WO2017065314A1 - ローヤルゼリー分画の製造方法 - Google Patents

ローヤルゼリー分画の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2017065314A1
WO2017065314A1 PCT/JP2016/080718 JP2016080718W WO2017065314A1 WO 2017065314 A1 WO2017065314 A1 WO 2017065314A1 JP 2016080718 W JP2016080718 W JP 2016080718W WO 2017065314 A1 WO2017065314 A1 WO 2017065314A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
royal jelly
fraction
raw milk
somatostatin
hippocampal
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/080718
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
徹 山國
伊知郎 川畑
山口　喜久二
清志 村田
Original Assignee
国立大学法人東北大学
ジャパンローヤルゼリー株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東北大学, ジャパンローヤルゼリー株式会社 filed Critical 国立大学法人東北大学
Priority to EP16855565.4A priority Critical patent/EP3363445B1/en
Priority to JP2016575246A priority patent/JP6117453B1/ja
Publication of WO2017065314A1 publication Critical patent/WO2017065314A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/63—Arthropods
    • A61K35/64—Insects, e.g. bees, wasps or fleas
    • A61K35/644—Beeswax; Propolis; Royal jelly; Honey
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a royal jelly fraction.
  • Dementia includes Alzheimer type dementia, cerebrovascular dementia, Lewy body dementia, frontotemporal lobar degeneration, etc., and 60 to 70% of dementia is said to be Alzheimer type dementia.
  • Alzheimer-type dementia includes presenile-onset Alzheimer's disease (AD, also called juvenile Alzheimer's disease) and senile-onset Alzheimer-type senile dementia (SDAT).
  • AD presenile-onset Alzheimer's disease
  • SDAT senile-onset Alzheimer-type senile dementia
  • ATD is divided into 65 years of onset age, and is differentiated by age from Alzheimer's disease (AD) of onset before 65 years old and Alzheimer-type senile dementia (SDAT) of onset after 65 years of age.
  • AD it is known that the hippocampus and entorhinal cortex that control memory are most likely to be affected at an early stage.
  • Episodic memory is particularly likely to be impaired in AD.
  • the hippocampus and entorhinal cortex are important for episodic memory.
  • the entorhinal cortex plays a role in bridging the hippocampus and cerebral neocortex, and memory is stored in the cerebral cortex from the hippocampus through the entorhinal cortex.
  • the entorhinal cortex is impaired from an early stage, so that memory cannot be stored in the cerebral cortex.
  • LTP Long-term potentiation
  • CREB cAMP responsive element binding protein
  • a ⁇ Soluble amyloid ⁇ oligomers are believed to be responsible for early cognitive dysfunction of AD. This A ⁇ oligomer suppresses CRE-dependent transcriptional activity closely related to memory formation in hippocampal neurons.
  • CAMP / PKA / ERK / CREB-dependent signal transduction pathways have been shown to be closely related to the memory and learning ability of the brain.
  • AD amyloid ⁇ protein
  • synaptic plasticity disorder without neuronal cell death due to soluble A ⁇ is a cause of memory impairment in Alzheimer's disease (AD). It has come to be understood as one.
  • LTP neurotransmission
  • a ⁇ is known to inhibit PKA / CREB signaling and suppress the generation of this LTP. That is, it is considered that a food containing a physiologically active substance that improves or suppresses signal transduction inhibition by A ⁇ is useful for improving / preventing AD.
  • Senile plaques and neurofibrillary tangles appear in the cerebrum of AD patients. In the cerebral cortex, senile plaques appear first, followed by neurofibrillary tangles. For this reason, it was initially thought that the cause of AD was senile plaques. However, from the results of a clinical study that memory impairment could not be improved by eliminating senile plaques, it was concluded that senile plaques were not the cause of AD but a result. More recently, soluble amyloid ⁇ (A ⁇ ) oligomers are believed to be responsible for memory impairment that appears early in AD.
  • a ⁇ soluble amyloid ⁇
  • a ⁇ oligomer accumulation suppression system comprising hippocampal neurons producing A ⁇ oligomer degrading enzyme (neprilysin) and hippocampal neurons producing factors (somatostatin) that strengthen neprilysin has been discovered.
  • a ⁇ is a molecule consisting of 42 amino acids, and structural changes occur for some reason, and two of these change together to form an A ⁇ oligomer. It has been proved that this A ⁇ oligomer has a toxicity that damages nerve cells in the hippocampus and causes memory impairment and cell death. It also has the activity of inducing neurofibrillary tangles in the hippocampus and cerebral cortex. Moreover, the action of this degrading enzyme and the expression of its activity enhancing factor are attenuated with aging and AD. Therefore, development of a functional food that can recover and strengthen the hippocampal A ⁇ oligomer degradation system is desired.
  • the present invention provides a method for producing a royal jelly fraction having a higher CRE-dependent transcription promoting action than the prior art.
  • the present invention relates to the following.
  • [1] Elution of royal jelly with water to obtain a residue, elution of the obtained residue with 50% ethanol to obtain a residue, and then elution of the obtained residue with 99.5% ethanol
  • a method for producing a royal jelly fraction comprising obtaining each fraction, [2]
  • [3] The composition according to [2], wherein the royal jelly is a royal jelly fraction obtained by the method of [1].
  • the royal jelly fraction of the present invention is useful for the prevention and / or treatment of Alzheimer's disease.
  • a sample obtained by dissolving royal jelly raw milk in DMSO exhibits stronger CRE-dependent transcription promoting activity than PBS ( ⁇ )-dissolved raw milk.
  • the left is PBS ( ⁇ )-dissolved raw milk, and the right is DMSO-dissolved raw milk.
  • *** is p ⁇ 0.001 and ** is p ⁇ 0.01.
  • MK-801 is 10 ⁇ M and nobiletin is a 30 ⁇ M treatment.
  • Transcriptional promoting activity was also confirmed in fractions (Fr. 2, 3, 4) other than the water-soluble fraction of royal jelly raw milk.
  • One-way analysis of variance with post hoc Tukey test was performed for all pairs. Each royal jelly fraction was treated with 100 ⁇ g / ml.
  • FIG. 4 shows a method for fractionating royal jelly raw milk.
  • FIG. 5 shows the transcriptional accelerating activity associated with memory of royal jelly lyophilized powder (FD powder) and each fraction.
  • FD powder royal jelly lyophilized powder
  • FIG. 5 shows the transcriptional accelerating activity associated with memory of royal jelly lyophilized powder (FD powder) and each fraction.
  • FD120329 freeze-dried powder 100 ⁇ g / ml and each fraction 100100 ⁇ g / ml
  • ## is p ⁇ 0.01
  • ### is p ⁇ 0.001.
  • FIG. 6 shows transcription promoting activity related to memory of fraction 3 of royal jelly.
  • Fr. 1-4 are 100 ⁇ g / ml and nobiletin is a 30 ⁇ M treatment.
  • the left side of FIG. 7 shows the inhibitory effect on the action of the royal jelly raw milk and the A ⁇ oligomer of fraction 3.
  • One-way analysis of variance with post hoc Tukey test was performed for all pairs.
  • FIG. 7 shows the effect of A ⁇ on CRE-dependent transcriptional activity. Student's t-test was used. For control, *** is p ⁇ 0.001.
  • tyrosine hydroxylase TH
  • phosphorylated cofilin which are rate-limiting enzymes for dopamine synthesis by royal jelly raw milk and fraction 3 in adult mouse midbrain (substantia nigra / ventral tegmental area) dopamine nerve.
  • the third fraction of 8 mg / kg royal jelly or 0.5 g / kg royal jelly raw milk was orally administered for 1 week, then fixed by refluxing, sliced sections were prepared, and midbrain tissues were stained. Increased phosphorylated cofilin levels and tyrosine hydroxylase expression were observed.
  • the scale bar is 300 ⁇ m.
  • FIG. 10 shows the effect of royal jelly raw milk (100 ⁇ g / ml) on the expression level of neprilysin mRNA in cultured hippocampal nerves. Each mRNA level was normalized by ⁇ -actin. Values are expressed as mean ⁇ SEM. For the control (empty column), *** is p ⁇ 0.001. For the vehicle (packed column), ### is p ⁇ 0.001. n is 3. CNT is the control and CS is 10 ⁇ M cyclosomatostatin.
  • FIG. 11 shows the effect of royal jelly fraction 3 on somatostatin, neprilysin, NGF and BDNF mRNA expression levels in cultured hippocampal nerves. Each mRNA level was normalized by ⁇ -actin.
  • FIG. 12 shows the enhancement of somatostatin expression by royal jelly raw milk and royal jelly fraction 3 in adult mouse hippocampal nerves.
  • the scale bar is 200 ⁇ m.
  • the stained part at the end of the arrow indicates the expression of somatostatin.
  • FIG. 13 shows enhanced expression of somatostatin by royal jelly raw milk and royal jelly fraction 3 in the adult mouse hippocampal nerve.
  • the lower part is an enlarged view of a part surrounded by a dotted line in the upper part.
  • FIG. 14 shows enhancement of somatostatin expression by royal jelly raw milk and royal jelly fraction 3 in the adult mouse hippocampal nerve.
  • 1 to 3 correspond to the control in the enlarged view of FIG. 13, the royal jelly fraction 3, and the royal jelly raw milk, respectively.
  • the somatostatin positive nerve cells of each treatment group in the immunohistochemical staining results were individually analyzed, and the somatostatin expression level is shown on the vertical axis. 1. Black circles are 30 cells in the control group. 2. Black squares represent royal jelly fraction 3 treatment group 32 cells. The black triangles show the analysis results of royal jelly raw milk treatment group 30 cells. *** p ⁇ 0.001 vs. control (significant difference test using Tukey ’s multi comparison test) in the royal jelly fraction 3 and the royal jelly raw milk treatment group.
  • the effect of enhancing the expression of somatostatin by oral administration of RJ raw milk in the aged mouse hippocampus One week oral administration of 0.5 g / kg of RJ raw milk in 17 month old C57BL6 strain old mice enhanced the expression level of somatostatin in cerebral cortex and hippocampus (arrow) in immunohistochemical analysis of brain tissue sections .
  • the scale bar is 200 ⁇ m.
  • the effect of enhancing expression of neprilysin by oral administration of RJ raw milk in the aged mouse hippocampus Same as above, oral administration of 0.5 g / kg of RJ raw milk in mice for one week enhanced the expression level of neprilysin in the cerebral cortex and hippocampus (arrow).
  • the scale bar is 200 ⁇ m.
  • the royal jelly fraction obtained by the production method of the present invention can be blended with pharmaceuticals, quasi drugs or foods for improving cognitive impairment.
  • Pharmaceutical forms include tablets, capsules, granules, syrups and the like. These pharmaceuticals can be produced using additives in normal pharmaceutical production.
  • the dose of the cognitive impairment improving agent of the present invention is not particularly limited.
  • it is 10 to 60 mg / kg body weight per day, preferably 20 mg / kg body weight per day. In some cases, it is 2 to 6 mg / kg body weight per day, preferably 2 to 3 mg / kg body weight.
  • the above dose can be administered once a day or divided into 2 to 3 times a day, and can be appropriately increased or decreased depending on the age, disease state, and symptoms.
  • the additive examples include lactose, dextrin, sucrose, mannitol, corn starch, sorbitol, crystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone and the like, and these can be used alone or in appropriate combination.
  • These pharmaceuticals can be produced by a method suitable for each pharmaceutical form according to the description of the Japanese Pharmacopoeia.
  • a flavoring agent, a coloring agent, a sweetener, etc. can also be used suitably.
  • the content of these additives can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • quasi drugs examples include tablets, capsules, granules, jellies, and drinks. These quasi-drugs can be manufactured using the additives in normal quasi-drug manufacture. Furthermore, these quasi drugs may contain other active ingredients such as vitamins. In addition, additives such as sweeteners, flavoring agents, coloring agents, and antioxidants may be used alone or in appropriate combination. These quasi drugs can be produced by methods well known to those skilled in the art.
  • Food forms include noodles, pasta, granules, tablets, jelly, liquid (beverage), and the like. These foods can be produced by appropriately using various food materials. Specific examples of food materials are rice, wheat, corn, potato, sweet potato, soy flour, seaweed flour, starch syrup, lactose, glucose, fructose, sucrose, mannitol, etc., which can be used alone or in appropriate combination. it can. If necessary, the desired shape can be obtained by using water or the like. Furthermore, flavoring agents, coloring agents, sweetening agents, edible oils, vitamins and the like can be added as appropriate.
  • the present invention also relates to a method for treating and / or preventing cognitive impairment, including administering the royal jelly fraction of the present invention to a subject in need of improvement of cognitive impairment.
  • the part of the brain called the hippocampus is indispensable for the higher-order functions of the brain that memorize everyday events and words. It is known that neuronal dysfunction of the hippocampus occurs in the early stage of Alzheimer's disease, which is the leading cause of dementia.
  • tyrosine hydroxylase TH
  • phosphorylated cofilin which are rate-limiting enzymes for dopamine synthesis
  • the third fraction of 8 mg / kg royal jelly or 0.5 g / kg royal jelly raw milk was orally administered for 1 week, then fixed by refluxing, sliced sections were prepared, and midbrain tissues were stained. Increased expression of phosphorylated cofilin levels and tyrosine hydroxylase was observed (FIG. 9).
  • Royal jelly raw milk and its fractions enhanced the expression of neprilysin and somatostatin in hippocampal neurons expressing A ⁇ oligomer degrading enzyme (neprilysin) and hippocampal neurons expressing factor (somatostatin) that enhances the function of neprilysin. Therefore, royal jelly can recover and enhance the degradation system of hippocampal A ⁇ oligomers.
  • Royal jelly raw milk increased neprilysin mRNA levels in a somatostatin receptor-dependent manner.
  • the hippocampal nerve culture system was used as an activity evaluation system for the somatostatin-neprilysin system.
  • Royal jelly raw milk fraction 3 increased the mRNA levels of neprilysin, its activity enhancing factors somatostatin, NGF, and BDNF (FIG. 11).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、ローヤルゼリーを水で溶出し残差を得ること、得られた残差を５０％エタノールで溶出し残差を得ること、次いで、得られた残差を９９．５％エタノールで溶出し溶出各分を得ることを含む、ローヤルゼリー分画の製造方法に関する。

Description

ローヤルゼリー分画の製造方法
　本発明は、ローヤルゼリー分画の製造方法に関する。
　認知症には、アルツハイマー型認知症、脳血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症等が含まれ、認知症の６０～７０％がアルツハイマー型認知症といわれている。アルツハイマー型認知症には、初老期発症型のアルツハイマー病（ＡＤ、若年性アルツハイマー病とも言われる。）と老年期発症型のアルツハイマー型老年期認知症（ＳＤＡＴ）とが含まれる。一般にはＡＴＤを発症年齢６５歳で分け、６５歳以前の発症のアルツハイマー病（ＡＤ）と、６５歳以降の発症のアルツハイマー型老年期認知症（ＳＤＡＴ）と年齢で区別している。ＡＤでは、記憶を司る海馬や嗅内皮質が最も早期に冒されやすいことが知られている。
　ＡＤでは記憶障害のうち特に、エピソード記憶が障害されやすい。エピソード記憶には海馬と嗅内皮質が重要である。嗅内皮質は海馬と大脳新皮質を橋渡しする役目があり、記憶は海馬から嗅内皮質を通って大脳皮質に蓄えられていく。しかしＡＤでは早期から嗅内皮質が障害されるため、記憶を大脳皮質に蓄えることができなくなる。
　海馬における長期増強（ＬＴＰ）は記憶と学習において重要なメカニズムのひとつとされている。また、ＡＤなどの認知機能障害などにおいては、様々な要因によりシナプス可塑性障害が起こり、その結果ＬＴＰが抑制されることによって記憶障害が引き起こされることが報告されている。このシナプス可塑性に重要な分子標的のひとつがｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化とそれに続くＣＲＥ依存的転写活性である。可溶性のアミロイドβ（Ａβ）オリゴマーは、ＡＤの初期の認知機能障害の原因と信じられている。このＡβオリゴマーは、海馬神経細胞において記憶形成と密接に関連するＣＲＥ依存的転写活性を抑制する。
　ｃＡＭＰ／ＰＫＡ／ＥＲＫ／ＣＲＥＢ依存的シグナル伝達経路は、脳の記憶・学習能力と密接に関連することが証明されている。近年、脳内におけるアミロイドβタンパク質（Ａβ）の蓄積に起因する神経の変性・脱落に加えて、可溶性Ａβによる神経細胞死を伴わないシナプス可塑性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）における記憶障害の原因の一つと理解されるようになってきた。例えば、学習および記憶形成の細胞機構の一つと考えられている海馬グルタミン酸シナプスにおける神経伝達の長期増強（ＬＴＰ）は、シナプス可塑性の代表的な例である。ＡβはＰＫＡ／ＣＲＥＢシグナル伝達を阻害して、このＬＴＰの発生を抑制することが知られている。つまり、このようなＡβによるシグナル伝達阻害を改善または抑制する生理活性物質を含有する食品は、ＡＤの改善・予防に有用であると考えられる。
　ＡＤの患者の大脳には、老人斑と神経原線維変化が現れる。大脳皮質では、まず老人斑が現れ、次いで神経原線維変化が現れる。このため、当初は、ＡＤの原因は、老人斑であると考えられていた。しかし、老人斑を消しても記憶障害を改善することができなかったとの臨床研究の結果から、老人斑は、ＡＤの原因ではなく結果であると結論された。より最近は、可溶性アミロイドβ（Ａβ）オリゴマーが、ＡＤの早期に現れる記憶障害の原因であると考えられている。
　近年、ＡＤの原因物質であるＡβオリゴマーを分解するシステムが海馬で発見された。より具体的には、Ａβオリゴマー分解酵素（ネプリライシン）を作る海馬神経細胞と、ネプリライシンの働きを強くする因子（ソマトスタチン）を作る海馬神経細胞からなるＡβオリゴマー蓄積抑制システムが発見された。
　Ａβは、４２のアミノ酸からなる分子であり、何らかの原因で構造変化が起こり、これが２つ集まって、Ａβオリゴマーができる。このＡβオリゴマーには、海馬にある神経細胞に傷害を与えて、記憶障害や細胞死を起こす毒性があることが証明されている。さらに、海馬や大脳皮質で神経原線維変化を誘導する活性もある。しかも、この分解酵素の働きや、その活性増強因子の発現は、老化やＡＤに伴って減弱する。したがって、海馬のＡβオリゴマー分解システムを回復・強化することができる機能性食品の開発が望まれている。
　凍結ローヤルゼリーが、神経細胞モデル（ＰＣ１２－Ｄ）に対する、ＣＲＥ依存性転写促進作用を有することが知られていた（特許文献１）。しかし、インビボでの記憶を司る海馬を構成する細胞に対する作用は、確認されていない。また、ローヤルゼリーのどのようなフラクションが、より有効であるのかも知られていない。
ＷＯ２００９／１５４１９７
　本発明は、従来技術に比べてより高いＣＲＥ依存性転写促進作用を有するローヤルゼリー分画の製造方法を提供する。
　本発明は、以下に関する。
［１］ローヤルゼリーを水で溶出し残差を得ること、得られた残差を５０％エタノールで溶出し残差を得ること、次いで、得られた残差を９９．５％エタノールで溶出し溶出各分を得ることを含む、ローヤルゼリー分画の製造方法、
［２］ローヤルゼリーを含む、海馬のＡβオリゴマー分解システムを回復・強化するための組成物、
［３］　ローヤルゼリーが、［１］の方法によって得られたローヤルゼリー分画である、［２］に記載の組成物。
　本発明のローヤルゼリー分画は、アルツハイマー病の予防及び/又は治療に有用である。
ローヤルゼリー原乳をＤＭＳＯに溶解したサンプルは、ＰＢＳ（－）溶解原乳と比べて強いＣＲＥ依存的転写促進活性を示す。左は、ＰＢＳ（－）溶解原乳であり、右は、ＤＭＳＯ溶解原乳である。値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）で示した。コントロールに対して、***は、ｐ＜０．００１であり、**は、ｐ＜０．０１である。ＭＫ－８０１は、１０μＭであり、ノビレチン（nobiletin）は、３０μＭ処置である。 ローヤルゼリー原乳の水溶性フラクション以外のフラクション（Ｆｒ．２，３，４）にも転写促進活性が確認された。全てのペアについて事後チューキー検定を伴う一元配置分散分析を行った。各ローヤルゼリーフラクションは、１００μｇ／ｍｌで処置した。ノビレチン（nobiletin）は、３０μＭ処置である。値は、全ての実験で平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）で示した。コントロールに対して、****は、ｐ＜０．０００１であり、**は、ｐ＜０．０１である。 図３は、ローヤルゼリー原乳及びそのフラクションの記憶と関連する転写の促進活性である。全てのペアについて事後チューキー検定を伴う一元配置分散分析を行った。値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）で示した。コントロールに対して、****は、ｐ＜０．０００１であり、*は、ｐ＜０．０５である。原乳フラクションは、１００μｇ／ｍｌであり、ノビレチン（nobiletin）は、３０μＭ処置である。 図４は、ローヤルゼリー原乳の分画方法である。水溶性画分は、ＰＢＳ（－）に溶解し、その他は、ＤＭＳＯに溶解し、活性を評価した。 図５は、ローヤルゼリーの凍結乾燥粉末（ＦＤ末）と各フラクションの記憶と関連する転写の促進活性である。全てのペアについて事後チューキー検定を伴う一元配置分散分析を行った。値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）で示した。コントロールに対して、***は、ｐ＜０．００１であり、**は、ｐ＜０．０１であり、*は、ｐ＜０．０５である。ＦＤ１２０３２９（フリーズドライ粉末１００μｇ／ｍｌ及び各フラクション１００１００μｇ／ｍｌ）に対して、##は、ｐ＜０．０１であり、###は、ｐ＜０．００１である。ノビレチン（３０μＭ）に対して、$$$は、ｐ＜０．００１であり、$は、ｐ＜０．０５である。 図６は、ローヤルゼリーのフラクション３の記憶と関連する転写の促進活性である。全てのペアについて事後チューキー検定を伴う一元配置分散分析を行った。値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）で示した。コントロールに対して、****は、ｐ＜０．０００１であり、*は、ｐ＜０．０５である。Ｆｒ．１～４は、１００μｇ／ｍｌであり、ノビレチン（nobiletin）は、３０μＭ処置である。 図７の左は、ローヤルゼリーの原乳及びフラクション３のＡβオリゴマーの作用に対する抑制効果である。全てのペアについて事後チューキー検定を伴う一元配置分散分析を行った。３０μＭアミロイドβ処理細胞に対して、***は、ｐ＜０．００１であり、*は、ｐ＜０．０５である。原乳フラクションは、１００μｇ／ｍｌであり、ノビレチン（nobiletin）は、３０μＭ処置である。　図７の右は、ＡβのＣＲＥ依存的転写活性に及ぼす影響である。スチューデントのｔ検定を用いた。コントロールに対して、***は、ｐ＜０．００１である。 図８は、初代培養海馬神経細胞におけるローヤルゼリーのフラクション３のＣＲＥ依存的転写活性に及ぼす影響である。全てのペアについて事後チューキー検定を伴う一元配置分散分析を行った。値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）で示した。コントロールに対して、***は、ｐ＜０．００１である。 図９は、成体マウス中脳（黒質・腹側被蓋野）ドパミン神経におけるローヤルゼリー原乳とフラクション３によるドパミン合成律速酵素であるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）及びリン酸化コフィリンの発現レベルである。８ｍｇ／ｋｇのローヤルゼリーの第３画分又は０．５ｇ／ｋｇのローヤルゼリー原乳を１週間経口投与後、還流固定し薄切切片を作成し、中脳組織を染色した。リン酸化コフィリンレベル及びチロシン水酸化酵素の発現増大が認められた。スケールバーは、３００μｍである。 図１０は、培養海馬神経のネプリライシンのｍＲＮＡ発現レベルに対するローヤルゼリー原乳（１００μｇ／ｍｌ）の効果である。各ｍＲＮＡレベルを、βアクチンによって標準化した。値は、平均±ＳＥＭで示した。コントロール（空カラム）に対して、***は、ｐ＜０．００１である。ベヒクル（充填カラム）に対して、###は、ｐ＜０．００１である。ｎは３である。ＣＮＴは、コントロールであり、ＣＳは、１０μＭシクロソマトスタチンである。 図１１は、培養海馬神経におけるソマトスタチン、ネプリライシン、ＮＧＦ及びＢＤＮＦのｍＲＮＡ発現レベルに対するローヤルゼリーフラクション３の効果である。各ｍＲＮＡレベルを、βアクチンによって標準化した。値は、平均±ＳＥＭで示した。コントロールに対して、***は、ｐ＜０．００１であり、**は、ｐ＜０．０１である。ｎは３である。ＳＭＴは、ソマトスタチンであり、ＮＰＬは、ネプリライシンである。 図１２は、成体マウス海馬神経におけるローヤルゼリー原乳とローヤルゼリーフラクション３によるソマトスタチンの発現の増強を示す。スケールバーは２００μｍである。矢印の先の染色されている部分がソマトスタチンの発現を示す。 図１３は、成体マウス海馬神経におけるローヤルゼリー原乳とローヤルゼリーフラクション３によるソマトスタチンの発現の増強を示す。下段は、上段の点線で囲んだ部分の拡大図である。 図１４は、成体マウス海馬神経におけるローヤルゼリー原乳とローヤルゼリーフラクション３によるソマトスタチンの発現の増強を示す。１～３は、それぞれ、図１３の拡大図のコントロール、ローヤルゼリーフラクション３、ローヤルゼリー原乳に対応する。免疫組織化学染色結果における各処置群のソマトスタチン陽性神経細胞を個別に解析し、ソマトスタチン発現レベルを縦軸に示した。１．黒丸はコントロール群３０細胞、２．黒四角はローヤルゼリーフラクション３処置群３２細胞、３．黒三角はローヤルゼリー原乳処置群３０細胞の解析結果を示した。ローヤルゼリーフラクション３、ローヤルゼリー原乳処置群ともに*** p < 0.001対コントロール（Tukey’s multiple comparison testを用いた有意差検定）。 老齢マウス海馬におけるＲＪ原乳経口投与によるソマトスタチンの発現増強効果。１７か月齢Ｃ５７ＢＬ６系統老齢マウスにおけるＲＪ原乳０．５ｇ／ｋｇの１週間経口投与は、脳組織切片の免疫組織化学的解析において、大脳皮質および海馬（矢印）におけるソマトスタチンの発現レベルを増強させた。スケールバーは２００μｍである。 老齢マウス海馬におけるＲＪ原乳経口投与によるネプリライシンの発現増強効果。同上マウスにおけるＲＪ原乳０．５ｇ／ｋｇの１週間経口投与は、大脳皮質および海馬（矢印）におけるネプリライシンの発現レベルを増強させた。スケールバーは２００μｍである。
　本発明の製造方法によって得られるローヤルゼリーの画分は、認知障害改善のための、医薬品、医薬部外品または食品などに配合することができる。
　医薬品の形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などが挙げられる。これら医薬品は、通常の医薬製造における添加剤を使用して製造することができる。
　本発明の認知障害改善剤の投与量は特に限定されないが、たとえば、経口投与の場合には一日あたり１０～６０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは一日あたり２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、非経口投与の場合には一日あたり２～６ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２～３ｍｇ／ｋｇ体重である。上記投与量は１日１回または２～３回に分けて投与することができ、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
　添加剤の具体例としては、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、これらを単独または適宜組合わせて使用することができる。これら医薬品は、日本薬局方の記載に従い、各々の医薬品の形態に適した方法で製造することができる。また、香味料、着色料、甘味料など適宜使用することもできる。これら添加剤の含有量は当業者に適切に選択され得る。
　医薬部外品の形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ゼリー剤、ドリンク剤などが挙げられる。これら医薬部外品は、通常の医薬部外品製造における添加剤を使用して製造することができる。さらに、これら医薬部外品は、例えばビタミン類などの他の有効成分を含有することもできる。また、甘味料、香味料、着色料、酸化防止剤などの添加剤を単独または適宜組み合わせて使用することもできる。これら医薬部外品は、当業者に周知の方法で製造することができる。
　食品の形態としては、麺、パスタ、顆粒、錠果、ゼリー、液体（飲料）などが挙げられる。これら食品は、様々な食品材料を適宜使用して製造することができる。食品材料の具体例は、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆粉、海藻粉、水飴、乳糖、グルコース、果糖、スクロース、マンニトールなどであり、これらを単独または適宜組み合わせて使用することができる。必要に応じて水などの使用により所望の形状にすることができる。さらに、香味料、着色料、甘味料、食用油、ビタミン類などを適宜添加することもできる。
　また、本発明は、本発明のローヤルゼリーの画分を、認知障害の改善の必要がある対象に投与することを含む、認知障害の治療及び/又は予防方法、より具体的には、に関する。
　以下に本発明を実施例で具体的に説明するが、これはその代表例を示すものであって、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
　海馬とよばれる脳の部位は、身の回りの出来事や言葉を記憶する脳の高次機能に不可欠である。認知症の最大の原因疾患であるアルツハイマー病の初期にはこの海馬の神経細胞の機能障害が起こることが知られている。
　海馬での記憶形成と関連する転写活性を指標にローヤルゼリーの作用を調べてみた。ネズミの脳の海馬から神経細胞を取り出して２週間培養し、その後培養液に新鮮なローヤルゼリー原乳を添加すると、海馬の神経細胞は応答して転写活性を上昇させた。さらに活性成分を濃縮して神経細胞を処置すると、応答は一層強くなることが観察された。今回の研究から、ローヤルゼリーは記憶と関連する海馬神経細胞の活性を強化する作用をもつことが示された。
　分画方法
１．オープンカラム（直径２５ｍｍ×全長５５０ｍｍ）にダイヤイオン（ＨＰ－２０、２０ｇ）を充填し、２～３時間水を流し続け平衡化させた。
２．上清（フラクション３）をエバポレーターで１ｍｌ～２ｍｌになるまで濃縮し、全量をカラムに充填した。
３．水（１００ｍｌ）を少しずつカラムに加え、溶出させ、画分を得た。
４．５０％エタノール（１００ｍｌ）を少しずつカラムに加え、溶出させ、画分を得た。
５．９９．５％エタノール（１００ｍｌ）を少しずつカラムに加え、溶出させ、画分を得た。
６．メタノール（１００ｍｌ）を少しずつカラムに加え、溶出させ、各分を得た。
７．上記の２～５で得られた画分を減圧下にて溶媒を留去し、収量を測定した。
　以下に、各画分の収量を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　１４日間培養した海馬神経細胞系での評価結果
　ＲＪ原乳のフラクション３を再分画したサンプル（Ｆｒ．３－１，Ｆｒ．３－２，Ｆｒ．３－３，Ｆｒ．３－４）について海馬の記憶形成と関連する活性を促進するか検証した。１００μｇ／ｍＬの処置濃度ではＦｒ．３－１，Ｆｒ．３－２，Ｆｒ．３－３，Ｆｒ．３－４の全てにおいて促進活性を認めた。しかしながら、各フラクションの収量を考慮すると、Ｆｒ．３－３に最も強い活性があると算出される（図８）。
　ローヤルゼリー及び各フラクションを１４日間培養した海馬神経細胞系で評価した。
１．４８時間後に採取した新鮮なローヤルゼリー原乳に濃度依存的なＣＲＥ依存的転写促進活性が認められた。
２．海馬神経細胞培養系においてローヤルゼリー原乳にＣＲＥ依存的転写促進活性を認めた。
３．１００μｇ／ｍｌのローヤルゼリー原乳のフラクション２及び３に、とりわけ、フラクション３において極めて強いＣＲＥ依存的転写促進活性が認められた。しかも、その転写促進効果は、３０μＭノビレチンよりも強力であり、コントロール群の７倍であった。
４．ローヤルゼリーのフリーズドライ粉末に原乳のフラクションを添加すると、転写活性は増大した。
５．ローヤルゼリー原乳及びフラクション３は、Ａβオリゴマーの抑制作用を抑制した。
　成体マウス中脳（黒質・腹側被蓋野）ドパミン神経におけるローヤルゼリー原乳とフラクション３によるドパミン合成律速酵素であるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）及びリン酸化コフィリンの発現レベルを検討した。８ｍｇ／ｋｇのローヤルゼリーの第３画分又は０．５ｇ／ｋｇのローヤルゼリー原乳を１週間経口投与後、還流固定し薄切切片を作成し、中脳組織を染色した。リン酸化コフィリンレベル及びチロシン水酸化酵素の発現増大が認められた（図９）。
　Ａβオリゴマー分解酵素（ネプリライシン）を発現する海馬神経細胞とネプリライシンの働きを増強する因子（ソマトスタチン）を発現する海馬神経細胞において、ローヤルゼリー原乳及びそのフラクションはネプリライシンとソマトスタチンの発現を増強した。したがって、ローヤルゼリーは、海馬のＡβオリゴマーの分解システムを回復・強化することができる。
　ローヤルゼリー原乳は、ソマトスタチン受容体依存的にネプリライシンｍＲＮＡレベルを上昇させた。ソマトスタチン－ネプリライシン系の活性評価系として海馬神経培養系を用いた。非選択的ソマトスタチン受容体遮断薬であるシクロソマトスタチン（cyclosomatostatin、ＣＳ）はＲＪによるネプリライシンｍＲＮＡの発現増強を抑制した（図１０）。
　ローヤルゼリー原乳フラクション３は、ネプリライシン、その活性増強因子であるソマトスタチン、ＮＧＦ、及びＢＤＮＦのｍＲＮＡレベルを上昇させた（図１１）。
　ローヤルゼリー原乳及びフラクション３の作用について、インビボで検討した。８ｍｇ／ｋｇのローヤルゼリーフラクション３又は０．５ｇ／ｋｇのローヤルゼリー原乳を１週間経口投与後、還流固定し、薄切切片を作製し、海馬組織染色を行った。その結果、ソマトスタチンの免疫反応及び陽性反応の増加が認められた（図１２、１３、１４）。
　老齢のマウス海馬におけるネプリライシン及びその増強因子であるソマトスタチンの発現に対するローヤルゼリー原乳の影響を免疫組織化学的に解析した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（１７月齢、雄）に、ローヤルゼリー原乳（生理食塩液抽出物５００ｍｇ／ｋｇ）を７日間経口投与した。その結果、老齢マウス海馬においてローヤルゼリー原乳によるネプリライシン及びソマトスタチンの発現の増強が認められた（図１５、１６）。

Claims (3)

  1. 　ローヤルゼリーを水で溶出し残差を得ること、
    得られた残差を５０％エタノールで溶出し残差を得ること、次いで、
    得られた残差を９９．５％エタノールで溶出し溶出各分を得ること
    を含む、ローヤルゼリー分画の製造方法。
  2. 　ローヤルゼリーを含む、海馬のＡβオリゴマー分解システムを回復・強化するための組成物。
  3. 　ローヤルゼリーが、請求項１の方法によって得られたローヤルゼリー分画である、請求項２に記載の組成物。
PCT/JP2016/080718 2015-10-16 2016-10-17 ローヤルゼリー分画の製造方法 WO2017065314A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16855565.4A EP3363445B1 (en) 2015-10-16 2016-10-17 Method for producing royal jelly fraction ant its use for treating alzheimer's disease
JP2016575246A JP6117453B1 (ja) 2015-10-16 2016-10-17 ローヤルゼリー分画の製造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-204320 2015-10-16
JP2015204320 2015-10-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017065314A1 true WO2017065314A1 (ja) 2017-04-20

Family

ID=58518225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/080718 WO2017065314A1 (ja) 2015-10-16 2016-10-17 ローヤルゼリー分画の製造方法

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3363445B1 (ja)
JP (1) JP6117453B1 (ja)
WO (1) WO2017065314A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008228727A (ja) * 2007-02-23 2008-10-02 Akitaya Honten:Kk ローヤルゼリー分解酵素含有物
JP2009029772A (ja) * 2007-07-05 2009-02-12 Api Co Ltd 酵素処理ローヤルゼリー、並びにそれを含有する抗酸化剤、保湿剤、皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤、血圧降下剤、疲労回復剤、及びカルシウム吸収促進剤
WO2009154197A1 (ja) * 2008-06-17 2009-12-23 ジャパンローヤルゼリー株式会社 認知障害改善剤
CN102260728A (zh) * 2011-07-05 2011-11-30 北京师范大学 一种蜂王浆多肽及其用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100023910A (ko) * 2007-06-04 2010-03-04 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조 신규한 로열 젤리 분획물과 그의 제조 방법 및 용도
CN104415025B (zh) * 2013-09-09 2017-04-26 石家庄维奥化工有限公司 一种延缓退行性疾病进展的组合物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008228727A (ja) * 2007-02-23 2008-10-02 Akitaya Honten:Kk ローヤルゼリー分解酵素含有物
JP2009029772A (ja) * 2007-07-05 2009-02-12 Api Co Ltd 酵素処理ローヤルゼリー、並びにそれを含有する抗酸化剤、保湿剤、皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤、血圧降下剤、疲労回復剤、及びカルシウム吸収促進剤
WO2009154197A1 (ja) * 2008-06-17 2009-12-23 ジャパンローヤルゼリー株式会社 認知障害改善剤
CN102260728A (zh) * 2011-07-05 2011-11-30 北京师范大学 一种蜂王浆多肽及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3363445A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2017065314A1 (ja) 2017-10-12
EP3363445A4 (en) 2019-06-05
EP3363445A1 (en) 2018-08-22
JP6117453B1 (ja) 2017-04-19
EP3363445B1 (en) 2020-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5300167B2 (ja) 気分障害治療用組成物
US20130261136A1 (en) Coffee extracts as ingredients of foods, drugs, cosmetics, dietary supplements, and biologics
JP2019529333A (ja) 脳活動を増強するための組成物
KR20160147132A (ko) 오미자 잎 추출물을 함유하는 파킨슨 질환 또는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물
JP2007015958A (ja) 神経成長因子産生促進剤
JP7229513B2 (ja) 脳の機能改善剤および脳の機能改善用飲食品
JP6117453B1 (ja) ローヤルゼリー分画の製造方法
EP3305311A1 (en) Brain function-protecting agent
WO2020004357A1 (ja) アルツハイマー病の治療、予防又は改善用組成物、脳神経細胞死の抑制用組成物、アミロイドβペプチドで誘導されるミクログリアの活性化の抑制用組成物、及び、アミロイドβペプチドで誘導されるＰＧＥ２、ＴＮＦ－α又はＩＬ－１β産生の抑制用組成物
EP3632454A1 (en) Composition containing poria cocos bark extract for preventing, improving or treating neurodegenerative disorders
KR101806068B1 (ko) 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 항치매용 조성물
KR101290749B1 (ko) 더덕 추출물을 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 예방 또는 개선용 조성물
KR102634982B1 (ko) 오스모틴 단백질을 유효성분으로 함유하는 파킨슨병의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20180137971A (ko) 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 및 치료용 조성물
KR20050092292A (ko) 기억력 증강 효과가 있는 생약재 조성물
US20210228521A1 (en) Autophagy activating agent
JP5779796B2 (ja) 脳機能改善剤及び脳機能改善用飲食品
KR20070091928A (ko) 승마 추출물을 함유하는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용조성물
KR101835227B1 (ko) 서목태 추출물을 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 조성물
JP2009256282A (ja) 抗ａｌｓ剤
JP2009256283A (ja) 抗ａｌｓ剤
KR102588274B1 (ko) D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
CN111615392A (zh) 自闭症谱系障碍和精神疾病改善剂
KR20120055159A (ko) 감국 추출물을 포함하는 불면 증상의 예방 및 개선용 조성물과 그의 제조방법
KR20230108751A (ko) 푸코잔틴를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016575246

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16855565

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2016855565

Country of ref document: EP