WO2017213226A1 - 高分子化合物およびこれを用いた細胞操作方法 - Google Patents
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- C08J2333/00—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Derivatives of such polymers
- C08J2333/04—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Derivatives of such polymers esters
- C08J2333/14—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Derivatives of such polymers esters of esters containing halogen, nitrogen, sulfur, or oxygen atoms in addition to the carboxy oxygen
Definitions
- the present invention relates to a polymer compound whose physical properties are changed by light irradiation and a cell manipulation method using the polymer compound.
- polymer materials whose hydration property is increased by light have been reported.
- these polymer materials change their physical properties at a temperature and pH that are not suitable for cell culture, or change in physical properties is insufficient.
- this polymer material has not yet been controlled to be insoluble and soluble in water by light.
- this polymer material has a problem of limiting its application to cell systems, such as liberation of low molecular components by photocleavage reaction and strong acid generation.
- a material that crosslinks with light is used for photolithography and the like. However, many of these materials require high temperature heat treatment.
- the present invention has been made in view of such circumstances, and does not require high-temperature treatment, and does not liberate low-molecular components, and is a highly soluble material that changes from a water-insoluble state to a soluble state by light irradiation.
- the object is to provide molecular compounds.
- the polymer compound of the present invention has a main chain and a side chain, the side chain has an aromatic ring, and the aromatic ring is bonded to a first carbon atom in which the hydrogen atom to which the bond is bonded is replaced with a nitro group.
- the polymer compound of the present invention is represented by the following chemical formula (2).
- A is a single bond or a functional group
- R 1 is an aldehyde group or a functional group represented by the above chemical formula (1)
- R 1 and NO 2 are bonded to adjacent carbon atoms, respectively.
- R 2 is at least one selected from hydrogen, an alkyl group, a functional group represented by the following chemical formula (3), and a functional group represented by the following chemical formula (4) (R 6 and R 7 are hydrogen, an alkyl group, or an aromatic ring, and R 8 is an alkyl group), R 3 and R 4 are hydrogen or an alkyl group, G is 3 or less alkyl groups that may be substituted with hydrogen of the benzene ring, w and z represent a mole percentage, and 0 ⁇ w ⁇ 100, 0 ⁇ z ⁇ 100.
- the polymer compound of the present invention is represented by the following chemical formula (5).
- a and B is a single bond or a functional group
- R 3, R 4, and R 9 is hydrogen or an alkyl radical
- R 6 and R 7 are hydrogen, an alkyl group or an aromatic ring
- the composite material of the present invention has a base material and a layer containing the polymer compound of the present invention provided on the surface of the base material.
- the light-driven actuator of the present invention has a light source and the composite material of the present invention.
- the cell manipulation method of the present invention comprises a culturing step of culturing cells on the surface of the layer containing the polymer compound of the composite material of the present invention, and after the culturing step, illuminating at least a part of the surface of the polymer compound layer.
- the compound of the present invention is represented by the following chemical formula (6).
- Another compound of the present invention is represented by the following chemical formula (7).
- the schematic diagram for demonstrating the light responsive peeling of Example 16 (b) The image of the composite material bottom face after light responsive peeling.
- FIG. 21 Schematic diagram for explaining photocrosslinked cell patterning in Example 21, (b) Image of bottom surface of composite material after photocrosslinked cell patterning. Chemical formulas of polymer compounds of the present embodiment used in Examples 22 to 33.
- FIG. 22 The schematic diagram for demonstrating the photoresponsive melt
- FIG. 23 Schematic diagram for explaining photoresponsive crosslinking of Example 23 and photoresponsive dissolution of the crosslinked product, (b) Image of composite bottom surface after photoresponsive crosslinking, (c) After photoresponsive dissolution of crosslinked product Image of composite bottom.
- FIG. Schematic diagram for explaining photoresponsive peeling swelling of Example 24, (b) Image of composite material bottom surface after photoresponsive peeling swelling.
- FIG. 29 (A) Schematic diagram for explaining photoresponsive peeling of Example 29, (b) Image of composite bottom surface before ultraviolet light irradiation, (c) Image of composite bottom surface during ultraviolet light irradiation, (d) Ultraviolet An image of the bottom surface of the composite material immediately after light irradiation, (e) An image of the bottom surface of the composite material after spraying the medium.
- FIG. 30 (A) Schematic diagram for explaining photoresponsive peeling in Example 30, (b) Image of composite material bottom before irradiation with ultraviolet light, (c) Image of composite material bottom after irradiation with ultraviolet light.
- FIG. 31 Schematic diagram for explaining photoresponsive peeling in Example 31, (b) Image of iPS cell colony on composite material before ultraviolet light irradiation, (c) iPS cell on composite material after ultraviolet light irradiation Colony image.
- FIG. 32 Schematic diagram for explaining photoresponsive peeling in Example 32, (b) Image of iPS cell colony on composite material before ultraviolet light irradiation, (c) iPS cell on composite material during ultraviolet light irradiation Image of colony, (d) Image of iPS cell colony on composite immediately after irradiation with ultraviolet light, (e) Image of iPS cell colony after medium was sprayed on composite after irradiation with ultraviolet light.
- FIG. 33 Schematic diagram for explaining photoresponsive peeling in Example 33, (b) image of cells on composite material before irradiation with ultraviolet light, (c) image of cells on composite material after irradiation with ultraviolet light.
- the polymer compound according to the embodiment of the present invention has a main chain and a side chain, and the side chain has an aromatic ring.
- the aromatic ring is a first carbon atom in which the bonded hydrogen atom is replaced with a nitro group, and the bonded hydrogen atom is replaced with an aldehyde group or a functional group represented by the following chemical formula (1). With two carbon atoms. The first and second carbon atoms are adjacent in the same benzene ring.
- the solvent solubility changes greatly by light irradiation.
- the operation of fixing an operation target, for example, a cell, to the surface of the layer containing the polymer compound of the present embodiment or removing the operation target from the surface of the layer is macroscopic from the micrometer scale.
- the scale can be freely adjusted by light irradiation.
- the utilization of human iPS cells has been actively studied, and the need for new cell manipulations such as selection of useful cells and removal of unnecessary cells on a culture substrate is rapidly increasing.
- the polymer compound of the present embodiment in which the solubility in water near neutrality can be controlled by light irradiation is extremely useful as a material that meets such needs.
- the polymer compound of the present embodiment exhibits solvent solubility when irradiated with light. For this reason, the operation target fixed to the base material via the layer containing the polymer compound can be easily removed using light and its solvent. Further, when the polymer compound of the present embodiment is used, unlike the low-molecular compound, it can be expected that the manipulation target object is strongly bonded by a strong cohesive force like many adhesives. Since the polymer compound of the present embodiment that changes from a water-insoluble state to a soluble state by light irradiation can be operated using water, it has a lower environmental impact than an operation using an organic solvent. In addition, materials whose physical properties change in aqueous systems due to light irradiation can be used for control of biosystems including cell culture. For this reason, cell operations such as actuating cell detachment from the substrate with light or patterning cells with light are facilitated.
- Examples of the polymer compound of this embodiment include a polymer compound of a random copolymer represented by the following chemical formula (2).
- A is a single bond or a functional group
- R 1 is an aldehyde group or a functional group represented by the above chemical formula (1)
- R 1 and NO 2 are bonded to adjacent carbon atoms, respectively.
- R 2 is at least one selected from hydrogen, an alkyl group, a functional group represented by the following chemical formula (3), and a functional group represented by the following chemical formula (4) (R 6 and R 7 are hydrogen, an alkyl group, or an aromatic ring, and R 8 is an alkyl group), R 3 and R 4 are hydrogen or an alkyl group, G is 3 or less alkyl groups that may be substituted with hydrogen of the benzene ring, w and z represent a mole percentage, and 0 ⁇ w ⁇ 100, 0 ⁇ z ⁇ 100.
- this polymer compound may contain other components.
- a polymer compound of a random copolymer represented by the following chemical formula (5) can be given.
- a and B is a single bond or a functional group
- R 3, R 4, and R 9 is hydrogen or an alkyl radical
- R 6 and R 7 are hydrogen, an alkyl group or an aromatic ring
- this polymer compound may contain other components.
- a and B connecting the main chain and the benzene ring is not particularly limited.
- a and B include a single bond or a functional group having an ester bond, an ether bond, an amide bond, a thioether bond, a thioester bond, a urethane bond, or an alkylene group. That is, the main chain and the benzene ring may be directly bonded by a single bond, or may be bonded via an ester bond, an ether bond, an amide bond, a thioether bond, a thioester bond, a urethane bond, or an alkylene group. Alternatively, they may be bonded via an ester bond, an ether bond, an amide bond, a thioether bond, a thioester bond, a urethane bond, or another functional group having an alkylene group.
- the polymer compound of the present embodiment can be produced by the following method.
- a polymerizable monomer is synthesized by reacting a polymerizable acid chloride or alkyl chloride such as methacryloyl chloride with a compound containing an aromatic ring having a hydroxyl group or an amino group.
- This compound also has a 2-nitrobenzaldehyde (hereinafter sometimes referred to as “NBA”) moiety or an acetal protected 2-nitrobenzaldehyde (hereinafter sometimes referred to as “ANBA”) moiety.
- NBA 2-nitrobenzaldehyde
- ANBA acetal protected 2-nitrobenzaldehyde
- Examples of the polymerizable monomer include a compound represented by the following chemical formula (6) or a compound represented by the following chemical formula (7). It is preferable in terms of yield and the like to produce a polymer compound containing NBA or ANBA of this embodiment using a compound having an acetalized aldehyde group like these compounds.
- the polymer compound of this embodiment can also be produced by reacting a reactive polymer having acid chloride or alkyl chloride with a compound containing an NBA or ANBA moiety and an aromatic ring having a hydroxyl group or an amino group.
- a reactive polymer having acid chloride or alkyl chloride with a compound containing an NBA or ANBA moiety and an aromatic ring having a hydroxyl group or an amino group.
- a commercially available product can be used as it is.
- a compound having an amino group and NBA is obtained by introducing a nitro group into the ortho position of a methyl group by nitration of commercially available p-toluidine and then converting the methyl group to an aldehyde group by oxidation.
- a compound having an amino group and NBA can also be obtained by reducing the carboxyl group in a state where the amino group of commercially available 5-amino-2-nitrobenzoic acid is acetylated and protected.
- FIG. 1 schematically shows a structural change of the polymer compound of the present embodiment.
- the first carbon atom to which the nitro group is bonded is adjacent to the second carbon atom to which the aldehyde group or the functional group represented by the chemical formula (1) is bonded in the same benzene ring.
- NBA has a high proton dissociation ability, as shown in FIG. 1, and 2-nitrosobenzoic acid.
- the ANBA changes to the phenyl ester structure of ethylene glycol.
- polymer compounds obtained from acrylamide monomers such as N-isopropylacrylamide, N-tert-butylacrylamide, or N, N-dimethylacrylamide, or polymer compounds obtained by (co) polymerizing vinyl ether monomers
- the polymer compound having an appropriate hydration property changes from a water-insoluble state to a soluble state upon irradiation with light.
- FIG. 2 schematically shows photoresponsive crosslinking of the polymer compound of this embodiment.
- a solid phase such as in air or in a poor solvent, as shown in FIG. 2, equilibrium dimerization of nitroso groups generated from at least some NBA groups or ANBA groups, etc.
- the solvent solubility decreases.
- the composite material according to the embodiment of the present invention includes a base material and a layer containing the polymer compound of the present embodiment provided on the surface of the base material.
- the composite material of this embodiment can change the physical properties of the surface by light irradiation. More specifically, the solubility of the polymer compound existing on the surface of the composite material in a solvent such as water or the crosslinking reaction of the polymer compound can be induced by light irradiation. Since the layer containing the polymer compound of the present embodiment can be irradiated with light from the base material side of the composite material, the base material is preferably made of a material that transmits light. Examples of the substrate include plastic substrates or films such as polystyrene, polymethylpentene, polycarbonate, and cycloolefin polymer, glass, quartz, silicone resin, and cellulosic membrane materials such as dialysis membranes.
- a composite layer in which the polymer compound of the present embodiment and a polymer compound that does not respond to light are mixed can be used as a layer containing the polymer compound of the composite material of the present embodiment.
- the supported layered material is accelerated and peeled in accordance with the change in physical properties of the polymer compound region of this embodiment irradiated with light. Can be controlled.
- the composite material of this embodiment can change the cell adhesiveness of the surface by light irradiation.
- cell adhesion can be controlled by irradiating light to all or part of the surface of the composite material, and the cultured cells are selectively detached.
- cell sorting operations such as capturing can be performed.
- the polymer compound of this embodiment is strongly expected to be a useful and powerful means for detailed analysis of individual cell adhesion states in addition to cell sorting operations including purification and selective acquisition.
- a cell manipulation method includes a culturing step of culturing cells on the surface of a layer containing a polymer compound of the composite material of the present embodiment, and a layer containing a polymer compound after the culturing step.
- the light irradiation process which irradiates light to at least one part of the surface, and the removal process which removes the cell which exists in the area
- light can be irradiated from the substrate side.
- the layer containing the polymer compound can be dissolved in water to remove a part of the cultured cells.
- the polymer compound of the present embodiment When the polymer compound of the present embodiment is dried or present in a poor solvent, the polymer compound of the present embodiment in a solid phase state is easily irradiated with a light to easily form a crosslinked structure having solvent resistance. It is formed. For this reason, another material such as a crosslinked polymer can be supported on the surface of the layer containing the polymer compound of the present embodiment by spin coating.
- the photo-crosslinking reaction of the polymer compound of the present embodiment can be limited to a part to leave the photoresponsive group, and the polymer compound of the present embodiment can be irradiated with light in water or other solvent to induce solubility. . Therefore, if a gel that swells in a solvent is supported on the layer containing the polymer compound of the present embodiment, the gel layer is stably fixed on the surface of the layer containing the polymer compound in the dark. However, the gel layer can be quickly swelled and peeled from the layer containing the polymer compound by light irradiation. At that time, the lifting of the gel layer is accompanied by a large movement, so that the gel layer can be used as a one-way optically driven actuator. That is, the light-driven actuator according to the embodiment of the present invention includes a light source and the composite material of the present embodiment.
- ratio means mass ratio
- % means mass%
- a 2% 2,2,2-trifluoroethanol (TFE) solution of polymer 1 was spin-coated on a hydrophilic-treated polystyrene substrate and heated at 85 ° C. for 1 hour to obtain a composite material.
- TFE 2,2,2-trifluoroethanol
- FIG. 4B is an image obtained by observing the composite material from the bottom with an inverted microscope after the light response swelling.
- a 0.05% methanol solution of polyacrylic acid (PAAc) was spin-coated on a polystyrene substrate for tissue culture at 85 ° C.
- PAAc polyacrylic acid
- a solution prepared by dissolving 0.2% of polymer 2 in a mixed solvent of 2,2,2,3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP) and TFE is spin-coated on this substrate and heated at 85 ° C. for 30 minutes. The composite material was obtained.
- HFIP 2,2,2,3,3,3-hexafluoroisopropanol
- a 0.1% methanol solution of PAAc was spin-coated on a polystyrene substrate for tissue culture and heated at 85 ° C. for 2 hours.
- a PAAc-modified polystyrene substrate was prepared.
- a solution obtained by dissolving 0.41% of Polymer 3 in a mixed solvent of 77% HFIP and 23% TFE was spin-coated on this substrate, and heated at 85 ° C. for 2 hours to obtain a composite material. In a state where this composite material is immersed in PBS of pH 7.4, as shown in FIG.
- light having a wavelength of 365 nm and an intensity of 120 mW / cm 2 is applied to the polymer 3 in the form of dots of a predetermined pattern from the polystyrene substrate side. Irradiated for 2 minutes. Thereafter, when the surface of the composite material was pipetted, the polymer 3 was peeled from the region irradiated with light.
- a methanol solution containing 2% of hydroxypropylcellulose (HPC), 0.015% of tetramethoxymethyl glycoluril (TMMGU), and 3 mmol / kg of H 2 SO 4 was spin-coated on the composite layer of this composite, and 2 A crosslinked HPC layer was formed by heating for a period of time.
- HPC hydroxypropylcellulose
- TMMGU tetramethoxymethyl glycoluril
- the composite layer was irradiated with light having a wavelength of 365 nm and an intensity of 66 mW / cm 2 in the form of inverted dots in a predetermined pattern for 4 minutes from the polystyrene substrate side of this material on which the crosslinked HPC layer was formed. Then, when this material was immersed in a mixed solution in which ethanol and water were mixed at a ratio of 7: 3, the crosslinked HPC layer was spontaneously peeled off from the composite layer in the dot-shaped region that was not irradiated with light. In contrast, peeling of the crosslinked HPC layer from the composite layer was suppressed in the inverted dot-shaped region irradiated with light.
- a 1% TFE solution of polymer 4 was spin coated on a polystyrene substrate and heated at 85 ° C. for 30 minutes to obtain a composite material.
- FIG. 8A light having a wavelength of 365 nm and an intensity of 66 mW / cm 2 was irradiated to the polymer 4 in the form of dots in a predetermined pattern for 30 seconds from the polystyrene substrate side of the composite material in the air.
- the composite material was immersed in a mixed solution in which ethanol and water were mixed at 7: 3.
- a mixed solution in which ethanol and water were mixed at 7: 3.
- the polymer 4 was dissolved in the mixed solution and removed from the composite material, whereas in the region irradiated with light, dissolution of the polymer 4 in the mixed solution was suppressed by the crosslinking reaction.
- the cross-linked product of polymer 4 remained in the composite material.
- FIG. 9A light having a wavelength of 365 nm and an intensity of 66 mW / cm 2 was irradiated to the polymer 5 in a predetermined pattern of dots for 20 seconds from the polystyrene substrate side of the composite material in the air.
- a 0.05% methanol solution of PAAc was spin-coated on a polystyrene substrate for tissue culture and heated at 85 ° C. for 2 hours.
- a PAAc-modified polystyrene substrate was prepared.
- a 0.5% TFE solution of polymer 6 was spin coated onto this substrate to obtain a composite. In a state where this composite material is immersed in a 5 mN NaOH aqueous solution, as shown in FIG.
- a methanol solution containing 0.2% HPC, 0.0015% TMMGU, and 0.5 mmol / kg H 2 SO 4 was spin-coated on a polystyrene substrate for tissue culture, and heated at 85 ° C. for 2 hours.
- a cell adhesion-inhibiting crosslinked HPC layer was formed to prepare an HPC gel-modified polystyrene substrate.
- a composite material was obtained by spin-coating a solution obtained by dissolving 0.7% of the polymer 7 in a mixed solvent in which TFE and n-butanol were mixed at a ratio of 7: 3 on the crosslinked HPC layer.
- the crosslinked product of polymer 7 remained on the crosslinked HPC layer. Then, NIH / 3T3 cells dispersed in the medium were seeded on the composite material and cultured until the next day. As a result, the cells adhered to the surface of the crosslinked polymer 7 remaining in the region irradiated with light.
- polymer 9 shown in FIG. 12 was prepared.
- a 1% TFE solution of polymer 9 was spin-coated on a polystyrene substrate and heated at 85 ° C. for 2 hours to obtain a composite material.
- FIG. 13A when the polymer 9 is irradiated with light of a wavelength of 365 nm and an intensity of 120 mW / cm 2 in a predetermined pattern from the polystyrene substrate side of the composite material in the medium for 2 seconds, the light is irradiated.
- the polymer 9 in the obtained area was dissolved in the medium.
- a 1% TFE solution of polymer 9 shown in FIG. 12 was spun onto a polystyrene substrate for tissue culture. Coated and heated at 85 ° C. for 15 minutes to obtain a composite.
- FIG. 14 (a) light with a wavelength of 365 nm and an intensity of 66 mW / cm 2 is irradiated onto the polymer 9 in a predetermined pattern of dots for 5 seconds from the polystyrene substrate side of the composite material in the air. Rinse.
- a 1% TFE solution of polymer 9 shown in FIG. 12 was spin coated on a polystyrene substrate at 85 ° C.
- a composite was obtained by heating for 2 hours.
- the entire surface of the polymer 9 layer of this composite material was irradiated with light having a wavelength of 365 nm and an intensity of 28 mW / cm 2 for 10 seconds, rinsed with water, and then dried.
- a methanol solution containing 3.6% HPC, 0.044% TMMGU, and 4.4 mmol / kg H 2 SO 4 was spin-coated on the polymer 9 layer of the composite material and heated at 85 ° C. for 2 hours.
- the polymer 9 was irradiated in a hexagonal shape with a predetermined pattern for 5 seconds from the polystyrene substrate side of the composite material in PBS of pH 7.4, with a wavelength of 365 nm and an intensity of 120 mW / cm 2 . In the region irradiated with light, the polymer 9 immediately peeled and swollen from the polystyrene substrate.
- a 1% TFE solution of polymer 9 shown in FIG. 12 was spin-coated on a polystyrene substrate at 85 ° C. for 2 hours.
- a composite was obtained by heating.
- NIH / 3T3 cells dispersed in the medium were seeded on this composite.
- FIG. 16 (a) When the cells were cultured for half a day, as shown in FIG. 16 (a), cells adhered and spread over the entire surface of the polymer 9 layer.
- the cells that had spread in the region irradiated with the light changed in a round shape. After 1 hour, when the medium was lightly sprayed on the entire surface of the composite material, the cells were detached from the polymer 9 in the region irradiated with light.
- a TFE solution containing 1.5% of the polymer 11 was spin-coated on a polystyrene substrate and heated at 85 ° C. for 2.5 hours to obtain a composite material.
- FIG. 17 (a) when light of a wavelength of 365 nm and an intensity of 120 mW / cm 2 is irradiated onto the polymer 11 in a predetermined pattern from the polystyrene substrate side of the composite material in PBS for 2 seconds, the light is emitted.
- the polymer 11 in the irradiated area was dissolved in PBS.
- a TFE solution containing 1.5% of polymer 11 was spin coated on a polystyrene substrate and 2.5 hours at 85 ° C.
- a composite was obtained by heating.
- NIH / 3T3 cells dispersed in the medium were seeded on this composite.
- FIG. 18 (a) When cultured for half a day, as shown in FIG. 18 (a), cells spread and adhered to the entire surface of the polymer 11 layer.
- the polymer 11 was irradiated with light having a wavelength of 365 nm and an intensity of 66 mW / cm 2 in a local rectangular shape for 10 seconds.
- the medium was lightly sprayed on the entire surface of the composite material, the cells and the polymer 11 were peeled off from the polystyrene substrate in the region irradiated with light.
- Two types of phosphate buffer aqueous solutions (each having a pH of 7.41) containing 0.01% of polymer 12 and polymer 14 were prepared.
- the lower critical solution temperatures (LCST) of the aqueous solution of polymer 12 and the aqueous solution of polymer 14 before ultraviolet light irradiation were 10 ° C. and 20 ° C., respectively.
- LCST is the temperature at which the polymer is water-soluble below that temperature.
- LCST was not observed in the measured temperature range of 60 ° C. or lower in the aqueous solution of polymer 12 and the aqueous solution of polymer 14 after irradiation with ultraviolet light. From this, at pH 7.41, the polymer 12 is at least in the range of 10 ° C. to 60 ° C., and the polymer 14 is in the range of at least 20 ° C. to 60 ° C. It was confirmed that it changed to a molten state.
- a mixed solution of 88% TFE solution containing 0.9% polymer 12 and 12% n-BuOH was applied to a polystyrene substrate.
- the composite was obtained by spin coating and heating at 85 ° C. for 2 hours. This composite material was immersed in water at 37 ° C. for 1 hour, and then NIH / 3T3 cells dispersed in a medium were seeded on the composite material. When the cells were cultured for half a day, as shown in FIG. 20 (a), cells spread and adhered across the entire surface of the polymer 12 layer.
- a part of the cells on the composite material was irradiated with light having a wavelength of 365 nm and an intensity of 120 mW / cm 2 from the polystyrene substrate side for 3 seconds.
- the culture medium was lightly sprayed on the entire surface of the composite material, the cells that had adhered and extended only in the light-irradiated region were detached from the polystyrene substrate and collected in a state of being integrated with the polymer 12.
- 98% of the cells collected from the light-irradiated area survived.
- a part of the cells on the composite material was irradiated with light having a wavelength of 365 nm and an intensity of 120 mW / cm 2 for 3 seconds from the polystyrene substrate side.
- the composite layer was dissolved in the medium, and the cells that had adhered and extended on the dissolved composite layer were detached individually. It has been demonstrated that a single cell unit can be manipulated using the polymer compound of the present invention.
- a mixed solution of 91% solution and 9% n-BuOH was spin coated on a polystyrene substrate and heated at 85 ° C. for 2 hours to obtain a composite material having a composite layer of polymer 12 and pNIPAAm on the surface.
- the surface of this composite material was coated with a film adjusting agent (Corning, Matrigel), and further agglomerates of human iPS cells were seeded.
- the surface of this composite material was coated with a film adjusting agent (Corning, Matrigel), and further agglomerates of human iPS cells were seeded.
- a TFE solution containing 0.56% was spin-coated on a polystyrene substrate and heated at 85 ° C. for 2.5 hours to obtain a composite material having a composite layer of polymer 12 and pNIPAAm on the surface.
- NIH / 3T3 cells were dispersed in the medium and seeded on this composite. When cultured for half a day, as shown in FIG. 24 (a), cells spread and adhered across the entire surface of the composite layer.
- the region of the composite layer in which the pseudopod tips of some cells existed was irradiated with light having a wavelength of 365 nm and an intensity of 120 mW / cm 2 from the polystyrene substrate side for 3 seconds.
- the tip of the false foot was detached only from the surface of the composite layer in the region irradiated with light, and the false foot contracted. It has been demonstrated that specific sites of individual cells can be independently manipulated using the polymer compound of the present invention.
- NBA polymer (compound 15 and compound 16) containing N-tert-butylacrylamide (NTBAAm) was synthesized as follows using compound 14 which is a polymerizable monomer having an NBA group as a moderately hydrophobic monomer component. did. First, an anhydrous tetrahydrofuran solution containing Compound 14: N-isopropylacrylamide: N-tert-butylacrylamide: azoisobutyronitrile in the raw material molar ratio (x: y: z: AIBN) described in Table 1 below was added to nitrogen. The mixture was stirred overnight at 65 ° C. under an air stream. After cooling, the precipitate formed by dropwise addition to ether was reprecipitated using a tetrahydrofuran-ether solution to obtain Compound 15.
- the composition ratio of Compound 15 is a 1 H-NMR (CDCl 3 ) spectrum, a peak derived from aromatics, NH groups, and benzylic hydrogen atoms appearing in the vicinity of 6 to 8 ppm, and appearing in the vicinity of 1 to 4 ppm. It estimated from the integrated value of the other peak.
- the composition ratio of Compound 15 was estimated based on the methine hydrogen peak (4 ppm) of the isopropyl group of N-isopropylacrylamide.
- Example 35 Survival rate of cells recovered by photoresponsive peeling from pNBANIPAAm coat layer pNIPAAm (compound 14 in FIG. 12; hereinafter referred to as ether group) in which the NBA group was modified at an introduction rate of 4 mol% via the ether group.
- PNIPAAm into which an NBA group was introduced was sometimes referred to as “pNBANIPAAm”).
- the coat layer was seeded with NIH / 3T3 cells and cultured at 37 ° C. for 2 days. Then, from the bottom surface side of the substrate, light having a central wavelength of 365 nm and an intensity of 40 mW / cm 2 was irradiated for 10 seconds, and the cells were collected by lightly spraying the medium on the surface.
- NIH / 3T3 cells After dispersing to single cells with a phosphate buffer solution of pH 7.4 containing 1 mM EDTA, the cells were stained with trypan blue. The number of stained and non-stained cells was counted, and the survival rate of NIH / 3T3 cells was estimated to be 96% (left of the graph in FIG. 25).
- the survival rate of NIH / 3T3 cells recovered after a 0.05 w / v% trypsin-0.53 mM EDTA solution was allowed to act on a normal culture dish at 37 ° C. for 2 minutes was estimated by the same method. % (Right of the graph in FIG. 25). It was found that the viability of cells detached by photoresponsive lysis of pNBANIPAAm was not significantly different from the viability of cells recovered by general enzymatic detachment.
- Example 36 Photoresponsive pH change of NBA copolymer aqueous solution
- a trace amount of BTB was added to a 0.01% aqueous solution of pNBANIPAAm having an NBA group introduction rate of 10 mol% in a four-plane transmission optical cell (cuvette) having an optical path length of 1 cm.
- About 1% of 0.01N NaOH aqueous solution was further added to prepare a weakly basic blue aqueous solution as shown in FIG.
- the lower half of the aqueous solution in the cuvette was irradiated with ultraviolet light having a center wavelength of 365 nm. As shown in FIG.26 (b), it changed to yellow rapidly in the area
- Example 37 pH Dependence of Photoresponsive Dehydration Characteristics
- the aqueous solution was cooled again to 0 ° C., and the aqueous solution was irradiated with ultraviolet light having a central wavelength of 365 nm until the spectral change was saturated. Then, the turbidity of the aqueous solution at each temperature was measured while gradually increasing the temperature of the aqueous solution again. The result is shown in FIG.
- the transition temperature (11 to 15 ° C.) of the aqueous solution before ultraviolet light irradiation was considerably lower than the transition temperature 31 ° C. of the aqueous pNIPAAm homopolymer solution.
- the higher the transition temperature the higher the solubility of the polymer. From this result, it was found that the solubility of pNIPAAm was reduced by the introduction of NBA.
- the transition temperature of the aqueous solution having a pH of 7.4 was not observed at 60 ° C. or lower.
- Example 38 Dependence of photoresponsive dehydration characteristics on NBA introduction rate
- 0.01% of four types of pNBANIPAAm having NBA group introduction rates of 0 mol%, 4 mol%, 7 mol%, and 10 mol% were used.
- the turbidity at 700 nm of the pH 7.4 phosphate buffer solution contained was measured from 0 ° C to 60 ° C. The result is shown in FIG.
- FIG. 28 As shown in FIG. 28, as the NBA group introduction rate increased, the transition temperature of the aqueous solution before ultraviolet light irradiation decreased. That is, as the NBA group introduction rate increased, the solubility of the polymer decreased.
- the transition temperature after ultraviolet light irradiation markedly increased with an increase in the NBA group introduction rate.
- Example 39 NTBAAm introduction rate dependency of photoresponsive dehydration characteristics
- pNIPAAm containing 0.01% phosphate buffer solution (pH 7) containing pBANIIPAAm with an NBA group introduction rate of 10 mol%. 4 pNIPAAm containing 0.01% phosphate buffer solution (pH 7) containing pBANIIPAAm with an NBA group introduction rate of 10 mol%. 4
- the turbidity at 700 nm of a 0.01% phosphate buffer solution (pH 7.4) of pNIPAAm containing 20 mol% of NTBAAm was measured from 0 ° C to 60 ° C. The result is shown in FIG. As shown in FIG.
- the transition temperature before the ultraviolet light irradiation of the pNIPAAm aqueous solution containing NTBAAm was lower than the transition temperature before the ultraviolet light irradiation of the pNIPAAm aqueous solution not containing NTBAAm. That is, the introduction of NTBAAm increased the dark stability of the pNIPAAm polymer. On the other hand, the transition temperature after irradiation with ultraviolet light significantly increased regardless of the presence or absence of NTBAAm.
- Example 40 Photoresponsive dissolution of pNBANIPAAm coated film A layer coated with pNBANIPAAm having an NBA group introduction rate of 10 mol% in pH 4.0, pH 5.0, and pH 7.4 (at 25 ° C.). Then, ultraviolet light was irradiated along a pattern of a fine polka dot pattern with a diameter of 100 ⁇ m, and the photoresponsive dissolution characteristics were observed. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 30A, at pH 4.0, the polymer film was not dissolved even when a sufficient amount of ultraviolet light was irradiated. As shown in FIGS. 30 (b) and 30 (c), at pH 5.0 and pH 7.4, the polymer film rapidly dissolved in response to ultraviolet light irradiation.
- the pNBANIPAAm coat film was kept insoluble for 1 month in a state immersed in a buffer solution at 37 ° C. and pH 7.4. Thereafter, it was observed that when this pNBANIPAAm coat film was irradiated with light, it was dissolved sharply.
- Example 41 Light release control of polyethylene fine particles fixed to pNBANIPAAm A dispersion obtained by dispersing a small amount of polyethylene fine particles in a TFE solution of pNBANIPAAm having an NBA group introduction rate of 10 mol% was cast on a polystyrene substrate. A sample in which polyethylene fine particles were fixed to the surface of the polystyrene substrate via pNBANIPAAm was obtained. While observing with a microscope, light having a wavelength of 365 nm was irradiated from the bottom surface of the substrate to a region where a predetermined fine particle aggregate was present in a phosphate buffer solution having a pH of 7.4.
- Example 42 Photorelease control of fluorescently labeled bovine serum albumin immobilized on pNBANIPAAm pNBANIPAAm having an NBA group introduction rate of 7 mol% was coated on a polystyrene substrate.
- RBSA bovine serum albumin
- FIG. 32A schematically shows how RBSA is optically released.
- FIG. 32B shows fluorescence distribution images before (left) and after (right) light irradiation. As shown in FIG. 32 (b), the fluorescence disappeared only from the light irradiation region. That is, RBSA fixed on the substrate surface was selectively released from the substrate surface by local light irradiation.
- Example 43 Patterning and photoselective peeling of cultured cells using NBA copolymer-coated membrane on cell adhesion-inhibiting surface 0.20% of pNIPAAm containing 5 mol% methacrylic acid, and polyethylene glycol having glycidyl groups at both ends
- pNIPAAm containing 5 mol% methacrylic acid
- polyethylene glycol having glycidyl groups at both ends
- a basic methanol solution containing 0.039% was spin-coated on the polystyrene substrate surface.
- the cell adhesion inhibition surface was produced by heating at 80 degreeC for 2 hours.
- a TFE solution containing 1.3% NIPAAm containing 10 mol% NBA groups and 20 mol% NTBAAm and 0.23% unmodified pNIPAAm was spin-coated on the cell adhesion-inhibiting surface and heated at 85 ° C. for 1.5 hours. did.
- a phosphate buffer aqueous solution of pH 7.4 is placed, and light having a wavelength of 365 nm and an intensity of 30 mW / cm 2 is irradiated for 6 seconds along the inverted pattern of the dot pattern to dissolve the blend polymer in the light irradiation region.
- a blended polymer layer was obtained.
- a dispersion in which MDCK cells were dispersed in a medium was seeded on this blend polymer layer and cultured for half a day. The result is shown in FIG.
- FIG. 33 (a) it was confirmed that cells were adhered and extended only on the blend polymer layer having a dot pattern. Then, as shown in FIG. 33 (b), light having a wavelength of 365 nm and an intensity of 30 mW / cm 2 was irradiated for 40 seconds to a specific approximately half of the dot regions (in the form of stripes in the horizontal direction). Then, when the culture medium was lightly sprayed on the surface, as shown in FIG. 33 (c), the cells were selectively detached only from the striped dot regions irradiated with light. From these results, it was demonstrated that cell patterning and selective detachment / recovery of cells can be performed by optical manipulation.
- Example 44 Formation of String Cell Tissue Using NBA Copolymer Attempts have been made to evaluate hepatic metabolism such as drugs and hepatotoxicity using a culture system of hepatocytes and cell lines derived therefrom.
- a general culture method has a problem that liver-specific functions are hardly expressed.
- culture as a tissue body in which cells are aggregated has been studied as a technique for improving functional decline.
- the difficulty of supplying oxygen and nutrients into the cell agglomeration is a problem. Therefore, an attempt was made to construct a string-like tissue structure fixed on the culture substrate by applying the optical characteristics of the NBA-modified polymer as a structure in which the culture medium flows through the gap between the tissue body and the substrate. The formation process of this structure is schematically shown in FIG.
- an acidic methanol solution containing 0.30% of hydroxypropyl cellulose and 0.042% of polyethylene glycol having a carboxyl group at both ends was spin-coated on the surface of a polystyrene substrate. And this was heated at 85 degreeC for 3 hours, and the cell adhesion inhibition surface was produced. Thereafter, a 1.6% TFE solution of pNIPAAm containing 15 mol% NBA groups and 20 mol% NTBAAm was spin-coated on the cell adhesion-inhibiting surface. This was heated at 85 ° C. for 1 hour and then coated with fibronectin.
- the fibronectin coat was irradiated with light in a striped pattern to dissolve and remove the photoresponsive polymer layer from the light irradiation region.
- HepG2 cells which are cell lines derived from human hepatocytes, were seeded there and adhered in a pattern on the photoresponsive polymer layer remaining in a stripe shape. After culturing for 2 days, it was confirmed that a string-like tissue body that was detached from the surface of the base material was separated from the base material surface while leaving a part of the photoresponsive polymer layer to which the HepG2 cells were adhered by local light irradiation. This image is shown in FIG.
- Example 45 Photoresponsive ionomycin supply from culture equipment using NBA copolymer
- calcium ions are included in the medium at a concentration on the order of mM.
- calcium ions due to the action of the calcium ion pump present in the cell membrane, calcium ions are kept at a very low concentration of nM order in the cells of the cell culture system.
- ionomycin is added to cells in a cell culture system, ionomycin is taken into the cell membrane and induces calcium permeation through the cell membrane.
- cell membrane calcium penetration is significant, cell death is caused. This mechanism is schematically shown in FIG.
- a base material capable of stably immobilizing ionomycin and supplying it to an arbitrary position at an arbitrary timing was prepared.
- a TFE solution containing pNIPAAm containing 10 mol% NBA groups and 50 mol% NTBAAm and ionomycin was spin-coated on the polystyrene substrate surface.
- NIH / 3T3 cells were seeded and cultured for half a day. Thereafter, when ultraviolet light having a wavelength of 365 nm was locally irradiated in a normal medium, cell death was caused only in the irradiated region.
- the mechanism of ionomycin fixation and light release is schematically shown in FIG. Moreover, the image which shows this local cell death is shown in FIG.37 (b).
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Abstract
光照射によって水に不溶な状態から可溶な状態に変化する高分子化合物を提供する。この高分子化合物は、下記の化学式(5)で表される。ただし、AおよびBは単結合または官能基であり、R3、R4、およびR9は水素またはアルキル基であり、R6およびR7は水素またはアルキル基等である。
Description
本発明は、光照射によって物性が変化する高分子化合物と、この高分子化合物を用いた細胞操作方法に関するものである。
外部からの刺激によって物性が変化する材料の応用が、バイオや医療などの分野で盛んに検討されている。細胞やタンパク質などを扱うバイオデバイスの部材として、水系で物性が大きく変化する材料が求められている。ヒトiPS由来細胞の活用が本格的に検討され、培養細胞を個別操作するニーズが急速に高まる昨今、μmスケールの局所作用が可能である光で物性を制御できる材料の有用性は計り知れない。
これまでに、光によって水和性が増加する高分子材料が報告されている。しかしながら、これらの高分子材料は、細胞培養に適さない温度やpHで物性が変化するか、物性変化が不十分であった。また、光酸発生基を有し、大きな光物性変化を示す高分子材料の報告もある。しかし、この高分子材料は、水への不溶と可溶を光で制御するまでに至っていない。さらに、この高分子材料は、光開裂反応による低分子成分の遊離や、強い酸発生を伴うなど、細胞系への適用を制限する問題もあった。一方、光によって架橋する材料がフォトリソグラフィなどに活用されている。しかし、この材料の多くは高温加熱処理を要する。
T.Nishi, F.Tabusa, T.Tanaka, T.Shimizu, K.Nakagawa,Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1985,vol.33,No.3,p.1140-1147
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、高温処理が不要で、低分子成分をほとんど遊離させることなく、光照射によって水に不溶な状態から可溶な状態に変化する高分子化合物を提供することを目的とする。
本発明の高分子化合物は、主鎖と側鎖とを有し、側鎖が芳香環を備え、芳香環が、結合していた水素原子がニトロ基で置換された第一炭素原子と、結合していた水素原子がアルデヒド基または下記の化学式(1)で表される官能基で置換された第二炭素原子とを備え、第一炭素原子と第二炭素原子が、同じベンゼン環内で隣り合っている。
本発明の高分子化合物は、下記の化学式(2)で表される。
ただし、Aは、単結合または官能基であり、R1は、アルデヒド基または上記の化学式(1)で表される官能基であり、R1とNO2は、隣り合った炭素原子にそれぞれ結合しており、R2は、水素、アルキル基、下記の化学式(3)で表される官能基、および下記の化学式(4)で表される官能基の中から選ばれる少なくとも一種であり(R6およびR7は水素、アルキル基、または芳香環であり、R8はアルキル基である)、
R3およびR4は、水素またはアルキル基であり、Gは、ベンゼン環の水素と置換されてもよい3個以下のアルキル基であり、wおよびzは、モル百分率を示し、0<w≦100、0≦z<100である。
本発明の高分子化合物は、下記の化学式(5)で表される。
ただし、AおよびBは、単結合または官能基であり、R3、R4、およびR9は、水素またはアルキル基であり、R6およびR7は、水素、アルキル基、または芳香環であり、x、y、およびzは、モル百分率を示し、0≦x<100、0≦y<100、0≦z<100(ただしx=y=0を除く)である。
本発明の複合材は、基材と、基材の表面に設けられた本発明の高分子化合物を含有する層とを有する。
本発明の光駆動アクチュエータは、光源と、本発明の複合材とを有する。
本発明の細胞操作方法は、本発明の複合材の高分子化合物を含有する層の表面で細胞を培養する培養工程と、培養工程の後、高分子化合物層の表面の少なくとも一部に光を照射する光照射工程と、光照射工程で光を照射した領域に存在する細胞を除去する除去工程とを有する。
本発明によれば、光照射によって水に不溶な状態から可溶な状態になるなどの物性が変化する高分子化合物が得られる。
以下、本発明の高分子化合物、複合材、光駆動アクチュエータ、および細胞操作方法について、実施形態と実施例に基づいて説明する。重複説明は適宜省略する。なお、2つの数値の間に「~」を記載して数値範囲を表す場合、この2つの数値も数値範囲に含まれる。
本発明の実施形態に係る高分子化合物は、主鎖と側鎖とを有し、側鎖が芳香環を備えている。芳香環は、結合していた水素原子がニトロ基で置換された第一炭素原子と、結合していた水素原子がアルデヒド基または下記の化学式(1)で表される官能基で置換された第二炭素原子とを備えている。第一炭素原子と第二炭素原子は、同じベンゼン環内で隣り合っている。
本実施形態の高分子化合物は、光照射によって溶媒溶解性、例えば水溶解性が大きく変化する。このため、操作対象物、例えば細胞を本実施形態の高分子化合物を含有する層の表面に固定したり、操作対象物をこの層の表面から除去したりする操作が、マイクロメータースケールからマクロなスケールまで、光照射によって自在に行える。ヒトiPS細胞の活用が活発に検討される昨今、培養基材上での有用細胞の選抜や不要細胞の除去などの新規な細胞操作のニーズが急速に高まっている。特に、中性付近での水に対する溶解性を光照射によって制御できる本実施形態の高分子化合物は、このようなニーズに応える材料として極めて有用である。
本実施形態の高分子化合物は、光照射によって溶媒可溶性が発現する。このため、この高分子化合物を含有する層を介して基材に固定された操作対象物を、光とその溶媒を用いて容易に除去できる。また、本実施形態の高分子化合物を用いれば、低分子化合物とは異なり、多くの接着剤と同様に、強い凝集力によって操作対象物を強く接着することが期待できる。光照射によって水に不溶な状態から可溶な状態に変化する本実施形態の高分子化合物は、水を用いる操作ができるため、有機溶媒を用いる操作と比べて環境負荷が小さい。また、光照射によって水系で物性が変化する材料は、細胞培養をはじめとするバイオ系の制御に用いることができる。このため、基材からの細胞剥離を光で作動したり、光で細胞をパターニングしたりするなどの細胞操作が容易となる。
本実施形態の高分子化合物として、下記の化学式(2)で表されるランダム共重合体の高分子化合物が挙げられる。
ただし、Aは、単結合または官能基であり、R1は、アルデヒド基または上記の化学式(1)で表される官能基であり、R1とNO2は、隣り合った炭素原子にそれぞれ結合しており、R2は、水素、アルキル基、下記の化学式(3)で表される官能基、および下記の化学式(4)で表される官能基の中から選ばれる少なくとも一種であり(R6およびR7は水素、アルキル基、または芳香環であり、R8はアルキル基である)、
R3およびR4は、水素またはアルキル基であり、Gは、ベンゼン環の水素と置換されてもよい3個以下のアルキル基であり、wおよびzは、モル百分率を示し、0<w≦100、0≦z<100である。なお、この高分子化合物への光照射による溶媒溶解性の変化が失われないのであれば、この高分子化合物は他の成分を含んでいてもよい。
より具体例な本実施形態の高分子化合物として、下記の化学式(5)で表されるランダム共重合体の高分子化合物が挙げられる。
ただし、AおよびBは、単結合または官能基であり、R3、R4、およびR9は、水素またはアルキル基であり、R6およびR7は、水素、アルキル基、または芳香環であり、x、y、およびzは、モル百分率を示し、0≦x<100、0≦y<100、0≦z<100(ただしx=y=0を除く)である。なお、この高分子化合物への光照射による溶媒溶解性の変化が失われないのであれば、この高分子化合物は他の成分を含んでいてもよい。
主鎖とベンゼン環とをつないでいるAおよびBの構造には特に制限がない。AおよびBとしては、単結合、またはエステル結合、エーテル結合、アミド結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、ウレタン結合、もしくはアルキレン基を備える官能基が挙げられる。すなわち、主鎖とベンゼン環が、単結合で直接結合されていてもよいし、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、ウレタン結合、またはアルキレン基を介して結合されていてもよいし、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、ウレタン結合、またはアルキレン基を備える他の官能基を介して結合されていてもよい。
本実施形態の高分子化合物は、以下の方法で製造できる。まず、メタクリロイルクロリド等の重合性の酸クロリドまたはアルキルクロリドと、水酸基またはアミノ基を有する芳香環を含む化合物を反応させて重合性モノマーを合成する。この化合物は、2-ニトロベンズアルデヒド(以下「NBA」と記載することがある)部位またはアセタール保護された2-ニトロベンズアルデヒド(以下「ANBA」と記載することがある)部位も備えている。つぎに、この重合性モノマーを重合または共重合させて、本実施形態の高分子化合物が得られる。
この重合性モノマーとして、下記の化学式(6)で表される化合物または下記の化学式(7)で表される化合物が挙げられる。これらの化合物のように、アセタール化されたアルデヒド基を有する化合物を用いて、本実施形態のNBAまたはANBAを含む高分子化合物を製造することが、収率などの点で好ましい。
また、酸クロリドまたはアルキルクロリドを有する反応性高分子と、NBA部位またはANBA部位と、水酸基またはアミノ基とを有する芳香環を含む化合物を反応させても、本実施形態の高分子化合物が製造できる。水酸基とNBAを有する化合物は、市販品がそのまま利用できる。アミノ基とNBAを有する化合物は、市販のp-トルイジンのニトロ化によりメチル基のオルト位にニトロ基を導入した後、酸化によりメチル基をアルデヒド基に変換して得られる。アミノ基とNBAを有する化合物は、市販の5-アミノ-2-ニトロ安息香酸のアミノ基をアセチル化保護した状態で、カルボキシル基を還元して得ることもできる。
図1は、本実施形態の高分子化合物の構造変化を模式的に示している。ニトロ基が結合している第一炭素原子と、アルデヒド基または上記の化学式(1)で表される官能基が結合している第二炭素原子が、同じベンゼン環内で隣り合っている。このため、水や他の溶媒中で、本実施形態の高分子化合物に波長300nm以上410nm以下の光を照射すると、図1に示すように、NBAは高いプロトン解離能を有する2-ニトロソ安息香酸に変化し、ANBAはエチレングリコールのフェニルエステル構造に変化する。
そして、pHが4を超えると、2-ニトロソ安息香酸からプロトンが解離して負電荷を帯びる。こうして、N-イソプロピルアクリルアミド、N-tert-ブチルアクリルアミド、もしくはN,N-ジメチルアクリルアミドなどのアクリルアミド系モノマーから得られる高分子化合物、またはビニルエーテル系モノマーを(共)重合して得られる高分子化合物などの適度な水和性を有する高分子化合物は、光の照射によって水に不溶な状態から可溶な状態に変化する。
図2は、本実施形態の高分子化合物の光応答架橋を模式的に示している。空気中または貧溶媒中など、固相状態の本実施形態の高分子化合物に光照射した場合、図2に示すように、少なくとも一部のNBA基またはANBA基から生じるニトロソ基の平衡二量化などによって、高分子間の架橋がもたらされる。このため、固相状態の本実施形態の高分子化合物に光を照射すると溶媒溶解性が低下する。
本発明の実施形態に係る複合材は、基材と、基材の表面に設けられた本実施形態の高分子化合物を含有する層を備えている。本実施形態の複合材は、光の照射によって表面の物性を変化させることができる。より具体的には、複合材の表面に存在する高分子化合物の水などの溶媒への溶解性、または高分子化合物の架橋反応を、光照射によって誘起することができる。複合材の基材側から本実施形態の高分子化合物を含有する層に光を照射できるので、基材は光を透過する材料から構成されていることが好ましい。基材としては、ポリスチレン、ポリメチルペンテン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー等のプラスチック基板もしくはフィルム、ガラス、石英、シリコーン樹脂、または透析膜などのセルロース系膜材料が挙げられる。
また、本実施形態の高分子化合物と光に応答しない高分子化合物を混合した複合層を、本実施形態の複合材の高分子化合物を含有する層として用いることもできる。この複合層の上にゲルなどからなる層状物をさらに担持した材料では、光を照射する本実施形態の高分子化合物の領域の物性変化に応じて、担持された層状物の剥離の促進と剥離の抑制が制御できる。本実施形態の複合材は、表面の細胞接着性を光の照射によって変化させることが可能である。
したがって、本実施形態の複合材を細胞の培養基材として用いれば、複合材の表面の全部または一部の領域に光を照射することによって細胞接着性が制御でき、培養細胞を選択的に剥離あるいは捕捉するなどの細胞分別操作が可能となる。特に、本実施形態の複合材によれば、接着細胞やコロニーの個別剥離はもちろん、細胞内の特定部位(例えば偽足)のみを剥離することが可能である。このため、本実施形態の高分子化合物は、純化や選択取得を含む細胞の選別操作に加え、個々の細胞接着状態の詳細な解析のための有用かつ強力な実現手段となることが強く期待される。
本発明の実施形態に係る細胞操作方法は、本実施形態の複合材の高分子化合物を含有する層の表面で細胞を培養する培養工程と、培養工程の後、高分子化合物を含有する層の表面の少なくとも一部に光を照射する光照射工程と、光照射工程で光を照射した領域に存在する細胞を除去する除去工程とを備えている。光照射工程では、基材側から光を照射することができる。除去工程では、高分子化合物を含有する層を水に溶かして、培養した細胞の一部を除去することができる。
本実施形態の高分子化合物が乾燥しているときや貧溶媒中に存在するときなど、固相状態の本実施形態の高分子化合物に光照射することによって、溶媒耐性を有する架橋構造が容易に形成される。このため、本実施形態の高分子化合物を含有する層の表面に、架橋ポリマーなどの別の材料をスピンコートで担持させることができる。
本実施形態の高分子化合物の光架橋反応を一部にとどめて光応答基を残存させ、水や他の溶媒中で本実施形態の高分子化合物に光照射して可溶性を誘起させることもできる。このため、本実施形態の高分子化合物を含有する層の上に溶媒中で膨潤するゲルを担持させれば、暗所では高分子化合物を含有する層の表面にゲル層が安定して固定されるが、光照射によって速やかに、高分子化合物を含有する層からゲル層を膨潤剥離させることができる。その際のゲル層の浮き上がりは大きな動きを伴うため、一方向の光駆動アクチュエータとして用いることができる。すなわち、本発明の実施形態に係る光駆動アクチュエータは、光源と、本実施形態の複合材を備えている。
以下の実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。また、特記しない限り、比は質量比を、%は質量%をそれぞれ意味する。
5-ヒドロキシ-2-ニトロベンズアルデヒド(1当量)、エチレングリコール(1.5当量)、およびp-トルエンスルホン酸・一水和物(触媒量)のベンゼン懸濁液を、ディーン・スターク装置を用いて数時間加熱還流した。冷後、減圧下で溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラム(メルク7734、酢酸エチル:ヘキサン=1:4~3:7(容量比))にて分離精製した。化合物1を80~95%の収率で得た。なお、非特許文献1記載の方法によっても化合物1が合成できる。
メタクリロイルクロリド(1当量)、化合物1(1.1当量)、およびトリエチルアミン(1.2当量)のジクロロメタン溶液を、室温で数時間から一昼夜撹拌した後、反応液を希塩酸にて処理した。その後、ジクロロメタンで抽出し、濃縮した残渣をシリカゲルカラム(メルク7734、酢酸エチル:ヘキサン=3:7(容量比))にて精製した。化合物2(上記の化学式(6)で表される化合物)を90%以上の収率で得た。
1H-NMR (CDCl3): 8.02 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.57 (1H, d, J = 2.6 Hz), 7.29 (1H, dd, J = 8.8, 2.6 Hz), 6.54 (1H, s), 6.39 (1H, m), 5.84 (1H, m), 4.04 (4H, m), 2.07 (3H, dd, J = 1.5, 1.0 Hz)
1H-NMR (CDCl3): 8.02 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.57 (1H, d, J = 2.6 Hz), 7.29 (1H, dd, J = 8.8, 2.6 Hz), 6.54 (1H, s), 6.39 (1H, m), 5.84 (1H, m), 4.04 (4H, m), 2.07 (3H, dd, J = 1.5, 1.0 Hz)
化合物2、メタクリル酸メチル、およびアゾイソブチロニトリルの無水テトラヒドロフラン溶液を、窒素気流下、65℃で一昼夜撹拌した。冷後、エーテルに滴下して生じた析出物を濾取した。テトラヒドロフラン-エーテル溶液を用いて再沈殿させ化合物3を得た。具体的には、化合物2:メタクリル酸メチル:アゾイソブチロニトリルが、約50:50:1~2(モル比)になるように秤量した後、重合反応および精製により化合物3を60~70%の収率で得た。1H-NMRスペクトルから、化合物3の組成比y:zを49:51と概算した。
1H-NMR (d-acetone): 8.04 (1H, bs), 7.58 (1H, bs), 7.45 (1H, bs), 6.42 (1H, bs), 3.97 (4H, m, OCH2OCH2O), 3.65 (3H, m), 2.67-1.71 (4H, m), 1.71-0.77 (6H, m)
1H-NMR (d-acetone): 8.04 (1H, bs), 7.58 (1H, bs), 7.45 (1H, bs), 6.42 (1H, bs), 3.97 (4H, m, OCH2OCH2O), 3.65 (3H, m), 2.67-1.71 (4H, m), 1.71-0.77 (6H, m)
化合物3のクロロホルム溶液に希塩酸または濃塩酸を加え、40~70℃で数時間から数日間撹拌した。濃縮後、エーテルに滴下して生じた析出物を濾取した。テトラヒドロフラン-エーテル溶液を用いて再沈殿させ化合物4を得た。1H-NMR(CDCl3)スペクトルで、アルデヒド基を保護していたアセタールに由来する3.97ppmおよび6.42ppmのピークが消失したこと、ならびにアルデヒド基に由来する10.36ppmのピークが出現したことから、化合物4の生成を確認した。また、本実施例における化合物4の組成比x:y:zは、ニトロベンズアルデヒド基の芳香環に由来する7~8ppmおよび10ppm付近のピークの積分値と、メトキシ基に由来する3.6ppm付近のピークの積分値から、x:y:z=49:0:51と概算した。
化合物2、N,N-ジメチルアクリルアミド、およびアゾイソブチロニトリルの無水テトラヒドロフラン溶液を、窒素気流下、65℃で一昼夜撹拌した。冷後、エーテルに滴下して生じた析出物を濾取した。テトラヒドロフラン-エーテル溶液を用いて再沈殿させ化合物5を得た。具体的には、化合物2:N,N-ジメチルアクリルアミド:アゾイソブチロニトリルが、約10:90:1(モル比)になるように秤量した後、重合反応および精製により化合物5を51%の収率で得た。1H-NMRスペクトルから、化合物5の組成比y:zを14:86と概算した。
1H-NMR (CDCl3): 7.97 (1H, bs), 7.47 (1H, bs), 7.23 (1H, bs), 6.39 (1H, bs), 4.02 (4H, bs, OCH2CH2O), 3.25-0.86 (60H, m)
1H-NMR (CDCl3): 7.97 (1H, bs), 7.47 (1H, bs), 7.23 (1H, bs), 6.39 (1H, bs), 4.02 (4H, bs, OCH2CH2O), 3.25-0.86 (60H, m)
化合物5のクロロホルムまたはテトラヒドロフラン溶液に濃塩酸を加え、60℃で数時間~数日間撹拌した。エーテル希釈により生じた析出物を、テトラヒドロフラン-エーテルを用いて再沈殿させ化合物6を得た。1H-NMR(CDCl3)スペクトルで、アルデヒド基を保護していたアセタールに由来する4ppm付近のピークと、アルデヒド基に由来する10ppm付近のピークの積分値より、化合物6の組成比x:y:zを32:11:57と算出した。
氷冷した3-クロロプロピルアミンの塩酸塩(1.5当量)およびトリエチルアミン(3当量)の無水ジクロロメタン溶液に、メタクリロイルクロリド(1当量)の無水ジクロロメタン溶液を窒素気流下で滴下し、室温にて一昼夜撹拌した。希塩酸処理後、ジクロロメタン抽出を行い、濃縮により得た残渣をシリカゲルカラム(メルク7734、酢酸エチル:ヘキサン=3:2(容量比))にて精製した。化合物7を50~60%の収率で得た。
1H-NMR (CDCl3): 6.08 (1H, bs), 5.69 (1H, bs), 5.34 (1H, bs), 3.61 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.46 (2H, dt, J = 6.0, 6.6 Hz), 2.05 (2H, tt, J = 6.6, 6.3 Hz), 1.97 (3H, bs)
1H-NMR (CDCl3): 6.08 (1H, bs), 5.69 (1H, bs), 5.34 (1H, bs), 3.61 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.46 (2H, dt, J = 6.0, 6.6 Hz), 2.05 (2H, tt, J = 6.6, 6.3 Hz), 1.97 (3H, bs)
化合物7(1.1当量)、化合物1(1当量)、および無水炭酸カリウム(1.2当量)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液を、120℃で数時間撹拌した後、氷水で処理した。エーテル抽出後、濃縮により得た残渣をシリカゲルカラム(メルク7734、酢酸エチル:ヘキサン=9:1(容量比))にて精製した。化合物8(上記の化学式(7)で表される化合物)を50~60%の収率で得た。
1H-NMR (CDCl3): 8.03 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.29 (1H, d, J = 2.8 Hz), 6.91 (1H, dd, J = 9.0, 2.8 Hz), 6.55 (1H, s), 6.12 (1H, bs), 5.70 (1H, bs), 5.35 (1H, m), 4.15 (2H, t, J = 5.9 Hz), 4.05 (4H, m), 3.54 (2H, m), 2.10 (2H, m), 1.98 (3H, bs)
1H-NMR (CDCl3): 8.03 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.29 (1H, d, J = 2.8 Hz), 6.91 (1H, dd, J = 9.0, 2.8 Hz), 6.55 (1H, s), 6.12 (1H, bs), 5.70 (1H, bs), 5.35 (1H, m), 4.15 (2H, t, J = 5.9 Hz), 4.05 (4H, m), 3.54 (2H, m), 2.10 (2H, m), 1.98 (3H, bs)
化合物8:N,N-ジメチルアクリルアミド:アゾイソブチロニトリルが25:75:1(モル比)で含まれる無水テトラヒドロフラン溶液を、窒素気流下、65℃で一昼夜撹拌した。冷後、エーテルに滴下することで生じた析出物を濾取した。テトラヒドロフラン-エーテル溶液を用いて再沈殿させ化合物9を得た。1H-NMR(CDCl3)スペクトルで、化合物8に由来する6~8ppmのピークと、1~4ppmに出現するその他のピークの積分値から、化合物9の組成比y:zを22:78と概算した。
化合物9のクロロホルム溶液に希塩酸を加え、60℃で3日間撹拌した。エーテル希釈により生じた析出物を、テトラヒドロフラン-エーテルを用いて再沈殿させ化合物10を得た。1H-NMR(CDCl3)スペクトルで、アルデヒド基を保護しているアセタールに由来する4ppmのピークと、芳香族およびNH基に由来する7~8ppmのピークの積分値から、化合物10の組成比x:y:zを17:5:78と概算した。
化合物8:N-イソプロピルアクリルアミド:アゾイソブチロニトリルが25:75:1(モル比)で含まれる無水テトラヒドロフラン溶液を、窒素気流下、65℃で一昼夜撹拌した。冷後、エーテルに滴下することで生じた析出物を濾取した。テトラヒドロフラン-エーテル溶液を用いて再沈殿させ化合物11を得た。1H-NMR(CDCl3)スペクトルで、化合物8の芳香族に由来する7~8ppmのピークと、1~4ppmに出現するその他のピークの積分値から、化合物11の組成比y:zを25:75と概算した。化合物11の組成比は、原料の仕込み比とほぼ一致していた。
化合物11のクロロホルム溶液に希塩酸を加え、60℃で3日間撹拌した。エーテル希釈により生じた析出物を、テトラヒドロフラン-エーテルを用いて再沈殿させ化合物12を得た。1H-NMR(CDCl3)スペクトルで、アルデヒド基を保護しているアセタールに由来する4ppmのピークが消失したことから、化合物12の組成比x:y:zを25:0:75と概算した。すなわち、化合物12は、化合物11のアセタール保護されたアルデヒド基のほとんどが、アルデヒド基に変化した化合物であった。
塩化メタクリロイド(1.1当量)、5-ヒドロキシ-2-ニトロベンズアルデヒド(1当量)、およびトリエチルアミン(1.2当量)の無水ジクロロメタン溶液を、一昼夜撹拌後、反応液を希塩酸で処理した。ジクロロメタン抽出後、濃縮により得た残渣をシリカゲルカラム(メルク7734、酢酸エチル:ヘキサン=3:7(容量比))で精製した。化合物13を87%以上の収率で得た。
1H-NMR(CDCl3): 10.45 (1H, s), 8.22 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.71 (1H, d, J = 2.6 Hz), 7.55 (1H, dd, J = 8.8, 2.6 Hz), 6.41 (1H, s), 5.88 (1H, m), 2.08 (3H, dd, J = 1.4, 1.0 Hz)
1H-NMR(CDCl3): 10.45 (1H, s), 8.22 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.71 (1H, d, J = 2.6 Hz), 7.55 (1H, dd, J = 8.8, 2.6 Hz), 6.41 (1H, s), 5.88 (1H, m), 2.08 (3H, dd, J = 1.4, 1.0 Hz)
実施例14:化合物4(x=33、y=16、z=51)の光応答膨潤
実施例4と同様の方法で、図3に示すポリマー1(化合物4でx=33、y=16、z=51)を調製した。親水処理化ポリスチレン基板上に、ポリマー1の2%2,2,2-trifluoroethanol(TFE)溶液をスピンコートし、85℃で1時間加熱して複合材を得た。この複合材をpH7.4のリン酸緩衝溶液(PBS)に浸漬した状態で、図4(a)に示すように、ポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー1に10秒間照射すると、直ちに光を照射した領域のポリマー1が膨潤した。図4(b)は、光応答膨潤後に、倒立顕微鏡で複合材を底面から観察した画像である。
実施例4と同様の方法で、図3に示すポリマー1(化合物4でx=33、y=16、z=51)を調製した。親水処理化ポリスチレン基板上に、ポリマー1の2%2,2,2-trifluoroethanol(TFE)溶液をスピンコートし、85℃で1時間加熱して複合材を得た。この複合材をpH7.4のリン酸緩衝溶液(PBS)に浸漬した状態で、図4(a)に示すように、ポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー1に10秒間照射すると、直ちに光を照射した領域のポリマー1が膨潤した。図4(b)は、光応答膨潤後に、倒立顕微鏡で複合材を底面から観察した画像である。
実施例15:化合物4(x=49、y=0、z=51)の光応答剥離
ポリアクリル酸(PAAc)の0.05%メタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して、PAAc修飾ポリスチレン基材を調製した。また、実施例4と同様の方法で、図3に示すポリマー2(化合物4でx=49、y=0、z=51)を調製した。2,2,2,3,3,3-hexafluoroisopropanol(HFIP)とTFEの混合溶媒にポリマー2を0.2%溶解させた溶液をこの基材上にスピンコートし、85℃で30分間加熱して複合材を得た。この複合材を0.05mN水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した状態で、図5(a)に示すように、ポリスチレン基板側から、波長365nm、強度66mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー2に30秒間照射した。その後、複合材の表面をピペッティングすると、光を照射した領域からポリマー2が剥離した。
ポリアクリル酸(PAAc)の0.05%メタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して、PAAc修飾ポリスチレン基材を調製した。また、実施例4と同様の方法で、図3に示すポリマー2(化合物4でx=49、y=0、z=51)を調製した。2,2,2,3,3,3-hexafluoroisopropanol(HFIP)とTFEの混合溶媒にポリマー2を0.2%溶解させた溶液をこの基材上にスピンコートし、85℃で30分間加熱して複合材を得た。この複合材を0.05mN水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した状態で、図5(a)に示すように、ポリスチレン基板側から、波長365nm、強度66mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー2に30秒間照射した。その後、複合材の表面をピペッティングすると、光を照射した領域からポリマー2が剥離した。
実施例16:化合物4(x=0、y=49、z=51)の光応答剥離
PAAcの0.1%メタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して、PAAc修飾ポリスチレン基材を調製した。また、実施例4と同様の方法で、図3に示すポリマー3(化合物4でx=0、y=49、z=51)を調製した。HFIP77%とTFE23%の混合溶媒にポリマー3を0.41%溶解させた溶液をこの基材上にスピンコートし、85℃で2時間加熱して複合材を得た。この複合材をpH7.4のPBSに浸漬した状態で、図6(a)に示すように、ポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー3に2分間照射した。その後、複合材の表面をピペッティングすると、光を照射した領域からポリマー3が剥離した。
PAAcの0.1%メタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して、PAAc修飾ポリスチレン基材を調製した。また、実施例4と同様の方法で、図3に示すポリマー3(化合物4でx=0、y=49、z=51)を調製した。HFIP77%とTFE23%の混合溶媒にポリマー3を0.41%溶解させた溶液をこの基材上にスピンコートし、85℃で2時間加熱して複合材を得た。この複合材をpH7.4のPBSに浸漬した状態で、図6(a)に示すように、ポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー3に2分間照射した。その後、複合材の表面をピペッティングすると、光を照射した領域からポリマー3が剥離した。
実施例17:化合物4(x=0、y=49、z=51)と部分加水分解PMMAの複合層からのヒドロキシプロピルセルロースゲル層の光応答剥離
図3に示すポリマー3の2%TFE溶液と、部分加水分解PMMAの0.2%TFE溶液を1:5で混合した混合溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートして、ポリマー3と部分加水分解PMMAの複合層を表面に備える複合材を得た。ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)を2%、tetramethoxymethyl glycoluril(TMMGU)を0.015%、H2SO4を3mmol/kgを含むメタノール溶液を、この複合材の複合層にスピンコートし、85℃で2時間加熱することによって架橋HPC層を形成した。
図3に示すポリマー3の2%TFE溶液と、部分加水分解PMMAの0.2%TFE溶液を1:5で混合した混合溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートして、ポリマー3と部分加水分解PMMAの複合層を表面に備える複合材を得た。ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)を2%、tetramethoxymethyl glycoluril(TMMGU)を0.015%、H2SO4を3mmol/kgを含むメタノール溶液を、この複合材の複合層にスピンコートし、85℃で2時間加熱することによって架橋HPC層を形成した。
図7(a)に示すように、架橋HPC層を形成したこの材料のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度66mW/cm2の光を所定パターンの反転ドット状に複合層に4分間照射した。その後、エタノールと水を7:3で混合した混合液にこの材料を浸漬すると、光を照射しなかったドット状の領域では架橋HPC層が複合層から自発的に剥離した。これに対して、光を照射した反転ドット状の領域では、架橋HPC層の複合層からの剥離が抑制された。
実施例18:化合物6(x=0、y=20、z=80)の光応答溶解抑制
実施例6と同様の方法で、図3に示すポリマー4(化合物6でx=0、y=20、z=80)を調製した。ポリスチレン基板上に、ポリマー4の1%TFE溶液をスピンコートし、85℃で30分間加熱して複合材を得た。図8(a)に示すように、空気中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度66mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー4に30秒間照射した。その後、エタノールと水を7:3で混合した混合液に複合材を浸漬した。光を照射しなかった領域では、ポリマー4が混合液に溶解して複合材から除去されたのに対して、光を照射した領域では、ポリマー4の架橋反応によって混合液への溶解が抑制され、複合材にポリマー4の架橋物が残存した。
実施例6と同様の方法で、図3に示すポリマー4(化合物6でx=0、y=20、z=80)を調製した。ポリスチレン基板上に、ポリマー4の1%TFE溶液をスピンコートし、85℃で30分間加熱して複合材を得た。図8(a)に示すように、空気中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度66mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー4に30秒間照射した。その後、エタノールと水を7:3で混合した混合液に複合材を浸漬した。光を照射しなかった領域では、ポリマー4が混合液に溶解して複合材から除去されたのに対して、光を照射した領域では、ポリマー4の架橋反応によって混合液への溶解が抑制され、複合材にポリマー4の架橋物が残存した。
実施例19:化合物6(x=0、y=14、z=86)の光応答架橋と架橋体の光応答溶解
実施例6と同様の方法で、図3に示すポリマー5(化合物6でx=0、y=14、z=86)を調製した。ポリスチレン基板上に、ポリマー5の1%TFE溶液をスピンコートして複合材を得た。図9(a)に示すように、空気中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度66mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー5に20秒間照射した。
実施例6と同様の方法で、図3に示すポリマー5(化合物6でx=0、y=14、z=86)を調製した。ポリスチレン基板上に、ポリマー5の1%TFE溶液をスピンコートして複合材を得た。図9(a)に示すように、空気中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度66mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー5に20秒間照射した。
その後、エタノールと水を7:3で混合した混合液に複合材を浸漬すると、光を照射しなかった領域では、ポリマー5が混合液に溶解して複合材から除去されたのに対して、光を照射した領域では、ポリマー5の架橋反応によって混合液への溶解が抑制され、複合材にポリマー5の架橋物が残存した。さらに、波長360~440nm、強度400mW/cm2の光を所定パターンのドット状の局所のポリマー5に1分間照射した。その結果、追加の光を照射した局所領域では、ポリマー5の架橋物が混合液に溶解して複合材から除去された。
実施例20:化合物6(x=32、y=11、z=57)の光応答剥離膨潤
PAAcの0.05%メタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して、PAAc修飾ポリスチレン基材を調製した。また、実施例6と同様の方法で、図3に示すポリマー6(化合物6でx=32、y=11、z=57)を調製した。ポリマー6の0.5%TFE溶液をこの基材上にスピンコートして複合材を得た。この複合材を5mNのNaOH水溶液に浸漬した状態で、図10(a)に示すように、ポリスチレン基板側から、波長360~440nm、強度400mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー6に10秒間照射した。光を照射した領域ではポリマー6がPAAc層から直ちに剥離膨潤した。
PAAcの0.05%メタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して、PAAc修飾ポリスチレン基材を調製した。また、実施例6と同様の方法で、図3に示すポリマー6(化合物6でx=32、y=11、z=57)を調製した。ポリマー6の0.5%TFE溶液をこの基材上にスピンコートして複合材を得た。この複合材を5mNのNaOH水溶液に浸漬した状態で、図10(a)に示すように、ポリスチレン基板側から、波長360~440nm、強度400mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー6に10秒間照射した。光を照射した領域ではポリマー6がPAAc層から直ちに剥離膨潤した。
実施例21:化合物6(x=0、y=23、z=77)の光架橋細胞パターニング
実施例6と同様の方法で、図3に示すポリマー7(化合物6でx=0、y=23、z=77)を調製した。また、HPCを0.2%、TMMGUを0.0015%、H2SO4を0.5mmol/kgそれぞれ含むメタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して細胞接着阻害性の架橋HPC層を形成し、HPCゲル修飾ポリスチレン基材を調製した。さらに、TFEとn-ブタノールを7:3で混合した混合溶媒にポリマー7を0.7%溶解した溶液を、この架橋HPC層上にスピンコートして複合材を得た。
実施例6と同様の方法で、図3に示すポリマー7(化合物6でx=0、y=23、z=77)を調製した。また、HPCを0.2%、TMMGUを0.0015%、H2SO4を0.5mmol/kgそれぞれ含むメタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して細胞接着阻害性の架橋HPC層を形成し、HPCゲル修飾ポリスチレン基材を調製した。さらに、TFEとn-ブタノールを7:3で混合した混合溶媒にポリマー7を0.7%溶解した溶液を、この架橋HPC層上にスピンコートして複合材を得た。
図11(a)に示すように、空気中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー7に1分間照射した。エタノールと水を7:3で混合した混合液を、複合材の表面に吹き付けて2分間静置し、軽く揺すってからこの混合液を吸引除去した。その後、複合材を水で2回洗浄したところ、光を照射しなかった領域では架橋HPC層からポリマー7が除去された。一方、光を照射した領域では、ポリマー7の架橋物が架橋HPC層上に残存した。そして、培地に分散させたNIH/3T3細胞を複合材に播種し、翌日まで培養したところ、光を照射した領域に残存していたポリマー7の架橋物の表面に細胞が接着した。
実施例22:化合物10(x=17、y=5、z=78)の光応答溶解
実施例10と同様の方法で、図12に示すポリマー9(化合物10でx=17、y=5、z=78)を調製した。ポリスチレン基板上に、ポリマー9の1%TFE溶液をスピンコートし、85℃で2時間加熱して複合材を得た。図13(a)に示すように、培地中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー9に2秒間照射すると、光を照射した領域のポリマー9が培地に溶解した。
実施例10と同様の方法で、図12に示すポリマー9(化合物10でx=17、y=5、z=78)を調製した。ポリスチレン基板上に、ポリマー9の1%TFE溶液をスピンコートし、85℃で2時間加熱して複合材を得た。図13(a)に示すように、培地中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー9に2秒間照射すると、光を照射した領域のポリマー9が培地に溶解した。
実施例23:化合物10(x=17、y=5、z=78)の光応答架橋と架橋体の光応答溶解
図12に示すポリマー9の1%TFE溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で15分間加熱して複合材を得た。図14(a)に示すように、空気中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度66mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー9に5秒間照射して、水でリンスした。その後、複合材をpH7.4のPBSに浸漬したところ、光を照射しなかった領域ではポリマー9が徐々にPBSに溶解した。一方、光を照射した領域では、ポリマー9の架橋物がポリスチレン基板上に残存した。さらに、PBS中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を、残存したポリマー9の一部(長方形状)に1秒間照射すると、光を照射した領域のポリマー9はPBSに溶解した。
図12に示すポリマー9の1%TFE溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で15分間加熱して複合材を得た。図14(a)に示すように、空気中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度66mW/cm2の光を所定パターンのドット状にポリマー9に5秒間照射して、水でリンスした。その後、複合材をpH7.4のPBSに浸漬したところ、光を照射しなかった領域ではポリマー9が徐々にPBSに溶解した。一方、光を照射した領域では、ポリマー9の架橋物がポリスチレン基板上に残存した。さらに、PBS中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を、残存したポリマー9の一部(長方形状)に1秒間照射すると、光を照射した領域のポリマー9はPBSに溶解した。
実施例24:化合物10(x=17、y=5、z=78)からのHPC層の光応答剥離膨潤
図12に示すポリマー9の1%TFE溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して複合材を得た。この複合材のポリマー9の層の表面全体に、波長365nm、強度28mW/cm2の光を10秒間照射し、水でリンスした後に乾燥した。さらに、HPCを3.6%、TMMGUを0.044%、H2SO4を4.4mmol/kgそれぞれ含むメタノール溶液を、複合材のポリマー9の層にスピンコートし、85℃で2時間加熱することによって架橋HPC層を形成した。図15(a)に示すように、pH7.4のPBS中で複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を所定パターンの六角形状にポリマー9に5秒間照射した。光を照射した領域ではポリマー9がポリスチレン基板から直ちに剥離膨潤した。
図12に示すポリマー9の1%TFE溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して複合材を得た。この複合材のポリマー9の層の表面全体に、波長365nm、強度28mW/cm2の光を10秒間照射し、水でリンスした後に乾燥した。さらに、HPCを3.6%、TMMGUを0.044%、H2SO4を4.4mmol/kgそれぞれ含むメタノール溶液を、複合材のポリマー9の層にスピンコートし、85℃で2時間加熱することによって架橋HPC層を形成した。図15(a)に示すように、pH7.4のPBS中で複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を所定パターンの六角形状にポリマー9に5秒間照射した。光を照射した領域ではポリマー9がポリスチレン基板から直ちに剥離膨潤した。
実施例25:化合物10(x=17、y=5、z=78)からの細胞の光応答剥離
図12に示すポリマー9の1%TFE溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して複合材を得た。培地に分散させたNIH/3T3細胞をこの複合材に播種した。半日培養したところ、図16(a)に示すように、ポリマー9の層の表面全面に細胞が接着伸展した。複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を局所的にポリマー9に1分間照射したところ、光を照射した領域では伸展していた細胞が丸く変化した。1時間後、複合材の表面全体に培地を軽く吹き付けると、光を照射した領域では細胞がポリマー9から剥離した。
図12に示すポリマー9の1%TFE溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して複合材を得た。培地に分散させたNIH/3T3細胞をこの複合材に播種した。半日培養したところ、図16(a)に示すように、ポリマー9の層の表面全面に細胞が接着伸展した。複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を局所的にポリマー9に1分間照射したところ、光を照射した領域では伸展していた細胞が丸く変化した。1時間後、複合材の表面全体に培地を軽く吹き付けると、光を照射した領域では細胞がポリマー9から剥離した。
実施例26:化合物12(x=25、y=0、z=75)の光応答溶解
実施例12と同様の方法で、図12に示すポリマー11(化合物12でx=25、y=0、z=75)を調製した。ポリマー11を1.5%含むTFE溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2.5時間加熱して複合材を得た。図17(a)に示すように、PBS中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を、所定パターンのドット状にポリマー11に2秒間照射すると、光を照射した領域のポリマー11はPBSに溶解した。
実施例12と同様の方法で、図12に示すポリマー11(化合物12でx=25、y=0、z=75)を調製した。ポリマー11を1.5%含むTFE溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2.5時間加熱して複合材を得た。図17(a)に示すように、PBS中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度120mW/cm2の光を、所定パターンのドット状にポリマー11に2秒間照射すると、光を照射した領域のポリマー11はPBSに溶解した。
実施例27:化合物12(x=25、y=0、z=75)と細胞の光応答剥離
ポリマー11を1.5%含むTFE溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2.5時間加熱して複合材を得た。培地に分散させたNIH/3T3細胞をこの複合材に播種した。半日培養したところ、図18(a)に示すように、ポリマー11の層の表面全面に細胞が接着伸展した。複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度66mW/cm2の光を、局所的な長方形状にポリマー11に10秒間照射した。30分後、複合材の表面全体に培地を軽く吹き付けると、光を照射した領域では、細胞とポリマー11が一体となった状態でポリスチレン基板から剥離した。
ポリマー11を1.5%含むTFE溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2.5時間加熱して複合材を得た。培地に分散させたNIH/3T3細胞をこの複合材に播種した。半日培養したところ、図18(a)に示すように、ポリマー11の層の表面全面に細胞が接着伸展した。複合材のポリスチレン基板側から、波長365nm、強度66mW/cm2の光を、局所的な長方形状にポリマー11に10秒間照射した。30分後、複合材の表面全体に培地を軽く吹き付けると、光を照射した領域では、細胞とポリマー11が一体となった状態でポリスチレン基板から剥離した。
実施例28:化合物12(x=10、y=0、z=90とx=4、y=0、z=96)水溶液の濁度の温度依存性
実施例12と同様の方法で、図12に示すポリマー12(化合物12でx=10、y=0、z=90)とポリマー14(化合物12でx=4、y=0、z=96)を調製した。ポリマー12とポリマー14をそれぞれ0.01%含む2種類のリン酸緩衝水溶液(いずれもpH7.41)を調製した。これら2種類の水溶液の波長700nmにおける濁度(光路長1cm)の温度依存性を、波長365nmの紫外光の照射前後で測定した。なお、紫外光照射後の各水溶液は、十分量の紫外光を照射したものである。その結果を図19に示す。紫外光照射前の濁度を■で、紫外光照射後の濁度を●で表している。
実施例12と同様の方法で、図12に示すポリマー12(化合物12でx=10、y=0、z=90)とポリマー14(化合物12でx=4、y=0、z=96)を調製した。ポリマー12とポリマー14をそれぞれ0.01%含む2種類のリン酸緩衝水溶液(いずれもpH7.41)を調製した。これら2種類の水溶液の波長700nmにおける濁度(光路長1cm)の温度依存性を、波長365nmの紫外光の照射前後で測定した。なお、紫外光照射後の各水溶液は、十分量の紫外光を照射したものである。その結果を図19に示す。紫外光照射前の濁度を■で、紫外光照射後の濁度を●で表している。
紫外光照射前のポリマー12の水溶液およびポリマー14の水溶液の下限臨界溶液温度(LCST)は、それぞれ10℃および20℃であった。なお、LCSTは、その温度以下でポリマーが水溶するときの温度である。一方、紫外光照射後のポリマー12の水溶液およびポリマー14の水溶液では、測定した60℃以下の温度範囲においてLCSTが観察されなかった。このことから、pH7.41において、ポリマー12は少なくとも10℃以上60℃以下の範囲で、ポリマー14は少なくとも20℃以上60℃以下の範囲で、紫外光照射によって水に不溶な状態から水に可溶な状態に変化することが確認できた。
実施例29:化合物12(x=10、y=0、z=90)と細胞の光応答剥離
ポリマー12を0.9%含むTFE溶液88%とn-BuOH12%の混合溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して複合材を得た。この複合材を37℃の水に1時間浸漬した後、培地に分散させたNIH/3T3細胞をこの複合材に播種した。半日培養したところ、図20(a)に示すように、ポリマー12の層の表面全体で細胞が接着伸展した。
ポリマー12を0.9%含むTFE溶液88%とn-BuOH12%の混合溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して複合材を得た。この複合材を37℃の水に1時間浸漬した後、培地に分散させたNIH/3T3細胞をこの複合材に播種した。半日培養したところ、図20(a)に示すように、ポリマー12の層の表面全体で細胞が接着伸展した。
そして、複合材上の一部の細胞に、波長365nm、強度120mW/cm2の光をポリスチレン基板側から3秒間照射した。その直後に複合材の表面全体に培地を軽く吹き付けると、光を照射した領域のみの接着伸展していた細胞が、ポリマー12と一体となった状態でポリスチレン基板から剥離し回収できた。同様の条件で多数の細胞を回収し、トリパンブルーで染色したところ、光を照射した領域から回収した細胞の98%が生存していた。
実施例30:化合物12(x=10、y=0、z=90)とpNIPAAmの複合層からの細胞の光応答剥離
ポリマー12を0.91%、および無修飾Poly(N-isopropylacrylamide)(pNIPAAm)を0.36%含むTFE溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2.5時間加熱して、ポリマー12とpNIPAAmの複合層を表面に備える複合材を得た。MDCK細胞を培地に分散してこの複合材に播種した。半日培養したところ、図21(a)に示すように、この複合層の表面全体で細胞が接着伸展した。複合材上の細胞の一部の領域に、波長365nm、強度120mW/cm2の光をポリスチレン基板側から3秒間照射した。光を照射した領域では複合層が培地に溶解し、溶解した複合層上に接着伸展していた細胞が個別に剥離した。本発明の高分子化合物を用いて細胞1個単位で操作できることが実証された。
ポリマー12を0.91%、および無修飾Poly(N-isopropylacrylamide)(pNIPAAm)を0.36%含むTFE溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2.5時間加熱して、ポリマー12とpNIPAAmの複合層を表面に備える複合材を得た。MDCK細胞を培地に分散してこの複合材に播種した。半日培養したところ、図21(a)に示すように、この複合層の表面全体で細胞が接着伸展した。複合材上の細胞の一部の領域に、波長365nm、強度120mW/cm2の光をポリスチレン基板側から3秒間照射した。光を照射した領域では複合層が培地に溶解し、溶解した複合層上に接着伸展していた細胞が個別に剥離した。本発明の高分子化合物を用いて細胞1個単位で操作できることが実証された。
実施例31:化合物12(x=10、y=0、z=90)とpNIPAAmの複合層と細胞コロニーの光応答剥離
ポリマー12を1.5%、および無修飾pNIPAAmを0.44%含むTFE溶液91%とn-BuOH9%の混合溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して、ポリマー12とpNIPAAmの複合層を表面に備える複合材を得た。室温に保った状態で、この複合材の表面に膜調整剤(コーニング社、マトリゲル)をコートし、さらにヒトiPS細胞の集塊を播種した。
ポリマー12を1.5%、および無修飾pNIPAAmを0.44%含むTFE溶液91%とn-BuOH9%の混合溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2時間加熱して、ポリマー12とpNIPAAmの複合層を表面に備える複合材を得た。室温に保った状態で、この複合材の表面に膜調整剤(コーニング社、マトリゲル)をコートし、さらにヒトiPS細胞の集塊を播種した。
2日間培養したところ、複合材の表面全体でヒトiPS細胞のコロニーが接着伸展した。コロニーの一つが接着していた複合層の領域に、波長365nm、強度120mW/cm2の光をポリスチレン基板側から3秒間照射した。図22(a)に示すように、光を照射した領域では、複合層がポリスチレン基板から剥離し、接着伸展していたコロニーが顕著に収縮した。
実施例32:化合物12(x=7、y=0、z=93)と細胞コロニーの光応答剥離
実施例12と同様の方法で、図12に示すポリマー13(化合物12でx=7、y=0、z=93)を調製した。ポリマー13の0.88%TFE溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2.5時間加熱して複合材を得た。室温に保った状態で、この複合材の表面に膜調整剤(コーニング社、マトリゲル)をコートし、さらにヒトiPS細胞の集塊を播種した。
実施例12と同様の方法で、図12に示すポリマー13(化合物12でx=7、y=0、z=93)を調製した。ポリマー13の0.88%TFE溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2.5時間加熱して複合材を得た。室温に保った状態で、この複合材の表面に膜調整剤(コーニング社、マトリゲル)をコートし、さらにヒトiPS細胞の集塊を播種した。
6日間培養したところ、複合材の表面全体でヒトiPS細胞のコロニーが接着伸展した。コロニーの一つが接着していたポリマー13の領域に、波長365nm、強度120mW/cm2の光をポリスチレン基板側から3秒間照射した。図23(a)に示すように、光を照射した領域では、ポリマー13の層がポリスチレン基板から剥離し、接着伸展していたコロニーが顕著に収縮した。さらに、複合材の表面に培地を軽く吹き付けると、接着伸展していたコロニーとポリマー13が一体となった状態で、ポリスチレン基板から分離・除去された。
実施例33:化合物12(x=10、y=0、z=90)とpNIPAAmの複合層からの細胞内特定部位の選択的な光応答剥離
ポリマー12を0.81%、および無修飾pNIPAAmを0.56%含むTFE溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2.5時間加熱して、ポリマー12とpNIPAAmの複合層を表面に備える複合材を得た。NIH/3T3細胞を培地に分散してこの複合材に播種した。半日培養したところ、図24(a)に示すように、この複合層の表面全体で細胞が接着伸展した。いくつかの細胞の偽足先端が存在していた複合層の領域に、波長365nm、強度120mW/cm2の光をポリスチレン基板側から3秒間照射した。光を照射した領域の複合層の表面のみから偽足の先端が外れ、偽足が収縮した。本発明の高分子化合物を用いて個別細胞の特定部位を独立して操作できることが実証された。
ポリマー12を0.81%、および無修飾pNIPAAmを0.56%含むTFE溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、85℃で2.5時間加熱して、ポリマー12とpNIPAAmの複合層を表面に備える複合材を得た。NIH/3T3細胞を培地に分散してこの複合材に播種した。半日培養したところ、図24(a)に示すように、この複合層の表面全体で細胞が接着伸展した。いくつかの細胞の偽足先端が存在していた複合層の領域に、波長365nm、強度120mW/cm2の光をポリスチレン基板側から3秒間照射した。光を照射した領域の複合層の表面のみから偽足の先端が外れ、偽足が収縮した。本発明の高分子化合物を用いて個別細胞の特定部位を独立して操作できることが実証された。
適度に疎水的なモノマー成分として、NBA基を有する重合性モノマーである化合物14を用いて、N-tert-ブチルアクリルアミド(NTBAAm)を含むNBAポリマー(化合物15および化合物16)を、以下の通り合成した。まず、化合物14:N-イソプロピルアクリルアミド:N-tert-ブチルアクリルアミド:アゾイソブチロニトリルを下記の表1に記載した原料モル比(x:y:z:AIBN)で含む無水テトラヒドロフラン溶液を、窒素気流下、65℃で一昼夜撹拌した。冷後、エーテルに滴下することで生じた析出物をテトラヒドロフラン-エーテル溶液を用いて再沈殿させ、化合物15を得た。
化合物15の組成比は、1H-NMR(CDCl3)スペクトルで、6~8ppm付近に出現する芳香族、NH基、およびベンジル位の水素原子に由来するピークと、1~4ppm付近に出現するその他のピークの積分値より概算した。なお、実施例34-6では、化合物15の組成比は、N-イソプロピルアクリルアミドのイソプロピル基のメチン水素ピーク(4ppm)を基準に概算した。
化合物15のクロロホルム、テトラヒドロフラン、または1,4-ジオキサン溶液に塩酸を加え、60℃で3日間撹拌した。エーテル希釈により生じた析出物を、テトラヒドロフラン-エーテルによって再沈殿して化合物16を得た。化合物16の脱保護化率は、1H-NMR(CDCl3またはCD3COCD3)スペクトルで、4ppmに出現するアルデヒド基を保護しているアセタールに由来するピークの消失、および7~8ppm付近に出現する芳香族由来のピークが単一であることを確認した場合は100%とした。一方、4ppmに出現するアルデヒド基を保護しているアセタールに由来するピークの残存、および7~8ppm付近に出現する芳香族由来のピークを2種類確認した場合は、11ppm付近に出現するアルデヒド基由来のピークを基準に化合物16の脱保護化率を概算した。
実施例35:pNBANIPAAmコート層からの光応答剥離によって回収された細胞の生存率
エーテル基を介してNBA基を導入率4mol%で修飾したpNIPAAm(図12の化合物14。以下、エーテル基を介してNBA基を導入したpNIPAAmを「pNBANIPAAm」ということがある)を基板にコートした。そのコート層にNIH/3T3細胞を播種し、37℃で2日間培養した。そして、基板の底面側から、中心波長365nm、強度40mW/cm2の光を10秒間照射し、表面に培地を軽く吹き付けることによって細胞を回収した。1mMのEDTAを含むpH7.4のリン酸緩衝溶液で、単細胞にまで分散した後、トリパンブルーで染色した。染色細胞と非染色細胞の個数をカウントして、NIH/3T3細胞の生存率を96%と見積もった(図25のグラフの左)。
エーテル基を介してNBA基を導入率4mol%で修飾したpNIPAAm(図12の化合物14。以下、エーテル基を介してNBA基を導入したpNIPAAmを「pNBANIPAAm」ということがある)を基板にコートした。そのコート層にNIH/3T3細胞を播種し、37℃で2日間培養した。そして、基板の底面側から、中心波長365nm、強度40mW/cm2の光を10秒間照射し、表面に培地を軽く吹き付けることによって細胞を回収した。1mMのEDTAを含むpH7.4のリン酸緩衝溶液で、単細胞にまで分散した後、トリパンブルーで染色した。染色細胞と非染色細胞の個数をカウントして、NIH/3T3細胞の生存率を96%と見積もった(図25のグラフの左)。
また、0.05w/v%トリプシン-0.53mMのEDTA溶液を通常の培養ディッシュに37℃で2分間作用させた後に回収したNIH/3T3細胞について、同様の方法で生存率を見積もったところ98%だった(図25のグラフの右)。pNBANIPAAmの光応答溶解によって剥離された細胞の生存率は、一般的な酵素的剥離によって回収された細胞の生存率とほとんど差がないことがわかった。
実施例36:NBAコポリマー水溶液の光応答pH変化
光路長1cmの四面透過光学セル(キュベット)内で、NBA基の導入率が10mol%のpNBANIPAAmの0.01%水溶液に微量のBTBを加えた。約1%の0.01NのNaOH水溶液をさらに添加して、図26(a)に示すような弱塩基性の青色水溶液を調製した。そして、キュベット内の水溶液の下半分に中心波長365nmの紫外光を照射した。図26(b)に示すように、光照射された領域で速やかに黄色に変化した。
光路長1cmの四面透過光学セル(キュベット)内で、NBA基の導入率が10mol%のpNBANIPAAmの0.01%水溶液に微量のBTBを加えた。約1%の0.01NのNaOH水溶液をさらに添加して、図26(a)に示すような弱塩基性の青色水溶液を調製した。そして、キュベット内の水溶液の下半分に中心波長365nmの紫外光を照射した。図26(b)に示すように、光照射された領域で速やかに黄色に変化した。
さらに、水溶液全体に光照射したところ、図26(c)に示すように、キュベット内全体が黄色に変化した。つまり、光照射によって水溶液のpH低下が引き起こされた。この結果から、ポリマー側鎖のNBA基の光反応によって、弱酸であるo-ニトロソ安息香酸基が生成してプロトンを放出しpHが低下したこと、およびこのプロトン放出によってポリマーがイオン化したことがわかった。
実施例37:光応答脱水和特性のpH依存性
NBA基の導入率が10mol%のpNBANIPAAmの1%水溶液と、各種pHの緩衝液または塩酸水溶液とを、pNBANIPAAmの0.01%水溶液となるようにキュベット内で混合した。この水溶液の温度を0℃から60℃まで徐々に上昇させながら、波長700nmの光の吸光度が0となる水溶液の光学密度を測定して濁度とした。その後、再び水溶液を0℃に冷却し、スペクトル変化が飽和するまで、中心波長365nmの紫外光を水溶液に照射した。そして、再び水溶液の温度を徐々に上昇させながら、各温度での水溶液の濁度を測定した。この結果を図27に示す。
NBA基の導入率が10mol%のpNBANIPAAmの1%水溶液と、各種pHの緩衝液または塩酸水溶液とを、pNBANIPAAmの0.01%水溶液となるようにキュベット内で混合した。この水溶液の温度を0℃から60℃まで徐々に上昇させながら、波長700nmの光の吸光度が0となる水溶液の光学密度を測定して濁度とした。その後、再び水溶液を0℃に冷却し、スペクトル変化が飽和するまで、中心波長365nmの紫外光を水溶液に照射した。そして、再び水溶液の温度を徐々に上昇させながら、各温度での水溶液の濁度を測定した。この結果を図27に示す。
図27に示すように、pH1.7~7.4では、紫外光照射前の水溶液の転移温度(11~15℃)が、pNIPAAmホモポリマー水溶液の転移温度31℃よりかなり低かった。なお、転移温度が高いほど、ポリマーの溶解性が高い。この結果から、NBAの導入によって、pNIPAAmの溶解性が低下することがわかった。一方、紫外光照射後の水溶液では、pH7.4の水溶液の転移温度が60℃以下で観察されなかった。これに対して、pH4.0の水溶液の転移温度は33℃付近に、pH1.7の水溶液の転移温度は21℃付近にそれぞれ観察された。この結果から、pNBANIPAAmへの光照射によって、弱酸であるo-ニトロソ安息香酸が生成したことが示された。
実施例38:光応答脱水和特性のNBA導入率依存
実施例37と同様にして、NBA基の導入率が0mol%、4mol%、7mol%、および10mol%の4種類のpNBANIPAAmを0.01%含むpH7.4のリン酸緩衝溶液の700nmにおける濁度を0℃から60℃で測定した。その結果を図28に示す。図28に示すように、NBA基の導入率の増加にともなって、紫外光照射前の水溶液の転移温度が低下した。つまり、NBA基の導入率の増加にともなって、ポリマーの溶解性が低くなった。一方、紫外光照射後の転移温度は、NBA基の導入率の増加にともなって著しく上昇した。
実施例37と同様にして、NBA基の導入率が0mol%、4mol%、7mol%、および10mol%の4種類のpNBANIPAAmを0.01%含むpH7.4のリン酸緩衝溶液の700nmにおける濁度を0℃から60℃で測定した。その結果を図28に示す。図28に示すように、NBA基の導入率の増加にともなって、紫外光照射前の水溶液の転移温度が低下した。つまり、NBA基の導入率の増加にともなって、ポリマーの溶解性が低くなった。一方、紫外光照射後の転移温度は、NBA基の導入率の増加にともなって著しく上昇した。
実施例39:光応答脱水和特性のNTBAAm導入率依存
実施例37と同様にして、NBA基の導入率が10mol%のpNBANIPAAmで、NTBAAmを含まないpNIPAAmの0.01%リン酸緩衝溶液(pH7.4)、およびNTBAAmを20mol%含むpNIPAAmの0.01%リン酸緩衝溶液(pH7.4)の700nmにおける濁度を0℃から60℃で測定した。その結果を図29に示す。図29に示すように、NTBAAmを含むpNIPAAm水溶液の紫外光照射前の転移温度は、NTBAAmを含まないpNIPAAm水溶液の紫外光照射前の転移温度より低下した。つまり、NTBAAmの導入により、pNIPAAmポリマーの暗所安定性が高くなった。一方、紫外光照射後の転移温度は、NTBAAmの有無に関わらず著しく上昇した。
実施例37と同様にして、NBA基の導入率が10mol%のpNBANIPAAmで、NTBAAmを含まないpNIPAAmの0.01%リン酸緩衝溶液(pH7.4)、およびNTBAAmを20mol%含むpNIPAAmの0.01%リン酸緩衝溶液(pH7.4)の700nmにおける濁度を0℃から60℃で測定した。その結果を図29に示す。図29に示すように、NTBAAmを含むpNIPAAm水溶液の紫外光照射前の転移温度は、NTBAAmを含まないpNIPAAm水溶液の紫外光照射前の転移温度より低下した。つまり、NTBAAmの導入により、pNIPAAmポリマーの暗所安定性が高くなった。一方、紫外光照射後の転移温度は、NTBAAmの有無に関わらず著しく上昇した。
実施例40:pNBANIPAAmコート膜の光応答溶解
pH4.0、pH5.0、およびpH7.4の各pH緩衝液(25℃)中で、NBA基の導入率が10mol%のpNBANIPAAmをコートした層に、直径100μmの微小水玉模様のパターンに沿って紫外光を照射し、光応答溶解特性を観察した。その結果を図30に示す。図30(a)に示すように、pH4.0では十分量の紫外光を照射してもポリマー膜が溶解しなかった。図30(b)および図30(c)に示すように、pH5.0およびpH7.4では、紫外光照射に応答してポリマー膜が速やかに溶解した。なお、このpNBANIPAAmコート膜は、37℃、pH7.4の緩衝溶液に浸漬した状態で1ヶ月間不溶状態保った。その後、このpNBANIPAAmコート膜に光照射を行うと、鋭敏に溶解することが観察された。
pH4.0、pH5.0、およびpH7.4の各pH緩衝液(25℃)中で、NBA基の導入率が10mol%のpNBANIPAAmをコートした層に、直径100μmの微小水玉模様のパターンに沿って紫外光を照射し、光応答溶解特性を観察した。その結果を図30に示す。図30(a)に示すように、pH4.0では十分量の紫外光を照射してもポリマー膜が溶解しなかった。図30(b)および図30(c)に示すように、pH5.0およびpH7.4では、紫外光照射に応答してポリマー膜が速やかに溶解した。なお、このpNBANIPAAmコート膜は、37℃、pH7.4の緩衝溶液に浸漬した状態で1ヶ月間不溶状態保った。その後、このpNBANIPAAmコート膜に光照射を行うと、鋭敏に溶解することが観察された。
実施例41:pNBANIPAAmに固定されたポリエチレン微粒子の光リリース制御
NBA基の導入率が10mol%のpNBANIPAAmのTFE溶液に微量のポリエチレン微粒子を分散させた分散液をポリスチレン基材にキャストした。pNBANIPAAmを介してポリエチレン微粒子がポリスチレン基材表面に固定された試料を得た。顕微鏡で観察しながら、pH7.4のリン酸緩衝溶液中で、所定の微粒子凝集体が存在する領域に、波長365nmの光を基材底面から照射した。pNBANIPAAmが溶解して、光が照射された微粒子のみが選択的に浮上することが観察された。この結果を図31に示す。この結果から、手操作で基材から剥離できないような微小物体を、光制御で基材から剥離できることが実証された。
NBA基の導入率が10mol%のpNBANIPAAmのTFE溶液に微量のポリエチレン微粒子を分散させた分散液をポリスチレン基材にキャストした。pNBANIPAAmを介してポリエチレン微粒子がポリスチレン基材表面に固定された試料を得た。顕微鏡で観察しながら、pH7.4のリン酸緩衝溶液中で、所定の微粒子凝集体が存在する領域に、波長365nmの光を基材底面から照射した。pNBANIPAAmが溶解して、光が照射された微粒子のみが選択的に浮上することが観察された。この結果を図31に示す。この結果から、手操作で基材から剥離できないような微小物体を、光制御で基材から剥離できることが実証された。
実施例42:pNBANIPAAmに固定化された蛍光標識ウシ血清アルブミンの光リリース制御
NBA基の導入率が7mol%のpNBANIPAAmをポリスチレン基材上にコートした。ローダミンで蛍光標識されたウシ血清アルブミン(RBSA)のリン酸緩衝溶液(pH7.4)をこのpNBANIPAAm膜上に載せた。そして、37℃で30分間静置して、pNBANIPAAmの薄層を介して、RBSAが基材表面に固定された試料を得た。基材底面側からこの試料に微小の文字パターンの光を照射して、照射前後の蛍光分布を共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。図32(a)は、RBSAが光リリースされる様子を模式的に示している。図32(b)は、光照射前(左)と光照射後(右)のそれぞれの蛍光分布像である。図32(b)に示すように、光照射域のみから蛍光が消失した。すなわち、基材表面に固定されたRBSAが、局所光照射によって選択的に基材表面からリリースされた。
NBA基の導入率が7mol%のpNBANIPAAmをポリスチレン基材上にコートした。ローダミンで蛍光標識されたウシ血清アルブミン(RBSA)のリン酸緩衝溶液(pH7.4)をこのpNBANIPAAm膜上に載せた。そして、37℃で30分間静置して、pNBANIPAAmの薄層を介して、RBSAが基材表面に固定された試料を得た。基材底面側からこの試料に微小の文字パターンの光を照射して、照射前後の蛍光分布を共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。図32(a)は、RBSAが光リリースされる様子を模式的に示している。図32(b)は、光照射前(左)と光照射後(右)のそれぞれの蛍光分布像である。図32(b)に示すように、光照射域のみから蛍光が消失した。すなわち、基材表面に固定されたRBSAが、局所光照射によって選択的に基材表面からリリースされた。
実施例43:細胞接着阻害表面上のNBAコポリマーコート膜を用いた培養細胞のパターニングと光選択剥離
5mol%のメタクリル酸を含むpNIPAAmを0.20%、および両末端にグリシジル基を有するポリエチレングリコールを0.039%含む塩基性メタノール溶液をポリスチレン基材表面にスピンコートした。そして、80℃で2時間加熱することにより、細胞接着阻害表面を作製した。10mol%のNBA基および20mol%のNTBAAmを含むNIPAAmを1.3%、ならびに無修飾pNIPAAmを0.23%含むTFE溶液をこの細胞接着阻害表面にスピンコートし、85℃で1.5時間加熱した。
5mol%のメタクリル酸を含むpNIPAAmを0.20%、および両末端にグリシジル基を有するポリエチレングリコールを0.039%含む塩基性メタノール溶液をポリスチレン基材表面にスピンコートした。そして、80℃で2時間加熱することにより、細胞接着阻害表面を作製した。10mol%のNBA基および20mol%のNTBAAmを含むNIPAAmを1.3%、ならびに無修飾pNIPAAmを0.23%含むTFE溶液をこの細胞接着阻害表面にスピンコートし、85℃で1.5時間加熱した。
その後、pH7.4のリン酸緩衝水溶液を載せ、ドットパターンの反転パターンに沿って波長365nm、強度30mW/cm2の光を6秒間照射して、光照射域のブレンドポリマーを溶解し、ドットパターン状のブレンドポリマー層を得た。MDCK細胞を培地に分散した分散液をこのブレンドポリマー層上に播種し、半日培養した。この結果を図33に示す。
図33(a)に示すように、ドットパターン状のブレンドポリマー層上のみで細胞が接着伸展していることを確認した。そして、図33(b)に示すように、これらのドット領域の特定の約半数の箇所(横方向のストライプ状)に、波長365nm、強度30mW/cm2の光を40秒間照射した。その後、表面に培地を軽く吹き付けると、図33(c)に示すように、光照射されたストライプ状のドット領域のみから、細胞が選択的に剥離した。この結果から、光操作によって、細胞のパターニングと、細胞の選択的な剥離回収がそこからできることが実証された。
実施例44:NBAコポリマーを用いたひも状細胞組織体の形成
肝実質細胞やそれに由来する株化細胞の培養系を用いて、薬物等の肝代謝や肝毒性を評価する試みがなされている。しかし、一般的な培養方法では肝特異的機能がほとんど発現しないことが問題になっている。このため、機能低下を改善する手法として、細胞同士が凝集した組織体としての培養が検討されている。しかし、細胞集塊内部への酸素や栄養分の供給の難しさが課題となっている。そこで、組織体と基材の隙間を培地が流れる構造として、培養基材上に固定されたひも状の組織体構造を、NBA修飾ポリマーの光特性を応用して構築することを試みた。この構造の形成過程を図34に模式的に示す。
肝実質細胞やそれに由来する株化細胞の培養系を用いて、薬物等の肝代謝や肝毒性を評価する試みがなされている。しかし、一般的な培養方法では肝特異的機能がほとんど発現しないことが問題になっている。このため、機能低下を改善する手法として、細胞同士が凝集した組織体としての培養が検討されている。しかし、細胞集塊内部への酸素や栄養分の供給の難しさが課題となっている。そこで、組織体と基材の隙間を培地が流れる構造として、培養基材上に固定されたひも状の組織体構造を、NBA修飾ポリマーの光特性を応用して構築することを試みた。この構造の形成過程を図34に模式的に示す。
まず、ヒドロキシプロピルセルロースを0.30%、両末端にカルボキシル基を有するポリエチレングリコールを0.042%含む酸性メタノール溶液をポリスチレン基材表面にスピンコートした。そして、これを85℃で3時間加熱して、細胞接着阻害表面を作製した。その後、15mol%のNBA基と20mol%のNTBAAmを含むpNIPAAmの1.6%TFE溶液をこの細胞接着阻害表面にスピンコートした。これを85℃で1時間加熱した後、フィブロネクチンコートした。
pH7.4のリン酸緩衝水溶液中で、このフィブロネクチンコートにストライプ状のパターンで光照射して、光照射域から光応答ポリマー層を溶解除去した。そこにヒト肝実質細胞由来の株化細胞であるHepG2細胞を播種して、ストライプ状に残存した光応答ポリマー層上にパターン状に接着させた。2日間培養後、局所光照射によってHepG2細胞が接着した光応答ポリマー層の一部を残して基材表面から剥離し、基材から浮き上がったひも状の組織体が形成できることを確認した。この画像を図35に示す。
実施例45:NBAコポリマーを用いた培養機材からの光応答イオノマイシン供給
細胞培養系において、カルシウムイオンがmMオーダーの濃度で培地に含まれる。しかし、細胞膜に存在するカルシウムイオンポンプの働きによって、細胞培養系の細胞内では、カルシウムイオンがnMオーダーの非常に低い濃度に保たれている。細胞培養系の細胞にイオノマイシンを添加すると、イオノマイシンが細胞膜に取り込まれて細胞膜のカルシウム透過を誘起する。細胞膜のカルシウム透過が著しい場合には、細胞死が引き起こされる。この機構を図36に模式的に示す。
細胞培養系において、カルシウムイオンがmMオーダーの濃度で培地に含まれる。しかし、細胞膜に存在するカルシウムイオンポンプの働きによって、細胞培養系の細胞内では、カルシウムイオンがnMオーダーの非常に低い濃度に保たれている。細胞培養系の細胞にイオノマイシンを添加すると、イオノマイシンが細胞膜に取り込まれて細胞膜のカルシウム透過を誘起する。細胞膜のカルシウム透過が著しい場合には、細胞死が引き起こされる。この機構を図36に模式的に示す。
生理活性を有する化合物の光放出制御技術の例として、イオノマイシンを安定に固定化し、かつ任意のタイミングで任意の箇所に供給できる基材を調製した。10mol%のNBA基と50mol%のNTBAAmを含むpNIPAAmと、イオノマイシンを含むTFE溶液を、ポリスチレン基材表面にスピンコートした。この上にNIH/3T3細胞を播種し、半日培養した。その後、通常培地中で波長365nmの紫外光を局所照射すると、その照射領域のみで細胞死が引き起こされた。イオノマイシンの固定と光リリースの機構を図37(a)に模式的に示す。また、この局所的細胞死を示す画像を図37(b)に示す。
一方、光照射前に通常培地からカルシウムイオンを含まない培地に置換した場合には、光照射後に細胞死が誘起されなかった。この結果は、光照射によって引き起こされた細胞死が、イオノマイシンによってもたらされた細胞へのカルシウムイオンの流入であることを示している。また、NTBAAm含有量が20mol%のポリマーを用いた場合では、ポリマーのイオノマイシンの保持が不十分だった。このため、暗所でも、イオノマイシンがポリマーから培養系に放出され、細胞が全体的にダメージを受けることが観察された。さらに、NBA基のモノマー成分以外のモノマーがNTBAAmであるポリマーを用いた場合では、光照射によってもイオノマイシンは放出されず、細胞のダメージが誘起されなかった。
Claims (9)
- 請求項1において、
下記の化学式(2)で表される高分子化合物。
R1は、アルデヒド基または上記の化学式(1)で表される官能基であり、
R1とNO2は、隣り合った炭素原子にそれぞれ結合しており、
R2は、水素、アルキル基、下記の化学式(3)で表される官能基、および下記の化学式(4)で表される官能基の中から選ばれる少なくとも一種であり(R6およびR7は水素、アルキル基、または芳香環であり、R8はアルキル基である)、
Gは、ベンゼン環の水素と置換されてもよい3個以下のアルキル基であり、
wおよびzは、モル百分率を示し、0<w≦100、0≦z<100である。 - 基材と、前記基材の表面に設けられた請求項1から3のいずれかに記載の高分子化合物を含有する層とを有する複合材。
- 光源と、請求項4に記載の複合材とを有する光駆動アクチュエータ。
- 請求項4に記載の複合材の前記高分子化合物を含有する層の表面で細胞を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記高分子化合物を含有する層の表面の少なくとも一部の領域に光を照射する光照射工程と、
前記光照射工程で光を照射した領域に存在する細胞を除去する除去工程と、
を有する細胞操作方法。 - 請求項6において、
前記除去工程で、前記高分子化合物を含有する層の一部を水に溶かして、前記培養した細胞の一部を除去する細胞操作方法。
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