WO2017111194A1 - Optical probe for bio-sensor, optical bio-sensor including same, and method for manufacturing optical probe for bio-sensor - Google Patents

Optical probe for bio-sensor, optical bio-sensor including same, and method for manufacturing optical probe for bio-sensor Download PDF

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윤현철
한용덕
김재호
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Definitions

  • the present invention relates to an optical marker for a biosensor capable of optically detecting the presence, concentration, etc. of the target biological material, an optical biosensor comprising the same and a method for manufacturing the optical marker for the biosensor.
  • optical biosensors developed so far are optical probes to confirm the reaction and binding in a bioreceptor that can selectively react and bind with a target analyte to be detected.
  • Representative optical signal markers include enzymes, color dyes, metal nanoparticles, organic fluorescent dyes, inorganic fluorescent nanoparticles, and the like. These optical markers are spectroscopic such as changes in the intensity of absorption spectrum due to color, spectral shifting of the absorption spectrum, and changes in fluorescence intensity in the presence of excitation light.
  • spectroscopic optical signals act very positively on the signal sensitivity of the biosensor, but in order to detect these spectroscopic optical signals, 1) a high power short wavelength laser light source or a halogen group lamp and a monochromator are used.
  • a high power short wavelength laser light source or a halogen group lamp and a monochromator are used.
  • the use of combined light sources, 2) an excitation / emission filter for the characteristics of the corresponding spectral signal, and 3) photosensitive elements such as photomultiplier tubes (PMT) are essential.
  • PMT photomultiplier tubes
  • These spectroscopic light sources and optical components are expensive and have disadvantages such as high complexity and high power requirements. Therefore, point-of-care-testing (POCT) optics are operated in limited resource-limited conditions. There is a problem that is difficult to apply as a biosensor.
  • the new optical analysis methodology should be able to derive optical signals from non-spectral light sources, such as white mixed light, which can be used at least with low-magnification optical microscopes or smartphone cameras, without the need for separate spectral filters or expensive light-receiving elements.
  • non-spectral light sources such as white mixed light
  • the conditions such as conversion and analysis should be satisfied using only the optical system.
  • One object of the present invention is to provide an optical marker for a biosensor that can generate a strong retroreflective signal for incident light and thus can be applied to a non-spectroscopic biosensor.
  • Another object of the present invention is to provide a biosensor having the optical marker capable of detecting the presence, concentration, etc. of the target biological material in a non-spectroscopic manner.
  • An optical marker for a biosensor may selectively bind to a target biomaterial, and may retroreflect incident light, and may include transparent core particles; A total reflection inducing layer covering a part of the surface of the core particle and formed of a material having a refractive index smaller than that of the core particle; A modified layer formed on the total reflection inducing layer; And a biocognitive material coupled to the modifying layer and selectively binding to the target biomaterial.
  • the core particles have a spherical shape, and may be formed of a transparent oxide or a transparent polymer material.
  • the core particles may be formed of one material selected from the group consisting of silica, glass, polystyrene, polymethyl methacrylate, and the like.
  • the core particles may have an average diameter of more than 700nm 5 ⁇ m.
  • the total reflection inducing layer may cover an area of about 30% or more and 70% or less of the surface of the core particles.
  • the core particles may be formed of a material having a refractive index of 1.4 or more
  • the total reflection inducing layer may be formed of a material having a refractive index of 1.2 or less.
  • the total reflection inducing layer may be formed of one or more materials selected from the group consisting of aluminum (Al), copper (Cu), gold (Au), silver (Ag), zinc (Zn), and the like.
  • the total reflection inducing layer may have a thickness of 10 to 100nm.
  • the modifying layer may be formed of one or more materials selected from the group consisting of platinum (Pt), gold (Au), silver (Ag) and the like.
  • the modified layer may have a thickness of 10 to 100 nm.
  • the biocognitive material may include one or more selected from proteins, nucleic acids, ligands and the like.
  • the biocognitive substance may be an antibody substance that specifically reacts with the antigenic substance.
  • the biocognitive substance may be The biomaterial may be a nucleic acid material capable of complementary binding to a genetic material, and when the target biomaterial is a cell signal material, the biocognitive material may be a chemical ligand material selectively binding to the cell signal material.
  • the optical marker may further include a magnetic layer disposed between the total reflection inducing layer and the modifying layer and formed of a magnetic material.
  • Biosensor is a biomaterial fixing unit for fixing the target biomaterial; An optical label that selectively binds to the target biomaterial and can retroreflect irradiated light; A light source unit emitting light to the optical label unit; And a light receiving unit for receiving the light retroreflected by the optical label unit.
  • the optical label portion is a spherical transparent core particle; A total reflection inducing layer covering a part of the surface of the core particle and formed of a material having a refractive index smaller than that of the core particle; A modified layer formed on the total reflection inducing layer; And a biocognitive material coupled to the modifying layer and selectively binding to the target biomaterial.
  • the biomaterial fixing unit comprises a substrate; And a fixing material disposed on the substrate and selectively coupled to the target biomaterial, wherein the light source may irradiate light in a direction inclined at 5 to 60 ° with respect to a normal of the surface of the substrate.
  • the light receiving unit may include: a light splitting unit configured to split incident light incident on the optical labeling unit and light retroreflected from the optical labeling unit; An image generator for receiving and imaging the retroreflected optical signal divided by the light splitter; And an image analyzer configured to analyze image information generated by the image generator, in which case the light splitter may be installed at an angle of 0 to 60 ° in the same direction as the light source with respect to a normal of the substrate surface.
  • Method for producing an optical marker for a biosensor comprises the steps of preparing a transparent core particles; Arranging the core particles in a single layer on the surface of the substrate; Sequentially performing a deposition process of a first metal and a deposition process of a second metal on the substrate on which the core particles are arranged to form a total reflection guide layer and a modification layer which are laminated to cover a portion of the surface of the core particles; Coupling a biocognitive material selectively binding to a target biomaterial to the modified layer; And separating the optical marker including the core particle, the total reflection inducing layer, the modifying layer, and the biocognitive material from the substrate.
  • the transparent core particles may include silica core particles prepared by a Stober method using Tetraethylorthosilicate (TEOS).
  • TEOS Tetraethylorthosilicate
  • arranging the core particles in a monolayer on a surface of the substrate comprises: modifying the surfaces of the core particles hydrophobicly and then arranging them in a monolayer at an interface of water and air; And drawing the substrate to the air direction from inside the water to attach the core particles to the surface of the substrate.
  • the first metal and the second metal is deposited on the substrate by a method of chemical vapor deposition (CVD) or physical vapor deposition (PVD), respectively,
  • the first metal comprises at least one selected from the group consisting of aluminum (Al), copper (Cu), gold (Au) and silver (Ag), and the second metal is platinum (Pt), gold (Au) and silver ( Ag) may comprise one or more selected from the group consisting of.
  • the first metal may be deposited such that the total reflection inducing layer covers 30 to 70% of the surface of the core particle.
  • the biocognitive material when the target biomaterial is an antigenic material, the biocognitive material may be an antibody protein or an aptamer material that specifically reacts with the antigenic material, and the target biomaterial is a genetic material.
  • the biocognitive material may be a nucleic acid material capable of complementary binding to the genetic material
  • the biocognitive material when the target biomaterial is a cell signal material, the biocognitive material is a chemical ligand that selectively binds to the cell signal material It may be a substance.
  • the step of coupling the biocognitive material to the modified layer having a disulfide group in one terminal or molecular structure and in the other terminal or molecular structure Bonding a self-assembled monolayer (SAM) having a succinimide group to the surface of the modified layer; Coupling an amine-terminated PAMAM dendrimer to the self-assembled monolayer; coupling a cross-linker having a sulfo-NHS group (N-hydroxysulfosuccinimide group) and a diazirine group to the PAMAM dendrimer; And irradiating with ultraviolet light to photo-crosslinking between the amine group of the antibody protein and the diazirine group of the crosslinking agent.
  • SAM self-assembled monolayer
  • the method of manufacturing the optical marker for the biosensor may further comprise forming a protective film on the exposed surface of the core particles to prevent non-specific binding to the target biomaterial.
  • the optical marker since the optical marker has a total reflection inducing layer covering a part of the transparent core particle surface, it is possible to generate a very strong retroreflective signal even when using a non-spectral general light source such as white mixed light.
  • a non-spectral general light source such as white mixed light.
  • the biocognitive material is formed only on the modified layer of the surface of the optical marker, when the target biomaterial and the optical marker are combined, the exposed surface of the core particles is arranged to face the light source, thereby generating a stronger retroreflective signal.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining a biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2A and 2B are cross-sectional views illustrating an exemplary embodiment of the optical marker shown in FIG. 1.
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating a method of manufacturing an optical marker for a biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a view for explaining an embodiment of a method for producing a transparent oxide core particle.
  • FIG. 5 is a view for explaining an embodiment of a method for arranging the core particles in a single layer on the surface of the substrate.
  • FIG. 6 is a view for explaining an embodiment of a method for modifying a biocognitive material, which is a nucleic acid material, in a modified layer.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating an embodiment of a method of modifying a biotin biocognitive material in a modified layer.
  • FIG. 8 is a view for explaining an embodiment of a method for modifying a biocognitive material, which is an antibody protein material, in a modified layer.
  • FIG. 9 is a schematic diagram for explaining a biosensor manufactured according to the present invention for the experiment.
  • FIG 12 shows the use of optical marker (top) and photo-crosslinking techniques in which antibody IgG is modified through self-assembled monolayers (SAM), dendrimers, and photo-crosslinking techniques.
  • SAM self-assembled monolayers
  • SAM photo-crosslinking techniques
  • FIG. 13A and 13B are images and graphs showing experimental results of the experiment of Example 3.
  • FIG. 13A and 13B are images and graphs showing experimental results of the experiment of Example 3.
  • first and second may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.
  • the first component may be referred to as the second component, and similarly, the second component may also be referred to as the first component.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a biosensor according to an exemplary embodiment of the present invention
  • FIGS. 2A and 2B are cross-sectional views illustrating an exemplary embodiment of the optical label unit shown in FIG. 1.
  • the biosensor 100 may detect the presence, the concentration, etc. of the target biomaterial 10 through an optical method.
  • the target biomaterial 10 is not particularly limited, and may include a biomaterial containing one or more substances selected from proteins, polysaccharides, lipids, and the like, such as microorganisms such as bacteria and viruses, red blood cells, cells, and genetic substances.
  • the biosensor 100 may include an optical label unit 110, a biomaterial fixing unit 120, a light source unit 130, and a light receiving unit 140.
  • the biosensor 100 secures the target biomaterial 10 to the biomaterial fixing unit 120 and then selectively couples the optical label unit 110 to the target biomaterial 10. Subsequently, after irradiating the light generated by the light source unit 130 to the optical label unit 110 coupled to the target biological material 10, the light is retroreflected by the optical label unit 110 at the light receiving unit 140. By receiving it and analyzing it, the presence, concentration, etc. of the target biological material 10 can be detected.
  • the biosensor 100 first couples the optical label unit 110 to the target biomaterial 10 and then couples the optical label unit 110 to the biomaterial fixing unit 120, and then the After irradiating the light generated by the light source unit 130 to the optical label unit 110 coupled to the target biological material 10, the light receiving unit 140 receives the light retroreflected by the optical label unit 110 By analyzing this, the presence, concentration, etc. of the target biological material 10 may be detected.
  • the optical label unit 110 may retroreflect light emitted from the light source unit 130 in the direction of the light source unit 130, and may be selectively coupled to the target biomaterial 10.
  • the optical label unit 110 is a transparent core particle 111, the total reflection induction layer 112 covering a portion of the core particles 111, the formula formed on the total reflection induction layer 112 It may include a layer 113 and the biocognitive material 115 directly or indirectly coupled to the modified layer 113.
  • the core particle 111 may have a spherical shape.
  • the term 'spherical' is defined as including not only a perfect sphere whose radius from the center to every point on the surface is the same but also a substantial sphere whose difference between the maximum and minimum radius is less than about 10%.
  • the core particle 111 has an average diameter of about 700 nm or more and 5 ⁇ m or less, in consideration of a coupling property with the target biomaterial 10 or a relationship with a wavelength of light irradiated from the light source. Can have.
  • the core particles 111 may be formed of a transparent material that can transmit incident light.
  • the core particles 111 may be formed of a transparent oxide or a transparent polymer material.
  • the transparent oxide may include, for example, silica, glass, and the like, and the transparent polymer material may include, for example, polystyrene and polymethyl methacrylate. )) And the like.
  • the total reflection inducing layer 112 is formed to cover a part of the surface of the core particle 111, and totally reflects at least a portion of the light traveling through the core particle 111 to reflect the amount of light retroreflected in the direction of the light source. Can be increased.
  • the total reflection inducing layer 112 may be formed on the surface of the core particles 111 to cover an area of about 30% or more and 70% or less of the surface of the core particles 111.
  • the biosensor 100 has a large amount of light leaking without rereflection among the light incident inside the core particle 111.
  • the total reflection inducing layer 112 covers more than 70% of the surface of the core particle 111, the amount of light incident into the core particle 111 decreases, thereby decreasing the sensitivity of the biosensor 100.
  • the total reflection inducing layer 112 may be formed on the surface of the core particle 111 to cover about 40% or more and 60% or less of the surface of the core particle 111.
  • the total reflection induction layer 112 is the core particles It may be formed of a material having a refractive index smaller than that of 111.
  • the core particles 111 may be formed of a material having a refractive index of about 1.4 or more in the visible light wavelength range of at least 360 nm to 820 nm, and the total reflection inducing layer 112 may be less than the core particles 111. It may be formed of a material having a small refractive index.
  • the total reflection inducing layer 112 may be formed of a metal material having a smaller refractive index.
  • the total reflection inducing layer 112 includes gold (Au) having a refractive index of about 0.22 for light having a wavelength of 532 nm, silver (Ag) having a refractive index of about 0.15, and aluminum (Al) having a refractive index of about 1.0.
  • the total reflection induction layer 112 is preferably formed of a material having a strong adhesive force with the core particles (111).
  • the core particle 111 is formed of a transparent oxide
  • the total reflection inducing layer 112 may be formed of aluminum (Al) or copper (Cu).
  • the total reflection inducing layer 112 may have a thickness of about 10 to 100nm to prevent light leakage by light transmission and to improve the dispersibility of the optical label unit 110.
  • the total reflection induction layer 112 is less than 10 nm in thickness, some of the light incident inside the core particles 111 may pass through the total reflection induction layer 112 and may leak.
  • the thickness of the 112 exceeds 100 nm, the weight of the optical label portion 110 is increased, which may cause a problem that the dispersibility of the optical label portion 110 in the liquid is lowered.
  • the modification layer 113 may be formed on a surface of the total reflection inducing layer 112.
  • the modification layer 113 may be formed of a metal material which is easily bonded to a biological material.
  • the modification layer 113 may be formed of a noble metal such as platinum (Pt), gold (Au), silver (Ag), etc., which are easily modified by a biomaterial and have excellent oxidation stability.
  • the modification layer 113 may be formed as a separate layer independent of the total reflection induction layer 112.
  • the modified layer 113 may be a layer of a noble metal material covering the total reflection inducing layer 112.
  • the modification layer 113 and the total reflection inducing layer 112 may be integrally formed.
  • the total reflection inducing layer 112 is formed of a noble metal having a lower refractive index than the core particles such as gold (Au), silver (Ag), or the like, the total reflection inducing layer 112 may be the modification layer 113. Can also function.
  • the modifying layer 113 may have a thickness of about 10 to 100 nm to prevent dispersibility and aggregation in the liquid of the optical label unit 110.
  • the biocognitive material 115 may be directly or indirectly coupled to the modifying layer 113, and may be formed of a material that may be selectively bonded to the target biomaterial 10.
  • the biocognitive material 115 may be changed according to the target biomaterial 10 to be detected, and may include one or more selected from proteins, nucleic acids, ligands, and the like.
  • the biocognitive material 115 may be an antibody or aptamer substance that specifically reacts with the antigenic substance, and the target biomaterial When 10 is a genetic material, the biocognitive material 115 may be a nucleic acid material such as DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), or PNA (peptide nucleic acid) that is complementary to the genetic material.
  • the biocognitive material 115 may be a chemical ligand material that selectively binds to the cell signal material.
  • the biocognitive material 115 may be directly bonded to the modifying layer 113.
  • the biocognitive material 115 may be formed of the functional group and the metal of the modifying layer 113. It can be directly bonded to the modified layer 113 by the combination.
  • the biocognitive material 115 includes a thiol group (-SH)
  • the biocognitive material 115 may be bonded to the modified layer (B) by the bond between the thiol group and the metal of the modification layer 113. 113).
  • the biocognitive material 115 has a first functional group capable of binding to the metal of the modifying layer 113 and a second functional group capable of binding to the biocognitive material 115 in a molecular structure. It may be coupled to the modified layer 113 through an intermediate reactant such as a self assembled monolayer.
  • the intermediate reactant includes a thiol group or disulfide group capable of bonding with a metal of the modified layer 113 in a terminal or molecular structure.
  • a material having a carboxyl group, a receiving imide group, an aldehyde group, or the like capable of bonding to the amine group of the biocognitive material 115 in another terminal or molecular structure may be used.
  • the biocognitive material 115 may be formed to be bonded only to the surface of the modified layer 113 and not to be exposed to the exposed surface of the core particle 111.
  • the target living body is described as described below.
  • the exposed portion of the core particles 111 may be oriented so that the optical label unit 110 is directed toward the light source unit 130. It can be induced, and as a result can significantly improve the sensitivity of the biosensor 100.
  • the biocognitive material 115 may be selectively selectively coupled to the modified layer 113 in various ways depending on the type of the biocognitive material 115. This will be described later.
  • the optical label unit 110 is disposed between the total reflection induction layer 112 and the modification layer 113 as shown in FIG. 2B, and further includes a magnetic layer 114 formed of a magnetic material. It may include.
  • the magnetic layer 114 may be formed of a magnetic material such as iron (Fe), nickel (Ni), manganese (Mn), a sintered body or an oxide thereof.
  • the direction of the optical label unit 110 may be adjusted by applying a magnetic field from the outside, and the optical label unit may be used by using an external magnetic field. Only the optical label 110 may be easily separated in the mixture including the 110.
  • the biomaterial fixing part 120 may include a substrate 121 and a fixing material 122 disposed on the substrate 121 and selectively coupled to the target biomaterial 10.
  • the material, shape, etc. of the substrate 121 is not particularly limited.
  • a silicon substrate, a glass substrate, a polymer substrate, a paper substrate, a metal substrate, or the like, on which a gold (Au) thin film is formed may be used as the substrate 121, or the surface may be bonded to the fixing material 122.
  • This modified glass substrate, polymer substrate, paper substrate, metal substrate and the like can be used.
  • the fixation material 122 may be a material that selectively binds to the target biomaterial 10.
  • the fixation material 122 may be changed according to the target biomaterial 10 to be detected, and may include one or more selected from proteins, nucleic acids, ligands, and the like.
  • the fixation material 122 may be an antibody or an aptamer substance that specifically reacts with the antigenic substance.
  • the immobilization material 122 may be a nucleic acid material such as DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), etc.
  • the fixation material 122 may be a chemical ligand material that selectively binds to the cell signal material. That is, the fixation material 122 may be the same material as the biorecognition material 115 or may be another material that selectively binds to the target biomaterial 10.
  • the fixing material 122 may be directly bonded to the substrate 121 or may be bonded to the substrate 121 through an intermediate reactant such as a self assembled monolayer.
  • the fixing material 122 may be bonded to the substrate 121 in the same or similar manner to that of the biocognitive material 115 is bonded to the modifying layer 113.
  • the biomaterial fixing unit 120 is disposed on the substrate 121 to accommodate the solution containing the target biomaterial 10 together with the substrate 121 and to form a space opened to the upper ( It may further include).
  • the side wall may be disposed on the substrate 121 to surround the fixed material 122 coupled to the substrate 121. If it is possible to form a space for accommodating the solution containing the target biomaterial 10 together with the substrate 121, the structure, shape, material, etc. of the side wall is not particularly limited.
  • the light source unit 130 is disposed on the biomaterial fixing unit 120, and the optical label unit 110 coupled to the target biomaterial 10 in the accommodation space of the biomaterial fixing unit 120. It may include a light source for irradiating light. As the light source, a light source generating light in which light of various wavelengths is mixed may be used, or a light source generating monochromatic light of a specific wavelength may be used without limitation.
  • the light receiving unit 140 is disposed above the biological material fixing unit 120 so as to be spaced apart from the light source unit 130, and the optical label among the light generated by the light source unit 130 and irradiated to the optical label unit 110.
  • the configuration of the light receiver 140 is not particularly limited.
  • the light receiver 140 includes, in one embodiment, a microscope capable of directly identifying the retroreflected light, or in another embodiment, an image generator and an image to image the retroreflected light signal.
  • An image analysis unit for analyzing image information generated by the generation unit, or in another embodiment, the incident light incident on the optical label unit 110 from the light source unit 130 and the recursion from the optical label unit 110
  • An optical splitter for dividing the reflected light, a lens for concentrating and enlarging the optical signal divided by the optical splitter, an image generator for receiving and imaging the enlarged optical signal, and image information generated by the image generator It may include an image analysis unit for analyzing the.
  • the light source unit 130 is the substrate 121 to which the fixing material 122 is coupled
  • Light can be irradiated in a direction inclined at about 5 to 60 degrees with respect to the normal of the surface.
  • the light source unit 130 is inclined about 5 to 60 degrees with respect to the normal of the surface of the substrate 121.
  • the light splitter may be disposed to be irradiated with light, and the light splitter may be disposed to be inclined at a predetermined angle with respect to the normal of the surface of the substrate 121 to minimize the mirror reflection effect of the light generated by the light splitter.
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating a method of manufacturing an optical marker for a biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • the optical marker manufactured by the manufacturing method has the same structure as the optical marker 110 shown in FIGS. 1, 2A, and 2B.
  • a method of manufacturing the biosensor optical marker 110 may include preparing core particles 111 (S110); Arranging the core particles (111) in a single layer on a surface of a substrate (S120); The total reflection guide layer 112 stacked to cover a portion of the surface of the core particles 111 by performing a deposition process of a first metal and a deposition process of a second metal on the substrate on which the core particles 111 are arranged.
  • the core particles 111 may be synthesized by a chemical method.
  • the core particles 111 when the core particles 111 are formed of a transparent oxide, the core particles may be manufactured using a Stover method or a seed-growth method.
  • FIG. 4 is a view for explaining an embodiment of a method of manufacturing transparent oxide core particles, and illustrates a method of preparing silica core particles by a Stober method using Tetraethylorthosilicate (TEOS).
  • TEOS Tetraethylorthosilicate
  • the core particles 111 when the core particles 111 are formed of a transparent polymer material, the core particles 111 may be manufactured by a method such as suspension polymerization, dispersion polymerization, emulsion polymerization, or precipitation polymerization.
  • the core particles 111 manufactured by the above method may have a spherical shape having an average diameter of about 700 nm or more and 5 ⁇ m or less.
  • the core particles 111 are Langmuir-Blodgett as shown in FIG. 5. It can be arranged in a single layer on the substrate using a film) process.
  • the surfaces of the core particles 111 are hydrophobically modified, and they are densely arranged in a single layer at the interface of water and air.
  • a Langmuir-Blodgett film of the core particles 111 may be formed at an interface between the water and the air, and then transferred to the substrate.
  • the substrate in which the core particles 111 are arranged in a single layer to form the total reflection guide layer 112 first.
  • a deposition process of the first metal may be performed on the substrate, followed by deposition of the second metal.
  • the deposition of the first metal and the second metal may be deposited on the substrate by a method of chemical vapor deposition (CVD) or physical vapor deposition (PVD).
  • CVD chemical vapor deposition
  • PVD physical vapor deposition
  • the first metal and the second metal may be formed by using physical vapor deposition (PVD), which may be processed at a relatively low temperature, rather than the chemical vapor deposition method. It is preferable to deposit.
  • the first metal and the second metal may be deposited on the substrate by a method such as thermal evaporation deposition, sputtering deposition, or ion beam evaporation (EBPVD). Can be deposited on.
  • the first metal may be a metal having a refractive index of about 1.4 or more, such as aluminum (Al), copper (Cu), gold (Au), silver (Ag), and the second metal may be platinum (Pt), gold (Au), Precious metals such as silver (Ag) and the like.
  • the first metal may be deposited to a thickness of about 10 to 100 nm.
  • the second metal may be deposited to a thickness of about 10 to 100 nm to prevent dispersibility and aggregation in the liquid of the optical marker 110.
  • the first and second metals are deposited after arranging the spherical core particles 111 to form a Langmuir-Blodgett film on the substrate as described above, the first and second metals are deposited.
  • the total reflection inducing layer 112 and the modifying layer 113 may be formed to cover about 30 to 70% of the surface of the core particles 111 by adjusting the deposition thickness of the second metal.
  • the biocognitive material 115 may be a material that can selectively bind to the target biomaterial 10.
  • the biocognitive material 115 may be an antibody or aptamer substance that specifically reacts with the antigenic substance, and the target biomaterial
  • the biocognitive material 115 may be a nucleic acid material such as DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), or PNA (peptide nucleic acid) that is complementary to the genetic material.
  • the biocognitive material 115 may be a chemical ligand or a cell receptor material that selectively binds to the cell signal material.
  • the biocognitive material 115 may be directly or indirectly coupled to the modification layer 113. Specifically, when the biocognitive material 115 includes a functional group capable of bonding with the metal of the modifying layer 113, the biocognitive material 115 is a combination of the functional group and the metal of the modifying layer 113. It may be directly coupled to the modified layer 113 by. In contrast, the biocognitive material 115 is a magnet having a first functional group capable of binding to the metal of the modifying layer 113 and a second functional group capable of binding to the biocognitive material 115 in a molecular structure. It may be coupled to the modified layer 113 through an intermediate reactant such as a self assembled monolayer.
  • the biocognitive material 115 may be selectively formed to be bonded only to the surface of the modified layer 113 and not to be exposed to the exposed surface of the core particle 111.
  • the biocognitive material 115 is a nucleic acid material such as DNA, RNA, PNA that selectively reacts with the genetic material, as shown in Figure 6, 1 to a thiol group (-SH)
  • the nucleic acid material is directly bonded to the metal of the modification layer 113 through the thiol group introduced after introduction into the nucleic acid material, or (2) has a thiol group or disulfide group in one terminal or molecular structure and the other terminal or A self assembled monolayer having at least one functional group selected from a carboxyl group, a succinimide group, an aldehyde group, etc.
  • nucleic acid biocognitive material 115 to the modified layer 113 only by binding the nucleic acid material having the amine group introduced therein to the self-assembled monolayer. Can be combined.
  • the biocognitive material 115 when the biocognitive material 115 is a chemical ligand material that selectively reacts with a cell signaling material, it has a disulfide group in one terminal or molecular structure and succinimide in the other terminal or molecular structure.
  • a self-assembled monolayer (SAM) having a group or an aldehyde group is bonded only to the surface of the modified layer 113 through the bond between the disulfide group and the metal of the modified layer 113 and then the amine end of the self-assembled monolayer PAMAM dendrimers (amine-terminated poly (amidoamine) dendrimers) may be modified, and the chemical ligands to which succinimide groups are introduced may be bound thereto.
  • FIG. 7 illustrates an embodiment of a method of selectively modifying biotin in the modifying layer 113 in the same manner as described above.
  • the biocognitive material 115 is an antibody protein material that selectively binds to the antigen
  • the protein material such as the antibody is a core particle 111 and the modified layer 113 compared to the nucleic acid or chemical ligand More specific modifications are needed because nonspecific binding to) occurs very strongly. Specifically, as shown in FIG.
  • a self-assembled monolayer having a disulfide group in one terminal or molecular structure and a succinimide group in the other terminal or molecular structure is formed with the disulfide group and the modified layer ( After bonding to the surface of the modified layer 113 through the bonding between the metal of 113), the PAMAM dendrimer (amine-terminated poly (amidoamine) dendrimer) of the amine terminal can be modified to the self-assembled monolayer.
  • a cross-linker having a sulfo-NHS group (N-hydroxysulfosuccinimide group) and a diazirine group is formed through covalent formation between the amine group of the PAMAM dendrimer group and the sulfo-NHS group group of the crosslinker.
  • the BSA-containing solution may be treated under dark conditions to protect the exposed surface of the core particle 111 in which the modified layer 113 is not formed.
  • the antibody protein is introduced with an amine group, and then irradiated with ultraviolet light to induce photo-crosslinking between the diazirine group of the crosslinking agent and the amine group of the antibody protein, thereby providing the antibody protein. May be bonded to the crosslinking agent.
  • crosslinking agent sulfo-NHS-diazirine (SDA), NHS-SS-Diazirine (SDAD), sulfo-NHS-SS-Diazirine (sulfo-SDAD), N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide (ANB- NOS), sulfosuccinimidyl 6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH) and the like can be used.
  • SDA sulfo-NHS-diazirine
  • SDAD NHS-SS-Diazirine
  • sulfo-SDAD sulfo-NHS-SS-Diazirine
  • ANB- NOS N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide
  • the optical marker 110 manufactured as described above may be separated from the substrate through an ultrasonic treatment.
  • a protective film may be formed on the exposed surface of the core particle 111 and the surface of the modified layer 113 to prevent nonspecific binding to the target biological material.
  • the optical marker 110 is immersed in a phosphate buffer solution containing bovine serum albumin (BSA) to expose the surface of the core particles 111 except for the biocognitive material 115 and the modified layer 113.
  • BSA bovine serum albumin
  • the protective film may be formed on the surface.
  • Samples are attached to a carbon tape having first particles including spherical silica core particles and a total aluminum reflection inducing layer covering 50% of the surface thereof, and second particles consisting of silica core particles only.
  • first particles including spherical silica core particles and a total aluminum reflection inducing layer covering 50% of the surface thereof, and second particles consisting of silica core particles only.
  • second particles consisting of silica core particles only.
  • a biosensor as shown in Figure 9 was prepared for their analysis. Meanwhile, silica core particles coated with the total aluminum reflection inducing layer were attached to the carbon tape so that the exposed surface of the core particles faced the light source.
  • a light source, a beam splitter, and the sample were arranged in a line.
  • the specimens are installed at an angle of 30 ° to the right side based on the direction of the incident light, and the influence of various mirror reflections that may be generated from the beam splitter.
  • the light splitter was also inclined 25 ° to the right of the incident light.
  • a portable spectrometer was used as the optical receiver in order to analyze the amount of light of the retroreflected light.
  • the amount of retroreflected light for each of the samples was measured using a 405 nm wavelength diode laser, a 532 nm diode laser, a 655 nm diode laser, and a white LED as the light source.
  • FIG. 10 is a result of analysis of retroreflected light on the samples when the three types of diode lasers are used as a light source
  • FIG. 11 is a result of analysis of retroreflected light on the samples when the white LED is used as the light source.
  • the strongest retroreflective signal was detected in the carbon tape with silica core particles coated with the total aluminum reflection inducing layer, and almost no retroreflective signal was detected in the carbon tape to which the particles were not attached.
  • the carbon tape with silica core particles coated with the total aluminum reflection inducing layer at the wavelengths of 405 nm, 532 nm and 655 nm was 458% and 246, respectively, compared with the carbon tape with pure silica particles.
  • %, 180% strong retroreflective signal was provided.
  • the result of retroreflective signal analysis of a white LED light source is similar to that of diode lasers.
  • the carbon tape having silica core particles coated with the total reflection induction layer on all wavelengths is pure silica particles. It gave a stronger retroreflective signal than the carbon tape with.
  • the total particle induction layer when the total particle induction layer is coated on the core particles, the amount of retroreflected light can be remarkably improved, and the particles can be used as optical markers in all visible light regions.
  • FIG 12 shows the use of optical marker (top) and photo-crosslinking techniques in which antibody IgG is modified through self-assembled monolayers (SAM), dendrimers, and photo-crosslinking techniques.
  • SAM self-assembled monolayers
  • SAM photo-crosslinking techniques
  • an antibody protein (mouse IgG) is modified through a self-assembled monolayer (SAM), a dendrimer, and a photo-crosslinking technique
  • the antibody is selectively modified on a modified layer only in a modified layer.
  • SAM self-assembled monolayer
  • the antibody was modified not only on the modified layer but also on the surface of the exposed silica core particles. You can check it. Therefore, when the biorecognition material is an antibody protein, it can be seen that photo-crosslinking technique plays an important role in the site-selective modification of the antibody protein.
  • Sandwich immunoassay was performed for cTnI, a myocardial infarction biomarker. Specifically, after modifying the cTnI immobilized antibody on the surface of the gold chip (Amine-reactive self-assembled monolayer (SAM) formed gold chip (gold chip), and reacted cTnI (0 ⁇ 1000 ng / mL) of various concentrations, In response, the antibody for detecting cTnI bound the modified optical marker. The sensing substrates were then imaged using an x5 objective lens and a white LED light source on an optical microscope.
  • SAM spot-reactive self-assembled monolayer
  • 13A and 13B are images and graphs showing experimental results for the above experiment.
  • the immunosensing technique implemented in the present invention detects clinically meaningful biomarkers even though only minimal optical systems and non-spectral white light sources are used. could be implemented.

Abstract

Disclosed is an optical probe for a bio-sensor, the optical probe being selectively bonded to a target analyte and retro-reflecting incident light. The optical probe comprises: transparent core particles; a total reflection inducing layer coating a part of the surface of the core particles and made of a material having a refractive index smaller than that of the core particles; a modification layer formed on the total reflection inducing layer; and a bio-recognition material bonded to the modification layer and selectively bonded to the target analyte. The optical probe can function as an excellent optical probe for both a non-spectral light source and a spectral light source.

Description

바이오 센서용 광학 표지자, 이를 포함하는 광학 바이오센서 및 상기 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법Optical marker for biosensor, optical biosensor comprising same and method for manufacturing optical marker for biosensor
본 발명은 목적 생체물질의 유무, 농도 등을 광학적으로 감지할 수 있는 바이오 센서용 광학 표지자, 이를 포함하는 광학 바이오센서 및 상기 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to an optical marker for a biosensor capable of optically detecting the presence, concentration, etc. of the target biological material, an optical biosensor comprising the same and a method for manufacturing the optical marker for the biosensor.
바이오센서 및 랩온어칩(Lab-on-A-Chip) 개념은 질병진단 기술의 핵심기술로 부상했지만 세계적으로도 현재까지 혈당센서, 감염증에 대한 래피드 킷 외에는 시장에서 뚜렷한 성공을 이루어내지 못하고 있는 실정이다. 특히 지금까지 개발된 광학식 바이오센서는 검출하고자 하는 생체물질(target analyte)과 선택적으로 반응 및 결합할 수 있는 생체감지층(bioreceptor)에서의 반응 및 결합여부를 확인하기 위해 광학신호 표지자(optical probe)를 사용하며, 대표적인 광학신호 표지자로는 효소, 발색염료, 금속나노입자, 유기형광염료, 무기형광나노입자 등이 있다. 이들 광학 표지자는 그 종류에 따라 발색에 의한 흡광스펙트럼(absorption spectrum)의 강도변화, 흡광스펙트럼의 적색편이(spectral shifting), 여기광(excitation light) 존재 하에서의 형광발광(fluorescence) 강도 변화 등의 분광학적 광학신호를 제공하는데, 이러한 분광학적 광학신호는 바이오센서의 신호민감도에 매우 긍정적으로 작용하나, 이들 분광학적 광학신호들을 검출하기 위해서는 1)고출력 단파장 레이저 광원 혹은 할로겐족 램프와 모노크로메이터(monochromator)가 조합된 광원, 2)해당 분광신호 특성에 맞는 분광 필터(excitation/emission filter) 3)광전증배관(photomultiplier tube, PMT) 등과 같은 고민감도의 수광 소자 등의 사용이 필수적이다. 이들 분광학적 광원 및 광학부품들은 고가이며 높은 복잡성과 고전력 요구 등의 단점을 가지고 있으므로, 제한된 분석환경(resource-limited condition)에서 운용이 되는 현장 진단형(point-of-care-testing, POCT) 광학 바이오센서로서 적용되기 어려운 문제점이 있다. The concept of biosensor and lab-on-a-chip has emerged as a core technology for disease diagnosis technology, but it has not been able to achieve clear success in the market other than blood glucose sensors and rapid kits for infectious diseases. to be. In particular, the optical biosensors developed so far are optical probes to confirm the reaction and binding in a bioreceptor that can selectively react and bind with a target analyte to be detected. Representative optical signal markers include enzymes, color dyes, metal nanoparticles, organic fluorescent dyes, inorganic fluorescent nanoparticles, and the like. These optical markers are spectroscopic such as changes in the intensity of absorption spectrum due to color, spectral shifting of the absorption spectrum, and changes in fluorescence intensity in the presence of excitation light. These spectroscopic optical signals act very positively on the signal sensitivity of the biosensor, but in order to detect these spectroscopic optical signals, 1) a high power short wavelength laser light source or a halogen group lamp and a monochromator are used. The use of combined light sources, 2) an excitation / emission filter for the characteristics of the corresponding spectral signal, and 3) photosensitive elements such as photomultiplier tubes (PMT) are essential. These spectroscopic light sources and optical components are expensive and have disadvantages such as high complexity and high power requirements. Therefore, point-of-care-testing (POCT) optics are operated in limited resource-limited conditions. There is a problem that is difficult to apply as a biosensor.
따라서 직관적이고 상용화 가능성이 높은 현장 진단형 광학 바이오센서의 구현을 위해서는 비분광 분석에 의한 새로운 광학신호 검출, 변환, 분석 방법론 등의 개발이 필수적이다. 새로운 광학분석방법론은 백색 혼합광과 같이 분광되지 않은 일반광원으로부터 광학신호를 유도할 수 있어야 하며, 해당 신호는 별도의 분광 필터나 고가의 수광 소자의 도움 없이 저배율의 광학현미경 또는 스마트폰 카메라 등 최소한의 광학계만을 이용하여 변환, 분석이 가능해야 하는 등의 조건을 만족시켜야 한다. Therefore, the development of new optical signal detection, conversion, and analysis methodologies by non-spectral analysis is essential for the realization of an intuitive and highly commercialized on-site diagnostic optical biosensor. The new optical analysis methodology should be able to derive optical signals from non-spectral light sources, such as white mixed light, which can be used at least with low-magnification optical microscopes or smartphone cameras, without the need for separate spectral filters or expensive light-receiving elements. The conditions such as conversion and analysis should be satisfied using only the optical system.
본 발명의 일 목적은 입사 광에 대해 강한 재귀반사 신호를 생성할 수 있어서 비분광식 바이오센서에 적용할 수 있는 바이오 센서용 광학 표지자를 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide an optical marker for a biosensor that can generate a strong retroreflective signal for incident light and thus can be applied to a non-spectroscopic biosensor.
본 발명의 다른 목적은 상기 광학 표지자를 구비하여 비분광 방식으로 목적 생체물질의 유무, 농도 등을 감지할 수 있는 바이오 센서를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a biosensor having the optical marker capable of detecting the presence, concentration, etc. of the target biological material in a non-spectroscopic manner.
본 발명의 또다른 목적은 상기 광학 표지자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for preparing the optical marker.
본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서용 광학 표지자는 목적 생체물질과 선택적으로 결합하고, 입사광을 재귀반사시킬 수 있고, 투명한 코어 입자; 상기 코어 입자 표면의 일부를 피복하고, 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 물질로 형성된 전반사 유도층; 상기 전반사 유도층 상에 형성된 수식층; 및 상기 수식층에 결합되고, 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 포함한다. An optical marker for a biosensor according to an embodiment of the present invention may selectively bind to a target biomaterial, and may retroreflect incident light, and may include transparent core particles; A total reflection inducing layer covering a part of the surface of the core particle and formed of a material having a refractive index smaller than that of the core particle; A modified layer formed on the total reflection inducing layer; And a biocognitive material coupled to the modifying layer and selectively binding to the target biomaterial.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자는 구형의 형상을 갖고, 투명한 산화물 또는 투명한 고분자 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 코어 입자는 실리카(silica), 글라스(glass), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate)) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 물질로 형성될 수 있다. 한편, 상기 코어 입자는 700nm 이상 5㎛ 이하의 평균 직경을 가질 수 있다. In one embodiment, the core particles have a spherical shape, and may be formed of a transparent oxide or a transparent polymer material. For example, the core particles may be formed of one material selected from the group consisting of silica, glass, polystyrene, polymethyl methacrylate, and the like. On the other hand, the core particles may have an average diameter of more than 700nm 5㎛.
일 실시예에 있어서, 상기 전반사 유도층은 상기 코어 입자의 표면 중 약 30％ 이상 70％ 이하의 면적을 피복할 수 있다.In one embodiment, the total reflection inducing layer may cover an area of about 30% or more and 70% or less of the surface of the core particles.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자는 1.4 이상의 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있고, 상기 전반사 유도층은 1.2 이하의 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 유도층은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag), 아연(Zn) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질로 형성될 수 있다. In one embodiment, the core particles may be formed of a material having a refractive index of 1.4 or more, and the total reflection inducing layer may be formed of a material having a refractive index of 1.2 or less. For example, the total reflection inducing layer may be formed of one or more materials selected from the group consisting of aluminum (Al), copper (Cu), gold (Au), silver (Ag), zinc (Zn), and the like.
일 실시예에 있어서, 상기 전반사 유도층은 10 내지 100nm의 두께를 가질 수 있다. In one embodiment, the total reflection inducing layer may have a thickness of 10 to 100nm.
일 실시예에 있어서, 상기 수식층은 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag) 등으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질로 형성될 수 있다. 한편, 상기 수식층은 10 내지 100 nm의 두께를 가질 수 있다. In one embodiment, the modifying layer may be formed of one or more materials selected from the group consisting of platinum (Pt), gold (Au), silver (Ag) and the like. On the other hand, the modified layer may have a thickness of 10 to 100 nm.
일 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질은 단백질, 핵산, 리간드 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 생체물질이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 물질일 수 있고, 상기 목적 생체물질이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질일 수 있다. In one embodiment, the biocognitive material may include one or more selected from proteins, nucleic acids, ligands and the like. For example, when the target biomaterial is an antigenic substance, the biocognitive substance may be an antibody substance that specifically reacts with the antigenic substance. When the target biomaterial is a genetic substance, the biocognitive substance may be The biomaterial may be a nucleic acid material capable of complementary binding to a genetic material, and when the target biomaterial is a cell signal material, the biocognitive material may be a chemical ligand material selectively binding to the cell signal material.
일 실시예에 있어서, 상기 광학 표지자는 상기 전반사 유도층과 상기 수식층 사이에 배치되고, 자성 물질로 형성된 자성층을 더 포함할 수 있다. In an embodiment, the optical marker may further include a magnetic layer disposed between the total reflection inducing layer and the modifying layer and formed of a magnetic material.
본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서는 목적 생체물질을 고정하는 생체물질 고정부; 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하고, 조사된 광을 재귀반사시킬 수 있는 광학 표지부; 상기 광학 표지부에 광을 조사하는 광원부; 및 상기 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광을 수용하는 수광부를 포함한다. Biosensor according to an embodiment of the present invention is a biomaterial fixing unit for fixing the target biomaterial; An optical label that selectively binds to the target biomaterial and can retroreflect irradiated light; A light source unit emitting light to the optical label unit; And a light receiving unit for receiving the light retroreflected by the optical label unit.
일 실시예에 있어서, 상기 광학 표지부는 구형의 투명한 코어 입자; 상기 코어 입자 표면의 일부를 피복하고, 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 물질로 형성된 전반사 유도층; 상기 전반사 유도층 상에 형성된 수식층; 및 상기 수식층에 결합되고, 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 포함할 수 있다. In one embodiment, the optical label portion is a spherical transparent core particle; A total reflection inducing layer covering a part of the surface of the core particle and formed of a material having a refractive index smaller than that of the core particle; A modified layer formed on the total reflection inducing layer; And a biocognitive material coupled to the modifying layer and selectively binding to the target biomaterial.
일 실시예에 있어서, 상기 생체물질 고정부는 기판; 및 상기 기판 상에 배치되고 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 고정 물질을 포함할 수 있고, 상기 광원은 상기 기판 표면의 법선에 대해 5 내지 60˚ 경사진 방향으로 광을 조사할 수 있다. 한편, 상기 수광부는 상기 광학 표지부에 입사하는 입사광과 상기 광학 표지부로부터 재귀반사된 광을 분할하는 광분할부; 상기 광분할부에 의해 분할된 재귀반사 광 신호를 수신하여 이미지화하는 화상 생성부; 및 상기 화상 생성부에 의해 생성된 화상 정보를 분석하는 화상 분석부를 포함할 수 있고, 이 경우, 상기 광분할부는 상기 기판 표면의 법선에 대해 상기 광원과 동일한 방향으로 0 내지 60˚ 경사지게 설치될 수 있다. In one embodiment, the biomaterial fixing unit comprises a substrate; And a fixing material disposed on the substrate and selectively coupled to the target biomaterial, wherein the light source may irradiate light in a direction inclined at 5 to 60 ° with respect to a normal of the surface of the substrate. The light receiving unit may include: a light splitting unit configured to split incident light incident on the optical labeling unit and light retroreflected from the optical labeling unit; An image generator for receiving and imaging the retroreflected optical signal divided by the light splitter; And an image analyzer configured to analyze image information generated by the image generator, in which case the light splitter may be installed at an angle of 0 to 60 ° in the same direction as the light source with respect to a normal of the substrate surface. have.
본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법은 투명한 코어 입자들을 제조하는 단계; 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들을 단층으로 배열시키는 단계; 상기 코어 입자들이 배열된 상기 기판 상에서 제1 금속의 증착 공정 및 제2 금속의 증착 공정을 순차적으로 수행하여 상기 코어 입자들의 표면 일부를 피복하도록 적층된 전반사 유도층 및 수식층을 각각 형성하는 단계; 상기 수식층에 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 결합시키는 단계; 및 상기 코어 입자, 상기 전반사 유도층, 상기 수식층 및 상기 생체인지물질을 포함하는 광학 표지자를 상기 기판으로부터 분리하는 단계를 포함한다. Method for producing an optical marker for a biosensor according to an embodiment of the present invention comprises the steps of preparing a transparent core particles; Arranging the core particles in a single layer on the surface of the substrate; Sequentially performing a deposition process of a first metal and a deposition process of a second metal on the substrate on which the core particles are arranged to form a total reflection guide layer and a modification layer which are laminated to cover a portion of the surface of the core particles; Coupling a biocognitive material selectively binding to a target biomaterial to the modified layer; And separating the optical marker including the core particle, the total reflection inducing layer, the modifying layer, and the biocognitive material from the substrate.
일 실시예에 있어서, 상기 투명한 코어 입자들은 TEOS(Tetraethylorthosilicate)를 이용한 스토버 방법(Stober method)에 의해 제조된 실리카 코어 입자들을 포함할 수 있다. In one embodiment, the transparent core particles may include silica core particles prepared by a Stober method using Tetraethylorthosilicate (TEOS).
일 실시예에 있어서, 상기 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들을 단층으로 배열시키는 단계는, 상기 코어 입자들의 표면을 소수성으로 개질한 후 이들을 물 및 공기의 계면에 단층으로 배열시키는 단계; 및 상기 기판을 상기 물의 내부에서 상기 공기 방향으로 인출하여 상기 코어 입자들을 상기 기판의 표면에 부착시키는 단계를 포함할 수 있다. In one embodiment, arranging the core particles in a monolayer on a surface of the substrate comprises: modifying the surfaces of the core particles hydrophobicly and then arranging them in a monolayer at an interface of water and air; And drawing the substrate to the air direction from inside the water to attach the core particles to the surface of the substrate.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 금속 및 상기 제2 금속은 각각 화학적 기상 증착법(chemical vapor deposition, CVD) 또는 물리적 기상 증착법(physical vaopr deposition, PVD)의 방법으로 상기 기판 상에 증착되고, 상기 제1 금속은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하며, 상기 제2 금속은 백금(Pt), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. In one embodiment, the first metal and the second metal is deposited on the substrate by a method of chemical vapor deposition (CVD) or physical vapor deposition (PVD), respectively, The first metal comprises at least one selected from the group consisting of aluminum (Al), copper (Cu), gold (Au) and silver (Ag), and the second metal is platinum (Pt), gold (Au) and silver ( Ag) may comprise one or more selected from the group consisting of.
일 실시예에 있어서, 상기 전반사 유도층이 상기 코어 입자 표면의 30 내지 70％를 피복하도록 상기 제1 금속이 증착될 수 있다. In one embodiment, the first metal may be deposited such that the total reflection inducing layer covers 30 to 70% of the surface of the core particle.
일 실시예에 있어서, 상기 목적 생체물질이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 단백질 또는 압타머(Aptamer) 물질일 수 있고, 상기 목적 생체물질이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질일 수 있다. In one embodiment, when the target biomaterial is an antigenic material, the biocognitive material may be an antibody protein or an aptamer material that specifically reacts with the antigenic material, and the target biomaterial is a genetic material. In the case of the biocognitive material may be a nucleic acid material capable of complementary binding to the genetic material, when the target biomaterial is a cell signal material, the biocognitive material is a chemical ligand that selectively binds to the cell signal material It may be a substance.
일 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질이 상기 항체 단백질 물질인 경우, 상기 수식층에 상기 생체인지물질을 결합시키는 단계는, 한쪽 말단 혹은 분자구조 내에 다이설파이드기를 구비하고 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 숙신이미드기를 구비하는 자기조립단분자막(SAM)을 상기 수식층의 표면에 결합시키는 단계; 상기 자기조립단분자막에 아민 말단의 PAMAM 덴드리머를 결합시키는 단계; sulfo-NHS기(N-hydroxysulfosuccinimide group) 및 디아지린기(diazirine group)를 구비하는 가교제(cross-linker)를 상기 PAMAM 덴드리머에 결합시키는 단계; 자외선을 조사하여 상기 항체 단백질의 아민기과 상기 가교제의 디아지린기(diazirine group) 사이의 광가교(photo-crosslinking) 시키는 단계를 포함할 수 있다. In one embodiment, when the biocognitive material is the antibody protein material, the step of coupling the biocognitive material to the modified layer, having a disulfide group in one terminal or molecular structure and in the other terminal or molecular structure Bonding a self-assembled monolayer (SAM) having a succinimide group to the surface of the modified layer; Coupling an amine-terminated PAMAM dendrimer to the self-assembled monolayer; coupling a cross-linker having a sulfo-NHS group (N-hydroxysulfosuccinimide group) and a diazirine group to the PAMAM dendrimer; And irradiating with ultraviolet light to photo-crosslinking between the amine group of the antibody protein and the diazirine group of the crosslinking agent.
일 실시예에 있어서, 상기 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법은 상기 목적 생체물질과의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 상기 코어 입자의 노출된 표면에 보호막을 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다.In one embodiment, the method of manufacturing the optical marker for the biosensor may further comprise forming a protective film on the exposed surface of the core particles to prevent non-specific binding to the target biomaterial.
본 발명에 따르면, 상기 광학 표지자가 투명한 코어 입자 표면의 일부를 피복하는 전반사 유도층을 구비하므로 백색 혼합광과 같이 분광되지 않은 일반광원을 이용하더라도 매우 강한 재귀반사 신호를 생성할 수 있다. 그리고 상기 생체인지물질이 광학 표지자의 표면 중 수식층에만 형성되어 목적 생체물질과 상기 광학 표지자를 결합시킨 경우 상기 코어 입자의 노출면이 광원을 향하도록 배열되므로 보다 강한 재귀반사 신호를 생성할 수 있다. 또한, 전반사 유도층과 수식층 사이에 자성층을 형성하는 경우, 외부에서 자기장을 인가함으로써 상기 광학 표지부(110)의 배향 방향을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 외부 자기장을 이용하여 혼합물 내에서 상기 광학 표지부만을 용이하게 분리할 수 있다.According to the present invention, since the optical marker has a total reflection inducing layer covering a part of the transparent core particle surface, it is possible to generate a very strong retroreflective signal even when using a non-spectral general light source such as white mixed light. In addition, when the biocognitive material is formed only on the modified layer of the surface of the optical marker, when the target biomaterial and the optical marker are combined, the exposed surface of the core particles is arranged to face the light source, thereby generating a stronger retroreflective signal. . In addition, in the case of forming a magnetic layer between the total reflection induction layer and the modified layer, by applying a magnetic field from the outside it is possible to adjust the orientation direction of the optical label unit 110 as well as the optical label in the mixture using an external magnetic field Only the bay can be easily separated.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위한 모식도이다.1 is a schematic diagram for explaining a biosensor according to an embodiment of the present invention.
도 2a 및 도 2b는 도 1에 도시된 광학 표지부의 실시예를 설명하기 위한 단면도들이다. 2A and 2B are cross-sectional views illustrating an exemplary embodiment of the optical marker shown in FIG. 1.
도 3는 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법을 설명하기 위한 순서도이다.3 is a flowchart illustrating a method of manufacturing an optical marker for a biosensor according to an embodiment of the present invention.
도 4는 투명 산화물 코어 입자를 제조하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.4 is a view for explaining an embodiment of a method for producing a transparent oxide core particle.
도 5는 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들을 단층으로 배열시키는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.5 is a view for explaining an embodiment of a method for arranging the core particles in a single layer on the surface of the substrate.
도 6은 핵산 물질인 생체인지물질을 수식층에 수식하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다. 6 is a view for explaining an embodiment of a method for modifying a biocognitive material, which is a nucleic acid material, in a modified layer.
도 7은 비오틴(Biotin) 생체인지물질을 수식층에 수식하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다. FIG. 7 is a diagram illustrating an embodiment of a method of modifying a biotin biocognitive material in a modified layer.
도 8은 항체 단백질 물질인 생체인지물질을 수식층에 수식하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다. 8 is a view for explaining an embodiment of a method for modifying a biocognitive material, which is an antibody protein material, in a modified layer.
도 9는 실험을 위해 본 발명에 따라 제작된 바이오 센서를 설명하기 위한 모식도이다. 9 is a schematic diagram for explaining a biosensor manufactured according to the present invention for the experiment.
도면 10은 광원으로 상기 3종류의 다이오드 레이저들을 사용한 경우의 상기 시료들에 대한 재귀반사 광의 분석 결과이다.10 is a result of analysis of retroreflected light on the samples when the three types of diode lasers are used as a light source.
도면 11은 광원으로 백색 LED를 사용한 경우의 상기 시료들에 대한 재귀반사 광의 분석 결과이다. 11 is a result of analysis of retroreflected light on the samples when a white LED is used as a light source.
도면 12는 항체단백질(mouse IgG)이 자기조립단분자막(SAM), 덴드리머(dendrimer) 그리고 광 가교(photo-crosslinking) 기법을 통해 수식된 광학 표지자(상단) 및 광 가교(photo-crosslinking) 기법의 사용 없이 자기조립단분자막(SAM)만을 이용하여 수식된 광학 표지자(하단)에 대해 형광이 표지된 anti-mouse IgG를 처리한 후의 형광현미경 사진들이다. 12 shows the use of optical marker (top) and photo-crosslinking techniques in which antibody IgG is modified through self-assembled monolayers (SAM), dendrimers, and photo-crosslinking techniques. Fluorescence micrographs after treatment of fluorescently labeled anti-mouse IgG with respect to the modified optical marker (bottom) using only self-assembled monolayer (SAM).
도 13a 및 도 13b는 실시예 3의 실험에 대한 실험 결과를 나타내는 이미지들과 그래프이다.13A and 13B are images and graphs showing experimental results of the experiment of Example 3. FIG.
이하, 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. As the inventive concept allows for various changes and numerous embodiments, particular embodiments will be illustrated in the drawings and described in detail in the text. However, this is not intended to limit the present invention to a specific disclosed form, it should be understood to include all modifications, equivalents, and substitutes included in the spirit and scope of the present invention. In describing the drawings, similar reference numerals are used for similar elements. In the accompanying drawings, the dimensions of the structures are shown in an enlarged scale than actual for clarity of the invention.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. Terms such as first and second may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another. For example, without departing from the scope of the present invention, the first component may be referred to as the second component, and similarly, the second component may also be referred to as the first component.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terminology used herein is for the purpose of describing particular example embodiments only and is not intended to be limiting of the invention. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly indicates otherwise. In this application, the terms "comprises" or "having" are intended to indicate that there is a feature, step, operation, component, part, or combination thereof described on the specification, and one or more other features or steps. It is to be understood that the present invention does not exclude, in advance, the possibility of the presence or addition of any operation, component, part, or combination thereof.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. Terms such as those defined in the commonly used dictionaries should be construed as having meanings consistent with the meanings in the context of the related art and shall not be construed in ideal or excessively formal meanings unless expressly defined in this application. Do not.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위한 모식도이고, 도 2a 및 도 2b는 도 1에 도시된 광학 표지부의 실시예를 설명하기 위한 단면도들이다. 1 is a schematic diagram illustrating a biosensor according to an exemplary embodiment of the present invention, and FIGS. 2A and 2B are cross-sectional views illustrating an exemplary embodiment of the optical label unit shown in FIG. 1.
먼저 도 1 및 도 2a를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서(100)는 광학적 방식을 통해 목적 생체물질(10)의 유무, 농도 등을 감지할 수 있다. 상기 목적 생체물질(10)은 특별히 제한되지 않으며, 세균, 바이러스 등의 미생물이나 적혈구, 세포, 유전자 물질 등과 같이 단백질, 다당류, 지질 등으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 함유하는 생체물질을 포함할 수 있다. First, referring to FIGS. 1 and 2A, the biosensor 100 according to an exemplary embodiment of the present invention may detect the presence, the concentration, etc. of the target biomaterial 10 through an optical method. The target biomaterial 10 is not particularly limited, and may include a biomaterial containing one or more substances selected from proteins, polysaccharides, lipids, and the like, such as microorganisms such as bacteria and viruses, red blood cells, cells, and genetic substances.
상기 바이오 센서(100)는 광학 표지부(110), 생체물질 고정부(120), 광원부(130) 및 수광부(140)를 포함할 수 있다. 일 실시예로, 상기 바이오 센서(100)는 목적 생체물질(10)을 상기 생체물질 고정부(120)에 고정한 후 상기 광학 표지부(110)를 상기 목적 생체물질(10)에 선택적으로 결합시키고, 이어서 상기 목적 생체물질(10)에 결합된 상기 광학 표지부(110)에 상기 광원부(130)에서 생성된 광을 조사한 후 상기 수광부(140)에서 상기 광학 표지부(110)에서 재귀반사된 광을 수신하여 이를 분석함으로써 상기 목적 생체물질(10)의 유무, 농도 등을 감지할 수 있다. 이와 달리, 다른 실시예로, 상기 바이오 센서(100)는 상기 목적 생체물질(10)에 상기 광학 표지부(110)를 먼저 결합시킨 후 이를 상기 생체물질 고정부(120)에 결합시키고, 이어서 상기 목적 생체물질(10)에 결합된 상기 광학 표지부(110)에 상기 광원부(130)에서 생성된 광을 조사한 후 상기 수광부(140)에서 상기 광학 표지부(110)에서 재귀반사된 광을 수신하여 이를 분석함으로써 상기 목적 생체물질(10)의 유무, 농도 등을 감지할 수도 있다.The biosensor 100 may include an optical label unit 110, a biomaterial fixing unit 120, a light source unit 130, and a light receiving unit 140. In one embodiment, the biosensor 100 secures the target biomaterial 10 to the biomaterial fixing unit 120 and then selectively couples the optical label unit 110 to the target biomaterial 10. Subsequently, after irradiating the light generated by the light source unit 130 to the optical label unit 110 coupled to the target biological material 10, the light is retroreflected by the optical label unit 110 at the light receiving unit 140. By receiving it and analyzing it, the presence, concentration, etc. of the target biological material 10 can be detected. Unlike this, in another embodiment, the biosensor 100 first couples the optical label unit 110 to the target biomaterial 10 and then couples the optical label unit 110 to the biomaterial fixing unit 120, and then the After irradiating the light generated by the light source unit 130 to the optical label unit 110 coupled to the target biological material 10, the light receiving unit 140 receives the light retroreflected by the optical label unit 110 By analyzing this, the presence, concentration, etc. of the target biological material 10 may be detected.
상기 광학 표지부(110)는 상기 광원부(130)로부터 조사된 광을 상기 광원부(130)의 방향으로 재귀반사시킬 수 있고, 상기 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 광학 표지부(110)는 투명한 코어 입자(111), 상기 코어 입자(111)의 일부를 피복하는 전반사 유도층(112), 상기 전반사 유도층(112) 상에 형성된 수식층(113) 및 상기 수식층(113)에 직접 또는 간접적으로 결합된 생체인지물질(115)을 포함할 수 있다. The optical label unit 110 may retroreflect light emitted from the light source unit 130 in the direction of the light source unit 130, and may be selectively coupled to the target biomaterial 10. In one embodiment, the optical label unit 110 is a transparent core particle 111, the total reflection induction layer 112 covering a portion of the core particles 111, the formula formed on the total reflection induction layer 112 It may include a layer 113 and the biocognitive material 115 directly or indirectly coupled to the modified layer 113.
상기 코어 입자(111)는 구형의 형상을 가질 수 있다. 본 발명에 있어서 '구형'이라 함은 중심으로부터 표면의 모든 지점까지의 반지름들이 동일한 완벽한 구형뿐만 아니라 최대 반지름과 최소 반지름의 차이가 약 10％ 미만인 실질적인 구형체도 포함하는 것으로 정의된다. The core particle 111 may have a spherical shape. In the present invention, the term 'spherical' is defined as including not only a perfect sphere whose radius from the center to every point on the surface is the same but also a substantial sphere whose difference between the maximum and minimum radius is less than about 10%.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자(111)는 상기 목적 생체물질(10)과의 결합 특성이나 상기 광원으로부터 조사되는 광의 파장과의 관계 등을 고려하여, 약 700nm 이상 5㎛ 이하의 평균 직경을 가질 수 있다. In one embodiment, the core particle 111 has an average diameter of about 700 nm or more and 5 μm or less, in consideration of a coupling property with the target biomaterial 10 or a relationship with a wavelength of light irradiated from the light source. Can have.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자(111)는 입사광을 투과시킬 수 있는 투명 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 코어 입자(111)는 투명 산화물이나 투명 고분자 물질 등으로 형성될 수 있다. 상기 투명 산화물은, 예를 들면, 실리카(silica), 글라스(glass) 등을 포함할 수 있고, 상기 투명 고분자 물질은, 예를 들면, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate)) 등을 포함할 수 있다. In one embodiment, the core particles 111 may be formed of a transparent material that can transmit incident light. For example, the core particles 111 may be formed of a transparent oxide or a transparent polymer material. The transparent oxide may include, for example, silica, glass, and the like, and the transparent polymer material may include, for example, polystyrene and polymethyl methacrylate. )) And the like.
상기 전반사 유도층(112)은 상기 코어 입자(111)의 표면 중 일부를 피복하도록 형성되고, 상기 코어 입자(111) 내부를 진행하는 광의 적어도 일부를 전반사시켜 상기 광원의 방향으로 재귀반사되는 광량을 증가시킬 수 있다. The total reflection inducing layer 112 is formed to cover a part of the surface of the core particle 111, and totally reflects at least a portion of the light traveling through the core particle 111 to reflect the amount of light retroreflected in the direction of the light source. Can be increased.
일 실시예에 있어서, 상기 전반사 유도층(112)은 상기 코어 입자(111)의 표면 중 약 30％ 이상 70％ 이하의 면적을 피복하도록 상기 코어 입자(111)의 표면 상에 형성될 수 있다. 상기 전반사 유도층(112)이 상기 코어 입자(111) 표면의 30％ 미만을 피복하는 경우, 상기 코어 입자(111) 내부에 입사된 광 중 재귀반사되지 않고 누설되는 광량이 많아 상기 바이오 센서(100)의 감도가 저하되는 문제점이 있다. 그리고 상기 전반사 유도층(112)이 상기 코어 입자(111) 표면을 70％ 초과하여 피복하는 경우, 상기 코어 입자(111) 내부로 입사되는 광량이 감소하여 상기 바이오 센서(100)의 감도가 저하되는 문제점이 있다. 일 예로, 상기 전반사 유도층(112)은 상기 코어 입자(111) 표면의 약 40％ 이상 60％ 이하를 피복하도록 상기 코어 입자(111)의 표면 상에 형성될 수 있다.In one embodiment, the total reflection inducing layer 112 may be formed on the surface of the core particles 111 to cover an area of about 30% or more and 70% or less of the surface of the core particles 111. When the total reflection inducing layer 112 covers less than 30% of the surface of the core particle 111, the biosensor 100 has a large amount of light leaking without rereflection among the light incident inside the core particle 111. ) Has a problem that the sensitivity is reduced. When the total reflection inducing layer 112 covers more than 70% of the surface of the core particle 111, the amount of light incident into the core particle 111 decreases, thereby decreasing the sensitivity of the biosensor 100. There is a problem. For example, the total reflection inducing layer 112 may be formed on the surface of the core particle 111 to cover about 40% or more and 60% or less of the surface of the core particle 111.
일 실시예에 있어서, 상기 코어 입자(111) 내부를 진행하는 광의 적어도 일부를 전반사시켜 상기 광원부(130)의 방향으로 재귀반사되는 광량을 증가시키기 위해, 상기 전반사 유도층(112)은 상기 코어 입자(111)보다 굴절률이 작은 물질로 형성될 수 있다. 일 실시예로, 상기 코어 입자(111)는 적어도 360nm 내지 820 nm의 가시광선 파장 영역에서 약 1.4 이상의 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있고, 상기 전반사 유도층(112)은 코어 입자 (111)보다 작은 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있다. In one embodiment, in order to totally reflect at least a portion of the light traveling inside the core particles 111 to increase the amount of light retroreflected in the direction of the light source unit 130, the total reflection induction layer 112 is the core particles It may be formed of a material having a refractive index smaller than that of 111. In one embodiment, the core particles 111 may be formed of a material having a refractive index of about 1.4 or more in the visible light wavelength range of at least 360 nm to 820 nm, and the total reflection inducing layer 112 may be less than the core particles 111. It may be formed of a material having a small refractive index.
구체적으로, 상기 코어 입자(111)가 가시광선 영역에서 약 1.4 이상의 굴절률을 갖는 투명 산화물 또는 투명 고분자 물질로 형성된 경우, 상기 전반사 유도층(112)은 그보다 작은 굴절률을 갖는 금속 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 유도층(112)은 532nm 파장의 광에 대해 약 0.22의 굴절률을 갖는 금(Au), 약 0.15의 굴절률을 갖는 은(Ag), 약 1.0의 굴절률을 갖는 알루미늄(Al), 약 0.4의 굴절률을 갖는 구리(Cu), 약 1.2의 굴절률을 갖는 아연(Zn) 등으로부터 선택된 하나 이상의 금속으로 형성될 수 있다. Specifically, when the core particle 111 is formed of a transparent oxide or a transparent polymer material having a refractive index of about 1.4 or more in the visible region, the total reflection inducing layer 112 may be formed of a metal material having a smaller refractive index. . For example, the total reflection inducing layer 112 includes gold (Au) having a refractive index of about 0.22 for light having a wavelength of 532 nm, silver (Ag) having a refractive index of about 0.15, and aluminum (Al) having a refractive index of about 1.0. , Copper (Cu) having a refractive index of about 0.4, zinc (Zn) having a refractive index of about 1.2, and the like.
한편, 상기 전반사 유도층(112)은 상기 코어 입자(111)와 접착력이 강한 물질로 형성되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기 코어 입자(111)가 투명 산화물로 형성된 경우, 상기 전반사 유도층(112)은 알루미늄(Al) 또는 구리(Cu)로 형성될 수 있다. On the other hand, the total reflection induction layer 112 is preferably formed of a material having a strong adhesive force with the core particles (111). For example, when the core particle 111 is formed of a transparent oxide, the total reflection inducing layer 112 may be formed of aluminum (Al) or copper (Cu).
일 실시예에 있어서, 광 투과에 의한 광 누설을 방지하고 상기 광학 표지부(110)의 분산성을 향상시키기 위하여, 상기 전반사 유도층(112)은 약 10 내지 100nm의 두께를 가질 수 있다. 상기 전반사 유도층(112)의 두께가 10nm 미만인 경우, 상기 코어 입자(111) 내부에 입사된 광 중 일부가 상기 전반사 유도층(112)을 투과하여 누설되는 문제점이 발생할 수 있고, 상기 전반사 유도층(112)의 두께가 100nm를 초과하는 경우, 상기 광학 표지부(110)의 중량이 커져 액체 내에서의 상기 광학 표지부(110)의 분산성이 저하되는 문제점이 발생할 수 있다. In one embodiment, the total reflection inducing layer 112 may have a thickness of about 10 to 100nm to prevent light leakage by light transmission and to improve the dispersibility of the optical label unit 110. When the total reflection induction layer 112 is less than 10 nm in thickness, some of the light incident inside the core particles 111 may pass through the total reflection induction layer 112 and may leak. When the thickness of the 112 exceeds 100 nm, the weight of the optical label portion 110 is increased, which may cause a problem that the dispersibility of the optical label portion 110 in the liquid is lowered.
상기 수식층(113)은 상기 전반사 유도층(112) 표면 상에 형성될 수 있다. 상기 수식층(113)은 생체물질과의 결합이 용이한 금속 물질로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 수식층(113)은 생체물질에 의한 수식이 용이하고 산화 안정성이 우수한 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag) 등과 같은 귀금속으로 형성될 수 있다. The modification layer 113 may be formed on a surface of the total reflection inducing layer 112. The modification layer 113 may be formed of a metal material which is easily bonded to a biological material. For example, the modification layer 113 may be formed of a noble metal such as platinum (Pt), gold (Au), silver (Ag), etc., which are easily modified by a biomaterial and have excellent oxidation stability.
일 실시예에 있어서, 상기 수식층(113)은 상기 전반사 유도층(112)과 독립된 별개의 층으로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 유도층(112)이 귀금속이 아닌 금속 물질로 형성된 경우, 상기 수식층(113)은 상기 전반사 유도층(112)을 피복하는 귀금속 물질층일 수 있다. 이와 달리, 다른 실시예에 있어서, 상기 수식층(113)과 상기 전반사 유도층(112)은 일체로 형성될 수 있다. 예를 들면, 상기 전반사 유도층(112)이 금(Au), 은(Ag) 등과 같이 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 귀금속으로 형성된 경우, 상기 전반사 유도층(112)은 상기 수식층(113)으로도 기능할 수 있다.In one embodiment, the modification layer 113 may be formed as a separate layer independent of the total reflection induction layer 112. For example, when the total reflection inducing layer 112 is formed of a metal material other than a noble metal, the modified layer 113 may be a layer of a noble metal material covering the total reflection inducing layer 112. Unlike this, in another embodiment, the modification layer 113 and the total reflection inducing layer 112 may be integrally formed. For example, when the total reflection inducing layer 112 is formed of a noble metal having a lower refractive index than the core particles such as gold (Au), silver (Ag), or the like, the total reflection inducing layer 112 may be the modification layer 113. Can also function.
일 실시예에 있어서, 상기 수식층(113)은 상기 광학 표지부(110)의 액체 내부에서의 분산성 및 응집 방지를 위해 약 10 내지 100 nm의 두께를 가질 수 있다.In one embodiment, the modifying layer 113 may have a thickness of about 10 to 100 nm to prevent dispersibility and aggregation in the liquid of the optical label unit 110.
상기 생체인지물질(115)은 상기 수식층(113)에 직접 또는 간접적으로 결합되고, 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합할 수 있는 물질로 형성될 수 있다. 상기 생체인지물질(115)은 검출하고자 하는 목적 생체물질(10)에 따라 변경될 수 있고, 단백질, 핵산, 리간드 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 생체물질(10)이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 또는 압타머(Aptamer) 물질일 수 있고, 상기 목적 생체물질(10)이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 등과 같은 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질(10)이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질일 수 있다.The biocognitive material 115 may be directly or indirectly coupled to the modifying layer 113, and may be formed of a material that may be selectively bonded to the target biomaterial 10. The biocognitive material 115 may be changed according to the target biomaterial 10 to be detected, and may include one or more selected from proteins, nucleic acids, ligands, and the like. For example, when the target biomaterial 10 is an antigenic substance, the biocognitive material 115 may be an antibody or aptamer substance that specifically reacts with the antigenic substance, and the target biomaterial When 10 is a genetic material, the biocognitive material 115 may be a nucleic acid material such as DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), or PNA (peptide nucleic acid) that is complementary to the genetic material. In addition, when the target biomaterial 10 is a cell signal material, the biocognitive material 115 may be a chemical ligand material that selectively binds to the cell signal material.
일 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질(115)은 상기 수식층(113)에 직접 결합될 수 있다. 예를 들면, 상기 생체인지물질(115)이 상기 수식층(113)의 금속과 결합할 수 있는 작용기를 구비하는 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 작용기와 상기 수식층(113) 금속의 결합에 의해 상기 수식층(113)에 직접 결합될 수 있다. 일 예로, 상기 생체인지물질(115)이 티올기(-SH)를 포함하는 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 티올기와 상기 수식층(113)의 금속 사이의 결합에 의해 상기 수식층(113)에 직접 결합될 수 있다. In one embodiment, the biocognitive material 115 may be directly bonded to the modifying layer 113. For example, when the biocognitive material 115 includes a functional group capable of bonding with a metal of the modifying layer 113, the biocognitive material 115 may be formed of the functional group and the metal of the modifying layer 113. It can be directly bonded to the modified layer 113 by the combination. For example, when the biocognitive material 115 includes a thiol group (-SH), the biocognitive material 115 may be bonded to the modified layer (B) by the bond between the thiol group and the metal of the modification layer 113. 113).
다른 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질(115)은 분자 구조 내에 상기 수식층(113)의 금속과 결합할 수 있는 제1 작용기 및 상기 생체인지물질(115)과 결합할 수 있는 제2 작용기를 구비하는 자기조립단분자막(self assembled monolayer)과 같은 중간 반응물을 통해 상기 수식층(113)에 결합될 수 있다. 일 예로, 상기 생체인지물질(115)이 아민기를 포함하는 경우, 상기 중간 반응물로는 말단 또는 분자 구조 내에 상기 수식층(113)의 금속과 결합할 수 있는 티올기 또는 다이설파이드기를 구비하고, 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 상기 생체인지물질(115)의 아민기와 결합할 수 있는 카복실기, 수신이미드기, 알데하이드기 등을 구비하는 물질이 사용될 수 있다.In another embodiment, the biocognitive material 115 has a first functional group capable of binding to the metal of the modifying layer 113 and a second functional group capable of binding to the biocognitive material 115 in a molecular structure. It may be coupled to the modified layer 113 through an intermediate reactant such as a self assembled monolayer. For example, when the biocognitive material 115 includes an amine group, the intermediate reactant includes a thiol group or disulfide group capable of bonding with a metal of the modified layer 113 in a terminal or molecular structure. A material having a carboxyl group, a receiving imide group, an aldehyde group, or the like capable of bonding to the amine group of the biocognitive material 115 in another terminal or molecular structure may be used.
한편, 상기 생체인지물질(115)은 상기 수식층(113) 표면에만 결합되고, 상기 코어 입자(111)의 노출 표면에는 결합되지 않도록 형성될 수 있다. 이와 같이, 상기 전반사 유도층(112) 및 수식층(113)에 의해 피복된 코어 입자(111)에 대해 상기 생체인지물질(115)을 위치 선택적으로 형성하는 경우, 하기에서 설명되는 바와 같이 목적 생체물질(10)과 결합된 광학 표지부(110)에 있어서 노출된 상기 코어 입자(111) 부분이 광원부(130)를 향하도록 상기 광학 표지부(110)를 배향시킬 수 있으므로, 보다 강력한 재귀반사 신호를 유도할 수 있고, 그 결과 상기 바이오 센서(100)의 감도를 현저하게 향상시킬 수 있다. Meanwhile, the biocognitive material 115 may be formed to be bonded only to the surface of the modified layer 113 and not to be exposed to the exposed surface of the core particle 111. As described above, in the case where the biocognitive material 115 is selectively formed on the core particles 111 covered by the total reflection inducing layer 112 and the modifying layer 113, the target living body is described as described below. In the optical label unit 110 combined with the material 10, the exposed portion of the core particles 111 may be oriented so that the optical label unit 110 is directed toward the light source unit 130. It can be induced, and as a result can significantly improve the sensitivity of the biosensor 100.
본 발명에 있어서는 상기 생체인지물질(115)의 종류에 따라 다양한 방법으로 상기 생체인지물질(115)을 상기 수식층(113)에만 위치 선택적으로 결합시킬 수 있다. 이에 대해서는 후술한다.In the present invention, the biocognitive material 115 may be selectively selectively coupled to the modified layer 113 in various ways depending on the type of the biocognitive material 115. This will be described later.
일 실시예에 있어서, 상기 광학 표지부(110)는 도 2b에 도시된 바와 같이 상기 전반사 유도층(112)과 상기 수식층(113) 사이에 배치되고, 자성물질로 형성된 자성층(114)을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 자성층(114)은 철 (Fe), 니켈 (Ni), 망간 (Mn), 이들의 소성체 또는 산화물 등과 같은 자성물질로 형성될 수 있다. In an embodiment, the optical label unit 110 is disposed between the total reflection induction layer 112 and the modification layer 113 as shown in FIG. 2B, and further includes a magnetic layer 114 formed of a magnetic material. It may include. For example, the magnetic layer 114 may be formed of a magnetic material such as iron (Fe), nickel (Ni), manganese (Mn), a sintered body or an oxide thereof.
상기 광학 표지부(110)가 상기 자성층(114)을 더 포함하는 경우, 외부에서 자기장을 인가함으로써 상기 광학 표지부(110)의 배향 방향을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 외부 자기장을 이용하여 상기 광학 표지부(110)를 포함하는 혼합물 내에서 상기 광학 표지부(110)만을 용이하게 분리할 수 있다. When the optical label unit 110 further includes the magnetic layer 114, the direction of the optical label unit 110 may be adjusted by applying a magnetic field from the outside, and the optical label unit may be used by using an external magnetic field. Only the optical label 110 may be easily separated in the mixture including the 110.
상기 생체물질 고정부(120)는 기판(121) 및 상기 기판(121) 상에 배치되고 상기 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합하는 고정 물질(122)을 포함할 수 있다. The biomaterial fixing part 120 may include a substrate 121 and a fixing material 122 disposed on the substrate 121 and selectively coupled to the target biomaterial 10.
상기 고정 물질(122)이 결합될 수 있다면 상기 기판(121)의 재질, 형상 등은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 기판(121)으로는 금(Au) 박막이 표면에 형성된 실리콘 기판, 글라스 기판, 고분자 기판, 종이 기판, 금속 기판 등이 사용되거나 상기 고정 물질(122)이 결합될 수 있도록 표면이 개질된 글라스 기판, 고분자 기판, 종이 기판, 금속 기판 등이 사용될 수 있다. If the fixing material 122 can be combined, the material, shape, etc. of the substrate 121 is not particularly limited. For example, a silicon substrate, a glass substrate, a polymer substrate, a paper substrate, a metal substrate, or the like, on which a gold (Au) thin film is formed, may be used as the substrate 121, or the surface may be bonded to the fixing material 122. This modified glass substrate, polymer substrate, paper substrate, metal substrate and the like can be used.
상기 고정 물질(122)은 상기 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합하는 물질일 수 있다. 상기 고정 물질(122)은 검출하고자 하는 목적 생체물질(10)에 따라 변경될 수 있고, 단백질, 핵산, 리간드 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 생체물질(10)이 항원 물질인 경우, 상기 고정 물질(122)은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 또는 압타머(Aptamer) 물질 일 수 있고, 상기 목적 생체물질(10)이 유전자 물질인 경우, 상기 고정 물질(122)은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 등과 같은 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질(10)이 세포신호 물질인 경우, 상기 고정 물질(122)은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질일 수 있다. 즉, 상기 고정 물질(122)은 상기 생체인지물질(115)과 동일한 물질일 수도 있고, 상기 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합하는 다른 물질일 수도 있다. The fixation material 122 may be a material that selectively binds to the target biomaterial 10. The fixation material 122 may be changed according to the target biomaterial 10 to be detected, and may include one or more selected from proteins, nucleic acids, ligands, and the like. For example, when the target biomaterial 10 is an antigenic substance, the fixation material 122 may be an antibody or an aptamer substance that specifically reacts with the antigenic substance. 10) when the genetic material, the immobilization material 122 may be a nucleic acid material such as DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), etc. capable of complementary binding to the genetic material, When the target biomaterial 10 is a cell signal material, the fixation material 122 may be a chemical ligand material that selectively binds to the cell signal material. That is, the fixation material 122 may be the same material as the biorecognition material 115 or may be another material that selectively binds to the target biomaterial 10.
일 실시예에 있어서, 상기 고정 물질(122)은 상기 기판(121)에 직접 결합하거나 자기조립단분자막(self assembled monolayer)과 같은 중간 반응물을 통해 상기 기판(121)에 결합될 수 있다. 예를 들면, 상기 고정 물질(122)은 상기 생체인지물질(115)이 상기 수식층(113)에 결합되는 방식과 동일 또는 유사한 방식으로 상기 기판(121)에 결합될 수 있다. In some embodiments, the fixing material 122 may be directly bonded to the substrate 121 or may be bonded to the substrate 121 through an intermediate reactant such as a self assembled monolayer. For example, the fixing material 122 may be bonded to the substrate 121 in the same or similar manner to that of the biocognitive material 115 is bonded to the modifying layer 113.
한편, 상기 생체물질 고정부(120)는 상기 기판(121) 상에 배치되어 상기 기판(121)과 함께 목적 생체물질(10)이 함유된 용액을 수용하고 상부로 개구된 공간을 형성하는 측벽(미도시)을 더 포함할 수 있다. 상기 측벽은 상기 기판(121) 상에 결합된 상기 고정 물질(122)을 둘러싸도록 상기 기판(121) 상에 배치될 수 있다. 상기 기판(121)과 함께 상기 목적 생체물질(10)이 함유된 용액을 수용하는 공간을 형성할 수 있다면, 상기 측벽의 구조, 형상, 재질 등은 특별히 제한되지 않는다. On the other hand, the biomaterial fixing unit 120 is disposed on the substrate 121 to accommodate the solution containing the target biomaterial 10 together with the substrate 121 and to form a space opened to the upper ( It may further include). The side wall may be disposed on the substrate 121 to surround the fixed material 122 coupled to the substrate 121. If it is possible to form a space for accommodating the solution containing the target biomaterial 10 together with the substrate 121, the structure, shape, material, etc. of the side wall is not particularly limited.
상기 광원부(130)는 상기 생체물질 고정부(120) 상부에 배치되고, 상기 생체물질 고정부(120)의 수용 공간 내에서 상기 목적 생체물질(10)과 결합된 상기 광학 표지부(110)에 광을 조사하는 광원을 포함할 수 있다. 상기 광원으로는 다양한 파장의 광이 혼합된 광을 생성하는 광원이 사용되거나 특정 파장의 단색 광을 생성하는 광원이 제한 없이 사용될 수 있다. The light source unit 130 is disposed on the biomaterial fixing unit 120, and the optical label unit 110 coupled to the target biomaterial 10 in the accommodation space of the biomaterial fixing unit 120. It may include a light source for irradiating light. As the light source, a light source generating light in which light of various wavelengths is mixed may be used, or a light source generating monochromatic light of a specific wavelength may be used without limitation.
상기 수광부(140)는 상기 광원부(130)와 이격되도록 상기 생체물질 고정부(120) 상부에 배치되고, 상기 광원부(130)에서 생성되어 상기 광학 표지부(110)에 조사된 광 중 상기 광학 표지부(110)에 의해 재귀반사된 광을 수용하여 상기 목적 생체물질(10)의 유무, 농도 등에 대한 정보를 분석할 수 있다. 상기 재귀반사된 광을 수용하여 상기 목적 생체물질(10)에 대한 정보를 분석할 수 있다면, 상기 수광부(140)의 구성은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 수광부(140)는 일 실시예로, 상기 재귀반사된 광을 직접 확인할 수 있는 현미경을 포함하거나, 다른 실시예로, 상기 재귀반사된 광 신호를 이미지화하는 화상 생성부 및 상기 화상 생성부에 의해 생성된 화상 정보를 분석하는 화상 분석부를 포함하거나, 또다른 실시예로, 상기 광원부(130)로부터 상기 광학 표지부(110)에 입사하는 입사광과 상기 광학 표지부(110)로부터 재귀반사된 광을 분할하는 광분할부, 상기 광분할부에 의해 분할된 광 신호를 집중하고 확대 할 수 있는 렌즈, 확대된 광신호를 수신하여 이미지화하는 화상 생성부 및 상기 화상 생성부에 의해 생성된 화상 정보를 분석하는 화상 분석부를 포함할 수 있다.The light receiving unit 140 is disposed above the biological material fixing unit 120 so as to be spaced apart from the light source unit 130, and the optical label among the light generated by the light source unit 130 and irradiated to the optical label unit 110. By receiving the light retroreflected by the unit 110 may analyze information on the presence, concentration, etc. of the target biological material (10). If the retroreflected light can be accommodated to analyze the information on the target biomaterial 10, the configuration of the light receiver 140 is not particularly limited. For example, the light receiver 140 includes, in one embodiment, a microscope capable of directly identifying the retroreflected light, or in another embodiment, an image generator and an image to image the retroreflected light signal. An image analysis unit for analyzing image information generated by the generation unit, or in another embodiment, the incident light incident on the optical label unit 110 from the light source unit 130 and the recursion from the optical label unit 110 An optical splitter for dividing the reflected light, a lens for concentrating and enlarging the optical signal divided by the optical splitter, an image generator for receiving and imaging the enlarged optical signal, and image information generated by the image generator It may include an image analysis unit for analyzing the.
일 실시예에 있어서, 상기 생체물질 고정부(120)의 기판(121)으로부터 거울 반사된 광의 영향을 제거하기 위하여, 상기 광원부(130)는 상기 고정 물질(122)이 결합된 상기 기판(121) 표면의 법선에 대해 약 5 내지 60˚ 경사진 방향으로 광을 조사할 수 있다. In one embodiment, in order to remove the influence of the mirror reflected light from the substrate 121 of the biomaterial fixing unit 120, the light source unit 130 is the substrate 121 to which the fixing material 122 is coupled Light can be irradiated in a direction inclined at about 5 to 60 degrees with respect to the normal of the surface.
한편, 상기 수광부(140)가 상기 광분할부, 상기 화상 생성부 및 상기 화상 분석부를 포함하는 경우, 상기 광원부(130)는 상기 기판(121) 표면의 법선에 대해 약 5 내지 60˚ 경사진 방향으로 광을 조사하도록 배치될 수 있고, 상기 광 분할부 역시 상기 기판(121) 표면의 법선에 대해 일정한 각도만큼 경사지게 배치되어 상기 광분할부에서 발생하는 광의 거울 반사 영향을 최소화할 수 있다. Meanwhile, when the light receiving unit 140 includes the light splitting unit, the image generating unit, and the image analyzing unit, the light source unit 130 is inclined about 5 to 60 degrees with respect to the normal of the surface of the substrate 121. The light splitter may be disposed to be irradiated with light, and the light splitter may be disposed to be inclined at a predetermined angle with respect to the normal of the surface of the substrate 121 to minimize the mirror reflection effect of the light generated by the light splitter.
도 3는 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법을 설명하기 위한 순서도이다. 상기 제조방법에 의해 제조되는 상기 광학 표지자는 도 1, 도 2a 및 도 2b에 도시된 광학 표지부(110)와 동일한 구조를 갖는다.3 is a flowchart illustrating a method of manufacturing an optical marker for a biosensor according to an embodiment of the present invention. The optical marker manufactured by the manufacturing method has the same structure as the optical marker 110 shown in FIGS. 1, 2A, and 2B.
도 1, 도 2a 및 도 2b와 함께 도 3을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서용 광학 표지자(110)의 제조방법은 코어 입자들(111)을 제조하는 단계(S110); 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들(111)을 단층으로 배열시키는 단계(S120); 상기 코어 입자들(111)이 배열된 상기 기판 상에서 제1 금속의 증착 공정 및 제2 금속의 증착 공정을 수행하여 상기 코어 입자들(111)의 표면 일부를 피복하도록 적층된 전반사 유도층(112) 및 수식층(113)을 각각 형성하는 단계(S130); 상기 수식층(113)에 생체인지물질(115)을 결합시키는 단계(S140); 및 상기 생체인지물질(115)이 결합된 상기 광학 표지자(110)를 상기 기판으로부터 분리하는 단계(S150)를 포함한다. Referring to FIG. 3 together with FIGS. 1, 2A, and 2B, a method of manufacturing the biosensor optical marker 110 according to an embodiment of the present invention may include preparing core particles 111 (S110); Arranging the core particles (111) in a single layer on a surface of a substrate (S120); The total reflection guide layer 112 stacked to cover a portion of the surface of the core particles 111 by performing a deposition process of a first metal and a deposition process of a second metal on the substrate on which the core particles 111 are arranged. And forming the modified layer 113, respectively (S130); Coupling a biocognitive material (115) to the modified layer (113) (S140); And separating the optical marker 110 to which the biocognitive material 115 is coupled from the substrate (S150).
상기 코어 입자들(111)을 제조하는 단계(S110)에 있어서, 상기 코어 입자들(111)은 화학적 방법으로 합성될 수 있다. In the manufacturing of the core particles 111 (S110), the core particles 111 may be synthesized by a chemical method.
일 실시예로, 상기 코어 입자들(111)이 투명 산화물로 형성된 경우, 상기 코어 입자들은 스토버 방법(Stober method) 또는 씨드 성장(seed-growth) 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 도 4는 투명 산화물 코어 입자를 제조하는 방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면으로서, TEOS(Tetraethylorthosilicate)를 이용한 스토버 방법(Stober method)에 의해 실리카 코어 입자들을 제조하는 방법을 설명하고 있다. In one embodiment, when the core particles 111 are formed of a transparent oxide, the core particles may be manufactured using a Stover method or a seed-growth method. FIG. 4 is a view for explaining an embodiment of a method of manufacturing transparent oxide core particles, and illustrates a method of preparing silica core particles by a Stober method using Tetraethylorthosilicate (TEOS).
다른 실시예로, 상기 코어 입자들(111)이 투명 고분자 물질로 형성된 경우, 상기 코어 입자들(111)은 현탁중합, 분산중합, 유화중합 또는 침전중합 등의 방법으로 제조될 수 있다. In another embodiment, when the core particles 111 are formed of a transparent polymer material, the core particles 111 may be manufactured by a method such as suspension polymerization, dispersion polymerization, emulsion polymerization, or precipitation polymerization.
상기와 같은 방법으로 제조된 상기 코어 입자들(111)은 약 700nm 이상 5㎛ 이하의 평균 직경을 가지는 구형의 형상을 가질 수 있다. The core particles 111 manufactured by the above method may have a spherical shape having an average diameter of about 700 nm or more and 5 μm or less.
상기 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들(111)을 단층으로 배열시키는 단계(S120)에 있어서, 상기 코어 입자들(111)은 도 5에 도시된 바와 같이 랭뮤어-블로드젯막(Langmuir-Blodgett film) 공정을 이용하여 상기 기판 상에 단층으로 배열시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 코어 입자들(111)을 상기 기판 표면 상에 단층으로 배열시키기 위하여, 상기 코어 입자들(111)의 표면을 소수성으로 개질한 후 이들을 물 및 공기의 계면에 단층으로 촘촘하게 배열시켜 상기 물과 공기의 계면에 상기 코어 입자들(111)의 랭뮤어-블로드젯막(Langmuir-Blodgett film)을 형성하고, 이를 상기 기판에 전이시킬 수 있다. In the step S120 of arranging the core particles 111 in a single layer on the surface of the substrate, the core particles 111 are Langmuir-Blodgett as shown in FIG. 5. It can be arranged in a single layer on the substrate using a film) process. For example, in order to arrange the core particles 111 in a single layer on the surface of the substrate, the surfaces of the core particles 111 are hydrophobically modified, and they are densely arranged in a single layer at the interface of water and air. A Langmuir-Blodgett film of the core particles 111 may be formed at an interface between the water and the air, and then transferred to the substrate.
상기 전반사 유도층(112) 및 수식층(113)을 각각 형성하는 단계(S130)에 있어서, 먼저 상기 전반사 유도층(112)을 형성하기 위하여 상기 코어 입자들(111)이 단층으로 배열된 상기 기판 상에 제1 금속의 증착 공정을 수행하고, 이어서 상기 제2 금속의 증착을 수행할 수 있다. In the step (S130) of forming the total reflection guide layer 112 and the modification layer 113, respectively, the substrate in which the core particles 111 are arranged in a single layer to form the total reflection guide layer 112 first. A deposition process of the first metal may be performed on the substrate, followed by deposition of the second metal.
상기 제1 금속 및 제2 금속의 증착은 화학적 기상 증착법(chemical vapor deposition, CVD) 또는 물리적 기상 증착법(physical vaopr deposition, PVD)의 방법으로 상기 기판 상에 증착될 수 있다. 다만, 상기 코어 입자들(111)이 열적 안정성을 낮은 경우에는 상기 화학적 기상 증착법보다는 상대적으로 저온에서 공정이 가능한 물리적 기상 증착법(physical vaopr deposition, PVD)을 이용하여 상기 제1 금속 및 제2 금속을 증착하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기 제1 금속 및 제2 금속은 열증발 진공증착(Thermal evaporation deposition), 스퍼터링 증착(Sputtering deposition) 또는 이온빔 보조증착(e-beam physical vapor depositio, EBPVD) 등의 방법으로 상기 기판 상에 증착될 수 있다. 상기 제1 금속은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag) 등 굴절률이 약 1.4 이상인 금속일 수 있고, 상기 제2 금속은 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag) 등과 같은 귀금속일 수 있다. The deposition of the first metal and the second metal may be deposited on the substrate by a method of chemical vapor deposition (CVD) or physical vapor deposition (PVD). However, when the core particles 111 have low thermal stability, the first metal and the second metal may be formed by using physical vapor deposition (PVD), which may be processed at a relatively low temperature, rather than the chemical vapor deposition method. It is preferable to deposit. For example, the first metal and the second metal may be deposited on the substrate by a method such as thermal evaporation deposition, sputtering deposition, or ion beam evaporation (EBPVD). Can be deposited on. The first metal may be a metal having a refractive index of about 1.4 or more, such as aluminum (Al), copper (Cu), gold (Au), silver (Ag), and the second metal may be platinum (Pt), gold (Au), Precious metals such as silver (Ag) and the like.
상기 전반사 유도층(112)을 통한 광 투과를 방지하고 상기 광학 표지자(110)의 액체 내에서의 분산성을 향상시키기 위하여, 상기 제1 금속은 약 10 내지 100nm의 두께로 증착될 수 있다. 그리고 상기 광학 표지자(110)의 액체 내에서의 분산성 및 응집 방지를 위해 상기 제2 금속은 약 10 내지 100 nm의 두께로 증착될 수 있다. In order to prevent light transmission through the total reflection inducing layer 112 and to improve dispersibility of the optical indicator 110 in the liquid, the first metal may be deposited to a thickness of about 10 to 100 nm. The second metal may be deposited to a thickness of about 10 to 100 nm to prevent dispersibility and aggregation in the liquid of the optical marker 110.
상기와 같이 기판 상에 랭뮤어-블로드젯막(Langmuir-Blodgett film)을 형성하도록 상기 구형의 코어 입자들(111)을 배열시킨 후 상기 제1 및 제2 금속을 증착하는 경우, 상기 제1 및 제2 금속의 증착 두께를 조절함으로써 상기 전반사 유도층(112) 및 상기 수식층(113)을 상기 코어 입자들(111) 표면의 약 30 내지 70％를 피복하도록 형성할 수 있다.When the first and second metals are deposited after arranging the spherical core particles 111 to form a Langmuir-Blodgett film on the substrate as described above, the first and second metals are deposited. The total reflection inducing layer 112 and the modifying layer 113 may be formed to cover about 30 to 70% of the surface of the core particles 111 by adjusting the deposition thickness of the second metal.
상기 수식층(113)에 생체인지물질(115)을 결합시키는 단계(S140)에 있어서, 상기 생체인지물질(115)은 목적 생체물질(10)과 선택적으로 결합할 수 있는 물질일 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 생체물질(10)이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 또는 압타머(Aptamer) 물질일 수 있고, 상기 목적 생체물질(10)이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 등과 같은 핵산 물질일 수 있으며, 상기 목적 생체물질(10)이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 또는 세포 리셉터 물질일 수 있다.In step S140 of coupling the biocognitive material 115 to the modifying layer 113, the biocognitive material 115 may be a material that can selectively bind to the target biomaterial 10. For example, when the target biomaterial 10 is an antigenic substance, the biocognitive material 115 may be an antibody or aptamer substance that specifically reacts with the antigenic substance, and the target biomaterial When 10 is a genetic material, the biocognitive material 115 may be a nucleic acid material such as DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), or PNA (peptide nucleic acid) that is complementary to the genetic material. In addition, when the target biomaterial 10 is a cell signal material, the biocognitive material 115 may be a chemical ligand or a cell receptor material that selectively binds to the cell signal material.
상기 생체인지물질(115)은 상기 수식층(113)에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 생체인지물질(115)이 상기 수식층(113)의 금속과 결합할 수 있는 작용기를 구비하는 경우, 상기 생체인지물질(115)은 상기 작용기와 상기 수식층(113) 금속의 결합에 의해 상기 수식층(113)에 직접 결합될 수 있다. 이와 달리, 상기 생체인지물질(115)은 분자 구조 내에 상기 수식층(113)의 금속과 결합할 수 있는 제1 작용기 및 상기 생체인지물질(115)과 결합할 수 있는 제2 작용기를 구비하는 자기조립단분자막(self assembled monolayer)과 같은 중간 반응물을 통해 상기 수식층(113)에 결합될 수도 있다.The biocognitive material 115 may be directly or indirectly coupled to the modification layer 113. Specifically, when the biocognitive material 115 includes a functional group capable of bonding with the metal of the modifying layer 113, the biocognitive material 115 is a combination of the functional group and the metal of the modifying layer 113. It may be directly coupled to the modified layer 113 by. In contrast, the biocognitive material 115 is a magnet having a first functional group capable of binding to the metal of the modifying layer 113 and a second functional group capable of binding to the biocognitive material 115 in a molecular structure. It may be coupled to the modified layer 113 through an intermediate reactant such as a self assembled monolayer.
상기 생체인지물질(115)은 상기 수식층(113) 표면에만 결합되고 상기 코어 입자(111)의 노출 표면에는 결합되지 않도록 위치 선택적으로 형성될 수 있다. The biocognitive material 115 may be selectively formed to be bonded only to the surface of the modified layer 113 and not to be exposed to the exposed surface of the core particle 111.
일 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질(115)이 유전자 물질에 대해 선택적으로 반응하는 DNA, RNA, PNA 등의 핵산 물질인 경우, 도 6에 도시된 바와 같이, ①티올기(-SH)를 상기 핵산 물질에 도입한 후 도입된 상기 티올기를 통해 상기 핵산 물질을 상기 수식층(113)의 금속에 직접 결합시키거나 ②한쪽 말단 혹은 분자 구조 내부에 티올기 또는 다이설파이드기를 구비하고 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 카복실기, 숙신이미드기, 알데하이드기 등으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 구비하는 자기조립단분자막(self assembled monolayer)을 상기 티올기 또는 다이설파이드기를 이용하여 상기 수식층(113)의 금속에 결합시킨 후 아민기가 도입된 상기 핵산 물질을 상기 자기조립단분자막에 결합시키는 방식으로 상기 핵산 생체인지물질(115)을 상기 수식층(113)에만 결합시킬 수 있다. In one embodiment, when the biocognitive material 115 is a nucleic acid material such as DNA, RNA, PNA that selectively reacts with the genetic material, as shown in Figure 6, ① to a thiol group (-SH) The nucleic acid material is directly bonded to the metal of the modification layer 113 through the thiol group introduced after introduction into the nucleic acid material, or (2) has a thiol group or disulfide group in one terminal or molecular structure and the other terminal or A self assembled monolayer having at least one functional group selected from a carboxyl group, a succinimide group, an aldehyde group, etc. in a molecular structure is bonded to the metal of the modified layer 113 using the thiol group or disulfide group. The nucleic acid biocognitive material 115 to the modified layer 113 only by binding the nucleic acid material having the amine group introduced therein to the self-assembled monolayer. Can be combined.
다른 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질(115)이 세포 신호 물질에 대해 선택적으로 반응하는 화학적 리간드 물질인 경우, 한쪽 말단 혹은 분자구조 내에 다이설파이드기를 구비하고 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 숙신이미드기 또는 알데하이드기를 구비하는 자기조립단분자막(SAM)을 상기 다이설파이드기와 상기 수식층(113)의 금속 사이의 결합을 통해 상기 수식층(113)의 표면에만 결합시킨 후 상기 자기조립단분자막에 아민 말단의 PAMAM 덴드리머(amine-terminated poly(amidoamine) dendrimer)를 수식하고, 여기에 숙신이미드기가 도입된 상기 화학적 리간드를 결합시킬 수 있다. 도 7은 상기와 같은 방법으로 상기 수식층(113)에 비오틴(Biotin)을 위치 선택적으로 수식하는 방법의 일 실시예를 도시하고 있다.In another embodiment, when the biocognitive material 115 is a chemical ligand material that selectively reacts with a cell signaling material, it has a disulfide group in one terminal or molecular structure and succinimide in the other terminal or molecular structure. A self-assembled monolayer (SAM) having a group or an aldehyde group is bonded only to the surface of the modified layer 113 through the bond between the disulfide group and the metal of the modified layer 113 and then the amine end of the self-assembled monolayer PAMAM dendrimers (amine-terminated poly (amidoamine) dendrimers) may be modified, and the chemical ligands to which succinimide groups are introduced may be bound thereto. FIG. 7 illustrates an embodiment of a method of selectively modifying biotin in the modifying layer 113 in the same manner as described above.
또다른 실시예에 있어서, 상기 생체인지물질(115)이 항원에 대해 선택적으로 결합하는 항체 단백질 물질인 경우, 항체와 같은 단백질 물질은 핵산이나 화학적 리간드에 비해 코어 입자(111)와 수식층(113)에 대한 비특이적 결합이 매우 강하게 일어나기 때문에 보다 정교한 수식방법이 필요하다. 구체적으로, 도 8에 도시된 바와 같이, 한쪽 말단 혹은 분자구조 내에 다이설파이드기를 구비하고 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 숙신이미드기를 구비하는 자기조립단분자막(SAM)을 상기 다이설파이드기와 상기 수식층(113)의 금속 사이의 결합을 통해 상기 수식층(113)의 표면에만 결합시킨 후 상기 자기조립단분자막에 아민 말단의 PAMAM 덴드리머(amine-terminated poly(amidoamine) dendrimer)를 수식할 수 있다. 이어서, sulfo-NHS기(N-hydroxysulfosuccinimide group) 및 디아지린기(diazirine group)를 구비하는 가교제(cross-linker)를 상기 PAMAM 덴드리머의 아민기와 상기 가교제의 sulfo-NHS기 사이의 공유결합 형성을 통해 상기 PAMAM 덴드리머에 결합시킨 후 암조건에서 BSA 함유 용액을 처리하여 상기 수식층(113)이 형성되지 않은 상기 코어 입자(111)의 노출 표면을 보호할 수 있다. 그 후, 아민기가 도입된 항체 단백질을 제공한 후 자외선을 조사하여 상기 가교제의 디아지린기(diazirine group)와 상기 항체 단백질의 아민기 사이의 광가교(photo-crosslinking)를 유도함으로써, 상기 항체 단백질을 상기 가교제에 결합시킬 수 있다. 이 경우, 상기 가교제로는 sulfo-NHS-diazirine (SDA), NHS-SS-Diazirine(SDAD), sulfo-NHS-SS-Diazirine (sulfo-SDAD), N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide (ANB-NOS), sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (sulfo-SANPAH) 등이 사용될 수 있다. 한편, 미반응한 가교제 잔기를 차단하기 위해 에탄올아민(ethanolamine)을 처리한 후 다시 자외선을 조사할 수 있다. In another embodiment, when the biocognitive material 115 is an antibody protein material that selectively binds to the antigen, the protein material such as the antibody is a core particle 111 and the modified layer 113 compared to the nucleic acid or chemical ligand More specific modifications are needed because nonspecific binding to) occurs very strongly. Specifically, as shown in FIG. 8, a self-assembled monolayer (SAM) having a disulfide group in one terminal or molecular structure and a succinimide group in the other terminal or molecular structure is formed with the disulfide group and the modified layer ( After bonding to the surface of the modified layer 113 through the bonding between the metal of 113), the PAMAM dendrimer (amine-terminated poly (amidoamine) dendrimer) of the amine terminal can be modified to the self-assembled monolayer. Subsequently, a cross-linker having a sulfo-NHS group (N-hydroxysulfosuccinimide group) and a diazirine group is formed through covalent formation between the amine group of the PAMAM dendrimer group and the sulfo-NHS group group of the crosslinker. After bonding to the PAMAM dendrimer, the BSA-containing solution may be treated under dark conditions to protect the exposed surface of the core particle 111 in which the modified layer 113 is not formed. Thereafter, the antibody protein is introduced with an amine group, and then irradiated with ultraviolet light to induce photo-crosslinking between the diazirine group of the crosslinking agent and the amine group of the antibody protein, thereby providing the antibody protein. May be bonded to the crosslinking agent. In this case, as the crosslinking agent, sulfo-NHS-diazirine (SDA), NHS-SS-Diazirine (SDAD), sulfo-NHS-SS-Diazirine (sulfo-SDAD), N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide (ANB- NOS), sulfosuccinimidyl 6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH) and the like can be used. On the other hand, in order to block the unreacted cross-linking agent residues can be irradiated with ultraviolet light again after treatment with ethanolamine (ethanolamine).
상기 광학 표지자(110)를 상기 기판으로부터 분리하는 단계(S150)에 있어서, 상기와 같이 제조된 광학 표지자(110)는 초음파 처리를 통해 상기 기판으로부터 분리될 수 있다. In the step of separating the optical marker 110 from the substrate (S150), the optical marker 110 manufactured as described above may be separated from the substrate through an ultrasonic treatment.
한편, 상기 기판으로부터 분리된 광학 표지자(110)에 대해서는, 목적 생체물질과의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 상기 코어 입자(111)의 노출된 표면 및 상기 수식층(113) 표면에 보호막을 형성할 수 있다. 예를 들면, 상기 광학 표지자(110)를 BSA(bovine serum albumin)를 함유하는 인산완충용액에 침지시켜 상기 생체인지물질(115)을 제외한 상기 노출된 코어 입자(111) 표면 및 상기 수식층(113) 표면에 상기 보호막을 형성할 수 있다. On the other hand, for the optical marker 110 separated from the substrate, a protective film may be formed on the exposed surface of the core particle 111 and the surface of the modified layer 113 to prevent nonspecific binding to the target biological material. have. For example, the optical marker 110 is immersed in a phosphate buffer solution containing bovine serum albumin (BSA) to expose the surface of the core particles 111 except for the biocognitive material 115 and the modified layer 113. The protective film may be formed on the surface.
이하에서는 본 발명의 실시예에 대해 상술한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 몇 가지 실시 형태에 대한 것으로서, 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. However, the following examples are for some embodiments of the present invention, and the present invention should not be construed as being limited to the following examples.
[실시예 1] Example 1
시료들(Sample)로, 구형의 실리카 코어 입자 및 이의 표면 50％를 피복하는 알루미늄 전반사 유도층을 포함하는 제1 입자들이 부착된 카본 테이프(carbon tape), 실리카 코어 입자만으로 이루어진 제2 입자들이 부착된 카본 테이프(carbon tape) 및 어떠한 입자들도 부착되지 않은 카본 테이프(carbon tape)를 준비하였다. 그리고 이들의 분석을 위해 도 9에 도시된 바와 같은 바이오 센서를 제작하였다. 한편, 알루미늄 전반사 유도층이 피복된 실리카 코어 입자는 상기 코어 입자의 노출면이 상기 광원(Light source)을 향하도록 상기 카본 테이프에 부착되었다. Samples are attached to a carbon tape having first particles including spherical silica core particles and a total aluminum reflection inducing layer covering 50% of the surface thereof, and second particles consisting of silica core particles only. Prepared carbon tape and carbon tape to which no particles were attached. And a biosensor as shown in Figure 9 was prepared for their analysis. Meanwhile, silica core particles coated with the total aluminum reflection inducing layer were attached to the carbon tape so that the exposed surface of the core particles faced the light source.
상기 바이오 센서에 있어서, 광원(Light source), 광 분할기(Beam splitter) 및 상기 시료가 일렬로 배치되었다. 상기 시료들 표면에서 발생하는 거울반사의 영향을 제거하기 위해 상기 시료들은 입사광의 진행방향을 기준으로 오른쪽으로 30˚ 경사지게 설치되었고, 상기 광 분할기(Beam splitter)로부터 발생될 수 있는 각종 거울반사들의 영향을 배제하기 위해 상기 광 분할기 역시 상기 입사광의 진행방향을 기준으로 오른쪽으로 25˚ 경사지게 설치되었다. 한편, 재귀반사된 광의 광량을 분석하기 위하여 상기 수광부(Optical receiver)로는 휴대용 분광기(spectrometer)를 사용하였다. In the biosensor, a light source, a beam splitter, and the sample were arranged in a line. In order to remove the influence of the mirror reflection occurring on the surface of the specimens, the specimens are installed at an angle of 30 ° to the right side based on the direction of the incident light, and the influence of various mirror reflections that may be generated from the beam splitter. In order to exclude the light splitter, the light splitter was also inclined 25 ° to the right of the incident light. On the other hand, a portable spectrometer was used as the optical receiver in order to analyze the amount of light of the retroreflected light.
상기 광원으로 405 nm 파장의 다이오드 레이저, 532 nm 파장의 다이오드 레이저, 655 nm 파장의 다이오드 레이저 및 백색 LED를 각각 사용하여 상기 시료들 각각에 대해 재귀반사된 광량을 측정하였다. The amount of retroreflected light for each of the samples was measured using a 405 nm wavelength diode laser, a 532 nm diode laser, a 655 nm diode laser, and a white LED as the light source.
도면 10은 광원으로 상기 3종류의 다이오드 레이저들을 사용한 경우의 상기 시료들에 대한 재귀반사 광의 분석 결과이고, 도면 11은 광원으로 백색 LED를 사용한 경우의 상기 시료들에 대한 재귀반사 광의 분석 결과이다. FIG. 10 is a result of analysis of retroreflected light on the samples when the three types of diode lasers are used as a light source, and FIG. 11 is a result of analysis of retroreflected light on the samples when the white LED is used as the light source.
도 10을 참조하면, 알루미늄 전반사 유도층이 피복된 실리카 코어 입자가 부착된 카본 테이프에서 가장 강한 재귀반사 신호가 검출되었고, 입자가 부착되지 않은 카본 테이프에서는 재귀반사 신호가 거의 검출되지 않았다. 구체적으로, 정량적인 분석결과 405 nm, 532 nm, 655 nm의 각 파장에서 알루미늄 전반사 유도층이 피복된 실리카 코어 입자가 부착된 카본 테이프가 순수 실리카 입자가 부착된 카본 테이프에 비해 각각 458％, 246％, 180％ 강한 재귀반사 신호를 제공하였다. Referring to FIG. 10, the strongest retroreflective signal was detected in the carbon tape with silica core particles coated with the total aluminum reflection inducing layer, and almost no retroreflective signal was detected in the carbon tape to which the particles were not attached. Specifically, as a result of quantitative analysis, the carbon tape with silica core particles coated with the total aluminum reflection inducing layer at the wavelengths of 405 nm, 532 nm and 655 nm was 458% and 246, respectively, compared with the carbon tape with pure silica particles. %, 180% strong retroreflective signal was provided.
도 11을 참조하면, 백색 LED 광원에 대한 재귀반사 신호 분석결과도 다이오드 레이저들 광원의 분석결과와 유사하게, 모든 파장에서 알루미늄 전반사 유도층이 피복된 실리카 코어 입자가 부착된 카본 테이프가 순수 실리카 입자가 부착된 카본 테이프보다 강한 재귀반사 신호를 제공하였다.Referring to FIG. 11, the result of retroreflective signal analysis of a white LED light source is similar to that of diode lasers. The carbon tape having silica core particles coated with the total reflection induction layer on all wavelengths is pure silica particles. It gave a stronger retroreflective signal than the carbon tape with.
이상의 사항을 종합하면, 코어 입자에 전반사 유도층을 피복하는 경우 재귀반사되는 광량을 현저하게 향상시킬 수 있고, 또한, 상기와 같은 입자들은 모든 가시광 영역에서 광학 표지자로 사용이 가능함을 확인할 수 있다. In summary, when the total particle induction layer is coated on the core particles, the amount of retroreflected light can be remarkably improved, and the particles can be used as optical markers in all visible light regions.
[실시예 2]  Example 2
도면 12는 항체단백질(mouse IgG)이 자기조립단분자막(SAM), 덴드리머(dendrimer) 그리고 광 가교(photo-crosslinking) 기법을 통해 수식된 광학 표지자(상단) 및 광 가교(photo-crosslinking) 기법의 사용 없이 자기조립단분자막(SAM)만을 이용하여 수식된 광학 표지자(하단)에 대해 형광이 표지된 anti-mouse IgG를 처리한 후의 형광현미경 사진들이다.  12 shows the use of optical marker (top) and photo-crosslinking techniques in which antibody IgG is modified through self-assembled monolayers (SAM), dendrimers, and photo-crosslinking techniques. Fluorescence micrographs after treatment of fluorescently labeled anti-mouse IgG with respect to the modified optical marker (bottom) using only self-assembled monolayer (SAM).
도 12를 참조하면, 항체단백질(mouse IgG)이 자기조립단분자막(SAM), 덴드리머(dendrimer) 그리고 광 가교(photo-crosslinking) 기법을 통해 수식된 광학 표지자에서는 상기 항체가 수식층에만 위치 선택적으로 수식되었으나, 항체단백질(mouse IgG)이 광 가교(photo-crosslinking) 기법의 사용 없이 자기조립단분자막(SAM)만을 이용하여 수식된 광학 표지자에서는 상기 항체가 수식층뿐만 아니라 노출된 실리카 코어 입자 표면에도 수식되었음을 확인할 수 있다. 따라서, 생체인지물질이 항체 단백질인 경우, 광 가교(photo-crosslinking) 기법은 상기 항체 단백질의 위치 선택적 수식에 중요한 역할을 수행함을 알 수 있다. Referring to FIG. 12, in an optical label in which an antibody protein (mouse IgG) is modified through a self-assembled monolayer (SAM), a dendrimer, and a photo-crosslinking technique, the antibody is selectively modified on a modified layer only in a modified layer. However, in optical markers in which antibody IgG was modified using only self-assembled monolayer (SAM) without the use of photo-crosslinking techniques, the antibody was modified not only on the modified layer but also on the surface of the exposed silica core particles. You can check it. Therefore, when the biorecognition material is an antibody protein, it can be seen that photo-crosslinking technique plays an important role in the site-selective modification of the antibody protein.
[실시예 3] Example 3
심근경색 바이오마커인 cTnI의에 대한 샌드위치 면역분석(sandwich immunoassay)을 수행하였다. 구체적으로, 아민 반응성(Amine-reactive) 자기조립단분자막(SAM)이 형성된 골드 칩(gold chip) 표면에 cTnI 고정화 항체를 수식하고, 다양한 농도의 cTnI (0 ~ 1000 ng/mL)를 반응시킨 후, 이에 대해 cTnI 검출용 항체가 수식된 광학 표지자를 결합시켰다. 이후 해당 센싱 기판들을 광학현미경 상에서 x5 대물렌즈와 백색 LED광원을 사용하여 화상정보를 수득하였다. Sandwich immunoassay was performed for cTnI, a myocardial infarction biomarker. Specifically, after modifying the cTnI immobilized antibody on the surface of the gold chip (Amine-reactive self-assembled monolayer (SAM) formed gold chip (gold chip), and reacted cTnI (0 ~ 1000 ng / mL) of various concentrations, In response, the antibody for detecting cTnI bound the modified optical marker. The sensing substrates were then imaged using an x5 objective lens and a white LED light source on an optical microscope.
도 13a 및 도 13b는 상기 실험에 대한 실험 결과를 나타내는 이미지들과 그래프이다. 13A and 13B are images and graphs showing experimental results for the above experiment.
도 13a 및 도 13b를 참조하면, cTnI의 농도가 증가할수록 센싱 기판에 나타나는 광학 표지자의 수가 증가하였으며, 이를 Image J 프로그램으로 계수한 결과 도 13b와 같이 나타났다. 도 13b는 3회 반복 실험 결과를 평균한 결과를 도시한 것이다. 제작된 재귀반사 기반의 cTnI 면역센싱 시스템의 검출민감도는 0.03 ng/mL로 계산되었으며, 이는 심근경색 진단에서 Cut-off level로 알려진 0.1 ng/mL 수준을 만족하는 결과이다. 기존의 cTnI 광학 바이오센서들이 복잡한 분광분석 시스템을 이용하여 cTnI를 검출했던 것과 반대로 본 발명에서 구현된 면역센싱 기법에서는 최소한의 광학계와 비분광 백색광원만을 사용했음에도 임상학적으로 의미있는 바이오마커의 검출을 구현할 수 있었다. 13A and 13B, as the concentration of cTnI increased, the number of optical markers appearing on the sensing substrate increased, and the result was counted by Image J program as shown in FIG. 13B. 13B shows the result of averaging the results of three replicate experiments. The detection sensitivity of the manufactured retroreflective-based cTnI immunosensing system was calculated to be 0.03 ng / mL, which satisfies the 0.1 ng / mL level known as the cut-off level in the diagnosis of myocardial infarction. In contrast to conventional cTnI optical biosensors that detect cTnI using a complex spectroscopic analysis system, the immunosensing technique implemented in the present invention detects clinically meaningful biomarkers even though only minimal optical systems and non-spectral white light sources are used. Could be implemented.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.While the foregoing has been described with reference to preferred embodiments of the present invention, those skilled in the art will be able to variously modify and change the present invention without departing from the spirit and scope of the invention as set forth in the claims below. It will be appreciated.

Claims (25)

  1. 목적 생체물질과 선택적으로 결합하고, 입사광을 재귀반사시키는 바이오 센서용 광학 표지자에 있어서, In the optical marker for a biosensor that selectively binds to a target biological material and retroreflects incident light,
    투명한 코어 입자;Transparent core particles;
    상기 코어 입자 표면의 일부를 피복하고, 적어도 360nm 내지 820nm의 가시광선 파장 영역에서 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 물질로 형성된 전반사 유도층;A total reflection inducing layer covering a part of the surface of the core particle and formed of a material having a refractive index smaller than that of the core particle in a visible light wavelength range of at least 360 nm to 820 nm;
    상기 전반사 유도층 상에 형성된 수식층; 및A modified layer formed on the total reflection inducing layer; And
    상기 수식층에 결합되고, 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 포함하는 바이오 센서용 광학 표지자.The optical marker for a biosensor coupled to the modified layer, comprising a biocognitive material that selectively binds to the target biomaterial.
  2. 제1항에 있어서, The method of claim 1,
    상기 코어 입자는 구형의 형상을 갖고, 투명한 산화물 또는 투명한 고분자 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.The core particle has a spherical shape, the optical marker for a biosensor, characterized in that formed of a transparent oxide or a transparent polymer material.
  3. 제2항에 있어서, The method of claim 2,
    상기 코어 입자는 실리카(silica), 글라스(glass), 폴리스티렌(polystyrene) 및 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate))로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.The core particle is an optical marker for biosensor, characterized in that formed of one material selected from the group consisting of silica, glass, polystyrene, and poly (methyl methacrylate). .
  4. 제2항에 있어서, The method of claim 2,
    상기 코어 입자는 700nm 이상 5㎛ 이하의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.The core particle is an optical marker for a biosensor, characterized in that it has an average diameter of 700nm or more and 5㎛ or less.
  5. 제2항에 있어서, The method of claim 2,
    상기 전반사 유도층은 상기 코어 입자의 표면 중 약 30％ 이상 70％ 이하의 면적을 피복하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.And the total reflection inducing layer covers an area of about 30% or more and 70% or less of the surface of the core particle.
  6. 제1항에 있어서, The method of claim 1,
    상기 코어 입자는 상기 가시광선 파장 영역에서 1.4 이상의 굴절률을 갖는 물질로 형성되고, The core particle is formed of a material having a refractive index of 1.4 or more in the visible light wavelength region,
    상기 전반사 유도층은 상기 가시광선 파장 영역에서 상기 코어 입자보다 작은 굴절률을 갖는 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.The total reflection inducing layer is an optical marker for a biosensor, characterized in that formed of a material having a refractive index smaller than the core particles in the visible light wavelength region.
  7. 제6항에 있어서, The method of claim 6,
    상기 전반사 유도층은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag) 및 아연(Zn)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.The total reflection inducing layer is formed of at least one material selected from the group consisting of aluminum (Al), copper (Cu), gold (Au), silver (Ag) and zinc (Zn).
  8. 제6항에 있어서, The method of claim 6,
    상기 전반사 유도층은 10 내지 100nm의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자.The total reflection inducing layer is an optical marker for a biosensor, characterized in that having a thickness of 10 to 100nm.
  9. 제1항에 있어서, The method of claim 1,
    상기 수식층은 백금(Pt), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 물질로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자. The modifying layer is an optical marker for a biosensor, characterized in that formed of at least one material selected from the group consisting of platinum (Pt), gold (Au) and silver (Ag).
  10. 제8항에 있어서, The method of claim 8,
    상기 수식층은 10 내지 100 nm의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자. The modifying layer is an optical marker for a biosensor, characterized in that having a thickness of 10 to 100 nm.
  11. 제1항에 있어서, The method of claim 1,
    상기 생체인지물질은 단백질, 핵산, 리간드 및 리셉터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자. The biocognitive is an optical marker for a biosensor, characterized in that it comprises one or more selected from the group consisting of proteins, nucleic acids, ligands and receptors.
  12. 제8항에 있어서, The method of claim 8,
    상기 목적 생체물질이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 또는 압타머(Aptamer) 물질이고, When the target biomaterial is an antigenic substance, the biocognitive substance is an antibody or aptamer substance that specifically reacts with the antigenic substance,
    상기 목적 생체물질이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 핵산 물질이며,When the target biomaterial is a genetic material, the biocognitive material is a nucleic acid material capable of complementary binding to the genetic material,
    상기 목적 생체물질이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 물질 또는 세포 리셉터인 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자. When the target biomaterial is a cell signal material, the biocognitive material is a chemical ligand material or a cell receptor that selectively binds to the cell signal material.
  13. 제1항에 있어서, The method of claim 1,
    상기 전반사 유도층과 상기 수식층 사이에 배치되고, 자성 물질로 형성된 자성층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자. The optical marker for a biosensor, further comprising a magnetic layer disposed between the total reflection induction layer and the modified layer and formed of a magnetic material.
  14. 목적 생체물질을 고정하는 생체물질 고정부;A biomaterial fixing unit to fix the target biomaterial;
    상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하고, 조사된 광을 재귀반사시킬 수 있는 광학 표지부;An optical label that selectively binds to the target biomaterial and can retroreflect irradiated light;
    상기 광학 표지부에 광을 조사하는 광원부; 및A light source unit emitting light to the optical label unit; And
    상기 광학 표지부에 의해 재귀반사된 광을 수용하는 수광부를 포함하는 바이오 센서.Biosensor comprising a light receiving unit for receiving the light retroreflected by the optical label.
  15. 제14항에 있어서, The method of claim 14,
    상기 광학 표지부는,The optical label unit,
    구형의 투명한 코어 입자;Spherical transparent core particles;
    상기 코어 입자 표면의 일부를 피복하고, 상기 코어 입자보다 굴절률이 작은 물질로 형성된 전반사 유도층;A total reflection inducing layer covering a part of the surface of the core particle and formed of a material having a refractive index smaller than that of the core particle;
    상기 전반사 유도층 상에 형성된 수식층; 및A modified layer formed on the total reflection inducing layer; And
    상기 수식층에 결합되고, 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.A biosensor coupled to the modifying layer and comprising a biocognitive material that selectively binds to the target biomaterial.
  16. 제14항에 있어서, The method of claim 14,
    상기 생체물질 고정부는 기판; 및 상기 기판 상에 배치되고 상기 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 고정 물질을 포함하고,The biomaterial fixing unit includes a substrate; And a fixation material disposed on the substrate and selectively binding to the target biomaterial,
    상기 광원은 상기 기판 표면의 법선에 대해 5 내지 60˚ 경사진 방향으로 광을 조사하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.The light source is a biosensor, characterized in that for irradiating light in a direction inclined 5 to 60 ° with respect to the normal of the surface of the substrate.
  17. 제16항에 있어서, The method of claim 16,
    상기 수광부는, 상기 광학 표지부에 입사하는 입사광과 상기 광학 표지부로부터 재귀반사된 광을 분할하는 광분할부; 상기 광분할부에 의해 분할된 재귀반사 광 신호를 수신하여 이미지화하는 화상 생성부; 및 상기 화상 생성부에 의해 생성된 화상 정보를 분석하는 화상 분석부를 포함하고,The light receiving unit may include: a light splitting unit configured to split incident light incident on the optical labeling unit and light retroreflected from the optical labeling unit; An image generator for receiving and imaging the retroreflected optical signal divided by the light splitter; And an image analyzing unit analyzing the image information generated by the image generating unit,
    상기 광분할부는 상기 기판 표면의 법선과 상기 광원과 동일한 방향으로 0 내지 60˚의 각도를 이루도록 설치된 것을 특징으로 하는 바이오 센서.The light splitter is a biosensor characterized in that it is installed to form an angle of 0 to 60 degrees in the same direction as the normal to the surface of the substrate and the light source.
  18. 투명한 코어 입자들을 제조하는 단계; Preparing transparent core particles;
    기판의 표면 상에 상기 코어 입자들을 단층으로 배열시키는 단계; Arranging the core particles in a single layer on the surface of the substrate;
    상기 코어 입자들이 배열된 상기 기판 상에서 제1 금속의 증착 공정 및 제2 금속의 증착 공정을 순차적으로 수행하여 상기 코어 입자들의 표면 일부를 피복하도록 적층된 전반사 유도층 및 수식층을 각각 형성하는 단계; Sequentially performing a deposition process of a first metal and a deposition process of a second metal on the substrate on which the core particles are arranged to form a total reflection guide layer and a modification layer which are laminated to cover a portion of the surface of the core particles;
    상기 수식층에 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 결합시키는 단계; 및 Coupling a biocognitive material selectively binding to a target biomaterial to the modified layer; And
    상기 코어 입자, 상기 전반사 유도층, 상기 수식층 및 상기 생체인지물질을 포함하는 광학 표지자를 상기 기판으로부터 분리하는 단계를 포함하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.And separating the optical marker including the core particle, the total reflection inducing layer, the modifying layer, and the biocognitive material from the substrate.
  19. 제18항에 있어서, The method of claim 18,
    상기 투명한 코어 입자들은 TEOS(Tetraethylorthosilicate)를 이용한 스토버 방법(Stober method) 또는 씨드성장법 (Seed-growth method)에 의해 제조된 실리카 코어 입자들을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.The transparent core particles are a method for producing an optical marker for a biosensor, comprising silica core particles produced by a Stober method or Seed-growth method using TEOS (Tetraethylorthosilicate) .
  20. 제18항에 있어서, The method of claim 18,
    상기 기판의 표면 상에 상기 코어 입자들을 단층으로 배열시키는 단계는,Arranging the core particles in a single layer on the surface of the substrate,
    상기 코어 입자들의 표면을 소수성으로 개질한 후 이들을 물 및 공기의 계면에 단층으로 배열시키는 단계; 및Modifying the surfaces of the core particles hydrophobicly and then arranging them in a monolayer at the interface of water and air; And
    상기 기판을 상기 물의 내부에서 상기 공기 방향으로 인출하여 상기 코어 입자들을 상기 기판의 표면에 부착시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.And extracting the substrate from the inside of the water in the air direction to attach the core particles to the surface of the substrate.
  21. 제18항에 있어서, The method of claim 18,
    상기 제1 금속 및 상기 제2 금속은 각각 화학적 기상 증착법(chemical vapor deposition, CVD) 또는 물리적 기상 증착법(physical vaopr deposition, PVD)의 방법으로 상기 기판 상에 증착되고,The first metal and the second metal are respectively deposited on the substrate by a method of chemical vapor deposition (CVD) or physical vapor deposition (PVD),
    상기 제1 금속은 알루미늄(Al), 구리(Cu), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하며,The first metal includes at least one selected from the group consisting of aluminum (Al), copper (Cu), gold (Au), and silver (Ag),
    상기 제2 금속은 백금(Pt), 금(Au) 및 은(Ag)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.The second metal is a method of manufacturing an optical marker for a biosensor, characterized in that it comprises at least one selected from the group consisting of platinum (Pt), gold (Au) and silver (Ag).
  22. 제21항에 있어서, The method of claim 21,
    상기 전반사 유도층이 상기 코어 입자 표면의 30 내지 70%를 피복하도록 상기 제1 금속이 증착되는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.And the first metal is deposited such that the total reflection inducing layer covers 30 to 70% of the surface of the core particles.
  23. 제18항에 있어서, The method of claim 18,
    상기 목적 생체물질이 항원 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 항원 물질과 특이적으로 반응하는 항체 단백질 또는 압타머(Aptamer) 물질이고,When the target biomaterial is an antigenic substance, the biocognitive substance is an antibody protein or aptamer substance that specifically reacts with the antigenic substance,
    상기 목적 생체물질이 유전자 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 유전자 물질과 상보적인 결합이 가능한 핵산 물질이며,When the target biomaterial is a genetic material, the biocognitive material is a nucleic acid material capable of complementary binding to the genetic material,
    상기 목적 생체물질이 세포신호 물질인 경우, 상기 생체인지물질은 상기 세포신호 물질과 선택적으로 결합하는 화학적 리간드 또는 세포 리셉터 물질인 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.When the target biomaterial is a cell signal material, the biocognitive material is a chemical ligand or a cell receptor material that selectively binds to the cell signal material.
  24. 제18항에 있어서, The method of claim 18,
    상기 생체인지물질이 상기 항체 단백질 물질인 경우, 상기 수식층에 상기 생체인지물질을 결합시키는 단계는,When the biocognitive material is the antibody protein material, the step of coupling the biocognitive material to the modified layer,
    한쪽 말단 혹은 분자구조 내에 다이설파이드기를 구비하고 이와 다른 말단 또는 분자 구조 내에 숙신이미드기를 구비하는 자기조립단분자막(SAM)을 상기 수식층의 표면에 결합시키는 단계;Bonding a self-assembled monolayer (SAM) having a disulfide group in one terminal or molecular structure and a succinimide group in the other terminal or molecular structure to the surface of the modified layer;
    상기 자기조립단분자막에 아민 말단의 PAMAM 덴드리머를 결합시키는 단계;Coupling an amine-terminated PAMAM dendrimer to the self-assembled monolayer;
    sulfo-NHS기(N-hydroxysulfosuccinimide group) 및 디아지린기(diazirine group)를 구비하는 가교제(cross-linker)를 상기 PAMAM 덴드리머에 결합시키는 단계;coupling a cross-linker having a sulfo-NHS group (N-hydroxysulfosuccinimide group) and a diazirine group to the PAMAM dendrimer;
    자외선을 조사하여 상기 항체 단백질의 아민기과 상기 가교제의 디아지린기(diazirine group) 사이의 광가교(photo-crosslinking) 시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.And irradiating ultraviolet light to photo-crosslinking between the amine group of the antibody protein and the diazirine group of the crosslinking agent.
  25. 제18항에 있어서, The method of claim 18,
    상기 목적 생체물질과의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 상기 코어 입자의 노출된 표면에 보호막을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법.And forming a protective film on the exposed surface of the core particle to prevent nonspecific binding with the target biomaterial.
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