WO2017208589A1 - 細胞処理システム - Google Patents

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WO2017208589A1
WO2017208589A1 PCT/JP2017/012059 JP2017012059W WO2017208589A1 WO 2017208589 A1 WO2017208589 A1 WO 2017208589A1 JP 2017012059 W JP2017012059 W JP 2017012059W WO 2017208589 A1 WO2017208589 A1 WO 2017208589A1
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WO
WIPO (PCT)
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cell
cell culture
laser
cells
culture container
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/012059
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English (en)
French (fr)
Inventor
松本　潤一
Original Assignee
株式会社片岡製作所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社片岡製作所 filed Critical 株式会社片岡製作所
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Priority to US16/305,378 priority patent/US11441113B2/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/22—Transparent or translucent parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves

Definitions

  • the present invention relates to a cell processing system for growing unnecessary cell aggregates by killing unnecessary cells among cells cultured on a cell culture vessel.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the cell aggregate used for the purpose of regenerative medicine to supplement a patient's injured tissue or organ is mixed with defective or unnecessary cells, not only the original effect may not be exhibited, but also tumorigenesis and others Can also have a negative impact on the health of patients.
  • discarding the entire culture container in which unnecessary cells are mixed leads to a decrease in the yield (yield) of target cells or tissues, and increases the cost of regenerative medicine.
  • the purpose of the present invention is to make it easier to harvest cell aggregates of a desired size.
  • the present invention is a system for growing unnecessary cell aggregates by killing unnecessary cells among cells cultured on a cell culture container, and imaging apparatus for imaging part or all of the cell culture container And an analysis unit that calculates the area or size of each of one or a plurality of cell aggregates present on the cell culture container based on pixel values constituting an image captured by the imaging device
  • a display device that displays the area or size of each cell aggregate calculated by the analysis unit on a screen and irradiating a laser toward the cell culture container to kill cells existing on the cell culture container
  • a cell processing system including a control unit that controls an irradiation position when irradiating a laser toward a culture container was configured.
  • the analysis unit stores an upper limit value or a lower limit value for the area or size of the cell aggregate, and the area or dimension of each cell aggregate present on the cell culture container is the upper limit value or It is determined whether or not a lower limit is exceeded, and the display device displays a determination result for each cell aggregate existing on the cell culture container by the analysis unit on a screen. preferable.
  • the present invention also provides a system for killing unnecessary cells out of cells cultured on a cell culture container to grow a necessary cell aggregate, and images part or all of the cell culture container. Based on the imaging device and the pixel values constituting the image captured by the imaging device, each area or size of one or a plurality of cell aggregates existing on the cell culture container is calculated. The upper limit value or lower limit value of the area or size of the cell aggregate is stored, and the area or size of each cell aggregate present on the cell culture container does not exceed the upper limit value or the lower limit value.
  • An analysis unit for determining whether or not, a laser irradiation device for letting cells existing on the cell culture container to die by irradiating the laser toward the cell culture container, and a determination result by the analysis unit. Configured cell processing system and a control unit for controlling the irradiation position when irradiating a laser toward the cell culture vessel from said laser irradiation apparatus Te.
  • control unit irradiates a laser to kill a cell aggregate having a smaller area or size than the lower limit value among the cell aggregates existing on the cell culture container, the area is smaller than the upper limit value.
  • the laser irradiation apparatus is controlled so as to irradiate a laser to cut a large-sized cell aggregate or reduce its area or size, the size of the cell aggregate on the cell culture vessel Can be evenly aligned.
  • the graph which shows notionally the relationship between the elapsed time from the culture
  • the cell processing system of the present embodiment includes an imaging device 6 that images part or all of a cell culture container 1 for culturing cells, and an image captured by the imaging device 6.
  • the analysis unit 51 for obtaining each feature quantity of one or a plurality of cell aggregates 9 existing on the cell culture vessel 1, and the feature quantity of each cell aggregate 9 obtained by the analysis unit 51 is displayed on the screen
  • a display device 7 that displays and presents to the user, a laser irradiation device 3 that kills unnecessary cells existing on the cell culture container by irradiating the laser toward the cell culture container 1, and a user's hand
  • the input device 8 that receives the operation input by the control unit 52 and the control unit 52 that controls the irradiation position when the laser irradiation device 3 irradiates the cell culture container 1 with the laser.
  • the laser irradiation device 3 irradiates one or a plurality of cell culture vessels 2 supported by the support 2 with a laser beam L, and kills specific cells among the cells cultured on the cell culture vessels 1.
  • a laser irradiation process is performed.
  • the laser irradiation device 3 includes a laser light source 31, a processing nozzle 33 that emits the laser light L supplied from the laser light source 31 toward the cell culture container 1, and the laser light source 31 and the processing.
  • An optical system 32 that is interposed between the nozzle 33 and guides the laser light L output from the laser light source 31 to the processing nozzle 33 is provided.
  • the laser light source 31 is a device that oscillates a continuous wave laser or a pulse laser (which may be a high frequency laser having a long pulse width close to a continuous wave) L.
  • the wavelength of the laser L to be used is not limited uniquely, and for example, a visible light laser or an infrared laser of 405 nm, 450 nm, 520 nm, 532 nm, 808 nm or the like can be employed. However, it is necessary to select a wavelength such that the irradiated layer 12 of the cell culture vessel 1 described later can absorb the energy of the laser L.
  • an ultraviolet laser having a wavelength of 380 nm or less may be absorbed by DNA or protein, and there is a concern about the influence on cells. Therefore, the wavelength of the laser L is preferably longer than 380 nm.
  • a continuous wave diode laser with a maximum output of 5 W having a wavelength in the vicinity of 405 nm is assumed as the laser light source 31.
  • the processing nozzle 33 incorporates a lens for condensing the laser light L to be irradiated on the irradiated layer 12 of the cell culture container 1, a shutter or a mirror for switching ON / OFF of emission of the laser light L, and the like. .
  • the processing nozzle 33 is located below the cell culture container 1 supported by the support 2 and emits a laser L upward.
  • the optical axis of the laser beam L emitted from the processing nozzle 33 is substantially orthogonal to the irradiated layer 12 of the cell culture container 1.
  • the optical system 32 for propagating the laser L from the laser light source 31 toward the processing nozzle 33 can be configured using any optical element such as an optical fiber, a mirror, or a lens.
  • the displacement mechanism 4 for manipulating the irradiation position of the laser beam L with respect to the cell culture container 1 causes the processing nozzle 33 of the laser irradiation apparatus 3 to be displaced relative to the cell culture container 1 supported by the support 2.
  • the XY stage 4 is a known one that can move an object at high speed and precisely along the X-axis direction (left-right direction) and the Y-axis direction (front-rear direction) via a linear motor carriage or the like.
  • the processing nozzle 33 is supported by the XY stage 4 and the processing nozzle 33 is moved relative to the support 2 and the cell culture container 1.
  • the support 2 may be supported by the XY stage 4 and the support 2 and the cell culture container 1 may be moved with respect to the processing nozzle 33.
  • the displacement mechanism 4 irradiates the irradiated layer 12 of the cell culture vessel 1 with the laser L while keeping the angle at which the irradiated layer 12 of the cell culture vessel 1 intersects the optical axis of the laser beam L substantially constant. The position can be displaced.
  • the cell culture container 1 in the present embodiment generates heat and / or acid upon irradiation of the laser beam L to the container body 11 that can transmit the laser beam L emitted from the processing nozzle 33.
  • the irradiated layer 12 which is a layer containing the photoresponsive material to be provided is provided.
  • the container body 11 is made of a material such as plastic or glass having transparency or translucency that transmits light in a wavelength band to which the laser L emitted from the processing nozzle 33 belongs.
  • plastics include polystyrene polymers, acrylic polymers (polymethyl methacrylate (PMMA), etc.), polyvinylpyridine polymers (poly (4-vinylpyridine), 4-vinylpyridine-styrene copolymers, etc.), silicone Polymers (polydimethylsiloxane, etc.), polyolefin polymers (polyethylene, polypropylene, polymethylpentene, etc.), polyester polymers (polyethylene terephthalate (PET), polyethylene naphthalate (PEN), etc.), polycarbonate polymers, epoxy polymers, etc.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PEN polyethylene naphthalate
  • polycarbonate polymers epoxy polymers, etc.
  • a ready-made culture vessel may be used as the vessel body 11 as it is.
  • the shape of the container body 11 can be a dish shape, a multi-dish shape, a flask shape, or the like, similar to a ready-made culture vessel.
  • the light transmittance of the container body 11 produced using polystyrene resin is very high, and is 85% or more at a light wavelength of about 380 nm or more. However, at a light wavelength of about 380 nm or less, the light transmittance decreases as the light wavelength decreases, that is, the absorption of light by the container body 11 increases. This is probably due to impurities contained in the polystyrene material.
  • the irradiated layer 12 is preferably composed of a polymer (polymer) containing a dye structure (chromophore) that absorbs light in the wavelength band to which the laser L emitted from the processing nozzle 33 belongs.
  • a dye structure chromophore
  • the dye structure that absorbs the laser beam L include organic compounds such as azobenzene, diarylethene, spiropyran, spirooxazine, fulgide, leuco dye, indigo, carotenoid (such as carotene), flavonoid (such as anthocyanin), and quinoid (such as anthraquinone).
  • Examples of the skeleton constituting the polymer include acrylic polymers, polystyrene polymers, polyolefin polymers, polyvinyl acetate and polyvinyl chloride, polyolefin polymers, polycarbonate polymers, and epoxy polymers.
  • a raw material solution containing the above-described dye structure-containing polymer or a raw material solution in which the dye structure-containing polymer is dissolved in a solvent (1,2-dichloroethane, methanol, etc.) is applied to the container body 11 by spin coating or casting. If it is applied to the opposite surface, that is, the bottom of the well 10 and cured, it is possible to form the irradiated layer 12 that is irradiated with the laser light L and generates heat.
  • the irradiated layer 12 having an average thickness of 70 nm is laid on the bottom of the well 10.
  • dye which absorbs the laser beam L in the constituent material of the container main body 11, or producing the container main body 11 by using the pigment structure-containing polymer as a material the irradiation with the laser beam L generates heat.
  • the irradiated layer 12 to be irradiated may be formed.
  • the light absorptance of the irradiated layer 12 having a predetermined thickness constituted by coating the container body 11 with a polymer having azobenzene as a dye structure has a peak at about 60% when the light wavelength is about 360 nm. Decreases as the length increases from about 360 nm.
  • the light absorption rate of the irradiated layer 12 is less than 20% in the region where the light wavelength is about 425 nm or more. However, even if the light wavelength becomes longer, there is a certain degree of light absorption, and the irradiated layer 12 can sufficiently absorb the laser light L having a wavelength of 405 nm, 450 nm, 520 nm, or 532 nm. .
  • a photoacid generator that generates an acidic substance upon irradiation with the laser light L may be used together with or in place of the above-described dye structure-containing polymer.
  • the photoacid generator is composed of a dye structure (chromophore) that absorbs light in the wavelength band to which the laser L emitted from the processing nozzle 33 belongs, and an acidic substance after decomposition. It is preferable to have a structure with an acid precursor.
  • a sulfonic acid derivative, a carboxylic acid ester, an onium salt, a photoacid generating group having a nitrobenzaldehyde structure, and the like correspond to such a photoacid generator.
  • a thioxanthone-based sulfonic acid derivative (sulfonic acid 1,3,6-trioxo-3,6-dihydro-1H-11-thia-azacyclopenta [a] anthracene -2-yl ester) and naphthaleneimide-based sulfonic acid derivatives (sulfonic acid 1,8-naphthalimide, etc.).
  • sulfonic acid derivatives such as disulfones, disulfonyldiazomethanes, disulfonylmethanes, sulfonylbenzoylmethanes, imide sulfonates, and benzoin sulfonates can also be employed.
  • carboxylic acid esters there may be mentioned 1,8-naphthalenedicarboxylic acid imide methylsulfonate or 1,8-naphthalenedicarboxylic acid imide tosyl sulfonates, examples of the onium salts, tetrafluoroborate (BF 4 - ), A sulfonium salt or an iodonium salt having an anion such as hexafluorophosphate (PF 6 ⁇ ), hexafluoroantimonate (SbF 6 ⁇ ), and the like.
  • PF 6 ⁇ hexafluorophosphate
  • SBF 6 ⁇ hexafluoroantimonate
  • a raw material liquid containing the above-mentioned photoacid generator in a plastic especially acrylic polymer or polystyrene polymer such as PMMA), or the photoacid generator in a solvent (1,2-dichloroethane, methanol, etc.
  • a solvent especially 1,2-dichloroethane, methanol, etc.
  • Light absorption rate of irradiated layer 12 having a predetermined thickness formed by coating container body 11 with a polymer containing a thioxanthone-based sulfonic acid derivative having a thioxanthone skeleton as a dye structure and a sulfonic acid as an acid precursor are distributed over a range of light wavelengths from about 375 nm to about 460 nm.
  • the irradiated layer 12 cannot absorb light having a wavelength outside this range. Therefore, if the laser beam L has a wavelength of 405 nm or 450 nm, it can be absorbed by the irradiated layer 12.
  • the light absorption rate of the irradiated layer 12 is smaller than the light absorption rate of the irradiated layer 12 configured using a polymer having azobenzene as a dye structure, and the visible light region has a light wavelength of about 400 nm to about 700 nm. And cut 20% (or 10%).
  • the irradiated layer 12 is preferably formed using a material that does not emit fluorescence when irradiated with the laser beam L.
  • the thickness of the irradiated layer 12 is preferably 10 ⁇ m or less.
  • the surface of the irradiated layer 12 of the cell culture container 1 may be coated with a material for enhancing cell adhesion, for example, ECM (extracellular matrix) such as laminin or matrigel.
  • ECM extracellular matrix
  • a medium (particularly a liquid medium) 13 is filled in the well 10 formed in the container body 11 of the cell culture container 1.
  • the medium 13 is located immediately above the irradiated layer 12 laid on the bottom of the well 10.
  • the cultured cells grow while adhering to the surface of the irradiated layer 12 to form a cell aggregate 9.
  • L is irradiated to a portion directly under the cell to be killed in the irradiated layer 12 of the cell culture vessel 1 supported by the support 2.
  • the processing nozzle 33 is disposed below the cell culture container 1, and the laser light L launched from the processing nozzle 33 is transmitted through the container main body 11, and the irradiated layer 12 is irradiated from the back side.
  • the lens built in the processing nozzle 33 focuses the laser beam L emitted from the processing nozzle 33 on the irradiated layer 12 of the cell culture container 1.
  • the portion of the irradiated layer 12 that has been irradiated with the laser light L absorbs the energy of the laser light L to generate heat and / or acid, and the heat causes the cells present immediately above the portion to die.
  • a photoacid generator is used as the constituent material of the irradiated layer 12, an acidic substance is generated at the location irradiated with the laser light L in the irradiated layer 12, and the acidic substance is directly above the location. Promotes death of cells existing in the layer or detachment from the irradiated layer 12.
  • the photoacid generator is a sulfonic acid derivative
  • the generated acidic substance is a sulfonic acid.
  • the wavelength of the laser light is, for example, 405 nm.
  • the magnitude of the output of the laser L is between 0.4 W and 5 W. Of course, the output may exceed 5W.
  • the beam diameter of the laser L is 50 ⁇ m or less. The beam diameter may be reduced to about 20 ⁇ m to 25 ⁇ m.
  • the scanning speed for moving the processing nozzle 33 that is, the laser beam L
  • the scanning speed for moving the processing nozzle 33 that is, the laser beam L
  • the scanning speed for moving the processing nozzle 33 that is, the laser beam L
  • the scanning speed for moving the processing nozzle 33 that is, the laser beam L
  • the scanning speed for moving the processing nozzle 33 that is, the laser beam L
  • the scanning speed for moving the processing nozzle 33 that is, the laser beam L
  • the scanning speed for moving the processing nozzle 33 that is, the laser beam L
  • the scanning speed for moving the processing nozzle 33 that is, the laser beam L
  • the amount of energy (energy density) per unit area given by the laser light L at the irradiation position of the laser light L is about 8.7 J / cm 2 .
  • the wavelength, output, and energy amount of the laser beam L are such that even if the laser beam L is directly applied to the cells, the cells do not die. It can lead to death accurately.
  • the wavelength of the laser beam L irradiated to the irradiated layer 12 is set to some extent from the irradiation of the laser beam L so that the cell to be killed does not die immediately (such a cell is alive several minutes or ten minutes after the irradiation of the laser L). It is preferable to adjust the size so that it will die after a lapse of time (for example, several tens of minutes, one hour to several hours later, typically 60 minutes or 120 minutes later). It is actually possible to create a situation in which the target cell is alive immediately after irradiation with the laser light L, and the cell dies after a certain amount of time has elapsed since the irradiation.
  • the width or range of cells can be killed by adjusting the output of the laser L or the amount of energy per unit area. As the output of the laser L and / or the amount of energy per unit area increases, the width or range of cell death increases. In addition, it is considered that the time required from the irradiation of the laser L to the death of unnecessary cells is shorter as the output of the laser L and / or the amount of energy per unit area is larger.
  • the cell does not die immediately if it is irradiated once at a position immediately below the cell to be killed in the irradiated layer 12 (the cell survives several minutes or a few tens of minutes after the laser L irradiation). It is also preferable to irradiate the laser beam L having such an output or energy amount a plurality of times. By such a process, the time required from the irradiation of the laser light L to the death of the target cell can be shortened while minimizing the thermal influence on cells other than the cells to be killed.
  • the suitable conditions for the output of the laser L and / or the amount of energy per unit area used for the laser irradiation treatment are affected by the constituent material and thickness of the irradiated layer 12 provided in the cell culture vessel 1.
  • the amount of heat per unit area generated by the irradiated layer 12 that has been irradiated with the laser light L by absorbing the energy of the laser light L is equal to the amount of energy per unit area of the laser light L irradiated to the irradiated layer 12.
  • the irradiation layer 12 having a unit area is multiplied by a light utilization rate which is a ratio that can be used by absorbing the energy of the laser light L.
  • This light utilization rate depends on the property of the constituent material of the irradiated layer 12, that is, the light absorptance, as well as the material contributing to the photothermal reaction that absorbs the laser light L and generates heat. It varies depending on how much is present per unit area. If the coating thickness of the constituent material applied to form the irradiated layer 12 on the container body 11 is increased, the amount of the material contributing to the photothermal reaction increases, and the light utilization rate of the irradiated layer 12 in the unit area also increases. To do. Accordingly, the amount of heat per unit area generated in the irradiated layer 12 increases, and the cells are more likely to die. Therefore, it is necessary to experimentally determine the output of the laser L and / or the energy amount per unit area suitable for the cell killing process in accordance with the light utilization rate of the irradiated layer 12 provided in the cell culture vessel 1.
  • the imaging device 6 captures an image of cultured cells or cell aggregates 9 on the cell culture vessel 1 obtained through, for example, a phase contrast microscope, using a solid-state imaging device (image sensor) such as a CCD or CMOS. .
  • the display device 7 is a known liquid crystal display or the like.
  • the input device 8 is a pointing device such as a touch panel, a track pad, or a mouse that can be operated by a user with a finger, a keyboard, a push button, or the like.
  • a touch panel as the input device 8 may be provided so as to overlap the screen of the display as the display device 7.
  • the processing nozzle 33 of the laser irradiation apparatus 3, the cell culture vessel 1 during the laser irradiation process, and the support 2 are disposed in the processing chamber 0 in an atmosphere equivalent to a CO 2 incubator.
  • the CO 2 incubator maintains the cell culture environment, for example, the pH of the medium filled in the cell culture vessel 1 in a suitable state by adjusting the temperature of the internal atmosphere, the CO 2 concentration and the temperature. To play a role.
  • the imaging of the cell culture container 1 by the imaging device 6 may be performed inside the processing chamber 0 or outside the processing chamber 0.
  • the analysis unit 51 and the control unit 52 are configured by a general-purpose personal computer, a server computer, a workstation, or the like, or a computer 5 similar thereto.
  • the computer 5 includes a CPU 5a, a main memory 5b, an auxiliary storage device 5c, a video codec 5d, an I / O interface 5e, and the like, which are controllers (system controller, I / O controller, etc.). It is controlled by 5f and cooperates.
  • the auxiliary storage device 5c is a flash memory, a hard disk drive, or the like.
  • the video codec 5d generates a screen to be displayed based on the drawing instruction received from the CPU 5a, and transmits the screen signal to the display device 7 (Graphics Processing Unit), and temporarily stores the screen and image data.
  • a video memory or the like to be stored is used as an element.
  • the I / O interface 5e is a device for communicating with and controlling the laser light source 31, the XY stage 4, the input device 8, the imaging device 6, and the like.
  • the I / O interface 5e may include a servo driver (servo controller).
  • the program to be executed by the computer 5 is stored in the auxiliary storage device 5c, and is read into the main memory 5b and decoded by the CPU 5a when the program is executed. And the computer 5 demonstrates the function as the analysis part 51 and the control part 52 in this cell culture system according to a program.
  • the analysis unit 51 is present on one or a plurality of cell aggregates 9 shown in the image, that is, on the cell culture container 1 to be imaged, based on the pixel values constituting the image captured by the imaging device 6.
  • the position and range of each of the one or a plurality of cell aggregates 9 are detected.
  • at least the area or size (diameter or the like) of each cell aggregate 9 is calculated as the feature amount.
  • the maximum width (in other words, the long diameter) of the cell aggregate 9 may be obtained, or the minimum width (in other words, the short diameter) may be obtained. .
  • the analysis unit 51 transmits, as a feature quantity of the cell aggregate 9 existing on the cell culture vessel 1, based on the pixel value of the captured image, the transmission of each cell aggregate 9 reflected in the image.
  • the index value of the shape of each cell assembly 9 shown in the image for example, the roundness, the cell density of each cell assembly 9 and the like may be calculated.
  • each cell aggregate 9 reflected in the said image based on the pixel value of the imaged image as a feature-value of the cell aggregate 9 which exists on the cell culture container 1.
  • FIG. By identifying the type of the cell, which cell aggregate 9 present on the cell culture vessel 1 is a necessary cell for the purpose of culture (in other words, which cell aggregate 9 is unnecessary other than the target cell) It is possible to determine which part of each cell assembly 9 is a target cell and which part is an unnecessary cell.
  • undifferentiated ES cells or undifferentiated iPS cells existing on the cell culture vessel 1 can be stained alive and have low cytotoxicity.
  • a fluorescent marker (lectin probe rBC2LCN that binds to a sugar chain present on the surface of an undifferentiated cell) already exists. If this fluorescent marker is used in the culture of ES cells or iPS cells, undifferentiated ES cells or undifferentiated iPS cells, which are target cells present in the cell culture vessel 1, can be stained.
  • the analysis unit 51 analyzed which cell aggregate 9 existing on the cell culture container 1 is the target cell, or which part of each cell aggregate 9 is the target cell and which part is the unnecessary cell. In this case, only the portion occupied by the target cell in the target cell aggregate 9 is detected when calculating the area or size of each cell aggregate 9, the feature amount such as the transparency and the roundness. It is preferable to obtain the area or size, permeability, roundness, etc. of the part.
  • the analysis unit 51 stores and holds the upper limit value and / or the lower limit value for the characteristic amount of the cell aggregate 9 that should be, using a required storage area of the main memory 5c or the auxiliary storage device 5c. Then, it is determined whether or not the feature amount of each cell aggregate 9 on the cell culture container 1 obtained through image analysis exceeds the upper limit value and / or the lower limit value.
  • FIG. 6 conceptually shows the relationship between the elapsed time from the start of culture and the area or size of the normal cell assembly 9.
  • the solid line represents the lower limit of the appropriate range of the area or size of the cell assembly 9
  • the broken line represents the upper limit of the appropriate range of the area or size of the cell assembly 9.
  • the shaded area is an appropriate range of the area or size of the cell assembly 9.
  • the upper limit value and the lower limit value of the area or size of the normal cell aggregate 9 can vary depending on the length of the culture time.
  • the cell aggregate 9 whose area or dimension deviates from an appropriate range according to the culture time is not used for the next stage of culture in the cell culture vessel 1, for example, subculture or differentiation induction.
  • the cell aggregate 9 having an area or dimension smaller than the lower limit of the appropriate range is considered to be a defective aggregate 9 in which cells are not proliferating well and does not grow according to the culture time.
  • the cell aggregate 9 having an area or size larger than the upper limit of the appropriate range has a growth rate exceeding the assumption although the cell proliferation itself has progressed. When used for differentiation induction, it may cause variation in the growth state of cells after passage or differentiation.
  • the analysis unit 51 determines whether the area or size of each cell assembly 9 on the cell culture container 1 calculated through the image analysis has deviated from an appropriate range according to the culture time.
  • Each cell aggregate 9 indicates whether it should be kept alive, killed, cut or trimmed.
  • the cell aggregate 9 having an area or dimension within an appropriate range should be kept alive.
  • the cell aggregate 9 having an area or dimension smaller than the lower limit is defective and should be killed.
  • the cell aggregate 9 is cut into a plurality of cell aggregates 9 having an area or dimension within an appropriate range, or one of the cell aggregates 9 is selected. Cells (particularly, cells at the periphery of the cell aggregate 9) are killed to reduce their area or size.
  • the computer 5 displays on the screen of the display device 7 the information on the characteristic amount of each cell aggregate 9 present on the cell culture vessel 1 analyzed by the analysis unit 51.
  • 7 to 9 show screen display examples of the feature values of the respective cell aggregates 9.
  • the position of a large number of cell aggregates 9 existing on the cell culture container 1 is displayed in the left region 61 together with the entire captured image of one cell culture container 1.
  • the dimension (diameter), which is the feature amount, and the dimension of the cell aggregate 9 are within the appropriate range for each cell aggregate 9 present on the cell culture vessel 1 in the right region 62.
  • a list of determination results (whether cell aggregate 9 having a diameter smaller than the lower limit value is “lethal” and cell aggregate 9 having a diameter larger than the upper limit value is “trimming”) is displayed in a list.
  • FIGS. 8 and 9 an enlarged photographed image of one cell assembly 9 selected by the user from among the cell assemblies 9 present on the cell culture container 1 is shown in the left region 61. Yes.
  • the outline 63 drawn on the enlarged image is the outer edge of the area determined by the analysis unit 51 that has analyzed the captured image of the cell culture container 1 as one cell aggregate 9.
  • An operation input for designating which enlarged cell image of the cell aggregate 9 is displayed by the user's hand is received via the input device 8.
  • FIG. 8 is a screen display example of a cell aggregate 9 whose dimensions are smaller than the lower limit value and should be killed
  • FIG. 9 is a screen display example of a cell aggregate 9 whose dimensions are larger than the upper limit value and to be cut or trimmed.
  • a circle 64 drawn on the inner side of the outline 63 is a trimming that kills cells in the periphery of the target cell assembly 9 (that is, outside the circle 64).
  • the expected size of the cell assembly 9 obtained as a result of executing is shown. That is, the outline 63 and the circle 64 represent the range of cells that are killed in the trimming.
  • the analysis unit 51 calculates a feature amount other than the area or size of the cell aggregate 9 existing on the cell culture container 1, for example, the roundness of the shape of the cell aggregate 9, the cell density, etc.
  • the roundness of each cell aggregate 9 can be displayed on the screen of the display device 7.
  • the analysis unit 51 determines which of the cell aggregates 9 existing on the cell culture vessel 1 is the target cell, which part of each cell aggregate 9 is the target cell, and which part is the unnecessary cell. Is analyzed, the screen of the display device 7 is displayed in such a manner that the user can visually recognize at which position in the cell culture container 1 the target cell is present or at which position the unnecessary cell is present. Is preferably displayed.
  • the conditions for determination by the analysis unit 51 can be arbitrarily set.
  • the cell aggregate 9 has a permeability comparison with its upper limit value and / or lower limit value, cell size Comparison of roundness of aggregate 9 and its upper limit value and / or lower limit value, comparison of cell density of cell aggregate 9 and its upper limit value and / or lower limit value, whether cell is target cell It is possible to determine whether each cell assembly 9 should be kept alive, killed, cut or trimmed based on whether or not.
  • a combination of a plurality of feature amount conditions for the cell aggregate 9 may be used to determine whether the target cell aggregate should be kept alive, killed, or cut or trimmed.
  • the area or size of the cell assembly 9 is within an appropriate range between the lower limit value and the upper limit value, and the roundness of the cell assembly 9 is within the appropriate range between the lower limit value and the upper limit value. It may be determined that the cell assembly 9 should be utilized by satisfying the AND condition such that the cell assembly 9 is within the range, or the area or size of the cell assembly 9 is between the lower limit value and the upper limit value.
  • the cell aggregate 9 is determined to be alive by satisfying the OR condition that the cell aggregate 9 is within an appropriate range or the cells constituting the cell aggregate 9 are clearly target cells. It may be.
  • the control unit 52 controls the irradiation position when the laser L is irradiated from the processing nozzle 33 of the laser irradiation device 3 toward the cell culture container 1.
  • the cells directly under the cells to be killed in the irradiated layer 12 of the cell culture container 1 are used. It is necessary to irradiate the laser beam L only to the place.
  • An operation input for designating which cell or cell aggregate 9 is killed by the user's hand or which cell or cell aggregate 9 is allowed to survive without being killed is accepted via the input device 8.
  • the laser L is irradiated to a range other than the area occupied by the designated cell or cell aggregate 9 in the cell culture container 1.
  • the computer 5 determines which position or which range in the cell culture vessel 1 is irradiated with the laser L and which position or which range is not irradiated with the laser L according to the determination result by the analysis unit 51. .
  • the analysis unit 51 determines that, among the cell aggregates 9 existing on the cell culture container 1, the cell aggregate 9 whose area or dimension is within an appropriate range of the lower limit value and the upper limit value is to survive.
  • the cell aggregate 9 smaller than the lower limit value is determined to be killed, and the cell aggregate 9 larger than the upper limit value is determined to be cut or trimmed. Further, when the roundness of the shape of each cell aggregate 9 is calculated, the cell aggregate 9 whose roundness is smaller than the lower limit value stored in the main memory 5b or the auxiliary storage device 5c.
  • the cell aggregate 9 whose density is smaller than the lower limit value or larger than the upper limit value stored in the main memory 5b or the auxiliary storage device 5c. Determines that this is lethal.
  • the upper limit value and / or the lower limit value of the roundness of the normal cell assembly 9 and the density of the cells can vary depending on the length of time that has elapsed since the start of cell culture.
  • the type of the cell or cell aggregate 9 existing on the cell culture vessel 1 is determined through image analysis, it is determined that the necessary target cells are allowed to survive and other unnecessary cells are killed.
  • a plurality of feature amount conditions for the cell aggregate 9 are combined with AND or OR to determine whether the target cell aggregate should be kept alive, killed, cut or trimmed. It doesn't matter.
  • the cell treatment system of the present embodiment can take any of the above (I) to (III). That is, the control unit 52 obtains XY coordinates of one or a plurality of irradiation positions in the cell culture container 1 belonging to an area designated as a position or a range where the user should irradiate the laser L with his / her hand. Alternatively, the laser L should be irradiated to a region in the cell culture vessel 1 other than the region occupied by the cell aggregate 9 of the target cells to be alive, in other words, a region where unnecessary cells and other cells to be killed may exist. The region is specified, and XY coordinates of one or a plurality of irradiation positions belonging to the region are obtained. Then, the XY coordinates of the irradiation position are temporarily stored in the main memory 5b or the auxiliary storage device 5c.
  • the irradiated layer 12 of the cell culture container 1 is used.
  • the cell L on the boundary line 91 is killed by irradiating a laser L to a location immediately below the boundary line 91 that cuts the target cell aggregate 9 into a plurality of portions. Therefore, the control unit 52 obtains a plurality of XY coordinates located on the boundary line 91 as coordinates of the irradiation position of the laser L.
  • the control unit 52 obtains a plurality of XY coordinates belonging to the outer peripheral edge portion 92 as coordinates of the irradiation position of the laser L.
  • the control unit 52 turns ON / OFF the emission of the laser L from the processing nozzle 33 toward the irradiated layer 12 of the cell culture container 1 and the output intensity of the laser L irradiated to the irradiated layer 12, that is, the energy of the laser L. Control the amount. Specifically, a signal for instructing ON / OFF of emission of the laser L from the processing nozzle 33 is given to the processing nozzle 33 via the I / O interface 5e, and a signal for controlling the output of the laser L is supplied to the I / O. This is applied to the processing nozzle 33 or the laser light source 31 via the interface 5e.
  • control unit 52 operates the XY stage 4 supporting the processing nozzle 33 to move the processing nozzle 33 toward the XY coordinates of the irradiation position of the laser L, and the laser beam emitted from the processing nozzle 33.
  • the L optical axis is positioned at the XY coordinates. Specifically, a command signal corresponding to the XY coordinates of the irradiation position of the laser L is given to the XY stage 4 via the I / O interface 5e. If laser beam L is moved according to the time series of the XY coordinates of the irradiation position while emitting continuous wave laser L or a high frequency pulse laser L close to continuous wave from processing nozzle 33, laser L is cell-cultured.
  • the control unit 52 performs raster scan on the cell culture container 1 (irradiated layer 12) of the region other than the region designated by the user or the region occupied by the cell aggregate 9 to be alive by the optical axis of the processing nozzle 33.
  • the laser L is emitted from the processing nozzle 33 at the timing when the optical axis of the processing nozzle 33 reaches just below the cell to be killed. As a result, a state is realized in which unnecessary cells located in the above region die and only the cell aggregate 9 of necessary target cells is alive in the cell culture container 1.
  • the cell processing system of this embodiment is useful for reliably harvesting the aggregate 9 of target cells having a certain size when a certain cell period has passed since the start of the culture of the target cells.
  • the period from the start of the culture using the cell culture vessel 1 to the end thereof, that is, the start of passage or differentiation induction is about 7 days.
  • defective cells that are slow-growing are killed and thinned out, and the rapidly growing cell aggregate 9 is cut or trimmed to reduce its size. This makes it possible to reliably harvest iPS cell aggregates 9 having a size suitable for passage at a time point seven days after the start of culture.
  • the cell aggregate 9 is still remarkably small for about two days after the seeding of the iPS cells into the cell culture container 1, the imaging of the cell culture container 1 using the present cell processing system, image analysis, and laser L
  • the thinning, cutting or trimming process of the cell aggregate 9 by irradiation starts from the point when three days have elapsed from the start of the culture.
  • the number of cells in the cell culture vessel 1 increases as the day elapses from the start of cell culture, and the rate of proliferation thereof exponentially accelerates.
  • the cycle of performing the thinning, cutting, or trimming process of the cell aggregate 9 by imaging, image analysis, and laser L irradiation of the cell culture container 1 is shortened as the elapsed time from the start of cell culture increases.
  • the cell aggregate is injected by injecting a culture solution or other liquid into the well 10 of the cell culture container 1 (or by applying the culture solution or other liquid to the cell assembly 9). 9 can be lifted and collected.
  • an enzyme may be used.
  • a system for growing unnecessary cell aggregates 9 by killing unnecessary cells among cells cultured on the cell culture vessel 1, a part or all of the cell culture vessel 1 is used.
  • the area of each of the one or a plurality of cell aggregates 9 existing on the cell culture container 1 based on the imaging device 6 for imaging and the pixel values constituting the image captured by the imaging device 6
  • the analysis unit 51 that calculates the size
  • the display device 7 that displays the area or size of each cell assembly 9 calculated by the analysis unit 51 on the screen, and the laser L toward the cell culture vessel 1
  • the laser irradiation device 3 that kills the cells existing on the cell culture container 1 and the user's hand kills any of the cells existing on the cell culture container 1 by laser L irradiation or Laser L illumination
  • An input device 8 that receives an operation input that designates whether or not to survive without operating, or an operation input that designates which position on the cell culture vessel 1 is irradiated with the laser L or not irradiated with the laser L;
  • the analysis unit 51 stores an upper limit value or a lower limit value for the area or size of the cell aggregate 9, and the area or size of each cell aggregate 9 present on the cell culture vessel 1 is the upper limit. Determine whether the value or lower limit is exceeded.
  • the display device 7 displays the determination result for each cell aggregate 9 existing on the cell culture vessel 1 by the analysis unit 51 on the screen.
  • it is a system for killing unnecessary cells among the cells cultured on the cell culture container 1 and growing the necessary cell aggregate 9, which is a part of the cell culture container 1 or Each of the one or a plurality of cell aggregates 9 existing on the cell culture container 1 based on the image pickup device 6 that picks up the whole image and the pixel values constituting the image picked up by the image pickup device 6
  • the upper limit value or lower limit value for the area or size of the cell assembly 9 is stored, and the area or size of each cell assembly 9 existing on the cell culture container 1 is calculated.
  • An analysis unit 51 that determines whether or not the upper limit value or the lower limit value has been exceeded, and a laser that kills cells existing on the cell culture container 1 by irradiating the cell culture container 1 with the laser L Irradiation 3 and a control unit 52 that controls the irradiation position when irradiating the laser L from the laser irradiation device 3 toward the cell culture container 1 according to the determination result by the analysis unit 51. Configured.
  • control unit 52 irradiates the laser L to kill the cell aggregate 9 having an area or size smaller than the lower limit value among the cell aggregates 9 existing on the cell culture vessel 1
  • the laser irradiation apparatus 3 is controlled so as to irradiate the laser L so as to cut the cell aggregate 9 having an area or size larger than the upper limit value or to reduce the area or size.
  • the upper limit value and / or the lower limit value to be compared with the characteristic amount (area or size, roundness, cell density, etc.) of the cell aggregate 9 existing on the cell culture container 1 may be arbitrarily set by the user. it can.
  • the computer 5 functioning as the analysis unit 51 accepts an input of the upper limit value and / or lower limit value by the user's hand through the input device 8, and the input upper limit value and / or lower limit value is received from the main memory 5b or the auxiliary memory. It is stored and stored in the storage device 5c, and used for the determination of each cell aggregate 9 on the cell culture container 1.
  • the cell processing system of the present embodiment it becomes possible to harvest the cell aggregate 9 having a desired size more easily and stably when a predetermined cell culture period elapses.
  • the wavelength of the laser L used for the laser irradiation process for killing unnecessary cells is not limited to 405 nm.
  • the irradiated layer 12 of the cell culture vessel 1 is configured using a material (particularly a polymer) containing a dye structure that can absorb light of that wavelength. Is required.
  • a near-infrared laser L having a wavelength of 808 nm or 1064 nm it is one idea to use phthalocyanines (phthalocyanine derivatives, phthalocyanine-based near-infrared absorbing dyes) as materials.
  • the diameter of the laser beam L may be further reduced to be smaller than 50 ⁇ m.
  • an optical fiber having a small core diameter is connected to the processing nozzle 33 and the laser light L supplied from the laser light source 31 is input to the processing nozzle 33 through this optical fiber, the laser beam emitted from the processing nozzle 33
  • the diameter of L can be reduced to 25 ⁇ m or less, and the amount of energy (energy density) of the laser L per unit area increases accordingly. Thereby, even if the maximum output of the laser light source 31 is not large, it becomes possible to give a large amount of energy to a point where the laser L is irradiated, that is, a place where unnecessary cells exist.
  • the projected shape when the irradiated layer 12 is irradiated with the laser beam L is not limited to a dot shape or a circular shape.
  • the projected shape of the laser beam L may be formed into a rod-shaped line beam that is extended in a predetermined direction. If the line beam is used, the time required for raster scanning a certain region in the cell culture container 1 (irradiated layer 12 thereof) can be further shortened.
  • the processing nozzle 33 that irradiates the laser L toward the cell culture vessel 1 supported by the support 2 is mounted on the XY stage 4 so that the processing nozzle 33 is moved in the X-axis direction and the Y-axis direction.
  • the support body 2 that supports the cell culture container 1 may be mounted on a displacement mechanism 4 such as an XY stage, and the cell culture container 1 may be moved in the X-axis direction and the Y-axis direction.
  • one of the processing nozzle 33 and the support 2 is mounted on a linear motor carriage that can travel in the X-axis direction, and the other is mounted on a linear motor carriage that can travel in the Y-axis direction.
  • the laser beam L emitted from 33 can be displaced relative to the irradiated layer 12 of the cell culture vessel 1 in both the X-axis direction and the Y-axis direction.
  • a galvano scanner may be employed as the displacement mechanism 4 for displacing the irradiation position of the laser L with respect to the irradiated layer 12 of the cell culture vessel 1.
  • the galvano scanner rotates a mirror that reflects the laser light L supplied from the laser light source 31 by a servo motor or a stepping motor, and changes the optical axis of the laser L at high speed via the mirror. It is possible.
  • the angle at which the optical axis of the laser light L intersects the irradiated layer 12 of the cell culture container 1 cannot be kept strictly constant.
  • the laser light source is a semiconductor laser or the like and the laser oscillated by the laser light source is transmitted to the galvano scanner using an optical fiber or the like, the diameter of the laser beam L irradiated on the irradiated layer 12 or the dimension of the projected shape. It is not easy to focus on the minimum.
  • the optical axis of the laser beam L is irradiated layer 12 of the cell culture vessel 1 as in the XY stage 4 or the linear motor carriage. It is preferable to use a mechanism that can be moved relatively in parallel.
  • a fiber laser as a laser light source or condensing solid laser light, the diameter of the laser beam L irradiated onto the irradiated layer 12 or the size of the projected shape can be minimized. become.
  • the laser light L emitted from the processing nozzle 33 as an illumination light source when photographing the cells in the cell culture vessel 1.
  • the output of the laser L applied to the cell culture container 1 from the processing nozzle 33 needs to be sufficiently weaker than the output of the laser L applied to the cell culture container 1 in order to kill unnecessary cells.
  • the irradiated layer 12 is configured by applying a polymer as a material of the irradiated layer 12 to the bottom of the well 10 formed in the container body 11 of the cell culture container 1.
  • a polymer as a material of the irradiated layer 12
  • it is difficult to form an irradiated layer by applying a polymer to a multi-dish container body having a plurality of wells by spin coating or the like. Accordingly, a plate-like body containing a material that generates heat upon irradiation with the laser beam L is produced, and this plate-like body is placed or adhered to the bottom of each well of the container body, thereby covering the cell culture container. It is conceivable to form an irradiation layer.
  • the plate-like body may be obtained by applying a pigment that absorbs the laser beam L to a thin plate made of a transparent or translucent plastic or glass material that transmits the laser beam L.
  • the constituent material of the thin plate may contain a dye that absorbs the laser beam L. It is naturally possible to use the dye structure-containing polymer or the photoacid generator described in the above embodiment as a dye that absorbs the laser light L.
  • the laser beam L is irradiated to the irradiated layer 12 after passing through the container body 11 from below the cell culture vessel 1.
  • the laser beam L is irradiated from above, that is, from the surface side of the irradiated layer 12. It is also conceivable to irradiate the irradiated layer 12 directly (without passing through the container body 11). In this case, the container main body 11 does not need to have transparency or translucency for transmitting the laser light L.
  • the focal point of the laser beam L to be irradiated is preferably adjusted not to the cells on the irradiated layer 12 but to the irradiated layer 12.
  • feeder cells When culturing iPS cells and other cells using the cell culture vessel 1, feeder cells may be used in combination.
  • the laser beam machine according to the present invention can also be used for killing feeder cells that are no longer needed in the cell culture vessel 1.
  • the laser light L emitted from the processing nozzle 33 of the laser processing machine may be killed by directing laser beam L directly to the cell aggregate 9 and focusing the layer on the layer of the cell aggregate 9 on the cell culture container.
  • the laser beam L may be a pulse laser with a minimum pulse width such as a picosecond laser or a femtosecond laser.
  • the cell treatment system according to the present invention can be used not only for culturing undifferentiated iPS cells but also for induction of differentiation after preparation of iPS cell colonies.
  • a cell aggregate 9 of a desired size consisting of a target cell that is, a differentiated cell
  • After thinning out the slow-growing cell aggregate 9 or cutting or trimming the fast-growing cell aggregate 9 This is because unnecessary cells, that is, cells that have differentiated into cells other than undifferentiated cells or cells other than target cells are killed and eliminated, as in the treatment of undifferentiated iPS cells.
  • Trimming that kills the cells in the outer peripheral edge 92 of the cell assembly 9 may be performed on the cell assembly 9 having an appropriate size whose area or dimension is equal to or lower than the upper limit value.
  • the width of the peripheral portion 92 of the cell aggregate 9 is killed, or the dimension of the cell aggregate 9 after trimming (the diameter of the circle 64) is determined by the user. It can be set arbitrarily.
  • the computer 5 receives an input of the width of the peripheral edge 92 to be trimmed by the user's hand or the value of the dimension of the cell aggregate 9 after trimming via the input device 8, and the inputted value is stored in the main memory. 5b or the auxiliary storage device 5c is stored and held, and is used to determine the coordinates of the irradiation position of the laser L in the trimming process of the cell aggregate 9 on the cell culture container 1.
  • the present invention can be used to grow unnecessary cell aggregates 9 by killing unnecessary cells among cells cultured on a cell culture vessel.

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Abstract

細胞培養容器上で培養される細胞のうち不要な細胞を死滅させて所望の大きさの細胞集合体を収穫すべく、細胞培養容器を撮像する撮像装置と、撮像された画像を基に細胞培養容器上に存在している各細胞集合体の面積若しくは寸法を算出する解析部と、各細胞集合体の面積若しくは寸法を画面に表示する表示装置と、細胞培養容器に向けてレーザを照射することで細胞培養容器上に存在している細胞を致死させるレーザ照射装置と、細胞培養容器上に存在している細胞のうちの何れをレーザ照射により致死させ若しくはレーザ照射をせずに生存させるかを指定する操作入力、または細胞培養容器上のどの位置にレーザを照射し若しくはレーザを照射しないかを指定する操作入力を受け付ける入力装置と、受け付けた操作入力に応じて細胞培養容器に向けてレーザを照射する際の照射位置を制御する制御部とを具備する細胞処理システムを構成した。

Description

細胞処理システム
　本発明は、細胞培養容器上で培養される細胞のうち不要な細胞を死滅させて必要な細胞集合体を育成するための細胞処理システムに関する。
　近時、体性幹細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ））、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ））を用いた再生医療技術及び創薬の研究開発が勃興している。この種の研究開発においては、必要となる目的細胞や組織を効率よく量産できることが極めて重要となる。
　細胞培養の過程では、培地で増殖した細胞コロニーの一部をクランプとして取り出し、そのクランプを新しい培地に移して再び培養する継代培養を行うことが通例である（例えば、下記特許文献を参照）。
　現状、増殖した細胞から複数のクランプを切り出す作業は、人の手によってなされている。だが、これには手間を要する上、作業を行う者のスキルその他の個人差の影響を受けるために、クランプの大きさが不揃いとなって、継代後の細胞の生育状態にばらつきを生ずる原因ともなる。
　また、患者の傷ついた組織や臓器を補う再生医療の目的で用いる細胞集合体に不良のまたは不要な細胞が混交していると、本来の効用を発揮できないおそれがあるだけでなく、腫瘍化その他の患者の健康に悪影響を及ぼすことにもなりかねない。しかしながら、不要細胞が混入している培養容器を丸ごと廃棄することは、目的細胞または組織の収率（歩留まり）の低下につながり、再生医療のコストを高騰させる。目的細胞または組織の収率を改善するためには、培養容器内に存在する不要細胞を死滅させまたは除去して、残りの細胞を無駄にせず利用することが望ましい。
特表２０１４－５０９１９２号公報
　本発明は、所望の大きさの細胞集合体をより容易に収穫できるようにすることを所期の目的としている。
　本発明では、細胞培養容器上で培養される細胞のうち不要な細胞を死滅させて必要な細胞集合体を育成するためのシステムであって、細胞培養容器の一部または全部を撮像する撮像装置と、前記撮像装置で撮像された画像を構成している画素値を基に、前記細胞培養容器上に存在している一または複数の細胞集合体の各々の面積若しくは寸法を算出する解析部と、前記解析部で算出した各細胞集合体の面積若しくは寸法を画面に表示する表示装置と、前記細胞培養容器に向けてレーザを照射することで細胞培養容器上に存在している細胞を致死させるレーザ照射装置と、ユーザの手による、前記細胞培養容器上に存在している細胞のうちの何れをレーザ照射により致死させ若しくはレーザ照射をせずに生存させるかを指定する操作入力、または前記細胞培養容器上のどの位置にレーザを照射し若しくはレーザを照射しないかを指定する操作入力を受け付ける入力装置と、前記操作入力装置で受け付けた操作入力に応じて前記レーザ照射装置から前記細胞培養容器に向けてレーザを照射する際の照射位置を制御する制御部とを具備する細胞処理システムを構成した。
　特に、前記解析部が、細胞集合体の面積若しくは寸法についての上限値または下限値を記憶しており、前記細胞培養容器上に存在している各細胞集合体の面積若しくは寸法がその上限値または下限値を超えていないかどうかを判定し、前記表示装置が、前記解析部による、前記細胞培養容器上に存在している各細胞集合体についての判定結果を画面に表示するものであることが好ましい。
　また、本発明では、細胞培養容器上で培養される細胞のうち不要な細胞を死滅させて必要な細胞集合体を育成するためのシステムであって、細胞培養容器の一部または全部を撮像する撮像装置と、前記撮像装置で撮像された画像を構成している画素値を基に、前記細胞培養容器上に存在している一または複数の細胞集合体の各々の面積若しくは寸法を算出するとともに、細胞集合体の面積若しくは寸法についての上限値または下限値を記憶しており、細胞培養容器上に存在している各細胞集合体の面積若しくは寸法がその上限値または下限値を超えていないかどうかを判定する解析部と、前記細胞培養容器に向けてレーザを照射することで細胞培養容器上に存在している細胞を致死させるレーザ照射装置と、前記解析部による判定結果に応じて前記レーザ照射装置から前記細胞培養容器に向けてレーザを照射する際の照射位置を制御する制御部とを具備する細胞処理システムを構成した。
　前記制御部が、前記細胞培養容器上に存在している細胞集合体のうち、前記下限値よりも面積若しくは寸法の小さい細胞集合体を致死させるべくレーザを照射する一方、前記上限値よりも面積若しくは寸法の大きい細胞集合体を切断しまたはその面積若しくは寸法を縮小するべくレーザを照射するように、前記レーザ照射装置を制御するものとすれば、細胞培養容器上にある細胞集合体の大きさを均一に揃えることができる。
　本発明によれば、所望の大きさの細胞集合体をより容易に収穫することが可能となる。
本発明の一実施形態の細胞処理システムの外観を示す図。 同実施形態の細胞培養システムのハードウェア資源構成を示す図。 同実施形態の細胞培養システムにおけるレーザ照射装置及び変位機構の概要を示す斜視図。 同実施形態の細胞処理システムによる細胞の殺処理方法を説明する側断面図。 同実施形態の細胞培養システムにおけるコンピュータの機能ブロック図。 培養開始からの経過時間と正常な細胞集合体の面積若しくは寸法との関係を概念的に示すグラフ。 同実施形態の細胞培養システムによる各細胞集合体の特徴量の画面表示例を示す図。 同実施形態の細胞培養システムによる各細胞集合体の特徴量の画面表示例を示す図。 同実施形態の細胞培養システムによる各細胞集合体の特徴量の画面表示例を示す図。 同実施形態の細胞培養システムによる細胞集合体の切断の模様を示す平面図。 同実施形態の細胞培養システムによる細胞集合体のトリミングの模様を示す平面図。
　本発明の一実施形態を、図面を参照して説明する。図１ないし図５に示すように、本実施形態の細胞処理システムは、細胞を培養するための細胞培養容器１の一部または全部を撮像する撮像装置６と、撮像装置６で撮像された画像を基に当該細胞培養容器１上に存在している一または複数の細胞集合体９の各々の特徴量を求める解析部５１と、解析部５１で求めた各細胞集合体９の特徴量を画面表示してユーザに提示する表示装置７と、当該細胞培養容器１に向けてレーザを照射することで細胞培養容器上に存在している不要な細胞を致死させるレーザ照射装置３と、ユーザの手による操作入力を受け付ける入力装置８と、レーザ照射装置３から当該細胞培養容器１に向けてレーザを照射する際の照射位置を制御する制御部５２とを具備する。
　レーザ照射装置３は、支持体２に支持させた一または複数の細胞培養容器２に向けてレーザビームＬを照射し、当該細胞培養容器１上で培養された細胞のうちの特定の細胞を死滅させるレーザ照射処理を実行する。図３に示しているように、レーザ照射装置３は、レーザ光源３１と、レーザ光源３１から供給されたレーザ光Ｌを細胞培養容器１に向けて出射させる加工ノズル３３と、レーザ光源３１と加工ノズル３３との間に介在しレーザ光源３１が出力するレーザ光Ｌを加工ノズル３３へと導く光学系３２とを備える。
　レーザ光源３１は、連続波レーザまたはパルスレーザ（連続波に近い、パルス幅の長い高周波レーザでもよい）Ｌを発振する装置である。使用するレーザＬの波長は一意に限定されず、例えば４０５ｎｍ、４５０ｎｍ、５２０ｎｍ、５３２ｎｍ、８０８ｎｍ等の可視光レーザや赤外線レーザを採用することができる。尤も、後述する細胞培養容器１の被照射層１２がそのレーザＬのエネルギを吸収できるような波長を選択する必要がある。また、波長が３８０ｎｍ以下の紫外線レーザは、ＤＮＡやタンパク質に吸収される可能性があり細胞への影響が懸念される。故に、レーザＬの波長は３８０ｎｍよりも長いことが好ましい。本実施形態では、レーザ光源３１として、波長が４０５ｎｍ近傍にある最大出力５Ｗの連続波ダイオードレーザを想定している。
　加工ノズル３３は、細胞培養容器１の被照射層１２に照射するべきレーザ光Ｌを集光するためのレンズや、レーザ光Ｌの出射のＯＮ／ＯＦＦを切り替えるためのシャッタまたはミラー等を内蔵する。加工ノズル３３は、支持体２に支持される細胞培養容器１の下方に位置し、上方に向かってレーザＬを出射させる。加工ノズル３３から出射するレーザビームＬの光軸は、細胞培養容器１の被照射層１２に対して略直交する。
　レーザ光源３１から加工ノズル３３に向けてレーザＬを伝搬させる光学系３２は、光ファイバ、ミラー、レンズ等の任意の光学要素を用いて構成できる。
　細胞培養容器１に対するレーザビームＬの照射位置を操作するための変位機構４は、支持体２に支持させた細胞培養容器１に対してレーザ照射装置３の加工ノズル３３を相対的に変位させるＸＹステージを主体とする。ＸＹステージ４は、リニアモータ台車等を介して対象物をＸ軸方向（左右方向）及びＹ軸方向（前後方向）に沿って高速かつ精密に移動させ得る既知のものである。本実施形態では、加工ノズル３３をＸＹステージ４に支持させ、加工ノズル３３を支持体２及び細胞培養容器１に対して移動させることとしている。だが、支持体２をＸＹステージ４に支持させ、支持体２及び細胞培養容器１を加工ノズル３３に対して移動させるようにしても構わない。何れにせよ、変位機構４により、細胞培養容器１の被照射層１２とレーザビームＬの光軸とが交わる角度を略一定に保ちながら、細胞培養容器１の被照射層１２に対するレーザＬの照射位置を変位させることができる。
　ここで、細胞培養容器１に関して補足する。図４に示すように、本実施形態における細胞培養容器１は、加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌを透過させ得る容器本体１１に、レーザ光Ｌの照射を受けて熱及び／または酸を発生させる光応答性材料を含む層である被照射層１２を設けたものである。
　容器本体１１は、加工ノズル３３から出射するレーザＬが属する波長帯の光を透過させる透明性または透光性を有する、プラスチックやガラス等の材料により構成する。プラスチックの例としては、ポリスチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー（ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等）、ポリビニルピリジン系ポリマー（ポリ（４－ビニルピリジン）、４－ビニルピリジン－スチレン共重合体等）、シリコーン系ポリマー（ポリジメチルシロキサン等）、ポリオレフィン系ポリマー（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等）、ポリエステルポリマー（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等）、ポリカーボネート系ポリマー、エポキシ系ポリマー等を挙げることができる。既製の培養容器を、そのまま容器本体１１として用いてもよい。容器本体１１の形状は、既製の培養容器と同様、ディッシュ（シャーレ）形、マルチディッシュ形、フラスコ形等とすることができる。
　ポリスチレン系樹脂を用いて作製した容器本体１１の光透過率は非常に高く、光波長約３８０ｎｍ以上では８５％以上となる。但し、光波長約３８０ｎｍ以下では、光波長が短くなるほど光透過率が低下、即ち容器本体１１による光の吸収が増大してゆく。これは、ポリスチレン材料に含まれる不純物に起因するものと思われる。
　被照射層１２は、加工ノズル３３から出射するレーザＬが属する波長帯の光を吸収する色素構造（発色団）を含んだポリマー（高分子）により構成することが好ましい。このような材料は、容器本体１１へのコーティングが容易であり、必要な細胞の接着性を確保でき、かつ細胞への移行も起こりにくいものとなるからである。レーザ光Ｌを吸収する色素構造の例としては、アゾベンゼン、ジアリールエテン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、ロイコ色素、インジゴ、カロチノイド（カロテン等）、フラボノイド（アントシアニン等）、キノイド（アントラキノン等）等といった有機化合物の誘導体を挙げることができる。並びに、ポリマーを構成する骨格の例としては、アクリル系ポリマー、ポリスチレン系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマー、ポリ酢酸ビニルやポリ塩化ビニル、ポリオレフィン系ポリマー、ポリカーボネート系ポリマー、エポキシ系ポリマー等を挙げることができる。
　被照射層１２の材料となる色素構造含有ポリマーの一具体例として、ポリ［メチルメタクリラート－ｃｏ－（ジスパースイエロー　７　メタクリラート）］（化１、（Ｃ5Ｈ8Ｏ2）m（Ｃ23Ｈ20Ｎ4Ｏ2）n）を示す。但し、このアゾポリマーにおけるアゾベンゼンの構
造については、無置換のアゾベンゼンの他、ニトロ基やアミノ基、メチル基等で修飾した様々なバリエーションが考えられる。
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　上述の色素構造含有ポリマーを含む原料液、または当該色素構造含有ポリマーを溶剤（１，２－ジクロロエタン、メタノール等）に溶解させた原料液を、スピンコート法やキャスト法等により容器本体１１の上向面即ちウェル１０の底に塗布して硬化させれば、レーザ光Ｌの照射を受けて熱を生じさせる被照射層１２を形成することが可能である。例えば、色素構造としてアゾベンゼンを有するポリマーを７μｇ／ｃｍ2の密度で容器本体１１の上向面即ちウェル１０の底に塗布すると、平均の厚みが７０ｎｍの被照射層１２をウェル１０の底に敷設することができる。なお、レーザ光Ｌを吸収する色素を容器本体１１の構成材料に含有させることで、または色素構造含有ポリマーを材料として容器本体１１を作製することにより、レーザ光Ｌの照射を受けて熱を生じさせる被照射層１２を形成しても構わない。
　色素構造としてアゾベンゼンを有するポリマーを容器本体１１にコーティングして構成した、所定の厚みを有する被照射層１２の光吸収率は、光波長が約３６０ｎｍのときに約６０％でピークとなり、光波長が約３６０ｎｍから長くなるほど低下してゆく。この被照射層１２の光吸収率は、光波長が約４２５ｎｍ以上の領域では２０％を切る。だが、光波長が長くなってもある程度以上の光吸収性が存在しており、４０５ｎｍ、４５０ｎｍ、５２０ｎｍまたは５３２ｎｍの波長のレーザ光Ｌを当該被照射層１２に十分に吸収させることが可能である。
　被照射層１２の材料として、上述の色素構造含有ポリマーとともに、またはこれに代えて、レーザ光Ｌの照射を受けて酸性物質を発生させる光酸発生剤を用いることも考えられる。上掲の特許文献１にも開示されている通り、光酸発生剤は、加工ノズル３３から出射するレーザＬが属する波長帯の光を吸収する色素構造（発色団）と、分解後に酸性物質となる酸前駆体とを備えた構造を有するものとすることが好ましい。スルホン酸誘導体、カルボン酸エステル類、オニウム塩類、ニトロベンズアルデヒド構造を有する光酸発生基等は、このような光酸発生剤に該当する。
　特に、光酸発生剤となるスルホン酸誘導体の例として、チオキサントン系スルホン酸誘導体（スルホン酸１，３，６－トリオキソ－３，６－ジヒドロ－１Ｈ－１１－チア－アザシクロペンタ［ａ］アントラセン－２－イルエステル等）及びナフタレンイミド系スルホン酸誘導体（スルホン酸１，８－ナフタルイミド等）を挙げることができる。これら以外に、ジスルホン類、ジスルホニルジアゾメタン類、ジスルホニルメタン類、スルホニルベンゾイルメタン類、イミドスルホネート類、ベンゾインスルホネート類等のスルホン酸誘導体も採用することが可能である。
　また、カルボン酸エステルの例として、１，８－ナフタレンジカルボン酸イミドメチルスルホネートや１，８－ナフタレンジカルボン酸イミドトシルスルホネート等を挙げることができ、オニウム塩の例として、テトラフルオロボレート（ＢＦ4 -）、ヘキサフルオロホスフェート（ＰＦ6 -）、ヘキサフルオロアンチモネート（ＳｂＦ6 -）等のアニオンを有するスルホニウム塩またはヨードニウム塩を挙げることができる。
　上述の光酸発生剤をプラスチック（特に、ＰＭＭＡのようなアクリル系ポリマーやポリスチレン系ポリマー等）に含ませた原料液、または当該光酸発生剤を溶剤（１，２－ジクロロエタン、メタノール等）に溶解させた原料液を、スピンコート法やキャスト法等により容器本体１１の上向面即ちウェル１０の底に塗布して硬化させれば、レーザ光Ｌの照射を受けて熱とともに酸を生じさせる被照射層１２を形成することが可能である。例えば、色素構造としてチオキサントン骨格を有し、酸前駆体としてスルホン酸類を有するチオキサントン系スルホン酸誘導体を含んだポリマーを２００μｇ／ｃｍ2の密度で容器本体１１のウェル１０の底に塗布すると、平均の厚みが２μｍの被照射層１２をウェル１０の底に敷設することができる。なお、光酸発生剤を容器本体１１の構成材料に含有させることにより、レーザ光Ｌの照射を受けて熱及び酸を生じさせる被照射層１２を形成しても構わない。
　色素構造としてチオキサントン骨格を有し、酸前駆体としてスルホン酸類を有するチオキサントン系スルホン酸誘導体を含んだポリマーを容器本体１１にコーティングして構成した、所定の厚みを有する被照射層１２の光吸収率は、光波長が約３７５ｎｍから約４６０ｎｍの範囲に亘って分布する。この範囲外の波長の光を当該被照射層１２が吸収することはできない。従って、４０５ｎｍまたは４５０ｎｍの波長のレーザ光Ｌであれば、当該被照射層１２に吸収させることが可能である。尤も、当該被照射層１２の光吸収率は、色素構造としてアゾベンゼンを有するポリマーを用いて構成した被照射層１２の光吸収率よりは小さくなり、光波長が約４００ｎｍから約７００ｎｍの可視光領域で２０％（さらに言えば、１０％）を切る。
　被照射層１２は、レーザ光Ｌの照射を受けて蛍光を発しない材料を用いて構成することが好ましい。また、被照射層１２の厚みは、１０μｍ以下とすることが好ましい。
　なお、細胞培養容器１の被照射層１２の表面に、細胞の接着性を高めるための材料、例えばラミニンやマトリゲル等のＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ）をコーティングしてもよい。
　細胞を培養する際には、細胞培養容器１の容器本体１１に成形されているウェル１０内に培地（特に、液体培地）１３を充填する。その培地１３は、ウェル１０の底に敷設されている被照射層１２の直上に所在することとなる。そして、培養される細胞は、当該被照射層１２の表面に接着しつつ増殖して細胞集合体９を形成する。
　図４に示しているように、細胞培養容器１のウェル１０内に存在している細胞のうちの所望の細胞を致死させるレーザ照射処理では、レーザ照射装置３の加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌを、支持体２に支持させた細胞培養容器１の被照射層１２における、致死させるべき細胞の直下の箇所に照射する。本実施形態では、加工ノズル３３を細胞培養容器１の下方に配置し、加工ノズル３３から打ち上げたレーザ光Ｌを容器本体１１を透過させた上、被照射層１２に裏面側から照射する。加工ノズル３３に内蔵されているレンズは、加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌの焦点を細胞培養容器１の被照射層１２に合わせる。被照射層１２におけるレーザ光Ｌの照射を受けた箇所は、レーザ光Ｌのエネルギを吸収して熱及び／または酸を生じ、その熱によって当該箇所の直上に存在する細胞を死に至らしめる。
　特に、被照射層１２の構成材料に光酸発生剤を用いているならば、被照射層１２におけるレーザ光Ｌの照射を受けた箇所で酸性物質が発生し、その酸性物質が当該箇所の直上に存在する細胞の死または被照射層１２からの剥離を促す。光酸発生剤がスルホン酸誘導体である場合、発生する酸性物質はスルホン酸類である。
　レーザ光の波長は、例えば４０５ｎｍとする。レーザＬの出力の大きさは、０．４Ｗから５Ｗの間とする。無論、出力が５Ｗを超えていても構わない。レーザＬのビーム径は、５０μｍ以下とする。ビーム径を、２０μｍないし２５μｍ程度に絞っても構わない。連続波レーザまたは連続波に近いパルスレーザＬを出射する加工ノズル３３（つまりは、レーザビームＬ）を細胞培養容器１に対して移動させる走査の速さは、５０ｍｍ／秒から２０００ｍｍ／秒の間とする。レーザＬの出力が５Ｗ、レーザビームＬ径が５０μｍ、走査速度１５００ｍｍ／秒の場合、レーザ光Ｌの照射箇所においてレーザ光Ｌが与える単位面積あたりのエネルギ量（エネルギ密度）は約８．７Ｊ／ｃｍ2となる。上記のレーザ光Ｌの波長、出力及びエネルギ量は、仮にレーザビームＬを細胞に直射したとしても細胞が死に至らないような大きさであるが、被照射層１２の働きにより、不要な細胞を的確に死に至らしめることができる。
　その上で、致死させるべき細胞以外の細胞、換言すれば不要細胞の周辺にある目的細胞または組織への熱影響を最小限に抑えるためには、被照射層１２に照射するレーザ光Ｌの波長、出力及びエネルギ量を、致死させるべき細胞が即死せず（レーザＬの照射から数分後または十数分後の時点で当該細胞が生存しているような）レーザ光Ｌの照射からある程度の時間が経過した後（例えば、数十分後、一時間後ないし数時間後。典型的には、６０分後または１２０分後）には死に至っているような大きさに調整することが好ましい。レーザ光Ｌの照射直後は対象の細胞が生存しており、その照射からある程度の時間が経過した後に当該細胞が死滅するという状況を作り出すことは現に可能である。
　レーザＬの出力または単位面積あたりのエネルギ量の調整を通じて、致死させる細胞の幅または範囲の大きさを拡縮させることも可能である。レーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量が大きいほど、細胞が死滅する幅または範囲は拡大する。また、レーザＬの照射から不要細胞が死に至るまでの所要時間も、レーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量が大きいほど短くなると考えられる。
　あるいは、被照射層１２における致死させるべき細胞の直下の箇所に、一回照射しただけでは当該細胞が即死しない（レーザＬの照射から数分後または十数分後の時点で当該細胞が生存している）ような出力またはエネルギ量を持つレーザ光Ｌを、複数回照射することも好ましい。このような処理により、致死させる細胞以外の細胞への熱影響を最小限に抑制しつつも、レーザ光Ｌの照射から対象の細胞の死滅までに要する時間を短縮することができる。
　レーザ照射処理に用いるレーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量の好適な条件は、細胞培養容器１に設ける被照射層１２の構成材料や厚み等の影響を受ける。レーザ光Ｌの照射を受けた被照射層１２がレーザ光Ｌのエネルギを吸収して発生させる単位面積あたりの熱量は、被照射層１２に照射されるレーザ光Ｌの持つ単位面積あたりエネルギ量に、単位面積の被照射層１２が当該レーザ光Ｌのエネルギを吸収して利用できる割合である光利用率を乗じたものとなる。この光利用率は、被照射層１２の構成材料の性質即ち光吸収率に依存するのは勿論のこと、レーザ光Ｌを吸収して熱を発する光熱反応に寄与する材料が被照射層１２の単位面積あたりどれくらいの量存在しているかによっても変化する。容器本体１１に被照射層１２を形成するために塗布する構成材料の塗布厚みを増せば、光熱反応に寄与する材料の量が増加して、単位面積の被照射層１２の光利用率も増大する。従って、被照射層１２において発生する単位面積あたりの熱量が増し、その分細胞が死に至りやすくなる。よって、細胞培養容器１に設ける被照射層１２の光利用率に応じて、細胞の死滅処理に適したレーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量を実験的に求める必要がある。
　撮像装置６は、例えば位相差顕微鏡を介して得られる、細胞培養容器１上の培養細胞または細胞集合体９の像を、ＣＣＤやＣＭＯＳ等の固体撮像素子（イメージセンサ）により撮像するものである。
　表示装置７は、既知の液晶ディスプレイ等である。入力装置８は、ユーザが手指で操作可能なタッチパネル、トラックパッド、マウスといったポインティングデバイスや、キーボード、押下ボタン等である。入力装置８としてのタッチパネルが、表示装置７としてのディスプレイの画面に重ねて設けてあることがある。
　レーザ照射装置３の少なくとも加工ノズル３３、レーザ照射処理中の細胞培養容器１及び支持体２は、ＣＯ2インキュベータと同等の雰囲気とした処理室０内に配置することが好ましい。周知の通り、ＣＯ2インキュベータは、内部の雰囲気の温度、ＣＯ2濃度及び温度を調節することで細胞の培養環境、例えば細胞培養容器１に充填されている培地のｐＨ等を好適な状態に維持する役割を担う。撮像装置６による細胞培養容器１の撮影は、処理室０内で行ってもよく、処理室０外で行ってもよい。
　解析部５１及び制御部５２は、汎用的なパーソナルコンピュータ、サーバコンピュータ、ワークステーション等、またはそれらと類似のコンピュータ５により構成される。図２に示すように、このコンピュータ５は、ＣＰＵ５ａ、メインメモリ５ｂ、補助記憶デバイス５ｃ、ビデオコーデック５ｄ、Ｉ／Ｏインタフェース５ｅ等を有し、これらがコントローラ（システムコントローラやＩ／Ｏコントローラ等）５ｆにより制御されて連携動作するものである。補助記憶デバイス５ｃは、フラッシュメモリ、ハードディスクドライブ、その他である。ビデオコーデック５ｄは、ＣＰＵ５ａより受けた描画指示をもとに表示させるべき画面を生成しその画面信号を表示装置７に向けて送出するＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）、画面や画像のデータを一時的に格納しておくビデオメモリ等を要素とする。Ｉ／Ｏインタフェース５ｅは、レーザ光源３１やＸＹステージ４、入力装置８や撮像装置６等と通信可能に接続してこれらを制御するためのデバイスである。Ｉ／Ｏインタフェース５ｅは、サーボドライバ（サーボコントローラ）を含むことがある。
　コンピュータ５が実行するべきプログラムは、補助記憶デバイス５ｃに記憶されており、プログラム実行の際に、メインメモリ５ｂに読み込まれ、ＣＰＵ５ａによって解読される。そして、コンピュータ５は、プログラムに従い、本細胞培養システムにおける解析部５１及び制御部５２としての機能を発揮する。
　解析部５１は、撮像装置６で撮像された画像を構成している画素値に基づき、当該画像に写っている一または複数の細胞集合体９、つまりは撮影対象の細胞培養容器１上に存在している一または複数の細胞集合体９のそれぞれの位置及び範囲を検出する。そして、その特徴量として、少なくとも、各細胞集合体９の面積若しくは寸法（直径等）を算出する。細胞集合体９の寸法を算出する場合、当該細胞集合体９の最大の幅（換言すれば、長径）を求めてもよいし、最小の幅（換言すれば、短径）を求めてもよい。加えて、解析部５１が、細胞培養容器１上に存在している細胞集合体９の特徴量として、撮像された画像の画素値に基づき、当該画像に写っている各細胞集合体９の透過度や、当該画像に写っている各細胞集合体９の形状の指標値、例えば真円度、各細胞集合体９の細胞の密度等を算出しても構わない。
　また、解析部５１が、細胞培養容器１上に存在している細胞集合体９の特徴量として、撮像された画像の画素値に基づき、当該画像に写っている各細胞集合体９に含まれる細胞の種類を判別して、細胞培養容器１上に存在しているどの細胞集合体９が培養目的である必要な細胞であるか（換言すれば、どの細胞集合体９が目的細胞以外の不要細胞であるか）、または各細胞集合体９のどの部分が目的細胞でどの部分が不要細胞であるかを求めることもあり得る。
　今日では、細胞培養容器１に充填される培地に添加することで、細胞培養容器１上に存在する未分化ＥＳ細胞または未分化ｉＰＳ細胞を固定せずに生きたまま染色可能な細胞毒性の低い蛍光マーカ（未分化細胞の表面に存在する糖鎖と結合するレクチンプローブｒＢＣ２ＬＣＮ）が既に存在している。ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の培養において、この蛍光マーカを使用すれば、細胞培養容器１に存在する目的細胞である未分化ＥＳ細胞または未分化ｉＰＳ細胞を染色することができる。そして、目的細胞を染色した状態で細胞培養容器１を撮影装置で撮像し、得られた画像を解析すれば、細胞培養容器１上に存在している目的細胞の位置及び範囲と、それ以外の不要細胞（既に分化した細胞等）の位置及び範囲とをそれぞれ知得でき、それらの細胞集合体９の面積、寸法または真円度等を算出することもできる。因みに、未分化細胞からｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを剥離させるストリッピング溶液も存在しており、ｒＢＣ２ＬＣＮレクチンを剥離させた後も未分化細胞の培養を続行することができる。
　無論、必要な目的細胞または不要細胞を染色する染色材を使用せずとも、既知の画像解析アルゴリズムを利用して、細胞培養容器１を撮影した画像に写っている目的細胞の位置及び範囲、不要細胞の位置及び範囲を知得することが可能である。人工知能による学習を通じて、画像に写っている細胞の種類の判定の精度を高めてゆくことも考えられる。
　解析部５１が、細胞培養容器１上に存在する細胞集合体９の何れが目的細胞であるか、または各細胞集合体９のどの部分が目的細胞でどの部分が不要細胞であるかを解析した場合には、各細胞集合体９毎の面積若しくは寸法、透過度、真円度等の特徴量を算出する際にも、対象の細胞集合体９のうちの目的細胞が占める部分だけを検出してその部分の面積若しくは寸法、透過度、真円度等を求めることが好ましい。
　さらに、解析部５１は、メインメモリ５ｃまたは補助記憶デバイス５ｃの所要の記憶領域を利用して、あるべき細胞集合体９の特徴量についての上限値及び／または下限値を記憶保持している。その上で、画像解析を通じて知得した細胞培養容器１上の各細胞集合体９の特徴量がその上限値及び／または下限値を超えていないかどうかを判定する。
　必要な目的細胞を培養してその細胞集合体９（または、クランプ）を得る作業では、培養の開始から経過した時間即ち培養時間（または、培養日数）と、その時間が経過した時点における正常な目的細胞の集合体９の面積若しくは寸法の大きさとの間に、一定の関係が存在する。図６に、培養開始からの経過時間と、正常な細胞集合体９の面積若しくは寸法との関係を、概念的に示している。図６中、実線は細胞集合体９の面積若しくは寸法の適正範囲の下限を表し、破線は細胞集合体９の面積若しくは寸法の適正範囲の上限を表している。網掛けを施した領域が、細胞集合体９の面積若しくは寸法の適正範囲である。正常な細胞集合体９の面積若しくは寸法の上限値及び下限値は、培養時間の長さに応じて変動し得る。
　面積若しくは寸法が培養時間に応じた適正範囲から逸脱している細胞集合体９は、細胞培養容器１による培養の次の段階、例えば継代や分化誘導等に用いないことが望ましい。面積若しくは寸法が適正範囲の下限よりも小さい細胞集合体９は、細胞がうまく増殖できておらず、培養時間に見合った生長をしていない不良な集合体９であると考えられる。翻って、面積若しくは寸法が適正範囲の上限よりも大きい細胞集合体９は、細胞の増殖自体は進んでいるもののその増殖の速さが想定を越えており、これをそのまま次の段階の継代や分化誘導に用いると、継代後または分化後の細胞の生育状態にばらつきを生ずる原因となり得る。
　そこで、解析部５１は、画像解析を経て算出した細胞培養容器１上の各細胞集合体９の面積若しくは寸法が培養時間に応じた適正範囲から逸脱していないかどうかを判定することで、各細胞集合体９毎に、これを生かすべきか、死滅させるべきか、切断またはトリミングを行うべきかを示す。面積若しくは寸法が適正範囲内にある細胞集合体９は、原則として、生かしておくべきものである。面積若しくは寸法が下限値よりも小さい細胞集合体９は、不良であり死滅させるべきものである。他方、面積若しくは寸法が上限値よりも大きい細胞集合体９については、これを切断して面積若しくは寸法が適正範囲内にある複数の細胞集合体９とするか、または当該細胞集合体９の一部の細胞（特に、当該細胞集合体９の周縁部の細胞）を死滅させてその面積若しくは寸法を縮小させる。
　コンピュータ５は、解析部５１で解析した、細胞培養容器１上に存在する各細胞集合体９の特徴量の情報を表示装置７の画面に表示させる。図７ないし図９に、各細胞集合体９の特徴量の画面表示例を示す。図７に示す例では、左方の領域６１に、一個の細胞培養容器１の全体の撮影画像とともに当該細胞培養容器１上に存在する多数の細胞集合体９の位置を表示している。並びに、右方の領域６２に、当該細胞培養容器１上に存在している各細胞集合体９について、その特徴量である寸法（直径）、及び当該細胞集合体９の寸法が適正範囲内にあるか否かの判定結果（直径が下限値よりも小さい細胞集合体９は「致死」、直径が上限値よりも大きい細胞集合体９は「トリミング」）を一覧表示している。
　図８及び図９に示す例では、左方の領域６１に、細胞培養容器１上に存在する細胞集合体９のうちユーザが選択した一つの細胞集合体９の撮影画像を拡大して示している。この拡大画像に重ねて描画している外郭線６３は、細胞培養容器１の撮影画像を解析した解析部５１が一つの細胞集合体９と判断した領域の外縁である。ユーザの手による、どの細胞集合体９の拡大画像を表示させるのかを指定する操作入力は、入力装置８を介して受け付ける。図８は寸法が下限値よりも小さい致死させるべき細胞集合体９の画面表示例であり、図９は寸法が上限値よりも大きい切断またはトリミングするべき細胞集合体９の画面表示例である。図９の左方の領域６１において、外郭線６３よりも内側に描画している円６４は、対象の細胞集合体９の周縁部（即ち、この円６４の外側）にある細胞を死滅させるトリミングを実行した結果得られる細胞集合体９の予想される大きさを示す。つまり、これら外郭線６３及び円６４が、トリミングにおいて致死させる細胞の範囲を表していることになる。
　解析部５１が、細胞培養容器１上に存在する細胞集合体９の面積若しくは寸法以外の特徴量、例えば細胞集合体９の形状の真円度や細胞の密度等を算出している場合には、その各細胞集合体９毎の真円度等を表示装置７の画面に表示させることができる。
　加えて、解析部５１が、細胞培養容器１上に存在する細胞集合体９の何れが目的細胞であるか、または各細胞集合体９のどの部分が目的細胞でどの部分が不要細胞であるかを解析した場合には、細胞培養容器１内のどの位置に目的細胞が存在しているのか、またはどの位置に不要細胞が存在しているのかを、ユーザが視認できる態様で表示装置７の画面に表示させることが好ましい。
　解析部５１による判定のための条件は、任意に設定することができる。細胞集合体９の面積若しくは寸法が上限値よりも大きい及び／または下限値よりも小さいという条件以外にも、細胞集合体９の透過度とその上限値及び／または下限値との大小比較、細胞集合体９の真円度とその上限値及び／または下限値との大小比較、細胞集合体９の細胞の密度とその上限値及び／または下限値との大小比較、細胞が目的細胞であるか否か、等により、各細胞集合体９を生かすべきか、死滅させるべきか、切断またはトリミングを行うべきかを判定することが可能である。
　さらに、細胞集合体９についての複数の特徴量の条件を組み合わせて、対象の細胞集合体を生かすべきか、死滅させるべきか、切断またはトリミングを行うべきかを判定するものとしても構わない。例えば、細胞集合体９の面積若しくは寸法が下限値から上限値までの間の適正範囲内に収まっており、なおかつ細胞集合体９の真円度が下限値から上限値までの間の適正範囲内に収まっている、というようなＡＮＤ条件が成立することを以て当該細胞集合体９を生かすべきものと判定するようにしてもよいし、細胞集合体９の面積若しくは寸法が下限値から上限値までの間の適正範囲内に収まっているか、または細胞集合体９を構成する細胞が明らかに目的細胞である、というようなＯＲ条件が成立することを以て当該細胞集合体９を生かすべきものと判定するようにしてもよい。
　制御部５２は、レーザ照射装置３の加工ノズル３３から細胞培養容器１に向けてレーザＬを照射する際の照射位置の制御を司る。既に述べた通り、細胞培養容器１上に存在する細胞または細胞集合体９のうちの所望の細胞のみを死滅させるためには、細胞培養容器１の被照射層１２における致死させるべき細胞の直下の箇所にのみレーザ光Ｌを照射する必要がある。細胞培養容器１内のどの位置にレーザ光Ｌを照射するかを決定する手順は、複数存在する：
　（Ｉ）表示装置７に表示出力した画像や情報を視認したユーザ自身が、細胞培養容器１内のどの位置若しくはどの範囲にレーザＬを照射するか、またはどの位置若しくはどの範囲にレーザＬを照射しないかを決定する。ユーザの手による、レーザＬの照射位置若しくは範囲、または非照射位置若しくは範囲を指定する操作入力は、入力装置８を介して受け付ける。ユーザがレーザＬの非照射位置若しくは範囲を指定した場合には、それ以外の位置若しくは範囲にレーザＬを照射することとなる。
　（II）表示装置７に表示出力した画像や情報を視認したユーザ自身が、細胞培養容器１上に存在している細胞若しくは細胞集合体９のうちの何れをレーザＬ照射により致死させるか、またはレーザＬ照射をせずに生存させるかを決定する。ユーザの手による、どの細胞若しくは細胞集合体９を致死させるか、またはどの細胞若しくは細胞集合体９を致死させずに生かすかを指定する操作入力は、入力装置８を介して受け付ける。ユーザが生存させる細胞若しくは細胞集合体９を指定した場合には、細胞培養容器１におけるその指定された細胞若しくは細胞集合体９が占める領域以外の範囲にレーザＬを照射することとなる。
　（III）コンピュータ５が、解析部５１による判定結果に応じて、細胞培養容器１内のどの位置若しくはどの範囲にレーザＬを照射し、どの位置若しくはどの範囲にレーザＬを照射しないかを決定する。解析部５１は、細胞培養容器１上に存在する細胞集合体９のうち、その面積若しくは寸法が下限値以上上限値以下の適正範囲内にある細胞集合体９についてはこれを生存させると判定し、下限値よりも小さい細胞集合体９についてはこれを死滅させると判定し、上限値よりも大きい細胞集合体９については切断またはトリミングを行うと判定する。また、各細胞集合体９の形状の真円度を算定している場合には、その真円度がメインメモリ５ｂまたは補助記憶デバイス５ｃに記憶している下限値よりも小さい細胞集合体９についてはこれを致死させるものと判定するか、周縁部の細胞を死滅させるトリミングにより当該細胞集合体９の形状を真円に近づけると判定する。各細胞集合体９の細胞の密度を算定している場合には、その密度がメインメモリ５ｂまたは補助記憶デバイス５ｃに記憶している下限値よりも小さいか上限値よりも大きい細胞集合体９についてはこれを致死させるものと判定する。なお、正常な細胞集合体９の真円度や細胞の密度等の上限値及び／または下限値は、細胞の培養を開始してから経過した時間の長さに応じて変動し得る。並びに、画像解析を通じて細胞培養容器１上に存在する細胞または細胞集合体９の種類を判定している場合には、必要な目的細胞は生存させ、それ以外の不要細胞は致死させると判定する。既に述べたとおり、細胞集合体９についての複数の特徴量の条件をＡＮＤまたはＯＲで組み合わせて、対象の細胞集合体を生かすべきか、死滅させるべきか、切断またはトリミングを行うべきかを判定しても構わない。
　本実施形態の細胞処理システムは、上記の（Ｉ）ないし（III）のうちの何れをとることもできる。即ち、制御部５２は、細胞培養容器１内の、ユーザが自身の手でレーザＬを照射するべき位置若しくは範囲として指定した領域に属する一または複数の照射位置のＸＹ座標を得る。または、細胞培養容器１内の、生存させるべき目的細胞の細胞集合体９が占める領域以外の領域、換言すれば不要細胞その他の致死させるべき細胞が存在し得る領域を、レーザＬを照射するべき領域として特定し、その領域に属する一または複数の照射位置のＸＹ座標を得る。そして、照射位置のＸＹ座標を、メインメモリ５ｂまたは補助記憶デバイス５ｃに一時記憶する。
　なお、面積若しくは寸法の大きい細胞集合体９を切断してより面積若しくは寸法の小さい複数の細胞集合体９を作製する際には、図１０に示すように、細胞培養容器１の被照射層１２における、対象の細胞集合体９を複数の部分に切り分ける境界線９１の直下の箇所にレーザＬを照射することにより、境界線９１上にある細胞を致死させる。そのために、制御部５２は、当該境界線９１上に位置している複数のＸＹ座標を、レーザＬの照射位置の座標として得る。
　また、トリミング、即ち細胞集合体９の周縁部の細胞を死滅させてより面積若しくは寸法の小さい、またはより真円度の高い細胞集合体９を作製する際には、図１１に示すように、細胞培養容器１の被照射層１２における、対象の細胞集合体９の外周縁部位９２の直下の箇所にレーザＬを照射することにより、外周縁部位に所在する細胞を致死させる。そのために、制御部５２は、当該外周縁部位９２に属している複数のＸＹ座標を、レーザＬの照射位置の座標として得る。
　制御部５２は、加工ノズル３３から細胞培養容器１の被照射層１２に向けたレーザＬの出射のＯＮ／ＯＦＦ、及び被照射層１２に照射するレーザＬの出力強度つまりはレーザＬの持つエネルギ量を制御する。具体的には、加工ノズル３３からのレーザＬの出射のＯＮ／ＯＦＦを指令する信号をＩ／Ｏインタフェース５ｅを介して加工ノズル３３に与えるとともに、レーザＬの出力を制御する信号をＩ／Ｏインタフェース５ｅを介して加工ノズル３３またはレーザ光源３１に与える。
　さらに、制御部５２は、加工ノズル３３を支持しているＸＹステージ４を操作することで、レーザＬの照射位置のＸＹ座標に向けて加工ノズル３３を移動させ、加工ノズル３３から出射するレーザビームＬの光軸を当該ＸＹ座標に位置づける。具体的には、レーザＬの照射位置のＸＹ座標に対応する指令の信号を、Ｉ／Ｏインタフェース５ｅを介してＸＹステージ４に与える。加工ノズル３３から連続波レーザＬまたは連続波に近い高周波数パルスレーザＬを出射させつつ、照射位置のＸＹ座標の時系列に従って加工ノズル３３ひいてはレーザビームＬを移動させれば、レーザＬを細胞培養容器１の被照射層１２に照射しながらその照射位置を連続的に移動させる走査を実行することができる。制御部５２は、細胞培養容器１（の被照射層１２）における、ユーザ自身が指定した領域、または生存させるべき細胞集合体９が占める領域以外の領域を加工ノズル３３の光軸によってラスタスキャンするように、加工ノズル３３を細胞培養容器１に対して相対的に移動させながら、加工ノズル３３の光軸が致死させる対象の細胞の直下に到達するタイミングで加工ノズル３３からレーザＬを出射させる。この結果、上記の領域に所在している不要細胞が死に至り、必要な目的細胞の細胞集合体９のみが細胞培養容器１内に生存している状態が具現される。
　本実施形態の細胞処理システムは、目的細胞の培養の開始から一定の細胞期間を経た時点で、一定の大きさを持つ目的細胞の集合体９を確実に収穫するために役立つ。例えば、未分化ｉＰＳ細胞の培養では、細胞培養容器１を用いた培養の開始からその終了即ち継代または分化誘導の着手までの期間が七日程度である。本細胞処理システムは、その七日間の培養期間の中途で、増殖の遅い不良な細胞を死滅させて間引きするとともに、増殖が速い細胞集合体９を切断またはトリミングしてその大きさを縮小する。これにより、培養の開始から七日後の時点において、継代に適した大きさのｉＰＳ細胞の集合体９を確実に収穫することが可能となる。
　その際、ｉＰＳ細胞の細胞培養容器１への播種から二日程度は未だ細胞集合体９が顕著に小さいことから、本細胞処理システムを利用した細胞培養容器１の撮像、画像解析及びレーザＬの照射による細胞集合体９の間引き、切断またはトリミング処理は、培養の開始から三日が経過した時点より実行に着手する。また、細胞培養を開始してから日が経過するほど、細胞培養容器１内の細胞の個数が増え、その増殖の速度が指数関数的に加速する。従って、細胞培養容器１の撮像、画像解析及びレーザＬの照射による細胞集合体９の間引き、切断またはトリミング処理を行う周期は、細胞培養の開始からの経過時間が増すほど短縮することが好ましい。
　必要な細胞培養期間が経過した後、細胞培養容器１のウェル１０内に培養液その他の液体を注入する（または、細胞集合体９に培養液その他の液体を掛ける）等して、細胞集合体９を浮かせて回収することが可能である。細胞培養容器１に接着する細胞をその表面から剥離させるために酵素を使用することは必須ではないが、酵素を使用しても構わない。
　本実施形態では、細胞培養容器１上で培養される細胞のうち不要な細胞を死滅させて必要な細胞集合体９を育成するためのシステムであって、細胞培養容器１の一部または全部を撮像する撮像装置６と、前記撮像装置６で撮像された画像を構成している画素値を基に、前記細胞培養容器１上に存在している一または複数の細胞集合体９の各々の面積若しくは寸法を算出する解析部５１と、前記解析部５１で算出した各細胞集合体９の面積若しくは寸法を画面に表示する表示装置７と、前記細胞培養容器１に向けてレーザＬを照射することで細胞培養容器１上に存在している細胞を致死させるレーザ照射装置３と、ユーザの手による、前記細胞培養容器１上に存在している細胞のうちの何れをレーザＬ照射により致死させ若しくはレーザＬ照射をせずに生存させるかを指定する操作入力、または前記細胞培養容器１上のどの位置にレーザＬを照射し若しくはレーザＬを照射しないかを指定する操作入力を受け付ける入力装置８と、前記操作入力装置８で受け付けた操作入力に応じて前記レーザ照射装置３から前記細胞培養容器１に向けてレーザＬを照射する際の照射位置を制御する制御部５２とを具備する細胞処理システムを構成した。
　前記解析部５１は、細胞集合体９の面積若しくは寸法についての上限値または下限値を記憶しており、前記細胞培養容器１上に存在している各細胞集合体９の面積若しくは寸法がその上限値または下限値を超えていないかどうかを判定する。前記表示装置７は、前記解析部５１による、前記細胞培養容器１上に存在している各細胞集合体９についての判定結果を画面に表示する。
　また、本実施形態では、細胞培養容器１上で培養される細胞のうち不要な細胞を死滅させて必要な細胞集合体９を育成するためのシステムであって、細胞培養容器１の一部または全部を撮像する撮像装置６と、前記撮像装置６で撮像された画像を構成している画素値を基に、前記細胞培養容器１上に存在している一または複数の細胞集合体９の各々の面積若しくは寸法を算出するとともに、細胞集合体９の面積若しくは寸法についての上限値または下限値を記憶しており、細胞培養容器１上に存在している各細胞集合体９の面積若しくは寸法がその上限値または下限値を超えていないかどうかを判定する解析部５１と、前記細胞培養容器１に向けてレーザＬを照射することで細胞培養容器１上に存在している細胞を致死させるレーザ照射装置３と、前記解析部５１による判定結果に応じて前記レーザ照射装置３から前記細胞培養容器１に向けてレーザＬを照射する際の照射位置を制御する制御部５２とを具備する細胞処理システムを構成した。
　前記制御部５２は、前記細胞培養容器１上に存在している細胞集合体９のうち、前記下限値よりも面積若しくは寸法の小さい細胞集合体９を致死させるべくレーザＬを照射する一方で、前記上限値よりも面積若しくは寸法の大きい細胞集合体９を切断しまたはその面積若しくは寸法を縮小するべくレーザＬを照射するように、前記レーザ照射装置３を制御する。
　細胞培養容器１上に存在する細胞集合体９の特徴量（面積若しくは寸法、真円度、細胞の密度等）と比較するべき上限値及び／または下限値は、ユーザが任意に設定することができる。解析部５１として機能するコンピュータ５は、ユーザの手による上限値及び／または下限値の入力を入力装置８を介して受け付けるとともに、その入力された上限値及び／または下限値をメインメモリ５ｂまたは補助記憶デバイス５ｃに記憶して保持し、細胞培養容器１上の各細胞集合体９についての判定に用いる。
　本実施形態の細胞処理システムによれば、所望の大きさの細胞集合体９をより容易に、かつ所定の細胞培養期間の経過時に安定して収穫することが可能となる。
　なお、本発明は以上に詳述した実施形態に限られるものではない。まず、不要細胞を致死させるためのレーザ照射処理に使用するレーザＬの波長は、４０５ｎｍに限定されないことは言うまでもない。他の波長のレーザＬを採用する場合には、その波長の光を吸収することができる色素構造を含んだ材料（特に、ポリマー）を用いて細胞培養容器１の被照射層１２を構成することが求められる。例えば、波長が８０８ｎｍや１０６４ｎｍ等の近赤外線レーザＬを使用するのであれば、フタロシアニン類（フタロシアニン誘導体、フタロシアニン系近赤外線吸収色素）を材料として用いることが一案である。但し、その場合には、細胞に移行しないよう、ポリマーの側鎖に化学結合により固定されることが望ましい。また、配位錯体は、金属イオンが遊離することから、ポリマー化するものでも避けた方がよいと思われる。
　レーザビームＬの径を、５０μｍよりもさらに小さく絞ってもよい。例えば、コア径の小さい光ファイバを加工ノズル３３に接続し、レーザ光源３１から供給されるレーザ光Ｌをこの光ファイバを通じて加工ノズル３３に入力するようにすれば、加工ノズル３３から出射するレーザビームＬの径を２５μｍ以下に絞ることができ、その分単位面積あたりのレーザＬのエネルギ量（エネルギ密度）が増す。これにより、レーザ光源３１の最大出力が大きくなくとも、レーザＬの照射箇所即ち不要細胞の存在する箇所に多量のエネルギをピンポイントに与えることが可能となる。
　レーザビームＬを被照射層１２に照射したときの投影形状は、点状または円形状には限られない。レーザビームＬの投影形状を、所定方向に引き延ばした棒状のラインビームに成形しても構わない。ラインビームを用いれば、細胞培養容器１（の被照射層１２）における一定の領域をラスタスキャンするのに要する時間をより短縮できる。
　上記実施形態では、支持体２に支持させた細胞培養容器１に向けてレーザＬを照射する加工ノズル３３をＸＹステージ４に搭載し、加工ノズル３３をＸ軸方向及びＹ軸方向に移動させるようにしていたが、細胞培養容器１を支持する支持体２をＸＹステージ等の変位機構４に搭載して、細胞培養容器１をＸ軸方向及びＹ軸方向に移動させるようにしても構わない。あるいは、加工ノズル３３と支持体２とのうち一方をＸ軸方向に走行可能なリニアモータ台車等に搭載し、他方をＹ軸方向に走行可能なリニアモータ台車等に搭載することにより、加工ノズル３３から出射するレーザビームＬを細胞培養容器１の被照射層１２に対して相対的にＸ軸方向及びＹ軸方向の両方向に変位させ得るようにすることも考えられる。
　細胞培養容器１の被照射層１２に対するレーザＬの照射位置を変位させるための変位機構４として、ガルバノスキャナを採用してもよい。周知の通り、ガルバノスキャナは、レーザ光源３１から供給されるレーザ光Ｌを反射するミラーをサーボモータやステッピングモータ等によって回動させるもので、ミラーを介してレーザＬの光軸を高速に変化させることが可能である。尤も、ガルバノスキャナを採用する場合、細胞培養容器１の被照射層１２に対してレーザ光Ｌの光軸が交わる角度を厳密には一定に保つことができない。また、レーザ光源が半導体レーザ等であり、当該レーザ光源が発振するレーザを光ファイバ等を用いてガルバノスキャナまで伝送する場合、被照射層１２に照射されるレーザビームＬの径若しくは投影形状の寸法を極小に絞ることも容易でない。レーザビームＬの径若しくは投影形状の寸法を極小に絞ってエネルギ密度を高めるためには、ＸＹステージ４やリニアモータ台車のような、レーザビームＬの光軸を細胞培養容器１の被照射層１２に対して相対的に平行移動させ得る機構を用いることが好ましい。但し、ファイバーレーザをレーザ光源として採用したり、固体レーザ光を集光したりすることにより、被照射層１２に照射されるレーザビームＬの径若しくは投影形状の寸法を極小に絞ることができるようになる。
　細胞培養容器１内の細胞を撮影する撮像装置６の構成要素となる固体撮像素子を、加工ノズル３３に付設することも考えられる。
　細胞培養容器１内の細胞を撮影する際の照明光源として、加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌを利用することも考えられる。無論、その場合に加工ノズル３３から細胞培養容器１に照射するレーザＬの出力は、不要細胞を死滅させるために細胞培養容器１に照射するレーザＬの出力よりも十分に弱める必要がある。
　上記実施形態では、細胞培養容器１の容器本体１１に成形されているウェル１０の底に被照射層１２の材料となるポリマーを塗布して被照射層１２を構成していた。だが、複数のウェルを包有するマルチディッシュ形の容器本体に、スピンコート等によりポリマーを塗布して被照射層を形成することは困難を伴う。そこで、レーザ光Ｌの照射を受けて熱を生じさせる材料を含有する板状体を作製し、この板状体を容器本体の各ウェルの底に設置または接着することにより、細胞培養容器の被照射層を構成するようにすることが考えられる。板状体は、レーザ光Ｌを透過させる透明性または透光性を有するプラスチックやガラス等の材料により構成した薄板にレーザ光Ｌを吸収する色素を塗布したものであってもよく、そのような薄板の構成材料にレーザ光Ｌを吸収する色素を含有させたものであってもよい。上記実施形態において述べた色素構造含有ポリマーや光酸発生剤を、レーザ光Ｌを吸収する色素として用いることも当然に可能である。
　上記実施形態では、レーザ光Ｌを細胞培養容器１の下方から容器本体１１を透過させた上で被照射層１２に照射していたが、レーザ光Ｌを上方即ち被照射層１２の表面側から（容器本体１１を透過させずに）被照射層１２に直接照射することも考えられる。この場合、容器本体１１がレーザ光Ｌを透過させる透明性または透光性を有している必要はない。照射するレーザ光Ｌの焦点は、被照射層１２の上にある細胞に合わせるのではなく、被照射層１２に合わせることが好ましい。
　細胞培養容器１を用いてｉＰＳ細胞その他の細胞を培養する場合に、フィーダー細胞を併用してもよい。本発明に係るレーザ加工機は、細胞培養容器１内の不要となったフィーダー細胞を死滅処理するためにも利用できる。
　被照射層１２が敷設されていない細胞培養容器で培養された細胞集合体９について、上述した間引きや切断、トリミング処理を実行する場合には、レーザ加工機の加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌの焦点を細胞培養容器上の細胞集合体９の層に合わせ、レーザ光Ｌを細胞集合体９に直接照射することで、致死させるべき不要な細胞を死滅させるようにしてもよい。この場合のレーザ光Ｌは、ピコ秒レーザやフェムト秒レーザのようなパルス幅が極小のパルスレーザであることがある。
　本発明に係る細胞処理システムは、未分化ｉＰＳ細胞の培養のみならず、ｉＰＳ細胞コロニー作製の後の分化誘導にも援用することができる。目的細胞即ち分化した細胞からなる必要な大きさの細胞集合体９を所定の細胞培養期間後に収穫するべく、増殖の遅い細胞集合体９を間引いたり、増殖の速い細胞集合体９を切断またはトリミングしたり、不要細胞即ち未分化の細胞や目的細胞以外の細胞に分化した細胞を死滅させて排除したりする点は、未分化ｉＰＳ細胞の培養における処理と同様であるからである。
　細胞集合体９の外周縁部９２の細胞を致死させるトリミングは、面積若しくは寸法が上限値以下である適正な大きさの細胞集合体９に施しても構わない。細胞集合体９のトリミング処理において、細胞集合体９の周縁部９２をどれぐらいの幅で死滅させるか、またはトリミング後の細胞集合体９の寸法（円６４の径の大きさ）は、ユーザが任意に設定することができる。コンピュータ５は、ユーザの手によるトリミングの対象となる周縁部９２の幅またはトリミング後の細胞集合体９の寸法の値の入力を入力装置８を介して受け付けるとともに、その入力された値をメインメモリ５ｂまたは補助記憶デバイス５ｃに記憶して保持し、細胞培養容器１上の細胞集合体９のトリミング処理におけるレーザＬの照射位置の座標の決定に用いる。
　その他、各部の具体的構成は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
　本発明は、細胞培養容器上で培養される細胞のうち不要な細胞を死滅させて必要な細胞集合体９を育成するために利用できる。
　１…細胞培養容器
　３…レーザ照射装置
　３３…加工ノズル
　４…変位機構（ＸＹステージ）
　５１…解析部
　５２…制御部
　６…撮像装置
　７…表示装置
　８…入力装置
　９…細胞集合体
　Ｌ…レーザ光

Claims (4)

  1. 細胞培養容器上で培養される細胞のうち不要な細胞を死滅させて必要な細胞集合体を育成するためのシステムであって、
    細胞培養容器の一部または全部を撮像する撮像装置と、
    前記撮像装置で撮像された画像を構成している画素値を基に、前記細胞培養容器上に存在している一または複数の細胞集合体の各々の面積若しくは寸法を算出する解析部と、
    前記解析部で算出した各細胞集合体の面積若しくは寸法を画面に表示する表示装置と、
    前記細胞培養容器に向けてレーザを照射することで細胞培養容器上に存在している細胞を致死させるレーザ照射装置と、
    ユーザの手による、前記細胞培養容器上に存在している細胞のうちの何れをレーザ照射により致死させ若しくはレーザ照射をせずに生存させるかを指定する操作入力、または前記細胞培養容器上のどの位置にレーザを照射し若しくはレーザを照射しないかを指定する操作入力を受け付ける入力装置と、
    前記操作入力装置で受け付けた操作入力に応じて前記レーザ照射装置から前記細胞培養容器に向けてレーザを照射する際の照射位置を制御する制御部と
    を具備する細胞処理システム。
  2. 前記解析部が、細胞集合体の面積若しくは寸法についての上限値または下限値を記憶しており、前記細胞培養容器上に存在している各細胞集合体の面積若しくは寸法がその上限値または下限値を超えていないかどうかを判定し、
    前記表示装置が、前記解析部による、前記細胞培養容器上に存在している各細胞集合体についての判定結果を画面に表示する請求項１記載の細胞処理システム。
  3. 細胞培養容器上で培養される細胞のうち不要な細胞を死滅させて必要な細胞集合体を育成するためのシステムであって、
    細胞培養容器の一部または全部を撮像する撮像装置と、
    前記撮像装置で撮像された画像を構成している画素値を基に、前記細胞培養容器上に存在している一または複数の細胞集合体の各々の面積若しくは寸法を算出するとともに、細胞集合体の面積若しくは寸法についての上限値または下限値を記憶しており、細胞培養容器上に存在している各細胞集合体の面積若しくは寸法がその上限値または下限値を超えていないかどうかを判定する解析部と、
    前記細胞培養容器に向けてレーザを照射することで細胞培養容器上に存在している細胞を致死させるレーザ照射装置と、
    前記解析部による判定結果に応じて前記レーザ照射装置から前記細胞培養容器に向けてレーザを照射する際の照射位置を制御する制御部と
    を具備する細胞処理システム。
  4. 前記制御部が、前記細胞培養容器上に存在している細胞集合体のうち、前記下限値よりも面積若しくは寸法の小さい細胞集合体を致死させるべくレーザを照射する一方、前記上限値よりも面積若しくは寸法の大きい細胞集合体を切断しまたはその面積若しくは寸法を縮小するべくレーザを照射するように、前記レーザ照射装置を制御する請求項２または３記載の細胞処理システム。
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