WO2018169442A1 - Биорезорбируемый биологический матрикс для замещения дефектов костной ткани и способ его получения - Google Patents
Биорезорбируемый биологический матрикс для замещения дефектов костной ткани и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- WO2018169442A1 WO2018169442A1 PCT/RU2017/050123 RU2017050123W WO2018169442A1 WO 2018169442 A1 WO2018169442 A1 WO 2018169442A1 RU 2017050123 W RU2017050123 W RU 2017050123W WO 2018169442 A1 WO2018169442 A1 WO 2018169442A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- bone
- biological
- matrix
- stage
- bioresorbable
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 134
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 104
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 91
- 230000007547 defect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 9
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 36
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 230000002328 demineralizing effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 15
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims abstract description 15
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims abstract description 14
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 68
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 39
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 31
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 25
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 25
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 238000005115 demineralization Methods 0.000 claims description 20
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 16
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 16
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 claims description 16
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 16
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 16
- 230000015961 delipidation Effects 0.000 claims description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 12
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 11
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 10
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 10
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 10
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 10
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 claims description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 6
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 210000003275 diaphysis Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 4
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 claims description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 4
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 4
- 230000000278 osteoconductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 4
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 3
- 210000004560 pineal gland Anatomy 0.000 claims description 3
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 3
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 claims description 2
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N ethanol;ethyl acetate Chemical compound CCO.CCOC(C)=O LJQKCYFTNDAAPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 239000006072 paste Substances 0.000 claims description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims 4
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004820 osteoconduction Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract 2
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 abstract 1
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 42
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 28
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 24
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 15
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 14
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 description 9
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 6
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 6
- PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N ε-Caprolactone Chemical compound O=C1CCCCCO1 PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 4
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 4
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 3
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102100040681 Platelet-derived growth factor C Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 108010017992 platelet-derived growth factor C Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000194 supercritical-fluid extraction Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010049951 Bone Morphogenetic Protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100028728 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000654 Bone morphogenetic protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028726 Bone morphogenetic protein 10 Human genes 0.000 description 1
- 101710118482 Bone morphogenetic protein 10 Proteins 0.000 description 1
- 102000003928 Bone morphogenetic protein 15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000349 Bone morphogenetic protein 15 Proteins 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024504 Bone morphogenetic protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000698776 Duma Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102100035368 Growth/differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710204281 Growth/differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000008108 Osteoprotegerin Human genes 0.000 description 1
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 description 1
- -1 PDGF-B Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 102100040682 Platelet-derived growth factor D Human genes 0.000 description 1
- 101710170209 Platelet-derived growth factor D Proteins 0.000 description 1
- 102100037596 Platelet-derived growth factor subunit A Human genes 0.000 description 1
- 208000004550 Postoperative Pain Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920013816 TRITON QS-44 Polymers 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 102400001359 Transforming growth factor beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 108010073925 Vascular Endothelial Growth Factor B Proteins 0.000 description 1
- 108010073923 Vascular Endothelial Growth Factor C Proteins 0.000 description 1
- 108010073919 Vascular Endothelial Growth Factor D Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 1
- 102100038217 Vascular endothelial growth factor B Human genes 0.000 description 1
- 102100038232 Vascular endothelial growth factor C Human genes 0.000 description 1
- 102100038234 Vascular endothelial growth factor D Human genes 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 101150067309 bmp4 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000316 bone substitute Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008473 connective tissue growth Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 210000001699 lower leg Anatomy 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229960000988 nystatin Drugs 0.000 description 1
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 1
- XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N octadec-7-ynoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC#CCCCCCC(O)=O XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000001095 phosphatidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 108010017843 platelet-derived growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- FCZYGJBVLGLYQU-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethoxy]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCS([O-])(=O)=O)C=C1 FCZYGJBVLGLYQU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 231100000732 tissue residue Toxicity 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
- A61L27/3645—Connective tissue
- A61L27/365—Bones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/02—Inorganic materials
- A61L27/12—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/18—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/222—Gelatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/26—Mixtures of macromolecular compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
- A61L27/3608—Bone, e.g. demineralised bone matrix [DBM], bone powder
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
- A61L27/3616—Blood, e.g. platelet-rich plasma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/402—Anaestetics, analgesics, e.g. lidocaine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/404—Biocides, antimicrobial agents, antiseptic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/404—Biocides, antimicrobial agents, antiseptic agents
- A61L2300/406—Antibiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking
Definitions
- the present invention relates to medical biotechnology, medicine, traumatology, orthopedics, dentistry and orthodontics, and in particular to a method for producing a biological matrix designed to replace bone defects.
- allografts be used as an alternative, but they lack the osteoactive potential of autografts, and in addition, they carry the risk of contamination by infectious agents and immune rejection due to the graft rejection reaction (“host versus graft”).
- the most modern approaches are aimed at improving the efficiency of bone grafts or other artificial endoprostheses by including bone progenitor cells or immature mesenchymal cells and growth factors in order to stimulate growth, differentiate cells and activate bone regeneration processes.
- the ideal bone graft should be made of biomaterials, in this case bone tissue, which fully imitate the structure and properties of the natural bone matrix (extracellular matrix bones).
- this matrix should both include osteoprogenic cells and provide a full range of metabolic and environmental signals found in native healthy bones.
- bioactive construct which is structurally, functionally and mechanically comparable to natural bone, which fully simulates the microenvironment, including biochemical and biophysical signals
- the most preferred bone substitute is a xenogenic biological matrix obtained using physicochemical methods of decellularization and deep cleaning, due to the preservation of the three-dimensional organization of collagen and the amorphous form of hydroxyapatite and the possibility of impregnation of various biologically active components into it.
- the present method includes additional steps where protein removal was performed with a 35% hydrogen peroxide (H202) solution for 24 hours at 40 ° C; removal of residual lipids and sterilization with sodium hydroxide 1 M, 1 hour at 20 ° C, followed by neutralization with an aqueous solution of NaH2P04 at a concentration of 12 g / l for 30 minutes, followed by treatment with 95% ethanol for 3 hours at 20 ° C with further processing 100 % ethanol for 2 hours at 20 ° C; after that, the samples were dried in air for 12 hours at 40 ° C. After packaging, gamma irradiation was carried out at 25 kGy. This method allows to obtain a sterile biological bone matrix.
- H202 hydrogen peroxide
- the disadvantages of this method are the insufficient purification of the matrix from the antigenic component due to the lack of enzymatic processing of the material, the use of high temperature at which the inevitable denaturation of collagen occurs, and the use of 100% ethanol, which requires special conditions.
- the prior art method is known (Bone graft material incorporating demineralized bone matrix and lipids, US7357947 B2, Biomet Inc. (US), 04/15/2008), where fresh bone mass was obtained from small animals - rats. After several washes with phosphate-buffered saline and ethanol, the bones were freeze-dried and ground into particles with a diameter of 100-500 ⁇ m, which were further decalcified with 0.6N HCI / 1% Triton X-100. For complete lipid removal the particles were immersed in a mixture of chloroform and methanol 1: 1 for 12 hours at room temperature. This method allows to obtain a demineralized bone matrix.
- the prior art method is known (Demineralized bone matrix compositions and methods, US 8202539 B2, Warsaw Orthopedic, Inc. (US), publ. 19.06.2012.), Where the bone, as an example of a cut of the human femur, was grinded in a mill radially for separation of the radial layers from the diaphysis. After removal of the spongy sections of the bone, the cortical bone was ground at three depths: 1, 5 mm - the periosteal layer, then another 1, 5 mm - the middle layer and then another 1, 5 mm - the endostal layer, so three depths were obtained - this is 1, 5, 3 and 4.5 mm.
- demineralization was carried out. Glycerol acted as a carrier of milled and demineralized particles. It was shown that arbitrary combinations of fractions of particles from different layers are possible. It was demonstrated that the demineralized bone matrix from the periosteal layer has the highest osteoinductivity than from the middle and especially from the endosteal layer. This method allows to obtain osteoinductive demineralized bone matrix.
- the disadvantages of this method are the lack of a stage of primary purification of bone material and a small number of washing steps, which does not allow to obtain a demineralized bone matrix of high purity.
- this method there are no stages of delipidation and decellularization, as a result of which the risk of an immune response to implantation of the obtained biological matrix is significantly increased.
- the properties of the obtained matrix were improved by treatment with ozone, where the matrix was placed in an ozone-rich solution with micro bubbles, the solution being periodically replaced, and the ozone concentration was from 0.1 to 400 ppm and the exposure time was from 0.1 to 7 hours, and the temperature of the ozone-enriched solution is from -20 to 50 ° C.
- ozone concentration was from 0.1 to 400 ppm and the exposure time was from 0.1 to 7 hours, and the temperature of the ozone-enriched solution is from -20 to 50 ° C.
- the demineralized bone matrix had a bone morphogenetic protein (BMP) concentration of -2> 5000 pg / g and compressibility up to 20 times. This technique allows to obtain a demineralized bone matrix with satisfactory biophysical characteristics.
- BMP bone morphogenetic protein
- the disadvantages of this method are the lack of stages of primary purification of bone material, removal of lipids, washing and processing with detergents, which does not allow to obtain a matrix of high quality and degree of purity and significantly increases the risk of immune reactions.
- a method is known from the prior art (Bone graft comprising a demineralized bone matrix and a stabilizing agent, US 7959941 B2, Warsaw Orthopedic, Inc., publ. 06/14/2011 1), where, after manual cleaning of soft tissues, the spongy bones were sawn into large segments and tubular ones into small ones. The segments were washed with cold deionized water. To remove lipids and dehydration, bone segments were placed in 100% ethanol for at least 1 hour, and ethanol was periodically replaced. For 100 g of bone, 4 L of 100% ethanol was used. Then, for the final dehydration, the bone segments were placed in a solution of anhydrous diethyl ether in a fume hood for 1 hour.
- a method is known from the prior art (Bone matrix compositions and methods, CA2690457 A1, Osteotech, Inc. et.al. (US), published December 24, 2008), where after manual cleaning of soft tissues, the bone was ground into a powder with a diameter of 2.8 -4 mm, which was then placed in a solution of chloroform and methanol 1: 1 for 6 hours to remove lipids. After drying in a fume hood overnight, the particles were further dried under vacuum for 12 hours. The particles were then demineralized in a 0.6N HCI solution for 75 minutes and washed with distilled water to pH> 3.
- the particles were then incubated in 100 mM phosphate-buffered saline with a pH of 7.4 containing 2 mM sodium azide (an enzyme inhibitor) and 6.0 mM ⁇ -ethylmaleimide (protease inhibitor) for 72 hours at 37 ° C. Then the particles were washed twice with water for 15 minutes at room temperature and lyophilized. This technique allows you to get lyophilized demineralized bone matrix in the form of powder or particles.
- the prior art method is known (Manufacturing method for fibrous demineralized bone matrix, US 9029077 B2, Cg Bio Co., Ltd. (KR) publ. 05/12/2015), where after manual removal of soft tissue from the bone, in the example, weighing 172 g , the remaining soft tissues, lipids and bone marrow were removed using a detergent containing surfactant.
- the bone was sawn in half and immersed in 20 ml of 0.6N HCI solution per 1 g of bone for 3 hours for partial demineralization. Next, the bone was placed in 20 ml of distilled water per 1 g of bone for washing.
- the bones were cut into layers with a slicer, and the layer thickness was about 0.5 mm.
- the bone layers were immersed in 30 ml of a 0.6N HCI solution per 1 g of bone for 3 hours for complete demineralization.
- the precipitating demineralized bone matrix was pulverized for 10 minutes, neutralized with phosphate-buffered saline, washed with distilled water, and lyophilized to obtain about 31 g of the matrix in the form of fibers. This technique allows you to get lyophilized demineralized bone matrix in the form of layers.
- the disadvantages of this method is the lack of a detailed description of the detergent treatment, with which it is supposed to remove lipids and decellularization, which significantly increases the risk of immune reactions.
- the prior art method is known (Bone matrix compositions and methods, US 8328876 B2, Warsaw Orthopedic Inc. (US), publ. 12/11/2012), where the demineralized powder was placed in a solution containing 50 mm Tris-HCI (pH 7.4 ), 5 mM CaCI 2 and 80 IU / ml of purified bacterial collagenase (ratio of 1 g of powder per 3 ml of solution) for 1 hour at 37 ° C with stirring. Next, the demineralized bone matrix was stirred for 1 hour in 45 ml of 0, 1 N acetic acid at 4 ° C. After this, the matrix was washed twice with cold water for 30 minutes and neutralized for 30 minutes with cold phosphate-buffered saline solution. This technique allows to increase the osteoinductive properties of demineralized bone matrix.
- the disadvantages of this method are the partial degradation of collagen in the bone matrix and leaching of bone morphogenetic proteins due to the use of acetic acid, which reduces the osteoinductive properties of the matrix.
- a method is known from the prior art (Bone graft material incorporating demineralized bone matrix and lipids, US 6565884 B2, Biomet Manufacturing LLC (US), published May 20, 2003), where a previously demineralized bone matrix was mixed with lecithin with a total matrix mass fraction of 20 up to 80% and encapsulated in gelatin for implantation. This technique allows to increase the osteoinductive properties of demineralized bone matrix.
- the disadvantage of this method is the use of physical mixing of the components, which does not allow the full impregnation of lecithin and gelatin in the structure of the matrix, which, in turn, reduces its effectiveness.
- a method is known from the prior art (Xenograft bone matrix for orthopedic applications, EP 1418866 A2, Aperion Biologies, Inc (US), published May 19, 2004), where frozen pig bones were washed with a disinfectant and thawed, followed by cleaning of soft tissues. The proximal and distal metaphyses were sawn off, and the diaphysis was sawn into segments convenient for processing, which were placed in a bath with isopropanol. Next, the segments were transferred into a vessel with hexane or methanol for 12-18 hours with constant stirring at 4 ° C. After twice washed with water for 10-12 hours with constant stirring at 4 ° C.
- the material was treated with 1, 5M NaCl for 10-12 hours with constant stirring at 4 ° C, and then washed in water and ground into powder with a diameter of ⁇ 500 ⁇ m. Then the powder was resuspended in a solution of 70% isopropanol and 0.1% Tween-20 and filtered through a sieve followed by a triplicate repeat of the procedure, which amounted to 4 times in total. The particles were resuspended in H 2 0 2 and stirred for 4-6 hours at 4 ° C. Then the supernatant was decanted and 0.5N HCI was added to the powder with stirring for 20-24 hours at 4 ° C.
- an ⁇ -galactosidase solution was added to reduce immunogenicity for 4-12 hours at 4-26 ° C, followed by draining of this solution and washing three times with water.
- the final stage of preparation was carried out by lyophilization for 36-38 hours. This method allows to obtain hypoimmunogenic demineralized bone matrix.
- tissues are washed with deionized water for 1 hour and phosphate-buffered saline for 12 hours and then washed three times with 500 ml of phosphate-buffered saline for 24 hours.
- tissues are exposed to 35 ml of DNase I (70 IU / ml) for 1 hour and washed twice more in 500 ml of phosphate-buffered saline for 24 hours.
- tissues are washed with deionized water for 1 hour and phosphate-buffered saline for 12 hours and then washed three times with 500 ml of phosphate-buffered saline for 24 hours. Further tissues are exposed to 35 ml of DNase I (70 IU / ml) for 1 hour and washed three more times in 500 ml of phosphate-buffered saline for 24 hours.
- DNase I 70 IU / ml
- the present method allows to obtain a decellularized bone matrix.
- the disadvantages of this method are the inadequate cleaning and decellularization of large volumes of biological tissues due to the limited impregnation of the thickness of the biomaterial with the reagents used, incomplete washing and the absence of additional physical effects.
- the entire process of purification and decellularization of the biomaterial is carried out at room temperature for a long time without the use of special preservatives, which increases the risk of degradation of the biomaterial and its contamination.
- this technique does not allow demineralization of biomaterial to obtain a matrix with a low content of mineral components.
- the solutions known from the prior art have an important drawback - the absence of one or more stages of processing biological material: primary purification, removal of lipids, washing or processing with detergents. As a rule, they do not contain the required number of washing steps or detergent treatment steps.
- the complete decellularization and purification of a foreign implantable biomaterial of both allogeneic and xenogenic origin should contain at least: (1) primary purification of bone material; (2) removal of odorous substances and lipids; (3) detergent treatment for the purpose of decellularization; (4) demineralization followed by neutralization of pH; (5) flushing at all stages of the processing of the material; (6) final sample preparation for direct shaping, including sterilization.
- the present invention is to develop an effective and safe biological matrix for the replacement of bone defects.
- the problem is solved through the use of multi-stage processing of biological material, namely xenogenic or allogeneic bone tissue, while maintaining the native three-dimensional organization of the collagen frame, preserving the native amorphous form of hydroxyapatite and calcium phosphate, the presence of active components in the biological matrix, namely extracellular proteins matrix and modifying biomolecules (including bioactive peptides and growth factors).
- the general technical result of the proposed group of inventions is the production of a biological matrix with increased osteo- and biointegration, optimal biodegradation rate, high biocompatibility, lack of immunoreactivity from the recipient, high ability to osteoconduction, expressed osteogenic potential in osteosynthesis and bone grafting.
- the biological matrix consists of bone collagen, hydroxyapatite and / or calcium phosphate, and the bone collagen in this matrix is presented in native unreduced form with a fully preserved three-dimensional structure, hydroxyapatite and calcium phosphate are presented in native amorphous form, and the matrix itself, purified from cell debris, foreign lipids, nucleic acids and immunogens, contains residual amounts of bone morphogenetic proteins and can be further modified by vesicular phosphatidyl ling and / or included cholesterol with hydrolyzed collagen and / or atelokollagenom and / or poly (e-caprolactone), and various biologically active substances (such as bioactive peptides and growth factors) by impregnation.
- various biologically active substances such as bioactive peptides and growth factors
- the stated technical problem is achieved through the use of multi-stage processing of biological material, namely xenogenic or allogeneic bone tissue, preservation of the native three-dimensional organization of the collagen frame, preservation of the native amorphous form of hydroxyapatite and calcium phosphate and the presence of active components in the biological matrix, namely extracellular matrix proteins and modifying biomolecules (including bioactive peptides and growth factors).
- biological material namely xenogenic or allogeneic bone tissue
- preservation of the native three-dimensional organization of the collagen frame preservation of the native amorphous form of hydroxyapatite and calcium phosphate
- active components in the biological matrix namely extracellular matrix proteins and modifying biomolecules (including bioactive peptides and growth factors).
- a method for producing a biological matrix for the replacement of bone defects of the present invention includes a number of successive steps, including: (1) pretreatment of the biological material; (2) rough cleaning and fractionation; (3) deep cleaning and extraction; (4) delipidation; (5) fermentation; (6) demineralization; (7) sterilization in supercritical media.
- the stage of pretreatment of biological material includes freezing the biomaterial at -20 - 40 ° C, treatment with disinfectants, including a solution of antibiotics and antimycotics, for 1 -72 hours at a temperature of 1-8 ° C; treatment with a solution of hydrogen peroxide at a concentration of 0.1-5% for 1-72 hours at a temperature of 1-8 ° C, and the ratio of biological tissue to solution is from 1: 10 to 1: 40.
- disinfectants including a solution of antibiotics and antimycotics
- solutions of gentamicin / amphotericin and penicillin / streptomycin and / or nystatin and / or fungizon are used as disinfectants.
- the disinfectant treatment is carried out under an ultrasonic bath under the general conditions described above.
- treatment with a hydrogen peroxide solution is carried out under an ultrasonic bath under the conditions described above.
- the pretreatment solution is changed 1 time per hour.
- the stage of coarse cleaning and fractionation includes cleaning the biological sample from soft tissues and the fibrous layer of the periosteum; fractionation of biological material; washing in a solution of hydrogen peroxide in a concentration of 0.1 - 5% for 1-72 hours at a temperature of 1 -8 ° C, and the ratio of biological tissue to solution is from 1: 10 to 1: 40.
- the cleaning of a biological sample from soft tissues is carried out immediately after the stage of preliminary processing of the biological material.
- the cleaning of the biological sample from soft tissues is carried out after freezing the preliminary sample at a temperature of -20 ° C.
- the fractionation of biological material is carried out by separating the spongy layer of the bone from the cortical layer.
- the fractionation of biological material is carried out by separating the tubular bone diaphysis from the metaphysis and pineal gland.
- the fractionation of biological material is carried out by separating the periosteal and middle layer from the endosteal layer, the periosteal and middle layer being separated to a depth of 8-10 mm.
- the treatment with a solution of hydrogen peroxide is carried out in an ultrasonic bath.
- each of the coarse cleaning solutions is changed 1 time per hour during the entire washing step.
- the biological sample is separated in the form of a block of cancellous bone.
- the biological sample is separated in the form of a block of spongy and cortical bone.
- the biological sample is separated in the form of a cortical plate.
- the biological sample is crushed to a state of crumbs or fine powder of cortical and / or cancellous bone.
- the stage of deep purification and extraction includes processing in solution of ionic and amphoteric surfactants; washing the matrix in buffer solutions and / or deionized water; neutralization of ionic surfactants and protein renaturation; secondary washing in buffer solutions and / or deionized water; ultrasonic extraction of impurities.
- sodium dodecyl sulfate at a concentration of 0.1-10% is used as ionic surfactants.
- lauryl sulfate, Triton X-200, Triton XQS-20, Triton QS-15, Triton QS-44 individually at a concentration of 0, 1 -10%, or, are used as ionic / anionic surfactants mixtures.
- (3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate) is used as amphoteric surfactants at a concentration of 0.1-10%.
- ionic surfactants and amphoteric surfactants are mixed in a ratio of 1: 40 to 40: 1.
- the treatment in solution of a complex of ionic and amphoteric surfactants is carried out using an ultrasonic disintegrator.
- the treatment in solution of a complex of ionic and amphoteric surfactants is carried out for 1 to 72 hours at a temperature of 35-41 ° C.
- the solution together with the biological material is sonicated using an ultrasonic disintegrator for 5-30 minutes at a temperature of 35-41 ° C.
- the treatment in solution of a complex of ionic and amphoteric surfactants is carried out with constant stirring at an orbital speed of 50-250 rpm.
- washing the matrix in buffer solutions and / or bidistilled deionized water is carried out for 1 -72 hours at a temperature of 1 -8 ° C, with phosphate-buffered saline being preferred.
- nonionic surfactants including Triton X-100 at a concentration of 0, 1 -5% and Tween-20 at a concentration of 0.005-1%.
- Tween 80, Bridge 35/56/72/76 / 92V / 97 / 58P, digitonin, digitoxygenin individually at a concentration of 0.1-10% or in a mixture are used to neutralize ionic surfactants.
- the neutralization and renaturation is carried out at a temperature of 35-41 ° C.
- neutralization and renaturation are carried out with constant stirring at an orbital speed of 100-250 rpm.
- secondary washing in buffer solutions and / or deionized water is carried out for 1 -72 hours at a temperature of 1 -8 ° C, with phosphate-buffered saline being preferred.
- each of the solutions of ionic and amphoteric surfactants, nonionic surfactants and washing solutions is changed 1 time per hour.
- antibiotics and / or antimycotics are added to the wash solution.
- the ultrasonic extraction of impurities is carried out in an ultrasonic bath.
- a preferred method is the combination of perfusion with an ionic detergent, in particular sodium dodecyl sulfate at a concentration of 1%, dissolved in deionized water, followed by washing with phosphate-buffered saline and perfusion with a nonionic detergent, in particular Triton X-100 at a concentration of 1%, to remove sodium dodecyl sulfate and renaturation of extracellular matrix proteins, followed by washing in phosphate buffered saline with antibiotics for 72 hours.
- an ionic detergent in particular sodium dodecyl sulfate at a concentration of 1%
- the bone matrix is centrifuged in phosphate-buffered saline at 300-3000 rpm in a horizontal centrifuge for 10-30 minutes.
- washing is carried out in buffer solutions with variable ionic strength.
- washing is carried out in a NaCI solution at a concentration of 250-800 mM.
- washing is carried out at a temperature of 0.5-2 ° C.
- the delipidation step includes treating with ethanol and / or a mixture of ethanol and chloroform; washing in buffer solutions or deionized water or delipidation in alcohols in supercritical environments.
- the delipidation is carried out in a mixture of ethanol and ethyl acetate, wherein the ratio of the components of the mixture is from 1: 1 to 1: 4, respectively.
- additional processing is carried out in a toluene solution at 35-41 ° C for 1 -72 hours.
- a subsequent treatment with sodium hydroxide is carried out at a concentration of 0.5-20 g / l at a temperature of 1 -8 ° C for 1 -72 hours.
- the fermentation stage includes treatment in enzyme solutions — DNase and / or trypsin and subsequent washing in buffer solutions or deionized water, and trypsin treatment is carried out with the addition of magnesium ions (MD 2+ ) in phosphate-saline buffer solution at a concentration of 0.2% .
- enzyme solutions DNase and / or trypsin
- trypsin treatment is carried out with the addition of magnesium ions (MD 2+ ) in phosphate-saline buffer solution at a concentration of 0.2% .
- the fermentation step is carried out by treatment in a DNase solution at a concentration of 10-500 ⁇ g / ml.
- the fermentation step is carried out by treatment in a trypsin solution at a concentration of 0.05-1%.
- trypsin treatment is carried out by adding a solution of magnesium chloride at a concentration of 0.05-5 mm.
- the fermentation step is carried out at a temperature of 37 ° C on an orbital shaker at 100-250 rpm.
- each of the fermentation solutions is changed 1 time per hour.
- the bone matrix is centrifuged in phosphate-buffered saline at 300-3000 rpm in a horizontal centrifuge for 10-30 minutes.
- the demineralization step involves treating a mixture of a strong acid and a non-ionic detergent in a solution, followed by neutralization, pH correction and washing.
- the demineralization step is carried out at a temperature of 18-25 ° C. with a 0.6 M HCI solution in combination with 1% Triton X-100 for 1 to 24 hours, followed by neutralization with 0.5 M NaOH at a temperature of 18-25 ° C. and washing in buffer solutions and / or deionized water for 1 -72 hours at a temperature of 1 -8 ° C, with phosphate-buffered saline being preferred.
- the bone material prior to the demineralization step, is pre-dried using an oven or freeze drying.
- a subsequent treatment is carried out with sodium hydroxide at a concentration of 0.5-20 g / l at a temperature of 1 -8 ° C for 1-72 hours and secondary washing is carried out in buffer solutions and / or deionized water is carried out in for 1 -72 hours at a temperature of 1 -8 ° C, with phosphate-buffered saline being preferred.
- a step of sterilization in the supercritical fluid is conducted under conditions of supercritical C0 2 at a pressure of 250 bar and a temperature of 35-41 ° C for 1-3 hours, with a preferred temperature is 37-40 ° C.
- the biological material is initially statically saturated with a supercritical solvent at a temperature of 35-41 ° C for 1-3 hours.
- sterilization in supercritical media is carried out by means of a constant supply of C0 2 at a speed of 1.5-5 kg / h.
- the ratio of the volume of the chamber to the volume of the sterilized biological tissue should be 1: 20-1: 200.
- the resulting biological matrix can be impregnated with phosphatidylcholine and / or cholesterol, with included gelatin (hydrolyzed collagen), and / or bone atelocollagen, and / or poly (e-caprolactone), and / or biologically active substances (including bioactive peptides and growth factors) wherein a solution of phosphatidylcholine and / or cholesterol in ethanol is resuspended in a round bottom flask, aqueous solutions of gelatin and / or biologically active substances are introduced into the flask and evaporated in a rotary evaporator to obtain a film.
- gelatin hydrolyzed collagen
- bone atelocollagen and / or poly (e-caprolactone)
- biologically active substances including bioactive peptides and growth factors
- a pre-purified biological matrix is introduced into the flask and evaporated on a rotary evaporator at a rotation speed of 100-300 rpm and a temperature of 37 ° C.
- the ratio of phosphatidylcholine and / or cholesterol and added substances is from 1: 20 to 1: 100 per dry weight, respectively.
- telocollagen is its reduced immunogenicity.
- Methods for producing atelocollagen are known, and are described, for example, in application US 20130071645 A1.
- the solution immediately after film formation, the solution is resuspended in phosphate-buffered saline in the presence of glass beads, after which the beads are removed and the resulting solution is sonicated in the presence of a pre-purified bone matrix using an immersion ultrasonic sonicator.
- sonifika ju is carried out at a temperature of 1 -6 ° C for 2-15 minutes.
- impregnation with biologically active substances is carried out at the stage of sterilization in supercritical media.
- lyophilization of the obtained biological matrix is carried out at a temperature of -20 - -80 ° C and a pressure of 20-130 Pa for 24-72 hours.
- the bioresorbable biological matrix obtained by this method can be used to fill in bone defects or as an implant in surgery, and bone defects formed as a result of surgery, congenital pathologies, tumors or injuries of various origins.
- a biological matrix which consists of bone collagen, hydroxyapatite and / or calcium phosphate, and the bone collagen in this matrix is presented in native unreduced form with a fully preserved three-dimensional structure, hydroxyapatite and calcium phosphate are presented in native amorphous form, and the matrix itself, purified from cell debris, foreign lipids, nucleic acids and immunogens, contains residual amounts of bone morphogenetic proteins and can be further modified ulyarnym phosphatidylcholine and / or cholesterol, c included hydrolyzed collagen and / or atelokollagenom and / or poly (e-caprolactone), and, optionally, various biologically active substances (such as bioactive peptides and growth factors) by impregnation.
- various biologically active substances such as bioactive peptides and growth factors
- FIG. 1 Generalized scheme of a method for bioresorbable biological matrix in a preferred embodiment of the invention
- FIG. 2 Biological matrix surface closeup
- FIG. 3 Histological section of the biological matrix (hematoxylin-eosin stain)
- FIG. 4 Microelectron diffraction pattern of the surface of the biological matrix
- FIG. 5 The formation of bone-cartilage callus on the 30th day
- FIG. 6 Complete fusion of bone tissue on the 60th day
- FIG. 7 X-ray of bone fusion: a - control group; b - experimental group
- any fragment of a mammalian organ or tissue can be used.
- an auto-, allo- or xeno-material of a mammalian bone tissue is used.
- Bioactive peptides or growth factors that can be impregnated to enhance osteoconductive or osteoinductive properties in a purified matrix prepared in accordance with one embodiment of the invention include bone morphogenetic proteins (BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP- 4, ⁇ -5, ⁇ -6, ⁇ -7, ⁇ -8, ⁇ -9, BMP-10, ⁇ -1 1, ⁇ -12, BMP-13, BMP-15, ⁇ -16, ⁇ -17 , BMP-18), vascular endothelial growth factors (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E), transforming growth factors beta (TGF- ⁇ - ⁇ , TGF- ⁇ -2, TGF ⁇ -3), stem cell factors (SCF), thrombotic total growth factors (PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D), insulin-like growth factors (IGF), fibroblast growth factors (FGF), connective tissue growth factors (CTGF-1, CTGF-2, CT
- the spongy layer is separated from the cortical layer and / or the diaphysis is separated from the metaphysis and pineal gland, and / or the periosteal and middle layer are separated from the endosteal layer, with separated to a depth of 8-10 mm.
- the sample is treated in a solution of ionic and amphoteric surfactants at a temperature of 37-41 ° C, then, in order to precipitate surfactants, they are washed in buffer solutions at at a temperature of 1-8 ° C, then ionic surfactants are neutralized, and sodium dodecyl sulfate and / or 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1 - propanesulfone are used as ionic surfactants at a concentration of 0, 1 -10%, to neutralize and renaturation use Triton X-100 at a concentration of 0, 1 -5% and / or Tween-20 at a concentration of 0.005-1%, and the extraction is carried out using an ultrasonic disintegrator.
- the sample is treated in a solution of ethanol and / or ethanol-chloroform and / or ethanol-ethyl acetate and toluene, and after delipidation, sodium hydroxide is treated at a concentration of 0.5-20 g / l.
- treatment is carried out in solutions of DNase and / or trypsin, and trypsin treatment is carried out in the presence of magnesium chloride at a concentration of 0.05-5 mM.
- the solution is treated with a strong acid solution, followed by neutralization with sodium hydroxide; for sterilization step is carried out in supercritical fluids processing with supercritical C0 2, wherein initially performed static supercritical solvent saturation of the sample at a temperature of 35-41 ° C for 1 to 3 hours with a further constant feed C0 2 at 1, 5-5 kg / h.
- the prepared purified biological sample is impregnated with emulsified vesicular phosphatidylcholine and cholesterol with additionally included substances.
- a solution of phosphatidylcholine and / or cholesterol with additives is evaporated in a rotary evaporator to obtain a near-walled film, resuspended in phosphate saline buffer, and the impregnation is carried out using an ultrasonic disintegrator.
- gelatin hydrolyzed collagen
- bone atelocollagen and / or poly- (£ -caprolactone)
- biologically active substances such as bioactive peptides or growth factors.
- poly e-caprolactone
- another biodegradable synthetic polymer may be used.
- a sample of biological tissue is subjected to: (1) cleaning and disinfection; (2) manual or automated cleaning of soft tissues and the fibrous layer of the periosteum with subsequent fractionation and disinfecting washing; (3) a stepwise treatment with ionic / amphoteric and nonionic detergents with intermediate and final washing; (4) delipidation with washing if necessary; (5) fermentation followed by washing; (6) demineralization followed by washing; (7) sterilization in supercritical media; and (8) impregnation with emulsified vesicular phosphatidylcholine / cholesterol with biologically active substances (including bioactive peptides and growth factors).
- the above method allows to obtain a biological matrix for the replacement of defects in bone tissue, consisting of bone collagen, hydroxyapatite and / or calcium phosphate, and the bone collagen in this matrix is presented in the native unrestored form with a fully preserved three-dimensional structure, hydroxyapatite and calcium phosphate are presented in the native amorphous form and the matrix itself, purified from cell debris, foreign lipids, nucleic acids and immunogens, contains residual amounts of bone morphogenetics eskih proteins have osteoconductive and osteoinductive capabilities, satisfactory physical and mechanical properties, it is sterile and may be presented in various forms.
- the obtained bioresorbable biological matrix can be presented in the form of a block, crumbs, fine powder, paste, membrane, plate.
- the obtained bioresorbable biological matrix immediately before use can be enriched in autologous stromal-vascular fraction, mesenchymal stem cell culture, conditioned culture medium, platelet-rich plasma or autoblood.
- Methods for preparing the stromal-vascular fraction and culture of mesenchymal stem cells are well known in the art and are described in numerous sources (for example, in WO 2016044780 A1).
- the bioresorbable biological matrix obtained by the above method can be used in clinical practice, namely in traumatology, orthopedics, dentistry and orthodontics to fill in bone defects in the treatment of congenital pathologies, injuries of various origins, benign tumors, for use as an implant and as a drug carrier.
- Prototypes of the biological matrix were obtained from the femur of cattle. Samples were washed and treated with disinfectants, and prepared according to the above procedure. The bone matrix was fractionated into usable blocks containing both the cortical layer and the spongy layer.
- CFU colony forming units
- the results of the comparative analysis of the control parameters of the test groups are presented in table 1. The data are presented as mean and standard deviation - M (o). Table 1
- the cleaved surface of the sample was a porous structure consisting of: micropores with a size of 0.5-1 microns, which, intertwining, formed a microporous network: pores with a dimension of 10-20 microns, as well as large cavity formations (50-100 microns). Pores permeate the entire thickness of the sample. Foreign inclusions in the pores were not observed. There are no pores on the outer surface; a slit-like and dense material structure was visible.
- Anesthetized animals were given access to the tibia, the muscle layer and periosteum were dissected, and a cut was performed on the front surface of the tibia closer to the metaphysical zone, where the bone has an extension and a thicker wall.
- the biological matrix was introduced into the defect and the wound was sutured. On the 30th and 60th day the animals were removed from the experiment.
- the results of the study showed that the biological matrix has osteoinductive properties and can cause bone regeneration.
- the formation of bone-cartilage callus is observed in all experimental groups.
- the most representative results are presented in FIG. 5. 60 days after implantation, in the complete absence of aseptic inflammation, complete fusion and regeneration of bone tissue was observed in all experimental groups. The most representative results are shown in FIG. 6.
- signs of bone fusion are clearly visible compared with the control group, and the resulting bone-cartilage callus is similar in density to healthy bone tissue of the tibia.
- the present invention describes a method for producing a biological matrix for replacing defects in bone tissue, comprising the steps of: (1) pretreating a biological material; (2) coarse cleaning and fractionation; (3) deep cleaning and extraction; (4) delipidation; (5) fermentation; (6) demineralization; (7) sterilization in supercritical media.
- the biological matrix described above consisting of bone collagen, hydroxyapatite and / or calcium phosphate, is characterized in that bone collagen is presented in a native unreduced form with a fully preserved three-dimensional structure, hydroxyapatite and calcium phosphate are presented in a native amorphous form, and the matrix itself, purified from cellular debris, foreign lipids, nucleic acids and immunogens, contains residual amounts of bone morphogenetic proteins, has osteoconductive and osteoinductive potential m, satisfactory physico-mechanical properties, is sterile and can be presented in various forms, the biological matrix can be impregnated with vesicular phosphatidylcholine and / or cholesterol, which additionally includes gelatin (hydrolyzed collagen) and / or bone atelocollagen, and / or poly- (e-caprolactone) with a complex of biologically active substances (such as bioactive peptides or growth factors), and is additionally sterilized and purified in supercritical environments.
- Bone graft comprising a demineralized bone matrix and a stabilizing agent. David Knaack, Kathy Fantasyedes, Michele Diegman, Nanette Forsyth, John Winterbottom, 201 1.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к медицинской биотехнологии, медицине, травматологии, ортопедии, стоматологии и ортодонтии. Предложен способ получения биологического матрикса, предназначенного для замещения дефектов костной ткани, может включать несколько последовательных стадий, таких как предварительная обработка биологического материала, грубая очистка и фракционирование, глубокая очистка и экстракция, делипидирование, ферментация, деминерализация и стерилизация в сверхкритических средах. Полученный биорезорбируемый биологический матрикс, характеризуется повышенной остео- и биоинтеграцией, оптимальной скоростью биодеградации, высокой биосовместимостью, отсутствием иммунореактивности со стороны реципиента, высокой способностью к остеокондукции, выраженными остеогенными потенциями при остеосинтезе и костной пластике. Матрикс состоит из костного коллагена, гидроксиапатита и/или фосфата кальция, и отличается тем, что костный коллаген представлен в нативной невосстановленной форме с полностью сохраненной трехмерной структурой, гидроксиапатит и фосфат кальция представлены в нативной аморфной форме, а сам матрикс, очищенный от клеточного дебриса, чужеродных липидов, нуклеиновых кислот и иммуногенов, содержит остаточные количества костных морфогенетических белков и импрегнирован везикулярным фосфатидилхолином и/или холестерином с включенным желатином (гидролизованным коллагеном), и/или костным ателоколлагеном, и/или поли-(ε-капролактоном) и дополнительно включенными биологически активными веществами (в том числе биоактивными пептидами и факторами роста).
Description
БИОРЕЗОРБИРУЕМЫЙ БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТРИКС ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ ДЕФЕКТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к медицинской биотехнологии, медицине, травматологии, ортопедии, стоматологии и ортодонтии, а именно к способу получения биологического матрикса, предназначенного для замещения дефектов костной ткани.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Сокращение сроков реабилитации и повышение эффективности восстановительных операций на опорно-двигательном аппарате остается актуальной социально-экономической и медицинской проблемой. В последнее время все большее внимание уделяется использованию процессов регенерации как альтернативе механического замещения дефектов кости посредством металлических и керамических имплантов.
Использование костных трансплантатов является общепринятым мировым стандартом при лечении переломов, обширных дефектов костной ткани после оперативных вмешательств и травм, а также при замене утраченных костей. Данный тезис подтверждается огромным количеством экспериментального и клинического материала по всему миру. Наиболее распространенным подходом является использование аутотрансплантатов. Однако использование собственного биологического материала имеет ряд серьезных ограничений, в первую очередь связанных с травматичностью, ограниченным ресурсом и такими осложнениями, как ранняя послеоперационная боль, хроническая боль в месте забора трансплантата, хронической вялотекущей инфекцией, рубцами, потерей крови и другими.
В качестве альтернативы предложено использовать аллотрансплантаты, но им не хватает остеоактивного потенциала аутотрансплантатов, и, кроме того, они несут риск контаминации инфекционными агентами и иммунного отторжения вследствие реакции отторжения трансплантата («хозяин против трансплантата»).
Наиболее современные подходы направлены на улучшение эффективности костных трансплантатов или других искусственных эндопротезов путем включения костных клеток-предшественников или незрелых клеток мезенхимального ряда и факторов роста в целях стимуляции роста, дифференцировки клеток и активации процессов регенерации кости.
В то же время идеальный костный трансплантат должен быть изготовлен из биоматериалов, в данном случае костной ткани, которые в полной мере имитируют структуру и свойства естественного костного матрикса (экстрацеллюлярного матрикса
кости). Кроме того, данный матрикс должен как включать остеопрогениторные клетки, так и обеспечивать полный спектр метаболических и экологических сигналов, обнаруживаемых в нативной здоровой кости.
Однако создание биоактивной конструкции, которая структурно, функционально и механически сравнима с натуральной костью, полностью моделирующей микросреду, в том числе биохимические и биофизические сигналы, до сих пор является вызовом для исследователей и производителей во всем мире. Наиболее предпочтительным заменителем костной ткани представляется ксеногенный биологический матрикс, полученный с использованием физико-химических методов децеллюляризации и глубокой очистки, вследствие сохранения трехмерной организации коллагена и аморфной формы гидроксиапатита и возможности импрегнации в него различных биологически активных компонентов.
Известен способ (Fages J, et al (1998) Viral inactivation of human bone tissue using supercritical fluid extraction. ASAIO J 44:289-293), где после распиливания кости проводили обезжиривание биологического матрикса методом сверхкритической флюидной экстракции при следующих условиях: скорость потока С02 - 2 кг/ч, давление 250 бар, температура 50°С, продолжительность обработки 10 минут на 1 г костной ткани. Настоящий способ включает дополнительные этапы, где проводили удаление белков 35% раствором перекиси водорода (Н202) в течение 24 часов при 40°С; удаление остаточных липидов и стерилизацию гидроксидом натрия 1 М, 1 час при 20°С с дальнейшей нейтрализацией водным раствором NaH2P04 в концентрации 12 г/л в течение 30 минут и последующей обработкой 95% этанолом в течение 3 часов при 20°С с дальнейшей обработкой 100% этанолом в течение 2 часов при 20°С; после этого образцы сушили на воздухе 12 часов при 40°С. После упаковки проводили стерилизацию гамма- облучением при 25 кГрей. Данный метод позволяет получить стерильный биологический костный матрикс.
Недостатками данного способа являются недостаточная очистка матрикса от антигенной составляющей вследствие отсутствия ферментативной обработки материала, использование высокой температуры, при которой происходит неизбежная денатурация коллагена, и использование 100% этанола, для которого требуются специальные условия.
Из предшествующего уровня техники известен способ (Bone graft material incorporating demineralized bone matrix and lipids, US7357947 B2, Biomet Inc. (US), 15.04.2008), где свежую костную массу получали из мелких животных - крыс. После нескольких промывок фосфатно-солевым буферным раствором и этанолом кости лиофильно высушивали и размалывали в частицы диаметром 100-500 мкм, которые были далее декальцифицированы 0,6N HCI/1 % Тритон Х-100. Для полного удаления липидов
частицы погружали в смесь хлороформа и метанола 1 :1 на 12 часов при комнатной температуре. Данный способ позволяет получить деминерализованный костный матрикс.
Недостатками данного способа являются отсутствие стадии первичной очистки костного материала и малое количество стадий промывки, что не позволяет получить деминерализованный костный матрикс высокой степени чистоты. Кроме того, данный способ позволяет получить костный матрикс только в виде крошки.
Из предшествующего уровня техники известен способ (Demineralized bone matrix compositions and methods, US 8202539 B2, Warsaw Orthopedic, Inc. (US), опубл. 19.06.2012.), где кость, на примере среза бедренной кости человека, размалывали на мельнице радиально для отделения радиальных слоев от диафиза. После удаления губчатых участков кости, кортикальную кость размалывали на трех глубинах: 1 ,5 мм - периостальный слой, далее еще 1 ,5 мм - средний слой и далее еще 1 ,5 мм - эндостальный слой, таким образом получали три глубины - это 1 ,5, 3 и 4,5 мм. Во избежание случайного попадания костного мозга в материал дальнейшее размалывание не проводили. Далее осуществляли деминерализацию. В качестве переносчика размолотых и деминерализованных частиц выступал глицерол. Было показано, что возможны произвольные комбинации долей частиц из различных слоев. Было продемонстрировано, что деминерализованный костный матрикс из периостального слоя обладает наиболее высокой остеоиндуктивностью, чем из среднего и тем более из эндостального слоя. Данный способ позволяет получить остеоиндуктивный деминерализованный костный матрикс.
Недостатками данного способа являются отсутствие стадии первичной очистки костного материала и малое количество стадий промывки, что не позволяет получить деминерализованный костный матрикс высокой степени чистоты. В данном способе отсутствуют стадии делипидирования и децеллюляризации, вследствие чего значительно повышается риск иммунного ответа на имплантацию полученного биологического матрикса.
Из предшествующего уровня техники известен способ (Process for demineralization of bone matrix with preservation of natural growth factors, US 8992964 B2, Bacterin International, Inc. (US), опубл. 31.03.2015), где для получения деминерализованного губчатого костного матрикса 1 -300 г губчатой кости помещали в 10-4500 мл 0,3-2М HCI, далее смесь перемешивали в течение 4-10 часов, в процессе перемешивания раствор HCI заменяли каждые 1 -4 часа. Каждые 5-90 минут проводили тест губчатого костного матрикса на полную сжимаемость. Полностью сжимаемые сегменты губчатого костного матрикса помещали в нейтрализующий раствор с рН > 4. Свойства полученного матрикса улучшали обработкой озоном, где матрикс помещали в обогащенный озоном раствор с микропузырьками, причем раствор периодически заменялся, а концентрация озона была от 0, 1 до 400 частей на миллион, причем время экспозиции составляло от 0,1 до 7 часов,
а температура обогащенного озоном раствора от -20 до 50°С. Такая обработка возможна и перед деминерализацией. Деминерализованный костный матрикс имел концентрацию костного морфогенетического белка (ВМР)-2 > 5000 пг/г и сжимаемость до 20 раз. Данная методика позволяет получить деминерализованный костный матрикс с удовлетворительными биофизическими характеристиками.
Недостатками данного способа являются отсутствие стадий первичной очистки костного материала, удаления липидов, промывки и обработки детергентами, что не позволяет получить матрикс высокого качества и степени чистоты и значительно повышает риск иммунных реакций.
Из предшествующего уровня техники известен способ (Bone graft comprising а demineralized bone matrix and a stabilizing agent, US 7959941 B2, Warsaw Orthopedic, Inc., опубл. 14.06.201 1 ), где после ручной очистки от мягких тканей губчатые кости распиливали на большие сегменты, а трубчатые - на малые. Сегменты промывали холодной деионизированной водой. Для удаления липидов и дегидратации костные сегменты помещали в 100% этанол на как минимум 1 час, причем этанол периодически заменяли. На 100 г кости использовали 4 л 100% этанола. Далее для окончательной дегидратации костные сегменты помещались в раствор безводного диэтилового эфира в вытяжном шкафу на 1 час. На 100 г кости использовали 2 л эфира. Обезвоженные костные сегменты замораживали и размалывали в порошок. Далее порошок деминерализовали 0,5М HCI (50 мл на 1 г кости) в течение 3 часов при комнатной температуре или 4°С с постоянным перемешиванием. Далее костные сегменты нейтрализовывали холодной деионизированной водой до достижения раствором рН воды. На промывку уходило 500 мл воды на 1 г костной массы. Деминерализованный костный порошок помещали в 100% этанол в течение 1 часа (200 мл 100% этанола на 1 г кости) и далее в раствор безводного диэтилового эфира в вытяжном шкафу на 1 час (100 мл эфира на 1 г кости). После этого для испарения эфира костные сегменты оставляли на ночь в вытяжном шкафу. Получающиеся частицы не имели запаха, снежно-белые и легко отделялись друг от друга. Для стерилизации использовался холодный этиленоксид или гамма-облучение. Данный способ позволяет получить стерильный деминерализованный костный матрикс.
Недостатками данного способа являются использование больших объемов токсичного диэтилового эфира, что несовместимо с требованиями безопасности. За исключением начального этапа, отсутствуют стадии промывки и обработки детергентами, что не позволяет получить матрикс высокого качества и степени чистоты.
Из предшествующего уровня техники известен способ (Bone matrix compositions and methods, CA2690457 A1 , Osteotech, Inc. et.al. (US), опубл. 24.12.2008), где после ручной очистки от мягких тканей кость перемалывали в порошок диаметром 2,8-4 мм, который далее помещали в раствор хлороформа и метанола 1 : 1 на 6 часов для удаления
липидов. После высушивания в вытяжном шкафу в течение ночи частицы подвергали дополнительному высушиванию под вакуумом в течение 12 часов. Далее частицы подвергали деминерализации в 0,6N растворе HCI в течение 75 минут и промывали дистиллированной водой до рН > 3. Далее частицы инкубировали в 100 мМ фосфатно- солевом буферном растворе с рН 7,4, содержащем 2 мМ азида натрия (ингибитор ферментов) и 6,0 мМ Ν-этилмалеимида (ингибитор протеаз) в течение 72 часов при 37°С. Затем частицы дважды промывали водой в течение 15 минут при комнатной температуре и лиофилизировали. Данная методика позволяет получить лиофилизированный деминерализованный костный матрикс в виде порошка или частиц.
Недостатками данного способа являются практически полное отсутствие этапов промывки, а также обработки детергентами, что не позволяет получить матрикс высокого качества и степени чистоты. Данный способ позволяет получить костный матрикс только в виде порошка или крошки, что ограничивает его применимость.
Из предшествующего уровня техники известен способ (Manufacturing method for fibrous demineralized bone matrix, US 9029077 B2, Cg Bio Co., Ltd. (KR) опубл. 12.05.2015), где после ручного удаления мягких тканей с кости, в примере весом 172 г, оставшиеся мягкие ткани, липиды и костный мозг удаляли при помощи детергента, содержащего сурфактант. Кость распиливали пополам и погружали в 20 мл 0,6N раствора HCI на 1 г кости в течение 3 часов для частичной деминерализации. Далее кость помещали в 20 мл дистиллированной воды на 1 г кости для промывки. Кости распиливали слайсером на слои, причем толщина слоя составляла около 0,5 мм. Далее костные слои погружали в 30 мл 0,6N раствора HCI на 1 г кости на 3 часа для полной деминерализации. Преципитирующий деминерализованный костный матрикс пульверизировали в течение 10 минут, нейтрализовывали фосфатно-солевым буферным раствором, промывали дистиллированной водой и лиофилизировали получением около 31 г матрикса в виде волокон. Данная методика позволяет получить лиофилизированный деминерализованный костный матрикс в виде слоев.
Недостатками данного способа является отсутствие детального описания обработки детергентом, при помощи которого предполагается удаление липидов и децеллюляризация, что значительно повышает риск иммунных реакций.
Из предшествующего уровня техники известен способ (Bone matrix compositions and methods, US 8328876 B2, Warsaw Orthopedic Inc. (US), опубл. 11.12.2012), где деминерализованный порошок помещали в раствор, содержащий 50 мМ Tris-HCI (рН 7,4), 5 мМ CaCI2 и 80 ЕД/мл очищенной бактериальной коллагеназы (соотношение 1 г порошка на 3 мл раствора) на 1 час при 37°С с перемешиванием. Далее деминерализованный костный матрикс перемешивали в течение 1 часа в 45 мл 0, 1 N уксусной кислоты при 4°С. После этого матрикс дважды промывали холодной водой в течение 30 минут и нейтрализовывали в течение 30 минут холодным фосфатно-солевым буферным
раствором. Данная методика позволяет увеличить остеоиндуктивные свойства деминерализованного костного матрикса.
Недостатками данного способа являются частичная деградация коллагена в костном матриксе и вымывание костных морфогенетических белков вследствие использования уксусной кислоты, что снижает остеоиндуктивные свойства матрикса.
Из предшествующего уровня техники известен способ (Bone graft material incorporating demineralized bone matrix and lipids, US 6565884 B2, Biomet Manufacturing LLC (US), опубл. 20.05.2003), где заранее деминерализованный костный матрикс смешивали с лецитином с итоговой массовой долей матрикса от 20 до 80% и инкапсулировали в желатин для имплантации. Данная методика позволяет увеличить остеоиндуктивные свойства деминерализованного костного матрикса.
Недостатком данного способа является использование физического смешения компонентов, что не позволяет в полной мере импрегнировать лецитин и желатин в структуру матрикса, что, в свою очередь, снижает его эффективность.
Из предшествующего уровня техники известен способ (Xenograft bone matrix for orthopedic applications, EP 1418866 A2, Aperion Biologies, Inc (US), опубл. 19.05.2004), где замороженные свиные кости промывали дезинфектантом и размораживали с последующей очисткой от мягких тканей. Проксимальный и дистальный метафизы спиливали, а диафиз распиливали на удобные для обработки сегменты, которые помещали в ванну с изопропанолом. Далее сегменты переносили в сосуд с гексаном или метанолом на 12-18 часов при постоянном перемешивании при 4°С. После двукратно промывали водой в течение 10-12 часов при постоянном перемешивании при 4°С. Далее материал подвергали обработке 1 ,5М NaCI в течение 10-12 часов при постоянном перемешивании при 4°С, а далее промывали в воде и перемалывали в порошок с диаметром < 500 мкм. Затем порошок ресуспендировали в растворе 70% изопропанола и 0,1 % Tween-20 и фильтровали через сито с последующим трехкратным повторением процедуры, что в сумме составляло 4 раза. Частицы ресуспендировали в Н202 и перемешивали в течение 4-6 часов при 4°С. Затем надосадок сливали и к порошку добавляли 0,5N HCI с перемешиванием в течение 20-24 часов при 4°С. После трехкратной промывки водой добавляли раствор α-галактозидазы для снижения иммуногенности на 4-12 часов при 4-26°С с последующим сливанием этого раствора и трехкратной промывкой водой. Финальную стадию подготовки осуществляли лиофилизацией в течение 36-38 часов. Данный способ позволяет получить гипоиммуногенный деминерализованный костный матрикс.
Недостатками данного способа являются высокая длительность процедуры и возможность получения биологического матрикса только в форме порошка.
В качестве прототипа выбран способ (Decellularization and recellularization of organs and tissues, Патент US 8470520 B2, Regents Of The University Of Minnesota (US), опубл. 25.06.2013), описывающий:
(1) Де еллюляриза ию биологической ткани полиэтиленгликолем (ПЭГ), где ткани промываются в 200 мл фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 100 ЕД/мл пенициллина, 0, 1 мг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В в течение 20 минут. Далее ткани децеллюляризируются в 35 мл ПЭГ (1 г/мл) в течение 30 минут. После этого они как минимум дважды промываются в 500 мл фосфатно-солевого буферного раствора в течение 24 часов. Далее ткани экспонируются 35 мл ДНКазы I (70 ЕД/мл) в течение 1 часа и затем промываются в 500 мл фосфатно-солевого буферного раствора в течение 24 часов.
(2) Децеллюляризацию 5% Тритоном Х-100, 0,1 % NH4OH и 0,05% трипсином, где ткани промываются в 200 мл фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 100 ЕД/мл пенициллина, 0, 1 мг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В в течение 20 минут. Далее ткани децеллюляризируются в 0,05% трипсине в течение 30 минут, а затем 5% раствором Тритона Х-100 и 0, 1 % NH4OH в 500 мл фосфатно-солевого буферного раствора в течение 6 часов. Затем ткани промываются деионизированной водой в течение 1 часа и фосфатно-солевым буферным раствором в течение 12 часов и после этого промываются трижды 500 мл фосфатно-солевым буферным раствором в течение 24 часов. Далее ткани экспонируются 35 мл ДНКазы I (70 ЕД/мл) в течение 1 часа и еще дважды промываются в 500 мл фосфатно-солевого буферного раствора в течение 24 часов.
(3) Децеллюляризацию 1 % додецилсульфатом натрия, где ткани промываются в 200 мл фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 100 ЕД/мл пенициллина, 0, 1 мг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В в течение 20 минут. Далее ткани децеллюляризируются 500 мл 1 % водного раствора додецилсульфата натрия в течение 6 часов. Затем ткани промываются деионизированной водой в течение 1 часа и фосфатно- солевым буферным раствором в течение 12 часов и после этого промываются трижды в 500 мл фосфатно-солевого буферного раствора в течение 24 часов. Далее ткани экспонируются 35 мл ДНКазы I (70 ЕД/мл) в течение 1 часа и еще трижды промываются в 500 мл фосфатно-солевого буферного раствора в течение 24 часов.
(4) Децеллюляризацию 5% Тритоном Х-100 и 0, 1 % NH4OH, где ткани промываются в 200 мл фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 100 ЕД/мл пенициллина, 0, 1 мг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В в течение 20 минут. Далее ткани децеллюляризируются в 500 мл 5% водного раствора Тритона Х-100 и 0, 1 % NH4OH в течение 6 часов. Затем ткани промываются деионизированной водой в течение 1 часа и фосфатно-солевым буферным раствором в течение 12 часов и после этого промываются трижды в 500 мл фосфатно-солевого буферного раствора в течение 24 часов. Далее
ткани экспонируются 35 мл ДНКазы I (70 ЕД/мл) в течение 1 часа и еще трижды промываются в 500 мл фосфатно-солевого буферного раствора в течение 24 часов.
Настоящий способ позволяет получить децеллюляризированный костный матрикс.
Недостатками данного способа являются недостаточная очистка и децеллюляризация больших объемов биологических тканей вследствие ограничения пропитывания толщи биоматериала используемыми реагентами, неполная отмывка и отсутствие дополнительного физического воздействия. Кроме того, весь процесс очистки и децеллюляризации биоматериала проводится при комнатной температуре в течение длительного времени без использования специальных консервантов, что повышает риск деградации биоматериала и его контаминации. Помимо этого, данная методика не позволяет провести деминерализацию биоматериала для получения матрикса с низким содержанием минеральной компоненты.
Таким образом, известные из уровня техники решения имеют важный недостаток - отсутствие одной или более стадий обработки биологического материала: первичной очистки, удаления липидов, промывки или обработки детергентами. Как правило, они не содержат необходимого количества стадий промывки либо стадии обработки детергентами. В то же время полноценная децеллюляризация и очистка инородного имплантируемого биоматериала как аллогенного, так и ксеногенного происхождения должна содержать как минимум: (1) первичную очистку костного материала; (2) удаление пахучих веществ и липидов; (3) обработку детергентами с целью децеллюляризации; (4) деминерализацию с последующей нейтрализацией рН; (5) промывку на всех этапах обработки материала; (6) финальную подготовку образца для непосредственного придания необходимой формы, включая стерилизацию. Кроме того, большинство решений подразумевает получение биологического матрикса только в качестве мелкодисперсного порошка вследствие невозможности пассивной диффузии химических реагентов вглубь объемного матрикса по причине отказа от использования любых физических воздействий. Помимо этого, решения используют неприемлемые для биологической составляющей матрикса внешние условия, при которых происходит либо денатурация белка, либо его вымывание.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является разработка эффективного и безопасного биологического матрикса для замещения дефектов костной ткани.
Поставленная задача решается за счет использования многостадийной обработки биологического материала, а именно ксеногенной или аллогенной костной ткани, при сохранении нативной трехмерной организации коллагенового каркаса, сохранения нативной аморфной формы гидроксиапатита и фосфата кальция, наличия в биологическом матриксе активных компонентов, а именно белков экстрацеллюлярного
матрикса и модифицирующих биомолекул (включая биоактивные пептиды и факторы роста).
Общим техническим результатом предлагаемой группы изобретений является получение биологического матрикса, обладающего повышенной остео- и биоинтеграцией, оптимальной скоростью биодеградации, высокой биосовместимостью, отсутствием иммунореактивности со стороны реципиента, высокой способностью к остеокондукции, выраженным остеогенным потенциалом при остеосинтезе и костной пластике. Биологический матрикс состоит из костного коллагена, гидроксиапатита и/или фосфата кальция, причем костный коллаген в настоящем матриксе представлен в нативной невосстановленной форме с полностью сохраненной трехмерной структурой, гидроксиапатит и фосфат кальция представлены в нативной аморфной форме, а сам матрикс, очищенный от клеточного дебриса, чужеродных липидов, нуклеиновых кислот и иммуногенов, содержит остаточные количества костных морфогенетических белков и может быть дополнительно модифицирован везикулярным фосфатидилхолином и/или холестерином с включенными гидролизованным коллагеном и/или ателоколлагеном и/или поли(е-капролактоном), а также различными биологически активными веществами (такими как биоактивные пептиды и факторы роста), посредством импрегнации.
Поставленная техническая задача достигается за счет использования многостадийной обработки биологического материала, а именно ксеногенной или аллогенной костной ткани, сохранения нативной трехмерной организации коллагенового каркаса, сохранения нативной аморфной формы гидроксиапатита и фосфата кальция и наличия в биологическом матриксе активных компонентов, а именно белков экстрацеллюлярного матрикса и модифицирующих биомолекул (включая биоактивные пептиды и факторы роста).
Способ получения биологического матрикса для замещения дефектов костной ткани по настоящему изобретению включает ряд последовательных стадий, в том числе: (1) предварительную обработку биологического материала; (2) грубую очистку и фракционирование; (3) глубокую очистку и экстракцию; (4) делипидирование; (5) ферментацию; (6) деминерализацию; (7) стерилизацию в сверхкритических средах.
Стадия предварительной обработки биологического материала включает замораживание биоматериала при -20 — 40°С, обработку дезинфектантами, включая раствор антибиотиков и антимикотиков, в течение 1 -72 часов при температуре 1-8°С; обработку раствором перекиси водорода в концентрации 0, 1 -5% в течение 1-72 часов при температуре 1 -8°С, причем соотношение биологической ткани к раствору составляет от 1 : 10 до 1 :40.
В одном из вариантов осуществления способа в качестве дезинфектантов используют растворы гентамицин/амфотерицин и пенициллин/стрептомицин и/или нистатин и/или фунгизон.
В одном из вариантов осуществления способа обработку дезинфектантами проводят в условиях ультразвуковой ванны при общих условиях, описанных выше.
В одном из вариантов осуществления способа обработку раствором перекиси водорода проводят в условиях ультразвуковой ванны при условиях, описанных выше.
В одном из вариантов осуществления способа раствор для предварительной обработки меняют 1 раз в час.
Стадия грубой очистки и фракционирования включает очистку биологического образца от мягких тканей и фиброзного слоя периоста; фракционирование биологического материала; отмывку в растворе перекиси водорода в концентрации 0,1 - 5% в течение 1-72 часов при температуре 1 -8°С, причем соотношение биологической ткани к раствору составляет от 1 : 10 до 1 :40.
В одном из вариантов осуществления способа очистку биологического образца от мягких тканей проводят непосредственно после стадии предварительной обработки биологического материала.
В одном из вариантов осуществления способа очистку биологического образца от мягких тканей проводят после замораживания предварительного образца при температуре -20°С.
В одном из вариантов осуществления способа фракционирование биологического материала осуществляют отделением губчатого слоя кости от кортикального слоя.
В одном из вариантов осуществления способа фракционирование биологического материала осуществляют отделением диафиза трубчатой кости от метафиза и эпифиза.
В одном из вариантов осуществления способа фракционирование биологического материала осуществляют отделением периостального и среднего слоя от эндостального, причем периостальный и средний слой отделяют на глубину 8-10 мм.
В одном из вариантов осуществления способа обработку раствором перекиси водорода проводят в условиях ультразвуковой ванны.
В одном из вариантов осуществления способа каждый из растворов для грубой очистки меняют 1 раз в час в течение всей стадии отмывки.
В одном из вариантов осуществления способа биологический образец отделяют в форме блока губчатой кости.
В одном из вариантов осуществления способа биологический образец отделяют в форме блока губчатой и кортикальной кости.
В одном из вариантов осуществления способа биологический образец отделяют в форме кортикальной пластины.
В одном из вариантов осуществления способа биологический образец измельчают до состояния крошки или мелкодисперсного порошка кортикальной и/или губчатой кости.
Стадия глубокой очистки и экстракции включает обработку в растворе ионных и амфотерных поверхностно-активных веществ; отмывку матрикса в буферных растворах
и/или деионизированной воде; нейтрализацию ионных поверхностно-активных веществ и ренатурацию белков; вторичную отмывку в буферных растворах и/или деионизированной воде; ультразвуковую экстракцию примесей.
В одном из вариантов осуществления способа в качестве ионных поверхностно- активных веществ используют додецилсульфат натрия в концентрации 0,1 -10%.
В одном из вариантов осуществления способа в качестве ионных/анионных поверхностно-активных веществ используют лаурил сульфат, Тритон Х-200, Тритон XQS- 20, Тритон QS-15, Тритон QS-44 по отдельности в концентрации 0, 1 -10% или в смеси.
В одном из вариантов осуществления способа в качестве амфотерных поверхностно-активных веществ используют (3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1 - пропансульфонат) в концентрации 0,1 -10%.
В одном из вариантов осуществления способа ионные поверхностно-активные вещества и амфотерные поверхностно-активные вещества смешиваются в соотношении от 1 :40 до 40: 1.
В одном из вариантов осуществления способа обработку в растворе комплекса ионных и амфотерных поверхностно-активных веществ проводят с использованием ультразвукового дезинтегратора.
В одном из вариантов осуществления способа обработку в растворе комплекса ионных и амфотерных поверхностно-активных веществ проводят в течение 1 -72 часов при температуре 35-41 °С.
В одном из вариантов осуществления способа непосредственно перед стадией обработки в растворе комплекса ионных и амфотерных поверхностно-активных веществ раствор вместе с биологическим материалом сонифицируют с использованием ультразвукового дезинтегратора в течение 5-30 минут при температуре 35-41 °С.
В одном из вариантов осуществления способа обработку в растворе комплекса ионных и амфотерных поверхностно-активных веществ проводят при постоянном перемешивании при орбитальной скорости 50-250 оборотов в минуту.
В одном из вариантов осуществления способа отмывку матрикса в буферных растворах и/или бидистиллированной деионизированной воде проводят в течение 1 -72 часов при температуре 1 -8°С, причем предпочтительным является фосфатно-солевой буферный раствор.
В одном из вариантов осуществления способа нейтрализации ионных поверхностно-активных веществ и ренатурацию белков проводят в растворе неионных поверхностно-активных веществ, включающего Тритон Х-100 в концентрации 0, 1 -5% и Tween-20 в концентрации 0,005-1 %.
В одном из вариантов осуществления способа для нейтрализации ионных поверхностно-активных веществ используют Твин 80, Бридж 35/56/72/76/92V/97/58P, дигитонин, дигитоксигенин по отдельности в концентрации 0,1 -10% или в смеси.
В одном из вариантов осуществления способа нейтрализацию и ренатурацию проводят при температуре 35-41 °С.
В одном из вариантов осуществления способа нейтрализацию и ренатурацию проводят при постоянном перемешивании при орбитальной скорости 100-250 оборотов в минуту.
В одном из вариантов осуществления способа вторичную отмывку в буферных растворах и/или деионизированной воде проводят в течение 1 -72 часов при температуре 1 -8°С, причем предпочтительным является фосфатно-солевой буферный раствор.
В одном из вариантов осуществления способа каждый из растворов ионных и амфотерных поверхностно-активных веществ, неионных поверхностно-активных веществ и растворов для промывки меняют 1 раз в час.
В одном из вариантов осуществления способа в промывочный раствор добавляют антибиотики и/или антимикотики.
В одном из вариантов осуществления способа ультразвуковую экстракцию примесей проводят в условиях ультразвуковой ванны.
Предпочтительным способом является сочетание перфузии ионным детергентом, в частности додецилсульфатом натрия в концентрации 1 %, растворенным в деионизированной воде, с последующей промывкой фосфатно-солевым буферным раствором и перфузией неионным детергентом, в частности Тритон Х-100 в концентрации 1 %, для удаления додецилсульфата натрия и ренатурации белков внеклеточного матрикса с последующей промывкой в фосфатно-солевом буферном растворе с антибиотиками в течение 72 часов.
В одном из вариантов осуществления способа непосредственно после отмывки в буферных растворах проводят центрифугирование костного матрикса в фосфатно- солевом буферном растворе при 300-3000 об/мин на горизонтальной центрифуге в течение 10-30 минут.
В одном из вариантов осуществления способа проводят отмывку в буферных растворах с переменной ионной силой.
В одном из вариантов осуществления способа проводят отмывку в растворе NaCI в концентрации 250-800 мМ.
В одном из вариантов осуществления способа отмывку проводят при температуре 0,5-2°С.
Стадия делипидирования включает обработку этанолом и/или смесью этанола и хлороформа; отмывку в буферных растворах или деионизированной воде или делипидирование в спиртах в условиях сверхкритических сред.
В одном из вариантов осуществления способа делипидирование проводят в смеси этанола и этилацетата, причем соотношение компонентов смеси от 1 : 1 до 1 :4 соответственно.
В одном из вариантов осуществления способа после делипидирования в спиртах проводят дополнительную обработку в растворе толуола при 35-41 °С в течение 1 -72 часов.
В одном из вариантов осуществления способа после обработки в спиртах проводят последующую обработку гидроксидом натрия в концентрации 0,5-20 г/л при температуре 1 -8°С в течение 1 -72 часов.
Причем все стадии, за исключением того, где указано противоположное, осуществляются при постоянном перемешивании на роторной качалке-шейкере в условиях холодильной камеры при температуре 1 -8°С, причем температура не должна превышать 8°С.
Стадия ферментации включает обработку в растворах ферментов - ДНКаза и/или трипсин и последующую отмывку в буферных растворах или деионизированной воде, причем обработку трипсином осуществляют с добавлением ионов магния (Мд2+) в фосфатно-солевом буферном растворе в концентрации 0, 1-2%.
В ОДНОМ ИЗ вариантов осуществления способа стадию ферментации осуществляют обработкой в растворе ДНКазы в концентрации 10-500 мкг/мл.
В одном из вариантов осуществления способа стадию ферментации осуществляют обработкой в растворе трипсина в концентрации 0,05-1 %.
В одном из вариантов осуществления способа обработку трипсином осуществляют добавлением раствора магния хлорида в концентрации 0,05-5 мМ.
В одном из вариантов осуществления способа стадию ферментации осуществляют при температуре 37°С на орбитальном шейкере при 100-250 оборотов в минуту.
В одном из вариантов осуществления способа каждый из растворов для ферментации меняют 1 раз в час.
В одном из вариантов осуществления способа непосредственно после отмывки в буферных растворах проводят центрифугирование костного матрикса в фосфатно- солевом буферном растворе при 300-3000 об/мин на горизонтальной центрифуге в течение 10-30 минут.
Стадия деминерализации включает обработку в растворе смеси сильной кислоты и неионного детергента с последующей нейтрализацией, коррекцией рН и отмывкой.
В одном из вариантов осуществления способа стадию деминерализации осуществляют при температуре 18-25°С 0,6М раствором HCI в сочетании с 1 % Тритон X- 100 в течение 1 -24 часов с дальнейшей нейтрализацией 0,5М NaOH при температуре 18- 25°С и отмывкой в буферных растворах и/или деионизированной воде в течение 1 -72 часов при температуре 1 -8°С, причем предпочтительным является фосфатно-солевой буферный раствор.
В одном из вариантов осуществления способа перед стадией деминерализации костный материал предварительно высушивают при помощи сушильного шкафа или лиофильной сушки.
В одном из вариантов осуществления способа после отмывки проводят последующую обработку гидроксидом натрия в концентрации 0,5-20 г/л при температуре 1 -8°С в течение 1-72 часов и проводят вторичную отмывку в буферных растворах и/или деионизированной воде проводят в течение 1 -72 часов при температуре 1 -8°С, причем предпочтительным является фосфатно-солевой буферный раствор.
Стадию стерилизации в сверхкритических средах проводят в условиях сверхкритического С02 при давлении 250 бар и температуре 35-41 °С в течение 1-3 часов, причем предпочтительной является температура 37-40°С.
В одном из вариантов осуществления способа изначально проводят статическое насыщение биологического материала сверхкритическим растворителем при температуре 35-41 °С в течение 1 -3 часов.
В одном из вариантов осуществления способа стерилизацию в сверхкритических средах проводят посредством постоянной подачи С02 при скорости 1 ,5-5 кг/ч.
В одном из вариантов осуществления способа соотношение объема камеры и объема стерилизуемой биологической ткани должно составлять 1 :20-1 :200.
Полученный биологический матрикс может быть импрегнирован фосфатидилхолином и/или холестерином, с включенными желатином (гидролизованным коллагеном), и/или костным ателоколлагеном, и/или поли(е-капролактоном), и/или биологически активными веществами (включая биоактивные пептиды и факторы роста), причем раствор фосфатидилхолина и/или холестерина в этаноле ресуспендируют в круглодонной колбе, водные растворы желатина и/или биологически активных веществ вносят в колбу и выпаривают в роторном испарителе для получения пленки. Далее в колбу вносят предварительно очищенный биологический матрикс и выпаривают на роторном испарителе при скорости вращения 100-300 об/мин и температуре 37°С. Причем соотношение фосфатидилхолина и/или холестерина и добавляемых веществ составляет от 1 :20 до 1 : 100 на сухую массу, соответственно.
Преимуществом добавления ателоколлагена является его уменьшенная иммуногенность. Способы получения ателоколлагена известны, и описаны, например, в заявке US 20130071645 А1 .
В одном из вариантов осуществления способа непосредственно после образования пленки раствор ресуспендируют в фосфатно-солевом буферном растворе в присутствии стеклянных шариков, после чего шарики извлекают, а полученный раствор подвергают ультразвуковой сонификации в присутствии предварительно очищенного костного матрикса с использованием погружного ультразвукового сонификатора.
В одном из вариантов осуществления способа сонифика ию осуществляют при температуре 1 -6°С в течение 2-15 минут.
В одном из вариантов осуществления способа импрегнацию биологически активными веществами проводят на стадии стерилизации в сверхкритических средах.
В одном из вариантов осуществления способа после всех стадий способа проводят лиофилизацию полученного биологического матрикса при температуре -20 - - 80°С и давлении 20-130 Па в течение 24-72 часов.
Полученный по данному способу биорезорбируемый биологический матрикс может быть применен для заполнения дефектов костной ткани или в качестве имплантата в хирургии, причем дефекты костной ткани образовались в результате хирургического вмешательства, врожденных патологий, опухолей или травм различного генеза.
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты:
- разработан способ получения биологического матрикса, обладающего повышенной остео- и биоинтеграцией, оптимальной скоростью биодеградации, высокой биосовместимостью, отсутствием иммунореактивности со стороны реципиента, высокой способностью к остеокондукции, выраженным остеогенным потенциалом при остеосинтезе и костной пластике.
- разработан биологический матрикс, который состоит из костного коллагена, гидроксиапатита и/или фосфата кальция, причем костный коллаген в настоящем матриксе представлен в нативной невосстановленной форме с полностью сохраненной трехмерной структурой, гидроксиапатит и фосфат кальция представлены в нативной аморфной форме, а сам матрикс, очищенный от клеточного дебриса, чужеродных липидов, нуклеиновых кислот и иммуногенов, содержит остаточные количества костных морфогенетических белков и может быть дополнительно модифицирован везикулярным фосфатидилхолином и/или холестерином, с включенными гидролизованным коллагеном и/или ателоколлагеном и/или поли(е-капролактоном), а также, факультативно, различными биологически активными веществами (такими как биоактивные пептиды и факторы роста), посредством импрегнации.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 Обобщенная схема способа получения биорезорбируемого биологического матрикса в предпочтительном варианте изобретения
Фиг. 2 Макрофотография поверхности биологического матрикса
Фиг. 3 Гистологический срез биологического матрикса (окраска гематоксилин- эозином)
Фиг. 4 Микроэлектронограмма поверхности биологического матрикса
Фиг. 5 Формирование костно-хрящевой мозоли на 30-е сутки
Фиг. 6 Полное сращение костной ткани на 60-е сутки
Фиг. 7 Рентгенограмма костного сращения: а - контрольная группа; b - опытная группа
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В описании данного изобретения термины «включает», «включающий» и «включает в себя» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
В качестве биологического материала для осуществления изобретения может быть использован любой фрагмент органа или ткани млекопитающего. В предпочтительном варианте изобретения используется ауто-, алло- или ксено- материал костной ткани млекопитающего.
Биоактивные пептиды или факторы роста, которые могут быть импрегнированы для повышения остеокондуктивных или остеоиндуктивных свойств в очищенный матрикс, приготовленный в соответствии с одним из вариантов изобретения, включают в себя костные морфогенетические белки (ВМР-1 , ВМР-2, ВМР-3, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-8, ВМР-9, BMP- 10, ВМР-1 1 , ВМР-12, BMP- 13, BMP- 15, ВМР-16, ВМР-17, ВМР-18), факторы роста эндотелия сосудов (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E), трансформирующие ростовые факторы бета (TGF-β-Ι, TGF-β- 2, TGF^-3), факторы стволовых клеток (SCF), тромбо итарные факторы роста (PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D), инсулиноподобные факторы роста (IGF), факторы роста фибробластов (FGF), ростовые факторы соединительной ткани (CTGF-1 , CTGF-2, CTGF-3), Остеопротегерин (sRANKL).
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример получения биорезорбируемого матрикса
Для получения эффективного и безопасного биорезорбируемого биологического матрикса для замещения дефектов костной ткани был разработан и экспериментально протестирован способ, состоящий из нескольких последовательных стадий - стадия предварительной обработки биологического материала, грубой очистки и фракционирования, глубокой очистки и экстракции, делипидирования, ферментации, деминерализации и стерилизации в сверхкритических средах.
На стадии предварительной обработки в целях очистки от остатков крови, жиров и соединительной ткани биологический образец подвергается нескольким циклам замораживания и оттаивания, обработке в растворе перекиси водорода и антибиотиков/антимикотиков (дезинфектантов), причем замораживание осуществляют при температуре -20 - -40°С, а оттаивание - при комнатной температуре на водяной бане.
На стадии грубой очистки и фракционирования в целях разделения биологического образца, в данном случае костной ткани млекопитающего, осуществляют отделение губчатого слоя от кортикального слоя и/или отделение диафиза от метафиза и эпифиза, и/или отделение периостального и среднего слоя от эндостального, причем периостальный слой отделяют на глубину 8-10 мм.
На стадии глубокой очистки и экстракции, в целях децеллюляризации и очистки от антигенов и дебриса, образец обрабатывают в растворе ионных и амфотерных поверхностно-активных веществ при температуре 37-41 °С, далее в целях осаждения поверхностно-активных веществ осуществляют отмывку в буферных растворах при температуре 1-8°С, далее производят нейтрализацию ионных поверхностно-активных веществ, причем в качестве ионных поверхностно-активных веществ используют додецилсульфат натрия и/или 3-[(3-холамидопропил) диметиламмонио]-1 - пропансульфонат в концентрации 0, 1 -10%, для нейтрализации и ренатурации используют Тритон Х-100 в концентрации 0, 1 -5% и/или Tween-20 в концентрации 0,005-1 %, а экстракцию осуществляют с использованием ультразвукового дезинтегратора.
На стадии делипидирования в целях очистки от остатков жирных кислот и липидов образец обрабатывают в растворе этанола и/или этанола-хлороформа и/или этанола- этилацетата и толуола, причем после делипидирования осуществляют обработку гидроксидом натрия в концентрации 0,5-20 г/л.
На стадии ферментации проводят обработку в растворах ДНКазы и/или трипсина, причем обработку трипсином осуществляют в присутствии магния хлорида в концентрации 0,05-5 мМ.
На стадии деминерализации осуществляют обработку раствором сильной кислоты с последующей нейтрализацией гидроксидом натрия; на стадии стерилизации в сверхкритических средах осуществляют обработку сверхкритическим С02, причем изначально проводят статическое насыщение образца сверхкритическим растворителем при температуре 35-41 °С в течение 1 -3 часов с дальнейшей постоянной подачей С02 со скоростью 1 ,5-5 кг/ч.
В целях улучшения остеоиндуктивных свойств биологического матрикса готовый очищенный биологический образец импрегнируют эмульгированным везикулярным фосфатидилхолином и холестерином с дополнительно включенными веществами. Для этого, раствор фосфатидилхолина и/или холестерина с добавками выпаривают в роторном испарителе для получения околостенной пленки, ресуспендируют в фосфатно-
солевом буфере, а импрегнацию осуществляют с использованием ультразвукового дезинтегратора. В качестве дополнительно включенных в жировые везикулы веществ используют желатин (гидролизованный коллаген), и/или костный ателоколлаген, и/или поли-(£-капролактон), а также, в предпочтительном варианте реализации, могут быть включены биологически активные вещества, такие как биоактивные пептиды или факторы роста. Вместо поли(е-капролактона) может быть использован другой биодеградируемый синтетический полимер.
Таким образом, при прохождении процедуры образец биологической ткани подвергается: (1) очистке и дезинфекции; (2) ручной или автоматизированной очистке от мягких тканей и фиброзного слоя периоста с последующим фракционированием и дезинфицирующей отмывкой; (3) стадийной обработке ионными/амфотерными и неионными детергентами с промежуточной и окончательной отмывкой; (4) делипидированию с отмывкой в случае необходимости; (5) ферментации с последующей отмывкой; (6) деминерализации с последующей отмывкой; (7) стерилизации в сверхкритических средах и (8) импрегнации эмульгированным везикулярным фосфатидилхолином/холестерином с включенными биологически активными веществами (в том числе биоактивными пептидами и факторами роста).
Вышеописанный способ позволяет получить биологический матрикс для замещения дефектов костной ткани, состоящий из костного коллагена, гидроксиапатита и/или фосфата кальция, причем костный коллаген в настоящем матриксе представлен в нативной невосстановленной форме с полностью сохраненной трехмерной структурой, гидроксиапатит и фосфат кальция представлены в нативной аморфной форме, а сам матрикс, очищенный от клеточного дебриса, чужеродных липидов, нуклеиновых кислот и иммуногенов, содержит остаточные количества костных морфогенетических белков, обладает остеокондуктивным и остеоиндуктивным потенциалом, удовлетворительными физико-механическими свойствами, является стерильным и может быть представлен в различных формах.
При этом, полученный биорезорбируемый биологический матрикс может быть представлен в форме блока, крошки, мелкодисперсного порошка, пасты, мембраны, пластины. На различных стадиях описанного способа, предпочтительно на стадии стерилизации в условиях сверхкритических сред или непосредственно после данной стадии, в биологический матрикс могут быть импрегнированы синтетический полимер поли-(е-капролактон), гидролизованный коллаген, ателоколлаген, биоактивные пептиды, факторы роста, антибиотики, антисептики, анестетики по отдельности или их комбинации, при этом данные вещества вводятся в составе жировых везикул, состоящих из фосфатидилхолина и/или холестерина.
Причем полученный биорезорбируемый биологический матрикс непосредственно перед применением может быть обогащен аутологичной стромально-васкулярной
фракцией, культурой мезенхимальных стволовых клеток, кондиционированной культуральной средой, обогащенной тромбоцитами плазмой или аутокровью. Методы приготовления стромально-васкулярной фракции и культуры мезенхимальных стволовых клеток хорошо известно специалистам, и описано в многочисленных источниках (например, в заявке WO 2016044780 А1 ).
Полученный вышеуказанным способом биорезорбируемый биологический матрикс может применяться в клинической практике, а именно в травматологии, ортопедии, стоматологии и ортодонтии для заполнения дефектов костной ткани при лечении врожденных патологий, травм различного генеза, доброкачественных опухолей, для использования в качестве имплантата и как носитель лекарственного средства.
Характеризация полученного биорезорбируемого матрикса
Опытные образцы биологического матрикса были получены из бедренной кости крупного рогатого скота. Образцы были отмыты и обработаны дезинфектантами, и приготовлены согласно вышеописанной процедуре. Костный матрикс был фракционирован на удобные для использования блоки, содержащие как кортикальный слой, так и губчатый слой.
В качестве контрольных показателей оценивали морфологию образцов, обсемененность (стерильность) костного матрикса по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) (согласно ГОСТ ISO 11737-2-201 1), содержание остаточных липидов (Базарнова Ю.Г., Теоретические основы методов исследования пищевых продуктов, 2014; Скурихина И.М., Химический состав пищевых продуктов, 1987), содержание остаточной ДНК (ДНК-Сорб-С, AmpliSens; детекцию проводили флуорометрическим методом), содержание кальция (согласно ГОСТ ISO 12081 -2013), содержание белка (по Кьельдалю по ГОСТ 938.7-68 в модификации - Фармакопейная статья МЗ РФ), уровень рН и влажности (анализатор влагосодержания МВ35, Ohaus).
Образцы костного матрикса были поделены на группы: (1) нативная ткань - костная ткань, не подвергавшаяся обработке (п=10); (2) БМ - деминерализованный биологический матрикс (п=10); (3) БМ/СКС - деминерализованный биологический матрикс, дополнительно обработанный в условиях сверхкритических сред; (4) БМ/ИМП - деминерализованный биологический матрикс, импрегнированный везикулярным фосфатидилхолином и холестерином с включенным гидролизованным коллагеном. Результаты сравнительного анализа контрольных показателей испытуемых групп представлен в таблице 1. Данные представлены как среднее и стандартное отклонение - М (о).
Таблица 1
Сравнительный анализ контрольных показателей костного матрикса
Для оценки сохранения структуры проводили ультраструктурное исследование поверхности биологического матрикса на растровом электронном микроскопе. Было показано, что после обработки биологический матрикс полностью сохраняет свою трехмерную организацию. Наиболее показательные результаты представлены на фиг. 2, 3, 4.
Поверхность скола образца представляла собой пористую структуру, состоящую из: микропор размерностью 0,5-1 мкм, которые, переплетаясь, образовывали микропористую сеть: поры размерностью 10-20 мкм, а также больших полостных образований (50-100 мкм). Поры пронизывают всю толщу образца. Инородных включений в порах не наблюдалось. На внешней поверхности пор нет, была видна щелевидная и плотная структура материала.
Для оценки остеоиндуктивности биологического матрикса использовали экспериментальную модель (Мигулева И.Ю., Две новые модели экспериментального дефекта кости на голени крысы для исследования регенерации костной ткани после пластики различными материалами, 2015).
Содержание экспериментальных животных и уход за ними в условиях вивария были стандартными и соответствовали требованиям Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996). Все манипуляции с животными проводились в соответствии со стандартами ISO 10993-1 -2003 и ГОСТ Р ИСО 10993.2-2006. При выполнении исследований были соблюдены требования приказа МЗ СССР N° 755 от 12.08.1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм
работы с использованием экспериментальных животных», приложения к приказу МЗ СССР 1М° 755 от 12.08.1977 г. «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» и Федерального закона, принятого Государственной Думой 01.12.1999 г., «О защите животных от жестокого обращения».
Наркотизированным животным открывали доступ к болыиеберцовой кости, рассекали мышечный слой и надкостницу и на передней поверхности болыиеберцовой кости выполняли пропил ближе к метафизарной зоне, где кость имеет расширение и более толстую стенку. В образовавшийся дефект вводили биологический матрикс и ушивали рану. На 30-е и 60-е сутки животных выводили из эксперимента.
Результаты исследования показали, что биологический матрикс обладает остеоиндуктивными свойствами и способен вызывать регенерацию костной ткани. На 30 сутки после имплантации во всех опытных группах наблюдается формирование костно- хрящевой мозоли. Наиболее показательные результаты представлены на фиг. 5. Через 60 суток после имплантации при полном отсутствии асептического воспаления наблюдали полное сращение и регенерацию костной ткани во всех опытных группах. Наиболее репрезентативные результаты представлены на фиг. 6. На рентгенограмме на фиг. 7 хорошо видны признаки костного сращения по сравнению с группой контроля, а образовавшаяся костно-хрящевая мозоль по плотности аналогична здоровой костной ткани болыиеберцовой кости.
Таким образом, в настоящем изобретении описан способ получения биологического матрикса для замещения дефектов костной ткани, включающий в себя стадии: (1) предварительной обработки биологического материала; (2) грубой очистки и фракционирования; (3) глубокой очистки и экстракции; (4) делипидирования; (5) ферментации; (6) деминерализации; (7) стерилизации в сверхкритических средах.
Вышеописанный биологический матрикс, состоящий из костного коллагена, гидроксиапатита и/или фосфата кальция, отличается тем, что костный коллаген представлен в нативной невосстановленной форме с полностью сохраненной трехмерной структурой, гидроксиапатит и фосфат кальция представлены в нативной аморфной форме, а сам матрикс, очищенный от клеточного дебриса, чужеродных липидов, нуклеиновых кислот и иммуногенов, содержит остаточные количества костных морфогенетических белков, обладает остеокондуктивным и остеоиндуктивным потенциалом, удовлетворительными физико-механическими свойствами, является стерильным и может быть представлен в различных формах, причем биологический матрикс может быть импрегнирован везикулярным фосфатидилхолином и/или холестерином, в который дополнительно включены желатин (гидролизованный коллаген), и/или костный ателоколлаген, и/или поли-(е-капролактон) с комплексом биологически активных веществ (таких как биоактивные пептиды или факторы роста), и дополнительно стерилизован и очищен в условиях сверхкритических сред.
Хотя настоящее изобретение было подробно описано на примерах вариантов, которые представляются предпочтительными, необходимо помнить, что эти примеры осуществления изобретения приведены только в целях иллюстрации изобретения. Данное описание не должно рассматриваться как ограничивающее объем изобретения, поскольку в этапы описанных способов и устройств специалистами в области медицинской биотехнологии и клеточной технологии и др. могут быть внесены изменения, направленные на то, чтобы адаптировать их к конкретным устройствам или ситуациям, и не выходящие за рамки прилагаемой формулы изобретения. Специалисту в данной области понятно, что в пределах сферы действия изобретения, которая определяется пунктами формулы изобретения, возможны различные варианты и модификации, включая эквивалентные решения.
ССЫЛКИ
1 . СА2690457 А1 Patent. Bone matrix compositions and methods. Keyvan Behnam, Guobao Wei, Nanette Forsyth, Todd M. Boyce, Lawrence A. Shimp, 2008.
2. EP 1418866 A2 Patent. Xenograft bone matrix for orthopedic applications. Kevin R. Stone, Thomas J. Turek, 2004.
3. Fages J, Poirier B, Barbier Y, Frayssinet P, Joffret ML, Majewski W, Bonel G, Larzul D. Viral inactivation of human bone tissue using supercritical fluid extraction. ASAIO J. 1998;44(4):289-93.
4. US 6565884 B2 Patent. Bone graft material incorporating demineralized bone matrix and lipids. Marcel E. Nimni, 2003.
5. US 7959941 B2 Patent. Bone graft comprising a demineralized bone matrix and a stabilizing agent. David Knaack, Kathy Traianedes, Michele Diegman, Nanette Forsyth, John Winterbottom, 201 1.
6. US 8202539 B2 Patent. Demineralized bone matrix compositions and methods. Keyvan Behnam, Guobao Wei, James Beisser, 2012.
7. US 8328876 B2 Patent. Bone matrix compositions and methods. Keyvan Behnam, Christopher Cioffi, 2012.
8. US 8470520 B2 Patent. Decellularization and recellularization of organs and tissues. Harald Ott, Doris Taylor, 2013.
9. US 8992964 B2 Patent. Process for demineralization of bone matrix with preservation of natural growth factors. Nancy J. Shelby, Steven M. Scott, Benjamin P. Luchsinger, Gregory A. Juda, Kelly R. Kirker, Jesus Hernandez, Darrel L. Holmes, 2015.
10. US 9029077 B2 Patent. Manufacturing method for fibrous demineralized bone matrix. Seok- beom Song, Goo-Won Jeong, Jung-Won So, Han-Sol Seo, Hyun-Seung Ryu, Giue-Nam Kim, Byoung-Suck Kim, 2015.
1 1 . US7357947 B2 Patent. Bone graft material incorporating demineralized bone matrix and
lipids. Marcel E. Nimni, 2008.
Базарнова Ю.Г. Теоретические основы методов исследования пищевых продуктов, С- Пб, 2014
Мигулева И.Ю., Савотченко A.M. Две новые модели экспериментального дефекта кости на голени крысы для исследования регенерации костной ткани после пластики различными материалами // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2015. N° 2(53)
Скурихина И.М. Химический состав пищевых продуктов, М., 1987
Claims
1 . Способ получения биорезорбируемого биологического матрикса для замещения дефектов костной ткани из биологического материала, включающий следующие последовательные стадии:
a. стадию предварительной обработки биологического материала, включающую один или более цикл его замораживания при температурах от -20 до -80 °С и оттаивания при температурах от +5 до +37 °С;
b. стадию глубокой очистки и экстракции биологического материала, включающую обработку этого материала в растворе ионного или ионного и амфотерного детергента в буферном растворе, затем, факультативно, отмывку в буферном растворе, затем дальнейшую обработку в растворе неионного детергента, за которой следует экстракция материала с использованием ультразвукового дезинтегратора;
c. стадию делипидирования биологического материала, включающую обработку материала в растворе этанола и/или этанола-хлороформа и/или этанола- этилацетата и толуола, а затем обработку гидроксидом натрия;
d. стадию деминерализации биологического материала, включающую в себя обработку материала раствором сильной кислоты с последующей нейтрализацией гидроксидом натрия;
e. стадию пропитывания, включающую в себя импрегнацию стерилизованного биологического материала везикулярным фосфатидилхолином и/или холестерином, в который включены желатин (гидролизованный коллаген), и/или костный ателоколлаген, и/или поли-(£-капролактон), а также, факультативно, могут быть включены биологически активные вещества.
2. Способ по п. 1 , характеризующийся тем, что между стадией предварительной обработки/глубокой очистки и стадией экстракции проводят дополнительную стадию грубой очистки и фракционирования биологического материала, полученного из костной ткани млекопитающего, при которой происходит частичное или полное отделение губчатого слоя от кортикального слоя и/или отделение диафиза от метафиза и эпифиза, и/или отделение периостального и среднего слоя от эндостального.
3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что частичное отделение периостального и среднего слоя от эндостального производят на глубину 8-10 мм.
4. Способ по п. 1 , характеризующийся тем, что на стадии глубокой очистки и экстракции в качестве ионного детергента используют додецилсульфат натрия и/или 3-[(3- холамидопропил)диметиламмонио]-1 -пропансульфонат в концентрации 0,1 -10%, применяемые при температуре 37-41 °С; а в качестве неионного детергента
используют Тритон Х-100 в концентрации 0, 1 -5% и/или Tween-20 в концентрации 0,005-1 %, применяемые при температуре 1 -8°С.
5. Способ по п. 1 , характеризующийся тем, что между стадиями делипидирования и деминерализации проводят дополнительную стадию ферментации обрабатываемого материала, включающую в себя обработку материала в растворах ДНКазы и/или трипсина.
6. Способ по п. 1 , характеризующийся тем, что между стадиями деминерализации и пропитывания проводят дополнительную стадию стерилизации биологического материала, включающую в себя обработку материала сверхкритическим диоксидом углерода;
7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что на стадии стерилизации биологического материала проводят статическое насыщение материала сверхкритическим диоксидом углерода при температуре 35-41 °С в течение 1 -3 часов с постоянной подачей диоксида углерода со скоростью 1 ,5-5 кг/ч.
8. Способ по п. 1 , характеризующийся тем, что на стадии пропитывания биологического материала импрегнацию осуществляют с использованием ультразвукового дезинтегратора, а в качестве биологически активных веществ используют биоактивные пептиды и/или факторы роста.
9. Способ по п. 1 , характеризующийся тем, что между стадией предварительной обработки/глубокой очистки и стадией экстракции проводят дополнительную стадию грубой очистки и фракционирования биологического материала; между стадиями делипидирования и деминерализации проводят дополнительную стадию ферментации обрабатываемого материала, включающую в себя обработку материала в растворах ДНКазы и/или трипсина; между стадиями деминерализации и пропитывания проводят дополнительную стадию стерилизации биологического материала, включающую в себя обработку материала сверхкритическим диоксидом углерода.
10. Биорезорбируемый биологический матрикс для замещения дефектов костной ткани, полученный по способу, изложенному по любому из п. п. 1 -9, состоящий из костного коллагена, гидроксиапатита и/или фосфата кальция, характеризующийся тем, что костный коллаген представлен в нативной невосстановленной форме с сохраненной трехмерной структурой; гидроксиапатит и фосфат кальция представлены в нативной аморфной форме; а сам матрикс, очищенный от клеточного дебриса, чужеродных липидов, нуклеиновых кислот и иммуногенов, содержит остаточные количества костных морфогенетических белков, обладает остеокондуктивным и остеоиндуктивным потенциалом, является стерильным и может быть представлен в различных формах.
1 1 . Биорезорбируемыи биологический матрикс по п. 10, отличающийся тем, что представлен в форме блока.
12. Биорезорбируемый биологический матрикс по п. 10, отличающийся тем, что представлен в форме крошки, мелкодисперсного порошка, пасты, мембраны или пластины.
13. Биорезорбируемый биологический матрикс по п. 10, отличающийся тем, что содержит липиды, в том числе фосфатидилхолин и/или холестерин.
14. Биорезорбируемый биологический матрикс по п. 10, отличающийся тем, что содержит синтетические полимеры, в том числе поли(£-капролактон).
15. Биорезорбируемый биологический матрикс по п. 10, отличающийся тем, что дополнительно содержит аутологичную стромально-васкулярную фракцию.
16. Биорезорбируемый биологический матрикс по п. 10, отличающийся тем, что в дополнительно содержит мезенхимальные стволовые клетки, добавленные в процессе импрегнации.
17. Биорезорбируемый биологический матрикс по п. 10, отличающийся тем, что дополнительно содержит обогащенную тромбоцитами плазму крови человека, добавленную в процессе импрегнации.
18. Биорезорбируемый биологический матрикс по п. 10, отличающийся тем, что дополнительно содержит аутокровь.
19. Биорезорбируемый биологический матрикс по п. 10, отличающийся тем, что содержит ателоколлаген.
20. Биорезорбируемый биологический матрикс по п. 10, отличающийся тем, что содержит биоактивные пептиды и/или факторы роста.
21 . Биорезорбируемый биологический матрикс по п. 10, отличающийся тем, что дополнительно содержит антибиотик, антимикотик, антисептик и/или анестетик.
22. Применение биорезорбируемого биологического матрикса по п. 10 для заполнения дефектов костной ткани или в качестве имплантата в хирургии.
23. Применение биорезорбируемого биологического матрикса по п. 22, отличающееся тем, что дефекты костной ткани образовались в результате хирургического вмешательства, врожденных патологий, опухолей или травм различного генеза.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EA201992185A EA201992185A1 (ru) | 2017-03-17 | 2017-12-04 | Биорезорбируемый биологический матрикс для замещения дефектов костной ткани и способ его получения |
US16/607,729 US20210330862A1 (en) | 2017-03-17 | 2017-12-04 | Bioresorbable biological matrix for repairing bone tissue defects and method for the production thereof |
EP17900746.3A EP3597200A4 (en) | 2017-03-17 | 2017-12-04 | BIORESORBABLE BIOLOGICAL MATRIX TO REPLACE BONE TISSUE DEFECTS AND PRODUCTION PROCESS |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017108893 | 2017-03-17 | ||
RU2017108893A RU2665962C1 (ru) | 2017-03-17 | 2017-03-17 | Биорезорбируемый биологический матрикс для замещения дефектов костной ткани и способ его получения |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2018169442A1 true WO2018169442A1 (ru) | 2018-09-20 |
Family
ID=63459977
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/RU2017/050123 WO2018169442A1 (ru) | 2017-03-17 | 2017-12-04 | Биорезорбируемый биологический матрикс для замещения дефектов костной ткани и способ его получения |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210330862A1 (ru) |
EP (1) | EP3597200A4 (ru) |
EA (1) | EA201992185A1 (ru) |
RU (1) | RU2665962C1 (ru) |
WO (1) | WO2018169442A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3866817A4 (en) * | 2018-10-18 | 2022-07-20 | Ivory Graft Ltd. | MAMMALIAN DERIVED MATRIX AS A SAFE BONE SUBSTITUTE |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2713803C1 (ru) * | 2019-01-10 | 2020-02-07 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Амурская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ децеллюризации легкого для получения внеклеточного матрикса |
RU2704114C1 (ru) * | 2019-04-24 | 2019-10-24 | Общество с ограниченной ответственностью "ЛИОСЕЛЛ" | Способ получения минерально-органического компонента костной ткани |
RU191700U1 (ru) * | 2019-05-07 | 2019-08-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Имплантат антимикробный для замещения костной ткани |
RU2721604C1 (ru) * | 2019-06-07 | 2020-05-21 | Юрасова Юлия Борисовна | Способ получения остеопластических биоматериалов из костной ткани |
RU2722266C1 (ru) * | 2019-09-13 | 2020-05-28 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Р.Р. Вредена" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Р.Р. Вредена" Минздрава России) | Лиофилизированный биологический биодеградируемый минерализованный костнопластический материал и способ его изготовления |
RU2748991C1 (ru) * | 2020-10-19 | 2021-06-02 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы» (ГБУЗ "НИИ СП ИМ. Н.В.СКЛИФОСОВСКОГО ДЗМ") | Способ насыщения коллагеном трансплантата костной ткани |
RU2765927C1 (ru) * | 2021-04-30 | 2022-02-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Композитный матрикс для иммобилизации клеток в тканеподобной биоискусственной клеточной системе и способ его пространственной трансформации в процессе иммобилизации клеток |
CN113750293A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-07 | 青岛蓝皓生物技术有限公司 | 骨修复材料的制备方法 |
CN116617471B (zh) * | 2023-07-24 | 2023-10-13 | 成都贝施美医疗科技股份有限公司 | 一种具有双层结构的口腔胶原膜及其制备方法 |
Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2104703C1 (ru) * | 1989-11-22 | 1998-02-20 | Ост-Девелоппман | Способ получения материала для остеопластики и полученный этим способом материал |
US6565884B2 (en) | 2001-09-10 | 2003-05-20 | Interpore Cross International | Bone graft material incorporating demineralized bone matrix and lipids |
EP1418866A2 (en) | 2001-03-23 | 2004-05-19 | Crosscart Inc. | Xenograft bone matrix for orthopedic applications |
US7357947B2 (en) | 2001-09-10 | 2008-04-15 | Biomet, Inc. | Bone graft material incorporating demineralized bone matrix and lipids |
CA2690457A1 (en) | 2007-06-15 | 2008-12-24 | Osteotech, Inc. | Bone matrix compositions and methods |
WO2009100454A1 (en) * | 2008-02-07 | 2009-08-13 | Biomimetic Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for distraction osteogenesis |
US7959941B2 (en) | 2001-10-12 | 2011-06-14 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Bone graft comprising a demineralized bone matrix and a stabilizing agent |
US8202539B2 (en) | 2007-10-19 | 2012-06-19 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Demineralized bone matrix compositions and methods |
US8328876B2 (en) | 2003-12-31 | 2012-12-11 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Bone matrix compositions and methods |
US20130071645A1 (en) | 2010-05-14 | 2013-03-21 | DALIM TISSEN Inc. | Method for separating atelocollagen, method for preparing modified atelocollagen, atelocollagen prepared by using the same and collagen-based matrix |
US8470520B2 (en) | 2005-08-26 | 2013-06-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Decellularization and recellularization of organs and tissues |
US8992964B2 (en) | 2007-06-01 | 2015-03-31 | Bacterin International, Inc. | Process for demineralization of bone matrix with preservation of natural growth factors |
US9029077B2 (en) | 2011-09-29 | 2015-05-12 | Cg Bio Co., Ltd. | Manufacturing method for fibrous demineralized bone matrix |
US20150190547A1 (en) * | 2005-11-01 | 2015-07-09 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Bone matrix compositions and methods |
WO2016044780A1 (en) | 2014-09-19 | 2016-03-24 | Flex Partners | Stromal vascular fraction processing devices and methods |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201215725D0 (en) * | 2012-09-04 | 2012-10-17 | Univ Leeds | Composite connective tissue and bone implants |
US9861662B2 (en) * | 2013-07-03 | 2018-01-09 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Bone-derived extra cellular matrix gel |
-
2017
- 2017-03-17 RU RU2017108893A patent/RU2665962C1/ru active
- 2017-12-04 WO PCT/RU2017/050123 patent/WO2018169442A1/ru unknown
- 2017-12-04 US US16/607,729 patent/US20210330862A1/en not_active Abandoned
- 2017-12-04 EA EA201992185A patent/EA201992185A1/ru unknown
- 2017-12-04 EP EP17900746.3A patent/EP3597200A4/en not_active Withdrawn
Patent Citations (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2104703C1 (ru) * | 1989-11-22 | 1998-02-20 | Ост-Девелоппман | Способ получения материала для остеопластики и полученный этим способом материал |
EP1418866A2 (en) | 2001-03-23 | 2004-05-19 | Crosscart Inc. | Xenograft bone matrix for orthopedic applications |
US6565884B2 (en) | 2001-09-10 | 2003-05-20 | Interpore Cross International | Bone graft material incorporating demineralized bone matrix and lipids |
US7357947B2 (en) | 2001-09-10 | 2008-04-15 | Biomet, Inc. | Bone graft material incorporating demineralized bone matrix and lipids |
US7959941B2 (en) | 2001-10-12 | 2011-06-14 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Bone graft comprising a demineralized bone matrix and a stabilizing agent |
US8328876B2 (en) | 2003-12-31 | 2012-12-11 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Bone matrix compositions and methods |
US8470520B2 (en) | 2005-08-26 | 2013-06-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Decellularization and recellularization of organs and tissues |
US20150190547A1 (en) * | 2005-11-01 | 2015-07-09 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Bone matrix compositions and methods |
US8992964B2 (en) | 2007-06-01 | 2015-03-31 | Bacterin International, Inc. | Process for demineralization of bone matrix with preservation of natural growth factors |
CA2690457A1 (en) | 2007-06-15 | 2008-12-24 | Osteotech, Inc. | Bone matrix compositions and methods |
US8202539B2 (en) | 2007-10-19 | 2012-06-19 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Demineralized bone matrix compositions and methods |
WO2009100454A1 (en) * | 2008-02-07 | 2009-08-13 | Biomimetic Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for distraction osteogenesis |
US20130071645A1 (en) | 2010-05-14 | 2013-03-21 | DALIM TISSEN Inc. | Method for separating atelocollagen, method for preparing modified atelocollagen, atelocollagen prepared by using the same and collagen-based matrix |
US9029077B2 (en) | 2011-09-29 | 2015-05-12 | Cg Bio Co., Ltd. | Manufacturing method for fibrous demineralized bone matrix |
WO2016044780A1 (en) | 2014-09-19 | 2016-03-24 | Flex Partners | Stromal vascular fraction processing devices and methods |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
BAZARNOVA YU.G., THEORETICAL FOUNDATIONS OF FOOD RESEARCH METHODS, 2014 |
FAGES J ET AL.: "Viral inactivation of human bone tissue using supercritical fluid extraction", ASAIO J, vol. 44, 1998, pages 289 - 293, XP000769941 |
FAGES JPOIRIER BBARBIER YFRAYSSINET PJOFFRET MLMAJEWSKI WBONEL GLARZUL D: "Viral inactivation of human bone tissue using supercritical fluid extraction", ASAIO J., vol. 44, no. 4, 1998, pages 289 - 93, XP000769941 |
MIGULEVA I.YU.SAVOTCHENKO A.M.: "Two new models of an experimental bone defect on the lower leg of a rat for studying bone tissue regeneration after plasty with various materials", PROBLEMS OF RECONSTRUCTIVE AND PLASTIC SURGERY, 2015, pages 53 |
See also references of EP3597200A4 |
SKURIKHINA I.M., THE CHEMICAL COMPOSITION OF FOOD PRODUCTS, M., 1987 |
VINCE ADRIANA ET AL.: "DNA extraction from archival Giemsa-stained bone-marrow slides: comparison of six rapid methods", BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY, vol. 101, no. 2, 1998, pages 349 - 351, XP055558088 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3866817A4 (en) * | 2018-10-18 | 2022-07-20 | Ivory Graft Ltd. | MAMMALIAN DERIVED MATRIX AS A SAFE BONE SUBSTITUTE |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3597200A4 (en) | 2020-12-30 |
EA201992185A1 (ru) | 2020-04-06 |
EP3597200A1 (en) | 2020-01-22 |
RU2665962C1 (ru) | 2018-09-05 |
US20210330862A1 (en) | 2021-10-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2665962C1 (ru) | Биорезорбируемый биологический матрикс для замещения дефектов костной ткани и способ его получения | |
US7811608B2 (en) | Tissue repair compositions and methods for their manufacture and use | |
JP5399264B2 (ja) | 骨成長粒子及びそれの骨誘導組成物 | |
KR102248576B1 (ko) | 세포 및 조직 성장을 촉진하기 위한 고체 기질 | |
US20220160937A1 (en) | Rapid allograft treatment systems and methods | |
JP6621539B2 (ja) | 脱細胞化生体組織マトリクス材料に基づいた骨修復のための複合材料およびそれを調製する方法 | |
EP1283693A1 (en) | Partially demineralized cortical bone constructs | |
CN108653819B (zh) | 短流程制备多孔异种骨骨粉修复材料的方法和由该方法制得的骨修复材料 | |
Zhou et al. | Repair of segmental defects with nano-hydroxyapatite/collagen/PLA composite combined with mesenchymal stem cells | |
JP2022017214A (ja) | 生体材料インプラントおよびそれを作製する方法 | |
US20220111121A1 (en) | Tissue engineering bone scaffold and preparation method thereof | |
Karalashvili et al. | Decellularized bovine bone graft for zygomatic bone reconstruction | |
RU2691983C1 (ru) | Способ очистки, модификации и стерилизации производных костной ткани и кожного матрикса с использованием сверхкритического флюида | |
EP2236544A1 (en) | Collagen Implant | |
RU2722266C1 (ru) | Лиофилизированный биологический биодеградируемый минерализованный костнопластический материал и способ его изготовления | |
RU2693606C1 (ru) | Способ получения и применения высокоочищенного минерального матрикса в виде сегментов и гранул с остеоиндуктивными свойствами для замещения костных дефектов | |
RU2721604C1 (ru) | Способ получения остеопластических биоматериалов из костной ткани | |
Mansouri et al. | The role of fish scale derived scaffold and platelet rich plasma in healing of rabbit tibial defect: an experimental study | |
Hassanzadeh Nemati et al. | Comparison of SDS and TritonX-100 effects on cell removing of bovine spongy bone for using in bone replacements | |
US20240245831A1 (en) | Development of decellularized bovine bone graft | |
RU2456003C1 (ru) | Способ получения деминерализованного костного матрикса в виде крошки | |
Miron et al. | Novel Natural Bovine Bone Graft with Integrated Atelo-Collagen Type I: Atelo-collagen Bovine Bone Mineral (ABBM) Characterization in-vivo | |
JP2023525930A (ja) | 多孔質骨代用材料 | |
AU2014259553B2 (en) | Bioactive grafts and composites | |
CN116328039A (zh) | 一种可调控炎症代谢的特定矿化度天然骨修复材料及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 17900746 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2017900746 Country of ref document: EP Effective date: 20191017 |