WO2016104487A1 - Method for mass production of carotenoids - Google Patents

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carotenoid
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河野　重行
誠和 山▲崎▼
修平 大田
毅 竹下
英明 宮下
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国立大学法人東京大学
国立大学法人京都大学
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    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the species belonging to the order of Trevoxia algae or Yokomida which is obtained by a method further comprising a step of drying the algal bodies collected in the step.
  • the species belonging to the Trevoxia algae is Chlorellales, Prasiolales, or the species belonging to the Watanabe family, (13) to (15), Species belonging to the eye.
  • “Sphaeropleales” is a group to which Chlorophyceae belongs, and has chloroplasts in the cell, similar to Trevoxia algae, and is composed mainly of ⁇ -1, 4 glucan by photosynthesis. Is an algae that can be biosynthesized. In the present specification, algae belonging to the order of Yokomida are often collectively referred to as “Yokomida algae”.
  • Stress application process is a process of applying intense light stress to Trevoxia algae or Yokomiwa algae during culture. The purpose of this step is to activate the carotenoid synthesis pathway of Trevoxia algae or Yokomiwa algae by applying stress, and accumulate a large amount of carotenoids in the algae.
  • the Trevoxia algae used in the present invention corresponds to the Trevoxia algae. Although it may be a species belonging to any order or lineage group, it is preferably a species belonging to the order Chlorella, Pleurotus or Watanabea. Species belonging to the order Chlorella include those belonging to the family Chlorellaceae.
  • the Chlorella family here is a concept that includes the Chlorella-clade group, the Parachlorella-clade group, and the Prototheca-clade group (Takashi Nakata, 2012, supervised by Nobuyoshi Watanabe, Algae Handbook, pp33-37, NTS Inc).
  • Species belonging to the genus Didymogenes such as Didymogenes anomala can produce and accumulate neoxanthin in large quantities in addition to lutein and / or zeaxanthin.
  • algae belonging to the order Chlorella of the Trevoxia algae especially species belonging to the family Chlorellaceae, can also accumulate anthaxanthin.
  • Specific examples of accumulating large amounts of anterraxanthin and its derivatives include, but are not limited to, species belonging to the genus Chlorella such as Chlorella sorokiniana.
  • Trevoxia algae or Yokowa midoro algae can grow and proliferate, so it is desirable to continue culturing during the application of stress.
  • the mutant is an auxotrophic mutant such as a cysteine-requiring mutant
  • prepare a medium that satisfies the auxotrophy by adding 500 ng / mL to 100 ⁇ g / mL of cysteine to the TAP medium.
  • Recovery Step “Recovery step” is a step of recovering the alga bodies of Trevoxia algae or Yokowa algae from the culture solution after the stress application step (S001). The purpose of this step is to recover the algal bodies in the form of a slurry by removing the culture medium and coarse matters from the culture solution.
  • This step reduces the total weight of Trevoxia algae or Yokowa amidrogae that have accumulated a large amount of carotenoids in the cells, and makes handling easier. Moreover, preservability is also increased.
  • the organic solvent used may be a low-polar or non-polar water-immiscible medium, such as an aliphatic or alicyclic hydrocarbon having 6 to 10 carbon atoms such as n-hexane or n-heptane, or benzene.
  • An aromatic hydrocarbon having 6 to 10 carbon atoms is preferable, and hexane or n-heptane is more preferable.
  • Trevoxia algae or Yokowa midoro algae composed of algal bodies after the stress application step (S001) is 150 to 500 hours at a light intensity of 500-2500 ⁇ mol photons / m 2 / s against Trevoxia algae or Yokowa midoro algae in culture It can be obtained by applying intense light stress that irradiates light. Since the specific application method of intense light stress has been described in detail in the first aspect, the description thereof is omitted in this aspect.
  • the Trevoxia algae or Yokowa midoro algae after this step are obtained in a mixed state in the culture solution.
  • Natural colorant is a pigment component derived from a natural product, and is an additive used to add to foods, beverages, cosmetics, pharmaceuticals, etc. and adjust the color tone. Plants, filamentous fungi, bacteria, and insects are known as natural products that serve as raw materials for natural colorants.
  • the natural colorant of the present invention includes a pigment component that is an essential component, and a solvent and / or carrier that is a selective component. Hereinafter, each component will be specifically described.
  • Oils include vegetable oils such as wheat germ oil, apricot oil, olive oil, camellia oil, evening primrose oil, aloe vera oil, rapeseed oil, palm oil, cottonseed oil, soybean oil, corn oil, safflower oil, sesame oil, linseed oil, castor oil Can be mentioned. Ethanol etc. are mentioned as an organic solvent.
  • fillers examples include petrolatum, the sugar and / or calcium phosphate.
  • the dosage form of the natural colorant of the present invention is not particularly limited as long as it is a dosage form suitable for addition and / or mixing to foods and drinks (including feed), cosmetics, pharmaceuticals and the like.
  • Granules, powders, pastes, gels, liquids, suspensions, and the like are preferable as dosage forms because they can be easily added to objects.
  • the antioxidant of the present invention contains a pharmaceutically or food hygiene acceptable solvent as necessary.
  • the specific solvent that can be used in the antioxidant of the present invention may be the same as the solvent in the natural colorant of the third aspect.
  • the dosage form of the antioxidant of the present invention may be appropriately determined according to the intended use.
  • a dosage form suitable for additive mixing may be used.
  • granules, powders, pastes, solutions, suspensions, gels, and the like are preferable because they can be easily added to an object.
  • a dosage form suitable for administration is preferred.
  • Administration methods can be broadly classified into oral administration and parenteral administration, so that dosage forms suitable for each administration method may be used.
  • the antioxidant of the present invention is usually preferably used as an oral administration agent, but is not limited thereto.
  • the antioxidant of the present invention is low as long as there is no danger to the living body, it is used as an additive for food and drink, food for specified health use, cosmetics, or pharmaceuticals with high antioxidant action and safety. can do.
  • “food and beverage” is a term that collectively refers to beverages, foods, and feeds.
  • Beverages include, for example, water (including purified water, mineral water, deep sea water), tea drinks (including green tea, oolong tea, and tea), coffee, coffee drinks, milk (including raw milk and processed milk), milk drinks, Lactic acid bacteria beverages, juices, soft drinks (including carbonated beverages, fruit juice beverages, powdered beverages, sports drinks), jelly beverages, cocoa beverages, brewed sake (including beer, sake, yellow wine, wine, cider), distilled spirits (whiskey) , Brandy, vodka, rum, tequila, shochu, white liquor, gin) and mixed liquor (including liqueur, plum wine, vermouth).
  • Food includes general foods (especially processed foods) and foods for specified health use.
  • the food / beverage product of this aspect is added with the natural colorant of the third aspect or the antioxidant of the fourth aspect during or after the production.
  • the method for producing a food or drink according to this aspect includes other food materials, various nutrients, various vitamins, minerals, amino acids, various fats and oils, and various additives (for example, flavoring ingredients, sweeteners, An acidulant such as an organic acid, a surfactant, a pH adjuster, a stabilizer, an antioxidant, a dye, and a flavor) may be blended and manufactured according to a conventional method.
  • the foodstuff which concerns on this invention can also be manufactured by adding the natural colorant of a 3rd aspect, or the antioxidant of a 4th aspect to the food-drinks after manufacture.
  • the 6th aspect of this invention is cosmetics.
  • the cosmetic of the present invention comprises the natural colorant of the third aspect or the antioxidant of the fourth aspect. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the cosmetics which have a color taste and an antioxidant effect can be provided.
  • the algae to be cultivated are C. mirabilis, C. vulgaris, C. sorokiniana and C. viscose belonging to Trevoxia algae, P. kessleri NIES-2152, P. kessleri PK2 and P. beijerinckii, Lobos. L. lobophora belonging to the genus Phaeropsis, G. emersonii belonging to the genus Graeciella belonging to the order of Yokowa midlo, and M. zofingiensis belonging to the genus Muriera were used. It seed
  • Example 2 Production of carotenoids using yellow algae (1)> (the purpose) The amount of carotenoid in the yellow algae treated by the carotenoid mass production method of the present invention is verified.
  • Table 1 shows the amount of each carotenoid per 1 L of the culture solution calculated from Examples 2 to 4.
  • the calculation of carotenoids by the absorbance method was in accordance with the method described in Wellburn, AR (J. Plant Physiol., 1994, 144, 307-313). There was no significant difference in the tendency of the amount of carotenoids by either the HPLC method or the absorbance method.

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Abstract

　Provided is a method for mass production of carotenoids in a stable manner, using a minute algae which is easily cultured and which proliferates rapidly.　With this method it is possible to store, intracellularly, large quantities of carotenoids, by culturing species belonging to the Sphaeropleales order or the Trebouxiophyceae class, while imparting stress by irradiating same with light having an intensity of 500 to 2500μmol photons/m2/s for 150 to 500 hours.

Description

カロテノイドの大量生産方法Carotenoid mass production method
　本発明は、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を用いてカロテノイドを大量生産する方法、その方法で得られる藻体、及びその藻体を用いた抗酸化剤及び天然着色料に関する。 The present invention relates to a method for mass-producing carotenoids using Trevoxia algae or Yokowa algae, an alga obtained by the method, an antioxidant and a natural colorant using the alga.
　生物の生命活動において、呼吸によって体内に取り込まれた酸素の一部は、エネルギー代謝過程で酸化反応性の高い活性酸素に変化する。活性酸素は、日常的な生体活動の他、紫外線照射、喫煙、激しい運動等でも発生し、細胞を構成する脂質、タンパク質、及び核酸を酸化することが知られている。活性酸素は、適量であれば細菌やウイルス等の体外由来の異物に対する攻撃防御作用を有するが、過剰に発生すると老化、発癌、及び生活習慣病の原因となるなど、生体に対して有害な影響を及ぼす（非特許文献１）。 In the life activity of living organisms, part of the oxygen taken into the body by breathing changes into active oxygen with high oxidation reactivity during the energy metabolism process. It is known that active oxygen is generated not only by daily biological activities but also by ultraviolet irradiation, smoking, intense exercise, and the like, and oxidizes lipids, proteins, and nucleic acids constituting cells. Active oxygen has a protective effect against foreign substances such as bacteria and viruses if it is in an appropriate amount, but if it occurs excessively, it will cause aging, carcinogenesis, and lifestyle-related diseases, etc. (Non-Patent Document 1).
　細胞内で発生した過剰な活性酸素から細胞を防御するために、生物は、自ら生合成した抗酸化酵素により活性酸素を分解し、消去している。抗酸化酵素には、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）、カタラーゼ、及びグルタチオンペルオキシダーゼが知られている（非特許文献２）。また、生物は、スカベンジャーと呼ばれる抗酸化物質を生合成して又は外界から摂取して、活性酸素から細胞を防御している。抗酸化物質は、自身が酸化されることによって活性酸素を消去する抗酸化作用を有する物質である。抗酸化物質には、ビタミンC、ビタミンE、尿酸、コエンザイムQ10、ポリフェノール、カロテノイド等が知られている（非特許文献３）。このうちカロテノイドは、他の抗酸化物質と比較して抗酸化作用が極めて高いことが近年の研究から明らかとなってきた（非特許文献４）。例えば、アスタキサンチン、リコペン等のカロテノイドには、細胞の増殖抑制効果や炎症反応抑制効果等の様々な疾患に対する予防効果や抗体産生促進作用があることが報告されている（非特許文献４）。 In order to protect cells from excessive active oxygen generated in cells, living organisms decompose and eliminate active oxygen by antioxidant enzymes biosynthesized themselves. As the antioxidant enzyme, superoxide dismutase (SOD), catalase, and glutathione peroxidase are known (Non-patent Document 2). Organisms also protect cells from active oxygen by biosynthesizing or ingesting antioxidants called scavengers from the outside world. Antioxidants are substances that have an antioxidative action that eliminates active oxygen by being oxidized. As antioxidants, vitamin C, vitamin E, uric acid, coenzyme Q10, polyphenol, carotenoid, and the like are known (Non-patent Document 3). Of these, carotenoids have been shown by recent studies that their antioxidant activity is extremely high compared to other antioxidants (Non-Patent Document 4). For example, carotenoids such as astaxanthin and lycopene have been reported to have a preventive effect against various diseases such as a cell growth inhibitory effect and an inflammatory reaction inhibitory effect and an antibody production promoting effect (Non-patent Document 4).
　カロテノイドは、植物が紫外線照射によって発生する活性酸素から細胞を防御するために生産する抗酸化物質であり、自然界には600種以上が存在する。動物は、カロテノイドを生合成できないが、外界から摂取することで植物と同様の抗酸化作用を獲得することができる。例えば、エビやカニ等の甲殻類は、藻類由来のアスタキサンチンを摂食し、外皮に蓄積している。また、カロテノイドは、茶褐色、赤色、橙色、黄色、黄緑色等の特有の色彩を有する天然の色素成分で、食品素材の野菜や果実等にも含まれており、それらの色彩に寄与している。例えば、ニンジンやカボチャ等の緑黄色野菜に多く含まれる黄色色素のβ-カロテンやα-カロテン、トマトやスイカ等に含まれる赤色色素のリコペン、キャベツ等に含まれる黄色色素のルテイン、そして橙黄色色素のゼアキサンチン及びネオキサンチン等は、その好例である。以上のように、カロテノイドは、高い抗酸化作用と鮮やかな色彩を有し、また安全性が極めて高いという利点を有する。それ故、安全で効果的な抗酸化剤として、又はカラーバリエーションに富む天然着色料として、カロテノイドが近年注目されている。 Carotenoids are antioxidants produced by plants to protect cells from active oxygen generated by ultraviolet irradiation, and there are over 600 species in nature. Although animals cannot biosynthesize carotenoids, they can acquire the same antioxidant effect as plants by ingesting them from the outside. For example, crustaceans such as shrimps and crabs eat astaxanthin derived from algae and accumulate in the outer skin. Carotenoids are natural pigment components with specific colors such as brown, red, orange, yellow, and yellowish green, and are also contained in vegetables and fruits of food materials, contributing to these colors. . For example, β-carotene and α-carotene, which are yellow pigments abundant in green and yellow vegetables such as carrots and pumpkins, lycopene, a red pigment contained in tomatoes and watermelons, lutein, a yellow pigment contained in cabbages, and orange-yellow pigments Examples of such zeaxanthin and neoxanthine are good examples. As described above, carotenoids have the advantage that they have a high antioxidant action, vivid colors, and extremely high safety. Therefore, carotenoids have recently attracted attention as safe and effective antioxidants or natural colorants rich in color variations.
　カロテノイドは、一般に化学合成によって生産されている。例えば、現在生産されているβ-カロテンの85％以上は化学合成品である。しかし、その原材料は、化石燃料由来であり、化学触媒と試薬を多量に用いることから環境への影響や残留不純物による人体等の生体に対する安全面で不安が残る。また、合成工程では多量の熱源を必要とするため、エネルギー消費や製造コストが問題となる。 Carotenoids are generally produced by chemical synthesis. For example, over 85% of currently produced β-carotene is a chemically synthesized product. However, the raw materials are derived from fossil fuels, and since a large amount of chemical catalysts and reagents are used, there are concerns about the environmental impact and the safety of living bodies such as human bodies due to residual impurities. In addition, since a large amount of heat source is required in the synthesis process, energy consumption and manufacturing cost become problems.
　一方、カロテノイドの一部は、植物、酵母や微細藻類からの抽出によって生産されている。例えば、アスタキサンチンの製造には酵母のPhaffia rhodozymaや微細藻類のHaematococcus pluvialisが、またβ-カロテンの製造には微細藻類のDunaliella salina等が、使用され、実用化されている。このような生物由来のカロテノイドは、生体に対する安全性は高いが、P. rhodozymaは従属栄養生物であるため独立栄養生物と比較して培養コストが高いという問題がある。微細藻類は独立栄養生物ではあるが、H. pluvialisは増殖速度が遅く、培養日数が長期になる問題がある。また、D. salinaは屋外で培養できるが、日照、降雨、及び塩濃度等の環境的制約が多いことに加え、藻体が特有の臭気をもつことから、食品利用には適さないという問題がある。さらに、通常の培養条件下で培養された微細藻類の藻体内に蓄積されるカロテノイド量は、一般的に多くない。微細藻類の多くは、紫外線や栄養不足等の環境ストレスが付与されることによってはじめて特定のカロテノイドを大量に蓄積するようになる。それ故、微細藻類を用いたカロテノイドの生産方法において、効果的にカロテノイドを大量生産させるためには、生育に影響を与えず、かつ適切な環境ストレスを付与できる条件が重要となる。 On the other hand, some carotenoids are produced by extraction from plants, yeasts and microalgae. For example, the yeast Phaffia rhodozyma and the microalgae Haematococcus pluvialis are used for the production of astaxanthin, and the microalgae Dunaliella salina is used for the production of β-carotene. Such carotenoids derived from such organisms are highly safe for living organisms, but P. horhodozyma is a heterotrophic organism and thus has a problem of higher culture costs compared to autotrophic organisms. Although microalgae are autotrophic organisms, H.luvpluvialis has the problem of slow growth and prolonged culture days. Although D. salina can be cultured outdoors, there are many environmental restrictions such as sunshine, rainfall, and salt concentration, as well as the problem that alga bodies have a unique odor, making them unsuitable for food use. is there. Furthermore, the amount of carotenoid accumulated in the algal bodies of microalgae cultured under normal culture conditions is generally not large. Many microalgae accumulate a large amount of specific carotenoids only when environmental stresses such as ultraviolet rays and nutritional deficiencies are applied. Therefore, in the carotenoid production method using microalgae, in order to effectively mass-produce carotenoids, conditions that do not affect the growth and can apply appropriate environmental stress are important.
　本発明は、培養が容易で増殖速度の速い微細藻類を用いて、カロテノイドを安定的に、かつ大量に生産する方法を開発し、提供することである。 The present invention is to develop and provide a method for producing carotenoids stably and in large quantities using microalgae that is easy to culture and has a fast growth rate.
　本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、トレボウクシア藻綱に属する種又はヨコワミドロ目に属する種を強光下で特定の時間培養することによって、藻体の生育に影響を与えず、適切な環境ストレスを付与できることを見出した。また、この環境ストレスによってカロテノイド合成経路が活性化され、藻体内に特定のカロテノイドが大量に蓄積されることを見出した。本発明は当該新規知見に基づくものであって、以下を提供する。
（１）トレボウクシア藻綱（Trebouxiophyceae）又はヨコワミドロ目（Sphaeropleales）に属する種に500～2500μmol photons/m2/sの光強度で光を150～500時間照射して培養するストレス付与工程を含むカロテノイドの大量生産方法。
（２）前記ストレス付与工程後の培養液から藻体を回収する回収工程を含む、（１）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（３）前記回収工程後の藻体を乾燥させる乾燥工程を含む、（２）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（４）前記ストレス付与工程後又は乾燥工程後の藻体からカロテノイドを抽出する抽出工程を含む、（１）～（３）のいずれかに記載のカロテノイドの大量生産方法。
（５）前記抽出工程後の抽出液からカロテノイドを分離、精製する分離工程を含む、（４）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（６）光照射が連続照射である、（１）～（５）のいずれかに記載のカロテノイドの大量生産方法。
（７）前記トレボウクシア藻綱に属する種がクロレラ目（Chlorellales）、カワノリ目（Prasiolales）又はワタナベア系統群（Watanabea-clade）に属する種である、（１）～（６）のいずれかに記載のカロテノイドの大量生産方法。
（８）前記ヨコワミドロ目に属する種がイカダモ科（Scenedesmaceae）、ムリエラ属（Muriella）又はグラエシエラ属（Graesiella）に属する種である、（１）～（６）のいずれかに記載のカロテノイドの大量生産方法。
（９）前記カロテノイドがルテイン及び／又はゼアキサンチンである、（７）又は（８）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（１０）前記カロテノイドがアスタキサンチン及び／又はその誘導体である、（８）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（１１）前記カロテノイドがアンテラキサンチン及び／又はその誘導体である、（７）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（１２）前記カロテノイドがネオキサンチン及び／又はその誘導体である、（７）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（１３）500～2500μmol photons/m2/sの光強度で光を照射し、150～500時間培養する工程を含む方法によって得られるトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。
（１４）前記工程後の培養液から培地を除去して藻体を回収する工程をさらに含む方法によって得られる、（１３）に記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。
（１５）前記工程で回収された藻体を乾燥させる工程をさらに含む方法によって得られる、（１４）に記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。
（１６）前記トレボウクシア藻綱に属する種がクロレラ目（Chlorellales）、カワノリ目（Prasiolales）又はワタナベア系統群に属する種である、（１３）～（１５）のいずれかに記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。
（１７）前記ヨコワミドロ目に属する種がイカダモ科（Scenedesmaceae）、ムリエラ属（Muriella）又はグラエシエラ属（Graesiella）に属する種である、（１３）～（１５）のいずれかに記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。
（１８）（１３）～（１７）のいずれかに記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種を含む天然着色料。
（１９）（１３）～（１７）のいずれかに記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種を含む抗酸化剤。
（２０）（１８）に記載の天然着色料又は（１９）に記載の抗酸化剤を含む飲食品。
（２１）（１８）に記載の天然着色料又は（１９）に記載の抗酸化剤を含む化粧品。 As a result of repeated studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have affected the growth of algal bodies by culturing a species belonging to the Trevoxia algae or a species belonging to the order of the order of the order of agglomerates under a strong light for a specific time. It was found that appropriate environmental stress can be given without giving Moreover, it discovered that a carotenoid synthetic pathway was activated by this environmental stress, and a specific carotenoid was accumulated in large quantities in the alga. The present invention is based on the novel findings and provides the following.
(1) Carotenoids containing a stress-imparting process in which a species belonging to Trebouxiophyceae or Sphaeropleales is irradiated with light at a light intensity of 500-2500 μmol photons / m 2 / s for 150-500 hours. Mass production method.
(2) The method for mass production of carotenoids according to (1), including a recovery step of recovering algal bodies from the culture solution after the stress applying step.
(3) The carotenoid mass production method according to (2), including a drying step of drying the algal bodies after the recovery step.
(4) The method for mass production of carotenoids according to any one of (1) to (3), comprising an extraction step of extracting carotenoids from algal bodies after the stress applying step or the drying step.
(5) The method for mass production of carotenoid according to (4), including a separation step of separating and purifying carotenoid from the extract after the extraction step.
(6) The method for mass production of carotenoids according to any one of (1) to (5), wherein the light irradiation is continuous irradiation.
(7) The species belonging to the Trevoxia algae is a species belonging to the order Chlorellales, Prasiolales or Watanabea-clade, (1) to (6) A method for mass production of carotenoids.
(8) Mass production of carotenoids according to any one of (1) to (6), wherein the species belonging to the order of the order of the spleen is the species belonging to the family Scenedesmaceae, Muriella, or Graesiella Method.
(9) The carotenoid mass production method according to (7) or (8), wherein the carotenoid is lutein and / or zeaxanthin.
(10) The carotenoid mass production method according to (8), wherein the carotenoid is astaxanthin and / or a derivative thereof.
(11) The carotenoid mass production method according to (7), wherein the carotenoid is anthaxanthin and / or a derivative thereof.
(12) The carotenoid mass production method according to (7), wherein the carotenoid is neoxanthine and / or a derivative thereof.
(13) A species belonging to the order of Trevoxia algae or Aceraceae obtained by a method comprising a step of irradiating with a light intensity of 500 to 2500 μmol photons / m 2 / s and culturing for 150 to 500 hours.
(14) The species belonging to the genus Trevoxia algae or the order of Yokowa midlo, obtained by a method further comprising the step of recovering the alga bodies by removing the medium from the culture solution after the step.
(15) The species belonging to the order of Trevoxia algae or Yokomida, which is obtained by a method further comprising a step of drying the algal bodies collected in the step.
(16) The species belonging to the Trevoxia algae is Chlorellales, Prasiolales, or the species belonging to the Watanabe family, (13) to (15), Species belonging to the eye.
(17) The species of Trevoxia algae according to any one of (13) to (15), wherein the species belonging to the order of the spleen is the species belonging to the family Scenedesmaceae, Muriella, or Graesiella Species belonging to the order of the yellow-winged.
(18) A natural colorant comprising a species belonging to the order of Trevoxia algae or Yokomidae according to any one of (13) to (17).
(19) An anti-oxidant comprising a species belonging to the order Trevoxia algae or Yokowa amida in any one of (13) to (17).
(20) A food or drink comprising the natural colorant according to (18) or the antioxidant according to (19).
(21) A cosmetic comprising the natural colorant according to (18) or the antioxidant according to (19).
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2014-259462号の開示内容を包含する。 This specification includes the disclosure of Japanese Patent Application No. 2014-259462, which is the basis of the priority of the present application.
　本発明のカロテノイドの大量生産方法によれば、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を用いてカロテノイドを大量蓄積した藻体を生産することによって、カロテノイドを安定的に、かつ大量に生産することが可能となる。 According to the method for mass production of carotenoids of the present invention, it is possible to produce carotenoids stably and in large quantities by producing algae bodies in which carotenoids are accumulated in large quantities using Trevoxia algae or Yokowa amidro algae.
　本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類によれば、大量のカロテノイドを蓄積した藻体を提供することができる。 According to the Trevoxia algae or the yellow algae of the present invention, it is possible to provide an algal body accumulating a large amount of carotenoids.
　本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、茶色～黄緑色の天然着色料として利用することができる。 The Trevoxia algae or Yokowa midoro algae of the present invention can be used as a natural colorant of brown to yellow-green.
　本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、高い抗酸化作用を有する抗酸化剤として利用することができる。 The trevoxia algae or the yellow algae of the present invention can be used as an antioxidant having a high antioxidant action.
　本発明の抗酸化剤又は天然着色料を飲食品に添加することで、色味と抗酸化作用を有する飲食品を提供することができる。 </ RTI> By adding the antioxidant or natural colorant of the present invention to a food or drink, it is possible to provide a food or drink having a tint and an antioxidant effect.
本発明のカロテノイドの大量生産方法の工程フローを示す図である。It is a figure which shows the process flow of the mass production method of the carotenoid of this invention. 各トレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類を強光ストレス付与下で培養した時の成長曲線を示す図である。It is a figure which shows the growth curve when each Trevoxia algae and Yokowa midro algae are cultured under strong light stress provision. 強光ストレスを付与したMuriella zofingiensisにおける植物色素の藻体内比率を示す図である。図中、Chlはクロロフィルを、UC1とUC2は未知のカロテノイド（Unknown Caroteniod）を、UCE1～UCE4はいずれも未知のカロテノイドエステル（Unknown Caroteniod Ester）を示す。図中、0Dは培養0日目を、また14Dは培養14日目を意味する。It is a figure which shows the algal body ratio of the plant pigment in Muriella zofingiensis which gave intense light stress. In the figure, Chl represents chlorophyll, UC1 and UC2 represent unknown carotenoids (Unknown Caroteniod), and UCE1 to UCE4 represent unknown carotenoid esters (Unknown Caroteniod Ester). In the figure, 0D means day 0 of culture and 14D means day 14 of culture. 強光ストレスを付与したGraesiella emersoniiにおける植物色素の藻体内比率を示す図である。図中、Chlはクロロフィルを、UCE1とUCE2は未知のカロテノイドエステル（Unknown Caroteniod Ester）を示す。図中、0Dは培養0日目を、8Dは培養8日目を、そして14Dは培養14日目を意味する。It is a figure which shows the algal body ratio of the plant pigment in Graesiella emersonii which gave the intense light stress. In the figure, Chl represents chlorophyll, and UCE1 and UCE2 represent unknown carotenoid esters (Unknown Caroteniod Ester). In the figure, 0D means day 0 of culture, 8D means day 8 of culture, and 14D means day 14 of culture. 強光ストレスを付与したParachlorella kessleri NIES-2152における植物色素の藻体内比率を示す図である。図中、Chlはクロロフィルを、UCは未知のカロテノイド（Unknown Caroteniod）を示す。0Dは培養0日目を、また8Dは培養8日目を意味する。It is a figure which shows the algal body ratio of the plant pigment | dye in Parachlorellaskessleri NIES-2152 which gave the intense light stress. In the figure, Chl represents chlorophyll, and UC represents an unknown carotenoid (Unknown Caroteniod). 0D means day 0 of culture and 8D means day 8 of culture. 強光ストレスを付与したDidymogenes anomalaにおける植物色素の藻体内比率を示す図である。図中、UCは未知のカロテノイド（Unknown Caroteniod）を示す。0Dは培養0日目を、また14Dは培養14日目を意味する。It is a figure which shows the algal body ratio of the plant pigment in Didymogenes anomala which gave the intense light stress. In the figure, UC indicates an unknown carotenoid. 0D means day 0 of culture and 14D means day 14 of culture.
１．カロテノイドの大量生産方法
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、カロテノイドの大量生産方法である。本発明は、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類に特定の環境ストレスを付与したときに細胞内にカロテノイドが大量に蓄積される現象に基づいた発明である。本発明によれば、通常培養条件下で培養したときよりも細胞あたりの植物色素に占めるカロテノイド量の比率が有意に高いトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を得ることができる。また、その藻体から大量のカロテノイドを得ることもできる。 1. 1. Mass production method of carotenoid 1-1. Overview A first aspect of the present invention is a method for mass production of carotenoids. The present invention is an invention based on a phenomenon in which a large amount of carotenoid is accumulated in a cell when a specific environmental stress is applied to Trevoxia algae or Yokowa amid alga. According to the present invention, it is possible to obtain Trevoxia algae or Yokowa midoro algae having a significantly higher ratio of the amount of carotenoid to plant pigments per cell than when cultured under normal culture conditions. A large amount of carotenoid can also be obtained from the alga body.
１－２．定義
　本明細書で頻用する以下の用語について定義する。 1-2. Definitions The following terms frequently used in this specification are defined.
　「植物色素」とは、植物細胞内に存在する主要な色素成分であり、クロロフィル、カロテノイド、フラボノイド、及びベタレインの4群に大別される。本明細書で対象となるトレボウクシア藻類は、前記4群のうちクロロフィル及びカロテノイドの2種を包含する。本明細書では、そのうちのカロテノイドを対象とする。 “Plant pigments” are the main pigment components present in plant cells, and are roughly divided into four groups: chlorophyll, carotenoids, flavonoids, and betalains. The Trevoxia algae that are the subject of the present specification include two types of chlorophyll and carotenoid in the four groups. In the present specification, the carotenoids are targeted.
　「カロテノイド」とは、化学式C40H56を基本骨格とし、左右対称に近い構造を有する水不溶性のテトラテルペンの総称である。植物色素の一つであり、植物、糸状菌、又は微生物によって生合成され、茶色、赤色、橙赤色、橙色、橙黄色、黄色、淡黄色（レモン色）、黄緑、又は萌葱色を呈する。カロテノイドは、分子中に酸素を含むカロテン類と、分子中に酸素を含まないキサントフィル類に大別されるが、本明細書のカロテノイドは、いずれも包含する。カロテノイドの具体例として、カロテンに属する、赤色色素のリコペン、黄色色素のα-カロテン、β-カロテン、γ-カロテン及びβ-クロプトキサンチン、またキサントフィルに属する、淡黄色色素のアンテラキサンチン、茶色色素（オリーブ色を含む）のフコキサンチン、赤色色素のカプサンチン、アスタキサンチン及びアスタキサンチン誘導体（カンタキサンチン等）、橙赤色色素のビオラキサンチン、橙黄色色素のゼアキサンチン、及び黄色色素のルテイン及びネオキサンチン等が挙げられる。本発明の対象として好ましいカロテノイドは、ルテイン、ゼアキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン及びアスタキサンチンである。 “Carotenoid” is a general term for water-insoluble tetraterpenes having a chemical structure C 40 H 56 as a basic skeleton and a structure close to symmetry. A plant pigment that is biosynthesized by plants, filamentous fungi, or microorganisms, and exhibits a brown, red, orange-red, orange, orange-yellow, yellow, light yellow (lemon color), yellow-green, or violet color. Carotenoids are roughly classified into carotenes containing oxygen in the molecule and xanthophylls containing no oxygen in the molecule, and the carotenoids in the present specification include both. Specific examples of carotenoids include red pigment lycopene belonging to carotenes, yellow pigments α-carotene, β-carotene, γ-carotene and β-croptoxanthine, and light yellow pigment anthaxanthin, brown pigment ( Olive color) fucoxanthin, red pigment capsanthin, astaxanthin and astaxanthin derivatives (such as canthaxanthin), orange-red pigment violaxanthin, orange-yellow pigment zeaxanthin, and yellow pigment lutein and neoxanthine. Carotenoids preferred as the subject of the present invention are lutein, zeaxanthin, neoxanthine, anthaxanthin and astaxanthin.
　「トレボウクシア藻綱（Trebouxiophyceae）」とは、緑藻植物門（Chlorophyta）に属する一群であり、細胞内に葉緑体を有し、光合成によりα-1, 4グルカンを主成分とするデンプンを生合成することのできる藻類である。例えば、クロレラ目（Chlorellales）、ワタナベア系統群（Watanabea-clade）、トレボウクシア目（Trebouxiales）、ミクロタムニオン目（Microthamniales）及びカワノリ目(Prasiolales)を含む（仲田崇志, 2012, 渡邉信監修, 藻類ハンドブック, pp33-37, NTS Inc）。なお、本明細書では、トレボウクシア藻綱に属する藻類を総称して、しばしば「トレボウクシア藻類」と表記する。 “Trebouxiophyceae” is a group belonging to Chlorophyta, and has a chloroplast in the cell and biosynthesizes starch composed mainly of α-1, 4 glucan by photosynthesis. Algae that can do. Examples include Chlorellales, Watanabea-clade, Trebouxiales, Microthamniales, and Prasiolales (Takashi Nakata, 2012, supervised by Shinnobu Watanabe, Shiga Algae Handbook) , Pp33-37, NTS Inc). In the present specification, algae belonging to the Trevoxia algae are collectively referred to as “Treboxia algae”.
　「トレボウクシア藻綱に属する種」とは、分類学上、トレボウクシア藻綱に分類される種をいう。具体的には、前述のクロレラ目、ワタナベア系統群、トレボウクシア目、ミクロタムニオン目、及びカワノリ目に属する種が該当する。 “Species belonging to Trevoxia algae” refers to species classified as Trevoxia algae for taxonomics. Specifically, the above-mentioned species belonging to the order of Chlorella, Watanabe family, Trevoxia, Microtamnion, and Kawanori.
　「ヨコワミドロ目（Sphaeropleales）」とは、緑藻綱（Chlorophyceae）の属する一群であり、トレボウクシア藻類と同様に細胞内に葉緑体を有し、光合成によりα-1, 4グルカンを主成分とするデンプンを生合成することのできる藻類である。なお、本明細書では、ヨコワミドロ目に属する藻類を総称して、しばしば「ヨコワミドロ藻類」と表記する。 "Sphaeropleales" is a group to which Chlorophyceae belongs, and has chloroplasts in the cell, similar to Trevoxia algae, and is composed mainly of α-1, 4 glucan by photosynthesis. Is an algae that can be biosynthesized. In the present specification, algae belonging to the order of Yokomida are often collectively referred to as “Yokomida algae”.
　「ヨコワミドロ目に属する種」とは、分類学上、ヨコワミドロ目に分類される種をいう。具体的には、イカダモ科（Scenedesmaceae）に属する種、ムリエラ属（Muriella）に属する種（例えば、M. zofingiensis）又はグラエシエラ属（Graesiella）に属する種（例えば、G. emersonii）、が該当する。 ”“ Species belonging to the order of Yokomida ”refers to the species classified in the order of Yokomida. Specifically, it belongs to the species belonging to the family Scenedesmaceae, the species belonging to the genus Muriella (for example, M. zofingiensis), or the species belonging to the genus Graesiella (for example, G. emersonii).
　トレボウクシア藻綱と緑藻綱は、分子系統学的に姉妹関係にある互いに近縁な生物群である（Lemieux, C., et al., 2014, BMC Evol. Biol., 14, 211）。 Trevoxia algae and Green algae are closely related to each other in molecular phylogeny (Lemieux, C., et al., 2014, BMC Evol. Biol., 14, 211).
１－３．方法
　本発明のカロテノイドの大量生産方法における工程フローを図１に示す。本発明の生産方法は、ストレス付与工程（S001）、回収工程（S002）、乾燥工程（S003）、抽出工程（S004）及び分離工程（S005）を含む。このうちストレス付与工程は必須工程であり、回収工程、乾燥工程、抽出工程及び分離工程は選択工程である。選択工程として、さらなる工程を含んでいてもよい。以下、本発明におけるストレス付与工程、回収工程、乾燥工程、抽出工程及び分離工程に関して、具体的に説明をする。 1-3. Method The process flow in the method for mass production of carotenoids of the present invention is shown in FIG. The production method of the present invention includes a stress application step (S001), a recovery step (S002), a drying step (S003), an extraction step (S004), and a separation step (S005). Of these, the stress application step is an essential step, and the recovery step, the drying step, the extraction step, and the separation step are selection steps. A further process may be included as the selection process. Hereinafter, the stress application process, the recovery process, the drying process, the extraction process, and the separation process in the present invention will be specifically described.
１－３－１．ストレス付与工程
　「ストレス付与工程」（S001）は、培養中のトレボウクシア藻類又はヨコミワミドロ藻類に強光ストレスを付与する工程である。本工程は、ストレス付与によってトレボウクシア藻類又はヨコミワミドロ藻類のカロテノイド合成経路を活性化させ、藻体内に大量のカロテノイドを蓄積させることを目的とする。 1-3-1. Stress Application Process The “stress application process” (S001) is a process of applying intense light stress to Trevoxia algae or Yokomiwa algae during culture. The purpose of this step is to activate the carotenoid synthesis pathway of Trevoxia algae or Yokomiwa algae by applying stress, and accumulate a large amount of carotenoids in the algae.
　本発明で使用するトレボウクシア藻類は、前記トレボウクシア藻類が該当する。いずれの目又は系統群に属する種であってもよいが、好ましくはクロレラ目、カワノリ目、又はワタナベア系統群に属する種である。クロレラ目に属する種には、クロレラ科（Chlorellaceae）に属する種が挙げられる。ここでいうクロレラ科は、クロレラ系統群（Chlorella-clade）、パラクロレラ系統群（Parachlorella-clade）及びプロトテカ系統群（Prototheca-clade）を包含する概念である（仲田崇志, 2012, 渡邉信監修, 藻類ハンドブック, pp33-37, NTS Inc）。クロレラ科に属する種には、例えば、クロレラ属（Chlorella）に属する種（例えば、C. mirabilis、C. minutissima、C. vulgaris、C. sorokiniana、C. viscose、C. variabilis等）、オーセノクロレラ属（Auxenochlorella）に属する種（例えば、A. protothecoides等）、パラクロレラ属（Parachlorella）に属する種（例えば、P. kessleri、P. beijerinckii等）、ディクロスター属（Dicloster）に属する種（例えば、D. acuatus等）、ミクラクチニウム属（Micractinium）に属する種（例えば、M. pusillum、M. belenophorum等）、ロボスファエロプシス属（Lobosphaeropsis）に属する種（例えば、L. lobophora等）、ディクチオスファエリウム属（Dictyosphaerium）に属する種（例えば、D. pulchellum等）、ディディモゲネス属（Didymogenes）に属する種、及びアクチナストルム属（Actinastrum）に属する種（例えば、A. hantzschii等）が挙げられる。 The Trevoxia algae used in the present invention corresponds to the Trevoxia algae. Although it may be a species belonging to any order or lineage group, it is preferably a species belonging to the order Chlorella, Pleurotus or Watanabea. Species belonging to the order Chlorella include those belonging to the family Chlorellaceae. The Chlorella family here is a concept that includes the Chlorella-clade group, the Parachlorella-clade group, and the Prototheca-clade group (Takashi Nakata, 2012, supervised by Nobuyoshi Watanabe, Algae Handbook, pp33-37, NTS Inc). Species belonging to the family Chlorella include, for example, species belonging to the genus Chlorella (for example, C.bilmirabilis, C. minutissima, C. vulgaris, C. sorokiniana, C. viscose, C. variabilis, etc.), osenochlorella Species belonging to the genus (Auxenochlorella, such as A. protothecoides), species belonging to the genus Parachlorella (eg, P. kessleri, P. beijerinckii etc.), species belonging to the genus Dicloster (eg, D. acuatus etc.), species belonging to the genus Micractinium (eg M.Mpusillum, M. belenophorum etc.), species belonging to the genus Lobosphaeropsis (eg L. lobophora etc.), di Species belonging to the genus Dictyosphaerium (eg D. pulchellum), species belonging to the genus Didymogenes, and species belonging to the genus Actinastrum (eg A. h antzschii etc.).
　トレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類には、単細胞生物及び多細胞生物が存在するが、本明細書で使用する種はいずれであってもよい。好ましくは単細胞生物である。 There are unicellular organisms and multicellular organisms in Trevoxia algae and Yokowa algae, but any species may be used in the present specification. Preferably it is a unicellular organism.
　トレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類は、いずれの種も本願発明の方法によりカロテノイドを大量生産し、それを藻体内に蓄積できるが、生産されるカロテノイドの種類は、藻類の種類によって異なる。トレボウクシア藻類のクロレラ目、カワノリ及びワタナベア系統群に属する藻類は、主としてルテイン及び／又はゼアキサンチンを蓄積する。このようなカロテノイドを蓄積する具体例としては、限定はしないが、Chlorella vulgaris等のクロレラ属に属する種、及びParachlorella kessleri等のパラクロレラ属に属する種が挙げられる。Didymogenes anomala等のディディモゲネス属に属する種は、ルテイン及び／又はゼアキサンチンに加え、ネオキサンチンも大量に生産し、蓄積し得る。また、トレボウクシア藻類のクロレラ目に属する藻類、特にクロレラ科に属する種は、アンテラキサンチンも蓄積し得る。アンテラキサンチン及びその誘導体を大量に蓄積する具体例としては、限定はしないが、Chlorella sorokiniana等のクロレラ属に属する種等が挙げられる。 Treboxia algae and Yokowa amidro algae all produce carotenoids in a large amount by the method of the present invention and accumulate them in the algae, but the type of carotenoid produced varies depending on the type of algae. Algae belonging to the Chlorella order, Kawanori and Watanabe family of Trevoxia algae mainly accumulate lutein and / or zeaxanthin. Specific examples of accumulating such carotenoids include, but are not limited to, species belonging to the genus Chlorella such as Chlorella vulgaris, and species belonging to the genus Parachlorella such as Parachlorella kessleri. Species belonging to the genus Didymogenes such as Didymogenes anomala can produce and accumulate neoxanthin in large quantities in addition to lutein and / or zeaxanthin. Also, algae belonging to the order Chlorella of the Trevoxia algae, especially species belonging to the family Chlorellaceae, can also accumulate anthaxanthin. Specific examples of accumulating large amounts of anterraxanthin and its derivatives include, but are not limited to, species belonging to the genus Chlorella such as Chlorella sorokiniana.
　一方、ヨコワミドロ藻類は、主としてアスタキサンチン及びその誘導体（例えば、カンタキサンチン等）を蓄積する。このようなカロテノイドを蓄積する具体例としては、限定はしないが、Muriella zofingiensis等のムリエラ属に属する種が挙げられる。また、Graesiella emersonii等のグラエシエラ属に属する種ではルテイン及び／又はゼアキサンチンの蓄積も見られる。特定のカロテノイドを生産する場合には、所望するカロテノイドを大量に生産するトレボウクシア藻類を適宜選択すればよい。例えば、カロテノイドの種類に応じた色彩を基準に選択してもよい。 On the other hand, the yellow algae mainly accumulates astaxanthin and its derivatives (for example, canthaxanthin). Specific examples of accumulating such carotenoids include, but are not limited to, species belonging to the genus Muriera such as Muriella zofingiensis. In addition, accumulation of lutein and / or zeaxanthin is also observed in species belonging to the genus Graesiella such as Graesiella emersonii. When producing a specific carotenoid, Trevoxia algae that produce the desired carotenoid in large quantities may be appropriately selected. For example, you may select on the basis of the color according to the kind of carotenoid.
　本工程で使用するトレボウクシア藻類は、培養条件が一致又は近似する種であれば複数の種を一緒に培養してもよい。ここでいう培養条件とは、例えば、培地の組成、培地塩濃度、培養温度等が該当する。 </ RTI> The Trevoxia algae used in this step may be cultivated with a plurality of species together as long as the culture conditions match or approximate. The culture conditions referred to here include, for example, medium composition, medium salt concentration, culture temperature, and the like.
　本工程は、前述のように培養中のトレボウクシア藻類に対して行う。ストレス付与開始時における培養液中のトレボウクシア藻類の状態は、特に限定はしないが、後述するように本工程中も培養は継続することから、誘導期（lag phase）又は対数期（log phase）が好ましい。 This step is performed on Trevoxia algae during culture as described above. The state of Trevoxia algae in the culture solution at the start of stress application is not particularly limited, but as described later, since the culture continues during this step, the induction phase (lag phase) or log phase (log phase) preferable.
　本明細書において「強光ストレス」とは、環境ストレスの一つであって、外部刺激として強力な光を対象生物に作用させることをいう。具体的には、特定の光強度を有する光を特定時間トレボウクシア藻類に照射したときのストレスをいう。 In this specification, “strong light stress” is one of environmental stresses and means that a powerful light acts on a target organism as an external stimulus. Specifically, it refers to stress when light having a specific light intensity is irradiated to Trevoxia algae for a specific time.
　本明細書において「光強度」とは、光量子束密度を意味する。光強度は、その単位時間の単位面積当たりの光子数、すなわち照射された面に含まれる全光子数を照射面積（m2）と照射時間（秒）を乗じた数値で除した値（mol photons/m2/s）で表す。この光強度の光子数は、実際の照射面における光を分光ユニットなどによって測定することで算出できる。 In this specification, “light intensity” means the photon flux density. The light intensity is obtained by dividing the number of photons per unit area per unit time, that is, the total number of photons contained in the irradiated surface by the value obtained by multiplying the irradiation area (m 2 ) by the irradiation time (seconds) (mol photons / m 2 / s). The number of photons of this light intensity can be calculated by measuring the light on the actual irradiation surface with a spectroscopic unit or the like.
　本明細書において「特定の光強度」とは、500～2500μmol photons/m2/s、好ましくは550～2300μmol photons/m2/s、より好ましくは600～2000μmol photons/m2/sである。 In the present specification, the “specific light intensity” is 500 to 2500 μmol photons / m 2 / s, preferably 550 to 2300 μmol photons / m 2 / s, more preferably 600 to 2000 μmol photons / m 2 / s.
　照射する光は、450nm±15nm及び／又は580nm±15nmに波長スペクトルのピーク（極大波長）を有する光であればよい。例えば、380 nm～800 nmの全可視光域を含む白色光、又は400～500 nmの紫色光～青色光及び／又は560 nm～600 nmの黄色光が該当する。 The light to be irradiated may be light having a wavelength spectrum peak (maximum wavelength) at 450 nm ± 15 nm and / or 580 nm ± 15 nm. For example, white light including the entire visible light region of 380 nm to 800 nm, or purple light to blue light of 400 to 500 nm and / or yellow light of 560 nm to 600 nm is applicable.
　本工程で使用する光源は、前記波長域の光を放射可能な光源であれば特に限定はしない。例えば、全可視光域を含む白色光を放射可能な蛍光灯、白色発光ダイオード（Light Emitting Diode：以下、本明細書では、しばしば「LED」と表記する）、高輝度放電（HID：High Intensity Discharge）ランプ等が挙げられる。また、400 nm～500 nmの波長域内及び560 nm～600 nmの波長域内に波長スペクトルのピークを有する白色LEDを利用するのが効果的である。 The light source used in this step is not particularly limited as long as it is a light source capable of emitting light in the wavelength range. For example, a fluorescent lamp capable of emitting white light including the entire visible light range, a white light emitting diode (hereinafter referred to as “LED”), a high intensity discharge (HID: High Intensity Discharge). ) Lamp and the like. It is also effective to use a white LED having a wavelength spectrum peak in the wavelength range of 400 nm to 500 nm and in the wavelength range of 560 nm to 600 nm.
　本明細書において「特定時間」とは、前記光強度でトレボウクシア藻類に十分な強光ストレスを付与できる時間をいう。具体的には、150～500時間、好ましくは160～400時間、より好ましくは168～360時間、さらに好ましくは190～340時間である。日にち換算すれば、7～20日間や6～14日間に相当する。一般に光強度が強ければ照射する時間は短くても十分な強光ストレスを付与することができる。例えば、1800～2500μmol photons/m2/sの光強度であれば、150～250時間又は150～220時間の照射で足りる。一方、光強度が弱い場合には照射する時間は長い方が好ましい。例えば、500～1000μmol photons/m2/sの光強度であれば、280～500時間又は310～500時間照射することが好ましい。 In the present specification, the “specific time” refers to a time during which a sufficient intense light stress can be applied to Trevoxia algae with the light intensity. Specifically, it is 150 to 500 hours, preferably 160 to 400 hours, more preferably 168 to 360 hours, and further preferably 190 to 340 hours. In terms of dates, it corresponds to 7 to 20 days or 6 to 14 days. In general, if the light intensity is high, sufficient intense light stress can be applied even if the irradiation time is short. For example, if the light intensity is 1800 to 2500 μmol photons / m 2 / s, irradiation for 150 to 250 hours or 150 to 220 hours is sufficient. On the other hand, when the light intensity is weak, the irradiation time is preferably long. For example, when the light intensity is 500 to 1000 μmol photons / m 2 / s, irradiation is preferably performed for 280 to 500 hours or 310 to 500 hours.
　強光ストレスの付与は、総合時間で上記特定の光強度にて曝光できれば、連続照射であっても、また明暗期を有する明暗光であってもよい。明暗周期光の場合には、1日の明暗周期は特に限定はしないが、例えば、明期8時間：暗期16時間～16hr:8hr時間の範囲でよい。あるいは、明期中に周期的に又は非周期的に、肉眼で認識できる暗期（例えば、1秒以上、好ましくは数秒以上の暗期）が挿入される明暗光であってもよい。好ましくは連続照射である。ここでいう連続照射とは、連続光の照射だけでなく、蛍光灯のように、極めて短時間に明暗期を繰り返すパルス光の照射も含む。 The application of intense light stress may be continuous irradiation or bright and dark light having a bright and dark period as long as exposure can be performed at the specific light intensity in the total time. In the case of light / dark cycle light, the light / dark cycle of the day is not particularly limited, but may be, for example, in the range of light period 8 hours: dark period 16 hours to 16 hours: 8 hours. Alternatively, it may be bright or dark light in which a dark period (for example, a dark period of 1 second or more, preferably several seconds or more) that can be recognized by the naked eye is inserted periodically or aperiodically during the light period. Continuous irradiation is preferred. The continuous irradiation here includes not only continuous light irradiation but also pulsed light irradiation that repeats the light and dark periods in a very short time like a fluorescent lamp.
　照射方法は、培養中のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類に十分に曝光される方法であれば特に限定はしない。例えば、透明な培養槽の周囲に光源を設置して培養槽全体に光を照射する方法、一方向又は複数の方向から透明な培養槽に光を照射しながら培養槽を回転させることで培養槽全体に光を行き渡す方法等が挙げられる。光の照射は、光源からの直接照射が好ましいが、培養液全体に光を行き届かせる目的等のために反射板等を介した間接照射であってもよい。間接照射の場合、照射した光が減衰する可能性があることから、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類への光強度が前述の範囲となるように、必要に応じて光源の光強度を高めることが好ましい。 The irradiation method is not particularly limited as long as it is a method that allows sufficient exposure to Trevoxia algae or Yokowa algae during cultivation. For example, a method of irradiating light to the entire culture tank by installing a light source around the transparent culture tank, a culture tank by rotating the culture tank while irradiating light to the transparent culture tank from one or more directions The method of passing light through the whole is mentioned. The light irradiation is preferably direct irradiation from a light source, but may be indirect irradiation via a reflector or the like for the purpose of reaching the entire culture solution. In the case of indirect irradiation, since the irradiated light may be attenuated, it is preferable to increase the light intensity of the light source as necessary so that the light intensity to Trevoxia algae or Yokowa amidro algae falls within the aforementioned range.
　強光ストレスの付与下であってもトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、生育及び増殖が可能であることから、ストレス付与中、培養は継続することが望ましい。 Even under the application of intense light stress, Trevoxia algae or Yokowa midoro algae can grow and proliferate, so it is desirable to continue culturing during the application of stress.
　本工程における培養条件は、前記トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を培養可能な条件であれば、特に限定はしない。培養するトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の種に応じて、適宜最適の培養条件を設定すればよい。 The culture conditions in this step are not particularly limited as long as the above-mentioned Trevoxia algae or Yokowa algae can be cultured. What is necessary is just to set optimal culture | cultivation conditions suitably according to the seed | species of Trevoxia algae or Yokowa midro algae to culture.
　例えば、本工程で用いる培地は、通常は基本生育培地で足りる。例えば、TAP培地が挙げられる。TAP培地の組成は、NH4Cl 40mg, CaCl2・2H2O 5.1mg, MgSO4・7H2O 10mg, K2HPO411.9mg, KH2PO4 6.03mg, Hutner's trace elements 0.1mL, Acetic acid 0.1mL, Tris(hydroxymethyl) aminomethane 242mg, Distilled water 99.8mL（pH6.5～6.8）とすればよい。ここで、Hutner's trace elementsは、Na2EDTA・2H2O 5g, ZnSO4・7H2O 2.2g, H3BO3 1.14g, MnCl2・4H2O 506mg,FeSO4・7H2O 499mg, CoCl2・6H2O 161mg, CuSO4・5H2O 157mg, (NH4)6Mo7O24・4H2O 110mg, Distilled water 100mLからなる。培養するトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、野生株が好ましいが、変異株であっても構わない。ただし、その場合、培地の組成をその変異株の生育に適合したものに調製する。例えば、変異株がシステイン要求性変異株等の栄養要求性変異株であった場合、TAP培地に500ng/mL～100μg/mLのシステインを添加する等して、栄養要求性を満たす培地を調製する。 For example, the basic growth medium is usually sufficient for the medium used in this step. An example is TAP medium. The composition of TAP medium is NH 4 Cl 40mg, CaCl 2・ 2H 2 O 5.1mg, MgSO 4・ 7H 2 O 10mg, K 2 HPO 4 11.9mg, KH 2 PO 4 6.03mg, Hutner's trace elements 0.1mL, Acetic acid 0.1mL, Tris (hydroxymethyl) aminomethane 242mg, Distilled water 99.8mL (pH 6.5-6.8) may be used. Here, Hutner's trace elements are, Na 2 EDTA · 2H 2 O 5g, ZnSO 4 · 7H 2 O 2.2g, H 3 BO 3 1.14g, MnCl 2 · 4H 2 O 506mg, FeSO 4 · 7H 2 O 499mg, CoCl It consists of 2 · 6H 2 O 161 mg, CuSO 4 · 5H 2 O 157 mg, (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O 110 mg, Distilled water 100 mL. The trevoxia algae or the yellow algae to be cultured is preferably a wild strain, but may be a mutant strain. However, in that case, the composition of the medium should be adjusted to suit the growth of the mutant strain. For example, if the mutant is an auxotrophic mutant such as a cysteine-requiring mutant, prepare a medium that satisfies the auxotrophy by adding 500 ng / mL to 100 μg / mL of cysteine to the TAP medium. .
　培養温度は、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類が生育可能な温度であればよい。通常は15～35℃、好ましくは18～30℃、より好ましくは20～28℃、さらに好ましくは25±2℃の範囲内である。 The culture temperature may be any temperature at which Trevoxia algae or Yokowa algae can grow. Usually, it is within the range of 15 to 35 ° C., preferably 18 to 30 ° C., more preferably 20 to 28 ° C., and further preferably 25 ± 2 ° C.
　培養は、屋内、又は屋外のいずれであってもよい。飼料用やカロテノイドの抽出用として用いる場合には、大量培養可能な屋外培養でよい。一方、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類やそのカロテノイドをヒト飲食品用、医薬品用、及び化粧品用として用いる場合には、屋内培養が好ましい。屋内培養は、光、湿度、温度等の気象条件や培地の供給、及び無菌状態等が管理された植物工場のような完全閉鎖空間内の人工環境下における培養か、屋内に設置された培養庫内での培養のいずれであってもよい。 Culture may be indoors or outdoors. When used for feed or carotenoid extraction, outdoor culture capable of mass culture may be used. On the other hand, when Trevoxia algae or Yokowa amidro algae and their carotenoids are used for human foods and drinks, pharmaceuticals, and cosmetics, indoor culture is preferred. Indoor culture can be performed in an artificial environment in a completely enclosed space such as a plant factory where weather conditions such as light, humidity, and temperature, medium supply, and sterility are controlled, or an incubator installed indoors. Any of the culture in the inside may be sufficient.
　本工程では、全期間を通して、又は定期的若しくは不定期に、必要に応じて培地を撹拌してもよい。撹拌手段は問わない。例えば、撹拌棒等の撹拌装置を用いてもよいし、培養槽を反転、回転、振動することで培地を撹拌してもよい。また、必要に応じて、培地のCO2濃度が2～5％となるようにCO2を添加してもよい。 In this step, the medium may be agitated as necessary throughout the period or periodically or irregularly. Any stirring means may be used. For example, a stirring device such as a stirring rod may be used, or the culture medium may be stirred by reversing, rotating, or vibrating the culture tank. If necessary, CO 2 may be added so that the CO 2 concentration of the medium is 2 to 5%.
　本工程期間中、必要に応じて培地を1回又は複数回交換してもよい。交換培地は、使用中の培地と同じものが好ましいが、ストレス付与の効果を妨げない範囲で他の培地に交換することもできる。培地の交換時期は、特に限定しないが、培養液中のトレボウクシア藻類が死滅期（death phase）に入る前、具体的には静止期（stationary phase）が好ましい。また、培地交換の際に、必要に応じて培養液を希釈してもよい。 During this step, the medium may be changed once or multiple times as necessary. The exchange medium is preferably the same as the medium in use, but can be replaced with another medium as long as the effect of applying stress is not hindered. The time for exchanging the medium is not particularly limited, but it is preferably the stationary phase (stationary phase) before the Trevoxia algae in the culture solution enters the death phase. In addition, when changing the medium, the culture solution may be diluted as necessary.
１－３－２．回収工程
　「回収工程」（S002）とは、前記ストレス付与工程（S001）後の培養液からトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の藻体を回収する工程である。本工程は、培養液から培地や粗雑物等を除去して、藻体をスラリーの状態で回収することを目的とする。 1-3-2. Recovery Step “Recovery step” (S002) is a step of recovering the alga bodies of Trevoxia algae or Yokowa algae from the culture solution after the stress application step (S001). The purpose of this step is to recover the algal bodies in the form of a slurry by removing the culture medium and coarse matters from the culture solution.
　培養液から藻体を回収する方法は、当該分野で公知の常法を用いればよい。例えば、培養液を遠心又は濾過によって培地を除去する方法が挙げられる。具体的には、培養液を遠心機により適当な重力加速度（g）で適当な時間遠心した後に、上清を除去してスラリーを回収する方法や、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の藻体又は細胞サイズよりも小さい孔径を有するフィルターで濾過して培養液を除去し、フィルターに残ったスラリーを回収する方法が挙げられる。回収した藻体は、必要に応じて水又は培地と同程度の浸透圧を有するバッファ若しくは生理食塩水で1回以上洗浄してもよい。 As a method for recovering algal cells from the culture solution, a conventional method known in the art may be used. For example, a method of removing the culture medium by centrifuging or filtering the culture solution can be mentioned. Specifically, after centrifuging the culture solution with an appropriate gravity acceleration (g) for an appropriate period of time with a centrifuge, removing the supernatant and collecting the slurry, or the algal body or cell size of Trevoxia algae or Yokowa amid alga There is a method in which the culture solution is removed by filtration through a filter having a smaller pore size, and the slurry remaining on the filter is recovered. The collected algal cells may be washed once or more with water or a buffer or physiological saline having an osmotic pressure comparable to that of the medium as necessary.
　本工程により、細胞内にカロテノイドを大量蓄積したトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類をスラリーとして得ることができる。 Through this step, Trevoxia algae or Yokowa midoro algae in which a large amount of carotenoids are accumulated in the cells can be obtained as a slurry.
１－３－３．乾燥工程
　「乾燥工程」（S003）とは、前記回収工程（S002）後の藻体を乾燥させる工程である。本工程は、回収工程で得られた藻体を軽量化して、運搬や取扱いを容易にすることを目的とする。 1-3-3. Drying Step The “drying step” (S003) is a step of drying the algal bodies after the collecting step (S002). The purpose of this step is to reduce the weight of the algal bodies obtained in the recovery step and facilitate transportation and handling.
　本工程の「乾燥」とは、回収工程で得られたスラリー中の水分及び／又はトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞中の水分を減ずることをいう。乾燥によるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の生死は問わない。 “Drying” in this step refers to reducing the moisture in the slurry obtained in the recovery step and / or the moisture in the cells of Trevoxia algae or Yokowa algae. The life or death of Trevoxia algae or Yokowa midoro algae due to drying does not matter.
　乾燥方法は、水分を減じることができれば特に限定はしない。例えば、送風装置等を用いて温風若しくは冷風を当てる通風乾燥法、加熱により水分蒸発させる無風乾燥法、スラリーを適当なバッファで懸濁した後、その懸濁液を気体中に噴霧して急速乾燥させる噴霧乾燥、凍結乾燥（フリーズドライ）法、密閉容器内で真空ポンプ等を用いて脱気する真空乾燥法、外気に晒して放置する自然乾燥法（天日干しを含む）、又はその組み合わせが挙げられる。実際の工程では、上記方法を応用した各種乾燥装置を用いて行えばよい。例えば、ドラムドライヤー、遠赤バンド乾燥機、連続式真空乾燥装置、スプレードライヤー、フリーズドライヤー等が挙げられる。 The drying method is not particularly limited as long as moisture can be reduced. For example, a ventilation drying method in which hot or cold air is applied using a blower, a windless drying method in which moisture is evaporated by heating, a slurry is suspended in an appropriate buffer, and then the suspension is sprayed into a gas to rapidly Spray drying to dry, freeze drying (freeze drying) method, vacuum drying method to deaerate in a sealed container using a vacuum pump etc., natural drying method to leave exposed to the outside air (including sun drying), or a combination thereof Can be mentioned. In the actual process, various drying apparatuses to which the above method is applied may be used. For example, a drum dryer, a far-red band dryer, a continuous vacuum dryer, a spray dryer, a freeze dryer, and the like can be given.
　乾燥工程後の藻体は、固形状態、顆粒状態又は粉末状態のいずれであってもよい。運搬性を向上させるため、嵩を低減し収容率を向上させるため、等分量に分配可能にするため、又は後述の抽出工程においてカロテノイドの抽出効率を高めるためには顆粒状態又は粉末状態が好ましい。 The algal body after the drying step may be in a solid state, a granular state, or a powder state. In order to improve the transportability, to reduce the bulk and improve the accommodation rate, to be able to be divided into equal parts, or to increase the extraction efficiency of carotenoids in the extraction step described later, a granular state or a powder state is preferable.
　乾燥藻体の固体サイズが大きい場合には、乾燥藻体を必要に応じて断片化してもよい。本明細書において「断片化」とは、切断及び／又は粉砕により、乾燥藻体を小片状、顆粒状又は粉末状にすることをいう。乾燥藻体の断片化は、当該分野で公知の方法又は装置を用いて達成することができる。例えば、コンバージミル、ラインミル、押出し造粒機、破砕造粒機、環式圧縮解砕造粒機等の公知の断片化装置又は造粒装置、あるいはロール粉砕機又は摩砕機を用いて行えばよい。なお、前述のスプレードライヤー等を使用した噴霧乾燥等によりトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を乾燥させた場合には、乾燥と同時に粉末化することができるので便利である。 If the dry alga body has a large solid size, the dry alga body may be fragmented as necessary. In the present specification, “fragmentation” means that dried algal bodies are cut into pieces, granules, or powders by cutting and / or grinding. Fragmentation of dried alga bodies can be achieved using methods or devices known in the art. For example, a known fragmenting device or granulating device such as a convergence mill, a line mill, an extrusion granulator, a crushing granulator, a cyclic compression crushing granulator, or a roll crusher or a grinder may be used. . In addition, when Trevoxia algae or Yokowa midoro algae is dried by spray drying using the above-mentioned spray dryer or the like, it is convenient because it can be powdered simultaneously with drying.
　本工程により、細胞内にカロテノイドを大量蓄積したトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の総重量を軽減化し、取り扱いが容易になる。また、保存性も高まる。 This step reduces the total weight of Trevoxia algae or Yokowa amidrogae that have accumulated a large amount of carotenoids in the cells, and makes handling easier. Moreover, preservability is also increased.
１－３－４．抽出工程
　「抽出工程」（S004）とは、前記回収工程（S002）後、又は乾燥工程（S003）後のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の藻体又は細胞からカロテノイドを抽出する工程である。本工程の目的は、ストレス付与工程で藻体内に蓄積されたカロテノイドを抽出し、回収することである。 1-3-4. Extraction Step The “extraction step” (S004) is a step of extracting carotenoids from the algae bodies or cells of Trevoxia algae or Yokowa algae after the recovery step (S002) or the drying step (S003). The purpose of this step is to extract and collect carotenoids accumulated in the algal bodies in the stressing step.
　藻体からカロテノイドを抽出方法する方法は、植物細胞からカロテノイドを抽出する当該分野で公知のあらゆる方法を用いることができる。トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、クロレラ科藻類に代表されるように通常強固な細胞壁を有している。したがって、藻体からカロテノイドを効率的に抽出するには、回収したトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞を物理的方法及び／又は化学的方法で処理することが好ましい。 As a method for extracting carotenoids from algal cells, any method known in the art for extracting carotenoids from plant cells can be used. Trevoxia algae or Yokowa midoro algae usually have a strong cell wall, as typified by Chlorellaceae algae. Therefore, in order to efficiently extract carotenoids from the algal cells, it is preferable to treat the recovered cells of Trevoxia algae or Yokowa amid alga by physical methods and / or chemical methods.
　物理的方法としては、例えば、圧潰法、超音波法、又はその組み合わせによる抽出方法が挙げられる。 Examples of physical methods include an extraction method using a crushing method, an ultrasonic method, or a combination thereof.
　「圧潰法」とは、細胞に物理的圧力を付与して細胞壁を圧潰破砕し、細胞内の長鎖脂肪酸を抽出する方法である。圧潰法は、例えば、まず、回収した細胞をビーズミル又はグラインドミル等を用いて物理的にすり潰して破砕液を得る。具体的な条件や方法は、ミルの使用説明書等を参考にすればよい。その後、必要に応じて破砕液中のタンパク質を変性除去し、破砕溶液をそのまま又は有機溶媒等を加えて遠心した後、カロテノイドを含む有機溶媒相を回収する方法である。使用する有機溶媒は、低極性又は非極性の水非混和性媒体であればよく、n-ヘキサン若しくはn-ヘプタンのような炭素数6～10の脂肪族若しくは脂環式炭化水素又はベンゼンのような炭素数6～10の芳香族炭化水素が好ましく、ヘキサン又はn-ヘプタンがより好ましい。 The “crushing method” is a method in which a physical pressure is applied to cells to crush the cell wall and extract long-chain fatty acids in the cells. In the crushing method, for example, first, the collected cells are physically ground using a bead mill or a grind mill to obtain a crushed liquid. Specific conditions and methods may be referred to the mill instruction manual. Thereafter, the protein in the crushing solution is denatured and removed as necessary, and the crushing solution is centrifuged as it is or after adding an organic solvent or the like, and then the organic solvent phase containing the carotenoid is recovered. The organic solvent used may be a low-polar or non-polar water-immiscible medium, such as an aliphatic or alicyclic hydrocarbon having 6 to 10 carbon atoms such as n-hexane or n-heptane, or benzene. An aromatic hydrocarbon having 6 to 10 carbon atoms is preferable, and hexane or n-heptane is more preferable.
　「超音波法」とは、超音波によって細胞壁を破砕し、細胞内のカロテノイドを抽出する方法である。超音波法は、例えば、まず、回収した細胞を水又はバッファ等の適当な溶液に懸濁した後、超音波破砕装置（ソニケーター）を用いて適当な発振周波数と出力で細胞を破砕する。具体的な条件や方法は、超音波破砕装置の使用説明書等を参考にすればよい。その後、必要に応じて破砕液中のタンパク質を変性除去し、破砕溶液から前記圧潰による抽出方法と同様にカロテノイドを回収する方法が挙げられる。 The “ultrasonic method” is a method in which cell walls are crushed by ultrasonic waves and carotenoids in the cells are extracted. In the ultrasonic method, for example, first, the collected cells are suspended in an appropriate solution such as water or a buffer, and then the cells are crushed at an appropriate oscillation frequency and output using an ultrasonic crusher (sonicator). Specific conditions and methods may be referred to the instruction manual for the ultrasonic crushing apparatus. Thereafter, the protein in the crushing solution is denatured and removed as necessary, and the carotenoid is recovered from the crushing solution in the same manner as the extraction method by crushing.
　化学的方法としては、例えば、酵素法が挙げられる。 Examples of the chemical method include an enzyme method.
　「酵素法」とは、酵素によって細胞壁を溶解し、細胞内のカロテノイドを抽出する方法である。酵素方法では、例えば、Cellulase R-10、Hemicellulase、Lysozyme、α-Mannosidas、及びβ-Mannosidaseのカクテルを使用すればよい。酵素処理をする場合、まず、細胞を使用する酵素の存在下で処理する。その後、必要に応じて酵素処理溶液中のタンパク質を変性除去し、残った溶液から前記圧潰による抽出方法と同様にカロテノイドを回収する方法である。 The “enzymatic method” is a method in which cell walls are lysed by enzymes to extract carotenoids in the cells. In the enzyme method, for example, a cocktail of Cellulase® R-10, Hemicellulase, Lysozyme, α-Mannosidas, and β-Mannosidase may be used. When enzyme treatment is performed, first, cells are treated in the presence of the enzyme used. Thereafter, if necessary, the protein in the enzyme treatment solution is denatured and removed, and the carotenoid is recovered from the remaining solution in the same manner as the extraction method by crushing.
　本工程により、カロテノイドを細胞から分離し、有機溶媒中に溶解した抽出液として回収することができる。 Through this step, carotenoids can be separated from the cells and recovered as an extract dissolved in an organic solvent.
１－３－５．分離工程
　「分離工程」（S005）は、前記抽出工程（S004）で回収された抽出液からカロテノイドを分離し、精製する工程である。前記抽出工程で回収された抽出液には、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞から抽出されたカロテノイド以外の脂溶性物質が含まれている。本工程の目的は、その抽出液から目的とするカロテノイドを分離し、精製することである。 1-3-5. Separation Step The “separation step” (S005) is a step of separating and purifying carotenoids from the extract collected in the extraction step (S004). The extract collected in the extraction step contains a fat-soluble substance other than carotenoids extracted from cells of Trevoxia algae or Yokowa algae. The purpose of this step is to separate and purify the target carotenoid from the extract.
　有機溶媒に溶解したカロテノイドの回収方法又は精製方法は当該分野で公知の方法を用いればよく、特に限定はしない。例えば、エステル化やアルカリ等によって鹸化し、分溜する方法が挙げられる。 A method for recovering or purifying carotenoid dissolved in an organic solvent may be any method known in the art and is not particularly limited. For example, a method of saponification with an esterification or alkali or the like and fractionating may be mentioned.
　また、HPLC等の分離装置を用いて特定のカロテノイドを分離してもよい。 Further, a specific carotenoid may be separated using a separation apparatus such as HPLC.
１－４．効果
　本発明の生産方法によれば、通常培養の同種トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類と比較して細胞内に大量のカロテノイドを蓄積した藻体を簡便な方法で得ることができる。 1-4. Effect According to the production method of the present invention, an algal body in which a large amount of carotenoid is accumulated in cells can be obtained by a simple method as compared with the same-cultured homologous trevoxia algae or Yokowa midoro algae.
　また、その藻体からカロテノイドを抽出することで、カロテノイドを安定的に供給することができる。 Moreover, carotenoid can be stably supplied by extracting carotenoid from the alga body.
　さらに、本発明の生産方法によれば、特定のカロテノイドの藻内比率を制御し、様々な色彩のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を調製することができる。 Furthermore, according to the production method of the present invention, a specific carotenoid algae ratio can be controlled to prepare various colors of Trevoxia algae or Yokowa midoro algae.
２．カロテノイドを細胞内に蓄積したトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類
２－１．概要
　本発明の第２の態様はトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類である。本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、第１態様の生産方法によって得られるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類であって、強光ストレスを付与しない通常培養条件で培養した同種トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類と比較して細胞内に大量のカロテノイドを蓄積していることを特徴とする。本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、藻体のままで、生食できる他、後述する第３態様のように天然着色料や、飲食品への添加物として利用することができる。 2. 2. Trevoxia algae or Yokowa midoro algae that accumulate carotenoids in cells 2-1. Outline | summary The 2nd aspect of this invention is a trevouxia algae or a yellow-winged algae. The Trevoxia algae or Yokowa amidoro algae of the present invention is the Trevoxia algae or Yokowa amidro algae obtained by the production method of the first aspect, as compared with the same kind of Trevoxia algae or Yokowa amidro algae cultured under normal culture conditions that do not impart intense light stress. It is characterized by accumulating a large amount of carotenoids in cells. The Trevoxia algae or Yokowa amid alga of the present invention can be used as a natural colorant or an additive to foods and drinks as in the third embodiment to be described later, in addition to being able to eat raw algae.
２－２．構成
　本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、第１態様のカロテノイドの大量生産方法において、図１に示すストレス付与工程（S001）、回収工程（S002）、及び乾燥工程（S003）のいずれかの工程後に得られる藻体で構成される。細胞の生死は問わない。 2-2. Structure The trevoxia algae or the yellow algae of the present invention is any one of the stress application step (S001), the recovery step (S002), and the drying step (S003) shown in FIG. 1 in the carotenoid mass production method of the first aspect. It consists of alga bodies obtained later. It does not matter whether the cells are alive or dead.
　ストレス付与工程（S001）後の藻体で構成されるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、培養中のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類に対して、500～2500μmol photons/m2/sの光強度で150～500時間光を照射する強光ストレスを付与することによって得ることができる。強光ストレスの具体的な付与方法については第１態様で詳述したことから、本態様ではその説明を省略する。本工程後のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、培養液に混在した状態で得られる。 Trevoxia algae or Yokowa midoro algae composed of algal bodies after the stress application step (S001) is 150 to 500 hours at a light intensity of 500-2500 μmol photons / m 2 / s against Trevoxia algae or Yokowa midoro algae in culture It can be obtained by applying intense light stress that irradiates light. Since the specific application method of intense light stress has been described in detail in the first aspect, the description thereof is omitted in this aspect. The Trevoxia algae or Yokowa midoro algae after this step are obtained in a mixed state in the culture solution.
　回収工程（S002）後の藻体で構成されるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、ストレス付与工程（S001）後の培養液から培地を除去し、藻体を回収することによって得ることができる。培養液から藻体を回収する具体的な方法については、第１態様で詳述したことから、本態様ではその説明を省略する。本工程後のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、スラリーの状態で得られる。この状態の藻体は、食品として、例えば、パン等に塗布するペーストとして生食することもできる。 The Trevoxia algae or Yokowa midoro algae composed of the algal bodies after the recovery step (S002) can be obtained by removing the medium from the culture solution after the stress applying step (S001) and recovering the algal bodies. Since the specific method for recovering algal cells from the culture broth has been described in detail in the first aspect, the description thereof is omitted in this aspect. Trevoxia algae or Yokowa midoro algae after this step are obtained in a slurry state. The algal bodies in this state can be eaten raw as food, for example, as a paste applied to bread or the like.
　乾燥工程（S003）後の藻体で構成されるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、回収工程（S002）後の藻体を乾燥させることによって得ることができる。藻体を乾燥させる具体的な方法については、第１態様で詳述したことから、本態様ではその説明を省略する。本工程後のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、固形状態（小片状態、顆粒状態又は粉末状態を含む）で得られる。 The Trevoxia algae or Yokowa algae composed of algal bodies after the drying step (S003) can be obtained by drying the algal bodies after the recovery step (S002). Since the specific method for drying the algal bodies has been described in detail in the first aspect, the description thereof is omitted in this aspect. The Trevoxia algae or Yokowa algae after this step is obtained in a solid state (including a small piece state, a granular state, or a powder state).
　本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、第１態様の生産方法によって得られるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類である。これらの藻類は、強光ストレスを付与しない通常培養条件下で培養した同種藻類と比較して細胞内植物色素に占めるカロテノイド率が有意に高い。 The Trevoxia algae or Yokowa midoro algae of the present invention is the Trevoxia algae or Yokowa midoro algae obtained by the production method of the first aspect. These algae have a significantly higher carotenoid ratio in intracellular plant pigments than the same species of algae cultured under normal culture conditions that do not impart intense light stress.
　ここでいう「通常培養条件」とは、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の生育及び増殖を目的として当該分野で一般的に使用される培養条件をいう。例えば、クロレラ科藻類であれば、培地は、基本培地であるTAP培地（組成は前述）等を用いて、20～35℃の培養温度下で、20～150μmol/m2/sの光強度の光を明期：暗期＝8時間：16時間～16時間：8時間の範囲で培養する場合が挙げられる。 As used herein, “normal culture conditions” refers to culture conditions generally used in the art for the purpose of growth and proliferation of Trevoxia algae or Yokowa algae. For example, in the case of Chlorellaceae algae, the medium is a basic medium such as TAP medium (the composition is described above) and the like, with a light intensity of 20 to 150 μmol / m 2 / s at a culture temperature of 20 to 35 ° C. A case where light is cultured in the light period: dark period = 8 hours: 16 hours to 16 hours: 8 hours is mentioned.
　「細胞内植物色素に占めるカロテノイド率」とは、細胞あたりに含まれる全植物色素の量を100％としたときにカロテノイドの量が占める比率（％）をいう。植物色素の量は、質量又は容量等の絶対値であってもよいし、吸光度等の相対値に基づく換算値であってもよい。前述のようにトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、植物色素としてクロロフィルとカロテノイドのみを含むことから、ここでいうカロテノイド率とは、細胞あたりのクロロフィル量と全カロテノイド量の総和に対するカロテノイド量の割合に相当する。 “The carotenoid ratio in the intracellular plant pigment” refers to the ratio (%) of the amount of carotenoid when the amount of all plant pigments contained per cell is 100%. The amount of the plant pigment may be an absolute value such as mass or volume, or a converted value based on a relative value such as absorbance. As described above, Trevoxia algae or Yokowa amidro algae contain only chlorophyll and carotenoids as plant pigments, so the carotenoid rate here corresponds to the ratio of the amount of carotenoids to the sum of the amount of chlorophyll per cell and the total amount of carotenoids. .
　また、ここでいう「有意」とは、統計学的に有意差があることをいう。「統計学的に有意差がある」とは、通常培養条件と、第１態様に記載した本発明の強光培養条件のそれぞれから得られたトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞内植物色素に占めるカロテノイド率を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。有意差があるか否かの判断基準は、例えば、統計学的検定において、得られた値の危険率（有意水準）が小さい場合、例えば、p値が0.05未満（p＜0.05：危険率5％未満）、0.01未満（p＜0.01：危険率1％未満）又は0.001未満（p＜0.001：危険率0.1％未満）の場合が挙げられる。「p（値）」とは、統計学的検定において仮定した統計量分布において、その仮定が偶然正しくなる確率を示す。p（値）が小さいほど、仮定が真に近いことを意味するため、両者間に有意に差があると判断できる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、多重比較検定法を用いることができる。 Also, “significant” here means that there is a statistically significant difference. “Statistically significant difference” means that carotenoids occupy the intracellular plant pigments of trevoxia algae or sorghum algae obtained from the normal culture conditions and the intense light culture conditions of the present invention described in the first aspect. When the rate is processed statistically, it means that there is a significant difference between the two. The criterion for determining whether there is a significant difference is, for example, when the risk value (significance level) of the obtained value is small in a statistical test, for example, the p value is less than 0.05 (p <0.05: risk factor 5 %), Less than 0.01 (p <0.01: less than 1% risk) or less than 0.001 (p <0.001: less than 0.1% risk). “P (value)” indicates a probability that the assumption is accidentally correct in the statistical distribution assumed in the statistical test. A smaller p (value) means that the assumption is closer to true, so it can be determined that there is a significant difference between the two. The test method for statistical processing is not particularly limited as long as a known test method capable of determining the presence or absence of significance is appropriately used. For example, Student's t test or multiple comparison test can be used.
２－３．効果
　本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、細胞内に大量のカロテノイドを蓄積している。 2-3. Effect The Trevoxia algae or Yokowa midoro algae of the present invention accumulates a large amount of carotenoids in cells.
　本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、そのまま生食することもできる他、後述する天然着色料成分として、また抗酸化剤の有効成分として利用することができる。特に、藻体内に含まれるカロテノイドの種類や比率によって本発明の藻類の藻体は、茶色～黄緑色の様々な色彩を呈することから、様々なカラーバリエーションを有する生食用藻体、抗酸化剤、又は天然着色料として利用することができる。 The Trevoxia algae or Yokowa amid alga of the present invention can be eaten as it is, and can be used as a natural colorant component described later and as an active ingredient of an antioxidant. In particular, the algal bodies of the algae of the present invention exhibit various colors from brown to yellow-green depending on the type and ratio of carotenoids contained in the algal bodies, so that raw edible alga bodies having various color variations, antioxidants, Or it can utilize as a natural coloring agent.
３．天然着色料
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、天然着色料である。本発明の天然着色料は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を色素成分とする。本発明によれば、カロテノイドを主成分とする人体に安全な色素を大量かつ安定的に提供することができる。 3. Natural colorants 3-1. Outline | summary The 3rd aspect of this invention is a natural coloring agent. The natural colorant of the present invention contains the trevoxia algae or Yokowa amid alga of the second aspect as a pigment component. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, a safe pigment | dye can be stably provided in large quantities to the human body which has a carotenoid as a main component.
３－２．構成
　「天然着色料」とは、自然物に由来する色素成分であって、飲食品、化粧品、医薬品等に添加して、その色調を調整するために使用される添加剤をいう。天然着色料の原料となる自然物には、植物、糸状菌、細菌、昆虫が知られている。本発明の天然着色料は、必須成分である色素成分、及び選択成分である溶媒及び／又は担体を含む。以下、各成分について具体的に説明をする。 3-2. Structure “Natural colorant” is a pigment component derived from a natural product, and is an additive used to add to foods, beverages, cosmetics, pharmaceuticals, etc. and adjust the color tone. Plants, filamentous fungi, bacteria, and insects are known as natural products that serve as raw materials for natural colorants. The natural colorant of the present invention includes a pigment component that is an essential component, and a solvent and / or carrier that is a selective component. Hereinafter, each component will be specifically described.
（１）色素成分
　本発明の天然着色料は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を色素成分とする。実質的な色素成分は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞内に大量に蓄積されたカロテノイドである。本発明の天然着色料の色幅は、茶色、赤色、橙赤色、橙色、橙黄色、黄色、淡黄色（レモン色）、黄緑、萌葱色、及びそれらの中間色に及ぶ。本発明の天然着色料の色彩は、第２態様におけるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞内に蓄積されたカロテノイドの種類、及び細胞内に占めるそのカロテノイドの種の量比に基づく。例えば、細胞内カロテノイドにおいてルテイン及び／又はゼアキサンチン、またはネオキサンチン又はアンテラキサンチンの比率が高いトレボウクシア藻類は、橙黄色～黄色着色料となり得る。また、細胞内カロテノイドにおいてアスタキサンチン及び／又はその誘導体（カンタキサンチン等）の比率が高いヨコワミドロ藻類は赤色着色料となり得る。本発明の天然着色料は、顔料のように、異なる色を呈するカロテノイドを蓄積したトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を組み合わせて新たな色彩を調製してもよい。例えば、前述のルテイン等の比率が高い黄色用トレボウクシア藻類とアスタキサンチン等の比率が高い赤色用ヨコワミドロ藻類とを混合して橙色着色料を調製することもできる。 (1) Dye component The natural colorant of the present invention uses the trevoxia algae or the yellow algae of the second aspect as a dye component. The substantial pigment component is a carotenoid accumulated in a large amount in the cells of the Trevoxia algae or Yokowa midoro algae of the second embodiment. The color range of the natural colorant of the present invention extends to brown, red, orange-red, orange, orange-yellow, yellow, light yellow (lemon), yellow-green, amber, and intermediate colors thereof. The color of the natural colorant of the present invention is based on the kind of carotenoid accumulated in the cells of Trevoxia algae or Yokowa amidro algae in the second embodiment, and the amount ratio of the carotenoid species in the cells. For example, trevoxia algae having a high ratio of lutein and / or zeaxanthin, or neoxanthine or anthaxanthin in intracellular carotenoids can be orange-yellow to yellow colorants. In addition, a yellow algae having a high ratio of astaxanthin and / or a derivative thereof (such as canthaxanthin) in an intracellular carotenoid can be a red colorant. The natural colorant of the present invention may be prepared in a new color by combining Trevoxia algae or Yokohama algae with accumulated carotenoids exhibiting different colors, such as pigments. For example, an orange colorant can also be prepared by mixing yellow trevoxia algae with a high ratio of lutein, etc., and red yellow algae with a high ratio of astaxanthin or the like.
　第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類には、ストレス付与工程（S001）後の藻体で構成されるもの、回収工程（S002）後の藻体で構成されるもの、及び乾燥工程（S003）後の藻体で構成されるものの3形態があるが、本発明の天然着色料は、いずれの藻体で構成されていてもよく、またいずれの場合も細胞の生死は問わない。また、2形態以上の藻体を組み合わせた構成であってもよい。例えば、回収工程後のスラリー状態の藻体と乾燥工程後の粉末状態の藻体を混合したものが挙げられる。軽量性、コンパクト性、及び保存性等の観点から、回収工程後及び／又は乾燥工程後の藻体で構成されるものが好ましく、乾燥工程後の藻体で構成されるものがより好ましい。乾燥工程後の藻体で構成される場合、容量又は重量計測の容易性、及び添加後の混合容易性等の観点から顆粒状態又は粉末状態が好ましい。 The Trevoxia algae or the yellow algae of the second aspect includes those composed of algal bodies after the stress application step (S001), those composed of algal bodies after the recovery step (S002), and after the drying step (S003). The natural colorant of the present invention may be composed of any algal body, and in any case, the viability of the cell is not questioned. Moreover, the structure which combined the algal body of 2 or more forms may be sufficient. For example, what mixed the algal body of the slurry state after a collection process and the algal body of the powder state after a drying process is mentioned. From the viewpoints of lightness, compactness, storage stability, etc., those composed of algal bodies after the recovery process and / or drying process are preferred, and those composed of algal bodies after the drying process are more preferred. When comprised with the algal body after a drying process, a granular state or a powder state is preferable from viewpoints, such as the ease of a volume or weight measurement, and the ease of mixing after addition.
（２）溶媒
　本発明の天然着色料は、必要に応じて薬学上又は食品衛生上許容可能な溶媒を含む。本明細書で「薬学上又は食品衛生上許容可能」とは、医薬品若しくは化粧品の製剤技術分野又は食品衛生分野において人体等の生体に無害であり、かつ本発明の天然着色料の色調、又は医薬品若しくは化粧品の薬理効果に支障を与えないことをいう。 (2) Solvent The natural colorant of the present invention contains a pharmaceutically or food hygiene acceptable solvent as necessary. In the present specification, “pharmaceutically or food hygiene acceptable” means harmless to a living body such as a human body in the pharmaceutical technology or cosmetic preparation technical field or the food hygiene field, and the color tone of the natural colorant of the present invention or the pharmaceutical product. Or it does not impair the pharmacological effects of cosmetics.
　薬学上又は食品衛生上許容可能な溶媒として、例えば、水若しくはそれ以外の薬学上又は食品衛生上許容し得る、水溶液、油又は有機溶剤が挙げられる。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。油としては、小麦胚芽油、杏子油、オリーブオイル、椿油、イブニングプリムローズオイル、アロエベラオイル、菜種油、パーム油、綿実油、大豆油、コーン油、紅花油、ゴマ油、亜麻仁油、ひまし油等の植物油が挙げられる。有機溶剤としては、エタノール等が挙げられる。 Examples of the pharmaceutically or food hygiene acceptable solvent include water or other pharmaceutically or food hygiene acceptable aqueous solution, oil or organic solvent. Examples of the aqueous solution include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, phosphate buffers, and sodium acetate buffers. Examples of adjuvants include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, low concentration nonionic surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and the like. Oils include vegetable oils such as wheat germ oil, apricot oil, olive oil, camellia oil, evening primrose oil, aloe vera oil, rapeseed oil, palm oil, cottonseed oil, soybean oil, corn oil, safflower oil, sesame oil, linseed oil, castor oil Can be mentioned. Ethanol etc. are mentioned as an organic solvent.
（３）担体
　本発明の天然着色料は、必要に応じて薬学上又は食品衛生上許容可能な担体を含む。担体は、着色料としての取り扱いを容易にし、また剤形を維持する他、色素成分であるカロテノイドの変性を防ぎ、色調を維持することができる。担体には、例えば、賦形剤、結合剤、充填剤、乳化剤、pH調整剤、硬化調節剤、防腐剤、流動添加調節剤等が挙げられる。 (3) Carrier The natural colorant of the present invention contains a pharmaceutically or food hygiene acceptable carrier as necessary. The carrier facilitates handling as a colorant and maintains the dosage form, and also prevents the carotenoid that is a pigment component from being denatured and maintains the color tone. Examples of the carrier include an excipient, a binder, a filler, an emulsifier, a pH adjuster, a curing modifier, a preservative, and a fluid addition modifier.
　賦形剤には、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。 Excipients include, for example, sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides, metal salts, citric acid, tartaric acid, glycine, polyethylene glycol, pluronic, kaolin, silicic acid, or combinations thereof. It is done.
　結合剤には、例えば、植物デンプンを用いたデンプン糊、ペクチン、キサンタンガム、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、パラフィン、ポリビニルピロリドン又はそれらの組み合わせが挙げられる。 Examples of the binder include starch paste using plant starch, pectin, xanthan gum, simple syrup, glucose solution, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, shellac, paraffin, polyvinylpyrrolidone, or combinations thereof. Can be mentioned.
　充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。 Examples of fillers include petrolatum, the sugar and / or calcium phosphate.
　乳化剤としては、界面活性剤（例えば、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、酢酸グリセリル、イソステアラミド、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル）が例として挙げられる。 Examples of the emulsifier include surfactants (for example, polyethylene glycol, poloxamer, glyceryl acetate, isostearamide, sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester).
　pH調整剤には、アルカリ剤としての水酸化ナトリウムや水酸化カリウム、また酸剤としての、クエン酸、クエン酸ナトリウム、グリコール酸、アスコルビン酸等が挙げられる。 Examples of pH adjusters include sodium hydroxide and potassium hydroxide as alkaline agents, and citric acid, sodium citrate, glycolic acid, ascorbic acid and the like as acid agents.
　流動添加調節剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。 Examples of the flow addition regulator include silicate, talc, stearate or polyethylene glycol.
　上記の他にも、必要であれば可溶化剤、希釈剤、分散剤、安定剤、保湿剤、保存剤等張化剤等を適宜含むこともできる。 In addition to the above, if necessary, solubilizers, diluents, dispersants, stabilizers, humectants, preservatives such as tonicity agents and the like can be included as appropriate.
　本発明の天然着色料の剤形は、飲食品（飼料を含む）、化粧品、医薬品等への添加及び／又は混合に適した剤形にすればよく、特に限定はしない。顆粒剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、液剤、懸濁剤等は、対象物に添加しやすいことから剤形として好ましい。 The dosage form of the natural colorant of the present invention is not particularly limited as long as it is a dosage form suitable for addition and / or mixing to foods and drinks (including feed), cosmetics, pharmaceuticals and the like. Granules, powders, pastes, gels, liquids, suspensions, and the like are preferable as dosage forms because they can be easily added to objects.
　本発明の天然着色料の使用方法は、特に限定はしないが、通常は着色すべき飲食品（飼料を含む）、化粧品、医薬品等の製造時に直接添加すればよい。飲食品（飼料を含む）、化粧品、医薬品等が固体であれば、着色すべき対象物の表面を被覆するように本発明の天然着色料を塗布してもよい。 The method of using the natural colorant of the present invention is not particularly limited, but it may be added directly at the time of production of foods and drinks (including feed), cosmetics, pharmaceuticals and the like to be colored normally. If food / beverage products (including feed), cosmetics, pharmaceuticals and the like are solid, the natural colorant of the present invention may be applied so as to cover the surface of the object to be colored.
３－３．効果
　本発明の天然着色料は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類自体を色素成分とするが、その主成分は植物色素のカロテノイドである。カロテノイドの多くは野菜や果物等の一般食品となる植物にも含まれており、人体等の生体に対する危険性は無いか限りなく低い。したがって、本発明の天然着色料は、生体に対する安全性が極めて高く、飲食品、化粧品又は医薬品の着色料として有用である。 3-3. Effect The natural colorant of the present invention uses the trevoxia algae or the yellow algae itself of the second aspect as a pigment component, but the main component is a carotenoid of a plant pigment. Many of carotenoids are also contained in plants that are general foods such as vegetables and fruits, and there is no limit to the danger to living bodies such as human bodies. Therefore, the natural colorant of the present invention has extremely high safety for living organisms and is useful as a colorant for foods, drinks, cosmetics or pharmaceuticals.
　また、一般にカロテノイドは、動物細胞内では合成できないので魚介類や鳥類等には摂取した餌に含まれるカロテノイドを体内に蓄積し、発色又は色調を維持している種が多い。本発明の天然着色料は、前述のように主成分がカロテノイドであることから、養殖魚類用飼料及び愛玩動物用飼料（熱帯魚用飼料、鳥類用飼料等）に添加することで、飼料の着色のみならず、それを摂取した動物の色揚げ剤としても利用することができる。特に水産業界において養殖魚等の外観美や肉色は商品価値を左右する重要な因子であることから、本発明の天然着色料は安全性の高い色揚げ剤として有用性が高い。 In general, since carotenoids cannot be synthesized in animal cells, many species of fish and shellfish accumulate carotenoids contained in the ingested food and maintain their color or tone. As described above, the natural colorant of the present invention is composed mainly of carotenoids, so that it can be added to cultured fish feeds and pet food feeds (tropical fish feeds, bird feeds, etc.) only for coloring feeds. It can also be used as a color frying agent for animals that have consumed it. In particular, since the appearance and meat color of cultured fish and the like are important factors affecting the commercial value in the fishery industry, the natural colorant of the present invention is highly useful as a highly safe coloring agent.
　さらに、本発明の抗酸化剤は、後述する第４態様の抗酸化剤と構成が実質的に同じであることから、飲食品、化粧品又は医薬品への着色と同時に、それらに抗酸化作用を付与することもできる。 Furthermore, since the antioxidant of the present invention has substantially the same configuration as the antioxidant of the fourth aspect described later, it imparts an antioxidant action to the food, food, cosmetics or pharmaceuticals at the same time as coloring. You can also
４．抗酸化剤
４－１．概要
　本発明の第４の態様は、抗酸化剤である。本発明の抗酸化剤は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を有効成分とする。本発明によれば、カロテノイドを主成分とする人体に安全な抗酸化剤を提供することができる。 4). Antioxidant 4-1. Outline | summary The 4th aspect of this invention is an antioxidant. The antioxidant of the present invention contains the trevoxia algae or the yellow algae of the second aspect as an active ingredient. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the safe antioxidant for the human body which has carotenoid as a main component can be provided.
４－２．構成
　「抗酸化剤」（抗酸化物質又は酸化防止剤）とは、活性酸素（スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素等）を除去又は消去する物質である。具体的には、活性酸素を還元して安定な分子に変化させることで、活性酸素が関与する有害な反応を抑制することができる物質をいう。動植物によって生合成される抗酸化剤も多く、例えば、ビタミンC（アスコルビン酸）、ビタミンE（トコフェロール）、コエンザイムQ10、カロテノイド、フラボノイド等は、代表的な生物由来の抗酸化剤として知られている。 4-2. Structure “Antioxidant” (antioxidant or antioxidant) is a substance that removes or eliminates active oxygen (superoxide anion, hydroxy radical, hydrogen peroxide, singlet oxygen, etc.). Specifically, it refers to a substance that can suppress harmful reactions involving active oxygen by reducing active oxygen into stable molecules. There are many antioxidants biosynthesized by animals and plants. For example, vitamin C (ascorbic acid), vitamin E (tocopherol), coenzyme Q10, carotenoids, flavonoids, etc. are known as typical biological antioxidants. .
　なお、本発明の抗酸化剤とは、上記一般定義のような単一物質のみで構成される狭義の抗酸化剤だけでなく、複数の抗酸化剤の混合物や、単一又は複数の抗酸化剤と担体等との混合物からなる、いわゆる抗酸化組成物を包含する広義の抗酸化剤を意味するものとする。 The antioxidant of the present invention is not only a narrowly defined antioxidant composed of only a single substance as in the above general definition, but also a mixture of a plurality of antioxidants or a single or a plurality of antioxidants. It means an antioxidant in a broad sense including a so-called antioxidant composition comprising a mixture of an agent and a carrier.
　本発明の抗酸化剤は、必須成分である有効成分、及び選択成分である溶媒及び／又は担体を含む。以下、各成分について具体的に説明をする。 The antioxidant of the present invention includes an active ingredient that is an essential component and a solvent and / or carrier that is a selective component. Hereinafter, each component will be specifically described.
（１）有効成分
　本発明の抗酸化剤は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を有効成分として含む。第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、細胞内にカロテノイドを大量に蓄積している。前述のようにカロテノイドは、強い抗酸化力を有する抗酸化物質であることから、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類に含まれるカロテノイドが本発明の抗酸化剤の実質的な有効成分となる。 (1) Active ingredient The antioxidant of this invention contains the Trevoxia algae or Yokowa midoro algae of a 2nd aspect as an active ingredient. The Trevoxia algae or Yokowa midoro algae according to the second aspect accumulates a large amount of carotenoids in the cells. As described above, since carotenoid is an antioxidant substance having a strong antioxidant power, the carotenoid contained in the trevoxia algae or the yellow algae of the second aspect is a substantial active ingredient of the antioxidant of the present invention.
　本発明の抗酸化剤は、有効成分として、異なるカロテノイドを含む2種以上の第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を含んでいてもよい。また、他の公知の抗酸化剤、例えば、ビタミンEやフラボノイド等を互いの抗酸化作用を阻害しない範囲で含むこともできる。 The antioxidant of the present invention may contain, as an active ingredient, two or more kinds of Trevoxia algae or Yokowa midoro algae containing two or more different carotenoids. In addition, other known antioxidants such as vitamin E and flavonoids can also be contained within a range that does not inhibit each other's antioxidant action.
　本発明の抗酸化剤に含まれる第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の含有量（重量％）は、その抗酸化剤に包含される藻類の種類、その藻体に含まれるカロテノイドの種類、剤形、並びに後述する担体の種類によって異なる。有効成分である第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類がその機能を発揮し得る量で、かつ生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く生じない量であれば特に限定はなく、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。一般にカロテノイドは、生体に対して無害又は有害性が極めて低いことから、大量摂取しても副作用は生じない。それ故、例えば、含有量100重量％に相当するトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類のみで構成されていてもよい。 The content (% by weight) of the Trevoxia algae or Yokowa midoro algae of the second aspect contained in the antioxidant of the present invention is the kind of algae included in the antioxidant, the kind of carotenoid contained in the alga body, and the agent It differs depending on the shape and the type of carrier described later. There is no particular limitation as long as it is an amount in which the Trevoxia algae or Yokowa algae of the second aspect, which is an active ingredient, can exert its function, and causes little or no adverse side effects on the living body. It may be determined as appropriate in consideration. In general, carotenoids are harmless or harmful to living organisms, so no side effects occur even if they are ingested in large quantities. Therefore, for example, it may be composed only of Trevoxia algae or Yokowa midoro algae corresponding to a content of 100% by weight.
（２）溶媒
　本発明の抗酸化剤は、必要に応じて薬学上又は食品衛生上許容可能な溶媒を含む。本発明の抗酸化剤で使用され得る具体的な溶媒については、第３態様の天然着色料における溶媒と同じでよい。 (2) Solvent The antioxidant of the present invention contains a pharmaceutically or food hygiene acceptable solvent as necessary. The specific solvent that can be used in the antioxidant of the present invention may be the same as the solvent in the natural colorant of the third aspect.
（３）担体
　本発明の抗酸化剤は、必要に応じて薬学上又は食品衛生上許容可能な担体を含む。本発明の抗酸化剤で使用され得る具体的な担体については、第３態様の天然着色料における担体と同じでよい。 (3) Carrier The antioxidant of the present invention contains a pharmaceutically or food hygiene acceptable carrier as necessary. Specific carriers that can be used in the antioxidant of the present invention may be the same as the carriers in the natural colorant of the third aspect.
　本発明の抗酸化剤の剤形は、使用用途に合わせて適宜定めればよい。例えば、飲食品（飼料を含む）、化粧品等への添加剤として用いる場合には、添加混合に適した剤形にすればよい。例えば、顆粒剤、粉剤、ペースト剤、液剤、懸濁剤、ゲル剤等は、対象物に添加しやすいので好ましい。一方、医薬品又は特定保健用食品として用いる場合には、投与に適した剤形が好ましい。投与法は、経口投与と非経口投与に大別することができるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。本発明の抗酸化剤は、通常は経口投与剤として用いることが好ましいが、これに限定はされない。 The dosage form of the antioxidant of the present invention may be appropriately determined according to the intended use. For example, when used as an additive to foods and drinks (including feed), cosmetics, etc., a dosage form suitable for additive mixing may be used. For example, granules, powders, pastes, solutions, suspensions, gels, and the like are preferable because they can be easily added to an object. On the other hand, when used as a pharmaceutical product or food for specified health use, a dosage form suitable for administration is preferred. Administration methods can be broadly classified into oral administration and parenteral administration, so that dosage forms suitable for each administration method may be used. The antioxidant of the present invention is usually preferably used as an oral administration agent, but is not limited thereto.
　経口投与に適した剤形としては、例えば、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤（内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤を含む）等が挙げられる。固形剤は、必要に応じて当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。 Suitable dosage forms for oral administration include, for example, solid preparations (including tablets, pills, sublingual tablets, capsules, drops, troches), granules, powders, powders, liquids (internal solutions, suspensions). Agents, emulsions, and syrups). The solid preparation can be made into a dosage form with a coating known in the art, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric tablet, a film-coated tablet, a double tablet, or a multilayer tablet as necessary. .
　非経口投与は、全身投与及び局所投与に二分され、局所投与は組織内投与、経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分できることから、抗酸化剤もそれぞれの投与法に適した剤形にすればよい。例えば、経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。 Parenteral administration is divided into systemic administration and topical administration, and local administration can be further subdivided into tissue administration, transepidermal administration, transmucosal administration, and rectal administration, so that antioxidants are also suitable for each administration method What is necessary is just to make a dosage form. For example, dosage forms suitable for transepidermal or transmucosal administration include solutions (including coating agents, eye drops, nasal drops, and inhalants), suspensions (including emulsions and creams), and powders (dots). Nasal and suction agents), pastes, gels, ointments, plasters and the like.
　上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、それぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。また本発明の抗酸化剤の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載された方法を参照することができる。 The specific shape and size of each dosage form are not particularly limited as long as each dosage form is within the range of dosage forms known in the art. Moreover, what is necessary is just to formulate according to the conventional method of the said technical field about the manufacturing method of the antioxidant of this invention. For example, the method described in Remington's Pharmaceuticals Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.) Can be referred to.
４－３．効果
　本発明の抗酸化剤は、生体に対する危険性が無いか限りなく低いことから、抗酸化作用と安全性が高い飲食品用、特定保健用食品、化粧品用、又は医薬品用の添加剤として利用することができる。 4-3. Effect Since the antioxidant of the present invention is low as long as there is no danger to the living body, it is used as an additive for food and drink, food for specified health use, cosmetics, or pharmaceuticals with high antioxidant action and safety. can do.
５．飲食品
５－１．概要
　本発明の第５の態様は、飲食品である。本発明の飲食品は、第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤を含むことを特徴とする。本発明によれば、色味と抗酸化作用を有する飲食品を提供することができる。 5. Food and drink 5-1. Outline | summary The 5th aspect of this invention is food-drinks. The food / beverage products of this invention are characterized by including the natural colorant of a 3rd aspect, or the antioxidant of a 4th aspect. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the food / beverage products which have a color taste and an antioxidant effect can be provided.
５－２．構成
　本発明の飲食品は、第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤を含む。前述のように第３態様の天然着色料及び第４態様の抗酸化剤は実質的にその構成が同一である。したがって、本発明の飲食品は、第３態様の天然着色料に基づく色を呈し、同時に第４態様の抗酸化剤による高い抗酸化作用を有する。 5-2. Structure The food or drink of the present invention contains the natural colorant of the third aspect or the antioxidant of the fourth aspect. As described above, the natural colorant of the third aspect and the antioxidant of the fourth aspect have substantially the same configuration. Therefore, the food / beverage products of this invention exhibit the color based on the natural colorant of a 3rd aspect, and have the high antioxidant effect | action by the antioxidant of a 4th aspect simultaneously.
　本明細書において「飲食品」とは、飲料、食品及び飼料を総称する用語である。 In this specification, “food and beverage” is a term that collectively refers to beverages, foods, and feeds.
　飲料は、例えば、水（精製水、ミネラルウォーター、海洋深層水を含む）、茶飲料（緑茶、ウーロン茶、紅茶を含む）、コーヒー、コーヒー飲料、乳（生乳、加工乳を含む）、乳飲料、乳酸菌飲料、ジュース、清涼飲料水（炭酸飲料、果汁飲料、粉末飲料、スポーツドリンクを含む）、ゼリー飲料、ココア飲料、醸造酒（ビール、日本酒、黄酒、ワイン、シードルを含む）、蒸留酒（ウイスキー、ブランデー、ウォッカ、ラム、テキーラ、焼酎、白酒、ジンを含む）、及び混成酒（リキュール、梅酒、ベルモットを含む）が該当する。　食品は、一般食品（特に加工食品）及び特定保健用食品を含む。加工食品には、例えば、パン類、米飯類、麺類、パスタ、マヨネーズ、ショートニング、カスタードクリーム、ドレッシング類、牛乳、ヨーグルト、スープ、味噌汁、豆腐、スプレッド類（バター、ジャム、ふりかけ、マーガリン等）、ソース類、醤油、油、又は菓子（例えば、クッキー類、チョコレート、キャンディ、ケーキ、アイスクリーム、チューインガム）等が該当する。 Beverages include, for example, water (including purified water, mineral water, deep sea water), tea drinks (including green tea, oolong tea, and tea), coffee, coffee drinks, milk (including raw milk and processed milk), milk drinks, Lactic acid bacteria beverages, juices, soft drinks (including carbonated beverages, fruit juice beverages, powdered beverages, sports drinks), jelly beverages, cocoa beverages, brewed sake (including beer, sake, yellow wine, wine, cider), distilled spirits (whiskey) , Brandy, vodka, rum, tequila, shochu, white liquor, gin) and mixed liquor (including liqueur, plum wine, vermouth). Food includes general foods (especially processed foods) and foods for specified health use. Processed foods include, for example, breads, cooked rice, noodles, pasta, mayonnaise, shortening, custard cream, dressings, milk, yogurt, soup, miso soup, tofu, spreads (butter, jam, sprinkle, margarine, etc.), Sauces, soy sauce, oil, confectionery (for example, cookies, chocolate, candy, cake, ice cream, chewing gum) and the like are applicable.
　飼料は、例えば、養殖魚介類用飼料、家畜用飼料、鑑賞動物用飼料、又はペットフード等が含まれる。 The feed includes, for example, cultured seafood feed, livestock feed, appreciation animal feed, or pet food.
　本態様の飲食品は、製造過程で又は製造後に、第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤が添加される。本態様の飲食品の製造方法は、飲食品の製造過程で使用される他の食品素材、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、アミノ酸、各種油脂、種々の添加剤（例えば呈味成分、甘味料、有機酸等の酸味料、界面活性剤、pH調整剤、安定剤、酸化防止剤、色素、フレーバー）等を配合し、常法に従って製造すればよい。また、製造後の飲食品に第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤を添加することにより、本発明に係る食品を製造することもできる。 The food / beverage product of this aspect is added with the natural colorant of the third aspect or the antioxidant of the fourth aspect during or after the production. The method for producing a food or drink according to this aspect includes other food materials, various nutrients, various vitamins, minerals, amino acids, various fats and oils, and various additives (for example, flavoring ingredients, sweeteners, An acidulant such as an organic acid, a surfactant, a pH adjuster, a stabilizer, an antioxidant, a dye, and a flavor) may be blended and manufactured according to a conventional method. Moreover, the foodstuff which concerns on this invention can also be manufactured by adding the natural colorant of a 3rd aspect, or the antioxidant of a 4th aspect to the food-drinks after manufacture.
　飲食品中における第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤の含有量は、飲食品形態や目的により異なる。ここでいう目的とは、着色目的（色揚げ目的を含む）、抗酸化作用付与の目的、及びその両方をいう。例えば、一例として製造過程で食品への着色を目的とする場合、食品衛生法に準拠した含有量が望まれる。例えば、食用赤色2号では1日当たり0.006mg、食用黄色4号では0.469mgを超えない範囲での添加が基準となるため、それを超えない量を添加すればよい。 The content of the natural colorant of the third aspect or the antioxidant of the fourth aspect in the food and drink varies depending on the form and purpose of the food and drink. The purpose here refers to the purpose of coloring (including the purpose of color frying), the purpose of imparting an antioxidant effect, and both. For example, when the objective is to color food in the manufacturing process as an example, the content in accordance with the Food Sanitation Law is desired. For example, food red No. 2 is 0.006 mg per day, and food yellow No. 4 is added within a range not exceeding 0.469 mg. Therefore, an amount not exceeding it may be added.
６．化粧品
６－１．概要
　本発明の第６の態様は、化粧品である。本発明の化粧品は、第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤を含むことを特徴とする。本発明によれば、色味と抗酸化作用を有する化粧品を提供することができる。 6). Cosmetics 6-1. Outline | summary The 6th aspect of this invention is cosmetics. The cosmetic of the present invention comprises the natural colorant of the third aspect or the antioxidant of the fourth aspect. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the cosmetics which have a color taste and an antioxidant effect can be provided.
６－２．構成
　本発明の飲食品は、第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤を含む。前述のように第３態様の天然着色料及び第４態様の抗酸化剤は実質的にその構成が同一である。したがって、本発明の飲食品は、第３態様の天然着色料に基づく色を呈し、同時に第４態様の抗酸化剤による高い抗酸化作用を有する。 6-2. Structure The food or drink of the present invention contains the natural colorant of the third aspect or the antioxidant of the fourth aspect. As described above, the natural colorant of the third aspect and the antioxidant of the fourth aspect have substantially the same configuration. Therefore, the food / beverage products of this invention exhibit the color based on the natural colorant of a 3rd aspect, and have the high antioxidant effect | action by the antioxidant of a 4th aspect simultaneously.
　化粧品の形態は、限定しない。乳液、化粧液、クリーム、ローション、エッセンス、パック及びシート、ファンデーション、おしろい、頬紅、口紅、アイシャドー、アイライナー、マスカラ、洗顔料、皮膚洗浄料、ゲル剤、ジェル剤、美肌剤、ボディシャンプー等の洗浄料、シャンプー、リンス等の毛髪化粧料、頭髪料、ヘアートリートメント、養毛剤、浴用剤、軟膏、医薬部外品、あぶら取り紙等のいずれであってもよい。 The form of cosmetics is not limited. Milky lotion, cosmetic liquid, cream, lotion, essence, pack and sheet, foundation, funny, blusher, lipstick, eye shadow, eyeliner, mascara, facial cleanser, skin cleanser, gel, gel, skin cleanser, body shampoo, etc. Any of cleansing agents, hair cosmetics such as shampoos and rinses, hair preparations, hair treatments, hair nourishing agents, bath preparations, ointments, quasi-drugs, oil blotting paper, etc.
　本発明の化粧料を調製する場合、第３態様の天然着色料及び第４態様の抗酸化剤を既存の化粧品に配合すればよい。例えば、化粧品の形態に応じて従来公知の賦形剤や香料、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、顔料等の粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、酸化防止剤、pH調節剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤等と共に適宜配合し、常法に従って製造すればよい。 When preparing the cosmetic of the present invention, the natural colorant of the third aspect and the antioxidant of the fourth aspect may be blended into the existing cosmetic. For example, conventionally known excipients, fragrances, fats and oils, surfactants, preservatives, sequestering agents, water-soluble polymers, thickeners, pigments and other powder components, UV protection agents, depending on the cosmetic form , Moisturizers, antioxidants, pH adjusters, detergents, desiccants, emulsifiers and the like may be appropriately blended and produced according to conventional methods.
　化粧品における第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤の配合量は、化粧品の形態や目的により異なる。ここでいう目的とは、着色目的、抗酸化作用付与の目的、及びその両方をいう。例えば、一例として製造過程で化粧品への着色を目的とする場合、食品衛生法に準拠した含有量が望まれる。例えば、食用赤色２号では1日当たり0.006mg、食用黄色４号では0.469mgを超えない範囲での添加が基準となるため、それを超えない量を添加すればよい。 The blending amount of the natural colorant of the third aspect or the antioxidant of the fourth aspect in cosmetics varies depending on the form and purpose of the cosmetic. The purpose here refers to the purpose of coloring, the purpose of imparting antioxidant action, and both. For example, when the purpose is to color cosmetics in the manufacturing process as an example, the content in accordance with the Food Sanitation Law is desired. For example, for Food Red No. 2, 0.006 mg per day and for Food Yellow No. 4 in the range not exceeding 0.469 mg is the standard, so an amount not exceeding that may be added.
＜実施例１：強光ストレス下におけるトレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類の生育及び増殖＞
（目的）
　本発明の大量生産方法ではストレス付与工程でトレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類に対して強光下、長時間で培養を行う。通常の培養条件から逸脱した強光培養条件でのトレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類の生育及び増殖への影響を検証する。 <Example 1: Growth and proliferation of Trevoxia algae and Yokowa midoro algae under intense light stress>
(the purpose)
In the mass production method of the present invention, culturing for a long time under strong light is performed on Trevoxia algae and Yokowa algae in the stress application step. To verify the effects on growth and proliferation of Trevoxia algae and Yokowa algae under intense light culture conditions deviating from normal culture conditions.
（方法）
　培養する藻類は、トレボウクシア藻綱に属するクロレラ属のC. mirabilis、C. vulgaris、C. sorokiniana及びC. viscose、パラクロレラ属のP. kessleri NIES-2152、P. kessleri PK2及びP. beijerinckii、ロボスファエロプシス属のL. lobophora、及びヨコワミドロ目に属するグラエシエラ属のG. emersonii、及びムリエラ属のM. zofingiensisを用いた。後述する培地に1.0×106 cells/mLで播種した。 (Method)
The algae to be cultivated are C. mirabilis, C. vulgaris, C. sorokiniana and C. viscose belonging to Trevoxia algae, P. kessleri NIES-2152, P. kessleri PK2 and P. beijerinckii, Lobos. L. lobophora belonging to the genus Phaeropsis, G. emersonii belonging to the genus Graeciella belonging to the order of Yokowa midlo, and M. zofingiensis belonging to the genus Muriera were used. It seed | inoculated at the culture medium mentioned later at 1.0 * 10 < 6 > cells / mL.
　強光培養条件は、植物培養用蛍光灯Lv1（三菱電機オスラム）、CCFL照明ユニット（日本医科機器）及び強力LED電球（杭州遠方光電情報：中国）を組み合わせた光源から600 μmol photons/m2/sの光を、24時間連続照射で14日間照射した。93ｍLのチューブ（IWAKI）に80mLのTAP培地を入れ、チューブ内には20 mL/min/本で通気し、培地中のCO2濃度を2～5％とした。また、培養温度は25±2℃とした。 Strong light culturing conditions for plant culture fluorescent lamp Lv1 (Mitsubishi Electric Osram), CCFL illumination unit (Nippon Medical device) and strong LED bulb: 600 from a light source that combines (Hangzhou far photoelectric information China) μmol photons / m 2 / The light of s was irradiated for 14 days with continuous irradiation for 24 hours. 80 mL of TAP medium was placed in a 93 mL tube (IWAKI) and aerated at 20 mL / min / tube in the tube to adjust the CO 2 concentration in the medium to 2 to 5%. The culture temperature was 25 ± 2 ° C.
　培養開始時、1日後、2日後、3日後、4日後、6日後、8日後、及び11日後に培養液の一部を採取して、コールターカウンターCDA-1000（Sysmex）を用いて細胞数をカウントし、1mLあたりの細胞数を算出した。 At the start of culture, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 6 days, 8 days, and 11 days later, a part of the culture solution is collected and the number of cells is measured using Coulter Counter CDA-1000 (Sysmex) The number of cells per mL was calculated by counting.
（結果）
　図２に各トレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類を強光ストレス付与下で長時間培養した時の成長曲線を示す。いずれの種の成長曲線もシグモイド曲線となり、強光培養による成長の抑制は認められなかった。この結果から、強光培養条件であっても、トレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類の生育及び増殖には影響がないことが明らかとなった。 (result)
FIG. 2 shows a growth curve when each Trevoxia algae and Yokowa algae are cultured for a long time under strong light stress. The growth curves of all species were sigmoid curves, and no growth inhibition by strong light culture was observed. From this result, it became clear that even under strong light culture conditions, there was no effect on the growth and proliferation of Trevoxia algae and Yokowa midoro algae.
＜実施例２：ヨコワミドロ藻類を用いたカロテノイドの生産（１）＞
（目的）
　本発明のカロテノイド大量生産方法で処理したヨコワミドロ藻類におけるカロテノイド量を検証する。 <Example 2: Production of carotenoids using yellow algae (1)>
(the purpose)
The amount of carotenoid in the yellow algae treated by the carotenoid mass production method of the present invention is verified.
（方法）
　ヨコワミドロ藻類にはMuriella zofingiensisを用いた。強光培養条件は、実施例1の条件に準じた。培養初日、及び14日後の培養液2mLをそれぞれチューブに回収し、10000gで5分間の遠心により細胞を沈殿させた。上清を除去し、細胞ペレットを得た。これを－20℃で保存し、分析時に解凍して使用した。 (Method)
Muriella zofingiensis was used as the yellow algae. The intense light culture conditions were the same as in Example 1. On the first day of culture, and 2 mL of the culture solution after 14 days were collected in tubes, and the cells were precipitated by centrifugation at 10,000 g for 5 minutes. The supernatant was removed to obtain a cell pellet. This was stored at −20 ° C. and thawed for analysis.
　分析は、まず、細胞ペレットに200μLのDMF（N,N-dimethylformamide）を加えて、タッピングにより細胞を懸濁した。続いて、10000gで5分間遠心した後、上清を回収した。DMF処理は、細胞内の色素が溶出して細胞が白色になるまで繰り返した。回収した上清をまとめて、200μLで取り分け、NaOH-メタノール溶液（0.1gNaOH in 100mLメタノール）溶液を9:1の割合で加え、4℃で12時間静置した。この処理によって、溶液中でエステル状態で存在するカロテノイドエステルを鹸化して、カロテノイドに戻した。NaOHが単体のカロテノイドを分解するのを防ぐため4℃の低温下で反応を行った。反応後の溶液を40μL採取し、HPLC（Waters2695 Separations Module、Waters 2475 Multi λ Fluorescence Detector）で分析した。測定波長は440nmで、Zapataの分析系（Zapata et al. 2000）を用いた。ピークの同定には市販の標準物質（ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、β-カロテン、及びリコペン）を用いた。 For analysis, first, 200 μL of DMF (N, N-dimethylformamide) was added to the cell pellet, and the cells were suspended by tapping. Subsequently, after centrifugation at 10,000 g for 5 minutes, the supernatant was recovered. The DMF treatment was repeated until the intracellular dye eluted and the cells became white. Collected supernatants were combined, separated by 200 μL, a NaOH-methanol solution (0.1 g NaOHNain 100 mL methanol) solution was added at a ratio of 9: 1, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 12 hours. By this treatment, the carotenoid ester present in the ester state in the solution was saponified and returned to the carotenoid. The reaction was performed at a low temperature of 4 ° C to prevent NaOH from degrading the single carotenoid. 40 μL of the solution after the reaction was collected and analyzed by HPLC (Waters2695-Separations-Module, Waters-2475-Multi-λ-Fluorescence-Detector). The measurement wavelength was 440 nm, and a Zapata analysis system (Zapata et al. 2000) was used. Commercially available standard substances (lutein, zeaxanthin, astaxanthin, canthaxanthin, β-carotene, and lycopene) were used for peak identification.
（結果）
　図３に結果を示す。強光ストレス下培養初日におけるヨコワミドロ藻類の全植物色素に占めるカロテノイドの藻体内比率は、50％以下であった。一方、強光ストレスを付与し14日間培養した後の藻体中にはクロロフィルが存在せず（14D及び14D＋4℃）、そのほとんどがカロテノイドとなった。また、アスタキサンチンやアスタキサンチン誘導体の比率が顕著に増加し、強光ストレスによりヨコワミドロ藻類の藻体細胞内にアスタキサンチンやアスタキサンチン誘導体が大量に生産され、蓄積されることが明らかとなった。 (result)
The results are shown in FIG. The ratio of carotenoids in the total plant pigments of yellow algae on the first day of culture under intense light stress was 50% or less. On the other hand, chlorophyll was not present in the algal bodies after applying intense light stress and cultured for 14 days (14D and 14D + 4 ° C), and most of them became carotenoids. In addition, the ratio of astaxanthin and astaxanthin derivatives increased remarkably, and it was revealed that astaxanthin and astaxanthin derivatives were produced and accumulated in large quantities in the algal somatic cells of strong yellow stress.
＜実施例３：ヨコワミドロ藻類を用いたカロテノイドの生産（２）＞
（目的）
　本発明のカロテノイド大量生産方法で処理した、実施例２とは異なるヨコワミドロ藻類におけるカロテノイド量を検証する。 <Example 3: Production of carotenoids using yellow algae (2)>
(the purpose)
The amount of carotenoid in the yellow algae different from Example 2 treated by the carotenoid mass production method of the present invention is verified.
（方法）
　ヨコワミドロ藻類にはGraesiella emersoniiを用いた。強光培養条件は、実施例1の条件に準じた。14日間の強光培養条件は、実施例１の条件に準じた。また、8日間の強光培養条件として、強力LED電球（杭州遠方光電情報：中国）から2000 μmol photons/m2/sの光を、8日間連続照射した。 (Method)
Graesiella emersonii was used as the yellow algae. The intense light culture conditions were the same as in Example 1. The strong light culture conditions for 14 days were the same as in Example 1. Moreover, as a strong light culture condition for 8 days, 2000 μmol photons / m 2 / s of light was continuously irradiated for 8 days from a powerful LED bulb (Hangzhou remote photoelectric information: China).
　藻体から植物色素を抽出し、各色素を同定する方法は、実施例２に準じた。 The method of extracting plant pigments from algal bodies and identifying each pigment was in accordance with Example 2.
（結果）
　図４に結果を示す。実施例２で用いたMuriella zofingiensisと同様に、強光ストレス培養初日における全植物色素に占めるカロテノイドの藻体内比率は50％以下であった。強光ストレス下で8日間、及び14日間培養した後の藻体中の植物色素に占めるカロテノイドの比率は、いずれも90％以上となり（8D、14D）、また、ルテイン及びゼアキサンチン混合物の比率が増加した。この結果から、強光ストレスによりヨコワミドロ藻類にも細胞内にルテイン及びゼアキサンチンが大量に生産され、蓄積され得ることが確認された。 (result)
The results are shown in FIG. Similar to Muriella zofingiensis used in Example 2, the ratio of carotenoids in all plant pigments on the first day of intense light stress culture was 50% or less. The ratio of carotenoids to plant pigments in algal cells after 8 days and 14 days of culturing under intense light stress is over 90% (8D, 14D), and the ratio of lutein and zeaxanthin mixture is increased. did. From this result, it was confirmed that lutein and zeaxanthin can also be produced and accumulated in large quantities in the cells of the yellow algae by intense light stress.
＜実施例４：トレボウクシア藻類を用いたカロテノイドの生産（１）＞
（目的）
　本発明のカロテノイド大量生産方法で処理したトレボウクシア藻類におけるカロテノイド量を検証する。 <Example 4: Production of carotenoid using Trevoxia algae (1)>
(the purpose)
The amount of carotenoids in Trevoxia algae treated with the carotenoid mass production method of the present invention is verified.
（方法）
　トレボウクシア藻類にはParachlorella kessleri NIES-2152を用いた。14日間の強光培養条件は、実施例１の条件に準じた。また、8日間の強光培養条件として、強力LED電球（杭州遠方光電情報：中国）から2000 μmol photons/m2/sの光を、8日間連続照射した。 (Method)
Parachlorella kessleri NIES-2152 was used as the Trevoxia algae. The strong light culture conditions for 14 days were the same as in Example 1. Moreover, as a strong light culture condition for 8 days, 2000 μmol photons / m 2 / s of light was continuously irradiated for 8 days from a powerful LED bulb (Hangzhou remote photoelectric information: China).
　藻体から植物色素を抽出し、各色素を同定する方法は、実施例２に準じた。 The method of extracting plant pigments from algal bodies and identifying each pigment was in accordance with Example 2.
（結果）
　図５に結果を示す。強光ストレス培養初日における全植物色素に占めるカロテノイドの藻体内比率は、50％以下であった。強光ストレス下で8日間、及び14日間培養した後の藻体中の植物色素に占めるカロテノイドの比率は90％以上となり（8D）、また、ルテイン及びゼアキサンチン混合物の比率が増加した。この結果から、強光ストレスによりトレボウクシア藻類の細胞内にルテイン及びゼアキサンチンが大量に生産され、蓄積されることが確認された。 (result)
The results are shown in FIG. The percentage of carotenoids in all plant pigments on the first day of intense light stress culture was 50% or less. The ratio of carotenoids to plant pigments in algal cells after culturing under intense light stress for 8 days and 14 days was 90% or more (8D), and the ratio of lutein and zeaxanthin mixture was increased. From this result, it was confirmed that lutein and zeaxanthin were produced and accumulated in large quantities in cells of trevoxia algae by intense light stress.
　また、表１に、実施例２～４から算出された培養液1Lあたりの各カロテノイド量を示す。吸光度法によるカロテノイドの算出は、Wellburn, A.R.（J. Plant Physiol., 1994, 144, 307-313）に記載の方法に準じた。HPLC法及び吸光度法のいずれによる算出方法であってもカロテノイド量の傾向に大きな差は見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 Table 1 shows the amount of each carotenoid per 1 L of the culture solution calculated from Examples 2 to 4. The calculation of carotenoids by the absorbance method was in accordance with the method described in Wellburn, AR (J. Plant Physiol., 1994, 144, 307-313). There was no significant difference in the tendency of the amount of carotenoids by either the HPLC method or the absorbance method.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜実施例５：トレボウクシア藻類を用いたカロテノイドの生産（２）＞
（目的）
　本発明のカロテノイド大量生産方法で処理したトレボウクシア藻類におけるカロテノイド量を検証する。 <Example 5: Production of carotenoid using trevoxia algae (2)>
(the purpose)
The amount of carotenoids in Trevoxia algae treated with the carotenoid mass production method of the present invention is verified.
（方法）
　トレボウクシア藻類にはChlorella sorokinianaを用いた。14日間の強光培養条件は、実施例１の条件に準じた。 (Method)
Chlorella sorokiniana was used for trevoxia algae. The strong light culture conditions for 14 days were the same as in Example 1.
　藻体から植物色素を抽出し、各色素を同定する方法は、実施例２に準じた。より具体的には、カラムはWaters Symmetry C8 column (150 mm x 4.6 mm, 3.5 μm particle size, 100A pore size)を用い、溶媒A（メタノール：アセトニトリル：0.25Mピリジン水溶液 ＝ 50v：25v：25v）及び溶媒B（メタノール：アセトニトリル：アセトン ＝ 20v：60v：20v）を表２の条件で流速1 mL/minにてカラムに通した。抽出溶媒にはN,N-Dimethylformamide（DMF）又はメタノールを用いた。カラム投入量は30μLとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 The method of extracting plant pigments from the algal bodies and identifying each pigment was in accordance with Example 2. More specifically, the column was a Waters Symmetry C8 column (150 mm x 4.6 mm, 3.5 μm particle size, 100 A pore size), and solvent A (methanol: acetonitrile: 0.25 M aqueous pyridine solution = 50 v: 25 v: 25 v) and Solvent B (methanol: acetonitrile: acetone = 20v: 60v: 20v) was passed through the column under the conditions shown in Table 2 at a flow rate of 1 mL / min. As the extraction solvent, N, N-dimethylformamide (DMF) or methanol was used. The column input was 30 μL.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
ピークの同定には市販の標準物質（ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、β-カロテン、ネオキサンチン及びアンテラキサンチン）を用いた。 Commercially available standard substances (lutein, zeaxanthin, astaxanthin, canthaxanthin, β-carotene, neoxanthine and anthaxanthin) were used for peak identification.
（結果）
　図６に結果を示す。強光ストレス培養初日における全植物色素に占めるカロテノイドの藻体内比率は、50％以下であった。強光ストレス下で14日間培養した後の藻体中の植物色素に占めるカロテノイドの比率は90％以上となり（14D）、また、アンテラキサンチンの比率が著しく増加した。この結果から、強光ストレスによりトレボウクシア藻類、特にChlorella sorokinianaの細胞内にはアンテラキサンチンが大量に生産され、蓄積されることが確認された。表３に、Chlorella sorokinianaの培養液1Lあたりにおける各カロテノイド量を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 (result)
The results are shown in FIG. The percentage of carotenoids in all plant pigments on the first day of intense light stress culture was 50% or less. The ratio of carotenoids to plant pigments in algal cells after 14 days of culturing under intense light stress was over 90% (14D), and the ratio of anthaxanthin was significantly increased. From this result, it was confirmed that anthaxanthin was produced and accumulated in large quantities in the cells of Trevoxia algae, especially Chlorella sorokiniana, by intense light stress. Table 3 shows the amount of each carotenoid per liter of culture solution of Chlorella sorokiniana.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表中「＊」は、実際の藻体内蓄積量が測定不能であったことを示す。これは、含まれるカロテノイドの中には測定のためにNaOH処理を要するものがあるが、NaOH処理はクロロフィルも分解してしまうため、同時には測定できないことによる。 “*” In the table indicates that the actual algae accumulation could not be measured. This is because some of the contained carotenoids require NaOH treatment for measurement, but NaOH treatment also decomposes chlorophyll, so it cannot be measured at the same time.
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。 All publications, patents and patent applications cited in this specification are incorporated herein by reference in their entirety.

Claims (21)

  1. 　トレボウクシア藻綱（Trebouxiophyceae）又はヨコワミドロ目（Sphaeropleales）に属する種に500～2500μmol photons/m2/sの光強度で光を150～500時間照射して培養するストレス付与工程を含むカロテノイドの大量生産方法。 A method for mass production of carotenoids, including a stressing step of cultivating species belonging to Trebouxiophyceae or Sphaeropleales by irradiating with light at a light intensity of 500-2500 μmol photons / m 2 / s for 150-500 hours .
  2. 　前記ストレス付与工程後の培養液から藻体を回収する回収工程を含む、請求項１に記載のカロテノイドの大量生産方法。 The method for mass production of carotenoids according to claim 1, comprising a recovery step of recovering algal bodies from the culture solution after the stress applying step.
  3. 　前記回収工程後の藻体を乾燥させる乾燥工程を含む、請求項２に記載のカロテノイドの大量生産方法。 The method for mass-producing carotenoids according to claim 2, comprising a drying step of drying the algal bodies after the collecting step.
  4. 　前記ストレス付与工程後又は乾燥工程後の藻体からカロテノイドを抽出する抽出工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のカロテノイドの大量生産方法。 The carotenoid mass production method according to any one of claims 1 to 3, further comprising an extraction step of extracting carotenoid from the algal bodies after the stress applying step or the drying step.
  5. 　前記抽出工程後の抽出液からカロテノイドを分離、精製する分離工程を含む、請求項４に記載のカロテノイドの大量生産方法。 The method for mass production of carotenoids according to claim 4, comprising a separation step of separating and purifying carotenoids from the extract after the extraction step.
  6. 　光照射が連続照射である、請求項１～５のいずれか一項に記載のカロテノイドの大量生産方法。 6. The method for mass production of carotenoids according to any one of claims 1 to 5, wherein the light irradiation is continuous irradiation.
  7. 　前記トレボウクシア藻綱に属する種がクロレラ目（Chlorellales）、カワノリ目（Prasiolales）又はワタナベア系統群（Watanabea-clade）に属する種である、請求項１～６のいずれか一項に記載のカロテノイドの大量生産方法。 A large amount of carotenoid according to any one of claims 1 to 6, wherein the species belonging to the Trevoxia algae is a species belonging to the order Chlorellales, Prasiolales or Watanabea-clade. Production method.
  8. 　前記ヨコワミドロ目に属する種がイカダモ科（Scenedesmaceae）、ムリエラ属（Muriella）又はグラエシエラ属（Graesiella）に属する種である、請求項１～６のいずれか一項に記載のカロテノイドの大量生産方法。 The method for mass-producing carotenoids according to any one of claims 1 to 6, wherein the species belonging to the order of the order of the spleen is the species belonging to the genus Scenedesmaceae, the genus Muriella or the genus Graesiella.
  9. 　前記カロテノイドがルテイン及び／又はゼアキサンチンである、請求項７又は８に記載のカロテノイドの大量生産方法。 The carotenoid mass production method according to claim 7 or 8, wherein the carotenoid is lutein and / or zeaxanthin.
  10. 　前記カロテノイドがアスタキサンチン及び／又はその誘導体である、請求項８に記載のカロテノイドの大量生産方法。 The carotenoid mass production method according to claim 8, wherein the carotenoid is astaxanthin and / or a derivative thereof.
  11. 　前記カロテノイドがアンテラキサンチン及び／又はその誘導体である、請求項７に記載のカロテノイドの大量生産方法。 The method for mass-producing carotenoids according to claim 7, wherein the carotenoid is anthaxanthin and / or a derivative thereof.
  12. 　前記カロテノイドがネオキサンチン及び／又はその誘導体である、請求項７に記載のカロテノイドの大量生産方法。 The carotenoid mass production method according to claim 7, wherein the carotenoid is neoxanthine and / or a derivative thereof.
  13. 　500～2500μmol photons/m2/sの光強度で光を照射し、150～500時間培養する工程を含む方法によって得られるトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。 Species belonging to the order of Trevoxia algae or Aceraceae obtained by a method comprising a step of irradiating with a light intensity of 500 to 2500 μmol photons / m 2 / s and culturing for 150 to 500 hours.
  14. 　前記工程後の培養液から培地を除去して藻体を回収する工程をさらに含む方法によって得られる、請求項１３に記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。 14. A species belonging to the order of Trevoxia algae or Aceraceae according to claim 13, which is obtained by a method further comprising the step of removing the medium from the culture solution after the step and recovering the alga bodies.
  15. 　前記工程で回収された藻体を乾燥させる工程をさらに含む方法によって得られる、請求項１４に記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。 Species belonging to the order of Trevoxia algae or Aceraceae, obtained by a method further comprising a step of drying the algal bodies recovered in the step.
  16. 　前記トレボウクシア藻綱に属する種がクロレラ目（Chlorellales）、カワノリ目（Prasiolales）又はワタナベア系統群（Watanabea-clade）に属する種である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。 The Trevoxia algae according to any one of claims 13 to 15, wherein the species belonging to the Trevoxia algae is a species belonging to the order Chlorellales, Prasiolales, or Watanabea-clade. Or a species belonging to the order of Yokowa.
  17. 　前記ヨコワミドロ目に属する種がイカダモ科（Scenedesmaceae）、ムリエラ属（Muriella）又はグラエシエラ属（Graesiella）に属する種である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。 The species belonging to the order of the genus Cervaceae (Scenedesmaceae), the genus Muriella (Grauria), or the genus Graesiella (Televoxia algae or Yokomidae) according to any one of claims 13 to 15. The species to which it belongs.
  18. 　請求項１３～１７のいずれか一項に記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種を含む天然着色料。 A natural colorant comprising a species belonging to the order of Trevoxia algae or Yokomidae according to any one of claims 13 to 17.
  19. 　請求項１３～１７のいずれか一項に記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種を含む抗酸化剤。 Antioxidants comprising a species belonging to the order of Trevoxia algae or Aceraceae according to any one of claims 13 to 17.
  20. 　請求項１８に記載の天然着色料又は請求項１９に記載の抗酸化剤を含む飲食品。 A food or drink comprising the natural colorant according to claim 18 or the antioxidant according to claim 19.
  21. 　請求項１８に記載の天然着色料又は請求項１９に記載の抗酸化剤を含む化粧品。 Cosmetics comprising the natural colorant according to claim 18 or the antioxidant according to claim 19.
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