WO2019037393A1 - 一种对glp-1受体具有高亲和性的多肽化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种对glp-1受体具有高亲和性的多肽化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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刘熠
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Evans Blue also known as Evans Blue, binds to albumin in vitro and in vivo to form EB-albumin complexes, effectively increasing the in vivo half-life of EB molecules.
  • EB-NH 2 amino-functionalized EB molecule
  • the molecules with different functions are covalently modified, for example, the drug molecule, NOTA, DOTA, etc. are modified on the EB, PET imaging and treatment for tumors and lymph nodes.
  • the separation of unreacted material from the lyophilized mixture described in step (3) can be removed by a typical dialysis method, for example, by dissolving the lyophilized mixture in a suitable buffer for dialysis.
  • a suitable buffer for dialysis There is no particular limitation on the buffer.
  • PBS phosphate buffer
  • the selected buffer should match the reaction conditions of Evans blue, depending on the functional group of Evans blue (maleic anhydride requires pH6) .5-7.5; pyridyldithiol or iodoacetyl requires pH alkaline, 7.0-8.5).
  • the reaction system can be isolated and purified using size exclusion chromatography or reversed-phase high performance liquid chromatography.
  • Figure 1 is a graph showing the purity of maleic dimethylenediamine prepared in the step a of Example 1;
  • Figure 3 is a purity diagram of the maleimide Evans blue prepared in the step b of Example 1.

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Abstract

本发明提供一种对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物，其分子结构如下式（I）所示，其中，R代表伊文氏蓝或其衍生物基团。本发明的多肽化合物具有结构稳定、制备简便、疗效显著、药效长久和便于储存等诸多优点，本发明还提供所述多肽化合物的制备方法，及其在制备诊断、预防或治疗GLP-1/GLP-1受体通路相关疾病的药物中的应用。

Description

一种对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物及其制备方法和应用 技术领域
本发明属于生物医药、药物制剂领域，具体涉及一种对GLP-1受体具有高亲和作用的多肽化合物，及其制备方法和其在制备GLP-1或GLP-1受体通路相关疾病的诊断、预防或治疗药物中的应用。
背景技术
胰高血糖素肽-1(GLP-1)的主要功能是刺激胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌，促进饱腹感，抑制肠胃的蠕动，增加葡萄糖的摄取并减轻体重。在非胰岛素依赖性糖尿病在(NIDDM)中，GLP-1能促进新生细胞生长，恢复胰岛素分泌，却不降低血糖。此外，通过注射给药的途径，GLP-1不会引起任何毒副作用。因此，GLP-1在治疗II型糖尿病方面具有重要作用。此外，GLP-1受体在心肌细胞和内皮细胞中均有表达，GLP-1能通过GLP-1受体激活cAMP、磷脂酸肌醇-3激酶和活化抗氧化酶，能有效地保护心肌功能和纤维化。因此GLP-1对心肌缺血、心肌缺血再灌注损伤以及慢性心脏衰竭和继发性心肌梗死都具有潜在的治疗作用，以GLP-1为先导化合物的心肌疾病治疗药物也成为了新药研发的热点。
然而，GLP-1是一种内源性二肽基酶-IV(DPP-IV)的底物，DPP-IV通过降解GLP-1的N-末端组氨酸(7)-丙氨酸(8)的肽键使GLP-1失活，导致GLP-1体内半衰期只有1-2分钟。为了减少GLP-1的降解，延长GLP-1在血浆中的保留时间，需要开发使用DPP-IV抑制剂，或者使用GLP-1受体和GLP-1衍生物反应的配体，如Exendin-4。Exendin-4有39个氨基酸，与GLP-1具有很高的同源性，能有效抑制DPP-IV水解，将体内半衰期延长至2-4小时。例如商用药物Exenatide能有效控制血糖水平，但是每日两次给药给病人带来了诸多不便。为了进一步提高药物的血液半衰期，延长药效，Exendin-4的衍生物研发主要集中在两个方向：第一，将分子量5K-12K道尔顿的PEG修饰在Exendin-4的赖氨酸或半胱氨酸上。这虽然延长了半衰期，但是减低了药物分子与受体的结合，降低了药物的生物活性。第二，将药物分子与半衰期长的白蛋白相结合，实现药物的长循环药效。例如，十六碳链修饰的药物分子Liraglutide能与白蛋白相互结合能实现一日一次注射给药的效果；Exendin-4共价修饰的白蛋白分子药物分子Albiglutide半衰期可达4-7天，但Albiglutide是蛋白制品，不利于储存，且 造价太高。这些也限制了临床应用。
伊文氏蓝(Evans Blue，EB)，又称伊文思兰，在体外和体内能与白蛋白结合形成EB-白蛋白复合物，有效地提高了EB分子的体内半衰期。通过化学改造，将氨基功能化的EB分子(EB-NH 2)上连接不同的反应位点，共价修饰上不同功能的分子，例如，将药物分子、NOTA、DOTA等修饰在EB上，可以用于肿瘤和***的PET成像和治疗。
基于以上考虑，现有技术中提出了以一种将伊文氏蓝(Evans Blue)或其衍生物定位修饰在Exendin-4上制备GLP-1受体亲和性多肽的方法，初步研究表明了这类多肽保留了Exendin-4的天然生物活性，也延长了体内半衰期，在II型糖尿病治疗中减少了剂量和给药次数。但是研究发现，这类多肽的稳定性还有待提高，不能满足药物长时间储运的需求，导致临床应用受到限制。
发明内容
本发明的首要目的在于：提供一种对GLP-1受体具有高亲和性的多肽，具有良好的DPP-IV抑制效果，同时具有高稳定性，能够更长久地保持分子结构稳定，可有效延长体内半衰期。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
提供一种对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物，其分子结构如下式(I)所示：
Figure PCTCN2018075186-appb-000001
其中，R代表伊文氏蓝或其衍生物基团。
本发明的方案中，所述的伊文氏蓝或其衍生物基团可以来自不同链长修饰的伊文氏蓝或其衍生物。优选的方案中，所述的伊文氏蓝或其衍生物选自伊文氏蓝马来酰亚胺、伊文氏蓝醛、伊文氏蓝吡啶基二硫酚或伊文氏蓝碘代乙酰基中的任意一种。
本发明最优选的方案中，所述式(I)的R为伊文氏蓝马来酰亚胺基团，即所述的对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物的分子结构如下式(II)所示：
Figure PCTCN2018075186-appb-000002
本发明另一个目的在于：提供制备本发明所述的对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物的方法。
所述制备方法包括：以伊文氏蓝(Evans Blue)或其衍生物和[Leu] 14Exendin-4为原料，所述的伊文氏蓝或其衍生物带有可与巯基反应的基团，所述的[Leu] 14Exendin-4末端修饰有半胱氨酸Cys-，通过所述原料之间的偶联反应，将伊文氏蓝或其衍生物修饰在[Leu] 14Exendin-4末端半胱氨酸Cys的巯基上，得到本发明所述的对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物。
本发明优选的所述的方法，具体包括以下步骤：
(1)在醋酸钠溶液中，在还原剂存在下，末端修饰有半胱氨酸Cys-的[Leu] 14Exendin-4与带有可与巯基反应的基团的伊文氏蓝或其衍生物在避光条件下发生偶联反应，室温反应1-3小时，得到反应混合液；
(2)冻干步骤(1)的反应混合液，得到冻干混合物；
(3)从步骤(2)所得的冻干混合物中分离和提纯未反应的伊文氏蓝或其衍生物、未反应的[Leu] 14Exendin-4、以及偶联产物，所述的偶联产物即本发明所述的对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物。
本发明的方法中，步骤(1)所述的带有可与巯基反应的基团的伊文氏蓝或其衍生物，可以是不同链长修饰的伊文氏蓝或其衍生物，同时带有可与巯基反应的基团。
本发明进一步优选的方法中，所述的可与巯基反应的基团可以选自：马来酰亚胺基团、吡啶基二硫酚基团、碘代乙酰基基团或醛基中的任意一种。
本发明进一步优选的制备方法中，步骤(1)所述的醋酸钠溶液的浓度为50mM；所述的还原剂为NaCNBH 3，还原剂的加入比例为20mM。
本发明进一步优选的制备方法中，步骤(1)所述的末端修饰有半胱氨酸Cys-的[Leu] 14Exendin-4与带有可与巯基反应的基团的伊文氏蓝或其衍生物反应摩尔比为1:1。
本发明进一步优选的制备方法中，步骤(1)所述的偶联反应时间为2小时。
本发明方法中，步骤(3)所述的从冻干混合物中分离未反应的物质，可以通过典型的透析方法来去除，例如将所述的冻干混合物溶解在适当的缓冲液中透析。对于缓冲液没有特别的限制。通常是本领域中经常使用的一种，可以用PBS(磷酸盐缓冲液)，所选择的缓冲液要与伊文氏蓝的反应条件相匹配，取决于伊文氏蓝的官能团(马来酸酐要求pH6.5-7.5；吡啶基二硫酚或碘代乙酰基要求pH碱性，7.0-8.5)。反应体系可以使用体积排阻色谱或反向高效液相色谱进行分离和提纯。
本发明再一个目的在于：提供所述对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物在制备诊断、预防或治疗GLP-1/GLP-1受体通路相关疾病的药物中的应用。
所述的诊断包括对GLP-1/GLP-1受体通路相关疾病的影像学诊断以及疗效监测。
本发明优选的应用方案中，所述的GLP-1/GLP-1受体通路相关疾病是II型糖尿病或心肌梗死。其中，所述的多肽化合物通过促进胰岛素的过量分泌来实现对II型糖尿病的预防和治疗；通过GLP-1受体而激活cAMP和磷脂酸肌醇-3激酶来治疗心肌缺血性损伤；另外，所述的多肽化合物还能够活化抗氧化酶而减轻心肌缺血所引起的纤维化，并促进左心室的功能恢复。
本发明优选的应用方案中，将本发明所述的多肽化合物作为活性成分制备成口服制剂或注射剂。
所述的口服的制剂可以是固体的或液体的。固体口服制剂剂型可以是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂等，通常配制至少需要一种辅料成分，如淀粉，碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶；除了辅料成分之外，还有润滑剂，如使用硬脂酸镁或滑石。液体形式的口服制剂可以是悬浮液、体内使用的液体、乳剂或糖浆剂；这些口服剂型可辅以湿润剂、甜味剂、风味剂、防腐剂、抑或简单的稀释剂，如液体或液体石蜡。
所述的注射剂可以是无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干剂或栓剂。非水溶剂或悬浮剂中会含有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和/或可注射的酯(如油酸乙酯)。
本发明中制备的制剂给药量取决于各种因素，包括性别、年龄、体重、身体状况、饮食、给药时间和途径、代谢率和疾病的严重程度。一般来说，通过不同的给药途径观察药物在一到两个星期内被完全吸收的有效剂量。在每日有效剂量范围内，本发明的制剂可能一次给药， 或每日多次给药。与现有技术相比，本发明所述的多肽化合物保留了Exendin-4天然生物活性，同时拥有比未修饰的Exendin-4更长的体内半衰期，具有良好的药代动力学和药理效应。更值得一提的是，本发明中来自[Leu] 14Exendin-4的氨基酸序列为所述多肽化合物带来了很好的结构稳定性，比现有的其他同类多肽在分子结构稳定方面获得了显著的提升。
本发明的制备方法中，伊文氏蓝(Evans Blue)或其衍生物通过偶联反应修饰在[Leu] 14Exendin-4末端的C半胱氨酸Cys的巯基上，实现了对[Leu] 14Exendin-4多肽的定点伊文氏蓝修饰，制备方法简便易行。
总之，本发明的多肽具有制备简便，疗效明显，药效长久、稳定、便于储存等优点。
附图说明
图1为实施例1步骤a制备的马来酰亚二甲苯胺的纯度图；
图2体现了实施例1步骤a制备的马来酰亚二甲苯胺的分子量；
图3为实施例1步骤b制备的马来酰亚胺伊文氏蓝的纯度图；
图4体现了实施例1步骤b制备的马来酰亚胺伊文氏蓝的分子量；
图5为实施例1步骤2)制备的多肽化合物的纯度图；
图6体现了实施例1步骤2)制备的多肽化合物的分子量；
图7体现了实施例1步骤2)制备的多肽化合物与对比多肽的稳定性测定结果比较；
图8体现了实施例1步骤2)制备的多肽化合物的小鼠模型的药效分析结果。
图9体现了实施例1步骤2)制备的多肽化合物的食蟹猴模型的药效分析结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，本实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。
本发明中使用的[Leu] 14Exendin-4可通过现有技术的化学合成或基因工程重组表达等方式获得。
实施例1
1)制备马来酰亚胺伊文氏蓝衍生物：
a.中间体马来酰亚二甲苯胺Mal-tolidine的制备
将3-马来酰亚胺基丙酸(10.0mmol)、HATU(20mmol)和DIPEA(50.0mmol)依次投至3,3'-二甲基联苯胺tolidine(50.0mmol)的乙腈(500mL)溶液。室温搅拌48h后，将反应混合物过滤，滤液旋干除去溶剂得黄色粗产物。残留物过硅胶柱纯化得淡黄色的中间体Mal-C3-Tolidine，其表征见图1、2，产率60％。反应过程如下：
Figure PCTCN2018075186-appb-000003
b.带有马来酰亚胺基团的伊文氏蓝(MEB)的制备
将步骤a制得的马来酰亚二甲苯胺Mal-tolidine(5.0mmol)溶解至乙腈和水的混合溶剂得黄色溶液。在冰浴条件下，将HCl缓慢滴加至上述Mal-tolidine溶液。搅拌10min后，再缓慢滴加NaNO 2(20.0mmol)的溶液，持续搅拌30min得到黄色重氮盐溶液，待用。将NaHCO 3(30.0mmol)和1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠水合物(5.0mmol)分别溶于冰水中。然后，将新制的重氮盐溶液缓慢滴加至上述溶液，冰浴下继续搅拌2h得到紫色溶液。紫色溶液用纯水透析后直接冷冻干燥得紫色粉末Mal-C3-EB(MEB)，其表征见图3、4，产率约为80％。反应过程如下：
Figure PCTCN2018075186-appb-000004
2)制备伊文氏蓝修饰的[Leu] 14Exendin-4
步骤1)制备的MEB(1mmol)的醋酸钠溶液(50mM，pH 5.5)中加入5mL[Leu] 14Exendin-4(1mmol)溶于50mM醋酸钠溶液(50mM，pH 5.5)制得的溶液，然后加入20mM NaCNBH 3还原剂。在避光条件下室温反应2小时。用0.1％的含水三氟乙酸(TFA)终止反应，得到反应混合液，将反应混合液冻干得到冻干混合物，然后将冻干混合物溶解于pH为6.5的PBS缓冲液中，通过透析去除未反应物质，最终得到伊文氏蓝修饰的 [Leu] 14Exendin-4。纯化后的伊文氏蓝修饰的[Leu] 14Exendin-4表征如图5、6所示，其保留时间为22.5分钟。
本步骤中采用的[Leu] 14Exendin-4序列为：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-NH 2。
本步骤反应过程如下：
Figure PCTCN2018075186-appb-000005
伊文氏蓝修饰的[Met] 14Exendin-4的稳定性分析
为了检验实施例1所制备的多肽化合物的稳定性，我们选择同样被MEB修饰的[Met] 14Exendin-4作为对比多肽，其中被修饰的[Met] 14Exendin-4序列为：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-NH 2。
将两种化合物的溶液分别于37℃下放置36小时。利用液相和质谱监控两种溶液的稳定性。如图所示7，在放置36小时后，MEB修饰的[Met] 14Exendin-4(对比多肽)的分子量出现了新峰[m/z＝4999]，其归属于多肽蛋氨酸上的甲硫醚氧化产物亚砜。而实施例1的MEB修饰的[Leu] 14Exendin-4的分子量没有明显的变化。这说明Leu取代Met后有效提高了多肽化合物的分子稳定性。
小动物试验中的药效研究
利用小动物模型比较几种药物在II型糖尿病中的药效。在II型糖尿病模型小鼠中，将天然Exendin-4、商用Albiglutide、实施例1制备的多肽化合物分别经皮下注射至小鼠体内，而后定时取血，血糖浓度通过ELISA试剂盒监测定量，结果如图8所示。结果显示，本发明实施例1的多肽化合物能够比天然Exendin-4和商用Albiglutide更长久地将血糖维持在较低水平。
大动物试验中的药效研究
利用大动物模型比较几种药物在II型糖尿病中的药效，以II型糖尿病食蟹猴为实验模型，分别将商用Albiglutide和实施例1制备的多肽化合物经皮下注射至II型糖尿病模型食蟹猴体内，而后定时取血，血糖浓度通过ELISA试剂盒监测定量。结果如图所示9。结果显示，实施例1制备的多肽化合物对II型糖尿病模型食蟹猴的血糖控制能力也优于Albiglutide。
实施例2
带有醛基的伊文氏蓝(1mmol)的醋酸钠溶液(50mM，pH 5.5)中加入5mL[Leu] 14Exendin-4(1mmol)溶于50mM醋酸钠溶液(50mM，pH 5.5)制得的溶液，然后加入20mM的NaCNBH 3还原剂。在避光条件下，室温反应2小时。用0.1％的含水三氟乙酸(TFA)终止反应，反应混合液，将反应混合液冻干得到冻干混合物，然后将冻干混合物溶解于pH为7.0的PBS缓冲液中，通过透析去除未反应物质，最终得到伊文氏蓝修饰的[Leu] 14Exendin-4。
实施例3
带有啶基二硫酚基团的伊文氏蓝(1mmol)的醋酸钠溶液(50mM，pH 5.5)中加入5mL的[Leu] 14Exendin-4(1mmol)溶于50mM醋酸钠溶液(50mM，pH 5.5)制得的溶液，然后加入20mM的NaCNBH 3还原剂。在避光条件下，室温反应2小时。用0.1％的含水三氟乙酸(TFA)终止反应，反应混合液，将反应混合液冻干得到冻干混合物，然后将冻干混合物溶解于pH为8.5的PBS缓冲液中，通过透析去除未反应物质，最终得到伊文氏蓝修饰的[Leu] 14Exendin-4。
实施例4
带有碘代乙酰基团的伊文氏蓝(1mmol)的醋酸钠溶液(50mM，pH 5.5)中加入5mL的[Leu] 14Exendin-4(1mmol)溶于50mM醋酸钠溶液(50mM，pH 5.5)制得的溶液，然后加入20mM的NaCNBH 3还原剂。在避光条件下，室温反应2小时。用0.1％的含水三氟乙酸(TFA)终止反应，反应混合液，将反应混合液冻干得到冻干混合物，然后将冻干混合物溶解于pH为7.5的PBS缓冲液中，通过透析去除未反应物质，最终得到伊文氏蓝修饰的[Leu] 14Exendin-4。

Claims (10)

  1. 一种对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物，其分子结构如下式(I)所示：
    Figure PCTCN2018075186-appb-100001
    其中，R代表伊文氏蓝或其衍生物基团。
  2. 权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于：所述的伊文氏蓝或其衍生物选自伊文氏蓝马来酰亚胺、伊文氏蓝醛、伊文氏蓝吡啶基二硫酚或伊文氏蓝碘代乙酰基中的任意一种。
  3. 权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于：所述式(I)的R为伊文氏蓝马来酰亚胺基团，即所述的对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物的分子结构如下式(II)所示：
    Figure PCTCN2018075186-appb-100002
  4. 制备权利要求1所述的对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物的方法，其特征在于：以伊文氏蓝(Evans Blue)或其衍生物和[Leu] 14Exendin-4为原料，所述的伊文氏蓝或其衍生物带有可与巯基反应的基团，所述的[Leu] 14Exendin-4末端修饰有半胱氨酸Cys-，通过所述原料之间的偶联反应，将伊文氏蓝或其衍生物修饰在[Leu] 14Exendin-4末端半胱氨酸Cys的巯基上，得到所述的对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物。
  5. 权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
    (1)在醋酸钠溶液中，在还原剂存在下，末端修饰有半胱氨酸Cys-的[Leu] 14Exendin-4与带有可与巯基反应的基团的伊文氏蓝或其衍生物在避光条件下发生偶联反应，室温反应1-3小时，得到反应混合液；
    (2)冻干步骤(1)的反应混合液，得到冻干混合物；
    (3)从步骤(2)所得的冻干混合物中分离和提纯未反应的伊文氏蓝或其衍生物、未反应的[Leu] 14Exendin-4、以及偶联产物，所述的偶联产物即所述的对GLP-1受体具有高亲和性 的多肽化合物。
  6. 权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述的可与巯基反应的基团选自马来酰亚胺基团、吡啶基二硫酚基团、碘代乙酰基基团或醛基中的任意一种。
  7. 权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的末端修饰有半胱氨酸Cys-的[Leu] 14Exendin-4与带有可与巯基反应的基团的伊文氏蓝或其衍生物反应摩尔比为1:1；步骤(1)所述的醋酸钠溶液浓度为50mM；步骤(1)所述还原剂为NaCNBH 3，加入比例为20mM；步骤(1)所述的偶联反应时间为2小时。
  8. 权利要求1所述的对GLP-1受体具有高亲和性的多肽化合物在制备诊断、预防或治疗GLP-1/GLP-1受体通路相关疾病的药物中的应用。
  9. 权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的GLP-1/GLP-1受体通路相关疾病是II型糖尿病或心肌梗死。
  10. 权利要求8所述的应用，其特征在于：将权利要求1所述的多肽化合物作为活性成分制备成口服制剂或注射剂。
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