WO2018018170A1 - Uso de extractos de quillaja saponaria para la prevención y control de infecciones bacterianas en peces - Google Patents

Uso de extractos de quillaja saponaria para la prevención y control de infecciones bacterianas en peces Download PDF

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Trinidad SCHLOTTERBECK SUÁREZ
Hernán Alberto CAÑON JONES
Mario Hernán CASTILLO RUIZ
Hernán Danilo CORTÉS GONZÁLEZ
Ricardo Manuel Guillermo SAN MARTÍN GAMBOA
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Saponin Research Center S.A.
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Definitions

  • the present invention relates to the aquaculture industry, and particularly provides a new use of extracts of the Quillaja saponaria plant for the prevention and control of bacterial diseases in fish, as well as compositions comprising said extracts.
  • Piscirickettsiosis affects fish during their productive cycle in seawater, causing high mortality rates that reach 75% and economic losses in the industry of the order of hundreds of millions of dollars (Henr ⁇ quez, P., Kaiser, M., Bohle, H., Bustos, P., & Mancilla, M. (2016). Journal of fish diseases 39 (4) 441-448).
  • Reported symptoms of systemic infection caused by P. salmonis in fish include colonization of organs such as kidneys, liver, spleen, intestine, brain, ovaries and gills (Rozas, M., & Enriquez, R. (2014). Journal of fish diseases, 37 (3), 163-188).
  • organs such as kidneys, liver, spleen, intestine, brain, ovaries and gills.
  • Quillay is a tree native to Chile whose biomass is mainly used as a soap substitute due to the presence of saponins (San Mart ⁇ n, R. (1999). Economic Botany, 53 (3), 302-31 1).
  • Saponins can be obtained industrially as powder or liquid extracts, and can be in a state purified, partially purified or unpurified. These extracts are marketed by various companies, being one of the most important Natural Response and Desert King (San Mart ⁇ n, R. and Briones, R. (2000). Journal of the Science of Food and Agriculture, 80 (14), 2063- 2068). To date, extracts rich in saponins are used as natural emulsifiers in cosmetics, food and beverages.
  • PCT patent application WO2015155293 describes an oral composition or as a food additive for use in the prevention and / or treatment of infections in fish and particularly describes a composition comprising saponins of Quillaja saponaria as a prophylactic treatment or copepod of ectoparasites of the Caligus genus of fish.
  • saponins of Quillaja saponaria as a prophylactic treatment or copepod of ectoparasites of the Caligus genus of fish.
  • WO2015179840 describes combinations or compositions comprising Yucca schidigera and Quillaja saponaria, and additionally include antimicrobial, antibiotic and anticoccidial agents, for administration in animals to prevent diseases. As general disclosure describes that it can be applied orally to fish.
  • Application WO0151083 describes an adjuvant composition containing a saponin and an oligonucleotide comprising at least one dinucleotide of CpG not methylated.
  • the composition includes saponins derived from Quillaja saponaria, and even more preferably, the saponin is chemically modified or integrates a substantially pure saponin (QS-7, QS-17, QS-18 or QS-21). The use in fish is not described.
  • the Chilean patent application CL200402942 discloses a fish feed additive formulated based on the purified quillay extract ⁇ Quillaja saponaria Molina) comprising between 15-25% w / w triterpenic saponins obtained from said extract and 75-85% p / p of potato maltodextrin. This document does not mention that this food promotes the health of the fish.
  • the present invention discloses a new use of quillay extracts for the prevention and control of bacterial diseases in fish.
  • An object of the invention is an extract of Quillaja saponaria useful for manufacturing a medicinal composition for the prevention and control of a bacterial disease in fish.
  • Said medicinal preparation is administered to the fish orally in a dose range between 0.9-12 mg of saponins per kilogram of live weight of the fish. Administration to fish is done orally in combination with a food.
  • the bacterial disease is caused by a Gram negative bacterium, wherein said bacterium is selected from the group consisting of the genera Piscirickettsia, Aeromonas and Vibrio, and in a preferred embodiment, the bacterium belonging to the genus Piscirickettsia is Piscirickettsia salmonis .
  • the bacterial disease is caused by a Gram positive bacterium, preferably belonging to the Renibacterium genus.
  • quillay extracts is preferably used in salmonid fish, which are selected from the group consisting of the species Salmo salar, Salmo trutta, Salmo gairdnerii, Oncorhynchus mykiss and Oncorhynchus kisutch.
  • Another object of the present invention is a medicinal composition for the prevention and control of a bacterial disease in fish, which comprises an extract of Quillaja saponaria and an appropriate excipient.
  • Quillaja saponaria extract is found in a proportion between 2 to 90% w / w of the total weight of the composition.
  • the present invention also provides a food composition for the prevention and control of a bacterial disease in fish comprising an extract of Quillaja saponaria and an appropriate additive.
  • Quillaja saponaria extract is found in a proportion less than 6% w / w of the total weight of the composition.
  • Figure 1 is a chromatographic profile of a complete extract of Quillaja saponaria Molina measured by HPLC, where the main saponins QS7, QS17, QS18 and QS21 are indicated.
  • Figure 2 is an image obtained by optical microscopy of the ASK salmonid cell line in the presence of different concentrations of quillay extracts UD100-Q (Ultra Dry® 100-Q) and QD100 (Quillaja Dry® 100).
  • the present invention describes a new use of extracts of the quillay plant ⁇ Quillaja saponaria) for the prevention and control of bacterial infections that affect fish.
  • the inventors have proven that different saponin extracts of Quillaja saponaria Molina, endemic plant of Chile, have a protective effect against bacterial infections that affect the cultivation of salmonids.
  • the inventors have come to obtain adequate dose concentrations of the keel extracts to be used safely in salmon, without pathophysiologically altering the treated individuals.
  • the present invention relates to the use of quillay extracts that have a specific saponin profile.
  • the saponin profiles of these extracts are unique and exclusive to quillay, either in purified, partially purified or unpurified extracts.
  • Complete or unfractionated extracts of quillay (Quillaja saponaria Molina) have a characteristic and proprietary saponin profile containing over 100 types of chemically different saponins.
  • the main saponins correspond to QS7, QS17, QS18 and QS21, as seen in the chromatographic profile of Figure 1.
  • the relative concentrations of these saponins depend on the origin of the raw material.
  • partially purified extracts (between 2 to 90% w / pop / v of saponins depending on the powder or liquid product) contain non-saponinic compounds that essentially include a mixture of polyphenols and, in smaller quantities, other sugars.
  • Quillay saponin extracts can be obtained industrially as powder or liquid extracts, with varying degrees of purification.
  • various commercial extracts of Quillaja saponaria such as those shown in Table 1 below, can be used for the purposes of the present invention.
  • Ultra Dry® Extract of Quillaja saponaria Molina powder contains 100-Q mainly triterpenic saponins greater than 65% w / w.
  • Quillaja Dry® Quillaja Saponaria Molina powder extract contains 25% 100 w / w saponins.
  • Vax Sap ® powder It mainly contains triterpenic saponins greater than 90% w / w.
  • the present invention discloses the use of Quillaja saponaria extracts to prepare a medicinal composition and a food composition for the prevention and / or control of unwanted medical conditions related to bacterial diseases in fish.
  • Quillaja saponaria extracts of the present invention drugs whose purpose is to prevent, control, cure, treat or alleviate bacterial diseases in fish can be obtained; and also food products for medicinal use that have therapeutic properties for the same purposes can be obtained.
  • the present invention encompasses the use of Quillay extracts against bacteria that affect fish, including Gram negative bacteria such as Piscirickettsia salmonis, Aeromonas salmonicida and Vibrio sp; and Gram positive bacteria such as Renibacterium salmoninarum, or any other bacteria that affect the health of fish, whether in freshwater or seawater.
  • Gram negative bacteria such as Piscirickettsia salmonis, Aeromonas salmonicida and Vibrio sp
  • Gram positive bacteria such as Renibacterium salmoninarum, or any other bacteria that affect the health of fish, whether in freshwater or seawater.
  • the most susceptible species of fish are salmonids such as: rainbow trout ⁇ Oncorhynchus mykiss), brook trout ⁇ Salvelinus fontinalis), brown trout ⁇ Salmo trutta), alpine trout ⁇ Salvelinus alpinus), Atlantic salmon ⁇ Salmo salar) , Pacific salmon ⁇ Oncorhynchus spp.), keta salmon ⁇ Oncorhynchus keta), Chinook salmon ⁇ Oncorhynchus tshawytscha), among others.
  • the extracts of Quillaja saponaria in the present invention are used for the preparation of a medicinal product or a food product for the prevention or post-infection control of bacteria in fish. These products are administered orally in solid or liquid form.
  • Quillaja saponaria extracts are found in a proportion between 2% and 90% w / w of the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical form may be in powder, oil suspension or as part of a food pellet.
  • the medicinal composition comprises veterinary excipients suitable for salmonids for administration. oral, such as: lactose, corn starch, silicon dioxide, among others widely known to any person skilled in the art.
  • the food composition comprises food additives suitable for salmonids for oral administration, such as: fishmeal, fish and / or vegetable oil, vitamins, minerals, among others widely known to any person skilled in the art.
  • EXAMPLE 1 Evaluation of toxicity of quillay extracts in vitro and in vivo.
  • Tests of the products of quillay extracts on salmon-derived cell monolayers were performed in order to assess toxicity.
  • the lines used were SHK-1 and ASK.
  • the SHK-1 line described as macrophage-like cells, ⁇ Salmo salar, ECACC Number 971 1 1 106, European Collection of Cell Culture, Salisbury, Wilts, SP4 0JG, UK
  • Leibovitz 15 culture medium L-15, Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA
  • 10% v / v fetal bovine serum Hyclone, Thermo Fischer Scientific, Logan, Utah, USA
  • 4 mM L-glutamine Gibco
  • 1% v / v of 2-mercaptoethanol (2-ME, Gibco) and 50 ⁇ g / mL of gentamicin US Biological, Swampscott, MA, USA.
  • Cell line ASK (Atlantic Kidney Salmon, ATCC® CRL-2747 TM) was grown at 16 ° C in Leibovitz medium (L-15, Hyclone, Thermo Scientific), supplemented with gentamicin (50 g / mL), L-glutamine (4 mM) (Gibco, Thermo Scientific), 2% mercaptoethanol 1% (v / v) (2-ME, Gibco) and 10% fetal calf serum (v / v) (SFB, Hyclone).
  • the fish were kept in fiberglass ponds with a capacity of 1 000 L with independent water supply.
  • the level of oxygen dissolved in the water was about 10 mg / L.
  • Water temperature, oxygen levels and nitrogen compounds were adequately controlled.
  • a food item in the form of extruded pellets (Micro 10, made by Ewos) was available. With this item, five diets with a content of 0, 100, 200, 300 and 600 ppm of saponins / kg of food were prepared. These doses are equivalent to 0, 2, 4, 6 and 12 mg of saponins / kg of live weight of fish, respectively.
  • the fish were divided into 10 individual ponds with 50 fish each (5 groups with duplicate).
  • the fish were fed manually twice a day with the diets described in a certain amount according to the live weight and the expected growth rate of the fish. To be able to do this, the weight of the specimens of this trial was measured on days 0, 30 and 60 post-start of the experiment, in order to obtain data about their growth at each time.
  • the cells were infected with the bacterial inoculum diluted in 1 mL of culture medium (Minimum Essential Medium (MEM, Hyclone) supplemented with HEPES buffer (Hyclone,) (10mM), non-essential amino acids (1 x) (Hyclone,) and 10% fetal calf serum (v / v) (SFB, Hyclone), supplemented additionally with the keel extracts at the concentration to be tested, in particular the Ultra Dry® 100-Q products (UD100Q®, Desert King) (65% w / w saponins) or Quillaja Dry® 100 (QD100®, Desert King) (25% w / w saponins), then the infection capacity of P. salmonis was compared with respect to the untreated inoculum With the extracts.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • HEPES buffer Hyclone, 10mM
  • non-essential amino acids (1 x)
  • SFB Hyclone
  • the efficiency of the infection was quantified by qPCR through the amplification of the 16S ribosomal gene. Each condition was performed in triplicate. As a result, it was obtained that the keel extracts inhibited bacterial replication, where the Ultra Dry® 100-Q product managed to reduce the replication by 97.98% when compared to the untreated control. The Quillaja Dry® 100 product managed to inhibit bacterial replication by 64.40%, as shown in Table 3 below. Table 3. Results of the inhibition of infection of CHSE-214 cells by Piscirickettsia salmonis.
  • the quillay extracts were mixed with fish oil to reach the desired concentrations and then this mixture was impregnated at a ratio of 4.9: 1 (oil: dry pellet) in the fish feed. This was done using an industrial mixer or bitonera and incorporating the oil into the moving food for at least 5 minutes and mixing for at least 10 additional minutes.
  • the dose of saponins per kilogram of live weight of fish to be administered in the range of 0.9 to 12 mg of saponins per kilogram of live weight should be considered as important parameters.
  • the percentage of saponins that have quillay extract products must also be considered. In this way, any person skilled in the art can obtain the proportion of saponins that must be incorporated into the food.
  • EXAMPLE 4 Use of quillay extracts for the prevention and / or treatment of bacterial infections of fish in vivo.
  • each quillay extract product (Ultra Dry® 100-Q or Quillaja Dry® 100, Desert King) was added to food in a dose of 3.75 mg / kg of product.
  • the experiment was designed with the following experimental groups: positive controls (fish challenged with bacteria and fed without products) and negative controls (fish not challenged with bacteria and fed without products), and treatment groups (fish challenged with bacteria and fed with products).
  • the challenge was carried out through an experimental infection with Piscirickettsia salmonis by intraperitoneal injection in the ventral line at a rate of 0.1 mL of inoculum per fish, which had a titer of 3 x 10 6 copies of bacterial genome / mL.
  • Fish from the negative control group were inoculated 0.1 mL of culture medium. All experimental groups followed the following schedule, as indicated in Table 4 below.

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Abstract

La presente invención proporciona un nuevo uso de extractos de quillay útiles para fabricar una composición medicinal para la prevención y control de una enfermedad bacteriana en peces, la que se administra por vía oral preferentemente en combinación con un alimento. Otros objetos de invención se relacionan con la composición medicinal y la composición alimentaria para la prevención y control de una enfermedad bacteriana en peces que comprenden dichos extractos de quillay.

Description

USO DE EXTRACTOS DE QUILLAJA SAPONARIA PARA LA PREVENCIÓN Y CONTROL DE INFECCIONES BACTERIANAS EN PECES
Campo Técnico La presente invención se relaciona con la industria de la acuicultura, y particularmente proporciona un nuevo uso de extractos de la planta Quillaja saponaria para la prevención y control de enfermedades bacterianas en peces, así como composiciones que comprenden dichos extractos.
Antecedentes de la invención Es conocido que la industria salmonera ha crecido significativamente a nivel mundial en las últimas dos décadas; y en particular en Chile, este sector económico se ha vuelto uno de los de mayor relevancia del país. Sin embargo, existen diferentes enfermedades de origen bacteriano que infectan a los peces y que finalmente afectan considerablemente su producción. Dentro de las enfermedades bacterianas que afectan a los peces, la piscirickettsiosis o septicemia rickettsial salmonídea (SRS) es causada por la bacteria Gram-negativa Pisciríckettsia salmonis, un patógeno intracelular facultativo cuya infección es causa de una de las enfermedades más serias de la industria salmonera en Chile. La piscirickettsiosis afecta a los peces durante su ciclo productivo en agua de mar, causando elevadas tasas de mortalidad que alcanzan el 75% y pérdidas económicas en la industria del orden de cientos de millones de dólares (Henríquez, P., Kaiser, M., Bohle, H., Bustos, P., & Mancilla, M. (2016). Journal of fish diseases 39(4) 441 -448).
Los síntomas reportados de la infección sistémica causada por P. salmonis en peces incluyen la colonización de órganos tales como ríñones, hígado, bazo, intestino, cerebro, ovarios y branquias (Rozas, M., & Enríquez, R. (2014). Journal of fish diseases, 37(3), 163-188). Para combatir la piscirickettsiosis se han desarrollado diversas estrategias tales como el cultivo temprano de los peces, la utilización de antibióticos y el desarrollo de vacunas. Un factor que dificulta el control de este patógeno es que los tratamientos en base a vacunas poseen una eficacia limitada y por otro lado las elevadas dosis de antibióticos utilizadas en los cultivos produce resistencia a este tipo de medicamentos (Pulgar, R., Travisany, D., Zuñiga, A., Maass, A., & Cambiazo, V. (2015). Journal of biotechnology, 212, 30-31 ). Además, las medidas preventivas que involucran el uso de vacunas proveen protección a los peces por períodos cortos y no son efectivas en las etapas adultas de los salmones, hacia las fases finales del ciclo productivo (Tobar, J. A., Jerez, S., Caruffo, M., Bravo, C, Contreras, F., Bucarey, S. A., & Harel, M. (201 1 ). Vaccine, 29(12), 2336-2340). Por otra parte, se ha evidenciado la existencia de variantes de P. salmonis resistentes a los antibióticos más utilizados tales como flumequina, enrofloxacino, eritromicina, amoxicilina y ácido oxolínico (Mora, S. J. P., Farías, R. C, Gadicke, L. H. P., Rozas, S. M. (201 1 ). Tesis de medicina veterinaria: "Análisis de antibiogramas de cepas de Piscirickettsia salmonis aisladas de salmones y truchas cultivados en las regiones de los Ríos, Los Lagos y Aysén los años 2007 y 2008". Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Veterinarias). Lo anterior sumado a que la efectividad de los tratamientos y el nivel de protección otorgado depende de diversos factores tales como la inmunobiología de los peces, las condiciones de administración de los tratamientos y de factores ambientales, el control del resultado final se dificulta (Tobar, I. y cois. (2015). Frontiers in immunology, (6) 244). A pesar de los esfuerzos realizados, la elevada frecuencia de nuevos eventos epizoóticos causados por P. salmonis indican que se requieren nuevas alternativas para prevenir y controlar esta enfermedad.
Una alternativa al desarrollo de vacunas y tratamiento con antibióticos es la administración de una alimentación a los peces tal que les permita mejorar su salud. En este sentido se han ensayado dietas que contienen microalgas ricas en ácidos grasos poliinsaturados, glucanos, carotenoides, entre otros. Estos ingredientes pueden promover el bienestar de los peces mejorando la salud intestinal y aumentando la resistencia a enfermedades (Kousoulaki, K. y cois. (2015). Journal of nutritional science, 4, e24).
El quillay es un árbol nativo de Chile cuya biomasa se utiliza principalmente como un sustituto del jabón debido a la presencia de saponinas (San Martín, R. (1999). Economic Botany, 53(3), 302-31 1 ). Las saponinas pueden obtenerse de forma industrial como extractos en polvo o líquidos, y pueden estar en un estado purificado, parcialmente purificado o no purificado. Estos extractos son comercializados por diversas empresas, siendo unas de las más importantes Natural Response y Desert King (San Martín, R. y Briones, R. (2000). Journal of the Science of Food and Agriculture, 80(14), 2063-2068). A la fecha, los extractos ricos en saponinas son utilizados como emulsificantes naturales en cosméticos, alimentos y bebestibles. Adicionalmente se utilizan como adyuvantes para la producción de vacunas y formulaciones farmacéuticas (Maier, C. y cois. (2015). Journal of agricultura! and food chemistry, 63(6), 1756-1762). También se han descrito usos como biocida para la eliminación de nemátodos (US 20050074508), moluscos (US 20070196517) y hongos (Elizondo, E. A. M. y cois. (2010). Agro sur, 38(2), 87-96).
En la revisión de Wang, Y. y cois. (2016), International journal of molecular sciences, 17(3), 325, se describe en relación a animales acuáticos que las saponinas pueden modular el sistema inmune de camarones y de peces, a su vez promoviendo el crecimiento de estos últimos; pero que la mayoría de las saponinas son inestables en condiciones acuosas y son muy tóxicas para los peces a altas concentraciones.
Dentro del estado de la técnica relacionado específicamente con la aplicación de extractos de quillay en peces, la solicitud de patente PCT WO2015155293 describe una composición oral o como aditivo alimenticio para el uso en la prevención y/o tratamiento de infecciones en peces y particularmente describe una composición que comprende saponinas de Quillaja saponaria como un tratamiento o profiláctico de copépodos ectoparásitos del género Caligus de peces. En la evidencia experimental aportada por este documento no se indican pruebas que permitan determinar un efecto beneficioso contra otros patógenos.
El documento WO2015179840 describe combinaciones o composiciones que comprenden Yucca schidigera y Quillaja saponaria, y adicionalmente incluyen agentes antimicrobianos, antibióticos y anticoccidiales, para la administración en animales para prevenir enfermedades. Como divulgación general describe que se puede aplicar oralmente a peces.
La solicitud WO0151083 describe una composición adyuvante que contiene una saponina y un oligonucleótido que comprende al menos un dinucleótido de CpG no metilado. Preferentemente, la composición incluye saponinas derivadas de Quillaja saponaria, y aún más preferentemente, la saponina está modificada químicamente o integra una saponina sustancialmente pura (QS-7, QS-17, QS-18 o QS-21 ). No se describe el uso en peces. La solicitud de patente Chilena CL200402942 divulga un aditivo alimenticio para peces formulado en base al extracto purificado de quillay {Quillaja saponaria Molina) que comprende entre 15-25% p/p de saponinas triterpénicas obtenidas a partir de dicho extracto y 75-85% p/p de maltodextrina de papa. Este documento no menciona que este alimento promueva la salud de los peces. El documento de tesis de doctorado de Fernandes, R. N, (2014) Uso de saponina de quillaia {Quillaja saponaria Molina) em juvenis de pacu, Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciencias Agrárias e Veterinárias Centro de Aqüicultura, Brasil, describe un estudio en el que se evaluó el efecto de administrar saponinas de quillay en dosis desde 100 a 400 mg/Kg en la dieta a peces pacu {Piaractus mesopotamicus). Luego de 15 días de alimentar a los peces con las saponinas de quillay, 325 peces se inocularon con Aeromonas hydrophila y se observaron signos clínicos. Luego de siete días, la sobrevida de los peces pacu frente a la infección experimental fue superior luego del consumo de una dosis de saponinas de quillay de 200 mg/Kg. Por otra parte, dentro de la literatura científica la publicación de Vinay y cois. (2014), Veterinary immunology and immunopathology, 158(1 ), 73-85, describe una evaluación del efecto de un adyuvante basado en saponinas de Quillaja administrado intraperitonealmente en peces de la especie Paralichthys olivaceus. En este estudio se observa que las saponinas son un buen inductor de inflamación, pero también son tóxicas para el pez. Las concentraciones de saponinas de 500, 160, 50, 16 y 5 μg/pez produjeron tasas de mortalidad de 95%, 65%, 20% y 5%, respectivamente, con una dosis letal (LD50) de 22,4 mg/Kg. Los resultados determinan que el efecto tóxico de las saponinas depende del nivel de purificación y la fuente del producto. Finalmente, los autores observaron que una concentración de 3,4 mg/Kg de pez es tóxica, y se recomienda utilizar una concentración inferior en Paralichthys olivaceus. Respecto a divulgaciones de saponinas desde otras fuentes diferentes al quillay, la publicación de KrogdahI y cois. (2015), Journal of agricultura! and food chemistry, 63(15), 3887-3902, describe que las saponinas de soya administradas por vía oral como aditivo del alimento en dosis de 2-10 g/Kg producen inflamación intestinal en el salmón atlántico {Salmo salar), cuya severidad es dosis- dependiente.
Este análisis global del estado de la técnica indica que, a pesar de que se han descrito diversos usos y aplicaciones de las saponinas de quillay, éstas no se asocian al tratamiento de patógenos de importancia en peces de interés comercial.
Sumario de la Invención
La presente invención divulga un nuevo uso de extractos de quillay para la prevención y control de enfermedades bacterianas en peces. Un objeto de invención es un extracto de Quillaja saponaria útil para fabricar una composición medicinal para la prevención y control de una enfermedad bacteriana en peces. Dicha preparación medicinal se administra a los peces por vía oral en un rango de dosis entre 0,9 - 12 mg de saponinas por kilogramo de peso vivo de los peces. La administración a los peces se realiza por vía oral en combinación con un alimento. En una modalidad preferida, la enfermedad bacteriana es provocada por una bacteria Gram negativa, en donde dicha bacteria se selecciona del grupo que consiste en los géneros Piscirickettsia, Aeromonas y Vibrio, y en una modalidad preferida, la bacteria perteneciente al género Piscirickettsia es Piscirickettsia salmonis.
En otra modalidad preferida, la enfermedad bacteriana es provocada por una bacteria Gram positiva, preferentemente perteneciente al género Renibacterium.
El uso de los extractos de quillay se utiliza preferentemente en peces salmónidos, los que se seleccionan del grupo que consiste de las especies Salmo salar, Salmo trutta, Salmo gairdnerii, Oncorhynchus mykiss y Oncorhynchus kisutch. Otro objeto de la presente invención es una composición medicinal para la prevención y control de una enfermedad bacteriana en peces, que comprende un extracto de Quillaja saponaria y un excipiente apropiado. El extracto de Quillaja saponaria se encuentra en una proporción entre 2 al 90% p/p del peso total de la composición.
La presente invención también proporciona una composición alimentaria para la prevención y control de una enfermedad bacteriana en peces que comprende un extracto de Quillaja saponaria y un aditivo apropiado. El extracto de Quillaja saponaria se encuentra en una proporción inferior al 6% p/p del peso total de la composición.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un perfil cromatográfico de un extracto completo de Quillaja saponaria Molina medido por HPLC, donde se señalan las principales saponinas QS7, QS17, QS18 y QS21 . La Figura 2 es una imagen obtenida por microscopía óptica de la línea celular de salmónidos ASK en presencia de diferentes concentraciones de extractos de quillay UD100-Q (Ultra Dry® 100-Q) y QD100 (Quillaja Dry® 100).
Descripción detallada de la invención
La presente invención describe un nuevo uso de extractos de la planta del quillay {Quillaja saponaria) para la prevención y control de infecciones bacterianas que afectan a peces. Los inventores han comprobado que diferentes extractos de saponinas de Quillaja saponaria Molina, planta endémica de Chile, poseen un efecto protector frente a infecciones bacterianas que afectan el cultivo de salmónidos. Los inventores han llegado a obtener las concentraciones adecuadas de dosis de los extractos de quillay para ser utilizadas de forma segura en salmones, sin alterar fisiopatológicamente los individuos tratados.
La presente invención se relaciona con el uso de extractos de quillay que tienen un perfil de saponinas específicos. En todos los casos, los perfiles de saponinas de estos extractos son propios y exclusivos del quillay, ya sea en extractos purificados, parcialmente purificados o no purificados. Los extractos completos o no fraccionados de quillay (Quillaja saponaria Molina) presentan un perfil de saponinas característico y propio que contienen sobre 100 tipos de saponinas químicamente diferentes. Las saponinas principales corresponden a QS7, QS17, QS18 y QS21 , como se observa en el perfil cromatográfico de la Figura 1 . Las concentraciones relativas de estas saponinas dependen del origen de la materia prima. Adicionalmente, los extractos parcialmente purificados (entre 2 a 90% p/p o p/v de saponinas según sea el producto en polvo o líquido) contienen compuestos no-saponínicos que incluyen fundamentalmente una mezcla de polifenoles y, en menor cantidad, otros azúcares.
Los extractos de saponinas de quillay pueden obtenerse de forma industrial como extractos en polvo o líquido, con distintos grados de purificación. A modo de ejemplo, para los efectos de la presente invención se pueden utilizar diversos extractos comerciales de Quillaja saponaria, tales como los que se muestran en la Tabla 1 a continuación.
. Extractos comerciales (Desert King Chile) de Quillaja saponaria útiles para la presente invención.
Nombre del
Descripción
producto
Ultra Dry® Extracto de Quillaja saponaria Molina en polvo. Contiene 100-Q principalmente saponinas triterpénicas superior al 65% p/p.
Quillaja Dry® Extracto de Quillaja saponaria Molina en polvo. Contiene un 25% 100 p/p de saponinas.
Extracto altamente purificado de Quillaja saponaria Molina en
Vax Sap ® polvo. Contiene principalmente saponinas triterpénicas superior al 90% p/p.
Extracto acuoso de Quillaja saponaria Molina con una
QL 1000 ®
concentración de 8% p/v de saponinas.
Extracto acuoso de Quillaja saponaria Molina con una
QL Perm ®
concentración de 2% de saponinas. La presente invención divulga el uso de extractos de Quillaja saponaria para elaborar una composición medicinal y una composición alimentaria para la prevención y/o control de condiciones médicas no deseadas relacionadas a enfermedades bacterianas en peces. A través del nuevo uso de extractos de Quillaja saponaria de la presente invención se pueden obtener medicamentos cuyo propósito es prevenir, controlar, curar, tratar o aliviar enfermedades bacterianas en peces; y además se pueden obtener productos alimentarios para uso medicinal que poseen propiedades terapéuticas con los mismos fines. La presente invención abarca el uso de los extractos de Quillay contra bacterias que afectan a peces, entre las cuales se incluyen bacterias Gram negativas tales como Piscirickettsia salmonis, Aeromonas salmonicida y Vibrio sp; y bacterias Gram positivas tales como Renibacterium salmoninarum, o cualquier otra bacteria que afecte la salud de peces, ya sea en agua dulce o de mar. Las especies más susceptibles de peces son salmónidos tales como: la trucha arcoíris {Oncorhynchus mykiss), trucha de arroyo {Salvelinus fontinalis), la trucha café {Salmo trutta), trucha alpina {Salvelinus alpinus), el salmón del Atlántico {Salmo salar), salmón del Pacífico {Oncorhynchus spp.), salmón keta {Oncorhynchus keta), salmón Chinook {Oncorhynchus tshawytscha), entre otros. Los extractos de Quillaja saponaria en la presente invención se utilizan para la elaboración de un producto medicinal o un producto alimenticio para la prevención o el control post-infección de bacterias en peces. Dichos productos se administran por vía oral en forma sólida o líquida.
Para el uso de extractos de Quillaja saponaria en la elaboración de una composición o preparación medicinal, medicamento o composición veterinaria es posible realizar diferentes formulaciones que contienen a dichos extractos como principio activo. Los extractos de Quillaja saponaria se encuentran en una proporción entre el 2% y el 90% p/p del peso total de la composición. La forma farmacéutica puede ser en polvo, suspensión oleosa o como parte de un pellet alimenticio. En una realización preferida, la composición medicinal comprende excipientes veterinariamente apropiados para salmónidos para administración oral, tales como: lactosa, almidón de maíz, dióxido de silicio, entre otros ampliamente conocidos por cualquier experto en la materia.
Para la utilización de los extractos de Quillaja saponaria en la elaboración de un producto o composición alimentaria o suplemento alimenticio, dichos extractos se mezclan con alimento para peces en forma de pellet, el cual se mezcla con un aceite equivalente al 2% del peso del pellet a impregnar, para adherir el extracto al alimento. Algunos ejemplos de dietas para peces ampliamente conocidas en la industria son producidas por Ewos, BioMar, Salmofood, entre otras. En una modalidad preferida, la composición alimentaria comprende aditivos alimenticios apropiados para salmónidos para administración oral, tales como: harina de pescado, aceite de pescado y/o vegetal, vitaminas, minerales, entre otros ampliamente conocidos por cualquier experto en la materia.
A continuación se presentan ejemplos de realización de la invención, los cuales se han incluido con el objetivo de ilustrar la invención, sus modalidades preferidas y ejemplos comparativos, pero en ningún caso deben considerarse para restringir el alcance de la solicitud de patente, el cual sólo está delimitado por el contenido de las reivindicaciones que aquí se adjuntan.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 : Evaluación de toxicidad de extractos de quillay in vitro e in vivo.
Ensayo de citotoxicidad in vitro en líneas celulares de salmón.
Se realizaron ensayos de los productos de extractos de quillay sobre monocapas celulares derivadas de salmón con el fin de evaluar la toxicidad. Las líneas utilizadas fueron SHK-1 y ASK. La línea SHK-1 , descrita como células tipo macrófagos, {Salmo salar, ECACC Number 971 1 1 106, European Collection of Cell Culture, Salisbury, Wilts, SP4 0JG, UK) se cultivó a 15 °C en medio de cultivo Leibovitz 15 (L-15, Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suplementado con 10% v/v de suero fetal bovino (Hyclone, Thermo Fischer Scientific, Logan, Utah, USA), 4 mM de L-glutamina (Gibco), 1 % v/v de 2-mercaptoetanol (2-ME, Gibco) y 50 μg/mL de gentamicina (US Biological, Swampscott, MA, USA). La línea celular ASK (Atlantic Salmón Kidney, ATCC® CRL-2747™) se cultivó a 16°C en medio Leibovitz (L-15, Hyclone, Thermo Scientific), suplementado con gentamicina (50 g/mL), L-glutamina (4 mM) (Gibco, Thermo Scientific), 2-mercaptoetanol 1 % (v/v) (2-ME, Gibco) y suero fetal bovino 10% (v/v) (SFB, Hyclone). Todos los productos de extractos de quillay se prepararon en medio MEM o en medio Leibovitz 15 a una concentración de 1 mg/ml_, siendo disueltos a 37°C durante 3 horas con agitación suave. Todas las soluciones preparadas de estos extractos se filtraron con una membrana de nitrocelulosa de 0,22 m para evitar contaminación en los cultivos celulares. Las diluciones evaluadas se prepararon mediante diluciones seriadas a partir de la solución patrón.
Para evaluar la citotoxicidad de los extractos de quillay en líneas celulares de salmónidos se sembraron 5x105 células/pozo en placas de 6 pocilios y se incubaron en 2 mL de medio de cultivo como volumen final durante 72 horas a 15°C. Al cabo de este tiempo se reemplazó el medio de cultivo por medio fresco y se verificó la confluencia. Luego de 24 horas, las células se incubaron con los diferentes extractos de quillay, para lo cual se retiró 1 mL de medio de cultivo y se reemplazó con 1 mL del extracto de quillay disuelto en el mismo medio. La evaluación de citotoxicidad se realizó luego de 24 horas de incubación con los extractos de quillay. Para ello las células se lavaron 2 veces con PBS frío y luego se disgregaron usando una solución con tripsina 0,05% y EDTA 0,02%. Las células se analizaron por citometría de flujo (FACS Canto II (Beckton Dickinson) y se determinó la incorporación de loduro de Propidio como marcador de células muertas. Se utilizaron células incubadas en medio de cultivo con una solución de etanol como control positivo de muerte celular. Como control negativo se utilizaron células que no fueron incubadas con los extractos de quillay, pero que se sometieron a las mismas condiciones de manejo. Adicionalmente se evaluó la citotoxicidad mediante visualización de las células a través de microscopía óptica.
Los resultados indicaron que la concentración de los extractos que causa el 50% de muerte celular (CC50) varió entre 3,5 y 83,4 μg/mL y la CC90 varió entre 4,7 y 92,6 μg/mL dependiendo del producto utilizado, como se indica en la Tabla 2. La Figura 2 muestra resultados representativos con los productos QD 100 (Quillaja Dry® 100) y UD 100Q (Ultra Dry® 100-Q) mediante la visualización de la monocapa celular a través de microscopía óptica.
Tabla 2. Citotoxicidad celular (CC50) medida mediante citometría de flujo
(incorporación de yoduro de propidio).
Figure imgf000012_0001
Para determinar la toxicidad vía oral a corto plazo (60 días) en peces se emplearon 550 ejemplares de salmón del Atlántico {Salmo salar) clínicamente sanos de un peso promedio de 9,5 g. Previo al experimento los peces se aclimataron por 8 semanas, período durante el cual se tomaron aleatoriamente 50 peces y se examinaron para chequear su condición sanitaria a través de exámenes de necropsia y microbiológicos, según metodología estándar para comprobar la ausencia de agentes patógenos como virus, bacterias y parásitos (Thoesen J. (1994) Suggested procedures for the detection and Identification of certain finfish and shellfish pathogens, 4th edn. Fish Health Section, American Fisheries Society, Bethesda, MD; OIE (Office International des Epizooties) (2000) Diagnostic manual for aquatic animal diseases, 3rd edn. OIE, París).
Los peces se mantuvieron en estanques de fibra de vidrio de 1 .000 L de capacidad con suministro de agua independiente. El nivel de oxígeno disuelto en el agua fue sobre 10 mg/L. La temperatura del agua, los niveles de oxígeno y de compuestos nitrogenados fueron controlados en forma adecuada. Se dispuso de una partida de alimento en forma de pellets extruidos (Micro 10, elaborado por Ewos). Con esta partida se prepararon cinco dietas con un contenido de 0, 100, 200, 300 y 600 ppm de saponinas/Kg de alimento. Estas dosis equivalen a 0, 2, 4, 6 y 12 mg de saponinas/Kg de peso vivo de pez, respectivamente. Los peces se repartieron en 10 estanques individuales con 50 peces cada uno (5 grupos con duplicado).
Los peces se alimentaron manualmente dos veces al día con las dietas descritas en cantidad determinada de acuerdo al peso vivo y a la tasa de crecimiento esperada de los peces. Para poder realizar esto se midió el peso de los ejemplares de este ensayo los días 0, 30 y 60 post-inicio del experimento, con el objeto de obtener en cada oportunidad datos acerca de su crecimiento.
Los ejemplares en estudio se observaron diariamente, un mínimo de tres veces al día, registrándose los eventuales signos clínicos y las mortalidades. El experimento tuvo una duración de 60 días. Como resultado se obtuvo que durante el transcurso del ensayo no se produjeron mortalidades ni alteraciones atribuibles al producto administrado en las diferentes dosis. Adicionalmente, no se encontraron alteraciones patológicas macro o microscópicas a nivel hepático e intestinal en ningún grupo tratado en relación al grupo control. En conclusión, se puede afirmar que los extractos de Quillay son seguros en las dosis probadas. EJEMPLO 2: Ensayo in vitro sobre el uso de extractos de quillay para la prevención y/o tratamiento de infecciones bacterianas de peces.
Eficacia de productos de quillay sobre Piscirickettsia salmonis in vitro.
Para evaluar el efecto de extractos de quillay sobre la replicación de la bacteria Piscirickettsia salmonis se realizó una infección de prueba en monocapas de la línea celular embrionaria CHSE-214 {Oncorhynchus tshawytscha, ATCC Number CRL-1681 , American Type Culture Collection) de salmón Chinook. La replicación bacteriana se determinó mediante qPCR, técnica ampliamente conocida que permite cuantificar el número de copias de ADN bacteriano que se obtiene como producto de la infección. Las células se sembraron en una proporción de 1 ,2 x 106 células por pocilio en placas de 6 pocilios y se cultivaron con una confluencia del 60 al 70%. La monocapa celular se infectó con un inoculo bacteriano con un título de 105 copias de ADN genómico. Para determinar la eficacia de los extractos, las células se infectaron con el inoculo bacteriano diluido en 1 mL de medio de cultivo (Medio Esencial Mínimo (MEM, Hyclone) suplementado con buffer HEPES (Hyclone,) (10mM), aminoácidos no esenciales (1 x) (Hyclone,) y suero fetal bovino 10% (v/v) (SFB, Hyclone), suplementado adicionalmente con los extractos de quillay a la concentración a ensayar, en particular los productos Ultra Dry® 100-Q (UD100Q®, Desert King) (65% p/p saponinas) o Quillaja Dry® 100 (QD100®, Desert King) (25% p/p de saponinas). Luego se comparó la capacidad de infección de P. salmonis con respecto al inoculo sin tratar con los extractos.
La eficiencia de la infección fue cuantificada mediante qPCR a través de la amplificación del gen 16S ribosomal. Cada condición se realizó en triplicado. Como resultado se obtuvo que los extractos de quillay inhibieron la replicacion bacteriana, en donde el producto Ultra Dry® 100-Q logró reducir en un 97,98% la replicacion al compararlo con el control sin tratar. El producto Quillaja Dry® 100 logró inhibir en un 64,40% la replicacion bacteriana, según se muestra en la Tabla 3 a continuación. Tabla 3. Resultados del ensayo de inhibición de infección de células CHSE-214 por Piscirickettsia salmonis.
Concentración
inhibitoria de
Ct %
Tratamiento Copias/mL saponinas
(dRn) Inhibición totales
(mg/mL)
Control sin
15,29 7,94E+7 0 0 bacterias
UD100Q® (65 %
purificación de 20,07 1 .60E+6 0,00016 97,98 saponinas )
QD100® (25% de
purificación de 14,73 1 ,94E+7 0,00053 64,40 saponinas) EJEMPLO 3: Preparación de alimento impregnado con extractos de quillay.
Los extractos de quillay se mezclaron con aceite de pescado para alcanzar las concentraciones deseadas y luego esta mezcla se impregnó a razón de 4,9 : 1 (aceite : pellet seco) en el alimento para peces. Esto se realizó utilizando una mezcladora industrial o betonera e incorporando el aceite en el alimento en movimiento por al menos 5 minutos y mezclando por al menos 10 minutos adicionales.
Para la obtención de la composición alimentaria impregnada con extractos de quillay se debe considerar como parámetros importantes la dosis de saponinas por kilogramo de peso vivo de pez que se administrará en el rango de 0,9 a 12 mg de saponinas por kilogramo de peso vivo, el peso de los peces y la cantidad de alimento que consumen. También se debe considerar el porcentaje de saponinas que poseen los productos de extractos de quillay. De esta forma, cualquier experto en la materia puede obtener la proporción de saponinas que debe ser incorporada en el alimento.
A modo de ejemplo, para preparar una composición alimentaria considerando el producto QL Perm ®, éste debe utilizarse en una proporción del 6% p/p (60 g de producto por kilogramo de alimento).
EJEMPLO 4: Uso de extractos de quillay para la prevención y/o tratamiento de infecciones bacterianas de peces in vivo.
Eficacia de productos de quillay sobre Piscirickettsia salmonis in vivo.
Se utilizaron 180 salmones del Atlántico {Salmo salar), con un peso promedio de 30 g (alevines). Se seleccionaron peces clínicamente sanos y libres de los patógenos ISAv y P. salmonis, lo que fue chequeado mediante muestreo y posterior diagnóstico molecular a través de RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR). Adicionalmente, antes del traslado de los peces a la estación experimental se muestrearon 60 ejemplares para realizar el chequeo sanitario, el cual consideró análisis de necropsia, frotis fresco de branquias, intestino y piel, tinción Gram de órganos internos (bazo, riñon y cerebro), tinción naranja de acridina de branquias, IFAT BKD de riñon, IFAT SRS de riñon, cultivos bacteriológicos y RT-PCR para IPNv.
Durante el ensayo los peces se alimentaron con una dieta de calibre 15 EWOS Micro 15CP® en una proporción diaria de 0,75% de peso corporal (pc/día). A los alimentos se incorporó diariamente una dosis de cada producto de extracto de quillay (Ultra Dry® 100-Q o Quillaja Dry® 100, Desert King) en una dosis de 3,75 mg/Kg de producto.
Se diseñó el experimento con los siguientes grupos experimentales: controles positivos (peces desafiados con la bacteria y alimentados sin productos) y negativos (peces no desafiados con la bacteria y alimentados sin productos), y grupos tratamiento (peces desafiados con la bacteria y alimentados con productos).
El desafío se realizó a través de una infección experimental con Piscirickettsia salmonis por inyección intraperitoneal en la línea ventral a razón de 0,1 mL de inoculo por pez, el cual tenía un título de 3 x106 copias de genoma bacteriano/mL. A los peces del grupo control negativo se les inoculó 0,1 mL de medio de cultivo. Todos los grupos experimentales siguieron el siguiente cronograma, según se indica en la Tabla 4 a continuación.
Tabla 4. Cronograma del tratamiento para la prevención y/o control de
piscirickettsiosis in vivo utilizando extractos de quillay.
Día -15 0 1 7 45
Aclimatación Inicio Término
Tratamiento con extractos de
quillay vía oral Ultra Dry® 100- Inicio Término Q o Quillaja Dry® 100
Inoculación con Piscirickettsia Inicio/
salmonis Término
Seguimiento post infección Inicio Término
Seguimiento post tratamiento Inicio Término
Duración del ensayo Inicio Término Como resultado se obtuvo que el producto Ultra Dry® 100-Q logró reducir en un 37% la mortalidad asociada a la infección por Piscirickettsia salmonis (SRS) al compararlo con el grupo desafiado con la bacteria y alimentado con dieta normal (sin extractos de quillay). El producto Quillaja Dry® 100 logró una reducción de un 18% respecto al mismo control, según se muestra en la Tabla 5.
Tabla 5. Resultados ensayo in vivo con dietas funcionales con extractos de quillay.
Figure imgf000017_0001
Por lo tanto, los resultados obtenidos respecto del uso de extractos de Quillaja saponaria para la prevención y/o control de enfermedades bacterianas en peces son altamente efectivos, los que reflejan un efecto protector contra Piscirickettsia salmonis in vitro por sobre el 60% de eficacia; mientras que in vivo se pudo comprobar el efecto preventivo y/o de control de la enfermedad, evidenciando una disminución de la mortalidad asociada a la bacteria de un 18 a un 36% a una concentración de 3,75 mg/Kg de producto por peso vivo de los extractos naturales de quillay con diferentes grados de pureza de saponinas.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Uso de un extracto de Quillaja saponaria, CARACTERIZADO porque sirve para fabricar una composición medicinal para la prevención y control de una enfermedad bacteriana en peces.
2. El uso según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque dicha preparación medicinal se administra a los peces por vía oral en un rango de dosis entre 0,9 - 12 mg/Kg de saponinas por peso vivo.
3. El uso según la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque la administración a los peces se realiza por vía oral en combinación con un alimento.
4. El uso según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque la enfermedad bacteriana es provocada por una bacteria Gram negativa.
5. El uso según la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque la bacteria Gram negativa se selecciona del grupo que consiste en los géneros Piscirickettsia, Aeromonas y Vibrio.
6. El uso según la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque la bacteria perteneciente al género Piscirickettsia es Piscirickettsia salmonis.
7. El uso según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque la enfermedad bacteriana es provocada por una bacteria Gram positiva.
8. El uso según la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque la bacteria Gram positiva pertenece al género Renibacterium.
9. El uso según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque los peces son salmónidos.
10. El uso según la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque los salmónidos se seleccionan del grupo que consiste de las especies Salmo salar, Salmo trutta, Salmo gairdnerii, Oncorhynchus mykiss y Oncorhynchus kisutch.
1 1 . Una composición medicinal para la prevención y control de una enfermedad bacteriana en peces, CARACTERIZADA porque comprende un extracto de Quillaja saponaria y un excipiente apropiado.
12. La composición según la reivindicación 1 1 , CARACTERIZADA porque el extracto de Quillaja saponaria se encuentra en una proporción entre el 2% y el 90% p/p del peso total de la composición.
13. Una composición alimentaria para la prevención y control de una enfermedad bacteriana en peces, CARACTERIZADA porque comprende un extracto de Quillaja saponaria y un aditivo apropiado.
14. La composición según la reivindicación 13, CARACTERIZADA porque el extracto de Quillaja saponaria se encuentra en una proporción inferior al 6% p/p del peso total de la composición.
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