WO2016178277A1 - 暗環境同時観察培養装置 - Google Patents
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- G01N2015/03—Electro-optical investigation of a plurality of particles, the analyser being characterised by the optical arrangement
Definitions
- the present invention relates to a technique for performing colony counting in food hygiene inspection and the like.
- the number of viable bacteria represents the number of microorganisms that survive in 1 g of a food inspection object, and is used as an index for measuring microbial contamination of food.
- the number of general viable bacteria is measured by mixing the test object with an agar medium and culturing for 24 or 48 hours, and counting the number of colonies formed by the growth of general viable bacteria. It has been established. Examples of such inspection objects include soft drinks, ice confectionery, edible eggs, drinking milk, and dairy products.
- a colony counting device used in such a self-examination detects a minute colony that cannot be confirmed with the naked eye from a photographed image by causing the computer to execute an image processing program or an image recognition program. . This makes it possible to quickly perform colony counting without requiring a long culture period of 24 hours or 48 hours.
- a colony counting device for example, there is a technique described in Patent Document 1.
- Patent Document 1 irradiates a medium with white light, identifies colonies from an image of light transmitted through the medium, and performs colony counting. More specifically, there is a difference in the amount of white light transmitted between the portion where the colony is generated and the portion where the colony is not generated in the culture medium, and the difference appears as shading in the photographed image. Then, binarization processing and gray scale processing are performed on the image in which the shade appears, and a dark portion is extracted as a colony to perform colony counting. By performing image processing on the captured image and performing colony counting in this way, speeding up is achieved as compared with colony counting by conventional visual observation.
- the colony count so far is obtained by removing the medium from the culture apparatus every time a predetermined elapsed time such as 12 hours, 18 hours, 24 hours, etc. has elapsed from the start of the culture.
- the colony was counted by setting the colony counting apparatus as described in No. 1 and photographing the medium. Such colony counting can be said to be a discrete observation.
- the growth of colonies in the medium proceeds continuously over time as shown in the figure.
- the horizontal axis represents the elapsed time from the start of culture
- the vertical axis represents the contrast of light and shade acquired from an image of the culture medium.
- the contrast of light and shade is a difference in brightness between a blackish portion and a whitish portion in an image.
- a certain contrast of shades must be generated. For example, in the figure, there is no contrast that can be counted after 18 hours.
- the present inventor installs a culture medium in a culture chamber for culturing in a dark environment, and makes it easy to obtain an image with clear contrast between light and shade even in a culture chamber in a dark environment. Furthermore, the inventors have come up with the idea of acquiring an image by irradiating infrared light having a property that the difference in absorbance between the culture medium and the colony is larger than that of visible light and is difficult to scatter.
- the present invention makes it possible to count colonies at an early stage by configuring so that observation can be performed while culturing in this way.
- an observation target holding unit for holding an observation target, a dark environment culture chamber for culturing bacteria in the observation target held in the observation target holding unit in a dark environment, and a dark environment culture chamber
- An infrared light source that irradiates the observation object held in the observation object holding unit that is housed with infrared light
- an infrared light camera that captures an image of the observation object irradiated with infrared light from the infrared light source
- a dark environment simultaneous observation and culturing apparatus that has the above-described configuration and further includes a control unit that performs multiple imaging control for an infrared light camera to continuously image an observation object a plurality of times.
- a dark environment simultaneous observation and culturing apparatus that has the above-described configuration and the infrared light source emits near-infrared light.
- a dark environment simultaneous observation and culturing apparatus having the above-described configuration in which an infrared light source is provided with a filter that blocks a predetermined wavelength band of infrared light is provided.
- a dark environment simultaneous observation and culture apparatus having the above-described configuration and provided with a filter that blocks a predetermined wavelength band of infrared light is provided in the infrared light camera.
- the infrared light camera is disposed downward on the ceiling side in the dark environment culture chamber, and the infrared light source is disposed upward on the floor side in the dark environment culture chamber for observation.
- the object holding unit provides a dark environment simultaneous observation and culture apparatus disposed between the infrared light camera and the infrared light source.
- a dark environment simultaneous observation and culturing apparatus having the above-described configuration, in which the bacteria to be observed are arranged in a membrane filter. Moreover, the dark environment simultaneous observation culture apparatus which is provided with said structure and sets it as the deep direction distribution microbe source culture medium which pours a culture medium and a microbe source as said observation object is provided.
- An observation and culture method using any one of the above dark environment simultaneous observation and culture apparatuses wherein an observation object in which a fungus source is added to a medium in order to culture bacteria in a dark environment in a dark environment culture chamber An infrared light irradiation step of irradiating the observation object stored in the dark environment culture chamber with infrared light from the infrared light source; and an infrared light source irradiated with the infrared light source from the infrared light camera.
- An observation culture method using a dark environment simultaneous observation culture apparatus having an imaging step of imaging an observation object in a state of being present.
- the observation and culture method further includes a control sub-step for performing a plurality of imaging controls for the infrared light camera to continuously image the observation object a plurality of times.
- the observation culturing method includes the above-described steps, and the observation target setting step includes a deeply-distributed bacterial source medium manufacturing sub-step for manufacturing a deeply-distributed bacterial source medium by mixing the culture medium raw material and the bacterial source. I will provide a.
- the first embodiment mainly relates to claims 1, 3 to 8, and the like.
- the second embodiment mainly relates to claims 2 and 10.
- the third embodiment mainly relates to claims 1 to 11.
- the fourth embodiment mainly relates to claims 9 to 11.
- the dark environment simultaneous observation and culturing apparatus includes an infrared light source and an infrared light camera for capturing an image of an observation target in the culture process while culturing the bacteria included in the test target in the dark environment culture room.
- an infrared light source and an infrared light camera for capturing an image of an observation target in the culture process while culturing the bacteria included in the test target in the dark environment culture room.
- an infrared light source and an infrared light camera for capturing an image of an observation target in the culture process while culturing the bacteria included in the test target in the dark environment culture room.
- an infrared light source and an infrared light camera for capturing an image of an observation target in the culture process while culturing the bacteria included in the test target in the dark environment culture room.
- an infrared light source and an infrared light camera for capturing an image of an observation target in the culture process while culturing the bacteria included in the test target in the dark environment culture room
- infrared light has a greater difference in absorbance between the culture medium and colony than visible light.
- a medium with low transparency such as a milk mixed medium, blood medium, chocolate medium, etc.
- the absorbance of the visible light is about the same as that of the medium and the colony.
- the contrast between the medium and the colony is easily acquired as an image when the infrared light is irradiated, compared with when the visible light is irradiated.
- infrared light has a property that it is difficult to scatter against visible light such as white light. Therefore, an image taken by irradiating infrared light has a clearer boundary between a portion where a colony exists and a portion where a colony does not exist. Therefore, even when microscopic colonies are dense enough to be identified only as a single colony in an image taken by irradiation with visible light, those individual microcolonies are taken in an image taken with infrared light. Can be identified separately. In other words, when infrared light is irradiated, it is possible to take an image with excellent resolution, and colonies can be extracted with higher definition, thereby enabling early colony counting. Become. ⁇ Configuration of Embodiment 1>
- FIG. 1 is a conceptual diagram showing each configuration of the dark environment simultaneous observation and culture apparatus of the present embodiment.
- the “dark environment simultaneous observation and culture apparatus” (0100) includes a “dark environment culture room” (0101), an “infrared light source” (0102), an “infrared light camera” (0103), Have There is an “observation object holding unit” (0105) for holding the “observation object” (0104) between the infrared camera and the infrared light source.
- a “computer” (0106) for identifying and counting colonies from the image of the observation object photographed by the infrared light camera, and a “computer” for outputting the photographed images and colony counting results, etc.
- a display "(0107) is also shown.
- the arrow in a figure represents the infrared light irradiated to the observation object, and the arrow of a broken line represents the infrared light which permeate
- the “observation target holding unit” holds the observation target.
- the observation target is a container such as a petri dish that contains a general viable bacteria or fungi such as coliform bacteria to be inspected for hygiene inspection and the like, and a medium for imparting a growth environment thereto. In addition, when a membrane filter or the like is used, they are also observed.
- the “petri” (0106) containing the medium mixed with the sample is the observation target.
- There are various specific modes for holding the observation target such as a plate for placing the petri dish at a predetermined position, and a jig for holding the petri dish from both sides.
- the observation object holding unit can be appropriately selected according to the container to be observed, the culture mode, the shooting mode, and the like.
- the “dark environment culture room” (0101) is a room for culturing the bacteria in the observation object in the dark environment. As long as it is a room suitable for culture and becomes a dark environment when closed, there is no particular limitation. For example, an incubator or the like can be used as the dark environment culture room. In addition, the dark environment also has a meaning of preventing the influence of visible light when photographing an observation target by irradiating infrared light. Moreover, since the environment where products such as food are stored is often a dark environment, it is possible to perform a hygiene inspection assuming an environment where a product to be cultured in a dark environment is actually placed.
- the culture medium and culture method for culture can be appropriately selected according to the purpose of the bacteria and the test.
- the pour culture method is a method of culturing a medium prepared by mixing a medium and a bacterial source. Specifically, an agar medium and the like dissolved by heating and a sample are mixed and placed in a petri dish or the like, and then the medium solidified as the temperature decreases is cultured.
- the medium thus prepared is referred to as “deeply distributed bacterial source medium” in the present specification.
- the plate smear culture method is a method in which a dissolved agar medium is placed in a container such as a petri dish and solidified, and then a sample is smeared on the surface of the medium and inoculated.
- colonies are formed on the surface of the medium, so that the shape and the like can be observed in detail.
- the amount of inoculated sample is small and the detection limit is low.
- the sample in the pour culture method, can be inoculated into the medium, so the amount of inoculated sample is large and the detection limit is high. Therefore, it is advantageous for detecting bacteria when the number of bacteria in the sample is small, such as measurement of the number of general viable bacteria or measurement of coliform bacteria.
- colonies are formed in the medium, it can be said that the detection is more difficult than in the case of the plate smear culture method.
- the culture may be performed using a membrane filter.
- the membrane filter is a porous membrane that is used to separate fine particles or microorganisms of about 0.2 to several ⁇ m by filtration and has integral and continuous pores.
- cellulose Polyvinylidene DiFluoride: polyvinylidene fluoride
- PTFE Polytetrafluorethylene: polytetrafluoroethylene
- polyethylene nylon, or the like is used.
- Membrane filter culture is used in food hygiene inspections for soft drinks, etc.
- the soft drink is filtered through a membrane filter, and the filtered membrane filter is coagulated in a petri dish. Affix to the surface and culture.
- This method is suitable when the amount of samples is large and the number of bacteria is expected to be small.
- colonies formed on the membrane filter are detected based on an image photographed by reflected light because visible light hardly passes through the membrane filter.
- infrared light is detected by the membrane filter. Therefore, it is possible to perform based on an image photographed with transmitted light.
- the selection of the culture medium and culture method is, for example, culturing a standard agar medium by the pour culture method in the inspection of the general viable count, and culturing in the desoxycholate agar medium by the pour culture method in the inspection of the coliform group.
- culturing a standard agar medium by the pour culture method in the inspection of the general viable count and culturing in the desoxycholate agar medium by the pour culture method in the inspection of the coliform group.
- an egg yolk mannitol salt agar medium smeared with a sample is cultured.
- Infrared light source (0102) is provided for irradiating the observation object stored in the dark environment culture chamber with infrared light.
- An infrared light source is a light source that emits infrared light, which is light in a wavelength range of approximately 0.7 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
- the form of the infrared light source is preferably a surface-emitting type having an area larger than the irradiation target area of the observation target, from the viewpoint of capturing the entire observation target region as an image.
- an infrared light source including a plurality of light emitting elements such as LEDs that emit infrared light arranged in a lattice shape or a concentric shape and provided with a diffusion plate can be mentioned.
- the irradiation target area of the observation target is, for example, the bottom area of the petri dish when the observation target is a cylindrical petri dish.
- the infrared light source is preferably one that irradiates near infrared light, and more preferably, one that irradiates near infrared light in a wavelength range of about 0.7 ⁇ m to 1 ⁇ m.
- FIG. 2 is a conceptual diagram showing the wavelength region of near-infrared light together with the wavelength regions of other electromagnetic waves.
- visible light having a shorter wavelength than near infrared light wavelength 0.4 ⁇ m to wavelength 0.7 ⁇ m
- the absorbance of the medium and the colony is approximately the same, and in the wavelength longer than 1 ⁇ m, the absorbance due to water increases. This is because the absorbance of a medium containing a large amount of water increases and the difference from the absorbance of colonies becomes small.
- an infrared light source including a light-emitting element designed to emit infrared light having a wavelength in the desired range is used.
- an infrared light source including a filter for blocking a wavelength band of a predetermined excess region by absorption or reflection may be used.
- the infrared light irradiated by the infrared light source is exclusively for photographing, it is not always necessary to irradiate the infrared light.
- the “infrared light camera” (0103) captures an image of an observation target irradiated with infrared light from an infrared light source.
- An “image” refers to an image obtained by receiving light transmitted through a subject.
- a digital infrared camera is used to perform image processing for colony identification on the captured image.
- the infrared camera may be any camera provided with an image sensor (CCD, CMOS, etc.) using a photodiode having light receiving sensitivity in the wavelength region of infrared light.
- image sensor CCD, CMOS, etc.
- Various infrared light cameras having good light receiving sensitivity in a desired wavelength region have been commercialized. For example, “ARTCAM-1000MI-WOM-OP (Art Ray Co., Ltd.)” and “C11440-52U (Hamamamatsu Photonics Co., Ltd.) )”and so on.
- the number of effective pixels of the infrared camera is preferably 10 million or more.
- the infrared camera may include a filter that blocks a predetermined wavelength band of infrared light.
- a filter that blocks infrared light outside the wavelength range of 0.7 ⁇ m to 1 ⁇ m, which is suitable for photographing the observation target, or a filter that blocks the wavelength in the visible light region may be provided.
- the dark environment simultaneous observation and culture apparatus of the present embodiment captures an image of an observation object irradiated with infrared light
- the irradiation direction of the infrared light and the shooting direction of the infrared light camera face each other.
- an infrared light source and an infrared light camera are arranged, and an observation object is located between the infrared light source and the infrared light camera.
- the infrared light camera is installed on the ceiling part in the dark environment culture room so that the infrared light camera faces downward, and the infrared light source is installed on the floor part in the dark environment room so that the irradiation light faces upward.
- the petri dish to be observed is installed on an infrared light source.
- the infrared camera is basically arranged so as to face downward. If the infrared camera lens is facing upward, dust in the dark environment culture chamber may fall and adhere to the lens surface. It is because it becomes an obstacle.
- the petri dish is installed with the petri dish lid positioned on top. This is because, when cultivating by the plate smear culture method, it is possible to shoot an image with better contrast if the medium surface on which the smeared sample is located is directed to the infrared light camera. .
- FIG. 3 is a conceptual diagram showing an installation mode of an observation target in such a case.
- illustration outside the environmental culture chamber is omitted.
- an “infrared light camera” (0302) is installed on the ceiling portion of the “dark environment culture room” (0301) so as to face downward, and the “infrared light source” (0303) is irradiated on the floor portion. Is installed so that it faces upward.
- the “petri dish” (0304) to be observed is placed in the “observation target holding unit” (0305) so that the lid is positioned below.
- the petri dish When culturing using a solid medium such as an agar medium, the petri dish is allowed to stand with the lid up until the dissolved agar medium solidifies in either the pour or smear method. Then, after the agar medium is solidified, it is generally performed so that the lid is turned upside down and the lid is positioned below and placed in a culture room or the like. When culture is performed with the lid positioned on top, the water evaporated from the medium may aggregate on the surface of the lid and form droplets that fall on the surface of the medium. Such a situation hinders proper colony counting, such as a change in the culture conditions on the surface of the medium or an obstacle to photographing the medium. Therefore, as described above, the petri dish is installed so that the lid is positioned below.
- a solid medium such as an agar medium
- colony observation is performed by photographing an observation target while culturing. Therefore, it is preferable to install the petri dish in a posture suitable for culturing the observation target, and to be configured so that the observation target can be appropriately photographed in that posture. As described above, it is preferable to install the petri dish so that the lid of the petri dish is positioned below and to install an infrared light camera so that the bottom of the petri dish can be photographed.
- FIG. 4 is a conceptual diagram showing the positional relationship of each component when the observation target is a petri dish containing a medium by a flat plate smearing method.
- an “infrared light source” (0402) is installed on the ceiling portion of the “dark environment culture room” (0401) so that infrared light is irradiated downward, and an “infrared light camera” ( 0403) is installed on the floor so as to face upward.
- the “petri” (0404) is installed in the “jig” (0405) so that the lid is positioned below.
- a “cover” (0406) or the like that covers the infrared camera lens so that the lens can be opened and closed so that the cover can be opened only during photographing. If the lens is left facing upward, dust or the like present in the dark environment culture chamber may fall and adhere to the lens surface. Adhered dust or the like becomes noise in the photographed image and hinders proper photographing. Therefore, in order to prevent such a situation, it is preferable to provide a cover that covers the lens.
- FIG. 5 shows an example of a medium image taken by the dark environment simultaneous observation and culture apparatus of the present embodiment configured as described above, together with an image in the prior art.
- FIG. 5 shows a captured image (a) to be observed in the present embodiment and an image (b) obtained by capturing an image of visible light with a general camera.
- FIG. 6 shows a photograph of the apparatus that took the image of FIG. Photographing was performed by covering the entire apparatus shown so that visible light did not enter.
- ARTCAM-1000MI-WOM-OP Article Ray
- TS VIS-NIR compact fixed focus lens 16MM (Edmond Optics Japan) is used as the lens. Co., Ltd.) was used.
- 0D4 long pass filter 875NM (Edmond Optics Japan Co., Ltd.)” was used as a “filter” (0602) that cuts a wavelength shorter than 875 mn, which is the near-infrared wavelength region, and “infrared light source” (0603).
- LED used as the light emitting element was “SHF-487 880NM (OSRAM Opto Semiconductors)”.
- observation object (0604) used the agar culture medium prepared by pouring milk, assuming the general viable count test.
- FIG. 5 (b) uses the same medium as FIG. 5 (a), a 10 million pixel camera having the same resolution as the above-mentioned infrared light camera, a filter that cuts a wavelength longer than 650 nm, and a white LED. It is the image image
- the contrast between the bacteria shadow and the medium is clear, and the outline of the bacteria shadow is also clearly shown.
- the fungus shadow is thin and the contrast is unclear, and the outline of the fungus shadow is not clearly shown. Therefore, in the image in FIG. 5B, detection is not possible unless the growth of the bacteria is further increased and the shadow becomes larger, and as a result, detection is delayed.
- the presence or absence of colonies can be determined even when targeting a deeply-distributed bacterial source medium that is a medium prepared by a pour culture method in which colony detection is difficult compared to the case of a plate smear culture method. It can be seen that the shading shown is clearly copied. Therefore, the dark environment simultaneous observation and culturing apparatus of the present embodiment irradiates and shoots infrared light with high transmittance and is difficult to scatter, so that the colony detection target by the pour culture method or the membrane filter method can be particularly precisely defined. It can be said that it is suitable for performing. ⁇ Embodiment 1 effect>
- the dark environment simultaneous observation and culturing apparatus of the present embodiment allows culturing and photographing thereof to be performed in one apparatus, and can take an image with excellent resolution by infrared light and perform colony counting at an early stage. It becomes possible.
- ⁇ Embodiment 2> ⁇ Overview of Embodiment 2>
- the present embodiment is characterized in that the dark environment simultaneous observation and culturing apparatus according to the first embodiment includes a control unit that controls an imaging mode using an infrared light camera. Thereby, it becomes possible to observe an observation object in various modes.
- a control unit that controls an imaging mode using an infrared light camera.
- FIG. 7 is a conceptual diagram showing each configuration of the dark environment simultaneous observation and culture apparatus of the present embodiment.
- the “dark environment simultaneous observation and culture apparatus” (0700) includes a “dark environment culture room” (0701), an “infrared light source” (0702), an “infrared light camera” (0703), An “observation object holding unit” (0705) for holding an “observation object” (0704) and a “control unit” (0706) are included.
- “computer” is shown as an example of implementing the control unit.
- a “display” (0707) for outputting a photographed image, a colony count result, and the like may be connected to the computer. Since the other components of the control unit are the same as those in the first embodiment, description thereof is omitted here.
- the “control unit” (0706) has a function of performing a plurality of shooting controls for the infrared light camera to continuously shoot the observation target a plurality of times or / and a moving image shooting control for continuously shooting a video of the observation target. Fulfill.
- the specific mode of the multi-photographing control is, for example, that the first still image is captured at the start of culture, and then the still image is continuously captured for 48 hours at 30-minute intervals. Further, it may be controlled such that the imaging interval at the initial stage of culture is set to a relatively long time and the imaging interval at the stage after the initial stage is set to a relatively short time. For example, the period from the start of culture to 6 hours is set as the initial period, the imaging interval is 120 minutes, and after 6 hours from the start of culture, the imaging interval is set to 30 minutes. This is because it takes a certain amount of time for the bacteria to start dividing, and once division starts, re-division occurs one after another.
- the observation target when the observation target is a container containing a culture medium by the pour culture method, it may be controlled to take a picture while changing the focus of the infrared camera. For example, if the depth of the medium contained in the container is 5 mm, after taking a picture with the focus on the surface of the medium, the picture is taken each time while changing the focus in the depth direction of the medium by 1 mm, for a total of 5 sheets. Get the image. Colonies scattered in the depth direction of the medium can be detected by performing colony counting on each image thus obtained. Further, instead of shooting while shifting the focus, the position of the observation object holding unit may be configured to be variable so that the image is taken every time while changing the distance between the observation object and the infrared camera.
- control unit may be configured to perform control of infrared light irradiation by an infrared light source that is indispensable for photographing with an infrared light camera.
- an infrared light source may be controlled to irradiate infrared light in a timely manner, such as when an infrared light camera is necessary for photographing an observation object.
- the control unit is composed of, for example, hardware, software, or both hardware and software.
- hardware constituted by a CPU, a bus, a memory, an interface, a peripheral device, and the like
- software that can be executed on the hardware.
- the functions of each unit are realized by sequentially executing a program developed on the memory, and processing, storing, and outputting data on the memory and data input via the interface.
- FIG. 8 is a diagram showing a specific hardware configuration of the control unit. As shown in the figure, the “control unit” (0800) reads out a “CPU” (0801) for executing various arithmetic processes and a program for performing the various arithmetic processes in order to cause the CPU to execute, and reads a work area of the program.
- the “control unit” (0800) reads out a “CPU” (0801) for executing various arithmetic processes and a program for performing the various arithmetic processes in order to cause the CPU to execute, and reads a work area of the program.
- a data communication path such as a system bus (0805) to transmit / receive and process information .
- the processing in the control unit is shown as an example of performing multiple shooting control.
- the CPU develops a program for multi-shooting control stored in the storage device in the work area of the main memory, executes the program, and reads the imaging interval stored in the storage device. Then, processing for outputting a signal for causing the infrared camera to capture an image through the I / O according to the read value is performed.
- the CPU expands the program for controlling the infrared light source stored in the storage device in the work area of the main memory and executes it.
- the irradiation interval and irradiation time stored in the storage device are read out. Then, a process for outputting a signal for causing the infrared light source to image according to the read value to the infrared light source via the I / O is performed.
- the dark environment simultaneous observation and culture apparatus of the present embodiment may have a colony counting unit for counting colonies based on images taken by an infrared camera.
- FIG. 9 is a conceptual diagram illustrating an example of a colony detection unit.
- the “colony detection unit” (0901) includes a “filter unit” (0902), a “subtraction unit” (0903), a “gradation value setting unit” (0904), and an “extracted image acquisition unit”. ”(0905),“ determination means ”(0906), and“ counting means ”(0907).
- the colony counting unit can be realized by the hardware configuration described above.
- “Filter means” (0902) grayscales the digital image taken by the infrared camera and applies a low-pass filter to remove partial shading such as turbidity of the medium.
- the “subtracting unit” (0903) subtracts the image from which partial shading has been removed by the filter unit from the above-described grayscale image, and obtains an image obtained by subtracting the offset value.
- “Tone value setting means” (0904) sets a plurality of gradation values at predetermined intervals between the maximum gradation value and the minimum gradation value of the image obtained by the subtraction means.
- the “extracted image acquisition means” (0905) extracts only pixels that are darker than the gradation values set by the gradation value setting means from the image obtained by the subtraction means, and is binarized corresponding to each gradation value. A plurality of extracted images are obtained.
- the “determination means” (0906) removes from the extracted images obtained by the extracted image acquisition means other than the circular areas that are darker than the corresponding gradation values, and the central portion is darker and stepwise toward the periphery. An area that is thinned is determined as a colony.
- the “counter” (0907) counts the determined colonies. The count of colonies may be performed, for example, every time the observation target is photographed, or may be performed at a timing different from the timing of photographing.
- it may further have means for performing various processes based on the counting result by the counting means. For example, there may be provided means for setting a predetermined count value set in advance as a threshold value and outputting an alarm by sound or image when the count result by the counting means exceeds the threshold value. Or you may have a means to display the transition of the count result with progress of time from a culture
- it may have means for accumulating various information about colony counting, for example, information such as sample, culture medium, culture condition, counting result, transition of counting result, etc. into a database. And you may have a means to perform the process which referred this database. For example, there may be provided means for calculating the difference by comparing with the transition of the counting result of the same observation target stored in the database while actually recording the transition of the counting result. Or you may have a means to calculate the difference with the control of only the culture medium which does not contain a sample. And when the above-mentioned calculated difference exceeds a predetermined threshold value, there may be provided means for outputting some kind of alarm.
- it may have means for estimating the number of colonies after lapse of 24 hours or 48 hours from the start of culture for a sample provided with a bacterial source included in the observation target with reference to information accumulated in the database. If the number of colonies after 24 hours or 48 hours estimated by this means is less than or equal to the allowable value, it shall satisfy the safety standards for foods etc. provided with the sample, and immediately put on the distribution channel Ship to etc. Then, after confirming that the number of colonies counted from the actual observation target is less than or equal to an allowable value after 48 hours have elapsed from the start of the culture, the shipped foods and the like are taken out to the store.
- the dark environment simultaneous observation and culturing apparatus of the present embodiment can perform appropriate imaging according to the observation target, the culture method, and the like.
- the dark environment simultaneous observation and culture apparatus of the present embodiment has a many-to-many relationship between the infrared camera and the observation target. It can also be applied to cases where the relationship is For example, a rack that can store multiple trays with a plurality of dishes placed in a dark environment culture chamber is provided, and the same number of infrared cameras as the dishes placed on one tray are attached to the robot arm. You may comprise so that an infrared camera may be conveyed to each tray and image
- FIG. 10 is a conceptual diagram showing a case in which shooting is performed while sequentially transporting trays.
- this figure conceptualizes the state in the dark environment culture chamber, and mainly shows an infrared light camera, an infrared light source, and an observation target.
- one “tray” (1001) has three “petriets” (1002) to be observed.
- a total of 18 petri dishes are configured to circulate in a direction indicated by a dotted arrow while maintaining a constant posture along an annular “guide rail” (1003) indicated by a thick line in the drawing.
- power control such as a motor or the like, a transmission means such as a belt or a chain for transmitting power to each plate along the guide rail, a power control configured by a computer or the like to control the power It is realized by cooperating means.
- a plurality of trays may be attached to the rotating drum in a fixed posture, and the trays may be conveyed by rotating the drum.
- controlling photographing by an infrared camera and control for transporting a tray to be photographed to a predetermined photographing location are closely related. Therefore, you may comprise so that a control part may also control tray conveyance.
- an “infrared light camera” (1005) and an “infrared light source” (1006) for photographing all the petri dishes placed on the “tray” (1004) conveyed to the lower end of the guide rail are provided. It is installed at a position suitable for photographing. Note that the “tray” (1007) in a state where the petri dish is not placed has an opening at the petri dish placement planned portion, and therefore, infrared light is irradiated to the bottom surface of the petri dish.
- the power when the control unit sets the imaging interval of the observation target to 45 minutes, the power may be controlled so that one tray is transported to the imaging location every 45 minutes.
- the power control means may control the power so that each tray is sequentially transported to the photographing location at intervals of 2.5 minutes.
- a control part should just control an infrared-light camera so that the tray conveyed with a 2.5 minute space
- the dark environment simultaneous observation and culturing apparatus of the present embodiment can efficiently culture and observe a plurality of observation objects, and can further save labor in colony counting.
- the present embodiment relates to an observation culture method using the dark environment simultaneous culture apparatus according to any one of the first to third embodiments.
- FIG. 10 is a flowchart showing an example of the observation culture method of the present embodiment.
- the observation culture method of the present embodiment includes an “observation target installation step” (S1101), an “infrared light irradiation step” (S1102), and an “imaging step” (S1103).
- an observation object in which a bacterial source is added to the medium is installed in the dark environment culture chamber of the dark environment simultaneous observation and culture apparatus in order to culture bacteria in the dark environment.
- a fungal source is added by pouring a sample onto the coagulated medium surface after pouring an agar medium dissolved in a petri dish or the like.
- a petri dish or the like is installed in the dark environment culture chamber.
- the observation target housed in the dark environment culture chamber is irradiated with infrared light from the infrared light source.
- the CPU executes a program for controlling an infrared light source stored in a storage device based on the hardware configuration shown in the second embodiment.
- the observation target is imaged while being irradiated with infrared light from an infrared light source by the infrared light camera.
- the imaging step includes multiple imaging control for the infrared light camera to continuously image the observation object multiple times or / and the observation object. May further have a control sub-step for performing moving image shooting control for continuously moving image shooting. For example, in the case of multiple imaging control, the first imaging is performed at the start of culture, and then the imaging is continuously performed for 48 hours at 11 minute intervals.
- the CPU executes a program for controlling shooting of the infrared camera stored in the storage device. And so on.
- the image photographed through the above steps is used for visual observation or for execution of an image processing program for colony counting, a colony counting program, and the like.
- an image processing program for colony counting for colony counting
- a colony counting program for colony counting program
- the apparatus for performing those execution processes, etc. it can implement
- the observation target installation step may include a deep direction distribution source culture medium sub-step for manufacturing a deep direction distribution source medium by mixing the medium raw material and the bacteria source. That is, when culturing by the pour culture method, the dissolved agar medium and the like are mixed with a sample serving as a fungal source and then coagulated. A container such as a petri dish containing the deeply distributed bacterial source medium thus produced is placed in the dark environment culture chamber. ⁇ Embodiment 4 effect>
- the culture and the imaging thereof can be performed in one apparatus, and an image with excellent resolution can be captured by infrared light, and colony counting can be performed at an early stage.
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Abstract
【課題】観察対象を撮影した画像に画像処理等を施しコロニー計数を行うことで、コロニー計数の迅速化が図られている。しかしながら、より一層のコロニー計数の早期化が求められている。 【解決手段】上記課題を解決するために、観察対象を保持するための観察対象保持部と、暗環境下で観察対象保持部に保持された観察対象の中の菌の培養を行うための暗環境培養室と、暗環境培養室内に納められる観察対象保持部に保持された観察対象を赤外光で照射する赤外光源と、赤外光源により赤外光を照射される観察対象の像を撮影する赤外光カメラと、を有する暗環境同時観察培養装置などを提供する。
Description
本発明は、食品衛生検査などにおけるコロニー計数を行うための技術に関する。
食品の製造販売等を行う事業者に対して、取り扱う食品について衛生指標菌の測定検査などが義務付けられている。例えば、一般生菌数は食品の検査対象1g中に生存する微生物の数を表わし、食品の微生物汚染を計る指標として用いられている。一般生菌数の測定は、食品衛生法に基づく公定法においては、検査対象を寒天培地と混釈し24時間または48時間培養し、一般生菌が増殖して形成したコロニーの数を数えると定められている。このような検査対象には、例えば、清涼飲料水、氷菓、食鳥卵、飲用乳、乳製品などがある。
上述した事業者等は、このような公定法に基づく検査と併せて、より早期に食品の安全性を確認するため自主的に検査を行っている。かかる自主検査において使用されるコロニー計数装置は、カメラで培地を撮影し、撮影画像から肉眼では確認できない程度の微小なコロニーを、画像処理プログラムや画像認識プログラム等をコンピュータに実行させることで検出する。これにより、24時間または48時間といった長期の培養期間を要することなくコロニー計数を迅速に行うことを可能とする。このようなコロニー計数装置として、例えば、特許文献1に記載の技術がある。
特許文献1に記載の技術は、白色光を培地に照射し、培地を透過した光による像からコロニーを識別してコロニー計数を行うものである。より具体的には、培地においてコロニーが生じている部分と生じていない部分とで照射した白色光の透過量に差異が生じ、撮影された画像においてはその差異が濃淡として表れる。そして、その濃淡が表れた画像に対して二値化処理やグレースケール処理を施して濃い部分をコロニーとして抽出しコロニー計数を行う。このように撮影画像に画像処理を施してコロニー計数を行うことにより、従来の目視によるコロニー計数と比較して迅速化が図られている。
ところで、これまでのコロニー計数は、図12に示すように培養開始から12時間後、18時間後、24時間後などの所定の経過時間の到来の度に、培養装置から培地を取り出して特許文献1に記載されているようなコロニー計数装置にセットして、培地の撮影を行うことでコロニー計数を行っていた。このようなコロニー計数は離散的な観察といえる。
一方、培地におけるコロニーの成長は、図示するように時間経過とともに連続的に進む。この図における横軸は培養開始時からの経過時間を示し、縦軸は培地を撮影した画像から取得する濃淡のコントラストを示す。濃淡のコントラストは、画像中の黒っぽい部分と白っぽい部分との明度の差である。上述の通り、コロニーを識別しカウントするためには所定の濃淡のコントラストが生じていなければならない。例えば、図においては18時間経過の段階ではカウント可能な程のコントラストは生じていない。
ここで、従来のコロニー計数のように培養開始から6時間間隔でコロニー計数を行っていた場合、コロニーのカウントが初めてなされるのは18時間経過の段階となる。しかし、実際にコロニーのカウントが可能となるのは、それ以前の13時間経過後辺りからである。すなわち、最先でカウント可能な時から約5時間後に観察を行うことになり、無為に時間を過ごしたといえる。このように、従来のような離散的な観察では、カウント可能となる時と実際に観察を行う時とで隔たりが生じ、その隔たりが早期のコロニー計数を妨げることになる。
この問題に対して、観察の間隔を縮めるという考え方も存在する。しかしながら、離散的であることに変わらないため根本的にこの問題を解決することにはならない。また、観察の間隔を縮めるということは、培地を培養装置から頻繁に出し入れすることを意味し、培養条件に変動を生じさせるため、なるべく一定の条件で行うことが好ましい培養にとって好ましくない。したがって、コロニー計数を早期に行うための問題は解決されているとは言えない。
上記問題を解決するために、本発明者は、暗環境で培養を行うための培養室内に培地を設置するとともに、暗環境下の培養室内でも濃淡のコントラストが明瞭な画像を取得しやすくするために、可視光よりも培地とコロニーの吸光度の差異が大きく、散乱しにくいという性質の赤外光を照射して画像を取得することに思い至った。本発明は、このように培養しながら観察を行い得るように構成することで早期にコロニー計数を可能とする。
すなわち、観察対象を保持するための観察対象保持部と、暗環境下で観察対象保持部に保持された観察対象の中の菌の培養を行うための暗環境培養室と、暗環境培養室内に納められる観察対象保持部に保持された観察対象を赤外光で照射する赤外光源と、赤外光源により赤外光を照射される観察対象の像を撮影する赤外光カメラと、を有する暗環境同時観察培養装置を提供する。
また、上記の構成を備え、赤外光カメラが観察対象を複数回にわたり継続して撮影するための複数撮影制御を行う制御部をさらに有する暗環境同時観察培養装置を提供する。
また、上記の構成を備え、赤外光源は、近赤外光を照射する暗環境同時観察培養装置を提供する。また、上記の構成を備え、赤外光源には赤外光の所定の波長帯を遮るフィルターが備わる暗環境同時観察培養装置を提供する。また、上記の構成を備え、赤外光カメラには赤外光の所定の波長帯を遮るフィルターが備わる暗環境同時観察培養装置を提供する。
また、上記の構成を備え、赤外光カメラは、暗環境培養室内の天井側に下方に向けて配置され、赤外光源は、暗環境培養室内の床側に上方に向けて配置され、観察対象保持部は、赤外光カメラと赤外光源との間に配置される暗環境同時観察培養装置を提供する。
また、上記の構成を備え、観察対象の菌はメンブレンフィルタに配置されている暗環境同時観察培養装置を提供する。また、上記の構成を備え、前記観察対象として培地と菌源とを混釈することでなる深方向分布菌源培地とする暗環境同時観察培養装置を提供する。
上記いずれかの暗環境同時観察培養装置を用いた観察培養方法であって、暗環境培養室内に暗環境下で菌の培養を行うために培地に菌源を付加した観察対象を設置する観察対象設置ステップと、暗環境培養室内に納められた観察対象に前記赤外光源により赤外光を照射する赤外光照射ステップと、前記赤外光カメラにより赤外光源により赤外光を照射されている状態で観察対象を撮影する撮影ステップと、を有する暗環境同時観察培養装置を用いた観察培養方法を提供する。
また、上記のステップを有し、前記撮影ステップは、赤外光カメラが観察対象を複数回にわたり継続して撮影するための複数撮影制御を行う制御サブステップをさらに有する観察培養方法を提供する。また、上記のステップを有し、前記観察対象設置ステップは、培地原材料と菌源とを混釈して深方向分布菌源培地を製造する深方向分布菌源培地製造サブステップを有する観察培養方法を提供する。
本発明により、培養しながら観察を行うことで、より早期にコロニー計数を行うことを可能とすることができる。
以下、本発明の実施の形態について、添付図面を用いて説明する。なお、本発明は、これら実施形態に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
実施形態1は、主に請求項1、3から8などに関する。実施形態2は、主に請求項2、10などに関する。実施形態3は、主に請求項1から11に関する。実施形態4は、主に請求項9から11に関する。
<実施形態1>
<実施形態1 概要>
<実施形態1>
<実施形態1 概要>
本実施形態に係る暗環境同時観察培養装置は、検査対象に含まれる菌の培養を暗環境培養室で行いつつ、培養過程において観察対象の像を撮影するための赤外光源と赤外光カメラとを暗環境培養室に備えることに特徴を有する。
菌の培養に好適な暗環境室内にて赤外光を照射した像を撮影することができるため、培養しつつそれらの撮影画像に基づくコロニー計数のための観測をすることができるとともに、赤外光を照射して撮影することで可視光を照射する場合に対してより分解能に優れる撮影画像を取得することができ、早期のコロニー計数を可能とすることに寄与する。
上述したように赤外光は、可視光と比較して培地とコロニーの吸光度の差異が大きい。とくに牛乳を混釈した培地や血液培地やチョコレート培地などのように透明度の低い培地を用いた場合には、可視光は培地とコロニーの吸光度が同程度に高いが、赤外光においては両者の吸光度に差異が生じる。したがって、赤外光を照射した場合の方が可視光を照射した場合よりも、培地とコロニーとによる濃淡のコントラストを画像として取得しやすいという利点がある。
また、赤外光は白色光などの可視光に対して散乱しにくい性質を有する。したがって、赤外光を照射して撮影された画像の方が、コロニーが存在する部分と存在しない部分との境界が明瞭になる。したがって、可視光の照射により撮影された画像ではひとまとまりのコロニーとしてしか識別できないほどに微小なコロニーが密集している場合においても、赤外光により撮影した画像においてはそれらの個々の微小なコロニーを別個に識別し得る。すなわち、赤外光を照射した場合の方が、分解能に優れる画像を撮影することが可能となり、コロニーの抽出をより高精細に行うことができ、それにより早期にコロニー計数を行うことが可能となる。
<実施形態1 構成>
<実施形態1 構成>
図1は、本実施形態の暗環境同時観察培養装置の各構成を示す概念図である。図示するように、「暗環境同時観察培養装置」(0100)は、「暗環境培養室」(0101)と、「赤外光源」(0102)と、「赤外光カメラ」(0103)と、を有する。そして、赤外光カメラと赤外光源との間に「観察対象」(0104)を保持するための「観察対象保持部」(0105)がある。図中には、赤外光カメラにより撮影された観察対象の像からコロニーの識別し計数等を行うための「コンピュータ」(0106)や、撮影した画像やコロニー計数結果などを出力するための「ディスプレイ」(0107)も示されている。なお、図中の矢印は、実線の矢印は観察対象に照射される赤外光を表わし、破線の矢印は観察対象を透過した赤外光を表わすものである。
「観察対象保持部」(0105)は、観察対象を保持する。観察対象は、衛生検査等の検査対象となる一般生菌や大腸菌群などの細菌や真菌などとそれらに生育環境を付与するための培地を収めたシャーレ等の容器である。また、メンブレンフィルタ等を用いる場合にはそれらも観察対象となる。図中においては試料を混釈した培地を収めた「シャーレ」(0106)が観察対象となる。観察対象を保持する具体的態様は種々あり、例えば、シャーレを所定の位置に載置するためのプレートや、シャーレの両側方から挟持するための冶具などがある。観察対象となる容器や培養の態様、撮影の態様などに応じて観察対象保持部は適宜選択し得る。
「暗環境培養室」(0101)は、暗環境下で観察対象の中の菌の培養を行うための室である。培養に適した室であって、閉じた際に室内が暗環境となるものである限り特段の限定を付さない。例えば、インキュベータなどを暗環境培養室として用いることができる。また、暗環境とすることは、赤外光を照射して観察対象を撮影する際に、可視光の影響を受けることを防止する意味もある。また、食品等の製品を保管する環境は暗環境であることが多いため、暗環境下で培養する製品が実際に置かれる環境を想定した衛生検査を行うことができる。
また、培養のための培地や培養方法については、菌や検査の目的に応じて適宜選択し得る。培養方法は大きく混釈培養法と平板塗抹培養法とがある。混釈培養法は、培地と菌源とを混釈して調製した培地を培養する方法である。具体的には加熱して溶解させた寒天培地などと試料とを混ぜ合わせてシャーレなどの容器に納めた後に温度低下に伴い凝固させた培地を培養する。このように調製された培地を、本明細書においては「深方向分布菌源培地」と呼ぶ。
平板塗抹培養法は、溶解した寒天培地をシャーレなどの容器に納め凝固した後に、その培地表面上に試料を塗抹して接種する方法である。平板塗抹培養法では培地の表面上にコロニーが形成することから、その形状等を詳細に観察することができる。しかし、培地表面上にしか接種することができないため、接種試料量が少なく検出限界が低くなってしまう。
これに対し、混釈培養法では培地中に試料を接種することができるため接種試料量が多く、検出限界が高い。したがって、一般生菌数の測定や大腸菌群の測定のように試料中の菌数が少ない場合における菌検出に有利である。ただし、コロニーが培地中で形成するため、その検出は平板塗抹培養法の場合より難しいといえる。
また、メンブレンフィルタを用いて培養してもよい。メンブレンフィルタは、0.2~数μm程度の微粒子又は微生物を濾過によって分離するために用いられ、一体的かつ連続的な孔を有する多孔質体の膜である。その素材としては、セルロース、PVDF(PolyVinylidene DiFluoride:ポリフッ化ビニリデン)、PTFE(Polytetrafluoroethylene:ポリテトラフルオロエチレン)、ポリエチレン、ナイロンなどが用いられる。
メンブレンフィルタによる培養は、食品衛生検査においては清涼飲料水の検査などに用いられ、清涼飲料水をメンブレンフィルタにより濾過し、濾過後のメンブレンフィルタをシャーレ内で凝固させた目的に応じた寒天培地の表面に貼付して培養する。この方法は試料量が多く菌数が少ないと予想される場合に好適である。メンブレンフィルタ上に形成されるコロニーの検出は、従来はメンブレンフィルタを可視光が透過しにくいため専ら反射光により撮影された像に基づいて行っていたが、本実施形態における赤外光はメンブレンフィルタを透過するため透過光により撮影された像に基づいて行うことが可能となる。
また、培地及び培養方法の選択は、例えば、一般生菌数の検査においては混釈培養法により標準寒天培地を培養し、大腸菌群の検査においては混釈培養法によりデソキシコレート寒天培地で培養し、黄色ブドウ球菌の検査においては試料を塗抹した卵黄加マンニット食塩寒天培地を培養するといった具合である。
「赤外光源」(0102)は、暗環境培養室内に納められる観察対象を赤外光で照射するために備わる。赤外光源は、概ね波長0.7μm~波長1000μmの範囲の光である赤外光を発する光源である。赤外光源の形態は、観察対象の全領域を像として撮影し得る観点から、観察対象の照射対象面積より広い面積を有する面発光型であることが好ましい。具体例としては、赤外光を発するLEDなどの複数の発光素子を格子状や同心円状に配列するとともに拡散板を備える赤外光源が挙げられる。なお、観察対象の照射対象面積とは、例えば、観察対象が円筒形状のシャーレである場合には、そのシャーレの底面積をいう。
また、赤外光源は、近赤外光を照射するものであることが好ましく、さらに言えば概ね波長0.7μm~波長1μmの範囲の近赤外光を照射するものであることが好ましい。図2は、近赤外光の波長領域を他の電磁波の波長領域とともに示す概念図である。近赤外光よりも波長の短い可視光(波長0.4μm~波長0.7μm)においては培地とコロニーの吸光度が同程度となってしまい、1μmよりも長い波長では水による吸光度が大きくなり、水を多く含む培地の吸光量が増加しコロニーの吸光量との差異が小さくなってしまうからである。
また、赤外光源が発する光の波長領域を所望の領域範囲とするためには、その所望の範囲の波長の赤外光を発するように設計されている発光素子を備える赤外光源を用いてもよいし、発光素子の発する波長領域が所望の領域範囲を超える場合には、所定の超過領域の波長帯を吸収又は反射などにより遮るためのフィルターを備える赤外光源を用いてもよい。
なお、赤外光源により照射される赤外光は専ら撮影のためのものであるので、常時赤外光を照射しなくてもよい。例えば、赤外光カメラが観察対象を撮影するために必要なときなどの適時に赤外光を照射するよう赤外光源を制御するように構成してよい。
「赤外光カメラ」(0103)は、赤外光源により赤外光を照射される観察対象の像を撮影する。「像」とは、被写体を透過した光を受光することで得られる画像をいう。また、撮影された画像に対してコロニー識別のための画像処理等を行うためデジタル式の赤外光カメラを用いる。
赤外光カメラは、赤外光の波長領域において受光感度を有するフォトダイオードを用いた撮像素子(CCD、CMOSなど)を備えるカメラであればよい。所望の波長領域において良好な受光感度を有する赤外光カメラは種々製品化されており、例えば、「ARTCAM-1000MI-WOM-OP(株式会社アートレイ)」や「C11440-52U(浜松ホトニクス株式会社)」などがある。なお、高精細に撮影することが望ましいので、赤外光カメラの有効画素数は1000万以上であることが好ましい。
また、赤外光カメラには赤外光の所定の波長帯を遮るフィルターを備えてもよい。例えば、観察対象の撮影に好適な波長0.7μm~波長1μmの範囲外の赤外光を遮るフィルターや可視光領域の波長を遮るフィルターを備えていてもよい。
ここで、赤外光カメラ、赤外光源、観察対象のそれぞれの配置について説明する。まず、本実施形態の暗環境同時観察培養装置は赤外光を照射された観察対象の像を撮影するものであるので、赤外光の照射方向と赤外光カメラの撮影方向とが向き合うように赤外光源と赤外光カメラとが配置され、赤外光源と赤外光カメラとの間に観察対象が位置することが好ましい。
図1においては、暗環境培養室内の天井部分に赤外光カメラが下方を向くように設置され、赤外光源は暗環境室内の床部分に照射光が上方を向くように設置される。そして、観察対象となるシャーレは赤外光源の上に設置されている。このような配置は赤外光カメラの設置位置を優先した結果である。すなわち赤外光カメラは基本的に下方を向くように配置されることが好ましいからである。赤外光カメラのレンズが上方を向いていると、暗環境培養室内に存在する塵などがレンズ面に落下し付着してしまう場合があり、付着した塵などが撮影画像のノイズとなり適正な撮影の妨げとなるからである。
また、図1において、シャーレはシャーレの蓋が上に位置する姿勢で設置されている。これは、平板塗抹培養法により培養する場合に、その塗抹された試料が存在する培地表面が赤外光カメラに向くように配置する方がコントラストの良好な画像を撮影することができるからである。
また、図1に示したシャーレの姿勢を上下逆転させた姿勢にて設置するようにしてもよい。図3は、そのような場合における観察対象の設置態様を示す概念図である。図示の趣旨より案環境培養室外の図示を省略する。図示するように、「暗環境培養室内」(0301)の天井部分に「赤外光カメラ」(0302)が下方を向くように設置され、「赤外光源」(0303)は床部分に照射光が上方を向くように設置される。そして、観察対象となる「シャーレ」(0304)は、蓋が下に位置するように「観察対象保持部」(0305)に設置されている。
寒天培地などの固形培地を用いて培養を行う場合に、混釈または塗抹のいずれの方法においても、溶解した寒天培地が凝固するまでは蓋が上になる姿勢でシャーレは静置される。そして、寒天培地が凝固した後に上下を反転させ蓋が下方に位置する姿勢にして培養室等に納めることが一般的に行われている。蓋が上に位置した姿勢で培養をした場合、培地から蒸発した水分が蓋の表面で凝集し滴となって培地の表面に落ちることがある。このような事態は、培地表面での培養条件に変化が生じたり、培地の撮影の障害となるなど、コロニー計数を適正に行ううえでの妨げとなる。そこで、上述したように蓋が下に位置するようシャーレを設置する。
本実施形態の暗環境同時観察培養装置においては、培養しつつ観察対象を撮影することでコロニー観察を行うものである。したがって、観察対象の培養に好適な姿勢でシャーレを設置し、その姿勢のままで観察対象を適性に撮影し得るように構成することが好ましく、混釈して観察対象を調製する場合には、上述したようにシャーレの蓋が下に位置するよう設置するとともに、シャーレの底を撮影し得るよう赤外光カメラを設置することが好ましい。
また、試料を培地の表面に塗布して培養する場合、培養に好適なシャーレの姿勢は上述した理由により蓋が下に位置する姿勢である。この姿勢において、試料を塗抹した培地表面を撮影するためにはシャーレの蓋側に赤外光カメラを設置する必要がある。図4は、観察対象が平板塗抹法による培地を収めたシャーレである場合の各構成の位置関係を示す概念図である。図示するように、「暗環境培養室内」(0401)の天井部分に「赤外光源」(0402)が下に向けて赤外光が照射されるように設置され、「赤外光カメラ」(0403)は床部分に上方を向くように設置される。そして、「シャーレ」(0404)は、蓋が下に位置するように「冶具」(0405)に設置されている。
このように各構成を配置する場合には、赤外光カメラのレンズを開閉自在に覆う「カバー」(0406)などを設け、撮影の際にのみカバーが開くように構成することが好ましい。レンズが上方を向いてむき出しのままであると、暗環境培養室内に存在する塵などがレンズ面に落下し付着してしまう場合がある。付着した塵等は撮影画像のノイズとなり適正な撮影の妨げとなるため、かかる事態を防止するためにレンズを覆うカバーを設けることが好ましい。
以上のように構成される本実施形態の暗環境同時観察培養装置により撮影された培地の画像の例を、従来技術における画像とともに図5に示す。図5は、本実施形態における観察対象の撮影画像(a)と、可視光による像を一般的なカメラで撮影した画像(b)とを示すものである。
また、図6に、図5(a)の画像を撮影した装置の写真を示す。撮影は示されている装置全体を可視光が侵入しないようにカバーをして行った。この装置において、「赤外光カメラ」(0601)は、「ARTCAM-1000MI-WOM-OP(株式会社アートレイ)」を用い、レンズには「TS VIS-NIRコンパクト固定焦点レンズ16MM(エドモンドオプティクスジャパン株式会社)」を用いた。また、近赤外光波長領域である875mnより短い波長をカットする「フィルター」(0602)は、「0D4ロングパスフィルター875NM(エドモンドオプティクスジャパン株式会社)を用いた。また、「赤外光源」(0603)の発光素子となるLEDは「SHF-487 880NM(OSRAM Opto Semiconductors)」を用いた。そして、「観察対象」(0604)は、一般生菌数検査を想定し、牛乳を混釈して調製した寒天培地を用いた。
一方、図5(b)は、図5(a)と同じ培地を、上述の赤外光カメラと同一解像度の1000万画素カメラを用い、650nmより長い波長をカットするフィルターを用い、白色LEDを光源として撮影した画像である。
図示する通り、図5(a)における画像では菌影と培地とのコントラストが明瞭であり、菌影の輪郭もはっきりと写されている。一方、図5(b)における画像では菌影が薄くコントラストが不明瞭であり、菌影の輪郭もはっきりと写されていない。したがって、図5(b)における画像では、更に菌の成長を待ち、陰影がより大きくならなければ検出ができず、結果的に検出が遅くなってしまう。
以上の結果の通り、平板塗抹培養法の場合と比較してコロニー検出が難しい混釈培養法により調製した培地である深方向分布菌源培地を対象とした場合であっても、コロニーの存否を示す濃淡が明瞭に写されていることが分かる。したがって、本実施形態の暗環境同時観察培養装置は、透過率が高く散乱しにくい赤外光を照射して撮影することにより、とくに混釈培養法やメンブレンフィルタ法によるコロニー検出対象を高精細に行うために好適であるといえる。
<実施形態1 効果>
<実施形態1 効果>
本実施形態の暗環境同時観察培養装置により、培養とその撮影を一の装置内で行うことができるとともに、赤外光により分解能に優れる画像を撮影することができ早期にコロニー計数を行うことが可能となる。
<実施形態2>
<実施形態2 概要>
<実施形態2>
<実施形態2 概要>
本実施形態は、実施形態1の暗環境同時観察培養装置において、赤外光カメラにより撮影態様を制御する制御部を備えることを特徴とする。これにより、種々なる態様で観察対象を観察することが可能となる。
<実施形態2 構成>
<実施形態2 構成>
図7は、本実施形態の暗環境同時観察培養装置の各構成を示す概念図である。図示するように、「暗環境同時観察培養装置」(0700)は、「暗環境培養室」(0701)と、「赤外光源」(0702)と、「赤外光カメラ」(0703)と、「観察対象」(0704)を保持するための「観察対象保持部」(0705)と、「制御部」(0706)と、を有する。本図において制御部を具現する一例として「コンピュータ」を示した。また、コンピュータには撮影した画像やコロニー計数結果などを出力するための「ディスプレイ」(0707)を接続してもよい。制御部のほかの各構成については実施形態1における各構成と同様であるので、ここでの説明は省略する。
「制御部」(0706)は、赤外光カメラが観察対象を複数回にわたり継続して撮影するための複数撮影制御又は/及び観察対象を継続的に動画撮影するための動画撮影制御を行う機能を果たす。
複数撮影制御の具体的な態様は、例えば、培養開始の際に初回の静止画の撮影を行い、その後30分間隔で48時間にわたり継続して静止画を撮影するように制御する。また、培養の始期の段階における撮影間隔を相対的に長時間とし、始期以降の段階における撮影間隔を相対的に短時間とするように制御してもよい。例えば、培養開始から6時間までを始期としその間の撮影間隔を120分とし、培養開始から6時間経過後については撮影間隔を30分とするといった具合である。これは、菌が***を始めるまでに相応の時間がかかるとともに、一旦***が始まると次々に再***が生じるからである。
また、観察対象が混釈培養法による培地を収めた容器である場合には、赤外光カメラの焦点を変えながら撮影するように制御してもよい。例えば、容器に収められた培地の深さが5mmである場合に、培地表面に焦点を合わせて撮影を行ってから焦点をさらに1mmずつ培地の深さ方向に変えながら都度撮影を行い計5枚の画像を取得する。このように取得した各画像についてコロニー計数を行うことにより培地の深さ方向にも散在するコロニーを検出することができる。また、焦点をずらしながら撮影する代わりに、観察対象保持部の位置を変動自在に構成することで、観察対象と赤外光カメラとの距離を変化させながら都度撮影するようにしてもよい。
また、制御部は、赤外光カメラによる撮影に不可欠な赤外光源による赤外光照射の制御を併せて行うように構成してもよい。例えば、赤外光カメラが観察対象を撮影するために必要なときなどの適時に赤外光を照射するよう赤外光源を制御するように構成してよい。
制御部は、例えば、ハードウェア、ソフトウェア、ハードウェアとソフトウェアの両方のいずれかによって構成される。例えば、これらを実現する一例として、コンピュータを利用する場合には、CPU、バス、メモリ、インタフェース、周辺装置などで構成されるハードウェアと、それらハードウェア上で実行可能なソフトウェアがある。ソフトウェアとしては、メモリ上に展開されたプログラムを順次実行することで、メモリ上のデータや、インタフェースを介して入力されるデータの加工、保存、出力などにより各部の機能が実現される。
図8は制御部の具体的なハードウェア構成を示す図である。図示するように、「制御部」(0800)は、各種演算処理を実行するための「CPU」(0801)、各種演算処理を行なうプログラムをCPUに実行させるために読み出すとともにそのプログラムのワーク領域を提供する「主メモリ」(0802)、赤外光カメラを制御するためのプログラムや制御の条件である撮影間隔や撮影スケジュールなどの情報等を記憶する「記憶装置」(0803)、「赤外光カメラ」(0806)との信号の授受をするための「I/O」(0804)などを備え、それらがシステムバス(0805)などのデータ通信経路によって相互に接続され情報の送受信や処理を行う。なお、制御部により赤外光源の照射の制御を行う場合には、赤外光カメラと同様にI/Oを介して信号の授受等を行う。
制御部における処理を、複数撮影制御を行う場合を例として示す。例えば、まずCPUは、記憶装置に格納されている複数撮影制御のためのプログラムを主メモリのワーク領域に展開し、これを実行し記憶装置に格納される撮像間隔を読み出す。そして、読み出した値に応じて赤外光カメラに撮像させるための信号をI/Oを介して赤外光カメラに出力する処理を行う。
また、制御部が赤外光源の照射の制御を行う場合には、CPUは、記憶装置に格納されている赤外光源の制御のためのプログラムを主メモリのワーク領域に展開し、これを実行し記憶装置に格納される照射間隔や照射時間を読み出す。そして、読み出した値に応じて赤外光源に撮像させるための信号をI/Oを介して赤外光源に出力する処理を行う。
また、本実施形態の暗環境同時観察培養装置は、赤外線カメラにより撮影された画像に基づきコロニー計数をするためのコロニー計数部を有していてもよい。図9は、コロニー検出部の一例を示す概念図である。図示するように、「コロニー検出部」(0901)は、「フィルタ手段」(0902)と、「減算手段」(0903)と、「階調値設定手段」(0904)と、「抽出画像取得手段」(0905)と、「判定手段」(0906)と、「計数手段」(0907)と、を有する。コロニー計数部は、上記のハードウェア構成などにより実現され得る。
「フィルタ手段」(0902)は、赤外光カメラにより撮影されたデジタル画像をグレースケール化してローパスフィルタを適用し培地の濁りなどの部分的な濃淡を除去する。「減算手段」(0903)は、上述のグレースケール画像から、フィルタ手段により部分的な濃淡が除去された画像を差し引き、オフセット値を差し引いた画像を得る。
「階調値設定手段」(0904)は、減算手段で得た画像の最大の階調値と最小の階調値との間に所定間隔で複数の階調値を設定する。「抽出画像取得手段」(0905)は、減算手段で得られた画像から階調値設定手段で設定された各階調値より濃い画素のみを抽出して、各階調値に対応する二値化された複数の抽出画像を得る。
「判定手段」(0906)は、抽出画像取得手段により得られた各抽出画像から、対応する階調値より濃く円形状の領域以外を除去し、さらに中心部分が濃くその周囲に向けて段階的に薄くなっている領域をコロニーと判定する。「計数手段」(0907)は、判定されたコロニーの計数を行う。コロニーの計数は、例えば、観察対象を撮影するたびに行ってもよいし、撮影のタイミングとは異なるタイミングで行ってもよい。
また、計数手段による計数結果に基づき種々の処理を行う手段をさらに有していてもよい。例えば、予め設定された所定の計数値を閾値とし、計数手段による計数結果がその閾値を超えた場合に音声又は画像などによりアラームを出力する手段を有してもよい。あるいは、培養開始から時間の経過に伴う計数結果の推移をグラフ等で視覚的に表示する手段を有してもよい。
また、コロニー計数についての諸情報、例えば、試料、培地、培養条件、計数結果、計数結果の推移などの情報を蓄積してデータベースとするための手段を有してもよい。そして、このデータベースを参照した処理を行う手段を有してもよい。例えば、現に計数結果の推移を記録しながら、データベースに蓄積されている同じ観察対象の計数結果の推移と比較し差分を算出する手段を有してもよい。あるいは、試料を含まない培地のみのコントロールとの差分を算出する手段を有してもよい。そして、上述の算出された差分が所定の閾値を超えた場合には、何らかのアラームを出力するための手段を有してもよい。
また、データベースに蓄積されている情報を参照して観察対象に含まれる菌源を供した試料について、培養開始から24時間または48時間経過後のコロニー数を推定する手段を有してもよい。この手段により推定された24時間または48時間経過後のコロニー数が許容される値以下である場合には、その試料を供した食品等の安全基準を満たすものとし、直ちに流通経路に乗せ販売店等へ出荷する。そして、培養開始から48時間経過後に実際の観察対象から計数されたコロニー数が許容される値以下であることを確認したうえで、出荷された食品等を店頭に出す。このようにコロニー数を推定することで、現に48時間経過後にコロニー計数をして安全性の確認を行ってから流通経路に乗せる場合に比較して食品等を速やかに店頭に出すことができる。すなわち、より鮮度の高い食品等を市場に提供できるという利益を生じさせることができる。
また、データベースに蓄積されている情報を参照して観察対象に含まれる菌源を供した試料についての消費期限又は賞味期限を算出する手段を有してもよい。例えば、生肉の消費において許容される菌数を上回るまでの時間をデータベースに蓄積されている情報に基づき算出する。そして、算出された時間と培養を開始した時とから試料となった生肉の消費期限を算出するといった具合である。
<実施形態2 効果>
<実施形態2 効果>
本実施形態の暗環境同時観察培養装置により、観察対象や培養方法などに応じて適切な撮影をすることができる。
<実施形態3>
<実施形態3 概要>
<実施形態3>
<実施形態3 概要>
本実施形態において、実施形態1又は2を基本とし、赤外光カメラと観察対象とが多対多の関係にある暗環境同時観察培養装置を示す。
<実施形態3 構成>
<実施形態3 構成>
これまで赤外光カメラと観察対象とが一対一の関係にある場合について説明を行ってきたが、本実施形態の暗環境同時観察培養装置は、赤外光カメラと観察対象とが多対多の関係にある場合にも適用し得る。例えば、暗環境培養室内に複数のシャーレを載置したトレーを多段収納し得るラックを設け、一のトレーに載置されるシャーレと同数の赤外光カメラをロボットアームに取り付けて、ロボットアームにより赤外光カメラを各トレーへ搬送して撮影するように構成してもよい。また、赤外光カメラと赤外光源は固定し、シャーレを載置したトレーを順次撮影場所へ搬送して撮影するように構成することもできる。
図10は、トレーを順次搬送しながら撮影する構成とした場合を示す概念図である。なお、本図は暗環境培養室内の様子を概念化したものであり、主に赤外光カメラと赤外光源と観察対象とを示す。
図示するように、1枚の「トレー」(1001)には観察対象となる「シャーレ」(1002)が3つ載置されている。そして計18枚のシャーレは、図中の太線で示される環状の「ガイドレール」(1003)に沿って一定の姿勢を保ちつつ点線矢印で示される方向に周回するように構成される。このように構成するためには、モータなどの動力、動力をガイドレールに沿って各プレートに伝達するためのベルトやチェーンなどの伝達手段、動力を制御するためにコンピュータなどで構成される動力制御手段、などを協働させることで実現される。また、ガイドレールに代えて回転ドラムに複数のトレーを一定姿勢にて取付けて、ドラムの回転によりトレーを搬送するように構成してもよい。
後述するように、赤外光カメラによる撮影を制御することと、撮影される予定のトレーを所定の撮影場所へ搬送するための制御とは密接に関連する。そのため、制御部がトレー搬送の制御をも行うように構成してもよい。
そして、ガイドレールの下端に搬送された「トレー」(1004)に載置されているすべてのシャーレを撮影するための「赤外光カメラ」(1005)と「赤外光源」(1006)とが、撮影に好適な位置に設置されている。なお、シャーレを載置しない状態での「トレー」(1007)は、シャーレ載置予定箇所が開口しているため、赤外光はシャーレの底面に照射される。
ここで、制御部が観察対象の撮影間隔を45分とした場合には、一のトレーが45分毎に撮影場所に搬送されるように動力を制御すればよい。具体的には、動力制御手段は、各トレーが2.5分間隔で順次撮影場所に搬送されるように動力を制御すればよい。そして、制御部は、動力制御手段による制御に応じて2.5分間隔で搬送されるトレーを撮影するように赤外光カメラを制御すればよい。
<実施形態3 効果>
<実施形態3 効果>
本実施形態の暗環境同時観察培養装置により、複数の観察対象の培養と観察とを効率よく行うことができ、コロニー計数における省力化をより一層図ることが可能となる。
<実施形態4>
<実施形態4 概要>
<実施形態4>
<実施形態4 概要>
本実施形態は、実施形態1から3のいずれかの暗環境同時培養装置を用いた観察培養方法に関するものである。
<実施形態4 構成>
<実施形態4 構成>
図10は、本実施形態の観察培養方法の一例を示すフロー図である。図示するように、本実施形態の観察培養方法は、「観察対象設置ステップ」(S1101)と、「赤外光照射ステップ」(S1102)と、「撮影ステップ」(S1103)とを有する。
「観察対象設置ステップ」(S1101)は、暗環境同時観察培養装置の暗環境培養室内に暗環境下で菌の培養を行うために培地に菌源を付加した観察対象を設置する。例えば、平板塗抹培養法により培養を行う場合には、シャーレなどに溶解した寒天培地等を注いだ後凝固した培地表面上に試料を塗抹して菌源を付加する。そしてシャーレなどを暗環境培養室内に設置する。
「赤外光照射ステップ」(S0902)は、暗環境培養室内に納められた観察対象に前記赤外光源により赤外光を照射する。また、赤外光カメラが観察対象を撮影するために必要なときなどの適時に赤外光を照射してもよい。適時に照射するためには、例えば、実施形態2で示したハードウェア構成等に基づき、CPUが記憶装置に格納されている赤外光源の制御のためのプログラムを実行するなどして行われる。
「撮影ステップ」(S0903)は、前記赤外光カメラにより赤外光源により赤外光を照射されている状態で観察対象を撮影する。また、実施形態2又は3の暗環境同時観察培養装置を用いる場合には、撮影ステップは、赤外光カメラが観察対象を複数回にわたり継続して撮影するための複数撮影制御又は/及び観察対象を継続的に動画撮影するための動画撮影制御を行う制御サブステップをさらに有していても良い。例えば、複数撮影制御を場合には、培養開始の際に初回の撮影を行い、その後11分間隔で48時間にわたり継続して撮影する。このように撮影を制御するためには、例えば、実施形態2で示したハードウェア構成等に基づき、CPUが記憶装置に格納されている赤外光カメラの撮影を制御するためのプログラムを実行するなどして行われる。
上記各ステップを経て撮影された画像は、目視による観察に供されたり、コロニー計数のための画像処理プログラムやコロニー計数プログラムなどの実行に供される。なお、コロニー計数のための各種プログラムやそれらの実行処理等を行うための装置等については、実施形態2における各構成や既知の技術によって実現することができる。
また、観察対象設置ステップは、培地原材料と菌源とを混釈して深方向分布菌源培地を製造する深方向分布菌源培地製造サブステップを有していてもよい。すなわち、混釈培養法により培養を行う場合には溶解した寒天培地等と菌源となる試料とを混ぜ合わせたうえで凝固させる。そのようにして製造した深方向分布菌源培地を収めたシャーレなどの容器を暗環境培養室内に設置する。
<実施形態4 効果>
<実施形態4 効果>
本実施形態の培養方法により、培養とその撮影を一の装置内で行うことができるとともに、赤外光により分解能に優れる画像を撮影することができ早期にコロニー計数を行うことが可能となる。
0100 暗環境同時観察培養装置
0101 暗環境培養室
0102 赤外光源
0103 赤外光カメラ
0104 観察対象
0105 観察対象保持部
0106 コンピュータ
0107 ディスプレイ
0101 暗環境培養室
0102 赤外光源
0103 赤外光カメラ
0104 観察対象
0105 観察対象保持部
0106 コンピュータ
0107 ディスプレイ
Claims (11)
- 観察対象を保持するための観察対象保持部と、
暗環境下で観察対象保持部に保持された観察対象の中の菌の培養を行うための暗環境培養室と、
暗環境培養室内に納められる観察対象保持部に保持された観察対象を赤外光で照射する赤外光源と、
赤外光源により赤外光を照射される観察対象の像を撮影する赤外光カメラと、
を有する暗環境同時観察培養装置。 - 赤外光カメラが観察対象を複数回にわたり継続して撮影するための複数撮影制御を行う制御部をさらに有する請求項1に記載の暗環境同時観察培養装置。
- 赤外光源は、近赤外光を照射する請求項1又は2に記載の暗環境同時観察培養装置。
- 赤外光源には赤外光の所定の波長帯を遮るフィルターが備わる請求項1から3のいずれか一に記載の暗環境同時観察培養装置。
- 赤外光カメラには赤外光の所定の波長帯を遮るフィルターが備わる請求項1から4のいずれか一に記載の暗環境同時観察培養装置。
- 赤外光カメラは、暗環境培養室内の天井側に下方に向けて配置され、
赤外光源は、暗環境培養室内の床側に上方に向けて配置され、
観察対象保持部は、赤外光カメラと赤外光源との間に配置される請求項1から5のいずれか一に記載の暗環境同時観察培養装置。 - 観察対象の菌はメンブレンフィルタに配置されている請求項6に記載の暗環境同時観察培養装置。
- 前記観察対象として培地と菌源とを混釈することでなる深方向分布菌源培地を含む請求項1から7のいずれか一に記載の暗環境同時観察培養装置。
- 請求項1から8のいずれか一に記載の暗環境同時観察培養装置を用いた観察培養方法であって、
暗環境培養室内に暗環境下で菌の培養を行うために培地に菌源を付加した観察対象を設置する観察対象設置ステップと、
暗環境培養室内に納められた観察対象に前記赤外光源により赤外光を照射する赤外光照射ステップと、
前記赤外光カメラにより赤外光源により赤外光を照射されている状態で観察対象を撮影する撮影ステップと、
を有する暗環境同時観察培養装置を用いた観察培養方法。 - 前記撮影ステップは、赤外光カメラが観察対象を複数回にわたり継続して撮影するための複数撮影制御を行う制御サブステップをさらに有する請求項9に記載の観察培養方法。
- 前記観察対象設置ステップは、培地原材料と菌源とを混釈して深方向分布菌源培地を製造する深方向分布菌源培地製造サブステップを有する請求項9又は10に記載の観察培養方法。
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