WO2018044130A1 - 새로운 탄소-탄소 결합 기반 위치 특이적으로 변형된 단백질의 제조방법 - Google Patents

새로운 탄소-탄소 결합 기반 위치 특이적으로 변형된 단백질의 제조방법 Download PDF

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WO2018044130A1
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carbon
iodopropyl
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PCT/KR2017/009629
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박희성
이희윤
양애린
하수라
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한국과학기술원
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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a modified protein at a specific position, and more particularly, (a) adding a amino acid at a specific position of a target protein to label a position to be modified with a substance having a reactor; (b) activating the label of the position; And (c) attaching a post translational modification (PTM) moiety to the activated label to obtain a modified protein.
  • PTM post translational modification
  • Posttranslational modifications not only play an important role in expanding the diversity of protein function, but also have a number of important effects on biological activity (CT Walsh et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 44. pp. 7342-72, 2005). Proteins with specific modifications at specific sites are essential for studying basic biological mechanisms. There is no current method for producing a covalently modified protein that is present in a variety of nature.
  • the inventors of the present invention have developed a method for preparing a protein phosphorylated using a SepRS variant and an EF-Tu variant in Korean Patent No. 10-2016-0053885.
  • the above method has a disadvantage in that only phosphorylation of a large number of PTM present in the protein in the cell can be chemically incorporated at a desired position, and therefore, various types of PTM cannot be chemically incorporated, and phosphoamino acids are unstable under alkaline conditions. It is known that (Y. Oda et al., Nat. Bioechnol. Vol. 19, pp. 379-82, 2001).
  • the inventors have made intensive efforts to produce modified proteins with specific odors.
  • the present inventors labeled specific positions of target proteins with phosphorylated amino acids, and then activated them in alkaline conditions, and then in the presence of transition metals.
  • a halogenated compound containing a modification it was confirmed that a specific position-modified protein having the same effect as the PTM present in a real cell can be prepared, and the present invention was welcomed.
  • Another object of the present invention is to provide a reagent composition for attaching a post-translational modification group to a protein of interest, including an alkyl halide and a transition metal.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a reagent composition for attaching a post-translational modification group to a protein of interest, including alkyl halides and transition metals.
  • the present invention comprises the steps of (a) adding a amino acid at a specific position of the target protein to modify the position with a substance having a reactor; (b) activating the label of the position; And (c) attaching a post translational modification (PTM) moiety to the activated label to obtain a modified protein.
  • PTM post translational modification
  • the present invention also includes the steps of (a) adding a phosphoserine (Sep) to a specific position of the target protein; (b) treating the target protein to which phosphoserine has been added with a base (alkiali) to replace phosphoserine with dehydroalanine (Dha) to activate it; And (c) reacting the halogen compound containing the Dha with a post translational modification (PTM) moiety in the presence of a transition metal catalyst to carbon-carbon bond the post-translational modification group to produce a modified protein.
  • PTM post translational modification
  • the present invention also includes the steps of (a) adding a phosphoserine (Sep) to a specific position of the target protein; (b) treating the target protein with a base (alkiali) to replace phosphoserine with dehydroalanine (Dha) to activate it; And (c) reacting the halogen containing the Dha with a fluorescent label in the presence of a transition metal catalyst to carbon-carbon bond the post-translational modification functional group to obtain a modified protein. It provides a method for producing a target protein.
  • a phosphoserine Sep
  • Dha dehydroalanine
  • the present invention also provides a reagent composition for attaching a post-translational modification group to a protein of interest, including an alkyl halide and a transition metal.
  • Figure 1 (A) is a schematic diagram showing the three-step process of the present invention
  • (B) is a schematic diagram showing the concept of a carbon-carbon coupling in the novel protein used in the third step of the present invention.
  • Figure 2 (A) is a MALDI-TOF result of analyzing the result of methylation of the 79th residue of histone H3 by the method of the present invention, (B) is a Western blot result of detecting the modified protein of (A), (C) is the chemical structural formula of lysine modified with lysine and each other residue (monomethyl, dimethyl and trimethyl).
  • FIG. 3 (A) is a conceptual diagram showing the process of the in vitro transcription assay performed in the present invention, (B) is the result of analyzing the effect of 79th lysine methylation of histone H3 on chromosomal transcription, (C) Is the result of analyzing the effect of 79th lysine methylation of histone H3 on chromosome acetylation by p-300, (D) is a schematic diagram showing the transcriptional activation process by 79th lysine methylation of histone H3.
  • Figure 4 shows the chemical structure of the alkyl iodides (alkyl iodides) used in the present invention
  • 1-5 is for generating a PTM functional group
  • 13 is for connecting a fluorescent die
  • 6-12 is a commercial product to be.
  • FIG. 5 shows MALDI-TOF MS results of analyzing proteins with formylation (top panel) and alkylation (bottom panel) of the 79th lysine of histone H3 prepared by the method of the present invention.
  • Figure 6 shows the results of MALDI-TOF MS analysis of ubiquitylated lysine modified (acetylation and various methylation) attachment proteins prepared by the method of the present invention.
  • FIG. 8 shows the result of confirming that fluorescence is actually expressed after attaching the 13th alkyl iodide of FIG. 4 to the 33rd position by the method of the present invention.
  • Figure 9 (a) is a result of confirming the carbon-carbon bond reaction conditions according to various types of reaction buffer, (b) is the carbon-carbon bond reaction conditions for each pH of sodium citrate and sodium acetate showing the reaction effect among them This is the result of checking.
  • Figure 10 (a) is a result of confirming the carbon-carbon bond reaction conditions according to the form and amount of zinc (Zn) in the transition metal, (b) is the carbon-carbon bond according to the shape and concentration of copper (Cu) This is the result of checking reaction conditions.
  • Figure 11 (a) is a result of confirming the carbon-carbon bond reaction conditions for each concentration of the surfactant Trinton X-100, (b) is a result of confirming the carbon-carbon bond reaction conditions for each concentration of TPGS (TOcopheryl polyehtylene glycol succinate) (C) is the result of confirming the carbon-carbon bond reaction conditions for different concentrations of the surfactant.
  • TPGS TOcopheryl polyehtylene glycol succinate
  • TMEDA tetramethylethylenediamine
  • Figure 13 (a) is a result of confirming the carbon-carbon bond reaction conditions for each type of acid concentration light, (b) is a result of confirming the carbon-carbon bond reaction conditions for each type and concentration of Lewis acid.
  • a new carbon-carbon bond was produced to determine whether a modification could be attached to a desired position of the target protein.
  • PTM posttranlsational modification
  • histone H3Sep79 was prepared by incorporating phosphoserine (Sep) at the 79th position of histone H3. Then, taking advantage of the fact that the phosphoamino acids are unstable at base conditions, the alkaline solution was treated to activate Sep with dehydroalanine (Dha). Treat the activated Dha with a transition metal catalyst (Zn, Cu), react the alkyl iodides containing PTM, attach the PTM to the Dha, and place the desired PTM on the 79th position of histone H3 (e.g., For example, by obtaining a modified protein (trimethylation) attached (FIGS. 1 and 2), it was confirmed that the modified protein can perform the same function as the actual modified protein (FIG. 3). .
  • Dha Sep with dehydroalanine
  • Zn, Cu transition metal catalyst
  • the present invention comprises the steps of: (a) adding a amino acid at a specific position of the target protein to modify the position with a substance having a reactor; (b) activating the label of the position; And (c) attaching a post translational modification (PTM) moiety to the activated label to obtain a modified protein.
  • PTM post translational modification
  • post translational modification (PTM) refers to a specific compound in the residue portion of the amino acid synthesized after synthesis of the protein (a step of translating mRNA transcribed in the DNA is synthesized into the amino acid primary chain) It means binding, and is used in the same sense as protein modification.
  • the post-translational modification moiety can be used as long as it is a functional group of PTM of a commonly known protein, but preferably acylation, acetylation, and monomethylation ), Di-methylation, tri-methylation, amidation, butyrylation, carboxylation, glycosylation, and formylation ), Hydroxylation, aodation, oxidation, phosphorylation, propionylation, succinylation, sulfate, Glycation, Carbonylation, Formylation, Ubiquitination, Sumoylation, Nedlation Nitrolation It may be characterized in that it is generated by a reaction selected from the group consisting of ation, lipidation, biotinylation, pegylation and perfusion, but is not limited thereto.
  • the post-translational modification functional group may also be characterized as alkylation, wherein the alkylation may be used in all chemical reactions to prepare an atomic group in which one hydrogen atom is removed from an aliphatic saturated hydrocarbon, preferably Mono-methylation, di-methylation, tri-methylation, acetylation, formylation, ethylation, propylation, amylation, hexylation, heptyl It may be characterized in that selected from the group consisting of ration, octylation, nonylation and decylation, but is not limited thereto.
  • the amino acids added in step (a) may be used as long as they all have amino acids having a reactive group that can be activated by a chemical reaction, preferably non-natural amino acids, and most preferably phosphoserine ( phosphoserine, Sep), but is not limited thereto.
  • the method of adding Sep may be used without limitation as long as it is a method capable of incorporating Sep at a specific position of the target protein, and preferably may be the method described in Korean Patent No. 10-2016-0052369. More preferably, O-phosphoseryl specialized for tamino Sep recognizing at least one codon in mRNA of a protein of interest and aminoacylating phosphoserine (Se) in the tRNA Sep. -tRNA synthetase, SepRS) variants and Elongation factor Tu (EF-Tu) variants, which protect the tRNA Sep and SepRS complexes from deacylation, expressing mRNA encoding a protein of interest. It may be, but is not limited thereto.
  • the SepRS variant may be characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the Ef-Tu variant may be characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the tRNA Sep may be characterized by being represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • step (b) may be used as long as it is a method capable of activating the labeling substance, and preferably, may be activated by removing a reactor of the labeling substance.
  • the reactor for the labeling substance may be characterized in that the phosphoric acid group.
  • the removal of the reactor may be performed by treating a base (alkali) and a catalyst (catalyst), but is not limited thereto.
  • the base can be used without limitation as long as it is a compound that releases OH-ion in an aqueous solution, preferably lithium hydroxide (LiOH), barium hydroxide (Ba (OH) 2 ), strontium hydroxide (Sr (OH)). 2 ), magnesium hydroxide (Mg (OH) 2 ), calcium hydroxide (Ca (OH) 2 ), radium hydroxide (Ra (OH) 2 ), and beryllium hydroxide (Be (OH) 2 ) You can do
  • the attachment of the post-translational functional group in step (c) may be performed by a carbon-carbon bond with a label in which the radical of the functional group is activated in the presence of a transition metal.
  • the phosphorylated reactor is dehydroalanine. Converted to.
  • the converted dihydroalanine (Dha) has an alkene reactor, which can act as a radical acceptor, and applies a known transmetalation reaction of water-based transition metals to the desired post-translational reactor.
  • Reactor-rials are prepared by converting halogen compounds containing (PTM moiety) into transition metal catalysts, which are then bound to the radical acceptor Dha to attach a new carbon-carbon bond based PTM moiety to the target protein. .
  • the conditions of the carbon-carbon bond may be different depending on the characteristics of the target protein, when the target protein is histone, it may be characterized in that it is performed at pH 4.0 ⁇ 5.0.
  • the transition metal may be selected from the group consisting of zinc, copper, iron, gold, silver, mercury, cobalt, manganese and nickel.
  • the post-translational modification functional group can be used without limitation as long as it is a compound in which the functional group can be radically modified by transmetallization, and preferably, it is a compound represented by the following Chemical Formula 1 have:
  • R is hydrogen atom, alkyl group, cycloalkyl group, C2-C6 alkenyl group, C2-C6 alkynyl group, alkoxy group, C1-C6 alkylsulfonyl group, C1-C6 alkylcarbonyl group, C1-C6 alkoxycarbonyl group, C3-C6 cycloalkyl Carbonyl group, carboxyl group, hydrocarbonyl group, amino group, alkylamino group, arylamino group, alkoxycarbonylamino group, aryloxycarbonylamino group, hydrocarbonylamino group, alkylcarbonylamino group, arylcarbonylamino group, alkylthio group, arylthio group, sia No, wherein the alkyl group is C1-C6, the alkoxy group is C1-C6, the aryl group is C6-C14, phosphoryl group, succinyl group, formyl group, acyl
  • X is halogen
  • the compound is 3-iodo-N-methylpropan-1-amine hydrochloride, 3-iodo-NN-dimethylpropane-1 3-Iodo-NN-dimethylpropan-1-amine hydrochloride, 3-Iodo-NNN-trimethylpropan-1-amine hydrochloride, N- (3-iodopropyl) formamide, N- (3-iodopropyl) acetamide, 5- (dimethylamino ) -N- (2-((3-iodopropyl) amino) ethyl) naphthalene-1-sulfonamide hydrochloride) (5- (dimethylamino) -N- (2-((3-iodopropyl) amino) ethyl) naphtalene-1-sulfonamide hydrochlaride)), iodobutane, 2-iodopropane, 2-iodo-2-methylpropane,
  • the halogen may be selected from the group consisting of fluorine, chlorine, bromine and iodine, but is not limited thereto.
  • E. coli comprising X.Laevis histone H3 mRNA containing UAG at the codon encoding the 79th amino acid, and His 6- Tag at the C-terminus, SepRS9 and EF-Sep21 By expression, histone H3Sep79 protein was produced.
  • Histone H3 K79me3 was prepared by treating the hisotne H3 Dha79 with sodium powder, Cu (OAc) 2 , Triton X-100 and TMEDA in sodium acetate buffer (pH 4.5) (FIG. 2).
  • the present invention in another aspect, the method comprising the steps of (a) adding a phosphoserine (Separ) to a specific position of the target protein; (b) treating the target protein to which phosphoserine has been added with a base (alkiali) to replace phosphoserine with dehydroalanine (Dha) to activate it; And (c) reacting the halogen compound containing the Dha with a post translational modification (PTM) moiety in the presence of a transition metal catalyst to carbon-carbon bond the post-translational modification group to produce a modified protein.
  • PTM post translational modification
  • the base can be used without limitation as long as it is a compound that releases OH-ion in an aqueous solution, preferably lithium hydroxide (LiOH), barium hydroxide (Ba (OH) 2 ), strontium hydroxide (Sr (OH)). 2 ), magnesium hydroxide (Mg (OH) 2 ), calcium hydroxide (Ca (OH) 2 ), radium hydroxide (Ra (OH) 2 ), and beryllium hydroxide (Be (OH) 2 ) You can do
  • the transition metal may be selected from the group consisting of zinc, copper, iron, gold, silver, mercury, cobalt, manganese and nickel.
  • the present invention also relates to a reagent composition for attaching a post-translational modification group to a protein of interest, comprising an alkyl halide and a transition metal.
  • the alkyl halide is 3-iodo-N-methylpropan-1-amine hydrochloride, 3-iodo-NN-dimethylpropane- 3-Iodo-NN-dimethylpropan-1-amine hydrochloride, 3-Iodo-NNN-trimethylpropan-1-amine hydrochloride , N- (3-iodopropyl) formamide, N- (3-iodopropyl) acetamide, 5- (dimethyl Amino) -N- (2-((3-iodopropyl) amino) ethyl) naphthalene-1-solfonamide hydrochloride (5- (dimethylamino) -N- (2-((3-iodopropyl) amino) ethyl) naphtalene-1-sulfonamide hydrochlaride)), iodobutane, 2-iodopropane, 2-iodo-2-methylpropane hydroch
  • the transition metal may be selected from the group consisting of zinc, copper, iron, gold, silver, mercury, cobalt, manganese, and nickel, but is not limited thereto.
  • the reagent composition may be characterized in that it further comprises a surfactant, the surfactant is characterized in that selected from the group consisting of Trition X-100, TPGS, Tween20, Tween80, IGEPAL and Brij35 It may be, but is not limited thereto.
  • the reagent composition may be characterized in that it further comprises TMEDA.
  • the target protein is histone and the PTM functional group to be attached is methylation
  • alkyl iodide zinc powder, Cu (OAc) 2 , Triton X-100, TMEDA, and sodium acetate are used. It may be characterized by including.
  • the post-translational modification functional group is dansyl iodide, 5- (dimethylamino) -N- (2-((3-iodopropyl) amino) ethyl) naphthalene010sulfonamide,
  • dansyl iodide 5- (dimethylamino) -N- (2-((3-iodopropyl) amino) ethyl) naphthalene010sulfonamide
  • the present invention provides a method for preparing a pharmaceutical composition comprising: (a) adding phosphoserine (Sep) to a specific position of a target protein; (b) treating the target protein with a base (alkiali) to replace phosphoserine with dehydroalanine (Dha) to activate it; And (c) reacting the halogen containing the Dha with a fluorescent label in the presence of a transition metal catalyst to carbon-carbon bond the post-translational modification functional group to obtain a modified protein. It relates to a method for producing a target protein.
  • all the compounds may be used as long as the compound has a post-translational functional group capable of fluorescing at a specific wavelength, preferably 5- (dimethylamino) -N- (2-((3 Iodopropyl) amino) ethyl) naphthalene-1-sulfonamide hydrochloride) (5- (dimethylamino) -N- (2-((3-iodopropyl) amino) ethyl) naphtalene-1-sulfonamide hydrochlaride)) It can be characterized.
  • Alkyl iodides were synthesized by the following method. Since mono methylated iodides are easily cycled to acetidine in the base group, boc protection, Appel reaction and deprotection were applied sequentially to obtain mono methylated iodide hydrochloride salt. Dimethylated iodides were obtained via S N 2 reactions (including Finkelstein reaction) and halogen substitution reactions of alkyl chlorides. Sodium iodide is dissolved in acetone, but since sodium chloride is insoluble, the reaction proceeds to yield the product through precipitation of insoluble salts.
  • Trimethylated iodide methylated dimethylamino propanol to prepare quaternary ammonium salts, and then heated in aqueous hydriodic acid to give trimethyl amino propyl iodide.
  • quaternary ammonium salts Trimethylated iodide methylated dimethylamino propanol to prepare quaternary ammonium salts, and then heated in aqueous hydriodic acid to give trimethyl amino propyl iodide.
  • Boc anhydride (0.27ml, 1.15mmol) and triethylamine (TEA, 0.18ml, 1.27mmol) and 3- (methylamino) -1-pro-panol (0.10ml, 1.06mmol) in 3.50ml of methanol were added at room temperature.
  • the mixture was mixed overnight and then treated with NaHCO 3 .
  • the reaction was diluted with EtOAc and then the organic layer was extracted three times with EtOAc (15 ml).
  • the organic layer was dried over MgSO 4 , filtered and compressed into in vacuo .
  • Triphenylphsophine 131.1mg, 0.5mmol
  • imidazole 34.03mg, 0.5mmol
  • iodine 126.9mg, 0.5mmol
  • the wild type histone H3 was prepared by cloning the pCDFDuetH3wt vector from pCDFDuet (Novagen) carrying the Xenopus laevis histone H3 gene and the C-terminal His6 tag between BamHI and AscI cleavage sites.
  • pCDFDuet-H3wt vector was inserted into a codon position encoding the 79th amino acid by nested PCR to prepare a pCDFDuet-H3K79TAG vector, and then the Sep inclusion system (pKD-SepRS9-EFSep21, pETDuet-SepRS9-sepT) After transforming E. coli BL21 (DE3), the vector was expressed by a known method to obtain a protein.
  • the obtained protein was purified by Ni 2+ -NTA agarose column chromatography, followed by dialysis in water with 3 mM ⁇ -mercaptoethanol, and lyophilization. If necessary, the histone protein obtained by the above method was further purified by reversed-phase HPLC.
  • the ubiquitin gene was inserted next to the C-terminal His6-tag, TAG was inserted at the position encoding the amino acid at the 33rd position, to prepare a pCDFDuet-UB33TAG vector, which was then expressed in E. coli and ubiquitated, A histone protein containing Sep at the 33rd position was prepared.
  • pCDFDuet-GFP204TAG vector was prepared by inserting a TAG at the 204th amino acid position of the GFP gene having the C-terminal His6-tag, expressed in E. coli, and purified in the same manner to obtain a protein.
  • H3Sep79 (0.3 mg / ml) purified in Example 2 was reacted with various concentrations of LiOH, Ba (OH) 2 or Sr (OH) 2 at room temperature. 0.5 mM dithiothreitol (DTT) was added to prevent any possible oxidation and side reactions. The reaction mixture was mixed for 30 minutes, neutralized with the same amount of acetic acid, and then subjected to dialysis overnight with distilled water.
  • DTT dithiothreitol
  • H3Dha79 (20 ⁇ M), alkyl iodide (3 mM), and metal 0.1 mg zinc powder and 0.1 mM Cu (OAc) 2 ) were reacted in 20 ⁇ l reaction solution. It was confirmed that it is not.
  • Triton X-100 Triton X-100
  • Reactions involving 0.1 wt% triton X-100 were performed at various pH conditions (5.0-9.0) in various buffers (sodium citrate, sodium acetate, ammonium acetate, sodium phosphate, HEPES and potassium phosphate).
  • TEDA Tetramethylethylenediamine
  • HCl and NH 4 Cl HCl and NH 4 Cl
  • Lewis acids eg AuCl 3 and LiClO 4
  • the final reaction was electrophoresed on 15% SDS-PAGE, then transferred to a nitrocellulose membrane, and diluted 1000-fold with anti-H3K79me1, anti-H3K79me2 and anti-H3K79me3 antibodies of Abcam.
  • FIG. 2B it was confirmed that the methyl group binds to the 79th lysine of histone H3 as desired.
  • histone H3wt and modified histone H3 were determined by MALDI-TOF mass spectrometry.
  • the reaction solution containing sinapinic acid (sinapinic acid), 0.1% TFA, 50% acetonitrile was mixed with the protein to be analyzed at a ratio of 1: 1, and then 1 ⁇ l was collected and dropped on ground steel MTP384 for analysis.
  • the analyzer used was a Bruker Autoflex III MALDI-TOF mass spectrometer, the analysis mode was a reflection mode, and the molecular mass of the histone was reconfirmed using the linear positive ion mode.
  • the target protein was trypsinized and fragmented and then analyzed. Trypsin treatment electrophoresed the target protein in 15% SDS-PAGE, followed by cutting off the protein bands and treating the band with trypsin. It was.
  • Equal amounts of lyophilized histone proteins (H4, H2A, H2B and H3wt, or H3K79me1, H3K79me2, H3K79me3) were added to the unfolding buffer (8M guanidium chloride in 20 mM NaOAC, pH 5.2 and 10 mM DTT) and mixed. Thereafter, dialysis was performed in 4 ° C. refolding buffer (10 mM Tris-Hcl (pH 7.5), 2M NaCl, 1 mM EDTA, and 5 mM ⁇ -mercaptoethanol).
  • Histone octamers were isolated via superdex 200 gel filtration, and histone octamers were reassembled using PGEM-3z / 601 plasmid. Chromatin was reconstructed using histone octamer, p53ML plasmid, ACF and NAPi proteins.
  • the chromatin template (8 ⁇ l, 40 ng DNA) containing H3wt or H3K79-methylated histones and the p53ML plasmid (having five p53 protein binding sites and a 390-nucleotide G-less cassette and adenovirus major late promoter) was added to the p53 (20 ng) protein.
  • 0.5XHAT buffer (10MM Hepes (pH7.8), 30mM KCl, 2.5mM DTT, 0.2mM EDTA and 5mM sodium butyrate) were incubated at 20 ° C. for 20 min in total for 20 min.
  • the reaction was reacted with p300 (10 ng) protein and 20 ⁇ M acetyl-CoA at 25 ° C. for 30 minutes in total 25 ⁇ l reaction conditions, then 5 ⁇ l HeLa nuclear extracts (01 mg / m), 1 ⁇ l DTT (250 mM), 2.5 ⁇ l 20X RB buffer (400mM Hepes (ph 7.8), 120mM MgCl 2 ) and BC200 buffer (20mM Tris (pH7.9), 200mMKCl, 0.2mM EDTA and 20% glycerol) were added to bring the final KCl concentration to 65mM in the overall 45.5 ⁇ l reaction. The reaction was added at 30 ° C. for 20 minutes to form a pre-initiation complex.
  • the reaction was stopped by administering 150 ⁇ l of stop buffer (150 mM sodium acetate (pH 5.2), 0.5% SDS, 10 mM EDTA), and 30 ⁇ g of proteinase K was added thereto, followed by incubation at 37 ° C. for 30 minutes.
  • stop buffer 150 mM sodium acetate (pH 5.2), 0.5% SDS, 10 mM EDTA
  • 30 ⁇ g of proteinase K was added thereto, followed by incubation at 37 ° C. for 30 minutes.
  • chromatin containing histones without methylation showed low levels of transcriptional activity, while methylated chromatin showed high levels of transcriptional activity (FIGS. 3B and C). ).
  • Example 6 The reconstituted chromatin (35 ⁇ l, 350 ng DNA) in Example 6 was reacted with p53 protein at 30 ° C. for 20 minutes, followed by a total of 40 ⁇ l reaction conditions for 30 minutes at 30 ° C. with p300 protein and 1uCi3H labeled acetyl-coenzyme A. After further incubation, electrophoresis on SDS-AGE, and aceylation activity was measured by autoradiography.
  • the method for preparing a site-specifically modified target protein according to the present invention not only adds a desired modification at a desired position of the target protein, but also has the same effect as the target protein in which the modification has been added. It is useful for functional studies of target proteins, drug screening, and the like.

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Abstract

본 발명은 특정 위치가 변형된(modified) 목적 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (a) 목적 단백질의 특정 위치에 아미노산을 첨가하여 변형시킬 위치를 반응기를 가지는 물질로 표지하는 단계; (b) 상기 위치의 표지를 활성화시키는 단계; 및 (c) 상기 활성화된 표지에 번역후변형(post translational modification, PTM) 작용기(moiety)를 부착시켜 변형된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 새로운 탄소-탄소 결합 기반 위치 특이적으로 변형된 목적 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 위치 특이적으로 변형된 목적 단백질의 제조 방법은 목적 단백질의 원하는 위치에 원하는 변형(modification)을 추가할 뿐만 아니라, 변형이 추가된 목적 단백질이 세포 내에 존재하는 목적 단백질과 동일한 효과를 나타내어 목적 단백질의 기능연구, 신약 스크리닝에 등에 유용하다.

Description

새로운 탄소-탄소 결합 기반 위치 특이적으로 변형된 단백질의 제조방법
본 발명은 특정 위치가 변형된(modified) 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (a) 목적 단백질의 특정 위치에 아미노산을 첨가하여 변형시킬 위치를 반응기를 가지는 물질로 표지하는 단계; (b) 상기 위치의 표지를 활성화시키는 단계; 및 (c) 상기 활성화된 표지에 번역후변형(post translational modification, PTM) 작용기(moiety)를 부착시켜 변형된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 새로운 탄소-탄소 결합 기반 위치 특이적으로 변형된 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
번역후변형(postranslational modifications, PTMs)은 단백질 기능의 다양성을 확장시키는데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 생체 활동에서 여러 가지 중요한 영향을 미친다(CT Walsh et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. Vol.44 pp. 7342-72, 2005). 특정 위치에 특정 변형을 가지는 단백질은 기초적인 생물학적 기작을 연구하는데 있어서 필수적인 요소이다. 자연상에 다양하게 존재하는 공유굘합적으로 변형된 단백질을 제조할 수 있는 방법은 현재 존재하지 않는 실정이다.
특정 변형을 가지는 재조합 단백질을 생산함에 있어서 유전코드를 확장시키는 것은 유용한 방법이지만(K. Lang et al., Chem. Rev. Vol.114, pp. 4764-4806, 2014; CC Liu et al., Annu. Rev. Biochem. Vol.79, pp. 413-44, 2010), 일반적이지 않은 아미노산의 아실레이션을 위한 tRNA 합성효소 및 orthogonal tRNA 쌍이 필요하다는 단점이 있다. 이외에도 상당한 기술발전이 있었지만, 여전히 생체내에서 중요하다고 알려진 단백질 변형(예를 들어, 트라이메틸화된 라이신)을 제조할 수 있는 편리한 방법은 없다.
Cys 기반의 전략이 PTM 유사체를 제조하거나, 단백질 컨쥬게이트를 제조하는데 사용되고 있으나(E.V. Vinogradova et al., Nature. Vol.526, pp.687-691, 2015; M.D.Simon et al., Cell. Vol.128. pp. 1003-1012, 2007; S,I. van Kasteren et al., Nature. Vol.446, pp. 1105-09, 2007) 상기 방법으로 생산된 최종 산물의 PTM이 과연 자연계에 있는 것과 정말 같은지는 여전히 의문스러운 상황이다(D. P. Nguyen et al, Chem. Biol. Vol. 17, pp. 1072-76, 2010).
따라서, 이러한 수많은 노력에도 불구하고, 유기화학에서 널리 쓰이는 탄소-탄소 결합이 단백질 변형의 합성에 적용될 수 없었기 때문에 수많은 PTM을 화학적으로 합성하는 방법은 성공한 적이 없다.
한편 본 발명자들은 대한민국특허 제10-2016-0053885호에서 SepRS 변이체 및 EF-Tu 변이체를 이용하여 원하는 위치가 인산화된 단백질을 제조하는 방법을 개발한 바 있다. 하지만, 상기 방법은 세포 내 단백질에 존재하는 수많은 PTM 중, 인산화만 화학적으로 원하는 위치에 함입할 수 있어, 다양한 종류의 PTM을 화학적으로 함입할 수 없는 단점이 있으며, 포스포아미노산은 알칼리 조건에서 불안정하다는 사실이 공지되어 있다(Y. Oda et al., Nat. Bioechnol. Vol. 19, pp. 379-82, 2001).
또한, 최근에는 전이금속을 촉매로 하여 탄소-탄소 결합을 형성하는 화학반응이 공지되었다(A. Postigo et al., Chem. Rev. Vol. 255. pp .2991-3030, 2001; B. H. Lipshutz et al., J. Am. Chem. Soc. Vol. 134. pp. 19985-88, 2012).
이러한 배경하에 본 발명자들은 특정 위취가 변형된(modified) 단백질을 제조하기 위해 예의 노력한 결과, 목적 단백질의 특정 위치를 인산화한 아미노산으로 표지한 다음, 알칼리 조건에서 활성하 시킨 후, 전이 금속 존재 하에 목적하는 변형(modification)을 함유하는 할로겐화 화합물과 반응시킬 경우, 실제 세포 내에 존재하는 PTM과 동일한 효과를 가지는 특정 위치가 변형된(modified) 단백질을 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 환성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 위치 특이적으로 변형된 목적 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 알킬 할라이드 및 전이금속을 포함하는, 목적 단백질에 번역후변형 작용기 부착용 시약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 위치 특이적으로 변형된 목적 단백질 제조용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 알킬 할라이드 및 전이금속을 포함하는, 목적 단백질에 번역후변형 작용기 부착용 시약 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 목적 단백질의 특정 위치에 아미노산을 첨가하여 변형시킬 위치를 반응기를 가지는 물질로 표지하는 단계; (b) 상기 위치의 표지를 활성화시키는 단계; 및 (c) 상기 활성화된 표지에 번역후변형(post translational modification, PTM) 작용기(moiety)를 부착시켜 변형된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 위치 특이적으로 변형된 목적 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 목적 단백질의 특정 위치에 포스포세린(phosphoserine, Sep)을 첨가하는 단계; (b) 상기 포스포세린이 첨가된 목적 단백질에 염기(alkiali)를 처리하여 포스포세린을 디하이드로알라닌(dehydroalanine, Dha)으로 치환하여 활성화시키는 단계; 및 (c) 상기 Dha와 번역후변형(post translational modification, PTM) 작용기(moiety)를 함유한 할로겐화합물을 전이금속 촉매의 존재 하에 반응시켜, 번역후변형 작용기를 탄소-탄소 결합시켜 변형된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 특정 위치가 변형된(modified) 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 목적 단백질의 특정 위치에 포스포세린(phosphoserine, Sep)을 첨가하는 단계; (b) 상기 목적 단백질에 염기(alkiali)를 처리하여 포스포세린을 디하이드로알라닌(dehydroalanine, Dha)으로 치환하여 활성화시키는 단계; 및 (c) 상기 Dha와 형광표지를 함유한 할로겐화합물을 전이금속 촉매의 존재 하에 반응시켜, 번역후변형 작용기를 탄소-탄소 결합시켜 변형된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 특정 위치에 형광 표지된 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 알킬 할라이드 및 전이금속을 포함하는, 목적 단백질에 번역후변형 작용기 부착용 시약 조성물을 제공한다.
도 1의 (A)는 본 발명의 3단계 과정을 나타내는 개략도이며, (B)는 본 발명의 세 번째 단계에서 사용되는 새로운 단백질내 탄소-탄소 커플링 개념을 나타내는 개략도이다.
도 2의 (A)는 본 발명의 방법으로 히스톤 H3의 79번째 잔기를 메틸화 시킨 결과를 분석한 MALDI-TOF 결과이고, (B)는 (A)의 변형된 단백질을 검출한 웨스턴 블롯 결과이며, (C)는 라이신 및 각각 다른 잔기(모노메틸, 다이메틸 및 트라이메틸)로 변형된 라이신의 화학 구조식이다.
도 3의 (A)는 본 발명에서 수행한 in vitro transcription assay의 과정을 나타내는 개념도이고, (B)는 히스톤 H3의 79번째 라이신 메틸레이션이 염색체 전사에 미치는 영향을 분석한 결과이며, (C)는 히스톤 H3의 79번째 라이신 메틸레이션이 p-300에 의한 염색체 아세틸레이션에 미치는 영향을 분석한 결과이고, (D)는 히스톤 H3의 79번째 라이신 메틸레이션에 의한 전사 활성화 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명에서 사용한 알킬 아이오다이드(alkyl iodides)의 화학구조를 나타낸 것으로 1-5는 PTM 작용기를 생성하기 위한 것이고, 13은 형광 다이를 연결하기 위한 것이며, 6-12는 상용화된 제품이다.
도 5는 본 발명의 방법으로 제조한 히스톤 H3의 79번째 라이신이 포르밀레이션(윗 패널) 및 알킬레이션(아래 패널)된 단백질을 분석한 MALDI-TOF MS 결과이다.
도 6은 본 발명의 방법으로 제조한 유비퀴틸레이션 된 라이신 변형(아세틸레이션 및 다양한 메틸레이션) 부착 단백질의 MALDI-TOF MS 분석 결과이다.
도 7은 본 발명의 방법으로 상용 제품의 변형(도 4의 6-12)을 33번째 위치에 부착하여 제조한 단백질의 MALDI-TOF MS 분석 결과이다.
도 8은 본 발명의 방법으로 도 4의 13번째 알킬 아이오다이드를 33번째 위치에 부착한 다음, 실제로 형광이 발현되는지를 확인한 결과이다.
도 9의 (a)는 다양한 종류의 반응 버퍼에 따른 탄소-탄소 결합 반응조건을 확인한 결과이며, (b)는 그 중 반응 효과를 나타낸 소디움 시트레이트 및 소디움 아세테이트의 pH 별 탄소-탄소 결합 반응조건을 확인한 결과이다.
도 10의 (a)는 전이 금속 중, 아연(Zn)의 형태 및 양에 따른 탄소-탄소 결합 반응조건을 확인한 결과이며, (b)는 구리(Cu)의 형태 및 농도에 따른 탄소-탄소 결합 반응조건을 확인한 결과이다.
도 11의 (a)는 계면활성제 Trinton X-100의 농도별 탄소-탄소 결합 반응조건을 확인한 결과이고, (b)는 TPGS(TOcopheryl polyehtylene glycol succinate)의 농도별 탄소-탄소 결합 반응조건을 확인한 결과이며, (c)는 다른 종류의 계면활성제의 농도별 탄소-탄소 결합 반응조건을 확인한 결과이다.
도 12는 TMEDA(tetramethylethylenediamine)의 농도에 따른 탄소-탄소 결합 반응조건을 확인한 결과이다.
도 13의 (a)는 산의 종류 빛 농도별 탄소-탄소 결합 반응조건을 확인한 결과이며, (b)는 루이스 산의 종류 및 농도별 탄소-탄소 결합 반응조건을 확인한 결과이다.
도 14는 알킬 할라이드 화합물의 농도에 따른 탄소-탄소 결합 반응조건을 확인한 결과이다.
도 15는 탄소-탄소 결합 반응 시간에 따른 결과를 확인한 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 새로운 탄소-탄소 결합 생성을 통해 목적 단백질의 원하는 위치에 변형(modification)이 부착될 수 있는지 확인하고자 하였다.
본 발명에서는 목적 단백질의 원하는 위치에 표지를 함입하는 단계; 상기 표지를 활성화 시키는 단계; 및 전이 금속 촉매의 존재 하에, 활성화된 표지와 번역후변형(posttranlsational modification, PTM)을 포함하는 화합물을 반응시켜 새로운 탄소-탄소 결합을 형성하여 목적 단백질의 원하는 위치에 PTM을 부착시키는 단계를 수행하였다. 그 결과, 목적 단백질의 원하는 위치에 PTM을 부착할 수 있음을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 히스톤 H3의 79번째 위치에 포스포세린(phosphoserine, Sep)을 함입하여, 히스톤 H3Sep79를 제조하였다. 그 다음, 포스포아미노산이 염기 조건에서 불안정한 사실을 이용하여, 알칼리 용액을 처리하여 Sep을 디하이드로알라인(dehydroalanine, Dha)으로 활성화시켰다. 활성화 된 Dha에 전이 금속 촉매(Zn, Cu)를 처리하고, PTM을 포함하는 알킬 아이오다이드(alkyl iodides)를 반응시켜, Dha에 PTM을 부착하여, 히스톤 H3의 79번째 위치에 원하는 PTM(예를 들어 트라이메틸레이션)이 부착된 변형 단백질(modified protein)을 수득하여(도 1, 도 2), 상기 변형 단백질이 실제 체내 변형 단백질과 같은 기능을 수행 할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 목적 단백질의 특정 위치에 아미노산을 첨가하여 변형시킬 위치를 반응기를 가지는 물질로 표지하는 단계; (b) 상기 위치의 표지를 활성화시키는 단계; 및 (c) 상기 활성화된 표지에 번역후변형(post translational modification, PTM) 작용기(moiety)를 부착시켜 변형된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 위치 특이적으로 변형된 목적 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 용어 “번역후변형(post translational modification, PTM)”은 단백질의 합성(DNA에서 전사된 mRNA가 번역되어 아미노산 1차 사슬로 합성되는 단계) 이후에 합성된 아미노산의 잔기 부분에 특정 화합물이 결합하는 것을 의미하며, 단백질 수식(protein modification)과 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 번역후변형 작용기(moiety)는 통상적으로 알려진 단백질의 PTM의 작용기이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 아실레이션(acylation), 아세틸레이션(acetylation), 모노메틸레이션(mono-methylation), 다이메틸레이션(di-methylation), 트라이-메틸레이션(tri-methylation), 아미데이션(amidation), 뷰티릴레이션(butyrylation), 카복실레이션(carboxylation), 클라이코실레이션(glycosylation), 포밀레이션(formylation), 하이드록실레이션(hydroxylation), 아오디네이션(iodination), 옥시데이션(oxidation), 포스포릴레이션(phosphorylation), 프로피오닐레이션(propionylation), 석시닐레이션(succinylation), 설페이션(sulfation), 글라이케이션(glycation), 카보닐레이션(carbonylation), 포밀레이션(formylation), 유비퀴티네이션(ubiquitination), 수모일레이션(sumoylation), 네딜레이션(neddylation) 니트로실레이션(nitrosylation), 리피데이션(lipidation), 바이오티닐레이션(biotinylation), 페길레이션(pegylation) 및 퍼필레이션(pupylation)으로 구성된 군에서 선택되는 반응으로 생성되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 번역후변형 작용기는 또한 알킬레이션인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 알킬레이션은 지방족 포화 탄화수소에서 수소 원자 1개가 제거된 원자단을 제조하는 화학반응 이면 모두 이용가능하며, 바람직하게는 모노메틸레이션(mono-methylation), 다이메틸레이션(di-methylation), 트라이-메틸레이션(tri-methylation), 아세틸레이션(acetylation), 포밀레이션, 에틸레이션, 프로필레이션, 아밀레이션, 헥실레이션, 헵틸레이션, 옥틸레이션, 노닐레이션 및 데실레이션으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
반 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 첨가하는 아미노산은 화학반응에 의해 활성화 될 수 있는 반응기를 가지는 아미노산이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 비천연아미노산일 수 있으며, 가장 바람직하게는 포스포세린(phosphoserine, Sep)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Sep을 첨가하는 방법은 목적 단백질의 특정 위치에 Sep을 함입할 수 있는 방법이면 제한 없이 이용가능하나, 바람직하게는 대한민국 특허 제10-2016-0052369호에 기재된 방법일 수 있고, 더욱 바람직하게는 목적 단백질의 mRNA에서 최소한 하나의 코돈을 인식하는 tRNASep과 상기 tRNASep에 포스포세린(phosphoserine, Sep)을 아미노아실화 시키는데 특화된 O-포스포세릴-tRNA 합성효소(O-phosphoseryl-tRNA synthetase, SepRS) 변이체 및 상기 tRNASep과 SepRS 복합체를 탈아실화로부터 보호해주는 Elongation factor Tu(EF-Tu) 변이체를 이용하여, 목적 단백질을 코딩하는 mRNA를 발현하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 SepRS 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 Ef-Tu 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 tRNASep은, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 표지 물질을 활성화 시킬 수 있는 방법이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 표지 물질의 반응기를 제거하여 활성화 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표지 물질의 반응기는 인산기인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 반응기의 제거는 염기(alkali) 및 촉매(catalyst)를 처리하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 밤명에 있어서, 상기 염기는 수용액에서 OH-이온을 방출하는 화합물이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 수산화리튬(LiOH), 수산화바륨(Ba(OH)2), 수산화스트론튬(Sr(OH)2), 수산화마그네슘(Mg(OH)2), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화라듐(Ra(OH)2), 및 수산화베릴륨(Be(OH)2)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 번역후번역 작용기의 부착은 상기 작용기의 라디칼(radical)이 전이금속의 존재 하에 활성화된 표지와 탄소-탄소 결합을 통해 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 본원 발명에서는 기존의 공지된 방법으로 목적 단백질의 특정 위치에 인산화라는 번역후변형 반응기를 부착한 다음, 인산기가 염기성 조건에서 불안정하다는 사실을 이용하여 염기를 처리하여 인산화된 반응기를 디하이드로알라닌으로 변환시킨 것이다.
변환된 디하이드로알라닌(Dha)은 알켄 반응기를 가지고 있어, 라디컬 수용체로서 작동할 수 있으며, 기존의 공지된 물 기반 전이 금속의 트랜스메탈레이션(transmetalation) 반응을 응용하여, 목적하는 번역후변형 반응기(PTM moiety)를 함유하는 할로겐 화홥물을 전이 금속 촉매로 변화시켜 반응기-라이컬을 제조한 다음, 이를 라디컬 수용체인 Dha에 결합시켜 새로운 탄소-탄소 결합 기반 PTM moiety를 목적 단백질에 부착하는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 탄소-탄소 결합의 조건은 목적 단백질의 특징에 따라 상이할 수 있으며, 목적 단백질이 히스톤일 경우, pH 4.0 ~ 5.0에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전이 금속은 아연, 구리, 철, 금, 은, 수은, 코발트, 망간 및 니켈로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 번역후변형 작용기는 트랜스메탈레이션에 의해 작용기가 라디컬로 변형될 수 있는 화합물이면 제한없이 이용 가능하나, 바람직하게는 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 할 수 있다:
화학식 1: R-X
여기서 R은 수소 원자, 알킬기, 시클로알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기, 알콕시기, C1-C6 알킬술포닐기, C1-C6 알킬카르보닐기, C1-C6 알콕시카르보닐기, C3-C6 시클로알킬카르보닐기, 카르복시기, 히드로카르보닐기, 아미노기, 알킬아미노기, 아릴아미노기, 알콕시카르보닐아미노기, 아릴옥시카르보닐아미노기, 히드로카르보닐아미노기, 알킬카르보닐아미노기, 아릴카르보닐아미노기, 알킬티오기, 아릴티오기, 시아노기, 여기서 알킬기는 C1-C6, 알콕시기는 C1-C6, 아릴기는 C6-C14임, 포스포릴기, 석시닐기, 포르밀기, 아실기, 유비퀴틴, 수모(SUMON) 단백질 또는 네드(NEDD) 단백질 단백질이며,
X는 할로겐이다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 3-아이오도-N-메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-methylpropan-1-amine hydrochloride), 3-아이오도-N-N-다이메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-N-dimethylpropan-1-amine hydrochloride), 3-아이오도-N-N-N-트라이메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-N-N-trimethylpropan-1-amine hydrochloride), N-(3-아이오도프로필)포름아마이드(N-(3-iodopropyl)formamide), N-(3-아이오도프로필)아세트아마이드(N-(3-Iodopropyl)acetamide), 5-(다이메틸아미노)-N-(2-((3-아이오도프로필)아미노)에틸)나프탈렌-1-솔폰아마이드 하이드로클로라이드)(5-(dimethylamino)-N-(2-((3-iodopropyl)amino)ethyl)naphtalene-1-sulfonamide hydrochlaride)), 아이오도부탄(iodobutane), 2-아이오도프로판(2-iodopropane), 2-아이오도-2-메틸프로판(2-iodo-2-methylpropane), 1-아이오도부탄(1-iodobutane), 아이오도사이클로펜탄(iodocyclopentane), 3-아이오도프로피오닉 산(3-iodopropionic acid) 및 테트-뷰틸(4-아이오도뷰톡시)다이메틸실렌(tert-butyl(4-iodobutoxy)dimethylsilane)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 할로겐은 플루오르, 염소, 브롬 및 아이오딘으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 79번째 아미노산을 코딩하는 코돈의 위치에 UAG를 포함하고, C-말단에 His6-Tag을 포함하는 X.Laevis histone H3 mRNA를, SepRS9 및 EF-Sep21을 포함한 대장균에서 발현하여, histone H3Sep79 단백질을 제조하였다. 그 뒤, LiOH, Ba(OH)2 또는 Sr(OH)2를 각각 다른 조건에서 처리하여 histone H3 Dha79를 수득한 다음, 트라이메틸 아이오다이드(3-iodo-NmNmN-trimethylpropan-1-amine), 아연 가루, Cu(OAc)2, Triton X-100 및 TMEDA와 함께 상기 hisotne H3 Dha79를 소디움 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에서 처리하여 histone H3 K79me3를 제조하였다(도 2).
따라서 본 발명은 다른 관점에서, (a) 목적 단백질의 특정 위치에 포스포세린(phosphoserine, Sep)을 첨가하는 단계; (b) 상기 포스포세린이 첨가된 목적 단백질에 염기(alkiali)를 처리하여 포스포세린을 디하이드로알라닌(dehydroalanine, Dha)으로 치환하여 활성화시키는 단계; 및 (c) 상기 Dha와 번역후변형(post translational modification, PTM) 작용기(moiety)를 함유한 할로겐화합물을 전이금속 촉매의 존재 하에 반응시켜, 번역후변형 작용기를 탄소-탄소 결합시켜 변형된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 특정 위치가 변형된(modified) 목적 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 염기는 수용액에서 OH-이온을 방출하는 화합물이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 수산화리튬(LiOH), 수산화바륨(Ba(OH)2), 수산화스트론튬(Sr(OH)2), 수산화마그네슘(Mg(OH)2), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화라듐(Ra(OH)2), 및 수산화베릴륨(Be(OH)2)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전이 금속은 아연, 구리, 철, 금, 은, 수은, 코발트, 망간 및 니켈로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 알킬 할라이드 및 전이금속을 포함하는, 목적 단백질에 번역후변형 작용기 부착용 시약 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 알킬 할라이드는 3-아이오도-N-메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-methylpropan-1-amine hydrochloride), 3-아이오도-N-N-다이메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-N-dimethylpropan-1-amine hydrochloride), 3-아이오도-N-N-N-트라이메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-N-N-trimethylpropan-1-amine hydrochloride), N-(3-아이오도프로필)포름아마이드(N-(3-iodopropyl)formamide), N-(3-아이오도프로필)아세트아마이드(N-(3-Iodopropyl)acetamide), 5-(다이메틸아미노)-N-(2-((3-아이오도프로필)아미노)에틸)나프탈렌-1-솔폰아마이드 하이드로클로라이드(5-(dimethylamino)-N-(2-((3-iodopropyl)amino)ethyl)naphtalene-1-sulfonamide hydrochlaride)), 아이오도부탄(iodobutane), 2-아이오도프로판(2-iodopropane), 2-아이오도-2-메틸프로판(2-iodo-2-methylpropane), 1-아이오도부탄(1-iodobutane), 아이오도사이클로펜탄(iodocyclopentane), 3-아이오도프로피오닉 산(3-iodopropionic acid) 및 테트-뷰틸(4-아이오도뷰톡시)다이메틸실렌(tert-butyl(4-iodobutoxy)dimethylsilane)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 전이 금속은 아연, 구리, 철, 금, 은, 수은, 코발트, 망간, 및 니켈로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 시약 조성물은 계면활성제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 계면활성제는 Trition X-100, TPGS, Tween20, Tween80, IGEPAL 및 Brij35로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 시약 조성물은 TMEDA를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시약 조성물은 목적 단백질이 히스톤이고, 부착하고자 하는 PTM 작용기가 메틸레이션일 경우, 알킬 아이오다이드, 아연 가루, Cu(OAc)2, Triton X-100, TMEDA 및 Sodium acetate를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 상기의 방법을 이용하되, 번역후변형 작용기를 댄실 아이오다이드(dansyl iodide, 5-(dimethylamino)-N-(2-((3-iodopropyl)amino)ethyl)naphthalene010sulfonamide, 도 4의 13번째 화합물)로 하여, UbDha33에 부착시킨 결과, 상기 번역후변형 반응기가 부착된 단백질만 365nm UV 형광에서 빛을 발하는 것을 확인하였다(도 8).
따라서, 본 발명은 또다른 관점에서, (a) 목적 단백질의 특정 위치에 포스포세린(phosphoserine, Sep)을 첨가하는 단계; (b) 상기 목적 단백질에 염기(alkiali)를 처리하여 포스포세린을 디하이드로알라닌(dehydroalanine, Dha)으로 치환하여 활성화시키는 단계; 및 (c) 상기 Dha와 형광표지를 함유한 할로겐화합물을 전이금속 촉매의 존재 하에 반응시켜, 번역후변형 작용기를 탄소-탄소 결합시켜 변형된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 특정 위치에 형광 표지된 목적 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 활로겐화합물은 특정 파장에서 형광을 발휘할 수 있는 번역후변형 작용기를 가지는 화합물이면 모두 이용 가능하나, 바람직하게는 5-(다이메틸아미노)-N-(2-((3-아이오도프로필)아미노)에틸)나프탈렌-1-솔폰아마이드 하이드로클로라이드)(5-(dimethylamino)-N-(2-((3-iodopropyl)amino)ethyl)naphtalene-1-sulfonamide hydrochlaride))인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. N-말단이 변형(modifed)된 알킬 할라이드의 제조
알킬 아이오다이드들은 하기의 방법으로 합성하였다. 모노 메틸화된 아이오다이드들은 염기 조거네서 아케태딘(azetidine)으로 쉽게 사이클화되기 때문에, boc protection, Appel reaction 및 deprotection을 차례대로 적용하여 모노 메틸화된 아이오다이드 하이드로클로라이드 솔트를 수득하였다. 다이 메틸화된 아이오다이드는 알킬 클로라이드의 SN2 반응(Finkelstein reaction 포함) 및 할로겐 치환 반응을 통해 수득하였다. 소디움 아이오다이드는 아세톤에서 녹으나, 소디움 클로라이드는 녹지 않기 때문에 상기 반응은 녹지않는 솔트의 침전을 통해 생산물을 수득하는 쪽으로 진행된다. 트라이메틸화된 아이오다이드는 다이메틸아미노 프로판올을 메틸화시켜 4차 암모니움 솔트를 제조한 다음, 수용성 하이드리오딕 산에서 가열하여 트라이메틸 아미노 프로필 아이오다이드를 수득하였다. 이하, 각 생산물에 대한 상세한 반응을 개시하였다.
1-1. 3-Iodo-N-Methylpropan-1-amine hydrochlrode, Monomethyl iodides (1)의 제작
Figure PCTKR2017009629-appb-I000001
1) tert-Butyl (3-hydroxypropyl)(methyl)carbamate (1a) 제작
상온에서 Boc anhydride(0.27ml, 1.15mmol)에 메탄올 3.50ml에 있는 triethylamine(TEA, 0.18ml, 1.27mmol) 및 3-(methylamino)-1-pro-panol(0.10ml, 1.06mmol)을 가하였다. 상기 혼합액을 밤새 섞어준다음, NaHCO3를 처리하였다. 상기 반응물을 EtOAc로 희석한 다음, 유기층(organic layer)를 EtOAc(15ml)과 함께 3회 추출하였다. 상기 유기층을 MgSO4 위에서 말린 다음, 필터하여 in vacuo로 압축하였다. EtOAC:Hexane=1:1인 silica gel 기반의 column 크로마토그래피로 상기 혼합물을 분리하여 1a(99%, 198mg, 1.04mmol)을 수득하였다.
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
2) tert-Butyl (3-iodopropyl)(methyl)carbamate (1b) 제작
얼음 배치에 1.60ml의 dichloromethane과 PPh3(02.15mg, 0.31mmol)의 혼합액을 놓은 다음, iodine(0.31mmol, 75.6mg0, imidazeol(0.47mmol, 32.93mg) 및 상기 1a(59.28mg, 0.31mmol)을 5분 간격으로 투입하였다. 얼음 배치를 제거한 다음, 1시간 동안 섞어준 뒤, 물을 주입하여 반응을 중지시키고, CH2Cl2(2ml)로 희석한 다음, 유기층을 CH2Cl2(10ml)로 3회 추출하였다. 상기 유기층을 MgSO4 위에서 말린 다음, 필터하여 in vacuo로 압축하였다. EtOAC:Hexane=1:10인 silica gel 기반의 column 크로마토그래피로 상기 혼합물을 분리하여 1a(81%, 76.04mg, 0.25mmol)을 수득하였다.
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3) 및 13C NMR(150MHz, CDCl3)로 확인하였다.
3) 3-Iodo-N-Methylpropan-1-amine hydrochlrode (1) 제작
상온에서 diethyl ether(0.50ml)에 있는 2.0M hydrochloride를 dichloromethane(1.00ml)에 있는 115(61.20mg, 0.21mmol) 혼합액에 추가하였다. 상기 혼합액을 3.5시간 동안 섞어 준 다음, in vacuo에서 압축하여 1의 화합물을 흰색 고체로 수득하였다(46.90mg, 0.20mmol, 99%).
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
1-2. 3-Iodo-N, N-dimethylpropan-1-amine hydrochlrode, dimethyl iodides (2)의 제작
Figure PCTKR2017009629-appb-I000002
3-(dimethylamino)-1-propyl chloride hydrochloride(863mg, 5.46mmol)과 아세톤(30ml)이 섞인 용액에 NaI(1.64g, 10.92 mmol)을 섞은 다음, 24시간동안 가열하였다. 상기 반응물을 필터한 다음 진공으로 농축하여 2번 화합물(2.7g, 10.80 mmol, 99%)를 수득하였다.
그 결과는 1H NMR (600 MHz, CD3OD): δ 3.27 (t, J= 6.7 Hz, 1H), 3.22 - 3.15 (m, 1H), 2.87 (d, J = 1.8 Hz, 5H), 2.23 (p, J = 6.7 Hz, 1H) ppm; 13C NMR(150 MHz, CD3OD): δ 59.49, 43.66, 43.62, 29.37, 0.00 ppm; 및 High Resolution MS (ESI)로 확인하였다.
1-3. 3-Iodo-N,N,N-trimethylpropan-1-amine, trimethyl iodide(3)의 제작
Figure PCTKR2017009629-appb-I000003
1) 3-Hydroxy-N,N,N-trimethylpropan-1-amine (3a).제작
acetonitile (3.20ml)에 3-(dimethylamino)-1-propanol (70μl, 0.97mmol)이 섞인 용액에 iodomethane (182ul, 2.92mmol)을 25℃에서 3시간 동안 처리한 다음, Et2O를 처리하고, 비수용성의 quaternary ammonium salt를 필터링 한 뒤, 재결정화를 EtOH : Et2O = 8:2 비율로 수행하여, 3a 화합물(205mg, 0.84mmol, 86%)를 수득하였다.
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
2) 3-Iodo-N,N,N-trimethylpropan-1-amine (3) 제작.
물 (1.6ml)에 3-N-trimethylamino-1-propanol (78.37mg, 0.32mmol)이 섞인 용액에, HI (57wt% in H2O, 1.6 mL)를 25℃에서 7시간 동안 처리한 다음 120℃까지 가열하였고, 진공으로 농축하여 3을 수득하였다(113 mg, 0.08 mmol, 99%).
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
1-4. N-(3-iodopropyl)formamide, formyl iodide (4)의 제작
Figure PCTKR2017009629-appb-I000004
1) N-(3-hydroxypropyl)formamide (4a) 제작
메탄올(20ml)과 3-aminopropan-1-ol (500mg, 6.60 mmol) 이 섞인 용액에 methyl formate (817.20μl, 13.20mmol)를 25℃에서 10시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 진공으로 농축시킨 다음, 실리카 겔에서 flash column chromatography(DCM : MeOH=10 : 1)를 통해 정제하여 N-(3-hydroxypropyl)formamide 4a를 수득하였다(670mg, 6.58mmol, >99%).
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
2) 3-Formamidopropyl 4-methylbenzenesulfonate (4b) 제작
dichloromethane(20ml)과 4a (590mg, 5.70mmol)가 섞인 용액에, p-toluenesulfonyl chloride (1.09g, 5.70mmol) 및 pyridine (0.55ml, 6.84mmol)를 투입하여 25℃에서 반응시킨 다음, 진공으로 농축하고, 실리카 겔에서 flash column chromatography(only EtOAc)로 정제하여 4(b)를 수득하였다(147mg, 0.57mmol, 10%).
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
3) N-(3-iodopropyl)formamide (4) 제작
아세톤(7ml)과 4b (200mg, 0.77mmol)가 섞인 용액에, sodium iodide (233mg, 1.55mmol)을 투입하여 5시간 동안 25℃에서 반응시킨 다음, 진공으로 농축하고, 실리카 겔에서 flash column chromatography(only EtOAc)로 정제하여 4를 수득하였다(77mg, 0.36mmol, 47%).
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
1-5. N-(3-iodopropyl)acetamide, acetyl iodide (5)의 제작
Figure PCTKR2017009629-appb-I000005
1) N-(3-hydroxypropyl)acetamide (5a) 제작
dichloromethane (15ml)과 3-aminopropan-1-ol (500mg, 6.60mmol)이 섞인 용액에 acetic anhydride (673μl, 6.60mmol)를 주입하여 25℃에서 1시간 반응시킨 다음, 진공으로 농축하고, 실리카 겔에서 flash column chromatography(DCM : MeOH=10 : 1)로 정제하여 N-(3-hydroxypropyl)acetamide 5a를 수득하였다 (735mg, 6.58mmol, 95%).
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
2) 3-Acetamidopropyl 4-methylbenzenesulfonate (5b) 제작
dichloromethane (5ml)과 5a (187.9mg, 1.60mmol)가 섞인 용액에, p-toluenesulfonyl chloride (305mg, 1.60mmol) 및 pyridine (155.2μl, 1.92mmol)을 주입하여 25℃에서 4시간동안 반응시킨 다음, 진공으로 농축하고, 실리카 겔에서 flash column chromatography(only EtOAc)로 정제하여 5b를 수득하였다(43mg, 0.16 mmol, 10%)
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
3) N-(3-iodopropyl)acetamide (5) 제작
아세톤(1ml)과 5b (43mg, 0.16mmol)가 섞인 용액에, sodium iodide (46.40mg, 0.30mmol)를 주입하여 4시간 동안 25℃에서 반응시킨 다음, 진공으로 농축하고, 실리카 겔에서 flash column chromatography(only EtOAc)로 정제하여 5를 수득하였다(14mg, 0.06mmol, 41%).
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
1-6. 5-(dimethylamino)-N-(2-((3-iodopropyl)amino)ethyl)naphthalene-1-sulfonamide hydrochloride (13)의 제작
Figure PCTKR2017009629-appb-I000006
1) 5-(dimethylamino)-N-(2-hydroxyethyl)naphthalene-1-sulfonamide (13a) 제작
dichloromethane (10ml)과 2-aminoethanol (200μl, 3.27mmol)이 섞인 용액에, dansyl chloride (883.2mg, 3.27mmol, 1equiv) 및 trimethylamine (455μl, 3.27mmol)를 주입하여 25℃에서 반응시킨 후, sat. NH4Cl로 퀀칭시킨 다음, CH2Cl2로 3회 추출하여, MgSO4로 organic layer를 말린 후, 진공으로 농축하여 실리카 겔(EtOAc:hexane-1:1)에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 13a를 수득하였다(818.4 mg, 2.78mmol, 85%).
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
2) 2-(5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonamido)ethyl 4-methylbenzenesulfonate (13b) 제작
dichloromethane (9ml)과 13a (801.8mg, 2.72mmol)이 섞인 용액에 p-toluenesulfonyl chloride (518.5mg, 2.72mmol) 및 pyridine (0.29ml, 3.54mmol)을 주입하여 25℃에서 12시간 동안 반응시킨 후, sat NH4Cl로 퀀싱시킨 다음, CH2Cl2로 3회 추출하여, MgSO4로 organic layer를 말린 후, 진공으로 농축하여 실리카 겔(EtOAc:hexane-1:2)에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 13b를 수득하였다(792 mg, 1.77mmol, 65%, recovered 13a = 20%).
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
3) 5-(dimethylamino)-N-(2-((3-hydroxypropyl)amino)ethyl)naphthalene-1-sulfonamide (13c)제작
acetonitrile (2.5ml)과 13b(362.17mg, 0.80mmol)가 섞인 용액에 3-aminopropanol (185.4μl, 2.40mmol) 및 sodium carbonate (254mg, 2.40mmol)를 주입하여 10시간 동안 65℃에서 반응시킨 후, 물로 퀀칭시킨 다음, CH2Cl2로 희석하고, CH2Cl2로 3회 추출하여 MgSO4로 organic layer를 말린 후, 필터링한 다음, 진공으로 농축하고, 실리카 겔(MC : MeOH = 5 : 1)에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 13c를 수득하였다(253.1 mg, 0.72mmol, 90%).
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
4) tert-butyl (2-(5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonamido)ethyl)(3-hydroxypropyl) carbamate (13d)제작
dichloromethane (6ml)과 13c (235mg, 0.66mmol)가 섞인 용액에, Boc anhydride (140μl, 0.66mmol) 및 triethylamine (92μl, 0.66mmol)를 주입하여 25℃에서 5시간 동안 반응시킨 다음 sat NH4Cl로 퀀싱시킨 다음, CH2Cl2로 3회 추출하여, MgSO4로 organic layer를 말린 후, 진공으로 농축하여 실리카겔(only EtOAc)에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 13d를 수득하였다(229 mg, 0.51mmol, 77%).
그 결과는 1H NMR(600MHz, CDCl3), 13C NMR(150MHz, CDCl3) 및 High Resolution MS(ESI)로 확인하였다.
5) tert-butyl (2-(5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonamido)ethyl)(3-iodopropyl)carbamate (13e)제작
dichloromethane (5ml)과 13d (229mg, 0.5mmol)가 섞인 용액에, triphenylphsophine (131.1mg, 0.5mmol), imidazole (34.03mg, 0.5mmol) 및 iodine (126.9mg, 0.5mmol)을 주입하여 0℃에서 반응시킨 다음, 25℃에서 5시간 동안 배양한 후, phosphine oxide를 제거하기 위하여 diethylether로 희석한 다음, celite pad로 필터링하고, 진공으로 농축한 다음, 실리카겔(EtOAc:Hx=1:2)에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 13e를 수득하였다(158.7 mg, 0.28mmol, 57%).
6) 5-(dimethylamino)-N-(2-((3-iodopropyl)amino)ethyl)naphthalene-1-sulfonamide hydrochloride(13)제작
에탄올(1ml)과 13e (158.7mg, 0.28mmol)가 섞인 용액에, dioxane(0.7ml)에 녹인 4.0M hydrochloride를 주입하여 25℃에서 4시간 동안 반응시킨 다음, diethyl ether로 희석하고, 녹지않은 암모늄 염은 필터링한 다음, 진공에서 농축하여 13을 수득하였다(130mg, 0.26mmol, 93%).
실시예 2. Sep 함유 재조합 단백질 제조
pCDFDuetH3wt 벡터를 Xenopus laevis histone H3 gene 과 C-말단 His6 tag을 BamHI 및 AscI 절단 사이트 사이에 보유하는 pCDFDuet(Novagen) 으로부터 클로닝하여 야생형 histone H3(H3wt)를 제조하였다.
pCDFDuet-H3wt 벡터에 nested PCR을 통해 79번째 아미노산을 코딩하는 코돈위치에 TAG를 삽입하여, pCDFDuet-H3K79TAG 벡터를 제조한 다음, Sep 함입 시스템(pKD-SepRS9-EFSep21, pETDuet-SepRS9-sepT)을 가지는 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 시킨 후, 공지된 방법으로 벡터를 발현시켜 단백질을 수득하였다.
수득한 단백질을 Ni2+-NTA 아가로즈 컬럼 크로마토 그래피를 통해 정제한 다음, 3mM β-mercaptoethanol을 가진 물에서 dialysis한 뒤, 동결건조하였다. 필요할 경우, 상기 방법으로 수득한 히스톤 단백질을 reversed-phase HPLC로 추가 정제하였다.
C-말단 His6-tag 옆에 유비퀴틴 유전자를 삼입하고, 33번째 위치의 아미노산을 코딩하는 위치에 TAG를 삽입하여, pCDFDuet-UB33TAG 벡터를 제조한 다음, 이를 상기 대장균에서 발현하여, 유비퀴틸레이션되고, 33번째 위치에 Sep이 함입된 히스톤 단백질을 제작하였다.
같은 방법으로 C-말단 His6-tag을 가지는 GFP 유전자의 204번째 아미노산 위치에 TAG를 삽입하여 pCDFDuet-GFP204TAG 벡터를 제조한 다음, 상기 대장균에서 발현한 뒤, 같은 방식으로 정제하여 단백질을 수득하였다.
실시예 3. Sep 표지 단백질의 알칼리 처리를 통한 활성화
실시예 2에서 정제한 H3Sep79(0.3mg/ml)을 상온에서 다양한 농도의 LiOH, Ba(OH)2 또는 Sr(OH)2와 함께 반응시켰다. 0.5mM의 dithiothreitol(DTT)를 추가로 혹시라도 있을 산화 반응 및 side reaction을 방지하였다. 상기 반응 혼합물을 30분간 섞어준 다음, 같은 양의 아세트산으로 중성화 시킨 뒤, 증류수로 밤새 dialysis를 수행하였다.
반응 혼합물 내 단백질의 in gel 트립신 처리 후, MALDI-TOF MS 분석을 수행한 결과, 히스톤 H3K79Sep이 디하이드로알라닌(dehydroalanine, Dha)로 전환되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 알킬 아이오다이드와 Dha 함유 단백질의 chemo-selection 커플링
커플링반응은 알킬 아이오다이드의 스톡 솔루션을 증류수에 풀어준 다음, 표지가 활성화된 단백질이 포함된 용액과 섞어주고, 아연 가루를 투입하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 30분간 배양한 다음, 상층액을 bio-beads SM-2 (Bio-Rad)에 처리하여 계면활성제를 제거하고, 밤새 물에서 dialysis를 수행하였다.
4-1. pH 반응 조건 확인
기존의 공지된 방법(19, 20)에 따라 유기 화합물의 금속 촉매 커플링 반응이 활성화된 단백질에 번역후변형 반응기(PTM Moiety)을 부착할 수 있는 지를 테스트 해보았다.
먼저 H3Dha79(20μM)와 알킬 아이오다이드(trimethyl iodide, 3mM), 금속(아연 가루 0.1mg 및 Cu(OAc)2 0.1mM)를 20μl 반응용액에서 반응시킨 결과, 단백질이 침전되어 커플링이 발생하지 않는 것을 확인하였다.
그 다음에는 버퍼와 계면활성제(Triton X-100)을 추가하였는데, 계면활성제는 물에서 일어나는 금속 기반 유기화합물 커플링에 도움을 준다고 알려져 있기 때문이다. 다양한 버퍼(소디움 시트레이트, 소디움 아세테이드, 암모늄 아세테이트, 소디움 포스페이트, HEPES 및 포타슘 포스페이트)의 다양한 pH 조건(5.0 ~ 9.0)에서 0.1 wt% triton X-100을 포함하는 반응을 수행하였다.
그 결과, SDS-PAGE 분석엣 산성 조건에서 변형이 부착된 단백질이 더 안정적인 것을 확인하였으며, 웨스턴 블롯 분석 결과, 상기 단백질이 H3K79Me3임을 확인할 수 있었다. 추가로 pH 조건을 더 최적화한 결과, pH 3.0-4.5가 알킬 할라이드 기반의 커플링 반응에서의 최적 조건임을 확인할 수 있었다.
4-2. 금속 기반 커플링 반응 필수 요소 탐색
단백질을 반응물질로 수행하는 금속 기반 커플링 반응은 단백질의 기능이 손상되지 않도록 반응을 수행하는 것이 중요하기 때문에, 관련 버퍼를 종류별로 시험한 결과, sodium acetetate pH 4.5에서 가장 효과가 좋은 것을 확인할 수 있었다(도 9).
아연 가루의 농도(20μl 반응에서 0-1mg)를 측정한 결과, 0.4mg의 농도가 최적임을 확인하였으며, 다른 입자 크기(아연 dust, 아연 나노입자)를 가지는 물질 테스트한 결과, 효과가 좋지 못하다는 것을 확인할 수 있었다. 구리의 경우 0-10mM 농도의 구리 솔트(Cu(OAc)2 또는 Cu(OTf)2)를 테스트한 결과, 1mM의 구리 솔트면 반응이 충분히 잘 진행되는 것을 확인할 수 있었다(도 10).
본 반응은 반응 중 라디컬이 생성되기 때문에 올바른 계면활성제를 이용하여 중간체를 안정화 시킬 필요가 있어, 6종류의 계면활성제(Triton X-100, TPGS, Tween 20, Tween 80, IGEPAL 및 Brij35)를 0=5wt%의 농도로 테스트 하였다. 그 결과, Triton X-100 및 IGEPAL이 2.0wt%에서 최적의 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 11).
추가로 반응을 최적화시키기 위하여 필요한 물질을 탐색하였는데, 메탈 할라이드와 자유 라디칼을 안정화시킨다고 알려진 Tetramethylethylenediamine(TMEDA)의 경우, 10mM 농도에서 반응 향상 효과를 나타내는 것을 확인하였으며(도 12), 산(예를 들어 HCl 및 NH4Cl) 또는 루이스 산(예를 들어 AuCl3 및 LiClO4)과 혼합된 은 솔트(AgBF4)는 유기 화합물 커플리의 효율을 증가시킨다고 알려졌으나, 본원 발명의 반응에서는 향상 효과가 관찰되지 않았다(도 13).
마지막으로, 알킬 할라이드는 30mM의 농도 이상에서는 향상 효과가 없었으며, 커플링 반응은 1분 안에 완성되는 것을 확인하였다(도 14 및 도 15)). 최종적으로 확정한 반응조건은 하기와 같다.
10μM H3Dha78, 30mM alkyl iodide, 0.4mg Zn powder, 1mM Cu(OAc)2, 2.0wt% Triton X-100 및 10mM TMEDA를 pH 4.5 500mM 소디움 아세테이트 버퍼에서 상온에서 반응시킴.
상기 결과물을 웨스턴 블로팅으로 확인하기 위해, 최종 반응물을 15% SDS-PAGE에서 전기영동한 다음, nitrocellulose membrane으로 transfer 하고, Abcam의 항-H3K79me1, 항-H3K79me2 및 항-H3K79me3 항체를 1000배 희석하여 확인한 결과, 도 2 B에 개시된 바와 같이 히스톤 H3의 79번째 라이신에 메틸기가 원하는 대로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 단백질의 질량분석 (Mass spectrometric analysis)
히스톤 H3wt 및 변형된 히스톤 H3의 분자 질량은 MALDI-TOF 질량 분석기로 측정하였다. 시나핀 산(sinapinic acid), 0.1% TFA, 50% acetonitrile이 함유된 반응액과 1:1의 비율로 분석할 단백질을 섞어준 다음, 1μl를 채취하여 ground steel MTP384에 떨어뜨려 분석에 이용하였다.
사용한 분석기계는 Bruker Autoflex III MALDI-TOF 질량 분석계이고, 분석 모드는 reflection mode 이며, linear positive ion mode를 이용하여 히스톤의 분자 질량을 다시 확인하였다.
좀 더 명확한 분석을 위해, 목적 단백질을 트립신으로 처리하여 조각낸 다음, 분석하였는데, 트립신 처리는 목적 단백질을 15% SDS-PAGE에서 전기 영동한 다음, 단백질 밴드를 잘라내고, 이 밴드에 트립신을 처리하였다.
그 결과, 도 2 및 도 5 내지 도 7에 개시된 바와 같이 히스톤의 원하는 위치에 원하는 번역후변형이 부착되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 히스톤 옥타머 조립 및 염색질(chromatin) 재구축(reconstitution)
동일한 양의 동결건조된 히스톤 단백질(H4, H2A, H2B 및 H3wt, 또는 H3K79me1, H3K79me2, H3K79me3)을 언폴딩 버퍼(8M guanidium chloride in 20mM NaOAC, pH 5.2 및 10mM DTT)에 넣고 섞어 주었다. 그 뒤, 4℃ 리폴딩 버퍼(10mM Tris-Hcl(pH7.5), 2M NaCl, 1mM EDTA 및 5mM β-mercaptoethanol)에서 dialysis를 수행하였다.
superdex 200 젤 필트레이션을 통해 히스톤 옥타머를 분리하였으며, PGEM-3z/601 플라스미드를 이용하여 히스톤 옥타머를 재조립하였다. 히스톤 옥타머와 p53ML 플라스미드, ACF 및 NAPi 단백질을 이용하여 염색질을 재구축하였다.
실시예 7. In vitro transcription 분석
실시예 6에서 재구축한 염색질을 이용하여 액티베이터 및 코액티베이터 기반의 in vitro 전사 분석을 수행하였다(21).
먼저 H3wt 또는 H3K79-메틸화 히스톤과 p53ML 플라스미드(p53 단백질 결합 사이트 5개 보유 및 390-nucleotide G-less cassette 및 adenovirus major late promoter 포함)를 포함하는 염색질 템플릿(8μl, 40ng DNA)을 p53(20ng) 단백질과 0.5XHAT 버퍼(10MM Hepes(pH7.8), 30mM KCl, 2.5mM DTT, 0.2mM EDTA 및 5mM sodium butyrate)에서 30℃, 20분간 총 20μl 반응조건으로 배양하였다.
상기 반응물을 p300(10ng) 단백질 및 20μM acetyl-CoA와 함께 30℃에서 30분간 총 25μl 반응조건으로 반응시킨 다음, 5μl HeLa nuclear extracts(01mg/m), 1μl DTT(250mM), 2.5μl 20X RB 버퍼(400mM Hepes(ph 7.8), 120mM MgCl2) 및 BC200 버퍼(20mM Tris(pH7.9), 200mMKCl, 0.2mM EDTA 및 20% 글리세롤)를 추가하여 최종 KCl 농도를 전체 45.5μl 반응에서 65mM이 되도록 물을 추가하여 30℃에서 20분간 반응시켜 pre-initiation 컴플렉스를 형성하였다.
2.5μl의 20X nucleotide 믹스(10mM ATP, CTP, 0.5mM UTP, 2mM 3’-O-methyl-GTP), 1μl의 [α-32P]UTP(10μCi/μl, 3000Ci/mmol) 및 1μl의 RNasin(10U/μl)을 추가하여 최종 부피 50μl을 맞춘 다음, 30℃에서 50분간 전사를 수행하였다.
150μl의 스톱 버퍼(150mM sodium acetate(pH 5.2), 0.5% SDS, 10mMEDTA)를 투여하여 반응을 중지시킨 다음, 30μg의 proteinase K를 투입하여 37℃에서 30분간 배양하였다.
끝으로, 방사선 표지된 RNA를 phenol/chloroform/isoamylalcohol(25:24:1) 용액으로 추출한 다음 에탄올로 침전 시킨 후, 8M Urea 함유된 5% 폴리아크릴아마이드 젤(19:1)에서 분리한 다음, 오토라이도그래피로 분석하였다.
그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 메틸레이션이 없는 히스톤을 함유한 염색질은 낮은 레벨의 전사 활성을 나타내느 반면, 메틸화된 염색질은 높은 레벨의 전사활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 3 B, C).
실시예 8. In vitro acetyltransferase 활성 분석
실시예 6에서 재구축한 염색질(35μl, 350ng DNA)을 p53 단백질과 30℃에서 20분간 반응시킨 다음, p300 단백질 및 1uCi3H로 표지된 acetyl-coenzyme A와 함께 30℃에서 30분간 총 40μl 반응조건으로 추가 배양한 다음, SDS-AGE에서 전기영동한 뒤, 오토라디오그래피로 aceylation 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 3 C에 개시된 바와 같이 히스톤 H3K79의 메틸레이션은 p300에 의해 매개되는 히스톤 아세틸레이션을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 위치 특이적으로 변형된 목적 단백질의 제조 방법은 목적 단백질의 원하는 위치에 원하는 변형(modification)을 추가할 뿐만 아니라, 변형이 추가된 목적 단백질이 세포 내에 존재하는 목적 단백질과 동일한 효과를 나타내어 목적 단백질의 기능연구, 신약 스크리닝에 등에 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (24)

  1. 다음의 단계를 포함하는 위치 특이적으로 변형된 목적 단백질의 제조 방법:
    (a) 목적 단백질의 특정 위치에 아미노산을 첨가하여 변형시킬 위치를 반응기를 가지는 물질로 표지하는 단계;
    (b) 상기 위치의 표지를 활성화시키는 단계; 및
    (c) 상기 활성화된 표지에 번역후변형(post translational modification, PTM) 작용기(moiety)를 부착시켜 변형된 단백질을 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 번역후변형 작용기는 아실레이션(acylation), 아세틸레이션(acetylation), 모노메틸레이션(mono-methylation), 다이메틸레이션(di-methylation), 트라이-메틸레이션(tri-methylation), 아미데이션(amidation), 뷰티릴레이션(butyrylation), 카복실레이션(carboxylation), 클라이코실레이션(glycosylation), 포밀레이션(formylation), 하이드록실레이션(hydroxylation), 아오디네이션(iodination), 옥시데이션(oxidation), 포스포릴레이션(phosphorylation), 프로피오닐레이션(propionylation), 석시닐레이션(succinylation), 설페이션(sulfation), 글라이케이션(glycation), 카보닐레이션(carbonylation), 포밀레이션(formylation), 유비퀴티네이션(ubiquitination), 수모일레이션(sumoylation), 네딜레이션(neddylation) 니트로실레이션(nitrosylation), 리피데이션(lipidation), 바이오티닐레이션(biotinylation), 페길레이션(pegylation) 및 퍼필레이션(pupylation)으로 구성된 군에서 선택되는 반응으로 생성되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 아미노산은 포스포세린(phosphoserine, Sep)인 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 포스포세린의 첨가는 목적 단백질의 mRNA에서 최소한 하나의 코돈을 인식하는 tRNASep과 상기 tRNASep에 포스포세린(phosphoserine, Sep)을 아미노아실화 시키는데 특화된 O-포스포세릴-tRNA 합성효소(O-phosphoseryl-tRNA synthetase, SepRS) 변이체 및 상기 tRNASep과 SepRS 복합체를 탈아실화로부터 보호해주는 Elongation factor Tu(EF-Tu) 변이체를 이용하여, 목적 단백질을 코딩하는 mRNA를 발현하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 SepRS 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 Ef-Tu 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 tRNASep은, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 표지 물질의 반응기를 제거하여 활성화 시키는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표지의 반응기는 인산기인 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 반응기의 제거는 염기(alkali)를 처리하여 수행하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 염기는 수산화리튬(LiOH), 수산화바륨(Ba(OH)2), 수산화스트론튬(Sr(OH)2), 수산화마그네슘(Mg(OH)2), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화라듐(Ra(OH)2), 및 수산화베릴륨(Be(OH)2)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 번역후번역 작용기의 부착은 상기 작용기의 라디칼(radical)이 전이금속의 존재 하에 활성화된 표지와 탄소-탄소 결합을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 탄소-탄소 결합은 목적 단백질이 히스톤일 경우, pH 4.0 ~ 5.0에서 수행되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 번역후변형 작용기는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조방법:
    화학식 1: R-X
    여기서 R은 수소 원자, 알킬기, 시클로알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기, 알콕시기, C1-C6 알킬술포닐기, C1-C6 알킬카르보닐기, C1-C6 알콕시카르보닐기, C3-C6 시클로알킬카르보닐기, 카르복시기, 히드로카르보닐기, 아미노기, 알킬아미노기, 아릴아미노기, 알콕시카르보닐아미노기, 아릴옥시카르보닐아미노기, 히드로카르보닐아미노기, 알킬카르보닐아미노기, 아릴카르보닐아미노기, 알킬티오기, 아릴티오기, 시아노기, 여기서 알킬기는 C1-C6, 알콕시기는 C1-C6, 아릴기는 C6-C14임, 포스포릴기, 석시닐기, 포르밀기, 아실기, 유비퀴틴, 수모(SUMON) 단백질 또는 네드(NEDD) 단백질이며,
    X는 할로겐이다.
  15. 제14항에 있어서, 상기 화합물은 3-아이오도-N-메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-methylpropan-1-amine hydrochloride), 3-아이오도-N-N-다이메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-N-dimethylpropan-1-amine hydrochloride), 3-아이오도-N-N-N-트라이메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-N-N-trimethylpropan-1-amine hydrochloride), N-(3-아이오도프로필)포름아마이드(N-(3-iodopropyl)formamide), N-(3-아이오도프로필)아세트아마이드(N-(3-Iodopropyl)acetamide), 5-(다이메틸아미노)-N-(2-((3-아이오도프로필)아미노)에틸)나프탈렌-1-솔폰아마이드 하이드로클로라이드)(5-(dimethylamino)-N-(2-((3-iodopropyl)amino)ethyl)naphtalene-1-sulfonamide hydrochlaride)), 아이오도부탄(iodobutane), 2-아이오도프로판(2-iodopropane), 2-아이오도-2-메틸프로판(2-iodo-2-methylpropane), 1-아이오도부탄(1-iodobutane), 아이오도사이클로펜탄(iodocyclopentane), 3-아이오도프로피오닉 산(3-iodopropionic acid) 및 테트-뷰틸(4-아이오도뷰톡시)다이메틸실렌(tert-butyl(4-iodobutoxy)dimethylsilane)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조방법.
  16. 다음 단계를 포함하는 특정 위치가 변형된(modified) 목적 단백질의 제조방법:
    (a) 목적 단백질의 특정 위치에 포스포세린(phosphoserine, Sep)을 첨가하는 단계;
    (b) 상기 포스포세린이 첨가된 목적 단백질에 염기(alkiali)를 처리하여 포스포세린을 디하이드로알라닌(dehydroalanine, Dha)으로 치환하여 활성화시키는 단계; 및
    (c) 상기 Dha와 번역후변형(post translational modification, PTM) 작용기(moiety)를 함유한 할로겐화합물을 전이금속 촉매의 존재 하에 반응시켜, 번역후변형 작용기를 탄소-탄소 결합시켜 변형된 단백질을 수득하는 단계.
  17. 제16항에 있어서, 상기 염기는 수산화리튬(LiOH), 수산화바륨(Ba(OH)2), 수산화스트론튬(Sr(OH)2), 수산화마그네슘(Mg(OH)2), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화라듐(Ra(OH)2), 및 수산화베릴륨(Be(OH)2)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법.
  18. 다음 단계를 포함하는 특정 위치에 형광 표지된 목적 단백질의 제조방법:
    (a) 목적 단백질의 특정 위치에 포스포세린(phosphoserine, Sep)을 첨가하는 단계;
    (b) 상기 목적 단백질에 염기(alkiali)를 처리하여 포스포세린을 디하이드로알라닌(dehydroalanine, Dha)으로 치환하여 활성화시키는 단계; 및
    (c) 상기 Dha와 형광표지를 함유한 할로겐화합물을 전이금속 촉매의 존재 하에 반응시켜, 번역후변형 작용기를 탄소-탄소 결합시켜 변형된 단백질을 수득하는 단계.
  19. 제18항에 있어서, 상기 할로겐화합물은 5-(다이메틸아미노)-N-(2-((3-아이오도프로필)아미노)에틸)나프탈렌-1-솔폰아마이드 하이드로클로라이드)(5-(dimethylamino)-N-(2-((3-iodopropyl)amino)ethyl)naphtalene-1-sulfonamide hydrochlaride))인 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조방법.
  20. 알킬 할라이드 및 전이금속을 포함하는, 목적 단백질에 번역후변형 작용기 부착용 시약 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 알킬 할라이드는 3-아이오도-N-메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-methylpropan-1-amine hydrochloride), 3-아이오도-N-N-다이메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-N-dimethylpropan-1-amine hydrochloride), 3-아이오도-N-N-N-트라이메틸프로판-1-아민 하이드로클로라이드(3-Iodo-N-N-N-trimethylpropan-1-amine hydrochloride), N-(3-아이오도프로필)포름아마이드(N-(3-iodopropyl)formamide), N-(3-아이오도프로필)아세트아마이드(N-(3-Iodopropyl)acetamide), 5-(다이메틸아미노)-N-(2-((3-아이오도프로필)아미노)에틸)나프탈렌-1-솔폰아마이드 하이드로클로라이드)(5-(dimethylamino)-N-(2-((3-iodopropyl)amino)ethyl)naphtalene-1-sulfonamide hydrochlaride)), 아이오도부탄(iodobutane), 2-아이오도프로판(2-iodopropane), 2-아이오도-2-메틸프로판(2-iodo-2-methylpropane), 1-아이오도부탄(1-iodobutane), 아이오도사이클로펜탄(iodocyclopentane), 3-아이오도프로피오닉 산(3-iodopropionic acid) 및 테트-뷰틸(4-아이오도뷰톡시)다이메틸실렌(tert-butyl(4-iodobutoxy)dimethylsilane)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 시약 조성물은 계면활성제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 계면활성제는 Trition X-100, TPGS, Tween20, Tween80, IGEPAL 및 Brij35로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
  24. 제21항에 있어서, 상기 시약 조성물은 TMEDA를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
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