WO2018170766A1 - 一种人程序性死亡配体2基因的siRNA及其应用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention belongs to the field of molecular genetics, and more particularly to a siRN capable of inhibiting human programmed death ligand 2
- Non-small cell lung cancer is a common malignant tumor in the world, and its incidence is increasing year by year. Studying NSCLC tumor recurrence factors and tumor immune escape mechanisms has important theoretical significance and clinical application value. T lymphocytes are important effector cells that mediate tumor immune responses, and T cell activation requires TCR-mediated antigen-specific signaling and costimulatory molecule-mediated costimulatory signals.
- PD-L2 Programmed death ligand 2
- B7-H1 is a negative T cell costimulatory molecule in the B7 family
- PD-L2 inhibits proliferation of CD4 and CD8 T cells by binding to its receptor PD-1
- activation negative regulation of the body's immune response process, thereby mediating tumor immune escape, promoting tumor growth
- the role of PD-L2 in tumor escape has an important role in the prevention and treatment of tumors, but the lack of specificity in the prior art
- the vector that inhibits the expression of the PD-L2 gene makes the related research not well developed.
- RNAi small interfering RNA
- siPDL2 sequence is as follows: [0007] Justice strand: 5,- GAGGGAAGUGAACAGUGCU-3' (SEQ ID NO: l);
- Antisense strand 5,-AGCACUGUUCACUUCCCUC-3' (SEQ ID NO: 2).
- 1 is a schematic diagram showing the results of quantitative PCR detection of PD-L2 gene expression levels after HepG2 cells transfected with siPDL2.
- Total RNA extraction Total RNA of PD-L2 cells normal and transfected with siPDL2 was extracted using the QIAGEN RNeasy Mini Kit.
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
提供了一种能高效特异性地抑制PD-L2基因的mRNA水平表达的siRNA，其序列为：正义链：5'-GAGGGAAGUGAACAGUGCU-3'(SEQ ID NO：1)；反义链：5'-AGCACUGUUCACUUCCCUC-3'(SEQ ID NO：2)。还提供了该siRNA用于制备治疗PD-L2基因表达异常相关疾病的药物的应用。
Description
说明书 发明名称：一种人程序性死亡配体 2基因的 siRNA及其应用 技术领域
[0001] 本发明属于分子遗传学领域， 尤其涉及一种能抑制人程序性死亡配体 2的 siRN
A及其应用。
背景技术
[0002] 非小细胞肺癌 （non-small cell lung cancer, NSCLC) 是当前世界的常见恶性肿 瘤， 其发病率有逐年增加的趋势。 研究 NSCLC肿瘤复发因素及肿瘤免疫逃逸机 制， 具有重要的理论意义和临床应用价值。 T淋巴细胞是介导肿瘤免疫应答的重 要效应细胞， T细胞活化需要 TCR介导的抗原特异性信号和共刺激分子介导的共 刺激信号。
技术问题
[0003] 程序性死亡配体 2 (PD-L2) /B7-H1是 B7家族中一个负性 T细胞共刺激分子， PD-L2通过与其受体 PD-1结合， 抑制 CD4和 CD8T细胞的增殖和活化， 负性调控 机体免疫应答过程， 从而介导肿瘤免疫逃逸， 促进肿瘤生长， 因此对 PD-L2在肿 瘤逃逸中作用的研究对于肿瘤的防治具有重要的作用， 但现有技术中缺乏特异 抑制 PD-L2基因表达的载体使得相关研究无法很好地幵展。
[0004] RNA干扰（RNA interference, RNAi)现象最早是由 Jorgensen等在发现的， 它 是一种高效、 特异性强的基因阻断技术， 近年来发展迅速， 很快就成为功能基 因组研究的有力工具， 可高效、 特异地抑制人 PD-L2基因表达， 进而为其功能研 究打下基础。
问题的解决方案
技术解决方案
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于 RNAi技术的针对人 PD-L2基因 mRNA的小分子 干扰 RNA (siRNA) 。
[0006] 从 GenBank获得人 PD-L2基因的 cDNA序歹 ij， 根据 siRNA靶序列的基本原则， 针对其设计了一条 19 nt的 siRNA: siPDL2序列如下：
[0007] 正义链： 5，- GAGGGAAGUGAACAGUGCU-3' (SEQ ID NO: l) ；
[0008] 反义链： 5，- AGCACUGUUCACUUCCCUC-3' (SEQ ID NO: 2) 。
发明的有益效果
有益效果
[0009] 本发明提供的 siPDL2具有干扰效率高， 可高效、 特异地抑制 PD-L2基因表达的 优点， 可作为有力工具应用于制备治疗 PD-L2基因表达异常相关疾病的药物。 对附图的简要说明
附图说明
[0010] 图 1为 HepG2细胞转染 siPDL2后定量 PCR检测 PD-L2基因表达水平的结果示意图 实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0011] 下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。 以下实施例中所使用的 技术， 包括 PCR扩增与检测、 细胞转染、 RNA提取等分子生物学技术， 以及细 胞培养、 检测技术等， 除非特别说明， 均为本领域内的技术人员已知的常规技 术； 所使用的仪器设备、 试剂和细胞系等， 除非是本说明书特别注明， 均为一 般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
[0012] 实施例一靶向 PD-L2基因的 siRNA寡核苷酸序列的设计
[0013] 在 GenBank査找到 PD-L2的 mRNA全序列， 从 PD-L2基因起始密码子 AUG下游 幵始， 搜索 AA序列， 其 3'端相邻 19 nt序列作为候选靶点， 从中选择 GC含量在 40-50%的 siRNA序列， 经 BLAST同源性比对证实特异性后应用 RNA structure 4.4 软件对靶 mRNA序列的二级结构进行评估， 最后获得靶核苷酸序列 siPDL2， 其正 义链序列如 SEQ ID NO: 1， 反义链序列如 SEQ ID NO: 2所示。
[0014] 实施例二 siRNA转染 HepG2细胞。
[0015] HepG2细胞 （购自 ATCC) ， 用 DMEM完全培养基 （含 10%胎牛血清） 培养， 按照 15万个 /孔的比例铺 6孔板， 于 37°C、 5% C02培养 18 h。 用 Lipofectamine 3000转染试剂盒（Invitrogen)进行细胞转染， 方法按照产品说明。 转染吋， 用 100
pmol siPDL2转染 A375细胞， siRNA与脂质体比例为 100 pmol: 10 μί。
[0016] 实施例三定量 PCR检测平 PD-L2基因表达水平
[0017] 提取总 RNA: 使用 QIAGEN RNeasy Mini Kit提取正常和转染 siPDL2的 PD-L2细 胞的总 RNA。
[0018] 逆转录： 使用 FastQuant RT Super Mix (天根生化） 进行逆转录。
[0019] 定量 PCR: 使用 SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (大连宝生物）
进行定量 PCR， 检测， 反应体系为 20 μί， 每个反应加入 1 L cDNA作为模板。 反应程序为： (1)95 °C 30 s , (2)95 °C 5s , (3)60°C 30s , (2)-(3)， 40个循环。 同吋 以 GAPDH为内参， 结果如图 1所示， 使用的定量 PCR引物如表 1所示：
[0020] 表 1
[0022] 如图 1所示， 转染 siPDL2后的 HepG2细胞， PD-L2基因的 mRNA表达水平与正常 HepG2细胞相比显著下降， 说明本发明的 siPDL2能够高效特异性抑制 PD-L2基因 的表达。
[0023]
工业实用性
[0024] 本发明提供的 siPDL2具有干扰效率高， 可高效、 特异地抑制 PD-L2基因表达的 优点， 可作为有力工具应用于制备治疗 PD-L2基因表达异常相关疾病的药物。
Claims
[权利要求 1] 一种 RNA干扰片段， 其特征在于， 所述 RNA干扰片段的序列如下:
正义链： 5'- GAGGGAAGUGAACAGUGCU-3' (SEQ ID NO: 1) 反义链： 5，- AGCACUGUUCACUUCCCUC-3' (SEQ ID NO: 2) 。
[权利要求 2] 权利要求 1中所述的 RNA干扰片段的应用，
其特征在于制备治疗 PD-L2基因表达异常相关疾病的药物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2017/077608 WO2018170766A1 (zh) | 2017-03-22 | 2017-03-22 | 一种人程序性死亡配体2基因的siRNA及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| PCT/CN2017/077608 WO2018170766A1 (zh) | 2017-03-22 | 2017-03-22 | 一种人程序性死亡配体2基因的siRNA及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2018170766A1 true WO2018170766A1 (zh) | 2018-09-27 |
Family
ID=63584900
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| PCT/CN2017/077608 WO2018170766A1 (zh) | 2017-03-22 | 2017-03-22 | 一种人程序性死亡配体2基因的siRNA及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2018170766A1 (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102428179A (zh) * | 2009-03-06 | 2012-04-25 | 国立大学法人三重大学 | 用于增强t细胞功能的方法 |
-
2017
- 2017-03-22 WO PCT/CN2017/077608 patent/WO2018170766A1/zh active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102428179A (zh) * | 2009-03-06 | 2012-04-25 | 国立大学法人三重大学 | 用于增强t细胞功能的方法 |
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