WO2018034259A1 - Ｔｍｅｍ１３２ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法 - Google Patents

Ｔｍｅｍ１３２ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法 Download PDF

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保広 松村
正浩 安永
信史 西條
慎悟 花岡
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国立研究開発法人国立がん研究センター
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Definitions

  • the present invention provides an antibody that binds to TMEM132A, an anticancer agent, and a method for examining cancer.
  • Colorectal cancer is a cancer that arises from cells of the colonic mucosa. So far, cetuximab, an antibody that targets the epidermal growth factor receptor (Epidermal Growth Factor Receptor;) EGFR) has been developed and used in colorectal cancer (Non-patent Documents 1-3). However, since EGFR is also expressed in normal tissues, cetuximab may also act in normal tissues, and the development of molecular targeting drugs targeting molecules that are more specifically expressed in colorectal cancer is desired. It was.
  • Epidermal Growth Factor Receptor Epidermal growth factor receptor
  • TMEM-180 has been developed as a target molecule candidate (Patent Document 1).
  • the present invention provides an antibody that binds to TMEM132A, an anticancer agent, and a method for examining cancer.
  • TMEM132A protein is specifically expressed in cancer.
  • the present inventors have also found that the presence or absence of expression of TMEM132A protein can be used particularly for the diagnosis of colorectal cancer.
  • the inventors have further found that TMEM132A protein is expressed on the surface of cancer cells and that antibodies that bind to TMEM132A protein can bind to the surface of cancer cells.
  • the present invention is based on these findings.
  • An antibody comprising a chain variable region (2) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • a light region comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13, a light chain CDR2 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15.
  • An antibody comprising a chain variable region (3) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • a light chain comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, a light chain CDR22 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and a light chain CDR23 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • An antibody comprising a chain variable region; and (4) a heavy chain CDR1 having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, a heavy chain CDR2 having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence and a light chain C having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29
  • a light chain variable region comprising R1, a light chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31, and (5) the above (1 )
  • an antibody that competes with TMEM132A for binding and (6) one to several amino acid insertions, substitutions, deletions in the amino acid sequences of the antibodies (1) to (4) and the CDR thereof, or Antibodies with additions.
  • the antibody (1) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. A light chain comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, a light chain CDR2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • An antibody comprising a chain variable region, or The antibody or antigen-binding fragment thereof according to [1] above, which is an antibody that competes in the binding between the antibody according to (1) and TMEM132A.
  • the above [2] comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence of the heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 4 and a light chain variable region having the amino acid sequence of the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 8 Or an antigen-binding fragment thereof.
  • the antibody (2) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • a light region comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13, a light chain CDR2 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15.
  • the antibody (3) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • a light chain comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, a light chain CDR22 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and a light chain CDR23 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • An antibody comprising a chain variable region, or The antibody or antigen-binding fragment thereof according to [1] above, which is an antibody that competes for binding between the antibody according to (3) and TMEM132A.
  • the above [6] comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence of the heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 20 and a light chain variable region having the amino acid sequence of the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 24 Or an antigen-binding fragment thereof.
  • the antibody (4) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27
  • a diagnostic agent for cancer comprising an antibody that binds to TMEM132A.
  • FIG. 1 is a diagram showing that TMEM132A protein is expressed on the surface of cancer cells.
  • FIG. 2 shows that the newly obtained anti-TMEM132A monoclonal antibody can stain the DLD-1 strain in which the TMEM132A protein is forcibly expressed.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of staining the anti-TMEM132A monoclonal antibody on the colorectal cancer tissue panel.
  • FIG. 4 shows the results of staining normal brain tissue and normal heart tissue with an anti-TMEM132A monoclonal antibody.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of staining normal lung tissue and normal liver tissue with an anti-TMEM132A monoclonal antibody.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of staining normal kidney tissue and normal small intestine tissue with an anti-TMEM132A monoclonal antibody.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of staining normal skin with an anti-TMEM132A monoclonal antibody.
  • the “subject” may be a mammal, preferably a human.
  • a subject can be a subject suffering from or at risk for mesothelioma or other tumor or cancer.
  • treatment means treatment and prevention. Therefore, in the present specification, the “pharmaceutical composition used for treating cancer” means a pharmaceutical composition used for treating or preventing cancer, and is used in the sense of including an anticancer agent as an example. It is done.
  • antibody means an immunoglobulin and includes polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • a preferred antibody is a monoclonal antibody.
  • the origin of the antibody is not particularly limited, and examples thereof include a non-human animal antibody, a non-human mammal antibody, and a human antibody.
  • the antibody may also be a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody.
  • the antibody may also be a bispecific antibody.
  • An antibody has a structure in which two heavy chains and two light chains are associated.
  • the heavy chain is composed of a heavy chain variable region (VH), a heavy chain constant region (CH1), a hinge region, CH2, and CH3, and a light chain includes a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL). Consists of.
  • the term “antigen-binding fragment” means a part of an antibody that maintains the binding to an antigen.
  • the antigen-binding fragment can comprise the heavy chain variable region or the light chain variable region of the antibody of the present invention, or both.
  • the antigen-binding fragment may be chimerized or humanized.
  • Examples of the antigen-binding fragment include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, scFv (single chain Fv), diabody, and sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2 ).
  • Such antibody fragments are not particularly limited, and can be obtained, for example, by treating an antibody with an enzyme.
  • Fab can be obtained by digesting an antibody with papain.
  • F (ab ′) 2 can be obtained by digesting the antibody with pepsin
  • Fab ′ can be obtained by further reducing this.
  • such an antigen-binding fragment of an antibody can be used.
  • An antibody that binds to TMEM132A selected from the group consisting of the following, or an antigen-binding fragment thereof is provided: (1) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. A light chain comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, a light chain CDR2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • An antibody comprising a chain variable region (2) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • a light region comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13, a light chain CDR2 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15.
  • An antibody comprising a chain variable region (3) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • a light chain comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, a light chain CDR22 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and a light chain CDR23 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • An antibody comprising a chain variable region (4) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 A light chain comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, a light chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 An antibody comprising a chain variable region; (5) An antibody that competes in the binding of the antibodies (1) to (4) and TMEM132A; (6) An antibody having 1 to several amino acid insertions, substitutions, deletions or additions in the amino acid sequences of the antibodies (1) to (4) and CDRs thereof; (7) an antibody having a heavy chain variable region and a light chain variable region having 80% or more identity with the amino acid sequences of
  • an antibody that binds to TMEM132A or an antigen-binding fragment thereof (1) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. A light chain comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, a light chain CDR2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • An antibody comprising a chain variable region An antibody that competes for binding between the antibody according to (1) and TMEM132A, An antibody having 1 to several amino acid insertions, substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence of the antibody and its CDR according to (1) above; or one or two of the CDRs of the antibody according to (1) above Antibodies with 3, 4, 5, or all as CDRs; Or an antigen-binding fragment thereof is provided.
  • an antibody that binds to TMEM132A or an antigen-binding fragment thereof (1a) an antibody comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence of the heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 4 and a light chain variable region having the amino acid sequence of the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 8; An antibody that competes in the binding of the antibody according to (1a) and TMEM132A; An antibody having 1 to several amino acid insertions, substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence of the antibody and CDR thereof described in (1a) above; or one or two of the CDRs of the antibody described in (1a) above Antibodies with 3, 4, 5, or all as CDRs; Or an antigen-binding fragment thereof is provided.
  • an antibody that binds to TMEM132A or an antigen-binding fragment thereof (2) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • a light region comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13, a light chain CDR2 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15.
  • An antibody comprising a chain variable region An antibody that competes for binding between the antibody according to (2) and TMEM132A, An antibody having 1 to several amino acid insertions, substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence of the antibody and its CDR according to (2) above; or one or two of the CDRs of the antibody according to (2) above Antibodies with 3, 4, 5, or all as CDRs; Or an antigen-binding fragment thereof is provided.
  • an antibody that binds to TMEM132A or an antigen-binding fragment thereof (2a) an antibody comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence of the heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region having the amino acid sequence of the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 16; An antibody that competes in the binding of the antibody according to (2a) and TMEM132A; An antibody having 1 to several amino acid insertions, substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence of the antibody and CDR thereof described in (2a) above; or one or two of the CDRs of the antibody described in (2a) above Antibodies with 3, 4, 5, or all as CDRs; Or an antigen-binding fragment thereof is provided.
  • an antibody that binds to TMEM132A or an antigen-binding fragment thereof (3) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • a light chain comprising a variable region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, a light chain CDR22 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and a light chain CDR23 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • An antibody comprising a chain variable region An antibody that competes in the binding of the antibody according to (3) and TMEM132A; An antibody having 1 to several amino acid insertions, substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence of the antibody and its CDR according to (3) above; or one or two of the CDRs of the antibody according to (3) above Antibodies with 3, 4, 5, or all as CDRs; Or an antigen-binding fragment thereof is provided.
  • an antibody that binds to TMEM132A or an antigen-binding fragment thereof (3a) an antibody comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence of the heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 20 and a light chain variable region having the amino acid sequence of the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 24, An antibody that competes in the binding of the antibody according to (3a) and TMEM132A; An antibody having 1 to several amino acid insertions, substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence of the antibody and its CDR described in (3a) above; or one or two of the CDRs of the antibody described in (3a) above Antibodies with 3, 4, 5, or all as CDRs; Or an antigen-binding fragment thereof is provided.
  • an antibody that binds to TMEM132A or an antigen-binding fragment thereof (4) A heavy chain comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27
  • An antibody comprising a chain variable region An antibody that competes for binding between the antibody according to (4) and TMEM132A, An antibody having 1 to several amino acid insertions, substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence of the antibody and its CDR according to (4) above; or one or two of the CDRs of the antibody according to (4) above Antibod
  • an antibody that binds to TMEM132A or an antigen-binding fragment thereof (4a) an antibody comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence of the heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 28, and a light chain variable region having the amino acid sequence of the light chain variable region represented by SEQ ID NO: 32; An antibody that competes in the binding of the antibody according to (4a) and TMEM132A; An antibody having 1 to several amino acid insertions, substitutions, deletions or additions in the amino acid sequence of the antibody and CDR thereof described in (4a) above; or one or two of the CDRs of the antibody described in (4a) above Antibodies with 3, 4, 5, or all as CDRs; Or an antigen-binding fragment thereof is provided.
  • an antibody that binds to TMEM132A or an antigen-binding fragment thereof that binds to a part of the extracellular region of TMEM132A.
  • a part of the extracellular region of TMEM132A can be, for example, a region at amino acid positions 143 to 317 or a region at amino acid numbers 411 to 597 of GenBank Accession No .: NP_060340 .
  • “having one to several amino acid insertions, substitutions, deletions or additions” means any insertions, substitutions, deletions or additions as long as an antibody capable of binding to TMETM132A is obtained. You may do it. “Having one to several amino acid insertions, substitutions, deletions or additions” is meant to include having, for example, one, two, three or four amino acid insertions, substitutions, deletions or additions Can be used.
  • the amino acid substitution can be, for example, a conservative amino acid substitution.
  • Such insertion, substitution, deletion or addition can be performed by those skilled in the art by site-directed mutagenesis. Such insertions, substitutions, deletions or additions may also be found in competing antibodies.
  • “having 80% or more identity” means that when the identity of the amino acid sequence of the target antibody is confirmed with respect to the reference antibody, the amino acid sequence matches the two amino acid sequences at the maximum. This means that the number of common amino acids is 80% or more with respect to the amino acid sequence of the reference antibody.
  • the identity can be 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, It can be 99% or more.
  • An antibody having “80% or more identity” can be obtained by those skilled in the art by site-directed mutagenesis. Such insertions, substitutions, deletions or additions may also be found in competing antibodies.
  • the antibody of the present invention can be obtained by a method well known to those skilled in the art using the antigen as the TMEM132A protein (for example, the amino acid sequence of human TMEM132A can be GenBank Accession No .: NP_060340). That is, a polyclonal antibody can be obtained by immunizing an animal with an antigen and an adjuvant and obtaining plasma of the immunized animal. Alternatively, it may be obtained by immunizing an animal with an antigen and an adjuvant, obtaining B lymphocytes from the immunized animal, cell-fusion with myeloma to form a hybridoma, and cloning a hybridoma that produces the desired antibody.
  • a polyclonal antibody can be obtained by immunizing an animal with an antigen and an adjuvant and obtaining plasma of the immunized animal. Alternatively, it may be obtained by immunizing an animal with an antigen and an adjuvant, obtaining B lymphocytes from the immunized animal,
  • Chimeric antibodies can be prepared by methods well known in the art. For example, it can be prepared by replacing the constant region of an antibody with the constant region of a human antibody.
  • Humanized antibodies include, for example, complementarity determining regions (CDRs) derived from animals other than humans, framework regions derived from human antibodies, and constant regions derived from human antibodies.
  • CDRs complementarity determining regions
  • a humanized antibody can be obtained, for example, by transplanting the above CDR into a human antibody.
  • Human antibodies can be obtained, for example, by immunizing genetically modified mice that produce human antibodies with antigens.
  • Bispecific antibodies are antibodies that can bind to two different epitopes or antigens and can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • Bispecific antibodies are, for example, a method of producing a hybrid hybridoma by further fusing cells that produce two different antibodies, or a V H region and a VL region cannot be paired between the two regions.
  • An antibody that competes in the binding between an antibody and an antigen can be obtained by a competitive assay well known to those skilled in the art.
  • An antibody that competes for binding to the same antigen if it can block the binding of the desired antibody in a competition assay, for example, at least 20%, preferably at least 20-50%, more preferably at least 50%. Can do.
  • Competing antibodies can be confirmed by cross-blocking assays, preferably by competitive ELISA assays.
  • the antigen is coated on, for example, a microtiter plate, where the presence of a candidate competitive antibody is added and incubated to form a bond between the antigen and the candidate antibody. Then, after labeling the desired antibody, it is further added to the well, incubated, washed, and the binding amount of the desired antibody is quantified to determine whether or not the antibody has competed. If competing, there should be less label remaining in the well.
  • TMEM132A is widely expressed in cancer cells.
  • TMEM132A is specifically expressed in epithelial cancer cells (eg, colon cancer cells, pancreatic cancer cells, ovarian cancer cells, and breast cancer cells).
  • epithelial cancer cells eg, colon cancer cells, pancreatic cancer cells, ovarian cancer cells, and breast cancer cells.
  • expression of TMEM132A was not confirmed in normal tissues. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for diagnosing cancer, comprising determining whether TMEM132A protein is present in a biological sample obtained from a subject.
  • a method for detecting cancer cells comprising determining whether TMEM132A protein is present in a biological sample obtained from a subject.
  • an antibody that binds to TMEM132A can be used to determine whether TMEM132A protein is present. According to the present invention, it is possible to determine whether the TMEM132A protein is present using the antibody of the present invention.
  • the method for diagnosing cancer according to the present invention may further include performing cancer therapy such as chemotherapy and radiation therapy on a subject diagnosed with cancer.
  • TMEM132A is expressed on the cell surface of cancer cells. Therefore, according to the present invention, a conjugate of an antibody that binds to TMEM132A and a cytotoxic agent is provided.
  • the cytotoxic agent used in the present invention include substances having anticancer activity. Substances with anti-cancer activity, when brought into contact with cancer, decrease the size of the cancer, delay or stop the increase in size of the cancer, delay or stop the growth of cancer, or metastasis of cancer It refers to a substance that causes inhibition. Examples of the substance having anticancer activity include anticancer agents, toxins, and radioisotopes, which can be used in the present invention.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for use in treating cancer comprising a conjugate of an antibody that binds to TMEM132A and a cytotoxic agent.
  • the cancer can be an epithelial cancer (eg, colon cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, and breast cancer).
  • the antibody of the present invention may have cytotoxic activity such as antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) or complement-dependent cytotoxic activity (CDC activity).
  • cytotoxic activity such as antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) or complement-dependent cytotoxic activity (CDC activity).
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • CDC activity complement-dependent cytotoxic activity
  • TMEM132A is a protein that appears on the surface of cancer cells, and is therefore preferred as a target for the antibody of the present invention.
  • the human antibody subtype used in the constant region can be IgG1.
  • one or more N-linked sugar chains are bound to the Fc region, and fucose is bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-linked sugar chain. There may be no antibody.
  • the pharmaceutical composition or drug containing the antibody of the present invention as an active ingredient can be formulated by a known pharmaceutical method.
  • the pharmaceutical composition or medicament of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the excipient can be an excipient that can be appropriately administered to give an effective amount of the antibody of the present invention, which is an active ingredient, to the subject.
  • the pharmaceutical composition or medicament of the present invention can be an injection, and the injectable excipient is a sterile aqueous solution, such as a pharmaceutical such as Ringer's solution, Hanks' solution or saline. And an isotonic solution containing glucose, glucose and other adjuvants.
  • the adjuvant examples include alcohols such as ethanol, polyalcohols such as polyethylene glycol, and nonionic surfactants such as polysorbate 80, which can be added during formulation. Sesame oil, coconut oil and soybean oil can be used as an oily liquid for injection, and benzyl benzoate or benzyl alcohol can be used as an auxiliary agent.
  • the pharmaceutical composition or medicament of the present invention can be administered parenterally (for example, intravenously or intrathoracically) in the form of an injection.
  • ADCC activity is achieved by, for example, incubating cancer cells and effector cells expressing Fc receptors (for example, NK cells and monocytes) under physiological conditions in the presence of the antibody of the present invention, and It can be determined by counting the number of cells and / or the number of dead cells.
  • CDC activity is, for example, incubating cancer cells with a solution containing complement (eg, human serum) in the presence of antibodies under physiological conditions, and counting the number of live and / or dead cells of cancer cells. Can be determined.
  • Cytotoxic activity can be enhanced by various methods well known to those skilled in the art.
  • antibodies lacking fucose in the Fc region sugar chain, bisecting N-acetylglucosamine (GlcNAc) bound to the sugar chain, amino acid substitution in the Fc region enhances the binding between the Fc receptor of the effector cell and the antibody
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • the antibody can be a genetically modified antibody such as a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody by a method well known to those skilled in the art for the purpose of reducing the antigenicity of the antibody itself in humans.
  • the antibody of the present invention may be a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • the antibody may also be a bispecific antibody.
  • the present invention also provides a conjugate of the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof and an imaging probe.
  • a composition for use in imaging cancer, a cancer diagnostic kit, or a cancer diagnosis comprising a conjugate of the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof and an imaging probe.
  • Medicine is provided.
  • cancer is an epithelial cancer cell (eg, colon cancer cell, pancreatic cancer cell, ovary). Cancer cells and breast cancer cells).
  • imaging probes examples include fluorescent imaging probes, enhancement agents such as contrast agents for nuclear magnetic resonance imaging (MRI) (for example, paramagnetic ions), and radioactivity for imaging such as PET molecular imaging probes. Nuclides.
  • MRI nuclear magnetic resonance imaging
  • radioactivity for imaging such as PET molecular imaging probes. Nuclides.
  • an antibody that binds to TMEM132A or an antigen-binding fragment thereof for the manufacture of a medicament for treating cancer.
  • use of an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to TMEM132A for the manufacture of a composition for use in imaging cancer, a diagnostic kit for cancer, or a diagnostic agent for cancer is provided. Provided.
  • a method of treating cancer in a subject in need thereof comprising administering to the subject an antibody that binds to TMEM132A.
  • a method of treating cancer in a subject in need thereof comprising administering to the subject a conjugate of an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to TMEM132A and a cytotoxic agent. A method is provided.
  • Example 1 Purification of TMEM132A protein and production of monoclonal antibody
  • TMEM132A protein was produced as an antigen to obtain purified protein.
  • Antigen preparation PCR amplification was performed on a vector (ORIGENE RC214846) in which the TMEM132A gene was incorporated according to a conventional method using the following primers.
  • a DNA polymerase PrimeStar HS DNA polymerase (takara R010A) was used, and it was designed to add a 6 ⁇ His tag sequence to the C-terminus of each antigen.
  • Immune antigen I Primer sequence for amplification catatgttccacctcaaagggcaggattg (SEQ ID NO: 33) gtcgaccttgaagcggtctagcttggcagtc (SEQ ID NO: 34) Primer sequence for amplification of immune antigen II catatgaatacagcaccactgactggagtg (SEQ ID NO: 35) gtcgacttccagagaggctacacgcgagtccag (SEQ ID NO: 36)
  • the immune antigen I corresponds to a part of the extracellular region of TMEM132A (GenBank Accession No .: region of amino acid numbers 143 to 317 of NP_060340), and the immune antigen II corresponds to another extracellular region of TMEM132A. It corresponds to a part (region of amino acid numbers 411 to 597 of GenBank Accession No .: NP_060340).
  • the resulting PCR amplification byproduct was then incorporated into the expression vector pET21b.
  • NdeI and SalI (Takara) were reacted for 2 hours to pET21b and PCR amplification by-products, respectively, according to the manufacturer's protocol. Thereafter, the DNA-cut fragments were separated by 1% agarose gel electrophoresis, cut out from the gel, and purified using the promega wizard SV gal and PCR clean-up system kit.
  • the expression vector and the insert containing the immunizing antigen I or II were reacted for 30 minutes using Ligation high (Toyobo).
  • the cells were transformed with Competent High DH5 ⁇ (Toyobo) and cultured on LB medium (50 ⁇ g / mL) plate.
  • a plasmid was extracted from the transformed E. coli and sequenced to confirm that the target gene was inserted into the vector.
  • an expression vector having the target gene was transformed and introduced into BL21 (DE3), which is E. coli for protein expression. Subsequently, transformed BL21 (DE3) was cloned.
  • the transformed BL21 (DE3) was inoculated into 10 mL of LB medium, and the medium cultured at 37 ° C. for 16 hours was transferred to 1 L of LB medium and cultured at 37 ° C.
  • OD 600 nm reached 0.6
  • gene expression was induced by adding IPTG to a final concentration of 1 mM, and the cells were further cultured for 4 hours.
  • E. coli cells were disrupted, and the precipitate was suspended in denaturing buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 6 M guanidine hydrochloride) and allowed to permeate for 16 hours, and then the sample supernatant was recovered. And purified with a nickel column.
  • denaturing buffer 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 6 M guanidine hydrochloride
  • TMEM132A forced expression cell line 0.5 ⁇ g of pIRES2-AcGFP1 (Clontech) plasmid incorporating TMEM132A gene (Genbank Accession No .: NM — 017870.3) and Flag sequence was diluted with 0.1 mL of Opti-MEM (invitrogen).
  • Lipofectionamine LTX 2.5 ⁇ L was added to obtain a preparation for transfection. After standing at room temperature for 25 minutes, the prepared solution obtained above was added to a 24-well plate (corning) containing DLD1 cells (4 ⁇ 10 4 cells / well).
  • G418 ThermoFisher
  • BD FACSAria cell sorter
  • serum antibody titers were measured by flow cytometry on ELISA or DLD-1 cells or K562 cells using immunizing antigen as a solid phase using antiserum collected from 100 tail veins with PBS. And an immunized mouse individual used for cell fusion was selected. Individuals judged to have sufficiently increased the antibody titer were administered 100 ⁇ L of immune antigen diluted to 1 ⁇ g / mL with PBS as final immunization and 400 ⁇ L from the tail vein.
  • the spleen, iliac lymph nodes, inguinal lymph nodes, inferior lymph nodes, and inferior lymph nodes were removed and fused with mouse myeloma cells p3X63 by the PEG method.
  • the culture supernatant of the hybridoma was collected 10 to 14 days after the fusion.
  • Antibody-producing hybridoma cells that were positive for DLD-1 cells, strongly positive for DLD-1 TMEM132A forced expression cells, and negative for K562 cells were selected by flow cytometry.
  • the selected antibody-producing hybridoma cells were monocloned and established by the limiting dilution method.
  • T6-0429, T6-1022, and T6-1179 clones were obtained from immune antigen II, and T6-1475 clones were obtained from immune antigen I.
  • the monoclonal antibodies obtained from these clones are referred to as T6-0429 antibody, T6-1022 antibody, T6-1179 antibody and T6-1475 antibody.
  • Antibody isotypes were determined by isotype-specific ELISA (Bethyl).
  • T6-0429 antibody was IgG2a
  • T6-1022 antibody was IgG2a
  • T6-1179 antibody was IgG1
  • T6-1475 antibody was IgG2a.
  • Example 2 Cancer cell recognition ability by monoclonal antibody binding to TMEM132A
  • TMEM132A cancer cell recognition ability by monoclonal antibody binding to TMEM132A
  • the cancer cells to be measured were suspended in a medium and added to a V-bottom 96-well plate (corning) at 1 ⁇ 10 5 cells / well.
  • the plate was centrifuged at 440 ⁇ g, 4 ° C. for 3 minutes, the supernatant was removed, and the antibody-producing hybridoma culture supernatant or antibody solution was added to the cell pellet at 50 ⁇ L / well and suspended. After reacting at 4 ° C. for 45 minutes, it was washed 3 times with 0.1% BSA / 2 mM EDTA / PBS 200 ⁇ L / well. The supernatant was removed, and the secondary antibody was added to the cell pellet at 50 ⁇ L / well for suspension.
  • T6-0429 antibody which is a TMEM132A antibody
  • TMEM-0429 forced expression DLD-1 strain bound more T6-0429 antibody.
  • binding of T6-0429 antibody could not be confirmed against the K562 strain. From this, it became clear that TMEM132A can detect colorectal cancer. It was also revealed that TMEM1232A was expressed on the cancer cell membrane.
  • a monoclonal antibody that binds to TMEM132A can detect colorectal cancer using a colorectal cancer tissue array.
  • the T6-0429 antibody is an antibody that can be used for immunohistological staining
  • the T6-0429 antibody was used to immunize the DLD-1 strain and the TMEM132A forced expression DLD-1 strain. Chemical staining was performed.
  • the human colon cancer cell line DLD-1 was positive for the T6-0429 antibody.
  • the TMEM132A forced expression DLD-1 strain strongly expressed TMEM132A and showed a strong positive reaction to the T6-0429 antibody.
  • the colon cancer tissue array was obtained from BioChain Institute Inc. (Newark, CA) and used for experiments. Each tissue array was stained according to the manufacturer's manual. As the antibody, T6-0429 antibody (10 ⁇ g / mL) was used. The result was as shown in FIG. As shown in FIG. 3, a staining image detectable with the T6-0429 antibody was not obtained in the normal colon tissue, but about 30% of the colon cancer tissue was positive for the T6-0429 antibody. Met. From this, it was shown that the antibody that binds to TMEM132A can detect colorectal cancer. A breast cancer tissue array was also obtained from BioChain sInstitue Inc. (Newark, CA) and confirmed in the same manner, and about 20% was found to be positive. From this, it was shown that the antibody that binds to TMEM132A can detect breast cancer.
  • T6-0429 antibody 10 ⁇ g / mL
  • Paraffin sections were prepared from normal tissue samples based on a conventional method, and immunohistological staining was performed using T6-0429 antibody (10 ⁇ g / mL). Specifically, a sliced sample or a cryopreserved sample was air-dried (about 30 minutes at room temperature). Cold acetone was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes (acetone fixation). After washing 3 times with PBS-T, 3% H 2 O 2 (30% H 2 O 2 diluted with ultrapure water) was added and allowed to stand at room temperature for 20 minutes.
  • T6-0429 antibody was negative in all normal tissues of skin, brain, small intestine, liver, heart, lung and kidney. However, a limited positive site was confirmed in normal skin tissue (see FIG. 7).
  • the cancer cells to be measured were suspended in a medium and added to a V-bottom 96-well plate (corning) at 1 ⁇ 10 5 cells / well.
  • the plate was centrifuged at 440 ⁇ g and 4 ° C. for 3 minutes, the supernatant was removed, and the antibody-producing hybridoma culture supernatant or antibody solution was added to the cell pellet at 50 ⁇ L / well and suspended. After reacting on ice for 45 minutes, it was washed 3 times with 0.1% BSA / 2 mM EDTA / PBS 200 ⁇ L / well. The supernatant was removed, and the secondary antibody was added to the cell pellet at 50 ⁇ L / well and suspended.
  • AlexaFluor647 Goat anti-Rat IgG (HL) (Life Technologies) diluted 400-fold with 0.1% BSA / 2 mM EDTA / PBS was used. After reacting on ice for 45 minutes, it was washed 3 times with 0.1% BSA / 2 mM EDTA / PBS 200 ⁇ L / well. The supernatant was removed and the cell pellet was suspended by adding 50 ng / mL Propidium Iodide / 0.1% BSA / 2 mM EDTA / PBS at 250 ⁇ L / well.
  • the cells thus stained were measured using a flow cytometer such as Guava easyCyte 8HT (Merck Millipore), and the obtained data was analyzed by FlowJO (Tommy Digital Biology).
  • a flow cytometer such as Guava easyCyte 8HT (Merck Millipore)
  • FlowJO Tommy Digital Biology
  • FMEM analysis reveals that TMEM132A is widely expressed on the surface of cancer cells such as breast cancer cell lines, colon cancer cell lines, ovarian cancer cell lines, and pancreatic cancer cell lines. It became.
  • anti-TMEM132A antibody is useful for detection of cancer. It also suggests that anti-TMEM132A antibody is useful for cancer treatment by retaining ADCC activity or CDC activity (for example, converting the antibody isotype to an isoform with high ADCC activity such as IgG1 and IgG3). It was done.
  • Example 3 Sequencing of a monoclonal antibody
  • the sequences of the heavy and light chain variable regions of a monoclonal antibody were determined.
  • RNA was extracted from the T6-0429, T6-11022, T6-1179 and T6-1475 clones obtained in Example 1 using RNeasy® Mini® Kit® (QIAGEN). From the above total RNA, cDNA was synthesized using SMARTer® RACE® 5 ′ / 3 ′ Kit (takara) and the 5 ′ terminal RACE (rapid “amplification” of “cDNA” ends) method.
  • the target gene was amplified using KOD FX Neo (Toyobo).
  • Amplification conditions Denature 98 °C, 10 seconds, Anneal 68 °C, 30 seconds, Extend, 72 °C 90 seconds 5 cycles, Denature 98 °C, 10 seconds, Anneal 65 °C, 30 seconds, Extend, 68 °C 90 seconds 5 cycles
  • the touchdown PCR method of 98 ° C, 10 seconds, Anneal 63 ° C, 30 seconds, Extend 68 ° C, 90 seconds 25 cycles was used.
  • PCR was carried out using a PCR device (Applied Biosystem ProPro PCR System).

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Abstract

［課題］本発明は、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法を提供する。 ［解決手段］ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体。

Description

ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法
　本発明は、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法を提供する。
　近年、抗がん剤として、特定の分子に特異的に作用する分子標的薬が多数開発されている。特に、あるがん細胞に特異的に発現している分子や、がん細胞において発現が亢進している分子を抗原とした様々な抗体医薬の開発が進められている。このような抗体医薬の開発では、まず、手術の際に採取したがん組織におけるmRNA発現と、その近傍から採取した正常組織におけるmRNAの発現を比較して、がん組織のみに特異的に発現している分子や、がん組織において発現が亢進している分子を特定し、これを抗原として抗体を作製する。
　大腸がんは、大腸粘膜の細胞から発生するがんである。これまでに、上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR）を標的とする抗体であるセツキシマブが開発され、大腸がんに使用されている（非特許文献１－３）。しかしながら、EGFRは正常組織でも発現しているため、セツキシマブは正常組織にも作用する可能性があり、より特異的に大腸がんに発現する分子を標的とした分子標的薬の開発が望まれていた。この点、大腸がんが発生する粘膜組織はわずかしか存在しないため、がん化した粘膜細胞と正常な粘膜細胞を比較して標的分子を特定することが難しいという問題があった。これについて、ＴＭＥＭ－１８０が標的分子の候補として開発されている（特許文献１）。
WO2016039321A1
Cunningham D. et al., The New England Journal of Medicine., Vol.351, No.4, 2004, p.p.337-345. Goldstein NI. Et al., Clin Cancer Res. Vol.1, 1311-1318, 1995. Karapetis CS. Et al., The New Engl J Med. Vol.359, 1757-1765.
　本発明は、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法を提供する。
　本発明者らは、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質は、がんに特異的に発現することを見出した。本発明者らはまた、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質の発現の有無は、特に大腸がんの診断に用いうることを見出した。本発明者らはさらに、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質は、がんの細胞表面に表出すること、および、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質に結合する抗体は、がん細胞の表面に結合し得ることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく発明である。
　例えば、本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体であって以下からなる群から選択される抗体、またはその抗原結合性断片：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（２）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（３）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；および
（４）配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；並びに
（５）上記（１）～（４）の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体；および
（６）上記（１）～（４）の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体。
［２］抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
　上記（１）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
である、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［３］配列番号４で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、上記［２］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［４］抗体が、
（２）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
　上記（２）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
である、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［５］配列番号１２で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、上記［４］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［６］抗体が、
（３）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
　上記（３）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
である、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［７］配列番号２０で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、上記［６］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［８］抗体が、
（４）配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
　上記（４）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
である、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［９］配列番号２８で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３２で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、上記［８］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［１０］ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体を含む、がんの診断薬。
［１１］抗体が、上記［１］～［９］のいずれかで定義された抗体である、上記［１０］に記載のがんの診断薬。
［１２］対象においてがん細胞を検出する方法であって、
　対象から得られた生体試料中に、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かを決定することを含む、方法。
［１３］上記［１２］に記載のがん細胞の検出方法であって、
　ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かをＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体により決定する、方法。
［１４］上記［１３］に記載のがん細胞の検出方法であって、
　抗体が、上記［１］～［９］のいずれかで定義された抗体である、方法。
［１５］ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体を含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物。
［１６］抗体が、上記［１］～［９］のいずれかで定義された抗体である、上記［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］抗体が、細胞傷害剤とのコンジュゲートの形態である、上記［１５］または［１６］に記載の医薬組成物。
図１は、がん細胞の表面にＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が発現していることを示す図である。
図２は、新しく得た抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体がＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質を強制発現させたＤＬＤ－１株を染色できることを示す図である。
図３は、大腸がん組織パネルに対して抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体で染色した結果を示す図である。
図４は、正常脳組織および正常心臓組織に対して抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体で染色した結果を示す図である。
図５は、正常肺組織および正常肝臓組織に対して抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体で染色した結果を示す図である。
図６は、正常腎臓組織および正常小腸組織に対して抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体で染色した結果を示す図である。
図７は、正常皮膚に対して抗ＴＭＥＭ１３２Ａモノクローナル抗体で染色した結果を示す図である。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「対象」とは、哺乳動物であり得、好ましくは、ヒトである。対象は、中皮腫その他の腫瘍または癌に罹患している、またはそのリスクがある対象であり得る。
　本明細書では、「処置」とは、治療および予防を意味する。従って、本明細書において「がんを処置することに用いる医薬組成物」とは、がんを治療または予防することに用いる医薬組成物を意味し、抗がん剤を一例として含む意味で用いられる。
　本明細書では、「抗体」は、免疫グロブリンを意味し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の由来は、特に限定されないが例えば、非ヒト動物の抗体、非ヒト哺乳動物の抗体、およびヒト抗体が挙げられる。また、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。また、抗体は、二重特異性抗体であってもよい。
　抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖とが会合した構造を取る。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３からなり、軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなる。
　本明細書では、「抗原結合性断片」とは、抗原への結合性が維持された抗体の一部を意味する。抗原結合性断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域またはその両方を含みうる。抗原結合性断片は、キメラ化またはヒト化されていてもよい。抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（単鎖（Ｆｖ）２）が挙げられる。このような抗体の断片は、特に限定されないが例えば、抗体を酵素で処理して得ることができる。例えば、抗体をパパインで消化すると、Ｆａｂを得ることができる。あるいは、抗体をペプシンで消化すると、Ｆ（ａｂ’）２を得ることができ、これをさらに還元するとＦａｂ’を得ることができる。本発明ではこのような抗体の抗原結合性断片を用いることができる。
　本発明によれば、
　ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体であって以下からなる群から選択される抗体、またはその抗原結合性断片が提供される：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（２）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（３）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（４）配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
（５）上記（１）～（４）の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体；
（６）上記（１）～（４）の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；
（７）上記（１）～（４）の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体；および
（８）上記（１）～（４）の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体。
　本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、
　上記（１）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
　上記（１）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
　上記（１）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
　本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（１ａ）配列番号４で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体、
　上記（１ａ）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
　上記（１ａ）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
　上記（１ａ）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
　本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（２）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
　上記（２）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
　上記（２）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
　上記（２）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
　本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（２ａ）配列番号１２で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体、
　上記（２ａ）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
　上記（２ａ）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
　上記（２ａ）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
　本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（３）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、
　上記（３）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
　上記（３）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
　上記（３）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
　本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（３ａ）配列番号２０で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体、
　上記（３ａ）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
　上記（３ａ）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
　上記（３ａ）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
　本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（４）配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、
　上記（４）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
　上記（４）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
　上記（４）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
　本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
（４ａ）配列番号２８で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３２で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体、
　上記（４ａ）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体、
　上記（４ａ）に記載の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体；若しくは
　上記（４ａ）に記載の抗体のＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てをＣＤＲとして有する抗体；
またはその抗原結合性断片が提供される。
　本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、ＴＭＥＭ１３２Ａの細胞外領域の一部に結合する抗体が提供される。本発明のある態様では、ＴＭＥＭ１３２Ａの細胞外領域の一部は、特に限定されないが例えば、GenBank Accession No.: NP_060340のアミノ酸番号１４３～３１７位の領域またはアミノ酸番号４１１～５９７位の領域であり得る。
　本明細書において、「１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する」とは、ＴＭＥＴＭ１３２Ａに対する結合性を有する抗体が得られる限り、どのような挿入、置換、欠失または付加を有していてもよい。「１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する」とは、例えば、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有することを含む意味で用いられ得る。アミノ酸の置換は、例えば、保存的アミノ酸の置換とすることができる。このような挿入、置換、欠失または付加は、部位特異的変異導入法などにより当業者であれば可能である。このような挿入、置換、欠失または付加はまた、競合抗体において発見されることもある。
　本明細書において、「８０％以上の同一性を有する」とは、参照抗体に対して目的の抗体のアミノ酸配列の同一性を確認する場合には、２つのアミノ酸配列をアミノ酸配列の一致が最大となるようにアラインメントしたときに、共通するアミノ酸の数が参照抗体のアミノ酸配列に対して８０％以上であることを意味する。上記同一性は、８０％以上とすることができ、８５％以上とすることができ、９０％以上とすることがで、９５％以上とすることができ、９８％以上とすることができ、９９％以上とすることができる。「８０％以上の同一性を有する」抗体は、部位特異的変異導入法などにより当業者であれば可能である。このような挿入、置換、欠失または付加はまた、競合抗体において発見されることもある。
　本発明の抗体は、抗原をＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質（例えば、ヒトＴＭＥＭ１３２Ａのアミノ酸配列は、GenBank Accession No.: NP_060340とすることができる）として当業者に周知の方法により得ることができる。すなわち、抗原とアジュバントとを動物に免疫することと、免疫した動物の血漿を得ることによりポリクローナル抗体を得ることができる。あるいは、抗原とアジュバントとを動物に免疫し、免疫した動物からＢリンパ球を得て、ミエローマと細胞融合させてハイブリドーマを形成させ、所望の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングして得てもよい。
　キメラ抗体は、本分野において周知の方法により作製することができる。例えば、抗体の定常領域をヒトの抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。
　ヒト化抗体は、例えば、ヒト以外の動物由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびヒト抗体由来の定常領域とを含む。ヒト化抗体は、例えば、上記のＣＤＲをヒト抗体に移植して得ることができる。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体を産生する遺伝子改変マウスに抗原を免疫することにより得ることができる。二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープまたは抗原に結合することができる抗体であって、当業者に周知の方法で調製することができる。二重特異性抗体は、例えば、２つの異なる抗体を産生する細胞をさらに融合して、ハイブリッドハイブリドーマを作製する方法や、ＶＨ領域とＶＬ領域を、上記２つの領域間では対を形成できない短いリンカーを介して１本のポリペプチド鎖上で発現させ、別のポリペプチド鎖であって、前記ＶＨ領域とＶＬ領域と対形成する相補的なＶＨ領域とＶＬ領域を有するポリペプチド鎖と複合体を形成させることにより作製できる。
　ある抗体と抗原との結合において競合する抗体は、当業者に周知の競合アッセイなどにより得ることができる。競合アッセイで、例えば、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０～５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、所望の抗体の結合をブロックすることができるならば、同じ抗原に対する結合において競合する抗体とすることができる。競合する抗体は、交差ブロッキングアッセイ、好ましくは、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより確認することができる。交差ブロッキングアッセイでは、抗原を、例えばマイクロタイタープレート上にコーティングし、ここに候補となる競合抗体存在を添加してインキュベートし、抗原と候補抗体との結合を形成させる。その後、所望の抗体を標識した上でさらにウェルに添加してインキュベートし、洗浄して、所望の抗体の結合量を定量することにより、抗体が競合したか否かを判断することができる。競合する場合には、ウェル中に残存する標識量が少なくなるはずである。
　本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａは、がん細胞に広く発現する。ＴＭＥＭ１３２Ａは、特に、上皮性のがん細胞（例えば、大腸がん細胞、膵臓がん細胞、卵巣がん細胞、および乳がん細胞）に発現する。一方で、ＴＭＥＭ１３２Ａは、正常組織では発現が確認されなかった。従って、本発明によれば、がんの診断方法であって、対象から得られた生体試料中に、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かを決定することを含む方法が提供される。本発明によればまた、がん細胞の検出方法であって、対象から得られた生体試料中に、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かを決定することを含む方法が提供される。本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体を用いて、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かを決定することができる。本発明によれば、本発明の抗体を用いて、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かを決定することができる。本発明のがんの診断方法は、がんであると診断された対象に対して、化学療法および放射線療法などのがんの治療法を実施することをさらに含んでいてもよい。
　本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａは、がん細胞の細胞表面に表出する。従って、本発明によれば、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートが提供される。本発明で用いられる細胞傷害剤としては、例えば、抗がん活性を有する物質が挙げられる。抗がん活性を有する物質は、がんに接触させた場合に、がんのサイズの低下、がんのサイズの増大の遅延若しくは停止、がんの増殖の遅延若しくは停止、またはがんの転移の阻害を生じさせる物質をいう。抗がん活性を有する物質としては、抗がん剤、毒素、およびラジオアイソトープなどが挙げられ、本発明で用いることができる。本発明によればまた、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートを含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物が提供される。がんは上皮性のがん（例えば、大腸がん、膵臓がん、卵巣がん、および乳がん）とすることができる。
　本発明のある態様では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）などの細胞傷害活性を有し得る。特にＴＭＥＭ１３２Ａはがん細胞の表面に表出するタンパク質であるため、本発明の抗体の標的として好ましい。
　抗体は、そのＡＤＣＣ活性を高める観点では、例えば、定常領域に用いるヒトの抗体のサブタイプはＩｇＧ１とすることができる。抗体は、そのＡＤＣＣ活性を高める観点では、例えば、Ｆｃ領域に１以上のＮ－結合型糖鎖が結合し、該Ｎ－結合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体であってもよい。
　本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成物または薬剤は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、本発明の医薬組成物または薬剤は、薬学上許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。賦形剤は、有効成分である本発明の抗体の有効量を対象に与えるために適宜投与されうる賦形剤とすることができる。ある態様では、本発明の医薬組成物または薬剤は、注射剤とすることができ、注射用の賦形剤は、無菌の水性溶液、例えば、リンガー溶液、ハンクス溶液または生理食塩水などの薬学的に許容可能な緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液とすることができる。補助剤としては、エタノールなどのアルコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルコール、ポリソルベート８０などの非イオン性界面活性剤などが挙げられ、製剤化の際に添加することができる。注射用の油性液としては、ゴマ油、ヤシ油および大豆油を用いることができ、補助剤として、安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールを用いることができる。本発明の医薬組成物または薬剤は、注射剤の形で非経口投与（例えば、静脈内投与または胸腔内投与）することができる。
　抗体のＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性は、当業者に周知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣ活性は、例えば、がん細胞とＦｃ受容体を発現するエフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞や単球）を本発明の抗体の存在下で生理的条件下でインキュベートし、中皮腫細胞の生細胞数および／または死細胞数をカウントすることにより決定することができる。ＣＤＣ活性は、例えば、がん細胞を補体を含む溶液（例えば、ヒト血清）と抗体存在下で生理的条件下でインキュベートし、がん細胞の生細胞数および／または死細胞数をカウントすることにより決定することができる。
　細胞傷害活性は、当業者に周知の種々の方法によって増強することができる。例えば、Ｆｃ領域糖鎖のフコースが欠失した抗体、糖鎖にバイセクティングＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合した抗体、Ｆｃ領域のアミノ酸置換によりエフェクター細胞のＦｃ受容体と抗体との結合を増強し、これにより細胞傷害活性を増強する方法が知られ、このように改変した抗体も本発明の抗体として用いることができる。
　抗体は、ヒトにおける抗体自体の抗原性を低下させること等を目的として、当業者に周知の方法により、遺伝子改変抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体とすることができる。本発明の医薬組成物または薬剤においては、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。抗体はまた、二重特異性抗体であってもよい。
　また、本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとのコンジュゲートが提供される。本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片とイメージングプローブとのコンジュゲートを含む、がんをイメージングすることに用いるための組成物、がんの診断キット、またはがんの診断薬が提供される。がんをイメージングすることに用いるための組成物、がんの診断キット、またはがんの診断薬では、がんは上皮性のがん細胞（例えば、大腸がん細胞、膵臓がん細胞、卵巣がん細胞、および乳がん細胞）とすることができる。
　本発明で用いることができるイメージングプローブとしては、例えば、蛍光イメージングプローブ、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用造影剤などの増強剤（例えば、常磁性イオン）およびＰＥＴ分子イメージングプローブなどのイメージング用の放射性核種が挙げられる。
　本発明によれば、がんを処置する医薬の製造のための、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。本発明によれば、がんをイメージングすることに用いるための組成物、がんの診断キット、またはがんの診断薬の製造のためのＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。
　本発明によれば、がんをその必要のある対象において処置する方法であって、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体を前記対象に投与することを含む、方法が提供される。本発明によればまた、がんをその必要のある対象において処置する方法であって、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体またはその抗原結合性断片と細胞傷害剤とのコンジュゲートを前記対象に投与することを含む、方法が提供される。
実施例１：ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質の精製とモノクローナル抗体の作製
　本実施例では、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質に対する抗体を取得するため、抗原としてＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質を作製して精製タンパク質を得た。
１）抗原作製
　ＴＭＥＭ１３２Ａの遺伝子が組み込まれているベクター(ORIGENE RC214846)に対して、以下のプライマーを用いて常法に従ってPCR増幅を行った。ＤＮＡポリメーラーゼとしては、PrimeStar HS DNA polymerase (takara R010A)を用い、各々抗原のＣ末端には６×Ｈｉｓタグ配列を付加するよう設計した。
免疫抗原Ｉ　増幅用プライマー配列
　catatgttccacctcaaagggcaggattg （配列番号３３）
　gtcgaccttgaagcggtctagcttggcagtc （配列番号３４）
免疫抗原ＩＩ　増幅用プライマー配列
　catatgaatacagcaccactgactggagtg （配列番号３５）
　gtcgacttccagagaggctacacgcgagtccag （配列番号３６）
ここで、免疫抗原Ｉは、ＴＭＥＭ１３２Ａの細胞外領域の一部（GenBank Accession No.: NP_060340のアミノ酸番号１４３～３１７位の領域）に対応し、免疫抗原ＩＩは、ＴＭＥＭ１３２Ａの細胞外領域の別の一部（GenBank Accession No.: NP_060340のアミノ酸番号４１１～５９７位の領域）に対応する。
　次に、得られたＰＣＲ増副産物を発現ベクターｐＥＴ２１ｂに組込んだ。具体的には、ｐＥＴ２１ｂとＰＣＲ増副産物それぞれに対して、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩ（Takara）を製造者プロトコルに従って２時間反応させた。その後、１％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ切断断片を分離し、ゲルから切り出してpromega wizard SV gal and PCR clean-up systemキットを用いて精製した。
　Ligation high（東洋紡）を用いて30分間上記発現ベクターと免疫抗原ＩまたはＩＩを含むインサートを反応させた。
　Competent High DH5α（東洋紡）を用いて形質転換させ、ＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬ）プレートで培養した。形質転換した大腸菌からプラスミドを抽出してシーケンスを行って目的遺伝子がベクターに挿入されていることを確認した。
　次に、タンパク質発現用大腸菌であるＢＬ２１（ＤＥ３）に目的遺伝子を有する発現ベクターを形質転換して導入した。その後、形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）をクローニングした。
　形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）を１０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃、１６時間培養した培地を１ＬのＬＢ培地に移し替え、３７℃で培養した。ＯＤ６００ｎｍの値が０．６になったところで、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘導し、さらに４時間培養した。
　４時間後、大腸菌を菌体破砕して、その沈殿物を変性緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、６Ｍ塩酸グアニジン）で懸濁し、１６時間浸透させた後に、サンプルの上清を回収してニッケルカラムにて精製した。
２）ＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現株細胞の作製
　ＴＭＥＭ１３２Ａ遺伝子（Genbank Accession No.: NM_017870.3）及びＦｌａｇ配列を組み込んだpIRES2-AcGFP1(Clontech) plasmid 0.5μgを0.1mLのOpti-MEM(invitrogen)で希釈し、Lipofectionamine LTXを2.5μL添加して、トランスフェクション用の調製液を得た。室温で静置し２５分後、ＤＬＤ１細胞（４×１０4細胞／ウェル）を含む２４ウェルプレート(corning)に上記で得られた調製液を添加した。トランスフェクション後に、０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（ThermoFisher）を培地に加え１４日間培養した細胞に対してＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター（ＢＤ）を用いてＧＦＰ発現細胞のみを取得した。
　得られた細胞を９６ウェルプレートに限外希釈した。細胞のコロニーが単一であったウェルに対し、ウエスタンブロットを行った。Ｆｌａｇ配列が確認できた細胞を強制発現細胞とした。
３）抗体作製
　ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈した上記免疫抗原Ｉまたは免疫抗原ＩＩとＦｒｅｕｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔとを１：１で混合して調製したエマルジョンをマウス（日本ＳＬＣ、Ｂａｌｂ／ｃ、メス、６～８週令）腹腔内に１００μＬずつ投与した。以降１４日ごとにアジュバント（Ｇｅｒｂｕ　ａｄｊｕｖａｎｔ１００、Ｇｅｒｂｕ　ＧｍｂＨ．など）と混合した免疫抗原を腹腔に投与した。３回目の免疫から免疫７日後に、ＰＢＳで１００尾静脈から採血し調製した抗血清を用いて、免疫抗原を固相としたＥＬＩＳＡまたはＤＬＤ－１細胞若しくはＫ５６２細胞に対するフローサイトメトリーで血清抗体価を評価し、細胞融合に用いる免疫マウス個体を選択した。十分に抗体価が上がったと判断した個体には、最終免疫としてＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した免疫抗原を腹腔から１００μＬ、尾静脈から４００μＬ投与した。最終免疫から３日後に脾臓、腸骨リンパ節、鼠径リンパ節、腋下リンパ節および膝下リンパ節を摘出し、ＰＥＧ法にてマウスミエローマ細胞ｐ３Ｘ６３と融合した。融合１０日～１４日後にハイブリドーマの培養上清を回収した。フローサイトメトリーにてＤＬＤ－１細胞に陽性、ＤＬＤ－１　ＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現細胞に強陽性、Ｋ５６２細胞に陰性を示す抗体産生ハイブリドーマ細胞を選択した。選択した抗体産生ハイブリドーマ細胞は限界希釈法にて単クローン化、樹立した。このようにして、免疫抗原ＩＩからＴ６－０４２９クローン、Ｔ６－１０２２クローン、およびＴ６－１１７９クローンを、免疫抗原ＩからＴ６－１４７５クローンを得た。これらのクローンから得られたモノクローナル抗体は、Ｔ６－０４２９抗体、Ｔ６－１０２２抗体、Ｔ６－１１７９抗体およびＴ６－１４７５抗体と呼ぶ。抗体のアイソタイプはアイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ）で判定した。Ｔ６－０４２９抗体はＩｇＧ２ａ、Ｔ６－１０２２抗体はＩｇＧ２ａ、Ｔ６－１１７９抗体はＩｇＧ１およびＴ６－１４７５抗体はＩｇＧ２ａであった。
実施例２：ＴＭＥＭ１３２Ａに結合するモノクローナル抗体によるがん細胞の認識能
　本実施例では、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合するモノクローナル抗体が正常組織とは反応しない一方で、がん細胞を認識することを見出した。
フローサイトメトリー
　測定対象とするがん細胞を培地に懸濁し、１×１０5個／ウェルとなるようにＶ底９６ウェルプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ）に添加した。プレートを４４０×ｇ、４℃、３分遠心してから上清を除き、細胞ペレットに抗体産生ハイブリドーマ培養上清もしくは抗体溶液を５０μＬ／ウェルで加えて懸濁した。４℃で４５分反応させた後、０．１％ＢＳＡ／２ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ　２００μＬ／ウェルで３回洗浄した。上清を除き、細胞ペレットに二次抗体を５０　μＬ／ウェルで加えて懸濁した。なお二次抗体としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｒａｔ　ＩｇＧ（Ｈ－Ｌ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を０．１％ＢＳＡ／２ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳで４００倍に希釈したものを用いた。４℃で４５分反応させた後、０．１％ＢＳＡ／２ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ　２００μＬ／ウェルで３回洗浄した。上清を除き、細胞ペレットに１μｇ／ｍＬ　Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ／０．１％ＢＳＡ／２ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳを２００μＬ／ウェルで加えて懸濁した。このように染色した細胞をＧｕａｖａ　ｅａｓｙＣｙｔｅ　８ＨＴ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）等のフローサイトメーターを用いて測定し、得られたデータをＦｌｏｗＪＯ（トミーデジタルバイオロジー）で解析した。
　上記フローサイトメトリーの手法の通りに、ヒト大腸がん細胞株ＤＬＤ－１若しくは実施例１で作製したＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現ＤＬＤ－１株またはＴＭＥＭ１３２Ａ陰性の細胞株Ｋ５６２とＴ６－０４２９抗体とを用いて抗体のがん細胞認識能を確認した。Ｔ６－０４２９抗体はＡｌｅｘａ６４７標識した抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。結果は、図１に示される通りであった。
　図１に示されるように、ＤＬＤ－１株にはＴＭＥＭ１３２Ａ抗体であるＴ６－０４２９抗体が結合することが明らかとなった。また、ＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現ＤＬＤ－１株では、Ｔ６－０４２９抗体がより多く結合することが明らかとなった。さらに、Ｋ５６２株に対しては、Ｔ６－０４２９抗体の結合が確認できなかった。このことから、ＴＭＥＭ１３２Ａは、大腸がんを検出することができることが明らかとなった。また、ＴＭＥＭ１２３２Ａは、がんの細胞膜上に表出していることも明らかとなった。
　次に、大腸がん組織アレイを用いてＴＭＥＭ１３２Ａに結合するモノクローナル抗体が大腸がんを検出できることを示した。
まず、Ｔ６－０４２９抗体が免疫組織学染色に利用可能な抗体であることを確認するために、ＤＬＤ－１株とＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現ＤＬＤ－１株とを対象として、Ｔ６－０４２９抗体を用いて免疫化学染色を行った。
　まず、適当量の細胞をチャンバースライドに播種し、３７℃でインキュベーション（ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔ）した。上清を除去して、ＤＰＢＳでウェルを洗浄した後、冷アセトンを添加（アセトン固定）した。室温で１０分間静置し、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、３％Ｈ2Ｏ2（３０％Ｈ2Ｏ2を超純水で希釈）を添加した。室温で２０分間静置した。PBS-Tで3回洗浄した後に、５％スキムミルクを含むＰＢＳ－Ｔを添加して、室温で３０分間静置した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、ＨＲＰ直接標識－Ｔ６－０４２９抗体（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、ＤＡＢ染色（室温で５分間静置）した。超純水で洗浄した後に、ヘマトキシリン染色（室温で２分間静置）した。水道水中に浸漬して、１０分間静置した。さらに、エタノールに２分間×３回、キシレンに２分間×３回それぞれ浸漬して、脱水透徹した。マウントクイックを用いて封入し、乾燥させた後、顕微鏡により染色像を観察した。
　結果は、図２に示される通りであった。図２に示されるように、ヒト大腸がん細胞株ＤＬＤ－１は、Ｔ６－０４２９抗体陽性であった。また、ＴＭＥＭ１３２Ａ強制発現ＤＬＤ－１株は、ＴＭＥＭ１３２Ａを強く発現しており、Ｔ６－０４２９抗体に対して強い陽性反応を示した。
　大腸がん組織アレイは、BioChain Institue Inc.(Newark, CA)から入手し、実験に用いた。製造者マニュアルに従い、各組織アレイを染色した。抗体としては、Ｔ６－０４２９抗体（１０μｇ／ｍＬ）を用いた。結果は図３に示される通りであった。図３に示されるように、正常大腸組織には、Ｔ６－０４２９抗体では検出可能な染色像は得られなかったが、大腸がん組織に対しては、その３割程度がＴ６－０４２９抗体陽性であった。このことから、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体は、大腸がんを検出することができることが示された。乳がん組織アレイもBioChain Institue Inc.(Newark, CA)から入手し、同様に確認したところ、約２０％が陽性であることが分かった。このことから、ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体は、乳がんを検出することができることが示された。
　さらに、Ｔ６－０４２９抗体（１０μｇ／ｍＬ）を用いて正常組織を認識しうるか否かを確認した。正常組織検体から常法に基づいてパラフィン切片を作製し、Ｔ６－０４２９抗体（１０μｇ／ｍＬ）を用いて免疫組織学染色を行った。具体的には、薄切サンプルもしくは凍結保存サンプルを風乾（室温で３０分程度）させた。冷アセトンを添加して、室温で１０分間静置（アセトン固定）した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、３％Ｈ2Ｏ2（３０％Ｈ2Ｏ2を超純水で希釈）を添加し、室温で２０分間静置した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、５％スキムミルクを含むＰＢＳ－Ｔを添加して、室温で３０分間静置した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、ＨＲＰ直接標識Ｔ６－０４２９抗体（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、ＤＡＢ染色（室温で５分間静置）した。超純水で洗浄した後に、常法に従ってヘマトキシリン染色（室温で２分間静置）した。水道水中に浸漬して、１０分間静置した。さらにエタノールに２分間×３回、キシレンに２分間×３回それぞれ浸漬して、脱水透徹した。マウントクイックを用いて封入し、乾燥させた後、顕微鏡により染色像を観察した。
　結果は、図４～７に示される通りであった。図４～７に示されるように、Ｔ６－０４２９抗体は、皮膚、脳、小腸、肝臓、心臓、肺および腎臓のいずれの正常組織でも陰性であった。ただし、正常皮膚組織では限定的な陽性部位が確認された（図７参照）。
　また、抗ＴＭＥＭ１３２Ａ抗体を用いて、各種上皮性がん細胞株のＦＡＣＳによる検出を試みた。
　具体的には、測定対象とするがん細胞を培地に懸濁し、1×105個/wellとなるようにV底96ウェルプレート(corning)に添加した。プレートを440×g、4℃、3分遠心してから上清を除き、細胞ペレットに抗体産生ハイブリドーマ培養上清もしくは抗体溶液を50 μL/wellで加えて懸濁した。氷上で45分反応させた後、0.1%BSA/2mM EDTA/PBS 200 μL/wellで3回洗浄した。上清を除き、細胞ペレットに二次抗体を50 μL/wellで加えて懸濁した。二次抗体としてAlexaFluor647 Goat anti-Rat IgG(H-L)（Life Technologies）を0.1%BSA/2mM EDTA/PBSで400倍に希釈したものを用いた。氷上で45分反応させた後、0.1%BSA/2mM EDTA/PBS 200 μL/wellで3回洗浄した。上清を除き、細胞ペレットに50 ng/mL Propidium Iodide/0.1%BSA/2mM EDTA/PBSを250 μL/wellで加えて懸濁した。このように染色した細胞をGuava easyCyte 8HT（Merck Millipore）等のフローサイトメーターを用いて測定し、得られたデータをFlowJO（トミーデジタルバイオロジー）で解析した。
　がん細胞株としては、乳がん細胞株、大腸がん細胞株、卵巣がん細胞株、膵臓がん細胞株を用いた。
　結果は、下記表１に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示されるように、ＴＭＥＭ１３２Ａは、乳がん細胞株、大腸がん細胞株、卵巣がん細胞株および膵臓がん細胞株などのがん細胞の細胞表面に広く発現することがＦＡＣＳ解析により明らかとなった。
　このことから、抗ＴＭＥＭ１３２Ａ抗体は、がんの検出に有用であることが明らかとなった。また、抗ＴＭＥＭ１３２Ａ抗体にＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を保持させること（例えば、抗体のアイソタイプをＩｇＧ１やＩｇＧ３などのＡＤＣＣ活性の高いアイソフォームに変換すること）によってがんの処置に有用であることも示唆された。
実施例３：モノクローナル抗体の配列決定
　本実施例では、モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を決定した。
　実施例１において得られたＴ６－０４２９クローン、Ｔ６－１０２２クローン、Ｔ６－１１７９クローンおよびＴ６－１４７５クローンから、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した。上記total RNAから、SMARTer RACE 5’/3’Kit(takara)を用いて5’末端RACE(rapid amplification of cDNA ends)法を用いてcDNAを合成した。
　得られたｃＤＮＡを鋳型として、KOD FX Neo（東洋紡）を用いて目的遺伝子を増幅した。増幅条件はDenature 98℃, 10秒、Anneal 68℃, 30秒, Extend, 72℃ 90秒 5サイクル、Denature 98℃, 10秒、Anneal 65℃, 30秒、Extend,68℃ 90秒 5サイクル、Denature 98℃, 10秒、Anneal 63℃, 30秒, Extend 68℃, 90秒 25サイクルのタッチダウンPCR法を用いた。ＰＣＲは、PCR装置（Applied Biosystem ProFlex PCR System）を用いて実施した。
　上記ＰＣＲにおいては、以下のプライマー配列を使用した。
重鎖用フォワードプライマー：
　CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（配列番号３７）または
　CTAATACGACTCACTATAGGGC（配列番号３８）
重鎖用リバースプライマー：
　CCCATGGCCACCARATTCTYATCAGACAG（配列番号３９）
軽鎖用フォワードプライマー：
　CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（配列番号４０）
　CTAATACGACTCACTATAGGGC（配列番号４１）
軽鎖用リバースプライマー：
　GTTGTTCAWGARGCACACGACTGAGGCA（配列番号４２）
　増幅したＨ鎖及びＬ鎖のＰＣＲ産物をTarget Clone-plus-(東洋紡)を用いてＴＡクローニングを行った。クローニング後、ＤＨ５α（東洋紡）に形質転換し、シングルコロニーからプラスミドをPlasmid Mini Kit (QIAGEN)を用いて抽出した。クローニングしたＨ鎖、Ｌ鎖各々の遺伝子をABI PRISM 3100 Genetic Analyzerを用いて遺伝子の塩基配列を解析した。結果は、以下表に示される通りであった。重鎖可変領域において、アミノ酸番号１～１９位はシグナル配列であり、軽鎖可変領域において、アミノ酸番号１～２０はシグナル配列であった。ただし、Ｔ６－１４７５クローンの重鎖可変領域に関しては、アミノ酸番号１～１８位がシグナル配列であった。
Ｔ６－０４２９クローンの重鎖可変領域（配列番号４）
　ＣＤＲ１：配列番号１、ＣＤＲ２：配列番号２、ＣＤＲ３：配列番号３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Ｔ６－０４２９クローンの軽鎖可変領域（配列番号８）
　ＣＤＲ１：配列番号５、ＣＤＲ２：配列番号６、ＣＤＲ３：配列番号７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Ｔ６－１０２２クローンの重鎖可変領域（配列番号１２）
　ＣＤＲ１：配列番号９、ＣＤＲ２：配列番号１０、ＣＤＲ３：配列番号１１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Ｔ６－１０２２クローンの軽鎖可変領域（配列番号１６）
　ＣＤＲ１：配列番号１３、ＣＤＲ２：配列番号１４、ＣＤＲ３：配列番号１５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
Ｔ６－１１７９クローンの重鎖可変領域（配列番号２０）
　ＣＤＲ１：配列番号１７、ＣＤＲ２：配列番号１８、ＣＤＲ３：配列番号１９
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Ｔ６－１１７９クローンの軽鎖可変領域（配列番号２４）
　ＣＤＲ１：配列番号２１、ＣＤＲ２：配列番号２２、ＣＤＲ３：配列番号２３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Ｔ６－１４７５クローンの重鎖可変領域（配列番号２８）
　ＣＤＲ１：配列番号２５、ＣＤＲ２：配列番号２６、ＣＤＲ３：配列番号２７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Ｔ６－１４７５クローンの軽鎖可変領域（配列番号３２）
　ＣＤＲ１：配列番号２９、ＣＤＲ２：配列番号３０、ＣＤＲ３：配列番号３１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　配列表には以下の配列が記載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010

Claims (17)

  1. 　ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体であって以下からなる群から選択される抗体、またはその抗原結合性断片：
    （１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
    （２）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；
    （３）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；および
    （４）配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体；並びに
    （５）上記（１）～（４）の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体；および
    （６）上記（１）～（４）の抗体とそのＣＤＲのアミノ酸配列において１～数アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加を有する抗体。
  2. 抗体が、
    （１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
    　上記（１）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
    である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  3. 　配列番号４で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  4. 　抗体が、
    （２）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
    　上記（２）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
    である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  5. 　配列番号１２で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  6. 　抗体が、
    （３）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２２、および配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
    　上記（３）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
    である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  7. 　配列番号２０で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  8. 　抗体が、
    （４）配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む抗体、若しくは、
    　上記（４）に記載の抗体とＴＭＥＭ１３２Ａとの結合において競合する抗体
    である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  9. 　配列番号２８で示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３２で示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  10. 　ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体を含む、がんの診断薬。
  11. 　抗体が、請求項１～９のいずれか一項で定義された抗体である、請求項１０に記載のがんの診断薬。
  12. 　対象においてがん細胞を検出する方法であって、
    　対象から得られた生体試料中に、ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かを決定することを含む、方法。
  13. 　請求項１２に記載のがん細胞の検出方法であって、
    　ＴＭＥＭ１３２Ａタンパク質が存在するか否かをＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体により決定する、方法。
  14. 　請求項１３に記載のがん細胞の検出方法であって、
    　抗体が、請求項１～９のいずれか一項で定義された抗体である、方法。
  15. 　ＴＭＥＭ１３２Ａに結合する抗体を含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物。
  16. 　抗体が、請求項１～９にいずれかで定義された抗体である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 　抗体が、細胞傷害剤とのコンジュゲートの形態である、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
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