WO2018199798A1 - Пептидные производные противовирусного препарата занамивира - Google Patents

Пептидные производные противовирусного препарата занамивира Download PDF

Info

Publication number
WO2018199798A1
WO2018199798A1 PCT/RU2017/000278 RU2017000278W WO2018199798A1 WO 2018199798 A1 WO2018199798 A1 WO 2018199798A1 RU 2017000278 W RU2017000278 W RU 2017000278W WO 2018199798 A1 WO2018199798 A1 WO 2018199798A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
influenza virus
zanamivir
general formula
associate
type
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/000278
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Николай Владимирович БОВИН
Александр Александрович ЧИНАРЁВ
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Синтавр"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Синтавр" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Синтавр"
Priority to PCT/RU2017/000278 priority Critical patent/WO2018199798A1/ru
Publication of WO2018199798A1 publication Critical patent/WO2018199798A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/16—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D309/28—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms

Definitions

  • This invention relates to the chemistry of organic compounds, pharmacology and medicine, and relates to the development and preparation of co-associates consisting of various types of oligoglycine molecules that are highly effective in inhibiting the influenza virus.
  • Viral diseases are responsible for both global pandemics and annual seasonal epidemics such as influenza. Outbreaks of disease can be characterized by increased virulence and can occur suddenly, leading to high mortality. Importantly, viral diseases are not limited to diseases in humans. For example, flu also affects livestock and birds.
  • influenza virus drugs are used whose action is aimed at suppressing the replication of the influenza virus.
  • the main target for drug intervention is viral neuraminidase, an enzyme necessary for the normal budding of viral particles and the manifestation of the infectious properties of the influenza virus.
  • Zanamivir is the first derivative of guanidino-neuraminic acid that acts on the neuraminidase of the influenza virus, which has become used as a medicine against the influenza virus. Subsequent developments [11] were aimed at obtaining analogues, with increased activity and bioavailability, as well as prolonged action. Dimerization of the zanamivir molecule by combining two monomers at hydroxyl 07 resulted in the production of an analog of approximately the same activity as the monomer, but with a prolonged action. However, this is not enough for effective treatment of influenza, since zanamivir and similar neuraminidase inhibitors only reduce the duration of the disease by 1 to 2 days, but do not lead to a radical rapid cure, and are also unable to act preventively.
  • antenna peptides - [H-Gly n -NH] 2 -4X representing from 2 to 4 oligoglycine chains (antennas) associated with a branching center (X), which is used as ⁇ , ⁇ -diaminoalkane oligoethyleneglycol with terminal amino groups, as well as di, are tri- and tetraamino derivatives of pentaerythritol.
  • the antennas reach a critical size, 4 - 7 Gly residues, the peptide molecules are capable of spontaneous self-assembly of supramers.
  • supramers they are polyglycine-I structures, where oligoglycine chains are located at the sites of the hexagonal lattice, spiral, and multiple hydrogen bonds arise between them.
  • oligoglycine chains are located at the sites of the hexagonal lattice, spiral, and multiple hydrogen bonds arise between them.
  • transmission electron and scanning probe microscopy methods it was shown that morphologically the supramers are extended planar formations (20 crystals); their height approximately corresponds to the length of the peptide molecule (40-70 A), and planar sizes vary in the range from 50 to 5000 nm.
  • Substituents of various nature can be covalently attached to the ends of the antennas of the branched molecules (directly or via a spacer / linker insert, sp); modified [R-sp-Gly n- NH] 2-4 X molecules are also capable of self-assembly as polyglycine-ll.
  • the surface of the formed supramers is covered with R groups, which ensure the solubility of the supramers in water, their resistance to sedimentation, as well as biological activity.
  • the indicated effect is caused by the specific recognition of neuraminic acid (Neu5Aca) residues by the viral lectin hemagglutinin (HA); this interaction is weak (K D ⁇ 1 ⁇ mol) at the monovalent level, but its affinity increases by 2–3 orders of magnitude with multipoint binding of the virus to glycopeptide supramers.
  • glycopeptide supramers adsorbed on viral particles sterically hinder the interaction of the latter with target cells.
  • the principle of the suppression of infectivity described above was proposed to be used for the construction of new generation antiviral drugs [1, 3-6].
  • supramers of mixed composition consisting of glycopeptide molecules and a diluent peptide [Suc-Gly 6 -NH (CH 2 ) 2] 2, the antennas of which are terminated with small hydrophilic groups (for example, ⁇ ( ⁇ 2 ) 2 C (0) -), which do not significantly affect the self-assembly of supramers (Fig. 1).
  • Mixed supramers suppress the interaction of fetuin with the influenza virus even in micromolar concentrations (1C 50 ⁇ 0.1 - 10 ⁇ mol), being 2–3 orders of magnitude more powerful blockers than monomeric 6'SLN.
  • the present invention is the creation of new effective inhibitors of influenza viruses of humans and animals based on zanamivir, promising for use in clinical practice.
  • the technical result of the invention is the development and preparation of new effective inhibitors of human and animal influenza viruses based on zanamivir, as well as the development and preparation of new multimeric derivatives (co-associates), which possess not only a prolonged action, but also an increased inhibitory activity against neuraminidase, and as a result, they are characterized by an increased ability to suppress the reproduction of the influenza virus.
  • X represents a spacer group
  • p is an integer from 6 to 10.
  • the spacer group X is —OC (0) NH (CH 2 ) 6 NHCO (CH 2 ) 4 CO—.
  • n 9.
  • X represents a spacer group
  • p is an integer from 6 to 10;
  • n is an integer from 6 to 10;
  • R represents ⁇ -, NOOSSN 2 CH 2 CO— or HOSN 2 CO—;
  • the molar ratio of compounds (I) and (II) in the co-associate is from 1: 10 to
  • the spacer group X is —OC (0) NH (CH 2 ) 6 NHCO (CH 2 ) 4 CO—.
  • n 9.
  • m is 9.
  • Y is a linker for linking the activated carboxyl group —COOW to a spacer
  • W represents an activating residue
  • W is a 4-paranitrophenyl moiety.
  • the present invention also relates to the use of compounds of the general formula (I) as well as co-associates of the invention as inhibitors of human influenza viruses.
  • the types of virus for which the co-associates of the invention can be used are A or B.
  • the subtype of type A human influenza virus is H1 or NC.
  • the invention relates to the use of compounds of general formula (I), as well as co-associates of the invention, for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of diseases associated with the human influenza virus.
  • the invention also includes pharmaceutical compositions for treating and / or preventing diseases associated with human influenza viruses, comprising a therapeutically effective amount of compounds of the general formula (I) or co-associates of the invention.
  • the invention also includes the preparation of compounds of general formula (I) as well as co-associates of the invention.
  • a chaotropic agent is a substance capable of breaking hydrogen bonds, for example, a thiocyanate anion or urea.
  • An associate is physically stable (that is, one that can be reliably detected by physical methods) at the considered temperature, a complex of identical (associate) or different (co-associate) small molecules that are not interconnected by covalent bonds.
  • Supramer is a general term that includes both homogeneous associates (see above) and co-associates.
  • Influenza virus - as used herein means any strain of human influenza viruses. That is, any type of human influenza virus selected from types A or B. In particular, any type of human influenza virus type A that has a subtype of H1 or NS, determined by the antigenicity of the surface hemagglutinin protein; however, the virus subtype determined by the surface protein neuraminidase can be any. Human influenza C viruses and avian influenza viruses are not included in this document.
  • a linker is a molecular fragment connecting two functional fragments of a bioconjugate, in this case, a fragment responsible for binding to a virus and a fragment responsible for association.
  • the linker does not significantly affect the properties of the bioconjugate, therefore, they strive to make it as simple as possible. Since the properties of the linker can be performed by an infinite variety of molecular fragments, it is difficult to define it in the form of a chemical formula, and therefore it is advisable to use the term “linker” as a substitute for the chemical formula.
  • Activating residue is a molecular group used to increase the reactivity of a carboxyl group in amidation reactions.
  • any activating residues including, for example, such as 4-nitrophenyl, pentachlorophenyl, 4.000 Congresspellorophenyl and others.
  • Zanamivir (Zanamivir, Zn) - (2R, 3R, 4S) - 4 - [(diaminomelidene) amino] - 3-acetamido-2 - [(1 R, 2R) - 1, 2,3-trihydroxypropyl] - 3.4 -dihydro-2H-pyran-6-carboxylic acid.
  • compositions are those which, within the framework of a medical report, are suitable for use in contact with human and animal tissues without undue toxicity, irritation, allergic reactions, etc., and correspond to a reasonable ratio of benefit and risk.
  • pharmaceutically acceptable non-toxic salts include those formed by inorganic acids such as hydrochloric, hydrobromic, phosphoric, sulfuric and perchloric acids, or organic acids such as acetic, oxalic, maleic, tartaric, succinic, citric or malonic acids. Description of drawings
  • Figure 2 Scheme for the synthesis of a zanamivir derivative with an activated carboxyl group in the spacer of the general formula - zanamivir-XY-COOW.
  • Reagents and conditions i. MeONa, MeON, 4 h, room t-pa, silica gel chromatography; ii. p- N0 2 C 6 H 4 OCOCI, DMAP, Ru, 12 h, room. t-pa, silica gel chromatography; iii. BocNH (CH 2 ) NH 2 , DMAP, Ru, 12 h, br. t-pa, silica gel chromatography; iv. Ph 3 P, THF, 12 h, br t-ra; v.
  • the second way to obtain multimers is to create star-like molecules and similar ones, when a limited number of ligands (3 - 8) are usually attached to a symmetric matrix, which, unlike polymers, has a certain structure; their main disadvantage is the relatively short distance between the ligands, which does not allow true multi-point binding to the target.
  • the distance between the sial-binding proteins of the influenza virus exceeds the distance of 10 nm [6], which is difficult to achieve within the framework of the concept of this type of multimeric molecules.
  • the first problem (associated with polymers) is solved by the use of supramers instead of true polymers [10]
  • the second problem is solved by the optimal (usually significant, as in the above example of the sial-binding proteins of the influenza virus) distance between ligands - the development and use of a co-associate that uses “diluent” molecules [10].
  • the drug zanamivir (Zn) is a 4-guanidino derivative of the neuraminic acid glycol, which is an analogue of the transition state of the sialic substrate in the catalytic site of neuraminidase (NA) [1 1, 12], it acts on neuraminidase and not on influenza hemagglutinin.
  • NA neuraminidase
  • the number of copies of neuraminidase (target of action of zanamivir) on the virion is approximately three times lower than
  • Branched associating peptides including molecules with four oligoglycine antennas, were previously prepared using the activated ester method in the classical solution version of its implementation [1].
  • the synthesis scheme for self-associated tetrant oligoglycines includes several cycles of lengthening of peptide antennas; the antennas are sequentially expanded onto one or two glycine residues, starting with tetraaminomethylmethane [NH 2 CH 2 ] 4C, which serves as a branching center.
  • the first step within each cycle is the acylation of tetraamine with the tert-butyloxycarbonylglycine / glycylgicin L / -oxysuccinimide ester (Boc-Gly-OSu / Boc-Gly 2 -OSu); a complete reaction is achieved through the use of an excess of activated ether (10 - 20 mol.% based on NH 2 -rpynny).
  • ninhydrin reagent 2.5 g of ninhydrin in a mixture of Me 2 CO / H 2 0 / AcOH, 96: 4: 1
  • Mass spectra were obtained on a Vision-2000 time-of-flight spectrometer (Thermo Bioanalysis Corp., Great Britain) with laser ionization of the sample from the matrix surface (MALDI), which was used as dihydroxybenzoic acid.
  • MALDI matrix surface
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) A solution of 100 ⁇ mol [Suc-Gly 9- NHCH 2 ] 4C in 1 ml of distilled water (pH about 6) or in PBS buffer (sodium phosphate buffer) (pH about 7) is heated to 60-80 for 1-2 minutes ° C. To the resulting heated solution was added a solution of 10 ⁇ mol [Zanamivir-X-C1u 9- MCHS 2 ] 4 C in distilled water (0.5 ml) at a temperature of 60-80 ° C, after which the resulting solution was cooled to room temperature over 10-20 minutes ; the resulting co-associate is stored at 4 ° C and used without further manipulation, except for dilution.
  • the subject of the invention also includes the administration to a subject in need of appropriate treatment or prophylaxis of a therapeutically effective amount of zanamivir inhibitors of the general formula (I) or a co-associate of the invention.
  • a therapeutically effective amount is meant such an amount of a zanamivir inhibitor of general formula (I) or a co-associate of the invention, administered or delivered to a patient, in which the patient is most likely to exhibit the desired response to treatment (prophylaxis).
  • the exact amount required can vary from subject to subject, depending on the age, body weight and general condition of the patient, the severity of the disease, the method of administration of the drug, combined treatment with other drugs, etc.
  • An inhibitor of general formula (I) or a co-associate of the invention or a pharmaceutical composition containing a compound of general formula (I) or co-associate can be administered to the patient in any amount and by any route of administration effective for treating or preventing a disease.
  • compositions comprising the essence of the invention can be administered orally, parenterally, topically, and the like to the human or other animals.
  • a compound of general formula (I) or a co-associate can be administered daily to a patient for a certain period of days (e.g. 2-10 days), and then a period follows without taking a compound of general formula (I) or co-associate ( e.g. 1-30 days).
  • a dose of each of the components of the combination therapy is administered during the desired treatment period.
  • Compounds of combination therapy may be administered the patient both at a time, in the form of a dosage containing all the components, and in the form of individual dosages of the components.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions that contain the compounds of the invention (or a prodrug or other pharmaceutically acceptable derivative) and one or more pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants, solvents and / or excipients, such as can be administered to the patient in conjunction with -associates constituting the essence of the present invention, and which do not destroy the pharmacological activity of this co-associate, and are also non-toxic when administered in doses sufficient for accurate delivery of a therapeutic amount of the compound.
  • compositions of this invention comprise a compound of general formula (I) or co-associates in conjunction with pharmaceutically acceptable carriers, which may include any solvents, diluents, dispersions or suspensions, surfactants, isotonic agents, thickeners and emulsifiers , preservatives, binders, lubricants, etc., suitable for a particular dosage form.
  • pharmaceutically acceptable carriers may include any solvents, diluents, dispersions or suspensions, surfactants, isotonic agents, thickeners and emulsifiers , preservatives, binders, lubricants, etc.
  • Materials that may serve as pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, mono- and oligosaccharides, as well as their derivatives; gelatin; talc; excipients such as cocoa butter and suppository wax; oils such as peanut, cottonseed, safrole, sesame, olive, corn and soybean oil; glycols such as propylene glycol; esters such as ethyl oleate and ethyl laurate; agar; buffering agents such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; alginic acid; pyrogen-free water; isotonic solution, Ringer's solution; ethyl alcohol and phosphate buffers.
  • excipients such as cocoa butter and suppository wax
  • oils such as peanut, cottonseed, safrole, sesame, olive, corn and soybean oil
  • glycols such as propylene glycol
  • esters such as ethyl oleate and ethyl laur
  • composition of the composition may be other non-toxic compatible lubricants, such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate, as well as dyes, release fluids, film-forming agents, sweeteners, flavors and fragrances, preservatives and antioxidants.
  • non-toxic compatible lubricants such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate
  • dyes such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate
  • release fluids such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate
  • film-forming agents such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate
  • sweeteners such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate
  • flavors and fragrances such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate
  • preservatives and antioxidants such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate
  • the subject of this invention is also dosage forms — a class of pharmaceutical compositions whose composition is optimized for a particular route of administration into the body in a therapeutically effective dose, for example, for administration to the body orally, topically, pulmonally, for example, as an inhalation spray, or intravascularly, intranasally , subcutaneously, intramuscularly, as well as by the infusion method, in recommended dosages.
  • a therapeutically effective dose for example, for administration to the body orally, topically, pulmonally, for example, as an inhalation spray, or intravascularly, intranasally , subcutaneously, intramuscularly, as well as by the infusion method, in recommended dosages.
  • Dosage forms of the present invention may contain formulations prepared using liposome methods, microencapsulation methods, methods of preparing nanoforms of the drug, or other methods known in the pharmaceutical industry.
  • the active principle is mixed with one or more pharmaceutical excipients such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, silica, gum arabic, mannitol, microcrystalline cellulose, hypromellose or the like.
  • pharmaceutical excipients such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, silica, gum arabic, mannitol, microcrystalline cellulose, hypromellose or the like.
  • Tablets may be coated with sucrose, a cellulosic derivative, or other suitable coating materials. Tablets can be prepared in various ways, such as direct compression, dry or wet granulation, or hot fusion.
  • a pharmaceutical composition in the form of a gelatin capsule can be prepared by mixing the active principle with a solvent and filling the mixture with soft or hard capsules.
  • aqueous suspensions, isotonic saline solutions or sterile injectable solutions are used that contain pharmacologically compatible agents, for example propylene glycol or butylene glycol.
  • zanamivir derivatives of general formula (I), as well as co-associates of the invention are able to inhibit infection of cells with influenza viruses much more effectively than monomeric zanamivir.
  • suprameric molecules of the invention in addition to high antiviral activities are also characterized by low toxicity, and they are also free from the drawback that characterizes the polymer derivatives of zanamivir - the uncertainties of their structure.

Abstract

Изобретение относится к химии органических соединений, фармакологии и медицине, а именно, к разработке и получению нового лекарственного средства для лечения заболеваний, вызванных вирусом гриппа человека. Для этого используют производные занамивира общей формулы (I) [Занамивир-Х-Glyn-NHCH2]4С, а также со-ассоциаты, состоящие из олигоглициновых молекул разного вида, а именно производного занамивира общей формулы (I): [Занамивир-Х-Glyn-NHCH2]4С, и пептида, выбранного из пептидов общей формулы (II): [R-GlynGlym-NHCH2]4C, в которых m, n, R и Х имеют значения, указанные в описании. Причем молярное соотношение производного занамивира (I) и пептида (II) в со-ассоциате составляет от 1:10 до 1:100. Данные со-ассоциаты обладают высокой эффективностью в ингибировании вирусов гриппа и являются перспективными для применения в клинической практике. Данное изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество со-ассоциатов по изобретению.

Description

ПЕПТИДНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ПРОТИВОВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА ЗАНА ИВИРА Область техники Данное изобретение относится к химии органических соединений, фармакологии и медицине и касается разработки и получения со-ассоциатов, состоящих из олигоглициновых молекул разного вида, обладающих высокой эффективностью в отношении ингибирования вируса гриппа.
Уровень техники
Вирусные заболевания ответственны как за глобальные пандемии, так и за ежегодные сезонные эпидемии, такие как грипп. Вспышки заболеваний могут характеризоваться усиленной вирулентностью и могут происходить внезапно, приводя к высокой смертности. Важным является то, что вирусные заболевания не ограничиваются заболеваниями у людей. Например, грипп также поражает скот и птиц.
В настоящее время в терапии заболеваний, вызванных вирусом гриппа, используют лекарственные препараты, действие которых направлено на подавление репликации вируса гриппа. Главным образом мишенью для лекарственного вмешательства является вирусная нейраминидаза - фермент, необходимый для нормального почкования вирусных частиц и проявления инфекционных свойств вируса гриппа.
Занамивир является первым производным гуанидино-нейраминовой кислоты, действующим на нейраминидазу вируса гриппа, которое стало использоваться как лекарство против вируса гриппа. Последующие разработки [11] были направлены на получение аналогов, с увеличенной активностью и биодоступностью, а также пролонгированным действием. Димеризация молекулы занамивира путем соединения двух мономеров по гидроксилу 07 привела к получению аналога примерно такой же активности, как мономер, но с пролонгированным действием. Однако для эффективного лечения гриппа этого недостаточно, поскольку занамивир и аналогичные ингибиторы нейраминидазы всего лишь сокращают длительность заболевания на 1 - 2 дня, но не приводят к радикальному быстрому излечению, а также неспособны действовать превентивно.
Ранее были синтезировали молекулы антенных пептидов - [H-Glyn-NH]2-4X, представляющие собой от 2 до 4 олигоглициновых цепей (антенн), связанных с разветвляющим центром (X), в качестве которого использовали α,ω-диаминоалканы, олигоэтиленгликоли с концевыми аминогруппами, а также ди,- три- и тетрааминопроизводные пентаэритрита. При достижении антеннами критического размера, 4 - 7 остатков Gly, молекулы пептидов оказываются способными к спонтанной самосборке супрамеров. Согласно данным Раман-спектроскопии, супрамеры представляют собой структуры полиглицин-И, где олигоглициновые цепи располагаются в узлах гексагональной решетки, спирализуются и между ними возникают множественные водородные связи. Методами просвечивающей электронной и сканирующей зондовой микроскопии было показано, что морфологически супрамеры представляют собой протяженные плоские образования (20-кристаллы); их высота приблизительно соответствует длине пептидной молекулы (40-70 А), а планарные размеры варьируются в диапазоне от 50 до 5000 нм.
К концам антенн разветвленных молекул могут быть ковалентно присоединены (непосредственно, либо через спейсерную/линкерную вставку, sp) заместители различной природы (R); модифицированные молекулы [R-sp-Glyn-NH]2-4X также оказываются способными к самосборке по типу полиглицин-ll. В случае гликопептидов, поверхность образующихся супрамеров оказывается покрытой группами R, которые обеспечивают растворимость супрамеров в воде, их устойчивость к седиментации, а также биологическую активность. В частности, самоассоциирующие гликопептиды [Neu5Aca-sp- Glyn-NHCH2]4C (n=7 - 10), в отличие от неассоциирующих аналогов (п<7), демонстрируют повышенное сродство к вирусам гриппа. Указанный эффект обуславливается специфическим распознаванием остатков нейраминовой кислоты (Neu5Aca) вирусным лектином гемагглютинином (НА); это взаимодействие является слабым (KD ~ 1 мкмоль) на моновалентном уровне, однако его аффинность на 2 - 3 порядка возрастает при многоточечном связывании вируса с гликопептидными супрамерами. Это дает возможность применения самоассоциирующих гликопептидов в качестве конкурентных ингибиторов клеточной адгезии вируса. В свою очередь, гликопептидные супрамеры, адсорбированные на вирусных частицах, стерически препятствуют взаимодействию последних с клетками-мишенями. Описанный выше принцип подавления инфекционности было предложено использовать для конструирования антивирусных препаратов нового поколения [1 , 3-6].
Можно было бы ожидать, что конъюгаты сиалогликанов с самоассоциирующими пептидами окажутся мощными блокаторами вируса гриппа, но на примере двухантенных молекул было показано, что объемные трисахаридные заместители препятствуют самосборке. Так, производное б'-сиалиллактозамина [6'SLN-nHHKep-Gly6-NH(CH2)2]2, не образует супрамеры в индивидуальной форме. Однако оказалось возможным получить супрамеры смешанного состава (со-ассоциаты), состоящие из молекул гликопептида и пептида-разбавителя [Suc-Gly6-NH(CH2)2]2, антенны которого терминированы небольшими гидрофильными группами (например НООС(СН2)2С(0)-), которые не оказывают существенного влияния на процесс самосборки супрамеров (Рис. 1). Смешанные супрамеры подавляют взаимодействие фетуина с вирусом гриппа уже в микромолярных концентрациях (1С50~0.1 - 10 мкмоль), являясь на 2-3 порядка более мощными блокаторами, чем мономерный 6'SLN. Следует обратить внимание на наличие зависимости антивирусной активности смешанных супрамерных форм от их состава, а именно на увеличение активности при формальном снижении содержания гликопептида в данной конкретной форме. Этот эффект связан с тем, что при больших "разбавлениях" гликопептида сукцинильным производным, уменьшаются стерические препятствия для включения молекул
Figure imgf000004_0001
в состав супрамера. С другой стороны, при больших "разбавлениях" могут достигаться оптимальные плотность и распределение 6'SLN групп на поверхности супрамера с точки зрения взаимодействия с вирусом [10].
Таким образом, поиск и разработка более активных и эффективных аналогов занамивира в качестве ингибиторов вируса гриппа является актуальной задачей.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание новых эффективных ингибиторов вирусов гриппа человека и животных на основе занамивира, перспективных для применения в клинической практике.
Техническим результатом изобретения является разработка и получение новых эффективных ингибиторов вирусов гриппа человека и животных на основе занамивира, а также разработка и получение новых мультимерных производных (со-ассоциатов), которые обладают не только пролонгированным действием, но и повышенной ингибирующей активностью по отношению к нейраминидазе, а вследствие этого и характеризуются повышенной способностью подавлять размножение вируса гриппа.
Указанный технический результат достигается путем получения производных занамивира по 7 -положению общей формулы (I).
Figure imgf000004_0002
или его фармацевтически приемлемой соли, где:
X представляет собой спейсерную группу,
п - целое число от 6 до 10.
В частных вариантах воплощения изобретения спейсерная группа X представляет собой -OC(0)NH(CH2)6NHCO(CH2)4CO-.
В частных вариантах воплощения изобретения п равно 9.
Технический результат достигается также путем получения со-ассоциатов двух типов соединений, а именно, соединений общей формулы (I):
Figure imgf000005_0001
или его фармацевтически приемлемой соли, где:
X представляет собой спейсерную группу,
п - целое число от 6 до 10;
и соединений общей формулы (II):
[R-Glym-NHCH2]4C
или его фармацевтически приемлемой соли, где
m - целое число от 6 до 10;
R представляет собой Η-, НООССН2СН2СО- или НОСН2СО-;
причем молярное соотношение соединений (I) и (II) в со-ассоциате составляет от 1 :10 до
1 :100.
В частных вариантах воплощения изобретения спейсерная группа X представляет собой -OC(0)NH(CH2)6NHCO(CH2)4CO-.
В частных вариантах воплощения изобретения п равно 9.
В частных вариантах воплощения изобретения m равно 9.
Технический результат достигается также осуществлением способа получения соединения общей формулы (I) путем конденсации соединения общей формулы занамивир-X-Y-COOW с соединениями общей формулы [GlynNHCH2]4C,
где X представляет собой спейсерную группу,
Y представляет собой линкер для связывания активированной карбоксильной группы -COOW со спейсерной;
W представляет собой активирующий остаток;
причем спейсерная группа присоединена к занамивиру по его 7-О-положению. В частных вариантах воплощения изобретения W представляет собой 4-пара- нитрофенильный остаток.
Настоящее изобретение также относится к применению соединений общей формулы (I), а также со-ассоциатов по изобретению в качестве ингибиторов вирусов гриппа человека. В частности, типы вируса, в отношении которых могут использоваться со-ассоциаты по изобретению, представляют собой А или В. Причем, в некоторых вариантах изобретения, подтип вируса гриппа человека типа А представляет собой Н1 или НЗ. Кроме того, изобретение относится к применению соединений общей формулы (I), а также со-ассоциатов по изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусом гриппа человека.
Изобретение также включает фармацевтические композиции для лечения и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусами гриппа человека, содержащие терапевтически эффективное количество соединений общей формулы (I) или со- ассоциатов по изобретению.
Изобретение также включает получение соединений общей формулы (I), а также со-ассоциатов по изобретению.
Подробное описание изобретения Определения (термины)
Хаотропный агент - вещество, способное разрушать водородные связи, например роданид-анион или мочевина.
Ассоциат (со-ассоциат) - физически устойчивый (то есть тот, который можно надежно обнаруживать физическими методами) при рассматриваемой температуре комплекс одинаковых (ассоциат) или разных (со-ассоциат) малых молекул, не соединенных между собой ковалентными связями.
Супрамер - общий термин, включающий как гомогенные ассоциаты, (см. выше), так и со-ассоциаты.
Вирус гриппа - в настоящем документе означает любой штамм вирусов гриппа человека. То есть любой тип вирусов гриппа человека, выбранного из типов А или В. В частности, любой тип вируса гриппа человека типа А, который имеет подтип Н1 или НЗ, определяющийся антигенностью поверхностного белка гемагглютинина; при этом подтип вируса, определяющийся поверхностным белком нейраминидазой, может быть любым. Вирусы человеческого гриппа С и вирусы птичьего гриппа не имеются в виду в настоящем документе.
Линкер - молекулярный фрагмент, соединяющий два функциональных фрагмента биоконъюгата, в данном случае фрагмента, ответственного за связывание с вирусом, и фрагмента, ответственного за ассоциацию. Линкер существенно не влияет на свойства биоконъюгата, поэтому его стремятся сделать максимально простым. Так как свойства линкера может выполнять бесконечное разнообразие молекулярных фрагментов, его сложно дефинировать в виде химической формулы, и поэтому целесообразно использовать термин "линкер" как заменитель химической формулы.
Спейсер (X)- молекулярный фрагмент, соединяющий два функциональных фрагмента биоконъюгата; его роль заключается в обеспечении оптимального расстояния между соединяемыми им фрагментами биоконъюгата. В отличие от простого линкера (см. выше), спейсер бывает значительно длиннее. Вообще говоря, спейсер включает в себя линкер, но иногда формально удобнее выделить в молекуле биоконъюгата линкерныи, так и спеисерныи фрагменты. Неограничивающими примерами спейсера изобретению могут быть X = -C(0)NH(CH2)6NHC(0)(CH2)4C(0)-, а также
Figure imgf000007_0001
Активирующий остаток - молекулярная группа, используемая для повышения реакционной способности карбоксильной группы в реакциях амидирования. В рамках изобретения могут быть использованы любые активирующие остатки, в том числе, например, такие как 4-нитрофенильный, пентахлорфенильный, Ν-оксисукцинимидный и другие.
Сукцинат, сукцинатная группа (Sue) - остаток янтарной кислоты НООССН2СН2СО-.
Занамивир (Zanamivir, Zn) - (2R,3R,4S)- 4-[(диаминомелилиден)амино]- 3- ацетамидо- 2-[(1 R,2R)- 1 ,2,3-тригидроксипропил]- 3,4-дигидро- 2Н-пиран- 6-карбоксиловая кислота.
Структурная формула занамивира (Zn) представляет собой:
Figure imgf000007_0002
Производные занамивира по 7-0- положению (отмечено звездочкой) представляют собой:
Figure imgf000007_0003
Примеры структурных формул производных занамивира по 7-О-положению согласно изобретению приведены на рисунках 3 и 7.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Фармацевтически приемлемые соли - такие, которые, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д., и отвечают разумному соотношению пользы и риска. Примерами фармацевтически приемлемых нетоксичных солей могут служить соли, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная, бромоводородная, фосфорная, серная и хлорная кислоты, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, малеиновая, винная, янтарная, лимонная или малоновая кислоты. Описание рисунков
Рисунок 1. Схема взаимодействия супрамеров с поверхностью вирусной частицы
(НА - гемагглютинин, NA - нейраминидаза):
(А) Супрамер, образованный в результате сборки только одного типа гликопептида - производного занамивира [Занамивир-Х-С1у9-МНСН2]4С (ассоциат);
(Б) Супрамер смешанного состава, с "разбавителем", благодаря отсутствию пространственных затруднений взаимодействует с вирусом лучше (со-ассоциат) - со- ассоциат двух типов молекул [3aHaMHBHp-X-Glyn-NHCH2]4C и [R-Glym-NHCH2]4C.
Рисунок 2. Схема синтеза производного занамивира с активированной карбоксильной группой в спейсере общей формулы - занамивир-X-Y-COOW. Реагенты и условия: i. MeONa, МеОН, 4 ч, комн. т-ра, хроматография на силикагеле; ii. р- N02C6H4OCOCI, ДМАП, Ру, 12 ч, комн. т-ра, хроматография на силикагеле; iii. BocNH(CH2)NH2, ДМАП, Ру, 12 ч, комн. т-ра, хроматография на силикагеле; iv. Ph3P, ТГФ, 12 ч, комн. т-ра; v. Et3N, Н20, 12 ч, комн. т-ра, хроматография на силикагеле; vi. bis(Boc)PCH, МеОН; vii. CF3COOH, 2 ч, комн. т-ра, эксклюзионная хроматография на геле LH-20; viii. динитрофениловый эфир адипиновой кислоты, ДМФА/ДМСО, 5:1 ,. 12 ч, комн. т- ра, эксклюзионная хроматография на геле LH-20.
Рисунок 3. Строение некоторых молекул общей формулы (I) и общей формулы (II), входящих в со-ассоциаты по изобретению.
Рисунок 4. Схема синтеза молекул общей формулы (I) и общей формулы (II), входящих в со-ассоцитаты по изобретению. Реагенты и условия: i. Boc-Gly-OSu, NEt3, ДМФА, 24 ч, 70оС, хроматография на силикагеле; ii. CF3COOH, 2 ч, комн. т-ра; iii. Boc-Gly2- OSu, NEt3, ДМСО, 24 ч, 70оС, хроматография на силикагеле; iv. Boc-Gly2-OSu, Li2C03, 12 М LiCI (водн)., 72 ч комн. т-ра, высаживание при разбавлении водой; v. янтарный ангидрид, Li2C03, 12 М LiCI (водн)., 72 ч комн. т-ра, эксклюзионная хроматография на геле LH-20; vi. Zn-7-0-C(0)NH(CH2)6NHC(0)(CH2)4C(0)ONp (3), Li2C03, 12 М LiCI (водн)., 72 ч комн. т-ра, эксклюзионная хроматография на геле LH-20.
Рисунок 5. 1Н-ЯМР спектр [Zn-X-Gly9-NHCH2]4C,
где X - C(0)NH(CH2)6NHC(0)(CH2)4C(0)-. Рисунок 6. 1Н-ЯМР спектр [Suc-Gly9-NHCH2]4C.
Рисунок 7. Структурная формула [Zn-X-Gly9-NHCH2]4C,
Figure imgf000009_0001
где X -
Подробное раскрытие изобретения
Существует два подхода к получению мультимерных (то есть, содержащих много копий лиганда) производных каких-либо активных лигандов. Первый - иммобилизация лигандов на полимере; этот путь как правило приводит к увеличенной активности, но имеет два серьезных недостатка: 1 ) повышенная токсичность из-за метаболитов полимера-матрицы [6]; 2) неопределенность структуры ("inconsistency") полимера чрезвычайно затрудняет регистрацию таких препаратов для массового лечения, их разрешают к применению как правило для лечения при непосредственной угрозе жизни, как например при онкологии.
Второй путь к получению мультимеров - это создание star-like молекул и аналогичных им, когда ограниченное число лигандов (3 - 8) присоединено как правило к симметричной матрице, которые в отличие от полимеров имеют определенную структуру; их основным недостатком является относительно короткая дистанция между лигандами, не позволяющая связываться с мишенью истинно мультиточечно. Например, расстояние между сиало-связывающими белками вируса гриппа превышает дистанцию 10 нм [6], что трудно достижимо в рамках концепции этого типа мультимерных молекул.
В данном изобретении, основанном на получении мультимерных производных второго типа, первую проблему (связанную с полимерами) решают применением супрамеров вместо истинных полимеров [10], а вторую проблему - оптимального (как правило значительного, как в приведенном выше примере сиалосвязывающих белков вируса гриппа) расстояния между лигандами - разработкой и применением со-ассоциата, в котором используются молекулы «разбавителя» [10].
Ранее для блокирования вируса гриппа были использованы со-ассоциаты, в которых использовались молекулы «разбавителя» [10], когда активным вирус- связывающим лигандом является трисахарид 6'SLN, взаимодействующий с гемагглютинином вириона; это приводило к противовирусному эффекту, но недостаточно мощному из-за низкой аффинности трисахарида 6'SLN по отношению к белку (гемагглютинину). Препарат занамивир (Zn) представляет собой 4-гуанидино- производное гликаля нейраминовой кислоты, являющегося аналогом переходного состояния сиалового субстрата в каталитическом сайте нейраминидазы (NA) [1 1 , 12], он действует на нейраминидазу, а не на гемагглютинин вируса гриппа. Количество копий нейраминидазы (мишень действия занамивира) на вирионе примерно втрое ниже, чем
8
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) гемагглютинина, поэтому было совершенно неожиданно обнаружено, что соединения общей формулы (I), а также со-ассоциаты по изобретению обладают высокой противовирусной активностью. Получение производных занамивира общей формулы (I) и со-ассоцитов на их основе по изобретению
Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученных в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области. Сущность изобретения поясняется рисунками. Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.
Ранее было осуществлено получение разветвленных ассоциирующих пептидов, в том числе молекул с четырьмя олигоглициновыми антеннами, с помощью метода активированных эфиров в классическом растворном варианте его реализации [1]. Схема синтеза самоассоциирующих тетрантенных олигоглицинов (рис. 4) включает несколько циклов удлинения пептидных антенн; антенны последовательно наращиваются на один или два глициновых остатка, начиная с тетрааминометилметана [NH2CH2]4C, служащего разветвляющим центром. Первой стадией внутри каждого цикла является ацилирование тетраамина с помощью Л/-оксисукцинимидного эфира трет- бутилоксикарбонилглицина/глицилгпицина (Boc-Gly-OSu/Boc-Gly2-OSu); исчерпывающее протекание реакции достигается за счет использования избытка активированного эфира (10 - 20 мольн. % в расчете на NH2-rpynny). Синтез пептидов с короткими антеннами [Вос- Glyn-NHCH2]4i η=1 , 3, 5, проводят в диметилформамиде (DMF); при получении [Boc-Gly7- NHCH2]4C в качестве растворителя используют диметилсульфоксид (DMSO); наконец, пептид с антеннами, построенными из девяти глициновых остатков, [Boc-Gly9-NHCH2]4C приходится синтезировать в концентрированном водном растворе хлористого лития, являющегося хаотропным агентом, подавляющим ассоциацию пептида и обеспечивающим его растворимость в процессе ацилирования. Образующийся в результате присоединения глициновых остатков к аминокомпоненту защищенный пептид, [Boc-Glyn-NHCH2]4C деблокируется с помощью трифторуксусной кислоты. Затем, аналогично методам, описанным ранее [1 , 2, 5], к тетраантенным пептидам исчерпывающе (4 эквивалента) присоединяли остаток занамивира (Zn).
По тем же принципам синтезировали четырехантенные производные с карбоксильными группам на концах антенн (соединения общей формулы (II), рис. 3), которые использовали в качестве "разбавителей". Двухкомпонентные со-ассоциаты получали из олигоглициновых пептидов путем смешения и выдерживания компонентов при температуре 60-80 °С, с последующим медленным охлаждением.
Реагенты и методы
Реактивы и растворители были получены из коммерческих источников (Sigma-
Aldrich, Merck, Acros) и использовались без дополнительной очистки.
Разветвленные олигоглицины [HCIxH-Glyn-NHCH2]4C, п=1 - 9, синтезировали как описано ранее в работе [1].
Производные гликаля 1 и 2 (Рис.2) получены в соответствии с методами, описанными в работе [13].
Для тонкослойной хроматографии использовали стеклянные пластинки, покрытые силикагелем Sg-60 (Merck, Германия). Проявление пластинок проводили:
- путем их выдерживания в парах аммиака (для нитрофениловых эфиров);
- выдерживанием в парах соляной кислоты, опрыскиванием нингидриновым реагентом (2.5 г нингидрина в смеси Ме2СО/Н20/АсОН, 96:4:1) и нагреванием в течение 5-
10 мин при 120-150 °С или опрыскиванием 10% Н3Р04 и нагреванием в течении 10 мин при 150 °С.
Спектры ядерного магнитного резонанса (1Н-ЯМР) записывали на спектрометре WM-500 (Bruker, США). Рабочая частота прибора 500 МГц; температура проведения экспериментов 303 К; химические сдвиги протонов определяли по отношению к сигналу CF3COOD (δΗ 11.50) или D20 (δΗ 4.75).
Масс-спектры получали на время-пролетном спектрометре Vision-2000 (Thermo Bioanalysis Corp., Великобритания) с лазерной ионизацией образца с поверхности матрицы (MALDI), в качестве которой использовали дигидроксибензойную кислоту.
Пример 1.
Синтез (4S,5R,6R)-5-a4eTaMHflo-4-ryaHMflMHO-6- 2R,3-flMrHflpoKCH-1R-[6-(4- нитрофенил-6-оксагексаноат)-аминогексил-карбомаилокси]-пропил}-5,6-дигидро-4Н- пиран-2-оновой кислоты (3)
К раствору 250 мг (0.53 ммоль) 2 (рис.2) в DMSO (1 мл) прибавлено 875 мг (2.65 ммоль) динитрофенилового эфира адипиновой кислоты в ДМФА (5 мл). Реакционную смесь перемешивали 12 ч при комнатной температуре, после чего прибавили к ней 60 мл 5% АсОН, выпавший осадок отфильтровали, фильтрат упарили до объема ~7 мл. Выделение продукта проводили методом эксклюзионной хроматографии на колонке с гелем Sephadex LH-20 (30x750 мм), элюция - МеОН/Н20, 3:1. Продукт получен в виде бесцветной пены; выход - 285 мг (75%); ТСХ: R, 0.48, /-РгОН-ЕЮАс-Н20, 4:3:2; Н ЯМР (700 МГц, D20): 8.36, 7.39 (2м, 2х2Н, 2*2> СН Аг), 5.89 (д, 1 Н, J34 2.3 Гц, Н-3), 4.95 (дд, 1 Н, J7,8 9.2 Гц, J6 1.9 Гц, H-7), 4.55 (дд, 1 Н, J5,6 10.3 Гц, Н-6), 4.44 (дд, 1 Н, J4,5 9.2 Гц, Н-4), 4.14 (т, 1 Н, Н-5), 4.05 (ддд, 1 Н, Н-8), 3.67 (дд, 1 Н, J5,6a 2.7 Гц, J6a,6b 12.0 Гц, Н-9а), 3.50 (дд, 1 Н, J5,6a 6.7 Гц, Н9Ь), 3.23-3.18 (м, 5Н, ОС(0)СН2, OC(0)NHCH, NH2CH2), 3.09-2.97 (м, 1 Н, OC(O)NHCH), 2.31 (т, 2Н, NHC(0)CH2), 1.97 (с, ЗН, NC(0)CH3), 1.78-1.70 (м, 4Н, 2xJC(0)CH2CH2), 1.55-1.40 (м, 4Н, 2хСН2), 1.35-1.25 (м, 8Н, 4хСН2); MALDI-MS: 724 [М]+, 747 [M+Na]+, 763 [М+К]+; Найдено (%): С 51.40; Н 6.45; N 13.46. Рассчитано для C3iH45N7013 (%): С 51.45; Н 6.27; N 13.55.
Пример 2.
Синтез [3aHaMMBMp-X-Gly9-NHCH2]4C, X = -C(0)NH(CH2)6NHC(0)(CH2)4C(0)-
К нагретой до 70 °С смеси 320 мг (0.12 мкмоль) [CF3COOHxH-Gly9-NHCH2]4C и 143 мг (1.94 ммоль) Li2C03 вЮ мл 12 М LiCI водн. прибавили 420 мг (0.58 ммоль) активированного производного Zn 3 (рис.2). Реакционную смесь оставили интенсивном перемешивании на 72 ч, выделение продукта проводили методом эксклюзионной хроматографии на колонке с гелем Sephadex LH-20 (30x750 мм), элюция - 0.05 М NH3 в MeCN/H20, 1 :1. Продукт получен в виде бесцветной пены; выход - 477 мг (87%); 1Н ЯМР (700 МГц, CF3COOD): 6.33 (д, Н, J3,4 2.6 Гц, Н-3 Zn), 4.75-4.52 (м, 2Н, Н-4,6 Zn), 4.47-4.20 (м, 23Н, 9хСН2 Gly, Н-5,7,8,9 Zn), 3.65-3.55, 3.35-3.25 (2м, 2х2Н, 2xCH2NH sp), 3.19 (уш. с, 2Н, NHCH2C), 2.79, 2.66 (2т, 2х2Н, J 6.5 Гц, 2хСН2СО sp), 2.30-2.20 (m, ЗН, NC(0)CH3), 1.96-1.86 (м, 4Н, 2хСН2СН2СО sp), 1.80-1.73, 1.68-1.58 (2м, 2х2Н, 2хСН2 sp), 1.52-1.40 (м, 4Н, 2хСН2 sp); MALDI-MS: 4525 [М]+, 4548 [M+Na]+, 4563 [М+К]+; Найдено (%): С 46.90; Н 6.42; N 19.66. Рассчитано для C177H284N64076 (%): С 46.99; Н 6.33; N 19.81.
Пример 3.
Синтез [ Занамивир-Х-01у9-МНСН2]4С*
К раствору 270 мг (0.53 ммоль) аналога соединения 2 с олигоэтиленгликолевым спейсером (рис. 7) в 1 мл DMSO прибавлено 875 мг (2.65 ммоль) динитрофенилового эфира адипиновой кислоты в ДМФА (5 мл). Реакционную смесь перемешивали 12 ч при комнатной температуре, после чего прибавили к ней 60 мл 5% АсОН, выпавший осадок отфильтровали, фильтрат упарили. Выделение продукта проводили методом эксклюзионной хроматографии на колонке с гелем Sephadex LH-20 (30x750 мм), элюция - МеОН/Н20, 3:1. Продукт получен в виде бесцветной пены; выход - 280 мг (71%). Бесцветная пена, 1Н ЯМР (700 МГц, D20): 5.74 (д, J34 2.6 Гц, Н-3 Zn), 5.24 (с, 2Н, NCH2CO sp1), 4.52 (дд, 1 Н, J6,7 1.4 Hz, J5,6 10.5 Hz, H-6 Zn), 4.46 (дд, 1 H, J3,4 2.6 Hz, J45 9.0 Hz, H-4 Zn), 4.10-3.48 (м, 35H), 3.35-3.25 (м, 4H, 2xCH2NH sp1), 2.75, 2.32 (2т, 2x2H, 2xCH2CONH), 2.02 (с, ЗН, NC(0)CH3), 1.85-1.77 (м, 4Н, 2xCH2CH2NH), 1.75-1.70 (м, 4Н, 2хСН2СН2СО); MALDI-MS: 5210 [М]+, 5233 [M+Na]+, 5249 [М+К]+; Найдено (%): С 48.07; Н 7.00; N 20.27. Рассчитано для C209H352N76O80 (%): С 48.19; Н 6.81 ; N 20.43. Полученное соединение (448 мг, 0.58 ммоль) прибавили к нагретой до 70 °С смеси 320 мг (0.12 мкмоль) [CF3COOHxH-Gly9-NHCH2]4C и 143 мг (1.94 ммоль) Li2CO3 Bl 0 мл 12 М LiCI. Реакционную смесь оставили при интенсивном перемешивании на 72 ч, выделение продукта проводили на колонке с гелем Sephadex LH-20 (30*750 мм), элюция - 0.05 М NH3 в MeCN/H20, 1 :1. Продукт получен в виде бесцветной пены; выход - 481 мг (85%).
Figure imgf000013_0001
"где X представляет собой
Пример 4.
Синтез
Figure imgf000013_0002
тетрааммноиевой соли
К нагретой до 70 °С смеси 320 мг (0.12 мкмоль) [CF3COOHxH-Gly9-NHCH2] C и 143 мг (1.94 ммоль) Li2C03 в10 мл 12 М LiCI водн. прибавили 160 мг (1.6 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную смесь оставили интенсивном перемешивании на 72 ч, выделение продукта проводили методом эксклюзионной хроматографии на колонке с гелем Sephadex LH-20 (30*750 мм), элюция - 0.05 М NH3 в MeCN/H20, 1 :1. Продукт получен в виде бесцветной пены; выход - 231 мг (72%); 1Н ЯМР (700 МГц, CF3COOD): 4.37-4.21 (м, 18Н, 9*СН2 Gly), 3.19 (уш. с, 2Н, NHCH2C), 2.96-2.90, 2.87-2.82 (2м, 2*2Η, 2хСН2 Sue); MALDI-MS: 2586[М]+, 2609 [M+Na]\ 2625 [М+К]+; Найдено (%): С 41.98; Н 6.62; N 23.16. Рассчитано для C93H152N44048 (%): С 42.08; Н 5.77; N 23.22.
Пример 5.
Получение со-ассоциата [Занамивир-Х-С1у9-МНСН2]4С и [Suc-Gly9-NHCH2]4C, соотношение 1 :5, X = C(0)NH(CH2)6NHC(0)(CH2)4C(0)
Раствор 100 мкмоль [Suc-Gly9-NHCH2]4C в 1 мл дистиллированной воды (рН около 6) или в буфере PBS (натрий-фосфатный буфер) (рН около 7) в течение 1-2 мин нагревают до температуры 60 °С (результат был одинаковым в температурных пределах 60-80 °С). К полученному нагретому раствору добавляют раствор 20 мкмоль [Занамивир- X-Gly9-NHCH2]4C в дистиллированной воде (1 мл) при температуре 60-80 °С, после чего полученный раствор охлаждают до комнатной температуры в течение 10-20 минут; полученный со-ассоциат хранят при 4 °С и используют без дальнейших манипуляций, кроме разбавления.
Пример 6.
Получение со-ассоциата [Занамивир-Х-С1у9-МНСН2]4С и [Suc-Gly9-NHCH2]4C, соотношение 1 :10, X = C(0)NH(CH2)6NHC(0)(CH2)4C(0)
12
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Раствор 100 мкмоль [Suc-Gly9-NHCH2]4C в 1 мл дистиллированной воды (рН около 6) или в буфере PBS (натрий-фосфатный буфер) (рН около 7) в течение 1-2 мин нагревают до температуры 60-80 °С. К полученному нагретому раствору добавляют раствор 10 мкмоль [Занамивир-Х-С1у9-МНСН2]4С в дистиллированной воде (0.5 мл) при температуре 60-80 °С, после чего полученный раствор охлаждают до комнатной температуры в течение 10-20 минут; полученный со-ассоциат хранят при 4 °С и используют без дальнейших манипуляций, кроме разбавления.
Способ терапевтического применения соединений общей формулы (I) и со- ассоциатов по изобретению
Предмет данного изобретения также включает введение субъекту, нуждающемуся в соответствующем лечении или профилактике, терапевтически эффективного количества ингибиторов на основе занамивира общей формулы (I) или со-ассоциата по изобретению. Под терапевтически эффективным количеством подразумевается такое количество ингибитора занамивира общей формулы (I) или со-ассоциата по изобретению, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение (профилактику). Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.
Ингибитор общей формулы (I) или со-ассоциат по изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая соединение общей формулы (I) или со- ассоциат, может быть введен в организм пациента в любом количестве и любым путем введения, эффективным для лечения или профилактики заболевания.
После смешения соединения общей формулы (I) или со-ассоциата с конкретным подходящим фармацевтически допустимым носителем в желаемой дозировке, композиции, составляющие суть изобретения, могут быть введены в организм человека или других животных перорально, парентерально, местно и т.п.
Введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, неделю (или любой другой временной интервал), или время от времени. Кроме того, соединение общей формулы (I) или со-ассоциат может вводиться в организм пациента ежедневно в течение определенного периода дней (например, 2-10 дней), а затем следует период без приема соединения общей формулы (I) или со-ассоциата (например, 1-30 дней).
В том случае, когда соединение общей формулы (I) или со-ассоциат по изобретению используется как часть режима комбинированной терапии, доза каждого из компонентов комбинированной терапии вводится в течение требуемого периода лечения. Соединения, составляющие комбинированную терапию, могут вводиться в организм пациента как единовременно, в виде дозировки, содержащей все компоненты, так и в виде индивидуальных дозировок компонентов.
Фармацевтические композиции
Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат соединения по изобретению (или пролекарственную форму или другое фармацевтически приемлемое производное) и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента совместно с со-ассоциатами, составляющими суть данного изобретения, и которые не разрушают фармакологической активности этого со-ассоциата, а также являются нетоксичными при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения.
Фармацевтические композиции, заявляемые в данном изобретении, содержат соединение общей формулы (I) или со-ассоциаты совместно с фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут включать в себя любые растворители, разбавители, дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители и эмульгаторы, консерванты, вяжущие вещества, смазочные материалы и т.д., подходящие для конкретной формы дозирования. Материалы, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают, но не ограничиваются, моно- и олигосахариды, а также их производные; желатин; тальк; эксципиенты, такие как какао-масло и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое, хлопковое, сафроловое, кунжутное, оливковое, кукурузное и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический раствор, раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы. Также в составе композиции могут быть другие нетоксичные совместимые смазочные вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, разделительные жидкости, пленкообразователи, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.
Предметом данного изобретения являются также лекарственные формы - класс фармацевтических композиций, состав которых оптимизирован для определённого пути введения в организм в терапевтически эффективной дозе, например, для введения в организм орально, местно, пульмональным, например, в виде ингаляционного спрея, или внутрисосудистым способом, интраназально, подкожно, внутримышечно, а также инфузионным способом, в рекомендованных дозировках.
Лекарственные формы данного изобретения могут содержать составы, полученные методами использования липосом, методами микрокапсулирования, методами приготовления наноформ препарата, или другими методами, известными в фармацевтике.
При получении композиции, например в форме таблетки, активное начало смешивают с одним или несколькими фармацевтическими эксципиентами, такими как желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, кремнезем, аравийская камедь, маннит, микрокристаллическая целлюлоза, гипромеллоза или аналогичные соединения.
Таблетки можно покрыть сахарозой, целлюлозным производным или другими веществами, подходящими для нанесения оболочки. Таблетки могут быть получены различными способами, такими как непосредственное сжатие, сухое или влажное гранулирование или горячее сплавление в горячем состоянии.
Фармацевтическую композицию в форме желатиновой капсулы можно получить, смешивая активное начало с растворителем и заполняя полученной смесью мягкие или твердые капсулы.
Для введения парентеральным путем используются водные суспензии, изотонические солевые растворы или стерильные растворы для инъекций, которые содержат фармакологически совместимые агенты, например пропиленгликоль или бутиленгликоль.
Характеристика биологической активности
Противовирусная активность соединений общей формулы (I), а также со- ассоциатов по изобретению была изучена в опытах по подавлению инфекционности вируса гриппа в клеточной культуре [метод проведения эксперимента описан в работе 14], Таблица 1.
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
Как следует из данных, приведенных в таблице 1 , противовирусная активность супрамерного занамивира (соединения общей формулы (I) как такового сопоставима с активностью неконъюгированного Zn. В то же время, "разбавленные" со-ассоциаты по изобретению, в частности при степени разбавления 1 :10, на порядок активнее неконъюгированного занамивира. Сами по себе соединения общей формулы (II), в частности супрамер [Suc-Gly9-NHCH2]4C, не обладают противовирусной активностью, а их добавление к мономерному занамивиру не увеличивает активность последнего (Таблица 1)- Таким образом, производные занамивира общей формулы (I), а также со- ассоциаты по изобретению способны ингибировать инфекцию клеток вирусами гриппа значительно эффективнее, чем мономерный занамивир. Кроме того, супрамерные молекулы по изобретению (со-ассоциаты) помимо высокой противовирусной активности характеризуются также низкой токсичностью. А также лишены недостатка, которым характеризуются полимерные производные занамивира - неопределенности их структуры.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения. Библиографический список:
[1] Tuzikov, A., Chinarev, A., Gambaryan, A, Oleynikov, V., Klinov, D., Matsko, N., Kadykov, V., Ermishov, M., Demin, I., Demin, V., Rye, P., Bovin, N. Polyglycine II nanosheets: supramolecular antivirals? ChemBioChem., 2003, 4(2-3), 147-154. DOI: 10.1002/cbic.200390025.
[2] Tsygankova, S., Chinarev, A., Tuzikov, A., Zaitsev, I., Severin, N., Kalachev, A., Rabe, J., Bovin, N. Assembly of oligoglycine layers on mica surface. J. Biomat. Nanobiotech., 2011 , 2(1), 90-96. DOI : 10.4236/jbnb.201 1.21012. [4] Bovin, N., Tuzikov, A., Chinarev, A. Oligoglycines: Materials with unlimited potential for nanotechnologies. Nanotechnologies in Russia (Engl. Transl.), 2008, 3(5-6), 291-302. DOI: 10.1 134/S1995078008050042.
[5] Tsygankova, S., Chinarev, A. , Tuzikov, A., Severin, N., Kalachev, A., Rabe, J., Gambaryan, A., Bovin, N.Biantennary oligoglycines and glyco-oligoglycines self-associating in aqueous medium. Beilstein . J. Org. Chem., 2014, 10, 1372-1382. DOI: 10.3762/bjoc.10.140.
[6] Bovin, N., Tuzikov, A., Chinarev, A., Gambaryan, A. Multimeric glycotherapheutics: New paradigm. Glycoconjugate J., 2004, 21(8-9), 471-478. DOI: 10.1007/s10719-004-5537-3io
[7] Baum, L.G., Paulson, J. C. Sialyloligosaccharides of the respiratory epithelium in the selection of human influenza virus receptor specificity. Acta Histochem., 1990, Suppl. 40, 35- 38.
[8] Couceiro, J. N., Paulson, J. C, Baum L.G. Influenza virus strains selectively recognize sialyloligosaccharides on human respiratory epithelium; the role of the host cell in selection of hemagglutinin receptor specificity. Virus Res., 1993, 29, 155-165.
[9] Gagneux, P., Cheriyan, M., Hurtado-Ziola, N., van der Linden, E. C, Anderson, D., McClure, H., Varki, A., Varki, N. M. Human-specific regulation of alpha 2-6-linked sialic acids. J. Biol. Chem., 2003, 278, 48245-48250.
[10] RU2612221.
[11] von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat. Rev. Drug Discov. 2007, 6(12), 967-974.
[12] Shtyria, J.A., Mochalova, L.V., Bovin, N.V. Influenza virus neuraminidase: structure and function. Acta Naturae 2009, 1(2), 26-32.
[13] Scheigetz, J., Zamboni, R., Bernstein, MA, Roy, B. A synthesis of 4-a-guanidino-2-deoxy- 2,3-dehydro-N- acetylneuraminuic acid. Org. Prep. Proc. Int. 1995, 27(6), 637-644; Chandler, M., Bamford, M., Conroy. R., Lamont, В., Patwl., В., Patel, V., Steeples, I., Stoper, R., Weir, N., Wright, M., Wiliamson, C. Synthesis of the potent influenza neuraminidase inhibitor 4- guanidino Neu5Ac2en. X-Ray molecular structure of 5-acetamido-
4-amino-2,6-anhydro-3,4,5-trideoxy-D-erythro-L-gluco-nononic acid. J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 1995, 1173-1180.
[14] Matrosovic^ M^N., GambaryanA A^S. Solid-phase assays of receptor-binding specificity.
Meth. Mol. Biol., 2012, 865, 71-94. DOI: 10.1007/978-1 -61779-621 -0_5
[15] Weight A.K., Haldar J., Alvarez de Cienfuegos L., Gubareva L.V., Tumpey T.M., Chen J.,
Klibanov A.M. Attaching zanamivir to a polymer markedly enhances its activity against drug- resistant strains of influenza a virus. J Pharm Sci. 2011 , 100(3):831-835. doi: 0.1002/jps.22338.
[16] N.V.Bovin, A.B.Tuzikov, A.A.Chinarev, A.S. Gambaryan. Multimeric glycotherapeutics: new paradigm. Glycoconjugate J., 2004, 21 , 471-478.

Claims

Формула изобретения
1. Производное занамивира по 7-О-положению общей формулы (I):
Figure imgf000019_0001
или его фармацевтически приемлемая соль, где
X представляет собой спейсерную группу,
п может принимать значения от 6 до 10.
2. Производное по п. 1 , характеризующееся тем, что
X представляет собой -OC(0)NH(CH2)6NHCO(CH2)4CO-;
п равно 9.
3. Способ получения производного по п.1 путем конденсации соединения занамивир-X-Y-COOW.c соединениями общей формулы [GlynNHCH2]4C,
где X представляет собой спейсерную группу,
Y представляет собой линкер для связывания активированной карбоксильной группы -COOW со спейсерной;
W представляет собой активирующий остаток;
причем спейсерная группа присоединена к занамивиру по его 7-О-положению.
4. Способ по п.З, в котором W представляет собой 4-пара-нитрофенильный остаток.
5. Со-ассоциат двух типов молекул, а именно
производного занамивира по 7-О-положению по п.1 общей формулы (I):
Figure imgf000019_0002
или его фармацевтически приемлемой соли,
где X представляет собой спейсерную группу;
п = 6 + 10;
и пептида, выбранного из пептидов общей формулы (II):
[R-Glym-NHCH2]4C (II),
или его фармацевтически приемлемой соли, где m =6 + 10;
R представляет собой H, HOOCCH2CH2CO- или НОСН2СО-;
причем молярное соотношение производного занамивира общей формулы (I) и пептида общей формулы (II) в со-ассоциате составляет от 1 :10 до 1 :100.
6. Со-ассоциат по п. 5, характеризующийся тем, что X представляет собой -
OC(0)NH(CH2)6NHCO(CH2)4CO-;
п равно 9.
7. Применение со-ассоциата по п.5 в качестве ингибитора вируса гриппа человека.
8. Применение по п.7, в котором вирус гриппа человека представляет собой вирус гриппа типа А или вирус гриппа типа В.
9. Применение по п.8, в котором вирус гриппа человека типа А имеет подтип Н1 или НЗ.
10. Применение со-ассоциата по п.5 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболевания, ассоциированного с вирусом гриппа человека.
11. Применение по п.10, в котором вирус гриппа человека представляет собой вирус гриппа типа А или вирус гриппа типа В.
12. Применение по п.11 , в котором вирус гриппа человека типа А имеет подтип Н1 или НЗ.
13. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики заболевания, ассоциированного с вирусом гриппа человека, характеризующаяся тем, что она содержит терапевтически эффективное количество, по меньшей мере, одного из со-ассоциатов по п.5.
14. Фармацевтическая композиция по п.13, в котором вирус гриппа человека представляет собой вирус гриппа типа А или вирус гриппа типа В.
15. Фармацевтическая композиция по п.14, в котором вирус гриппа человека типа
А имеет подтип Н1 или НЗ.
16. Фармацевтическая композиция по п.13, характеризующая тем, что заболевание представляет собой грипп.
PCT/RU2017/000278 2017-04-28 2017-04-28 Пептидные производные противовирусного препарата занамивира WO2018199798A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2017/000278 WO2018199798A1 (ru) 2017-04-28 2017-04-28 Пептидные производные противовирусного препарата занамивира

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2017/000278 WO2018199798A1 (ru) 2017-04-28 2017-04-28 Пептидные производные противовирусного препарата занамивира

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018199798A1 true WO2018199798A1 (ru) 2018-11-01

Family

ID=63919943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/000278 WO2018199798A1 (ru) 2017-04-28 2017-04-28 Пептидные производные противовирусного препарата занамивира

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2018199798A1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000055149A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-21 Biota Scientific Management Pty. Ltd. Dimeric compounds and as inhibitors of neuraminidase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000055149A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-21 Biota Scientific Management Pty. Ltd. Dimeric compounds and as inhibitors of neuraminidase

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WATSON, KEITH G. ET AL.: "Highly potent and long-acting trimeric and tetrameric inhibitors of influenza virus neuraminidase", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 14, no. 6, 2004, pages 1589 - 1592, XP055383072 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8071535B2 (en) Guanidinium derivatives for improved cellular transport
NZ747501A (en) Amino acid derivatives functionalized on the n-terminal capable of forming drug encapsulating microspheres
US6444706B2 (en) Guanidine derivatives, processes for preparing them and their use as pharmaceutical compositions
JP2014111628A (ja) ウイルス融合のインヒビターのコレステロール誘導体
RU2676713C2 (ru) Терапевтические пептиды
WO2005116036A1 (en) Curcumol derivatives, the compositions comprising the same and the use of the same in the manufacture of medicament
CN111718395B (zh) 一种前药激活化合物、前药体系及其制备方法和应用
WO2021164677A1 (zh) 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
EP0374888A3 (en) Sulfated tannins and theirs salts
JPH07505371A (ja) 免疫調節活性を有する新規親油性オリゴペプチド
US7268162B2 (en) Aloe-emodin derivatives and their use in the treatment of neoplasias
US9828333B2 (en) Compounds for the treatment of influenza
WO2017152756A1 (zh) cRGD-厄洛替尼缀合物及其制备方法
EP2599783B1 (en) N6-(ferrocenmethyl)quinazolin-2,4,6-triamin (h2) and the derivatives and prodrugs thereof as antileishmanial, antiprotozoal, antiparasitic and antimicrobial agents
WO2010024108A1 (ja) インフルエンザウイルス感染症の予防ないし治療剤
WO2020057422A1 (zh) 一类万古霉素硫鎓衍生物、其制备方法、药物组合物和用途
WO2018199798A1 (ru) Пептидные производные противовирусного препарата занамивира
JP6910043B2 (ja) ヘマグルチニン結合ペプチド、および、これを含むインフルエンザウイルス感染症の予防・治療薬
US6440946B1 (en) Multiple-agents-binding compound, production and use thereof
BG63208B1 (bg) Бициклични тахикининови антагонисти, тяхното приготовляване и използуване в фармацевтични състави
CN116262132A (zh) 抗胰腺癌多肽药物偶联物及其无载体自组装纳米药物和制备方法及应用
CN110922450B (zh) Psma激活式抗肿瘤前药cpt-x及其制备方法和应用
WO2015096725A1 (zh) 端基具有亲脂性结构的线性脂肽、其制备方法及用途
CN108822190B (zh) 多肽及其药物组合物和用途
RU2612221C1 (ru) Блокаторы вируса гриппа

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17906956

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17906956

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205N DATED 19/12/2019)