WO2017217344A1 - 分子標的薬バブルおよび分子標的薬バブルの製造方法 - Google Patents

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WO2017217344A1
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bubble
molecular target
target drug
solution
container
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PCT/JP2017/021547
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克郎 立花
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ＳｏｎｏＣｏｒｅ株式会社
学校法人福岡大学
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a micro-sized or nano-sized bubble (molecular target drug bubble) to which a molecular target drug is attached, and a method for producing the bubble.
  • the present invention relates to a molecular target drug bubble used for ultrasonic therapy and a method for producing the molecular target drug bubble.
  • An anticancer agent has an effective anticancer action such as an action of suppressing the division of cancer cells, but often has a side effect because it also has an action of suppressing the growth of normal cells.
  • DDS drug delivery system
  • liposomes are mainly composed of phospholipids, which are constituents of living bodies, they have low toxicity to living bodies and are easy to use as DDS carriers. However, since liposomes are not sufficiently stable in vivo, they may disappear in blood vessels before being transported to the affected area. In this case, the drug in the bubble cannot be intensively administered to the affected area. In addition, it has been difficult to stably and easily bind molecular target drugs such as trastuzumab to liposomes.
  • the present invention has been made in view of the above-described conventional problems, and its purpose is to provide a molecular target drug bubble that can be reliably transported to a target affected area while stably holding the molecular target drug in blood. Is to provide. Another object is to provide a method for producing a molecular target drug bubble that can stably and easily produce such a molecular target drug bubble.
  • an outer shell composed of an outer shell material mainly composed of albumin;
  • a molecular target drug bubble comprising a molecular target drug attached to the outer shell and specifically recognizing a target molecule.
  • the molecular targeted drugs are cetuximab, rituximab, trastuzumab, trastuzumab, gemtuzumab, ozogamicin, alemtuzumab, ibritumomab tiuxetane, tositumumab, bevacizumab, panitumumab, ofatumumab, depisumumab, depisumumab
  • the molecular targeted drug bubble according to any one of (1) to (3) above, comprising at least one selected from the group consisting of: pembrolizumab, blinatumomab, dinutuximab, daratumumab, nesitumumab, and erotuzumab.
  • the gas is nitrous oxide, oxygen, hydrogen, helium, methane, ethane, propane, butane, pentane, cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane, ethylene, propylene, propadiene, butene, acetylene, propyne, perfluoropropane
  • Molecular target drug bubble according to (5) above which contains at least one selected from the group consisting of perfluorobutane and perfluoropentane.
  • the molecular target drug bubble which can be reliably conveyed to an affected part is provided by using as a shell material albumin which has high stability in the blood and has high holding power with respect to the molecular target drug. be able to.
  • the molecular target drug bubble efficiently reaches (accumulates) the affected area with the molecular target drug attached. Then, when the molecular target drug bubble reaches the affected area, the molecular target drug bubble (outer shell) is ruptured by irradiating ultrasonic waves, whereby the molecular target drug is supplied to the affected area and the cells of the affected area A part of can be destroyed. Thereby, an affected part can be treated efficiently.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a state in which a part of the first embodiment of the molecular targeted drug bubble of the present invention is cut.
  • FIG. 2 is a flowchart for explaining the first embodiment of the method for producing a molecular targeted drug bubble of the present invention.
  • 3 (a) to 3 (d) are cross-sectional views for explaining a first embodiment of the method for producing a molecular targeted drug bubble of the present invention.
  • FIG. 4 is a partially enlarged view for explaining a state in which the aqueous liquid and the inner surface (upper surface) of the container collide violently in the step of vibrating the container shown in FIG.
  • FIG. 5A and 5B are perspective views showing a state in which a part of the second embodiment of the molecular targeted drug bubble of the present invention is cut.
  • FIG. 6 is a graph showing the bubble size distribution of molecular target drug bubbles obtained in Examples and the like.
  • FIG. 7 is a graph showing the cell killing rate of oral squamous cell carcinoma cell HSC-2 in Examples and Comparative Examples.
  • FIG. 8A is a graph showing the bubble diameter distribution of the first liquid immediately after centrifugation in Example 3.
  • FIG. FIG. 8B is a graph showing the bubble diameter distribution of the molecular target drug bubble of Example 3.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a state in which a part of the molecular target drug bubble according to the first embodiment of the present invention is cut.
  • the molecular targeted drug bubble 1 shown in FIG. 1 is attached to the outer shell 2 (spherical membrane) constituting the shell, the gas 3 enclosed in the outer shell 2, and the outer shell 2, and makes the target molecule unique. And a molecular target drug 4 that can be recognized manually.
  • a molecular target drug bubble 1 is used when performing ultrasonic therapy in the medical field. More specifically, the molecular target drug bubble 1 is injected into a blood vessel by intravenous injection or the like, and is transported to the affected part by blood flow. Thereafter, when the molecular target drug bubble 1 reaches the vicinity of the affected part, the molecular target drug bubble 1 is irradiated with ultrasonic waves to rupture the molecular target drug bubble 1 (outer shell 2). Thereby, while supplying a molecular target drug with respect to the cell of an affected part, a part of cell of an affected part can be destroyed.
  • each component constituting the molecular target drug bubble 1 will be described.
  • the outer shell 2 has a function of holding the gas 3 enclosed inside thereof in the molecular target drug bubble 1.
  • the outer shell 2 is made of an outer shell material mainly composed of albumin.
  • This outer shell material is an amphiphilic material mainly having both hydrophobic and hydrophilic properties (substituents) in one molecule.
  • Amphiphilic materials that can be used as an outer shell material together with albumin are not particularly limited, but include higher fatty acids such as palmitic acid and stearic acid, sugars such as galactose, sterols such as cholesterol and sitosterol, and interfaces.
  • Activators, natural or synthetic polymers, fluorescent dyes, antibodies, labeled metals and the like can be mentioned, and one or more of these can be used in combination.
  • human serum albumin can be used as albumin.
  • Human serum albumin is a protein that occupies about 60% of the total protein constituting blood plasma, and has high stability. Therefore, the stability of the molecular target drug bubble 1 in blood can be increased by using albumin as the main component of the outer shell material.
  • Albumin has many positively and negatively charged sites in its molecule. Therefore, the molecular target drug 4 is reliably attached (adsorbed or bound) to the outer shell 2 by adsorbing or binding polar groups or polarized atoms of the molecular target drug 4 to the charged portions of albumin. Therefore, binding in the molecular target drug 4 also increases the stability in blood. Therefore, the molecular target drug bubble 1 can be reliably transported to the affected part.
  • the content of albumin in the outer shell material is preferably 50 to 100 wt%, more preferably 70 to 100 wt%, and further preferably 90 to 100 wt%.
  • the stability of the molecular target drug bubble 1 in the blood is further improved, and the molecular target drug bubble 1 in a state where the molecular target drug 4 is attached is obtained. A larger amount can be transported to the affected area.
  • the amphiphilic material constituting the outer shell 2 is arranged in a spherical shape in the aqueous medium so that the hydrophobic group is on the inner side and the hydrophilic group is on the outer side. Due to this property, the outer shell 2 becomes a micelle composed of a single layer of molecules of an amphiphilic material.
  • Gas 3 is a gaseous substance at the temperature (about 20 ° C.) when the molecular target drug bubble 1 is manufactured. Further, the gas 3 is a gaseous substance even when the molecular target drug bubble 1 is injected into the body, that is, at a temperature inside the body (about 37 ° C.).
  • the gas 3 is not particularly limited.
  • an inert gas such as air, nitrogen, nitrous oxide, oxygen, carbon dioxide, hydrogen, helium, argon, xenon, or krypton, sulfur hexafluoride, dipentafluoride.
  • Sulfur, sulfur fluoride such as trifluoromethyl sulfur pentafluoride, methane, ethane, propane, butane, pentane, cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane, ethylene, propylene, propadiene, butene, acetylene, propyne, perfluoropropane, Examples include low molecular weight hydrocarbons such as perfluorobutane and perfluoropentane or halides thereof, ethers such as dimethyl ether, ketones, and esters, and one or more of these are combined. Can be used.
  • the molecular target drug bubble 1 in which these gases are encapsulated is more stable in the body and is more reliably transported through the blood vessel to the affected part (the site to be treated).
  • the gas 3 may not be contained in the outer shell 2.
  • a liquid component bubble storage solution, for example, described later
  • An aqueous medium flows in, and the gas 3 may escape from the outer shell 2.
  • Such a bubble (capsule) is also included in the molecular target drug bubble 1 of the present embodiment.
  • the molecular target drug (molecular target therapeutic drug) 4 is attached to the surface of the outer shell 2 as shown in FIG.
  • the molecular target drug 4 is a drug that specifically recognizes a target molecule.
  • the molecular target drug 4 used for cancer treatment specifically recognizes a molecule (protein) derived from a cancer cell that is not present in a normal cell, and suppresses the action of a molecule necessary for cancer growth and transfer.
  • a molecular target drug 4 that specifically recognizes a molecule involved in inflammation and suppresses the action of the molecule can be used.
  • Examples of the molecular target drug 4 include low molecular weight drugs composed of low molecular weight compounds having a molecular weight of about 300 to 500, and antibody drugs (monoclonal antibody drugs) composed of proteins having a molecular weight of about tens of thousands to hundreds of thousands. Can be used.
  • the antibody drug is not particularly limited, but cetuximab, rituximab, trastuzumab, trastuzumab, gemtuzumab, ozogamicin, alemtuzumab, ibritumomab, tiuxetane, tositumomab, bevacizumab, panitumumab, offatumumab, denotumumab Ramsilmab, nivolumab, pembrolizumab, blinatumomab, dinutuximab, daratumumab, nesitumumab, erotuzumab, and the like can be used, and one or more of these can be used in combination.
  • Such molecular target drug 4 adheres to the outer shell 2, whereby the molecular target drug bubble 1 can efficiently reach (accumulate) the target affected part. Therefore, it is possible to efficiently treat the affected part by supplying the molecular target drug 4 more accurately.
  • the weight ratio of albumin and molecular target drug 4 in the molecular target drug bubble 1 is not particularly limited, but is preferably about 1000: 1 to 1: 1, and is preferably about 500: 1 to 11: 9. More preferably, it is about 100: 1 to 6: 4. If the weight ratio between albumin and the molecular target drug 4 is within the above range, a sufficient amount of the molecular target drug 4 can be supplied to the affected part when the outer shell 2 is ruptured near the affected part. . Therefore, the affected part can be treated more efficiently.
  • the diameter of the outer shell 2 (bubble) composed of such components is changed by changing the conditions of each step of the method for producing a molecular target drug bubble of the present invention. That is, the molecular target drug bubble 1 to be manufactured has a micro size (about several hundreds of micrometers) or a nano size (about several hundreds of nanometers).
  • the average diameter of the outer shell 2 is not particularly limited, but is preferably about 10 nm to 1000 ⁇ m, more preferably about 10 nm to 100 ⁇ m, and further preferably about 50 to 2000 nm. If the average diameter of the outer shell 2 is within the above range, the molecular target drug bubble 1 is sufficiently small when the molecular target drug bubble 1 is injected into the body by intravenous injection. 1 can move smoothly in the blood vessel. Further, the bubble having such a diameter has high stability in the blood vessel, and is reliably transported to the target site without disappearing while moving in the blood vessel. In particular, since nanobubbles have high stability in blood vessels, they are reliably transported to a target site without almost disappearing.
  • the molecular target drug bubble 1 has an outer shell 2 having an average diameter of about 200 to 300 nm, the molecular target drug bubble 1 is smoothly transported into the new blood vessel and cannot be reached by the micro-sized molecular target drug bubble 1 Can reach even such cancer cells. That is, the molecular targeted drug bubble 1 can be suitably used for cancer treatment. Also, some of the molecular targeted drug bubbles 1 can be taken into cancer cells through the blood vessel wall.
  • the average diameter of the outer shell 2 shown in FIG. 1 and FIGS. 5A and 5B described later is, for example, laser diffraction / scattering method, nanoparticle tracking analysis method, electric resistance method, AFM (Atomic Force Microscope). It can be measured by observation with a laser microscope.
  • AFM Acoustic Force Microscope
  • a resonance type particle measurement system (trade name: Archimedes) manufactured by Malvern may be used.
  • a bubble containing a gas has a property of efficiently reflecting ultrasonic waves at the interface between the liquid and the gas. Therefore, the molecular target drug bubble 1 having the outer shell 2 having the average diameter in the above range has a sufficiently large area at the interface between the blood and the gas 3 in the blood vessel, and is effectively used as an ultrasound contrast agent.
  • the molecular target drug bubble 1 as described above can be manufactured by the bubble manufacturing method of the present embodiment described below.
  • FIG. 2 is a flowchart for explaining the first embodiment of the molecular target drug bubble manufacturing method of the present invention
  • FIGS. 3 (a) to 3 (d) show the molecules of the present invention
  • FIG. 4 is a cross-sectional view for explaining a first embodiment of a method for producing a target drug bubble
  • FIG. 4 shows an aqueous liquid and an inner surface (upper surface) of the container in the step of vibrating the container shown in FIG. It is the elements on larger scale for demonstrating the state which collided violently.
  • FIGS. 3A to 3D and 4 the upper side in FIGS. 3A to 3D and 4 is referred to as “upper”, and the lower side in FIGS. 3A to 3D and 4 is referred to as “lower”. To tell.
  • the method for producing a molecular target drug bubble of this embodiment has five steps (S1) to (S5) as shown in FIG.
  • step (S1) the first solution containing the outer shell material, the second solution containing the molecular target drug, and the bubble production container into which the first and second solutions are injected (hereinafter simply referred to as “production container”). It is a step of preparing ").
  • Step (S2) is a step of injecting the first solution to a predetermined height of the production container.
  • Step (S3) is a step of sealing the manufacturing container in a state where the manufacturing container is filled with gas and the inside of the manufacturing container is pressurized.
  • Step (S4) is a step of vibrating the production container at a predetermined rotational speed so that the first solution repeatedly collides with the inner surface of the container.
  • the step (S5) is a step of injecting the second solution into the production container after vibration and mixing the first solution and the second solution to obtain a mixed solution containing molecular target drug bubbles.
  • the bubble 100 is generated in the step (S4). Thereafter, through the step (S5), the molecular target drug bubble 1 in which the molecular target drug 4 is attached to the surface of the bubble 100 (outer shell 2) is generated.
  • the molecular target drug bubble 1 in which the molecular target drug 4 is attached to the surface of the bubble 100 (outer shell 2) is generated.
  • the outer shell material and the aqueous medium constituting the outer shell 2 of the molecular target drug bubble 1 are placed in a preparation container, and the outer shell material is dissolved in the aqueous medium to prepare the first solution 10.
  • a predetermined amount of the outer shell material and the aqueous medium are added to the preparation container, and then stirred to dissolve the outer shell material in the aqueous medium.
  • the order of putting the outer shell material and the aqueous medium into the preparation container is not particularly limited.
  • a method for dissolving the outer shell material in the aqueous medium for example, stirring with a stirring bar, ultrasonic treatment, or the like can be used.
  • the aqueous medium is not particularly limited.
  • saline 0.8% such as saline and PBS (phosphate buffered saline).
  • a sugar aqueous solution in which various sugars such as glucose and sucrose and distilled water are mixed. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the outer shell material in the first solution 10 is not particularly limited, but is preferably contained in the first solution 10 at a concentration equal to or higher than the critical micelle concentration (CMC) of the outer shell material.
  • the content of the outer shell material contained in the first solution 10 is preferably about 0.001 to 50 wt%, and more preferably about 0.01 to 20 wt%.
  • the concentration of the outer shell material in the first solution 10 is more surely equal to or higher than the critical micelle concentration, the outer shell 2 (micelle) can be reliably formed in the first solution 10. Therefore, in the step (S4) described later, the gas 3 is easily taken into the micelle, and the bubble 100 having a desired diameter can be easily generated in the first solution 10.
  • the content of the aqueous medium contained in the prepared first solution 10 is preferably 50 to 99.999 wt%, and more preferably 80 to 99.99 wt%. Thereby, the outer shell material can be sufficiently dissolved in the aqueous medium, and a more uniform first solution 10 can be obtained.
  • a second solution containing the molecular target drug 4 is prepared.
  • the molecular target drug 4 and the aqueous medium are put in an adjustment container different from the adjustment container for the first solution 10, and the molecular target drug 4 is dissolved in the aqueous medium to prepare the second solution. That is, the second solution can be adjusted using the same method as the first solution described above.
  • the aforementioned molecular target drug 4 and the aqueous medium can be used.
  • the content of the aqueous medium contained in the prepared second solution is not particularly limited, and can be, for example, 50 to 99.99 wt%.
  • a commercially available molecular target drug can also be used.
  • Erbitux registered trademark manufactured by Merck Serono Co., which contains cetuximab as an active ingredient can be used.
  • the production container 20 includes an opening, and includes a container main body 21 that contains the first solution 10 and a lid 22 for sealing the container main body 21.
  • the container body 21 is not particularly limited, but it is preferable that the outer shape as shown in FIG.
  • a vial with a capacity of about 0.5 to 20 ml is used as the container body 21.
  • a bubble-containing liquid of about 0.3 to 0.6 ml required for one ultrasonic diagnosis is placed in one manufacturing container 20. Can be manufactured.
  • the molecular target drug bubble-containing liquid in one manufacturing container 20 can be used up, so that waste of the manufactured molecular target drug bubble-containing liquid can be eliminated.
  • the dimensions of the vial with such a small capacity are such that the length X in the longitudinal direction is about 35 to 60 mm and the outer diameter R is about 10 to 40 mm.
  • the lid 22 has a disk-shaped rubber stopper (septum) 221 that is in close contact with the bottle mouth of the container body 21, and the rubber stopper 221 is fixed to the bottle mouth of the container body 21. And a tightening portion 222 to be tightened.
  • the tightening portion 222 is configured to cover the edge of the rubber plug 221 and has an opening at a substantially center in a plan view.
  • screw grooves formed so as to be screwable with each other are formed on the inner peripheral surface on the bottle mouth side of the tightening portion 222 and on the outer peripheral surface on the bottle mouth side of the container body 21 (not shown).
  • the rubber plug 221 is fixed in close contact with the bottle mouth of the container body 21 by screwing them together.
  • the container body 21 and the tightening part 222 can be fixed in a state where the rubber stopper 221 is in close contact with the bottle mouth of the container body 21 by caulking the fastening part 222 to the bottle mouth of the container body 21.
  • [S2] Step of injecting the first solution into the production container The prepared first solution 10 is injected to a predetermined height of the container body 21 (production container 20). In this embodiment, as shown in FIG. 3A, the injection is performed up to Y [mm]. Therefore, as shown in FIG. 3A, the container main body 21 in the state in which the first solution 10 is injected has a gap portion 11 in the upper part thereof.
  • the height (length in the longitudinal direction) of the container main body 21 is set to X [mm] in a state where the container main body 21 (manufacturing container 20) into which the first solution 10 has been injected is left still horizontally.
  • the height of the liquid surface of the first solution 10 in the container body 21 is Y [mm]
  • the first solution 10 is more vigorously applied to the upper and lower surfaces and the side surfaces (particularly the upper and lower surfaces) of the production container 20. It can be made to collide. Due to this collision, a shock wave is generated in the first solution 10, and the bubble 100 can be easily formed in the first solution 10.
  • the relationship preferably satisfies the relationship of 0.3 ⁇ Y / X ⁇ 0.5, and more preferably satisfies the relationship of 0.35 ⁇ Y / X ⁇ 0.4. Thereby, the bubble 100 can be more easily formed in the first solution 10 in the step (S4).
  • the container body 21 into which the first solution 10 has been injected is moved into the chamber.
  • the air in the chamber is replaced with gas 3.
  • the first solution 10 and the gas 3 can be sealed in the production container 20 by fastening the lid 22 to the opening of the container body 21.
  • a syringe filled with gas 3 is prepared. Then, the injection needle of the syringe is pierced through the rubber stopper 221. Thereafter, the inside of the production container 20 is pressurized by further adding the gas 3 from the syringe into the production container 20. Thereafter, the injection needle is removed from the rubber stopper 221. Thereby, the manufacturing container 20 sealed with the inside of the manufacturing container 20 pressurized with the gas 3 can be obtained.
  • the pressure in the manufacturing container 20 (the pressure of the gas 3 filled in the gap 11) is made larger than 1.0 atm.
  • the pressure in the production container 20 is preferably 1.5 to 10 atm, and more preferably 2 to 5 atm. Thereby, a part of the gas 3 is finely dispersed or dissolved in the first solution 10.
  • the bubble 100 is easily generated when the first solution 10 and the manufacturing container 20 collide with each other to generate a shock wave in the step (S 4). Become. Accordingly, more bubbles 100 can be generated in the first solution 10 in the step (S4).
  • generated in the 1st solution 10 can be adjusted more easily by setting the pressure in the manufacturing container 20 to the arbitrary values larger than 1.0 atm.
  • the inside of the manufacturing container 20 is pressurized (the pressure in the manufacturing container 20 is greater than 1.0 atm), but the next step (without pressurizing the inside of the manufacturing container 20) S4) may be performed.
  • the manufacturing container 20 is vibrated so that the first solution 10 repeatedly collides with the upper and lower surfaces and side surfaces (particularly the upper and lower surfaces) of the manufacturing container 20.
  • the manufacturing container 20 is vibrated so that the manufacturing container 20 reciprocates substantially in the longitudinal direction (vertical direction in FIG. 3C).
  • the manufacturing container 20 sealed in the step (S3) (the lower diagram in FIG. 3C) is vibrated upward (the middle diagram in FIG. 3C).
  • the first solution 10 moves to the vicinity of the middle of the production container 20.
  • the production container 20 is further vibrated upward, the first solution 10 moves to the upper part of the production container 20 and collides with the lower surface (rubber plug 221) of the lid 22 (upper view in FIG. 3C).
  • a shock wave is generated as shown in FIG. Due to the pressure of the shock wave, the gas 3 is finely dispersed in the first solution 10 to form a bubble 100.
  • the bubble 100 contains a gas 3 finely dispersed or dissolved in the first solution 10 by vibration.
  • the manufacturing container 20 (the upper diagram in FIG. 3C) is vibrated downward (the middle diagram in FIG. 3C).
  • the first solution 10 moves to the vicinity of the middle of the production container 20.
  • the production container 20 is further vibrated downward, the first solution 10 moves to the lower part of the production container 20 and collides with the lower surface of the production container 20 (the lower diagram in FIG. 3C).
  • shock waves are generated as shown in FIG.
  • the method for producing a molecular target drug bubble of the present embodiment it is preferable to vibrate the production container 20 at 5000 rpm or more in order to obtain a sufficiently fine and uniform-sized bubble 100.
  • the magnitude (pressure) of the shock wave generated when the first solution 10 and the production container 20 collide sufficiently increases, and the bubble 100 generated in the first solution 10 is miniaturized and the size thereof is reduced.
  • the number of rotations of the manufacturing container 20 is set to a low value within the above range, the magnitude of the generated shock wave is reduced, so that the bubble 100 having a relatively large diameter can be generated.
  • the “number of rotations” of the manufacturing container 20 means the number of times that the manufacturing container 20 moves through the entire vibration path per unit time. For example, the fact that the manufacturing container 20 vibrates at 5000 rpm means that the manufacturing container 20 moves (vibrates) all vibration paths 5000 times per minute.
  • the rotation speed of the production container 20 is more preferably 5500 rpm or more, and further preferably 6000 to 20000 rpm.
  • a bead type high-speed cell disruption system can be used as an apparatus that can vibrate the production container 20 at the number of rotations as described above.
  • homogenizer a high-speed cell disruption system
  • Precellys manufactured by Bertin Technologies, Inc. can be used.
  • the pressure of the shock wave generated when the first solution 10 and the production container 20 collide is preferably 40 kPa to 1 GPa.
  • the pressure of the shock wave generated at the time of collision between the first solution 10 and the production container 20 within the above range, the bubbles 100 generated in the first solution 10 are made finer and the size thereof is made more uniform. Can do.
  • the finer bubble 100 can be generated.
  • the vibration width in the longitudinal direction of the production container 20 is preferably about 0.7X to 1.5X [mm], more preferably about 0.8X to 1X [mm]. More preferred.
  • the first solution 10 and the lower surface of the production container 20 and the lid 22 can be made to collide with each other. The number of collisions can be increased sufficiently.
  • the speed at which the first solution 10 moves in the production container 20 is increased. Therefore, the magnitude of the shock wave generated when the first solution 10 collides with the lower surface of the production container 20 and the lid 22 is sufficiently large. As a result, a large amount of fine bubbles 100 can be generated in the first solution 10.
  • the production container 20 when the production container 20 is reciprocated in the vertical direction, the production container 20 is preferably vibrated in the short direction (horizontal direction). Thereby, since the first solution 10 also collides with the inner side surface of the manufacturing container 20, more shock waves can be generated in the first solution 10.
  • the vibration width in the short direction of the production container 20 is preferably about 0.3X to 0.8X [mm], and more preferably about 0.5X to 0.7X [mm]. Thereby, the effect mentioned above becomes more remarkable.
  • the direction in which the manufacturing container 20 is vibrated may be only the short direction.
  • the vibration width in the short direction (horizontal direction) of the manufacturing container 20 is preferably the same as the vibration width in the short direction described above. With such a vibration width, the first solution 10 reliably collides with the inner side surface of the manufacturing container 20, so that more shock waves can be generated in the first solution 10. As a result, a large amount of fine bubbles 100 can be generated in the first solution 10.
  • the instantaneous relative speed between the production container 20 and the first solution 10 in the production container 20 when the first solution 10 collides with the upper and lower surfaces and the side surfaces of the production container 20 is 40 km / h or more. It is preferable to vibrate the production container 20 so as to be. Moreover, it is more preferable to vibrate the production container 20 so that the instantaneous relative speed is 50 km / h or more.
  • the time for vibrating the production container 20 under the above conditions is preferably about 10 to 120 seconds, and more preferably about 30 to 60 seconds.
  • generated in the 1st solution 10 can be adjusted by changing the rotation speed of the manufacturing container 20 within the range mentioned above.
  • nanobubbles having a size of approximately several tens to several hundreds of nanometers can be stably generated.
  • the manufacturing container 20 is vibrated so that the manufacturing container 20 reciprocates substantially in the longitudinal direction, but the method of vibrating the manufacturing container 20 is not limited to this.
  • the manufacturing container 20 may be vibrated so that the manufacturing container 20 rotates mainly in the lateral direction and / or the longitudinal direction thereof.
  • the first solution 10 in the production container 20 repeatedly collides with the upper and lower surfaces and side surfaces of the production container 20 to generate a shock wave. Even if such a vibration method is used, a large amount of bubbles 100 of uniform size can be stably generated in the first solution 10.
  • the relationship of 1 ⁇ Y / X ⁇ 10 may be satisfied. It is preferable that the relationship of 1.5 ⁇ Y / X ⁇ 8 is satisfied, and it is more preferable that the relationship of 2 ⁇ Y / X ⁇ 5 is satisfied.
  • the content of the outer shell material in the mixed solution 12 is preferably about 0.001 to 50 wt%, and more preferably about 0.01 to 20 wt%. If the content of the outer shell material in the mixed solution 12 is within the above range, the stability of the molecular target drug bubble 1 is improved, and the molecular target drug bubble 1 contained in the mixed solution 12 even when stored for a long period of time. The fluctuations in the number and size of the molecular target drug bubble 1 can be more reliably suppressed, and the temporal stability of the molecular target drug bubble 1 can be further improved.
  • the content ratio of albumin in the outer shell material is 90 wt% or more, even if the content of the outer shell material in the mixed solution 12 is very small (for example, about 0.05 wt%), The temporal stability of the target drug bubble 1 is extremely excellent.
  • the inside of the manufacturing container 20 is pressurized. Therefore, when removing the lid 22 of the production container 20, if the pressure inside the production container 20 is rapidly reduced, the particle size of the bubbles 100 in the first solution 10 may change or the content may be reduced. May occur. Therefore, in this step, when removing the lid 22 of the production container 20, it is preferable to reduce the pressure in the production container 20 to atmospheric pressure in advance.
  • a decompression syringe for decompressing the inside of the production container 20 is prepared, and the injection needle is inserted into the rubber stopper 221. At this time, the injection needle of the decompression syringe is prevented from coming into contact with the first solution 10.
  • the pressure in the production container 20 is reduced to atmospheric pressure by operating the plunger of the syringe for decompression and sucking the gas 3 in the production container 20. Thereafter, the lid 22 is removed from the production container 20. If such a method is used, the above-described adverse effect does not occur on the generated bubble 100.
  • the above-described steps (S2) to (S5) are preferably performed at a constant temperature. If the temperature condition in the manufacturing process is constant, the characteristics (viscosity, etc.) of each solution (first solution 10, second solution, mixed solution 12) are stabilized in each step (S2) to (S5).
  • the molecular target drug bubble 1 can be stably produced.
  • a method for keeping the temperature of each solution constant for example, a method of performing each of the above-described steps (S2) to (S5) in a glove box or a thermostat can be mentioned.
  • the production container 20 is vibrated at a high speed in the step (S4), the production container 20 is likely to generate heat due to a collision between the first solution 10 and the inner surface of the production container 20.
  • the bubble 100 having a uniform diameter can be stably generated in the first solution 10, and finally, the molecular target drug bubble 1 having a uniform diameter can be stably generated.
  • the molecular target drug bubble 1 having an average diameter of about 10 nm to 1000 ⁇ m is manufactured.
  • the conventional bubble manufacturing method requires a large-scale reflux device and various systems (tubes, nozzles, compressors, etc.) constituting the bubble manufacturing device. For this reason, it has been difficult to maintain a clean and sterile environment when producing bubbles used in the food and medical fields.
  • the manufacturing container 20 since the highly airtight manufacturing container 20 is used for manufacturing the molecular targeted drug bubble 1, the first solution 10, the second solution, and the gas 3 are contained in the manufacturing container 20.
  • the manufacturing container 20 may be sterilized by ⁇ -ray sterilization or the like. Thereby, since the inside of the production container 20 is sterilized, the molecular target drug bubble 1 can be produced in a sterilized environment.
  • the molecular target drug bubble 1 obtained as described above can exist stably in the mixed solution 12. Therefore, the production container 20 (hereinafter simply referred to as “bubble-containing container”) containing the obtained molecular target drug bubble-containing liquid (hereinafter simply referred to as “bubble-containing liquid”) can be stored at room temperature for a long period of time. Specifically, it can be stored for a period of 6 to 24 months. Further, even after such a long period of storage, the stability of the molecular target drug bubble 1 in the mixed solution 12 is high, so that it can be used without having to vibrate the bubble-containing container again.
  • capacitance can be used as a manufacturing container, the unit price of a bubble containing container can be suppressed. Therefore, the bubble-containing container obtained as described above has an advantage that it is easy to handle for medical institutions.
  • [S6] Centrifugation Processing Step The molecular targeted drug bubble manufacturing method of the present embodiment is performed after the step (S4) and before the step (S5), even if the manufacturing container 20 is centrifuged. Good. By this process, the bubbles 100 generated in the manufacturing container 20 can be separated according to a desired diameter. Thereafter, by performing the step (S5) using the separated first solution 10 containing the bubble 100 having a desired diameter, the molecular target drug bubble 1 having a more monodispersed bubble diameter distribution can be obtained.
  • the bubble 100 having a large diameter tends to move to the upper layer of the manufacturing container 20, and the bubble 100 having a small diameter is manufactured. There is a tendency to move to the lower layer of the container 20. Therefore, if the liquid (supernatant) in the upper layer of the production container 20 is removed by a suction means (syringe, pipette, etc.), the average diameter of the bubbles 100 in the first solution 10 remaining in the production container 20 is determined by the step ( S4) It becomes smaller than the average diameter of the bubble 100 obtained after.
  • the average diameter of the bubble 100 in the supernatant liquid sucked by the suction means becomes larger than the average diameter of the bubble 100 obtained after the step (S4). Therefore, the molecular target drug bubble 1 having a more monodispersed bubble diameter distribution can be finally obtained by using the centrifugation process.
  • the bubble 100 having a large diameter can be easily moved to an upper layer, and the diameter is small.
  • the molecular target drug bubble 1 having a more monodispersed bubble diameter distribution can be obtained.
  • the average diameter is 200 to 300 nm by appropriately setting the centrifugation conditions.
  • a first solution 10 containing bubbles 100 can be obtained.
  • the molecular target drug bubble 1 having an average diameter of 200 to 300 nm can be obtained. Since this molecular target drug bubble 1 does not have a relatively large size bubble, it functions as an ultrasound contrast agent with high resolution when it reaches the affected area, and a high-definition image can be obtained.
  • the conditions for the centrifugation treatment are appropriately set according to the average diameter of the bubble 100 to be separated.
  • the centrifugal acceleration of about 1 ⁇ g to 22000 ⁇ g is applied to the bubble-containing liquid for about 30 seconds to 24 hours.
  • the centrifugal acceleration is set to a small value (about 1 ⁇ g to 100 ⁇ g)
  • the bubble 100 having a more monodisperse bubble diameter distribution is obtained by processing for a long time (about 12 hours to about 24 hours).
  • the centrifugal acceleration is set to a large value (100 ⁇ g to 22000 ⁇ g)
  • the bubble 100 having a more monodispersed bubble diameter distribution is obtained by processing for a relatively short time (about 30 seconds to 12 hours). be able to.
  • the centrifuge capable of performing the centrifugal separation process on the bubble-containing container with the centrifugal acceleration as described above is not particularly limited.
  • a micro high-speed such as a trade name “TOMY MX-301” (manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.)
  • a cooling centrifuge can be used.
  • the centrifugal acceleration (centrifugal force) in the above range is loaded on the bubble-containing liquid by setting the rotation speed to about 50 to 2000 rpm.
  • the centrifugation process may be performed once or multiple times.
  • step (S6) may be performed after performing steps (S1) to (S5). Further, after step (S5), step (S4) may be repeated at least once.
  • the injection needle of the syringe is pierced through the rubber stopper 221 of the lid 22.
  • the bubble-containing liquid is sucked from the bubble-containing container.
  • the injection needle is removed from the rubber stopper 221, and the injection needle of the syringe that sucked the bubble-containing liquid is punctured into the blood vessel (for example, a vein) of the patient, and the bubble-containing liquid is injected into the blood vessel.
  • the molecular targeted drug bubble 1 is carried to the affected part by the blood flow.
  • the lid 22 may be removed from the bubble-containing container (manufacturing container 20), and the bubble-containing liquid may be sucked from the bubble-containing container using a syringe.
  • the molecular target drug bubble 1 injected into the blood vessel efficiently reaches (accumulates) the affected area with the molecular target drug 4 attached. Then, when the molecular target drug bubble 1 reaches the affected part, the outer shell 2 is ruptured by irradiating therapeutic ultrasonic waves having such a frequency and intensity that the outer shell 2 is ruptured. As a result, the molecular target drug 4 is supplied to the affected area, and part of the cells of the affected area can be destroyed, so that the affected area can be efficiently treated.
  • the bubble-containing liquid in the bubble-containing container can be used by a method using oral administration in addition to a method of injecting into a blood vessel using an injection needle.
  • the ultrasonic wave for diagnosis is irradiated to the molecular target drug bubble 1 in the blood vessel, and the reflected wave is monitored. Thereby, the position and behavior in the blood vessel (inside the body) of the molecular target drug bubble 1 can be accurately grasped.
  • the intensity (output) of therapeutic ultrasound is preferably about 0.1 to 30 W / cm 2 , and more preferably about 0.5 to 10 W / cm 2 .
  • the intensity of therapeutic ultrasound is preferably about 10 to 120 seconds, more preferably about 30 to 60 seconds.
  • the frequency of the ultrasonic wave irradiated during the ultrasonic treatment is preferably about 100 kHz to 10 MHz, and more preferably about 700 kHz to 1 MHz.
  • the bubble can be ruptured with a lower ultrasonic output.
  • the bubble-containing liquid may be sucked from the bubble-containing container by removing the lid 22 in a state where the pressure in the bubble-containing container is reduced to atmospheric pressure.
  • the pressure in the bubble-containing container is reduced to atmospheric pressure, it is possible to reliably prevent the bubble-containing liquid from being blown out of the manufacturing container 20 at the moment when the lid 22 is removed.
  • 5 (a) and 5 (b) are perspective views showing a state in which a part of the second embodiment of the molecular targeted drug bubble of the present invention is cut.
  • the molecular target drug bubble 1 of the present embodiment further includes a drug 5 other than the molecular target drug 4 in the outer shell 2 as shown in FIGS. 5 (a) and 5 (b). Except for this, the molecular target drug bubble 1 of the first embodiment is the same as that described above.
  • Such molecular target drug bubble 1 can be manufactured by the method for manufacturing a molecular target drug bubble of the present embodiment described later.
  • FIG. 5A shows the molecular target drug bubble 1 in which the drug 5 is sealed in the outer shell 2 in a gas state or a solid state
  • FIG. 5B shows the drug 5 is in a liquid state.
  • the molecular target drug bubble 1 enclosed in the outer shell 2 is shown.
  • the drug 5 is not particularly limited as long as it is effective for the treatment of the affected area targeted by the molecular target drug 4 to be used, but includes a gene, a drug, and the like. Specifically, peptides, antibodies, oligosaccharides, polysaccharides, genes, oligonucleotides, antisense oligonucleotides, siRNA, ribozymes, triple helix molecules, viral vectors, plasmids, low molecular organic compounds, anticancer agents, metals, etc. One or more of these can be used in combination.
  • the volume ratio of the drug 5 to the gas 3 is preferably about 1:99 to 90:10, more preferably about 10:90 to 70:30, and about 40:60 to 60:40. Is more preferable. If the volume ratio of the drug 5 and the gas 3 is within the above range, the stability of the molecular target drug bubble 1 is improved, and the molecular target drug bubble 1 can be more reliably transported to the vicinity of the affected part. In addition, when the outer shell 2 is ruptured in the vicinity of the affected area, a sufficient amount of the drug 5 can be administered to the affected area. Therefore, the affected part can be treated more efficiently.
  • the diameter of the outer shell 2 (bubble) of the molecular target drug bubble 1 composed of such components is the same as that of the molecular target drug bubble 1 shown in FIG. It changes by changing the conditions.
  • the first solution 10 includes an aqueous medium, an outer shell material, and a drug 5. That is, in the method for producing a molecular targeted drug bubble of the present embodiment, the first solution 10 prepared in the step (S1) of the first embodiment described above includes the drug 5 in addition to the outer shell material and the aqueous medium. Except for this, it is the same as the bubble manufacturing method of the first embodiment described above.
  • the outer shell material, the drug 5 and the aqueous medium are placed in a preparation container, and the outer shell material and the drug 5 are dissolved in the aqueous medium to prepare the first solution 10. That is, after adding a predetermined amount of the outer shell material, the drug 5 and the aqueous medium in the preparation container, the mixture is stirred to dissolve the outer shell material and the drug 5 in the aqueous medium.
  • the order in which the outer shell material, the drug 5, and the aqueous medium are put into the preparation container is not particularly limited.
  • a method for dissolving the outer shell material and the drug 5 in an aqueous medium for example, stirring with a stirrer, ultrasonic treatment, or the like can be used.
  • the content of the drug 5 contained in the first solution 10 to be prepared is preferably 0.1 to 50 wt%, and more preferably 20 to 50 wt%. Thereby, a sufficient amount of the drug 5 can be contained in the molecular target drug bubble 1 to be manufactured. As a result, it is possible to produce the molecular target drug bubble 1 that has a better therapeutic effect on the affected area.
  • the molecular target drug bubble 1 (see FIG. 5 (a) and FIG. 5 (b)) having a uniform size is stably produced in a large amount in the production container 20. Can be manufactured. At the same time, a production container 20 containing a large amount of the molecular target drug bubble 1 of uniform size is obtained.
  • the gas 3 finely dispersed or dissolved in the first solution 10 in the step (S3), and the first vibration due to the vibration in the step (S4).
  • a gas 3 and a drug 5 finely dispersed or dissolved in the solution 10 are contained.
  • the drug 5 is enclosed in the outer shell 2 together with the gas 3, or is contained or adsorbed in the outer shell 2 itself.
  • the molecular target drug bubble and the method for manufacturing the molecular target drug bubble of the second embodiment also produce the same actions and effects as the method for manufacturing the molecular target drug bubble and the molecular target drug bubble of the first embodiment.
  • Step of injecting first solution into container 700 ⁇ l of the first solution was injected into a 2 ml vial.
  • the liquid surface height Y of the first solution was 25 mm.
  • the mixed solution obtained as described above was taken out from the vial with a syringe.
  • a bubble measurement device manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd., particle size / zeta potential / molecular weight measurement system ELSZ-2000
  • the bubble size distribution measurement of the molecular target drug bubble (outer shell) contained in the mixed solution was performed.
  • the average diameter was about 1 ⁇ m.
  • the weight ratio of albumin to cetuximab in the obtained molecular target drug bubble satisfied the relationship of 100: 1 to 6: 4.
  • Example 2 In the step of injecting the second solution into the container, a mixed solution containing molecular target drug bubbles was prepared in the same manner as in Example 1 except that the injection amount of 100 mg of arbitax injection solution to be injected into the vial was changed to 1050 ⁇ l. Obtained. In addition, the weight ratio of albumin to cetuximab in the obtained molecular target drug bubble satisfied the relationship of 100: 1 to 6: 4.
  • Example 3 In the step of preparing the first solution, the same procedure as in Example 1 was performed except that the first solution was prepared by changing the amount of 25% phosphate buffered saline (PBS) used from 12 ml to 120 ml. The vial sealed with the first solution was vibrated to generate bubbles in the sealed vial. [Centrifuge separation process] Next, the hermetically sealed vial was subjected to a centrifugal separation process at 1200 rpm for 5 minutes using a micro high-speed cooling centrifuge (Tomy Seiko Co., Ltd., “TOMY MX-301”).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the first liquid containing bubbles is divided into three parts, a dark cloudy part on the upper side of the vial, a light cloudy part in the middle of the vial, and a substantially transparent part on the lower side of the vial. Separated into parts.
  • the dark cloudy portion on the upper side of the vial was removed by suction with a micropipette. Thereafter, another micropipette is inserted into the vial so that its tip reaches near the bottom of the vial, and the substantially transparent portion on the lower side of the vial is aspirated to obtain the first after centrifugation. A liquid was obtained.
  • the above process was repeated to prepare 1200 ⁇ l of the first liquid after centrifugation containing bubbles.
  • FIG. 6 shows the bubble diameter distribution measured for the molecular target drug bubbles or bubbles of Example 1, Example 2 and Comparative Example 1 obtained as described above using the bubble measuring apparatus.
  • FIG. 6 also shows the bubble size distribution of the molecular target drug bubble of the reference example prepared in the same manner as in Example 1 except that the amount of arbitux injection 100 mg used was changed to 350 ⁇ l. Show.
  • Example 2 in which the amount of the molecular target drug (Arbitux injection solution 100 mg) is large, the molecular target drug bubble having a larger bubble diameter is larger than other molecular target drug bubbles or bubbles. (See the arrows in FIG. 6).
  • the amount of the molecular target drug adhering to the outer shell of the bubble increases, so it is presumed that a large molecular target drug bubble was generated.
  • FIG. 8A is a graph showing the bubble diameter distribution of the first liquid immediately after centrifugation in Example 3.
  • FIG. 8B is a graph showing the bubble diameter distribution of the molecular target drug bubble of Example 3.
  • the albumin concentration in the first solution was extremely low (0.025%), molecular target drug bubbles having an average bubble diameter of about 285.3 nm could be stably obtained.
  • the average bubble diameter of the 1st liquid after the centrifugation containing a bubble is about 269.9 nm, and before and after the process of inject
  • Example and Comparative Examples obtained as described above were evaluated for cancer cell killing effect against HSC-2, which is a human-derived oral squamous cell carcinoma cell line, as follows.
  • Example 2 An echo gel was applied on the acoustic emission surfaces of four ultrasonic probes, and then a 24-well cell culture plate was placed. Next, HSC-2 was seeded on four wells at positions corresponding to the four ultrasonic probes. Next, 100 ⁇ l of the sample of the first embodiment was added to the four wells seeded with HSC-2. Thereafter, the ultrasonic probe was activated, and the frequency was 1.011 MHz, the sound intensity was 725 mW / cm 2 , the pulse repetition frequency was 10 Hz, the duty ratio was 50%, and the irradiation time was 15 seconds. And sonicated. Thereafter, 15 ⁇ l of trypan blue staining dead HSC-2 cells on 4 wells was added. Thereafter, the survival rate of HSC-2 was measured using a cell counter (manufactured by TC20 Bio Rad). In Comparative Example 1, the survival rate of HSC-2 was measured in the same manner as in Example 1.
  • Example 2 the survival rate of HSC-2 was measured in the same manner as in Example 1 except that the amount of the sample added to the four wells was changed to 150 ⁇ l.
  • the results of evaluation as described above are shown in FIG.
  • FIG. 7 is a graph showing the cell killing rate of oral squamous cell carcinoma cell HSC-2 in Examples and Comparative Examples.
  • the molecular targeted drug bubbles of Examples 1 and 2 were superior in the cell killing effect as compared with the albumin bubble obtained in Comparative Example 1. More specifically, from a comparison between Example 1 and Comparative Example 1 in which 100 ⁇ l was added to each well, in Example 1, a decrease in cell viability of about 12% was observed compared to Comparative Example 1. Further, from the comparison between Example 2 and Comparative Example 1 in which 150 ⁇ l was added to each well, in Example 2, a decrease in cell viability of about 19% was observed compared to Comparative Example 1. From this result, it was found that the higher the concentration of the molecular target drug (Arbitux injection solution 100 mg), the higher the cell killing effect.
  • the concentration of the molecular target drug Arbitux injection solution 100 mg
  • the molecular targeted drug bubble of the present invention is irradiated with therapeutic ultrasonic waves to rupture the outer shell (bubble), whereby the molecular targeted drug is supplied to the cancer cell in the affected area, and the cancer cell It was found that the treatment effect of the affected area can be increased by destroying a part.
  • the molecular target drug bubble which can be reliably conveyed to an affected part is provided by using as a shell material albumin which has high stability in the blood and has high holding power with respect to the molecular target drug. be able to.
  • the molecular target drug bubble efficiently reaches (accumulates) the affected area with the molecular target drug attached. Then, when the molecular target drug bubble reaches the affected area, the molecular target drug bubble (outer shell) is ruptured by irradiating ultrasonic waves, whereby the molecular target drug is supplied to the affected area and the cells of the affected area A part of can be destroyed. Thereby, an affected part can be treated efficiently. Therefore, the molecular targeted drug bubble of the present invention has industrial applicability.

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Abstract

本発明の分子標的薬バブルは、アルブミンを主成分とする外殻材料で構成された外殻と、該外殻に付着し、標的の分子を特異的に認識する分子標的薬とを含む。外殻材料中のアルブミンの含有量は、５０～１００ｗｔ％であるのが好ましい。また、分子標的薬としては、分子量が３００～５００程度の低分子量の化合物で構成される低分子薬や、分子量が数万～数十万程度のタンパク質で構成される抗体薬（モノクローナル抗体薬）を用いることができる。

Description

分子標的薬バブルおよび分子標的薬バブルの製造方法
　本発明は、分子標的薬が付着したマイクロサイズまたはナノサイズのバブル（分子標的薬バブル）、およびそのバブルの製造方法に関する。特に、超音波治療に用いる分子標的薬バブル、およびその分子標的薬バブルの製造方法に関する。
　抗癌剤は、癌細胞の***を抑制する作用等の効果的な抗癌作用を有するが、正常な細胞の増殖抑制作用も有するため、副作用を起こすことが多い。この副作用を抑制するために、近年、正常な細胞に作用することなく、癌細胞に選択的に薬剤を届けるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の開発が進められている。
　ＤＤＳとしては、癌細胞に由来する分子を特異的に認識し、癌細胞に選択的に作用する分子標的薬を用いる方法や、マイクロサイズまたはナノサイズの微小な気泡（バブル）を用いる方法が検討されている。バブルを用いる方法では、遺伝子や薬剤（薬物）を封入したバブルを静脈等から体内へ注入し、これを血管を通して患部に運搬する。そして、バブルが患部付近に到達した際に、超音波をバブルに照射して、バブルを破裂させる。そうすることにより、バブルに封入された薬物を患部に集中的に投与することができる。このバブルとしては、リポソームが用いられている（例えば、特許文献１）。また、リポソームにトラスツズマブを結合させた製剤の開発も進められている（例えば、特許文献２）。
　リポソームは、生体の構成成分であるリン脂質を主成分としているため、生体への毒性が低く、ＤＤＳのキャリアとして使用し易い。しかしながら、リポソームは、生体内での安定性が十分ではないため、患部に運搬される前に血管内で消失してしまうことがある。この場合には、バブル内の薬物を患部に集中的に投与することができない。また、リポソームに、トラスツズマブのような分子標的薬を安定かつ容易に結合させることが困難であった。
特開２００８－１００９５６号公報 国際公開第ＷＯ２０１３／１４１３４６号
　本発明は、上記従来の問題点を鑑みたものであり、その目的は、血液中で安定的に分子標的薬を保持しつつ、目的の患部に確実に運搬することができる分子標的薬バブルを提供することである。また、別の目的は、かかる分子標的薬バブルを安定かつ容易に製造することができる分子標的薬バブルの製造方法を提供することである。
　このような目的は以下の（１）～（１１）の本発明により達成される。
　（１）　アルブミンを主成分とする外殻材料で構成された外殻と、
　該外殻に付着し、標的の分子を特異的に認識する分子標的薬とを含むことを特徴とする分子標的薬バブル。
　（２）　前記外殻材料中の前記アルブミンの含有量は、５０～１００ｗｔ％である上記（１）に記載の分子標的薬バブル。
　（３）　前記アルブミンと前記分子標的薬との重量比率は、１０００：１～１：１である上記（１）または（２）に記載の分子標的薬バブル。
　（４）　前記分子標的薬は、セツキシマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ　オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ　チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、デノスマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブ　ベドチン、モガムリズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ　エムタンシン、ラムシルマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ブリナツモマブ、ジヌツキシマブ、ダラツムマブ、ネシツムマブ、エロツズマブからなる群から選択される少なくとも１種を含む上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の分子標的薬バブル。
　（５）　前記バブルは、前記外殻内に封入されたガスをさらに有する上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の分子標的薬バブル。
　（６）　前記ガスは、亜酸化窒素、酸素、水素、ヘリウム、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、エチレン、プロピレン、プロパジエン、ブテン、アセチレン、プロピン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタンからなる群から選択される少なくとも１種を含む上記（５）に記載の分子標的薬バブル。
　（７）　アルブミンを主成分とする外殻材料を含む第１の溶液と、標的の分子を特異的に認識する分子標的薬を含む第２の溶液とを準備する工程と、
　前記第１の溶液を、容器の所定の高さまで注入する工程と、
　前記第１の溶液が前記容器の内面に繰り返し衝突するように、所定の回転数で前記容器を振動させる工程と、
　振動後の前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合して、混合液を得る工程とを有することを特徴とする分子標的薬バブルの製造方法。
　（８）　前記容器を振動させる工程は、５０００ｒｐｍ以上の回転数で行われる上記（７）に記載の分子標的薬バブルの製造方法。
　（９）　前記容器を振動させる工程は、前記容器内を１．０ａｔｍより大きい圧力にした状態で行われる上記（７）または（８）に記載の分子標的薬バブルの製造方法。
　（１０）　前記混合液中における、前記アルブミンの含有量をＸ［ｗｔ％］とし、前記分子標的薬の含有量をＹ［ｗｔ％］としたとき、１≦Ｙ／Ｘ≦１０の関係を満足する上記（７）ないし（９）のいずれかに記載の分子標的薬バブルの製造方法。
　（１１）　前記混合液中における前記外殻材料の含有量は、０．００１～５０ｗｔ％である上記（７）ないし（１０）のいずれかに記載の分子標的薬バブルの製造方法。
　本発明によれば、血液中での安定性が高く、分子標的薬に対して高い保持力を有するアルブミンを外殻材料として用いることにより、患部に確実に運搬可能な分子標的薬バブルを提供することができる。この分子標的薬バブルは、分子標的薬が付着した状態で、患部に効率良く到達（集積）する。そして、分子標的薬バブルが患部に到達した時に、超音波を照射して分子標的薬バブル（外殻）を破裂させることにより、患部に対して、分子標的薬が供給されるとともに、患部の細胞の一部を破壊することができる。これにより、患部を効率良く治療することができる。
図１は、本発明の分子標的薬バブルの第１実施形態について、その一部を切断した状態を示す斜視図である。 図２は、本発明の分子標的薬バブルの製造方法の第１実施形態を説明するためのフローチャートである。 図３（ａ）～（ｄ）は、本発明の分子標的薬バブルの製造方法の第１実施形態を説明するための断面図である。 図４は、図３（ｃ）に示す容器を振動させる工程において、水性液体と容器の内面（上面）とが激しく衝突した状態を説明するための部分拡大図である。 図５（ａ）および（ｂ）は、本発明の分子標的薬バブルの第２実施形態について、その一部を切断した状態を示す斜視図である。 図６は、実施例等で得られた分子標的薬バブルのバブル径分布を示すグラフである。 図７は、実施例および比較例について、口腔扁平上皮癌細胞ＨＳＣ－２の細胞殺傷率を示すグラフである。 図８（ａ）は、実施例３における、遠心分離直後の第１の液体のバブル径分布を示すグラフである。図８（ｂ）は、実施例３の分子標的薬バブルのバブル径分布を示すグラフである。
　以下、本発明の分子標的薬バブルおよび分子標的薬バブルの製造方法を添付図面に示す好適な実施形態に基づいて説明する。
　＜第１実施形態＞
　まず、本発明の分子標的薬バブルおよび分子標的薬バブルの製造方法の第１実施形態について説明する。本実施形態の分子標的薬バブルは、後述する本実施形態の分子標的薬バブルの製造方法によって製造することができる。
１．分子標的薬バブル
　図１は、本発明の分子標的薬バブルの第１実施形態について、その一部を切断した状態を示す斜視図である。
　図１に示す分子標的薬バブル１は、その殻を構成する外殻２（球状の膜）と、外殻２内に封入されたガス３と、外殻２に付着し、標的の分子を特異的に認識する分子標的薬４とを有している。このような分子標的薬バブル１は、医療分野において、超音波治療を行う際に用いられる。より具体的には、分子標的薬バブル１は、静脈注射等により血管内に注入され、血流により患部にまで運搬される。その後、分子標的薬バブル１が患部付近に到達した際に、分子標的薬バブル１に超音波を照射して、分子標的薬バブル１（外殻２）を破裂させる。これにより、患部の細胞に対して、分子標的薬が供給されるとともに、患部の細胞の一部を破壊することができる。以下、分子標的薬バブル１を構成する各成分を説明する。
　外殻２は、その内側に封入されるガス３を分子標的薬バブル１内に保持する機能を有している。
　本発明では、外殻２は、アルブミンを主成分とする外殻材料で構成されている。この外殻材料は、主として１つの分子中に疎水性と親水性との両方の性質（置換基）を有する両親媒性材料である。アルブミンとともに、外殻材料として用いることができる両親媒性材料としては、特に限定されないが、パルミチン酸、ステアリン酸のような高級脂肪酸、ガラクトースのような糖類、コレステロール、シトステロールのようなステロール類、界面活性剤、天然または合成高分子、蛍光色素、抗体、標識金属等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　アルブミンとしては、具体的には、人血清アルブミンを用いることができる。人血清アルブミンは、血液の血漿を構成する全タンパク質の６０％程度を占めるタンパク質であり、高い安定性を有する。そのため、外殻材料の主成分としてアルブミンを用いることにより、血液中での分子標的薬バブル１の安定性を高くすることができる。また、アルブミンは、その分子中に、プラスおよびマイナスに帯電した箇所を多く有する。そのため、分子標的薬４が有する極性基や分極した原子がアルブミンの帯電した箇所に吸着または結合することにより、分子標的薬４が外殻２に確実に付着（吸着、結合）する。したがって、分子標的薬４と結合することによっても、血液中での安定性が高くなる。そのため、分子標的薬バブル１を確実に患部まで運搬することができる。
　外殻材料中のアルブミンの含有量は、５０～１００ｗｔ％であるのが好ましく、７０～１００ｗｔ％であるのがより好ましく、９０～１００ｗｔ％であるのがさらに好ましい。外殻材料中のアルブミンの含有量が上記範囲内であれば、血液中での分子標的薬バブル１の安定性がより向上するとともに、分子標的薬４を付着した状態の分子標的薬バブル１をより多量に患部に運搬することができる。
　なお、図１には示されていないが、外殻２を構成する両親媒性材料は、水性媒体中において、疎水基が内側に、親水基が外側になるようにして球状に配置される。この性質により、外殻２は、両親媒性材料の分子の単層で構成されるミセルとなる。
　ガス３は、分子標的薬バブル１を製造する際の温度（２０℃程度）において、気体状の物質である。また、ガス３は、分子標的薬バブル１を体内に注入した状態において、すなわち、体内の温度（３７℃程度）においても、気体状の物質である。
　ガス３としては、特に限定されないが、例えば、空気、窒素、亜酸化窒素、酸素、二酸化炭素、水素、ヘリウム、アルゴン、キセノン、クリプトンのような不活性ガス、六フッ化硫黄、十フッ化二硫黄、トリフルオロメチル硫黄ペンタフルオリドのようなフッ化硫黄、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、エチレン、プロピレン、プロパジエン、ブテン、アセチレン、プロピン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタンのような低分子量炭化水素類またはこれらのハロゲン化物、ジメチルエーテルのようなエーテル類、ケトン類、エステル類等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの物質の中でも、特に、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン、六フッ化硫黄が好ましい。これらのガスが封入された分子標的薬バブル１は、体内においてより安定性が高く、血管を通して患部（治療対象部位）までより確実に運搬される。なお、ガス３は、外殻２内に含まれていなくてもよい。例えば、分子標的薬バブル１が生成された時点では、外殻２内にガス３が封入された状態であっても、その後、外殻２内に液体成分（バブルの保存液、例えば、後述する水性媒体）が流入して、ガス３が外殻２から抜け出すことがある。このような状態のバブル（カプセル）も、本実施形態の分子標的薬バブル１に含まれる。
　分子標的薬（分子標的治療薬）４は、図１に示すように、外殻２の表面に付着している。分子標的薬４は、標的の分子を特異的に認識する薬物である。例えば、癌治療に用いられる分子標的薬４は、正常細胞にはない、癌細胞に由来する分子（タンパク質）を特異的に認識し、癌の増殖や移転に必要な分子の作用を抑制する機能を有する。また、癌治療以外の分野では、例えば、関節リウマチ等の炎症性疾患に対して、炎症に関わる分子を特異的に認識し、その分子の作用を抑制する分子標的薬４を用いることもできる。
　分子標的薬４としては、分子量が３００～５００程度の低分子量の化合物で構成される低分子薬や、分子量が数万～数十万程度のタンパク質で構成される抗体薬（モノクローナル抗体薬）等を用いることができる。
　低分子薬としては、特に限定されないが、イマニチブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダサチニブ、ラパチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ルキソリチニブ、アキシチニブ、ビスモデギブ、カルフィルゾミブ、ボスチニブ、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、ポナチニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、アファチニブ、イブルチニブ、セルチニブ、アレクチニブ、イデラリシブ、ニンテダニブ、オラパリブ、パルボシクリブ、レンバチニブ、ソニデジブ、コビメチニブ、オシメルチニブ、イキサゾミブ等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　また、抗体薬としては、特に限定されないが、セツキシマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ　オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ　チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、デノスマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブ　ベドチン、モガムリズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ　エムタンシン、ラムシルマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ブリナツモマブ、ジヌツキシマブ、ダラツムマブ、ネシツムマブ、エロツズマブ等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　このような分子標的薬４が外殻２に付着することにより、分子標的薬バブル１を目的の患部に効率良く到達（集積）させることができる。そのため、患部に対して、より正確に分子標的薬４を供給して、効率良く治療することができる。
　分子標的薬バブル１中のアルブミンと分子標的薬４との重量比率は、特に限定されないが、１０００：１～１：１程度であるのが好ましく、５００：１～１１：９程度であるのがより好ましく、１００：１～６：４程度であるのがさらに好ましい。アルブミンと分子標的薬４との重量比率が上記範囲内であれば、患部付近で外殻２を破裂させた際に、患部に対して、十分な量の分子標的薬４を供給することができる。そのため、患部をより効率良く治療することができる。
　このような成分で構成された外殻２（バブル）の径は、本発明の分子標的薬バブルの製造方法の各工程の条件を変更することにより変化する。すなわち、製造される分子標的薬バブル１は、マイクロサイズ（数百マイクロメートル程度）、または、ナノサイズ（数百ナノメートル程度）を有することとなる。
　具体的に、外殻２の平均径は、特に限定されないが、１０ｎｍ～１０００μｍ程度であるのが好ましく、１０ｎｍ～１００μｍ程度であるのがより好ましく、５０～２０００ｎｍ程度であるのがさらに好ましい。外殻２の平均径が上記範囲内であれば、分子標的薬バブル１を静脈注射により体内に注入した際に、分子標的薬バブル１の径が十分に小さいため、血流により分子標的薬バブル１が血管内を滑らかに移動することができる。また、このような径のバブルは、血管内での安定性が高く、血管内を移動している間に消滅することなく、目的の部位まで確実に運ばれる。特に、ナノバブルは、血管内での安定性が高いため、ほぼ消滅することなく、目的の部位まで確実に搬送される。
　ここで、癌細胞が存在する患部では、その周囲の血管から癌細胞へと、正常血管よりも細径の新生血管が伸びている。平均径が２００～３００ｎｍ程度の外殻２を有する分子標的薬バブル１であれば、分子標的薬バブル１が、新生血管内にも円滑に搬送され、マイクロサイズの分子標的薬バブル１では到達できないような癌細胞にまで到達することができる。すなわち、かかる分子標的薬バブル１は、癌治療に好適に用いられることができる。また、一部の分子標的薬バブル１を、血管壁を通過させて、癌細胞に取り込ませることもできる。
　なお、図１および後述する図５（ａ）および（ｂ）に示す外殻２の平均径は、例えば、レーザー回折・散乱法、ナノ粒子トラッキング解析法、電気抵抗法、ＡＦＭ（Ａｔｏｍｉｃ　Ｆｏｒｃｅ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、レーザー顕微鏡による観測等により測定することができる。また、ＡＦＭを測定する装置としては、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ社製の共振式粒子計測システム（商品名：アルキメデス）を用いることができる。
　また、一般的に、気体を内包するバブルは、液体と気体との界面において効率良く超音波を反射する性質を有している。そのため、上記範囲の平均径の外殻２を有する分子標的薬バブル１は、血管内において、血液とガス３との界面の面積が十分に大きく、超音波造影剤としても有効に用いられる。
　上述したような分子標的薬バブル１は、以下に記載する本実施形態のバブルの製造方法により製造することができる。
２．分子標的薬バブルの製造方法
　図２は、本発明の分子標的薬バブルの製造方法の第１実施形態を説明するためのフローチャートであり、図３（ａ）～（ｄ）は、本発明の分子標的薬バブルの製造方法の第１実施形態を説明するための断面図であり、図４は、図３（ｃ）に示す容器を振動させる工程において、水性液体と容器の内面（上面）とが激しく衝突した状態を説明するための部分拡大図である。
　なお、以下の説明では、図３（ａ）～（ｄ）および図４中の上側を「上」と言い、図３（ａ）～（ｄ）および図４中の下側を「下」と言う。
　本実施形態の分子標的薬バブルの製造方法は、図２に示すように、工程（Ｓ１）～（Ｓ５）の５つの工程を有する。工程（Ｓ１）は、外殻材料を含む第１の溶液と、分子標的薬を含む第２の溶液と、第１および第２の溶液が注入されるバブル製造用容器（以下、単に「製造容器」という）を準備する工程である。工程（Ｓ２）は、第１の溶液を製造容器の所定の高さまで注入する工程である。工程（Ｓ３）は、製造容器内にガスを充填して、製造容器内を加圧した状態で製造容器を密閉する工程である。工程（Ｓ４）は、第１の溶液が容器の内面に繰り返し衝突するように、所定の回転数で製造容器を振動させる工程である。工程（Ｓ５）は、振動後の製造容器内に第２の溶液を注入し、第１の溶液と第２の溶液とを混合して、分子標的薬バブルを含む混合液を得る工程である。
　本実施形態のバブルの製造方法では、工程（Ｓ４）において、バブル１００が生成される。その後、工程（Ｓ５）を経て、バブル１００（外殻２）の表面に分子標的薬４が付着した分子標的薬バブル１が生成される。以下、これらの工程について順次説明する。
　［Ｓ１］　準備工程
　まず、分子標的薬バブル１の外殻２を構成する外殻材料および水性媒体を調製容器に入れて、外殻材料を水性媒体に溶解させて、第１の溶液１０を調製する。すなわち、調製容器内に外殻材料および水性媒体を所定量加えた後、攪拌して、外殻材料を水性媒体に溶解させる。外殻材料、水性媒体を調製容器に入れる順番は、特に限定されない。外殻材料を水性媒体に溶解させる方法としては、例えば、攪拌子による攪拌、超音波処理等を用いることができる。
　水性媒体としては、特に限定されないが、例えば、蒸留水、純水、超純水、イオン交換水、ＲＯ水等の水、Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）等の生理食塩水（０．９％程度の食塩水）、グルコース、スクロース等の各種糖類と蒸留水とを混合した糖水溶液等が挙げられる。これらは、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　第１の溶液１０中における外殻材料の含有量は、特に限定されないが、外殻材料の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上の濃度で第１の溶液１０に含まれているのが好ましい。具体的には、第１の溶液１０に含まれる外殻材料の含有量は、０．００１～５０ｗｔ％程度であることが好ましく、０．０１～２０ｗｔ％程度であることがより好ましい。
　これにより、第１の溶液１０中の外殻材料の濃度が、より確実に臨界ミセル濃度以上となるので、第１の溶液１０中に外殻２（ミセル）を確実に形成することができる。そのため、後述する工程（Ｓ４）において、ミセル内にガス３が簡単に取り込まれ、所望の径のバブル１００を第１の溶液１０中に容易に生成させることができる。
　調製される第１の溶液１０に含まれる水性媒体の含有量は、５０～９９．９９９ｗｔ％であるのが好ましく、８０～９９．９９ｗｔ％であるのがより好ましい。これにより、外殻材料を水性媒体に十分に溶解させることができ、より均一な第１の溶液１０を得ることができる。
　また、第１の溶液１０とは別に、分子標的薬４を含む第２の溶液を準備する。
　分子標的薬４および水性媒体を、第１の溶液１０の調整容器とは別の調整容器に入れて、分子標的薬４を水性媒体に溶解させて、第２の溶液を調整する。すなわち、第２の溶液は、前述した第１の溶液と同様の方法を用いて調整することができる。
　分子標的薬４および水性媒体としては、前述した、分子標的薬４および水性媒体を用いることができる。
　調製される第２の溶液に含まれる水性媒体の含有量は、特に限定されないが、例えば、５０～９９．９９ｗｔ％とすることができる。また、第２の溶液としては、市販されている分子標的薬剤を用いることもできる。例えば、セツキシマブを有効成分とするメルクセローノ社製のアービタックス（登録商標）等を用いることができる。
　次に、製造容器２０を準備する。
　製造容器２０は、開口部を備え、第１の溶液１０を収容する容器本体２１と、容器本体２１を密閉するための蓋２２とを有している。
　容器本体２１は、特に限定されないが、図３（ａ）に示すような外形が有底円筒状をなしていることが好ましい。本実施形態では、容器本体２１として、容量が０．５～２０ｍｌ程度のバイアル瓶を用いる。本発明の分子標的薬バブルの製造方法では、容器本体２１として、このような容量の小さなバイアル瓶を用いた場合であっても、容器本体２１を蓋２２で密閉した際に、容器本体２１内の密閉空間で適切な圧力が第１の溶液１０に付与されるので、均一なサイズのバブル１００を安定的に得ることができる。特に、容量が０．５～２．５ｍｌ程度のバイアル瓶であれば、１つの製造容器２０内に、１回の超音波診断に必要となる０．３～０．６ｍｌ程度のバブル含有液を製造することができる。この場合、超音波診断の際に、１つの製造容器２０内の分子標的薬バブル含有液を使い切ることができるため、製造される分子標的薬バブル含有液の無駄をなくすことができる。
　このように容量の小さいバイアル瓶（容量：０．５～２０ｍｌ程度）の寸法は、長手方向の長さＸが、３５～６０ｍｍ程度であり、外径Ｒが、１０～４０ｍｍ程度である。
　蓋２２は、図３（ｂ）～（ｄ）に示すように、容器本体２１の瓶口に密着する円盤状のゴム栓（セプタム）２２１と、ゴム栓２２１を容器本体２１の瓶口に固定する締付部２２２とを備えている。
　締付部２２２は、ゴム栓２２１の縁部を覆うように構成されており、その平面視略中央に開口を有している。また、締付部２２２の瓶口側の内周面および容器本体２１の瓶口側の外周面には、互いに螺合可能に形成されるネジ溝が、それぞれ形成されており（図示せず）、これらを螺合させることにより、ゴム栓２２１が容器本体２１の瓶口と密着した状態で固定される。また、締付部２２２を容器本体２１の瓶口にかしめることで、ゴム栓２２１が容器本体２１の瓶口と密着した状態で、容器本体２１と締付部２２２とを固定することもできる。
　［Ｓ２］第１の溶液を製造容器に注入する工程
　調製された第１の溶液１０を容器本体２１（製造容器２０）の所定の高さまで注入する。本実施形態では、図３（ａ）に示すように、Ｙ［ｍｍ］まで注入する。したがって、図３（ａ）に示すように、第１の溶液１０が注入された状態の容器本体２１は、その上部に空隙部１１を有する。
　本実施形態では、第１の溶液１０が注入された容器本体２１（製造容器２０）を水平に静置した状態において、容器本体２１の高さ（長手方向の長さ）をＸ［ｍｍ］とし、容器本体２１における第１の溶液１０の液面の高さをＹ［ｍｍ］としたとき、０．２≦Ｙ／Ｘ≦０．７の関係を満足するのが好ましい。上記関係を満足することにより、十分な大きさの空隙部１１が存在するので、工程（Ｓ４）において、第１の溶液１０を製造容器２０の上下面および側面（特に、上下面）により勢いよく衝突させることができる。この衝突により、第１の溶液１０中に衝撃波が生じ、第１の溶液１０中にバブル１００を容易に形成することができる。
　なお、前記関係は、０．３≦Ｙ／Ｘ≦０．５の関係を満足するのがより好ましく、０．３５≦Ｙ／Ｘ≦０．４の関係を満足するのがさらに好ましい。これにより、工程（Ｓ４）において、第１の溶液１０中にバブル１００をより容易に形成することができる。
　［Ｓ３］製造容器を密閉する工程
　次に、容器本体２１にガス３を充填させて、製造容器２０内を加圧した状態で密閉する（図３（ｂ）参照）。具体的には、第１の溶液１０が注入された容器本体２１の空隙部１１を、ガス３でパージした後、蓋２２を容器本体２１の開口部（瓶口）に締付ける。これにより、製造容器２０内に第１の溶液１０とガス３とが密閉される。
　容器本体２１の空隙部１１をガス３でパージする方法としては、例えば、第１の溶液１０が注入された容器本体２１をチャンバー内に移動させる。次に、チャンバー内の空気をガス３で置換する。その後、蓋２２を容器本体２１の開口部に締付けることにより、製造容器２０内に第１の溶液１０とガス３とを密閉することができる。
　次に、ガス３が充填された注射器を準備する。そして、注射器の注射針をゴム栓２２１に刺通する。その後、注射器から製造容器２０内にさらにガス３を加えることにより、製造容器２０内が加圧される。その後、ゴム栓２２１から注射針を抜去する。これにより、製造容器２０内がガス３により加圧された状態で密閉された製造容器２０を得ることができる。
　本実施形態のバブルの製造方法では、製造容器２０内の圧力（空隙部１１に充填されたガス３の圧力）を１．０ａｔｍより大きくする。特に、製造容器２０内の圧力は、１．５～１０ａｔｍであるのが好ましく、２～５ａｔｍであるのがより好ましい。これにより、ガス３の一部が第１の溶液１０に微分散または溶解する。
　第１の溶液１０にガス３が微分散または溶解することにより、工程（Ｓ４）において、第１の溶液１０と製造容器２０とが衝突して衝撃波が発生する際に、バブル１００が発生し易くなる。これにより、工程（Ｓ４）において、第１の溶液１０中により多くのバブル１００を生成させることができる。
　また、製造容器２０内の圧力を１．０ａｔｍよりも大きい任意の値に設定することにより、第１の溶液１０中に生成するバブル１００の径および含有量をより容易に調整することができる。
　なお、本実施形態では、製造容器２０内を加圧した状態（製造容器２０内の圧力を１．０ａｔｍよりも大きくした状態）としているが、製造容器２０内を加圧することなく、次工程（Ｓ４）を行ってもよい。
　［Ｓ４］製造容器を振動させる工程
　次に、第１の溶液１０が、製造容器２０の上下面および側面（特に、上下面）に繰り返し衝突するように、製造容器２０を振動させる。本実施形態では、図３（ｃ）に示すように、製造容器２０が、略その長手方向（図３（ｃ）では、鉛直方向）に往復運動するように、製造容器２０を振動させる。
　本工程では、工程（Ｓ３）で密閉した製造容器２０（図３（ｃ）の下図）を上方向に振動させる（図３（ｃ）の真中の図）。これにより、第１の溶液１０は、製造容器２０の中間付近に移動する。更に製造容器２０を上方向に振動させると、第１の溶液１０が製造容器２０の上部に移動して、蓋２２の下面（ゴム栓２２１）に衝突する（図３（ｃ）の上図）。この際に、図４に示すように、衝撃波が発生する。この衝撃波の圧力により、ガス３が第１の溶液１０中に微分散し、バブル１００が形成する。このバブル１００内には、振動により第１の溶液１０に微分散または溶解したガス３が含まれる。
　一方、製造容器２０（図３（ｃ）の上図）を下方向に振動させる（図３（ｃ）の真中の図）。これにより、第１の溶液１０は、製造容器２０の中間付近に移動する。更に製造容器２０を下方向に振動させると、第１の溶液１０が製造容器２０の下部に移動して、製造容器２０の下面に衝突する（図３（ｃ）の下図）。この時も、図４に示すように、衝撃波が発生する。
　また、製造容器２０を鉛直方向に振動させる際に、第１の溶液１０は、製造容器２０の内側の側面とも衝突する。この時も、図４に示すように、衝撃波が発生する。
　以上の操作を繰り返し行うことによって、第１の溶液１０中に均一なサイズのバブル１００を多量に安定的に生成させることができる。
　本実施形態の分子標的薬バブルの製造方法では、十分に微細で、均一なサイズのバブル１００を得るために、製造容器２０を５０００ｒｐｍ以上で振動させるのが好ましい。これにより、第１の溶液１０と製造容器２０とが衝突する際に発生する衝撃波の大きさ（圧力）が十分に大きくなり、第１の溶液１０中に生じるバブル１００が微細化され、そのサイズを均一にすることができる。また、製造容器２０の回転数を上記範囲内で低めに設定した場合には、発生する衝撃波の大きさが小さくなるので、比較的径の大きなバブル１００を生成することができる。また、回転数を高めに設定した場合には、発生する衝撃波の大きさが大きくなるので、比較的径の小さいバブル１００を生成することができる。なお、本明細書において、製造容器２０の「回転数」とは、単位時間当たりに、製造容器２０がその全振動経路を移動する回数を意味する。例えば、製造容器２０が５０００ｒｐｍで振動するとは、製造容器２０が、１分間に全振動経路を５０００回移動（振動）することを意味する。
　また、製造容器２０の回転数は、５５００ｒｐｍ以上であることがより好ましく、６０００～２００００ｒｐｍであることがさらに好ましい。製造容器２０の回転数を上記範囲内とすることにより、振動により生成したバブル１００同士が、衝突により崩壊したり、合体して粗大化するのをより確実に防止することができる。これにより、バブル１００の径を微細化しつつ、より均一なサイズのバブル１００を多量に第１の溶液１０中に生成させることができる。
　上記のような回転数で製造容器２０を振動させることができる装置としては、例えば、ビーズ方式の高速細胞破砕システム（ホモジナイザー）を用いることができる。具体例としては、バーティンテクノロジーズ（ｂｅｒｔｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製のプレセリーズ（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ）等を用いることができる。
　また、第１の溶液１０と製造容器２０とが衝突する際に発生する衝撃波の圧力は、４０ｋＰａ～１ＧＰａとなることが好ましい。第１の溶液１０と製造容器２０との衝突時に発生する衝撃波の圧力が上記範囲内となることにより、第１の溶液１０中に生じるバブル１００をより微細化し、そのサイズをより均一にすることができる。特に、第１の溶液１０と製造容器２０との衝突時に発生する衝撃波の圧力が大きくなるほど、より微細なバブル１００を生成することができる。
　製造容器２０を振動させる際に、製造容器２０の長手方向の振動幅は、０．７Ｘ～１．５Ｘ［ｍｍ］程度であるのが好ましく、０．８Ｘ～１Ｘ［ｍｍ］程度であるのがより好ましい。これにより、製造容器２０の振動時に、第１の溶液１０と製造容器２０の下面および蓋２２とを確実に衝突させることができ、第１の溶液１０と製造容器２０の下面および蓋２２との衝突回数を十分に多くすることができる。また、このように十分な振動幅で製造容器２０を振動させることにより、第１の溶液１０が製造容器２０内を移動する速度が大きくなる。そのため、第１の溶液１０と製造容器２０の下面および蓋２２との衝突時に発生する衝撃波の大きさが十分に大きくなる。結果として、第１の溶液１０中に微細なバブル１００を多量に生成させることができる。
　また、製造容器２０を鉛直方向に往復運動させる際に、製造容器２０は、その短手方向（水平方向）にも振動させるのが好ましい。これにより、製造容器２０の内側の側面にも第１の溶液１０が衝突するので、第１の溶液１０に衝撃波をより多く発生させることができる。製造容器２０の短手方向への振動幅は、０．３Ｘ～０．８Ｘ［ｍｍ］程度であるのが好ましく、０．５Ｘ～０．７Ｘ［ｍｍ］程度であるのがより好ましい。これにより、上述した効果はより顕著となる。
　なお、製造容器２０を振動させる方向は、その短手方向のみであってもよい。この場合、製造容器２０の短手方向（水平方向）への振動幅は、上述した短手方向への振動幅と同じであることが好ましい。かかる振動幅であれば、製造容器２０の内側の側面に第１の溶液１０が確実に衝突するので、第１の溶液１０に衝撃波をより多く発生させることができる。その結果、第１の溶液１０中に微細なバブル１００を多量に生成させることができる。
　また、本工程では、第１の溶液１０を製造容器２０の上下面および側面に衝突させる際における製造容器２０と製造容器２０内の第１の溶液１０との瞬間相対速度が４０ｋｍ／ｈ以上となるように製造容器２０を振動させることが好ましい。また、かかる瞬間相対速度が５０ｋｍ／ｈ以上となるように製造容器２０を振動させることがより好ましい。上記条件を満足することにより、第１の溶液１０と製造容器２０とが衝突する際に生じる衝撃波の圧力を十分に大きくすることができる。その結果、第１の溶液１０中に生じるバブル１００をより微細化し、そのサイズをより均一にすることができる。
　なお、製造容器２０を上記条件で振動させる時間は、１０～１２０秒程度であるのが好ましく、３０～６０秒程度であるのがより好ましい。製造容器２０の振動時間を上記範囲内とすることにより、第１の溶液１０が製造容器２０と衝突する回数が十分に多くなるため、第１の溶液１０中に、多量のバブル１００を生成させることができる。なお、製造容器２０の振動時間を上記範囲内で長く設定することにより、第１の溶液１０中に生成されるバブル１００の量をより多くすることができる。
　また、第１の溶液１０中に生成されるバブル１００の平均径は、製造容器２０の回転数を前述した範囲内で変更することにより調整することができる。本実施形態では、おおよそ数十～数百ナノメーターサイズのナノバブルを安定的に生成することができる。
　なお、本実施形態では、製造容器２０が、ほぼその長手方向に往復運動するように、製造容器２０を振動させているが、製造容器２０を振動させる方法は、これに限定されない。例えば、製造容器２０が、主として、その短手方向および／または長手方向に回転運動するように、製造容器２０を振動させてもよい。この場合であっても、製造容器２０内の第１の溶液１０は、製造容器２０の上下面および側面に繰り返し衝突することにより、衝撃波が発生する。このような振動方法を用いても、第１の溶液１０中に、均一なサイズのバブル１００を多量に安定的に生成することができる。
　［Ｓ５］第１の溶液と第２の溶液とを混合する工程
　上記条件で振動させた後の製造容器２０の蓋を外し、第２の溶液を容器本体２１に注入する。これにより、第１の溶液１０と第２の溶液とが混合して、混合液１２を得る（図３（ｄ）参照）。これにより、混合液１２中において、バブル１００（外殻２）の表面に分子標的薬４が付着した分子標的薬バブル１（図１参照）を得ることができる。
　なお、第２の溶液を容器本体２１に注入した後、第１の溶液１０と第２の溶液とを、例えば、撹拌子による撹拌、超音波処理等を用いて混合してもよい。
　なお、混合液１２中におけるアルブミンの含有量をＸ［ｗｔ％］とし、分子標的薬４の含有量をＹ［ｗｔ％］としたとき、１≦Ｙ／Ｘ≦１０の関係を満足することが好ましく、１．５≦Ｙ／Ｘ≦８の関係を満足することがより好ましく、２≦Ｙ／Ｘ≦５の関係を満足することがさらに好ましい。混合液１２が上記条件を満足することにより、外殻２の表面に十分な量の分子標的薬４が付着した分子標的薬バブル１を生成することができる。かかる分子標的薬バブル１を用いることにより、患部付近で外殻２を破裂させた際に、患部に対して、十分な量の分子標的薬４を供給することができる。そのため、患部をより効率良く治療することができる。
　また、混合液１２中における外殻材料の含有量は、０．００１～５０ｗｔ％程度であることが好ましく、０．０１～２０ｗｔ％程度であることがより好ましい。混合液１２中における外殻材料の含有量が上記範囲内であれば、分子標的薬バブル１の安定性が向上し、長期間保存した場合でも、混合液１２中に含まれる分子標的薬バブル１の数およびサイズの変動をより確実に抑えることができ、分子標的薬バブル１の経時安定性をより向上させることができる。特に、外殻材料中のアルブミンの含有比率が９０ｗｔ％以上である場合には、混合液１２中の外殻材料の含有量がごく少量（例えば、０．０５ｗｔ％程度）であっても、分子標的薬バブル１の経時安定性は極めて優れる。　
　また、製造容器２０内は加圧されている。そのため、製造容器２０の蓋２２を外す際に、製造容器２０内を急激に減圧すると、第１の溶液１０中のバブル１００の粒径が変化したり、含有量が減少したりする等の悪影響が生じる可能性がある。そのため、本工程において、製造容器２０の蓋２２を外す際に、あらかじめ、製造容器２０内の圧力を大気圧まで減圧しておくことが好ましい。
　例えば、製造容器２０内を減圧するための減圧用注射器を用意し、その注射針をゴム栓２２１に刺通する。その際に、減圧用注射器の注射針が第１の溶液１０に接触しないようにする。次に、減圧用注射器のプランジャーを操作して、製造容器２０内のガス３を吸引することにより、製造容器２０内の圧力を大気圧まで減圧する。その後、製造容器２０から蓋２２を外す。かかる方法を用いれば、生成されたバブル１００に上述したような悪影響が生じない。
　なお、上述した工程（Ｓ２）～（Ｓ５）は、一定の温度下で行われるのが好ましい。製造過程における温度条件が一定であれば、各工程（Ｓ２）～（Ｓ５）において、各溶液（第１の溶液１０、第２の溶液、混合液１２）の特性（粘性等）が安定するため、分子標的薬バブル１を安定的に製造することができる。各溶液の温度を一定に維持するための方法としては、例えば、上述した各工程（Ｓ２）～（Ｓ５）をグローブボックスや恒温槽内で行う方法が挙げられる。特に、工程（Ｓ４）において、製造容器２０を高速で振動させるため、第１の溶液１０と製造容器２０の内面との衝突により製造容器２０が発熱し易い。しかし、恒温槽内で製造容器２０を振動させることにより、第１の溶液１０の温度が上昇するのを確実に防止することができる。その結果、第１の溶液１０中に均一な径のバブル１００を安定的に生成することができ、最終的に、均一な径を有する分子標的薬バブル１を安定的に生成することができる。
　以上の工程（Ｓ１）～（Ｓ５）を経て、平均径が１０ｎｍ～１０００μｍ程度の分子標的薬バブル１が製造される。
　なお、従来のバブルの製造方法では、大掛かりな還流装置や、バブルの製造装置を構成する様々なシステム（チューブ、ノズル、コンプレッサ等）が必要であった。そのため、食品分野や医療分野等に用いられるバブルを製造する際に、清潔で、かつ無菌環境を維持するのが困難であった。これに対して、本発明では、分子標的薬バブル１の製造に気密性の高い製造容器２０を用いるため、第１の溶液１０、第２の溶液およびガス３を製造容器２０内に含有した状態で、例えば、γ線滅菌等による滅菌処理を製造容器２０に施せばよい。これにより、製造容器２０内が滅菌されるため、分子標的薬バブル１を滅菌環境下で製造することができる。
　なお、上記のようにして得られた分子標的薬バブル１は、混合液１２中に安定的に存在することができる。そのため、得られた分子標的薬バブル含有液（以下、単に「バブル含有液」という）を含む製造容器２０（以下、単に「バブル含有容器」という）は、室温にて長期保存することができる。具体的には、６～２４か月間もの期間にわたって保存することができる。また、これだけ長期間保存した後でも、混合液１２中での分子標的薬バブル１の安定性が高いため、再度バブル含有容器を振動させたりする必要なく、使用することが可能である。また、製造容器として、容量が小さい製造容器２０を用いることができるので、バブル含有容器の単価を抑えることができる。そのため、上記のようにして得られたバブル含有容器は、医療機関等にとっては、取扱い易いというメリットがある。
　［Ｓ６］遠心分離処理工程
　本実施形態の分子標的薬バブルの製造方法は、工程（Ｓ４）後であって、工程（Ｓ５）前に、製造容器２０に対して、遠心分離処理を行ってもよい。この処理により、製造容器２０内に生成されたバブル１００を、所望の径別に分離することができる。その後、分離した所望の径のバブル１００を含む第１の溶液１０を用いて、工程（Ｓ５）を行うことにより、より単分散なバブル径分布を有する分子標的薬バブル１を得ることができる。
　具体的には、工程（Ｓ４）後の製造容器２０に対して遠心分離処理を行うことにより、径の大きいバブル１００が製造容器２０の上層へ移動する傾向があり、径の小さいバブル１００が製造容器２０の下層へ移動する傾向がある。したがって、製造容器２０の上層の液体（上澄み液）を吸引手段（注射器、ピペット等）により除去すれば、製造容器２０内に残存する第１の溶液１０中のバブル１００の平均径は、工程（Ｓ４）後に得られたバブル１００の平均径よりも小さくなる。また、吸引手段により吸引した上澄み液中のバブル１００の平均径は、工程（Ｓ４）後に得られたバブル１００の平均径よりも大きくなる。したがって、遠心分離処理を用いることにより、最終的に、より単分散なバブル径分布を有する分子標的薬バブル１を得ることができる。
　また、第１の溶液１０で使用する水性媒体と比重の異なる物質をバブル含有液に加えて、遠心分離処理することにより、径の大きいバブル１００がより上層へと移動し易くなり、径の小さいバブル１００がより下層へと移動し易くなる、その結果、より単分散なバブル径分布を有する分子標的薬バブル１を得ることができる。
　工程（Ｓ１）～（Ｓ４）を経て、例えば、平均径が６００ｎｍのバブル１００を含有する第１の溶液１０を経た場合、遠心分離の条件を適宜設定することにより、平均径が２００～３００ｎｍのバブル１００を含有する第１の溶液１０を得ることができる。この第１の溶液１０を用いて工程（Ｓ５）を行うことにより、平均径が２００～３００ｎｍの分子標的薬バブル１を得ることができる。この分子標的薬バブル１は、比較的大きいサイズのバブルが存在しないため、患部に到達した際に、解像度の高い超音波造影剤としても機能し、高精細な画像を得ることができる。
　遠心分離処理の条件は、分離するバブル１００の平均径によって適宜設定され、例えば、バブル含有液に１×ｇ～２２０００×ｇ程度の遠心加速度が３０秒～２４時間程度かかるようにする。遠心加速度を小さく設定（１×ｇ～１００×ｇ程度）する場合には、長時間（１２時間～２４時間程度）にわたって処理することにより、より単分散なバブル径分布を有するバブル１００を得ることができる。また、遠心加速度を大きく設定（１００×ｇ～２２０００×ｇ）する場合には、比較的短時間（３０秒～１２時間程度）の処理により、より単分散なバブル径分布を有するバブル１００を得ることができる。遠心分離処理を上記条件で行うことにより、所望の平均径を有するバブル１００を効率良く分離することができる。
　上記のような遠心加速度でバブル含有容器に遠心分離処理を行うことができる遠心分離機としては、特に限定されないが、例えば、商品名「ＴＯＭＹ　ＭＸ－３０１」（トミー精工社製）等の微量高速冷却遠心機を用いることができる。なお、上記微量高速冷却遠心機を用いる場合には、その回転数が５０～２０００ｒｐｍ程度に設定することにより、上記範囲の遠心加速度（遠心力）がバブル含有液に負荷される。
　また、遠心分離処理は、１回でもよいし、複数回にわたって行ってもよい。
　上記の説明では、工程（Ｓ１）～（Ｓ５）を行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズの分子標的薬バブル１（図１参照）を多量に安定的に製造することができる。ただし、本実施形態のバブルの製造方法は、これに限定されない。例えば、前述した工程（Ｓ６）を、工程（Ｓ１）～（Ｓ５）を行った後に行ってもよい。また、工程（Ｓ５）の後に、工程（Ｓ４）を少なくとも１回以上繰り返し行うようにしてもよい。
３．使用方法
　上記のようにして得られたバブル含有容器は、患者の超音波治療に用いられる。
　具体的には、まず、注射器の注射針を蓋２２のゴム栓２２１に刺通する。次に、バブル含有容器内からバブル含有液を吸引する。そして、ゴム栓２２１から注射針を抜去し、バブル含有液を吸引した注射器の注射針を患者の血管（例えば静脈）に穿刺して、バブル含有液を血管内に注入する。これにより、分子標的薬バブル１は、血流により患部に運ばれる。なお、バブル含有容器（製造容器２０）から蓋２２を外し、注射器を用いて、バブル含有容器内からバブル含有液を吸引してもよい。
　血管内に注入された分子標的薬バブル１は、分子標的薬４が付着した状態で、患部に効率良く到達（集積）する。そして、分子標的薬バブル１が患部に到達した時に、外殻２が破裂する程度の周波数および強度を有する治療用超音波を照射して、外殻２を破裂させる。これにより、患部に対して、分子標的薬４が供給されるとともに、患部の細胞の一部を破壊することができるため、患部を効率良く治療することができる。
　また、上記バブル含有容器内のバブル含有液は、注射針を用いて血管内に注射する方法以外に、経口投与を用いる方法によっても使用することができる。
　また、この場合、超音波治療と超音波診断とを組み合わせて行うのも有効である。具体的には、血管内の分子標的薬バブル１に対して、診断用超音波を照射して、その反射波をモニタリングする。これにより、分子標的薬バブル１の血管内（体内）での位置や挙動を正確に把握することができる。
　なお、治療用超音波の強度（出力）は、０．１～３０Ｗ／ｃｍ２程度であるのが好ましく、０．５～１０Ｗ／ｃｍ２程度であるのがより好ましい。治療用超音波の強度を上記範囲内とすることにより、より確実に分子標的薬バブル１を破裂させることができるとともに、患部周辺の正常細胞へ与えるダメージを無くすか低減することができる。また、治療用超音波の強度が上記範囲内である場合、その照射時間は、１０～１２０秒程度であるのが好ましく、３０～６０秒程度であるのがより好ましい。
　また、超音波治療の際に照射する超音波の周波数は、１００ｋＨｚ～１０ＭＨｚ程度であるのが好ましく、７００ｋＨｚ～１ＭＨｚ程度であるのがより好ましい。照射する超音波の周波数を上記範囲内とすることにより、より低い超音波出力でバブルを破裂させることができる。
　なお、バブル含有容器内の圧力を大気圧まで減圧した状態で、蓋２２を外し、バブル含有容器内からバブル含有液を吸引してもよい。この場合、バブル含有容器内の圧力を大気圧まで減圧しているため、蓋２２を外した瞬間に、バブル含有液が製造容器２０の外部に吹き出すのを確実に防止することができる。
　＜第２実施形態＞
　次に、本発明の分子標的薬バブルおよび分子標的薬バブルの製造方法の第２実施形態について説明する。
　図５（ａ）および（ｂ）は、本発明の分子標的薬バブルの第２実施形態について、その一部を切断した状態を示す斜視図である。
　以下、第２実施形態の分子標的薬バブルおよび分子標的薬バブルの製造方法について、前記第１実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
１．分子標的薬バブル
　本実施形態の分子標的薬バブル１は、図５（ａ）および（ｂ）に示すに示すように、外殻２内に、分子標的薬４以外の薬物５をさらに含んでいる以外は、前述した第１実施形態の分子標的薬バブル１と同様である。かかる分子標的薬バブル１は、後述する本実施形態の分子標的薬バブルの製造方法により製造することができる。
　なお、図５（ａ）では、薬物５が気体状態あるいは固体状態で外殻２内に封入されている分子標的薬バブル１を示しており、図５（ｂ）では、薬物５が液体状態で外殻２内に封入されている分子標的薬バブル１を示している。
　薬物５としては、使用する分子標的薬４の対象となる患部の治療に有効であれば特に限定されないが、遺伝子、薬剤等を含む。具体的には、ペプチド、抗体、オリゴ糖、多糖、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、トリプルヘリックス分子、ウイルスベクター、プラスミド、低分子有機化合物、抗癌剤、金属等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　薬物５とガス３との体積比率は、１：９９～９０：１０程度であるのが好ましく、１０：９０～７０：３０程度であるのがより好ましく、４０：６０～６０：４０程度であるのがさらに好ましい。薬物５とガス３との体積比率が上記範囲内であれば、分子標的薬バブル１の安定性が向上し、患部付近までより確実に分子標的薬バブル１を運搬することができる。また、患部付近で外殻２を破裂させた際に、患部に対して、十分な量の薬物５を投与することができる。そのため、患部をより効率良く治療することができる。
　このような成分で構成された分子標的薬バブル１の外殻２（バブル）の径は、図１に示す分子標的薬バブル１と同様に、本発明の分子標的薬バブルの製造方法の各工程の条件を変更することにより変化する。
　次に、本実施形態の分子標的薬バブルの製造方法について説明する。
２．分子標的薬バブルの製造方法
　本実施形態では、第１の溶液１０が、水性媒体、外殻材料および薬物５を含んでいる。すなわち、本実施形態の分子標的薬バブルの製造方法は、前述した第１実施形態の工程（Ｓ１）において調整する第１の溶液１０が、外殻材料、水性媒体に加え、薬物５を含んでいる以外は、前述した第１実施形態のバブルの製造方法と同様である。
　［Ｓ１］　準備工程
　本実施形態では、外殻材料、薬物５および水性媒体を調製容器に入れて、外殻材料と薬物５とを水性媒体に溶解させて、第１の溶液１０を調製する。すなわち、調製容器内に外殻材料、薬物５および水性媒体を所定量加えた後、攪拌して、外殻材料および薬物５を水性媒体に溶解させる。外殻材料、薬物５、水性媒体を調製容器に入れる順番は、特に限定されない。外殻材料および薬物５を水性媒体に溶解させる方法としては、例えば、攪拌子による攪拌、超音波処理等を用いることができる。
　薬物５としては、前述した遺伝子、薬剤等が使用される。調製される第１の溶液１０に含まれる薬物５の含有量は、０．１～５０ｗｔ％であるのが好ましく、２０～５０ｗｔ％であるのがより好ましい。これにより、製造される分子標的薬バブル１に十分な量の薬物５を含ませることができる。その結果、患部に対する治療効果がより優れた分子標的薬バブル１を製造することができる。
　このようにして調整された第１の溶液１０を用いて、前述した第１実施形態と同様に、工程（Ｓ２）～（Ｓ５）、または工程（Ｓ２）～（Ｓ４）を行った後に、工程（Ｓ６）を行い、その後、工程（Ｓ５）を行うことにより、製造容器２０内に均一なサイズの分子標的薬バブル１（図５（ａ）および図５（ｂ）参照）を多量に安定的に製造することができる。また、同時に、均一なサイズの分子標的薬バブル１を多量に含有する製造容器２０が得られる。
　本実施形態では、分子標的薬バブル１（外殻２）内には、工程（Ｓ３）において第１の溶液１０中に微分散または溶解したガス３、および工程（Ｓ４）の振動により第１の溶液１０に微分散または溶解したガス３、薬物５が含まれる。その結果、生成される分子標的薬バブル１（バブル１００）は、薬物５がガス３とともに外殻２内に封入され、または、外殻２自体に含有または吸着している。
　かかる第２実施形態の分子標的薬バブルおよび分子標的薬バブルの製造方法によっても、前記第１実施形態の分子標的薬バブルおよび分子標的薬バブルの製造方法と同様の作用・効果を生じる。
　以上、本発明の分子標的薬バブルおよび分子標的薬バブルの製造方法を図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明は、これに限定されるものではなく、各工程は、同様の機能を発揮し得る任意の工程と置換することができる。
　次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．分子標的薬バブルの製造
　（実施例１）
　［準備工程］
　まず、調整容器としての１５ｍｌのバイアル瓶に、アルブミンが２５０ｍｇ／ｍｌ含まれるアルブミン溶液（ＣＳＬ　Ｂｅｈｒｉｎｇ社製　アルブミナー２５％）１２０μｌと、２５％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１２ｍｌとを入れた。その後、アルブミン溶液と２５％ＰＢＳとを撹拌することにより、第１の溶液を得た。なお、第１の溶液中のアルブミン濃度は、０．２５％であった。また、第２の溶液として、セツキシマブを有効成分とするアービタックス注射液１００ｍｇ（メルクセローノ社製、抗悪性腫瘍剤　抗ヒトＥＧＦＲ　モノクローナル抗体）を準備した。また、製造容器としての２ｍｌのバイアル瓶（高さＸ：４５ｍｍ、外径Ｒ：１３ｍｍ）を準備した。なお、このバイアル瓶は、図３に示す製造容器２０と同様の形状をなしている。
　［第１の溶液を容器に注入する工程］
　２ｍｌバイアル瓶内に、第１の溶液７００μｌを注入した。なお、第１の溶液の液面の高さＹは、２５ｍｍであった。
　［容器を密閉する工程］
　次に、第１の溶液が注入されたバイアル瓶内の空隙をパーフルオロプロパンでパージした後、バイアル瓶の瓶口に図３に示す蓋２２と同様の形状の蓋を挿着した。次に、パーフルオロプロパンが充填された注射器を準備した。注射器の注射針で蓋のゴム栓を刺通して、注射器からバイアル瓶内にさらに１ｍｌのパーフルオロプロパンを加えた。これにより、内部の圧力が１．３ａｔｍの密閉バイアル瓶を得た。
　［容器を振動させる工程］
　次に、ｂｅｒｔｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（高速細胞破砕システム）を用いて、密閉バイアル瓶を、６５００ｒｐｍで１０秒間振動後に２０秒間静置させるプロセスを１サイクルとした。このプロセスを６回行うことにより、バイアル瓶を振動させた。その際、密閉バイアル瓶は、上下方向に往復運動し、第１の溶液がバイアル瓶の上下面に繰り返し衝突することを確認した。なお、密閉バイアル瓶を振動させる際に、密閉バイアル瓶の長手方向（鉛直方向）の振動幅は、４０ｍｍであり、密閉バイアル瓶の短手方向（水平方向）の振動幅は、２０ｍｍであった。上記条件に設定することにより、いずれのバイアル瓶についても、バイアル瓶と水性液体との瞬間相対速度が４０ｋｍ／ｈ以上となるようにした。
　［第１の溶液と第２の溶液とを混合する工程］
　振動後、密閉バイアル瓶の蓋を外し、第２の溶液としてのアービタックス注射液１００ｍｇの７００μｌをバイアル瓶内に注入した。これにより、第１の溶液と第２の溶液とが混合し、バブルの表面にセツキシマブが付着した分子標的薬バブルを含む混合液（バブル含有液）を得た。
　上記のようにして得られた混合液をバイアル瓶から注射器で取出した。次に、バブル測定装置（大塚電子製　粒径・ゼータ電位・分子量測定システム　ＥＬＳＺ－２０００）を用いて、混合液に含まれる分子標的薬バブル（外殻）のバブル径分布測定を行ったところ、その平均径は、１μｍ程度であった。また、得られた分子標的薬バブル中のアルブミンとセツキシマブとの重量比率は、１００：１～６：４の関係を満たしていた。
　（実施例２）
　第２の溶液を容器に注入する工程において、バイアル瓶に注入するアービタックス注射液１００ｍｇの注入量を１０５０μｌに変更した以外は、前記実施例１と同様にして、分子標的薬バブルを含む混合液を得た。また、得られた分子標的薬バブル中のアルブミンとセツキシマブとの重量比率は、１００：１～６：４の関係を満たしていた。
　（実施例３）
　第１の溶液を準備する工程において、２５％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の使用量を１２ｍｌから１２０ｍｌに変更して第１の溶液を調製した以外は、前記実施例１と同様にして、第１の溶液が密閉されたバイアル瓶を振動させて、密閉バイアル瓶内にバブルを生成した。
　［遠心分離工程］
　次に、振動後の密閉バイアル瓶に対して、微量高速冷却遠心機（トミー精工社製、「ＴＯＭＹ　ＭＸ－３０１」）を用いて、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行った。この遠心分離処理により、バブルを含有する第１の液体は、バイアル瓶の上側に濃い白濁部分と、バイアル瓶の中間に淡い白濁部分と、バイアル瓶の下側にほぼ透明な部分との３つの部分に分離された。次に、マイクロピペットにより、バイアル瓶の上側の濃い白濁部分を吸引して除去した。その後、他のマイクロピペットを、その先端がバイアル瓶の底付近に到達するように、バイアル瓶に挿入し、バイアル瓶の下側のほぼ透明な部分を吸引して、遠心分離後の第１の液体を得た。
　上記工程を繰り返し、バブルを含有する遠心分離後の第１の液体を１２００μｌ準備した。
　［第１の溶液と第２の溶液とを混合する工程］
　次に、他のバイアル瓶を準備し、遠心分離後の第１の液体１２００μｌと、第２の溶液としてのアービタックス注射液１００ｍｇの１８００μｌを他のバイアル瓶内に注入した。これにより、第１の溶液と第２の溶液とが混合し、バブルの表面にセツキシマブが付着した分子標的薬バブルを含む混合液（バブル含有液）を得た。
　なお、本実施例では、第１の溶液中のアルブミン濃度が０．０２５％であった。また、得られた分子標的薬バブル中のアルブミンとセツキシマブとの重量比率は、１００：１～６：４の関係を満たしていた。
　（比較例１）
　アービタックス注射液１００ｍｇを用いることなく、容器を振動させる工程後のバイアル瓶内の第１の溶液を得た。この第１の溶液内には、バブル（アルブミンバブル）が生成しており、その平均径は１μｍ程度であった。
２－１．バブル径分布評価（１）
　上記のようにして得られた実施例１、実施例２および比較例１の分子標的薬バブルまたはバブルについて、上記バブル測定装置を用いて測定されたバブル径分布を図６に示す。なお、図６には、参考のため、アービタックス注射液１００ｍｇの使用量を３５０μｌに変更した以外は、前記実施例１と同様にして作成した参考例の分子標的薬バブルのバブル径分布を併せて示す。
　図６に示すように、分子標的薬（アービタックス注射液１００ｍｇ）の投入量が多い実施例２では、その他の、分子標的薬バブルまたはバブルに比べて、大きなバブル径を有する分子標的薬バブルが多量に存在していることが分かった（図６中、矢印部分参照）。分子標的薬の投入量を増やすことにより、バブルの外殻に付着する分子標的薬の量が増加するため、サイズの大きい分子標的薬バブルが生成したと推測される。
２－２．バブル径分布評価（２）
　実施例３について、遠心分離直後の第１の液体、および、最終的に得られる分子標的薬バブルのバブル径分布を、ナノ粒子解析システム（商品名：ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）を用いて測定した。その結果を、図８に示す。なお、図８（ａ）は、実施例３における、遠心分離直後の第１の液体のバブル径分布を示すグラフである。図８（ｂ）は、実施例３の分子標的薬バブルのバブル径分布を示すグラフである。
　実施例３では、第１の溶液中のアルブミン濃度が極めて低い（０．０２５％）にもかかわらず、平均バブル径が２８５．３ｎｍ程度の分子標的薬バブルを安定的に得ることができた。また、バブルを含有する遠心分離後の第１の液体の平均バブル径が２６９．９ｎｍ程度であり、分子標的薬を含む第２の液体を第１の液体に注入する工程の前後で、平均バブル径に大きな差は生じないことが分かった。
３．細胞殺傷効果の評価
　上記のようにして得られた実施例および比較例について、ヒト由来の口腔扁平上皮癌細胞株であるＨＳＣ－２に対する癌細胞殺傷効果を、以下のようにして評価した。
　まず、４つの超音波プローブの音響放射面上にエコーゲルを塗布した後、２４ウェル細胞培養用プレートを配置した。次に、４つの超音波プローブに対応する位置にある４つのウェル上にＨＳＣ－２を播種した。次に、ＨＳＣ－２が播種された４つのウェル上に、第１実施形態の試料１００μｌを添加した。その後、超音波プローブを起動して、周波数：１．０１１ＭＨｚ、音響強度：７２５ｍＷ／ｃｍ２、パルス繰り返し周波数：１０Ｈｚ、デューティー比：５０％、照射時間：１５秒の条件で、４つのウェルに対して超音波処理を行った。その後、４つのウェル上に死滅したＨＳＣ－２細胞を染色するトリパンブルー１５μｌを添加した。その後、ＨＳＣ－２の生存率を、セルカウンター（ＴＣ２０　Ｂｉｏ　Ｒａｄ社製）を用いて測定した。また、比較例１について、実施例１と同様にして、ＨＳＣ－２の生存率を測定した。
　また、実施例２および比較例１について、４つのウェル上に添加する試料の量を１５０μｌに変更した以外は、前記実施例１と同様にして、ＨＳＣ－２の生存率を測定した。
　以上のようにして評価した結果を図７に示す。
　図７は、実施例および比較例について、口腔扁平上皮癌細胞ＨＳＣ－２の細胞殺傷率を示すグラフである。
　図７に示すように、実施例１および２の分子標的薬バブルは、比較例１で得られたアルブミンバブルに比べて、その細胞殺傷効果が優れていた。より具体的には、各ウェルに１００μｌを添加した、実施例１と比較例１との比較から、実施例１では、比較例１よりも約１２％の細胞生存率の減少が認められた。また、各ウェルに１５０μｌを添加した、実施例２と比較例１との比較から、実施例２では、比較例１よりも約１９％の細胞生存率の減少が認められた。この結果から、分子標的薬（アービタックス注射液１００ｍｇ）の濃度が高いほど、細胞殺傷効果が高くなることが分かった。なお、アービタックス注射液１００ｍｇを、各ウェルに１００μｌおよび１５０μｌ添加して、前記実施例１と同様の評価を行ったところ、十分な細胞殺傷効果は認められなかった。このことから、本発明の分子標的薬バブルは、治療用超音波を照射して、外殻（バブル）を破裂させることにより、分子標的薬が患部の癌細胞に供給されるとともに、癌細胞の一部を破壊して、患部の治療効果を高めることができることが分かった。
　本発明によれば、血液中での安定性が高く、分子標的薬に対して高い保持力を有するアルブミンを外殻材料として用いることにより、患部に確実に運搬可能な分子標的薬バブルを提供することができる。この分子標的薬バブルは、分子標的薬が付着した状態で、患部に効率良く到達（集積）する。そして、分子標的薬バブルが患部に到達した時に、超音波を照射して分子標的薬バブル（外殻）を破裂させることにより、患部に対して、分子標的薬が供給されるとともに、患部の細胞の一部を破壊することができる。これにより、患部を効率良く治療することができる。したがって、本発明の分子標的薬バブルは、産業上の利用可能性を有する。

Claims (11)

  1. 　アルブミンを主成分とする外殻材料で構成された外殻と、
    　該外殻に付着し、標的の分子を特異的に認識する分子標的薬とを含むことを特徴とする分子標的薬バブル。
  2. 　前記外殻材料中の前記アルブミンの含有量は、５０～１００ｗｔ％である請求項１に記載の分子標的薬バブル。
  3. 　前記アルブミンと前記分子標的薬との重量比率は、１０００：１～１：１である請求項１または２に記載の分子標的薬バブル。
  4. 　前記分子標的薬は、セツキシマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ　オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ　チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、デノスマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブ　ベドチン、モガムリズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ　エムタンシン、ラムシルマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ブリナツモマブ、ジヌツキシマブ、ダラツムマブ、ネシツムマブ、エロツズマブからなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項１ないし３のいずれかに記載の分子標的薬バブル。
  5. 　前記バブルは、前記外殻内に封入されたガスをさらに有する請求項１ないし４のいずれかに記載の分子標的薬バブル。
  6. 　前記ガスは、亜酸化窒素、酸素、水素、ヘリウム、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、エチレン、プロピレン、プロパジエン、ブテン、アセチレン、プロピン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタンからなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項５に記載の分子標的薬バブル。
  7. 　アルブミンを主成分とする外殻材料を含む第１の溶液と、標的の分子を特異的に認識する分子標的薬を含む第２の溶液とを準備する工程と、
    　前記第１の溶液を、容器の所定の高さまで注入する工程と、
    　前記第１の溶液が前記容器の内面に繰り返し衝突するように、所定の回転数で前記容器を振動させる工程と、
    　振動後の前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合して、混合液を得る工程とを有することを特徴とする分子標的薬バブルの製造方法。
  8. 　前記容器を振動させる工程は、５０００ｒｐｍ以上の回転数で行われる請求項７に記載の分子標的薬バブルの製造方法。
  9. 　前記容器を振動させる工程は、前記容器内を１．０ａｔｍより大きい圧力にした状態で行われる請求項７または８に記載の分子標的薬バブルの製造方法。
  10. 　前記混合液中における、前記アルブミンの含有量をＸ［ｗｔ％］とし、前記分子標的薬の含有量をＹ［ｗｔ％］としたとき、１≦Ｙ／Ｘ≦１０の関係を満足する請求項７ないし９のいずれかに記載の分子標的薬バブルの製造方法。
  11. 　前記混合液中における前記外殻材料の含有量は、０．００１～５０ｗｔ％である請求項７ないし１０のいずれかに記載の分子標的薬バブルの製造方法。
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