単ドメイン抗体109番(Kabatナンバリング)のアミノ酸から抗体軽鎖定常領域113番(EUナンバリング)(Kabatナンバリング113番)のアミノ酸の間を指すことが出来る。抗原結合ドメインがVLから作製された単ドメイン抗体の場合、抗原結合ドメインと抗体定常領域の境界付近とは、単ドメイン抗体96番(Kabatナンバリング)から、好ましくは単ドメイン抗体104番(Kabatナンバリング)からである。
より具体的ないくつかの実施態様において、抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインはそれぞれ異なる抗原結合特異性を有する単ドメイン抗体であり、連結された抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインはポリペプチドから遊離可能であり、遊離後の抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインが二重特異的抗原結合分子を形成している。このような二重特異的抗原結合分子の例として、それだけに限定されないが、例えば、抗原結合ドメインが標的細胞表面抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合ドメインは免疫細胞表面抗原に特異的に結合する二重特異的抗原結合分子、抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインが同じ抗原の異なるサブユニットに結合する二重特異的抗原結合分子、抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインが同じ抗原中の異なるエピトープに結合する二重特異的抗原結合分子等が挙げられる。このような二重特異的抗原結合分子は、標的細胞に起因する疾患の治療において、免疫細胞を標的細胞の近傍までにリクルーティングすることができ、有用であると考えられる。
第2の抗原結合ドメインの抗原結合活性は、運搬部分により抑制されていても、運搬部分により抑制されていなくても良い。また、第2の抗原結合ドメインは、運搬部分の一部構造と会合を形成していても、形成していなくても良い。特に、抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインが異なる抗原結合特異性を有する場合、例えば、図8に示すように、第2の抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制されていなくても、また第2の抗原結合ドメインが運搬部分の一部構造と会合を形成していなくても、抗原結合ドメインが遊離しない状態において、抗原結合ドメインの抗原結合活性を発揮することが出来ず、抗原結合ドメインと第2の抗原結合ドメインが連結されている二重特異的抗原結合分子は、二重特異的に2種類の抗原に結合する機能を発揮できない。
図8において、抗原結合ドメインが更に第2の抗原結合ドメインと連結されている一態様を例示している。
本発明のポリペプチドを製造する一つの方法として、抗原結合活性を有する抗原結合ドメインを取得し、当該抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制ドメインにより抑制されるように、抗原結合ドメインと運搬部分を連結させてポリペプチド前駆体を形成させ、当該ポリペプチド前駆体に更に切断サイトを挿入、もしくは当該ポリペプチド前駆体の一部を切断サイトに改変する方法がある。ポリペプチド前駆体に切断サイトを導入できれば良く、切断サイトの導入方法は、切断サイトの挿入とポリペプチド前駆体の一部の改変のどちらでも良い。更に、両方の手段を合わせて、ポリペプチド前駆体に改変サイトを導入することも出来ることについては、本明細書に触れた当業者であれば明らかであり、本発明の範囲を逸脱しないであろう。
また、本発明のポリペプチドを製造する他の方法として、抗原結合活性を有する抗原結合ドメインを取得し、当該抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制ドメインにより抑制されるように、抗原結合ドメインと運搬部分を切断サイトを介して連結させてポリペプチドを形成させる方法もある。抗原結合ドメインと運搬部分を切断サイトを介して連結させるとき、抗原結合ドメインと運搬部分の間に切断サイトが挟まれる形でも良く、抗原結合ドメインの一部または/および運搬部分の一部を改変して切断サイトの一部として使用する形でも良い。
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインに抑制されるように、当該単ドメイン抗体と当該運搬部分を連結させてポリペプチド前駆体を形成させる工程;
(c) 前記ポリペプチド前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む製造方法である。
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインに抑制されるように、当該単ドメイン抗体と当該運搬部分を連結させてポリペプチド前駆体を形成させる工程;
(c) 前記単ドメイン抗体と前記運搬部分との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む製造方法である。
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が運搬部分の抑制ドメインに抑制されるように、当該単ドメイン抗体を、プロテアーゼ切断配列を介して当該運搬部分と連結させてポリペプチドを形成させる工程;
を含む製造方法である。
(d) 前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチド前駆体中に組み込まれた前記単ドメイン抗体の前記標的抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む製造方法である。本発明において「結合活性が弱められ」ているとは、連結前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、減少の程度は問わない。
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することで前記単ドメイン抗体を遊離させ、遊離の単ドメイン抗体が抗原に結合することを確認する工程;
を含む製造方法である。
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVHの代わりとしてVLと会合させ 、または当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVLの代わりとしてVHと会合させることによって、前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む製造方法である。
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVHの代わりとしてVLと会合させ 、または当該単ドメイン抗体をIgG抗体のVLの代わりとしてVHと会合させることによって、前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記単ドメイン抗体と前記IgG抗体様分子前駆体中の抗体定常領域との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む製造方法である。
(a) 標的抗原に結合する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体の抗原結合活性が抑制されるように、当該単ドメイン抗体をIgG抗体VHまたはVLの代わりとして、プロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の重鎖定常領域または軽鎖定常領域と連結させ、前記単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子を形成させる工程;
を含む製造方法である。
(d) 前記IgG抗体様分子または前記IgG抗体様分子前駆体に導入された前記単ドメイン抗体の前記標的抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む製造方法である。本発明において「結合活性が弱められ」ているとは、会合前または連結前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、減少の程度は問わない。
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することで前記単ドメイン抗体を遊離させ、遊離の単ドメイン抗体が前記標的抗原に結合することを確認する工程;
を含む製造方法である。
また、単ドメイン抗体の抗原結合活性を特定のVH/VL/VHHで抑制させる別の方法として、単ドメイン抗体中の、VH/VL/VHHとの会合に関与しているアミノ酸残基を置換して会合を促進すること、もしくはそれらのアミノ酸残基が最初から会合を促進できるアミノ酸である単ドメイン抗体を使用することにより、会合前後の抗原結合活性の差が所望のレベルにある単ドメイン抗体/抑制ドメインペアを用意することもできる。
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
(b) (a)工程で作製した改変単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制するように、当該改変単ドメイン抗体を抗体VHと会合させ、または当該改変単ドメイン抗体を抗体VLと会合させることによって、当該改変単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記改変単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む製造方法である。
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
(b) (a)工程で作製した改変単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制するように、当該改変単ドメイン抗体を抗体VHと会合させ、または当該改変単ドメイン抗体を抗体VLと会合させることによって、当該改変単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子前駆体を形成させる工程;
(c) 前記改変単ドメイン抗体と前記IgG抗体様分子前駆体の定常領域との境界付近にプロテアーゼ切断配列を導入する工程;
を含む製造方法である。
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、または単ドメイン抗体中の、抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
(b) (a)工程で作製した改変単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制するように、当該改変単ドメイン抗体をプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の重鎖定常領域と連結させ、または当該改変単ドメイン抗体をプロテアーゼ切断配列を介してIgG抗体の軽鎖定常領域と連結させ、当該改変単ドメイン抗体が導入されたIgG抗体様分子を形成させる工程;
を含む製造方法である。
(d) 前記IgG抗体様分子または前記IgG抗体様分子前駆体に導入された前記改変単ドメイン抗体の前記標的抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む製造方法である。本発明において「結合活性が弱められ」ているとは、会合前または連結前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、減少の程度は問わない。
(e) 前記プロテアーゼ切断配列をプロテアーゼで切断することで前記改変単ドメイン抗体を遊離させ、遊離の改変単ドメイン抗体が前記標的抗原に結合することを確認する工程;
を含む製造方法である。
(a) 標的抗原結合活性を有する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体を特定のVLと会合させる工程;
(c) (b)工程で特定のVLと会合させた前記単ドメイン抗体の前記抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、特定のVLと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体をスクリーニングする方法を提供する。本発明において「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、減少の程度は問わない。
(a) 標的抗原結合活性を有する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体を特定のVHと会合させる工程;
(c) (b)工程で特定のVHと会合させた前記単ドメイン抗体の前記抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、特定のVHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体をスクリーニングする方法を提供する。本発明において「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、減少の程度は問わない。
(a) 標的抗原結合活性を有する単ドメイン抗体を取得する工程;
(b) (a)工程で取得した単ドメイン抗体を特定のVHHと会合させる工程;
(c) (b)工程で特定のVHHと会合させた前記単ドメイン抗体の前記抗原に対する結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、特定のVHHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体をスクリーニングする方法を提供する。本発明において「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、減少の程度は問わない。
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VLとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
を含む、特定のVLと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を製造する方法を提供する。
(b) (a)工程で作製された改変単ドメイン抗体を特定のVLと会合させる工程;
(c) 当該VLと会合させた前記改変単ドメイン抗体の抗原結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、特定のVLと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を製造する方法を提供する。本発明において「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、減少の程度は問わない。
(a) 単ドメイン抗体中の、抗体VHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
を含む、特定のVHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を製造する方法を提供する。
(b) (a)工程で作製された改変単ドメイン抗体を特定のVHと会合させる工程;
(c) 当該VHと会合させた前記改変単ドメイン抗体の抗原結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、特定のVHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を製造する方法を提供する。本発明において「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、減少の程度は問わない。
(a) 単ドメイン抗体中の、VHHとの会合に関与するアミノ酸残基を置換し、当該単ドメイン抗体の標的抗原に対する結合活性を保持する改変単ドメイン抗体を作製する工程;
を含む、特定のVHHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を製造する方法を提供する。
(b) (a)工程で作製された改変単ドメイン抗体を特定のVHHと会合させる工程;
(c) 当該VHHと会合させた前記改変単ドメイン抗体の抗原結合活性が弱められ、もしくは失われていることを確認する工程;
を含む、特定のVHHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を製造する方法を提供する。本発明において「結合活性が弱められ」ているとは、会合前と比較して標的抗原に対する結合活性が減少していることを意味し、減少の程度は問わない。
本明細書において「第1会合支持ドメイン」、「第2会合支持ドメイン」とは、お互いに疎水結合、水素結合、イオン結合等の結合で相互作用し、会合体を形成できるドメインを言う。第1会合支持ドメインと第2会合支持ドメインの好適な例として、それだけに限定されないが、例えば、抗体の軽鎖定常領域(CL)と重鎖定常領域のCH1ドメインが挙げられる。
(1)単ドメイン抗体と第1会合支持ドメインを連結させた融合ポリペプチドを、ファージディスプレイ等のディスプレイ法でファージ等の表面にディスプレイさせる;
(2)抑制ドメインと第2会合支持ドメインを連結させた会合パートナーを用意し、融合ポリペプチドと会合パートナーを会合させる。この融合ポリペプチドと会合パートナーが会合している状態において、標的抗原に結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下の融合ポリペプチドを選択する;
(3)(2)で選択した融合ポリペプチド中の単ドメイン抗体と会合パートナー中の抑制ドメインとの会合を解消させ、単ドメイン抗体とが抑制ドメインと会合しない状態で、標的抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する。
ここで、単ドメイン抗体と抑制ドメインの会合を解消する方法として、図9Bに示す会合パートナーの抑制ドメインと第2会合支持ドメインの境界付近を切断する方法、図9Cに示す融合ポリペプチドの単ドメイン抗体と第1会合支持ドメインの境界付近を切断する方法等を使用し得る。
図9D(1)で示されるように、単ドメイン抗体と抑制ドメインを同時に発現させて会合を形成させ、当該状態において抗原と結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下である単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドを選択し、図9D(2)/(2')/(2'')で示されるように、抑制ドメインを同時に発現させない状態で単ドメイン抗体を発現させ、当該状態において抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドを選択することで、単ドメイン抗体と第1会合支持ドメインを連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリから、特定の抑制ドメイン、例えばVH/VL/VHH、と会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体をスクリーニングすることが可能である。抑制ドメインを同時に発現させない状態で単ドメイン抗体を発現させ、当該状態において抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である単ドメイン抗体を含むポリペプチドを選択し、その後単ドメイン抗体と抑制ドメインを同時に発現させて会合を形成させ、当該状態において抗原と結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下である単ドメイン抗体を含むポリペプチドを選択する方法でも、単ドメイン抗体と第1会合支持ドメインを連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリから、特定の抑制ドメイン、例えばVH/VL/VHH、と会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体をスクリーニングすることが可能である。また、図9D(2)/(2')/(2'')で示されるような、抑制ドメインを同時に発現させない状態で単ドメイン抗体を発現させ(単ドメイン抗体のみを発現させる、または単ドメイン抗体と第1会合支持ドメインと含む融合ポリペプチドのみを発現させる、または単ドメイン抗体と第1会合支持ドメインを含む融合ポリペプチドを第2会合支持ドメインのみと会合させる)、当該状態において抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドを選択し、選択された融合ポリペプチドから、図9D(1)で示されるような、単ドメイン抗体と抑制ドメインを同時に発現させて会合を形成させ、当該状態において抗原と結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下である単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドを選択することでも、単ドメイン抗体と第1会合支持ドメインを連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリから、特定の抑制ドメイン、例えばVH/VL/VHH、と会合することで抗原結合活性が抑制されるもしくは失われる単ドメイン抗体をスクリーニングすることが可能である。
「抗原結合活性が一定値以下」とは、例えば、本願明細書で例示される方法で抗原結合活性を測定した時、一定の基準を下回る抗原結合活性を指すことができる。「抗原結合活性が一定値以上」とは、同様に、例えば、本願明細書で例示される方法で抗原結合活性を測定した時、一定の基準を上回る抗原結合活性を指すことができる。抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドは、抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドより抗原に強く結合する。
単ドメイン抗体とIgG抗体CH1ドメインとを連結させた融合ポリペプチドを複数含むライブラリから目的とする単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドをスクリーニングすることができる。
(a) 本発明におけるライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVLとIgG抗体軽鎖定常領域を融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) (a)工程でディスプレイされた融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、単ドメイン抗体と前記VLが会合する状態で抗原と結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程で選択された融合ポリペプチドに含まれる単ドメイン抗体が前記VLが会合しない状態で抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む単ドメイン抗体のスクリーニング方法が提供される。
また、プロテアーゼ切断配列を含む会合パートナーを使用する代わりに、ライブラリ中の融合ポリペプチドにプロテアーゼ切断配列を導入し、融合ポリペプチドがプロテアーゼに切断されることで単ドメイン抗体とVLの会合を解消させることも可能である。融合ポリペプチド中のプロテアーゼ切断配列は、切断時に単ドメイン抗体とVLの会合が解消され、且つ切断後も単ドメイン抗体の抗原結合活性が保持される限り、その位置は限定されない。プロテアーゼ切断配列の位置の例として、例えば、融合ポリペプチド中の単ドメイン抗体とIgG抗体CH1ドメインの境界付近に位置することが可能である。
(a) 本発明におけるライブラリの融合ポリペプチドをインビトロディスプレイさせる工程;
(b) 特定のVHとIgG抗体CH1ドメインを融合した会合パートナーを用意する工程;
(c) (a)工程でディスプレイされた融合ポリペプチドと(b)工程で用意した会合パートナーとを会合させ、単ドメイン抗体と前記VHが会合する状態で抗原と結合しない、もしくは抗原結合活性が一定値以下である融合ポリペプチドを選択する工程;
(d) (c)工程で選択された融合ポリペプチドに含まれる単ドメイン抗体が前記VHと会合しない状態で抗原と結合する、もしくは抗原結合活性が一定値以上である融合ポリペプチドを選択する工程;
を含む単ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドのスクリーニング方法が提供される。
また、プロテアーゼ切断配列を含む会合パートナーを使用する代わりに、ライブラリ中の融合ポリペプチドにプロテアーゼ切断配列を導入し、融合ポリペプチドがプロテアーゼに切断されることで単ドメイン抗体とVHの会合を解消させることも可能である。融合ポリペプチド中のプロテアーゼ切断配列は、切断時に単ドメイン抗体とVHの会合が解消され、且つ切断後も単ドメイン抗体の抗原結合活性が保持される限り、その位置は限定されない。プロテアーゼ切断配列の位置の例として、例えば、融合ポリペプチド中の単ドメイン抗体とIgG抗体軽鎖定常領域の境界付近に位置することが可能である。
癌組織や炎症性組織のような病変部位で発現するプロテアーゼで切断されることによって、初めて抗原結合活性を発揮する抗体を作製する方法が報告されている。Probodyと呼ばれる同抗体は、図1に示すように抗体の抗原結合部位をマスクするペプチドを病変部位で発現するプロテアーゼで切断されるリンカーで抗体とつなぐことで抗体の抗原結合活性を阻害した抗体分子である(非特許文献18)。Probodyを構成するリンカーが標的の病態部位において発現するプロテアーゼによって切断されることでマスクペプチドが解離し、抗原結合活性が回復した抗体分子が生成され、標的の病態組織において抗原に結合することが可能となる。
Probodyは上述のようなメカニズムにより標的の病態部位で選択的に抗原に結合することでtherapeutic windowを拡大することが出来ると考えられる。しかしながら、Probodyにおけるプロテアーゼによる抗体の切断は不可逆的であるため、病態部位で切断された抗体は、病態部位から再び血中に戻ることが可能であり、血流に乗って正常組織に分布し、正常組織に発現する抗原に結合する可能性があると考えられる。プロテアーゼで活性化されたProbodyは、活性化前のProbodyと同様にFc領域を保有するため長い血中滞留性を保有する。そのため、病態部位に発現するプロテアーゼで活性化された抗体は長く血中に滞留する可能性がある。また、病態部位で発現が上昇しているプロテアーゼであっても、そのようなプロテアーゼは正常組織にも低いレベルでは発現しており、また病態部位で産生された遊離型プロテアーゼが血中に漏出していることもあるため(The Chinese-German Journal of Clinical Oncology Jun. 2004, Vol. 3, No. 2 P78-P80)、そのような遊離型プロテアーゼでProbodyは活性化されうる。そのため、Probodyは病態部位以外でも活性化される可能性が考えられ、そのように活性化されたProbodyも同様に長く血中に滞留する。このように病態部位、正常組織、血中において継続的にProbodyは活性化され、活性化されたProbodyは長い血中滞留性を有すると、血中に蓄積する可能性がある。血中に蓄積した活性化されたProbodyは正常組織に発現する抗原に結合することで副作用を発揮してしまう可能性がある(図2)。
Probodyはリンカーによって抗体と連結されたマスクペプチドによってその抗原結合活性が阻害されているが、抗原結合活性は完全に阻害されているわけではない。Probodyは、リンカーによって連結されたマスクペプチドが抗原結合部位に結合した状態と解離した状態の平衡状態にあり、解離した状態の分子は抗原に結合することができてしまう(図3)。実際、非特許文献17に記載されている抗EGFR Probodyは、プロテアーゼによるリンカーの切断の前でもEGFRに対する結合活性を有する。プロテアーゼによるリンカーの切断により30-100倍の結合活性上昇がみられるが、活性化される前のProbodyも活性化されたProbodyの1/30-1/100の結合活性を有することから、活性化される前のProbodyが高い濃度で存在すると、正常組織に発現する抗原に結合することで副作用を発揮してしまう可能性がある。
また、Probodyは抗体の抗原結合部位をマスクするために人工的なペプチドを使用する。人工ペプチドは天然ヒト蛋白質に存在しない配列を有するため、ヒトにおいて免疫原性を有する可能性がある。免疫原性は抗薬物抗体を誘導することで、抗体医薬の作用を減じることが知られている(Blood. 2016 Mar 31;127(13):1633-41.)。
さらにProbodyに対する抗薬物抗体として、抗体とマスクペプチドの複合体(活性化される前のProbody)に対する抗薬物抗体、マスクペプチドが解離した抗体(活性化されたProbody)に対する抗薬物抗体、マスクペプチド(活性化されたProbodyから解離したマスクペプチド)に対する抗薬物抗体などが考えられる。このうち、マスクペプチドに対する抗薬物抗体(抗マスクペプチド抗体)は、活性化される前のProbodyのマスクペプチドに結合することで、プロテアーゼによる切断が起こらなくてもProbodyを活性化してしまう可能性がある(図4)。抗マスクペプチド抗体によって活性化されたProbodyは正常組織に発現する抗原に結合することで副作用を発揮してしまう可能性がある。
実施例1に示したようにProbody技術には以下の課題がある。
1. プロテアーゼによる切断で活性化されたProbodyが長い血中滞留性を有する
2. プロテアーゼによる切断前のProbodyであっても抗原に対する結合活性を有する
3. マスクペプチドが人工的な非ヒト配列であり、抗マスクペプチド抗体を誘導しうる
これらの課題を解決した、病態部位で活性を発揮する抗体医薬を提供するためには以下の条件を満たすことが有用であると考えた。
1. プロテアーゼによる切断で活性化された抗原結合ドメインが短い血中半減期を有する
2. プロテアーゼによる切断前の分子の抗原結合活性を最少化する
3. 人工的な非ヒト配列を有するマスクペプチドを使用しない
上記条件を満たすポリペプチドの一例として図5に示す分子を考案した。抗原結合ドメインと運搬部分が連結された状態のポリペプチドは長い半減期を有し、抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制されており、抗原に結合しない(A)。抗原結合ドメインが遊離後、抗原結合活性が回復し、半減期も短い(B)。
図5に示すポリペプチドは様々なバリエーションを有するが、IgG抗体様分子を使用する場合、図6に例示されるような製造方法で製造することが可能である。まず標的の抗原に結合する単ドメイン抗体(例:VHあるいはVHH)を取得する(A)。得られた単ドメイン抗体を、ジャームライン配列を有するIgG抗体のVHとVLの一方と入れ替えて、VHとVLの他方と会合させ、IgG抗体様分子を形成させる(B)。IgG抗体様分子中にプロテアーゼ切断配列を導入する(C)。導入位置の例として、導入した単ドメイン抗体(VHあるいはVHH)と定常領域(CH1またはCL)との境界付近が挙げられる。
単ドメイン抗体は単ドメインで存在する場合において抗原結合活性を有するが、VL/VH/VHH等と可変領域を形成すると抗原結合活性を失う。VL/VHはジャームライン配列を有する天然のヒト抗体配列であることから免疫原性のリスクは低く、同VL/VHを認識する抗薬物抗体が誘導される可能性は極めて低い。また、VHHを使用して単ドメイン抗体と可変領域を形成する場合、VHHをヒト化することによって、免疫原性のリスクを低減し、同ヒト化VHHを認識する抗薬物抗体が誘導される可能性を低下させられる。IgG抗体様分子に挿入されたプロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることによって、単ドメイン抗体が遊離する。遊離した単ドメイン抗体は抗原結合活性を有する。プロテアーゼによる切断前のIgG抗体様分子は一般的なIgG分子と類似する構造であることから長い血中滞留性を有するのに対して、プロテアーゼによる切断で遊離した単ドメイン抗体は、Fc領域を保有せず、分子量が約13kDa程度であることから腎***により速やかに消失する。実際、全長IgGの半減期は2~3週間程度であるのに対して(Blood. 2016 Mar 31;127(13):1633-41.)、単ドメイン抗体の半減期は約2時間である(Antibodies 2015, 4(3), 141-156)。そのためプロテアーゼにより活性化された抗原結合分子は血中半減期が短く、正常組織の抗原に結合する可能性は低くなる。
単ドメイン抗体がVLの場合は、プロテアーゼ切断配列を、例えばVLとCLの境界付近に導入することで同様のコンセプトを達成可能である。
3-1 IL-6Rに結合するVHHを組み込んだポリペプチドの調製
国際公開WO2010/115998号に記載されている、ヒトIL-6Rに対して結合および中和活性を有するVHHであるIL6R90(配列番号:1)をヒトIgG1の定常領域(CH1-hinge-CH2-CH3)に融合したIL6R90-G1m(配列番号:2)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。
ヒトジャームライン配列を有する様々なサブクラスの軽鎖(可変領域-定常領域)としてVK1-39-k0MT(配列番号:3)、VK2-28-k0MT(配列番号:4)、VK3-20-k0MT(配列番号:5)、VL1-40-lamL(配列番号:6)、VL1-44-lamL(配列番号:7)、VL2-14-lamL(配列番号:8)、VL3-21-lamL(配列番号:9)、k0(配列番号:10)、lamL(配列番号:11)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。
IgG抗体様分子であるIL6R90-G1m/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:3)、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:4)、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT(重鎖配列番号;2、軽鎖配列番号:5)、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:6)、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:7)、IL6R90-G1m/VL2-14-lamL(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:8)、IL6R90-G1m/VL3-21-lamL(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:9)、IL6R90-G1m/k0(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:10)、IL6R90-G1m/lamL(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:11)を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL、IL6R90-G1m/VL2-14-lamL、IL6R90-G1m/VL3-21-lamL、IL6R90-G1m/k0、IL6R90-G1m/lamLのヒトIL-6Rに対する結合活性を以下の方法で評価した。
抗原として用いた組み換えヒトIL-6Rは以下のように調製した。J. Immunol. 152, 4958-4968 (1994)で報告されているN末端側1番目から357番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL-6R(以下、hsIL-6R、IL6RあるいはIL-6Rとも呼ぶ)のCHO定常発現株を当業者公知の方法で構築し、培養し、hsIL-6Rを発現させた。得られた培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの2工程によりhsIL-6Rを精製した。最終工程においてメインピークとして溶出した画分を最終精製品とした。
各分子とhsIL-6Rの結合評価を、OctetHTX ( ForteBio ) を用いて行った。具体的には、Biosensor / Protein A (ProA) ( ForteBio, 18-5013 ) に各分子を結合させ、hsIL-6Rを作用させて、30℃における結合を評価した。OctetHTXで測定した継時的な結合量を表すセンサーグラムを図10に示した。VLが欠損したIL6R90-G1m/k0とIL6R90-G1m/lamLはhsIL-6Rに結合したが、VLと可変領域を形成したIL6R90-G1m/VK1-39-k0MT、IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT、IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT、IL6R90-G1m/VL1-40-lamL、IL6R90-G1m/VL1-44-lamL、IL6R90-G1m/VL2-14-lamLはhsIL-6Rと結合することができないことが示された。このことから、ヒトIL-6Rに対して結合活性を有するVHHをVLと会合させて可変領域を形成することでIL-6R結合活性を失わせることが出来ることが見いだされた。
抗ヒトIL-6R VHHであるIL6R90とCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入する検討を行った。癌特異的に発現しているウロキナーゼ(uPA)およびMT-SP1で切断されることが報告されている配列であるペプチド配列A(配列番号:12)をIL6R90とCH1の境界付近の3か所にグリシン-セリンリンカーの有り無しで挿入した図11に示す6種類の重鎖を設計した。IL6R90H1001(配列番号:13)、IL6R90H1002(配列番号:14)、IL6R90H1003(配列番号:15)、IL6R90H1004(配列番号:16)、IL6R90H1005(配列番号:17)、IL6R90H1006(配列番号:18)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
これらの重鎖と、軽鎖としてVK1-39-k0MT(配列番号:3)を用いて、IgG抗体様分子であるIL6R90H1001/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:13、軽鎖配列番号:3)、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:14、軽鎖配列番号:3)、IL6R90H1003/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:15、軽鎖配列番号:3)、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:16、軽鎖配列番号:3)、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:17、軽鎖配列番号:3)、IL6R90H1006/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:18、軽鎖配列番号:3)を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
IL6R90H1001/VK1-39-k0MT、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1003/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、IL6R90H1006/VK1-39-k0MTをプロテアーゼにより切断し、IL-6Rへの結合活性を有するVHHが遊離するかどうかを検証した。
可溶型ヒトIL-6Rは当業者公知の方法で調製した。調製した可溶型ヒトIL-6Rを当業者公知の方法でビオチン化した。
可溶型ヒトIL-6R(hsIL-6Rあるいは可溶型ヒトIL-6Rとも呼ぶ、配列番号:35)のC末端にビオチンを付加する目的で、hsIL-6Rをコードする遺伝子断片の下流に、ビオチンリガーゼによってビオチンが付加される特異的な配列(AviTag配列、配列番号:36)をコードする遺伝子断片をリンカーを介して連結させた。hsIL-6RとAviTag配列が連結されたタンパク質(hsIL6R-Avitag、配列番号:37)をコードする遺伝子断片を動物細胞発現用ベクターに組み込み、構築されたプラスミドベクターを293Fectin (Invitrogen)を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen)に導入した。このときEBNA1(配列番号:57)を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ(BirA、配列番号:58)を発現する遺伝子を同時に導入し、さらにhsIL-6R-Avitagをビオチン標識する目的でビオチンを添加した。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的のタンパク質( hsIL-6R-BAP1 )を培養上清中に分泌させた。この細胞培養液を0.22μmボトルトップフィルターでろ過し、培養上清を得た。
メーカーのプロトコールに従いHiTrap NHS-activated HP (GEヘルスケア)に、抗ヒトIL-6R抗体を固定化したカラム(抗ヒトIL-6R抗体カラム)を作製した。TBSで平衡化した抗ヒトIL-6R抗体カラムに培養上清をアプライし、2 M Arginine, pH4.0で吸着したhsIL-6Rを溶出させた。次に、TBSで平衡化されたSoftLink Avidin カラム(Promega)に、同緩衝液で希釈した抗ヒトIL-6R抗体カラム溶出液をアプライし、5 mM ビオチン, 50 mM Tris-HCl, pH8.0および2 M Arginine, pH4.0でhsIL-6R-BAP1を溶出した。この溶出液を、Superdex200(GEヘルスケア)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって、hsIL-6R-BAP1の会合体を除去し、バッファーがD-PBS, 0.05% CHAPSに置換された精製hsIL-6R-BAP1を得た。
プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ12.5nM、IgG抗体様分子 100ug/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図12に示す。その結果、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、IL6R90H1006/VK1-39-k0MTにおいて、プロテアーゼ切断配列がVHHと重鎖定常領域の境界付近でプロテアーゼによって切断されることが確認された。
次に、プロテアーゼ処理によって遊離したVHHとIL-6Rの結合評価を、OctetHTX ( ForteBio ) を用いて行った。具体的には、ストレプトアビジンセンサー( ForteBio, 18-5021 ) に hsIL-6R-BAP1 を結合させ、切断したIgG抗体様分子を作用させて、30℃における結合を評価した。OctetHTXで測定した継時的な結合量を表すセンサーグラムを図13に示す。その結果、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、IL6R90H1006/VK1-39-k0MTにおいて結合が確認された。IL6R90-G1m/k0、IL6R90-G1m/lamLは2価で結合するためavidityで結合するのに対して、遊離するVHHはaffinityで結合するため、プロテアーゼ処理したIL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、IL6R90H1006/VK1-39-k0MTはIL6R90-G1m/k0、IL6R90-G1m/lamLと比較してIL-6Rからの早い解離速度を示した。また、VHHはIL6R90-G1m/k0、IL6R90-G1m/lamLと比較して分子量が小さいため、その分結合量(リスポンス)が低くなっている。
これらの結果から、IL6R90H1002/VK1-39-k0MT、IL6R90H1004/VK1-39-k0MT、IL6R90H1005/VK1-39-k0MT、IL6R90H1006/VK1-39-k0MTは、そのままではIL-6Rに対して結合活性を示さないが、プロテアーゼ処理によりVHHと重鎖定常領域の境界付近に挿入したペプチド配列Aが切断され、その結果としてVHHドメインが遊離し、遊離したVHHはIL-6Rに対して結合することができることが確認された。このことから実施例2に記載されたコンセプトの分子を実際に作製することが出来たと言える。
4-1 IL-6Rに結合するVHHを組み込んだポリペプチドのIL-6R結合評価
国際公開WO2010/115998号に記載されているIL-6Rに対して結合および中和活性を有するVHHである20A11(配列番号:19)を、実施例3と同様にしてヒトIgG1の定常領域(CH1-hinge-CH2-CH3)に融合した20A11-G1m(配列番号:38)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。
この重鎖と、軽鎖としてVK1-39-k0MT(配列番号:3)、VK2-28-k0MT(配列番号:4)、VK3-20-k0MT(配列番号:5)、VL1-40-lamL(配列番号:6)、VL1-44-lamL(配列番号:7)、VL2-14-lamL(配列番号:8)、VL3-21-lamL(配列番号:9)を用いて、実施例3と同様の方法によりポリペプチド20A11-G1m/VK1-39-k0MT、20A11-G1m/VK2-28-k0MT、20A11-G1m/VK3-20-k0MT、20A11-G1m/VL1-40-lamL、20A11-G1m/VL1-44-lamL、20A11-G1m/VL2-14-lamL、20A11-G1m/VL3-21-lamLの発現・精製を行った。
実施例3と同様の方法で、得られた20A11-G1m/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:3)、20A11-G1m/VK2-28-k0MT(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:4)、20A11-G1m/VK3-20-k0MT(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:5)、20A11-G1m/VL1-40-lamL(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:6)、20A11-G1m/VL1-44-lamL(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:7)、20A11-G1m/VL2-14-lamL(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:8)、20A11-G1m/VL3-21-lamL(重鎖配列番号:38、軽鎖配列番号:9)のIL-6Rに対する結合を評価した結果を図14に示す。その結果、本実施例で使用した軽鎖の中で、20A11とヒトジャームラインIgG1の定常領域(CH1-hinge-CH2-CH3)と融合させた重鎖と会合することで20A11のIL-6R結合活性を失わせるものはなかった。
この理由として、20A11と本実施例で使用したVLが安定な可変領域を形成していないことが考えられた。
20A11とVLを安定な可変領域を形成させるために、20A11のVLとの界面に存在するアミノ酸に変異を導入した。20A11に対して37番目のFをVに(F37V)、45番目のRをLに、47番目のGをWに(すべてKabatナンバリング)置換する変異を導入した20A11hu(配列番号:20)を実施例3と同様にしてヒトIgG1の定常領域(CH1-hinge-CH2-CH3)に融合した20A11hu-G1m(配列番号:39)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。
この重鎖と、軽鎖としてVK1-39-k0MT(配列番号:3)、VK2-28-k0MT(配列番号:4)、VK3-20-k0MT(配列番号:5)、VL1-40-lamL(配列番号:6)、VL1-44-lamL(配列番号:7)、VL2-14-lamL(配列番号:8)、VL3-21-lamL(配列番号:9)を用いて、ポリペプチドの20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:3)、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:4)、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:5)、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:6)、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:7)、20A11hu-G1m/VL2-14-lamL(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:8)、20A11hu-G1m/VL3-21-lamL(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:9)の発現・精製を実施例3と同様の方法により行った。
得られた20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL、20A11hu-G1m/VL2-14-lamL、20A11hu-G1m/VL3-21-lamLのIL-6Rに対する30℃または25℃における結合を実施例3と同様の方法で評価した結果を図15に示す。
その結果、20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT、20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT、20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT、20A11hu-G1m/VL1-40-lamL、20A11hu-G1m/VL1-44-lamL、20A11hu-G1m/VL2-14-lamLはIL-6Rと結合することができないことが示された。
これらの結果から、実施例3で使用したVLと会合させてもIL-6R結合活性を失わなかった20A11に、VHHとVLの界面部位に存在するアミノ酸を、37V, 45L, 47W(Kabatナンバリング)にし、20A11huに改変することで、VHHとVLを安定な可変領域を形成させることができ、VHHのIL-6R結合活性を失わせられることが示された。
実施例3と同様の方法で、20A11huとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列(配列番号:12)または可動リンカーと連結されたプロテアーゼ切断配列(配列番号:44)を挿入した重鎖20A11huH1001(配列番号:40)、20A11huH1002(配列番号:41)、20A11huH1004(配列番号:42)、20A11huH1006(配列番号:43)を作製した。
これらの重鎖と、軽鎖としてVK1-39-k0MT(配列番号:3)を用いて、ポリペプチド20A11huH1001/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:40、軽鎖配列番号:3)、20A11huH1002/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:41、軽鎖配列番号:3)、20A11huH1004/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:42、軽鎖配列番号:3)、20A11huH1006/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:43、軽鎖配列番号:3)の発現・精製を実施例3と同様の方法により行った。
20A11huH1001/VK1-39-k0MT、20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT、20A11huH1006/VK1-39-k0MTを実施例3と同様の方法でプロテアーゼにより切断し、切断の程度を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図16に示す。
その結果、20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT、20A11huH1006/VK1-39-k0MTにおいて、VHHとCH1の境界付近がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
次に、プロテアーゼ処理によって遊離したVHHとIL-6Rの30℃または25℃における結合評価を実施例3と同様の方法で行った。Octetのセンサーグラムを図17に示す。
その結果、プロテアーゼ処理によってVHHとCH1の境界付近の切断が確認された20A11huH1002/VK1-39-k0MT、20A11huH1004/VK1-39-k0MT、20A11huH1006/VK1-39-k0MTにおいてIL-6Rへの結合が確認された。
これらの結果から、VHHを組み込んだポリペプチドにおいて、特定のVLと会合させる際に直ちに抗原結合活性が失われない場合でも、VHHのVLとの界面に存在するアミノ酸に会合促進の変異を導入することで抗原結合活性を失わせることができることが確認された。
この結果から、実施例3のようにあらかじめ得られているVHHを軽鎖と組み合わせる方法以外に、軽鎖との会合に関与するアミノ酸を置換したVHHを軽鎖と組み合わせる方法によっても、実施例2に記載されたコンセプトの分子を作製できることが示された。
5-1 免疫アルパカ由来VHHの取得
当業者公知の方法でIL-6R、CD3およびPlexinA1をアルパカに免疫し、4及び8週後にPBMCを回収した。回収したPBMCからJ. Immunol. Methods (2007) 324, 13に記載の方法を参考にVHH遺伝子を増幅した。増幅したVHH遺伝子断片は、gene3遺伝子と接続してファージミドベクターに挿入した。VHH断片が挿入されたファージミドベクターを大腸菌にエレクトロポレーション法で導入し、当業者既知の方法でVHHを提示するファージを得た。得られたファージを用いて、ELISA法でIL-6R、CD3またはPlexinA1に対する結合を評価し、結合するクローンの配列を当業者公知の方法で解析して抗原に結合するVHHを同定した。
実施例5-1で構築されたVHHライブラリからヒトCD3に結合するVHHを同定した。抗原として、ビオチン標識されたヒトCD3ε及びヒトCD3δをヒト抗体定常領域に連結したタンパク質(ヒトCD3ed-Fc)を用いて、ヒトCD3に対して結合能をもつVHHの濃縮を行った。ヒトCD3ed-Fcは以下のように調製された。配列番号:59で示すアミノ酸配列をコードする遺伝子と配列番号:60で示すアミノ酸配列をコードする遺伝子およびBirA(配列番号:58)をコードする遺伝子を持った動物細胞発現ベクターをFreeStyle293細胞(Invitrogen)に導入した。導入後L-ビオチンを加えてビオチン化を培養液中で実施し、細胞培養はプロトコルに従って37℃で振とう培養し、4から5日後に上清を回収した。上清からProteinAカラム(Eshmuno A (Merck))を用いて、抗体の定常領域が融合しているタンパク質を得た。さらにCD3εδヘテロダイマーのみを取得する目的でAnti-FLAG M2カラムを用いて、抗体の定常領域が融合しているCD3εδヘテロダイマー(ヒトCD3ed-Fcと呼ぶ)を分画した。引き続き、ゲル濾過クロマトグラフィー(Superdex200、GE Healthcare)を実施して目的のCD3εδヘテロダイマー(ヒトCD3ed-Fcと呼ぶ)を分取した。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行われた。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加することによって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られた。次に、ファージライブラリ液に終濃度4%BSAとなるようにBSAが添加された。パニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパニング方法が参照された(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(FG beads NeutrAvidin)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)が用いられた。
具体的には、調製されたファージライブラリ液に100 pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは0.5 mLのTBST(0.1%Tween20を含有するTBS, TBSはTaKaRa社製)にて2回洗浄された後、0.5 mLのTBSにてさらに1回洗浄された。その後、0.5 mLの1 mg/mLのトリプシンが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.5)となった20 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによって、ファージライブラリ液が調製された。このサイクルをパニングと呼び、全部で2回繰り返した。なお2回目のパニングでは、ビーズの洗浄はTBSTで3回、続けてTBSで2回行われた。また、ヒトCD3ed-Fcとファージの結合時には4 nmolのヒトFcが加えられた。
実施例5-1または5-2から得られたヒトCD3結合クローンのVHH配列(表2)をコードする塩基配列を実施例3に記載の方法で、プロテアーゼ切断サイトおよび定常領域をコードする塩基配列に接続し、動物細胞発現ベクターに挿入し、IgG抗体様分子の重鎖として使用した。
実施例5-3で調製したIgG抗体様分子を実施例3と同様の方法でプロテアーゼにより切断し、切断の程度を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図18に示す。なおプロテアーゼ濃度は25 nMで実施し、測定にはOctetRED ( ForteBio )を用いた。
その結果、IgG抗体様分子中のプロテアーゼ切断配列がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
次に、プロテアーゼ処理によって遊離したVHHとCD3の結合評価を実施例3と同様の方法で行った。Octetのセンサーグラムを図19に示す。
その結果、bC3edL1R1N160H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT、bC3edL1R1N161H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT、bC3edL1R1N164H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MTにおいて、プロテアーゼ処理前のIgG抗体様分子は抗原結合を示さないのに対し、プロテアーゼ処理後に抗原結合が確認された。また、表2に記載されたVHHと同様な方法で得られた複数のCD3に対して結合するVHHも、表3に記載されたIgG抗体様分子と同様なプロテアーゼ切断サイトを含むIgG様分子を作製したところ、プロテアーゼ処理によって抗原との結合が確認された。これらの結果から、実施例3、4で示されたポリペプチド以外にも、プロテアーゼ切断配列を組み込むことで、プロテアーゼ処理によってプロテアーゼ切断配列が切断され、抗原結合ドメインが遊離し、遊離した抗原結合ドメインが抗原に結合することができるIgG抗体様分子が示された。
実施例3と同様に軽鎖の各位置にプロテアーゼ切断配列を組み込んだVK1-39P-2-Pk0MT(配列番号:67)、VK1-39P-1-Pk0MT(配列番号:68)、VK1-39P-Pk0MT(配列番号:69)、VK1-39P+2-Pk0MT(配列番号:70)、VK1-39P+3-Pk0MT(配列番号:71)、VK1-39P+4-Pk0MT(配列番号:72)、及びVK1-39P+5-Pk0MT(配列番号:73)を作製した。
これらの軽鎖と、重鎖としてIL6R90-G1m(配列番号:2)を用いたIgG抗体様分子の発現・精製を実施例3と同様の方法により行った。なおプロテアーゼ濃度は25 nMで実施した。切断配列を導入されていないIgG抗体様分子としてIL6R90-G1m/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:3)を用いた。
続いて調製したIgG抗体様分子を実施例3と同様の方法でプロテアーゼにより切断し、切断の程度を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図20に示す。その結果、VK1-39P+2-Pk0MT(配列番号:70)、VK1-39P+3-Pk0MT(配列番号:71)、VK1-39P+4-Pk0MT(配列番号:72)、及びVK1-39P+5-Pk0MT(配列番号:73)において、プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼによって切断されることが確認された。さらにプロテアーゼ処理によって露出したVHHとIL-6Rの結合評価を実施例3と同様の方法で行った。Octetのセンサーグラムを図21に示す。その結果、軽鎖に切断配列を導入した場合にも、プロテアーゼ処理によって結合が認められ、軽鎖にプロテアーゼ切断配列を導入して軽鎖をプロテアーゼで切断したときに、抗原結合ドメインが露出し抗原結合能を示す、プロテアーゼ活性化ポリペプチドを取得可能なことが示された。
実施例6で確認されたように、プロテアーゼ活性化ポリペプチドの軽鎖にプロテアーゼ切断配列を導入した場合でも、軽鎖切断後に抗原結合ドメインが露出し、抗原に結合する。
そこで、単ドメイン抗体等の抗原結合ドメインを含む重鎖とプロテアーゼ切断配列を導入した軽鎖をファージミドに組み込み、ファージに提示させる。異なる種類の抗原結合ドメインを含む複数のファージディスプレイ用ファージミドが構築され、それらのファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行われる。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加することによって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られる。ファージライブラリ液に、終濃度4%BSAとなるようにBSAが添加される。
上記のように作製されたファージライブラリからプロテアーゼ活性化ポリペプチドをパニングにより取得する。パニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパニング方法が参照され(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)、プロテアーゼ添加前では抗原が固定されている磁気ビーズに結合しなかったファージを回収し、プロテアーゼ添加後に抗原が固定されている磁気ビーズに結合したファージを回収する。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated、FG beads NeutrAvidin)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用いられる。回収したファージから前項に記載されたファージELISAで抗原と結合するクローンを選定しても良く、あるいは抗体遺伝子を動物発現用ベクターへサブクローニングを行って動物細胞を用いて発現し、プロテアーゼ処理前後の結合活性を比較して、結合クローンを選定する。
実施例3で確認されたように、軽鎖の会合によって抗原結合ドメインを含む重鎖の抗原結合能が制御される。そこで、軽鎖と会合した時に抗原結合能を失い、重鎖のみまたは重鎖と軽鎖定常領域を提示した時に抗原結合能を示す重鎖をファージディスプレイ法により取得する。
単ドメイン抗体等の抗原結合ドメインを含む重鎖をファージミドに組み込み、ファージに提示させる。異なる種類の抗原結合ドメインを含む複数のファージディスプレイ用ファージミドが構築され、それらのファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行われる。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加することによって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られる。ファージライブラリ液に、終濃度4%BSAとなるようにBSAが添加される。
上記のように作製されたファージライブラリから重鎖のみまたは重鎖と軽鎖定常領域を提示しているときに抗原結合能を示し、重鎖が軽鎖可変領域と会合した時に抗原結合能が失われる重鎖をパニングにより取得する。パニング方法として、実施例5に記載された磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパニング方法が参照される。重鎖または重鎖と軽鎖定常領域を提示したファージライブラリから、抗原が固定されている磁気ビーズに結合したファージを回収する。回収したファージを大腸菌に感染させ、軽鎖を発現するヘルパーファージを用いて重鎖と軽鎖を提示するファージを産生する。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液から上述の方法で抗原結合ドメインを含む重鎖と軽鎖を提示したファージが得られる。重鎖と軽鎖を提示したファージの集団から、抗原が固定されている磁気ビーズに結合しないファージを回収する。
なお、図9Dに示されたようにパニングは、抗原が固定されている磁気ビーズに結合する重鎖のみまたは重鎖と軽鎖定常領域を提示したファージ集団の回収、および抗原が固定されている磁気ビーズに結合しない重鎖と軽鎖を提示したファージ集団の回収の順序を入れ替えて実施することもある。なお、ヘルパーファージを用いて軽鎖を発現する方法以外に、通常通り重鎖と同じファージミドに軽鎖をコードする領域を組み込み、パニングごとに軽鎖定常領域のみあるいは軽鎖全長をコードする遺伝子を組み込んで用いることもある。
回収したファージから前項に記載されたファージELISAで抗原と結合するクローンを選定しても良く、あるいは抗体遺伝子を動物発現用ベクターへサブクローニングを行って動物細胞を用いて発現し、プロテアーゼ処理前後の結合活性を比較して、結合クローンを選定する。
実施例3で、軽鎖との会合によって重鎖にVHの代わりとして含まれるVHHの抗原結合能が制御されることが確認された。そこで、特定の軽鎖と会合した時に抗原結合能を失い、重鎖のみまたは重鎖と軽鎖定常領域を提示した時、即ち軽鎖可変領域と会合していない時に抗原結合能を示すVHHを免疫アルパカPBMC由来のVHHとCH1を連結したものを提示させたファージライブラリから取得し、当該VHHを含むIgG抗体様分子を作製した。
国際公開公報WO2015/046554号に記載の方法に基づき、ヘルパーファージのゲノムに、プロモーター、シグナル配列、抗体軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域の遺伝子、または軽鎖定常領域の遺伝子などを組み込むことにより、軽鎖発現ヘルパーファージの構築を行った。本ヘルパーファージが感染した大腸菌からは抗体軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域、または軽鎖定常領域のみの発現が可能となる。
具体的には国際公開公報WO2015/046554号に記載の方法で構築したヘルパーファージM13KO7TCのゲノム抽出を行い、軽鎖発現ユニットを導入した。導入する軽鎖遺伝子として、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域(VK1-39-k0MTdC、配列番号:152)をコードする遺伝子、または軽鎖定常領域(k0MTdC、配列番号: 153)をコードする遺伝子を用いた。lacプロモーター - pelBシグナル配列 - 軽鎖遺伝子を上記方法でM13KO7TC/SacIへ挿入し、大腸菌株ER2738へエレクトロポレーション法により導入した。
得られた大腸菌を培養し、培養上清に2.5 M NaCl/10%PEGを添加してPEG沈殿法によりヘルパーファージを精製した。得られたヘルパーファージM13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC及びM13KO7TC-k0MTdCのタイターを一般的なプラーク形成法にて確認した。
当業者公知の方法で、ヒトIL-6Rの細胞外ドメイン、ヒトCD3εγヘテロダイマー、サルCD3εγヘテロダイマー及びヒトPlexinA1の細胞ドメインの4種類を免疫原として、アルパカに免疫し、4週間後にPBMCを回収した。CD3εγヘテロダイマーはJournal of Molecular Biology (2000) 302:899-916.を参考に調製した。回収したPBMCからJ. Immunol. Methods (2007) 324, 13に記載の方法を参考にVHH遺伝子を増幅した。増幅したVHH遺伝子断片は、CH1-gene3遺伝子と接続してファージミドベクターに挿入し、VHHとCH1を連結させたVHH-CH1を複数含むライブラリを調製した。
VHH-CH1をコードする遺伝子が挿入されたファージミドベクターを大腸菌にエレクトロポレーション法で導入し、得られた大腸菌を培養し、実施例9-1で調製したヘルパーファージM13KO7TC-Vk1-39-k0MTdCを感染させることで、ファージミドベクターから発現するVHH-CH1とヘルパーファージから発現する全長軽鎖がFab構造を形成し、VHH-CH1をコードする遺伝子が含まれるファージミドの表面に、VHH-CH1/全長軽鎖(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)を提示するファージ集団を作製できる。また、VHH-CH1をコードする遺伝子が挿入されたファージミドベクターが導入された大腸菌を培養し、実施例9-1で調製したヘルパーファージM13KO7TC-k0MTdCを感染させることで、ファージミドベクターから発現するVHH-CH1とヘルパーファージから発現する軽鎖定常領域がVHH-CH1とCLが会合した構造を形成し、VHH-CH1/軽鎖定常領域(VHH-CH1/k0MTdC)を提示するファージ集団を作製できる。培養上清に2.5 M NaCl/10% PEGを添加してPEG沈殿法によりファージを精製できる。得られたファージのタイターを一般的なプラーク形成法にて確認できる。
実施例9-2で作製されたVHH-CH1ライブラリから、軽鎖可変領域との会合で抗原結合が阻害され、軽鎖可変領域がないときに抗原結合能を示すVHHを含むVHH-CH1をパニングにより取得した。
抗原として、参考実施例で作製したビオチン標識されたヒトPlexinA1を用いた。
パニング方法として、以下のステップ:
(1)実施例9-2で作製されたVHH-CH1ファージライブラリに対し、実施例9-3の方法でVHH-CH1/軽鎖定常領域(VHH-CH1/k0MTdC)を提示するファージ集団を制作し、中から抗原が固定されている磁気ビーズに結合したファージを回収する
(2)回収したファージに対して実施例9-3の方法でVHH-CH1/全長軽鎖(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)を提示するファージ集団を制作し、中から抗原が固定されている磁気ビーズに結合しないファージを回収する;
(3)回収したファージに対して、ステップ(1)と(2)を繰り返し、所望のファージを回収する;
に沿って行った。パニングの結果、軽鎖Vk1-39-k0MTdCとの会合でPlexinA1に対する結合が阻害され、軽鎖可変領域がないときにPlexinA1に対する結合能を示すVHH-CH1を複数個選択できた。
また、別のパニング方法として、以下のステップ:
(1)実施例9-2で作製されたVHH-CH1ファージライブラリに対し、実施例9-3方法でVHH-CH1/軽鎖定常領域(VHH-CH1/k0MTdC)を提示するファージ集団を制作し、中から抗原が固定されている磁気ビーズに結合したファージを回収する;
(2)回収したファージに対して実施例9-3の方法でVHH-CH1/全長軽鎖(VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC)を提示するファージ集団を制作し、中から抗原が固定されている磁気ビーズに結合しないファージを回収し、回収したファージから更に、抗軽鎖抗体 (EY Laboratories, Cat. BAT-2107-2)が固定された磁気ビーズに対して結合するファージを回収する;
(3)回収したファージに対して、ステップ(1)と(2)を繰り返し、所望のファージを回収する;
に沿って行った。パニングの結果、軽鎖Vk1-39-k0MTdCとの会合でPlexinA1に対する結合が阻害され、軽鎖可変領域がないときにPlexinA1に対する結合能を示すVHH-CH1を複数個選択できた。
パニングにより選択されたVHH-CH1中のVHHは、IgG抗体様分子の作製に使用できる。
実施例9-4で選択されたVHH-CH1に含まれるVHHをコードする塩基配列を実施例3に記載の方法で、プロテアーゼ切断サイトおよび重鎖定常領域をコードする塩基配列に接続してIgG抗体様分子の重鎖として使用し、全長軽鎖VK1-39-k0MT(配列番号:3)と組み合わせて、当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
作製されたIgG抗体様分子は表4に示す。
実施例9-4で調製したIgG抗体様分子を実施例3と同様の方法でプロテアーゼにより切断し、切断の程度を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図22に示す。なお、プロテアーゼ濃度は25 nMで実施した。
その結果、作製した各IgG抗体様分子中のプロテアーゼ切断配列がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
次に、プロテアーゼ処理によって遊離したVHHとヒトPlexinA1の結合評価を実施例3と同様の方法で行った。Octetのセンサーグラムを図23に示す。
その結果、作製した各IgG抗体様分子において、プロテアーゼ処理前のIgG抗体様分子は抗原結合を示さないのに対し、プロテアーゼ処理後に遊離VHHによる抗原結合が確認された。
10-1 癌抗原とCD3に結合する二重特異性VHH-VHH及び二重特異性VHH-VHH含有ポリペプチドの作製
図8に示されたように、プロテアーゼによって活性化される抗原結合ドメインは第2の抗原結合ドメインと二重特異的抗原結合分子を形成してもよい。
ヒトグリピカン3を認識するVHH HN3(配列番号:159)とCD3を認識するVHH G03(配列番号:160)をグリシンとセリンで構成されるリンカーを介して接続し、二重特異的VHH-VHH HN3G03を作製し、さらにプロテアーゼ切断配列を介して配列番号:161に示す抗体重鎖定常領域を接続した二重特異的VHH-VHH含有重鎖HN3G03-cF760mnHIF(配列番号:162)を動物発現用ベクターに挿入した。
Her2を認識するVHH HerF07(配列番号:163)とCD3を認識するVHH G03(配列番号:160)をグリシンとセリンで構成されるリンカーを介して接続し、二重特異的VHH-VHH HerF07G03を作製し、さらにプロテアーゼ切断配列を介して配列番号:161に示す抗体重鎖定常領域を接続した二重特異的VHH-VHH含有重鎖HerF07G03-cF760mnHIF(配列番号:164)を動物発現用ベクターに挿入した。
それぞれの二重特異的VHH-VHH含有重鎖を、軽鎖VK1.39-k0MT(配列番号:3)と、ヒンジ領域からC末端までのヒト定常領域配列VHn-Kn010dGK(配列番号:166)がそれぞれ挿入されている動物発現用ベクターと共にExpi293細胞(Life technologies)に導入し、二重特異性VHH-VHH含有ポリペプチドを発現した。その後、当業者公知の方法でMonoSpin ProA 96ウェルプレートタイプ (GL science, Cat No.:7510-11312)を用いて二重特異性VHH-VHH含有ポリペプチドを精製した。二重特異的VHH-VHH HN3G03を含むポリペプチドはHN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTであり、二重特異的VHH-VHH HerF07G03を含むポリペプチドはHerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTである。
次に、プロテアーゼ処理として、精製した二重特異性VHH-VHH含有ポリペプチド 40μgに終濃度25nMとなるようにuPA(Recombinant Human u-Plasminogen Activator、R&D systems)を加え20時間以上37℃で保温した。プロテアーゼを処理しないサンプルは、プロテアーゼの代わりにPBSをプロテーゼの量と同じ量加えて保温した。プロテアーゼ切断を実施した二重特異性VHH-VHH含有ポリペプチドが目的通り切断されているかを還元SDS-PAGEで確認した結果を図24に示す。図24に示す通り、プロテアーゼ切断によって二重特異的VHH-VHHが全体から切り離されたことが示唆された。
CD3へのアゴニスト活性はJurkat-NFAT レポーター細胞(NFAT luc2_jurkat cell)を用いて評価された。Jurkat-NFATレポーター細胞は、CD3を発現しているヒト急性T細胞性白血病由来細胞にNFAT応答エレメントとルシフェラーゼ (luc2P) が融合しているセルラインであり、CD3の下流のシグナルが活性化するとルシフェラーゼが発現する 。標的細胞として、GPC3を用いた抗体はヒト肝がん由来細胞株のSK-HEP-1にhuman GPC3を強制発現させて樹立したSK-pca60細胞株を使用した。White-bottomed, 96-well assay plate (Costar, 3917)の各ウェルに、1.25E+04 cells /well, 7.50E+04 cells/wellとなるようにTarget cellとEffector cellをそれぞれ加え、当該wellにプロテアーゼ処理有りもしくはプロテアーゼ処理無しのHN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTの終濃度が1, 10, 100nMになるように添加した。5% CO2存在下で37℃, 24 hours incubateしたのち、Luciferase酵素活性をBio-Glo luciferase assay system (Promega, G7940) を使用して添付のprotocolに従って発光量を測定した。検出には2104 EnVisionを使用した。その結果を図25に示す。プロテアーゼ処理無しのサンプルの場合ルシフェラーゼ活性が上昇しなかったのに対して、プロテアーゼ処理有りのHN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTはではルシフェラーゼ活性が上昇することが示された。すなわち、プロテアーゼ処理有りのHN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT の場合、CD3に対するアゴニスト活性が確認でき、プロテアーゼ切断によってHN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTからGPC3とCD3の二重特異的VHH-VHHが遊離され、未切断時に阻害されたCD3結合活性を発揮した。
CD3へのアゴニスト活性はJurkat-NFAT レポーター細胞(NFAT luc2_jurkat cell)を用いて評価された。Jurkat-NFATレポーター細胞(Effector cell)は、CD3を発現しているヒト急性T細胞性白血病由来細胞にNFAT応答エレメントとルシフェラーゼ (luc2P) が融合しているセルラインであり、CD3の下流のシグナルが活性化するとルシフェラーゼが発現する 。標的細胞(Target cell)として、LS1034細胞株を使用した。White-bottomed, 96-well assay plate (Costar, 3917)の各ウェルに、2.50E+04 cells /well, 7.50E+04 cells/wellとなるようにTarget cellとEffector cellをそれぞれ加え、当該wellにプロテアーゼ処理有りもしくはプロテアーゼ処理無しのHerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTの終濃度が0.01, 0.1, 1nMになるように添加した。5% CO2存在下で37℃, 24 hours incubateしたのち、Luciferase酵素活性をBio-Glo luciferase assay system (Promega, G7940) を使用して添付のprotocolに従って発光量を測定した。検出には2104 EnVisionを使用した。その結果を図26に示す。プロテアーゼ処理無しのサンプルの場合ルシフェラーゼ活性が上昇しなかったのに対して、プロテアーゼ処理有りのHerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTではルシフェラーゼ活性が上昇することが示された。すなわち、プロテアーゼ処理有りのHerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT の場合、CD3に対するアゴニスト活性が確認でき、プロテアーゼ切断によってHerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MTからHer2とCD3の二重特異的VHH-VHHが遊離し、未切断時に阻害されたCD3結合活性を発揮した。
11-1.IL-6Rに結合するVHHを組み込んだポリペプチドへの多種のプロテアーゼ切断配列の導入
国際公開WO2010/115998号に記載されている、ヒトIL-6Rに対して結合および中和活性を有するVHHであるIL6R90(配列番号:1)をヒトIgG1の定常領域(CH1-hinge-CH2-CH3)に融合したIL6R90-G1T4(配列番号:167)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。IgG抗体様分子であるIL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT(重鎖配列番号:167、軽鎖配列番号:3)を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies) を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MTの重鎖のVHHとCH1の境界付近に多種のプロテアーゼ切断配列を挿入した。表5に示すプロテアーゼ切断配列をVHHとCH1の境界付近に挿入したものの発現ベクターを、当業者公知の方法で作製した。プロテアーゼ切断配列が挿入されたVHH含有重鎖配列を表6に示す。
これらの重鎖と軽鎖を組み合わせて、VHHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入した表7に示すIgG1抗体様分子を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
実施例11-1で調製したIgG抗体様分子がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン( MT-SP1 ) ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 10nM、抗体 50μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図27に示す。その結果、どのプロテアーゼ切断配列を挿入したIgG抗体様分子でも、プロテアーゼ処理によって37kDa付近に新たなバンドが生じた。即ち、IgG抗体様分子VHHとCH1の境界付近に挿入された、表5で示すプロテアーゼ切断配列がプロテアーゼによって切断されることが確認された。また、類似する方法で、表5で示すプロテアーゼ切断配列はIgG抗体に組み込まれるときにhuman uPA, mouse uPAに切断されることも確認された。
国際公開WO2010/115998号に記載されている、ヒトIL-6Rに対して結合および中和活性を有するVHHであるIL6R75(配列番号:190)をヒトIgG1の定常領域(CH1-hinge-CH2-CH3)に融合したIL6R75-G1m(配列番号:191)をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。実施例4-2と同様にVHHとVLの界面部位へアミノ酸改変を導入したIL6R75hu-G1m(配列番号:192)を作製した。プロテアーゼ切断配列を組み込んだ軽鎖VK1-39P+4-Pk0MT(配列番号:72)と、重鎖としてIL6R90-G1m(配列番号:2)、20A11hu-G1m(配列番号:39)、IL6R75hu-G1m(配列番号:192)を用いたIgG抗体様分子IL6R90-G1m/ VK1-39P+4-Pk0MT(重鎖配列番号:2、軽鎖配列番号:72)、20A11hu-G1m/ VK1-39P+4-Pk0MT(重鎖配列番号:39、軽鎖配列番号:72)、IL6R75hu-G1m/ VK1-39P+4-Pk0MT(重鎖配列番号:192、軽鎖配列番号:72)の発現・精製を実施例3と同様の方法により行った。
IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MTを実施例3と同様の方法でプロテアーゼにより切断し、切断の程度を評価した結果を図28に示す。具体的には、プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ50nM、IgG抗体様分子 50μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した。その結果、IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT、IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MTにおいて、VLとCLの境界付近がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
次に、プロテアーゼ処理によって露出したVHHとIL6Rの結合をELISAで評価した。具体的には、ストレプトアビジン・コート384ウェルプレート ( Greiner, 781990 ) に実施例3で使用した hsIL-6R-BAP1 を固相し、切断したIgG抗体様分子を室温で結合させた。30分間の反応後、HRP標識抗ヒトIgG抗体 ( Sigma, SAB3701362-2MG ) を室温で 10分間作用させ、TMB Chromogen Solution ( life technologies, 002023 ) を反応させた。室温で30分反応させた後、硫酸で反応を停止させ、Synergy HTX マルチモードリーダー (BioTek) で450 nm吸光度を測定した。抗原を固相したウェルとしなかったウェルの吸光度の比を算出し、S/N比とした。ELISAのS/N比(平均値)を縦軸、各IgG抗体様分子の濃度を横軸に、結果を図29に示す。この結果から、軽鎖に切断配列を導入したIgG抗体様分子20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MTのプロテアーゼ処理後では、プロテアーゼ未処理のIgG抗体様分子と比べてIL-6Rへの結合活性が10倍以上になり、IgG抗体様分子IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MTの場合、プロテアーゼ処理によりIL-6Rへの結合活性が1000倍以上となったことが示された。
13-1 多様なプロテアーゼ切断配列が導入されたポリペプチドの作製
ウロキナーゼやマトリプターゼ以外のプロテアーゼの認識配列を用いて、実施例3と同様にIgG抗体様分子を作製した。IL6R90-G1mの可変領域と定常領域の境界付近に、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-13で切断されることが知られている各種ペプチド配列およびそれらの切断配列の近傍にグリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーを含むペプチド配列を挿入した。挿入した配列は表8に示す。
これらの重鎖改変体と軽鎖を組み合わせて、重鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入したIgG抗体様分子を表9に示す。これらのIgG抗体様分子を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
実施例13-1で調製したIgG抗体様分子がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトMMP-2( R&D Systems, 902-MP-010 )、リコンビナントヒトMMP-7( R&D Systems, 907-MP-010)、リコンビナントヒトMMP-9( R&D Systems, 911-MP-010 )、リコンビナントヒトMMP-13( R&D Systems, 511-MM-010)を用いた。なお、MMP-2、MMP-7、MMP-9とMMP-13は1 MMP-aminophenylmercuric acetate (APMA; abcam, ab112146 ) と混ぜ、37℃でそれぞれ1または24時間活性化させてから使用した。プロテアーゼ 50 nM、100 nM、または 500 nM、IgG抗体様分子50μg/mLまたは100μg/mL、PBSまたは 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7.2 (以下、Tris)、37℃の条件下で20時間反応させた後に、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図30Aと図30Bに示す。図30Bではプロテアーゼによる切断をassay buffer(MMP Activity Assay Kit (Fluorometric - Green) (ab112146), Component C: Assay Buffer)で実施した。
その結果、MMP-2では6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.2-6R90EICHEMP2.2G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.3-6R90EICHEMP2.3G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.4-6R90EICHEMP2.4G1m/VK1-39-k0MT,6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT、6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EICHEG4SMP2.2G4SG1m/VK1-39-k0MT が、MMP-7では6R90EIVHEMP7.1-6R90EICHEMP7.1G1m/VK1-39-k0MT、6R90EIVHEMP7.2-6R90EICHEMP7.2G1m/VK1-39-k0MT、MMP-9では6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT、6R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EICHEG4SMP9G4SG1m/VK1-39-k0MT、MMP-13では6R90EIVHEMP13-6R90EICHEMP13G1m/VK1-39-k0MTが切断されることが確認された。
14-1 各種プロテアーゼ切断配列を導入した抗体改変体の作製
配列番号:831で示す重鎖と配列番号:832で示す軽鎖を有する抗体の軽鎖可変領域と定常領域の境界付近に表10中に示すプロテアーゼ切断配列を挿入し、異なるプロテーゼ切断配列を有する軽鎖改変体を作製した(表11)。
上記で作製したプロテアーゼ切断配列を有する軽鎖改変体と配列番号:831で示す重鎖を組み合わせて、表12に示す抗体改変体を当業者公知の方法でExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
14-1で調製した抗体改変体がプロテアーゼ処理により切断されるかSDS-PAGEで検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトu-Plasminogen Activator/Urokinase(human uPA, huPA) ( R&D Systems, 1310-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 40 nM、抗体 100μg/mL、PBS、37℃の条件下で1時間反応させたのちに、還元SDS-PAGEに供した。その結果、プロテアーゼ切断配列が導入された各抗体改変体はいずれもプロテアーゼ処理で切断されることを確認した。即ち、表10中のプロテアーゼ切断配列がプロテアーゼにより切断可能であることが示された。また、G7L.106a.12aa以外の抗体改変体のいずれも、G7L.106a.12aaより効率よく切断された。
15-1 プロテアーゼ切断配列を導入した抗体改変体の作製
実施例14で見出したプロテアーゼ切断配列に加えて、切断効率の向上とプロテアーゼに対する選択性向上を目的に更なるプロテアーゼ切断配列の検討を実施した。配列番号:831で示す重鎖と配列番号:832で示す軽鎖を有する抗体の軽鎖可変領域と定常領域の境界付近に表13中に示すプロテアーゼ切断配列を挿入し、異なるプロテーゼ切断配列を有する軽鎖改変体を作製した(表14、15)。
15-1で調製した抗体改変体がプロテアーゼ処理により切断されるかどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトu-Plasminogen Activator/Urokinase(human uPA, huPA)(R&D Systems;1310-SE-010)もしくはリコンビナントヒトMatriptase/ST14 Catalytic Domain (human MT-SP1, hMT-SP1) (R&D Systems; 3946-SE-010)を用い、huPA 40 nMもしくはhMT-SP1 3 nM、抗体改変体 100μg/mL、PBS、37℃の条件下で1時間反応させたのちに、キャピラリー電気泳動イムノアッセイに供した。キャピラリー電気泳動イムノアッセイにはWes (Protein Simple) を使用し、切断前後の軽鎖の検出には抗ヒトlambda鎖HRP標識抗体 (abcam; ab9007) を使用した。その結果、プロテアーゼ処理前に確認された36kDa付近のピークが消失し、20kDa付近に新たにピークが出現した。即ち、36kDa付近のピークが抗体改変体の未切断軽鎖であり、20kDa付近のピークが切断軽鎖と考えられた。プロテアーゼ処理後に得られた各ピークの面積をWes専用のソフトウェア (Compass for SW; Protein Simple) を用いて出力し、抗体改変体の切断率 (%) は(切断軽鎖ピーク面積)*100/(切断軽鎖ピーク面積+未切断軽鎖ピーク面積)の式により算出した。huPA処理による抗体改変体の切断率 (%) を表16、hMT-SP1処理による抗体改変体の切断率 (%) を表17に示した。前記表16および表17に示した抗体改変体の中で、G7L.106a.12aa(重鎖:G7H-G1T4(配列番号:831)、軽鎖:G7L.106a.12aa-LT0(配列番号:952))と比較してhuPAによる切断率が高くhMT-SP1における切断率が低い、即ちhuPAへより選択性の高い抗体改変体を表18に示した。
16-1 プロテアーゼ切断配列を導入した二重特異性抗体の作製
配列番号:1051で示す重鎖と配列番号:832で示す軽鎖を有する抗体(親抗体)の軽鎖可変領域と定常領域の境界付近に表19中に示すプロテアーゼ切断配列を挿入し、異なるプロテーゼ切断配列を有する軽鎖改変体を作製した(表20)。
配列番号:832で示す軽鎖や上記で作製したプロテアーゼ切断配列を有する軽鎖改変体と、配列番号:1051で示す重鎖を組み合わせて、表21に示す抗体改変体を当業者公知の方法でExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
また、キーホールリンペットヘモシアニン (KLH) に対する抗体であるMabKLHn(重鎖:IC17HdK-F760mnN17(配列番号:1390)、軽鎖:IC17L-k0(配列番号:1391))も当業者公知の方法でExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
配列番号:1051で示す重鎖と配列番号:832で示す軽鎖を有する親抗体及び表21で示す抗体改変体とMabKLHnを混合し、WO2015046467に記載の方法で表22に示す二重特異性抗体を作製した。
マウスに移植するプロテアーゼ安定発現細胞株としてB16F10/chGPC3/muPA細胞を用いた。この細胞株は、マウスメラノーマ株B16F10細胞に、改変したマウスの chimeric Glypican 3(chGPC3)遺伝子と、mouse uPA(muPA: NM_008873)遺伝子を導入し、安定発現株を樹立後にクローン化した細胞株である。B16F10/chGPC3/muPA細胞は10% FBS(SIGMA社製)、0.5 mg/mL Geneticin(gibco社製)、および1.5 μg/mL Puromycin(gibco社製)を含むRPMI1640培地(ナカライテスク社製)にて培養した。
移植動物としてチャールズリバー社から購入したC57BL/6NCrlマウス(6週齢、♀)を用いた。C57BL/6NCrlマウスの皮下にB16F10/chGPC3/muPA細胞を移植(一匹あたり1E6細胞数)し、移植腫瘍体積の平均がおよそ200 mm3から300 mm3になったマウスを改変抗体投与モデルマウスとして用いた。
移植腫瘍体積は以下の式にて算出した。
腫瘍体積=長径×短径×短径/2
B16F10/chGPC3/muPA細胞移植モデルマウスへの投与薬剤は、実施例16-1で作製された表22に示す各種プロテアーゼ切断配列を導入した抗体改変体を用いた。投与薬剤は 改変抗体濃度が0.1 mg/mLになるようにPBST-buffer(PBS+0.05% Tween20 buffer)を用いて調製した。
B16F10/chGPC3/muPA細胞移植マウスに、移植後11日目に各種プロテアーゼ切断配列を導入した抗体改変体5検体をそれぞれ投与量1 mg/kg(マウス体重1kgあたりの投与抗体量 mg)にて尾静脈より投与した。投与試験における抗体改変体名、投与量、また投与方法等の詳細を表23に示した。
抗体改変体投与後1日目および3日目に、B16F10/chGPC3/muPA細胞移植モデルマウスから眼窩採血により血液を採取した。採血はイソフルラン麻酔下で実施した。採取した血液を1,900×g、4℃で10分遠心した後、遠心後の上清を血漿成分として取得し、-30℃で保管した。
実施例16-6で回収した血漿からDynabeads Protein A (Thermo; 10001D) を用いて当業者公知の方法で抗体を精製し、抗体改変体のプロテアーゼ切断効率を評価するためキャピラリー電気泳動イムノアッセイに供した。キャピラリー電気泳動イムノアッセイにはWes (Protein Simple) を使用し、抗体軽鎖の検出には抗ヒトlambda鎖HRP標識抗体 (abcam; ab9007)を使用し、抗体重鎖の検出には抗ヒト重鎖HRP標識抗体 (Protein Simple; 043-491)を使用した。その結果、抗ヒトlambda鎖抗体では36kDa付近に未切断の全長軽鎖のピークが検出され、抗ヒト重鎖抗体では56kDa付近に全長重鎖のピークが検出された。なお、MabKLHnの軽鎖はkappa鎖であるため抗ヒトlambda鎖抗体では検出されないため、抗ヒトlambda鎖抗体を用いることでプロテアーゼ切断配列を導入した軽鎖の切断効率の評価が可能である。キャピラリー電気泳動イムノアッセイにより得られた各ピークの面積をWes専用のソフトウェア (Compass for SW; Protein Simple) で出力し、軽鎖残存比として(軽鎖ピーク面積)/(重鎖ピーク面積)を計算することで、マウス体内で切断されずに残った全長軽鎖の割合を求めた。マウス投与後1日後および3日後に回収した抗体の軽鎖残存比を図31に示した。その結果、腫瘍移植マウスの体内において、プロテアーゼ切断配列を導入した表21で示す抗体改変体は、配列番号:1051で示す重鎖と配列番号:832で示す軽鎖を有する親抗体よりも軽鎖残存比が低下していることが確認された。即ち、プロテアーゼ切断配列を導入した軽鎖が腫瘍移植マウス体内で効率良く切断されたことが示された。
ビオチン化プレキシンA1(ビオチン標識されたヒトPlexinA1とも呼ぶ)は当業者公知の方法で調製した。具体的には、プレキシンA1の細胞外領域をコードする遺伝子断片の下流にビオチンリガーゼによってビオチンが付加される特異的な配列(AviTag配列、配列番号:36)をコードする遺伝子断片とFLAGタグ配列(配列番号:199、DYKDDDDK)をコードする遺伝子断片をグリシンとセリンで構成されるリンカーをコードする遺伝子断片を介して連結した。プレキシンA1とAviTag配列およびFLAGタグ配列が連結されたタンパク質(配列番号:200)をコードする遺伝子断片を動物細胞発現用ベクターに組み込み、構築されたプラスミドベクターを293フェクチン(Invitrogen)を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen)に導入した。このときEBNA1(配列番号:57)を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ(BirA、配列番号:201)を発現する遺伝子を同時に導入し、さらにプレキシンA1をビオチン標識する目的でビオチンを添加した。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的のタンパク質(ビオチン化プレキシンA1)を培養上清中に分泌させた。この細胞培養液を0.22μmボトルトップフィルターでろ過し、培養上清を得た。
Anti FLAG M2 agarose (Sigma-Aldrich, #A2220)をカラムに詰めて、FLAGカラムを作製した。FLAGカラムをあらかじめD-PBS(-)で平衡化し、培養上清をアプライして、ビオチン化プレキシンA1をカラムに結合させた。続いて、D-PBS(-)に溶解したFLAG ペプチドでビオチン化プレキシンA1を溶出した。この溶出液を、HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, 320mL (GE healthcare, 28-9893-36)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって、会合体を除去して、精製ビオチン化プレキシンA1を得た。
また、抗原結合ドメインの一例である特定のVLもしくはVHもしくはVHHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体をスクリーニングまたは製造することで、本発明のポリペプチドを効率よく製造することが可能である。さらに、本発明のポリペプチドに使用できる抗原結合ドメインの一例である特定のVLもしくはVHもしくはVHHと会合することで抗原結合活性が抑制される単ドメイン抗体を含むライブラリを用いれば、前述のポリペプチドを作製するときに必要とする抗原結合ドメインを、効率よく取得することが可能である。
Claims (15)
- ポリペプチドであって、当該ポリペプチドは抗原結合ドメインと運搬部分とを含み、当該運搬部分は前記抗原結合ドメインの抗原結合活性を抑制する抑制ドメインを有し、当該ポリペプチドは配列番号:833~852、1062~1081で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる配列を一つまたは複数含むプロテアーゼ切断配列を有する、ポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼにより切断された状態における前記抑制ドメインの前記抗原結合ドメインの抗原結合活性に対する抑制は、前記プロテアーゼ切断配列が未切断の状態における前記抑制ドメインの前記抗原結合ドメインの抗原結合活性に対する抑制より弱い、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインは前記運搬部分より短い血中半減期を有する、請求項1または請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインは前記ポリペプチドから遊離可能であり、前記抗原結合ドメインは、前記ポリペプチドから遊離している状態下における抗原結合活性は、前記ポリペプチドから遊離していない状態下における抗原結合活性より高い、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインと前記運搬部分の前記抑制ドメインが会合することで前記抗原結合ドメインの抗原結合活性が抑制される、請求項1から請求項4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼにより切断されることで、前記抗原結合ドメインが前記ポリペプチドから遊離可能になる、または/及び前記抗原結合ドメインと前記運搬部分の前記抑制ドメインの会合が解消される、請求項4または請求項5に記載のポリペプチド。
- 前記プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼである、請求項1から請求項6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体を含み、もしくは単ドメイン抗体であり、前記運搬部分の前記抑制ドメインは当該単ドメイン抗体の抗原結合活性を抑制する、請求項1から請求項7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記抗原結合ドメインは単ドメイン抗体を含み、前記運搬部分の前記抑制ドメインはVHH、または抗体VH、または抗体VLであり、前記単ドメイン抗体は当該VHH、または抗体VH、または抗体VLにより抗原結合活性が抑制される、請求項1から請求項8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記運搬部分は抗体定常領域を含む、請求項1から請求項9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは前記運搬部分の抗体定常領域のN末端と前記抗原結合ドメインのC末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合されており、前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗原結合ドメインと前記抗体定常領域の境界付近に位置する、請求項10に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドの抗体定常領域はIgG抗体定常領域である、請求項10または請求項11に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドはIgG抗体様分子である、請求項1から請求項12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
- 請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
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