WO2018054944A1

WO2018054944A1 - Mikroskopbeleuchtungsanordnung zur strukturierten beleuchtung

Info

Publication number: WO2018054944A1
Application number: PCT/EP2017/073729
Authority: WO
Inventors: Christian Schumann; Cornell Peter Gonschior; Albrecht Weiss
Original assignee: Leica Microsystems Cms Gmbh
Priority date: 2016-09-21
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2018-03-29
Also published as: DE102016117803A1

Abstract

Es wird ein Mikroskop (1) mit einer einen Auflichtbeleuchtungsstrahlengang (11) mit einer optischen Achse (12) definierenden Weitfeld-Auflichteinheit (10), mit einer digitalen Bildaufnahmeeinheit (40) und mit einer Steuereinheit (50), wobei in den Beleuchtungsstrahlengang (11) eine Leuchtfeldblende eingebracht ist, die als ein auf Grundlage einer Positionsvorgabe der Steuereinheit (50) mittels eines Antriebs (18) durch Drehen um eine parallel zu der optischen Achse (12) liegende Rotationsachse (17) in unterschiedlichen Winkelstellungen positionierbares Blendenrad (100) ausgebildet ist ist, vorgeschlagen. Es ist vorgesehen, dass das Blendenrad (100) eine oder mehrere Strukturblenden trägt, die derart ausgebildet und auf dem Blendenrad (100) Weit- angeordnet ist oder sind, dass durch deren Beleuchten mittels einer Lichtquelle (13) der feld-Auflichteinheit (10) bei zwei oder mehr der unterschiedlichen Winkelstellungen durch Rotation oder Translation zumindest teilweise ineinander überführbare Beleuch- tungsmuster in einer Objektebene (23) des Mikroskops (1) erzeugbar sind.

Description

Mikroskopbeleuchtungsanordnung zur strukturierten Beleuchtung

Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Mikroskop, ein Blendenrad und ein Mikroskopieverfahren gemäß den Oberbegriffen der unabhängigen Patentansprüche.

Stand der Technik In der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie ist das Licht von Emittern außerhalb der Fokusebene ein entscheidender kontrastverringernder Faktor. Zur Kontrasterhöhung durch Reduktion solchen Lichts existiert eine Vielzahl von Verfahren auf der Grundlage der sogenannten strukturierten Beleuchtung (engl. Structured Illumination Microscopy, SIM). Ausgewählte Beispiele werden nachfolgend genannt.

In der US 6,376,818 B1 ist ein Verfahren offenbart, das umfasst, aus mehreren digitalen Bildern, die mit einem periodischen Muster in unterschiedlichen Phasenlagen überlagert wurden, ein Ergebnisbild mit erhöhtem Kontrast zu erzeugen. Das Verfahren umfasst die Schritte, ein Objekt mit einer Lichtquelle zu beleuchten und dabei ein im Wesentlichen periodisches Muster auf das Objekt zu projizieren. Nach Aufnahme eines ersten Bilds wird die Phasenlage des Musters geändert und es wird ein zweites Bild des Objekts aufgenommen. Dies wird wenigstens ein weiteres Mal wiederholt. Die aufgezeichneten Bilder werden jeweils paarweise miteinander verrechnet. Auf diese Weise kann das periodische Muster rechnerisch entfernt und ein fokussiertes, d.h. durch Licht von Emittern außerhalb der Fokusebene weitgehend unbeeinflusstes, digitales Bild erhalten werden.

Das periodische Muster wird gemäß US 6,376,818 B1 durch Verwendung einer geeigneten Beleuchtungsmaske erzeugt, die verschoben werden kann, um die unterschiedlichen Phasenlagen zu erhalten. Eine konkrete mechanische Ausgestaltung ist in der US 6,376,818 B1 allerdings nicht offenbart. ln der US 6,819,415 B2 und der US 7,335,866 B2 sind alternative Verrechnungsverfahren angegeben. Die US 6,819,415 B2 offenbart dabei zudem eine technische Ausgestaltung, bei dem die unterschiedlichen Gitterphasen durch Kippen einer planparalle- len, strukturierten Platte im Beleuchtungsstrahlengang in der Ebene der Leuchtfeldblende erzeugt werden. Die strukturierte Platte wird dabei um eine Achse gekippt, die senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs steht. Die US

8,089,691 B2 offenbart ein kombiniertes Beleuchtungs- und Detektionssystem als externes Modul für ein Mikroskop. In der US 8,089,691 B2 wird vorgeschlagen, ein in der Leuchtfeldblendenebene des Mikroskops positioniertes Gitter seitlich mit Hilfe eines Piezostellers zu verschieben.

In der wissenschaftlichen und Patentliteratur sind ferner Systeme basierend auf Beugungsgittern in einer zum Bildfeld konjugierten Ebene bekannt, die zur auflösungsstei- gernden Verrechnung der Einzelbilder genutzt werden (siehe beispielsweise M. G. Gustafsson, J. Microscopy 198, 2000, 82-87).

Sämtlichen erläuterten Realisierungen der strukturierten Beleuchtung im Stand der Technik sind der apparative Aufwand und damit die kostspielige Herstellung gemein. Wünschenswert wäre eine Realisierung mit minimalem apparativem Aufwand, die ohne aufwendige Adaptionen mit vorhandenen Mikroskopsystemen kombiniert werden kann.

Offenbarung der Erfindung Erfindungsgemäß werden vor diesem Hintergrund ein Mikroskop, ein Blendenrad und ein Mikroskopieverfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vorgeschlagen. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung. Werden nachfolgend Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Mikroskops erläutert, gelten diese grundsätzlich für das erfindungsgemäße Blendenrad und das Mikroskopieverfahren in gleicher Weise. Die Erfindung kommt in einem Mikroskop mit einer einen Auflichtbeleuchtungsstrah- lengang mit einer optischen Achse definierenden Weitfeld-Auflichteinheit, mit einer digitalen Bildaufnahmeeinheit und mit einer Steuereinheit zum Einsatz, bei dem in den Beleuchtungsstrahlengang eine Leuchtfeldblende eingebracht ist, die als ein auf Grundlage einer Positionsvorgabe der Steuereinheit mittels eines Antriebs durch Drehen um eine parallel zu der optischen Achse liegende Rotationsachse in unterschiedlichen Winkelstellungen positionierbares Blendenrad ausgebildet ist.

Sofern hier von einem„Weitfeld"-Mikroskop bzw. einer entsprechenden„Weitfeld"- Auflichteinheit die Rede ist, seien hierunter ein Mikroskop bzw. eine Auflichteinheit verstanden, in der Auflicht im Gegensatz zu einem scannenden bzw. abtastenden System in Form eines im Wesentlichen lagefesten Lichtbündels mit großem Querschnitt in die Objektebene eingestrahlt wird. Eine Weitfeld-Beleuchtungseinheit unterscheidet sich damit von einer scannenden bzw. abtastenden Beleuchtungseinheit durch die flächige (aber, wie nachfolgend erläutert, ggf. strukturierte) Beleuchtung eines Objekts im Gegensatz zu einer punktförmigen Beleuchtung.

Die Leuchtfeldblende in bekannten Weitfeld-Auflichtbeleuchtungseinrichtungen zur Fluoreszenzanregung ist häufig als Scheibe mit verschiedenen Blendenöffnungen aus- geführt, wie auch nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figur 2 erläutert. Diese wird hier auch als„Blendenrad" bezeichnet. Das Blendenrad ist in einer Leuchtfeldblen- denebene angeordnet und kann daher in die Probe abgebildet werden. Bereits in herkömmlichen Mikroskopen kann dabei durch einen geeigneten Antrieb, beispielsweise einen Schrittmotor oder einen Gleichstrommotor mit Encoder, die gewünschte Blen- denöffnung in der Leuchtfeldblendenebene im Beleuchtungsstrahlengang positioniert werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden stattdessen oder zusätzlich zu konventionellen Blenden in einem derartigen Blendenrad entweder eine Strukturblende in de- finierten unterschiedlichen Positionen oder unterschiedliche Strukturblenden in dem Beleuchtungsstrahlengang positioniert, wozu ebenfalls der Schrittmotor verwendet wird. Dieser wird ggf. zur Erzielung der erforderlichen Positioniergenauigkeit angepasst oder speziell angesteuert. Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist der, dass die Realisierung des Beleuchtungsgitters bzw. Beleuchtungsmusters und die Positionierung zur Erzeugung verschiedener Phasenlagen mit dem Mitteln dargestellt wird, die ein derartiges gat- tungsgemäßes Mikroskop, insbesondere ein Fluoreszenzmikroskop, direkt mitbringt. Es kann daher auf zusätzliche Strukturen, Blenden, Antriebe und entsprechende zusätzliche Ansteuermittel verzichtet werden.

Hierzu sieht die vorliegende Erfindung vor, dass das Blendenrad eine oder mehrere Strukturblenden trägt, die derart ausgebildet und auf dem Blendenrad angeordnet ist oder sind, dass durch deren Beleuchten mittels einer Lichtquelle der Weitfeld- Auflichteinheit bei zwei oder mehr der unterschiedlichen Winkelstellungen durch Rotation oder Translation zumindest teilweise ineinander überführbare Beleuchtungsmuster in einer Objektebene des Mikroskops erzeugbar sind.

Die Beleuchtungsmuster sind dabei„durch Rotation ineinander überführbar", wenn eine Drehung beider Muster zueinander um einen gemeinsamen Drehpunkt, der insbesondere auch außerhalb des Musters liegen kann, die Beleuchtungsmuster ineinander überführt bzw. aufeinander abbildet. Die Beleuchtungsmuster sind hingegen„durch Translation ineinander überführbar", wenn eine entsprechende Überführung bzw. Abbildung aufeinander durch eine lineare Verschiebung erzielt werden kann. Die Überführung der Beleuchtungsmuster ineinander bzw. deren Abbildung aufeinander erfolgt „wenigstens teilweise", was bedeutet, dass die Muster nicht vollständig ineinander überführt bzw. miteinander zur Deckung gebracht werden können müssen. Insbeson- dere können in Randbereichen auch nicht ineinander überführbare Anteile verbleiben. Weiter unten werden konkrete Ausgestaltungen diskutiert, die es ermöglichen, entsprechend ineinander überführbare Beleuchtungsmuster mittels eines Blendenrads zu erzeugen. Ist zuvor und nachfolgend von einer„Phasenlage" eines repetitiven Musters oder von der Veränderung einer entsprechenden Phasenlage die Rede, sei hierunter die Verschiebung des Musters gegenüber einem Ursprungsmuster oder die Verschiebung zweier entsprechender Muster zueinander verstanden. Beispielsweise weisen zwei ineinander überführbare Muster eine identische Phasenlage auf, wenn diese aufeinander abgebildet werden. Jede Verschiebung führt zu einem Versatz der Muster zueinander und damit zu einem Phasenversatz. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann eine Verschiebung der Phasenlage eines Beleuchtungsmusters lediglich durch Drehen des Blendenrads bewirkt werden. Mittel zur Ansteuerung eines entsprechenden Blendenrads sind in einem entsprechenden Mikroskop, wie zuvor angesprochen, typischerweise bereits vorhanden; daher muss lediglich ggf. der Umfang der Ansteuerung eingestellt und eine mit der Verstellung des Blendenrads synchronisierte Bildaufnahme durch ein entsprechendes Ansteuerschema realisiert werden. Selbst wenn eine Ansteuereinheit, beispielsweise ein Schrittmotor, zum Einsatz für die vorliegende Erfindung ersetzt werden muss, schafft die vorliegende Erfindung dennoch den Vorteil, dass keine zusätzlichen Bauteile vorgesehen werden müssen.

Vorteilhafterweise ist also in dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Mikroskop die Steuereinheit dazu eingerichtet, Positionsvorgaben an den Antrieb auszugeben, die diesen dazu veranlassen, das Blendenrad in den zwei oder mehr Winkelstellungen zu positionieren, und ferner Bildaufnahmesignale an die Bildaufnahmeeinheit auszuge- ben, die diese dazu veranlassen, bei jeder der zwei oder mehr Winkelstellungen zumindest ein Bild aufzunehmen. Diese Ansteuerung erfolgt, wie erwähnt, mittels bereits weitgehend vorhandener Mittel; aufwendige Adaptionen wie im Stand der Technik sind nicht erforderlich.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Strukturblenden als Strichgitter ausgebildet sind, wobei unter einem„Gitter" jegliche (teil-)repetitive Anordnung von Linien verstanden wird. Ein„Gitter" ist also nicht auf Anordnungen mit sich kreuzweise oder in bestimmten Winkeln schneidenden Linien beschränkt; auch parallel oder divergierend bzw. konvergierend verlaufende Linien, parallel angeordnete Wellen- oder Zackenmuster und dergleichen werden hier als„Gitter" bezeichnet. Bei einem Strichgitter erfolgt eine Strukturierung durch Bereiche geringerer und höherer Lichtdurchlässigkeit. Diese ist beispielsweise bei einem (im Wesentlichen) lichtundurchlässigen Linienmuster auf einer insbesondere planparallelen, transparenten (Glas-)Platte gegeben. Neben scharf begrenzten, (im Wesentlichen) lichtundurchlässigen Linien können auch Gradienten vorhanden sein oder es kann eine nur teilweise Lichtundurchlässigkeit vorliegen. In sämtlichen Fällen sind die Bereiche geringerer Lichtdurchlässigkeit als Linienstrukturen ausgebildet. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist die eine oder sind die mehreren Strukturblenden derart ausgebildet, dass in den zwei oder mehr Winkelstellungen, in denen dieselbe Strukturblende beleuchtet wird, die durch Rotation zumindest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster erzeugbar sind. In dieser Ausgestaltung wird also zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern unterschiedlicher Phasenlage die- selbe Strukturblende in definierten, leicht voneinander abweichenden (Dreh- )Positionen bzw. Winkelstellungen beleuchtet.

In einer besonders einfachen Ausgestaltung kann eine entsprechende Strukturblende mit geraden, divergierende Linien, die oder deren Verlängerungen in der Rotationsach- se des Blendenrads zusammenlaufen, versehen sein. Ein entsprechendes Beispiel ist unter Bezugnahme auf die beigefügte Figur 2 veranschaulicht. Entsprechende gerade Linien können auch beispielsweise durch gewellte oder gezackte Linien ersetzt oder um solche ergänzt sein, die ebenfalls Beleuchtungsmuster erzeugen, die durch eine Rotation um die Rotationsachse des Blendenrads aufeinander abbildbar sind. Grund- sätzlich können die oder die eine der mehreren Strukturblenden in Bezug auf die Rotationsachse radial divergierende Linienstrukturen aufweisen; wie die Form der Linien (gerade, gewellt, gezackt usw.) gestaltet ist, entscheidet der Fachmann nach Bedarf.

Der Vorteil dieser Ausführungsform ist die freie Wahl der Phasenlage (in den Grenzen der Positioniergenauigkeit) und eine Unempfindlichkeit gegenüber der genauen Positionierung der Rotationsachse des Blendenrads relativ zur optischen Achse der Weit- feld-Auflichtbeleuchtungseinheit bzw. des Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs. Auf diese Weise vereinfacht sich die Montage. Allerdings sind in dieser Ausführungsform die Anforderungen an die präzise Ansteuerbarkeit und die reproduzierbare, exakte Positio- nierung durch den verwendeten Antrieb hoch.

Alternativ dazu oder zusätzlich können auch zwei oder mehr der Strukturblenden derart ausgebildet sein, dass in den zwei oder mehr Winkelstellungen, in denen jeweils eine dieser Strukturblenden beleuchtet wird, die durch Translation zumindest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster erzeugbar sind. Im Gegensatz zu der zuvor erläuterten Ausgestaltung werden also hier zur Erzeugung der Beleuchtungsmuster unterschiedlicher Phasenlagen unterschiedliche Strukturblenden verwendet. Ein Bei- spiel hierfür ist unter Bezugnahme auf die Figur 3 veranschaulicht. Hier sind Kreisbögen vorgesehen, deren Mittelpunkt der Rotationsachse des Blendenrads entspricht, die jedoch in unterschiedlichen Gitterblenden leicht radial zueinander versetzt sind, die also unterschiedliche Radien aufweisen. Auch hier ist es nicht zwingend erforderlich, dass lediglich Kreisbögen verwendet werden. Es können beispielsweise auch gewellte Linien vorgesehen sein, die, beispielsweise mit einer konstanten Amplitude, einem entsprechenden Kreisbogen folgen. Es ist also insgesamt in dieser Ausführungsform vorgesehen, wenn die zwei oder mehr Strukturblenden Linienstrukturen aufweisen, die Kreisbögen um die Rotationsachse folgen und radial zueinander versetzt sind. Vorteil dieser Ausführungsform ist die Unempfindlichkeit gegenüber Fehlpositionierungen des Antriebs, weil eine zusätzliche Rotation des Blendenrads die Phasenlage nicht notwendigerweise ändert, sofern noch dieselbe Blende beleuchtet und in der Objektebene abgebildet wird. Insbesondere die in Bezug auf Figur 3 diskutierten Kreisbögen sind bezüglich einer derartigen Fehlpositionierung ausgesprochen tolerant. Die ge- nannte Ausführungsform erfordert jedoch, dass die einzelnen Blendengitter präzise zur Rotationsachse der Blendenscheibe und letztere präzise zur optischen Achse der Beleuchtungseinrichtung ausgerichtet werden.

Die erwähnten Linien gemäß der erläuterten Alternativen müssen nicht die einzigen Linien eines entsprechenden Liniengitters sein. Vielmehr können auch zusätzliche Linien vorgesehen sein, die die genannten Linien schneiden, zwischen diesen verlaufen usw., die aber den genannten Kriterien nicht entsprechen. Derartige Linien können beispielsweise zur Erzielung weiterer optischer Effekte vorgesehen sein und werden vom Fachmann zu diesem Zweck ausgewählt.

Wie bereits erwähnt, kommt die vorliegende Erfindung insbesondere in einem Fluoreszenzmikroskop zum Einsatz. Ist daher hier von einem„Mikroskop" die Rede, ist dieses vorteilhafterweise derart ausgebildet, dass es als Fluoreszenzmikroskop betreibbar ist. Die hierzu erforderlichen technischen Mittel kennt der Fachmann und stellt sie ohne weiteres bereit.

In einem entsprechenden Mikroskop kann die Weitfeld-Auflichteinheit, in der das Blen- denrad in einer zur Objektebene konjugierten Ebene angeordnet ist, eine köhlersche oder eine kritische Beleuchtung bereitstellen. In beiden Fällen entfaltet die vorliegende Erfindung die genannten Vorteile.

Wie erwähnt, erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Blendenrad für ein Mikroskop. Dieses ist zur Verwendung als Leuchtfeldblende für ein Mikroskop mit einer Weitfeld-Auflichteinheit ausgebildet, mit einer Rotationsachse versehen und zeichnet sich erfindungsgemäß dadurch aus, dass es eine oder mehrere Strukturblenden trägt, die eine Strukturierung durch Bereiche geringerer und als Linienstrukturen ausgebildete Bereiche höherer Lichtdurchlässigkeit aufweisen, wobei eine oder mehrere der Strukturblenden in Bezug auf die Rotationsachse radial divergierende Linienstrukturen aufweist oder aufweisen und/oder zumindest zwei der Struktur-blenden Linienstrukturen aufweisen, die Kreisbögen um die Rotationsachse folgen und radial zueinander versetzt sind. Details zu entsprechenden Linienstrukturen wurden bereits zuvor ausführlich diskutiert. Wie erwähnt, betreffen die oben bezüglich des Mikroskops erläuterten Merkmale und Vorteile das Blendenrad, das in einem entsprechenden Mikroskop eingesetzt werden kann, in gleicher weise. Insbesondere ein derartiges Blendenrad wird in einem Mikroskop eingesetzt, wie es zuvor erläutert wurde.

Dies gilt, wie ebenfalls bereits erwähnt, auch für das erfindungsgemäß vorgeschlagene Mikroskopieverfahren. Dieses zeichnet sich erfindungsgemäß dadurch aus, dass ein Mikroskop eingesetzt wird, wie es zuvor erläutert wurde. Das Mikroskopieverfahren umfasst vorteilhafterweise, das Blendenrad in den zwei oder mehr Winkelstellungen zu positionieren, durch Beleuchten mittels der Lichtquelle der Weitfeld-Auflichteinheit bei den zwei oder mehr Winkelstellungen die durch Rotation oder Translation zumindest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster in der Objektebene des Mikroskops zu erzeugen, und mittels der Bildaufnahmeeinheit bei jeder der zwei oder mehr Winkelstellungen zumindest ein Bild aufzunehmen.

Vorteilhafterweise werden die Bilder unter Verwendung eines Bildbearbeitungsalgo- rithmus bearbeitet, beispielsweise gemäß den eingangs erwähnten Druckschriften. Auf diese Weise können im Rahmen der vorliegenden Erfindung kontrastverbesserte Fluoreszenzbilder erhalten werden.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläu- tert, welche jeweils unterschiedliche Aspekte gemäß bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen.

Figurenbeschreibung In Figur 1 ist ein Mikroskop gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schematisch veranschaulicht und insgesamt mit 1 bezeichnet.

Das Mikroskop 1 , das insbesondere als Fluoreszenzmikroskop ausgebildet sein kann, umfasst eine insgesamt mit 10 bezeichnete Weitfeld-Auflichteinheit, eine insgesamt mit 20 bezeichnete Tubuseinheit, eine insgesamt mit 30 bezeichnete Beobachtungseinheit, eine insgesamt mit 40 bezeichnete digitale Bildaufnahmeeinheit und eine insgesamt mit 50 bezeichnete Steuereinheit.

Die Weitfeld-Auflichteinheit 10 definiert einen hier nur in Form der Randstrahlen des orthoskopischen Strahlengangs veranschaulichten Auflichtstrahlengang 1 1 mit einer strichpunktiert gezeichneten optischen Achse 12. Licht einer Lichtquelle 13 wird im dargestellten Beispiel in dem Auflichtstrahlengang 1 1 mittels einer Linse oder Linsengruppe 14 fokussiert. Ein jenseits des Brennpunkts der Linse oder Linsengruppe 14 in dem Auflichtstrahlengang 1 1 divergent verlaufendes Lichtbündel wird im dargestellten Beispiel mittels einer weiteren Linse oder Linsengruppe 15 kollimiert und kann über einen dichroitischen Strahlteiler 16 in ein Objektiv 24 eingestrahlt und in eine Objektebene 23 des Objektivs 24 fokussiert werden. Die Auflichteinheit 10 bzw. deren Auflichtstrahlengang 1 1 kann durch Einsatz geeigneter Optiken als Köhler-Beleuchtung, als kritische Beleuchtung oder auch als Mischform beider Beleuchtungsarten ausgeführt sein.

Im Brennpunkt der Linse oder Linsengruppe 14 liegt die Leuchtfeldblendenebene, die zu der Objektebene 23 konjugiert ist und in die ein hier mit 100 bezeichnetes Blendenrad eingebracht ist, welches um eine mit 17 bezeichnete Rotationsachse mittels eines Antriebs 18 in unterschiedlichen Winkelstellungen positionierbar ist.

Wie auch unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Figuren veranschaulicht, trägt das Blendenrad 100 eine oder mehrere Strukturblenden die derart ausgebildet und auf dem Blendenrad angeordnet ist oder sind, dass durch deren Beleuchten mittels der Lichtquelle 13 der Weitfeld-Auflichteinheit 10 bei zwei oder mehr der unterschiedlichen Winkelstellungen durch Rotation oder Translation zumindest teilweise ineinander überführbare Beleuchtungsmuster in der Objektebene 23 des Mikroskops 1 bzw. des Objektivs 24 erzeugbar sind.

Ein Beobachtungsstrahlengang, hier ebenfalls nur in Form der Randstrahlen des orthoskopischen Strahlengangs der besseren Unterscheidung halber punktiert veranschaulicht, ist mit 21 bezeichnet. Seine optische Achse ist gestrichelt gezeigt und mit 22 bezeichnet.

Die Elemente im Beobachtungsstrahlengang 21 sind stark vereinfacht gezeigt. Dies gilt auch für den Auflichtstrahlengang 10. Es können jeweils zusätzliche Elemente vorhanden sein oder gezeigte Elemente wegfallen. Es ist ein Umkehrmikroskop 1 veran- schaulicht, die Erfindung kann jedoch auch in einem regulären Mikroskop zum Einsatz kommen.

Beobachtungslicht durchtritt im dargestellten Beispiel den dichroitischen Strahlteiler 16 und wird mittels optischer Elemente 25 fokussiert und anschließend wieder kollimiert. Eine Umlenkung erfolgt an Umlenkelementen 26 wie Spiegeln oder Prismen. Mittels einer Tubuslinse 27 wird das Beobachtungslicht in eine Beobachtungseinrichtung 30 mit Okularen 31 eingestrahlt. Ein Teil des Beobachtungslichts kann beispielsweise an einem Prisma 44 oder einer anderen geeigneten Auskoppeleinrichtung ausgekoppelt und über ein optisches Element 43 in die Bilderfassungseinheit 40 mit einer Kamera 41 mit einem Bilderfassungsmedium 42, beispielsweise einem CCD-Chip, eingekoppelt werden.

Die Ansteuerung des Mikroskops, insbesondere der Bildaufnahmeeinheit 40 und des Antriebs 18 des Blendenrads 100, erfolgt mittels der Steuereinrichtung 50 in der bereits zuvor erläuterten Weise. Figur 2 zeigt ein Blendenrad 100, in dem eine Strukturblende 101 und zwei konventionelle Blenden 103, 104 gezeigt sind. Das Blendenrad 100 bildet typischerweise einen Vollkreis, der um die Rotationsachse 17, die auch hier veranschaulicht ist, in der Papierebene gedreht werden kann. Neben den gezeigten Blenden können weitere Blenden vorgesehen sein.

Die Strukturblende 101 weist in Bezug auf die Rotationsachse 17 radial divergierende Linienstrukturen auf. Durch eine Drehung, z.B. mittels des als mikroschrittfähigem Schrittmotor zur Blendenpositionierung ausgebildeten Antriebs 18 und genaue Positionierung um die Rotationsachse 17 des Blendenrads 100 lässt sich damit eine über das Bildfeld konstante Phase der strukturierten Beleuchtung realisieren. Vorteil dieser Ausführungsform ist, wie bereits oben erwähnt, die freie Wahl der Phasenlage (in den Grenzen der Positioniergenauigkeit) und eine Unempfindlichkeit gegenüber der genauen Positionierung der Rotationsachse 17 der Blendenscheibe relativ zur optischen Achse der Beleuchtungseinrichtung. Auf diese Weise vereinfacht sich die Montage in dem Mikroskop 1 .

In einer weiteren Ausführungsform, die in Figur 3 veranschaulicht ist, sind mehrere Strukturblenden 102a bis 102c vorgesehen, die jeweils Strichgitter mit Kreisabschnitten aufweisen. Der Mittelpunkt der Kreisabschnitte entspricht jeweils der Rotationsachse 17. Auch diese sind auf einem (hier nicht veranschaulichten) Blendenrad 100 angeordnet und können durch Drehung des Blendenrads 100 in den Auflichtstrahlengang 1 1 eingeschwenkt werden. Mindestens drei unterschiedliche Phasenlagen bezüglich der radialen Position sind im dargestellten Beispiel an unterschiedlichen Positionen des Blendenrads 100 vorgesehen. Durch Positionierung des Gitters der jeweiligen Phasenlage an der Leuchtfeldblendenposition können Bilder der unterschiedlichen Gitterphasen aufgenommen werden. Es handelt sich hier also um drei Strukturblenden 102a bis 102c, die Linienstrukturen aufweisen, die Kreisbögen um die Rotationsachse 17 folgen und radial zueinander versetzt sind. Vorteil dieser Ausführungsform ist die Unempfindlichkeit gegenüber Fehlpositionierungen des Schrittmotors, wohingegen jedoch die einzelnen Blendengitter präzise zur Rotationsachse ausgerichtet werden müssen, und letztere präzise zur optischen Achse der Beleuchtungseinrichtung.

In weiteren Ausführungsformen können Strukturblenden beliebige Gitter tragen, die der Rotationssymmetrie der Bewegung des Blendenrades Rechnung tragen. Das Gittermuster muss durch eine Rotation in sich selbst überführbar sein. Vorstellbar sind bei- spielsweise radialsymmetrische Karogitter mit Kanten entlang der radialen und azimutalen Richtung des Blendenrades, oder nicht notwendigerweise gerade Linienmuster, die durch Rotation einer Linie um die Mitte des Blenderades entstehen. Entsprechendes wurde bereits erläutert. Die diskutierte Beleuchtungsanordnung kann sowohl in externen Auflichtfluoreszenzbe- leuchtungseinrichtungen (z. B. als Modul, das an einen Unendlichstrahlengang ankoppelbar ist), als auch in integrierten Auflichtfluoreszenzbeleuchtungseinrichtungen eingebaut werden. Eine Berechnung des optischen Schnittbildes kann nach Aufnahme der Bilder mit unterschiedlicher Phasenlage gemäß den mehrfach erwähnten Verrech- nungsvorschriften erfolgen.

Bezugszeichenliste

I Mikroskop

10 Weitfeld-Auflichteinheit

20 Tubuseinheit

30 Beobachtungseinheit

40 Bildaufnahmeeinheit

50 Steuereinheit

I I Auflichtstrahlengang

12 optische Achse

13 Lichtquelle

14 Linse oder Linsengruppe

15 Linse oder Linsengruppe

16 dichroitischer Strahlteiler

17 Rotationsachse

18 Antrieb

Beobachtungsstrahlengang optische Achse

Objektebene

Objektiv

optisches Element

Umlenkelement

Tubuslinse

Okulare

Kamera

Bilderfassungsmedium optisches Element Auskoppelelement Steuereinheit Blendenrad

Strukturblendea Strukturblendeb Strukturblendec Strukturblende

konventionelle Blende konventionelle Blende

Claims

Patentansprüche

Mikroskop (1 ) mit einer einen Auflichtbeleuchtungsstrahlengang (1 1 ) mit einer optischen Achse (12) definierenden Weitfeld-Auflichteinheit (10), mit einer digitalen Bildaufnahmeeinheit (40) und mit einer Steuereinheit (50), wobei in den Beleuchtungsstrahlengang (1 1 ) eine Leuchtfeldblende eingebracht ist, die als ein auf Grundlage einer Positionsvorgabe der Steuereeinheit (50) mittels eines Antriebs (18) durch Drehen um eine parallel zu der optischen Achse (12) liegende Rotationsachse (17) in unterschiedlichen Winkelstellungen positionierbares Blendenrad (100) ausgebildet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Blendenrad (100) eine oder mehrere Strukturblenden (101 , 102a-102c) trägt, die derart ausgebildet und auf dem Blendenrad (100) angeordnet ist oder sind, dass durch deren Beleuchten mittels einer Lichtquelle (13) der Weitfeld-Auflichteinheit (10) bei zwei oder mehr der unterschiedlichen Winkelstellungen durch Rotation oder Translation zumindest teilweise ineinander überführbare Beleuchtungsmuster in einer Objektebene (23) des Mikroskops (1 ) erzeugbar sind.

Mikroskop (1 ) nach Anspruch 1 , bei dem die Steuereinheit (50) dazu eingerichtet ist, Positionsvorgaben an den Antrieb (18) auszugeben, die diesen dazu veranlassen, das Blendenrad (100) in den zwei oder mehr Winkelstellungen zu positionieren, und ferner Bildaufnahmesignale an die Bildaufnahmeeinheit (40) auszugeben, die diese dazu veranlassen, bei jeder der zwei oder mehr Winkelstellungen zumindest ein Bild aufzunehmen.

Mikroskop (1 ) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die eine oder die mehreren Strukturblenden (101 , 102a-102c) eine Strukturierung durch Bereiche geringerer und höherer Lichtdurchlässigkeit aufweisen. - 2 -

4. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 3, bei dem die Bereiche geringerer Lichtdurchlässigkeit als Linienstrukturen ausgebildet sind.

5. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 4, bei dem die oder eine der mehreren Struktur- blenden (101 ) derart ausgebildet ist oder sind, dass in den zwei oder mehr Winkelstellungen, in denen dieselbe Strukturblende (101 ) beleuchtet wird, die durch Rotation zumindest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster erzeugbar sind.

6. Mikroskop (100) nach Anspruch 5, bei dem die oder die eine der mehreren Strukturblenden (101 ) in Bezug auf die Rotationsachse (17) radial divergierende Linienstrukturen aufweist oder aufweisen.

7. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 4, bei dem zwei oder mehr der Strukturblenden (102a-102c) derart ausgebildet sind, dass in den zwei oder mehr Winkelstellungen, in denen jeweils eine dieser Strukturblenden (102a-102c) beleuchtet wird, die durch Translation zumindest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster erzeugbar sind.

8. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 7, bei dem die zumindest zwei Strukturblenden

(102a-102c) Linienstrukturen aufweisen, die Kreisbögen um die Rotationsachse (17) folgen und radial zueinander versetzt sind.

9. Mikroskop (1 ) nach einem der vorstehenden Ansprüche, das derart ausgebildet ist, dass es als Fluoreszenzmikroskop betreibbar ist.

10. Mikroskop (1 ) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Auflichteinheit (10) köhlersche oder kritische Beleuchtung bereitstellt.

1 1 . Blendenrad (100), das zur Verwendung als Leuchtfeldblende für ein Mikroskop

(1 ) mit einer Weitfeld-Auflichteinheit (10) ausgebildet ist, mit einer Rotationsachse (17), dadurch gekennzeichnet, dass das Blendenrad (100) eine oder mehrere Strukturblenden (101 , 102a-102c) trägt, die eine Strukturierung durch Bereiche - 3 - geringerer und als Linienstrukturen ausgebildete Bereiche höherer Lichtdurchlässigkeit aufweisen, wobei eine oder mehrere der Strukturblenden (101 ) in Bezug auf die Rotationsachse (17) radial divergierende Linienstrukturen aufweist oder aufweisen und/oder zumindest zwei der Strukturblenden (102a-102c) Linien- strukturen aufweisen, die Kreisbögen um die Rotationsachse (17) folgen und radial zueinander versetzt sind.

12. Mikroskopieverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroskop (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 10 verwendet wird.

13. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 12, das umfasst, das Blendenrad (100) in den zwei oder mehr Winkelstellungen zu positionieren, durch Beleuchten des Blendenrads (100) mittels der Lichtquelle (13) der Weitfeld-Auflichteinheit (10) bei den zwei oder mehr Winkelstellungen die durch Rotation oder Translation zumin- dest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster in der Objektebene

(23) des Mikroskops (1 ) zu erzeugen, und mittels der Bildaufnahmeeinheit (40) bei jeder der zwei oder mehr Winkelstellungen zumindest ein Bild aufzunehmen.

14. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 13, das umfasst, die Bilder unter Verwen- dung eines Bildbearbeitungsalgorithmus zu bearbeiten.