WO2017013731A1 - 精製ウイルス液の製造方法、ウイルス検出方法及びウイルス精製部材 - Google Patents

精製ウイルス液の製造方法、ウイルス検出方法及びウイルス精製部材 Download PDF

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WO2017013731A1
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WO
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humic acid
acid
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PCT/JP2015/070663
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平橋　智裕
大英 中熊
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Dic株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a purified virus solution, a virus detection method, and a virus purification member.
  • a method of concentrating a sample used for virus detection by ultracentrifugation or polyethylene glycol method is known.
  • Patent Document 1 reports a method of capturing a virus through a solution containing the virus in a surface-treated hollow fiber and evaluating the concentration of the virus. In that case, ultrafiltration is performed as necessary. In some cases, secondary concentration is performed on a membrane.
  • the virus concentration method as described above has a problem that humic acid, which is a substance that inhibits the NAT method present in the environment, is also recovered at the same time.
  • Humic acid is a kind of humic substance that exists in the environment, and it is a high-molecular organic material that is chemically and biologically synthesized from the degradation products of plant residues, microorganisms, and plankton deceased by microorganisms. It is a mixture of acids. Humic substances, also called humic substances, are soluble in alkaline solutions, but there are humic acids that form precipitates in acidic solutions, fulvic acids that are soluble at any pH, and humic substances (or humic substances) that are insoluble in alkalis. Since humic substances are derived from animals and plants, they exist in every place in the environment, such as soil, seawater, river lakes, drainage, and waste.
  • humic substances are amorphous polymer substances because they are derived from animals and plants, but many have a three-dimensional network structure having many aromatic rings.
  • humic acid is often a polyphenol type carboxylic acid having at least one acidic group such as a hydroxyl group or a carboxyl group, and has a chelating property of metals due to its structure, and is used industrially as a chelating agent. It is done.
  • Patent Document 2 reports a method for improving the virus detection rate by adsorbing impurities such as humic acid on silica gel having specific pores.
  • impurities such as humic acid
  • Silica gel having specific pores since it is nonspecific adsorption depending on the size of the pores, there is a problem that it is insufficient for quantitative measurement.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a purified virus solution capable of specifically recovering and purifying only virus while trapping humic acid as a contaminant, and a virus purification member capable of purifying the virus. Is an issue.
  • Another object of the present invention is to provide a virus detection method using the purified virus solution obtained by the method for producing the purified virus solution.
  • Production of a purified virus solution comprising a step of bringing a sample solution containing virus and humic acid into contact with a substrate having a functional group A having a pKa of a conjugate acid of 8.0 to 9.9 on the surface A method for producing, wherein the functional group A is a single functional group; (2) The production method according to (1), further comprising a step of bringing the base material brought into contact with the sample solution into contact with a recovered solution having a pH of 10 to 12; (3) The production method according to (1) or (2), wherein the substrate is a hollow fiber membrane; (4) The production method according to any one of (1) to (3), wherein the functional group A is an amino group; (5) The production method according to any one of (1) to (4), wherein the pH of the sample solution is 3.0 to 9.0; (6) A step of bringing a sample solution containing virus and humic acid into contact with a substrate having a functional group A having a conjugate acid pKa of 8.0 to 9.9 on the surface, and a recovery
  • the method for producing a purified virus solution of the present invention is capable of specifically recovering and concentrating only virus without concentrating humic acid, which is a contaminant, so that it contains a highly sensitive and quantitative virus containing virus. It is possible to provide a test solution.
  • the base material having the functional group A of the present invention can adsorb virus and humic acid in the sample liquid.
  • the pKa of the conjugate acid of the functional group A is 8.0 to 9.9 and it is a single functional group
  • the recovered solution is brought into contact with the substrate, only the virus remains adsorbed with humic acid. Therefore, it is possible to obtain a purified virus solution from which humic acid has been removed (that is, a virus solution in which only the virus is specifically concentrated with little or no concentration of humic acid). Since the humic acid is selectively removed from the purified virus solution obtained, the subsequent virus detection step can be carried out accurately and quantitatively.
  • a sample solution containing virus and humic acid is obtained by turbidity of a sample containing virus in water.
  • a sample containing virus in water For example, if it is a liquid sample such as environmental water or water for daily use, it may be diluted with sterilized water. If so, a supernatant turbid with sterilized water, a washing solution obtained by washing the solid sample surface with sterilized water, or the like can be used as the sample solution.
  • the virus applicable to this embodiment is not particularly limited, and is a double-stranded DNA virus, a single-stranded DNA virus, a double-stranded RNA virus, a single-stranded RNA virus, a single-stranded RNA reverse transcription virus, or a double-stranded virus.
  • Examples include DNA reverse transcription viruses.
  • Examples of the double-stranded DNA virus include adenovirus and podovirus.
  • Examples of the single-stranded DNA virus include parvovirus.
  • RNA virus examples include rotavirus and reovirus.
  • RNA virus examples include single-stranded RNA viruses acting as mRNA of enterovirus, hepatitis A virus (HAV), hepatitis C virus (HCV) norovirus, feline calicivirus, etc .; measles virus, rabies virus, Marburg Examples thereof include single-stranded RNA viruses that act as complementary strands of mRNA such as viruses, Ebola viruses, and influenza viruses.
  • HAV hepatitis A virus
  • HCV hepatitis C virus
  • feline calicivirus etc .
  • measles virus rabies virus
  • Marburg examples thereof include single-stranded RNA viruses that act as complementary strands of mRNA such as viruses, Ebola viruses, and influenza viruses.
  • RNA reverse transcription virus examples include human immunodeficiency virus and foamy virus.
  • Examples of the double-stranded DNA reverse transcription virus include hepatitis B virus.
  • viruses that can be applied to the present form are adenoviruses, polyomaviruses, hepatitis A viruses (HAV), noroviruses, enteroviruses, polioviruses, hepatitis E viruses that exist in water and can infect humans ( HEV), rotavirus, Aichi virus, parecovirus and reovirus, preferably norovirus, HAV, HEV, enterovirus and rotavirus.
  • the above viruses may be applied alone or in combination of two or more.
  • the humic acid that can be contained in the sample liquid of the present embodiment is not particularly limited, and is known, for example, humic acid that may exist in nature, humic acid that differs from humic acid in nature at least in part in chemical structure. Derivatives and the like. These humic acids may be contained alone in the sample solution, or two or more kinds may be mixed and contained.
  • Humic acid has a complicated structure as described above, but humic acid can be detected and evaluated by measuring absorbance.
  • the pH of the sample solution is preferably 3.0 to 9.0, and more preferably 8.0 to 9.9. It is preferable that the pH of the sample solution is in the above range because the charge balance between the virus and humic acid becomes suitable.
  • the pH may be adjusted by a known and commonly used method, and may be adjusted with various acid bases or with an inorganic salt buffer. When the sample has a desired pH, it can be used as it is without adjustment.
  • the method for producing a purified virus solution comprises a step of bringing a sample solution containing a virus and humic acid into contact with a substrate having a functional group A having a pKa of a conjugate acid of 8.0 to 9.9 on the surface.
  • the functional group A is a single functional group.
  • the substrate having the functional group A having a pKa of the conjugate acid of the present invention of 8.0 to 9.9 on the surface may be any substrate having the functional group A on the surface. Having the functional group A on the surface means that the substrate itself may have a functional group, a compound having the functional group A may be immobilized on the surface of the substrate, or a compound having the functional group A. It can also be obtained by applying to the substrate surface.
  • the material of the base material is not particularly limited, but is preferably a hydrophobic material, specifically, an olefin resin, a styrene resin, an acrylic resin, a sulfone resin, a polyimide resin, a urethane resin, an ester resin.
  • a hydrophobic material specifically, an olefin resin, a styrene resin, an acrylic resin, a sulfone resin, a polyimide resin, a urethane resin, an ester resin.
  • examples thereof include resins, ether resins, and cellulose blended esters.
  • the olefin resin examples include polyethylene (for example, low density polyethylene, linear low density polyethylene, ultra-low density polyethylene, medium density polyethylene, high density polyethylene, etc.), polypropylene, polybutene, polybutylene, polybutadiene, ethylene- Examples include ethylene such as a propylene copolymer (random copolymer) and / or a copolymer of propylene and another ⁇ -olefin (particularly a random copolymer).
  • polyethylene for example, low density polyethylene, linear low density polyethylene, ultra-low density polyethylene, medium density polyethylene, high density polyethylene, etc.
  • polypropylene polybutene
  • polybutylene polybutadiene
  • ethylene- Examples include ethylene such as a propylene copolymer (random copolymer) and / or a copolymer of propylene and another ⁇ -olefin (particularly a random copolymer).
  • styrenic resin examples include high impact polystyrene (HIPS), methyl methacrylate / butadiene / styrene copolymer, styrene / maleic anhydride copolymer, styrene / acrylonitrile copolymer, in addition to a single polymer of styrene. .
  • HIPS high impact polystyrene
  • methyl methacrylate / butadiene / styrene copolymer examples include methyl methacrylate / butadiene / styrene copolymer, styrene / maleic anhydride copolymer, styrene / acrylonitrile copolymer, in addition to a single polymer of styrene. .
  • acrylic resins include (meth) acrylic monomers ((meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid C1-18 alkyl ester, hydroxyalkyl (meth) acrylate, glycidyl (meth) acrylate, (meth) Acrylonitrile, etc.) or copolymers, for example, poly (meth) acrylic acid esters such as poly (meth) methyl acrylate, methyl methacrylate- (meth) acrylic acid copolymer, methyl methacrylate-acrylic acid ester- (Meth) acrylic acid copolymer, methyl methacrylate- (meth) acrylic acid ester copolymer, (meth) acrylic acid ester-styrene copolymer (MS resin, etc.) and the like.
  • poly (meth) acrylic acid esters such as poly (meth) methyl acrylate, methyl methacrylate- (meth) acrylic acid copolymer, methyl methacrylate-acrylic acid ester- (Meth
  • sulfone resins examples include polysulfone resins, polyether sulfone resins, and polyaryl sulfone resins.
  • polyimide resin examples include polyetherimide resin, polyamideimide resin, and polybenzimidazole resin.
  • urethane resins examples include diisocyanates (aliphatic diisocyanates such as hexamethylene diisocyanate, alicyclic diisocyanates such as 1,4-cyclohexane diisocyanate and isophorone diisocyanate, tolylene diisocyanate, diphenylmethane-4,4'-diisocyanate.
  • diisocyanates aliphatic diisocyanates such as hexamethylene diisocyanate, alicyclic diisocyanates such as 1,4-cyclohexane diisocyanate and isophorone diisocyanate, tolylene diisocyanate, diphenylmethane-4,4'-diisocyanate.
  • Aromatic diisocyanates such as 1,5-naphthalene diisocyanate or hydrogenated diisocyanates thereof, araliphatic diisocyanates such as xylylene diisocyanate or hydrogenated diisocyanates thereof, and polyols (for example, polyester polyol, polytetra Polyether polyol such as methylene ether glycol, polycarbonate polyol, etc.) and, if necessary, obtained by reaction with a chain extender Such as that polyurethane-based resin and the like.
  • polyols for example, polyester polyol, polytetra Polyether polyol such as methylene ether glycol, polycarbonate polyol, etc.
  • ester resins include aromatic polyesters such as polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, and polyethylene naphthalate, and polyesters obtained by condensation of diols and dicarboxylic acids used in coating resins and the like.
  • ether resins examples include poly (thio) ether resins, such as polyoxyalkylene resins (stabilized polyoxymethylene glycol or homo- or copolyacetal resins, polyoxypropylene glycol, polyoxytetramethylene glycol, etc. Polyoxy C1-4 alkylene diols), polyphenylene ether resins, polyphenylene ether ketone resins, polysulfide resins (polythioether resins such as polyphenylene sulfide or copolymers thereof), polyether ketone resins (polyether ether ketone resins) Resin).
  • polyoxyalkylene resins stabilized polyoxymethylene glycol or homo- or copolyacetal resins, polyoxypropylene glycol, polyoxytetramethylene glycol, etc. Polyoxy C1-4 alkylene diols
  • polyphenylene ether resins polyphenylene ether ketone resins
  • polysulfide resins polythioether resins such as polyphen
  • the functional group A in the present invention has a pKa of a conjugate acid of 8.0 to 9.9, preferably 8.5 to 9.9, more preferably 9.0 to 9.5, and is on the surface of the substrate.
  • functional group A is a single functional group.
  • the functional group A is a single functional group
  • the functional group A (functional group having a pKa of 8.0 to 9.9) existing on the surface of the substrate is a single one. Means that it consists of At this time, the functional group A may be present directly on the substrate or may be present via another element (for example, an intervening group).
  • the functional group A is a single functional group for polyethyleneimine and the like in which a plurality of types of functional groups A exist.
  • Whether or not the functional group A is single can be determined by measuring the number of inflection points of the titration curve obtained when the substrate containing the functional group A is titrated with an acid.
  • the value of “pKa of the conjugate acid of the functional group A” is a calculated value calculated from the titration value when the base material containing the functional group A is titrated with an acid, according to the Henderson Hasselbalch equation. Shall be adopted. That is, since the “pKa of the conjugate acid of the functional group A” is calculated in a form introduced into the base material, for example, when the functional group A is “—CH 2 NH 2 ”, It may be different from the pKa value of the conjugate acid of the corresponding amine “CH 3 NH 2 ”.
  • the “functional group A” means a minimum group having a pKa of 8.0 to 9.9 and satisfying the pKa.
  • the functional group A includes “—CH 2 NHCH 2 CH 2 OH”, “—NHCH 2 CH 2 OH”, “ Five groups of —CH 2 CH 2 OH ”,“ —CH 2 OH ”and“ —OH ”are conceivable.
  • the pKa of the conjugate acid of “—CH 2 CH 2 OH”, “—CH 2 OH”, and “—OH” is less than 8.0, these groups are not the functional group A.
  • amino groups include primary amino groups such as 1-hydroxy-2-aminoethyl group; secondary amino groups such as 1-hydroxy-2- (N-methylamino) ethyl group; 1-hydroxy-2- (N , N-dimethylamino) ethyl group, N, N-dimethylaminoethoxycarbonyl group, tertiary amino group such as N, N-diethylaminoethoxycarbonyl group and the like.
  • conjugated acid refers to AH + in the following formula.
  • the virus and humic acid are adsorbed on the functional group A. This is probably because the functional group A having a pKa of the conjugate acid of 8.0 to 9.9 is positive, and the virus and humic acid are negative, so that electrical coupling occurs. .
  • a compound having an amino group may be applied to the substrate surface.
  • examples of the compound having an amino group that can be used include amino group-containing silane coupling agents such as N- ⁇ (aminoethyl) ⁇ -aminopropyltrimethoxysilane, and various known resins having an amino group.
  • a compound having a functional group A may be bonded to the surface of the substrate. For example, there is a method of reacting ammonia or diethylamine via an epoxy group included on the surface of the substrate.
  • the substrate that has been brought into contact with the sample solution can obtain a purified virus solution, for example, by bringing a recovered solution having a pH of 10 to 12 into contact therewith. That is, in one embodiment, the method for producing a purified virus solution according to the present invention further comprises a step of bringing the substrate that has been brought into contact with the sample solution into contact with a recovered solution having a pH of 10 to 12.
  • a recovery solution having a pH of 10 to 12 When contacted with a recovery solution having a pH of 10 to 12, the field becomes alkaline, so that the charge of the functional group A becomes neutral, the electrical bond between the virus and the functional group A is released, and the virus is detached. Conceivable.
  • humic acid is not detached from the base material, a purified virus solution can be obtained. This is probably because the hydrophobic structure of humic acid is adsorbed by interacting with the substrate.
  • a recovery solution When the virus is released by contacting with humic acid, even humic acid can be easily eluted, and humic acid can be mixed into the purified virus solution. The reason for this is not clear, but due to the binding of multiple functional groups to the virus, it is difficult for the virus to be detached even if it is brought into contact with the recovery solution, and if it is not contacted with a higher alkaline recovery solution, the virus is detached. This is probably because humic acid is also desorbed and eluted at the same time.
  • the shape of the substrate of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a porous membrane shape, a hollow fiber shape, a flat membrane shape, and a bead shape, but a hollow fiber shape is preferable from the viewpoint of contact efficiency with the sample liquid, A hollow fiber shape made of a porous membrane is particularly preferred.
  • the base material of the present invention When bringing the base material of the present invention into contact with the sample liquid, various methods can be used. In the case of a batch type, the base material and the sample solution can be brought into contact with each other by placing them in a beaker, a test tube, a microtube, a chip, or the like and stirring. When stirring, a stirring blade or a stirring bar may be used, or stirring may be performed with a vibration mixer or the like.
  • the base material may be packed in a column or tube, and the sample solution may be passed through, or the base material may be fixed on a carrier and then passed through.
  • a purified virus liquid can be obtained by recovering the recovered liquid from which the virus has been eluted.
  • the substrate and the recovered solution may be separated.
  • a known and commonly used method may be used as the separation method, and methods such as filtration, decantation, and centrifugation may be used, or only the liquid may be collected using a syringe or the like.
  • the obtained purified virus solution can be subjected to a virus detection step.
  • the virus detection step is a step of detecting and identifying a virus.
  • a virus detection method a morphological identification method from an isolated culture has been used in the past, but a nucleic acid amplification test (NAT) method represented by a polymerase chain reaction method (PCR) or the like is now used.
  • NAT nucleic acid amplification test
  • PCR polymerase chain reaction method
  • the NAT method is advantageous in that it can detect a virus for which a culture method has not been established and can be detected in a short period of time because the number of days of culture is not required.
  • the virus When the virus concentration is low in the purified virus solution obtained in the recovery step, the virus may be concentrated by a known and conventional method. Specifically, positively charged membrane method or negatively charged membrane method, polyethylene glycol precipitation method, cellulose Examples include an agglomeration method and an ultrafiltration method.
  • the purified virus solution obtained in the present invention can be detected with high sensitivity because humic acid that inhibits the NAT method is removed or almost separated.
  • the purified virus solution is subjected to the NAT method, it is preferable to perform a pretreatment for extracting nucleic acids from the virus.
  • Extraction of viral nucleic acid is not particularly limited, and a phenol / chloroform extraction method, an extraction method using a surfactant or a protease in combination, or the like is used.
  • viral nucleic acid purification can also be performed by a liquid phase extraction method, an ethanol precipitation method, a spin column method, or the like.
  • the extracted nucleic acid is examined by the NAT method.
  • the NAT method is a general term for a method of artificially amplifying a minute amount of a gene such as a virus and detecting it with high sensitivity.
  • transcription-mediated amplification ( TMA) method strand displacement reaction (LAMP) method
  • isothermal gene amplification (ICAN) method strand displacement reaction (ICAN) method
  • nucleic acid sequence amplification (NASBA) method ligase chain reaction (LCR) method and the like.
  • nucleic acid amplification is performed using primers specific to the virus, and if amplification is observed, it is found that the virus is present.
  • Reference Example 1 Base Material Preparation Example A high-density polyethylene (HIZEX 2200J, manufactured by Mitsui Petrochemical Co., Ltd.) having a density of 0.968 g / cm 3 and a melt index of 5.5 is used. Using a spinneret for hollow fiber shaping having a diameter of 5 mm and a discharge cross-sectional area of 1.06 cm 2 , spinning was performed at a spinning temperature of 160 ° C. and wound around a bobbin with a spinning draft 1890. The obtained unstretched hollow fiber had an inner diameter of 324 ⁇ m and a film thickness of 48 ⁇ m.
  • HIZEX 2200J manufactured by Mitsui Petrochemical Co., Ltd.
  • the unstretched hollow fiber was heat-treated at 115 ° C. for 24 hours at a constant length. Subsequently, the film was stretched 1.8 times at a deformation rate of 7500% / min at room temperature, and then heated in a heating furnace at 100 ° C. until the total stretching ratio was 3.8 times so that the deformation rate was 220% / min. The stretched yarn was further subjected to thermal shrinkage in a heating furnace at 125 ° C. until the total draw ratio became 2.3 times to obtain a drawn yarn.
  • the resulting porous hollow fiber membrane had an inner diameter of 294 ⁇ m and a film thickness of 40 ⁇ m.
  • Example 1 1) The hollow fiber obtained in Reference Example 1 was added to a 2.5 wt% ethanol / water mixed solution (50 ° C.) in an ethylene-vinyl alcohol copolymer (Nippon Synthetic Chemical Products, ethylene content 44 mol%, weight average molecular weight 90000). The film was immersed for 100 seconds and kept at 80 ° C. for 80 seconds under ethanol saturated steam at 50 ° C., and then the solvent was further dried for 80 seconds for hydrophilic treatment. The hollow fibers thus obtained (about 13 cm, about 150 fibers: 19.5 mg of immobilized resin) were immersed in a test tube containing 20 mL of acetone, 16 mL of epichlorohydrin, and 4 mL of 40% NaOH aqueous solution. . The reaction was carried out at 30 to 40 ° C. for 5 hours while applying ultrasonic waves, and after completion of the reaction, the reaction product was washed with acetone and water and vacuum dried to obtain a hollow fiber having an epoxy group introduced therein.
  • the hollow fiber introduced with the epoxy group prepared above was immersed in a 20% ethanolamine aqueous solution and reacted at 40 ° C. for 15 hours. After completion of the reaction, the reaction product was washed with water to obtain a hollow fiber having an amino group (conjugated acid pKa8.9) introduced therein.
  • the amount of the functional group was measured by titrating the hollow fiber, the amount of the functional group introduced was 0.040 ⁇ mol / cm 2 (inner surface area).
  • humic acid was quantified by measuring absorbance at 260 nm.
  • phage RNA was extracted from each fraction using QIAGEN MinElute Virus Spin kit (Qiagen Co., Ltd.), and the amount of RNA was quantified by a real-time RT-PCR method. Primer and probe sequences used for the measurement were prepared according to the literature (Journal of Virological Methods 149 (2008), p123-128), and the measurement was performed using a StepOnePlus real-time PCR system (Life Technologies Japan, Inc.).
  • the amount of phage and humic acid contained in the non-adsorbed fraction with respect to the mixed solution of phage and humic acid before the substrate contact treatment (hereinafter referred to as untreated) Were 8% and 4%, respectively. Therefore, it was found that the adsorption rate to the base material in the module was 92% for phage and 96% for humic acid, respectively.
  • the recovery rate of the phage and humic acid in the eluted fraction with respect to the untreated phage / humic acid mixed solution was 64 respectively. %, 46%.
  • the phage recovery rate (humic acid recovery rate / phage recovery rate) relative to the humic acid recovery rate obtained above was calculated as a recovery rate ratio, and was 0.72.
  • the recovery ratio means that the smaller the value, the more humic acid could be separated.
  • Example 2 A hollow fiber introduced with an epoxy group produced in the same manner as in Example 1 was immersed in 28% aqueous ammonia and reacted at 20 ° C. for 15 hours. After completion of the reaction, the reaction product was washed with water to obtain a hollow fiber having an amino group (conjugated acid pKa 9.5) introduced therein. When the amount of the functional group was measured by titrating the hollow fiber, the amount of the functional group introduced was 0.022 ⁇ mol / cm 2 (inner surface area).
  • a module for a small amount of sample was prepared in the same manner as in Example 1, and 1 mL of phage / humic acid mixed solution was adsorbed, and recovery evaluation was performed with 1 mL of 1 mmol / L NaOH (pH: 11).
  • the adsorption rates of phage and humic acid in the non-adsorbed fraction with respect to the untreated phage / humic acid mixed solution were 95% and 100%, respectively.
  • the recovery rates of phage and humic acid in the eluted fraction were 69% and 32%, respectively. Therefore, the recovery rate ratio is 0.46.
  • Example 3 A hollow fiber introduced with an epoxy group prepared in the same manner as in Example 1 was immersed in a 20% diethylamine aqueous solution and reacted at 40 ° C. for 15 hours. After completion of the reaction, the reaction product was washed with water to obtain a hollow fiber having an amino group (conjugated acid pKa 9.9) introduced therein. When the amount of the functional group was measured by titrating the hollow fiber, the amount of the functional group introduced was 0.025 ⁇ mol / cm 2 (inner surface area).
  • a module for a small amount of sample was prepared in the same manner as in Example 1, and the collection and evaluation by adsorption of 1 mL of the phage / humic acid mixed solution and 1 mL of 10 mmol / L NaOH (pH: 12) were performed.
  • the adsorption rates of phage and humic acid in the non-adsorbed fraction with respect to the untreated phage / humic acid mixture were 96% and 100%, respectively.
  • the recovery rates of phage and humic acid in the eluted fraction were 63% and 46%, respectively. Therefore, the recovery rate ratio is 0.73.
  • Example 1 A hollow fiber introduced with an epoxy group prepared in the same manner as in Example 1 was immersed in a 5% polyallylamine aqueous solution and reacted at 40 ° C. for 15 hours. After completion of the reaction, the reaction product was washed with water to obtain a hollow fiber having an amino group (conjugated acid pKa10.6) introduced therein. When the amount of the functional group was measured by titrating the hollow fiber, the amount of the functional group introduced was 0.015 ⁇ mol / cm 2 (inner surface area).
  • a module for a small amount of sample was prepared in the same manner as in Example 1, and 1 mL of phage / humic acid mixed solution was adsorbed, and recovery evaluation was performed with 1 mL of 1 mmol / L NaOH (pH: 11). Since the amount of phage and humic acid in the non-adsorbed fraction with respect to the untreated phage / humic acid mixture was 0%, the adsorption rates of phage and humic acid were calculated to be 100% and 100%, respectively. In addition, after passing through the phage / humic acid mixture, elution was performed with the recovery solution. With respect to the untreated phage / humic acid mixture, the phage and humic acid in the eluted fraction were hardly recovered. The recovery rate was 0%. For this reason, the recovery ratio could not be calculated.
  • Example 2 A hollow fiber introduced with an epoxy group prepared in the same manner as in Example 1 was immersed in a 5% poly- ⁇ -lysine aqueous solution and reacted at 40 ° C. for 15 hours. After completion of the reaction, the reaction product was washed with water to obtain a hollow fiber into which an amino group (conjugated acid pKa 7.6) was introduced. When the amount of the functional group was measured by titrating the hollow fiber, the amount of the functional group introduced was 0.042 ⁇ mol / cm 2 (inner surface area).
  • a module for a small amount of sample was prepared in the same manner as in Example 1, and 1 mL of phage / humic acid mixed solution was adsorbed, and recovery evaluation was performed with 1 mL of 1 mmol / L NaOH (pH: 11).
  • the adsorption rates of phage and humic acid in the non-adsorbed fraction with respect to the untreated phage / humic acid mixture were 100% and 87%, respectively.
  • the recovery rates of phage and humic acid in the eluted fraction were 71% and 65%, respectively. Therefore, the recovery ratio is 0.92.
  • Example 3 A hollow fiber introduced with an epoxy group produced in the same manner as in Example 1 was immersed in an aqueous solution of 5% polyethyleneimine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., average molecular weight 600) and reacted at 40 ° C. for 15 hours. After completion of the reaction, the reaction product was washed with water to obtain a hollow fiber into which an amino group (conjugated acid pKa 8.8; average value) was introduced. When the amount of the functional group was measured by titrating the hollow fiber, the amount of the functional group introduced was 0.021 ⁇ mol / cm 2 (inner surface area).
  • a module for a small amount of sample was prepared in the same manner as in Example 1, and the collection and evaluation with 1 mL of phage / humic acid mixed solution and 1 mL of 10 mmol / L NaOH (pH: 11) were performed.
  • the adsorption rates of phage and humic acid in the non-adsorbed fraction with respect to the untreated phage / humic acid mixture were 100% and 97%, respectively.
  • the recovery rates of phage and humic acid in the eluted fraction were 70% and 68%, respectively. Therefore, the recovery ratio is 0.97.
  • the recovery rate ratio is particularly small, and phages can be selectively separated.
  • the resulting solution is a purified virus in which only the virus is suitably concentrated. It can be said that it is a liquid.
  • the method for producing a purified virus solution of the present invention can be suitably used for a virus inspection method.

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Abstract

夾雑物であるフミン酸はトラップしたまま、ウイルスのみを特異的に回収し精製することができる精製ウイルス液の製造方法、及び該ウイルス精製を行えるウイルス精製部材を提供することを課題とする。　ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程を有する、精製ウイルス液の製造方法であって、上記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする、製造方法。

Description

精製ウイルス液の製造方法、ウイルス検出方法及びウイルス精製部材
　本発明は、精製ウイルス液の製造方法、ウイルス検出方法及びウイルス精製部材に関する。
　安全志向が高まる近年、河川水や海水といった環境水、水道水や井戸水等の生活用水、土壌や食品等、我々を取り巻く環境に対する安全性の担保が非常に重要視されている。特に環境水や生活水が各種ウイルスによって汚染されると、近隣住民へと爆発的に感染し、甚大な健康被害を生じる恐れがあり、とくに開発途上地域における生活用水のウイルス汚染は大きな問題となっている。
　これらを鑑み、環境中のウイルス汚染を恒常的に監視することは、人々の安全安心を維持していく上で非常に重要であり、そのためには簡便で正確にウイルス量を評価する方法を確立することが急務である。
　しかし、様々な環境、特に環境水中のウイルス量はごく少量であるため、検出することが非常に難しいということが課題となっている。そこで、ウイルスを濃縮回収したうえで、ウイルスを検出する方法が試みられてきた。
　例えば、ウイルス検出に用いる試料を、超遠心やポリエチレングリコール法などによって濃縮する方法などが知られている。
　また、特許文献１においては、表面処理された中空糸にウイルスを含む液を通じてウイルスを捕捉し、ウイルスの濃度を評価する方法が報告されており、その際には、必要に応じて限外ろ過膜で２次濃縮を行う場合もある。
　上記のような方法でウイルスを濃縮回収し、得られたウイルス液を、各種方法で検出、同定を行う。一般的によく行われるのが、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等に代表される核酸増幅検査（ＮＡＴ）法である。ＮＡＴ法は、ウイルスに含まれる核酸を人工的に増幅して高感度に検出する方法であり、ウイルスに特異なプライマーによって検出を行う場合や、遺伝子を増幅させた後にハイブリダイゼーション等で同定を行う。
　しかし、上記のようなウイルス濃縮方法では、環境中に存在するＮＡＴ法を阻害する物質であるフミン酸も同時に回収してしまうという問題があった。
　フミン酸とは、環境中に存在する腐植物質の一種であり、植物残差や微生物、プランクトンの遺骸が微生物による分解を受け、その分解生成物から化学的、生物的に合成された高分子有機酸の混合物である。腐植物質はフミン質とも呼ばれ、アルカリ溶液に可溶だが、酸性溶液では沈殿を形成するフミン酸、どのｐＨでも可溶なフルボ酸、及びアルカリに不溶なヒューミン（またはフムス質）が存在する。フミン質は、動植物由来物質であることから、土壌・海水・河川湖沼水や排水・廃棄物等、環境中のあらゆる場所に存在する。フミン質は、動植物由来であることから不定形の高分子物質であるが、芳香環族を多数有する三次元網目状構造をもつものが多い。その中でもフミン酸は、水酸基やカルボキシル基と言った酸性基を一つ以上有するポリフェノール型カルボン酸であることが多く、その構造から金属類のキレート性を有し、工業的にはキレート剤として用いられる。
　一方、ウイルスの回収及び同定を行う際にＮＡＴ法を用いる場合、このフミン酸が阻害物質として働くという問題点があった。フミン酸は上記のように様々な環境中に存在することから、環境中から得たサンプル中へのフミン酸のコンタミネーションは避けられず、環境中からウイルスを濃縮したとしてもフミン酸まで回収してしまうと、ＮＡＴ法での検出が行えなくなり、ウイルスが存在しているのにもかかわらず不検出と判断されてしまう為、環境安全に対する脅威となっている。
　上記問題を解決する為に、特許文献２においては、特定の細孔を持つシリカゲルにフミン酸等の夾雑物を吸着させることによる、ウイルス検出率の向上方法が報告されている。しかし、細孔の大きさに依存した非特異的な吸着であるため、定量的測定には不十分であるといった問題があった。
国際公開第２０１２／１４４５５４号 特開２０１１－１５５９１９号公報
　本発明の課題は、夾雑物であるフミン酸はトラップしたまま、ウイルスのみを特異的に回収し精製することができる精製ウイルス液の製造方法、及び該ウイルス精製を行えるウイルス精製部材を提供することを課題とする。また、該精製ウイルス液の製造方法によって得られる精製ウイルス液を用いたウイルス検出方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは鋭意検討の結果、所定の基材を適用することにより上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、上記課題は、以下の手段により達成される。
　（１）ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程を有する、精製ウイルス液の製造方法であって、上記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする、製造方法；
　（２）前記サンプル液と接触させた前記基材を、ｐＨ１０～１２の回収液に接触させる工程をさらに有する、（１）に記載の製造方法；
　（３）前記基材が中空糸膜である、（１）または（２）に記載の製造方法；
　（４）前記官能基Ａがアミノ基である、（１）～（３）のいずれかに記載の製造方法；
　（５）前記サンプル液のｐＨが３．０～９．０である、（１）～（４）のいずれかに記載の製造方法；
　（６）ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程と、ｐＨ１０～１２である回収液を基材と接触させる工程と、基材と接触後の回収液を回収して得られる精製ウイルス液をウイルス検出工程にかける工程とを有し、前記官能基Ａが、単一の官能基であることを特徴とする、ウイルス検出方法；
　（７）共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａを表面に有する基材を有し、前記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする、ウイルス精製部材。
　本発明の精製ウイルス液の製造方法は、夾雑物であるフミン酸を濃縮することなく、ウイルスのみを特異的に回収し濃縮することができることから、ウイルス検出方法に対し感度よく定量的なウイルス含有試験液を提供することが可能である。
　本発明は、ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程を有する精製ウイルス液の製造方法であって、上記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする。
　本発明の官能基Ａを有する基材は、サンプル液中のウイルス及びフミン酸を吸着することができる。この時、官能基Ａの共役酸のｐＫａが８．０～９．９であり、なおかつ単一の官能基である時、回収液を基材に接触させると、フミン酸を吸着したままウイルスのみを溶出できることから、フミン酸が除去された精製ウイルス液（すなわち、フミン酸は濃縮されることなく、またはほとんどなく、ウイルスのみを特異的に濃縮したウイルス液）を得ることができる。得られた精製ウイルス液はフミン酸が選択的に除去されているため、その後のウイルス検出工程を精度よく定量的に実施することができる。
〔ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液〕
　本発明におけるウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液とは、ウイルス及びフミン酸が含まれる水媒体の液体である。ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液は、ウイルスを含有すると思われるサンプルを水に混濁すればよく、ウイルスを含有するサンプルとは、河川水・湖沼水・海水・雨水といった環境水、井戸水・水道水・ボトルドウォーターといった飲料水や下水・排水・プール水・農業用水・工業用水・冷媒水といった産業用水に代表される生活用水；食品、土壌、動植物、血液等の体液など、様々なものをサンプルとして用いることができる。
　ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液は、ウイルスを含有するサンプルを水に混濁することによって得られ、例えば環境水や生活用水のような液体サンプルであれば滅菌水で希釈すればよく、固形サンプルであれば滅菌水で混濁した上清や、固形サンプル表面を滅菌水で洗浄した洗浄液等もサンプル液として用いることができる。
　本形態に適用可能なウイルスとしては、特に制限されず、２本鎖ＤＮＡウイルス、１本鎖ＤＮＡウイルス、２本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルス、２本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルス等が挙げられる。
　前記２本鎖ＤＮＡウイルスとしては、アデノウイルス、ポドウイルス等が挙げられる。
　前記１本鎖ＤＮＡウイルスとしては、パルボウイルス等が挙げられる。
　前記２本鎖ＲＮＡウイルスとしては、ロタウイルス、レオウイルス等が挙げられる。
　前記１本鎖ＲＮＡウイルスとしては、エンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ノロウイルス、ネコカリシウイルス等のｍＲＮＡとして作用する１本鎖ＲＮＡウイルス；麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス等のｍＲＮＡの相補鎖として作用する１本鎖ＲＮＡウイルスが挙げられる。
　前記１本鎖ＲＮＡ逆転写ウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス、泡沫状ウイルス等が挙げられる。
　前記２本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルスとしては、Ｂ型肝炎ウイルス等が挙げられる。
　これらのうち、本形態に適用されうるウイルスは、水中に存在し、ヒトに感染しうるアデノウイルス、ポリオーマウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ノロウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ロタウイルス、アイチウイルス、パレコウイルス、レオウイルスであることが好ましく、ノロウイルス、ＨＡＶ、ＨＥＶ、エンテロウイルス、ロタウイルスであることがより好ましい。
　上述のウイルスは単独で適用しても、２種以上が混合されて適用されてもよい。
　また、本形態のサンプル液に含有されうるフミン酸としては、特に制限されず、公知のもの、例えば、自然界に存在しうるフミン酸、自然界のフミン酸と化学構造の少なくとも一部が異なるフミン酸誘導体等が挙げられる。これらのフミン酸はサンプル液中に単独で含まれていても、２種以上が混合して含まれていてもよい。
　フミン酸は、上述のように複雑な構造を有しているが、吸光度の測定によりフミン酸の検出、評価を行うことができる。
　サンプル液のｐＨは、３．０～９．０であることが好ましく、８．０～９．９であることがより好ましい。サンプル液のｐＨが上記範囲にあると、ウイルス及びフミン酸の電荷バランスが好適になることから好ましい。ｐＨは公知慣用の方法で調整すればよく、各種酸塩基で調整してもよいし、無機塩のバッファーで調整してもかまわない。また、サンプルが、所望のｐＨである場合は、無調整でそのままサンプル液とすることができる。
〔ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程〕
　本形態に係る精製ウイルス液の製造方法は、ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液を、共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａを表面に有する基材と接触させる工程を有する。この際、前記官能基Ａは単一の官能基である。
　本発明の共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａを表面に有する基材とは、官能基Ａを表面に有する基材であればよい。官能基Ａを表面に有するとは、基材自体が官能基を有していてもよいし、基材表面に官能基Ａを有する化合物を固定化してもよいし、官能基Ａを有する化合物を基材表面に塗布することでも得ることができる。
　基材の材質は特に限定は無いが、好ましくは疎水性の材料であり、具体的にはオレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂、スルホン系樹脂、ポリイミド系樹脂、ウレタン系樹脂、エステル系樹脂、エーテル系樹脂、セルロース混紡エステルが挙げられる。
　オレフィン系樹脂としては、例えば、ポリエチレン（例えば、低密度ポリエチレン、直鎖状低密度ポリエチレン、超低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレンなど）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリブチレン、ポリブタジエンの他、エチレン－プロピレン共重合体（ランダム共重合体）等のエチレン及び／又はプロピレンと他のα－オレフィンとの共重合体（特にランダム共重合体）などが挙げられる。
　スチレン系樹脂としては、スチレンの単一重合体のほか、ハイインパクトポリスチレン（ＨＩＰＳ）、メチルメタクリレート・ブタジエン・スチレン共重合体、スチレン・無水マレイン酸共重合体、スチレン・アクリロニトリル共重合体などが挙げられる。
　アクリル系樹脂としては、（メタ）アクリル系単量体（（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸Ｃ１－１８アルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリロニトリルなど）の単独又は共重合体、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸メチルなどのポリ（メタ）アクリル酸エステル、メタクリル酸メチル－（メタ）アクリル酸共重合体、メタクリル酸メチル－アクリル酸エステル－（メタ）アクリル酸共重合体、メタクリル酸メチル－（メタ）アクリル酸エステル共重合体、（メタ）アクリル酸エステル－スチレン共重合体（ＭＳ樹脂など）などが挙げられる。
　スルホン系樹脂としては、ポリスルホン樹脂、ポリエーテルスルホン樹脂、ポリアリールスルホン樹脂などが例示できる。
　ポリイミド系樹脂としては、ポリエーテルイミド系樹脂、ポリアミドイミド系樹脂、ポリベンズイミダゾール系樹脂などが挙げられる。
　ウレタン系樹脂としては、例えば、ジイソシアネート類（ヘキサメチレンジイソシアネートなどの脂肪族ジイソシアネート類、１，４－シクロヘキサンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートなどの脂環族ジイソシアネート類、トリレンジイソシアネート、ジフェニルメタン－４，４′－ジイソシアネート、１，５－ナフタレンジイソシアネートなどの芳香族ジイソシアネート類又はその水添ジイソシアネート類、キシリレンジイソシアネートなどの芳香脂肪族ジイソシアネート類又はその水添ジイソシアネート類など）と、ポリオール類（例えば、ポリエステルポリオール、ポリテトラメチレンエーテルグリコールなどのポリエーテルポリオール、ポリカーボネートポリオールなど）と、必要により鎖伸長剤との反応により得られるポリウレタン系樹脂などが挙げられる。
　エステル系樹脂としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート等の芳香族ポリエステル、さらに塗料用樹脂等で使用されるジオールとジカルボン酸との縮合により得られるポリエステルなどが挙げられる。
　エーテル系樹脂としては、ポリ（チオ）エーテル系樹脂が挙げられ、ポリオキシアルキレン系樹脂（安定化されたポリオキシメチレングリコール又はホモ又はコポリアセタール系樹脂、ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシテトラメチレングリコールなどのポリオキシＣ１－４アルキレンジオール）、ポリフェニレンエーテル系樹脂、ポリフェニレンエーテルケトン系樹脂、ポリスルフィド系樹脂（ポリフェニレンスルフィド又はその共重合体などのポリチオエーテル系樹脂）、ポリエーテルケトン系樹脂（ポリエーテルエーテルケトン系樹脂を含む）などが挙げられる。
　〔官能基Ａ〕
　本発明における官能基Ａとは、共役酸のｐＫａが８．０～９．９、好ましくは８．５～９．９、より好ましくは９．０～９．５であり、かつ基材表面に存在するとき、官能基Ａは単一の官能基である。
　この際、「官能基Ａが単一の官能基である」とは、基材の表面に存在する官能基Ａ（ｐＫａが８．０～９．９である官能基）が、単一のものからなることを意味する。この際、官能基Ａは、基材に直接存在していても、他の要素（例えば、介在する基）を介して存在していてもよい。
　よって、複数種の官能基Ａが存在するポリエチレンイミン等については、官能基Ａが単一の官能基であるとはいえない。
　官能基Ａが単一であるか否かは、官能基Ａを含む基材を酸で滴定した際に得られる滴定曲線の変曲点数を計測することで判別することができる。
　なお、本明細書において、「官能基Ａの共役酸のｐＫａ」の値は、官能基Ａを含む基材を酸で滴定した際の滴定値から、ヘンダーソン・ハッセルバルヒの式により算出された計算値を採用するものとする。すなわち、当該「官能基Ａの共役酸のｐＫａ」は基材に導入された形態で算出されたものであるため、例えば官能基Ａが「－ＣＨ２ＮＨ２」である場合には、これに相当するアミンである「ＣＨ３ＮＨ２」の共役酸のｐＫａの値とは異なる場合がある。
　また、基材が介在する基を有する場合において、「官能基Ａ」は、ｐＫａが８．０～９．９であり、かつ、当該ｐＫａを満たす最小の基を意味するものとする。例えば、基材の表面に存在する基が「－ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」である場合、官能基Ａとしては、「－ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」「－ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」「－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」「－ＣＨ２ＯＨ」「－ＯＨ」の５種の基が考えられる。これらのうち、「－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」「－ＣＨ２ＯＨ」「－ＯＨ」の共役酸のｐＫａは８．０未満であることから、これらの基は官能基Ａではない。一方、「－ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」および「－ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」はｐＫａが８．０～９．９の範囲内にあることから官能基Ａとなりうる。このうちの最小の基は「－ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」であることから、当該「－ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ」が官能基Ａとなる（よって、「－ＣＨ２－」は介在基である）。
　官能基Ａの具体例としては、特に制限されないが、アミノ基が挙げられる。アミノ基としては、１－ヒドロキシ－２－アミノエチル基等の１級アミノ基；１－ヒドロキシ－２－（Ｎ－メチルアミノ）エチル基等の２級アミノ基；１－ヒドロキシ－２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エチル基、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエトキシカルボニル基、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエトキシカルボニル基等の３級アミノ基等が挙げられる。
　なお、本明細書において、「共役酸」とは、下式におけるＡＨ＋のことを指す。
　　Ａ　＋　Ｈ＋　　　→　　　ＡＨ＋
　官能基Ａを表面に有する基材と、ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液とを接触させると、官能基Ａにウイルスとフミン酸が吸着する。これは、共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａがプラスを帯び、ウイルス及びフミン酸がマイナスを帯びていることから、電気的な結合が生じているものと思われる。
　上記基材の表面に官能基Ａを導入するには、様々な方法がある。例えば、アミノ基を有する化合物を基材表面に塗布してもよい。この際、用いられうるアミノ基を有する化合物としては、Ｎ－β（アミノエチル）γ－アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基含有シランカップリング剤や、アミノ基を有する公知各種の樹脂が挙げられる。また、基材表面に官能基Ａを有する化合物を結合させてもよく、例えば基材表面に有するエポキシ基を介してアンモニアやジエチルアミンを反応させる方法などもある。またジメチルアミノエチルメタクリレートや、ジエチルアミノエチルメタクリレートといったアミノ基含有モノマーを塗布後グラフト重合させることにより、基材表面に官能基を導入する方法などもある。
〔回収液〕
　前記サンプル液と接触させた基材は、例えば、ｐＨ１０～１２の回収液を接触させることで、精製ウイルス液を得ることができる。すなわち、一実施形態において、本発明に係る精製ウイルス液の製造方法は、サンプル液と接触させた前記基材を、ｐＨ１０～１２の回収液に接触させる工程をさらに有する。ｐＨ１０～１２の回収液と接触させると場がアルカリ側になるため、官能基Ａの電荷が中性となり、ウイルスと官能基Ａ間の電気的な結合が解除され、ウイルスが脱離されるからと考えられる。この際、フミン酸は基材から脱離しないため、精製されたウイルス液を得ることができる。これは、フミン酸の疎水的な構造が基材と相互作用して吸着されているからではないかと考えられる。
　なお、共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基が複数存在する（官能基Ａが単一ではない）場合、例えばポリエチレンイミンを固定化した基材のような場合、回収液と接触させてウイルスを脱離させる際、フミン酸までもが溶出しやすくなり、精製ウイルス液にフミン酸が混入しうる。この理由は定かではないが、複数の官能基がウイルスと結合する事により、回収液と接触させてもウイルスが脱離しにくくなり、より高いアルカリ性の回収液と接触させなければウイルスを脱離させる事ができなくなる結果、フミン酸も同時に脱離・溶出してしまう為と考えられる。
〔基材〕
　本発明の基材の形状は特に限定は無く、多孔質膜状、中空糸状、平膜状、ビーズ状、が挙げられるが、サンプル液との接触効率の点から中空糸状であることが好ましく、多孔質膜からなる中空糸状が特に好ましい。
　本発明の基材とサンプル液を接触させる場合、様々な方法を用いることができる。バッチ式の場合、基材とサンプル液をビーカーや試験管、マイクロチューブやチップ等に入れ、撹拌することで接触させることができる。撹拌する場合、撹拌翼や撹拌子を使用してもよいし、振動式ミキサー等で撹拌してもよい。
　フロー式の場合、基材をカラムやチューブに詰めた上、サンプル液を通液してもよいし、担体に基材を固定したうえで通液してもよい。
〔精製ウイルス液の回収工程〕
　上記回収液をサンプル液と接触させた基材と接触させると、回収液にウイルスが溶出するため、ウイルスが溶出した回収液を回収することで、精製ウイルス液を得ることができる。精製ウイルス液を回収するには、基材と回収液とを分離すればよい。分離の方法は公知慣用の方法を用いればよく、濾過、デカンテーション、遠心分離等の方法を用いることができるし、注射器等を用いて液のみを採取してもよい。
〔ウイルス検出工程〕
　得られた精製ウイルス液は、ウイルス検出工程に供することができる。
　ウイルス検出工程とは、ウイルスを検出、及び同定する工程である。ウイルス検出方法としては、古くは単離培養からの形態的同定法が用いられていたが、現在はポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等に代表される核酸増幅検査（ＮＡＴ）法が用いられる。ＮＡＴ法は、培養方法が確立していないウイルスを検出できるうえ、培養日数が不要なため短期間での検出が可能と言う利点がある。
　回収工程で得られる精製ウイルス液中で、ウイルス濃度が低い場合、公知慣用の方法でウイルスを濃縮してもよく、具体的には陽電荷膜法や陰電荷膜法、ポリエチレングリコール沈殿法、セルロース凝集法、限外ろ過法などが挙げられる。本発明で得られる精製ウイルス液は、ＮＡＴ法を阻害するフミン酸が除去、またはほとんど分離されているため、感度よく検出することが可能である。
　精製ウイルス液をＮＡＴ法に供する場合、ウイルスから核酸を抽出する前処理を行うことが好ましい。ウイルス核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）の抽出は、特に限定されるものではなく、フェノール・クロロホルム抽出法、界面活性剤やプロテアーゼを併用した抽出法等が用いられる。また、ウイルス核酸精製に関しても、液相抽出法、エタノール沈殿法やスピンカラム法等により行うことができる。
　抽出された核酸は、ＮＡＴ法により検査を行うが、ＮＡＴ法はウイルス等の微量の遺伝子を人工的に増幅して高感度に検出する方法の総称であり、ＰＣＲ法の他、転写媒介増幅（ＴＭＡ）法、鎖置換反応（ＬＡＭＰ）法、等温遺伝子増幅（ＩＣＡＮ）法、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法等が挙げられる。
　例えばＰＣＲ法の場合、ウイルスに特異的なプライマーを用いて核酸増幅を行い、増幅が認められればウイルスが存在することが判明する。
　以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明は実施例の記載に制限されるものではない。また、実施例において特段の記載がない場合、部及び％は質量基準である。
（参考例１）基材の調製例
　密度０．９６８ｇ／ｃｍ３、メルトインデックス５．５の高密度ポリエチレン（三井石油化学工業株式会社製ＨＩＺＥＸ　２２００Ｊ）を吐出口径１６ｍｍ、円環スリット幅が２．５ｍｍ、吐出断面積が１．０６ｃｍ２の中空糸賦型用紡糸口金を用い、紡糸温度１６０℃で紡糸し、紡糸ドラフト１８９０でボビンに巻き取った。得られた未延伸中空糸の寸法は内径が３２４μｍ、膜厚が４８μｍであった。
　この未延伸中空糸を１１５℃で２４時間、定長で熱処理した。つづいて室温で７５００％／ｍｉｎの変形速度で１．８倍延伸した後、１００℃の加熱炉中で変形速度が２２０％／ｍｉｎとなるように総延伸倍率が３．８倍になるまで熱延伸を行った、さらに１２５℃の加熱炉で総延伸倍率が２．３倍になるまで連続的に熱収縮を行い、延伸糸を得た。得られた多孔性中空糸膜の内径は２９４μｍ、膜厚は４０μｍであった。
（実施例１）
　１）エチレン－ビニルアルコール共重合体（日本合成化学製品、エチレン含量４４モル％、重量平均分子量９００００）２．５ｗｔ％エタノール／水混合溶液（５０℃）に参考例１で得られた中空糸を１００秒間浸漬し、５０℃のエタノール飽和蒸気下で８０秒保温した後、さらに８０秒かけて溶剤を乾燥させて親水化処理を行った。このようにして得られた中空糸（約１３ｃｍ、約１５０本：樹脂固定化量１９．５ｍｇ）を、アセトン２０ｍＬ、エピクロロヒドリン１６ｍＬ、４０％ＮａＯＨ水溶液４ｍＬを入れた試験管中に浸漬した。超音波をかけながら、３０～４０℃で５時間反応させ、反応終了後、アセトンと水で洗浄し、真空乾燥し、エポキシ基が導入された中空糸を得た。
　上記で作製したエポキシ基が導入された中空糸を、２０％エタノールアミン水溶液に浸漬し、４０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ８．９）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０４０μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
　２）該アミノ基固定化中空糸（６ｃｍ×１２本）を用いて、少量サンプル用モジュール（内径３ｍｍ、外径５ｍｍ、有効長５ｃｍ、外表面積５ｃｍ２）を作製した。
　３）精製水にＱβファージ（ＮＢＲＣ２００１２）及びフミン酸（ナカライテスク株式会社）をそれぞれ終濃度１×１０８ＰＦＵ／ｍＬ、１０ｐｐｍとなるよう加えてファージ・フミン酸混合液（ｐＨ：７．０）を調製した。
　上記のファージ・フミン酸液１ｍＬを、注射器を用いてモジュールに通液し、ろ液を非吸着画分として回収した。次いで１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ　１ｍＬを回収液（ｐＨ：１１）として、注射器を用いてモジュールに通液し、ろ液を溶出画分として回収した。
　それぞれの画分において、フミン酸を２６０ｎｍの吸光度測定にて定量した。また、それぞれの画分から、ＱＩＡＧＥＮ　ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｖｉｒｕｓ　Ｓｐｉｎキット（株式会社キアゲン）を用いてファージＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法にてＲＮＡ量を定量した。測定に用いたプライマー及びプローブの配列は文献（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１４９（２００８），ｐ１２３－１２８）に従って作製し、測定はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（ライフテクノロジースジャパン株式会社）を使用した。
　ファージ及びフミン酸の濃度を測定した結果、基材への接触処理前(以降これを未処理とする)のファージ・フミン酸混合液に対し、非吸着画分中に含まれるファージ及びフミン酸量はそれぞれ８％、４％であった。よって、モジュール中の基材に対する吸着率は、それぞれファージが９２％，フミン酸が９６％であることが分かった。
　また、ファージ・フミン酸混合液を通液後、回収液にて溶出操作を行ったところ、未処理のファージ・フミン酸混合液に対し、溶出画分におけるファージ，フミン酸の回収率はそれぞれ６４％，４６％であった。
　上記で得られたフミン酸の回収率に対するファージの回収率（フミン酸の回収率／ファージの回収率）を回収率比として算出したところ、０．７２であった。なお、回収率比は、その値が小さいほどフミン酸を分離することができたことを意味する。
（実施例２）
　１）実施例１と同様にして作製したエポキシ基が導入された中空糸を、２８％アンモニア水に浸漬し、２０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ　９．５）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０２２μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
　２）実施例１と同様に少量サンプル用モジュールを作製し、ファージ・フミン酸混合液１ｍＬの吸着・１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ　１ｍＬ（ｐＨ：１１）による回収評価を実施した。未処理のファージ・フミン酸混合液に対する非吸着画分におけるファージ，フミン酸の吸着率はそれぞれ９５％，１００％であった。また、溶出画分におけるファージ，フミン酸の回収率はそれぞれ６９％，３２％であった。よって、回収率比は０．４６である。
（実施例３）
　１）実施例１と同様にして作製したエポキシ基が導入された中空糸を、２０％ジエチルアミン水溶液に浸漬し、４０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ　９．９）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０２５μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
　２）実施例１と同様に少量サンプル用モジュールを作製し、ファージ・フミン酸混合液１ｍＬの吸着・１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ　１ｍＬ（ｐＨ：１２）による回収評価を実施した。未処理のファージ・フミン酸混合液に対する非吸着画分におけるファージ，フミン酸の吸着率はそれぞれ９６％，１００％であった。また、溶出画分におけるファージ，フミン酸の回収率はそれぞれ６３％，４６％であった。よって、回収率比は０．７３である。
（比較例１）
　１）実施例１と同様にして作製したエポキシ基が導入された中空糸を、５％ポリアリルアミン水溶液に浸漬し、４０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ１０．６）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０１５μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
　２）実施例１と同様に少量サンプル用モジュールを作製し、ファージ・フミン酸混合液１ｍＬの吸着・１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ　１ｍＬ（ｐＨ：１１）による回収評価を実施した。未処理のファージ・フミン酸混合液に対する非吸着画分のファージ，フミン酸量はそれぞれ０％である事から、ファージ及びフミン酸の吸着率はそれぞれ１００％，１００％と算出された。また、ファージ・フミン酸混合液を通液後、回収液にて溶出操作を行ったところ、未処理のファージ・フミン酸混合液に対し、溶出画分におけるファージ，フミン酸はほとんど回収されず、回収率はそれぞれ０％であった。このため、回収率比は算出できなかった。
（比較例２）
　１）実施例１と同様にして作製したエポキシ基が導入された中空糸を、５％ポリεリジン水溶液に浸漬し、４０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ　７．６）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０４２μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
　２）実施例１と同様に少量サンプル用モジュールを作製し、ファージ・フミン酸混合液１ｍＬの吸着・１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ　１ｍＬ（ｐＨ：１１）による回収評価を実施した。未処理のファージ・フミン酸混合液に対する非吸着画分におけるファージ，フミン酸の吸着率はそれぞれ１００％，８７％であった。また、溶出画分におけるファージ，フミン酸の回収率はそれぞれ７１％，６５％であった。よって、回収比率は０．９２である。
（比較例３）
　１）実施例１と同様にして作製したエポキシ基が導入された中空糸を、５％ポリエチレンイミン（和光純薬製品、平均分子量６００）の水溶液に浸漬し、４０℃で１５時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、アミノ基（共役酸のｐＫａ　８．８；平均値）が導入された中空糸を得た。中空糸を滴定して官能基量を測定したところ、導入された官能基量は、０．０２１μｍｏｌ／ｃｍ２（内表面積）であった。
　２）実施例１と同様に少量サンプル用モジュールを作製し、ファージ・フミン酸混合液１ｍＬの吸着・１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ　１ｍＬ（ｐＨ：１１）による回収評価を実施した。未処理のファージ・フミン酸混合液に対する非吸着画分におけるファージ，フミン酸の吸着率はそれぞれ１００％，９７％であった。また、溶出画分におけるファージ，フミン酸の回収率はそれぞれ７０％，６８％であった。よって、回収比率は０．９７である。
　実施例１～３および比較例１～３で得られた結果を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果からも明らかなように、実施例１～３では回収率比が特に小さく、選択的にファージを分離することができ、得られた液は、ウイルスのみを好適に濃縮した精製ウイルス液であるといえる。
　一方、比較例１～３では、回収率比が１に近い値となっており、得られた回収液には、ウイルスとともにフミン酸も混合していることが分かる。
　本発明の精製ウイルス液の製造方法は、ウイルス検査方法に対し好適に使用可能である。

Claims (7)

  1. 　ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程を有する、精製ウイルス液の製造方法であって、
    　上記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする、製造方法。
  2. 　前記サンプル液と接触させた前記基材を、ｐＨ１０～１２の回収液に接触させる工程をさらに有する、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記基材が中空糸膜である、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　前記官能基Ａがアミノ基である、請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
  5. 　前記サンプル液のｐＨが３．０～９．０である、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
  6. 　ウイルス及びフミン酸を含有するサンプル液と、共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａを表面に有する基材とを接触させる工程と、
    　ｐＨ１０～１２である回収液を基材と接触させる工程と、
    　基材と接触後の回収液を回収して得られる精製ウイルス液をウイルス検出工程にかける工程とを有し、
    　前記官能基Ａが、単一の官能基であることを特徴とする、ウイルス検出方法。
  7. 　共役酸のｐＫａが８．０～９．９である官能基Ａを表面に有する基材を有し、前記官能基Ａが単一の官能基であることを特徴とする、ウイルス精製部材。
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